JP2021521782A - デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための組成物及び方法 - Google Patents

デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

ジストロフィン又はユートロフィンの三重スプライス変異体、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するためのその使用方法を本明細書に記載する。調節エレメントの直接発現の制御下にある三重スプライス変異体ジストロフィン又はユートロフィンをコードする核酸を含むウイルスベクターもまた提供される。ヒト患者への送達のために処方されたこのようなウイルスベクターを含む組成物もまた提供される。

Description

電子形式で提出された資料の参照による組み込み
本出願人は、電子形式で提出された配列表資料を参照により本明細書に組み込む。このファイルは、「ＵＰＮ＿１８−８４３８ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（２０１９年４月１６日作成、２６９，８１７バイト）と表記されている。
連邦政府が後援する研究の声明
本発明は、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ／ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅにより与えられたＲ０１ＮＳ０９４７０５に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、早期の移動筋力低下から末期の呼吸器・心筋症へと進行する重度の障害性の全身性小児期発症疾患であり、異常に高額な介護者お及び技術依存を特徴とする（非特許文献１；及び非特許文献２。）ＤＭＤは、人類で最も一般的な単一遺伝子致死性疾患の１つであり、歴史的な世界的な発生率は、男児出生の約１：４０００である。分子基盤は、細胞骨格タンパク質ジストロフィン（Ｄｐ４２７）の４２７ ｋｄアイソフォームの欠損であり、症例の大部分は、ＤＭＤ遺伝子のマルチエキソン、フレームシフト欠失によって引き起こされる。より軽度の疾患であるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、対立遺伝子性であり、ほとんどの症例は、コードされたタンパク質のロッドドメインの長さを変化させるジストロフィン遺伝子の内部欠失又は重複から生じる。
ジストロフィンは、「ポジショナルクローニング」によって発見された最初のタンパク質であり、この発見は、その分子基盤を解明するための主要な基礎として、疾患のヒト遺伝地図位置を用いるための概念の最初の証拠を提供した。このアプローチによって発見された多くのタンパク質は、影響を受けた細胞中の存在量が非常に少なく、タンパク質の生理学的機能の確認を複雑にしている。ジストロフィンは、１９８７年に発見され、この分野の３０年は、筋細胞におけるタンパク質の正確な機能の理解における大きなギャップに直面している。しかしながら、筋収縮時に発生した力から筋細胞膜を保護するジストロフィンの役割の間接的証拠が提供されている。ジストロフィンの機械的負荷の性質は、あまり特徴付けられていないままである。
保因者の発見と出生前カウンセリングにより、米国におけるＤＭＤの発症率は、若干低下している（非特許文献３）。グルココルチコステロイド、ＡＣＥ阻害薬、機械的換気サポートの併用による現行の治療法は、一時的に進行速度を遅らせる可能性があるが、最終的な臨床経過は厳しいものである（非特許文献４）。
遺伝子治療の時代には、全身性遺伝子送達のための最も毒性が低く、最も広く普及したプラットフォームとして、様々なＡＡＶベクターが浮上してきた。これらの遺伝子治療は、全身的な体内分布に非常に有望であるが、その制限は、（ａ）全長Ｄｐ４２７に必要な３分の１に限定されたクローニング能力、（ｂ）耐久性治療に潜在的に必要とされる用量でのベクター免疫原性及び毒性の未解決の問題、並びに（ｃ）ヒト治療に必要とされるスケールでの従来の製造の異常なコストを含む。ＡＡＶベクターは、約５キロ塩基の一本鎖ＤＮＡゲノムを包み込むパルボウイルスのサブファミリーの野生型メンバーに構造的に関連している。全長ジストロフィンのｍＲＮＡは、１４キロ塩基で、オープンリーディング
フレームは、約１２ｋｂである。
ＤＭＤを引き起こす変異の大部分は、＞２．５メガ塩基、Ｘ連鎖遺伝子における散発性マルチエキソン、フレームシフト欠失である（非特許文献５； 非特許文献６；及び非特許文献７）。欠損した全長タンパク質に対する中枢（胸腺）免疫寛容がない場合、組換えジストロフィンは、外来タンパク質に対する宿主免疫応答を誘導する能力を有する（非特許文献８）。新規ベクター及び血管送達方法は、前臨床試験の概念実証において、有望な局所的及び全身的遺伝子導入を達成しており、ＤＭＤの遺伝子療方法への合理的アプローチを示唆している（非特許文献９； 非特許文献１０； 非特許文献１１；及び非特許文献１２）。しかしながら、これらの開発は、この分野における主要なベクター発見の課題と患者の安全性の懸念にも焦点を当てている（非特許文献８； 非特許文献１３； 非特許文献１４；及び非特許文献１５）。ＤＭＤを治療するＡＡＶベクターの別の例として、特許文献１は、Ｎ末端ユートロフィン領域内に位置するヒトユートロフィンに対して約２７０アミノ酸の「アクチニン結合ドメイン」の機能部分、プロリンリッチヒンジ領域１及び４（Ｈ１）及び（Ｈ４）の少なくとも機能部分、並びにＣ末端ユートロフィンタンパク質の一部を有する「マイクロユートロフィン」（「ｍ−ユートロフィン」、「μユートロフィン」又は「μ−Ｕ」とも呼ばれる）を提供する。マイクロユートロフィンは、中央ロッド反復ドメインの内部欠失及び下流のＣ末端領域における切断を含む。
米国特許第７，７７１，９９３号
Ｌａｎｄｆｅｌｄｔ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ： ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１４． ８３（６）： ｐ． ５２９−３６ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ−Ｋａｔｚ， Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｏｓｔ ｏｆ ｉｌｌｎｅｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ａｎｄ Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ ｉｎ Ｇｅｒｍａｎｙ． Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ， ２０１４． ９： ｐ． ２１０ Ｐｅｇｏｒａｒｏ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， ＳＰＰ１ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｓ ａ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１１． ７６（３）： ｐ． ２１９−２６ ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｃ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｒｏｕｐ ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｓｔｕｄｙ−ａ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｔｈｅｒａｐｙ： Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｕｓｅｄ． Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ， ２０１３ Ｋｕｎｋｅｌ， Ｌ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎａｔｕｒｅ， １９８６． ３２２（６０７４）： ｐ． ７３−７ Ｍｏｎａｃｏ， Ａ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃＤＮＡｓ ｆｏｒ ｐｏｒｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｇｅｎｅ． Ｎａｔｕｒｅ， １９８６． ３２３（６０８９）： ｐ． ６４６−５０ Ｋｏｅｎｉｇ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｖｅｒｓｕｓ Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ， １９８９． ４５（４）： ｐ． ４９８−５０６ Ｍｅｎｄｅｌｌ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ２０１０． ３６３（１５）： ｐ． １４２９−３７ Ｇｒｅｅｌｉｓｈ， Ｊ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｂｌｅ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ． Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９９． ５（４）： ｐ． ４３９−４３ Ｓｕ， Ｌ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｎｉｆｏｒｍ ｓｃａｌｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｓｔｒｉａｔｅｄ ｍｕｓｃｌｅ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｖｅｎｕｌａｒ ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ２００５． １１２（１２）： ｐ． １７８０−８ Ｇａｏ， Ｇ．， Ｌ．Ｈ． Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ， ａｎｄ Ｊ．Ｍ． Ｗｉｌｓｏｎ， Ｎｅｗ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２００５． ５（３）： ｐ． ２８５−９７ Ｋａｔｚ， Ｍ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｄｉａｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ： ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２０１０． ２１（４）： ｐ． ３７１−８０ Ｍｅｎｄｅｌｌ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｙｏｂｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， １９９５． ３３３（１３）： ｐ． ８３２−８ Ｍｏｕｌｙ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｙｏｂｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ： ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａｎｙ ｌｉｇｈｔ ａｔ ｔｈｅ ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｎｎｅｌ？ Ａｃｔａ Ｍｙｏｌ， ２００５． ２４（２）： ｐ． １２８−３３ Ｗａｎｇ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ａ ｒａｎｄｏｍ−ｂｒｅｄ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２００７． １８（１）： ｐ． １８−２６
デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び関連疾患の治療が依然として必要である。
本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を含む筋ジストロフィー（ＭＤ）、並びに他の疾患の治療に有用な組成物及び方法を提供する。ＡＡＶカプシド及びベクターゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが本明細書に提供される。ベクターゲノムは、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質を、その発現を指示する調節配列の制御下でコードする核酸配列を含む。
特定の態様では、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質は、らせんＡ’のＣ末端部分に融合されたらせんＡのＮ末端部分を含む第１のらせんと、らせんＢのＣ末端部分に融合されたらせんＢ’のＮ末端部分を含む第２のらせんと、らせんＣ’のＣ末端部分に融合されたらせんＣのＮ末端部分を含む第３のらせんとを含むハイブリッドらせんドメインを含み、らせんＡ、Ｂ、及びＣは、天然ジストロフィンスーパーファミリータンパク質中のらせんＡ’、Ｂ’及びＣ’を有する第２の三重らせん反復に隣接しない第１の三重らせん反復中に存在する。特定の態様では、ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質は、三重スプライス変異体ジストロフィン又は三重スプライス変異体ユートロフィンである。
さらに別の態様では、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質は、Ｎ末端らせん反復、ハイブリッド三重らせん反復、及びＣ末端らせん反復を含み、ここで、三重スプライス変異体タンパク質におけるハイブリッド反復を含むらせん反復の総数は、１から、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質のらせん反復数より１小さいいずれかの整数から選択され、ハイブリッド三重らせん反復は、図２Ｆに示されるように、らせん反復をその長軸に垂直に二分する平面上でスプライスされた２つのらせん反復によって形成される。特定の態様では、ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質は、三重スプライス変異体ジストロフィン又は三重スプライス変異体ユートロフィンである。
配列番号１又は２２のアミノ酸配列を有する新規な組換え変異体ジストロフィンが提供され、配列番号３、７及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する新規組換え変異体ユートロフィンも提供される。特定の態様では、三重スプライス変異体タンパク質は、ユートロフィンであり、配列番号１９、又はそれと約９５％〜約９９％同一の配列を含む核酸によってコードされる。
さらなる態様において、三重スプライス変異体タンパク質は、ハイブリッド三重らせん反復及びＣ末端らせん反復を含み、ここで、三重スプライス変異体タンパク質におけるハイブリッド反復を含むらせん反復の総数は、５であり、ハイブリッド三重らせん反復は、図２Ｆに示されるように、らせん反復をその長軸に垂直に二分する平面上でスプライスされた２つのらせん反復によって形成される。特定の態様では、変異体タンパク質のＣ末端らせん反復は、全長ジストロフィン中のらせん反復２１、２２、２３、及び２４からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１は、全長ジストロフィン中のらせん反復１であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２は、全長ジストロフィン中のらせん反復２０である。さらに別の態様では、変異体タンパク質のＣ末端らせん反復は、全長ユートロフィン中のらせん反復１９、２０、２１、及び２２からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１は、全長ユートロフィン中のらせん反復１であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２は、全長ユートロフィン中のらせん反復１８である。
なおさらなる態様において、配列番号１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は２２のアミノ酸配列を含む新規な組換え変異体ジストロフィンタンパク質が提供される。特定の態様では、変異体ジストロフィンスーパーファミリータンパク質をコードする核酸が提供される。なおさらなる態様では、変異体ジストロフィンスーパーファミリータンパク質をコードする核酸を含むプラスミドが提供される。
特定の態様では、三重スプライス変異体ジストロフィンスーパーファミリータンパク質をコードする核酸配列を含むベクターゲノムを含むｒＡＡＶを含む医薬組成物が提供される。
さらにさらなる態様では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーと診断された対象を治療する方法であって、三重スプライス変異体ジストロフィンスーパーファミリータンパク質をコードする核酸配列を有するベクターゲノムを含むｒＡＡＶを含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
本発明の他の局面及び利点は、以下の発明の詳細な説明から明らかになるであろう。
図１Ａ〜図１Ｄは、ハイブリッド三重らせんドメインを形成する図示を提供する。図１Ａは、例示的なジストロフィスーパーファミリータンパク質の構成要素を示す。タンパク質のＮ末端（ＮＨ２−として示される）からＣ末端（−ＣＯＯＨとして示される）まで、構成要素は、１）２つのカルポニン相同ドメイン（ＣＨ１及びＣＨ２）、２）いくつかの三重らせんドメイン（数字が続くＴＨとして示される）、３）モジュール状の多ドメイン球状領域（ＷＷ−ＥＦ−ＺＺ）、及び４）極Ｃ末端領域である。この図では、２４個の三重らせんドメインがある。灰色の矢じりは、短縮ジストロフィンスーパーファミリータンパク質の以前の形成において利用されたスプライス接合部位を示し（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７７１，９９３号に記載されるような）、一方、黒色の矢じりは、ハイブリッド三重らせんドメインを形成するために使用されるスプライス接合部位を示す。図１Ｂは、図１Ｃに示されるようなハイブリッド三重らせんを形成するためにスプライスされた三重らせんドメイン（白色の矢印ではＴＨｎ、影付き矢印ではＴＨｎ’）の詳細を提供する。図１Ｂ〜図１Ｄの各々の白色の矢印又は影付き矢印は、ドメイン中のらせんを示す（ＴＨｎについては、らせんＡ、Ｂ、及びＣ；ＴＨｎ’については、らせんＡ’、Ｂ’、及びＣ’；ハイブリッド三重らせんドメイン中のらせんＡ−Ａ’、Ｂ’−Ｂ、及びＣ−Ｃ’）。黒い矢印線は、スプライス接合部位を示す。図１Ｄは、ハイブリッド三重らせんドメインの線形表示を提供する。バー／矢印の白い部分は、それらが元々ＴＨｎからのものであることを示し、影付き部分は、それらが元々ＴＨｎ’からのものであることを示している。図１Ｄに示すように、ハイブリッド三重らせんドメインの第１のらせんは、Ｎ末端にらせんＡを含み、Ｃ末端にらせんＡ’を含み、ハイブリッド三重らせんドメインの第２のらせんは、Ｎ末端にらせんＢ’を含み、Ｃ末端にらせんＢを含み、ハイブリッド三重らせんドメインの第３のらせんは、Ｎ末端にらせんＣを含み、Ｃ末端にらせんＣ’を含む。 図２Ａ〜図２Ｆは、本明細書に提供されるユートロフィン修飾を例示する。より明るい色の残基は、トリプトファンを示し、これは、α−アクチニン、β−及びα−スペクトリン、ジストロフィン、ユートロフィン及びスペクトロプラキンによって共有される三重らせん反復ドメインについての隠れマルコフモデリング（ＨＭＭ）において最も保存された残基である。広範な進化的結合を有する他のすべての位置での配列の相違から、個々の反復のこれらの領域は、三重らせんを不安定にすることなく、ある反復から別の反復へと交換できるわけではないことが確証される。単一のスプライスでは、この問題を解決することはできないが、トリプトファン残基の平面を横切る三重スパイスは、平面の左右に結合したアミノ酸を保持することによって解決することができる。図２Ａは、α−アクチニンの三重らせん反復ドメイン（ＴＨ１）の一部を示す。図２Ｂは、α−アクチニンのＴＨ２部分を示す。図２Ｃは、α−アクチニンのＴＨ３部分を示す。図２Ｄは、α−アクチニンのＴＨ４部分を示す。図２Ｅは、β−及びα−スペクトリンｔｅｔ部位を示す。図２Ｆは、平面の左右に結合したアミノ酸を保持することにより、トリプトファン残基の図面を横切る三重スプライスを示す（配向を助けるために、トリプトファンを２回示す）。 図３は、スペクトリンファミリー（ＰＦ００４３５）のＨＭＭロゴの一部を示す。詳細は、ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｆａｍｉｌｙ／ＰＦ００４３５＃ｔａｂｖｉｅｗ＝ｔａｂ４に見出すことができる。このＨＭＭロゴは、ＨＭＭのプロパティーの概要をグラフィカルな形式で表示する。位置＃１６におけるスペクトリン様三重らせん反復についてのＨＭＭロゴに示されるように、２つのアンカートリプトファンの各々の相対的保存。当業者は、例えば、Ｓｃｈｕｓｔｅｒ−Ｂｏｅｃｋｌｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ， ＨＭＭ Ｌｏｇｏｓ ｆｏｒ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００４ Ｊａｎ ２１；５：７に記載されているように、ロゴをどのように解釈するかを見出すことができる。 図４は、本明細書に記載されるようなナノジストロフィンの形成の概要、及びマイクロジストロフィンの形成との比較を提供する。 図５は、ジストロフィンのらせんＢにおける可能なスプライス接合部を示すグリッドを提供する。この図面に関するより詳細な説明は、発明の詳細な説明の第１段落、Ｉ．ジストロフィン、ユートロフィン及びその他、Ａ．らせんにおけるスプライス接合部に見出すことができる。示されるバリアントは、配列番号１３〜１８のナノジストフィン（ｄｙｓｔｏｐｈｉｎ）アミノ酸配列に対応する。 図６Ａ〜図６Ｃは、ジストロフィンロッドの長さが、筋節の出現前に確立されたことを示す。図６Ａは、イントロン位置及び相を示すために整列されたヒトジストロフィン遺伝子、ｍＲＮＡ、及びタンパク質ドメイン構造を示す。ヒトジストロフィンの２４個のスペクトリン反復のうち２２個は、ＨＭＭの４６位に相０イントロン（黒い輪郭を有する点）を含む。刺胞動物のジストロフィンは、ロッドドメイン相０イントロンを共有している（わかりやすくするために、刺胞動物のｍＲＮＡには、ＨＭＭの４６位の相０イントロンのみが描かれている）。図６Ｂは、三重らせんドメインＨＭＭについてのコンセンサス配列に垂直に整列されたロッドドメインを用いて示されたヒトβ重スペクトリン、ジストロフィン、及びＭＡＣＦ１を提供する。重ね合わせたのは、対応するコード配列に対するイントロンの位置及び相であり、ジストロフィン及びＭＡＣＦ１遺伝子の構造的類似性を明確に示している。わかりやすくするために、最も遠縁の種由来のオルソロガス遺伝子と共有するイントロンのみを示し、スペクトリン遺伝子は、１３反復（スペクトリン−Ａ．クイーンズランディカ（Ａ．ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃａ）；ジストロフィン−Ｎ．ベクテンシス（Ｎ．ｖｅｃｔｅｎｓｉｓ）；ＭＡＣＦ１−センモウヒラムシ（Ｔ． ａｄｈａｅｒｅｎｓ））の遠隔部分的遺伝子重複から痕跡的イントロン（矢印）を示した。図６Ｃは、特定の真核生物系統におけるαアクチニンタンパク質スーパーファミリーメンバーの系統発生的分布を提供する。ロッドドメインスペクトリン反復の数は、括弧内に特定される。ジストロプラキンスーパーファミリーのメンバーは、ＨＭＭの４６位に相０イントロンを有しているが、αアクチニン及びスペクトリンファミリータンパク質は、この位置に相０イントロンの保存を欠いている。真菌と平板動物門の間には、祖先ＭＡＣＦ１オルソログのＨＭＭ ４６イントロン駆動拡大が観察される。祖先ＭＡＣＦ１オルソログは、祖先ＷＷ−ＥＦ−ＺＺジストロフィンオルソログにＮ末端アクチン結合ドメインと全長ロッドドメインを供与する部分的遺伝子重複を経た。 図７Ａ〜図７Ｆは、広範な形質導入がジストロフィン関連タンパク質複合体を回復させ、筋線維変性を予防し、血清ＣＫレベルを正常化し、ＡＡＶ９−μユートロフィン治療ｍｄｘマウスにおける筋機能を改善することを示す。図７Ａに示すように、天然ユートロフィン（Ｕｔｒｏ＿Ｃ）、γ−サルコグリカン、胚性ミオシン重鎖（ｅＭＨＣ）、及びラミニンに特有のエピトープに対する天然及び組換えユートロフィン（Ｕｔｒｏ＿Ｎ）が共有するエピトープに対する代表的な肢筋の免疫染色；スケールバー２５μｍ。図７Ｂは、筋壊死及び単核細胞浸潤の抑制を示す代表的な肢筋のＨ＆Ｅを提供する；スケールバー１００μｍ。図７Ｃは、組換えユートロフィン（ＡＡＶ９−μＵｔｒｏ）及びγ−サルコグリカン（γ−ｓａｒｃ）の発現を検出するウェスタンブロット分析を提供する。図７Ｄは、中心有核筋原線維（ＣＮＦ）のパーセンテージ、方法において定義される統計的尺度を提供する（色＝別個の動物、形状＝別個の筋肉、同じ色／形状＝技術的反復）。図９Ｅは、治療マウス（Ｎ＝５）、未治療マウス（Ｎ＝１２）（＊＊＊ｐ＜０．０００１）、及び野生型由来のＮ．Ｓ．（Ｎ＝７）における血清ＣＫレベルの計測を提供する。図７Ｆは、治療マウス（ｎ＝８）、未治療ｍｄｘマウス（ｎ＝１１）、及び野生型マウス（ｎ＝６）における把持後１時間の垂直活動の定量を提供する。エラーバーは、ＳＤ、＊＊ｐ＜０．００１を表し；Ｎ．Ｓは、有意ではないことを示し；統計的有意性は、多群比較を伴うＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定によって評価した。 図８Ａ〜図８Ｇは、７週齢のＧＲＭＤイヌにおけるＡＡＶ９−μユートロフィンの全身送達が筋壊死を予防し、血清ＣＫレベルの迅速な減少をもたらすことを示す。図８Ａは、実験的タイムラインを提供する。図８Ｂは、未治療の筋肉における豊富な筋壊死線維及び単核細胞浸潤を示す外側広筋及び側頭筋の代表的なＨ＆Ｅを提供し、一方、治療された筋肉は、ＷＴに類似する。図８Ｃは、対応する定量（図８Ｅ）を伴う、筋変性を示す石灰化線維を示すアリザリンレッドＳ染色を提供する（左パネル、赤）。図１０Ｄは、対応する定量を伴う（図８Ｆ）、ｅＭＨＣ陽性線維のクラスターを示すｆ１．６５２での免疫蛍光染色を提供する（右パネル、赤色）。図８Ｇは、全身ＡＡＶ９−μユートロフィン注入前／後の様々な時点での血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを提供する。スケールバー１００μｍ。 図９Ａ〜図９Ｄは、μユートロフィンの広範な発現が、７週齢での全身送達後に、治療されたＧＲＭＤイヌにおいてジストロフィン関連タンパク質複合体タンパク質をレスキューすることを示す。図９Ａ及び図９Ｂは、代表的な肢筋の免疫蛍光染色を提供する。図９Ａは、天然及び組換えユートロフィン（Ｕｔｒｏ＿Ｎ）、天然ユートロフィン（Ｕｔｒｏ＿Ｃ）、ラミニンを示す。図９Ｂは、s−ジストログリカン（緑色）、s−サルコグリカン（緑色）及びγ−サルコグリカン（赤色）を示す。スケールバー１００μｍ。図９Ｃは、剖検時の横紋筋におけるμユートロフィン（〜１３５ｋＤ）の広範な生体分布を示すウェスタンブロット分析を示す。図９Ｄは、外側広筋（ＶＬ）及び頭蓋サルトリウス（ＣＳ）の筋肉生検におけるs−ジストログリカンの発現を示すウェスタンブロット分析を示す。治療（Ｈ）／治療（Ｂ）は、治療したイヌ、Ｈａｎｎ及びＢｅｅｔｌｅ由来の組織を示す。 図１０Ａ〜図１０Ｄは、μユートロフィンではなくμジストロフィンの局所発現がジストロフィン欠失ヌルイヌモデルにおいて検出可能な末梢及び局所免疫応答を誘発することを示す。図１０Ａは、実験的タイムラインを提供する。ジストロフィン欠失ヌルイヌ（Ｇｒｉｎｃｈ及びＮｅｄ）に、各々、ＡＡＶ９−μジストロフィン（右）及びＡＡＶ９−μユートロフィン（左）を、それらの脛骨前区画に等用量（１×１０１２ｖｇ／ｋｇ）で筋肉内注射した。図１０Ｂに示すように、ＰＢＭＣを注射前、注射後２、４、６、８週間で収集し、全μジストロフィン（プールＡ〜Ｄ）及びμユートロフィン（プールＥ〜Ｊ）ペプチド配列にわたる合成ペプチドと共に培養し、一方、ワクチンペプチド及びＰＭＡ／イオンは陽性対照として機能した。陽性結果は、≧５スポット形成単位（ＳＦＵ）／１Ｅ５ ＰＢＭＣ（点線）と解釈された。図１０Ｃは、Ｕｔｒｏ Ｎ（上列）及びジストロフィン（下列）に対する注射後４週間で収集された筋肉生検の免疫蛍光（緑色）染色を示す。赤い境界を有する挿入図−参考のために、ジストロフィンについて緑色に染色された正常な筋肉の外観。図１０Ｄは、注射後４週間で収集された筋肉生検の代表的なＨ＆Ｅを示す。 図１１は、マイクロユートロフィンの概観を提供する。欠失接合部（スプライス接合部）の部位を示す。ヒンジ１、２、及び４は、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ４として標識される。ＳＲ１、ＳＲ２、ＳＲ３及びＳＲ２２は、全長のユートロフィンのＴＨ１、ＴＨ３、ＴＨ３、ＴＨ２２に対応する。 図１２Ａ〜図１２Ｄは、ハイブリッド試験：垂直活動監視及び全肢力試験全体の設計を提供する。図１２Ａは、その実験的タイムラインを示す概略図を提供する。図１２Ｂは、ｃ５７マウス（ｎ＝１１）とｍｄｘマウス（ｎ＝１２）との間のオープンフィールドケージにおける垂直活動の定量を示し、その後、全肢力試験は、ｃ５７マウスとｍｄｘマウスとの間に有意差を示さなかった（Ｐ＞０．０５ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）。図１２Ｃは、ｃ５７（ｎ＝１１）及びｍｄｘマウス（ｎ＝１７）の両方について、一連の７回の引っ張りにわたって全肢力試験を行ったことを示す。Ｃ５７マウスを四角で示し、ｍｄｘマウスを丸で示す。各一連の引っ張りに対する全肢力の分布が示されている。式を示す（Ｐ＜０．０００１、２方向ＡＮＯＶＡ検定）。図１２Ｄは、力試験後１時間の累積垂直活動後の分析を提供し、ｃ５７マウスとｍｄｘマウスとの間に有意差があることを示した（Ｐ＜０．０００１、２方向ＡＮＯＶＡ）。 図１３は、全肢力試験（Ｐｒｅ）前の５分間、並びに力試験後の最初の５分間及び２回目の５分間の、ｃ５７マウス及びｍｄｘマウスの両方の自発運動の視覚的表示を提供する。破線は、水平活動を表し、ドットは、垂直活動を表す。 図１４Ａ〜図１４Ｇは、強制収縮後のＢＩＯ １４．６ハムスター骨格筋のクラスター化筋細胞における急性筋細胞膜破壊を示す。図１４Ａは、エバンスブルー色素の静脈内注射の７２時間後の筋線維におけるエバンスブルー色素及びジストロフィン対比染色の同時観察を提供する。図１４Ｂにおいて、ＦＩＴＣフィルターを通して見られるように、ジストロフィン染色の完全な不在は、図１４Ａからの切片におけるすべてのエバンスブルー陽性繊維において明らかである。図１４Ｃは、筋細胞損傷が随意走行の１回の８時間以内に、ほとんどのエバンスブルー陽性線維においてジストロフィンの損失をもたらすことを示す。図１４Ｄは、０．７５筋肉長／秒の伸長速度での強縮拘縮の３時間後の前脛骨筋を示す。急性損傷は、プロシオンオレンジ色素取り込みによって示され；ジストロフィン対比染色がこれらの線維における完全な膜崩壊及び非特異的タンパク質分解の不在を示す。