BR112020021179A2

BR112020021179A2 - composições e métodos para tratar distrofia muscular de duchenne

Info

Publication number: BR112020021179A2
Application number: BR112020021179-6A
Authority: BR
Inventors: Hansell Stedman
Original assignee: The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2021-03-02
Also published as: WO2019204303A3; CN112601454A; CN112601454B; WO2019204303A2; EP3780952A4; CA3099958A1; US20210155956A1; JP2021521782A; EP3780952A2

Abstract

composições e métodos para tratar distrofia muscular de duchenne. são aqui descritos mutantes de encaixe triplo de distrofina ou utrofina e métodos de uso dos mesmos para tratar distrofia muscular de duchenne. também são providos vetores virais que compreendem um ácido nucleico codificando uma distrofina ou utrofina mutantes de encaixe triplo sob o controle da expressão direta de elementos reguladores dos mesmos. composições também são providas que contêm tais vetores virais formulados para a entrega a um paciente humano.

Description

“COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE” INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL SUBMETIDO NA FORMA ELETRÔNICA

[0001] O requerente por meio deste incorpora por referência o material de Listagem de Sequência depositado na forma eletrônica por meio desta. O arquivo é rotulado “UPN_18-8438PCT_ST25.txt”, criado em 16 de abril de 2019 e 269.817 bites.

DECLARAÇÃO DE PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL

[0002] Esta invenção foi feita com o suporte governamental sob R01NS094705 concedido pelo National Institutes of Health / National Institute of Neurological Disorders and Stroke. O governo tem certos direitos na invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença severamente incapacitante, sistêmica de início na infância que progride da fraqueza muscular locomotiva precoce até o estágio final respiratório e cardiomiopatia caracterizada pela dependência de cuidador e tecnologia extraordinariamente caros (Landfeldt, E., et al., The burden of Duchenne muscular dystrophy: a international, cross-sectional study. Neurology, 2014. 83(6): p. 529-36; e Schreiber-Katz, O., et al., Comparative cost of illness analysis and assessment of health care burden of Duchenne and Becker muscular dystrophies in Germany. Orphanet J Rare Dis, 2014. 9: p. 210.). A DMD está entre as doenças letais de gene único mais comuns do gênero humano, com uma incidência histórica global de aproximadamente 1:4000 nascimentos masculinos. A base molecular é a deficiência da isoforma de 427 kd da proteína citoesqueletal distrofina (Dp427), que na maioria dos casos é causada pelas deleções por deslocamento de múltiplos exons no gene da DMD. Uma doença mais branda, a Distrofia Muscular de Becker (BMD), é alélica e a maioria dos casos estão surgindo das deleções ou duplicações internas do gene da distrofina que altera o comprimento do domínio de bastão da proteína codificada.

[0004] A distrofina foi a primeira proteína descoberta pela “clonagem posicional” e esta descoberta proveu a prova inicial de conceito para o uso de uma posição no mapa genético humano da doença como a base primária para elucidar a sua base molecular. Muitas proteínas descobertas por este método são de abundância muito baixa nas células afetadas, complicando a averiguação da função fisiológica das proteínas. A distrofina foi descoberta em 1987 e 30 anos no campo são enfrentados com lacunas consideráveis no entendimento da função exata da proteína na célula muscular. Entretanto, foi provido que evidência indireta do papel da distrofina na proteção das membranas da célula muscular das forças desenvolvidas durante a contração muscular. A natureza da carga mecânica da distrofina permanece insuficientemente caracterizada.

[0005] A detecção de carreador e acompanhamento pré-natal têm diminuído um pouco a incidência de DMD nos Estados Unidos da América (Pegoraro, E., et al., SPP1 genotype is a determinant of disease severity in Duchenne Muscular Dystrophy. Neurology, 2011. 76(3): p. 219-26). A terapia corrente com a combinação de glicocorticosteróides, inibidores de ACE e suporte ventilador mecânico pode temporariamente diminuir a taxa de progressão, mas o curso clínico final é inexorável (McDonald, C.M., et al., The cooperative international neuromuscular research group duchenne natural history study-a longitudinal investigation in the era of glucocorticoid therapy: Design of protocol and the methods used. Muscle Nerve, 2013.).

[0006] Na era da terapia gênica, vários vetores AAV emergiram como as plataformas minimamente tóxicas e mais amplamente disseminadas para a distribuição de gene sistêmico. Estas terapias gênicas representam uma grande promessa para a biodistribuição sistêmica, mas as limitações incluem (a) a capacidade de clonagem limitada a um terço do que é requerido para Dp427 de tamanho completo, (b) problemas não resolvidos de imunogenicidade de vetor e toxicidade nas doses potencialmente necessárias para terapia durável e (c) o custo extraordinário de fabricação convencional em uma escala requerida para a terapia humana. Os vetores AAV estão estruturalmente relacionados com os membros tipo selvagem da subfamília de parvovírus que encapsidam um genoma de DNA de filamento único de aproximadamente 5 quilobases. O mRNA para a distrofina de comprimento completo tem 14 quilobases, com um quadro de leitura aberta de aproximadamente 12 kb.

[0007] A maioria das mutações causando DMD são deleções de deslocamento de éxons múltiplos esporádicos no gene >2,5 megabases, ligado a X (Kunkel, L.M., et al., Analysis of deletions in DNA from patients with Becker e Duchenne Muscular Dystrophy. Nature, 1986. 322(6074): p. 73-7; Monaco, A.P., et al., Isolation of candidate cDNAs for portions of the Duchenne muscular dystropht gene. Nature, 1986. 323(6089): p. 646-50; e Koenig, M., et al., The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet, 1989. 45(4): p. 498-506.). Na ausência de tolerância central (tímica) para a proteína completa deficiente, a distrofina recombinante tem a capacidade para induzir respostas imunes hospedeiras para a proteína estranha (Mendell, J.R., et al., Dystrophyn immunity in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 2010. 363(15): p. 1429-37). Novos vetores e métodos de distribuição vascular têm alcançado transferência de gene regional e sistêmica promissora nos estudos pré-clínicos de prova de conceito, sugerindo métodos racionais para a terapia de gene para a DMD (Greelish, J.P., et al., Stable restoration of the sarcoglycan complex in dystrophic muscle perfused with histamine and a recombinant adeno-associated viral vector. Nat Med, 1999. 5(4): p. 439-43; Su, L.T., et al., Uniform scale-independent gene transfer to striated muscle after transvenular extravasation of vector. Circulation, 2005. 112(12): p. 1780-8; Gao, G., L.H. Vandenberghe e J.M. Wilson, New recombinant serotypes of AAV vectors. Curr Gene Ther, 2005. 5(3): p. 285-97; e Katz, M.G., et al., Cardiac gene therapy: optimization of gene delivery techniques in vivo. Hum Gene Ther, 2010. 21(4): p. 371-80.). Estes desenvolvimentos, entretanto, também salientam os principais desafios da descoberta de vetor e problemas de segurança de paciente neste campo (Mendell, J.R., et al., Dystrophyn immunity in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 2010. 363(15): p. 1429-37; Mendell, J.R., et al., Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 1995. 333(13): p. 832-8; Mouly, V., et al., Myoblast transfer therapy: is there any light at the end of the tunnel? Acta Myol, 2005. 24(2): p. 128-33; e Wang, Z., et al., Immunity to adeno-associated virus-mediated gene transfer in a random-bred canine model of

Duchenne muscular dystrophy. Hum Gene Ther, 2007. 18(1): p. 18-26.). Como um outro exemplo de vetores de AAV tratando DMD, a Patente US No. 7.771.993 provê uma “micro-utrofina” (também citada como “m-utrofina”, “µ-utrofina” ou “µ-U”) tendo uma porção funcional do “domínio de ligação de actinina” de cerca de 270 aminoácidos relativos à utrofina humana que está localizado dentro da região de terminal N da utrofina, pelo menos porções funcionais das regiões de dobradiça ricas em prolina 1 e 4 (H1) e (H4) e uma porção do terminal C da proteína utrofina. A micro- utrofina contém deleções internas dos domínios de repetição rod central e uma truncagem na região de terminal C a jusante.

[0008] Permanece uma necessidade quanto ao tratamento da distrofia muscular de Duchenne e doenças relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção provê composições e métodos úteis para o tratamento da Distrofia Muscular (MD), incluindo a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e a Distrofia Muscular de Becker (BMD) e outras doenças. É aqui provido um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) tendo um capsídeo de AAV e um genoma vetorial. O genoma vetorial compreende uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina sob o controle de sequências reguladoras que direcionam a sua expressão.

[0010] Em certas modalidades, a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina compreende um domínio helicoidal híbrido compreendendo uma primeira hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice A fundida a uma porção de terminal C de uma hélice A’, uma segunda hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice B’ fundida a uma porção de terminal C de uma hélice B, e, uma terceira hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice C fundida a uma porção de terminal C da hélice C’, em que as hélices A, B e C estão presentes em uma primeira repetição helicoidal tripla que não está adjacente a uma segunda repetição helicoidal tripla tendo hélices A’, B’ e C’ em uma proteína da superfamília da distrofina nativa. Em certas modalidades, a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma distrofina mutante de encaixe triplo ou utrofina mutante de encaixe triplo.

[0011] Ainda em modalidades adicionais, a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina compreende repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N, uma repetição helicoidal tripla híbrida e repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C, em que o número total das repetições helicoidais incluindo a repetição híbrida na proteína mutante de encaixe triplo é selecionado de qualquer número inteiro de 1 a 1 menos do que o número de repetições helicoidais da proteína da superfamília da distrofina completa e em que a repetição helicoidal tripla híbrida é formada pelas duas repetições helicoidais encaixadas no plano que bifurca as repetições helicoidais perpendiculares ao seu eixo longo como representado na FIG. 2F. Em certas modalidades, a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma distrofina mutante de encaixe triplo ou utrofina mutante de encaixe triplo.

[0012] As novas distrofinas mutantes recombinantes tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 22 são providas e novas utrofinas mutantes recombinantes tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 7 e 20 também são providas. Em certas modalidades, a proteína mutante de encaixe triplo é utrofina e codificada por um ácido nucléico compreendendo a SEQ ID NO: 19 ou uma sequência de cerca de 95% acerca de 99% idêntica a esta.

[0013] Em modalidades adicionais, a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma repetição helicoidal tripla híbrida e repetições helicoidais de terminal C, em que o número total das repetições helicoidais incluindo a repetição híbrida na proteína mutante de encaixe triplo é cinco e em que a repetição helicoidal tripla híbrida é formada por duas repetições helicoidais encaixadas no plano que bifurca as repetições helicoidais perpendiculares ao seu eixo longo como representado na FIG. 2F. Em certas modalidades, as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem de repetições helicoidais 21, 22, 23 e 24 na distrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida é 1 repetição helicoidal na distrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 20 repetições helicoidais na distrofina completa. Ainda em uma outra modalidade, as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem das repetições helicoidais 19, 20, 21 e 22 na utrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida é 1 repetição helicoidal na utrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 18 repetições helicoidais na utrofina completa.

[0014] Ainda em modalidades adicionais, novas proteínas mutantes recombinantes da distrofina compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 22 são providas. Em certas modalidades, ácido nucléicos codificando proteína mutante da superfamília da distrofinas são providas. Ainda em uma modalidade adicional, plasmídeos compreendendo ácidos nucléicos codificando uma proteína mutante da superfamília da distrofina são providos.

[0015] Em certas modalidades, composições farmacêuticas compreendendo um rAAV compreendendo um genoma vetorial compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína da superfamília mutante de encaixe triplo da distrofina são providas.

[0016] Ainda em modalidades adicionais, métodos de tratar um sujeito diagnosticado com distrofia muscular de Duchenne compreendendo administrar uma composição farmacêutica compreendendo um rAAV compreendendo um genoma vetorial tendo uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína da superfamília mutante de encaixe triplo da distrofina são providos.

[0017] Outros aspectos e vantagens da presente invenção estarão evidentes a partir da seguinte Descrição Detalhada da Invenção. BREVE DESCRIÇÃO DO0S DESENHOS

[0018] A FIG. 1A a FIG. 1D proveem uma ilustração da formação de um domínio híbrido de hélice tripla. A FIG. 1A mostra componentes de uma proteína da superfamília da distrofia exemplificada. A partir do terminal N (indicado como NH2-) da proteína para o terminal C (indicado como -COOH), os componentes são 1) dois domínios de homologia da calponina (CH1 e CH2), 2) diversos domínios de hélice tripla (indicada como TH seguido por um número), 3) uma região de multidomínio globular, modular (WW-EF-ZZ) e 4) uma região de terminal C extrema. nesta ilustração, existem 24 domínios de hélice tripla. As pontas de seta cinzas indicam o sítio de junção de encaixe utilizado na formação anterior de uma proteína encurtada da superfamília da distrofina (tal como descrita na Patente US No. 7.771.993, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade), enquanto que as pontas de seta pretas indicam o sítio de junção de encaixe usado para formar um domínio híbrido de hélice tripla. A FIG. 1B provê uma visão mais próxima nos domínios de hélice tripla, THn nas setas brancas e THn’ nas setas sombreadas, que são encaixadas para formar uma hélice tripla híbrida como mostrado na FIG. 1C. Cada seta branca ou seta sombreada na FIG. 1B até FIG. 1D indica uma hélice em um domínio (Hélice A, B e C para THn; Hélice A’, B’ e C’ para THn’; e Hélice A-A’, B’-B e C-C’ no domínio híbrido de hélice tripla). As linhas de seta preta indicam os sítios de junção de encaixe. A FIG. 1D provê uma exibição linear do domínio híbrido de hélice tripla. A seção branca das barras/setas indica que elas são originalmente de THn enquanto que a seção sombreada indicou que elas são originalmente de THn’. Como mostrado na FIG. 1D, a primeira hélice do domínio híbrido de hélice tripla compreende a Hélice A no terminal N e a Hélice A’ no terminal C; a segunda hélice do domínio híbrido de hélice tripla compreende a Hélice B’ no terminal N e a Hélice B no terminal C; e a terceira hélice do domínio híbrido de hélice tripla compreende a Hélice C no terminal N e a Hélice C’ no terminal C.

[0019] A FIG. 2A até FIG. 2F ilustram as modificações na utrofina aqui providas. Os resíduos de cor mais clara representam os triptofanos, que são os resíduos mais conservados na Modelos Ocultos de Markov (HMM) para a repetição helicoidal tripla domínios compartilhados pela α-actinina, β- e α-espectrina, distrofina, utrofina e as espectroplaquinas. A divergência de sequência em todas as outras posições com acoplamento evolucionário extensivo estabelecem que estas regiões de repetições individuais não são intercambiáveis de uma repetição para a outra sem desestabilizar a hélice tripla. Nenhum encaixe único pode resolver este problema, mas um encaixe triplo através do plano dos resíduos de triptofano pode, pela retenção do aminoácido acoplado à esquerda e direita do plano. A FIG. 2A ilustra uma porção do domínio de repetição helicoidal tripla (TH1) da α-actinina. A FIG. 2B ilustra uma porção TH2 de α- actinina. A FIG. 2C ilustra uma porção TH3 de α-actinina. A FIG. 2D ilustra uma porção TH4 de α-actinina. A FIG. 2E ilustra um sítio tet da β- e α-espectrina. A FIG. 2F ilustra um encaixe triplo através do plano dos resíduos de triptofano, pela retenção do aminoácido acoplado à esquerda e direita do plano (para ajudar com orientação, os triptofanos são mostrados duas vezes).

[0020] A FIG. 3 mostra parte do logo HMM da família da Espectrina (PF00435). Mais detalhes podem ser encontrados em pfam.xfam.org/family/PF00435#tabview=tab4. Este logo HMM provê uma vista geral rápida das propriedades de um HMM em uma forma gráfica. A conservação relativa de cada um dos dois triptofanos de ancoramento, como representado no logo HMM para as repetições helicoidais triplas semelhantes à espectrina na posição #16. Uma pessoa versada na técnica pode encontrar como interpretar o logo como descrito para o exemplo, em Schuster-Böckler B et al, HMM Logos for visualização de famílias de proteína. BMC Bioinformatics. 21 de janeiro de 2004; 5:7.

[0021] A FIG. 4 provê uma vista geral da formação de uma nano-distrofina como aqui descrita assim como uma comparação com a formação de uma microdistrofina.

[0022] A FIG. 5 provê uma grade mostrando possíveis junções de encaixe na Hélice B da distrofina. Descrição mais detalhada com referência a este desenho pode ser encontrada no primeiro parágrafo da Descrição Detalhada da Invenção, I. Distrofina, utrofina e outros, A. Junções de encaixe nas hélices. As variantes representadas correspondem às sequências de aminoácido de nanodistofina das SEQ ID NOs: 13 a 18.

[0023] A FIG. 6A até a FIG. 6C mostram que o comprimento do bastão de Distrofina foi estabelecido antes da emergência de sarcômeros. A FIG. 6A mostra o gene da distrofina humana, o mRNA e a estrutura do domínio de proteína alinhados demonstram a posição e faseamento de intron. 22 das 24 repetições de espectrina da distrofina humana contêm uma fase de 0 intron na posição HMM 46 (pontos com contorno preto). A distrofina cnidariana compartilha os introns de fase 0 do domínio de bastão (para clareza apenas os introns da posição HMM 46 fases 0 são representados no mRNA cnidariano). A FIG. 6B provê espectrina, distrofina e MACF1 pesadas beta humana representadas com os domínios rod verticalmente alinhados com uma sequência de consenso para o domínio helicoidal triplo HMM. Estão sobrepostas as posições e fases de introns relativos às sequências codificadoras correspondentes, mostrando claramente a similaridade estrutural da distrofina e genes MACF1. Para clareza, apenas introns compartilhados com genes ortólogos das espécies mais distantemente relacionadas são mostradas, com o gene da espectrina mostrando introns vestigiais (seta) de uma duplicação de gene parcial remota de 13 repetições (espectrina – A. queenslandica; distrofina - N. vectensis; MACF1 – T. adhaerens). A FIG. 6C provê uma distribuição filogenômica dos membros da superfamília da proteína alfa-actinina em linhagens eucarióticas selecionadas. O número de repetições de espectrina do domínio de bastão é especificado em parênteses. Os membros dos introns de fase 0 abrigam a superfamília da distroplaquina na posição HMM 46, ao passo que as proteínas da família da alfa- actinina e espectrina carecem da conservação de um intron de fase 0 nesta posição. A expansão dirigida pelo intron HMM 46 do ortólogo MACF1 ancestral é observada entre fungos e Placozoos. O ortólogo MACF1 ancestral sofreu uma duplicação de gene parcial que doou um domínio de ligação de actina de terminal N e um domínio de bastão completo para um ortólogo de distrofina WW-EF-ZZ ancestral.

[0024] A FIG. 7A até FIG. 7F mostram que a transdução generalizada restaura o Complexo de Proteína Associada com a Distrofina, impede a degeneração da miofibra, normaliza o nível de CK sérico e melhora a função muscular em camundongos mdx tratados com AAV9-µUtrofina. Como mostrado na FIG. 7A, o imunotingimento de músculo do membro representativo quanto aos epítopos compartilhados pela Utrofina nativa e recombinante (Utro_N), quanto a epítopos únicos para a Utrofina nativa (Utro_C), -sarcoglicano, cadeia pesada da miosina embrionária (eMHC) e laminina; barra de escala 25 m. A FIG. 7B provê H&E de músculos de membro representativos mostrando a supressão de mionecrose e infiltração celular mononuclear; barra de escala 100 m. A FIG. 7C provê a análise de western blot detectando a expressão de utrofina recombinante (AAV9-µUtro) e -

sarcoglicano (-sarc). A FIG. 7D provê a porcentagem de miofibras centralmente nucleadas (CNF), medidas estatísticas como definido em métodos (Cor = animal distinto, formato = músculo distinto, mesma cor/formato = réplica técnica). A FIG. 9E provê medição de níveis CK séricos em camundongos tratados (n = 5), camundongos não tratados (n = 12) (***p<0,0001) e N.S. do tipo selvagem (n = 7). A FIG. 7F provê a quantificação da atividade vertical uma hora após a força de aderência em camundongos tratados (n=8), camundongos mdx não tratados (n = 11) e camundongos tipo selvagem (n = 6). As barras de erro representam SD, **p<0,001; N.S indica não significante; significância estatística foi avaliada pelo teste de Kruskal- Wallis com comparação de grupo múltiplo.

[0025] A FIG. 8A até FIG. 8G mostram que a distribuição sistêmica de AAV9- µUtrofina em cães GRMD em 7 semanas de idade impede a mionecrose e resultas na redução rápida de níveis séricos de CK. FIG. 8A provê um cronograma experimental. A FIG. 8B provê H&E representativa dos músculos vastus lateralis e temporalis mostrando fibras mionecróticas abundantes e infiltração de célula mononuclear em músculo não tratado, enquanto que os músculos tratados se assemelham ao tipo selvagem. A FIG. 8C provê tingimento com Vermelho de Alizarina S mostrando fibras calcificadas indicando degeneração muscular (painel esquerdo, vermelho), com quantificação correspondente (FIG. 8E). A FIG. 10D provê tingimento imunofluorescente com f1,652 mostrando grupo de fibras positivas em eMHC (painel direito, vermelho), com quantificação correspondente (FIG. 8F). A FIG. 8G provê níveis séricos de creatina cinase (CK) em vários pontos de tempo pré/pós infusão de AAV9-µUtrofina sistêmica. Barra de escala 100 m.

[0026] A FIG. 9A até a FIG. 9D mostram que a expressão generalizada de µUtrofina resgata as proteínas do complexo de proteína associado com distrofina em cães GRMD tratados depois da distribuição sistêmica na idade de 7 semanas. A FIG. 9A e FIG. 9B proveem tingimento imunofluorescente de músculo de membro representativo. A FIG. 9A mostra Utrofina nativa e recombinante (Utro_N), Utrofina nativa (Utro_C), laminina. A FIG. 9B mostra β-distroglicano (verde), β-sarcoglicano (verde) e γ-sarcoglicano (vermelho). Barra de escala 100 m. A FIG. 9C mostra uma análise de western blot mostrando a biodistribuição generalizada de Utrofina (~135 kD) em músculo estriado na necrópsia. A FIG. 9D mostra uma análise de western blot mostrando a expressão de β-distroglicano em biópsias musculares de Vastus Lateralis (VL) e cranial sartorius (CS). Tratado (H)/ Tratado (B) indica tecido de cães tratados dogs, Hann e Beetle.

[0027] A FIG. 10A até FIG. 10D mostram que a expressão focal de μDistrofina, mas não μUtrofina evoca uma resposta imune periférica e local detectável em um modelo de cão delecional-nulo de distrofina. A FIG. 10A provê uma cronometragem experimental. Os cães delecionais-nulos em Distrofina (Grinch e Ned) cada um recebeu injeções IM de AAV9-μDistrofina (Direito) e AAV9-μUtrofina (Esquerdo) em doses equivalentes (1x1012vg/kg) nos seus compartimentos tibiais anteriores. Como mostrado na FIG. 10B, as PBMCs foram coletadas pré-, 2, 4, 6, 8 semanas após a injeção e cultivadas com peptídeos sintéticos transpondo as sequências de peptídeo de μDistrofina inteira (Reunião A-D) e μUtrofina (Reunião E-J), enquanto que peptídeos de vacina e PMA/Ion serviram como controles positivos. Um resultado positivo foi interpretado como ≥ 5 unidades formando mancha (SFU)/1E5 de PBMCs (linha pontilhada). A FIG. 10C mostra tingimento imunofluorescente (verde) de biópsias musculares coletadas 4 semanas após a injeção contra Utro N (fileira de topo) e distrofina (fileira de fundo). Inserto com borda vermelha – para referência, aparência de músculo normal tingido de verde para distrofina. A FIG. 10D mostra H&E representativo de biópsias musculares coletadas 4 semanas após a injeção

[0028] A FIG. 11 provê uma vista geral de micro-utrofina. O sítio de junção de deleção (junção de encaixe) é indicado. As dobradiças 1, 2 e 4 são rotuladas como H1, H2 e H4. SR1, SR2, SR3 e SR22 correspondem a TH1, TH3, TH3 e TH22 de uma utrofina completa.

[0029] A FIG. 12A até FIG. 12D proveem um esquema de um teste híbrido: monitoramento da atividade vertical e o teste de força de membro inteiro. A FIG. 12A provê um diagrama esquemático mostrando esta cronometragem experimental. A FIG. 12B mostra a quantificação da atividade vertical na gaiola cheia aberta entre camundongos c57 (n = 11) e mdx (n = 12) antes que o teste de força de membro inteiro não mostrasse nenhuma diferença significante entre camundongos c57 e mdx (P>0,05 teste de Mann-Whitney). A FIG. 12C mostra que o teste de força de membro inteiro foi conduzido em uma série de sete pulsos tanto para o camundongo c57 (n = 11) quanto para o mdx (n = 17). os camundongos c57 são indicados com um quadrado e os camundongos mdx são indicados com um círculo. A distribuição da força de membro inteiro para cada série de pulsos é demonstrada. As equações são representadas (P<0,0001, teste ANOVA de 2 vias). A FIG. 12D provê uma análise de pós-atividade vertical acumulativa por 1 h depois que o teste de força mostrou que haviam diferenças significantes entre os camundongos c57 e mdx (P<0,0001, ANOVA de 2 vias).

[0030] A FIG. 13 provê uma representação visual da atividade locomotora tanto dos camundongos c57 quanto dos mdx por 5 min antes do teste de força de membro inteiro (Pré), assim como nos primeiros 5 min e nos 5 min seguintes depois do teste de força. As linhas representam atividade horizontal e os pontos representam atividade vertical.

[0031] A FIG. 14A até FIG. 14G mostram que o rompimento sarcolemal agudo em miócitos agrupados de músculo esqueletal de hamster BIO 14,6 depois de contração forte. A FIG. 14A provê vista simultânea de corante azul de Evans e contratingimento de distrofina em fibras musculares 72 h depois da injeção i.v. de corante azul de Evans. Na FIG. 14B, como visualizado através de um filtro FITC, a ausência completa de tingimento com distrofina é evidente em todas as fibras positivas em azul de Evans na seção da FIG. 14A. A FIG. 14C mostra que a lesão de miócito leva à perda de distrofina na maioria das fibras positivas em azul de Evans dentro de 8 h de um surto único de corrida voluntária. A FIG. 14D mostra o músculo Tibialis anterior 3 h depois da contratura tetânica em uma taxa de estiramento de 0,75 estiramentos musculares por segundo. A lesão aguda é mostrada pela absorção do corante laranja de procion; o contratingimento de distrofina indica a ausência de desintegração completa de membrana e proteólise não específica nestas fibras. A FIG. 14E mostra o contratingimento de distrofina de criosseção muscular depois de 1 h de exercício na roda de corrida. A FIG. 14F mostra a fluorescência do corante azul de Evans na mesma seção como na FIG. 14E. A FIG. 14G provê o corante vermelho de Alizarin S de alguma região de criosseção serial. Ampliações originais: FIG. 14A, 14B e 14E a 14G, 100X; FIG. 14C e FIG. 14D, 200X.

[0032] A FIG. 15 provê uma análise de glicosilases complexas da proteína associada com distrofina, ligantes, superfamília da Actinina Espectrina, proteínas motoras e superfamília de titina-obsurina. Mais debate com referência a esta figura pode ser encontrado no Exemplo 3.

[0033] A FIG. 16A e FIG. 16B proveem um modelo de repetições helicoidais triplas adjacentes de utrofina humana usando padrões derivados de beta2-espectrina humana (3EDV, FIG. 16A) e plectina humana (5J1G). Mais detalhes podem ser encontrados no Exemplo 3.

[0034] A FIG. 17 provê uma vista geral de micro-Utrofina. Esta micro-Utrofina justapõe um domínio não estruturado, rico em prolina inter-helicoidal de “dobradiça-2” (H2) contra a última repetição helicoidal tripla, número 22 da Utrofina de tamanho completo. R1, R2, R3 e R22 corresponde a TH1, TH3, TH3 e TH22 de uma utrofina completa. Mais detalhes podem ser encontrados no Exemplo 3, Seção F.

[0035] A FIG. 18 provê o nível de expressão da micro-Utrofina otimizada como descrito no Exemplo 3.

[0036] A FIG. 19 mostra a expressão de μUtrofina robusta dependente da dose e a estabilização de níveis tipo selvagem de expressão de sarcoglicano no sarcolema seis semanas após a injeção nos cães GRMD como descrito no Exemplo 3.

[0037] A FIG. 20 mostra a resposta de célula T específica de μUtrofina em cães GRMD injetados como debatido nos Exemplos 2 e 3. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) coletadas em 5 e 8 semanas após a injeção foram cultivadas com três agrupamentos de peptídeos sintéticos correspondendo ao capsídeo de AAV9 (A, B e C) assim como cinco agrupamentos de peptídeos sintéticos transpondo a sequência de peptídeo da μUtrofina inteira (A-B, C-D, E-F, G-H, I-J). A produção de γ-interferon foi avaliada contando-se as unidades formadoras de mancha por milhões de PBMCs, sem nenhuma resposta acima do fundo contra o capsídeo de AAV9 ou agrupamentos de peptídeo derivado de utrofina em cães injetados. Direita inferior, ensaio de controle a seguir da injeção de Adenovírus-CMV-lacZ, mostrando resposta positiva (asterisco) aos agrupamentos de peptídeo tanto de Had5 (1-4) quanto de lacZ (5-8) com base na interpretação mais conservativa de um resultado positivo (linha pontilhada).

[0038] A FIG. 21 mostra uma faixa de 79 kd nos músculos suportando carga de camundongos mdx injetados com AAV-μ-U como debatido no Exemplo 3, Seção G. Linhas 1, 2 e 4: músculos não suportando carga (por exemplo, flexores); 3, 5 e 7: músculos suportando carga (por exemplo, extensores); 6 fígado; 8 músculo de mdx injetado com PBS; 9, marcador de peso molecular.

[0039] A FIG. 22 mostra uma combinação de western blotting, purificação por imunoafinidade e LC/MS-MS identificando um fragmento de 79 kd como a porção de terminal N de micro-utrofina. A caixa abrange a sequência PPPPP, uma porção da “Dobradiça 2” imediatamente a montante da junção delecional, como mostrado.

[0040] A FIG. 23 mostra que o domínio SH3 faz contatos múltiplos de alta afinidade com cadeias laterais de aminoácido compatíveis a partir de hélices triplas adjacentes em ambos os lados, uma configuração com o potencial para transmitir forças longitudinais e resistir ao desdobramento.

[0041] A FIG. 24A até FIG. 24C mostram que Anc80 alcança uma biodistribuição global de micro-utrofina comparável àquela de AAV9 neste contexto, com transdução forte de músculo cardíaco e esqueletal (ver microfotografias na FIG. 24A e FIG. 24B e western blots na FIG. 24C) como debatido no Exemplo 3.

[0042] A FIG. 25 mostra uma comparação qualitativa de AAV9 e Anc80 para a biodistribuição de μUtrofina em grupos de camundongos mdx a seguir da administração sistêmica destes vetores em doses iguais de 2,5 x 1012 vg/camundongo. Os western blots representativos de músculos múltiplos de dois camundongos para cada vetor são mostrados, demonstrando transdução generalizada e eficiente de músculos estriados com ambos os vetores. A faixa mais elevada é μUtrofina, como rotulada com um anticorpo policlonal que especificamente reconhece um epítopo correspondendo ao terminal N da proteína. O controle de carga de amostra é a faixa mais baixa rotulada com um anticorpo para a proteína vinculina. Músculos estriados representados: Diafragma, Tríceps, Quadríceps, Gastrocnêmio, Parede abdominal, Pectoralis, Tibialis Anterior, Cardíaco.

[0043] A FIG. 26A e FIG. 26B mostram que AAV9-μUtrofina elimina MuRF-1(+), TUNEL (+) e miofibras centralmente nucleadas e no músculo de camundongo mdx. Na FIG. 26A, as imagens como rotuladas são representativas de camundongos mdx de 8 semanas de idade injetados como neonatos com AAV9μU ou PBS. O tingimento histológico com MuRF-1 e TUNEL serve como biomarcador para a proteólise ativa e apoptose respectivamente. A FIG. 26B provê uma Tabela resumindo a média e o desvio padrão de miofibras centralmente nucleadas, MuRF-1, TUNEL e miofibras embrionárias positivas em mdx tratado com PBS, mdx tratado com AAV9-μUtrofina e grupo c57 tipo selvagem tratado com PBS (n = 3). A nucleação central nas fibras musculares de mdx é indicativa de pelo menos um episódio anterior de necrose seguido pela regeneração conforme os camundongos mdx atingiram 8 semanas de idade.

[0044] A FIG. 27 provê que o crescimento normal de cães GRMD randomizados para AAV9-μUtrofina como evidência contra miosite imunomediada. Os pesos individuais de cães randomizados para as doses mais altas (1 x 1013,5 vg/kg) de AAV9 – cU (μ−Utrofina canina) sem imunossupressão, assim como controles relevantes incluindo filhotes da mesma ninhada randomizadas para PBS e outras fêmeas carreando filhotes da mesma ninhada e machos e fêmeas GRMD de ninhadas diferentes. Também são incluídos para comparação os pesos relevantes de fêmeas GRMD anteriormente relatadas recebendo AAV9 -- hD (μ−Distrofina humana) mostrando perda de peso rápida imediatamente antes da eutanásia e necropsia mostrando sinais de miosite sistêmica (Kornegay, J.N., et al., Widespread muscle expression of an AAV9 human mini-dystrophin vector after intravenous injection in neonatal dystrophin-deficient dogs. Mol Ther, 2010. 18(8): p. 1501-8.).

[0045] A FIG. 28 mostra um western blot de um estudo comparando a estabilidade de micro-utrofina e nano-utrofina in vivo. Camundongos Mdx foram injetados com vetores AAV codificando micro-utrofina ou nano-utrofina seguidos pela detecção da proteína (incluindo um subfragmento de terminal N de 79 kd) em tecido muscular.

[0046] A FIG. 29A e FIG. 29B mostram pontos de vista alternativos de uma rendição 3-D de uma repetição helicoidal híbrida mutante formada pela junção de TH 1 e TH 20 de distrofina completa. O encaixe na hélice antiparalela B é posicionada no plano com os resíduos W (amarelos) nas hélices A e C paralelas.

[0047] A FIG. 30A e FIG. 30B mostram pontos de vista alternados de uma rendição 3-D de uma repetição helicoidal híbrida mutante formada pela junção TH 1 e TH 18 da utrofina completa. O encaixe na hélice antiparalela B é posicionado no plano com os resíduos W (amarelo) nas hélices A e C paralela.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0048] As composições e métodos são providos para tratar Distrofia Muscular (MD), incluindo Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e Distrofia Muscular de Becker (BMD) e outras doenças relacionadas, por intermédio de uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina, uma sequência de ácido nucléico codificando a mesma ou um vetor compreendendo tal sequência de ácido nucléico.

[0049] Uma análise de evolução molecular não usual da distrofina e da sua família de supergene foi realizada, levando a uma mudança de paradigma. A análise dos inventores indicam que o papel primário da distrofina é aquele de um bastão forte, amarrado, não extensível, semelhante a “braço”, não um absorvedor de choque como anteriormente teorizado; que o seu comprimento é secundário em importância em relação à sua força; que a sua força depende, por todo o domínio de bastão que é responsável por 80% da estrutura primária da proteína, sobre a interação de aminoácidos nos limites entre as repetições “helicoidais triplas”, “semelhantes à espectrina” adjacentes; que a distrofina é apenas tão forte como a sua ligação mais fraca; que a evolução selecionou contra as deleções internas que enfraquece a proteína. Assim, de modo a encurtar, sem enfraquecer a proteína, é cortar a sequência codificadora para o polipeptídeo em sítios múltiplos que podem ser alinhados na proteína dobrada através dos domínios helicoidais triplos centrais de maior conservação de sequência (por exemplo, na distrofina através do plano 2-dimensional que bifurca os resíduos de triptofano interagindo no núcleo hidrofóbico). Este é o elemento mais forte nos Modelos Ocultos de Markov para todas as repetições helicoidais triplas como espectrina e se aplica à maior parte das repetições de distrofina, utrofina e as espectroplaquinas (MACF, distonina, etc.) I. Distrofina, utrofina e outros.