図１４Ｅは、走行車輪運動の１時間後の筋冷凍切除のジストロフィン対比染色を示す。図１４Ｆは、図１４Ｅと同じ切片におけるエバンスブルー色素蛍光を示す。図１４Ｇは、連続凍結切片の同じ領域のアリザリンレッドＳ染色を提供する。原倍率：図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｅ〜図１４Ｇ、１００Ｘ；図１４Ｃ及び図１４Ｄ、２００Ｘ。 図１５は、ジストロフィン関連タンパク質複合体グリコシラーゼ、リガンド、アクチニンスペクトリンスーパーファミリー、モータータンパク質及びタイチン−オブスリン（ｏｂｓｕｒｉｎ）スーパーファミリーの分析を提供する。この図に関するさらなる議論は、実施例３に見出すことができる。 図１６Ａ及び図１６Ｂは、ヒトβ２−スペクトリン（３ＥＤＶ、図１６Ａ）及びヒトプレクチン（５Ｊ１Ｇ）に由来する鋳型を使用した、ヒトユートロフィンの隣接する三重らせん反復のモデルを提供する。さらなる詳細は、実施例３に見出すことができる。 図１７は、マイクロユートロフィンの概要を提供する。このマイクロユートロフィンは、構造化されていない、プロリンに富むらせん間「ヒンジ−２」ドメイン（Ｈ２）を、全長ユートロフィンの最後の三重らせん反復２２番に対して並置する。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ２２は、全長ユートロフィンのＴＨ１、ＴＨ３、ＴＨ３及びＴＨ２２に対応する。さらなる詳細は、実施例３のセクションＦに見出すことができる。 図１８は、実施例３に記載されるような最適化されたマイクロユートロフィンの発現レベルを提供する。 図１９は、実施例３に記載されるように、ＧＲＭＤイヌにおける注射後６週間の筋細胞膜における野生型レベルのサルコグリカン発現の強固な用量依存性μユートロフィン発現及び安定化を示す。 図２０は、実施例２及び３で考察したように、注射したＧＲＭＤイヌにおけるμユートロフィン特異的Ｔ細胞応答を示す。注射後５週目及び８週目に収集した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＡＡＶ９カプシド（Ａ、Ｂ、及びＣ）に対応する合成ペプチドの３つのプール、並びにμユートロフィンペプチド配列全体にわたる合成ペプチドの５つのプール（Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ、Ｅ−Ｆ、Ｇ−Ｈ、Ｉ−Ｊ）と共に培養した。γインターフェロン産生は、１００万個のＰＢＭＣ当たりのスポット形成単位を計数することによって評価し、注射したイヌにおけるＡＡＶ９カプシド又はユートロフィン由来ペプチドプールに対するバックグラウンドを超える応答はなかった。右下、アデノウイルス−ＣＭＶ−ｌａｃＺ注射後の対照アッセイは、陽性結果の最も保守的な解釈（点線）に基づいて、Ｈａｄ５（１−４）及びｌａｃＺ（５−８）ペプチドプールの両方に対して陽性反応（星印）を示した。 図２１は、実施例３、セクションＧで考察したＡＡＶ−μ−Ｕ注射ｍｄｘマウスの荷重支持筋肉における７９ｋｄバンドを示す。レーン１、２、及び４：非荷重支持（例えば、屈筋）筋肉；３、５、及び７：荷重支持（例えば、伸筋）筋肉；６；肝臓；８ ＰＢＳ注射ｍｄｘ筋肉；９：分子量マーカー。 図２２は、マイクロユートロフィンのＮ末端部分として７９ｋｄ断片を同定する、ウェスタンブロッティング、免疫親和性精製、及びＬＣ／ＭＳ−ＭＳの組み合わせを示す。ボックスは、示されるように、欠失接合部のすぐ上流の「ヒンジ２」の一部である配列ＰＰＰＰＰを包含する。 図２３は、ＳＨ３ドメインが両側の隣接する三重らせんからの適合性アミノ酸側鎖との多重高親和性接触を作り、縦方向の力を伝達し、アンフォールディングに抵抗する可能性を有する配置を作ることを示す。 図２４Ａ〜図２４Ｃは、Ａｎｃ８０がこの状況においてＡＡＶ９のものと同等のマイクロユートロフィンの全体的な生体分布を達成し、実施例３において議論されるように、心筋及び骨格筋の強力な形質導入を伴うことを示す（図２４Ａ及び図２４Ｂの顕微鏡写真、並びに図２４Ｃのウェスタンブロットを参照されたい）。 図２５は、２．５×１０１２ｖｇ／マウスの等用量でのＡＡＶ９及びＡｎｃ８０の全身投与後のｍｄｘマウスのコホートにおけるμユートロフィンの生体分布についてのこれらのベクターの定性的比較を示す。各ベクターについて２匹のマウスからの複数の筋肉からの代表的なウェスタンブロットを示し、両ベクターによる横紋筋の広範かつ効率的な形質導入を実証する。最上部のバンドは、タンパク質のＮ末端に対応するエピトープを特異的に認識するポリクローナル抗体で標識されたμユートロフィンである。サンプル負荷対照は、タンパク質ビンクリンに対する抗体で標識された最下部のバンドである。表した横紋筋：横隔膜、三頭筋、四頭筋、腓腹筋、腹壁、胸筋、前脛骨筋、心臓。 図２６Ａ及び図２６Ｂは、ＡＡＶ９μユートロフィンがＭｕＲＦ−１（＋）、ＴＵＮＥＬ（＋）及び中心有核筋線維を、及びｍｄｘマウス筋肉において排除することを示す。図２６Ａにおいて、標識された画像は、新生仔としてＡＡＶ９μＵ又はＰＢＳのいずれかを注射された８週齢のｍｄｘマウスの代表である。ＭｕＲＦ−１とＴＵＮＥＬによる組織学的染色は、各々、活性タンパク質分解とアポトーシスのバイオマーカーとして機能する。図２６Ｂは、ｍｄｘ ＰＢＳ治療群、ｍｄｘ ＡＡＶ９−μユートロフィン治療群、及びｃ５７野生型ＰＢＳ治療群（ｎ＝３）における、中心有核筋線維、ＭｕＲＦ−１、ＴＵＮＥＬ、及び胚陽性筋線維の平均及び標準偏差を要約する表を提供する。ｍｄｘ筋線維における中心核形成は、ｍｄｘマウスが８週齢に達するにつれての、壊死の少なくとも１回の以前のエピソードと、その後に再生を示す。 図２７は、免疫介在性筋炎に対する証拠として、ＡＡＶ９−μユートロフィンに無作為化されたＧＲＭＤイヌの正常な成長を提供する。個々の体重のイヌを、免疫抑制なしのＡＡＶ９−ｃＵ（イヌμユートロフィン）の最高用量（１×１０１３．５ｖｇ／ｋｇ）に無作為化し、また関連対照は、ＰＢＳに無作為化された同腹仔、並びに他の同腹仔キャリアの雌並びに非同腹仔ＧＲＭＤの雄及び雌を含んでいた。比較のために、ＡＡＶ９−ｈＤ（ヒトμジストロフィン）を受ける関連体重の以前に報告されたＧＲＭＤ雌も含み、これは安楽死の直前に急速な体重減少を示し、剖検は、全身性筋炎の徴候を示した（Ｋｏｒｎｅｇａｙ， Ｊ．Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｍｕｓｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＡＡＶ９ ｈｕｍａｎ ｍｉｎｉ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｏｇｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２０１０． １８（８）： ｐ． １５０１−８）。 図２８は、インビボでのマイクロユートロフィン及びナノユートロフィンの安定性を比較する研究からのウェスタンブロットを示す。Ｍｄｘマウスに、マイクロユートロフィン又はナノユートロフィンのいずれかをコードするＡＡＶベクターを注射し、続いて筋肉組織中のタンパク質（７９ｋｄのＮ末端サブ断片を含む）を検出した。 図２９Ａ及び図２９Ｂは、全長ジストロフィンのＴＨ１及びＴＨ２０をスプライスすることによって形成される変異体ハイブリッドらせん反復の３−Ｄ表現の別の観点を示す。Ｂ逆平行らせんにおけるスプライスは、平行Ａ及びＣらせん上のＷ残基（黄色）を有する平面内に位置する。 図３０Ａ及び図３０Ｂは、全長ユートロフィンのＴＨ １及びＴＨ １８をスプライスすることによって形成される変異体ハイブリッドらせん反復の３−Ｄ表現の別の観点を示す。Ｂ逆平行らせんにおけるスプライスは、平行Ａ及びＣらせん上のＷ残基（黄色）を有する平面内に位置する。
ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質、それをコードする核酸配列、又はそのような核酸配列を含むベクターを介して、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を含む筋ジストロフィー（ＭＤ）、並びに他の関連疾患を治療するための組成物及び方法が提供される。
ジストロフィンとそのスーパー遺伝子ファミリーの異常な分子進化分析を行い、パラダイムシフトを導いた。本発明者らの分析は、ジストロフィンの主な役割が以前に理論化されたようなショックアブソーバーではなく、強力な、繋留性の、非伸長性の「支柱」様ロッドの役割であること；その長さは、その強度に対して二次的に重要であること；その強度がタンパク質の一次構造の８０％を占めるロッドドメイン全体にわたって、隣接する「三重らせん」、「スペクトリン様」反復間の境界でのアミノ酸の相互作用に依存すること；ジストロフィンは、その最も弱い連結と同程度にのみ強いこと；その進化がタンパク質を弱める内部欠失に対して選択されていることを示す。従って、タンパク質を弱めることなく、短縮するためには、ポリペプチドのコード配列を、最大配列保存の中心三重らせんドメインを横切って折り畳まれたタンパク質中で整列され得る複数の部位で切断することである（例えば、疎水性コア中の相互作用するトリプトファン残基を二分する二次元平面を横切るジストロフィン中）。これは、すべてのスペクトリン様三重らせん反復についての隠れマルコフモデルにおいて最も強い要素であり、ジストロフィン、ユートロフィン、及びスペクトロプラキン（ＭＡＣＦ、ジストニンなど）の反復のほとんどに適用される。
Ｉ． ジストロフィン、ユートロフィン及びその他
本明細書で使用されるように、ジストロフィンスーパーファミリータンパク質は、ジストロフィン、ユートロフィン、αアクチニン、αスペクトリン、βスペクトリン、又はスペクトリンファミリーの他のメンバー、プラキン、スペクトラキン（すなわち、スペクトロプラキン）など、３つのα−らせんからなり、タンパク質中の単一コピー又は複数の反復の縦列配置のいずれかとして生じる「スペクトリン様」及び「ロッド様」ドメインを含むタンパク質を指す。３−α−らせんドメインは、非らせんリンカーによって連結された２つの同様の（らせんＡ及びＣ）及び１つの反対の（らせんＢ）指向性α−らせんを含む。ドメインの疎水性コア中の多くの芳香族残基は、典型的には保存されている。例えば、Ｐａｒｒｙ ＤＡ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ−ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． １９９２ Ａｐｒ；６１（
４）：８５８−６７； 及びＤｊｉｎｏｖｉｃ−Ｃａｒｕｇｏ Ｋ ｅｔ ａｌ， Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ： ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ
ｆｏｒ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２００２ Ｆｅｂ ２０；５１３（１）：１１９−２３を参照されたい。このような反復の例は、図２Ａ〜２Ｅに見出すことができる。特定の態様では、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質は、健康な対照に存在し得るジストロフィンスーパーファミリータンパク質又はそのアイソフォームを指す。特定の態様では、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質は、当業者によってカノニカル配列と見なされるジストロフィンスーパーファミリータンパク質又はそのアイソフォームを指す。このようなカノニカル配列は、例えば、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇで利用可能である。
スペクトリンは、真核細胞の細胞膜の細胞内側を裏打ちする細胞骨格タンパク質である。スペクトリンは、五角形又は六角形の配置を形成し、足場を形成し、細胞膜の完全性及び細胞骨格構造の維持において重要な役割を果たす。例えば、Ｈｕｈ ＧＹ ｅｔ ａｌ， Ｃａｌｐａｉｎ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｌｐｈａ ＩＩ−ｓｐｅｃｔｒｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ． ２００１ Ｄｅｃ ４；３１６（１）：４１−４を参照されたい。このスーパーファミリーのタンパク質は、（１）Ｎ末端アクチン結合ドメイン、（２）αらせんスペクトリン反復の断面の２つの特徴によって定義できる。例えば、Ｒｏｅｐｅｒ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ‘ｓｐｅｃｔｒａｐｌａｋｉｎｓ’： ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｇｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｓｐｅｃｔｒｉｎ ａｎｄ ｐｌａｋｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００２ Ｎｏｖ １５；１１５（Ｐｔ ２２）：４２１５−２５を参照されたい。スペクトリンスーパーファミリーのメンバーは、αアクチニン（例えば、αアクチン−１、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｐ１２８１４及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＡＣＴＮ１を参照されたい；αアクチン−２、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｐ３５６０９及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＡＣＴＮ２を参照されたい；αアクチン−３、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｑ０８０４３ ａｎｄ ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＡＣＴＮ３を参照されたい；並びにαアクチン−４、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｏ４３７０７及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＡＣＴＮ４を参照されたい）、αスペクトリン（例えば、スペクトリンα鎖、赤血球１、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｐ０２５４９ ａｎｄ ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＳＰＴＡ１を参照されたい；βスペクトリン（例えば、スペクトリンβ鎖、赤血球、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｐ１１２７７ 及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＳＰＴＢを参照されたい；並びにスペクトリンβ鎖、非赤血球１、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｑ０１０８２ 及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＳＰＴＢＮ１を参照されたい、これらの各々は、全体が本明細書に組み込まれる）、ジストロフィン及びユートロフィンを含むが、これらに限定されない。
プラキンは、細胞骨格要素及び接合部複合体と結合するサイトリンカータンパク質である。例えば、Ｌｅｕｎｇ Ｃｌ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｋｉｎｓ： ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｙｔｏｌｉｎｋｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｔｒｅｎｄｓ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００２ Ｊａｎ；１２（１）：３７−４５を参照されたい。７つのプラキンファミリーメンバが同定されている：デスモプラキン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｐ１５９２４及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａ
ｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＤＳＰ、これは、本明細書に列挙されている配列を含め、全体が本明細書に含まれる）、プレクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｐ１５９２４ 及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＰＬＥＣ、これは、本明細書に列挙されている配列を含め、全体が本明細書に含まれる）、 水疱性類天疱瘡抗原１ （ＢＰＡＧ１， Ｄｙｓｔｏｎｉｎ） （ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｑ０３００１ 及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＤＳＴ、これは、本明細書に列挙されている配列を含め、全体が本明細書に含まれる） 、微小管−アクチン架橋因子（ＭＡＣＦ）
（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｑ９ＵＰＮ３ 及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＭＡＣＦ１、これは、本明細書に列挙されている配列を含め、全体が本明細書に含まれる） 、エンボプラキン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｑ９２８１７ 及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＥＶＰＬ、これは、本明細書に列挙されている配列を含め、全体が本明細書に含まれる） 、ペリプラキン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｏ６０４３７ 及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＰＰＬ、これは、本明細書に列挙されている配列を含め、全体が本明細書に含まれる） 及びエピプラキン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ − Ｐ５８１０７ 及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＥＰＰＫ１これは、本明細書に列挙されている配列を含め、全体が本明細書に含まれる）。このタンパク質のファミリー質は、プラキンドメイン及び／又はプラキン反復ドメイン（ＰＲＤ）の存在によって定義される。これら２つのドメインに加えて、プラキンは、いくつかのメンバーに共通であるがすべてではない他のドメイン、すなわちアクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）、コイルドコイルロッド、スペクトリン反復含有ロッド及び微小管結合ドメインを有する。
スペクトラプラキンは、スペクトリンスーパーファミリーとプラキンスーパーファミリーの両方に属し、例外的に長い細胞内タンパク質で、アクチン、微小管、中間径フィラメントの３つの細胞骨格要素すべてに結合するまれな能力を有する。スペクトラプラキンは、組織の完全性及び機能にとって非常に重要であり、単一の細胞骨格要素で操作し、これらの要素を調整する。例えば、上記で引用したＲｏｅｐｅｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．、及びＨｕｅｌｓｍａｎｎ Ｓ ｅｔ ａｌ， Ｓｐｅｃｔｒａｐｌａｋｉｎｓ． Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． ２０１４ Ａｐｒ １４；２４（８）：Ｒ３０７−８． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｕｂ．２０１４．０２．００３を参照されたい。スペクトルプラキンのメンバーは、上述したＢＰＡＧ１及びＭＡＣＦを含むがこれらに限定されない。ジストロフィンは、Ｆアクチンを介して細胞外マトリックスを細胞骨格に固定し、ジストログリカンのリガンドである。ジストロフィン関連糖タンパク質複合体の構成要素は、神経筋接合部（ＮＭＪ）及び末梢、中枢神経系の様々なシナプスに蓄積し、筋細胞膜を安定化させる構造的機能を有する。また、シグナル伝達イベント及びシナプス伝達にも関与している。例えば、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ１１５３２ 及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＤＭＤ＆ｋｅｙｗｏｒｄｓ＝ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎを参照されたい。ジストロフィンには、１０種類のアイソフォームがある。アイソフォーム４は、カノニカル配列とみなされ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ１１５３２−１を有するアミノ酸配列を有し、これは本明細書に組み込まれる。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ１１５３２−２を有するアイソフォーム１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１１５３２−３識別子を有するアイソフォーム２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ１１５３２−４を有するアイソフォーム３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ１１５３２−５を有するアイソフォーム５、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ１１５３２−６を有するアイソフォーム６、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ１１５３２−７を有するアイソフォーム７、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ１１５３２−８を有するアイソフォーム８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ１１５３２−９を有するアイソフォーム９
、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ１１５３２−１０を有するアイソフォーム１０を含む他のアイソフォーム、アイソフォームの各々の配列は、本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される「全長ジストロフィン」という用語は、いずれかのジストロフィンアイソフォームを指す場合がある。特定の態様では、「全長ジストロフィン」という用語は、アイソフォーム４（Ｄｐ４２７）を指す。ジストロフィンのホモログは、マウス（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１１５３１）、ラット（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１１５３０）、及びイヌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ９７５９２）を含む種々の生物において同定されている。Ｄｐ４２７又はジストロフィンのいずれかの他のアイソフォーム若しくはホモログをコードする可能な核酸配列は、公開されている。例えば、ＮＣＢＩ参照配列： ＮＭ＿０００１０９．３、 ＮＭ＿００４００６．２、 ＮＭ＿００４００９．３、 ＮＭ＿００４０１０．３、 ＮＭ＿００４０１１．３、 ＮＭ＿００４０１２．３、ＮＭ＿００４０１３．２、ＮＭ＿００４０１４．２、ＮＭ＿００４０１５．２、ＮＭ＿００４０１６．，２ ＮＭ＿００４０１７．２、ＮＭ＿００４０１８．２、ＮＭ＿００４０１９．２、ＮＭ＿００４０２０．３、ＮＭ＿００４０２１．２、ＮＭ＿００４０２２．２、ＮＭ＿００４０２３．２、ＮＭ＿００４００７．２、ＸＭ＿００６７２４４６８．２、ＸＭ＿００６７２４４６９．３、ＸＭ＿００６７２４４７０．３、ＸＭ＿００６７２４４７３．２、ＸＭ＿００６７２４４７４．３、ＸＭ＿００６７２４４７５．２、ＸＭ＿０１１５４５４６７．１、ＸＭ＿０１１５４５４６８．２、ＸＭ＿０１１５４５４６９．１、ＸＭ＿０１７０２９３２８．１、ＸＭ＿０１７０２９３２９．１、ＸＭ＿０１７０２９３３０．１ 及びＸＭ＿０１７０２９３３１．１（これらの各々は、本明細書に組み込まれる）を参照されたい。Ｄｐ４２７又はジストロフィンの他のアイソフォーム若しくはホモログをコードする追加の配列は、例えばｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｔｒａｎｓｅｑ／、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｓｉｘｐａｃｋ／、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ／及びｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎａｍｂｉｇ／のような逆翻訳のためのツールを介して生成され得る。さらに、コード配列は、対象、例えばヒト、マウス、ラット又はイヌにおける発現のためにコドン最適化され得る。
Ｄｐ４２７は、３６８５アミノ酸長である。また、例えば、ＵＳ７８９２８２４Ｂ２、及びジェンバンク：ＡＡＡ５３１８９．１を参照されたい。Ｄｐ４２７のＮ末端２４０アミノ酸は、細胞骨格アクチンフィラメントへの高親和性結合能を有する２つのカルポニン相同ドメイン（ＣＨ１＆２）に折り畳まれる。約３４０〜３０４０番目のアミノ酸からなる中央領域は、隠れマルコフモデリングによって三重らせん（ＴＨ１〜２４）として同定可能な２４の縦列に連結したドメインから構成されており、ロッド様タンパク質のスペクトリン及びαアクチニンの結晶化反復に対して測定可能な構造相同性を有する。３０５７〜３３５２の領域は、β−ジストログリカンを中心とするタンパク質の膜貫通複合体に対して高い親和性を有するモジュール状の多ドメイン球状領域（ＷＷ−ＥＦ−ＺＺ）を包含する。３３５３〜３６８５の極端なＣ末端領域は、タンパク質ジストロブレビン及びシントロフィンに対する一見消耗される高親和性結合ドメインを有する。Ｄｐ４２７は、横紋筋細胞の皮質でロッド様タンパク質としてモデル化され、Ｎ末端カルポニン相同ドメインにより細胞骨格Ｆ−アクチンの最外縁に結合し、Ｃ末端ＷＷ−ＥＦ−ＺＺドメインによりＤＧＣの膜貫通メンバーに結合している。中央のロッドドメインは、三重らせん反復ヒンジ１〜４と低レベルの相同性を有する２４ドメインから構成される。スペクトリン様反復の内部欠失は、対立遺伝子疾患ベッカー型ＭＤ（ＢＭＤ）において、疾患進行のより遅い速度と一般的に関連している。ＤＭＤの遺伝子治療の中心的課題は、骨格筋細胞と心筋細胞の大部分でＤｐ４２７を安全に、効果的に、持続的に置換することである。理想的には、この置換はＤｐ４２７の機能性と一致し；４２７ｋｄより実質的に小さいタンパク質がＤＭＤを重篤なＢＭＤ表現型に単に変換し得るという懸念がある。Ｄｐ４２７の説明は、図１Ａに見ることができる。隠れマルコフモデリングは、従来の方法を介して実行するこ
とができ、そのパラメーターは、当業者によって調整される場合がある。例えば、ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｈｉｄｄｅｎ＿Ｍａｒｋｏｖ＿ｍｏｄｅｌを参照されたい。１９〜２０の連続したＴＨドメインと３３５３〜３６８５の領域の欠失は、これらの組換えタンパク質の合成コード配列がＡＡＶベクターのクローニング能力の範囲内にあるという意味で、「ＡＡＶサイズの」小型化ジストロフィンを産生する。このような組換えタンパク質はすべて、Ｄｐ４２７のロッドの長さの１／５〜１／６のロッド様ドメインを共有しており、この短縮は、組換えタンパク質が２４反復全長タンパク質と同程度の「衝撃」を「吸収」する能力を損なうことを懸念している。
ユートロフィンは、ジストロフィンと実質的に相同であり、ロッドドメインで有意な相違が生じ、ここで、ユートロフィンは、反復１５及び１９並びに２つのヒンジ領域を欠く（例えば、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３９：５５ ［１９８９］； Ｗｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ３６９：２７ ［１９９５］； ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ４６９３９；及びｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＵＴＲＮ＆ｋｅｙｗｏｒｄｓ＝Ｕｔｒｏｐｈｉｎを参照されたい）。ユートロフィンの４つのアイソフォームが発見された。アイソフォーム１は、カノニカル配列とみなされ、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ４６９３９−１を有するアミノ酸配列を有し、これは本明細書に組み込まれる。他のアイソフォームは、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ４６９３９−２を有するアイソフォーム２；ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ４６９３９−３を有するアイソフォームＵｐ７１；及びＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ４６９３９−４を有するアイソフォームＵｐ１４０を含む。全長ユートロフィンは、あらゆるユートロフィンアイソフォームを指す場合がある。特定の態様では、全長ユートロフィンは、２２のスペクトリン様反復（ＳＲ１〜ＳＲ２２、又はＴＨ１〜ＴＨ２２）及び２つのヒンジ領域を含む、ユートロフィンアイソフォーム１を指す。ユートロフィンのホモログは、マウス（ジェンバンク受入番号Ｙ１２２２９及びＵｎｉＰｒｏｔ Ｅ９Ｑ６Ｒ７）、ラット（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＪ００２９６７及びＵｎｉＰｒｏｔ Ｇ３Ｖ７Ｌ１）、及びイヌ（ジェンバンク受入番号ＮＷ−１３９８３６）を含む種々の生物において同定されている。これら又は追加のホモログの核酸配列は、いずれかの適切な方法を用いてヒトユートロフィンの核酸配列と比較することができる。ユートロフィンアイソフォーム１又はいずれかの他のアイソフォーム又はいずれかのホモログをコードする核酸配列が利用可能である。例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００７１２４．２、ＸＭ＿００５２６７１２７．４、ＸＭ＿００５２６７１３０．２、ＸＭ＿００５２６７１３３．２、ＸＭ＿００６７１５５６０．３、ＸＭ＿０１１５３６１０１．２、ＸＭ＿０１１５３６１０２．２、ＸＭ＿０１１５３６１０６．２、ＸＭ＿０１１５３６１０７．２、ＸＭ＿０１１５３６１０９．２、ＸＭ＿０１７０１１２４３．１、ＸＭ＿０１７０１１２４４．１、ＸＭ＿０１７０１１２４５．１；ジェンバンク受入番号Ｘ６９０８６及びジェンバンク受入番号ＡＬ３５７１４９（これらの各々は、本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ユートロフィンアイソフォーム１又はいずれかの他のアイソフォーム又はいずれかの他のホモログをコードするさらなる配列は、逆翻訳のためのツール、例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｔｒａｎｓｅｑ／、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｓｉｘｐａｃｋ／、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ／、及びｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎａｍｂｉｇ／を介して生成され得る。さらに、コード配列は、対象、例えばヒト、マウス、ラット又はイヌにおける発現のために最適化されたコドンであり得る。
一局面において、本明細書に提供されるのは、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質である。一態様では、三重スプライス変異体タンパク質は、複数のらせん反復の内部欠失、及び全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質の
らせん反復の部分を連結することによって形成されるハイブリッドらせんドメインを含む。特定の態様では、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質は、らせんＡ’のＣ末端部分に融合されたらせんＡのＮ末端部分を有する第１のらせんと、らせんＢのＣ末端部分に融合されたらせんＢ’のＮ末端部分を含む第２のらせんと、らせんＣ’のＣ末端部分に融合されたらせんＣのＮ末端部分を含む第３のらせんとを有し、らせんＡ、Ｂ、及びＣは、第１の三重らせん反復に存在し、らせんＡ’、Ｂ’、及びＣ’は、天然ジストロフィンスーパーファミリータンパク質の第２の三重らせんドメインに存在する。特定の態様において、第１及び第２の三重らせんドメインは、非隣接であり、したがって、ハイブリッド三重らせんドメイン及び天然ジストロフィンスーパーファミリータンパク質に存在する１つ以上の三重らせんドメインの欠失を有する変異体ジストロフィンスーパーファミリータンパク質を提供する。したがって、三重スプライス変異体タンパク質中のらせん反復の総数は、３から、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質のらせん反復数より１小さいいずれかの整数、例えば、４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３から選択される。特定の態様において、本明細書に提供されるのは、全長ジストロフィンにおける少なくともらせん反復３〜らせん反復２１に欠失を有する変異体ジストロフィンタンパク質である。さらに別の態様では、変異体タンパク質は、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復３〜２３に欠失を有する。なおさらなる態様において、変異体タンパク質は、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復２〜らせん反復１９に欠失を有する。特定の態様では、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復３〜らせん反復１０に欠失を有する変異体ユートロフィンタンパク質が提供される。さらなる態様において、変異体ユートロフィンは、全長ユートロフィンの少なくともらせん反復２〜らせん反復１７に欠失を有する。
本明細書で使用される場合、用語「三重らせんドメイン」、「三重らせんドメイン」、「三重らせん反復」、「三重らせん反復」、及び「ＴＨ」は、交換可能であり、非らせんリンカーによって連結された３つのαらせん（すなわち、２つの同様の（らせんＡ及びＣ）及び１つの反対の（らせんＢ）指向性αらせん）からなるジストロフィンスーパーファミリータンパク質のロッド様反復及びスペクトリン様反復を指す。これらの反復は、隠れマルコフモデリングによって同定することができる。このような反復の例は、図２Ａ〜図２Ｅに見出すことができる。ハイブリッド三重らせん反復は、らせん反復をその長軸に垂直に二分する平面上でスプライスされた２つのらせん反復によって形成される。このような平面は、以下にさらに説明され、実施例及び図２Ｆに例示される。このようなハイブリッド三重らせん反復を形成する例示は、図１Ｃ及び図１Ｄに提示されるハイブリッド三重らせんドメイン（また、本明細書においてハイブリッド三重らせん反復として言及される）の例示と共に、図１に提供される。本明細書で使用される場合、「スプライス接合部」とは、核酸配列、アミノ酸配列、又は二次、三次若しくは四次構造を有するタンパク質における位置を示し、ここで、内部欠失は、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質において、又はハイブリッド三重らせんドメインを形成する２つの三重らせん反復のいずれかにおいて開始又は終結する；又はその配列の対応する配列が全長タンパク質において互いに直接隣接していないが、ハイブリッド三重らせんドメイン又はジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質において接合される。用語「直接隣接する」とは、２つの配列、ドメイン又は反復が各々、いずれかの他の配列、ドメイン又は反復によって分離されていないことを意味する。用語「接合」、「再接合」、又はそれらのいずれかの文法的バリエーションは、２つの配列、ドメイン又は反復が直接隣接することを示す。用語「形態」又はそのいずれかの文法的バリエーションは、スプライシング又は接合配列を指す。配列又は配列中の位置の対応は、配列アラインメント又は隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）によって決定される場合がある。
本明細書で使用される場合、「Ｎ末端部分」は、選択されたらせんについてのスプライ
ス接合部のアミノ末端側のアミノ酸配列を指す。特定の態様において、選択されたらせんの「Ｎ末端部分」は、スプライス接合部の（Ｎ末端側の）前の最初のＭｅｔから最後のアミノ酸配列までの全長アミノ酸配列を指す。特定の態様では、Ｎ末端部分にアミノ酸置換、欠失、切断及び／又は挿入がある場合がある。特定の態様において、このような置換は、保存的アミノ酸変化である。特定の態様では、欠失、切断又は挿入は、らせんの折り畳みに影響を及ぼさない１〜５アミノ酸長である。
「Ｃ末端部分」という用語は、選択されたらせんについてのスプライス接合部のカルボキシ末端側のアミノ酸配列を指す。特定の態様では、選択されたらせんの「Ｃ末端部分」は、スプライス接合部の（Ｃ末端側の）後の最初のアミノ酸配列からの全長アミノ酸配列を指す。特定の態様では、Ｎ末端部分にアミノ酸置換、欠失、切断及び／又は挿入がある場合がある。特定の態様において、このような置換は、保存的アミノ酸変化である。特定の態様では、欠失、切断又は挿入は、らせんの折り畳みに影響を及ぼさない１〜５アミノ酸長である。
例えば、特定の態様において、三重変異体ハイブリッドらせんドメインは、隣接しないらせんドメインのセグメントを連結することによって形成される３つのスプライスらせんを有し、ここで、各らせんは、天然のジストロフィンスーパーファミリータンパク質のらせん反復におけるらせんのＮ末端部分及びＣ末端部分を含む。変異体接合体を形成するために結合している三重らせんドメインは、各々平行Ａ及びＣへリックスと逆平行Ｂへリックスを有するので、三重らせん変異体のＡ及びＣへリックスのＮ末端部分は、天然のジストロフィンスーパーファミリータンパク質の同じ三重らせん反復からのものである一方、これらのへリックスのＣ末端部分は、天然のジストロフィンスーパーファミリータンパク質の別の三重らせん反復からのものである。三重らせん変異体ドメインを形成するための接合部の配置の結果として、Ｎ末端部分及びＣ末端部分は、様々な長さである場合があるが、一緒になって変異体三重らせんドメインのらせんを形成する。
用語「第１の」、「第２の」、「第３の」、「第４の」、又は「追加の」などの序数は、本明細書全体を通して、組成物及び方法の様々な形態及び構成要素を区別するための参照用語として使用される。特に明記しない限り、ＴＨ、アミノ酸配列、又は核酸配列を示すために序数を使用する場合、そのような数は、アミノ酸配列又はタンパク質においてＮ末端からＣ末端まで、又は核酸配列において５’から３’までカウントされる。
本明細書で使用される場合、タンパク質反復、それに続く数字は、特に明記されない限り、Ｎ末端から数えた参照タンパク質又は参照アミノ酸配列中のすべての反復中の反復数を指す。例えば、三重らせんドメイン２は、図１Ａに示すＴＨ２を指す。反復及び参照配列がポリヌクレオチドである場合、反復の数は、特に明記しない限り、５’末端から３’末端までカウントされる。
特定の態様では、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質は、Ｎ末端らせん反復、ハイブリッド三重らせん反復、及びＣ末端らせん反復を含む。特定の態様では、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質は、ハイブリッド三重らせん反復及びＣ末端らせん反復を含む。三重スプライス変異体タンパク質中のらせん反復の総数は、３から、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質のらせん反復数より１小さいいずれかの整数、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、及び２３から選択される。特定の態様では、変異体タンパク質中のＮ末端らせん反復に対応する、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質中の配列は、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復の最初に対応する配列に直接隣接する。特定の態様では、変異体タンパク質中のＣ末端らせん反復に対応する全長ジストロフィンスーパーファ
ミリータンパク質中の配列は、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復のうちの第２のらせん反復に対応する配列に直接隣接する。さらなる態様において、Ｎ末端らせん反復は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ４、ＴＨ５、ＴＨ６、ＴＨ７、ＴＨ８、ＴＨ９、ＴＨ１０、ＴＨ１１、ＴＨ１２、ＴＨ１３、ＴＨ１４、ＴＨ１５、ＴＨ１６、ＴＨ１７、ＴＨ１８、及びＴＨ１９を含む場合がある。なおさらなる態様において、Ｃ末端らせん反復は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ４、ＴＨ５、ＴＨ６、ＴＨ７、ＴＨ８、ＴＨ９、ＴＨ１０、ＴＨ１１、ＴＨ１２、ＴＨ１３、ＴＨ１４、ＴＨ１５、ＴＨ１６、ＴＨ１７、ＴＨ１８、及びＴＨ１９を含む場合があり、その各々のＴＨ番号は、Ｃ末端から数えられる。さらに、らせん反復がらせんドメイン１と、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質の最後のらせんドメインとによって形成される、変異体タンパク質における唯一のらせん反復が存在し得る。さらに、変異体タンパク質中に２つのらせん反復が存在し得る。このような２−ＴＨ変異体タンパク質は、全長タンパク質のらせん反復１と、らせん反復２及び全長タンパク質の最後のらせん反復によって形成される１つのハイブリッド三重らせんドメインとを含む場合がある。別の態様では、２つのＴＨ変異体タンパク質は、全長タンパク質中の最後のらせん反復と、らせん反復１及び全長タンパク質の最後のらせん反復から２番目のものによって形成される１つのハイブリッド三重らせんドメインとびを含む場合がある。本明細書で使用される場合、用語「ジストロフィスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質」、「三重スプライス変異体タンパク質」及び「変異体タンパク質」は、交換可能に使用される。また、ハイブリッド三重らせん反復のスプライス接合部を除いて、変異体タンパク質中の反復及び配列は、それらが全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質中にある場合と同じ反復及び配列に各々直接隣接している。
特定の態様では、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質は、Ｃ末端において、例えば１〜５００のいずれかの整数のアミノ酸が切断され得る。このような切断は、いかなる三重らせん反復も含まない。特定の態様では、このような切断は、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質のエキソンの始まり又は終わりに対応する位置で起こる場合がある。
ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列もまた、本明細書に提供される。このようなコード配列は、逆翻訳のためのツールを介して生成される場合がある。さらに、コード配列は、対象、例えばヒト、マウス、ラット又はイヌにおける発現のために最適化されたコドンであり得る。
一態様において、ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質は、三重スプライス変異体ジストロフィンである。さらなる態様において、三重スプライス変異体ジストロフィンは、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復３〜らせん反復２１における欠失を含む。別の態様では、三重スプライス変異体ジストロフィンは、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復３〜らせん反復２３における欠失を含む。さらに別の態様では、変異体ジストロフィンのＮ末端らせん反復は、全長ジストロフィンのらせん反復１を含む場合がある。変異体タンパク質のＣ末端らせん反復は、全長ジストロフィンのらせん反復２３とらせん反復２４を含む場合がある。さらなる態様において、変異体タンパク質のＮ末端らせん反復は、全長ジストロフィンのらせん反復１からなる場合がある。変異体タンパク質のＣ末端らせん反復は、全長ジストロフィンのらせん反復２３とらせん反復２４からなる場合がある。ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復のうち最初のものは、全長ジストロフィンのらせん反復２である。ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復のうちの２つ目は、全長ジストロフィンのらせん反復２２である。さらに別の態様において、三重スプライス変異体ジストロフィンは、全長ジストロフィンタンパク質の少なくともらせん反復２〜らせん反復１９における欠失を含む。Ｃ末端らせん反復は、全長ジストロフィンのらせん反復２１、２２、２３、及び２４を含む。ハイ
ブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復のうち最初のものは、全長ジストロフィンのらせん反復１であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復のうちの２つ目は、全長ジストロフィンのらせん反復１９である。特定の態様において、三重スプライス変異体ジストロフィンは、Ｎ末端にジストロフィンアイソフォーム４の約１〜約ａａ３３８のアミノ酸（ａａ）をさらに含む場合がある。特定の態様において、三重スプライス変異体ジストロフィンは、Ｃ末端に、約ａａ３０４１〜約ａａ３３５２、約ａａ３０４１〜約ａａ３０５４、約ａａ３０４１〜約ａａ３０５６、約ａａ３０４１〜約ａａ３０５７、約ａａ３０４１〜約ａａ３０８８、約ａａ３０４１〜約ａａ３４０８、又は約ａａ３０４１〜約ａａ３６８５のジストロフィンアイソフォーム４をさらに含む場合がある。特定の態様において、三重スプライス変異体ジストロフィンのこれらのＣ末端非ＴＨ配列のさらなる切断が存在する場合がある。本明細書で使用される場合、切断とは、Ｃ末端から始まる連続するアミノ酸の欠失を指す。特定の態様では、このような切断は、全長ジストロフィンのエキソンの始まり又は終わりに対応する位置で起こる場合がある。特定の態様において、切断は、長さが１、２、３、４、５、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約４００、約５００、又は約６００ａａである場合がある。三重スプライス変異体ジストロフィンをコードする核酸配列もまた、本明細書に提供される。そのようなコード配列は、逆翻訳のためのツールを介して生成される場合がある。さらに、コード配列は、対象、例えばヒト、マウス、ラット又はイヌにおける発現のために最適化されたコドンであり得る。
一態様では、三重変異体ジストロフィンは、配列番号１のアミノ酸配列を有するナノジストロフィン（ｎ−ジストロフィンとも呼ばれる）である。なおさらなる態様において、配列番号２の核酸配列を有する三重スプライス変異体ジストロフィンをコードする配列が提供される。一態様において、配列番号１をコードする核酸配列は、対象における発現のためにコドン最適化される。さらなる態様において、配列番号１をコードする核酸配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。コドン最適化のための従来のツールは、当業者に公に又は商業的に利用可能である。例えば、Ｆｕｇｌｓａｎｇ Ａ （Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ： ａ ｆｒｅｅｗａｒｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ２００３ Ｏｃｔ；３１（２）：２４７−９，） ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｃｏｄｏｎ−ｏｐｔ．ｈｔｍｌ， ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅａｒｔ−ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅｏｐｔｉｍｉｚｅｒ．ｈｔｍｌ， ａｎｄ ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔを参照されたい。
さらに別の態様では、三重変異体ジストロフィンは、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のアミノ酸配列を有するナノジストロフィンである。なおさらなる態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のアミノ酸配列を有する三重スプライス変異体ジストロフィンをコードする核酸配列である。特定の態様において、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、又は１８をコードする核酸配列は、対象における発現のためにコドン最適化される。さらなる態様において、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、又は１８をコードする核酸配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。
さらに別の態様では、三重変異体ジストロフィンは、配列番号２２のアミノ酸配列を有するナノジストロフィンである。
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト、獣医又は家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）動物、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）はペット、及び臨床研究に通常
使用される動物を含む、雄又は雌の哺乳動物を意味する。一態様では、これらの方法及び組成物の対象は、ヒトである。一態様では、これらの方法及び組成物の対象は、出生前、新生仔、乳児、幼児、就学前、小学生、十代の若者、若年成人又は成人である。「新生仔のヒト」は、０〜１２ヵ月、ヒトの幼児は１〜３歳、就学前のヒトは３〜５歳、ヒトの小学生は５〜１２歳、ヒトの十代の若者は１２〜１８歳、ヒトの若年成人は１８〜２１歳、ヒトの成人は１８歳を超えるヒトを指す。「健康な対象」は、疾患のない対象を指す。本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、ＤＭＤ及び／又はＢＭＤを指す場合がある。特定の態様では、「疾患」という用語は、異常なジストロフィンスーパーファミリータンパク質によって引き起こされる別の疾患を指す場合がある。特定の態様では、「疾患」は、ウィルブランド病を指す。
一態様では、ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質は、３重スプライス変異体ユートロフィンであり、全長ユートロフィンの少なくともらせん反復３及びらせん反復１９における欠失を含む。一態様では、変異体タンパク質のＮ末端らせん反復は、全長ユートロフィンのらせん反復１を含む。変異体タンパク質のＣ末端らせん反復は、全長ユートロフィンのらせん反復２１及びらせん反復２２を含む。さらなる態様では、変異体タンパク質のＮ末端らせん反復は、全長ユートロフィンのらせん反復１からなる。変異体タンパク質のＣ末端らせん反復は、全長ユートロフィンのらせん反復２１及びらせん反復２２からなる。ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復の１つ目は、全長ユートロフィンにおけるらせん反復２である。ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復のうちの２つ目は、全長ユートロフィンにおけるらせん反復２０である。さらに別の態様では、ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質は、３重スプライス変異体ユートロフィンであり、全長ユートロフィンの少なくともらせん反復２〜らせん反復１７における欠失を含む。変異体タンパク質のＣ末端らせん反復は、全長ユートロフィン中のらせん反復１９、２０、２１、及び２２を含む。ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復のうちの１つ目は、全長ユートロフィン中のらせん反復１であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つのらせん反復のうちの２つ目は、全長ユートロフィン中のらせん反復１８である。特定の態様において、三重スプライス変異体ユートロフィンは、Ｎ末端に約ａａ１〜約ａａ ３１１のユートロフィンアイソフォーム１をさらに含む場合がある。特定の態様では、三重スプライス変異体ユートロフィンは、Ｃ末端に、約ａａ２７９７〜約２８１１、約ａａ２７９７〜約２８４５、約ａａ２７９７〜約３１２４、約ａａ２７９７〜約３１３４、約ａａ２７９７〜約３１６５、約ａａ２７９７〜約３１６８、又は約ａａ２７９７〜約３４３３のユートロフィンアイソフォーム１をさらに含む場合がある。特定の態様では、三重スプライス変異体ユートロフィンのＣ末端非ＴＨ配列のさらなる切断が存在する場合がある。特定の態様では、このような切断は、全長ユートロフィンのエキソンの開始又は終了に対応する位置で起こる場合がある。特定の態様において、切断は、長さが１、２、３、４、５、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約４００、約５００、又は約６００ ａａである場合がある。三重スプライス変異体ユートロフィンをコードする核酸配列もまた、本明細書に提供される。このようなコード配列は、逆翻訳のためのツールを介して生成される場合がある。さらに、コード配列は、対象、例えばヒト、マウス、ラット又はイヌにおける発現のために最適化されたコドンであり得る。
一態様では、三重変異体ユートロフィンは、配列番号３のアミノ酸配列を含むナノユートロフィン（ｎ−ユートロフィンとも呼ばれる、又はダッシュマークを付けて又は付けずにｎ−Ｕ）である。さらなる態様では、三重スプライス変異体ユートロフィンをコードし、配列番号４の核酸配列を含む配列が本明細書に提供される。特定の態様では、三重変異体ユートロフィンは、配列番号５のアミノ酸配列を有するナノユートロフィン（ｎ−ユートロフィンとも呼ばれる、又はダッシュマークを付けて又は付けずにｎ−Ｕ）である。さ
らなる態様では、配列番号５をコードし、配列番号６の核酸配列、又は配列番号６と約９５％〜約９９％同一の核酸配列を有する配列が本明細書に提供される。特定の態様では、三重変異体ユートロフィンは、配列番号７のアミノ酸配列を有するナノユートロフィンである。さらなる態様では、配列番号７をコードし、配列番号８の核酸配列又は配列番号８と約９５％〜約９９％同一の核酸配列を有する配列が本明細書に提供される。一態様では、配列番号３、５、又は７をコードする核酸配列は、対象における発現のためにコドン最適化される。特定の態様では、三重変異体ユートロフィンは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するナノユートロフィンである。さらなる態様では、配列番号２０をコードし、配列番号１９の核酸配列又は配列番号１９と約９５％〜約９９％同一の核酸配列を有する配列が本明細書に提供される。一態様では、配列番号３、５、７、又は２０をコードする核酸配列は、対象における発現のためにコドン最適化される。さらなる態様において、配列番号３、５、７、又は２０をコードする核酸配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。さらに別の態様では、三重変異体ユートロフィンは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むナノユートロフィンである。
特定の態様では、本開示は、「三重スプライシング」を特徴とするヒトナノユートロフィン及びヒトナノジストロフィンの両方についてのアミノ酸及びすべてのコードする合成核酸配列を含む。特定の態様では、ハイブリッド三重らせんは、三重らせん反復２の中央と最後から３番目の三重らせん反復ドメインの中央とを連結する場合があり（ユートロフィンでは、２２の＃２０、ジストロフィンでは、２４の＃２２）、本明細書に記載され、配列番号１及び３の特徴として示される組換えタンパク質の両方に合計４つの反復ドメインを与える。これらのアミノ酸配列は、単一のＡＡＶベクターゲノムのコード能力内にコードされ得る最大の強度の組換えタンパク質を規定する。図４並びに実施例２及び３を参照されたい。
ジストロフィンのメカノバイオロジーについては、ほとんど知られていなかったが、タンパク質の生理学的役割に関する間接的な研究から、タンパク質のロッドドメインは、筋収縮時に縦方向に負荷される場合があることが示唆されている。本明細書に提示される例は、このことについての最初の直接的な証拠を提供する。マイクロユートロフィンを発現する若齢及び骨格成熟ｍｄｘ（ジストロフィンヌル）マウス間の比較では、組換えタンパク質のＮ末端に対する抗体を用いたウェスタンブロット分析により、筋成熟のプロセス及びミオシンアイソフォームスイッチが筋膜を横切る機械的負荷を増加させるにつれて、単一スプライス接合部の位置におけるロッドの破壊の証拠が明らかにされている。これは、ロッドドメインの強度が単一スプライス接合部の正確な位置で損なわれるという仮説を強く支持する。ナノユートロフィン及びナノジストフィン（ｎａｎｏ−ｄｙｓｔｏｐｈｉｎ）の開発の基礎をなす設計原理は、ロッドの不適合なサブドメインの並置を排除することによって、この以前の欠点を補う。
Ａ．らせんにおけるスプライス接合部
ハイブリッド三重らせん反復は、図１Ａ〜図１Ｄ及び図２Ｆに示すように、らせん反復をその長軸に垂直に二分する平面上でスプライスされた２つのらせん反復によって形成される。逆平行「Ｂ」らせんにおけるスプライス接合部の選択は、間接的な手段によって導かれる。ジストロフィン三重らせんの単一反復、ＴＨ１については、Ｘ線結晶構造が１つしか決定されていない（すなわち、ＴＨ２〜２４の構造については、決定されていない）。ジストロフィンの隣接する三重らせんは、スペクトリン及びαアクチニンよりも重なり合っており、それによって、縦方向の荷重支持中にらせんを安定させ、ロッドのサブ領域の結晶化が困難になる場合があるため、構造情報が不足している場合がある。それにもかかわらず、疎水性コアの中心にあるトリプトファン残基の保存により、「Ａ」らせんと「Ｃ」らせんにある、３つのスプライスのうちの２つに「アンカーポイント」が提供される。例えば、図３に示したＨＭＭロゴの１６位のＷの突出に注目されたい（Ｗｈｅｅｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１４）。相互作用する２つのトリプトファン残基を含む三重らせん反復についてすべての結晶構造を分析し、ＨＭＭｅｒウェブ上でのＨＭＭｓｃａｎ分析を用いて、「Ｂ」らせん中の個々の位置がトリプトファンを二分する断面（すなわち、らせん反復を長軸に垂直に二分する平面）に対応する確率を規定した。
ＬＱＧＥＩＥＡＨＴＤＶＹ（Ｎ末端からＣ末端、全長ジストロフィンＴＨ２２のアミノ酸配列）．．．ＱＥＤＬＥＱＥＱＶ（Ｎ末端からＣ末端、全長ジストロフィンＴＨ２のアミノ酸配列）は、ナノジストロフィンでハイブリッドＴＨを形成する全長ジストロフィンの２つのＴＨのらせんＢ（らせん２、ＴＨの３つのらせんの２番目のらせん）におけるスプライス接合部を取り囲む配列である。下線を引いた文字Ｅ及びＱは、らせんＢにおけるスプライス接合部を示す一方、Ｅ及びＱの両方は、配列番号１に例示されるように、得られたハイブリッドＴＨにおいて保存される。しかしながら、本明細書で使用される三重スプライス変異体ジストロフィンは、配列番号１の特徴として示されるように、ＥＱ間以外のらせんＢにおけるスプライス接合部を有する場合があることが、当業者によって理解される。このようなスプライス接合部は、ＬＱＧＥＩＥＡＨＴＤＶＹ．．．ＱＥＤＬＥＱＥＱＶ及び図５、並びに対応する配列番号１３〜１８のアミノ酸配列に示されるように、らせんＢ中のいずれかのアミノ酸のＮ末端又はＣ末端、又は別のＴＨにおけるらせんＢの他の対応する位置にある場合がある。配列中の位置の対応は、いずれかの２つ以上のジストロフィンＴＨ間のアミノ酸配列アラインメント、又は隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）によって決定され得る。
同様に、本明細書に使用される三重スプライス変異体ユートロフィンは、配列番号３の特徴として示されるように、らせんＢにおいてＨＱ間にスプライス接合部を有する場合があり、又は、スプライス接合部は、らせんＢにおけるＡＥＩＤＡＨＮＤＩＦＫＳ（Ｎ末端からＣ末端、全長ユートロフィンＴＨ２０におけるアミノ酸配列）．．．ＤＬ ＥＡＥＱＶＫＶ（Ｎ末端からＣ末端、全長ユートロフィンＴＨ２におけるアミノ酸配列）におけるいずれかのアミノ酸のＮ末端又はＣ末端、又は別のユートロフィンＴＨにおけるらせんＢの他の対応する位置にある場合がある。配列中の位置の対応は、いずれかの２つ以上のユートロフィンＴＨ間のアミノ酸配列アラインメント、又は隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）によって決定され得る。