[0050] Como aqui usado, uma proteína da superfamília da distrofina se refere a uma proteína compreendendo um domínio “semelhante à espectrina” e “semelhante à bastão” que consiste de três hélices α e ocorre como cópias únicas ou arranjos in tandem de repetições múltiplas na proteína, tal como distrofina, utrofina, alfa-actinina, alfa-espectrina, beta-espectrina ou outros membros da família da espectrina, plaquinas, espectraplaquinas (isto é, espectroplaquinas). O domínio de três hélices α compreende duas hélices α similares (Hélices A e C) e uma opostamente direcionada (Hélice B) unidas pelos ligadores não helicoidais. Vários resíduos aromáticos no núcleo hidrofóbico do domínio são tipicamente conservados. Ver, por exemplo, Parry DA et al. Analysis of the three-alpha-helix motif in the spectrin superfamily of proteins. Biophys J. abril de 1992; 61(4): 858-67; e Djinovic-Carugo K et al, The espectrin repeat: a structural platform for cytoskeletal protein assemblies. FEBS Lett. 20 de fevereiro de 2002; 513(1): 119-23. Os exemplos de tais repetições podem ser encontrados nas FIGs 2A a 2E. Em certas modalidades, a proteína da superfamília da distrofina completa se refere a uma proteína da superfamília da distrofina ou uma isoforma do mesmo, que pode existir em um controle saudável. Em certas modalidades, a proteína da superfamília da distrofina completa se refere à proteína da superfamília da distrofina ou uma isoforma da mesma considerada como uma sequência canônica por uma pessoa versada na técnica. Tais sequências canônicas estão disponíveis, por exemplo, em www.uniprot.org.

[0051] A espectrina é uma proteína citoesqueletal que alinha o lado intracelular da membrana plasmática nas células eucarióticas. A espectrina forma arranjos pentagonais ou hexagonais, formando uma armação e desempenhando um papel importante na manutenção da integridade da membrana plasmática e estrutura citoesqueletal. Ver, por exemplo, Huh GY et al, Calpain proteolysis of alpha II-spectrin in the normal adult human brain. Neurosci Lett. 4 de dezembro de 2001; 316(1): 41-4. As proteínas nesta superfamília podem ser definidas por dois traços: (1) um domínio de ligação de actina de terminal N; e (2) uma seção de repetições de espectrina de hélice α. ver, por exemplo, Röper K et al. As ‘espectraplaquinas’: gigantes citoesqueletais com características tanto da família da espectrina quanto da plaquina. J Cell Sci. 15 de novembro de 2002; 115(Pt 22): 4215-25. Os membros da superfamília da espectrina incluem mas não são limitados à alfa-actinina (por exemplo, alfa-actina- 1, ver, por exemplo, UniProtKB - P12814 e www.genecards.org/cgi- bin/carddisp.pl?gene=ACTN1; alfa-actina-2, ver, por exemplo, UniProtKB - P35609 e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ACTN2; alfa-actina-3, ver, por exemplo, UniProtKB - Q08043 e www.genecards.org/cgi- bin/carddisp.pl?gene=ACTN3; e alfa-actina-4, ver, por exemplo, UniProtKB - O43707 e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ACTN4, cada uma das quais é aqui incorporada por sua totalidade), alfa-espectrina (por exemplo, cadeia alfa da espectrina, eritrocítica 1, ver, por exemplo, UniProtKB - P02549 e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SPTA1; e cadeia alfa da espectrina, não eritrocítica 1, ver, por exemplo, UniProtKB - Q13813 e www.genecards.org/cgi- bin/carddisp.pl?gene=SPTAN1, cada uma das quais é aqui incorporada em sua totalidade), beta-espectrina (por exemplo, cadeia beta da espectrina, eritrocítica, ver, por exemplo, UniProtKB - P11277 e www.genecards.org/cgi- bin/carddisp.pl?gene=SPTB; e cadeia beta da espectrina, não eritrocítica 1, ver, por exemplo, UniProtKB - Q01082 e www.genecards.org/cgi- bin/carddisp.pl?gene=SPTBN1, cada uma das quais é aqui incorporada em sua totalidade), distrofina e utrofina.

[0052] As plaquinas são proteínas citoligadoras que se associam com elementos citoesqueletais e complexos juncionais. Ver, por exemplo, Leung Cl et al. Plakins: a family of versatile cytolinker proteins. Trends Cell Biol. janeiro de 2002; 12(1): 37-45. Sete membros da família das plaquinas foram identificados: desmoplaquina (UniProtKB - P15924 e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=DSP, que, incluindo as sequências aí listadas, são aqui incluída em suas totalidades), plectina (UniProtKB - P15924 e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=PLEC, que, incluindo as sequências aí listadas, são aqui incluídas em suas totalidades), antígeno

1 de pênfigo bolhoso (BPAG1, Distonina) (UniProtKB - Q03001 e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=DST, que, incluindo as sequências aí listadas, são aqui incluídas em suas totalidades), fator de reticulação de microtúbulo– actina (MACF) (UniProtKB - Q9UPN3 e www.genecards.org/cgi- bin/carddisp.pl?gene=MACF1, que, incluindo as sequências aí listadas, são aqui incluídas em suas totalidades), envoplaquina (UniProtKB - Q92817 e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=EVPL, que, incluindo as sequências aí listadas, são aqui incluídas em suas totalidades), periplaquina (UniProtKB - O60437 e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=PPL, que, incluindo as sequências aí listadas, são aqui incluídas em suas totalidades) e epiplaquina (UniProtKB - P58107 e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=EPPK1, que, incluindo as sequências aí listadas, são aqui incluídas em suas totalidades). Esta família de proteínas é definida pela presença de um domínio da plaquina e/ou um domínio de repetição da plaquina (PRD). Além destes dois domínios, as plaquinas também abrigam outros domínios que são comuns em alguns, mas nem todos membros: o domínio de ligação de actina (ABD), bastão espiralado, bastão contendo repetições de espectrina e domínio de ligação de microtúbulo.

[0053] As espectraplaquinas pertencem dentro das superfamílias tanto da espectrina quanto da plaquina e são proteínas intracelulares excepcionalmente longas que têm a rara capacidade para se ligar a todos os três elementos citoesqueletais: actina, microtúbulos e filamentos intermediários. As espectraplaquinas são criticamente importantes para a integridade e função de tecido, operando com elementos de citoesqueleto únicos assim como coordenando estes elementos. Ver, por exemplo, Röper K et al. como citado acima e Huelsmann S et al, Spectraplakins. Curr Biol. 14 de abril de 2014; 24(8): R307-8. doi: 10.1016/j.cub.2014,02.003. Membros das espectraplaquinas incluem, mas não são limitados a BPAG1 e MACF como descritos acima. A distrofina ancora a matriz extracelular ao citoesqueleto por intermédio de F-actina e é um ligante para distroglicano. O componente do complexo de glicoproteína associado com a distrofina acumula na junção neuromuscular (NMJ) e em uma variedade de sinapses nos sistemas nervosos periférico e central e tem uma função estrutural na estabilização do sarcolema.

O mesmo também está implicado nos eventos de sinalização e na transmissão sináptica.

Ver, por exemplo, www.uniprot.org/uniprot/P11532 e www.genecards.org/cgi- bin/carddisp.pl?gene=DMD&keywords=dystrophin.

Existem 10 isoformas de distrofina.

A isoforma 4 é considerada como a sequência canônica e tem uma sequência de aminoácido com identificador UniProtKB: P11532-1, que é aqui incorporado.

As outras isoformas incluindo isoforma 1 com identificador UniProtKB: P11532-2, isoforma 2 com identificador UniProtKB: P11532-3, isoforma 3 com identificador UniProtKB: P11532-4, isoforma 5 com identificador UniProtKB: P11532- 5, isoforma 6 com identificador UniProtKB: P11532-6, isoforma 7 com identificador UniProtKB: P11532-7, isoforma 8 com identificador UniProtKB: P11532-8, isoforma 9 com identificador UniProtKB: P11532-9 e isoforma 10 com identificador UniProtKB: P11532-10, a sequência de cada uma das isoformas é aqui incorporada.

O termo “distrofina completa” como aqui usado pode se referir a qualquer isoforma da distrofina.

Em certas modalidades, o termo “distrofina completa” se refere à isoforma 4 (Dp427). Homólogos de distrofina foram identificados em uma variedade de organismos, incluindo camundongo (UniProt P11531), rato (UniProt P11530) e cão (UniProt O97592). A sequência de ácido nucléico codificando Dp427 possível ou qualquer outra isoforma ou homólogo de distrofina estão publicamente disponíveis, ver, por exemplo, as Sequências de Referência NCBI: NM_000109,3, NM_004006,2, NM_004009,3, NM_004010,3, NM_004011,3, NM_004012,3, NM_004013,2, NM_004014,2, NM_004015,2, NM_004016.,2 NM_004017,2, NM_004018,2, NM_004019,2, NM_004020,3, NM_004021,2, NM_004022,2, NM_004023,2, NM_004007,2, XM_006724468,2, XM_006724469,3, XM_006724470,3, XM_006724473,2, XM_006724474,3, XM_006724475,2, XM_011545467,1, XM_011545468,2, XM_011545469,1, XM_017029328,1, XM_017029329,1, XM_017029330,1 e XM_017029331,1, cada uma das quais é aqui incorporada.

Sequência adicional codificando Dp427 ou qualquer outra isoforma ou homólogo de distrofina pode ser gerada por intermédio de ferramentas para a tradução reversa, por exemplo, www.ebi.ac.uk/Tools/st/, www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/,

www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_sixpack/, www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/ e www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranambig/. Além disso, as sequências codificadoras poderiam ser otimizadas no códon para a expressão em um sujeito, por exemplo, ser humano, camundongos, rato ou cão.

[0054] Dp427 tem 3685 aminoácidos no comprimento. Também, ver, por exemplo, US7892824B2 e GenBank: AAA53189,1. O terminal N 240 aminoácidos de Dp427 dobra em dois domínios de homologia da calponina (CH1&2) que tem a capacidade para ligação de alta afinidade aos filamentos de actina citoesqueletais. A região central de aproximadamente 340 a 3040 aminoácidos é composta de 24 domínios ligados em tandem identificáveis por Modelagem Oculta de Markov como hélices triplas (TH1-24) com homologia estrutural mensurável para repetições cristalizadas das proteínas tipo bastão espectrina e alfa-actinina. A região de 3057 a 3352 abrange uma região de multidomínio globular, modular (WW-EF-ZZ) com alta afinidade para o complexo que atravessa a membrana de proteínas centradas em torno do beta-distroglicano. A região extrema de terminal C de 3353 a 3685 tem aparentemente domínios de ligação de alta afinidade expansíveis para as proteínas distrobrevina e sintrofina. Dp427 foi modelada como uma proteína semelhante a bastão no córtex de miócitos estriados, ligados à borda mais estreita da F-actina citoesqueletal pelos domínios de homologia da calponina de terminal N e aos membros que atravessam a membrana do DGC pelos domínios WW-EF-ZZ do terminal C. O domínio de bastão central é composto de 24 domínios com homologia de baixo nível para as dobradiças de repetição helicoidais triplas 1 a 4. As deleções internas das repetições semelhantes à espectrina estão geralmente associadas com uma taxa mais lenta de progressão de doença, na doença alélica MD de Becker (BMD). Um desafio central para a terapia de gene para DMD é um substituto seguro, eficaz e durável para Dp427 na maioria dos miócitos esqueletais e cardíacos. Idealmente esta substituição corresponderia à funcionalidade de Dp427; existe a preocupação de que proteínas substancialmente menores do que 427 kd meramente converteriam DMD para um fenótipo BMD severo. Uma ilustração de Dp427 pode ser encontrada na FIG 1A. Os Modelos Ocultos de Markov podem ser executados por intermédio de métodos convencionais embora seus parâmetros possam ser ajustados por uma pessoa versada na técnica. Ver., por exemplo, en.wikipedia.org/wiki/Hidden_Markov_model. As deleções de 19 a 20 domínios TH contíguos e a região de 3353-3685 produz distrofinas miniaturizadas “de tamanho AAV” no sentido de que sequências codificadoras sintéticas para estas proteínas recombinantes estão dentro da capacidade de clonagem de vetores AAV. Todas de tais proteínas recombinantes compartilham domínios semelhantes a bastão 1/5o a 1/6o do comprimento do bastão na Dp427, aumentando as preocupações de que o encurtamento prejudica a capacidade das proteínas recombinantes para “absorver” tanto “choque” quanto a proteína completa de 24 repetições.

[0055] A utrofina é uma homologia substancial para a distrofina, com divergência significante ocorrendo no domínio de bastão, onde a utrofina carece das repetições 15 e 19 e de duas regiões de dobradiça (Ver por exemplo, Love et al., Nature 339: 55

[1989]; Winder et al., FEBS Lett., 369: 27 [1995]; www.uniprot.org/uniprot/P46939; e www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=UTRN&keywords=Utrophin). Quatro isoformas de utrofina foram verificadas. A Isoforma 1 é considerada como a sequência canônica e tem uma sequência de aminoácido com Identificador UniProt P46939-1, que é aqui incorporado. Outras isoformas incluem a Isoforma 2 com Identificador UniProt P46939-2; isoforma Up71 com Identificador UniProt P46939-3; e isoforma Up140 com Identificador UniProt P46939-4. A utrofina de comprimento completo pode se referir a qualquer isoforma da utrofina. Em certas modalidades, a utrofina completa se refere à isoforma da utrofina 1, que contém 22 repetições semelhantes à espectrina (SR1 a SR22 ou TH1 a TH22) e duas regiões de dobradiças. Homólogos de utrofina foram identificados em uma variedade de organismos, incluindo camundongo (número de acesso no Genbank Y12229 e UniProt E9Q6R7), rato (número de acesso no Genbank AJ002967 e UniProt G3V7L1) e cão (número de acesso no GenBank NW- 139836). A sequência de ácido nucléico destes ou homólogos adicionais pode ser comparada com a sequência de ácido nucléico da utrofina humana usando qualquer um dos métodos adequados. A sequência de ácido nucléico codificando a isoforma da utrofina 1 ou qualquer outra isoforma ou qualquer homólogo está disponível. Ver,

por exemplo, Sequência de referência NCBI: NM_007124,2, XM_005267127,4, XM_005267130,2, XM_005267133,2, XM_006715560,3, XM_011536101,2, XM_011536102,2, XM_011536106,2, XM_011536107,2, XM_011536109,2, XM_017011243,1, XM_017011244,1, XM_017011245,1; número de acesso no Genbank X69086 e número de acesso no GenBank AL357149, cada uma das quais é aqui incorporada. A sequência adicional codificando a isoforma da utrofina 1 ou qualquer outra isoforma ou qualquer homólogo pode ser gerada por intermédio de ferramentas para tradução reversa, por exemplo, www.ebi.ac.uk/Tools/st/, www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/, www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_sixpack/, www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/ e www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranambig/. Além disso, as sequências codificadoras poderiam ser otimizadas em códon para a expressão em um sujeito, por exemplo, ser humano, camundongos, rato ou cão.

[0056] Em um aspecto, é aqui provida uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina. Em uma modalidade, a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma deleção interna de repetições helicoidais múltiplas e um domínio helicoidal híbrido formado pelas porções de junção de repetições helicoidais da proteína da superfamília da distrofina completa. Em certas modalidades, a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina tem uma primeira hélice com uma porção de terminal N de uma hélice A fundida a uma porção de terminal C de uma hélice A’, uma segunda hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice B’ fundida a uma porção de terminal C de uma hélice B e uma terceira hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice C fundida a uma porção de terminal C of hélice C’, as hélices A, B e C estão presentes em uma primeira repetição helicoidal tripla e hélices A’, B’ e C’ estão presentes em um segundo domínio helicoidal triplo em uma proteína da superfamília da distrofina nativa. Em certas modalidades, o primeiro e segundo domínios helicoidais triplos não são adjacentes e, consequentemente, proveem uma proteína mutante da superfamília da distrofina tendo um domínio helicoidal triplo híbrido e uma deleção de 1 ou mais domínios helicoidais triplos presentes na proteína da superfamília da distrofina nativa. Assim, o número total das repetições helicoidais na proteína mutante de encaixe triplo é selecionado de qualquer número inteiro de 3 a 1 menos do que o número de repetições helicoidais da proteína da superfamília da distrofina completa, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 e 23. Em certas modalidades, são aqui providas proteínas da distrofina mutantes que têm deleções em pelo menos 3 repetições helicoidais a 21 repetições helicoidais na distrofina completa. Ainda em uma outra modalidade, a proteína mutante tem uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais a 23 na distrofina completa. Já em uma modalidade adicional, a proteína mutante tem uma deleção em pelo menos 2 repetições helicoidais a 19 repetições helicoidais na distrofina completa. Em certas modalidades, as proteínas da utrofina mutante são providas tendo uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais a 10 repetições helicoidais da distrofina completa. Em uma modalidade adicional, a utrofina mutante tem uma deleção em pelo menos 2 repetições helicoidais a 17 repetições helicoidais de utrofina de comprimento completo.

[0057] Como aqui usados, os termos “domínio helicoidal triplo”, “domínio de hélice tripla”, “repetição helicoidal tripla”, “repetição de hélice tripla” e “TH” são intercambiáveis e se referem à repetição semelhante a bastão e semelhante à espectrina de uma proteína da superfamília da distrofina consistindo de três hélices α, isto é, duas hélices α similarmente (Hélices A e C) e uma opostamente (Hélice B) direcionadas, unidas pelos ligadores não helicoidais. Estas repetições podem ser identificadas pelos Modelos Ocultos de Markov. Os exemplos de tais repetições podem ser encontrados na FIG. 2A até FIG. 2E. A repetição helicoidal tripla híbrida é formada por duas repetições helicoidais encaixadas no plano que bifurca as repetições helicoidais perpendiculares para o seu eixo longo. Tais planos são debatido adicionalmente abaixo e exemplificados nos Exemplos assim como na FIG. 2F. Uma ilustração da formação de tal repetição helicoidal tripla híbrida é provida na FIG. 1 com uma ilustração de um domínio híbrido de hélice tripla (também aqui indicado como uma repetição helicoidal tripla híbrida) apresentada na FIG. 1C e FIG. 1D. Como aqui usado, uma “junção de encaixe” indica uma posição em uma sequência de ácido nucléico, uma sequência de aminoácido ou uma proteína com estrutura secundária, terciária ou quaternária, onde a deleção interna começa ou termina na proteína da superfamília da distrofina completa ou em cada uma das duas repetições helicoidais triplas formando o domínio híbrido de hélice tripla; ou onde as sequências, as sequências correspondentes das quais na proteína completa não são imediatamente adjacentes entre si, mas são unidas no domínio híbrido de hélice tripla ou na proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina. O termo “imediatamente adjacente” significa que duas sequências, domínios ou repetições, não são separadas por nenhuma outra sequência, domínios ou repetições respectivamente. os termos “união,” “reunião,” ou qualquer uma de suas variações gramaticais indicam duas sequências, domínios ou repetições que se tornem imediatamente adjacentes. O termo “formar” ou qualquer uma de suas variações gramaticais se refere a juntar ou unir sequências. A correspondência de sequências ou posições nas sequências podem ser determinadas por um alinhamento de sequência ou pelo Modelo Oculto de Markov (HMM).

[0058] Como aqui usado, uma “porção de terminal N” se refere à sequência de aminoácido no lado do terminal amino da junção de encaixe para uma hélice selecionada. Em certas modalidades, a “porção de terminal N” de uma hélice selecionada se refere à sequência de aminoácido completa a partir do Met inicial até a última sequência de aminoácido antes (no lado do terminal N) da junção de encaixe. Em certas modalidades, podem haver substituições, deleções, truncagens e/ou inserções de aminoácido na porção de terminal N. Em certas modalidades, tais substituições são mudanças de aminoácido conservativas. Em certas modalidades, uma deleção, truncagem ou inserção é de um a cinco aminoácidos no comprimento que não afetem a dobra da hélice.

[0059] O termo uma “porção de terminal C” se refere à sequência de aminoácido no lado de terminal carbóxi da junção de encaixe para uma hélice selecionada. Em certas modalidades, a “porção de terminal C” de uma hélice selecionada se refere à sequência de aminoácido completa a partir da primeira sequência de aminoácido depois (no lado do terminal C) da junção de encaixe. Em certas modalidades, podem haver substituições, deleções, truncagens e/ou inserções de aminoácido no porção de terminal N. Em certas modalidades, tais substituições são mudanças de aminoácido conservativas. Em certas modalidades, uma deleção, truncação ou inserção é de um a cinco aminoácidos no comprimento que não afetem a dobra da hélice.

[0060] Por exemplo, em certas modalidades, os domínios helicoidais híbridos mutantes triplos têm três hélices de encaixe que são fomadas pela junção de segmentos de domínios helicoidais não adjacentes, em que cada hélice compreende uma porção de terminal N e uma porção de terminal C de uma hélice em uma repetição helicoidal de uma proteína da superfamília da distrofina nativa. Porque os domínios helicoidais triplos que são unidos para formar a junção mutante cada um tem hélices A e C parelelas e uma hélice B antiparalela, a porções de terminal N das hélices A e C na hélice tripla mutante são da mesma repetição helicoidal tripla na proteína da superfamília da distrofina nativa, enquanto que as porções de terminal C destas hélices são de uma outra repetição helicoidal tripla na proteína da superfamília da distrofina nativa. Como resultado do posicionamento da junção para formar o domínio helicoidal triplo mutante, as porções de terminal N e porções de terminal C podem ser de comprimentos variados, mas juntos formam uma hélice do domínio de hélice tripla mutante.

[0061] Um número ordinal, tal como “primeiro”, “segundo”, “terceiro”, “quarto” ou o termo “adicional” são usados por todo este relatório descritivo como termos de referência para distinguir entre várias formas e componentes das composições e métodos. A menos que especificado, se um número ordinal é usado para indicar uma TH, uma sequência de aminoácido ou uma sequência de ácido nucléico, tal número é contado a partir do terminal N para o terminal C em uma sequência de aminoácido ou uma proteína ou de 5’ para 3’ em uma sequência de ácido nucléico.

[0062] Como aqui usada, uma repetição de proteína seguida por um número se refere ao número de repetições entre todas as repetições em uma proteína de referência ou uma sequência de aminoácido de referência contando a partir do terminal N a menos que particularmente especificado. Por exemplo, o domínio de hélice tripla 2 se refere à TH2 ilustrada pela FIG. 1A. Quando a repetição e a sequência de referência são polinucleotídeos, o número das repetições é contado a partir da extremidade 5’ para a extremidades 3’ a menos que particularmente especificado.

[0063] Em certas modalidades, a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina compreende repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N, uma repetição helicoidal tripla híbrida e repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C. Em certas modalidades, a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina compreende uma repetição helicoidal tripla híbrida e repetições helicoidais de terminal C. O número total da(s) repetição(ões) helicoidal(is) na proteína mutante de encaixe triplo é selecionado de qualquer número inteiro de 3 a 1 menos do que o número de repetições helicoidais da proteína da superfamília da distrofina completa, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 e 23. Em certas modalidades, a(s) sequência(s) na proteína da superfamília da distrofina completa, que corresponde(m) à(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N na proteína mutante, está(ão) imediatamente adjacente(s) à sequência correspondendo à primeira das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida. Em certas modalidades, a(s) sequência(s) na proteína da superfamília da distrofina completa, que corresponde à(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C na proteína mutante, está imediatamente adjacente à sequência correspondendo à segunda das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida. Em uma modalidade adicional, a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N pode(m) compreender TH1, TH2, TH3, TH4, TH5, TH6, TH7, TH8, TH9, TH10, TH11, TH12, TH13, TH14, TH15, TH16, TH17, TH18 e TH19. Já em uma modalidade adicional, a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C pode(m) compreender TH1, TH2, TH3, TH4, TH5, TH6, TH7, TH8, TH9, TH10, TH11, TH12, TH13, TH14, TH15, TH16, TH17, TH18 e TH19, cada TH número da(s) qual(is) é contado a partir do terminal C. Adicionalmente, poderia haver apenas uma repetição helicoidal na proteína mutante em que as repetições helicoidais são o domínio híbrido de hélice tripla formado pelo domínio helicoidal 1 e o último domínio helicoidal da proteína da superfamília da distrofina completa. Além disso, poderia haver duas repetições helicoidais na proteína mutante. Tal proteína mutante com duas TH pode compreender 1 repetição helicoidal da proteína completa e um domínio híbrido de hélice tripla formado pelas 2 repetições helicoidais e a última das repetições helicoidais da proteína completa. em uma outra modalidade, a proteína mutante com duas TH pode compreender a última das repetições helicoidais na proteína completa e um domínio híbrido de hélice tripla formado por 1 repetição helicoidal e a segunda das últimas repetições helicoidais da proteína completa. Como aqui usado, os termos “proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina”, “proteína mutante de encaixe triplo” e “proteína mutante” são usados intercambiavelmente. Também, exceto na(s) junção(ões) de encaixe na repetição helicoidal tripla híbrida, as repetições e sequências na proteína mutante são imediatamente adjacentes às mesmas repetições e sequências respectivamente como são na proteína da superfamília da distrofina completa.

[0064] Em certas modalidades, a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina poderia ser truncada no terminal C, por exemplo, para qualquer número inteiro de 1 a 500 dos aminoácidos. Tal truncagem não compreende nenhuma repetição helicoidal tripla. Em certas modalidades, tal truncagem pode ocorrer em uma posição correspondendo a um começo ou um final de um exon da proteína da superfamília da distrofina completa.

[0065] Também é aqui provida uma sequência de ácido nucléico codificando a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina. Tal sequência codificadora pode ser gerada por intermédio de ferramentas para tradução reversa. Além disso, as sequências codificadoras poderiam ser otimizadas em códon para a expressão em um sujeito, por exemplo, ser humano, camundongos, rato ou cão.

[0066] Em uma modalidade, a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma distrofina mutante de encaixe triplo. Em uma modalidade adicional, a distrofina mutante de encaixe triplo compreende uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais para 21 repetições helicoidais da distrofina completa. Em uma outra modalidade, a distrofina mutante de encaixe triplo compreende uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais a 23 repetições helicoidais da distrofina completa. Ainda em uma outra modalidade, a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N da distrofina mutante compreende 1 repetição helicoidal na distrofina completa. A(s)

repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C da proteína mutante compreende 23 repetições helicoidais e 24 repetições helicoidais na distrofina completa.

Em uma modalidade adicional, as repetições helicoidais de terminal N da proteína mutante consistem de 1 repetição helicoidal na distrofina completa.

As repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem de 23 repetições helicoidais e 24 repetições helicoidais na distrofina completa.

A primeira das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida é 2 repetições helicoidais na distrofina completa.

A segunda das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida são 22 repetições helicoidais na distrofina completa.

Ainda em uma outra modalidade, a distrofina mutante de encaixe triplo compreende uma deleção em pelo menos 2 repetições helicoidais para 19 repetições helicoidais da proteína distrofina completa.

As repetições helicoidais de terminal C compreendem repetições helicoidais 21, 22, 23 e 24 na distrofina completa.

A primeira das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida é 1 repetição helicoidal na distrofina completa e a segunda das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida são 19 repetições helicoidais na distrofina completa.

Em certas modalidades, a distrofina mutante de encaixe triplo pode compreender adicionalmente de cerca do aminoácido (aa) 1 acerca do aa 338 da isoforma 4 da distrofina no terminal N.

Em certas modalidades, a distrofina mutante de encaixe triplo pode compreender ainda de cerca do aa 3041 acerca do aa 3352, cerca do aa 3041 acerca do aa 3054, cerca do aa 3041 acerca do aa 3056, cerca do aa 3041 acerca do aa 3057, cerca do aa 3041 acerca do aa 3088, cerca do aa 3041 acerca do aa 3408 ou cerca do aa 3041 acerca do aa 3685 da isoforma 4 da distrofina no terminal C.

Em certas modalidades, pode haver uma truncagem adicional desta sequência de terminal C não TH de uma distrofina mutante de encaixe triplo.

Como aqui usada, uma truncagem se refere a uma deleção de aminoácidos consecutivos partindo da extremidade de terminal C.

Em certas modalidades, tal truncagem pode ocorrer em uma posição correspondendo a um começo ou um final de um exon da distrofina completa.

Em certas modalidades, a truncagem pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 400, cerca de 500 ou cerca de 600 aa no comprimento. Também é aqui provida uma sequência de ácido nucléico codificando a distrofina mutante de encaixe triplo. Tal sequência codificadora pode ser gerada por intermédio de ferramentas para tradução reversa. Além disso, as sequências codificadoras poderiam ser otimizadas em códon para a expressão em um sujeito, por exemplo, ser humano, camundongos, rato ou cão.

[0067] Em uma modalidade, a distrofina tripla mutante é uma nanodistrofina (também indicada como n-distrofina) tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. Já em uma modalidade adicional, é provida uma sequência codificando a distrofina mutante de encaixe triplo tendo uma sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucléico codificando a SEQ ID NO: 1 é otimizada no códon para a expressão em um sujeito. Em uma modalidade adicional, a sequência de ácido nucléico codificando a SEQ ID NO: 1 é otimizada no códon para a expressão em ser humano. Ferramentas convencionais para a otimização de códon estão publicamente ou comercialmente disponíveis para uma pessoa versada na técnica. Ver, por exemplo, Fuglsang A (Otimizador de códon: uma ferramenta gratuita para a otimização em códon. Protein Expr Purif. Outubro de 2003; 31(2): 247-9,) www.genscript.com/codon-opt.html, www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart- gene-synthesis/geneoptimizer.html e www.idtdna.com/CodonOpt.

[0068] Ainda em uma outra modalidade, a distrofina tripla mutante é uma nano- distrofina tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 ou 18. Já em uma modalidade adicional, são aqui providas sequências de ácido nucléico codificando a distrofina mutante de encaixe triplo tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 ou 18. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucléico codificando a SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 é otimizada no códon para a expressão em um sujeito. Em uma modalidade adicional, a sequência de ácido nucléico codificando a SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 é otimizada no códon para a expressão em seres humanos.

[0069] Ainda em uma outra modalidade, a distrofina tripla mutante é uma nanodistrofina tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22.

[0070] O termo “sujeito” como aqui usado significa um animal mamífero macho ou fêmea, incluindo um ser humano, um animal veterinário ou de fazenda, um animal doméstico ou de estimação e animais normalmente usados para pesquisa clínica. Em uma modalidade, o sujeito destes métodos e composições é um ser humano. Em uma modalidade, o sujeito destes métodos e composições é um pré-natal, um recém- nascido, uma criancinha, um bebê, uma criança em idade pré-escolar, uma criança em idade escolar, um adolescente, um adulto jovem ou um adulto. Um ser humano recém-nascido se refere a um ser humano com uma idade de 0 a 12 meses; um bebê humano está com uma idade de 1 a 3 anos; uma criança humana em idade pré-escolar com uma idade de 3 a 5 anos; uma criança humana em idade escolar com uma idade de 5 a 12 anos; um adolescente humano com 12 a 18 anos de idade; um adulto jovem humano com uma idade de 18 a 21 anos; enquanto um adulto humano com uma idade além de 18 anos. Um “sujeito saudável” se refere a um sujeito sem uma doença. Como aqui usado, o termo “doença” pode se referir à DMD e/ou BMD. Em certas modalidades, o termo “doença” pode se referir a uma outra doença causada por uma proteína anormal da superfamília da distrofina. Em certas modalidades, “doença” se refere à doença de von Willebrand.

[0071] Em uma modalidade, a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma utrofina mutante de encaixe triplo e compreende uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais e 19 repetições helicoidais da utrofina completa. Em uma modalidade, a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N da proteína mutante compreende(m) 1 repetição helicoidal na utrofina completa. A(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C da proteína mutante compreende 21 repetições helicoidais e 22 repetições helicoidais na utrofina completa. Em uma modalidade adicional, as repetições helicoidais de terminal N da proteína mutante consiste de 1 repetição helicoidal na utrofina completa. As repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem de 21 repetições helicoidais e 22 repetições helicoidais na utrofina completa. A primeira das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida é 2 repetições helicoidais na utrofina completa. A segunda das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida é 20 repetições helicoidais na utrofina completa. Ainda em uma outra modalidade, a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma utrofina mutante de encaixe triplo e inclui uma deleção em pelo menos 2 repetições helicoidais a 17 repetições helicoidais da utrofina completa. As repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante incluem 19, 20, 21 e 22 repetições helicoidais na utrofina completa. A primeira das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida é 1 repetição helicoidal na utrofina completa e a segunda das duas repetições helicoidais que forma a repetição helicoidal tripla híbrida é 18 repetições helicoidais na utrofina completa. Em certas modalidades, a utrofina mutante de encaixe triplo pode compreendem ainda de cerca do aa 1 acerca do aa 311 da isoforma da utrofina 1 no terminal N. Em certas modalidades, a utrofina mutante de encaixe triplo pode compreender adicionalmente de cerca do aa 2797 acerca do 2811, de cerca do aa 2797 acerca do 2845, de cerca do aa 2797 acerca do 3124, de cerca do aa 2797 acerca do 3134, de cerca do aa 2797 acerca do 3165, de cerca do aa 2797 acerca do 3168 ou de cerca do aa 2797 acerca do 3433, da isoforma da utrofina 1 no terminal C. Em certas modalidades, pode haver uma truncagem adicional desta sequência não TH de terminal C de uma utrofina mutante de encaixe triplo. Em certas modalidades, tal truncagem pode ocorrer em uma posição correspondente a uma no começo ou uma no final de um exon da utrofina completa. Em certas modalidade, a truncagem pode ter 1, 2, 3, 4, 5, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 400, cerca de 500 ou cerca de 600 aa no comprimento. Também é aqui provida uma sequência de ácido nucléico codificando a utrofina mutante de encaixe triplo. Tal sequência codificadora pode ser gerada por intermédio de ferramentas para a tradução reversa. Além disso, as sequências codificadoras poderiam ser otimizadas em códon para a expressão em um sujeito, por exemplo, ser humano, camundongos, rato ou cão.

[0072] Em uma modalidade, a utrofina mutante tripla é uma nano-utrofina (também indicada como n-utrofina ou n-U com ou sem a marca de traço) compreendendo a sequência de aminoácido da: SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade adicional, é aqui provida uma sequência codificando a utrofina mutante de encaixe triplo e compreendendo uma sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades, a utrofina mutante tripla é uma nano-utrofina (também indicada como n- utrofina ou n-U com ou sem a marca de traço) tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade adicional, é aqui provida uma sequência codificando a SEQ ID NO: 5 e tendo uma sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de ácido nucléico de cerca de 95% acerca do 99% idêntica à SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, a utrofina mutante tripla é uma nano-utrofina tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade adicional, é aqui provida uma sequência codificando a SEQ ID NO: 7, e tendo uma sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de ácido nucléico de cerca de 95% acerca de 99% idêntica à SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucléico codificando as SEQ ID NOs: 3, 5 ou 7 é otimizada no códon para a expressão em um sujeito. Em certas modalidades, a utrofina mutante tripla é uma nano-utrofina tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade adicional, é aqui provida uma sequência codificando a SEQ ID NO: 20 e tendo uma sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 19 ou uma sequência de ácido nucléico de cerca de 95% acerca do 99% idêntica à SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucléico codificando as SEQ ID NOs: 3, 5, 7 ou 20 é otimizada no códon para a expressão em um sujeito. Em uma modalidade adicional, a sequência de ácido nucléico codificando as SEQ ID NOs: 3, 5, 7 ou 20 é otimizada no códon para a expressão em ser humano. Ainda em uma outra modalidade, a utrofina mutante tripla é uma nano-utrofina compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 21.

[0073] Em certas modalidades, esta divulgação inclui o aminoácido e todas as sequências de ácido nucléico sintéticas codificadoras tanto para a nano-utrofina humana quanto para a nanodistrofina humana retratando “triplamente encaixada”. Em certas modalidades, hélices triplas híbridas podem unir o meio da repetição helicoidal tripla 2 com aquele do terceiro a partir do último domínio de repetição helicoidal tripla

(#20 de 22 na utrofina, #22 de 24 na distrofina), dando um total de quatro domínios repetitivos em ambas as proteínas recombinantes como aqui descrito e ilustrado como traços das SEQ ID NOs: 1 e 3. Estas sequências de aminoácido definem as proteínas recombinantes de maior força que podem ser codificadas dentro da capacidade codificadora de um único genoma vetorial AAV. Ver a FIG. 4 e Exemplos 2 e 3.

[0074] Pouco foi conhecido da mecanobiologia da distrofina, mas estudos indiretos do papel fisiológico da proteína sugerem que o domínio de bastão da proteína pode ser carregado longitudinalmente durante a contração muscular. Os exemplos aqui apresentados proveem a primeira evidência direta para isto. Em comparações entre camundongos mdx jovens e esqueletalmente maduro (nulos em distrofina) expressando micro-utrofina, a análise de western blot com anticorpos direcionados contra o terminal N da proteína recombinante revela evidência para rompimento do bastão na posição da junção de encaixe única visto que os processos de maturação muscular e comutação da isoforma de miosina aumentam a carga mecânica através da membrana muscular. Isto fortemente sustenta a hipótese de que a força do domínio de bastão está comprometida na posição exata da junção de encaixe única. O princípio do esquema subjacente ao desenvolvimento de nano-utrofina e nanodistofina compensa quanto a este defeito anterior pela eliminação da justaposição de subdomínios incompatíveis do bastão. A. Junções de encaixe nas hélices

[0075] A repetição helicoidal tripla híbrida é formada por duas repetições helicoidais encaixadas no plano que bifurca as repetições helicoidais perpendiculares ao seu eixo longo como indicado na FIG. 1A até FIG. 1D e FIG. 2F. A escolha da junção de encaixe na hélice “B” antiparalela é derivada por meios indiretos. Apenas uma estrutura cristalina de raio X foi determinada para uma única repetição de uma hélice tripla de distrofina, TH1 (isto é nenhuma estrutura até o presente momento para TH2-24). As hélices triplas adjacentes de distrofina se sobrepõem mais do que aquelas da espectrina e alfa-actinina, estabilizando deste modo as hélices durante a portabilidade de carga longitudinal, podem parcialmente explicar a escassez de informação estrutural visto poder haver dificuldade na cristalização de subregiões do bastão. Não obstante, a conservação de resíduos de triptofano no centro do núcleo hidrofóbico provê “pontos de ancoragem” para dois dos três encaixes, aqueles nas hélices “A” e “C”. Observe por exemplo a proeminência de W na posição 16 no logotipo HMM mostrado na FIG. 3 (Wheeler et al., BMC Bioinformatics 2014). Todas as estruturas cristalinas foram analisadas quanto às repetições helicoidais triplas contendo os dois resíduos de triptofano influenciadores e usadas na análise HMMscan no portal da web HMMer para definir a probabilidade de que posições individuais dentro a hélice “B” corresponderia com o plano transversal bisseccionando os triptofanos (isto é, o plano que bifurca as repetições helicoidais perpendiculares ao seu eixo longo).

[0076] LQGEIEAHTDVY (terminal N para terminal C, uma sequência de aminoácido na distrofina de comprimento completo TH22)…QEDLEQEQV (terminal N para terminal C, uma sequência de aminoácido na distrofina de comprimento completo TH2) é a sequência circundando a junção de encaixe na hélice B (hélice 2, a segunda hélice das três hélices em uma TH) das duas TH da distrofina completa formando a TH híbrida na nanodistrofina. As letras sublinhadas E e Q indicam a junção de encaixe nas hélices B enquanto ambos de E e Q são preservados na TH híbrida resultante como ilustrado na SEQ ID NO: 1. Entretanto, seria entendido por uma pessoa versada na técnica que a distrofina mutante de encaixe triplo aqui usada pode ter uma junção de encaixe na hélice B outra que não entre EQ como indicado como um traço da SEQ ID NO: 1. Tal junção de encaixe pode estar no terminal N ou terminal C de qualquer aminoácido na hélice B como indicado em LQGEIEAHTDVY…QEDLEQEQV assim como FIG. 5 e as sequências de aminoácidos correspondentes das SEQ ID NOs: 13 a 18 ou uma outra posição correspondente de uma hélice B em uma outra TH. A correspondência das posições nas sequências pode ser determinada pelo alinhamento de sequência de aminoácido entre qualquer duas ou mais TH da distrofina ou o Modelo Oculto de Markov (HMM).

[0077] Similarmente, a utrofina mutante de encaixe triplo aqui usada pode ter uma junção de encaixe na hélice B entre HQ como indicado como um traço da SEQ ID NO: 3 ou pode estar no terminal N ou terminal C de qualquer aminoácido na Hélice B em

AEIDAHNDIFKS (terminal N para terminal C, uma sequência de aminoácido na utrofina de comprimento completo TH20)… DL EAEQVKV (terminal N para terminal C, uma sequência de aminoácido na utrofina de comprimento completo TH2) ou uma outra posição correspondente de uma hélice B em uma outra TH da utrofina. A correspondência de posições nas sequências pode ser determinada pelo alinhamento de sequência de aminoácido entre qualquer duas ou mais TH da utrofina ou pelo Modelo Oculto de Markov (HMM).

[0078] Em certas modalidades, a junção de encaixe nas Hélices A ou C (que são a hélice 1, isto é, a primeira hélice e hélice 3, isto é, a terceira hélice, das três hélices em uma repetição helicoidal tripla) pode estar em Triptofano (W) no núcleo do Modelo Oculto de Markov (HMM) e todas as estruturas cristalinas para as proteínas nesta superfamília. Em uma modalidade adicional, a junção de encaixe nas Hélices A ou C pode estar em uma posição que está a 1 aminoácido, 2 aminoácidos, 3 aminoácidos, 4 aminoácidos ou 5 aminoácidos da(s) W(s) para o lado do terminal C ou para o lado do terminal N da proteína. B. Sequência da nano-utrofina humana

[0079] As letras maiúsculas maiores nas sequências abaixo designam a porção idêntica à região de terminal N da utrofina humana completa. As letras maiúsculas menores designam a região idêntica à região de terminal C da utrofina humana de comprimento completo. W’s em itálicos correspondem aos resíduos de triptofano nas hélices “A” e “C” no núcleo do Modelo Oculto de Markov (HMM) e todas as estruturas cristalinas para as proteínas nesta superfamília, HQ em itálicos corresponde às posições dentro da superfamília HMM para a hélice “B” que flanqueia o plano hipotético de transecção como representado na FIG. 2F. As estruturas secundárias e terciárias previstas da proteína dobrada correspondem à TH híbrida representada na FIG. 4.

[0080] MAKYGEHEASPDNGQNEFSDIIKSRSDEHNDVQKKTFTKWINARFSKSG

KPPINDMFTDLKDGRKLLDLLEGLTGTSLPKERGSTRVHALNNVNRVLQVLHQNNV ELVNIGGTDIVDGNHKLTLGLLWSIILHWQVKDVMKDVMSDLQQTNSEKILLSWVRQ TTRPYSQVNVLNFTTSWTDGLAFNAVLHRHKPDLFSWDKVVKMSPIERLEHAFSKA QTYLGIEKLLDPEDVAVQLPDKKSIIMYLTSLFEVLPQQVTIDAIREVETLPRKYKKEC EEEAINIQSTAPEEEHESPRAETPSTVTEVDMDLDSYQIALEEVLTWLLSAEDTFQE QDDISDDVEEVKDQFATHEAFMMELTAHQSSVGSVLQAGNQLITQGTLSDEEEFEI QEQMTLLNARWEALRVESMDRQSRLHDVLMELQKKQLQQLSAWIQEAETTVNVLV DASHRENALQDSILARELKQQMQDIQAEIDAHQVKVNSLTHMVVIVDENSGESATAI LEDQLQKLGERWNDLKAKSASIRAHLEASAEKWNRLLMSLEELIKWLNMKDEELKK QMPIGGDVPALQLQYDHCKALRRELKEKEYSVLNAVDQARVFLADQPIEAPEEPRR NLQSKTELTPEERAQKIAKAMRKQSSEVKEKWESLNAVTSNWQKQVDKALEKLRD LQGAMDDLDADMKEAESVRNGWKPVGDLLIDSLQDHIEKIMAFREEIAPINFKVKTV NDLSSQLSPLDLHPSLKMSRQLDDLNMRWKLLQVSVDDRLKQLQEAHRDFGPSSQ HFLSTSVQLPWQRSISHNKVPYYINHQTQTTCWDHPKMTELFQSLADLNNVRFSAY RTAIKIRRLQKALCLDLLELSTTNEIFKQHKLNQNDQLLSVPDVINCLTTTYDGLEQM HKDLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGKIRVQSLKIGLMSLSKGLLEEKYRYLFKE VAGPTEMCDQRQLGLLLHDAIQIPRQLGEVAAFGGSNIEPSVRSCFQQNNNKPEISV

KEFIDWMHLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIVGFRYRSLKHFNY DVCQSCFFSGRTAKGHKLHYPMVEYCIPTTSGE (SEQ ID NO: 3)

[0081] Em certas modalidades, a nano-utrofina aqui provida compreende a seguinte sequência de aminoácido, que inclui uma das repetições de junção de mutação de encaixe triplo 2 e 20 na utrofina completa:

[0082] MAKYGEHEASPDNGQNEFSDIIKSRSDEHNDVQKKTFTKWINARFSKSG

KPPINDMFTDLKDGRKLLDLLEGLTGTSLPKERGSTRVHALNNVNRVLQVLHQNNV ELVNIGGTDIVDGNHKLTLGLLWSIILHWQVKDVMKDVMSDLQQTNSEKILLSWVRQ TTRPYSQVNVLNFTTSWTDGLAFNAVLHRHKPDLFSWDKVVKMSPIERLEHAFSKA QTYLGIEKLLDPEDVAVQLPDKKSIIMYLTSLFEVLPQQVTIDAIREVETLPRKYKKEC EEEAINIQSTAPEEEHESPRAETPSTVTEVDMDLDSYQIALEEVLTWLLSAEDTFQE QDDISDDVEEVKDQFATHEAFMMELTAHQSSVGSVLQAGNQLITQGTLSDEEEFEI QEQMTLLNARWEALRVESMDRQSRLHDVLMELQKKQLQQLSAWIQEAETTVNVLV DASHRENALQDSILARELKQQMQDIQAEIDAHQVKVNSLTHMVVIVDENSGESATAI LEDQLQKLGERWNDLKAKSASIRAHLEASAEKWNRLLMSLEELIKWLNMKDEELKK QMPIGGDVPALQLQYDHCKALRRELKEKEYSVLNAVDQARVFLADQPIEAPEEPRR NLQSKTELTPEERAQKIAKAMRKQSSEVKEKWESLNAVTSNWQKQVDKALEKLRD LQGAMDDLDADMKEAESVRNGWKPVGDLLIDSLQDHIEKIMAFREEIAPINFKVKTV NDLSSQLSPLDLHPSLKMSRQLDDLNMRWKLLQVSVDDRLKQLQEAHRDFGPSSQ HFLSTSVQLPWQRSISHNKVPYYINHQTQTTCWDHPKMTELFQSLADLNNVRFSAY RTAIKIRRLQKALCLDLLELSTTNEIFKQHKLNQNDQLLSVPDVINCLTTTYDGLEQM HKDLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGKIRVQSLKIGLMSLSKGLLEEKYRYLFKE VAGPTEMCDQRQLGLLLHDAIQIPRQLGEVAAFGGSNIEPSVRSCFQQNNNKPEISV KEFIDWMHLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIVGFRYRSLKHFNY

DVCQSCFFSGRTAKGHKLHYPMVEYCIPTTSGEDVRDFTKVLKNKFRSKKYFAKHP RLGYLPVQTVLEGDNLET (SEQ ID NO: 20)

[0083] O esquema detalhado da nano-utrofina para tratar restrições estruturais é aqui descrito. A análise filogênica sugere que a repetição helicoidal tripla ancestral existiu em uma proteína ortóloga para alfa-actinina, visto que esta é a única proteína nos proteossomas da maioria dos eucariotas de célula única para combinar com o consenso de espectrina. Conjuntos de treinamento incluindo alfa-actininas, alfa- e betaespectrinas e distroplaquinas criam HMMs para os quais os logos mostram conservação excepcional dos resíduos de triptofano. Nas estruturas cristalinas de alta resolução disponíveis, a posição das cadeias laterais e a interação aromática são altamente conservadas, como é a estrutura da terceira alfa hélice “B”. Nas sequências acima, observe as posições dos W’s sublinhados e os aminoácidos H e Q da hélice B. O rearranjo ou “junção” de sequências de polipeptídeo correspondendo a estes subdomínios é representado pelo tamanho da fonte diferente, com três sítios de descontinuidade focal correspondendo ao plano da seção ilustrada na FIG. 2F, criando um híbrido 3-D entre as repetições de utrofina 2 e 20.

[0084] Também é aqui provida uma nano-utrofina tendo cinco repetições helicoidais triplas semelhantes à espectrina, incluindo um domínio helicoidal triplo híbrido formado pela junção de TH 1 e 18 na proteína da utrofina humana completa. Em certas modalidades, a nano-utrofina tem a seguinte sequência:

[0085] MAKYGEHEASPDNGQNEFSDIIKSRSDEHNDVQKKTFTKWINARFSKSG

KPPINDMFTDLKDGRKLLDLLEGLTGTSLPKERGSTRVHALNNVNRVLQVLHQNNV ELVNIGGTDIVDGNHKLTLGLLWSIILHWQVKDVMKDVMSDLQQTNSEKILLSWVRQ TTRPYSQVNVLNFTTSWTDGLAFNAVLHRHKPDLFSWDKVVKMSPIERLEHAFSKA QTYLGIEKLLDPEDVAVQLPDKKSIIMYLTSLFEVLPQQVTIDAIREVETLPRKYKKEC EEEAINIQSTAPEEEHESPRAETPSTVTEVDMDLDSYQIALEEVLTWLVLIDQMLKSN IVTVGDVEEINKTVSRMKITKADLEQRQSSVGSVLQAGNQLITQGTLSDEEEFEIQEQ MTLLNARWDGTQHGVELRQQQLEDMIIDSLQWDDHREETEELMRKYEARLYILQQ ARRDPLTKQISDNQILLQELGPGDGIVMAFDNVLQKLLEEYGSDDTRNVKETTEYLK TSWINLKQSIADRQNALEAEWRTVQASRRDLENFLKWIQEAETTVNVLVDASHREN ALQDSILARELKQQMQDIQAEIDAHNDIFKSIDGNRQKMVKALGNSEEATMLQHRLD DMNQRWNDLKAKSASIRAHLEASAEKWNRLLMSLEELIKWLNMKDEELKKQMPIG GDVPALQLQYDHCKALRRELKEKEYSVLNAVDQARVFLADQPIEAPEEPRRNLQSK TELTPEERAQKIAKAMRKQSSEVKEKWESLNAVTSNWQKQVDKALEKLRDLQGAM DDLDADMKEAESVRNGWKPVGDLLIDSLQDHIEKIMAFREEIAPINFKVKTVNDLSS QLSPLDLHPSLKMSRQLDDLNMRWKLLQVSVDDRLKQLQEAHRDFGPSSQHFLST SVQLPWQRSISHNKVPYYINHQTQTTCWDHPKMTELFQSLADLNNVRFSAYRTAIKI RRLQKALCLDLLELSTTNEIFKQHKLNQNDQLLSVPDVINCLTTTYDGLEQMHKDLV NVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGKIRVQSLKIGLMSLSKGLLEEKYRYLFKEVAGPT EMCDQRQLGLLLHDAIQIPRQLGEVAAFGGSNIEPSVRSCFQQNNNKPEISVKEFID

WMHLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIVGFRYRSLKHFNYDVCQ SCFFSGRTAKGHKLHYPMVEYCIPTTSGE (SEQ ID NO: 21) C. Sequência da nanodistrofina humana:

[0086] As letras maiúsculas maiores abaixo designam a porção idêntica à região de terminal N da distrofina humana de comprimento completo. As letras maiúsculas menores designam região idêntica à região de terminal C da distrofina humana de comprimento completo. Os W’s sublinhados correspondem aos resíduos de triptofano nas hélices “A” e “C” no núcleo do Modelo Oculto de Markov (HMM) e todas as estruturas cristalinas para as proteínas nesta superfamília. Os EQ sublinhados correspondem às posições dentro da superfamília HMM para a hélice “B” que flanqueia o plano hipotético de transecção como representado na FIG. 2F. As estruturas secundárias e terciárias previstas da proteína dobrada correspondem à TH híbrida representada na FIG. 4.

[0087] MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDG

RRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNH KLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTS WSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDV DTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYS QQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFG SSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYM MDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEK QSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTEAETTANVLQDATRKERLLEDSKGVKELMKQ WQDLQGEIEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWS ELRKKSLNIRSHLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPAVQK QNDVHRAFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNV TRLLRKQAEEVNTEWEKLNLHSADWQRKIDETLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIK GSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNL STLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNK VPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLS LSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWL LNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHD SIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPV

LHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHY PMVEYCTPTTSGE (SEQ ID NO: 1).

[0088] Também é aqui provida uma nanodistrofina tendo cinco repetições helicoidais triplas semelhantes à espectrina, incluindo um domínio helicoidal triplo híbrido formado pela junção de TH 1 e 20 na distrofina humana completa. Em certas modalidades, a nano-utrofina tem a seguinte sequência:

[0089] MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDG

RRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNH KLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTS WSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDV DTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYS QQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFG SSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLSLLDQVIKSQRVMVGDLEDINEMIIKQKATMQD LEQRQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWDEVQEHLQNRRQ QLNEMLKDSTQWLEAKEEAEQVLGQARAKLESWKEGPYTVDAIQKKITETKQLAKD LRQWQTNVDVANDLALKLLRDYSADDTRKVHMITENINASWRSIHKRVSEREAALE ETHRLLQQFPLDLEKFLAWLTEAETTANVLQDATRKERLLEDSKGVKELMKQWQDL QGEIEAHTDVYHNLDENSQKILRSLEGSDDAVLLQRRLDNMNFKWSELRKKSLNIRS HLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPAVQKQNDVHRAFKR ELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNVTRLLRKQAEEV NTEWEKLNLHSADWQRKIDETLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLI DSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWK LLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTT CWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQH NLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGR IRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVA SFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAK

HQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTS GE (SEQ ID NO: 22) D. Outros

[0090] Muitas proteínas de peso molecular alto têm domínios internos repetitivos. A distrofina exemplifica a grande classe de proteínas para as quais informação estrutural tridimensional limitada está disponível para os domínios internos repetitivos. Um método conceitualmente idêntico pode ser aplicável às outras doenças genéticas. Por exemplo, a doença de von Willebrand com coagulopatia herdada comum é causada pelas mutações na sequência codificadora de 8 quilobases para uma proteína com repetições múltiplas (“vWF”). Estudos recentemente publicados revelaram que a expressão transgênica da proteína recombinante no fígado é suficiente para tratar a doença, mas a sequência codificadora é muito grande para um único genoma AAV e transjunção entre dois genomas AAV é muito ineficiente para alcançar níveis terapêuticos de expressão da proteína recombinante. Não há estrutura cristalina para a proteína inteira, mas a análise pelos métodos aqui esboçados imediatamente sugere oportunidades para criar uma proteína nanovWF miniaturizada que pode substituir a vWF de comprimento completo.

[0091] A doença de von Willebrand é tipicamente uma doença herdada causada pelas variações (mutações) no gene VWF. O gene VWF provê instruções para fabricar uma proteína de coagulo sanguíneo chamada de fator de von Willebrand, que é importante para formar coágulos sanguíneos e impedir perda de sangue adicional depois de uma lesão. Se o fator de von Willebrand não funciona normalmente ou muito pouco da proteína está disponível, os coágulos sanguíneos não podem se formar corretamente. As mutações no gene VWF que reduzem a quantidade de fator de von Willebrand ou fazem com que a proteína funcione de anormalmente (ou de modo algum) são responsáveis pelos sinais e sintomas associados com a condição. Estas variações podem ser herdadas em uma maneira autossômica dominante ou autossômica recessiva ou podem ocorrer pela primeira vez na pessoa afetada sem qualquer outro caso na família (conhecida como uma mutação nova). Ver, por exemplo, ghr.nlm.nih.gov/condition/von-willebrand-disease. Seria entendido por uma pessoa versada na técnica que, qualquer composição, regime, aspecto, modalidade e método aqui descritos através do Relatório descritivo é intencionado estar aplicado à doença de von Willebrand, um fator de von Willebrand mutante, uma sequência de ácido nucléico codificando um fator de von Willebrand mutante ou um vetor compreendendo tal sequência codificadora.

[0092] O fator de Von Willebrand (vWF) é importante na manutenção da hemostase. O mesmo promove a adesão das plaquetas aos sítios de lesão vascular pela formação de uma ponte molecular entre a matriz de colágeno subendotelial e o complexo receptor superficial de plaquetas GPIb-IX-V. O mesmo também atua como uma chaperona para o fator de coagulação VIII, levando o mesmo para o sítio de lesão, estabilizando a sua estrutura heterodimérica e protegendo o mesmo da depuração prematura do plasma. Existem 2 isoformas do fator de von Willebrand. A isoforma 1 é considerada como a sequência canônica e tem uma sequência de aminoácido com identificador UniProtKB: P04275-1, que é aqui incorporado. A outra isoforma é a isoforma 2 com identificador UniProtKB: P04275-2, a sequência da isoforma é aqui incorporada. vWF de “comprimento completo” pode se referir à isoforma 1. Em certas modalidades, vWF de “comprimento completo” pode se referir à isoforma 2 ou outros homólogos de vWF. Homólogos do fator de von Willebrand foram identificados em uma variedade de organismos, incluindo camundongo (UniProt Q8CIZ8), rato (UniProt Q62935), porco (UniProt Q28833) e cão (UniProt Q28295). A sequência de ácido nucléico possível codificando o fator de von Willebrand ou qualquer outra isoforma ou homólogo do mesmo está publicamente disponível, ver, por exemplo, as sequências de referência NCBI: NM_000552,4, X04385,1, M10321,1, X04146,1, AK128487,1, AK297600,1, AK292122,1,BC069030,1, BC022258,1, U81237,1, K03028,1, M17588,1, AF086470,1 e X02672,1, cada uma das quais é aqui incorporada.

[0093] Como aqui usado, “fator de von Willebrand mutante” ou “vWF mutante” se refere a um fator de von Willebrand tendo uma deleção interna de repetição(ões) e uma junção de encaixe unindo duas repetições, em que os sítios de junção de encaixe estão dentro de uma repetição ao invés de entre as repetições. Em certas modalidades, a junção de encaixe é determinada por intermédio de um método similar àquele de A. Junções de encaixe nas hélices, I, Distrofina, utrofina e outros ou de qualquer um dos Exemplos. A identificação ou caracterização da(s) repetição(ões) no vWF podem ser determinadas pelo Modelo Oculto de Markov (HMM) ou quaisquer outros métodos convencionais. Ver, por exemplo, Zhou YF et al. Sequence and structure relationships within von Willebrand factor. Blood. 12 de julho de 2012; 120(2): 449-58. doi: 10,1182/blood-2012-01-405134. Epub 6 de abril de 2012; Sadler JE. Biochemistry and genetics of von Willebrand factor. Annu Rev Biochem. 1998; 67: 395- 424; e Perkins SJ, et al. The secundary structure of the von Willebrand factor type A domain in factor B of human complement by Fourier transform infrared spectroscopy. Its ocorrerrence in collagen types VI, VII, XII e XIV, the integrins and others proteins by averaged structure predictions. J Mol Biol. 22 de abril de 1994; 238(1): 104-19. A sequência de ácido nucléico codificando vWF mutante pode ser gerada por intermédio de ferramentas para a tradução reversa. Além disso, as sequências codificadoras poderiam ser otimizadas no códon para a expressão em um sujeito, por exemplo, ser humano, camundongos, rato ou cão.

[0094] Deve ser entendido que qualquer composição aqui descrita é intencionada ser aplicada a outras composições, regimes, aspectos, modalidades e métodos descritos através do Relatório Descritivo. II. Cassete de Expressão

[0095] É aqui provido um cassete de expressão que compreende uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina sob o controle de sequências reguladoras que direcionam sua expressão.

[0096] Como aqui usado, o termo “expressão” ou “expressão de gene” se refere ao processo pelo qual a informação de um gene é usada na síntese de um produto de gene funcional. O produto de gene pode ser uma proteína, um peptídeo ou um polímero de ácido nucléico (tal como um RNA, um DNA ou um PNA). Em certas modalidades, o produto de gene funcional é uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina. Em certas modalidades, os termos “gene”, “minigene” e “transgene” se referem à sequência codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina, por exemplo, nanodistrofina ou nano-utrofina.

[0097] Como aqui usado, um “cassete de expressão” se refere a um polímero de ácido nucléico que compreende uma sequência codificadora, promotor e pode incluir outras sequências reguladoras para tal, cujo cassete pode ser empacotado dentro de um vetor.

[0098] Como aqui usado, o termo “sequência reguladora” ou “sequência de controle de expressão” se refere às sequências de ácido nucléico, tais como sequências iniciadoras, sequências realçadoras e sequências promotoras, que induzem, reprimem ou de outro modo controlam a transcrição das sequências de ácido nucléico codificando a proteína à qual estão operavelmente ligados.

[0099] Como aqui usado, o termo “operavelmente ligados” se refere tanto às sequências de controle de expressão que são contíguas com uma sequência codificadora quanto às sequências de controle de expressão que atuam em trans ou em uma distância para controlar a sequência codificadora. Em certas modalidades, a sequência codificadora codifica uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina.

[0100] O termo “heterólogo” quando usado com referência a uma proteína ou um ácido nucléico indica que a proteína ou o ácido nucléico compreende duas ou mais sequências ou subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucléico é tipicamente recombinantemente produzido, tendo duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostos para fabricar um novo ácido nucléico funcional. Por exemplo, em uma modalidade, o ácido nucléico tem um promotor de um gene arranjado para direcionar a expressão de uma sequência codificadora de um gene diferente. Assim, com referência à sequência codificadora, o promotor é heterólogo.

[0101] Identidade ou similaridade com respeito a uma sequência é aqui definida como a porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos (isto é, o mesmo resíduo) ou similar (isto é, resíduo de aminoácido do mesmo grupo com base nas propriedades de cadeia lateral comuns, ver abaixo) com as regiões de peptídeo e polipeptídeo aqui providas, depois alinhando as sequências e introduzindo intervalos, se necessário, para obter a identidade de sequência percentual máxima. A identidade percentual (%) é uma medida da relação entre dois polinucleotídeos ou dois polipeptídeos, como determinado comparando-se as suas sequências de nucleotídeo ou aminoácido, respectivamente. No geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. O alinhamento das duas sequências é examinado e o número de posições dando uma correspondência exata de aminoácido ou nucleotídeo entre as duas sequências determinado, dividido pelo comprimento total do alinhamento e multiplicado por 100 para dar uma figura de % de identidade. Esta figura de % de identidade pode ser determinada em relação ao comprimento inteiro das sequências a serem comparadas, que é particularmente adequado para as sequências do mesmo ou de comprimento muito similar e que são altamente homólogas ou em relação aos comprimentos mais curtos definidos, que é mais adequado para sequências de comprimento desigual ou que tenham um nível mais baixo de homologia. Existem vários algoritmos e programas de computado com base nisso, que estão disponíveis para serem usados na literatura e/ou publicamente ou comercialmente disponíveis para realizar alinhamentos e identidade percentual. A seleção do algoritmo ou programa não é uma limitação da presente invenção.

[0102] Os exemplos de programas de alinhamento adequados incluindo, por exemplo, o software CLUSTALW sob Unix e depois ser importado no programa Bioedit (Hall, T. A. 1999, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41: 95-98); o Clustal Omega disponível da EMBL-EBI (Sievers, Fabian, et al. “Fast, scalable generation of high‐ quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega”. Molecular systems biology 7.1 (2011): 539 e Goujon, Mickael, et al. “A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL–EBI.” Nucleic acids research 38. supl 2 (2010): W695-W699); o Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 9.1 (Devereux J. et al., Nucleic Acids Res., 12: 387-395, 1984, disponível da Genetics Computer Group, Madison, Wis., USA). Os programas BESTFIT e GAP, podem ser usados para determinar a % de identidade entre dois polinucleotídeos e a % de identidade entre duas sequências de polipeptídeo. Outros programas para determinar a identidade e/ou similaridade entre as sequências incluem, por exemplo, a família BLAST de programas disponível da National Center for Biotechnology Information (NCB), Bethesda, Md., USA e acessível através da home page da NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov), o programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamento de sequência GCG. Quando da utilização do programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usados; e FASTA (Pearson W. R. e Lipman D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448, 1988, disponível como parte do Pacote de Análise de Sequência Wisconsin). Software SeqWeb (uma interface com base na web para o Pacote GCG Wisconsin: programa Gap).

[0103] Em uma modalidade, o cassete de expressão é projetado para a expressão e secreção em um sujeito, por exemplo, ser humano, rato, camundongo ou cão. Em uma modalidade, o cassete de expressão é projetado para a expressão no músculo, incluindo músculos cardíacos, músculos esqueletais e músculos lisos.

[0104] Em certas modalidades, os elementos de controle reguladores incluem uma sequência promotora como parte das sequências de controle de expressão, por exemplo, localizada entre a sequência 5’ ITR selecionada e a sequência codificadora. Promotores constitutivos, promotores reguláveis [ver, por exemplo, WO 2011/126808 e WO 2013/04943], promotores específicos de tecido (ver, por exemplo, www.invivogen.com/tissue-specific-promoter) ou um promotor responsivo aos estímulos fisiológicos podem ser usados nos vetores aqui descritos. Em certas modalidade, o promotor específico de músculo pode ser usado, por exemplo, um promotor da creatinina cinase muscular (MCK), um promotor da Desmina, um promotor Mb ou um promotor para Miosin - polipeptídeo pesado 2, Miosina, Troponina T tipo 3, Troponina C tipo 2, proteína C de ligação da Miosina, cadeia leve da miosina esqueletal rápida 2, Actinina α2, proteína de membrana associada com vesícula 5, interagente do receptor do hormônio da tireóide 10, tropomiosina 3, Sarcoglicano γ, Diferenciação miogênica 1, Fator miogênico 6 (herculina) ou canal de cálcio, γ1 dependente de voltagem. Um outro promotor útil é um promotor SPc5-12 sintético, que permite a expressão robusta nos músculos esqueletais e cardíacos. (ver por exemplo, Rasowo et al, European Scientific Journal, junho de 2014, edição vol. 10, No. 18 e Publicações de Pedido de Patente US Nos. 20040192593 e 2017/0275649, todas das quais são aqui incorporadas por referência).

[0105] Em certas modalidades, os elementos de controle reguladores incluem um módulo regulador de ação cis cardíaco-específico (CS-CRM), que inclui qualquer um dos elementos CS-CRM 1-8. Em certas modalidades, as sequências reguladoras incluem o elemento CS-CRM4 ou o elemento CS-CRM4 em combinação com o promotor SPc5-12, tal como o promotor sintético quimérico CS-CRM4/SPc5-12 descrito anteriormente (Rincon et al. Genome-wide computational analysis reveals cardiomyocyte-specific transcriptional Cis-regulatory motifs that enable efficient cardiac gene therapy. Mol Ther. Janeiro de 2015; 23(1): 43-52), que é aqui incorporada por referência).

[0106] Os exemplos de promotores constitutivos adequados para controlar a expressão dos produtos terapêuticos incluem, mas não são limitados ao promotor da -actina de galinha (CB), promotor de citomegalovírus humano (CMV), promotor da ubiquitina C (UbC), os promotores precoce e tardio do vírus símio 40 (SV40), promotor U6, promotores de metalotioneína, promotor EFlα, promotor da ubiquitina, promotor da hipoxantina fosforribosil transferase (HPRT), promotor da diidrofoliato redutase (DHFR) (Scharfmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4626-4630 (1991), promotor da adenosina desaminase, promotor da fosfoglicerol cinase (PGK), promotor da piruvato cinase, promotor da fosfoglicerol mutase, o promotor da β-actina (Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989), as repetições de terminal longo (LTR) do Vírus da leucemia de Moloney e outros retrovírus, o promotor da timidina cinase do Vírus Simples do Herpes e outros promotores constitutivos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os exemplos de promotores específicos de tecido ou célula adequados para o uso na presente invenção incluem, mas não são limitados a endotelina-I (ET-I) e Flt-I, que são específicos para as células endoteliais, FoxJ1 (que alveja as células ciliadas).

[0107] Os promotores indutíveis adequados para controlar a expressão do produto terapêutico incluem promotores responsivos aos agentes exógenos (por exemplo, agentes farmacêuticos) ou para estímulos fisiológicos. Estes elementos de resposta incluem, mas não são limitados a um elemento de resposta de epoxia (HRE) que liga HIF-Iα e β, um elemento de resposta de íon metálico tal como descrito por Mayo et al. (1982, Cell 29: 99-108); Brinster et al. (1982, Nature 296: 39-42) e Searle et al. (1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1480-1489); ou um elemento de resposta de choque térmico tal como descrito por Nouer et al. (em: Heat Shock Response, ed. Nouer, L., CRC, Boca Raton, Fla., ppI67-220, 1991).

[0108] Em uma modalidade, a expressão da sequência codificadora é controlada por um promotor regulável que provê controle firme sobre a transcrição da sequência codificadora, por exemplo, um agente farmacológico ou fatores de transcrição ativados por um agente farmacológico ou em modalidades alternativas, estímulos fisiológicos. Os sistemas de promotor que não vazam e que podem ser firmemente controlados são preferidos. Os exemplos de promotores reguláveis que são complexos do fator de transcrição dependentes de ligante que podem ser usados na invenção incluem, sem limitação, membros da superfamília de receptor nuclear ativados pelos seus respectivos ligantes (por exemplo, glicocorticóide, estrogênio, progestina, retinóide, ecdissona e análogos e miméticos dos mesmos) e rTTA ativado pela tetraciclina. Em um aspecto da invenção, a comutação de gene é uma comutação de gene com base em EcR. Os exemplos de tais sistemas incluem, sem limitação, os sistemas descritos nas Patentes US Nos. 6.258.603, 7.045.315, Pedidos de Patente Publicados U.S. Nos. 2006/0014711, 2007/0161086 e Pedido Publicado Internacional U.S. No. WO 01/70816. Os exemplos de sistemas de receptor de ecdissona quimérico são descritos na Pat. U.S. No. 7.091.038, Pedidos de Patente Publicados U.S. Nos. 2002/0110861, 2004/0033600, 2004/0096942, 2005/0266457 e 2006/0100416 e Pedidos Publicados Internacionais U.S. Nos. WO 01/70816, WO 02/066612, WO 02/066613, WO 02/066614, WO 02/066615, WO 02/29075 e WO 2005/108617, cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade. Um exemplo de um sistema regulado por agonista de ecdissona não esteroidal é o Sistema de expressão Indutível de Mamífero RheoSwitch (New England Biolabs, Ipswich, MA).

[0109] Ainda outros sistemas de promotor podem incluir elementos de resposta incluindo, mas não são limitados a um elemento de resposta de tetraciclina (tet) (tal como descrito por Gossen & Bujard (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-551); ou um elemento de resposta hormonal tal como descrito por Lee et al. (1981, Nature 294: 228-232); Hynes et al. (1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2038-2042); Klock et al. (1987, Nature 329: 734-736); e Israel & Kaufman (1989, Nucl. Acids Res. 17: 2589-2604) e outros promotores indutíveis conhecidos na técnica. Usando tais promotores, a expressão do transgene pode ser controlada, por exemplo, pelo sistema Tet-on/off (Gossen et al., 1995, Science 268:1766-9; Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89(12): 5547-51); o sistema TetR-KRAB (Urrutia R., 2003, Genome Biol., 4(10):231; Deuschle U et al., 1995, Mol Cell Biol. (4): 1907-14); o sistema regulável por mifepristona (RU486) (Geneswitch; Wang Y et al., 1994, Proc. Natl.

Acad.

Sci.

USA., 91(17): 8180-4; Schillinger et al., 2005, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U S A,102(39): 13789-94); o sistema regulável tamoxifeno-dep humanizado (Roscilli et al., 2002, Mol.

Ther. 6(5): 653-63). A comutação de gene pode estar fundamentada na heterodimerização da ligação de proteína FK506 (FKBP) com proteína associada com a rapamicina FKBP (FRAP) e é regulada através da rapamicina ou seus análogos não imunossupressivos.