特定の態様において、らせんＡ又はＣ（三重らせん反復における３つのらせんのうち、らせん１、すなわち、第１のらせん、及びらせん３、すなわち、第３のらせんである）におけるスプライス接合部は、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）及びこのスーパーファミリーにおけるタンパク質についてのすべての結晶構造のコアにおけるトリプトファン（Ｗ）にある場合がある。さらなる態様において、らせんＡ又はＣにおけるスプライス接合部は、Ｗ（複数可）からタンパク質のＣ末端側又はＮ末端側へ１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、又は５アミノ酸である位置にある場合がある。
Ｂ．ヒトナノユートロフィン配列
以下の配列中のより大きな大文字は、全長ヒトユートロフィンのＮ末端領域と同一の部分を示す。より小さい大文字は、全長ヒトユートロフィンのＣ末端領域と同一の領域を示す。イタリック体のＷは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）及びこのスーパーファミリーにおけるタンパク質についてのすべての結晶構造のコアにおける「Ａ」及び「Ｃ」らせんにおけるトリプトファン残基に対応し、イタリック体のＨＱは、図２Ｆに示されるように、横断の仮想平面に隣接する「Ｂ」らせんについてのスーパーファミリーＨＭＭ内の位置に対応する。折り畳まれたタンパク質の予想される二次及び三次構造は、図４に示されるハイブリッドＴＨに対応する。
Figure 2021521782
特定の態様では、本明細書で提供されるナノユートロフィンは、全長ユートロフィン中の反復２及び２０を連結する三重スプライス変異を含む、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2021521782
構造的制約に対処するためのナノユートロフィンの詳細な設計は、本明細書に記載される。系統発生分析は、祖先の三重らせん反復がスペクトリンコンセンサスに合致するほとんどの単細胞真核生物のプロテオーム中の唯一のタンパク質であるため、αアクチニンとオルソロガスなタンパク質に存在したことを示唆している。αアクチニン、α−及びβスペクトリン、並びにジストロプラキンを含む訓練セットは、ロゴがトリプトファン残基の例外的保存を示すＨＭＭを作り出す。利用可能な高解像度結晶構造において、側鎖の位置及び芳香族相互作用は、第３の「Ｂ」αらせんの構造と同様に、高度に保存されている。上記の配列において、下線を引いたＷとＢらせんアミノ酸Ｈ及びＱの位置に注意する。これらのサブドメインに対応するポリペプチド配列の再配列又は「スプライシング」は、異なるフォントサイズによって示され、焦点不連続の３つの部位は、図２Ｆに示される断面の平面に対応し、ユートロフィン反復２と２０との間に３−Ｄハイブリッドを生成する。
全長ヒトユートロフィンタンパク質中のＴＨ１及び１８をスプライスすることによって形成されるハイブリッド三重らせんドメインを含む、５つのスペクトリン様三重らせん反
復を有するナノユートロフィンもまた、本明細書に提供される。特定の態様では、ナノユートロフィンは、以下の配列を有する：
Figure 2021521782
Ｃ．ヒトナノジストロフィン配列：
以下のより大きな大文字は、全長ヒトジストロフィンのＮ末端領域と同一の部分を示す。より小さい大文字は、全長ヒトジストロフィンのＣ末端領域と同一の領域を示す。下線を引いたＷは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）及びこのスーパーファミリー中のタンパク質のすべての結晶構造のコアにおける「Ａ」及び「Ｃ」らせん中のトリプトファン残基に対応する。下線を引いたＥＱは、図２Ｆに示されるように、横断の仮想平面に隣接する「Ｂ」らせんについてのスーパーファミリーＨＭＭ内の位置に対応する。折り畳まれたタンパク質の予想される二次及び三次構造は、図４に示されるハイブリッドＴＨに対応する。
Figure 2021521782
全長ヒトジストロフィンにおいてＴＨ１及び２０をスプライスすることによって形成されるハイブリッド三重らせんドメインを含む、５つのスペクトリン様三重らせん反復を有するナノジストロフィンもまた、本明細書に提供される。特定の態様では、ナノユートロフィンは、以下の配列を有する：
Figure 2021521782
Ｄ．その他
多くの高分子量タンパク質は、反復的な内部ドメインを有する。ジストロフィンは、限定された三次元構造情報が、反復的な内部ドメインに利用できる大きなクラスのタンパク質を例示している。概念的に同一のアプローチが、他の遺伝性疾患にも適用可能な場合がある。例えば、一般的な遺伝性凝固障害フォン・ウィルブランド病は、複数の反復（「ｖＷＦ」）を有するタンパク質をコードする８キロ塩基の変異によって引き起こされる。最近発表された研究により、肝臓における組換えタンパク質のトランスジェニック発現は、疾患を治療するのに十分であが、コード配列は、単一のＡＡＶゲノムには大きすぎ、２つのＡＡＶゲノム間のトランススプライシングは、組換えタンパク質発現の治療レベルを達成するには、あまりにも効率が悪いことが明らかになった。タンパク質全体についての結晶構造は存在しないが、本明細書に概説される方法による分析は、全長ｖＷＦを置換する
場合がある小型化されたナノｖＷＦタンパク質を作製する機会を直ちに示唆する。
フォン・ウィルブランド病は、典型的には、ＶＷＦ遺伝子の変異（変異）によって引き起こされる遺伝性疾患である。ＶＷＦ遺伝子は、フォン・ウィルブランド因子と呼ばれる血液凝固タンパク質をつくるための指令を提供する。フォン・ウィルブランド因子は、血栓を形成し、損傷後のさらなる失血を防ぐために重要である。フォン・ウィルブランド因子が正常に機能しないか、タンパク質の量が少なすぎると、血栓が適切に形成されなくなる。フォン・ウィルブランド因子の量を減少させたり、タンパク質を異常に機能させたりする（又はまったく機能させない）ＶＷＦ遺伝子変異は、この条件に関連する徴候及び症状の原因となる。これらの変異は、常染色体優性若しくは常染色体劣性の形で遺伝する場合があり、又は、家系内に他の症例がなくても、罹患者に初めて起こる場合がある（ｄｅ
ｎｏｖｏ変異として知られる）。例えば、ｇｈｒ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ／ｖｏｎ−ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ−ｄｉｓｅａｓｅを参照されたい。本明細書全体にわたって本明細書に記載されるいずれかの組成物、レジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）、局面、態様及び方法は、フォン・ウィルブランド病フォン、変異体フォン・ウィルブランド因子、変異体フォン・ウィルブランド因子をコードする核酸配列、又はそのようなコード配列を含むベクターに適用されることが意図されることが、当業者によって理解されるであろう。
フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）は、止血の維持に重要である。フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）は、内皮下コラーゲンマトリックスと血小板−表面受容体複合体ＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖとの間に分子架橋を形成することにより、血管損傷部位への血小板の接着を促進する。フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）はまた、凝固第ＶＩＩＩ因子のためのシャペロンとして作用し、それを損傷部位に送達し、そのヘテロ二量体構造を安定化し、血漿からの早すぎるクリアランスからそれを保護する。フォン・ウィルブランド因子には、２つのアイソフォームがある。アイソフォーム１は、カノニカル配列とみなされ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ０４２７５−１を有するアミノ酸配列を有し、これは本明細書に組み込まれる。他のアイソフォームは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｐ０４２７５−２を有するアイソフォーム２であり、アイソフォームの配列は、本明細書に組み込まれる。「全長」ｖＷＦは、アイソフォーム１を指す場合がある。特定の態様では、「全長」ｖＷＦは、アイソフォーム２又はｖＷＦの他のホモログを指す場合がある。フォン・ウィルブランド因子のホモログは、マウス（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ８ＣＩＺ８）、ラット（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ６２９３５）、ブタ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ２８８３３）、及びイヌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ２８２９５）など様々な生物で同定されている。フォン・ウィルブランド因子又はそのいずれかの他のアイソフォーム若しくはホモログをコードする可能な核酸配列は、公に入手可能である。例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００５５２．４、Ｘ０４３８５．１、Ｍ１０３２１．１、Ｘ０４１４６．１、ＡＫ１２８４８７．１、ＡＫ２９７６００．１、ＡＫ２９２１２２．１，ＢＣ０６９０３０．１、ＢＣ０２２２５８．１、Ｕ８１２３７．１、Ｋ０３０２８．１、Ｍ１７５８８．１、ＡＦ０８６４７０．１、及びＸ０２６７２．１（これらの各々は、本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「変異体フォン・ウィルブランド因子」又は「変異体ｖＷＦ」は、反復の内部欠失及び２つの反復を連結するスプライス接合部を有するフォン・ウィルブランド因子を指し、ここで、スプライス接合部位は、反復間ではなく反復内にある。特定の態様において、スプライス接合部は、Ａ．らせんにおけるスプライス接合部、Ｉ、ジストロフィン、ユートロフィン及びその他、又はいずれかの実施例と同様の方法によって決定される。ｖＷＦにおける反復の同定又は特徴付けは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、又はいずれかの他の従来の方法によって決定される場合がある。例えば、Ｚｈｏｕ
ＹＦ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈｉｎ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ． Ｂｌ
ｏｏｄ． ２０１２ Ｊｕｌ １２；１２０（２）：４４９−５８． ｄｏｉ： １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１２−０１−４０５１３４． Ｅｐｕｂ ２０１２ Ａｐｒ
６．； Ｓａｄｌｅｒ ＪＥ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９８；６７：３９５−４２４； 及びＰｅｒｋｉｎｓ ＳＪ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｆａｃｔｏｒ
Ｂ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｂｙ Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ． Ｉｔｓ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅｓ ＶＩ， ＶＩＩ， ＸＩＩ ａｎｄ ＸＩＶ， ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ａｖｅｒａｇｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９４ Ａｐｒ ２２；２３８（１）：１０４−１９を参照されたい。変異体ｖＷＦをコードする核酸配列は、逆翻訳のためのツールを介して生成される場合がある。さらに、コード配列は、対象、例えばヒト、マウス、ラット又はイヌにおける発現のためにコドン最適化され得る。
本明細書に記載されるいずれかの組成物は、本明細書全体にわたって記載される他の組成物、レジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）、局面、態様及び方法に適用されることが意図されることが理解されるべきである。
ＩＩ．発現カセット
ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列を、その発現を指示する調節配列の制御下で含む発現カセットが本明細書に提供される。
本明細書で使用される場合、用語「発現」又は「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物の合成において使用されるプロセスを指す。遺伝子産物は、タンパク質、ペプチド、又は核酸ポリマー（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＰＮＡ）である場合がある。特定の態様において、機能的遺伝子産物は、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質である。特定の態様において、用語「遺伝子」、「ミニ遺伝子」及び「導入遺伝子」は、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質、例えば、ナノジストロフィン又はナノユートロフィンをコードする配列を指す。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含み、そのための他の調節配列を含む場合がある核酸ポリマーを指し、このカセットは、ベクターにパッケージングされる場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「調節配列」又は「発現制御配列」は、それらが作動可能に連結された、タンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導し、抑制し、又はそうでなければ制御する、イニシエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列のような核酸配列を指す。
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、コード配列と連続する発現制御配列、及びコード配列を制御するためにトランスで又は少し離れて作用する発現制御配列の両方を指す。特定の態様において、コード配列は、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする。
用語「異種」は、タンパク質又は核酸に関して使用される場合、タンパク質又は核酸が
天然において互いに同じ関係で見出されない２つ以上の配列又はサブ配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、新しい機能的核酸を作製するように配置された無関係な遺伝子からの２つ以上の配列を有するように組換え的に産生される。例えば、一態様では、核酸は、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指示するように配置された１つの遺伝子由来のプロモーターを有する。従って、コード配列に関して、プロモーターは、異種である。
配列に関する同一性又は類似性は、本明細書では、配列を整列させ、必要であればギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後に、本明細書に提供されるペプチド及びポリペプチド領域と同一（すなわち、同一残基）又は類似（すなわち、共通の側鎖特性に基づく同一群由来のアミノ酸残基、下記参照）である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。同一性パーセント（％）は、各々、それらのヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較することによって決定される、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドの間の関係の尺度である。一般に、比較される２つの配列は、配列間に最大の相関を与えるように整列される。２つの配列のアラインメントを調べ、２つの配列間の正確なアミノ酸又はヌクレオチドの対応を与える位置の数を決定し、アラインメントの全長で割り、１００を掛けて、％同一性の数字を得る。この同一性％の数字は、比較される配列の全長にわたって決定される場合があり、これは、同一若しくは非常に類似した長さの配列に特に適切であり、高度に相同であり、又はより短い規定された長さにわたって決定される場合があり、これは、等しくない長さの配列により適切であり、若しくはより低いレベルの相同性を有する。アラインメント及び同一性パーセントを実施するために、使用するために利用可能である文献及び／又は公に若しくは商業的に利用可能ないくつかのアルゴリズム、及びそれに基づくコンピュータプログラムが存在する。アルゴリズム又はプログラムの選択は、本発明を限定するものではない。
適切なアラインメントプログラムの例は、例えば、ＵｎｉｘのソフトウェアＣＬＵＳＴＡＬＷ（次いでＢｉｏｅｄｉｔプログラムにインポートされた）（Ｈａｌｌ， Ｔ． Ａ． １９９９， ＢｉｏＥｄｉｔ： ａ ｕｓｅｒ−ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｅｄｉｔｏｒ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ ９５／９８／ＮＴ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ４１：９５−９８）；ＥＭＢＬ−ＥＢＩから入手可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ， Ｆａｂｉａｎ， ｅｔ ａｌ． “Ｆａｓｔ， ｓｃａｌａｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ‐ｑｕａｌｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ．” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ７．１ （２０１１）： ５３９ ａｎｄ Ｇｏｕｊｏｎ， Ｍｉｃｋａｅｌ， ｅｔ ａｌ． “Ａ ｎｅｗ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ａｔ ＥＭＢＬ-ＥＢＩ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８．ｓｕｐｐｌ ２ （２０１０）： Ｗ６９５−Ｗ６９９）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１ （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２：３８７−３９５， １９８４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．， ＵＳＡから入手可能）を含む。プログラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰは、２つのポリヌクレオチド間の％同一性及び２つのポリペプチド配列間の％同一性を決定するために使用される場合がある。
配列間の同一性及び／又は類似性を決定するための他のプログラムは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ，ＵＳＡから入手可能であり、ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣＢＩのホームページを通してアクセス可能なプログラムのＢＬＡＳＴファミリー、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を含む。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー、及び４のギャップペナルティーを使用することができる；及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ． Ｒ． ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｄ． Ｊ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：２４４４−２４４８， １９８８、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅの一部として入手可能）。ＳｅｑＷｅｂソフトウェア（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ：Ｇａｐプログラムに対するウェブベースのインターフェース）。
一態様では、発現カセットは、対象、例えばヒト、ラット、マウス又はイヌにおける発現及び分泌のために設計される。一態様において、発現カセットは、心筋、骨格筋及び平滑筋を含む筋肉における発現のために設計される。
特定の態様において、調節制御エレメントは、例えば、選択された５’ ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する、発現制御配列の一部としてのプロモーター配列を含む。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター（例えば、国際公開第２０１１／１２６８０８号及び国際公開第２０１３／０４９４３号参照）、組織特異的プロモーター（例えば、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ参照）、又は生理学的合図に応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターにおいて使用される場合がある。特定の態様では、筋肉特異的プロモーター、例えば、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、Ｄｅｓｍｉｎプロモーター、Ｍｂプロモーター、又はミオシン−重ポリペプチド２、ミオシン、トロポニンＴ型３、トロポニンＣ型２、ミオシン結合タンパク質Ｃ、速骨格ミオシン軽鎖２、アクチニンα２、小胞関連膜タンパク質５、甲状腺ホルモン受容体インタラクター１０、トロポミオシン３、サルコグリカンγ、筋原性分化１、筋原性因子６（ヘルクリン）又はカルシウムチャネル、電位依存性γ１のプロモーターが使用される場合がある。別の有用なプロモーターは、合成ＳＰｃ５−１２プロモーターであり、これは骨格筋及び心筋における強固な発現を可能にする（例えば、Ｒａｓｏｗｏ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｊｕｎｅ ２０１４， ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｏｌ． １０，Ｎｏ．１８並びに米国特許出願公開第２００４０１９２５９３号及び第２０１７／０２７５６４９号を参照されたい）。
特定の態様では、調節制御エレメントは、ＣＳ−ＣＲＭエレメント１〜８のいずれかを含む心臓特異的シス作用調節モジュール（ＣＳ−ＣＲＭ）を含む。特定の態様では、調節配列は、前述のキメラ合成ＣＳ−ＣＲＭ４／ＳＰｃ５−１２プロモーターなどのＳＰｃ５−１２プロモーターと組み合わせたＣＳ−ＣＲＭ４エレメント又はＣＳ−ＣＲＭ４エレメントを含む（Ｒｉｎｃｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆｓ ｔｈａｔ ｅｎａｂｌｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃａｒｄｉａｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１５ Ｊａｎ；２３（１）：４３−５２）、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
治療生成物の発現を制御するのに適した構成的プロモーターの例は、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）の初期及び後期プロモーター、Ｕ６プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＥＦｌαプロモーター、ユビキチンプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）プ
ロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター（Ｓｃｈａｒｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：４６２６−４６３０ （１９９１）、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーターホスホグリセロールムターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： １０００６−１００１０ （１９８９）、モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、並びに当業者に公知の他の構成的プロモーターを含むが、これらに限定されない。本発明における使用に適切な組織特異的プロモーター又は細胞特異的プロモーターの例は、内皮細胞に特異的なエンドセリン−Ｉ（ＥＴ−Ｉ）及びＦｌｔ−Ｉ、ＦｏｘＪ１（繊毛細胞を標的とする）を含むが、これらに限定されない。
治療生成物の発現を制御するために適切な誘導性プロモーターは、外因性因子（例えば、薬理学的因子）又は生理学的合図に応答するプロモーターを含む。これらの応答エレメントは、ＨＩＦ−Ｉα及びβに結合する低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）、Ｍａｙｏ ｅｔ ａｌ． （１９８２， Ｃｅｌｌ ２９：９９−１０８）； Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２） 及びＳｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１４８０−１４８９）によって記載されるような金属イオン応答エレメント；又はＮｏｕｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ， ｅｄ． Ｎｏｕｅｒ， Ｌ．， ＣＲＣ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．， ｐｐＩ６７−２２０， １９９１：において）によって記載されるような熱ショック応答エレメントを含むが、これらに限定されない。
一態様において、コード配列の発現は、コード配列の転写に対する厳密な制御を提供する調節可能なプロモーター、例えば、薬理学的薬剤、又は薬理学的薬剤によって活性化される、又は代替の態様では、生理学的合図によって活性化される転写因子によって制御される。漏れがなく、厳密に制御することができるプロモーターシステムが好ましい。本発明において使用される場合があるリガンド依存性転写因子複合体である調節可能なプロモーターの例は、それらの各々のリガンド（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、並びにそれらの類似体及び模倣体）によって活性化される核内受容体スーパーファミリーのメンバー、及びテトラサイクリンによって活性化されるｒＴＴＡを含むが、これらに限定されない。本発明の一局面では、遺伝子スイッチは、ＥｃＲベースの遺伝子スイッチである。このようなシステムの例は、米国特許第６，２５８，６０３号、第７，０４５，３１５号、米国特許出願公開第２００６／００１４７１１号、第２００７／０１６１０８６号、及び国際公開第０１／７０８１６号に記載されるシステムを含むが、これらに限定されない。キメラエクジソン受容体システムの例は、米国特許第７，０９１，０３８号、米国特許出願公開第２００２／０１１０８６１号、第２００４／００３３６００号、第２００４／００９６９４２号、第２００５／０２６６４５７号、及び第２００６／０１００４１６号、並びに国際公開第０１／７０８１６号、第０２／０６６６１２号、第０２／０６６６１３号、第０２／０６６６１４号、第０２／０６６６１５号、第０２／２９０７５号、及び第２００５／１０８６１７号（これらの各々は、全体が参照により組み込まれる）に記載されている。非ステロイド性エクジソンアゴニスト調節システムの例は、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）である。