Os exemplos de tais sistemas, incluem, sem limitação, a Tecnologia Transcricional ARGENT® (ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, Mass.) e os sistemas descritos nas Pat.

U.S.

Nos. 6.015.709, 6.117.680, 6.479.653, 6.187.757 e 6.649.595, Publicação U.S.

No. 2002/0173474, Publicação U.S.

No. 200910100535, Patente U.S.

No. 5.834.266, Patente U.S.

No. 7.109.317, Patente U.S.

No. 7.485.441, Patente U.S.

No. 5.830.462, Patente U.S.

No. 5.869.337, Patente U.S.

No. 5.871.753, Patente U.S.

No. 6.011.018, Patente U.S.

No. 6.043.082, Patente U.S.

No. 6.046.047, Patente U.S.

No. 6.063.625, Patente U.S.

No. 6.140.120, Patente U.S.

No. 6.165.787, Patente U.S.

No. 6.972.193, Patente U.S.

No. 6.326.166, Patente U.S.

No. 7.008.780, Patente U.S.

No. 6.133.456, Patente U.S.

No. 6.150.527, Patente U.S.

No. 6.506.379, Patente U.S.

No. 6.258.823, Patente U.S.

No. 6.693.189, Patente U.S.

No. 6.127.521, Patente U.S.

No. 6.150.137, Patente U.S.

No. 6.464.974, Patente U.S.

No. 6.509.152, Patente U.S.

No. 6.015.709, Patente U.S.

No. 6.117.680, Patente U.S.

No. 6.479.653, Patente U.S.

No. 6.187.757, Patente U.S.

No. 6.649.595, Patente U.S.

No. 6.984.635, Patente U.S.

No. 7.067.526, Patente U.S.

No. 7.196.192, Patente U.S.

No. 6.476.200, Patente U.S.

No. 6.492.106, WO 94/18347, WO 96/20951, WO 96/06097, WO 97/31898, WO 96/41865, WO 98/02441, WO 95/33052, WO 99110508, WO 99110510, WO 99/36553, WO 99/41258, WO 01114387, ARGENT® Regulated Transcription Retrovirus Kit, Versão 2.0 (9109102) e ARGENT® Regulated Transcription Plasmid Kit, Versão 2.0 (9109/02), cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

O sistema Ariad é projetado para ser induzido pela rapamicina e análogos do mesmo aludidos como “rapalogs”. Os exemplos de rapamicinas adequadas são providas nos documentos listados acima na conexão com a descrição do sistema ARGENT.

Em uma modalidade, a molécula é rapamicina [por exemplo, comercializada como Rapamune pela Pfizer]. Em uma outra modalidade, um rapalog conhecido como AP21967 [ARIAD] é usado. Os exemplos destas moléculas dimerizadas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não são limitados a rapamicina, FK506, FK1012 (um homodímero de FK506), análogos de rapamicina (“rapalogs”) que são facilmente preparados pelas modificações químicas do produto natural para adicionar um “obstáculo” que reduz ou elimina a afinidade para FKBP e/ou FRAP endógenos. Os exemplos de rapalogs incluem, mas não são limitados a tais como AP26113 (Ariad), AP1510 (Amara, J.F., et al.,1997, Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10618-23) AP22660, AP22594, AP21370, AP22594, AP23054, AP1855, AP1856, AP1701, AP1861, AP1692 e AP1889, com projetado 'obstáculos' que minimiza interações com FKBP endógeno. Ainda outros rapalogs podem ser selecionados, por exemplo, AP23573 [Merck].

[0110] Outros realçadores adequados incluem aqueles que são apropriados para uma indicação de tecido alvo desejado. Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende um ou mais realçadores de expressão. Em uma modalidade, o cassete de expressão contém dois ou mais realçadores expressão. Estes realçadores podem ser os mesmos ou podem diferir um do outro. Por exemplo, um realçador pode incluir um realçador precoce imediato do CMV. Este realçador pode estar presente em duas cópias que estão localizadas adjacentes um do outro. Alternativamente, as cópias duplas do realçador podem ser separadas por uma ou mais sequências. Ainda em uma outra modalidade, o cassete de expressão contém adicionalmente um intron, por exemplo, o intron da beta-actina de galinha. Outros introns adequados incluem aqueles conhecidos na técnica, por exemplo, tais como são descritos na WO 2011/126808. Os exemplos de sequências poliAs adequadas incluem, por exemplo, globulina de ligação de coelho (rBG), SV40, SV50, hormônio do crescimento bovino (bGH), hormônio do crescimento humano e poliAs sintéticos. Opcionalmente, uma ou mais sequências podem ser selecionadas para estabilizar mRNA. Um exemplo de uma tal sequência é uma sequência WPRE modificada, que pode ser engenheirada a montante da sequência poliA e a jusante da sequência codificadora [ver, por exemplo, MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619. Em uma modalidade, o realçador é um realçador MCK duplo ou triplo em tandem.

[0111] Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende ainda um sinal de poliadenilação (poliA). Em uma modalidade adicional, o poliA é um poli A de globina de coelho. Ver, por exemplo, a WO 2014/151341. Alternativamente, um outro poliA, por exemplo, uma sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento humano (hGH), um poliA de SV40 ou um poliA sintético pode ser incluído em um cassete de expressão.

[0112] Deve ser entendido que as composições no cassete de expressão aqui descrito são intencionadas a serem aplicadas a outras composições, regimes, aspectos, modalidades e métodos descritos através do Relatório Descritivo. III. Vetores

[0113] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucléico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina é engenheirada em um vetor, incluindo um vetor viral e um vetor não viral.

[0114] Um “vetor” como aqui usado é uma porção biológica ou química compreendendo uma sequência de ácido nucléico que pode ser introduzida dentro de uma célula alvo apropriada para a replicação ou expressão da dita sequência de ácido nucléico. Os exemplos de um vetor incluem, mas não são limitados a um vírus recombinante, um plasmídeo, Lipoplexos, um Polimersoma, Poliplexos, um dendrímero, um conjugado de peptídeo penetrante de célula (CPP), uma partícula magnética ou uma nanopartícula. Tais vetores preferivelmente têm uma ou mais origens de replicação e um ou mais sítios dentro dos quais as sequências codificadoras ou um cassete de expressão pode ser inserido. Os vetores frequentemente têm meios pelos quais as células com vetores podem ser selecionadas daquelas sem, por exemplo, eles codificam genes da resistência a fármaco. Os vetores comuns incluem plasmídeos, genomas virais e “cromossomas artificiais”. Os métodos convencionais de geração, produção, caracterização ou quantificação dos vetores são disponíveis a uma pessoa versada na técnica.

[0115] Como aqui usado, o termo “célula hospedeira” pode se referir à linhagem de célula de empacotamento no qual um vetor (por exemplo, um AAV recombinante) é produzido. Uma célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica

(por exemplo, ser humano, inseto ou levedura) que contém DNA exógeno ou heterólogo que foi introduzido dentro da célula por quaisquer meios, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, microinjeção, transformação, infecção viral, transfecção, distribuição de lipossoma, técnicas de fusão de membrana, pelotas revestidas com DNA de alta velocidade, infecção viral e fusão de protoplasto. Os exemplos de células hospedeiras podem incluir, mas não são limitados a uma célula isolada, uma cultura de célula, uma célula de Escherichia coli, uma célula de levedura, uma célula humana, uma célula não humana, uma célula mamífera, uma célula não mamífera, uma célula de inseto, uma célula HEK-293, uma célula hepática, uma célula renal, uma célula muscular, uma célula de músculo liso, uma célula de músculo cardíaco ou uma célula de músculo esqueletal.

[0116] O termo “exógeno” como usado para descrever uma sequência de ácido nucléico ou proteína significa que o ácido nucléico ou proteína não ocorrem naturalmente na posição na qual os mesmos existem em um cromossoma ou célula hospedeira/alvo. Uma sequência de ácido nucléico exógena também se refere a uma sequência derivada da e inserida dentro da mesma célula hospedeira ou sujeito, mas que está presente em um estado não natural, por exemplo, um número de cópia diferente ou sob o controle de elementos reguladores diferentes.

[0117] Como aqui usado, o termo “célula alvo” se refere a qualquer célula alvo na qual a expressão da proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina é desejada. Em certas modalidades, o termo “célula alvo” é intencionado como referência às células do sujeito sendo tratado para MD, incluindo DMD e BMD. Os exemplos de células alvos podem incluir, mas não são limitados a uma célula hepática, uma célula renal, uma célula muscular, uma célula de músculo liso, uma célula de músculo cardíaco ou uma célula de músculo esqueletal. Em certas modalidades, o vetor é fornecido a uma célula alvo ex vivo. Em certas modalidades, o vetor é fornecido à célula alvo in vivo.

[0118] Um vetor não viral pode ser um plasmídeo carreando um cassete de expressão que inclui, em um mínimo, a sequência de ácido nucléico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina e opcionalmente, um promotor ou outros elementos reguladores, que são fornecidos para o coração. A distribuição não viral de moléculas de ácido nucléico para os sistemas de músculo liso e cardíaco pode incluir métodos químicos ou físicos. Os métodos químicos incluem o uso de lipossomas catiônicos (“lipoplex”), polímeros (“poliplex”), combinações dos dois (“lipopoliplex”), fosfato de cálcio e DEAE dextrano. Adicional ou opcionalmente, tais moléculas de ácido nucléico podem ser usadas em uma composição compreendendo adicionalmente um ou mais reagentes, incluindo, por exemplo, reagentes lipossômicos tais como, por exemplo, DOTAP/DOPE, Lipofectina, Lipofectamina, etc e polímeros catiônicos tais como PEI, Effecteno e dendrímeros. Tais reagentes são eficazes para transfectar células musculares lisas. Além dos métodos químicos, vários métodos físicos existem que promovem a entrada direcionada de DNA não complexado dentro da célula. Estes métodos podem incluir microinjeção de células individuais, hidroporação, eletroporação, ultrassom e distribuição biolística (isto é, a pistola de gene).

[0119] Em certas modalidades, um cassete de expressão compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina é carreado por um vetor viral, por exemplo, um adenovírus recombinante, lentivírus, um bocavírus, um híbrido AAV/bocavírus (ver, por exemplo, Yan Z et al, A novel chimeric adenoassociated virus 2/human bocavirus 1 parvovirus vector efficiently transduces human airway epithelia. Mol Ther. Dezembro de 2013; 21(12): 2181-94. doi: 10,1038/mt,2013,92. Epub 30 de julho de 2013), um vírus simples do herpes ou vírus adenoassociado. Em tais modalidades, o vetor viral pode ser um vírus defeituoso em replicação.

[0120] Um “vírus defeituoso em replicação” ou “ vetor viral” se referem a uma partícula viral sintética ou artificial na qual um genoma vetorial compreendendo um cassete de expressão é empacotado em um capsídeo ou envelope viral, onde qualquer sequência genômica viral também empacotada dentro do capsídeo ou envelope viral são deficientes em replicação; isto é, eles não podem gerar virions progênie mas retêm a capacidade para infectar células alvos. Em uma modalidade, o genoma do vetor viral não inclui genes codificando as enzimas requeridas para replicar

(o genoma pode ser engenheirado para ser “medroso” - contendo apenas o transgene de interesse flanqueado pelos sinais requeridos para a amplificação e empacotamento do genoma artificial), mas estes genes podem ser supridos durante a produção. Portanto, o mesmo é julgado seguro para o uso em terapia de gene visto que a replicação e infecção pelos virions progênie não pode ocorrer exceto na presença da enzima viral requerida para a replicação.

[0121] O vetor pode ser qualquer vetor conhecido na técnica ou divulgado acima, incluindo DNA nu, um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeos, epissomas, vírus, etc. a introdução dentro da célula hospedeira do vetor pode ser obtida por qualquer meio conhecido na técnica ou como divulgado acima, incluindo transfecção e infecção. Um ou mais dos genes adenovirais podem ser estavelmente integrados dentro do genoma da célula hospedeira, estavelmente expresso como epissomas ou expressos transitoriamente. Os produtos de gene podem todos ser expressos transitoriamente, em um epissoma ou estavelmente integrado ou um pouco dos produtos de gene pode ser expresso estavelmente enquanto outros são expressos transitoriamente. Além disso, os promotores para cada um dos genes adenovirais podem ser selecionados independentemente de um promotor constitutivo, um promotor indutível ou um promotor adenoviral nativo. Os promotores podem ser regulados por um estado fisiológico específico do organismo ou célula (isto é, pelo estado de diferenciação ou nas células replicantes ou quiescentes) ou pelos fatores exogenamente adicionados, por exemplo.

[0122] A introdução das moléculas (como plasmídeos ou vírus) dentro da célula hospedeira também pode ser realizada usando técnicas conhecidas pelo técnico versado e como debatido por todo o Relatório Descritivo. Em modalidades preferidas, técnicas de transfecção padrão são usadas, por exemplo, transfecção com CaPO4 ou eletroporação. A montagem das sequências de DNAs selecionadas do adenovírus (assim como o transgene e outros elementos vetoriais dentro de vários plasmídeos intermediários e o uso dos plasmídeos e vetores para produzir uma partícula viral recombinante são todos obtidos usando técnicas convencionais. Tais técnicas incluem técnicas de clonagem convencionais de cDNA tais como aquelas descritas nos textos

[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual], uso de sequências de oligonucleotídeo sobrepostas dos genomas adenovirais, reação em cadeia da polimerase e qualquer método adequado que proveja a sequência de nucleotídeo desejada. As técnicas padrão de transfecção e cotransfecção são utilizadas, por exemplo, técnicas de precipitação com CaPO4. Outros métodos convencionais utilizados incluem recombinação homóloga dos genomas virais, plaqueamento de vírus em camada de ágar, métodos de medir a geração de sinal e os semelhantes.

[0123] As dosagens do vetor viral dependerão primariamente de fatores tais como a condição sendo tratada, a idade, peso e saúde do paciente e pode assim variar entre pacientes. Por exemplo, uma dosagem humana adulta ou veterinária terapeuticamente eficaz do vetor viral está geralmente na faixa de cerca de 100 L acerca do 100 mL de um carreador contendo concentrações de cerca de 1 x 106 acerca do 1 x 1015 partículas, cerca de 1 x 1011 A 1 x 1013 partículas ou cerca de 1 x 109 A 1x 1012 partículas virais. As dosagens variarão dependendo do tamanho do animal e da via de administração. Por exemplo, uma dosagem humana ou veterinária adequada (para um animal com cerca de 80 kg) para a injeção intramuscular está na faixa de cerca de 1 x 109 acerca do 5 x 1012 partículas por mL, para um único sítio. Opcionalmente, sítios múltiplos de administração podem ser fornecidos. Em um outro exemplo, uma dosagem humana ou veterinária adequada pode estar na faixa de cerca de 1 x 1011 acerca do 1 x 1015 partículas para uma formulação. Uma pessoa versada na técnica pode ajustar estas doses, dependendo da via de administração e da aplicação terapêutica ou vacinal para a qual o vetor recombinante é utilizado. Os níveis de expressão do transgene podem ser monitorados para determinar a frequência de administração da dosagem. Já outros métodos para determinar a cronometragem da frequência de administração estarão facilmente evidentes para uma pessoa versada na técnica.

[0124] Como aqui usado, um “genoma vetorial” se refere à sequência de ácido nucléico empacotada dentro de um vetor. A. Vetor Adenoviral Defeituoso em Replicação

[0125] Em uma modalidade, vetores adenovirais defeituosos em replicação são usados. Qualquer um de vários adenovírus adequados pode ser usado como uma fonte da sequência de capsídeo adenoviral e/ou na produção. Ver, por exemplo, as Patentes US Nos. 9.617.561, 9.592.284, 9.133.483, 8.846.031, 8.603.459, 8.394.386,

8.105.574, 7.838.277, 7.344.872, 8.387.368, 6.365.394, 6.287.571, 6.281.010,

6.270.996, 6.261.551, 6.251.677, 6.203.975, 6.083.716, 6.019.978, 6.001.557,

5.872.154, 5.871.982, 5.856.152, 5.698.202. Ainda outros adenovírus estão disponíveis da American Type Culture Collection. Em uma modalidade, as partículas adenovirais são tornadas defeituosas em replicação pelas deleções nos genes E1a e/ou E1b. Alternativamente, os adenovírus são tornados defeituosos em replicação por um outro meio, opcionalmente enquanto retém os genes E1a e/ou E1b. Os vetores adenovirais também podem conter outras mutações para o genoma adenoviral, por exemplo, mutações ou deleções sensíveis à temperatura em outros genes. Em outras modalidades, é desejável reter uma região E1a e/ou E1b intacta nos vetores adenovirais. uma tal região E1 intacta pode estar localizada na sua localização nativa no genoma adenoviral ou colocada no sítio de uma deleção no genoma adenoviral nativo (por exemplo, na região E3).

[0126] Na construção de vetores adenovirais úteis para a distribuição de um gene para a célula humana (ou outro mamífero), uma faixa de sequências de ácidos nucléicos adenovirais pode ser utilizada nos vetores. Por exemplo, todo ou uma porção do gene adenoviral precoce retardado E3 podem ser eliminados da sequência adenoviral que forma uma parte do vírus recombinante. A função de E3 é acreditada ser irrelevante para a função e produção da partícula viral recombinante. Os vetores adenovirais também podem ser construídos tendo uma deleção pelo menos da região ORF6 do gene E4 e mais desejavelmente por causa da redundância na função desta região, a região E4 inteira. Ainda um outro vetor adenoviral contém uma deleção no gene precoce retardado E2a. As deleções também podem ser feitas em qualquer um dos genes tardios L1 a L5 do genoma adenoviral. Similarmente, deleções nos genes intermediários IX e IVa2 podem ser úteis para alguns propósitos. Outras deleções podem ser feitas nos outros genes de adenovírus estruturais ou não estruturais. As deleções debatidas acima podem ser usadas individualmente, isto é, uma sequência adenoviral para o uso como aqui descrito pode conter deleções apenas em uma única região. Alternativamente, deleções de genes inteiros ou porções dos mesmos eficazes para destruir a sua atividade biológica podem ser usadas em qualquer combinação. Por exemplo, em um vetor exemplar, a sequência adenoviral pode ter deleções dos genes E1 e do gene E4 ou dos genes E1, E2a e E3 ou dos genes E1 e E3 ou dos genes E1, E2a e E4, com ou sem deleção de E3 e assim por diante. Como debatido acima, tais deleções podem ser usadas em combinação com outras mutações, tais como mutações sensíveis à temperatura, para se obter um resultado desejado.

[0127] Um vetor adenoviral carecendo de qualquer uma das sequências adenovirais essenciais (por exemplo, E1a, E1b, E2a, E2b, E4 ORF6, L1, L2, L3, L4 e L5) pode ser cultivado na presença dos produtos de gene adenovirais perdidos que sejam requeridos para a infectividade e propagação virais de uma partícula adenoviral. Estas funções auxiliares podem ser providas cultivando-se o vetor adenoviral na presença de uma ou mais construções auxiliares (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) ou uma célula hospedeira empacotadora. Ver, por exemplo, as técnicas descritas para a preparação de um vetor Ad humano “mínimo” no Pedido de Patente Internacional WO96/13597, publicado em 9 de maio de 1996 e aqui incorporado por referência. a. Vírus Auxiliar

[0128] Assim, dependendo do conteúdo de gene adenoviral dos vetores virais utilizados para carrear o cassete de expressão, um adenovírus auxiliar ou fragmento viral não replicante pode ser necessário prover sequências de gene adenoviral suficientes necessárias para produzir uma partícula viral recombinante infecciosa contendo o cassete de expressão. O vírus auxiliar útil contém sequências de gene adenoviral selecionadas não presentes na construção de vetor adenoviral e/ou não expressas pela linhagem de célula de empacotamento na qual o vetor é transfectado. Em uma modalidade, o vírus auxiliar é defeituoso em replicação e contém uma variedade de genes adenovirais além das sequências descritas acima. Um tal vírus auxiliar é desejavelmente usado em combinação com uma linhagem de célula expressando E1.

[0129] O vírus auxiliar também pode ser formado dentro de conjugados policatiônicos como descrito em Wu et al, J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989); K. J. Fisher e J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (1 de abril de 1994). O vírus auxiliar pode opcionalmente conter um segundo minigene repórter. Vários de tais genes repórter são conhecidos na técnica. A presença de um gene repórter no vírus auxiliar que seja diferente do transgene no vetor adenoviral permite que tanto o vetor Ad quanto o vírus auxiliar sejam independentemente monitorados. Este segundo repórter é usado para permitir a separação entre o vírus recombinante resultante e o vírus auxiliar na purificação. b. Linhagens de Célula de Complementação

[0130] Para gerar adenovírus recombinantes (Ad) deletados em qualquer um dos genes descritos acima, a função da região de gene deletada, se essencial para a replicação e infectividade do vírus, deve ser suprida ao vírus recombinante por um vírus ou linhagem de célula auxiliares, isto é, uma linhagem de célula de complementação ou empacotamento. Em muitas circunstâncias, uma linhagem de célula expressando o E1 humano pode ser usada para transcomplementar o vetor Ad. Entretanto, em certas circunstâncias, será desejável utilizar uma linhagem de célula que expresse os produtos de gene E1 e possa ser utilizada para a produção de um adenovírus deletado em E1. Tais linhagens de célula foram descritas. Ver, por exemplo, Patente US 6.083.716. Se desejado, pode-se utilizar as sequências aqui providas para gerar uma célula ou linhagem de célula de empacotamento que expressem, em um mínimo, o gene adenoviral E1 sob o controle transcricional de um promotor para a expressão em uma linhagem de célula precursora selecionada. Promotores indutíveis ou constitutivos podem ser utilizados para este propósito. Os exemplos de tais promotores são descritos em detalhes em outro lugar neste Relatório Descritivo. Uma célula precursora é selecionada para a geração de uma nova linhagem de célula expressando qualquer gene adenoviral desejado. Sem limitação, uma tal linhagem de célula precursora pode ser uma das células HeLa [Acesso ATCC No. CCL 2], A549 [Acesso ATCC No. CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por exemplo, Detroit 510, CCL 72] e WI-38 [CCL 75], entre outras. Estas linhagens de célula são todas disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209. Outras linhagens de célula precursora adequadas podem ser obtidas a partir de outras fontes.

[0131] Tais linhagens de célula expressando E1 são úteis na geração de vetores adenovirais recombinantes deletados em E1. Adicional ou alternativamente, as linhagens de célula que expressam um ou mais produtos de gene adenoviral, por exemplo, E1a, E1b, E2a e/ou E4 ORF6, podem ser construídas usando essencialmente os mesmos procedimentos que são usados na geração de vetores virais recombinantes. Tais linhagens de célula podem ser utilizadas para transcomplementar vetores adenovirais deletados nos genes essenciais que codificam estes produtos ou prover funções auxiliares necessárias para o empacotamento de um vírus dependente de auxiliar (por exemplo, vírus adenoassociado). A preparação de uma célula hospedeira envolve técnicas tais como a montagem de sequências de DNAs selecionados. Esta montagem pode ser realizada utilizando técnicas convencionais. Tais técnicas incluem cDNA e clonagem genômica, que são bem conhecidas e são descritas em Sambrook et al., citado acima, uso de sequências de oligonucleotídeo de sobreposição dos genomas adenovirais, combinados com a reação em cadeia da polimerase, métodos sintéticos e quaisquer outros métodos adequados que provejam a sequência de nucleotídeo desejada.

[0132] Ainda em uma outra alternativa, os produtos de gene adenoviral essenciais são providos em trans pelo vetor adenoviral e/ou vírus auxiliar. Em um tal caso, uma célula hospedeira adequada pode ser selecionada de qualquer organismo biológico, incluindo células procarióticas (por exemplo, bacterianas) e células eucarióticas, incluindo, células de inseto, células de levedura e células mamíferas. As células hospedeiras particularmente desejáveis são selecionadas dentre qualquer espécie mamífera, incluindo, sem limitação, células tais como A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, células HEK 293 ou PERC6 (ambas das quais expressam E1 adenoviral funcional) [Fallaux, FJ et al, (1998), Hum Gene Ther, 9: 1909-1917], Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 e fibroblasto primário, células de hepatócito e mioblasto derivadas de mamíferos incluindo ser humano, macaco, camundongo, rato, coelho e hamster. A seleção das espécies mamíferas provendo as células não é uma limitação desta invenção; nem o é o tipo de célula mamífera, isto é, fibroblasto, hepatócito, célula tumoral, etc. c. Montagem de Partícula Viral e Transfecção de uma Linhagem de Célula

[0133] Geralmente, quando da distribuição do vetor compreendendo o minigene pela transfecção, o vetor é fornecido em uma quantidade de cerca de 5 μg acerca de 100 μg de DNA e preferivelmente de cerca de 10 acerca do 50 μg de DNA acerca de 1 x 104 células acerca de 1 x 1013 células e preferivelmente cerca de 105 células. Entretanto, as quantidades relativas de DNA vetorial para células hospedeiras podem ser ajustadas, levando-se em consideração fatores tais como o vetor selecionado, o método de liberação e as células hospedeiras selecionadas. B. Sistemas Lentivirais

[0134] Uma variedade de sistemas lentivirais diferentes são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a WO2001089580 A1 para um método para a obtenção de transdução cardiovascular estável com um sistema lentiviral. Ver, por exemplo, a Patente US 6.521.457. Ver, também, o debate em NB Wasala et al. The evolution of heart gene delivery vectors, J Gen Med., outubro de 2011; 13(10): 557-565, que é aqui incorporado por referência. C. AAV Recombinante

[0135] Em certas modalidades, o genoma vetorial se refere à sequência de ácido nucléico empacotada dentro de um vetor, por exemplo, um rAAV. Para um rAAV, uma tal sequência de ácido nucléico pode conter sequências de repetição de terminal AAV invertido (ITRs) e um cassete de expressão. Em um exemplo, um genoma vetorial contém, em um mínimo, de 5’ a 3’, uma AAV 5’ ITR, uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina e uma AAV 3’ ITR. Em um exemplo, um genoma vetorial contém, em um mínimo, de 5’ a 3’, uma AAV 5’ ITR, um cassete de expressão e uma AAV 3’ ITR. As ITRs podem ser de AAV2 ou de AAV de fonte de aa diferente outra que não AAV2. Em outras modalidades, um genoma vetorial pode conter repetições de terminal (TRs) necessárias para vetor AAV autocomplementar.

[0136] Em uma modalidade, é aqui provido um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) tendo um capsídeo de AAV e um genoma vetorial, em que o genoma vetorial compreende um cassete de expressão como aqui descrito ou uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina (isto é, cDNA como aqui usado) sob o controle de sequências reguladoras que direcionam a sua expressão.

[0137] Em algumas modalidades, a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina é projetada para ser expressa a partir de um vírus adenoassociado recombinante e o genoma vetorial também contém repetições terminais invertidas de AAV (ITRs). Em uma modalidade, o rAAV é pseudotipado, isto é, o capsídeo de AAV é de uma fonte de AAV diferente do que o AAV que provê as ITRs. Em uma modalidade, as ITRs de AAV sorotipo 2 são usadas. Entretanto, as ITRs de outras fontes adequadas podem ser selecionadas. Opcionalmente, o AAV pode ser um AAV autocomplementar.

[0138] A abreviação “sc” se refere a autocomplementar. “AAV autocomplementar” se refere a uma construção na qual uma região codificadora carreada por uma sequência de ácido nucléico de AAV recombinante foi projetada para formar um padrão de DNA de filamento duplo intramolecular. Na infecção, ao invés de esperar pela síntese mediada por célula do segundo filamento, as duas metades complementares de scAAV associar-se-ão para formar uma unidade de DNA de filamento duplo (dsDNA) que está ponta para a replicação e transcrição imediata. Ver, por exemplo, D M McCarty et al, Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis, Gene Therapy, (agosto de 2001), Vol 8, Número 16, Páginas 1248-1254. Os AAVs autocomplementares estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.596.535,

7.125.717 e 7.456.683, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0139] Onde o gene deva ser expresso a partir de um AAV, os cassetes de expressão aqui descritos incluem uma repetição de terminal invertido (ITR) AAV 5’ e uma ITR de AAV 3’. Entretanto, outras configurações destes elementos podem ser adequadas. Uma versão encurtada da 5’ ITR, denominada ∆ITR, foi descrita na qual a sequência D e o sítio de resolução de terminal (trs) são deletados. Em outras modalidades, o AAV 5’ e/ou 3’ ITRs completos são usados. Onde um AAV pseudotipado deva ser produzido, as ITRs na expressão são selecionadas a partir de uma fonte que difira da fonte de AAV do capsídeo. Por exemplo, as ITRs de AAV2 podem ser selecionadas para o uso com um capsídeo de AAV tendo uma eficiência particular para o músculo alvejado. Em uma modalidade, as sequências de ITR de AAV2 ou a sua versão deletada (∆ITR), são usadas por conveniência e para acelerar a aprovação regulatória. Entretanto, as ITRs de outras fontes de AAV podem ser selecionadas. Onde a fonte das ITRs é de AAV2 e o capsídeo de AAV é de uma outra fonte de AAV, o vetor resultante pode ser denominado pseudotipado. Entretanto, outras fontes de ITRs de AAV podem ser utilizadas.

[0140] Como aqui usado, “partícula viral de AAV recombinante” ou “partícula viral de AAV” se referem à partícula resistente à nuclease (NRP) que tem um capsídeo e empacotado nele uma molécula de ácido nucléico heteróloga (genoma vetorial) compreendendo um cassete de expressão para uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina. Um tal cassete de expressão tipicamente contém uma sequência de repetição de terminal 5' e/ou 3' invertida de AAV flanqueando uma sequência de gene, na qual a sequência de gene é operavelmente ligada às sequências de controle de expressão. Tal capsídeo empacotado neste ponto um genoma vetorial também pode ser aludido como um capsídeo de AAV “completo”. Uma tal partícula viral de rAAV é denominada “farmacologicamente ativa” quando a mesma libera o transgene para uma célula hospedeira que é capaz de expressar o produto de gene desejado carreado pelo cassete de expressão.

[0141] Em muitos casos, as partículas de rAAV são aludidas como “resistente à DNase.” Entretanto, além desta endonuclease (DNase), outras endo- e exonucleases também podem ser usadas nas etapas de purificação aqui descritas, para remover ácidos nucléicos contaminantes. Tais nucleases podem ser selecionadas para degradar DNA de filamento único e/ou DNA e RNA de filamento duplo. Tais etapas podem conter uma única nuclease ou misturas de nucleases direcionadas a alvos diferentes e podem ser endonucleases ou exonucleases.

[0142] O termo “resistente à nuclease” indica que o capsídeo de AAV totalmente montou em torno do cassete de expressão que é projetado para distribuir um transgene para uma célula hospedeira e protege estas sequências genômicas empacotadas da degradação (digestão) durante as etapas de incubação da nuclease projetadas para remover ácidos nucléicos contaminantes que podem estar presentes do processo de produção.

[0143] Como aqui usado, um “capsídeo AAV9” é um capsídeo de AAV automontado composto de proteínas AAV9 vp múltiplas. As proteínas AAV9 vp são tipicamente produzidas como variantes de encaixe alternativas de uma sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 10 ou uma sequência pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% a esta, que codifica a sequência de aminoácido vp1 da SEQ ID NO: 9 (acesso do GenBank: AAS99264). Estas variantes de encaixe resultam em proteínas de comprimento diferente da SEQ ID NO: 9. Em certas modalidades, “capsídeo AAV9” inclui um AAV tendo uma sequência de aminoácido que seja 99% idêntica à SEQ ID NO: 9 (isto é, menos do que cerca de 1% de variação da sequência de referência). Ver, também US7906111 e WO 2005/033321. Tal AAV pode incluir, por exemplo, isolados naturais (por exemplo, hu31, a vp1 do qual é codificada pela SEQ ID NO: 11; ou hu32, a vp1 do qual é codificada pela SEQ ID NO: 12) ou variantes de AAV9 tendo substituições, deleções ou adições de aminoácido, por exemplo, incluindo mas não são limitados a substituições de aminoácido selecionadas de resíduos alternados “recrutados” da posição correspondente em qualquer outro capsídeo de AAV alinhado com o capsídeo AAV9; por exemplo, tal como descrito na US 9.102.949, US 8.927.514, US 8.734.809 e WO 2016/049230A1. Entretanto, em outras modalidades, outras variantes de AAV9 ou capsídeos de AAV9 tendo pelo menos cerca de 95% de identidade com as sequências aludidas acima podem ser selecionadas. Ver, por exemplo, Pedido de Patente Publicado US No. 2015/0079038. Os métodos de gerar o capsídeo, sequências codificadoras para tal e métodos para a produção de vetores virais rAAV foram descritos. Ver, por exemplo, Gao, et al, Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003) e US 2013/0045186A1.

[0144] Além de AAV9, outros vetores de AAV podem ser usados, por exemplo, AAV1, AAV5, AAV6, AAV8, AAV8 triplo, AAV9, Anc80, Anc81 e Anc82. Ver, por exemplo, Santiago-Ortiz et al., Gene Ther., 22(12): 934-46 (2015); US20170051257A1; e Zinn et al., Cell Rep., 12(6): 1056-1068 (2015).

[0145] As sequências de qualquer um dos capsídeos de AAVs podem ser facilmente geradas sinteticamente ou usando uma variedade de técnicas de biologia molecular e engendramento genético. As técnicas de produção adequadas são bem conhecidas por aqueles versadas na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativamente, peptídeos codificando oligonucleotídeos (por exemplo, CDRs) ou os próprios peptídeos podem ser gerados sinteticamente, por exemplo, pelos métodos de síntese de peptídeo de fase sólida bem conhecidos (Merrifield, (1962) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149; Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pp. 27-62). Estes e outros métodos de produção adequados estão dentro do conhecimento daqueles versados na técnica e não são uma limitação da presente invenção.

[0146] Métodos de preparar vetores com base em AAV são conhecidos. Ver, por exemplo, Pedido de Patente Publicado US No. 2007/0036760 (15 de fevereiro de 2007), que é aqui incorporada por referência. O uso dos capsídeos de AAV tendo tropismo para células musculares e/ou células cardíacas são particularmente bem adaptados para as composições e métodos aqui descritos. Entretanto, outros alvos podem ser selecionados. As sequências de AAV9 e métodos de gerar vetores com base no capsídeo de AAV9 são descritos na US 7.906.111; US2015/0315612; WO 2012/112832; e WO2017160360A3, que são aqui incorporadas por referência. Em certas modalidades, as sequências de AAV1, AAV5, AAV6, AAV9, AAV8triplo, Anc80, Anc81 e Anc82 são conhecidos e podem ser usadas para gerar vetor AAV. Ver, por exemplo, a US 7186552, WO 2017/180854, US 7.282.199 B2, US 7.790.449 e US

8.318.480, que são aqui incorporados por referência. As sequências de vários de tais AAVs são providas nas Patentes US 7.282.199 B2, US 7.790.449, US 8.318.480,

Patente US 7.906.111, WO/2003/042397, WO/2005/033321, WO/2006/110689, US

8.927.514, US 8.734.809; WO2015054653A3, WO-2016065001-A1, WO- 2016172008-A1, WO-2015164786-A1, US-2010186103-A1, WO-2010138263-A2 e WO 2016/049230A1 citadas acima e/ou estão disponíveis do GenBank. Métodos correspondentes foram descritos para vetores semelhantes a AAV1, AAV8 e AAVrh10. Ver, WO2017100676 A1; WO2017100674A1; e WO2017100704A1.

[0147] O vírus adenoassociado recombinante (AAV) aqui descrito pode ser gerado usando técnicas que são conhecidas. Ver, por exemplo, a WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2. Um tal método envolve cultivar uma célula hospedeira que contém uma sequência de ácido nucléico codificando um capsídeo de AAV; um gene rep funcional; um cassete de expressão composto, em um mínimo, de repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) e um transgene; e funções auxiliares suficientes para permitir o empacotamento do cassete de expressão dentro da proteína capsídica de AAV. A célula hospedeira pode ser uma célula 293 ou uma suspensão de célula 293. Ver, por exemplo, Zinn, E., et al., como aqui citado; Joshua C Grieger et al. Production of Recombinant Adeno-associated Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector. Mol Ther. fevereiro de 2016; 24(2): 287–297. Publicado online 3 de novembro 2015. Pré-publicado online 6 de outubro de 2015. doi: 10,1038/mt,2015,187; Laura Adamson-Small, et al. Sodium Chloride Enhances Recombinant Adeno-Associated Virus Production in a Serum-Free Suspension Manufacturing Platform Using the Herpes Simplex Virus System. Hum Gene Ther Methods. 1 de fevereiro de 2017; 28(1): 1–14. Publicado online 1 de fevereiro de 2017. doi: 10,1089/hgtb,2016,151; US20160222356A1; e Chahal PS et al. Production of adeno-associated virus (AAV) serotypes by transient transfection of HEK293 cell suspension cultures for gene delivery. J Virol Methods. fevereiro de 2014; 196: 163-

73. doi: 10,1016/j.jviromet,2013,10,038. Epub 13 de novembro de 2013.

[0148] Outros métodos de produzir rAAV disponível para uma pessoa versada na técnica podem ser utilizados. Os métodos adequados podem incluir sem limitação, sistema de expressão de baculovírus (por exemplo, sistema de célula de inseto infectada com baculovírus) ou produção por intermédio de levedura. Ver, por exemplo, WO2005072364A2; WO2007084773A2; WO2007148971A8; WO2017184879A1; WO2014125101A1; US6723551B2; Bryant, L.M., et al., Lessons Learned from the Clinical Development and Market Authorization of Glybera. Hum Gene Ther Clin Dev, 2013; Robert M. Kotin, Large-scale recombinant adeno-associated virus production. Hum Mol Genet. 15 de abril de 2011; 20(R1): R2–R6. Publicado online 29 de abril de

2011. doi: 10,1093/hmg/ddr141; Aucoin MG et al., Production of adeno-associated viral vectors in insect cells using triple infection: optimization of baculovirus concentration ratios. Biotechnol Bioeng. 20 de dezembro de 2006; 95(6): 1081-92; SAMI S. THAKUR, Production of Recombinant Adeno-associated viral vectors in yeast. Tese apresentada para a Graduate School of the University of Florida, 2012; Kondratov O et al. Direct Head-to-Head Evaluation of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors Manufactured in Human versus Insect Cells, Mol Ther. 10 de Agosto de

2017. pii: S1525-0016(17)30362-3. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.08.003. [Epub antes da impressão]; Mietzsch M et al, OneBac 2.0: Sf9 Cell Lines for Production of AAV1, AAV2, and AAV8 Vectors with Minimal Encapsidation of Foreign DNA. Hum Gene Ther Methods. fevereiro de 2017; 28(1): 15-22. doi: 10.1089/hgtb.2016.164.; Li L et al. Production and characterization of novel recombinant adeno-associated virus replicative-form genomes: a eukaryotic source of DNA for gene transfer. PLoS One. 1 de agosto de 2013; 8(8): e69879. doi: 10.1371/journal.pone.0069879. Print 2013; Galibert L et al, Latest developments in the large-scale production of adeno-associated virus vectors in insect cells toward the treatment of neuromuscular diseases. J Invertebr Pathol. Julho de 2011; 107 Supl: S80-93. doi: 10.1016/j.jip.2011.05.008; e Kotin RM, Large-scale recombinant adeno-associated virus production. Hum Mol Genet. 15 de abril de 2011; 20(R1): R2-6. doi: 10.1093/hmg/ddr141. Epub 29 de abril de 2011.

[0149] Para calcular o conteúdo de partícula vazia e cheia, volumes da faixa VP3 para uma amostra selecionada (por exemplo, nos exemplos aqui uma preparação purificada em gradiente de iodixanol onde # de GC = # de partículas) são plotadas contra as partículas GC carregadas. A equação linear resultante (y = mx+c) é usada para calcular o número de partículas nos volumes de faixa dos picos do artigo de teste. O número de partículas (pt) por 20 µL carregados é depois multiplicado por 50 para dar partículas (pt) /mL. Pt/mL dividido por GC/mL dá a razão de partículas para cópias do genoma (pt/GC). Pt/mL–GC/mL dá pt/mL vazio. pt/mL vazio dividido por pt/mL e x 100 dá a porcentagem de partículas vazias.

[0150] Geralmente, os métodos para ensaiar quanto aos capsídeos vazios e partículas de vetor de AAV com genomas empacotados foram conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7: 122-128. Para testar quanto ao capsídeo desnaturado, os métodos incluem submeter o estoque de AAV tratado à eletroforese em gel de SDS- poliacrilamida, consistindo de qualquer gel capaz de separar as três proteínas capsídicas, por exemplo, um gel gradiente contendo 3 a 8% de Tris-acetato no tampão, depois conduzindo o gel até que o material de amostra seja separado e manchando o gel sobre membranas de náilon ou nitrocelulose, preferivelmente náilon. Os anticorpos anticapsídicos de AAV são depois usados como os anticorpos primários que se ligam às proteínas capsídicas desnaturadas, preferivelmente um anticorpo monoclonal anticapsídico de AAV, o mais preferivelmente o anticorpo monoclonal anti- AAV-2 B1 (Wobus et al., J. Virol. (2000) 74: 9281-9293). Um anticorpo secundário é depois usado, um que se liga ao anticorpo primário e contém um meio para detectar a ligação com o anticorpo primário, mais preferivelmente um anticorpo anti-IgG contendo uma molécula de detecção covalentemente ligada a ele, o mais preferivelmente um anticorpo de IgG anti-camundongo de ovelha covalentemente ligado à peroxidase de rábano. Um método para detectar a ligação é usado para determinar semiquantitativamente a ligação entre os anticorpos primários e secundários, preferivelmente um método de detecção capaz de detectar emissões isotópicas radioativas, radiação eletromagnética ou mudanças colorimétricas, o mais preferivelmente um kit de detecção quimioluminescente. Por exemplo, para SDS- PAGE, as amostras das frações de coluna podem ser coletadas e aquecidas no tampão de carga da SDS-PAGE contendo agente redutor (por exemplo, DTT) e proteínas capsídicas foram resolvidos sobre géis de poliacrilamida de gradiente pré-

moldagem (por exemplo, Novex). O tingimento de prata pode ser realizado usando SilverXpress (Invitrogen, CA) de acordo com as instruções do fabricante ou outro método de tingimento adequado, isto é, os tingimentos SYPRO rubi ou coomassie. Em uma modalidade, a concentração de genomas vetoriais (vg) de AAV nas frações de coluna pode ser medida pela PCR em tempo real quantitativa (Q-PCR). As amostras são diluídas e digeridas com DNase I (ou uma outra nuclease adequada) para remover DNA exógeno. Depois da inativação da nuclease, as amostras são diluídas e amplificadas adicionalmente usando iniciadores e uma sonda fluorogênica TaqMan® específica para a sequência de DNA entre os iniciadores. O número de ciclos requeridos para atingir um nível definido de fluorescência (patamar de ciclo, Ct) é medido para cada amostra em um Sistema de Detecção de Sequência Applied Biosysthems Prism 7700. DNA plasmídico contendo sequências idênticas àquelas contidas no vetor AAV é utilizado para gerar uma curva padrão na reação Q-PCR. Os valores de patamar de ciclo (Ct) obtidos a partir das amostras são usados para determinar o título do genoma vetorial pela normalização do mesmo para os valores Ct da curva padrão de plasmídeo. Os ensaios de ponto final com base na PCR digital também podem ser usados.

[0151] Em um aspecto, um método de q-PCR otimizado é usado que utiliza uma serina protease de amplo espectro, por exemplo, proteinase K (tal como é comercialmente disponível da Qiagen). Mais particularmente, o ensaio de título de genoma pela qPCR otimizada é similar a um ensaio padrão, exceto que depois da digestão com DNase I, as amostras são diluídas com tampão de proteinase K e tratadas com proteinase K seguida pela inativação térmica. Adequadamente as amostras são dilutas com tampão de proteinase K em uma quantidade igual ao tamanho da amostra. O tampão de proteinase K pode ser concentrado até 2 vezes ou superior. Tipicamente, o tratamento com proteinase K é de cerca de 0,2 mg/mL, mas pode ser variado de 0,1 mg/mL acerca de 1 mg/mL. A etapa de tratamento é geralmente conduzida acerca de 55 °C por cerca de 15 minutos, mas pode ser realizado em uma temperatura mais baixa (por exemplo, cerca de 37 °C acerca de 50 °C) em um período de tempo mais longo (por exemplo, cerca de 20 minutos acerca de 30 minutos) ou uma temperatura mais alta (por exemplo, até cerca de 60 °C) por um período de tempo mais curto (por exemplo, cerca de 5 a 10 minutos). Similarmente, a inativação térmica é geralmente acerca de 95 °C por cerca de 15 minutos, mas a temperatura pode ser diminuída (por exemplo, cerca de 70 acerca de 90 °C) e o tempo prolongado (por exemplo, cerca de 20 minutos acerca de 30 minutos). As amostras são depois diluídas (por exemplo, 1000 vezes) e submetido à análise TaqMan como descrito no ensaio padrão.

[0152] Adicional ou alternativamente, a PCR digital de gotícula (ddPCR) pode ser usada. Por exemplo, métodos para determinar títulos de genoma vetorial de AAV de filamento único e autocomplementar pela ddPCR foram descritos. Ver, por exemplo, M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. abril de 2014; 25(2): 115-25. doi: 10,1089/hgtb,2013,131. Epub 14 de fevereiro de 2014.

[0153] Em resumo, o método para separar partículas de rAAV tendo sequências genômicas empacotadas de intermediários AAV deficientes no genoma envolve submeter uma suspensão compreendendo partículas virais de AAV recombinante e intermediários capsídicos de AAV à cromatografia líquida de desempenho rápido, em que as partículas virais de AAV e intermediários de AAV são ligados a uma resina de troca de ânion forte equilibrada em um alto (por exemplo, pH de 10,2 para AAV9) e submetido a um gradiente salino enquanto se monitora o eluato quanto à absorbância de ultravioleta acerca de 260 e cerca de 280. Embora menos ótimo para rAAV9, o pH pode estar na faixa de cerca de 10,0 a 10,4. Neste método, os capsídeos cheios de AAV são coletados de uma fração que é eluída quando a razão de A260/A280 atinge um ponto de inflexão. Em um exemplo, para a etapa de Cromatografia de Afinidade, o produto diafiltrado pode ser aplicado a uma resina de afinidade Capture Select Poros- AAV2/9 (Life Technologies) que eficientemente captura o sorotipo AAV2/9. Sob estas condições iônicas, uma porcentagem significante de DNA celular residual e proteínas flui através da coluna, enquanto as partículas de AAV são eficientemente capturadas.

[0154] Como aqui usado, o termo “tratamento” ou “tratar” se refere à(s) composição(ões) e/ou método(s) para o propósito de melhora de um ou mais sintomas de MD, incluindo DMD e BMD, restauração de uma função desejada da distrofina completa ou melhora de biomarcador de doença. Em algumas modalidades, o termo “tratamento” ou “tratar” é definido abrangendo administrar a um sujeito uma ou mais composições aqui descritas para os propósitos aqui indicados. “Tratamento” pode assim incluir um ou mais de prevenir doença, reduzir a severidade dos sintomas da doença, retardar a sua progressão, remover os sintomas da doença, retardar a progressão da doença ou aumentar a eficácia da terapia em um dado sujeito. Como aqui usado, o termo doença se refere à MD, incluindo DMD e BMD ou qualquer outra doença relacionada com a distrofina.

[0155] Deve ser entendido que as composições no vetor aqui descrito são intencionadas a serem aplicadas a outras composições, regimes, aspectos, modalidades e métodos descrito através do Relatório Descritivo. IV. Métodos e Kits

[0156] Em outras modalidades, métodos para alvejar músculo, incluindo músculo esqueletal, músculo cardíaco e/ou músculo liso são desejados. Isto pode envolver uma injeção intravenosa ou injeção intramuscular. Entretanto, outras vias de distribuição podem ser selecionadas.

[0157] Em certas modalidades, a composição da invenção é especificamente alvejada (por exemplo, por intermédio de injeção direcionada) ao coração. Em certas modalidades, a composição ou especificamente expressa no coração (por exemplo, cardiomiócitos). Os métodos para preferencialmente alvejar células cardíacas e/ou para minimizar a transferência de gene não cardíaca fora do alvo foram descritos. Ver, por exemplo, Matkar PN et al, Cardiac Gene Therapy: are we there yet? Gene Ther. agosto de 2016; 23(8-9): 635-48. doi: 10,1038/gt,2016,43. Epub 29 de abril de 2016; Publicações de Patente US20030148968A1, US20070054871A1, WO2000038518A1, US7078387B1, US6162796A e WO1994011506A1.

[0158] Em certas modalidades, um método tal como aquele na Patente US

7.399.750, é usado para aumentar o tempo de permanência do vetor carreando o gene de interesse no coração pela indução de hipotermia, isolação do coração da circulação e perto ou parada cardíaca completa. Agentes permeabilizantes são um componente essencial deste método e são usados durante a administração do vírus para aumentar a captação do vírus pelas células cardíacas. Este método é particularmente bem adaptado para vetores virais, onde a expressão de gene pode ser altamente específica para o músculo cardíaco e, em particular no caso de vetores rAAV, a expressão pode ser mantida por muito tempo, sem nenhum sinal de inflamação miocárdica. Ainda um outro sistema e técnica podem ser usados incluindo, sem limitação, por exemplo, um “biomarcapasso”, tal como aquele descrito na Patente US 8.642.747, US-2011-0112510.

[0159] Em uma modalidade, a distribuição é realizada pelo método da perfusão miocárdica global descrito na Publicação internacional número WO2005027995A2. Em uma outra modalidade, a distribuição é realizada pelos métodos de transferência de gene descritos no Pedido de patente internacional No. PCT/US2004/031322, depositado em 24 de setembro de 2004. Em resumo, este método envolve transferir uma micro-utrofina da invenção para as células musculares pela exsanguinação de uma região da microvasculatura do sujeito e distribuir o complexo a esta região sob alta pressão hidrostática usando uma configuração de cânulas de perfusão e balão como requerido para proteger os órgãos da proteína para o coração e pulmão durante a perfusão. Um cateter de balão tendo um balão que se estende substancialmente o comprimento completo da aorta ou vaso no qual é inserido dentro do sujeito é provido para o uso na distribuição sistemática de vetor. Ainda em uma outra modalidade, a invenção provê a distribuição por intermédio de um circuito de perfusão e método cirúrgico é provido para distribuir uma substância a um coração do sujeito in situ durante a cirurgia de desvio cardiopulmonar. O circuito de perfusão define um caminho para a recirculação de uma solução contendo um complexo macromolecular através de um circuito de circulação coronária através de um coração do sujeito durante um procedimento cirúrgico no qual a substância é impedida de ser fornecida aos outros órgãos do sujeito.

[0160] Em um aspecto, é aqui provida uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina, uma sequência de ácido nucléico codificando a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina, um cassete de expressão ou um vetor compreendendo tal sequência de ácido nucléico em um tampão de formulação (isto é, veículo). Em uma modalidade, a formulação compreende adicionalmente um tensoativo, preservante, excipientes e/ou tampão dissolvidos no líquido da suspensão aquosa. Em uma modalidade, o tampão é PBS. Várias soluções adequadas são conhecidas incluindo aquelas que incluem um ou mais de: solução salina tamponante, um tensoativo e um sal fisiologicamente compatível ou mistura de sais ajustados a uma concentração iônica equivalente acerca de 100 mM de cloreto de sódio (NaCl) acerca de 250 mM de cloreto de sódio ou um sal fisiologicamente compatível ajustado para uma concentração iônica equivalente. Adequadamente, a formulação é ajustada a um pH fisiologicamente aceitável, por exemplo, na faixa do pH 6 a 8 ou pH 6,5 a 7,5, pH 7,0 a 7,7 ou pH 7,2 a 7,8.

[0161] Um tensoativo adequado ou combinação de tensoativos, pode ser selecionado dentre tensoativos não iônicos que não sejam tóxicos. Em uma modalidade, um tensoativo de copolímero de bloco bifuncional terminando em grupos hidroxila primários é selecionado, por exemplo, tal como Pluronic® F68 [BASF], também conhecido como Poloxâmero 188, que tem um pH neutro, tem um peso molecular médio de 8400. Outros tensoativos e outros Poloxâmeros podem ser selecionados, isto é, copolímeros não iônicos de tribloco compostos de uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (poli (óxido de propileno)) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli (óxido de etileno)), SOLUTOL HS 15 (Macrogol-15 Hidroxiestearato), LABRASOL (Polióxi caprílico glicerídeo), polióxi 10 éter oleílico, TWEEN (ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano), etanol e polietileno glicol. Em uma modalidade, a formulação contém um poloxâmero. Estes copolímeros são habitualmente denominados com a letra “P” (para poloxâmero) seguido por três dígitos: os primeiros dois dígitos x 100 dá a massa molecular aproximada do núcleo de polioxipropileno e o último dígito x 10 dá a porcentagem do conteúdo de polioxietileno. Em uma modalidade o Poloxâmero 188 é selecionado. O tensoativo pode estar presente em uma quantidade de até cerca de 0,0005 % acerca de 0,001% da suspensão.

[0162] Em um exemplo, a formulação pode conter, por exemplo, solução salina tamponada compreendendo um ou mais de cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, dextrose, sulfato de magnésio (por exemplo, sulfato de magnésio∙7H2O), cloreto de potássio, cloreto de cálcio (por exemplo, cloreto de cálcio∙2H2O), fosfato de sódio dibásico e misturas dos mesmos, em água. Adequadamente, para a distribuição intratecal, a osmolaridade está dentro de uma faixa compatível com o fluido cerebroespinhal (por exemplo, cerca de 275 acerca de 290); ver, por exemplo, emedicine.medscape.com/article/2093316-overview. Opcionalmente, para a distribuição intratecal, um diluente comercialmente disponível pode ser usado como um agente de suspensão ou em combinação com um outro agente de suspensão e outros excipientes opcionais. Ver, por exemplo, solução Elliotts B® [Lukare Medical].

[0163] Em outras modalidades, a formulação pode conter um ou mais realçadores de permeação. Os exemplos de realçadores de permeação adequados podem incluir, por exemplo, manitol, glicocolato de sódio, taurocolato de sódio, desoxicolato de sódio, salicilato de sódio, caprilato de sódio, caprato de sódio, lauril sulfato de sódio, polioxietileno-9-laurel éter ou EDTA.

[0164] Como aqui usado, “carreador” inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção, tampões, soluções carreadoras, suspensões, colóides e os semelhantes. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados dentro das composições. Veículos de distribuição tais como lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas e os semelhantes, podem ser usados para a introdução das composições da presente invenção dentro de células hospedeiras adequadas. Em particular, o vetor de rAAV pode ser formulado para a distribuição encapsulado em uma partícula lipídica, um lipossoma, uma vesícula, uma nanoesfera ou uma nanopartícula ou os semelhantes. Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do dito vetor é incluída na composição farmacêutica. A seleção do carreador não é uma limitação da presente invenção. Outro carreador convencional farmaceuticamente aceitável, tal como preservantes ou estabilizantes químicos. Os preservantes exemplares adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, galato de propila, os parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol e paraclorofenol. Os estabilizantes químicos adequados incluem gelatina e albumina.

[0165] A frase “farmaceuticamente aceitável” se refere a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou similar não desejada quando administradas a um hospedeiro.

[0166] Como aqui usado, os termos “dosagem” ou “quantidade” podem se referir à dosagem ou quantidade total fornecida ao sujeito no curso de tratamento ou a dosagem ou quantidade fornecida em uma administração de unidade única (ou múltiplas unidades ou dosagem dividida).

[0167] Também, as composições de vetor podem ser formuladas em unidades de dosagem para conter uma quantidade de vetor que esteja na faixa de cerca de 1,0 x 109 partículas acerca de 1,0 x 1018 partículas (para tratar um sujeito) incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa e preferivelmente 1,0 x 1012 partículas a 1,0 x 1014 partículas para um paciente humano. Em uma modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109 ou 9x109 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em uma outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010 ou 9x1010 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em uma outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011 ou 9x1011 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em uma outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012 ou 9x1012 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. em uma outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1013, 2x1013,

3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013 ou 9x1013 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa.

Em uma outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014 ou 9x1014 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa.

Em uma outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015 ou 9x1015 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. em uma outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1016, 2x1016, 3x1016, 4x1016, 5x1016, 6x1016, 7x1016, 8x1016 ou 9x1016 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa.

Em uma outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1017, 2x1017, 3x1017, 4x1017, 5x1017, 6x1017, 7x1017, 8x1017 ou 9x1017 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa.

Em uma modalidade, para a aplicação humana a dose pode variar de 1x1010 acerca de 1x1012 partículas por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa.

Em uma modalidade, ao sujeito é fornecida uma quantidade terapeuticamente eficaz dos vetores aqui descritos.

Como aqui usado, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere à quantidade da composição compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina que distribui e expressa nas células alvos uma quantidade de enzima suficiente para alcançar eficácia.

Ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere à quantidade da composição compreendendo a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina que distribui a um sujeito.

Em uma modalidade, a dosagem do vetor é de cerca de 1 x 109 partículas (por exemplo, cópias de genoma, GC) por kg de massa corporal acerca de 1 x 1016 partículas por kg de massa corporal, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa e os pontos finais.

Em uma outra modalidade, a dosagem é 1 x 1010 partículas por kg de massa corporal acerca de 1 x 1013 partículas por kg de massa corporal.

[0168] As dosagens do vetor dependerão primariamente de fatores tais como a condição sendo tratada, a idade, peso e saúde do paciente e pode assim variar entre pacientes. Por exemplo, uma dosagem humana terapeuticamente eficaz do vetor está geralmente na faixa de cerca de 1 ml acerca de 100 ml de solução contendo concentrações de cerca de 1×107 a 1×1016 genomas ou vetor de partículas. A dosagem será ajustada para equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais e tais dosagens podem variar dependendo da aplicação terapêutica para a qual o vetor recombinante é utilizado. Os níveis de expressão do transgene podem ser monitorados para determinar a frequência da dosagem resultante em vetores, preferivelmente vetores AAV contendo o minigene. Opcionalmente, os regimes de dosagem similares àqueles descritos para os propósitos terapêuticos podem ser utilizados para imunização usando as composições da invenção.

[0169] Opcionalmente, a terapia com uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina (por exemplo, nano-utrofina ou nanodistrofina) ou um vetor expressando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina pode ser combinado com outras terapias.

[0170] A expressão da proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina (por exemplo, nano-utrofina ou nanodistrofina) pode ser detectada pelo tingimento imunofluorescente e imunomanchamento (Western blotting). A terapia com a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina (por exemplo, nano- utrofina ou nanodistrofina) pode ser monitorada medindo-se os complexos de DAP perdidos na membrana plasmática de miofibra, incluindo o complexo sarcoglicano que tipicamente não é encontrado no músculo distrófico não tratado devido à deficiência primária de distrofina. Alternativamente, a terapia com a proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina (por exemplo, nano-utrofina ou nanodistrofina) pode ser monitorada pela avaliação de que o músculo esteja protegido de fenótipos patológicos.

[0171] Em um aspecto, a invenção provê um kit para o uso por um médico ou outro conjunto de funcionários. Tipicamente, um tal kit conterá uma proteína mutante ou um vetor da invenção e, opcionalmente, instruções para a reconstituição e/ou distribuição da mesma. Em uma outra modalidade, o kit conterá uma proteína mutante ou um vetor em uma solução salina fisiologicamente compatível e, opcionalmente, instruções para a diluição e realização de um método como aqui descrito.

[0172] O kit da invenção também pode conter um cateter de balão para facilitar a transferência de gene somático como descrito (Pedido de patente internacional No. PCT/US2004/030463 ou pelos métodos de transferência de gene descritos no Pedido de patente internacional No. PCT/US2004/031322, depositado em 24 de setembro de 2004), agente transportador de oxigênio e/ou pelo menos um elemento descartável de um suporte circulatório e sistema de oxigenação extracorpóreos. Por exemplo, pelo menos um elemento descartável pode ser um oxigenador tendo um corpo oco, uma entrada de líquido em comunicação fluídica com o interior do corpo, uma saída de líquido em comunicação fluídica com o interior do corpo, uma entrada de gás para prover gás para o interior de uma câmara de gás, pelo menos uma membrana permeável a gás separando a câmara de gás do interior do corpo e uma saída de gás para permitir que gás saia da câmara de gás, por meio disso a troca gasosa é possibilitada entre um fluido no interior do corpo e um gás na câmara de gás. O oxigenador pode ser construído como descrito na Pat. U.S. No. 6.177.403, em que a membrana permeável a gás compreende tubulação de PTFE estendendo dentro de pelo menos uma porção do tube e em que a câmara de gás compreende o interior da tubulação de PTFE.

[0173] Deve ser entendido que as composições nos Métodos e Kits aqui descritos são intencionadas a serem aplicadas a outras composições, regimes, aspectos, modalidades e métodos descritos através do Relatório Descritivo.

[0174] Os termos “um” ou “uma” se referem a um(a) ou mais. Como tal, os termos “um” (ou “uma”), “um(a) ou mais,” e “pelo menos um(a)” são aqui usados intercambiavelmente.

[0175] As palavras “compreendem”, “compreende” e “compreendendo” devem ser interpretadas inclusivamente ao invés de exclusivamente. As palavras “consistem”, “consistindo” e suas variantes, devem ser interpretadas exclusivamente, ao invés de inclusivamente. Embora várias modalidades no Relatório Descritivo estejam apresentadas usando a linguagem “compreendendo”, sob outras circunstâncias, uma modalidade relacionada também é intencionada a ser interpretada e descrita usando a linguagem “consistindo de” ou “consistindo essencialmente de”.

[0176] O termo “cerca de” abrange uma variação dentro e incluindo ± 10%, a menos que de outro modo especificado.

[0177] A menos que de outro modo definido neste Relatório Descritivo, os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa ordinariamente versada na técnica e por referência aos textos publicados, que proveem uma pessoa versada na técnica com uma orientação geral para muitos dos termos usados no presente pedido.

EXEMPLOS

[0178] A estrutura primária da distrofina e a base molecular da doença BMD mais branda do que DMD sugeriu um meio conceitualmente simples de construir proteínas parcialmente funcionais menores para a terapia em DMD. As exclusões internas das porções contiguas únicas de um domínio repetitivo longo da distrofina foram usadas para obter variantes de distrofina de comprimento parcial semelhantes à BMD que localizam para o endereço celular normalmente ocupado pela distrofina completa e deste modo parcialmente substitui pela(s) a(s) funções fisiológica(s) chave da distrofina. Foi amplamente assumido, com base na vista de que a distrofina serve como um “amortecedor” molecular, que o comprimento completo da proteína seria necessário requerido para a função normal neste papel. O resultado antecipado foi que sob um teste apropriado, esta classe inteira de proteínas recombinantes conferiu fenótipos semelhantes à BMD aos pacientes com DMD. Nenhuma distrofina recombinante de comprimento parcial somaticamente liberada normalizou completamente a maioria os ensaios sensíveis da patologia em estudos pré-clínicos, sugerindo que os vetores preparados para o desenvolvimento clínico por diversas equipes, no melhor, vão “Beckerize” temporariamente a taxa de progressão de doença em DMD. As distrofinas tanto mais curtas quanto mais longas do que as do tipo selvagem podem ser associadas com doença severa na Distrofia Muscular de Becker (BMD), indicando que o papel mecânico da distrofina não é tão simples quanto aquele de um “amortecedor” dependente do comprimento. Tais correlações de genótipo/fenótipo na Distrofia Muscular de Duchenne e Becker serviram como pontos de partida para o desenvolvimento de substitutos de baixo peso molecular para Dp427, incluindo derivados potencialmente não imunogênicos do parálogo de distrofina, utrofina. Com base em uma nova compreensão da mecanobiologia da distrofina e utrofina, nós desenvolvemos variantes de utrofina ou distrofina que podem ser liberadas a um paciente para substituir a eficácia e segurança das terapias genéticas previamente estudadas na abordagem das limitações específicas da DMD indicadas acima. Exemplo 1 - Evolução da titina mas não distrofina correlaciona com a escalabilidade da potência locomotora A. Resultados e Discussões

[0179] Em animais grandes, a locomoção rápida é invariavelmente alimentada pela miosina sarcomérica, considerando que os eucariotos unicelulares que se movem mais rápido e primeiras linhagens de animais ramificados usam a dineína ciliar como a fonte locomotora de potência dominante (Colin, S. P., et al. Stealth predation and the predatory success of the invasive ctenophore Mnemiopsis leidyi. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 17223-17227 (2010); Srivastava, M. et al. The Trichoplax genome and the nature of placozoans. Nature 454, 955-960 (2008); Srivastava, M. et al. The Amphimedon queenslandica genome and the evolution of animal complexity. Nature 466, 720-726 (2010); Ryan, J. F. et al. The genome of the ctenophore Mnemiopsis leidyi and its implications for cell type evolution. Science 342, 1242592, doi:10,1126/science,1242592 (2013); e Moroz, L. L. et al. The ctenophore genome and the evolutionary origins of neural systems. Nature 510, 109-114, doi:10,1038/nature13400 (2014)). As pressões seletivas que conduzem a transição evolucionária da dineína para miosina deve refletir as restrições geométricas impostas pelas organelas nas quais estes motores obtêm uma densidade de potência máxima, com os sarcômeros, mas não receptível à cílios para a escala tridimensional. A base molecular desta transição pivotal é mal entendida. Neste ponto nós mostramos que a emergência de sarcômeros correlaciona com a aparência filogenomicamente reconstruída de proteínas contendo repetição de poli-IgG massiva ortóloga às titinas de cordado, considerando que a distrofina e seu complexo associado de glicoproteínas ligados à membrana surgiram aos poucos, antes da divergência das primeiras linhagens de ramificação. Nós identificamos espécies invertebradas que retém a estrutura do supergene de titina ancestral inferida, fornecendo uma visão unificada dos rearranjos genéticos que previamente obscureceram a ortologia genética e a origem comum dos sarcômeros em animais com simetria radial e bilateral. Surpreendentemente, as estruturas genéticas fornecem a evidência convincente de que o tamanho extraordinário do domínio de bastão de distrofina reflete o legado histórico de uma classe paráloga de proteínas que ligam ao microtúbulo em que a seleção para aumentar o comprimento ocorreram antes do início do surgimento dos sarcômeros. Estas descobertas têm implicações críticas para a mecanobiologia da distrofina e o esquema das proteínas miniaturizadas para o uso terapêutico na distrofia muscular (Exemplos 2 e 3). Nossa reconstrução sugere que as restrições geométricas na morfologia celular e plano corporal precisaram de uma conexão forte, mas flexível entre o citoesqueleto cortical e a matriz extracelular antes da miosina poder ser arranjada de maneira segura nos sarcômeros na densidade necessária para alimentar a locomoção rápida independente da escala.

[0180] A titina é a maior proteína no proteoma humano, servindo na forma monomérica como a armação primária para formação de sarcômero (Zoghbi, M. E., Woodhead, J. L., Moss, R. L. & Craig, R. Three-dimensional structure of vertebrate cardiac muscle myosin filaments. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 2386-2390, doi:10,1073/pnas,0708912105 (2008); e Kontrogianni-Konstantopoulos, A., Ackermann, M. A., Bowman, A. L., Yap, S. V. & Bloch, R. J. Muscle giants: molecular scaffolds in sarcomerogenesis. Physiol Rev 89, 1217-1267, doi:10,1152/physrev,00017,2009 (2009)). Nos vertebrados, a titina é principalmente composta de imunoglobulina (IgG) e domínios de fibronectina tipo-III (Fn3) organizados em “super-repetições” que formam um filamento polarizado que abrange os semi-sarcômeros, com terminais N- e C- únicos localizados do disco Z e linha M, respectivamente. Entretanto, as proteínas semelhantes à titina previamente identificadas nas espécies invertebradas são amplamente divergentes em número, estrutura primária, composição de domínio e comprimento, complicando a delineação da ortologia funcional (Tskhovrebova, L. & Trinick, J. Titin: properties and family relationships. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 679-689 (2003)). Nossas descobertas indicam que um “supergene de titina ancestral” desta estrutura geral sofreu rearranjos genômicos específicos de linhagem extensa e expansões de repetição modular.

[0181] Nos vertebrados, a viabilidade das fibras do músculo estriado sob carga de trabalho é dependente na proteção de membrana conferida por uma ligação mecânica dependente da distrofina entre os sarcômeros mais externos e a matriz extracelular (Hoffman, E. P., Brown, R. H., Jr. & Kunkel, L. M. Distrophin: the protein product of the Duchenne muscular distrophy locus. Cell 51, 919-928, doi:0092-8674(87)90579-4 [pii] (1987)). Aproximadamente 75 % do peso molecular da distrofina é contribuído por um grande “domínio de bastão” central composto de 24 domínios de repetição de espectrina, com os domínios de flancos estabelecendo contatos adesivos nas terminações opostas (FIG. 6A; e dados não mostrados). Os pacientes com Distrofia Muscular de Becker (BMD) podem ter exclusões truncadas ou duplicações de comprimento confinadas aos éxons que codificam o domínio de bastão, implorando a pergunta de se a função fisiológica da distrofina foi otimizada nas 24 repetições. Nós perguntamos se o número de repetições semelhantes à espectrina nos ortólogos de distrofina crescem sob a pressão seletiva por toda a filogenia de metazoano, possivelmente, correlacionando com a saída de potência crescente na taxa selecionada durante a evolução das cadeias alimentícias predatórias hierárquicas. Como mostrado (FIG. 6C), a distrofina ancestral em existência antes da divisão Cnidário-Bilatariano é predita ter um domínio de bastão de comprimento idêntico àquele em ser humanos, mas não podemos encontrar nenhuma evidência de bastões significantemente mais curtos em ortólogos anteriores. De maneira interessante, nossa análise filogenética forneceu uma forte evidência de que o complexo protéico associado com distrofina abrangendo a membrana surgiu muito antes do que a multicelularidade de metazoário, com ortólogos de quase todos os componentes implicados na doença presentes in the grupos irmãos unicelulares para metozoário

(dados não mostrados). Os ortólogos de distrofina de ancestral mais recente não teve tanto o domínio de ligação de actina (ABD) do terminal N quanto o domínio de bastão inteiro e somente consistiu de um domínio “WW-EF-ZZ” do terminal C que liga ao distroglicano putativo (FIG. 6A, FIG. 6E; e dados não mostrados). A linhagem de ramificação mais antiga com um ortólogo de distrofina “moderno” (isto é um ABD do terminal N e um domínio de bastão alongado) é a espécie de Placozoários T. adherens em que o domínio de bastão é de tamanho similar àquele dos seres humanos (dados não mostrados). Deste modo, a distrofina estava no “comprimento completo” antes das expansões de IgG de titina e a emergência de sarcômeros; entretanto, a linhagem evolutiva do domínio de bastão até agora não foi resolvida porque a divergência de sequência significante entre as proteínas homólogas atrai o artefato de “atração de ramificação longa”.

[0182] Nós resolvemos este problema pela identificação dos estados de caráter ancestral que evoluem mais lentamente do que os aminoácidos individuais ou nucleotídeos dentro de uma sequência: a posição e fase dos introns com relação ao Modelo Oculto de Markovs para os domínios protéicos codificados. Verificamos que as repetições de espectrina da distrofina e MACF1 compartilham um intron de fase 0s conservado em um padrão visualmente impressionante na posição 46 de consenso HMM, contrastando nitidamente com os introns aleatoriamente distribuídos dos genes de espectrina (FIG. 6A e FIG. 6B). A ilustração da estase evolutiva das posições de introns relevantes é acentuada por nossa representação de somente aqueles compartilhados nos genes ortólogos de espécies remotamente relacionadas (por exemplo, note a evidência da duplicação de gene parcial ancestral que estendeu a beta espectrina ORF pesada em 13 repetições) (Fig. 6B). Esta análise do estado característico do domínio de bastão identifica um ortólogo de MACF, não uma beta- espectrina, como doador próximo da distrofina CH e domínios de bastão, sugerindo o nome “distroplaquina” para este grupo cladístico (FIG. 6C). As estruturas genéticas constituem uma forte evidência de que a distrofina surgiu evolutivamente quando uma duplicação parcial de um gene codificando a porção de terminal N de uma espectroplaquina semelhante à MACF1 ancestral se tornou ligada em cis ao gene codificando o ortólogo de distrofina semelhante à Dp71 ancestral (WW-EF-ZZ). Nos ortólogos de MACF gigantes das linhagens selecionadas, há evidências para a duplicação em tandem recentes de éxons codificando as repetições de espectrina. Isto suporta uma reconstrução em que a pressão seletiva para o alongamento progressivo do domínio de bastão ocorreu (e em algumas linhagens continua) no contexto celular de um “strut”, de reticulação de microtúbulo-actina mas não naquele da distrofina por si.