さらに他のプロモーターシステムは、テトラサイクリン（ｔｅｔ）応答エレメント（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ ＆ Ｂｕｊａｒｄ （１９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５５４７−５５１）に記載されているような；又はＬｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９４：２２８−２３２）； Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８：２０３８−２０４２）； Ｋｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２９：７３４−７３６）； 及びＩｓｒａｅｌ ＆ Ｋａｕｆｍａｎ （１９８９， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：２５８９−２６０４）に記載されているようなホルモン応答エレメントを含むがこれらに限定されない応答エレメント、及び当技術分野で公知の他の誘導性プロモーターを含む場合がある。このようなプロモーターを使用して、導入遺伝子の発現は、例えば、Ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆシステム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−９； Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８９（１２）：５５４７−５１）；ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢシステム（Ｕｒｒｕｔｉａ Ｒ．， ２００３， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．， ４（１０）：２３１； Ｄｅｕｓｃｈｌｅ Ｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． （４）：１９０７−１４）；ミフェプリストン（ＲＵ４８６）調節可能なシステム （Ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ； Ｗａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９１（１７）：８１８０−４； Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ．１０２（３９）：１３７８９−９４）； ヒト化タモキシフェン依存性調節可能システム （Ｒｏｓｃｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６（５）：６５３−６３）によって制御され得る。遺伝子スイッチは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）とＦＫＢＰラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）とのヘテロ二量体化に基づく場合があり、ラパマイシン又はその非免疫抑制類似体を介して調節される。このようなシステムの例は、ＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＡＲＩＡＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．）及び米国特許第６，０１５，７０９号、第６，１１７，６８０号、第６，４７９，６５３号、第６，１８７，７５７号、及び第６，６４９，５９５号、米国特許出願公開第２００２／０１７３４７４号、米国特許出願公開第２００９１０１００５３５号、米国特許第５，８３４，２６６号、米国特許第７，１０９，３１７号、米国特許第７，４８５，４４１号、米国特許第５，８３０，４６２号、米国特許第５，８６９，３３７号、米国特許第５，８７１，７５３号、米国特許第６，０１１，０１８号、米国特許第６，０４３，０８２号、米国特許第６，０４６，０４７号、米国特許第６，０６３，６２５号、米国特許第６，１４０，１２０号、米国特許第６，１６５，７８７号、米国特許第６，９７２，１９３号、米国特許第６，３２６，１６６号、米国特許第７，００８，７８０号、米国特許第６，１３３，４５６号、米国特許第６，１５０，５２７号、米国特許第６，５０６，３７９号、米国特許第６，２５８，８２３号、米国特許第６，６９３，１８９号、米国特許第６，１２７，５２１号、米国特許第６，１５０，１３７号、米国特許第６，４６４，９７４号、米国特許第６，５０９，１５２号、米国特許第６，０１５，７０９号、国特許第６，１１７，６８０号、米国特許第６，４７９，６５３号、米国特許第６，１８７，７５７号、米国特許第６，６４９，５９５号、米国特許第６，９８４，６３５号、米国特許第７，０６７，５２６号、米国特許第７，１９６，１９２号、米国特許第６，４７６，２００号、米国特許第６，４９２，１０６号、国際公開第９４／１８３４７号、国際公開第９６／２０９５１号、国際公開第９６／０６０９７号、国際公開第９７／３１８９８号、国際公開第９６／４１８６５号、国際公開第９８／０２４４１号、国際公開第９５／３３０５２号、国際公開第９９１１０５０８号、国際公開第９９１１０５１０号、国際公開第９９／３６５５３号、国際公開第９９／４１２５８号、国際公開第０１１１４３８７号に記載されたシステム、ＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋｉｔ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ （９１０９１０２）、及びＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０
（９１０９／０２）（これらの各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含むが、これらに限定されない。Ａｒｉａｄシステムは、ラパマイシン及び「ラパログ」と呼ばれるその類似体によって誘導されるように設計されている。適切なラパマイシンの例は、ＡＲＧＥＮＴシステムの説明に関連して上記に列挙した文献に提供されている。一態様では、分子は、ラパマイシン［例えば、ＰｆｉｚｅｒによってＲａｐａｍｕｎｅとして市販されている］である。別の態様では、ＡＰ２１９６７［ＡＲＩＡＤ］として知られるラパログが使用される。本発明で使用することができるこれらの二量体化（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）分子の例は、ラパマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ１０１２（ＦＫ５０６のホモダイマー）、内因性ＦＫＢＰ及び／又はＦＲＡＰに対する親和性を低減又は排除する「隆起」を付加するための天然産物の化学修飾によって容易に調製されるラパマイシン類似体（「ラパログ」）を含むが、これらに限定されない。ラパログの例は、例えば、ＡＰ２６１１３（Ａｒｉａｄ）、ＡＰ１５１０ （Ａｍａｒａ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４（２０）：１０６１８−２３）ＡＰ２２６６０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２１３７０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２３０５４、ＡＰ１８５５、ＡＰ１８５６、ＡＰ１７０１、ＡＰ１８６１、ＡＰ１６９２及びＡＰ１８８９（内因性ＦＫＢＰとの相互作用を最小限にする「隆起」が設計された）を含むがこれらに限定されない。さらに他のラパログ、例えばＡＰ２３５７３［Ｍｅｒｃｋ］が選択される場合がある。
他の適切なエンハンサーは、所望の標的組織指標に適切なものを含む。一態様において、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一態様において、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じである場合があり、又は互いに異なる場合がある。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ即時初期エンハンサーを含む場合がある。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーで存在する場合がある。あるいは、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離される場合がある。さらに別の態様では、発現カセットは、イントロン、例えばニワトリβ−アクチンイントロンをさらに含む。他の適切なイントロンは、例えば、国際公開第２０１１／１２６８０８号に記載されているような、当技術分野で公知のイントロンを含む。適切なポリＡ配列の例は、例えば、ウサギ結合グロブリン（ｒＢＧ）、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡを含む。任意的に、ｍＲＮＡを安定化するために、１つ以上の配列が選択される場合がある。このような配列の例は、改変されたＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流で操作される場合がある［例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆ， ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００９） １６： ６０５−６１９９を参照されたい。一態様では、エンハンサーは、二重又は三重タンデムＭＣＫエンハンサーである。
一態様において、調節配列は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含む。さらなる態様において、ポリＡは、ウサギグロビンポリＡである。例えば、国際公開第２０１４／１５１３４１号を参照されたい。あるいは、別のポリＡ、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、又は合成ポリＡが発現カセットに含まれる場合がある。
本明細書に記載される発現カセット中の組成物は、本明細書全体にわたって記載される他の組成物、レジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）、局面、態様及び方法に適用されることが意図されることが理解されるべきである。
ＩＩＩ． ベクター
特定の態様において、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列は、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを含むベクター
中で操作される。
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列の複製又は発現のために適切な標的細胞に導入することができる前記核酸配列を含む生物学的又は化学的部分である。ベクターの例は、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）結合体、磁性粒子、又はナノ粒子を含むがこれらに限定されない。このようなベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点、及びコード配列又は発現カセットが挿入され得る１つ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞が、例えば、薬物耐性遺伝子をコードしないものから選択され得る手段を有する。一般的なベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」を含む。ベクターの生成、産生、特徴付け又は定量の従来の方法は、当業者が利用可能である。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指す場合がある。宿主細胞は、いずれかの手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ＤＮＡ−ｃｏａｔｅｄ ｐｅｌｌｅｔ）、ウイルス感染及びプロトプラスト融合によって細胞に導入された外因性又は異種ＤＮＡを含有する原核細胞又は真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、又は酵母）である場合がある。宿主細胞の例は、単離細胞、細胞培養物、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、肝細胞、腎細胞、筋肉細胞、平滑筋細胞、心筋細胞又は骨格筋細胞を含む場合があるが、これらに限定されない。
核酸配列又はタンパク質を記載するために使用される用語「外因性」は、核酸又はタンパク質が、それが染色体又は宿主／標的細胞中に存在する位置に、天然に存在しないことを意味する。外因性核酸配列はまた、同じ宿主細胞又は対象に由来し、及び挿入されるが、非天然状態（例えば、異なるコピー数）で、又は異なる調節エレメントの制御下で存在する配列を指す。
本明細書で使用される場合、用語「標的細胞」は、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質の発現が所望されるいずれかの標的細胞を指す。特定の態様において、用語「標的細胞」は、ＤＭＤ及びＢＭＤを含む、ＭＤについて治療される対象の細胞を指すことが意図される。標的細胞の例は、肝細胞、腎細胞、筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞又は骨格筋細胞を含む場合があるが、これらに限定されない。特定の態様では、ベクターは、エクスビボで標的細胞に送達される。特定の態様では、ベクターは、インビボで標的細胞に送達される。
非ウイルスベクターは、心臓に送達される、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質及び任意的にプロモーター又は他の調節エレメントをコードする核酸配列を最小限で含む発現カセットを有するプラスミドである場合がある。平滑筋系及び心筋系への核酸分子の非ウイルス送達は、化学的又は物理的方法を含む場合がある。化学的方法は、カチオン性リポソーム（「リポプレックス」）、ポリマー（「ポリプレックス」）、２つの組み合わせ（「リポポリプレックス」）、リン酸カルシウム、及びＤＥＡＥデキストランの使用を含む。さらに、又は任意的に、このような核酸分子は、例えば、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、リポフェクチン、リポフェクタミンなどのリポソーム試薬、並びにＰＥＩ、エフェクテン、及びデンドリマーなどのカチオン性ポリマーを含む、１つ以上の試薬をさらに含む組成物において使用される場合がある。このような試薬は、平滑筋細胞をトランスフェクトするのに有効である。化学的方法に加えて、複合体化されていな
いＤＮＡの細胞への直接侵入を促進する多くの物理的方法が存在する。これらの方法は、個々の細胞のマイクロインジェクション、ハイドロポレーション、エレクトロポレーション、超音波、及びバイオリスティック送達（すなわち、遺伝子銃）を含み得る。
特定の態様において、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットは、ウイルスベクター、例えば組換えアデノウイルス、レンチウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス（例えば、Ｙａｎ Ｚ ｅｔ ａｌ， Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２／ｈｕｍａｎ ｂｏｃａｖｉｒｕｓ １ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｓ ｈｕｍａｎ
ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１３ Ｄｅｃ；２１（１２）：２１８１−９４． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｍｔ．２０１３．９２． Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｊｕｌ ３０を参照）、単純ヘルペスウイルス、又はアデノ随伴ウイルスによって運ばれる。このような態様において、ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスである場合がある。
「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、発現カセットを含むベクターゲノムがウイルスカプシド又はエンベロープにパッケージングされ、ここで、同様にウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージングされたいずれかのウイルスゲノム配列が複製欠損である；すなわち、それらは、子孫ビリオンを生成することはできないが、標的細胞に感染する能力を保持する、合成又は人工ウイルス粒子を指す。一態様において、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、「無腸」−人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに挟まれた目的の導入遺伝子のみを含むように操作され得る）が、これらの遺伝子は、生産中に供給される場合がある。したがって、複製に必要なウイルス酵素が存在する場合を除いては、子孫ビリオンによる複製及び感染は起こり得ないため、遺伝子治療での使用は安全であると考えられる。
ベクターは、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルスなどを含む、当技術分野で公知の、又は上記に開示されたいずれかのベクターである場合がある。ベクターの宿主細胞への導入は、当技術分野で公知の、又はトランスフェクション及び感染を含む上記に開示したいずれかの手段によって達成される場合がある。アデノウイルス遺伝子の１つ以上は、宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれ、エピソームとして安定に発現され、又は一時的に発現される場合がある。遺伝子産物は、すべて一時的に、エピソーム上に、又は安定的に組み込まれて発現される場合があり、又は遺伝子産物の一部は、安定的に発現される一方、他のものは、一時的に発現され場合がある。さらに、アデノウイルス遺伝子の各々のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は天然アデノウイルスプロモーターから独立して選択される場合がある。プロモーターは、例えば、生物若しくは細胞の特定の生理学的状態によって（すなわち、分化状態によって、又は複製若しくは静止細胞において）、又は外因的に添加された因子によって調節される場合がある。
宿主細胞への（プラスミド又はウイルスとしての）分子の導入はまた、当業者に公知の技術を使用して、本明細書全体にわたって議論されるように達成される場合がある。好ましい態様では、通常のトランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ４トランスフェクション又はエレクトロポレーションが使用される。アデノウイルスの選択されたＤＮＡ配列（並びに種々の中間体プラスミドへの導入遺伝子及び他のベクターエレメント）のアセンブリ、並びに組換えウイルス粒子を産生するためのプラスミド及びベクターの使用は、すべて、従来の技術を使用して達成される。このような技術は、テキスト［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ］に記載されるようなｃＤＮＡの従来のクローニング技術、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの適切な方法を含む。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ４沈殿技術が使用される。他の用いられる従来の方法は、ウイルスゲノムの相同組み換え、寒天オーバーレイ中のウイルスのプラーク形成、シグナル生成を測定する方法などを含む。
ウイルスベクターの用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重及び健康などの因子に依存し、したがって、患者によって異なる場合がある。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効な成人又は獣医学的用量は、一般に、約１×１０６〜約１×１０１５粒子、約１×１０１１〜１×１０１３粒子、又は約１×１０９〜１×１０１２粒子ウイルスの濃度を含む約１００μＬ〜約１００ｍｌの範囲の担体である。投与量は、動物の大きさ及び投与経路に応じて範囲がある。例えば、筋肉内注射のための適切なヒト又は獣医学的投与量（約８０ｋｇの動物について）は、単一部位について、１ｍＬ当たり約１×１０９〜約５×１０１２粒子の範囲である。任意的に、複数の投与部位が送達される場合がある。別の例では、適切なヒト又は獣医学的投与量は、製剤について約１×１０１１〜約１×１０１５粒子の範囲である場合がある。当業者は、投与経路、及び組換えベクターが使用される治療又はワクチン適用に応じて、これらの用量を調節する場合がある。導入遺伝子の発現レベルは、投与量の投与頻度を決定するために監視され得る。投与の頻度のタイミングを決定するためのさらに他の方法は、当業者に容易に明らかである。
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ベクター内にパッケージングされた核酸配列を指す。
Ａ． 複製欠損アデノウイルスベクター
一態様では、複製欠損アデノウイルスベクターが使用される。多数の適切なアデノウイルスのいずれも、アデノウイルスカプシド配列の供給源として、及び／又は産生において使用される場合がある。例えば、米国特許第９，６１７，５６１号；第９，５９２，２８４号；第９，１３３，４８３号；第８，８４６，０３１号；第８，６０３，４５９号；第８，３９４，３８６号；第８，１０５，５７４号；第７，８３８，２７７号；第７，３４４，８７２；第８，３８７，３６８；第６，３６５，３９４号；第６，２８７，５７１号；第６，２８１，０１０号；第６，２７０，９９６号；第６，２６１，５５１号；第６，２５１，６７７号；第６，２０３，９７５号；第６，０８３，７１６号；第６，０１９，９７８号；第６，００１，５５７号；第５，８７２，１５４号；第５，８７１，９８２号；第５，８５６，１５２号；第５，６９８，２０２号を参照されたい。さらに他のアデノウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。一態様において、アデノウイルス粒子は、Ｅ１ａ及び／又はＥ１ｂ遺伝子における欠失によって複製欠損にされる。あるいは、アデノウイルスは、任意的にＥ１ａ及び／又はＥ１ｂ遺伝子を保持しながら、別の手段によって複製欠損にされる。アデノウイルスベクターはまた、アデノウイルスゲノムに対する他の変異、例えば、温度感受性変異又は他の遺伝子における欠失を含むことができる。他の態様では、アデノウイルスベクター中にインタクトＥ１ａ及び／又はＥ１ｂ領域を保持することが望ましい。このようなインタクトＥ１領域は、アデノウイルスゲノム中のその天然の位置に位置し、又は天然のアデノウイルスゲノム中の欠失部位（例えば、Ｅ３領域）に位置する場合がある。
ヒト（又は他の哺乳動物）細胞への遺伝子の送達のための有用なアデノウイルスベクターの構築において、一連のアデノウイルス核酸配列が、ベクターにおいて使用され得る。例えば、アデノウイルス遅延初期遺伝子Ｅ３の全部又は一部を、組換えウイルスの一部を形成するアデノウイルス配列から排除する場合がある。Ｅ３の機能は、組換えウイルス粒子の機能及び産生に無関係であると考えられる。アデノウイルスベクターはまた、Ｅ４遺
伝子の少なくともＯＲＦ６領域の欠失を有し、より望ましくは、この領域の機能における重複性のために、Ｅ４領域全体の欠失を有するように構築される場合がある。さらに別のアデノウイルスベクターは、遅延初期遺伝子Ｅ２ａにおける欠失を含む。欠失はまた、アデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれにおいてもなされる場合がある。同様に、中間遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２における欠失は、いくつかの目的のために有用である場合がある。他の構造的又は非構造的アデノウイルス遺伝子において、他の欠失がなされる場合がある。上記に論じた欠失は、個々に使用される場合があり、すなわち、本明細書に記載されるような使用のためのアデノウイルス配列は、単一の領域のみに欠失を含む場合がある。あるいは、それらの生物学的活性を破壊するのに有効な遺伝子全体又はその部分の欠失がいずれかの組み合わせで使用される場合がある。例えば、１つの例示的ベクターにおいて、アデノウイルス配列は、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子の欠失、又はＥ１、Ｅ２ａ及びＥ３遺伝子の欠失、又はＥ１及びＥ３遺伝子の欠失、又はＥ１、Ｅ２ａ及びＥ４遺伝子の欠失、並びにＥ３の欠失の有無などを有する場合がある。上記で論じたように、このような欠失は、所望の結果を達成するために、温度感受性変異のような他の変異と組み合わせて使用される場合がある。
いかなる必須アデノウイルス配列（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５）も欠損しているアデノウイルスベクターを、ウイルス感染及びアデノウイルス粒子の増殖に必要な欠損アデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養する場合がある。これらのヘルパー機能は、１つ以上のヘルパー構築物（例えば、プラスミド又はウイルス）又はパッケージング宿主細胞の存在下でアデノウイルスベクターを培養することによって提供される場合がある。例えば、国際特許出願公開第９６／１３５９７号（１９９６年５月９日公開）（参照により本明細書に組み込まれる）において「最小」ヒトＡｄベクターの調製について記載されている技術を参照されたい。
ａ． ヘルパーウイルス
したがって、発現カセットを運ぶために使用されるウイルスベクターのアデノウイルス遺伝子含有量に応じて、発現カセットを含む感染性組換えウイルス粒子を産生するために必要な十分なアデノウイルス遺伝子配列を提供するために、ヘルパーアデノウイルス又は非複製ウイルス断片が必要である場合がある。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物中に存在しない、及び／又はベクターがトランスフェクトされるパッケージング細胞株によって発現されない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。一態様において、ヘルパーウイルスは複製欠損であり、上述した配列に加えて、種々のアデノウイルス遺伝子を含む。このようなヘルパーウイルスは、望ましくは、Ｅ１発現細胞株と組み合わせて使用される。
ヘルパーウイルスはまた、Ｗｕ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４：１６９８５−１６９８７ （１９８９）； Ｋ． Ｊ． Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｊ． Ｍ． Ｗｉｌｓｏｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２９９：４９ （Ａｐｒｉｌ
１， １９９４）に記載されるように、ポリカチオン結合体に形成される場合がある。ヘルパーウイルスは、任意的に、第２のレポーターミニ遺伝子を含む場合がある。多くのこのようなレポーター遺伝子は、当技術分野で公知である。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子とは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在は、Ａｄベクターとヘルパーウイルスの両方を独立して監視することを可能にする。この第２のレポーターは、精製の際に、得られる組換えウイルスとヘルパーウイルスとの間の分離を可能にするために使用される。
ｂ． 補完細胞株
上述したいずれかの遺伝子で欠失した組換えアデノウイルス（Ａｄ）を作製するために、ウイルスの複製及び感染性に必須である場合には、欠失遺伝子領域の機能がヘルパーウ
イルス又は細胞株、すなわち補完又はパッケージング細胞株によって組換えウイルスに供給されなければならない。多くの状況において、ヒトＥ１を発現する細胞株は、Ａｄベクターをトランス補完するために使用され得る。しかしながら、特定の状況では、Ｅ１遺伝子産物を発現する細胞株を利用して、Ｅ１欠失アデノウイルスを産生することが望ましい。このような細胞株は記載されている。例えば、米国特許第６，０８３，７１６号を参照されたい。
所望であれば、選択された親細胞株における発現のためのプロモーターの転写制御下でアデノウイルスＥ１遺伝子を最小限発現するパッケージング細胞又は細胞株を作製するために、本明細書に提供される配列を利用する場合がある。誘導性又は構成性プロモーターがこの目的のために用いられる場合がある。このようなプロモーターの例は、本明細書の他の箇所に詳細に記載されている。親細胞は、いずれかの所望のアデノウイルス遺伝子を発現する新規細胞株の生成のために選択される。限定するものではないが、このような親細胞株は、とりわけ、ＨｅＬａ［ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ １８５］、ＨＥＫ ２９３、ＫＢ［ＣＣＬ １７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えば、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１０、ＣＣＬ ７２］及びＷＩ−３８［ＣＣＬ ７５］細胞である場合がある。これらの細胞株は、すべて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９から入手可能である。他の適切な親細胞株は、他の供給源から得られる場合がある。
このようなＥ１発現細胞株は、組換えアデノウイルスＥ１欠失ベクターの生成において有用である。さらに、又はあるいは、１つ以上のアデノウイルス遺伝子産物（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、及び／又はＥ４ ＯＲＦ６）を発現する細胞株は、組換えウイルスベクターの生成において使用されるのと本質的に同じ手順を使用して構築され得る。このような細胞株は、それらの産物をコードする必須遺伝子において欠失したアデノウイルスベクターをトランス補完するために、又はヘルパー依存性ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）のパッケージングに必要なヘルパー機能を提供するために利用することができる。宿主細胞の調製は、選択されたＤＮＡ配列のアセンブリなどの技術を含む。このアセンブリは、従来の技術を利用して達成される場合がある。このような技術は、ｃＤＮＡ及びゲノムクローニングを含み、これらは周知であり、上記で引用したＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されており、ポリメラーゼ連鎖反応、合成方法、及び所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの他の適切な方法と組み合わされた、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列を使用する。
さらに別の選択肢では、必須アデノウイルス遺伝子産物は、アデノウイルスベクター及び／又はヘルパーウイルスによってトランスに提供される。このような場合、適切な宿主細胞は、原核（例えば、細菌）細胞を含むいずれかの生物学的生物、並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む真核細胞から選択され得る。特に望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＨＥＫ ２９３細胞又はＰＥＲＣ６（両方とも機能的アデノウイルスＥ１を発現する）［Ｆａｌｌａｕｘ， ＦＪ ｅｔ ａｌ， （１９９８）， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ９：１９０９−１９１７］、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２などの細胞、並びにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターを含む哺乳動物に由来する初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞を含むが、これらに限定されないいずれかの哺乳動物種の中から選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択は、本発明を限定するものではなく、哺乳動物細胞のタイプ、すなわち、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞なども限定するものではない。
ｃ． ウイルス粒子のアセンブリ及び細胞株のトランスフェクション
一般に、トランスフェクションによってミニ遺伝子を含むベクターを送達する場合、ベ
クターは、約５μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、好ましくは、約１０〜約５０μｇのＤＮＡの量で約１×１０４細胞〜約１×１０１３細胞、好ましくは、約１０５細胞に送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法及び選択された宿主細胞のような因子を考慮して調節される場合がある。
Ｂ． レンチウイルスシステム