[0183] A comparação da evolução molecular dos domínios repetitivos na titina e distrofina revelou contrastes importantes. Matrizes de ponto revelam a evidência para uma “esteira” específica da linhagem da titina IgG e regiões de repetição de Fn3 (dados não mostrados), presumivelmente com base na multiplicação intercambiável em tandem regional enquanto a proteína geral é longa o suficiente para facilitar a sarcomerogênese. Entre os ortólogos de distrofina, a metabolização análoga das repetições de espectrina individuais parecem ter sido quase inexistentes, sugerindo uma seleção negativa forte contra estas por pelo menos 600 milhões de anos (dados não mostrados). Com base nestes resultados nós propusemos um modelo para a não permutabilidade das repetições de espectrina da distrofina, refletindo um papel da proteína na transmissão de força longitudinal, por meio da qual as interações de aminoácido entre as repetições de espectrina adjacentes devem ser preservadas pela ligação evolutiva (Hopf, T. A. et al. Mutation effects predicted from sequence co- variation. Nat Biotechnol 35, 128- 135, doi:10,1038/nbt,3769 (2017)) para manter a resistência à tração (dados não mostrados). Neste modelo, a seleção de purificação tem encontrado a novel justaposição, através da exclusão ou duplicação do gene interno, de repetições divergentes semelhantes à espectrina que foram previamente submetidas à evolução de aminoácido ligado com seus parceiros ancestralmente adjacentes (como observável na patogênese de BMD). Esta reconstrução de eventos ancestrais é novamente suportada por modelos de homologia alternativa de contraste das hélices triplas adjacentes do domínio de bastão de distrofina com base nos padrões divergentes fornecidos pelas espectrinas e plaquinas. (dados não mostrados). Em outras palavras, a evolução molecular da distrofina é consistente com a proposta de que a resistência à tração do domínio de bastão é mais importante do que seu comprimento, onde o último é um subproduto do seu legado histórico. O custo metabólico de perpetuar uma solução ancestral estruturalmente redundante ao problema da transmissão de força de transmembrana é inconsequentemente pequeno devido à localização da proteína a uma borda ultrafina do córtex citoesqueletal. Este conceito tem implicações críticas para o esquema de transgenes para as terapêuticas da doença, como demonstrado em detalhes nos Exemplos 2 e 3. B. Materiais e Métodos:

[0184] RNA-Seq: O transcriptoma de referência para Nematostella vectensis, foi montado a partir dos ESTs aglomerados originais publicados por JGI genome assembly (Putnam, N. H. et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetozoarion gene repertoire and genomic organization. Science 317, 86-94 (2007)) junto com os transcriptomas produzidos de uma linhagem clonal originada em Nova Jersey, EUA, (cepa NJ3) gerada pelo Finnerty Lab [Lubinski, et al., em revisão]. Contíguos redundantes foram removidos da montagem fundida usando CD-HIT com um corte de 100 % de identidade de sequência.

[0185] Buscas da ferramenta de busca de alinhamento local básico (BLAST): Os genomas foram submetidos a Blast usando algorítimos de BLASTp e/ou tBLASTn com parâmetros de pré-ajuste (matriz BLOSUM62, limiar de valor E esperado: 10, existência do custo de intervalo: 11, extensão do custo de intervalo: 1). Nos casos onde os homólogos completos não foram identificados, a região genômica em torno dos acertos de comprimento parcial de maior pontuação foi baixada e novamente a modelagem genética foi realizada (ver a seção de métodos de modelagem genética). Os transcriptomas foram submetidos a Blast do servidor NCBI BLAST usando o algoritmo de tBLASTn contra a banco de dados de montagem de espingarda de transcriptoma (TSA), novamente com os parâmetros pré-ajustados.

[0186] Modelagem Genética: Na ausência de dados de RNAseq correspondentes, os modelos genéticos que codificam a proteína foram derivados de programas do grupo FGENESH (www.softberry.com) usando parâmetros para encontrar genes específicos do organismo para o organismo listado mais intimamente relacionado com as espécies em consideração.

[0187] Análise do Domínio Protéico: Os domínios protéicos foram analisados executando-se a sequência de aminoácido primária contra os bancos de dados Pfam, TIGRFAM, CATH-Gene3D, Superfamília e HMM da família da proteína PIRSF usando a função HMMscan do European Particular Institute do pacote de suporte lógico HMMER (www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/-search/hmmscan) (Finn, R. D. et al. HMMER web server: 2015 update. Nucleic Acids Res 43, W30-38, doi:10,1093/nar/gkv397 (2015)).

[0188] Alinhamento de Repetição de Espectrina para Posição de Intron/Identificação de Fase: Todos os domínios de repetição de espectrina de HMM de perfil Pfam identificáveis foram alinhados à sequência de consenso de repetição de espectrina Pfam dentro do HMMscan. Estas repetições de espectrina foram sequencialmente alinhadas em uma sequência alinhamento de múltiplo de acordo com seu alinhamento relativo à sequência de consenso.

[0189] Posição de Intron/Identificação de Fase: As sequências de cDNAs anotadas por ORF foram alinhadas à sua estrutura genômica de codificação usando a função de matriz de ponto no MacVector (v15.1) (macvector.com) com um corte de 94 % de identidade de sequência. A posição e fase dos introns foram identificadas como pontos de quebra no alinhamento. Cada posição e fase do intron foi confirmada pela presença do doador do sítio de encaixe de consenso (-GT) e sítios aceitadores (AG-) presentes dentro da sequência de DNA genômico imediatamente depois e antes de cada bloco alinhada com 100 % de identidade, respectivamente.

[0190] Identificação de Intron Ancestral Inferida: os introns ancestrais inferidos são aqueles que são compartilhados entre as proteínas ortólogas em H. sapiens e A. queenslandica ou N. vectensis.

[0191] Matrizes de ponto: cDNA/DNA, proteína/DNA genômico e proteína/matrizes de ponto de proteína foram gerados dentro do MacVector (v15,1) (macvector.com).

[0192] Modelagem de homologia das repetições de espectrina de distrofina: Phyre2 foi usado para modelar as repetições de espectrina adjacentes da distrofina humana (www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N. & Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc 10, 845-858, doi:10,1038/nprot,2015,053 (2015)). Modelos de homologia diferentes foram gerados usando as estruturas cristalinas da beta2-espectrina (PDB-ID = 3EDV) (Davis, L. et al. Location and structure of the ankyrin-binding site on beta2-espectrina. J Biol Chem 284, 6982-6987, doi:10,1074/jbc.M809245200 (2009)) ou plectina (PDBID = 5J1G) (Ortega, E. et al. The Structure of the Plakin Domain of Plectin Reveals an Extended Rod-like Shape. J Biol Chem 291, 18643-18662, doi:10,1074/jbc.M116,732909 (2016)) como o padrão para o modelo de homologia.

[0193] Disponibilidade de Dados: Os dados de sequência usados para suportar as descobertas neste papel são providos na Informação Suplementar. Todos os outros dados estão disponíveis do autor correspondente a pedido. Exemplo 2 - Terapia de gene eficaz para distrofia muscular usando a Entende liberação mediada por AAV da micro-utrofina A. Resultados e Discussão

[0194] O produto de proteína essencial do gene da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é distrofina (Hoffman, E. P., Brown, R. H., Jr. & Kunkel, L. M. Dystrophin: a protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51, 919- 928, doi:0092-8674(87)90579-4 [pii] (1987)), uma proteína de 427 kd semelhante a bastão (Koenig, M., Monaco, A. P. & Kunkel, L. M. The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Cell 53, 219-226 (1988)) que protege os miócitos estriados da lesão induzida por contração (Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M. & Sweeney, H. L. Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90, 3710-3714 (1993)) pela ligação do citoesqueleto cortical à matriz extracelular (Ibraghimov-Beskrovnaya, O. et al. Primary Structure of dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the extracellular matrix. Nature 355, 696-702, doi:10,1038/355696a0 (1992)). A maioria dos pacientes com DMD têm exclusões de mudança de quadro de multi-éxon,

enquanto muitos com a doença de Becker MD alélica branda têm mutações que conservam a estrutura que mudam o comprimento do domínio de bastão de 150 nm da distrofina (Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H. & Kunkel, L. M. An explanação for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics 2, 90-95 (1988); e Koenig, M. et al. A base molecular for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion. American journal of human genetics 45, 498-506 (1989)). Nossa análise da história evolutiva profunda da distrofina sugere que o domínio de bastão foi cooptado de uma proteína citoesqueletal mais longa e surgiu antes da emergência do músculo estriado poderoso (Exemplo 1). Neste ponto nós mostramos que um transgene sintético otimizado no códon codificando um substituto de 25 nm não imunogênico, para distrofina, planejado racionalmente da proteína utrofina paráloga (Tinsley, J. M. et al. Primary Structure of dystrophin-related protein. Nature 360, 591- 593, doi:10,1038/360591a0 (1992)) para preservar a resistência à tração do domínio de bastão miniaturizado, previne a maioria dos aspectos histológicos e fisiológicos mais prejudiciais da distrofia muscular em modelos animais. Após a administração sistêmica de um vetor AAV a camundongos mdx deficientes em distrofina neonatais, todos os marcadores histológicos e bioquímicos de mionecrose e regeneração são completamente suprimidos por todo o crescimento até o peso adulto. Em cães deficientes em distrofina similarmente tratados até 4 kg de peso corporal, a distribuição e expressão sistêmicas do transgene preveniu a mionecrose sem reconhecimento imune mediado por célula do produto protéico, sugerindo a proteção através da tolerância imunológica central à utrofina completa. Estas descobertas suportam um modelo em que a resistência à tração é a característica essencial da distrofina e bastões de utrofina, com seu comprimento de 150 nm na maioria das linhagens preservadas purificando-se a seleção contra mutações que reduzem o comprimento à custa da força.

[0195] Embora os vetores internamente excluídos derivados de adenovírus humano tenham sido usados para obter a transferência de cDNAs de 12 kb codificando a distrofina de comprimento completo, este método foi abandonado por causa da imunogenicidade e biodistribuição limitada do capsídeo de vetor complexo (Clemens, P.

R. et al.

In vivo muscle gene transfer of full-lenght dystrophin with an adenoviral vector that lacks all viral genes.

Gene therapy 3, 965-972 (1996)). Múltiplos vetores derivados dos vírus associados com adenovírus humano (AAVs) foram mostrados facilitar a transferência genética sistêmica (Wang, B., et al.

Adeno- associated virus vector carrying human minidystrophyn genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model.

Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13714-13719. (2000); Harper, S.

Q. et al.

Modular flexibility of dystrophyn: implications for gebe therapy of Duchenne muscular dystrophy.

Nat Med 8, 253-261. (2002); Gregorevic, P. et al.

Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors.

Nat Med 10, 828-834 (2004); e Gregorevic, P. et al. rAAV6-microdystrophin preserves muscle function and extends lifespan in severely distrophic mouse.

Nat Med 12, 787-789 (2006)), mas sua capacidade de clonagem é limitada àquela do vírus do tipo selvagem, aproximadamente 5 kb.

Uma segunda restrição igualmente importante na terapia de gene para DMD é a natureza delecional da deficiência protéica na maioria dos pacientes, com o potencial para distrofina recombinante como uma proteína “não própria” (Mendell, J.

R. et al.

Distrofina immunity in Duchenne's muscular dystrophy.

N Engl J Med 363, 1429-1437 (2010)) para desencadear a miosite autoimune crônica.

Nós hipotetizamos que a análise detalhada da evolução molecular da distrofina pode informar um método de biologia sintética para ambas destas restrições, revelando-se previamente aspectos não apreciados do legado histórico da proteína.

Nossa reconstrução da história remota da distrofina sugeriu que no princípio da proteína, seu domínio de bastão continha 24 repetições do domínio helicoidal triplo “semelhante à espectrina” cooptado de uma porção de terminal N de uma outra proteína citoesqueletal semelhante à strut muito maior (Exemplo 1). As estruturas cristalinas de repetição helicoidal triplas da distrofina, utrofina e uma espectroplaquina intimamente relacionada sugerem que as interações de cadeia lateral de aminoácidos entre as repetições adjacentes criam uma interface de bloqueio crítica para a resistência do bastão.

Este princípio pode explicar os fenótipos resultantes das exclusões enquadradas e duplicações em pacientes com BMD e a raridade das exclusões nos parálogos de acordes (por exemplo, Lamprey) como a maioria dos rompimentos da sequência nativa de repetição helicoidal tripla tem o potencial para enfraquecer focalmente o domínio de bastão. Para minimizar o risco de criar uma “ligação mais fraca”, nós focamos nas exclusões flanqueadas em um lado pelo domínio desordenado classicamente rotulado como “Dobradiça 2” e também as sequências de terminal C excluídas além da terminação aproximada do domínio ZZ (Ishikawa-Sakurai, M., Yoshida, M., Imamura, M., Davies, K. E. & Ozawa, E. O domínio ZZ é essencialmente necessário para a ligação fisiológica da distrofina e utrofina ao beta-distroglicano. Hum Mol Genet 13, 693-702, (2004); Hnia, K. et al. ZZ domain of dystrophin and utrophin: topology and mapping of a beta-distroglycan interaction site. Biochem J 401, 667-677, (2007)). Para tomar vantagem da tolerância imunológica central obtida através da expressão do desenvolvimento precoce no timo (Mesnard- Rouiller, L., et al. Thymic myoid cells express high levels of muscle genes. J Neuroimmunol 148, 97-105, 2003), nós mapeamos estas exclusões na distrofina na proteína utrofina paráloga, que divergiu da distrofina anterior na evolução dos vertebrados. Com base nestas considerações, nós sintetizamos transgenes com base nas sequências de mRNAs de utrofina do tipo selvagem e depois melhoramos a expressão usando uma versão projetada da sequência. Aqui, relatamos os resultados obtidos em estudos pré-clínicos cegos usando vetores com base em AAV9 e o capsídeo ancestral derivado “Anc80” para liberar sistemicamente um transgene sintético de 3,5 kb (AAV9-µU, AAV9-µUtrofina) para todos os músculos estriados.

[0196] Nós inicialmente realizamos injeções intraperitoneais de doses até 2,5 x 1012 vg de AAV-µUtrofina em camundongos mdx neonatais pesando cerca de 5 gm e investigamos o grau de mioproteção por todo o desenvolvimento muscular. Nestes estudos cegos aleatorizados, nós observamos a biodistribuição global equivalente ao músculo tanto com AAV9 quanto Anc80 e ambos foram em tolerados em camundongos sem qualquer sinal de toxicidade (FIG. 7A – FIG. 7C). Na dose de 2,5 x 1012 vg/camundongo, a µUtrofina recombinante foi expressada em um nível suficiente para completar qualitativamente a supressão de todos os sinais biológicos testados da distrofia muscular, incluindo a centronucleação de miofibra (FIG. 7A e FIG.

7D), expressão da cadeia pesada da miosina embrionária (FIG. 7A e FIG. 7B), suprarregulagem da utrofina nativa (FIG. 7A e FIG. 9A), expressão de MURF1 como um marcador da degradação protéica, apoptose mionuclear (dados não mostrados), mionecrose em curso e infiltração da célula mononuclear (FIG. 7B). Destes sinais, a centronucleação é quantitativamente o indicador mais sensível da mioproteção e, camundongos mdx visto que este reflete os ciclos anteriores de regeneração. Pela primeira vez, nós demonstramos a normalização (ou prevenção) da centronucleação até um nível biologicamente indistinguível do tipo selvagem (FIG. 7D). Esta mioproteção observada foi associada com a normalização sustentada do complexo de glicoproteína associado com distrofina (DGC) no sarcolema dos músculos cardíacos e esqueletais (FIG. 7A). A análise de western blot também confirmou que a proteína de µUtrofina expressada foi suficiente para estabilizar a DGC (FIG. 7C). A expressão sustentada de µUtrofina nos músculos esqueletais e cardíacos foi observada por todo um período de 4 meses após a liberação do vetor (o ponto final do estudo), indicando o nível durável de mioproteção conferido ao tratamento de dose única. Notavelmente, a creatina cinase, um biomarcador que reflete a permeabilidade sarcolemal, foi estatisticamente indistinguível daquele dos camundongos do tipo selvagem (FIG. 7E), sugerindo que a otimização de códon e super-expressão da proteína recombinante precocemente no desenvolvimento melhorou a resposta relativa à administração de transgenes alternativos por intermédio da injeção pela veia da cauda depois do início da miopatologia (Gregorevic, P. et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nat Med 10, 828-834, 2004; Odom, G. L. et al. Micro-utrophin delivery through rAAV6 increases lifespan and improves muscle function in distrophic dystrophin/utrophin-deficient mice. Mol Ther 16, 1539-1545, 2008; Kennedy, T. L. et al. Micro-utrophin Improves Cardiac and Skeletal Muscle Function of Severely Affected D2/mdx Mice. Mol Ther Mehods Clin Dev 11, 92-105, 2018).

[0197] Para testar se a AAV9-µUtrofina confere uma melhora funcional nos camundongos mdx, nós utilizamos um ensaio híbrido estabelecido que liga o teste de teste de força de aperto com um componente volicional no qual nós medimos de maneira não invasiva a atividade vertical da força pós aperto dos animais (Song, Y. et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the distrophic mdx mouse. J Appl Physiol 122, 593-602, 2017). Nossos estudos anteriores mostram que este teste híbrido provê um dos parâmetros clínicos relevantes mais sensíveis os camundongos distinguindo mdx e do tipo selvagem, capturando o comportamento casualmente ligado à resposta à fadiga exagerada do músculo deficiente em distrofina (Kobayashi, Y. M. et al. Sarcolemma- localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature 456, 511- 515, 2008). Este teste demonstrou uma diferença objetiva, dramática e estatisticamente significante entre os camundongos mdx não tratados e tratados com AAV9-µUtrofina, enquanto o último grupo foi indistinguível dos camundongos do tipo selvagem (FIG. 7F). Além disso, os camundongos mdx tratados não mostraram somente distâncias em roda voluntária tratada (8 semanas) e distâncias de corrida em esteiras em declive (16 semanas) com relação aos camundongos não tratados, mas seus músculos EDL isolados ex vivo apresentaram uma resistência melhorada à contração excêntrica –lesão induzida, assim como um desempenho muscular melhorado in vivo pelo teste de força de aperto. Estas descobertas sugerem que a sobre-expressão precoce da Utrofina é capaz de uma melhora fenotípica completa na ausência da distrofina completa, apesar do comprimento comparativamente curto da ligação semelhante a bastão da proteína reversa projetada ao citoesqueleto de actina e a falta de uma porção de ligação R16-17 nNOS.

[0198] Estes resultados criaram a esperança de obter uma reversão completa, ao invés da reversão parcial semelhante a BMD da fisiopatologia de DMD através da transdução muscular sistêmica; entretanto, não foi claro se as diferenças dependentes de escala entre animais distróficos pequenos e grandes revelariam, limitações a este método. As consequências histológicas e imunológicas da transferência genética de µUtrofina foram novamente investigadas em um estudo cego em que cinco cães Golden Retriever com Distrofia Muscular (GRMD) com 4 a 7 dias de idade foram aleatorizados para a administração intravenosa de AAV9-µUtrofina em doses de 1 x 1013 e 3,2 x 1013 vg/kg no hora da injeção, sem imunossupressão. Seis semanas após a injeção, nós observamos a expressão e estabilização robustas dos níveis de µUtrofina do tipo selvagem da expressão de sarcoglicano no sarcolema (dados não mostrados). Além disso, estes cães tratados obtiveram um aumento de quatro vezes no peso similar àquele das fêmeas portadoras, ao contrário da diminuição do peso anteriormente indicada associada com a miosite imune após a administração sistêmica da distrofina xenogênica humana no mesmo modelo de GRMD. Kornegay, J. N. et al. Generalized muscle expression of a AAV9 human mini-distrophin vector after intravenous injection in neonatal distrophin-deficient dogs. Mol Ther 18, 1501- 1508, 2010). Esta expressão de µUtrofina sustentada foi associada com os níveis visivelmente reduzidos de mionecrose, normalização da infiltração mononuclear do diâmetro de Feret mínimo da miofibra (dados não mostrados). Em 5 e 8 semanas após a administração do vetor, os ensaios de ELISpot interferona-γ canina não revelaram nenhuma imunidade mediada por células contra o capsídeo AAV ou o produto transgene de µUtrofina e, nossos cães GRMD tratados não imunossuprimidos (dados não mostrados). A principal limitação deste estudo de prova de conceito deriva da diferença de 1000 vezes entre o peso adulto dos camundongos mdx e cães GRMD, 25 g e 25 kg respectivamente, limitando nossa dose AAV9 obtenível no cão a 2,0 x 1012 vg/kg com base no peso adulto antecipado. Nesta dose, os cães inevitavelmente “cresceriam demais” o vetor, como fez os camundongos mdx tratados com 2,15 x 1011 vg como 5 gm de neonatais (dados não mostrados). Portanto, nós focamos na análise histológica relativamente recente para detectar a expressão de µUtrofina recombinante, proteção de miócito e a resposta imune à administração de vetor sistêmica.

[0199] Nosso método neonatal oferece a possibilidade tratamento preventivo precoce antes do início do dano muscular irreversível e minimiza o risco da reação imune contra os antígenos do capsídeo de vetor, conforme as células T de memória reconhecendo que o AAV do tipo selvagem se desenvolve através da exposição ao ambiente em série Nichols, T. et al. Translational Data from AAV-Mediated Gene Therapy of Hemophilia B in Dogs. Hum Gene Ther Clin Dev, 2014; Calcedo, R. et al. Adeno-associated virus antibody profiles in newborns, children and adolescents. Clin

Vaccine Immunol 18, 1586-1588, 2011). Entretanto, a maioria dos pacientes DMD são tipicamente diagnosticados depois da idade de dois, através deste tempo o qual a degeneração da fibra muscular massiva, necrose com invasão celular mononuclear e variabilidade de tamanho de fibra aumentada já ocorreram (Yiu, E. M. & Kornberg, A. J. Duchenne Muscular Distrophy. Journal of paediatrics and child health 51, 759-764, 2015). Para explorar a viabilidade do nosso método em rapazes jovens com DMD, dois cães GRMD juvenis com 7,5 semanas de idade (Hann and Beetle) foram injetados intravenosamente com AAV9-Utrofina em uma dose tão alta quanto 1,25 x 1014 vg/kg na hora da injeção, durante o use transitório de uma dose de anti- inflamatório de prednisona, 1 mg/kg diariamente (Liu, J. M. et al. Effects of prednisone in canine muscular distrophy. Muscle Nerve 30, 767-773, 2004) (FIG. 8A). O imunotingimento das biópsias musculares, tomadas quatro semanas após a injeção, apresentou a expressão sarcolemal homogênea da Utrofina (FIG. 9A e dados não mostrados), a supressão da utrofina nativa (FIG. 9A), assim como o resgate do DGC (FIG. 9B). Isto foi novamente confirmado por western blot (FIG. 9D).

[0200] A caracterização histopatológica do músculo dos membros dos cães GRMD tratados demonstram a supressão quase completa da lesão muscular em curso, como evidenciado em controles pareados por idade não tratados por uma alta taxa de fibras mionecróticas, acúmulo de cálcio excessivo (FIG. 8C e FIG. 8E), fibras musculares de regeneração aglomerada (FIG. 8D e FIG. 8F), infiltração celular inflamatória abundante e infiltração de gordura (FIG. 10B e dados não mostrados). Impressivamente, os cães tratados com AAV9-Utrofina também mostraram a prevenção quase completa de degeneração muscular e regeneração em músculos mastigatórios (FIG. 8B e dados não mostrados), que são severamente afetados em cães não tratados porque estes expressam a isoforma de miosina MYH16 unicamente poderosa (Stedman, H. H. et al. Miosin gene mutation correlates with anatomical changes in the human lineage. Nature 428, 415-418 (2004); Toniolo, L. et al. Masticatory miosin unveiled: first determination of contractile parameters of muscle fibers from carnivore jaw muscles. Am J Physiol Cell Physiol 295, C1535-1542 (2008)). Uma outra análise de western blot na necrópsia (3,5 meses de idade) mostrou a expressão generalizada persistente da Utrofina no músculo esqueletal e cardíaco (FIG. 9C). Consistente com nossos estudos com cães GRMD neonatais anteriores, os ensaios de ELISpot interferona- não revelaram nenhum sinal acima do conhecimento contra Utrofina (dados não mostrados), Além disso, nenhum sinal de toxicidade acuda severa foi visto, ao contrário dos estudos anteriores em cães GRMD e primatas não humanos (Kornegay, J. N. et al. Generalizated muscle expression of an AAV9 human mini-distrophin vector after intravenous injection in neonatal distrophin-deficient dogs. Mol Ther 18, 1501-1508 (2010); Hinderer, C. et al. Severe Toxicity in Nonhuman Primates and Piglets Following High-Dose Intravenous Administration of an Adeno- Associated Virus Vector Expressing Human SMN. Hum Gene Ther, (2018); Hordeaux, J. et al. The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice. Mol Ther, (2018)). De maneira importante, uma queda de 80 % nos níveis de CK no soro foi medida 1 semana após a infusão com AAV9-Utrofina em ambos os cães dogs (FIG. 8G), uma descoberta que é consistente com as melhoras histológicas observadas. De modo a obter uma mioproteção durável por todo o crescimento muscular da infância à maturidade esqueletal, os cães distróficos e rapazes com DMD podem precisar da administração sistêmica do vetor de AAV em doses proporcionais àquela necessária em filhotes de camundongo mdx para manter a expressão robusto e homogênea no músculo mais severamente afetado, o diafragma (Stedman, H. H. et al. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature 352, 536-539, (1991)), por exemplo, 1 x 1015 vg/kg de peso corporal neonatal (dados não mostrados).

[0201] Para a avaliação pré-clínica rigorosa do vetor e/ou imunotoxicidade de transgene, nós tiramos vantagem do modelo canino Pointer Alemão de Pelo Curto delecional-nulo único (GSHPMD) (Schatzberg, S. J. et al. Molecular analysis of a spontaneous dystrophin 'knockout' dog. Neuromuscul Disord 9, 289-295. (1999); VanBelzen, D. J. et al. Mechanism of Deletion Removing All Dystrophin Exons in a Canine Model for DMD Implicates Concerted Evolution of X Chromosome Pseudogenes. Mol Ther Methods Clin Dev 4, 62-71, (2017)). O GSHPMD provê uma plataforma superior para o estudo da tolerância central, visto que a emenda alternativa no modelo de GRMD permite a leitura detectável da distrofina quase completa em níveis potencialmente tolerantes, como poderia ser esperado para facilitar o efeito terapêutico previamente demonstrado, a expressão de todo o corpo de longo prazo de microdistrofinas caninas codificadas por AAV (Schatzberg, S. J. et al. Alternative dystrophine gene transcripts in golden retriever muscular dystrophy. Muscle Nerve 21, 991-998. (1998); Yue, Y. et al. Safe and bodywide muscle transduction in young adult Duchenne muscular dystrophy in dogs with adeno-associated virus. Hum Mol Genet 24, 5880-5890, (2015); Le Guiner, C. et al. Long-term microdystrophin gene therapy is effective in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun 8, 16105, (2017)). Os cães GSHPMD adultos (Ned and Grinch) receberam, cada um, doses equivalentes (2 x 1012vg/kg) tanto de AAV9-µDistrofina quanto de AAV9-µUtrofina por intermédio da injeção intramuscular nos compartimentos tibiais contralaterais (FIG. 10A). A detecção de Interferona- por intermédio de ELISPOT revelou a presença de uma resposta imune mediada por célula sistêmica forte contra a µDistrofina, tão logo quanto 2 semanas após a injeção, mas não à µUtrofina apesar da expressão do promotor de CMV constitutivo, indicando a força da tolerância imunológica central (FIG. 10B). O imunotingimento das biópsias musculares coletadas 4 semanas após a injeção revelaram a expressão persistente da µUtrofina, mas somente quantidades esparsas de µDistrofina (FIG. 10C). H&E mostrou uma inflamação severa e infiltração da célula mononuclear no lado injetado com µDistrofina se comparado com sua ausência virtual no lado injetado com µUtrofina (FIG. 10D e dados não mostrados). Estas descobertas indicam que a resposta imune observada é conduzida pela µDistrofina e não o capsídeo do vetor, considerando que as doses equivalentes do vetor foram injetadas em ambos os membros.

[0202] Em resumo, depois de aproveitar um método filogenômico comparativo para identificar as restrições evolucionarias, nós projetamos reversamente um transgene sintético de 3,5 kb altamente terapêutico para a liberação sistêmica segura aos músculos de modelos murinos e caninos para DMD. Nossos estudos cegos surpreendentemente revelaram a mioproteção completa contanto que o nível inicial da liberação de gene seja suficiente para acomodar o crescimento muscular subsequente. Tomadas juntas, estas descobertas podem mudar o foco do campo para o uso de um método de terapia de gene com base em Utrofina funcionalmente otimizado não imunogênico, como um tratamento para a distrofia muscular de Duchenne. B. Materiais e Métodos a. Bioinformáticas e Análise filogenética

[0203] As sequências de DNAs genômicos publicamente disponíveis para as espécies listadas nas legendas das figuras e os textos manuscritos foram questionados pelos algorítimos de blast múltiplos, em particular tBLASTn26,27, para identificar as sequências codificadoras homólogas à distrofina e utrofina humanas completas. Para a maioria das espécies, o suporte da evidência das sequências de mRNAs estava disponível para definir os limiares de íntron/éxon. Onde não houve tal evidência, FGENESH+ (Softberry) foi usado com parâmetros de descoberta de gene específicos do organismo e o Modelo Oculto de Markov mais a predição genética com base em proteína similar para identificar a sequências codificadoras putativas dos contíguos montados. Como um teste interno deste método, virtualmente todas as sequências codificadoras definidas por transcriptoma foram propriamente identificadas pelo FGENESH+ program28. Nós reconhecemos que estes arquivos de sequências de mRNA e de proteína estão faltando éxons esporádicos em regiões indeterminadas do DNA genômico publicamente disponível. HMMER (hmmer.janelia.org/search/hmmscan) foi usado com cortes definidos pelo E-valor para definir os domínios que codificam a proteína emparelhados com o Modelo Oculto de Markovs para a homologia de calponina, repetição semelhante à espectrina, domínios WW, mão EF e ZZ. Todos os arquivos de sequência de peptídeo deduzidos foram alinhados por ClustalW usando os ajustes padrão no MacVector versão 13.5.1: Gonnet Series Matrix com parâmetros para a penalidade de intervalo aberto do alinhamento aos pares de 10, penalidade de intervalo estendido de 0,1 e parâmetros para a série de intervalo aberto de alinhamento múltiplo de 10, penalidade de intervalo estendido de 0,2 e divergência de atraso de 30 %. As reconstruções filogenéticas foram geradas tanto com o comprimento completo quanto com as sequências truncadas usando o método de construção de união de três vizinhos com empates em árvores resolvidos aleatoriamente e distâncias corrigidas com Poisson com os intervalos proporcionalmente distribuídos ou ignorados para estabelecer se a escolha impactou na topologia da árvore. Em todos tais casos, a topologia da árvore foi insensitiva à administração dos intervalos quando o modo “melhor árvore” foi selecionado. O uso alternativo do modo de bootstrap, com 10000 replicações, confirmou todos os nós nos filogramas de distância. As análises da matriz de proteína e DNA foram fundamentadas na matriz de pontuação pam250. Abreviações usadas: Ouriço-do-mar roxo, Strongylocentrotus purpuratus, S.pur; Anfioxus, Branchiostoma floridae, B.flo; Tubarão Elefante, Callorhinchus milii, C.mil; aligator Chinês, Alligator sinensis, A.sin; Camundongo, Mus musculus, M.mus; Cão, Canis familiaris, C.fam; Ser Humano, Homo sapiens, H.sap; Carolina anole, Anolis carolinensis, A.car; chimpanzé comum, Pan troglodytes, P.tro; ornintorrinco bico-de-pato, Ornithorhynchidae anatinus, O.ana.; Baiacu Japonês, Takifugu rubripes, T.rub; sapo tropical com garras, Xenopus tropicalis, X.tro; D – distrofina; U – utrofina. b. Esquema de Micro-utrofina Transgene e Produção de Vetor

[0204] Com base na análise filogenômica da conservação de sequência e correlações de genótipo-fenótipo entre os pacientes BMD/DMD, modelamos in silico o espectro das utrofinas miniaturizada codificáveis por AAV que preservam os domínios de homologia de calponina, as primeiras três e as últimas três repetições semelhantes à espectrina e a combinação dos domínios WW, mão EF e ZZ. Para preservar as interações das cadeias laterais do aminoácido entre as alças inter-hélicas das repetições adjacentes semelhantes à espectrina, nós focamos somente no subconjunto de µUtrofina em que as primeiras ou últimas três repetições foram conservadas intactas. Para minimizar a imunogenicidade, nós consideramos somente aquela µUtrofina que pode ser criada pela combinação de uma única exclusão interna e uma truncagem do terminal C. Embora as repetições semelhantes à espectrina sejam homólogas a uma sequência de consenso, a divergência é tal que nenhum encaixe pode ser encontrado entre os decapeptídeos idênticos em qualquer uma das utrofinas de mamífero. Assim, nós usamos o perfil Modelo Oculto de Markovs, como implementado online em hmmer.janelia.org/search/hmmscan, para definir e anotar os limiares helicoidais triplos de repetição semelhantes à espectrina na sequência de utrofina canina de comprimento completo (3456 aa, XP_005615306). Nós usamos proteínas que codificam transgenes coincidindo com as proteínas caninas e humanas nos camundongos neonatais, em que a tolerância específica de antígeno é facilmente induzida pela injeção intraperitoneal de AAV45, mas somente as versões caninas em cães neonatais e mais velhos, em que tolerância é antecipada para requerer a exposição pré-natal precoce para a proteína isogênica nativa durante a ontogenia imune (Davey, M.

G. et al.

Induction of Immune Tolerance to Foreign Protein via Adeno-Associated Viral Vector Gene Transfer in Mid-Gestation Fetal Sheep.

PLoS A 12, e0171132, (2017)). O transgene de µUtrofina foi planejado para conter o domínio de ligação de actina, repetições helicoidais triplas 1 a 3 e 22, um região desordenada rica em prolina aproximando o que foi previamente identificado como “dobradiça” 2 e os domínios WW, mão EF e ZZ do terminal C, deste modo criando uma proteína recombinante projetada para coincidir com a sequência de utrofina canina e humana com a exceção de um único local de encaixe na junção de exclusão, minimizando deste modo a imunogenicidade potencial nos cães deficientes em distrofina e, enfim, em seres humanos com relação aos transgenes previamente indicados (Wang, B., et al.

Adeno-associated virus vector carrying human minidistrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model.

Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13714-13719. (2000); Harper, S.

Q. et al.

Modular flexibility of dystrophyn: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy.

Nat Med 8, 253-261. (2002); Gregorevic, P. et al.

Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno- associated viral vectors.

Nat Med 10, 828-834 (2004); Gregorevic, P. et al. rAAV6- microdistrophin preserves muscle function and extends lifespan in severely distrophic mice.

Nat Med 12, 787-789 (2006); e Odom, G.

L., et al.

Micro-utrophin delivery through rAAV6 increases lifespan and improves muscle function in distrophic distrophin/utrophin-deficient mice.