様々な異なるレンチウイルスシステムが当技術分野で知られている。レンチウイルスシステムを用いて安定な心血管形質導入を得るための方法については、例えば、国際公開第２００１０８９５８０ Ａ１号を参照されたい。例えば、米国特許第６，５２１，４５７号を参照されたい。ＮＢ Ｗａｓａｌａ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｊ Ｇｅｎ Ｍｅｄ．， ２０１１ Ｏｃｔ； １３（１０）： ５５７−５６５（参照により本明細書に組み込まれる）の議論も参照されたい。
Ｃ． 組換えＡＡＶ
特定の態様では、ベクターゲノムは、ベクター、例えばｒＡＡＶ内にパッケージングされた核酸配列を指す。ｒＡＡＶの場合、このような核酸配列はＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及び発現カセットを含む場合がある。１つの例では、ベクターゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ ５’ ＩＴＲ、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列、及びＡＡＶ ３’ ＩＴＲを最小限含む。一例では、ベクターゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ ５’ ＩＴＲ、発現カセット、及びＡＡＶ ３’ ＩＴＲを最小限含む。ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来、又はＡＡＶ２以外の異なる供給源ＡＡＶ由来である場合がある。他の態様では、ベクターゲノムは、自己相補的ＡＡＶベクターに必要とされる末端反復（ＴＲ）を含む場合がある。
一態様では、ＡＡＶカプシド及びベクターゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供され、ここで、ベクターゲノムは、本明細書に記載される発現カセット、又はジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列（すなわち、本明細書で使用されるｃＤＮＡ）を、その発現を指示する調節配列の制御下で含む。
いくつかの態様において、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質は、組換えアデノ随伴ウイルスから発現されるように設計され、ベクターゲノムはまた、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。一態様では、ｒＡＡＶは、偽型であり、すなわち、ＡＡＶカプシドは、ＩＴＲを提供するＡＡＶとは異なる供給源ＡＡＶ由来である。一態様では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲが使用される。しかしながら、他の適切な供給源由来のＩＴＲが選択される場合がある。任意的に、ＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶである場合がある。
略語「ｓｃ」は、自己相補的を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって運ばれるコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染すると、細胞が仲介する第２鎖の合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成し、これは即座の複製と転写の準備が整っている。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， （Ａｕｇｕｓｔ ２００１）， Ｖｏｌ ８， Ｎｕｍｂｅｒ １６， Ｐａｇｅｓ １２４８−１２５４．を参照されたい。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５； ７，
１２５，７１７； ａｎｄ ７，４５６，６８３（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
遺伝子がＡＡＶから発現される場合、本明細書に記載される発現カセットは、ＡＡＶ ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶ ３’ ＩＴＲを含む。しかしながら、これらの要素の他の構成が適切である場合がある。５’ ＩＴＲの短縮版（ΔＩＴＲと呼ばれる）は、Ｄ配列と末端分離部位（ｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が削除されたものとして記述されている。他の態様では、全長ＡＡＶ ５’及び／又は３’ ＩＴＲが使用される。偽型ＡＡＶが産生される場合、発現におけるＩＴＲは、カプシドのＡＡＶ供給源とは異なる供給源から選択される。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、筋肉を標的化するための特定の効率を有するＡＡＶカプシドと共に使用するために選択される場合がある。一態様では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）は、便宜上、及び規制承認を加速するために使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源由来のＩＴＲを選択する場合がある。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源由来である場合、得られたベクターは、偽型と呼ばれる場合がある。しかしながら、ＡＡＶ ＩＴＲの他の供給源を利用する場合がある。
本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶウイルス粒子」は、カプシドを有し、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質のための発現カセットを含む異種核酸分子（ベクターゲノム）がその中にパッケージングされたヌクレアーゼ耐性粒子（ＮＲＰ）を指す。このような発現カセットは、典型的には、遺伝子配列に隣接するＡＡＶ ５’及び／又は３’逆方向末端反復配列を含み、遺伝子配列は、発現制御配列に作動可能に連結されている。ベクターゲノムを内部にパッケージングしたこのようなカプシドは、「完全」ＡＡＶカプシドとも呼ばれる場合がある。このようなｒＡＡＶウイルス粒子は、この発現カセットによって運ばれる所望の遺伝子産物を発現し得る宿主細胞に導入遺伝子を送達する場合、「薬理学的に活性」と呼ばれる。
多くの場合、ｒＡＡＶ粒子は、「ＤＮａｓｅ耐性」と呼ばれる。しかしながら、汚染核酸を除去するために、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、本明細書に記載される精製ステップにおいて、他のエンド及びエキソヌクレアーゼも使用される場合がある。このようなヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ及び／又は二本鎖ＤＮＡ、並びにＲＮＡを分解するように選択される場合がある。このようなステップは、単一のヌクレアーゼ、又は異なる標的に向けられたヌクレアーゼの混合物を含む場合があり、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼである場合がある。
用語「核酸耐性」は、ＡＡＶカプシドが、導入遺伝子を宿主細胞に送達するように設計された発現カセットの周りに完全に組み立てられており、これらのパッケージングされたゲノム配列を、生成プロセスから存在する場合がある汚染核酸を除去するために設計された核酸インキュベーションのステップ中に、分解（消化）から保護することを示している。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質から構成される自己組立ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は、典型的には、配列番号９のｖｐ１アミノ酸配列（ジェンバンク受入：ＡＡＳ９９２６４）をコードする、配列番号１０の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列から選択的スプライスバリアントとして産生される。これらのスプライスバリアントは、配列番号９の異なる長さのタンパク質を生じる。特定の態様において、「ＡＡＶ９カプシド」は、配列番号９と９９％同一であるアミノ酸配列（すなわち、参照される配列から約１％未満の変異）を有するＡＡＶを含む。また、米
国特許第７９０６１１１号及び国際公開第２００５／０３３３２１号を参照されたい。このようなＡＡＶは、例えば、天然の単離物（例えば、ｈｕ３１、そのｖｐ１は、配列番号１１によってコードされ、又はｈｕ３２、そのｖｐ１は、配列番号１２によってコードされる）、又はアミノ酸置換、欠失又は付加を有するＡＡＶ９のバリアント（例えば、ＡＡＶ９カプシドと整列したいずれかの他のＡＡＶカプシド中の対応する位置から「補充された」代替残基から選択されるアミノ酸置換を含むが、これに限定されない；例えば、米国特許第９，１０２，９４９号、米国特許第８，９２７，５１４号、米国特許第８，７３４，８０９号；及び国際公開第２０１６／０４９２３０Ａ１号に記載されるような）を含む場合がある。しかしながら、他の態様では、上記に参照した配列と少なくとも約９５％の同一性を有するＡＡＶ９又はＡＡＶ９カプシドの他のバリアントを選択する場合がある。例えば、米国特許出願公開第２０１５／００７９０３８号を参照されたい。カプシド、そのコード配列を生成する方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生方法は記載されている。例えば、Ｇａｏ， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ． １００ （１０）， ６０８１−６０８６ （２００３）及び米国特許第２０１３／００４５１８６Ａ１号を参照されたい。
ＡＡＶ９の他に、他のＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８三重、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１及びＡｎｃ８２が使用される場合がある。例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ２２（１２）：９３４−４６ （２０１５）； 米国特許第２０１７００５１２５７Ａ１号；及びＺｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．， １２（６）： １０５６−１０６８ （２０１５）を参照されたい。
いずれかのＡＡＶカプシドの配列は、合成的に、又は種々の分子生物学及び遺伝子工学技術を使用して容易に生成され得る。適切な製造技術は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）を参照されたい。あるいは、ペプチド（例えば、ＣＤＲ）又はペプチド自体をコードするオリゴヌクレオチドは、例えば、周知の固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， （１９６２） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９； Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， １９６９） ｐｐ． ２７−６２）によって合成的に生成され得る。これら及び他の適切な製造方法は、当業者の知識の範囲内であり、本発明を限定するものではない。
ＡＡＶベースのベクターを調製する方法は、公知である。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号（２００７年２月１５日）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。筋肉細胞及び／又は心臓細胞に対して向性を有するＡＡＶカプシドの使用は、本明細書に記載される組成物及び方法に特によく適している。しかしながら、他の標的を選択する場合がある。ＡＡＶ９の配列とＡＶ９カプシドに基づくベクターの生成方法は、米国特許第７，９０６，１１１号、第２０１５／０３１５６１２号、国際公開第２０１２／１１２８３２号及び国際公開第２０１７１６０３６０Ａ３号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。特定の態様では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８三重、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１及びＡｎｃ８２の配列は公知であり、ＡＡＶベクターを生成するために使用される場合がある。例えば、ＵＳ ７１８６５５２、国際公開第２０１７／１８０８５４， ＵＳ ７，２８２，１９９ Ｂ２， ＵＳ ７，７９０，４４９， ａｎｄ ＵＳ ８，３１８，４８０（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。多くのこのようなＡＡＶの配列は、上記に引用した米国特許第７，２８２，１９９ Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９号、米国特許第８
，３１８，４８０号、米国特許第７，９０６，１１１号、国際公開第／２００３／０４２３９７号、国際公開第／２００５／０３３３２１号、国際公開第／２００６／１１０６８９号、米国特許第８，９２７，５１４号、米国特許第８，７３４，８０９号；国際公開第２０１５０５４６５３Ａ３号、国際公開第２０１６０６５００１−Ａ１号、国際公開第２０１６１７２００８−Ａ１号、国際公開第２０１５１６４７８６−Ａ１号、米国特許第２０１０１８６１０３−Ａ１号、国際公開第２０１０１３８２６３−Ａ２号、及び国際公開第２０１６／０４９２３０Ａ１に提供され、並びに／又は、ジェンバンクから入手可能である。対応する方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶｒｈ１０様ベクターについて記載されている。国際公開第２０１７１００６７６Ａ１号；国際公開第２０１７１００６７４Ａ１号；及び国際公開第２０１７１００７０４Ａ１号を参照されたい。
本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、公知の技術を使用して生成される場合がある。例えば、国際公開第２００３／０４２３９７号；国際公開第２００５／０３３３２１号、国際公開第２００６／１１０６８９号；米国特許第７５８８７７２ Ｂ２号を参照されたい。このような方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；少なくともＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子から構成される発現カセット；並びにＡＡＶカプシドタンパク質への発現カセットのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。宿主細胞は、２９３細胞又は懸濁液２９３細胞である場合がある。例えば、本明細書に引用されるＺｉｎｎ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．，；Ｊｏｓｈｕａ Ｃ Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ＨＥＫ２９３ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｈａｒｖｅｓｔ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＧＭＰ ＦＩＸ ａｎｄ ＦＬＴ１ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｅｃｔｏｒ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１６ Ｆｅｂ； ２４（２）： ２８７-２９７． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１５ Ｎｏｖ ３． Ｐｒｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１５ Ｏｃｔ ６．
ｄｏｉ： １０．１０３８／ｍｔ．２０１５．１８７； Ｌａｕｒａ Ａｄａｍｓｏｎ−Ｓｍａｌｌ， ｅｔ ａｌ． Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１７ Ｆｅｂ １； ２８（１）： １-１４． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ
２０１７ Ｆｅｂ １． ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１５１； ＵＳ２０１６０２２２３５６Ａ１； ａｎｄ Ｃｈａｈａｌ ＰＳ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１４ Ｆｅｂ；１９６：１６３−７３． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２０１３．１０．０３８． Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｎｏｖ １３を参照されたい。
当業者に利用可能なｒＡＡＶを産生する他の方法が利用される場合がある。適切な方法は、バキュロウイルス発現システム（例えば、バキュロウイルス感染昆虫細胞システム）又は酵母による産生を含む場合があるが、これらに限定されない。例えば、国際公開第２００５０７２３６４Ａ２号；国際公開第２００７０８４７７３Ａ２号；国際公開第２００７１４８９７１Ａ８号；国際公開第２０１７１８４８７９Ａ１号；国際公開第２０１４１２５１０１Ａ１号；米国特許第ＵＳ６７２３５５１Ｂ２号； Ｂｒｙａｎｔ， Ｌ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｓｓｏｎｓ Ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｒｋｅｔ Ａｕｔｈｏｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｇｌｙｂｅｒａ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ， ２０１３； Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ． Ｋｏｔｉｎ， Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１１ Ａｐｒ １５； ２０（Ｒ１）： Ｒ２-Ｒ６． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１ Ａｐｒ ２９． ｄｏｉ： １０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１； Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ２００６ Ｄｅｃ ２０；９５（６）：１０８１−９２； ＳＡＭＩ Ｓ． ＴＨＡＫＵＲ， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ． Ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｆｌｏｒｉｄａ， ２０１２； Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｏ ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ−ｔｏ−Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１７ Ａｕｇ １０． ｐｉｉ： Ｓ１５２５−００１６（１７）３０３６２−３． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３． ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］； Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ，
ＯｎｅＢａｃ ２．０： Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１， ＡＡＶ２， ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１７ Ｆｅｂ；２８（１）：１５−２２． ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４．； Ｌｉ Ｌ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ−ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ： ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ６９８７９． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９． Ｐｒｉｎｔ ２０１３； Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ ｅｔ ａｌ， Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｊ
Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ． ２０１１ Ｊｕｌ；１０７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０−９３． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８； ａｎｄ Ｋｏｔｉｎ ＲＭ， Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２−６． ｄｏｉ： １０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１． Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９を参照されたい。
空及び完全粒子含有量を計算するために、選択された試料（例えば、本明細書の例では、イオジキサノール勾配精製調製物（ここで、ＧＣの数＝粒子の数））についてのＶＰ３バンド容量を、負荷されたＧＣ粒子に対してプロットする。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品のピークのバンド容量中の粒子数を計算する。次いで、負荷された２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割ると、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）が得ら
れる。Ｐｔ／ｍＬ−ＧＣ／ｍＬは、空のｐｔ／ｍＬを与える。空のｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛けると、空の粒子のパーセンテージを与える。
一般に、空のカプシド及びパッケージされたゲノムを有するＡＡＶベクター粒子についてアッセイするための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１９９９） ６：１３２２−１３３０； Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｔｈｅｒ． （２００３） ７：１２２−１２８を参照されたい。変性カプシドを試験するために、この方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することができるいずれかのゲル、例えば、緩衝剤中に３〜８％トリス−酢酸を含有する勾配ゲルからなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを泳動し、ゲルをナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくは、ナイロン上にブロットすることを含む。次いで、抗ＡＡＶカプシド抗体を、変性カプシドタンパク質、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ−２モノクローナル抗体に結合する一次抗体として使用する（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． （２０００）
７４：９２８１−９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出するための手段、より好ましくは、それに共有結合した検出分子、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を含有する抗ＩｇＧ抗体を含有する二次抗体が使用される。結合を検出するための方法は、一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために使用され、好ましくは、放射性同位体放出、電磁放射線、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットである。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、カラム画分からのサンプルを採取し、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝剤中で加熱し、カプシドタンパク質をプレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）上で分離した。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を使用して製造業者の説明書に従って銀染色を行い、又は他の適切な染色方法、すなわちＳＹＰＲＯルビー染色又はクーマシー染色を行う場合がある。一態様において、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって測定することができる。サンプルを希釈し、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の適切なヌクレアーゼ）で消化して、外因性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼの不活性化後、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを使用して、サンプルをさらに希釈し、増幅する。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ上の各サンプルについて、定義されたレベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に達するのに必要なサイクル数を測定する。ＡＡＶベクターに含まれるものと同一の配列を含むプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ−ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。サンプルから得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に正規化することによってベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用することができる。
一局面において、広域スペクトルセリンプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎから市販されているような））を利用する最適化ｑ−ＰＣＲ法が使用される。より詳細には、最適化ｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化後、サンプルをプロテイナーゼＫ緩衝剤で希釈し、プロテイナーゼＫで処理し、続いて熱不活性化することを除いて、標準アッセイと同様である。適切には、サンプルはサンプルサイズに等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝剤で希釈される。プロテイナーゼＫ緩衝剤は、２倍以上に濃縮される場合がある。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間で変化する場合がある。処理ステップは、一般に約５５℃で約１５分間行われるが、より長い時間（例えば、約２０分間〜約３０分間）にわたってより低い温度（例えば、約３７℃〜約５０℃）、又はより短い時間（例えば
、約５〜１０分間）にわたってより高い温度（例えば、約６０℃まで）で行われる場合がある。同様に、熱不活性化は、一般に約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げ（例えば、約７０〜約９０℃）、時間を延長する場合がある（例えば、約２０分間〜約３０分間）。次いで、サンプルを希釈し（例えば、１０００倍）、標準アッセイに記載されるようにＴａｑＭａｎ分析に供する。
さらに、又は代わりに、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用する場合がある。例えば、ｄｄＰＣＲによって一本鎖及び自己相補的ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ． Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ， Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５． ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１． Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
簡潔には、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ粒子をゲノム欠損ＡＡＶ中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶカプシド中間体を含む懸濁液を高速液体クロマトグラフィーにかけることを含み、ここで、ＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶ中間体は、高い（例えば、ＡＡＶ９については、ｐＨ１０．２）で平衡化された強力なアニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０での紫外線吸光度について溶出液を監視しながら塩勾配にかけられる。ｒＡＡＶ９については最適ではないが、ｐＨは、約１０．０〜１０．４の範囲である場合がある。この方法では、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に達したときに溶出される画分からＡＡＶフルカプシドを収集する。一態様では、親和性クロマトグラフィーステップのために、透析濾過された生成物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶ２／９親和性樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用する場合がある。これらのイオン性条件下では、有意な割合の残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質がカラムを通って流れる一方、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。