Mol Ther 16, 1539-1545 (2008)). A sequência codificadora escolhida para o uso em nossos estudos foi selecionada como o candidato de expressão mais alta de um conjunto de cDNAs que foram otimizados e sintetizados pelas empresas de biotecnologia concorrentes (GeneArt e DNA 2.0). A expressão foi determinada pelo tingimento de imunofluorescência e eletroporação por western blotting após 50 µg de DNA no músculo anterior da tíbia dos camundongos mdx. A sequência codificadora sintética escolhida para uso adicional foi descoberta conduzir a expressão aproximadamente 30 vezes maior em ensaios in vitro e in vivo do que a sequência de cDNA canina do tipo selvagem que codifica uma proteína recombinante de estrutura primária idêntica. Uma diferença notável entre o melhor cDNA sintético e do tipo selvagem é o nível de viés de códon, com somente um cDNA sintético otimizado coincidindo intimamente com o viés extremo das cadeias pesadas de miosina mamífera (por exemplo, 154 CTG leucinas, 0 TTA leucinas). O cDNA de µUtrofina canina sintética foi subclonado em um cassete de vetor de expressão AAV2 conduzido por um fragmento de 833 bp do CMV imediato antes do realçador/promotor ou um promotor sintético spc5-12 (CMV e SP, respectivamente). Os vetores AAV9 foram gerados e purificados pelo núcleo de vetor pré-clínico da Universidade da Pensilvânia usando o método de transfecção tripla em células HEK 293 como previamente descrito (Vandenberghe, L. H. et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther 21, 1251-1257, doi:10,1089/hum,2010,107 (2010)). As preparações do vetor foram ensaiadas quanto à qualidade, pureza e níveis de endotoxina antes de reunir para injeção de 2 x 1011 de AAV9 µUtrofina vg nos músculos anteriores da tíbia de camundongos mdx (Lock, M., et al. Analysis of particle content of recombinant adenoassociated virus serotype 8 vectors by ion-exchange chromatography. Hum Gene Ther Methods, 23, 56-64, doi:10,1089/hgtb,2011,217 [pii]). c. Animais - Geral

[0205] O Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade A&M e da Universidade da Pensilvânia aprovaram todos os protocolos de experimento animal em camundongos e cães. d. Administração de Vetor no Modelo Murino

[0206] As cepas de Camundongo C57BL/10SnJ e mdx foram adquiridas do

Jackson laboratory (Bar Harbor, ME). Este estudo envolveu 23 camundongos C57BL/10SnJ e 30 camundongos mdx, todos injetados a 9 ± 2 dias de idade. Antes de receber a injeção intraperitoneal de AAV9 µUtrofina ou Solução Salina Tamponada (PBS), os filhotes individuais foram tatuados no dedo do pé com o kit Aramis Micro tattoo (Ketchum Manufacturing Inc, Canadá) e atribuídos aleatoriamente a diferentes grupos de dosagem. Os investigadores foram cegos durante todas as injeções e coleta de tecidos. Com base neste protocolo, os filhotes de C57BL/10SnJ e mdx foram injetados com 50 a 250 µl de PBS como controle negativo ou AAV9 µUtrofina diluída em PBS por intermédio de uma seringa de insulina de calibre 32. Antes da injeção, cada camundongo foi pesado. Depois da administração do vetor, todos os camundongos foram retornados a suas ninhadas e separados depois de do desmame. e. Aquisição e Armazenamento do Tecido do Modelo Murino

[0207] em aproximadamente 8 semanas de idade, os camundongos mdx e C57BL/10SnJ foram submetidos à eutanásia com CO2 de acordo com a política institucional. O coração, tíbia anterior, gastrocnêmio, quadríceps, tríceps, músculos abdominais, do diafragma, temporalis e fígado foram coletados e novamente processados; outros foram armazenados mas não utilizados com base nos estudos mostrando uma expressão genética fora do alvo < 100 vezes menor na AAV9 em camundongos, Zincarelli, C. et al. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther 16, 1073-1080 (2008)). As amostras de tecido histológico projetadas foram colocadas em OCT (Tecido - Tek) contendo moldes embebidos (Richard-Allan Scientific) e rapidamente congeladas em isopentano resfriado em nitrogênio líquido. As amostras de tecido biológico projetados adicionais foram colocadas em recipientes para tecido e rapidamente congeladas em nitrogênio líquido. Todas as amostras foram armazenadas a -80° C. As criosseções de 5 a 7 µm de espessura foram cortadas em um criostato (Microm HM550, Thermo Scientific, EUA) A -25° C e montadas em lâminas de vidro (Superfrost Plus, Fisher Scientific, EUA). f. Histologia Básica – Tingimento com Hematoxilina e Eosina (H&E) e Tingimento com Vermelho Alizarina (ARS)

[0208] Seções cruzadas com 7 µm de espessura foram secadas com ar por 15 minutos na temperatura ambiente. Depois as lâminas foram tingidas com corante de hematoxilina de Harris por 2,5 minutos, lavadas em água destilada, imersas em 0,1 % de ácido acético por 15 segundos, seguido por uma lavagem de repetição em água de torneira por 4 mins e contracoloração com eosina a 1 % por 1 min. Como uma etapa final, as lâminas foram desidratadas em etanol três vezes, 2 mins cada. Os campos de alta potência que não de sobreposição representativos (HPF) foram fotografados para marcação (dados agora mostrados). O tingimento por vermelho Alizarina também foi realizado em seções cruzadas com 7 µm de espessura. Depois de 10 min de fixação por fosfato de formalina tamponada a 10 %, as seções foram lavadas 3 x 5 min com PBS e incubadas com o corante vermelho alizarina por 15 min na temperatura ambiente. Depois deste procedimento, as lâminas foram lavadas em etanol 3 vezes e montadas por cytoseal 60 (Thermo Scientific). g. Análise Morfométrica

[0209] Três grupos de camundongos, C57BL/Sn10J (controle) e mdx aleatorizados para injeção com PBS ou AAV9 µUtrofina, foram estudados pelos pesquisadores cegos para a identificação de amostra. De quatro a cinco áreas aleatoriamente escolhidas de cada tíbia anterior, gastrocnêmio, quadríceps, tríceps, temporalis e músculos abdominais, foram tingidas com H&E e rastreadas com microscópio ótico para a quantificação de miofibras centralmente nucleadas. As áreas nas junções do miotendônio foram excluídas das medições considerando que são ricas em fibras centralmente nucleadas tanto em mdx quanto em controles. No total,

11.649 fibras foram avaliadas. h. Procedimentos de Tingimento de Imunofluorescência: Tingimento de Utrofina Duplo de terminal N e terminal C

[0210] As seções de todas as amostras de músculo foram processadas por imunotingimento de utrofina usando-se anticorpos tanto policlonais do terminal N (contra a utrofina completa e recombinante) quanto monoclonais do terminal C (contra utrofina completa). Depois da incubação inicial por 20 minutos em uma solução a 1 % de Triton X-100 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) diluída em 0,01M de PBS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), as amostras foram lavadas três vezes em PBS por 5 minutos cada (3 x 5 minutos). As seções foram depois incubadas em 5 % de soro de asno normal por 15 minutos, seguido por uma incubação com anticorpo de utrofina do terminal N (N-19, sc-7460, IgG de cabra policlonal, Santa Cruz, CA, EUA, diluição de 1:50) por 60 minutos a 37° C. Depois de um segundo ciclo 3 x 5 minutos de lavagem de PBS, as lâminas foram incubadas com 5 % de soro de asno normal por 15 minutos na temperatura ambiente. As seções preparadas foram então incubadas em IgG-FITC de asno anticabra (sc-2024, Santa Cruz, CA, EUA, diluição de 1:300) por 30 minutos a 37° C. Após uma terceira lavagem com PBS por 3 x 5 mins, as seções foram primeiro incubadas com soro de cabra normal a 10 % (Invitrogen, Scotland, UK) por 15 minutos e depois com o anticorpo de utrofina do terminal C (MANCHO7, camundongo monoclonal IgG2a, Santa Cruz, CA, EUA, diluição de 1:25) a 37 °C por 60 mins. Depois de uma lavagem de PBS por 3 x 5 mins e incubação com 10 % de soro de cabra normal, as seções foram incubadas em IgG2a-Alexa de cabra anticamundongo, Fluor® 594 (A-21140, Life Technologies, EUA, diluição de 1:300) por 30 min a 37° C. As seções foram novamente lavadas em PBS por 3 x 5 mins e montadas em um Meio de Montagem Vectashield (H-1000) (Vector Laboratories, CA, EUA) ou Meio de Montagem com DAPI (H-1500) (Vector Laboratories). As fotografias foram tiradas com um microscópio Leica DM6000B (Leica, Alemanha). i. Procedimentos de Tingimento por Imunofluorescência: Tingimento de Imunofluorescência Duplo para γ-sarcoglicano/Laminina, MuRF-1/Laminina e MyHC- embrionário/Laminina

[0211] Os procedimentos de tingimento para estas proteínas seguindo o mesmo protocolo como previamente descrito (Song, Y., et al. Effects on contralateral muscles after unilateral electrical muscle stimulation and exercise. PloS a 7, e52230, doi:10,1371/journal.pone,0052230 (2012)). Anticorpos monoclonais de Coelho anti-γ- sarcoglicano (NBP1-59744, Novus Biologicals, Littleton, CO) e MURF1 (NBP1- 31207, Novus Biologicals, Littleton, CO) foram usados em uma diluição de 1:50 em PBS com Albumina de Soro Bovino (BSA). O anticorpo monoclonal MyHC-embrionário (F1,652)

(Developmental studies, Hybridoma Bank, Iowa, EUA) foi usado em uma diluição de 1:50 a 1:100 em PBS. O anticorpo policlonal de galinha, Laminina, (ab14055-50, Abcam, Cambridge, MA, EUA) em uma diluição de 1:500 a 1:1000 junto com o segundo anticorpo IgY de cabra anti-galinha (TR) (ab7116, Abcam, Cambridge, MA, EUA, diluição de 1:300) foram aplicados para identificar as fibras musculares. A sequência de peptídeos de anticorpo policlonal de coelho MYH16 foi gerada usando a sequência canina humana da região do MYH16 “Alça 2”. Sequência de Peptídeo:

LLALLFKEEEAPAGS j. Ensaio de TUNEL

[0212] As seções foram inicialmente fixadas em fosfato de formalina tamponado a 10 % (Fisher Scientific, EUA) por 20 min. Rotulação de extremidade cortada in situ do DNA fragmentado foi depois realizado usando o kit de detecção de apoptose de Fluoresceína TACS 2 TdT (Trevigen, Gaithersburg, MD, EUA), como descrito pela instrução do fabricante. k. Ensaio de Creatina Cinase Sérica (CK)

[0213] o soro do sangue foi coletado por intermédio de punção venosa da veia submandibular usando uma lanceta animal de 5 mm (Goldenrod Animal Lancet, Braintree Scientific, Inc, Braintree, MA). Um total de 150 µL foram coletados em um tubo de coleta de sangue heparinizado (Terumo, Número de Catálogo: TMLH). Os camundongos foram cuidadosamente monitorados por 30 minutos após a retirada do sangue para observar sinais potenciais de aflição. Os níveis de CK foram determinados pelo Laboratório de Patologias Clínicas no Hospital Veterinário Matthew J. Ryan da Universidade da Pensilvânia. l. Avaliação ex vivo das propriedades EDL contráteis do músculo

[0214] As avaliações ex vivo foram realizadas pelo Núcleo de Avaliação de Fisiologia Muscular da Universidade da Pensilvânia. As propriedades fisiológicas, incluindo a força de contração isométrica, força tetânica isométrica e queda da força depois das ECCs, foram quantificadas em músculos EDL recentemente isolados de camundongos mdx com 2 meses de idade usando um Sistema de Camundongo Aurora 1200A equipado com um software Dynamic Muscle Control v.5.3. Todos destes camundongos foram submetidos ao teste de força de aperto in vivo 24 horas antes da eutanásia de um teste ex vivo. Os músculos EDL foram mantidos em uma solução de Ringer constantemente oxigenada (100 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 3,4 mM de CaCl2, 1,2 mM de KH2PO4, 1,2 mM de MgSO4, 25 mM de HEPES e 5,5 mM de D-glicose) a 24° C. O protocolo de estímulo de contração muscular foi um estímulo único com uma duração de 0,2 ms. Para medir a geração da força tetânica máxima, o mesmo estímulo foi repetido em uma frequência de 120 Hz por 500 ms. Cinco minutos foram deixados entre as duas contrações tetânicas para garantir a recuperação muscular. O comprimento do músculo foi ajustado para obter a resposta de contração máxima e este comprimento foi medido entre as pontas visíveis mais externas das junções miotendinosas e registrado como comprimento ótimo (L0). A área muscular transversal (CSA) dos músculos EDL muscles foi calculada dividindo-se da massa muscular pelo produto do coeficiente de densidade muscular (1,06 g/cm 3), músculo L0 e o coeficiente de comprimento da fibra (0,45 para EDL). A força específica foi determinada normalizando a força para CSA.

[0215] Depois de testar as propriedades isométricas de EDL, uma série de cinco contrações excêntricas (ECCs – uma a cada cinco minutos) foi aplicada em ciclos começando com as contrações isométricas repetidas de 500 ms seguido pelo alongamento do músculo em 10 % de L0 enquanto administrando um estímulo tetânico máximo. A força absoluta relatada para cada ECC corresponde ao pico da força durante a fase isométrica da ECC. m. Atividade Vertical & Teste de Força de Aperto

[0216] Os camundongos foram cuidadosamente colocados na gaiola de campo aberto e sua atividade de linha de base vertical foi determinada por cinco minutos. Os camundongos foram depois retornados às suas gaiolas originais e deixados descansar por três minutos. Um transdutor de força axial foi usado para medir a força (Sensor Força de Faixa Dupla ± 10N de Vernier LabPro & Vernier, Beaverton Oregon), enquanto os dados foram coletados usando o software acompanhante (Logger Lite versão 1.8.1). Todos os experimentos foram realizados pelo mesmo pesquisador an maneira cega. Para reduzir mudanças de viés e para garantir a robustez do experimento cego, nós usamos o método como descrito (Song, Y. et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the distrophic mdx mouse. J Appl Physiol 122, 593-602, doi:10,1152/japplphysiol,00776,2016 (2017)). n. Modelo Canino

[0217] Dois grupos de cães foram usados para nosso experimento. O primeiro grupo foi criado em uma colônia na Universidade A&M e paridos na Universidade da Pensilvânia. Este estudo envolveu cinco cães GRMD afetados e quatro ninhadas de idades coincidentes incluindo uma do tipo selvagem e três fêmeas grávidas que serviram como um grupo de controle. Todos os cães distróficos foram identificados pelos níveis de fosfocinase sérica elevada em creatinina (CPK) e genotipados pelo ensaio de PCR. Todos os filhotes foram aleatoriamente designados aos grupos de tratamento e os pesquisadores foram mantidos cegos durante a avaliação clínica e histológica. Os filhotes foram injetados com AAV9 µUtrofina de 6 a 10 dias de idade na dose de 1,0 x 1013 vg/kg e 1,0 x 1013,5 vg/kg por intermédio do método da veia jugular externa. Dois filhotes foram injetados com uma dose baixa de AAV9 µUtrofina, dois foram injetados com alta dose e o restante foi injetado apenas como solução salina. Cada cão foi pesado diariamente pelas primeiras 6 semanas e após esse período, semanalmente.

[0218] O segundo grupo canino envolveu cães GRMD na idade de aproximadamente 7,5 semanas. Três dias antes da administração de vetor, os cães foram colocados em um regime de prednisolona oral de 1 mg/kg por 25 dias. A AAV9 µUtrofina foi injetada usando o mesmo método em duas doses únicas diferentes de 1,25 x 1014 vg/kg e 5,0 x 1013 vg/kg respectivamente. Os cães foram aleatoriamente designados à dose e os pesquisadores foram mantidos cegos durante as avaliações clínicas e histológicas.

[0219] Os cães Pointer Alemão de Pelo Curto delecionais-nulos (GSHPMD) foram criados e alojados na Universidade do Texas A&M. Dois cães GSHPMD com sete anos de idade afetados, Ned e Grinch, pesaram 21 kg e 24,2 kg respectivamente, cada cão recebeu cinco injeções intramusculares de AAV9-μDistrofina (Direito) e

AAV9-μUtrofina (Esquerdo), com uma dose equivalente total de 1,0 x 10 12 vg/kg, no seu compartimento anterior da tíbia. Todos os cinco locais de injeção foram tatuados, nos permitindo apontar os locais de injeção sites para as biópsias musculares 4 semanas após a injeção. O sangue periférico foi coletado pré-injeção e 2, 4, 6, 8 semanas após a injeção de modo a coletar as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). o. Aquisição e Armazenamento do Tecido Canino

[0220] O primeiro grupo de cães GRMD foram submetidos à biópsia por agulha do sartório craniano, vasto lateral e músculos tríceps braquiais a aproximadamente 6 semanas após a injeção de vetor. As amostras foram armazenadas com um conjunto de códigos cegos para prevenir viés durante a análise e interpretação. As biópsias foram obtidas através de uma Agulha de calibre 14 Trocar carregada com mola, deste modo minimizando significantemente a dor pós-procedimento nos animais. As biópsias musculares foram então congeladas em isopentano resfriado com nitrogênio líquido, embebidas em meio OCT (Sakuru, EUA) e armazenadas a -80 °C. Os códigos cegos foram quebrados depois da análise do tecido por indivíduos não associados com a autoria deste estudo. Um mês depois da exposição do vetor, o segundo grupo de injetados foram submetidos à biópsia muscular aberta dos mesmos músculos. Sete semanas depois da administração do vetor, estes cães foram submetidos à eutanásia e o tecido coletado foi criopreservado da mesma maneira. p. Análise Histológica Canina

[0221] As seções seriais transversalmente cortadas de 7 µm foram usadas para a análise de microscopia de campo claro e tingimento de imunofluorescência (SE) para examinar a expressão micro-utrofina e resgate de sarcoglicano. As seções musculares foram tingidas com H&E para a microscopia de campo claro e montado com permount. Para o tingimento SE, as seções foram bloqueadas em soro de asno a 5 % em PBS por 45 minutos seguido pela incubação por 60 min a 37° C usando uma diluição de 1:350 do anticorpo de cabra policlonal anti-utrofina (N-19, sc-7460, Santa Cruz, EUA) e diluição de 1:250 do anticorpo monoclonal de γ-sarcoglicano (ab55683, Abcam, EUA). As seções foram então lavadas três vezes em PBS e incubadas por 45 mins em anticorpo secundário Alexa488 de asno anti-cabra ou anticorpo secundário Alexa540 de asno anti-camundongo em uma diluição de 1:1000. As lâminas foram lavadas duas vezes com PBS por 5 mins após uma única lavagem de água e montado com um meio de montagem resistente ao desvanecimento contendo DAPI (H-1500, Vector Labs). As imagens foram capturadas na mesma configuração e processadas por intermédio de vias idênticas ajustando-se os limites e ganhos em todas as partes para evitar qualquer disparidade nas imagens de SE usando um microscópio florescente Olympus B-65. O diâmetro de Feret mínimo e os coeficientes de variação foram calculados de acordo com o protocolo TREAT_NMD DMD_M.1.2.001 como atualizado em 1/28/2014. q. Análise de Imunomancha

[0222] A análise de imunomancha foi realizada carregando-se 20 a 40 µg/linha de célula integral ou lisado celular integral em gel de dodecil sulfato de sódio- poliacrilamida a 10 %. A proteína foi transferida a uma membrana de difluoreto de polivinilideno. A micro-utrofina foi detectada pelo anticorpo policlonal de cabra contra o epítopo do terminal N em uma diluição de 1:500 (N-19, sc-7460, Santa Cruz, EUA) e um anticorpo secundário, um anticorpo de asno anti-cabra conjugado com peroxidase de rábano-silvestre (Sigma-Aldrich) em uma diluição de 1:5000. A detecção e quantificação da proteína foi realizada usando o sistema de visualização infravermelho Odyssey (LI-COR). Gama-sarcoglicano foi detectado para um anticorpo de camundongo monoclonal (Vector Labs VP-G803) e um anticorpo de asno secundário conjugado, anti-camundongo HRP (Santa Cruz Biotechnology). r. Detecção de Anticorpos Neutralizantes anti-AAV

[0223] Para avaliar a resposta imune humoral contra proteínas capsídicas AAV 9, o soro do sangue foi coletado no dia do nascimento, e depois nas semanas 4 e 8 por intermédio da veia periférica. As células HEK 293 foram semeadas em uma placa de 48 poços em uma densidade de 105 células/poço em 200 μl de DMEM contendo soro bovino fetal a 10 %. As células foram cultivadas por 3 a 4 horas a 37 °C e deixadas aderir à placa.

[0224] O vetor de Proteína de Fluorescência Verde AAV9 (GFP) (1 x 10 8 partículas) foi incubado com soro de camundongos em uma diluição serial com PBS por duas horas a 4° C em um volume total de 25 μL. A mistura foi depois adicionada às células em um volume final de 200 μl que continha 4 x 10 6 partículas de AAV9 e incubada por 24 ou 48 horas a 37° C. As células que expressam GFP foram contadas sob um microscópio fluorescente. O anticorpo neutralizante foi calculado usando a diluição mais alta onde a porcentagem de células positivas de GFP foi 50 % menor do que o controle sem soro. s. Avaliação da Reatividade da Célula T para Peptídeos Derivados de Capsídeos

[0225] As respostas da célula T do sangue periférico aos novos antígenos de capsídeo AAV foram quantificadas pelo ensaio IFN-γ ELISpot (Mingozzi, F. et al. AAV- 1-mediated gene transfer to skeletal muscle in humans results in dose-dependent activation of capsid-specific T cells. Blood 114, 2077-2086 (2009)). Em resumo, as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas em gradientes Ficoll Hypaque e cultivadas com peptídeos sintéticos (20 aminoácidos em comprimento, sobreposto em 10 resíduos) que mediram a proteína de capsídeo VP1. Para identificar os peptídeos individuais dentro de um conjunto que extraiu a atividade de IFN-γ, cada peptídeo estava presente em duas subconjuntos do mapeamento de interseção. Depois da incubação a 37° C por 36 horas, IFN-γ SFU foram contados. Menos do que 10 SFU/poço foram observados com os peptídeos de um conjunto de controle (GFP melhorado). As respostas foram consideradas positivas quando o SFU excedeu 50/106 PBMC em poços duplicados. t. Análise Estatística

[0226] Os tamanhos dos grupos informativos para as injeções de vector AAV em camundongos mdx foram estimados com base em um dos ensaios histológicos mais sensíveis e amplamente usados disponíveis: a proporção de fibras musculares centralmente nucleadas de camundongos submetidos à necrópsia a 8 semanas de idade. Para maximizar a potência estatística para o número de animais usados, adotamos o método descrito por Aarts, et al. (Aarts, E., et al., A solution to dependency: using multilevel analysis to accommodate nested data. Nat Neurosci,

2014. 17(4): p. 491-6), para acomodar a dependência entre os campos múltiplos de alta potência (HPFs) dentro de um camundongo. Os modelos de efeitos mistos responsáveis pelo agrupamento dentro do camundongo, usando uma estrutura de correlação permutável, foram usados para comparar os três grupos definidos pelo genótipo e tratamento. A estimativa da correlação intra-agrupamento (ICC) destes modelos indicou um valor baixo (< 10 %), sugerindo um tamanho de amostra eficaz relativamente alto apesar dos números necessariamente pequenos de camundongos por grupo (pelo menos quatro). Outros parâmetros de efeitos aleatórios calculados nesta análise incluem: a variação entre agrupamentos, σ2u; a variação dentro dos agrupamentos, σ2e; e o tamanho de amostra eficaz, neff.

[0227] Para caracterizar a distribuição do diâmetro de Feret mínimo nos cães distróficos do tipo selvagem tratados e não tratados, os pontos representando medições individuais dos HPFs representativos foram representados graficamente. Devido ao pequeno número de cães, esta análise é inteiramente descritiva.

[0228] Todas as análises, exceto a proporção das fibras musculares centralmente nucleadas foram apresentadas como média ± S.D. A análise estatística foi processada usando o software Prism 7 (GraphPad). A significância estatística dos valores p é indicada nas figuras: *p < 0,05; **p< 0,001; ***p< 0,0001; n.s., não significante. Exemplo 3 – Terapia de gene sistêmica para DMD usando liberação mediada por AAV de nano-utrofina e nanodistrofina A. Esquema de nano-utrofina humana

[0229] Um papel principal do domínio de bastão é a transmissão longitudinal de força e o comprimento extraordinário da distrofina reflete a o legado evolucionário da proteína. Como um resultado deste discernimento, nós identificamos um modo de tratar uma limitação central de outros métodos e esquematizar novos transgenes para obter transdução de força e mioproteção em níveis indistinguíveis do tipo selvagem.

[0230] A nossa análise de sequências para ortólogos e parálogos dos genes da distrofina e transcritos a partir de uma ampla amostragem de táxons metazoários nos levou à hipótese de que a BMD em pacientes com exclusões ou duplicações preservando a ossatura resultou da desestabilização focal do domínio de bastão durante a carga mecânica. Esta hipótese é sustentada pelos dados cristalográficos da distrofina e outras proteínas contendo domínios de repetição helicoidal tripla, análise bioinformática de união evolucionária entre aminoácidos nas repetições helicoidais triplas adjacentes e dados não publicados de nossos estudos de proteínas miniaturizadas recombinantes no músculo mecanicamente carregado. Nenhuma das minidistrofinas recombinantes relatadas até agora evitou o potencial para uma ligação mais fraca no sítio de exclusão interna, visto que todos os métodos de esquema usados modelam as repetições helicoidais triplas como unidades modulares, intercambiáveis. A despeito da sua melhora fenotípica impressionante em modelos de animal, mesmo a micro-utrofina arrisca esta limitação. Para tratar esta possibilidade e para encurtar adicionalmente o transgene, nós desenvolvemos um modelo para uma “nano-utrofina” de encaixe triplo (FIG. 4). Nós “cortamos” e “soldamos” o bastão da distrofina e utrofina através dos planos tridimensionais estruturalmente mais conservados de duas repetições helicoidais triplas não adjacentes de modo a preservar todas as interações de cadeia lateral de aminoácido evolucionariamente unidas nas interfaces menos conservadas, que portam carga alça a alça entre repetições adjacentes. Isto está modelado na FIG. 4 usando a metáfora dominó. Na seção seguinte isto está descrito em maiores detalhes usando representações gráficas de modelagem molecular. As avaliações são realizadas com respeito à nano- utrofina de encaixe triplo, para melhora potencial em relação à micro-utrofina para identificar transgenes terapêuticos através de testes sequenciais em camundongos deficientes em distrofina (imediata) e ratos (melhor modelo patogenético para a fibrose, degeneração e fraqueza na DMD mas requerendo 10x mais vetores). B. Produção Escalável de AAV para a liberação sistêmica na DMD.

[0231] Os vetores AAV9 e Anc80 utilizados em nossos estudos pré-clínicos em camundongos e dogs distróficos até agora foram preparados em células HEK 293 humanas aplicando-se o método da transfecção de plasmídeo tripla. Esta tecnologia conta com o crescimento de células dependentes de ancoragem em meios de cultura ricos, com os plasmídeos de entrada propagados em larga escala em cepas bacterianas antes da transfecção tal que o produto final retenha os padrões de metilação de DNA bacteriano potencialmente imunogênicos. A descoberta e produção do vetor AAV usando uma ampla faixa de capsídeos e plataformas são realizadas incluindo células HEK 293 dependentes de ancoragem e colocadas em suspensão assim como de células de inseto Sf9 infectadas em baculovírus. C. Modelos de Animal

[0232] Testes cegos, rigorosos da terapia sistêmica de AAVμ- versus n-Utrofina são investigados usando pontos finais primários, secundários e exploratórios que informam o esquema e execução de testes clínicos futuros. Dois pontos finais primários são selecionados: desempenho no mais sensível de nossos grupos publicados de ensaios fisiológicos integrativos em camundongos mdx (o teste vertical híbrido da atividade de força de membro, ver as figuras de (Song, Y., et al., Suite of Clinically Relevant Functional Assays to Address Therapeutic Efficacy and Disease Mechanism in the Distrophic mdx Mouse. J Appl Physiol, 2016: p. jap 00776 2016) e a imunodetecção quantitativa do fragmento de 25 kDa do terminal N de titina (Robertson, A.S., et al., Dramatic elevation in urinary amino terminal titin fragment excretion quantified by immunoassay in Duchenne muscular dystrophy patients and in dystrophin deficient rodents. Neuromuscul Disord, 2017. 27(7): p. 635-645). Ver, por exemplo, as FIGs. 12A-12D e FIG. 13. A última é um bioensaio não invasivo, com base em urina que tem faixa extraordinariamente dinâmica, unicamente reflete o nível sistêmico de mionecrose e se baseia no papel das isoformas de titina na miofibrilogênese (Exemplo 1). Uma meta global deste objetivo do projeto é caracterizar quantitativamente o grau e durabilidade da melhore fenotípica em um modelo econômico que recapitule os traços patológicos principais da DMD. Estudos em camundongos mdx são sistematicamente prolongados para ratos deficientes em distrofina porque este último modelo mais intimamente se assemelha com a marca da miodegeneração e fibrose patológicas observadas na DMD com índices facilmente quantificados de fraqueza muscular progressiva e cardiomiopatia Robertson, A.S., et al., Dramatic elevation in urinary amino terminal titin fragment excretion quantified by immunoassay in Duchenne muscular dystrophy patients and in dystrophin deficient rodents. Ver, Petrof, B.J., et al., Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc Natl Acad Sci, 1993. 90: p. 3710-14;

Neuromuscul Disord, 2017. 27(7): p. 635-645; Larcher, T., et al., Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PLoS One,

2014. 9(10): p. e110371; Nakamura, K., et al., Generation of muscular dystrophy model rats with a CRISPR/Cas system. Sci Rep, 2014. 4: p. 5635; Stedman, H.H., et al., The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature, 1991. 352(6335): p. 536-9; Shrager, J.B., et al., The mdx mouse and mdx diaphragm implications for the pathogenesis of Duchenne Muscular Dystrophy., in Neuromuscular Development and Disease, A.M. Kelly and H.M. Blau, Editors. 1992, Raven Press, Ltd.: New York. p. 317-328; Krupnick, A.S., et al., Inspiratory loading does not accelerate dystrophy in mdx mouse diaphragm: implications for regenerative therapy. J Appl Physiol, 2003. 94(2): p. 411-9; and Song, Y., et al., Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol, 2017. 122(3): p. 593-602. Several canine disease models (Cooper, B.J., et al., The homologue of the Duchenne locus is defective in X-linked muscular dystrophy of dogs. Nature, 1988. 334(6178): p. 154-6; Smith, B.F., et al., Molecular basis of canine muscle type phosphofructokinase deficiency. J Biol Chem, 1996. 271(33): p. 20070-4; Bridges, C.R., et al., Global cardiac-specific transgene expression using cardiopulmonary bypass with cardiac isolation. Ann Thorac Surg, 2002. 73(6): p. 1939-46; Arruda, V.R., et al., Regional intravascular delivery of AAV-2-F.IX to skeletal muscle achieves long- term correction of hemophilia B in a large animal model. Blood, 2004. Epub ahead of print; Arruda, V.R., et al., Peripheral transvenular delivery of adeno-associated viral vectors to skeletal muscle as a novel therapy for hemophilia B. Blood, 2010. 115(23): p. 4678-88; Mead, A.F., et al., Diaphragm remodeling and compensatory respiratory mechanics in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. J Appl Physiol (1985),

2014. 116(7): p. 807-15; and Su, L.T., et al., Uniform scale-independent gene transfer to striated muscle after transvenular extravasation of vector. Circulation, 2005. 112(12): p. 1780-8), pode ser usado, assim como o modelo de hamster para LGMD (por exemplo, ensaios histológicos na FIG. 14A a FIG. 14G, de Greelish, et al, Nature Medicine, (Greelish, J.P., et al., Stable restoration of the sarcoglycan complex in dystrophic muscle perfused with histamine and a recombinant adeno-associated viral vector.

Nat Med, 1999. 5(4): p. 439-43), que formou uma parte essencial do fundo para o primeiro teste clínico de fase I de terapia de gene usando vetores AAV na distrofia muscular humana: Stedman, et al, Human Gene Therapy.

Stedman, H., et al., Phase I clinical trial utilizing gene therapy for limb girdle muscular dystrophy: alpha- , beta-, gamma-, or delta-sarcoglycan gene delivered with intramuscular instillations of adeno- associated vectors.

Hum Gene Ther, 2000. 11(5): p. 777-90). D.

Perfil de Produto Alvos de Produto Resultado Aceitável Mínimo Resultados Ideais Sintomas e sinais de disfunção Sintomas e sinais de disfunção muscular muscular extrema na Distrofia locomotiva, respiratória e cardíaca na Indicação de Produto Muscular de Duchenne e Becker Distrofia Muscular de Duchenne e primário resultante de qualquer mutação Becker resultantede qualquer mutação gênica da distrofina do gene da distrofina Pacientes ambulatoriais ou pós- Criancinhas pré-sintomáticas, rapazes População de ambulatoriais com sintomas sintomáticos e adultos jovens com Paciente progressivos e sinais de DMD DMD/BMD Duração de Dose única Dose única Tratamento Modo de Liberação IV IV Suspensão congelada de vetor AAV Suspensão congelada de vetor de AAV Forma de Dosagem recombinante, para uso único recombinante, para uso único depois do depois do descongelamento descongelamento Infusão – cateter longo na veia Infusão – cateter longo na veia antecubital para a infusão antecubital para infusão sistêmica; veia Regime sistêmica; veia cefálica e/ou safena cefálica e/ou safena distal para distal para torniquete para torniquete para extremidade extremidade Prevenção completa de sintomas de Diminuição de muitos anos na taxa doença locomotora, respiratória e Eficácia da progressão da perda functional cardíaca associada com DMD/BMD, nas extremidades injetadas com base no diagnóstico pré-sintomático precoce confirmado Risco/Efeito Colateral Destituído de imunotoxicidade de Destituído de imunotoxicidade de longa longa duração a partir da proteína duração a partir da proteína recombinante codificada. Pode recombinante codificada. Pode requerer requerer imunossupressão imunossupressão transitória para transitória para minimizar risco de minimizar risco de resposta imune para resposta imune para o capsídeo o capsídeo vetorial, a readministração vetorial, a readministração pode ser pode ser proibida pelo desenvolvimento proibida pelo desenvolvimento de de anticorpos contra o capsídeo de anticorpos contra o capsídeo de proteína do vetor. proteína do vetor. A dose máxima aplicável pode ser limitada pelo risco de toxicidade envolvendo a imunidade inata e a hepatotoxicidade Vetor viral adenoassociado Vetor viral adenoassociado miotrópico Modalidade miotrópico codificando a isoforma codificando a isoforma artificialmente Terapêutica artificialmente unida de utrofina unida de utrofina

[0233] O diagrama acima descreve os perfis de produto alvo para AAVμUtrofina ou AAVnUtrofina, Nosso entendimento corrente da perda progressiva e da reposição fibro-gordurosa de miócitos estriados na DMD sugere que reversão significante da doença em sujeitos mais velhos pode ser limitada, mas a prevenção de perda adicional de miócito pode ser possível em qualquer estágio a seguir do início da expressão de μ- ou n-Utrofina recombinante. Experimentos são realizados direcionados primariamente nos camundongos e ratos deficientes em distrofina para informar expectativas quanto a parâmetros ideais em pacientes com DMD tratados na infância. A transdução com AAVμ- ou n-Utrofina suficiente na infância para normalizar a expressão de sarcoglicano por todo o crescimento até a maturidade esqueletal pode permitir crescimento relativamente normal de músculo e consequentemente aumento maturacional normal na força. Pelo menos quatro fatores podem limitar o benefício terapêutico em pacientes mais velhos: 1) o grau de perda de miócito irreversível antes do tratamento, 2) o grau no qual a reposição fibrogordurosa do músculo prejudica a distribuição de vetor e transdução de miócito, 3) a diminuição maturacional na permeabilidade endotelial para o vetor, potencialmente requerendo a extravasação forçada do lúmen vascular distal para um torniquete em pacientes mais velhos e 4) o aumento antecipado na exposição natural aos vírus de AAV com o avanço da idade do paciente, aumentando deste modo a proporção tanto com anticorpos com título mais alto para múltiplos sorotipos de AAV quanto células T de memória para peptídeos derivados de capsídeo AAV conservado. A toxicidade limitante da dose pode envolver o sistema imune inato e/ou o fígado. E. Base experimental e teórica para a substituição de μ- ou n-Utrofina na deficiência de distrofina

[0234] A utrofina foi originalmente verificada com base na homologia da sua sequência codificadora para distrofina (Love, D.R., et al., A autosomal transcript in skeletal muscle with homology to dystrophin. Nature, 1989. 339(6219): p. 55-8). Nós recentemente reconstruímos as histórias evolucionárias da distrofina e utrofina com base em sequências de genoma inteiro publicamente disponíveis a partir de uma ampla faixa de taxons. Duas observações são relevantes: 1) o gene “doador” para o domínio semelhante a bastão de ambas as proteínas tiveram pelo menos 21 domínios de repetição semelhantes à espectrina tandem de comprimento antes que o mesmo fosse unido, pela duplicação de gene parcial, ao domínio semelhante a Dp71 antes da emergência de músculo estriado, 2) genes separados para utrofina e distrofina foram fixados depois da divergência de cefalocordatos ao longo da linhagem levando a um ancestral comum de vertebrados sem mandíbula e com mandíbula e antes do aparecimento evolucionário de oligodendrócitos (Putnam, N.H., et al., The amphioxus genome and the evolution of the chordate karyotipo. Nature, 2008. 453(7198): p. 1064- 71; e Smith, J.J., et al., Sequencing of the sea lamprey (Petromyzon marinus) genome provide insights into vertebrate evolution. Nat Genet, 2013. 45(4): p. 415-21, 421e1- 2). Ambas as proteínas retêm interfaces de ligação para a actina citoesqueletal e o Complexo Associado à Proteína das glicoproteínas que atravessam membrana da Distrofina(/Utrofina) (D/UAPC). Está bem estabelecido que derivados recombinantes de comprimento completo da utrofina podem reverter mesmo fenótipos severos de distrofia muscular em camundongos (Tinsley, J., et al., Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med, 1998. 4(12): p. 1441-4;

Gilbert, R., et al., Adenovirus-mediated utrophin gene transfer mitigates the dystrophic phenotype of mdx mouse muscles. Hum Gene Ther, 1999. 10(8): p. 1299-310; and Odom, G.L., et al., Microutrophin delivery through rAAV6 increases lifespan and improves muscle function in dystrophic dystrophin/utrophin-deficient mice. Mol Ther,

2008. 16(9): p. 1539-45). A lacuna não resolvida em nosso entendimento foi a natureza das pressões seletivas que levaram à replicação em tandem inicial das repetições helicoidais triplas da proteína ancestral e se o(s) papel(is) fisiológico(s) corrente(s) de distrofina “requer” os 6 nm estimados/repetição x 24 repetições ou 144 nm de comprimento da proteína Dp427 nativa. O fenótipo clínico severo de alguns pacientes com BMD com exclusões internas pequenas tem sugerido que o comprimento do Dp427 é essencial para o seu papel como um amortecedor, mas BMD duplicacional desafia esta interpretação porque estes pacientes têm distrofinas tipo selvagem mais longas. Uma interpretação alternativa surge de nossa reconstrução da história evolucionária remota da distrofina (Exemplo 1).

[0235] Nós questionamos a questão decepcionantemente simples “quem veio primeiro, a distrofina ou o sarcômero?” A meta foi averiguar se evidência disponível de genomas e proteomas deduzidos das espécies existentes foi compatível com um modelo no qual o comprimento do bastão de distrofina aumentou durante o período da emergência de sarcômeros para a evolução recente de músculos especializados de contração rápida que são os mais susceptíveis para a lesão aguda nos mamíferos deficientes em distrofina (Webster, C., et al., Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne Muscular Dystrophy. Cell, 1988. 52(4): p. 503-13; e Petrof, B.J., et al., Adaptations in myosin heavy chain expression and contractile function in distrophic mouse diaphragm. Am. J. Physiol., 1993. 265: p. C834-C841). Como mostrado na FIG. 15, a evidência sustenta uma reconstrução na qual a distrofina antecedeu o sarcômero. A análise detalhada mostra que a distrofina é idêntica no comprimento em Vertebrados existentes e nas espécies de Cnidário (água-viva), com estruturas genéticas altamente conservadas como mostrado na FIG. 6A a FIG. 6C. O comprimento da distrofina foi provavelmente obtido bem antes da emergência dos sarcômeros, mesmo antes da divergência de Placozoários, um filo representado pelas espécies de animal de vida livre mais simples, Trichoplax adhaerens. Esta espécie usa a dineína ciliar (não a miosina) como a sua fonte de potência locomotiva primária e seu plano corporal possui apenas quatro tipos de célula, nenhuma das quais exibe sarcômeros identificáveis (Srivastava, M., et al., The Trichoplax genome and the nature of placozoans. Nature, 2008. 454(7207): p. 955-60). Uma análise inovativa da estrutura gênica provê evidência convincente de que o domínio tipo bastão da distrofina, responsável por 80 % do comprimento da proteína, parece ter sido co- optado na sua totalidade a partir de uma proteína ancestral maior (não a espectrina, observe os padrões distintos na FIG. 6B), com um papel distinto na reticulação dos filamentos e microtúbulos da actina (MACF). A implicação essencial desta descoberta é que uma proteína tipo MACF, não a distrofina por si, foi o sujeito da pressão seletiva que conduziu ao encompridamento original dos dois domínios de bastão ancestrais comuns das proteínas. A estrutura cristalina de MACF é distinta daquela da espectrina com respeito ao potencial para a transmissão de força longitudinal, provendo uma explicação para a preservação do comprimento da distrofina e utrofina em uma ampla faixa de táxons. Como mostrado nas FIGs. 16A e 16B, as espectrinas e distroplaquinas têm hélices triplas que se dobram distintamente com respeito ao grau de sobreposição e o número de interações de cadeia lateral de aminoácido estabilizante. Na FIG 16A e FIG. 16B, nós modelamos repetições helicoidais triplas adjacentes de utrofina humana usando padrões derivados de (FIG. 16A) beta2- espectrina humana (3EDV) e (FIG. 16B) plectina humana (5J1G). Nosso modelo prediz que a força é transmitida longitudinalmente através da ampla interface de interdomínio in vivo, como requerido para transmitir energia mecânica a partir do interior da célula para a matriz extracelular sem ruptura do sarcolema. Qualquer rompimento maior na ligação da cadeia lateral entre as repetições helicoidais triplas adjacentes e potencialmente sobrepostas desestabilizaria, portanto, a distrofina e utrofina durante a transmissão de força.

[0236] Este modelo é totalmente compatível com a proposição de que o traço mais importante do bastão de domínios é a força e não o comprimento, com o tamanho extraordinário das proteínas atribuíveis ao seu legado histórico como derivados pela duplicação de gene parcial de um homólogo de MACF muito mais longo. Assim, proteínas recombinantes curtas especificamente esquematizadas para otimizar a integridade estrutural do domínio de bastão em todas as interfaces inter-repetição deve completamente complementar a função mecânica das proteínas completas, por exemplo, Dp427. O caminho conceitualmente mais simples para se aproximar disso é evitar rearranjos internos que direcionalmente justapõem repetições helicoidais triplas incompatíveis. O problema é que a informação cristalográfica sobre a estrutura existe apenas para uma das 24 repetições helicoidais triplas da distrofina e a inter-repetição do homólogo estrutural primário é baixa exceto para os resíduos de triptofano conservados no centro das hélices A e C. Nós escolhemos focalizar inicialmente sobre uma proteína recombinante com uma exclusão interna e de um terminal C em relação à utrofina de comprimento completo e chamada de micro- ou μ-Utrofina. Como representado na FIG. 17, esta construção justapõe um domínio de “dobradiça-2” inter- helicoidal não estruturado, rico em prolina contra a última repetição helicoidal tripla, número 22 da utrofina de comprimento completo. Em um cenário de melhor caso, a “dobradiça” serviria como um espaçador inter-helicoidal com a capacidade para transmitir força longitudinal sem precisar emparelhar com as 22 sequências da repetição helicoidal tripla. Este foi a nossa justificativa para uma avaliação focalizada de μ-Utrofina, como descrito em detalhes abaixo e no Exemplo 2.

[0237] Um método sistemático para a otimização de transgene de μ-Utrofina determinou que o uso da tendência de códon para a cadeia pesada da miosina sarcomérica aumentou a expressão da proteína imunodetectável em 30 vezes acima do tipo selvagem in vitro (linha 5 versus linha 8, FIG. 18). De fato, o nível de expressão foi tão alto que competiu eficazmente com a expressão do controle e-gfp cotransfectado. Para analisar a eficácia terapêutica da construção μU otimizada depois de empacotar no AAV9, nós realizamos uma série de investigações randomizadas, cegas no modelo do camundongo mdx de DMD, como descrito no Exemplo 2.

[0238] Com base na análise in silico da ligação de MHC de epítopos de peptídeo de célula T mínimo, a μUtrofina tem menos do que a centésima parte do número de peptídeos estranhos potencialmente imunodominantes comparada com todas as μDistrofinas hipotéticas no hospedeiro deficiente em distrofina. Isto minimiza o risco de autoimunidade pós terapia na DMD e a exigência potencial para a imunossupressão crônica. Nossos estudos cegos da expressão de μUtrofina sistêmica em cães GRMD não imunossuprimidos proveram a reafirmação adicional pela documentação da ausência completa de reatividade de célula T periférica pelos ensaios ELISpot de interferon gama. Estes estudos foram necessariamente realizados com uma dose (normalizada para o peso corporal adulto) 1/10 o da dose máxima usada em camundongos mdx e apenas seria prolongada em uma data futura para avaliar a dose máxima tolerada no modelo DMD de animal grande com a tecnologia de produção escalável. F. Mecanobiologia da Lógica e Estrutura da Distrofina - Nano-utrofina

[0239] Nossas descobertas têm implicações importantes para o campo inteiro, visto que o mesmo pertence igualmente a todos os candidatos de distrofina de tamanho AAV que estão sendo desenvolvidos para a tradução em estudos clínicos.

[0240] Nós iniciamos uma série de experimentos cegos para tratar a estabilidade da μ-Utrofina em camundongos mdx injetados com AAV. Estes estudos quantitativos já proveram muitos dados favoráveis em pontos de tempo intermediários com respeito aos níveis de expressão de μ-utrofina. Entretanto, em análises adicionais nós indicamos uma “faixa extra” não prevista nas western blots depois de tingir com um anticorpo específico para o terminal N da utrofina. Como resumido na FIG. 21, o peso molecular designado para esta faixa nítida exatamente casa com aquela da porção de terminal N de 79 kd da μ-Utrofina. Em outras palavras, as descobertas sugerem que a μ-Utrofina de 135 kd foi rompida em proximidade imediata da junção entre a porção da “Dobradiça 2” e a repetição 22 semelhante à espectrina, flanqueando a exclusão da sequência codificadora correspondendo à utrofina de comprimento completo, liberando deste modo como um fragmento o “subdomínio” do terminal N de 79 kd. Em nossos estudos parece haver uma correlação entre o aparecimento e a intensidade da faixa de 79 kd e o nível recente máximo de transdução de força pelo músculo. Nós em seguida submetemos a região de 79 kd de géis adicionais à análise proteômica pela combinação de cromatografia líquida e espectroscopia de massa em tandem. Isto confirmou nossa hipótese, como mostrado na FIG. 22. Esta descoberta nos compeliu a reconsiderar a nossa suposição acerca da intercambiabilidade das repetições de espectrina, especificamente 4 e 22 quando colocadas em proximidade estrutural primária imediata com a dobradiça 2. Revendo as descobertas de nossa análise de bioinformática da distrofina, utrofina e titina, tornou-se claro que os domínios poli IgG da titina mostram evidência forte para a intercambiabilidade em relação ao tempo evolucionário, mas que em comparações de espécies idênticas nós não vimos nenhuma evidência de intercambiabilidade nas outras duas proteínas (Exemplo 1). Isto provê uma explicação convincente para a correlação genótipo-fenótipo nos casos selecionados de MD de Becker, especialmente casos severos associados com duplicações de gene em que pela conclusão de que existe uma distrofina mais longa do que a tipo selvagem que tem uma ligação mais fraca para a transmissão de força axial através da nova junção de duas porções ancestralmente não adjacentes do bastão.

[0241] Uma estrutura cristalina da família da proteína MACF/plaquina é potencialmente informativa, visto que os dados estruturais para a distrofina e utrofina são limitadas à primeira repetição helicoidal tripla (isto é a extremidade de terminal N extrema do bastão) e os domínios de dobradiça são prognosticados ser “não estruturados”. Antes da determinação desta estrutura foi especulação que o domínio SH3 entre repetições helicoidais triplas também serviram como uma dobradiça, evocando imagens de uma interface incerta entre duas porções fortes de um bastão. A estrutura revela, ao contrário, que o domínio SH3 faz múltiplos contatos de alta afinidade com cadeias laterais de aminoácido compatíveis das hélices triplas adjacentes em ambos os lados, uma configuração com o potencial para transmitir força longitudinal e resistir à desdobra (FIG. 23 mostrando a estrutura 3PEo SR4 & 5 do domínio da plaquina, SH3: interface de ligação SR4/5 no spacefill). A análise das estruturas primárias de diversos ortólogos de distrofina/utrofina de espécies de Cnidários (água-viva) mostra a presença de domínios intercalados mas reconhecíveis HMM mas nenhuma “dobradiça” não estruturada, sustentando adicionalmente a nossa hipótese acerca tanto da origem evolucionária do domínio de bastão da distrofina de uma proteína semelhante a MACF quanto da magnitude da transmissão de força de eixo longo através da área de superfície ampla das interfaces interdomínio.

[0242] Com estas restrições estruturais e funcionais em mente, nós revisamos o esquema de substitutos compatíveis com AAV, miniaturizados para Dp427, isto é, distrofina de comprimento completo. Nós projetamos uma nano-utrofina que tira proveito de uma oportunidade única para rearranjar internamente o domínio de bastão com o mínimo rompimento das interfaces interdomínio. Isto é realizado in silico mesclando-se pares de hélices triplas incompatíveis através de uma seção transversal axial conservada, aquela ilustrada no sítio dos resíduos de triptofano interativos, altamente conservados estabilizando o núcleo da hélice tripla (FIG. 3). Nós sintetizamos cDNAs otimizados no códon para esta construção, criamos e maxi- prepped os vetores de cassete transcricionais flanqueados por ITR para transfecção tripla de células 293. Adicionalmente, nós conduzimos um experimento cego no qual camundongos mdx foram randomizados para receber AAVs codificando “micro-” ou “nano-” utrofina. Os resultados mostraram que a micro-utropina foi clivada precisamente no final do subfragmento de 79 kd do terminal N, enquanto não houve nenhuma clivagem detectável da nano-utrofina sob carga fisiológica similar (FIG. 28). Ambas as proteínas foram apropriadamente localizadas no sarcolema em músculos de camundongos mdx. As descobertas deste experimento indicam que a força superior da nano-utrofina comparada com a micro-utrofina mais intimamente se aproxima da mecanobiologia da isoforma Dp427 da distrofina. Estudos adicionais são realizados utilizando os métodos usados acima nestes Exemplos para avaliar a melhora fenotípica em vários modelos de doença. Em paralelo, o grau de qualquer melhora na eficiência do empacotamento de transgene no AAV é estabelecido com base no tamanho reduzido do genoma vetorial. G. AAVs capsídicos Ancestrais Reconstruídos para Produtos Terapêuticos para DMD: Anc80, 81, 82

[0243] Os vetores AAV com base no sorotipo 9 de capsídeo de ocorrência natural alcançam biodistribuição global espetacular ao músculo estriado em cães e primatas não humanos. A base estrutural para isto é insuficientemente entendida, embora os resíduos capsídicos envolvidos na ligação aos receptores de membrana selecionados são bem definidos para outros sorotipos. AAV8 é uma melhor escolha para a transferência de gene cardíaco eficiente em cães, refletindo uma diferença de espécie visto que AAV9 provê transdução robusta do miocárdio em primatas. Tanto AAV8 quanto 9 estão associados com anticorpos neutralizantes em proporções significantes da população humana adulta. Em um esforço para contornar esta limitação enquanto mantém biodistribuição global para o músculo estriado, Zinn, et al (Zinn, E., et al., In Silico Reconstrution of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep, 2015. 12(6): p. 1056-68), usado a combinação de reconstrução de sequência ancestral in silico e síntese gênica in vitro para preparar AAVs com “novos” capsídeos vetoriais (isto é, recapitulação provável da ocorrência natural, mas variantes de capsídeo extintas a muito tempo). Entre estas, aquelas rotuladas Anc80, 81 e 82 representam as oportunidades mais imediatas para replicar ou prolongar a biodistribuição favorável de AAV8 e 9 enquanto se expande o conjunto de elegibilidade de populações de pacientes com o potencial para anticorpos neutralizantes de alto título depois da exposição histórica para AAVs existentes de ocorrência natural, como descrito em detalhes (Zinn et al, como citado acima).

[0244] Nós recentemente empacotamos o genoma da nossa μUtrofina no capsídeo Anc80 e usamos o vetor resultante para avaliar a transdução de músculos relevantes em camundongos mdx. Estes estudos mostram que Anc80 alcança uma biodistribuição global comparável com aquela de AAV9 neste contexto, com transdução forte de músculo cardíaco e esqueletal (FIG. 24A a 24C).

[0245] Os dados a partir de experimentos randomizados, cegos confirmam que Anc80 e AAV9 têm a capacidade para infectividade comparável in vivo em músculo distrófico, com base nos níveis de expressão de um transgene terapêutico.

[0246] Experimentos esquematizados para comparar qualitativamente AAV9 e Anc80 foram realizados para a biodistribuição de μUtrofina em grupos de camundongos mdx seguindo a administração sistêmica destes vetores em doses iguais de 2,5 x 1012 vg/camundongo. Western blots representativos de músculos múltiplos de dois camundongos para cada vetor são mostrados na FIG. 25, demonstrando transdução generalizada e eficiente de músculos estriados com ambos os vetores. Exemplo 4 – Utrofina e distrofina mutantes de cinco repetições

[0247] Nós projetamos as proteínas recombinantes utrofina e distrofina que contêm uma hélice tripla adicional em relação aos mutantes “nano” originais descritos acima. Estes mutantes de “cinco repetições” têm 5 repetições helicoidais triplas semelhantes à espectrina entre os domínios de homologia da calponina de terminal N e os domínios "WW-EF-ZZ" de terminal C presentes nas proteínas completas. Estas variantes também têm estabilidade melhorada devido à presença de uma mutação de encaixe triplo e, adicionalmente, são capazes de serem empacotados dentro de vetores AAV. Importantemente, o desenvolvimento destes mutantes ilustra que os princípios que contam com esquema de nanodistrofinas e nano-utrofinas com quatro repetições, incluindo aquelas aqui descritas, pode ser estendido para variantes tendo cinco repetições helicoidais. Uma sequência de aminoácido correspondente a uma distrofina de cinco repetições é provida na SEQ ID NO: 22, em que uma mutação de encaixe foi formada pela união de 1 repetição helicoidal e 20 da proteína distrofina completa (FIG. 29A e FIG. 29B). Uma sequência de aminoácido correspondente a uma utrofina de cinco repetições é provida na SEQ ID NO: 21, em que uma mutação de encaixe foi formada pela união de 1 repetição helicoidal e 18 da proteína completa da utrofina (FIG. 30A e FIG. 30B). (Texto Livre da Listagem de Sequência)

[0248] A seguinte informação é provida para sequências contendo texto livre sob o identificador numérico <223>. SEQ ID NO: Sob o texto livre <223> (contendo texto livre) 1 <223> sequência de aminoácido de nanodistrofina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(463) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal N da distrofina

SEQ ID NO: Sob o texto livre <223> (contendo texto livre) humana completa.

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (463)..(463) <223> resíduo de triptofano na hélice “A” no núcleo do Modelo Oculto de Markov (HMM) e todas as estruturas cristalinas para as proteínas nesta superfamília.

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (464)..(505) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal C da distrofina humana completa.

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (505)..(506) <223> posições dentro da superfamília HMM para a hélice “B” que flanqueia o plano hipotético de transecção como representado na FIG 2F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (506)..(550) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal N da distrofina humana completa.

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (550)..(550) <223> resíduo de triptofano na hélice “C” no núcleo do Modelo Oculto de Markov (HMM) e todas as estruturas cristalinas para as proteínas nesta superfamília.

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (551)..(1131) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal C da distrofina

SEQ ID NO: Sob o texto livre <223> (contendo texto livre) humana completa. 2 <223> uma sequência de ácido nucléico codificando nanodistrofina 3 <223> sequência de aminoácido de nano-utrofina 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(433) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal N de utrofina humana de comprimento completo

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (433)..(433) <223> resíduo de triptofano na hélice “A” no núcleo do Modelo Oculto de Markov (HMM) e todas as estruturas cristalinas para as proteínas nesta superfamília

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (434)..(477) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal C de utrofina humana de comprimento completo

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (477)..(478) <223> posições dentro da superfamília HMM para a hélice “B” que flanqueia o plano hipotético de transecção como representado na FIG 2F

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (478)..(514) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal N de utrofina humana de comprimento completo

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (514)..(514) <223> resíduo de triptofano na hélice “C” no núcleo do Modelo Oculto de

SEQ ID NO: Sob o texto livre <223> (contendo texto livre) Markov (HMM) e todas as estruturas cristalinas para as proteínas nesta superfamília

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (515)..(1098) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal C de utrofina humana de comprimento completo 4 <223> sequência de ácido nucléico codificando a proteína nano-utrofina-1 5 <223> sequência de aminoácido de nano-utrofina-2 6 <223> sequência de ácido nucléico codificando a proteína nano-utrofina-2 7 <223> sequência de aminoácido de nano-utrofina-3 8 <223> sequência de ácido nucléico codificando a proteína nano-utrofina-3 9 <223> sequência de aminoácido com Acesso no GenBank: AAS99264 10 <223> sequência codificadora para capsídeo de AAV9 vp1 11 <223> sequência codificadora para hu31 vp1 12 <223> sequência codificadora para hu32 vp1 13 <223> sequência de aminoácido para nanodistrofina 14 <223> sequência de aminoácido para nanodistrofina 15 <223> sequência de aminoácido para nanodistrofina 16 <223> sequência de aminoácido para nanodistrofina 17 <223> sequência de aminoácido para nanodistrofina 18 <223> sequência de aminoácido para nanodistrofina 19 <223> sequência engenheirada codificando nano-utrofina 20 <223> Construção Sintética 21 <223> mutante de utrofina humana

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(324) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal N de utrofina humana de comprimento completo

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (311)..(417) <223> hélice tripla híbrida

SEQ ID NO: Sob o texto livre <223> (contendo texto livre)

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (325)..(362) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal C de utrofina humana de comprimento completo

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (363)..(401) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal N de utrofina humana de comprimento completo

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (402)..(1208) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal C de utrofina humana de comprimento completo 22 <223> proteína da distrofina humana mutante

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(354) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal N da distrofina humana de comprimento completo

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (340)..(447) <223> hélice tripla híbrida

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (355)..(392) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal C da distrofina humana de comprimento completo

SEQ ID NO: Sob o texto livre <223> (contendo texto livre) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (393)..(431) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal N da distrofina humana de comprimento completo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (432)..(1237) <223> sequência de aminoácido idêntica à região de terminal C da distrofina humana de comprimento completo

[0249] Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, citados neste pedido e a Listagem de Sequências aqui aludida, assim como o Pedido de Patente Provisório US No. 62/658.464, depositado em 16 de abril de 2018, são por meio deste incorporados por referência nas suas totalidades como se cada publicação ou pedido de patente individuais fossem específica e individualmente indicados ser incorporados por referência. Numerosas modificações e variações são incluídas no escopo do Relatório Descritivo identificado acima e são esperadas serem óbvias para uma pessoa versada na técnica. Tais modificações e alterações às composições e processos, tais como seleções de sequências codificadoras diferentes ou seleção ou dosagem dos vetores ou moduladores imunes são acreditados estar dentro do escopo das reivindicações anexadas a este.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV) caracterizado pelo fato de arava ter um capsídeo AAV e um genoma vetorial, em que o genoma vetorial compreende uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína mutante da superfamília da distrofina compreendendo um domínio helicoidal triplo híbrido sob o controle de sequências reguladoras que direcionam a sua expressão, o domínio helicoidal triplo híbrido compreendendo uma primeira hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice A fundida a uma porção de terminal C de uma hélice A’; uma segunda hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice B’ fundida a uma porção de terminal C de uma hélice B; e uma terceira hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice C fundida a uma porção de terminal C de uma hélice C’; em as hélices A, B e C estão presentes em uma primeira repetição helicoidal tripla que não está adjacente a uma segunda repetição helicoidal tripla tendo hélices A’, B’ e C’ em uma proteína da superfamília da distrofina nativa.

2. rAAV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma distrofina mutante de encaixe triplo.

3. rAAV de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais para 21 repetições helicoidais da distrofina completa.

4. rAAV de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais para 23 repetições helicoidais da distrofina completa.

5. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

6. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma sequência da SEQ ID NO: 2.

7. rAAV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma deleção em pelo menos 2 repetições helicoidais para 19 repetições helicoidais da distrofina completa.

8. rAAV de acordo com a reivindicação 1 ou 7, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22.

9. rAAV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma utrofina mutante de encaixe triplo.

10. rAAV de acordo com a reivindicação 1 ou 9, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma utrofina mutante de encaixe triplo e compreende uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais para 19 repetições helicoidais da utrofina completa.

11. rAAV de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante tripla compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3.

12. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma sequência da SEQ ID NO: 4.

13. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 10, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante tripla compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20.

14. rAAV de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende a SEQ ID NO: 19 ou uma sequência cerca de 95% a cerca de 99% idêntica à SEQ ID NO: 19.

15. rAAV de acordo com a reivindicação 1 ou 9, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma utrofina mutante de encaixe triplo e compreende uma deleção em pelo menos 2 repetições helicoidais para 17 repetições helicoidais da utrofina completa.

16. rAAV de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante tripla compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 21.

17. rAAV caracterizado pelo fato de ter um capsídeo AAV e um genoma vetorial, em que o genoma vetorial compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina sob o controle de sequências reguladoras que direcionam sua expressão, em que a proteína mutante de encaixe triplo compreende repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N, uma repetição helicoidal tripla híbrida e repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C, em que o número total das repetições helicoidais incluindo a repetição híbrida na proteína mutante de encaixe triplo é selecionado de qualquer número inteiro de 1 a 1 menos do que o número de repetições helicoidais da proteína da superfamília da distrofina completa e em que a repetição helicoidal tripla híbrida é formada por duas repetições helicoidais encaixadas no plano que bifurca as repetições helicoidais perpendiculares ao seu eixo longo como representado na FIG. 2F.

18. rAAV de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N da proteína mutante, quando a(s) mesma(s) está(ão) na proteína da superfamília da distrofina completa, está imediatamente adjacente à 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida; e em que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C da proteína mutante, quando a mesma está na proteína da superfamília da distrofina completa, está imediatamente adjacente às 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida.

19. rAAV de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a proteína da superfamília da distrofina completa é distrofina.

20. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N da proteína mutante compreende(m)(m) 1 repetição helicoidal na distrofina completa e/ou em que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C compreende 23 repetições helicoidais e 24 repetições helicoidais na distrofina completa.

21. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20,

caracterizado pelo fato de que as repetições helicoidais de terminal N consistem de 1 repetição helicoidal na distrofina completa, em que as repetições helicoidais de terminal C consistem de 23 repetições helicoidais e 24 repetições helicoidais na distrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 2 repetições helicoidais na distrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 22 repetições helicoidais na distrofina completa.

22. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

23. rAAV de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a sequência codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.

24. rAAV de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a proteína da superfamília da distrofina completa é utrofina.

25. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18 e 24, caracterizado pelo fato de que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N da proteína mutante compreende(m) 1 repetição helicoidal na utrofina completa e/ou em que as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante compreendem 21 e 22 repetições helicoidais na utrofina completa.

26. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18, 24 e 25, caracterizado pelo fato de que as repetições helicoidais de terminal N da proteína mutante consistem de 1 repetição helicoidal na utrofina completa, em que as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem de 21 repetições helicoidais e 22 repetições helicoidais na utrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 2 repetições helicoidais na utrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 20 repetições helicoidais na utrofina completa.

27. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18 e 24 a 27,

caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3

28. rAAV de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.

29. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18 e 24 a 26, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante tripla compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20.

30. rAAV de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende a SEQ ID NO: 19 ou uma sequência cerca de 95% a cerca de 99% idêntica à SEQ ID NO: 19.

31. rAAV caracterizado pelo fato de ter um capsídeo AAV e um genoma vetorial, em que o genoma vetorial compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína mutante de encaixe triplo da superfamília da distrofina sob o controle de sequências reguladoras que direcionam sua expressão, em que a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma repetição helicoidal tripla híbrida e repetições helicoidais de terminal C, em que o número total das repetições helicoidais incluindo a repetição híbrida na proteína mutante de encaixe triplo é cinco e em que a repetição helicoidal tripla híbrida é formada por duas repetições helicoidais encaixadas no plano que bifurca as repetições helicoidais perpendiculares ao seu eixo longo como representado na FIG. 2F.

32. rAAV de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem de repetições helicoidais 21, 22, 23 e 24 na distrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida é 1 repetição helicoidal na distrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 20 repetições helicoidais na distrofina completa.

33. rAAV de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22.

34. rAAV de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem de repetições helicoidais 19, 20, 21 e 22 na utrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida é 1 repetição helicoidal na utrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 18 repetições helicoidais na utrofina completa.

35. rAAV de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 21.

36. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que as sequências reguladoras compreendem um promoter, em que o promotor é um promotor constitutivo ou em que o promotor é um promotor específico de músculo.

37. rAAV de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o promotor específico de músculo é um promotor da creatinina cinase muscular (MCK) ou o promotor SPc5-12.

38. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que as sequências reguladoras compreendem um promotor CS-CRM4/SPc5-12 quimérico.

39. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que as sequências reguladoras compreendem um realçador.

40. rAAV de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o realçador é uma tandem dupla ou tripla de um realçador MCK.

41. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o vírus adeno-associado recombinante é selecionado de AAV1, AAV5, AAV6, AAV8, AAV8 triplo, AAV9, Anc80, Anc81 e Anc82.

42. Proteína mutante recombinante de encaixe triplo da superfamília da distrofina caracterizada pelo fato de que compreende um domínio híbrido de hélice tripla compreendendo uma primeira hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice A fundida a uma porção de terminal C de uma hélice A’; uma segunda hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice B’ fundida a uma porção de terminal C de uma hélice B; e uma terceira hélice compreendendo uma porção de terminal N de uma hélice C fundida a uma porção de terminal C da hélice C’; em que as hélices A, B e C estão presentes em uma primeira repetição helicoidal tripla que não está adjacente a uma segunda repetição helicoidal tripla tendo hélices A’, B’ e C’ em uma proteína da superfamília da distrofina nativa.

43. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma distrofina mutante de encaixe triplo.

44. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais para 21 repetições helicoidais da distrofina completa.

45. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais para 23 repetições helicoidais da distrofina completa.

46. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

47. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44 e 46, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma sequência da SEQ ID NO: 2.

48. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma deleção em pelo menos 2 repetições helicoidais para 19 repetições helicoidais da distrofina completa.

49. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 42 ou 48, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22.

50. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma utrofina mutante de encaixe triplo.

51. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 42 ou 50, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma utrofina mutante de encaixe triplo e compreende uma deleção em pelo menos 3 repetições helicoidais para 19 repetições helicoidais da utrofina completa.

52. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante tripla compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3

53. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 e 50 a 52, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma sequência da SEQ ID NO: 4.

54. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 ou 51, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante tripla compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20.

55. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende a SEQ ID NO: 19 ou uma sequência cerca de 95% a cerca de 99% idêntica à SEQ ID NO: 19.

56. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 42 ou 50, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante da superfamília da distrofina é uma utrofina mutante de encaixe triplo e compreende uma deleção em pelo menos 2 repetições helicoidais para 17 repetições helicoidais da utrofina completa.

57. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações

42, 50 ou 56, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante tripla compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 21.

58. Proteína mutante recombinante de encaixe triplo da superfamília da distrofina caracterizada pelo fato de que compreende repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N, uma repetição helicoidal tripla híbrida e repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C, em que o número total das repetições helicoidais incluindo a repetição híbrida na proteína mutante de encaixe triplo é selecionado de qualquer número inteiro de 1 a 1 menos do que o número de repetições helicoidais da proteína da superfamília da distrofina completa e em que a repetição helicoidal tripla híbrida é formada por duas repetições helicoidais encaixadas no plano que bifurca as repetições helicoidais perpendicular ao seu eixo longo como representado na FIG 2F.

59. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N da proteína mutante, quando a mesma está na proteína da superfamília da distrofina completa, está imediatamente adjacente à 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida; e em que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C da proteína mutante, quando a mesma está na proteína da superfamília da distrofina completa, está imediatamente adjacente a 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida.

60. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 58 ou 59, caracterizada pelo fato de que a proteína da superfamília da distrofina completa é distrofina.

61. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 60, caracterizada pelo fato de que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N da proteína mutante compreende(m) 1 repetição helicoidal na distrofina completa e/ou em que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal C compreendem 23 repetições helicoidais e 24 repetições helicoidais na distrofina completa.

62. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 61, caracterizada pelo fato de que as repetições helicoidais de terminal N consistem de 1 repetição helicoidal na distrofina completa, em que as repetições helicoidais de terminal C consistem de 23 repetições helicoidais e 24 repetições helicoidais na distrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 2 repetições helicoidais na distrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 22 repetições helicoidais na distrofina completa.

63. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 62, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

64. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que a sequência codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.

65. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 58 ou 59, caracterizada pelo fato de que a proteína da superfamília da distrofina completa é utrofina.

66. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 58, 59 e 65, caracterizada pelo fato de que a(s) repetição(ões) helicoidal(is) de terminal N da proteína mutante compreende(m) 1 repetição helicoidal na utrofina completa e/ou em que as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante compreendem 21 e 22 repetições helicoidais na utrofina completa.

67. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 58, 59, 65 e 66, caracterizada pelo fato de que as repetições helicoidais de terminal N da proteína mutante consistem de 1 repetição helicoidal na utrofina completa, em que as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem de 21 repetições helicoidais e 22 repetições helicoidais na utrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 2 repetições helicoidais na utrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 20 repetições helicoidais na utrofina completa.

68. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 58, 59 e 65 a 67, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3

69. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que a sequência codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.

70. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 58, 59 e 65 a 67, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante tripla compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20.

71. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando a proteína mutante de encaixe triplo compreende a SEQ ID NO: 19 ou uma sequência cerca de 95% a cerca de 99% idêntica à SEQ ID NO: 19.

72. Proteína mutante recombinante de encaixe triplo da superfamília da distrofina, caracterizada pelo fato de que compreende uma repetição helicoidal tripla híbrida e repetições helicoidais de terminal C, em que o número total das repetições helicoidais incluindo a repetição híbrida na proteína mutante de encaixe triplo é cinco e em que a repetição helicoidal tripla híbrida é formada por duas repetições helicoidais encaixadas no plano que bifurca as repetições helicoidais perpendiculares ao seu eixo longo como representado na FIG. 2F.

73. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem de repetições helicoidais 21, 22, 23 e 24 na distrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida é 1 repetição helicoidal na distrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 20 repetições helicoidais na distrofina completa.

74. rAAV de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22.

75. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 72, caracterizado pelo fato de que as repetições helicoidais de terminal C da proteína mutante consistem de repetições helicoidais 19, 20, 21 e 22 na utrofina completa, em que 1 repetição helicoidal das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida é 1 repetição helicoidal na utrofina completa e em que 2 repetições helicoidais das duas repetições formando a repetição helicoidal tripla híbrida são 18 repetições helicoidais na utrofina completa.

76. rAAV de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que a proteína mutante de encaixe triplo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 21.

77. Proteína recombinante mutante da distrofina caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 22.

78. Utrofina recombinante mutante caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 3, 20 ou 21.

79. Sequência de ácido nucleico recombinante caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína mutante da superfamília da distrofina como definido em qualquer uma das reivindicações 42 a 78.

80. Plasmídeo caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico como definido na reivindicação 79 sob o controle de sequências reguladoras que direcionam a sua expressão.

81. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um rAAV como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 41 em um tampão de formulação.

82. Método de tratar um sujeito diagnosticado com distrofia muscular de Duchenne o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição como definida na reivindicação 81.

83. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41 caracterizado pelo fato de ser para o uso em um método para tratar MDS em um sujeito em necessidade do mesmo.

84. Uso de rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar a distrofia muscular de Duchenne.