本明細書で使用される場合、用語「治療」又は「治療すること」は、ＤＭＤ及びＢＭＤを含むＭＤの１つ以上の症状の改善、全長ジストロフィンの所望の機能の回復、又は疾患のバイオマーカーの改善を目的とする組成物及び／又は方法を指す。いくつかの態様では、用語「治療」又は「治療すること」は、本明細書に示される目的のために本明細書に記載される１つ以上の組成物を対象に投与することを包含すると定義される。したがって、「治療」は、疾患を予防すること、疾患症状の重篤度を減少させること、それらの進行を遅延させること、疾患症状を除去すること、疾患の進行を遅延させること、又は所与の対象における治療の効力を増加させることの１つ以上を含み得る。本明細書で使用される場合、疾患という用語は、ＤＭＤ及びＢＭＤを含むＭＤ、又はいずれかの他のジストロフィン関連疾患を指す。
本明細書に記載されるベクター中の組成物は、本明細書全体にわたって記載される他の組成物、レジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）、局面、態様及び方法に適用されることが意図されることが理解されるべきである。
ＩＶ． 方法及びキット
他の態様では、骨格筋、心筋、及び／又は平滑筋を含む筋肉を標的化するための方法が所望される。これは、静脈内注射又は筋肉内注射を含む場合がある。しかしながら、他の送達経路が選択される場合がある。
特定の態様では、本発明の組成物は、心臓に対して特異的に標的化される（例えば、直接注射を介して）。特定の態様では、組成物又は心臓（例えば、心筋細胞）において特異的に発現する。心臓細胞を優先的に標的化するための、及び／又は非標的非心臓遺伝子導
入を最小限にするための方法が記載されている。例えば、Ｍａｔｋａｒ ＰＮ ｅｔ ａｌ， Ｃａｒｄｉａｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ： ａｒｅ ｗｅ ｔｈｅｒｅ ｙｅｔ？ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１６ Ａｕｇ；２３（８−９）：６３５−４８． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｇｔ．２０１６．４３． Ｅｐｕｂ ２０１６ Ａｐｒ ２９；米国特許出願公開第２００３０１４８９６８Ａ１号、米国特許第２００７００５４８７１Ａ１号、国際公開第２００００３８５１８Ａ１号、米国特許第７０７８３８７Ｂ１号、米国特許第６１６２７９６Ａ、及び国際公開第１９９４０１１５０６Ａ１を参照されたい。
特定の態様では、米国特許第７，３９９，７５０号のような方法を使用して、低体温の誘導、循環からの心臓の単離、及びほぼ又は完全な心停止によって、心臓における目的の遺伝子を保有するベクターの滞留時間を増加させる。浸透化剤は、この方法の必須成分であり、心臓細胞によるウイルスの取り込みを増加させるためにウイルスの投与中に使用される。この方法は、遺伝子発現が心筋に高度に特異的である場合があるウイルスベクターに特によく適しており、特にｒＡＡＶベクターの場合には、心筋炎症の徴候を伴わずに、発現が長期間維持される場合がある。例えば、米国特許第８，６４２，７４７号、米国特許第２０１１−０１１２５１０号に記載されているような「バイオペースメーカー」を含むが、これに限定されない、さらに別のシステム及び技術を使用する場合がある。
一態様では、国際公開第２００５０２７９９５Ａ２号に記載されているグローバルな心筋灌流法により送達が達成される。別の態様では、送達は、２００４年９月２４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１３２２号に記載される遺伝子導入方法によって達成される。簡潔には、この方法は、対象の微小血管系の領域を失血させることによって、本発明のマイクロユートロフィンを筋肉細胞に移し、心臓及び肺の保護に必要な潅流カニューレ及びバルーンの構成を使用して、高静水圧下でこの領域に複合体を送達して、潅流の間、器官をタンパク質化することを含む。対象に挿入される大動脈又は血管の実質的に全長にわたって延在するバルーンを有するバルーンカテーテルが、ベクターの全身送達における使用のために提供される。さらに別の態様では、本発明は、潅流回路を介した送達を提供し、心肺バイパス手術中に、インサイチュで対象の心臓に物質を送達するための外科的方法を提供する。潅流回路は、外科手術中に、高分子複合体を含有する溶液が、冠状動脈循環回路を介して対象の心臓を通して再循環するための経路を画定し、物質が対象の他の器官に送達されるのを防止する。
一局面において、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列、発現カセット、又は製剤緩衝剤（すなわち、ビヒクル）中にこのような核酸配列を含むベクターを含む医薬組成物が、本明細書に提供される。一態様では、製剤は、水性懸濁液に溶解した界面活性剤、保存剤、賦形剤、及び／又は緩衝剤をさらに含む。一態様では、緩衝剤はＰＢＳである。緩衝食塩水、界面活性剤、及び約１００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）〜約２５０ｍＭ塩化ナトリウムに等しいイオン強度に調整された生理学的に適合性の塩若しくは塩の混合物、又は等価なイオン濃度に調整された生理学的に適合性の塩：のうちの１つ以上を含むものを含む種々の適切な溶液が知られている。適切には、製剤は、生理学的に許容され得るｐＨ、例えば、ｐＨ６〜８、又はｐＨ６．５〜７．５、ｐＨ７．０〜７．７、又はｐＨ７．２〜７．８の範囲に調整される。
適切な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択される場合がある。一態様では、第１級水酸基で終結する二官能性ブロックコポリマー界面活性剤、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８としても知られるＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン
（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド）の中央疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（Ｍａｃｒｏｇｏｌ−１５ ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリルグリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールが選択される場合がある。一態様では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、通常、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）と、続く３桁で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子量を与え、最後の桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量を与える。一態様では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の約０．０００５％〜約０．００１％までの量で存在する場合がある。
一例では、製剤は、水中に、例えば、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの混合物のうちの１つ以上を含む緩衝食塩水溶液を含む場合がある。適切には、髄腔内送達について、浸透圧は、脳脊髄液と適合性のある範囲内（例えば、約２７５〜約２９０）である；例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６−ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意的に、髄腔内送達のために、市販の希釈剤を懸濁剤として、又は別の懸濁剤及び他の任意的な賦形剤と組み合わせて使用する場合がある。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。
他の態様では、製剤は、１つ以上の透過促進剤を含む場合がある。適切な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウレルエーテル、又はＥＤＴＡを含む場合がある。
本明細書で使用される場合、「担体」は、いずれかの及びすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーディング、希釈剤、抗菌剤、及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。医薬活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。補助的な活性成分もまた、この組成物に組み込まれ得る。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルは、適切な宿主細胞への本発明の組成物の導入のために使用される場合がある。特に、ｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、又はナノ粒子などのいずれかにカプセル化された送達のために処方される場合がある。一態様では、治療有効量の前記ベクターが医薬組成物に含まれる。担体の選択は、本発明を限定するものではない。他の従来の薬学的に許容され得る担体、例えば保存剤、又は化学安定剤。適切な例示的な保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールを含む。適切な化学安定剤は、ゼラチン及びアルブミンを含む。
「薬学的に許容され得る」という語句は、宿主に投与された場合にアレルギー又は同様の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「投与量」又は「量」は、治療の過程で対象に送達される全投与量若しくは量、又は単一単位（又は複数単位若しくは分割投与量）投与で送達される投与量若しくは量を指すことができる。
また、ベクター組成物は、約１．０×１０９粒子〜約１．０×１０１８粒子（１人の対象を治療するため）、好ましくは、ヒト患者の場合、１．０×１０１２粒子〜１．０×１０１４粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）の範囲内の量のベクターを含むように、投与量単位で処方することができる。一態様では、組成物は、用量当たり、少なくとも１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、又は９ｘ１０９粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）を含むように処方される。別の態様では、組成物は、用量当たり、少なくとも１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０、又は９ｘ１０１０粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）を含むように処方される。別の態様では、組成物は、用量当たり、少なくとも１ｘ１０１１、２ｘ１０１１、３ｘ１０１１、４ｘ１０１１、５ｘ１０１１、６ｘ１０１１、７ｘ１０１１、８ｘ１０１１、又は９ｘ１０１１粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）を含むように処方される。別の態様では、組成物は、用量当たり、少なくとも１ｘ１０１２、２ｘ１０１２、３ｘ１０１２、４ｘ１０１２、５ｘ１０１２、６ｘ１０１２、７ｘ１０１２、８ｘ１０１２、又は９ｘ１０１２粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）を含むように処方される。別の態様では、組成物は、用量当たり、少なくとも１ｘ１０１３、２ｘ１０１３、３ｘ１０１３、４ｘ１０１３、５ｘ１０１３、６ｘ１０１３、７ｘ１０１３、８ｘ１０１３、又は９ｘ１０１３粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）を含むように処方される。別の態様では、組成物は、用量当たり、少なくとも１ｘ１０１４、２ｘ１０１４、３ｘ１０１４、４ｘ１０１４、５ｘ１０１４、６ｘ１０１４、７ｘ１０１４、８ｘ１０１４、又は９ｘ１０１４粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）を含むように処方される。別の態様では、組成物は、用量当たり、少なくとも１ｘ１０１５、２ｘ１０１５、３ｘ１０１５、４ｘ１０１５、５ｘ１０１５、６ｘ１０１５、７ｘ１０１５、８ｘ１０１５、又は９ｘ１０１５粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）を含むように処方される。別の態様では、組成物は、用量当たり、少なくとも１ｘ１０１６、２ｘ１０１６、３ｘ１０１６、４ｘ１０１６、５ｘ１０１６、６ｘ１０１６、７ｘ１０１６、８ｘ１０１６、又は９ｘ１０１６粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）を含むように処方される。別の態様では、組成物は、用量当たり、少なくとも１ｘ１０１７、２ｘ１０１７、３ｘ１０１７、４ｘ１０１７、５ｘ１０１７、６ｘ１０１７、７ｘ１０１７、８ｘ１０１７、又は９ｘ１０１７粒子（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）を含むように処方される。一態様では、ヒトへの適用のために、用量は、１×１０１０〜約１×１０１２粒子／用量（その範囲内のすべての整数又は分数量を含む）の範囲であり得る。一態様において、対象は、治療有効量の本明細書に記載されるベクターを送達される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、有効性を達成するのに十分な量の酵素を標的細胞中に送達及び発現するジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物の量を指す。又は「治療有効量」は、対象に送達するジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質を含む組成物の量を指す。一態様では、ベクターの投与量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０９粒子（例えば、ゲノムコピー、ＧＣ）〜体重１ｋｇ当たり約１×１０１６粒子（その範囲内及び終点内のすべての整数又は分数量を含む）である。別の態様では、投与量は、体重１ｋｇ当たり１×１０１０粒子〜体重１ｋｇ当たり約１×１０１３粒子である。
ベクターの投与量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重及び健康などの因子に依存し、したがって、患者間で異なる場合がある。例えば、ベクターの治療的に有効なヒト投与量は、一般に、約１×１０７〜１×１０１６ゲノム又は粒子ベクターの濃度を含む溶液約１ｍｌ〜約１００ｍｌである。投与量は、いずれかの副作用に対する治療的利益のバランスをとるように調節され、このような投与量は、組換えベクターが使用される治療的用途に応じて変化する場合がある。導入遺伝子の発現レベルを監視して、ベクター、好ましくは、ミニ遺伝子を含むＡＡＶベクターを生じる投薬頻度を決定することができる。
任意的に、治療目的のために記載される投薬レジメンと同様の投薬レジメンが、本発明の組成物を使用する免疫化のために利用される場合がある。
任意的に、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質（例えば、ナノユートロフィン又はナノジストロフィン）又はジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質を発現するベクターによる治療法を、他の治療法と組み合わせることができる。
ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質（例えば、ナノユートロフィン又はナノジストロフィン）の発現は、免疫蛍光染色及び免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）によって検出される場合がある。ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質（例えば、ナノユートロフィン又はナノジストロフィン）療法は、筋線維細胞膜上の欠損したＤＡＰ複合体を測定することによって監視される場合があり、該ＤＡＰ複合体は、ジストロフィンの一次欠損のために、典型的には、未治療のジストロフィン筋では見出されないサルコグリカン複合体を含む。あるいは、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質（例えば、ナノユートロフィン又はナノジストロフィン）療法は、筋肉が病理学的表現型から保護されることを評価することによって監視することができる。
一局面において、本発明は、臨床医又は他の職員による使用のためのキットを提供する。典型的には、このようなキットは、本発明の変異体タンパク質又はベクター、及び任意的に、その再構成及び／又は送達のための説明書を含む。別の態様では、キットは、生理学的に適合性の生理食塩水溶液中に変異体タンパク質又はベクターを含み、任意的に、希釈のための説明書を含み、本明細書に記載の方法を実施する。
本発明のキットはまた、記載されるように（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３０４６３号、又は２００４年９月２４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１３２２号に記載される遺伝子導入方法によって）、酸素輸送剤並びに／又は体外循環支持体及び酸素化システムの少なくとも１つの使い捨て要素を容易にするためのバルーンカテーテルを含む場合がある。例えば、少なくとも１つの使い捨て要素は、中空本体と、本体の内部と流体連通する液体入口と、本体の内部と流体連通する液体出口と、気体を気体チャンバの内部に提供する気体入口と、気体チャンバを本体の内部から分離する少なくとも１つの気体透過性膜と、気体が気体チャンバから出ることを可能にする気体出口とを有する人工肺であってもよく、それによって、本体の内部の流体と気体チャンバ内の気体との間の気体交換が可能になる。人工肺は、米国特許第６，１７７，４０３号に記載のように構成される場合があり、ここでは、気体透過性膜は、管の少なくとも一部内に延在するＰＴＦＥ管を含み、気体チャンバは、ＰＴＦＥ管の内部を含む。
本明細書に記載される方法及びキットにおける組成物は、本明細書全体にわたって記載される他の組成物、レジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）、局面、態様及び方法に適用されることが意図されることが理解されるべきである。
用語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を指す。そのように、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能に使用される。
「含む」及び「含むこと」という言葉は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「からなる」、「からなること」、及びその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書における様々な態様は、「含むこと」という言語を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する態様は、「からなること」又は「から本質的になること」という言語を使用して解釈及び記載されることも意図される。
用語「約」は、特に明記しない限り、±１０％を含む範囲内の変動を包含する。
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって、及び本出願で使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する公開されたテキストを参照することによって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
ジストロフィンの一次構造及びＤＭＤより軽症の疾患ＢＭＤの分子基盤は、ＤＭＤにおける治療のためのより小さく、部分的に機能的なタンパク質を構築する概念的に単純な手段を示唆した。ジストロフィンの長い反復ドメインの単一の連続部分の内部欠失を用いて、正常では、全長ジストロフィンによって占有される細胞のアドレスに局在するＢＭＤ様部分長ジストロフィンバリアントを達成し、それによってジストロフィンの重要な生理学的機能を部分的に置換した。ジストロフィンが分子「ショック吸収材」として働くという見解に基づき、タンパク質の全長がこの役割の正常な機能に必要であると広く考えられていた。予想された結果は、適切な試験の下で、この全クラスの組換えタンパクは、ＤＭＤ患者にＢＭＤ様の表現型を与えるであろうということであった。体細胞送達された部分長の組換えジストロフィンのいずれも、前臨床試験で最も感度の高い病理学的アッセイを完全に標準化していず、いくつかのチームによって臨床開発のために準備されたベクターがＤＭＤの疾患進行速度を、せいぜい一時的に「ベッカー化」することを示唆している。野生型ジストロフィンよりも短い及び長いベッカー型筋ジストロフィ（ＢＭＤ）の両方が、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）において重篤な疾患と関連し得、ジストロフィンの機械的役割は、長さ依存性の「ショック吸収材」のそれほど単純ではないことを示している。デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィーにおけるこのような遺伝子型／表現型相関は、Ｄｐ４２７（ジストロフィンパラログユートロフィンの潜在的に非免疫原性の誘導体を含む）の低分子量代替物の開発の出発点として役立った。ジストロフィン及びユートロフィンのメカノバイオロジーに関する新たな洞察に基づいて、本発明者らは、上述したＤＭＤ特異的限界に対処する上で、以前に研究された遺伝子治療の有効性と安全性に取って代わるように、患者に送達することができる、ユートロフィン又はジストロフィンバリアントを開発した。
実施例１：タイチンの進化は、運動能力（ｌｏｃｏｍｏｔｉｖｅ ｐｏｗｅｒ）のスケーラビリティと相関するが、ジストロフィンは相関しない
Ａ． 結果と考察
大型動物では、急速な運動は、必ず筋節ミオシンによって駆動されるが、最も速く移動する単細胞真核生物及び最も早い分枝動物系統は、繊毛ダイニンを優勢な運動力源として使用する（（Ｃｏｌｉｎ， Ｓ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅａｌｔｈ ｐｒｅｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｄａｔｏｒｙ ｓｕｃｃｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｔｅｎｏｐｈｏｒｅ Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｓ ｌｅｉｄｙｉ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０７， １７２２３−１７２２７ （２０１０）； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｔｒｉｃｈｏｐｌａｘ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｐｌａｃｏｚｏａｎｓ．
Ｎａｔｕｒｅ ４５４， ９５５−９６０ （２００８）； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，
Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ａｍｐｈｉｍｅｄｏｎ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃａ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ ４６６， ７２０−７２６ （２０１０）； Ｒｙａｎ，
Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｔｅｎｏｐｈｏｒｅ Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｓ ｌｅｉｄｙｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２，
１２４２５９２， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４２５９２ （２０１３）； ａｎｄ Ｍｏｒｏｚ， Ｌ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｔｅｎｏｐｈｏｒｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５１０， １０９−１１４， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３４００ （２０１４））。ダイニンからミオシンへの進化的転移を駆動する選択圧は、これらの運動が最大出力密度を達成するオルガネラによって課される幾何学的制約を反映しなければならず、筋節は３次元スケーリングに従うが、繊毛は従わない。この極めて重要な転移の分子的基礎は、あまり理解されていない。本明細書では、筋節の出現が、脊索動物のタイチンとオルソロガスなタンパク質を含む大量のポリ−ＩｇＧ反復の系統学的に再構築された出現と相関するのに対し、ジストロフィン及びそれに関連する膜結合糖タンパク質の複合体は、初期の分枝系統の分岐前に漸次発生したことを示す。本発明者らは、推測された祖先のタイチン上位遺伝子構造を保持する無脊椎動物種を同定し、これまで遺伝子オルソロジーを不明瞭にしていた遺伝子再編成の統一見解と、放射対称性と両側対称性を有する動物における筋節の共通起源を提供した。驚くべきことに、遺伝子構造は、ジストロフィンのロッドドメインの異常な大きさが、筋節夜明け前に長さを増すための選択が起こった、パラロガスなクラスの微小管結合タンパク質の歴史的遺産を反映しているという説得力のある証拠を提供している。これらの知見は、ジストロフィンのメカノバイオロジー及び筋ジストロフィーにおける治療的使用のための小型化タンパク質の設計に決定的な意味を持つ（実施例２及び３）。本発明者らの再構築は、細胞形態とボディープランの幾何学的制約がミオシンが迅速でスケール非依存性の運動を駆動するのに必要な密度で筋節に安全にアレイできる前に、皮質細胞骨格と細胞外マトリックスの間の強力ではあるが柔軟な連結を必要とすることを示唆する。
タイチンは、ヒトのプロテオーム中で最大のタンパク質であり、筋節形成のための一次足場として単量体の形で役立つ（Ｚｏｇｈｂｉ， Ｍ． Ｅ．， Ｗｏｏｄｈｅａｄ， Ｊ． Ｌ．， Ｍｏｓｓ， Ｒ． Ｌ． ＆ Ｃｒａｉｇ， Ｒ． Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｃａｒｄｉａｃ
ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｓｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５， ２３８６−２３９０， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７０８９１２１０５ （２００８）；及びＫｏｎｔｒｏｇｉａｎｎｉ−Ｋｏｎｓｔａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ， Ａ．， Ａｃｋｅｒｍａｎｎ， Ｍ． Ａ．， Ｂｏｗｍａｎ， Ａ． Ｌ．， Ｙａｐ， Ｓ． Ｖ． ＆ Ｂｌｏｃｈ， Ｒ． Ｊ． Ｍｕｓｃｌｅ ｇｉａｎｔｓ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｉｎ ｓａｒｃｏｍｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ８９， １２１７−１２６７， ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．０００１７．２００９ （２００９））。脊椎動物では、タイチンは、各々Ｚ帯とＭ線内に独特のＮ末端とＣ末端を有する「スーパー反復」に編成された免疫グロブリン（ＩｇＧ）及びフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインから主に構成されている。しかしながら、以前に無脊椎動物種で同定されたタイチン様タンパク質は、数、一次構造、ドメイン組成、及び長さが大きく異なり、機能的オルソロジーの描写を複雑にしている（Ｔｓｋｈｏｖｒｅｂｏｖａ， Ｌ． ＆ Ｔｒｉｎｉｃｋ， Ｊ． Ｔｉｔｉｎ： ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｆａｍｉｌｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４， ６７９−６８９ （２００３））。本発明者らの知見は、この一般構造の「祖先タイチンスーパー遺伝子」が広範な系統特異的ゲノム再配列とモジュラー反復拡大を受けていることを示している。
脊椎動物では、仕事量下での横紋筋線維の生存性は、最も外側の筋節と細胞外マトリックスとの間のジストロフィン依存性の機械的結合によって付与される膜保護に依存している（Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｅ． Ｐ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｈ．， Ｊｒ． ＆ Ｋｕｎｋｅｌ， Ｌ． Ｍ． Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ： ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄ
ｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｌｏｃｕｓ． Ｃｅｌｌ ５１， ９１９−９２８， ｄｏｉ：００９２−８６７４（８７）９０５７９−４ ［ｐｉｉ］ （１９８７））。ジストロフィンの分子量の約７５％は、２４個のスペクトリン反復ドメインから構成される大きな中央「ロッドドメイン」によって寄与され、隣接するドメインは、反対側の末端で接着接触を確立する（図６Ａ；データは示さず）。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）患者は、ロッドドメインをコードするエキソンに限局した切断欠失又は延長重複のいずれかを有する可能性があり、ジストロフィンの生理学的機能が２４の反復で最適化されているかどうかという疑問を投げかけている。本発明者らは、ジストロフィンオルソログにおけるスペクトリン様反復の数が、後生動物の系統発生を通して選択圧力下で増殖し、おそらく階層的捕食性食物連鎖の進化の間の選択された分類群における出力の増加と相関するかどうかを尋ねた。示されるように（図６Ｃ）、刺胞動物−左右相称動物の分割前に存在する祖先ジストロフィンは、ヒトにおけるロッドドメインと同一の長さのロッドドメインを有すると予測されるが、本発明者らは、初期のオルソログにおいて有意に短いロッドについての証拠を見出すことができなかった。興味深いことに、本発明者らの系統分析から、膜貫通型ジストロフィン関連タンパク質複合体は、後生動物の多細胞性よりもはるかに早く出現し、ほぼすべての疾患に関与する成分のオルソログが単細胞姉妹群から後生動物に存在するという強力な証拠が得られた（データは示さず）。最も初期の祖先ジストロフィンオルソログは、Ｎ末端アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）及びロッドドメイン全体の両方を欠き、推定上のジストログリカン結合性Ｃ末端「ＷＷ−ＥＦ−ＺＺ」ドメインのみからなっていた（図６Ａ、図６Ｅ；データは示さず）。「現代の」ジストロフィンオルソログ（すなわち、Ｎ末端ＡＢＤ及び細長いロッドドメイン）を有する最も初期の分岐系統は、プラコゾアン種Ｔ．アドヒレン（Ｔ． ａｄｈｅｒｅｎｓ）であり、ロッドドメインは、ヒトのものと同様のサイズである（データは示さず）。したがって、ジストロフィンは、タイチンのＩｇＧ拡張及び筋節の出現の前に「全長」であった；しかしながら、ロッドドメインの進化系統は、相同タンパク質間の有意な配列の相違が「長い分岐誘引」アーチファクトを招くので、これまで未解決である。
本発明者らは、配列内の個々のアミノ酸又はヌクレオチドよりもゆっくり進化する祖先形質状態：コードされたタンパク質ドメインに対する隠れマルコフモデルに対するイントロンの位置及び相を同定することにより、この問題に取り組んだ。本発明者らは、ジストロフィン及びＭＡＣＦ１のスペクトリン反復がＨＭＭコンセンサス位置４６において視覚的に顕著なパターンで保存された相０イントロンを共有し、スペクトリン遺伝子の無作為に分布したイントロンとは著しく対照的であることを発見した（図６Ａ及び図６Ｂ）。関連するイントロンの位置の進化的停滞の図解は、遠縁の種のオルソロガスな遺伝子で共有されているものだけを描くことによって強調されている（例えば、１３反復によってβ重スペクトリンＯＲＦを拡張した先祖の部分的遺伝子重複の証拠に注目）（図６Ｂ）。このロッドドメイン形質状態分析は、β−スペクトリンではなくＭＡＣＦオルソログを、ジストロフィンＣＨ及びロッドドメインの近接ドナーとして同定し、この分岐群についての名称「ジストロプラキン」を示唆する（図６Ｃ）。遺伝子構造は、祖先ＭＡＣＦ１様スペクトロプラキンのＮ末端部分をコードする遺伝子の部分的重複が祖先Ｄｐ７１様（ＷＷ−ＥＦ−ＺＺ）ジストロフィンオルソログをコードする遺伝子にシスで連結された場合に、ジストロフィンが進化的に発生したという強力な証拠を構成する。選択された系統の巨大ＭＡＣＦオルソログでは、スペクトリン反復をコードするエキソンの最近の縦列重複の証拠がある。このことは、微小管−アクチン架橋「支柱」の細胞状況において、ロッドドメインの進行性延長のための選択圧が生じたが（いくつかの系統では続いている）、ジストロフィンそれ自体では生じなかったという再構築を支持している。
タイチン及びジストロフィンにおける反復ドメインの分子進化を比較すると、重要な対比が明らかになった。ドットマトリックスは、おそらく、全体のタンパク質が筋節形成を
促進するのに十分な長さである限り、相互に交換可能な局所的な縦列増殖に基づいた、タイチンＩｇＧ及びＦｎ３反復領域の系統特異的な「トレッドミリング」の証拠を明らかにしている（データは、示していない）。ジストロフィンオルソログの中で、個々のスペクトリン反復の類似したターンオーバーはほとんど存在しなかったように思われ、これに対する少なくとも６億年間の強い負の選択を示唆している（データは示さず）。これらの結果に基づいて、本発明者らは、縦方向力伝達におけるタンパク質の役割を反映した、ジストロフィンのスペクトリン反復の非交換性のモデルを提案した。それにより、隣接するスペクトリン反復間のアミノ酸相互作用は、引張強度を維持するために進化的結合（Ｈｏｐｆ， Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏ−ｖａｒｉａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５， １２８− １３５， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３７６９
（２０１７））によって保存されなければならない（データは示されず）。このモデルでは、祖先的に隣接したパートナー（ＢＭＤ病因において観察可能なように）と結合したアミノ酸進化を以前に受けていた多様なスペクトリン様反復の、内部遺伝子欠失又は重複によって、精製選択が新規の並列に対抗してきた。この祖先現象の再構築は、スペクトリン及びプラキンによって提供される多様な鋳型に基づいてジストロフィンロッドドメインの隣接三重らせんの選択的相同モデルを対比することによってさらに支持される。（データは示さず）。言い換えれば、ジストロフィンの分子進化は、ロッドドメインの引張強度がその長さよりも重要であり、長さはその歴史的遺産の副産物であるという提案と一致する。膜貫通力伝達の問題に対する構造的に冗長な祖先の解決策を永続化するための代謝コストは、細胞骨格皮質の極薄の縁へのタンパク質の局在化のために、取るに足らないほど小さい。この概念は、実施例２及び３で詳細に示すように、疾患治療のための導入遺伝子の設計に決定的な意味を有する。
Ｂ． 材料及び方法：
ＲＮＡ−Ｓｅｑ：ネマトステラ・ベクテンシス（Ｎｅｍａｔｏｓｔｅｌｌａ ｖｅｃｔｅｎｓｉｓ）の参照トランスクリプトームは、ＪＧＩゲノムアセンブリによって発表された元のクラスター化ＥＳＴから（Ｐｕｔｎａｍ， Ｎ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅａ ａｎｅｍｏｎｅ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｅｕｍｅｔａｚｏａｎ ｇｅｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７， ８６−９４ （２００７））、Ｆｉｎｎｅｒｔｙ Ｌａｂフィンナーティ・ラボ［Ｌｕｂｉｎｓｋｉ， ｅｔ ａｌ．，改訂版］によって産生された（ＮＪ３株）、米国ニュージャージー州Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡに由来するクローン系統から産生されたトランスクリプトームと共に組み立てられた。１００％の配列同一性のカットオフを有するＣＤ−ＨＩＴを用いて、冗長なコンティグをマージされたアセンブリから除去した。
基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）検索：予め設定されたパラメーター（ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、期待Ｅ値閾値：１０、ギャップコスト存在：１１、ギャップコスト拡張：１）を用いて、ＢＬＡＳＴｐ及び／又はｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを用いてゲノムをブラストした。全長ホモログが同定されなかった場合、最高得点の部分長ヒットを囲むゲノム領域をダウンロードし、ｄｅ ｎｏｖｏ遺伝子モデリングを実施した（遺伝子モデリング法のセクションを参照）。トランスクリプトームは、トランスクリプトームショットガンアセンブリ（ＴＳＡ）データベースに対してｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを用いてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴサーバーから、再び予め設定されたパラメーターを用いてブラストした。
遺伝子モデリング：対応するＲＮＡｓｅｑデータがない場合、タンパク質コード遺伝子モデルは、検討中の種に最も近縁な列挙された生物の生物特異的遺伝子発見パラメーターを用いて、ＦＧＥＮＥＳＨスイート（ｗｗｗ．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ）のプログラ
ムから導き出した。
タンパク質ドメイン分析：タンパク質ドメインを、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｈｍｍｅｒ／−ｓｅａｒｃｈ／ｈｍｍｓｃａｎ）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＨＭＭｓｃａｎ機能を使用して、Ｐｆａｍ、ＴＩＧＲＦＡＭ、ＣＡＴＨ−Ｇｅｎｅ３Ｄ、Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、及びＰＩＲＳＦタンパク質ファミリーＨＭＭデータベースに対して一次アミノ酸配列を実行することによって分析した（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｈｍｍｅｒ／−ｓｅａｒｃｈ／ｈｍｍｓｃａｎ） （Ｆｉｎｎ， Ｒ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． ＨＭＭＥＲ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ： ２０１５ ｕｐｄａｔｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３， Ｗ３０−３８， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ３９７ （２０１５））。
イントロンの位置／相の同定のためのスペクトリン反復アライメント：すべてのＰｆａｍプロファイル−ＨＭＭ同定可能スペクトリン反復ドメインをＨＭＭｓｃａｎ内のＰｆａｍスペクトリン反復コンセンサス配列に整列させた。これらのスペクトリン反復を、コンセンサス配列に対するそれらのアラインメントに従って、複数の配列アラインメントに連続的に整列させた。
イントロン位置／相の同定：ＯＲＦ注釈付きｃＤＮＡ配列を、９４％配列同一性カットオフを用いて、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ｖ１５．１）（ｍａｃｖｅｃｔｏｒ．ｃｏｍ）のドットマトリックス機能を使用して、それらのコードするゲノム足場に整列させた。イントロンの位置及び相の各々は、アラインメントの切断点として同定された。各イントロン位置及び相は、各１００％同一性整列ブロックの直後及び直前のゲノムＤＮＡ配列内に各々存在するコンセンサススプライス部位ドナー（−ＧＴ）及びアクセプター部位（ＡＧ−）の存在によって確認した。
推測される祖先イントロンの同定：推測される祖先イントロンは、Ｈ．サピエンス（Ｈ． ｓａｐｉｅｎｓ）とＡ． クイーンズランディカ（Ａ． ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃａ）又はＮ．ベクテンシス（Ｎ． ｖｅｃｔｅｎｓｉｓ）のいずれかのオルソロガスタンパク質間で共有されるものである。
ドットマトリックス：ｃＤＮＡ／ＤＮＡ、タンパク質／ゲノムＤＮＡ、及びタンパク質／タンパク質ドットマトリックスを、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ｖ１５．１）（ｍａｃｖｅｃｔｏｒ．ｃｏｍ）内で作製した。
ジストロフィンスペクトリン反復の相同性モデリング：Ｐｈｙｒｅ２を用いて、ヒトジストロフィンからの隣接スペクトリン反復をモデル化した（ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｈｙｒｅ２／ｈｔｍｌ／ｐａｇｅ．ｃｇｉ？ｉｄ＝ｉｎｄｅｘ） （Ｋｅｌｌｅｙ， Ｌ． Ａ．， Ｍｅｚｕｌｉｓ， Ｓ．， Ｙａｔｅｓ， Ｃ． Ｍ．， Ｗａｓｓ， Ｍ． Ｎ． ＆ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ， Ｍ． Ｊ． Ｔｈｅ Ｐｈｙｒｅ２ ｗｅｂ ｐｏｒｔａｌ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ， ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １０， ８４５−８５８， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０５３ （２０１５））。明確な相同性モデルは、相同性モデルの鋳型としてのβ２−スペクトリン（ＰＤＢ−ＩＤ＝３ＥＤＶ）（Ｄａｖｉｓ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｋｙｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｂｅｔａ２−ｓｐｅｃｔｒｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４， ６９８２−６９８７， ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ８０９２４５２００ （２００９））又はプレクチン（ＰＤＢＩＤ ＝ ５Ｊ１Ｇ） （Ｏｒｔｅｇａ， Ｅ． ｅｔ ａｌ
． Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｋｉｎ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｐｌｅｃｔｉｎ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｒｏｄ−ｌｉｋｅ Ｓｈａｐｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９１， １８６４３−１８６６２， ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１６．７３２９０９ （２０１６））のいずれかの結晶構造を使用して生成した。
データの入手可能性：本稿の所見を裏付けるために用いた配列データを補足情報に提供する。他のすべてのデータは、依頼に応じて対応する著者から入手可能である。
実施例２−ＡＡＶを介したマイクロユートロフィンの送達を用いた筋ジストロフィーの効果的な遺伝子治療
Ａ． 結果と考察
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子の必須タンパク質生成物は、ジストロフィー（Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｅ． Ｐ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｈ．， Ｊｒ． ＆
Ｋｕｎｋｅｌ， Ｌ． Ｍ． Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ： ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｌｏｃｕｓ． Ｃｅｌｌ ５１， ９１９−９２８， ｄｏｉ：００９２−８６７４（８７）９０５７９−４ ［ｐｉｉ］ （１９８７））、及びロッド様４２７ｋｄタンパク質（Ｋｏｅｎｉｇ， Ｍ．， Ｍｏｎａｃｏ， Ａ． Ｐ． ＆ Ｋｕｎｋｅｌ， Ｌ． Ｍ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ
ｐｒｅｄｉｃｔｓ ａ ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｅｌｌ ５３， ２１９−２２６ （１９８８））であり、これは、皮質細胞骨格を細胞外マトリックスに結合することによって（Ｉｂｒａｇｈｉｍｏｖ−Ｂｅｓｋｒｏｖｎａｙａ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｌｉｎｋｉｎｇ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ． Ｎａｔｕｒｅ ３５５， ６９６−７０２， ｄｏｉ：１０．１０３８／３５５６９６ａ０ （１９９２））横紋筋細胞を収縮による損傷から保護する（Ｐｅｔｒｏｆ，
Ｂ． Ｊ．， Ｓｈｒａｇｅｒ， Ｊ． Ｂ．， Ｓｔｅｄｍａｎ， Ｈ． Ｈ．， Ｋｅｌｌｙ， Ａ． Ｍ． ＆ Ｓｗｅｅｎｅｙ， Ｈ． Ｌ． Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ
ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ ｆｒｏｍ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０， ３７１０−３７１４ （１９９３））。ＤＭＤ患者のほとんどは、マルチエキソンフレームシフト欠失を有する一方で、より軽度の対立遺伝子疾患ベッカー型ＭＤを有する多くは、ジストロフィンの１５０ｎｍロッドドメインの長さを変更するフレーム保存変異を有する（Ｍｏｎａｃｏ， Ａ． Ｐ．， Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎ， Ｃ． Ｊ．， Ｌｉｅｃｈｔｉ−Ｇａｌｌａｔｉ， Ｓ．， Ｍｏｓｅｒ， Ｈ． ＆ Ｋｕｎｋｅｌ， Ｌ． Ｍ． Ａｎ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌ
ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＤＭＤ ｌｏｃｕｓ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２，
９０−９５ （１９８８）； ａｎｄ Ｋｏｅｎｉｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｖｅｒｓｕｓ Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ． Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５， ４９８−５０６ （１９８９））。ジストロフィンの深い進化の歴史を分析した結果、ロッドドメインは、より長い細胞骨格タンパク質から共選択され、強力な横紋筋の出現に先立って生じたことが示唆された（実施例１）。ここで、本発明者らは、小型化されたロッドドメインの引張強度
を保存するために、パラログタンパク質ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ， Ｊ． Ｍ．
ｅｔ ａｌ． Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ ３６０， ５９１−５９３， ｄｏｉ：１０．１０３８／３６０５９１ａ０ （１９９２））から合理的に設計された、ジストロフィンの非免疫原性２５ｎｍ代替物をコードするコドン最適化合成導入遺伝子が、動物モデルにおける筋ジストロフィーの最も有害な組織学的及び生理学的側面を妨げることを示す。新生仔ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスにＡＡＶベクターを全身投与した後、筋壊死及び再生のすべての組織学的及び生化学的マーカーは、成体体重までの成長を通して完全に抑制される。最大４ｋｇ体重で同様に治療したジストロフィン欠損イヌでは、導入遺伝子の全身分布及び発現により、タンパク質産物の細胞性免疫認識を有さずに筋壊死が予防され、全長ユートロフィンに対する中枢性免疫寛容による防御が示唆された。これらの知見は、引張強度がジストロフィン及びユートロフィンロッドの本質的な特徴であり、ほとんどの系統において１５０ｎｍの長さが、強度を犠牲にして長さを減少させる変異に対する選択を精製することによって保存されるモデルを支持する。
ヒトアデノウイルスに由来する内部欠失ベクターは、全長ジストロフィンをコードする１２ｋｂ ｃＤＮＡの体細胞移入を達成するために使用されているが、このアプローチは、複合ベクターカプシドの免疫原性及び限定された生体分布のために放棄されている（Ｃｌｅｍｅｎｓ， Ｐ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｕｓｃｌｅ ｇｅｎｅ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｗｉｔｈ
ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｌａｃｋｓ ａｌｌ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅｓ． Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ３， ９６５−９７２ （１９９６））。ヒトアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する複数のベクターは、全身性遺伝子導入を容易にすることが示されている（Ｗａｎｇ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９７， １３７１４−１３７１９． （２０００）； Ｈａｒｐｅｒ， Ｓ． Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｄｕｌａｒ
ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ８， ２５３−２６１． （２００２）； Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ
ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｓｔｒｉａｔｅｄ ｍｕｓｃｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １０， ８２８−８３４ （２００４）； 及びＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ｒＡＡＶ６−ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄｓ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｉｃｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １２， ７８７−７８９ （２００６））が、そのクローニング能は、野生型ウイルス、約５ｋｂのものに限られている。ＤＭＤの遺伝子治療に関する同様に重要な第２の制約は、ほとんどの患者におけるタンパク質欠損の欠失性であり、「非自己」タンパク質としての組換えジストロフィンの可能性があり（Ｍｅｎｄｅｌｌ， Ｊ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３， １４２９−１４３７ （２０１０））、慢性自己免疫性筋炎を引き起こす。本発明者らは、ジストロフィンの分子進化の詳細な分析が、タンパク質の歴史的遺産のこれまで認識されていなかった側面を明らかにすることにより、これらの制約の両方に対する合成生物学的アプローチの情報を与えるかもしれないという仮説を立てた。ジストロフィンの遠隔歴史の本発明者らの再構築は、タンパク質の開始時に、そのロッドドメインが、はるかに大きな支柱様細胞骨格タンパク質のＮ末端部分から選択
される「スペクトリン様」三重らせんドメインの２４反復を含むことを示唆した（実施例１）。ジストロフィン、ユートロフィン、及び密接に関連するスペクトロプラキンからの三重らせん反復の結晶構造は、隣接する反復間のアミノ酸側鎖相互作用がロッドの強度に重要なインターロック界面を作り出すことを示唆する。この原理は、ＢＭＤ患者におけるフレーム内欠失及び重複に起因する表現型、並びに脊索動物のパラログ（例えば、Ｌａｍｐｒｅｙ）における欠失のまれさを説明する場合がある。なぜなら、三重らせん反復の本来の配列のほとんどの破壊は、ロッドドメインを局所的に弱める可能性があるからである。「最も弱いリンク」を作り出すリスクを最小化するために、本発明者らは「ヒンジ２」として古典的に標識された無秩序ドメインによって一方の側に隣接した欠失に焦点を当て、ＺＺドメインのおよその末端を越えてＣ末端配列を欠失させた（Ｉｓｈｉｋａｗａ−Ｓａｋｕｒａｉ， Ｍ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｍ．， Ｉｍａｍｕｒａ， Ｍ．， Ｄａｖｉｅｓ， Ｋ． Ｅ． ＆ Ｏｚａｗａ， Ｅ． ＺＺ ｄｏｍａｉｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｔｏ ｂｅｔａ−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １３， ６９３−７０２， （２００４）； Ｈｎｉａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＺＺ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ
ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｕｔｒｏｐｈｉｎ： ｔｏｐｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｂｅｔａ−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４０１， ６６７−６７７， （２００７））。胸腺における初期発生発現を通して達成された中枢性免疫寛容を利用するために（Ｍｅｓｎａｒｄ−Ｒｏｕｉｌｌｅｒ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｙｍｉｃ ｍｙｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｇｅｎｅｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ １４８， ９７−１０５， ２００３）、本発明者らは、ジストロフィンにおけるこれらの欠失を、脊椎動物の進化の初期にジストロフィンから分岐したパラロガスタンパク質ユートロフィン上にマップした。これらの考察に基づいて、本発明者らは、野生型ユートロフィンｍＲＮＡ配列に基づいて導入遺伝子を合成し、その後、配列の操作バージョンを用いて発現を改善した。本明細書では、本発明者らは、３．５ｋｂの合成導入遺伝子（ＡＡＶ９−μＵ、ＡＡＶ９−μユートロフィン）を全横紋筋に全身的に送達するために、ＡＡＶ９及び派生祖先カプシド「Ａｎｃ８０」に基づくベクターを用いた盲検前臨床試験で得られた結果について報告する。
本発明者らは、最初に、体重約５ｇの新生仔ｍｄｘマウスに２．５×１０１２ｖｇまでの用量のＡＡＶ−μユートロフィンを腹腔内注射し、筋発達を通して筋保護の程度を調べた。これらの無作為化盲検試験において、本発明者らは、ＡＡＶ９及びＡｎｃ８０の両方で筋肉に対する同等の全体的な生体分布を観察し、両方とも、毒性の徴候なしにマウスにおいて十分に耐性であった（図７Ａ〜図７Ｃ）。２．５×１０１２ｖｇ／マウス用量で、筋線維中心核形成（図７Ａ及び図７Ｄ）、胚性ミオシン重鎖発現（図７Ａ及び図７Ｂ）、天然ユートロフィンアップレギュレーション（図７Ａ及び図９Ａ）、タンパク質分解のマーカーとしてのＭＵＲＦ１発現、筋核アポトーシス（データは示さず）、進行中の筋壊死、及び単核細胞浸潤を含む、筋ジストロフィーの試験されたすべての組織学的徴候を定性的に完全に抑制するのに充分なレベルで、組換えμユートロフィンを発現させた（図７Ｂ）。これらの徴候のうち、中心核形成は、以前の再生サイクルを反映するので、定量的にｍｄｘマウスにおける筋保護の最も感受性の指標である。初めて、本発明者らは、野生型と生物学的に区別できないレベルへの中心核形成の正常化（又は予防）を実証する（図７Ｄ）。この観察された筋保護は、心筋及び骨格筋の筋細胞膜におけるジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の持続的な正常化と関連していた（図７Ａ）。ウェスタンブロット分析は、発現されたμユートロフィンタンパク質がＤＧＣを安定化するのに十分であることをさらに確認した（図７Ｃ）。骨格筋及び心筋におけるμユートロフィンの持続した発現がベクター送達後４ヶ月の期間（試験の終点）を通して観察され、これは、単回投与治療によって付与された筋保護の耐久性レベルを示す。興味深いことに、筋細胞膜
透過性を反映するバイオマーカーであるクレアチンキナーゼは、野生型マウスと統計学的に区別がつかず（図７Ｅ）、発生初期のコドン最適化と組換えタンパク質の過剰発現は、筋病理発症後の尾静脈注射を介した選択的導入遺伝子の投与と比較して、発生初期の応答を改善したことが示唆された（Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｓｔｒｉａｔｅｄ ｍｕｓｃｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．
Ｎａｔ Ｍｅｄ １０， ８２８−８３４， ２００４； Ｏｄｏｍ， Ｇ． Ｌ．，
ｅ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｕｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒＡＡＶ６ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｌｉｆｅｓｐａｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ／ｕｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６， １５３９−１５４５， ２００８； Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｔ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏ−ｕｔｒｏｐｈｉｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｒｅｌｙ Ａｆｆｅｃｔｅｄ Ｄ２／ｍｄｘ Ｍｉｃｅ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １１， ９２−１０５， ２０１８）。
ＡＡＶ９−μユートロフィンがｍｄｘマウスにおいて機能的改善を付与するかどうかを試験するために、本発明者らは、力把持試験を、本発明者らが動物の力把持後垂直活動を非侵襲的に測定する、意欲的構成要素とリンクする確立されたハイブリッドアッセイを利用した（Ｓｏｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ａｄｄｒｅｓｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｉｎ ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ． Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２２， ５９３−６０２， ２０１７）。本発明者らの以前の研究は、このハイブリッド試験がｍｄｘマウスと野生型マウスを区別する最も感度が高く、臨床的に重要なパラメーターの１つを提供し、ジストロフィン欠損筋肉の過度の疲労反応と因果関係のある挙動を捉えることを示している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｙ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｎＮＯＳ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｍｉｌｄ ｅｘｅｒｃｉｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４５６， ５１１−５１５， ２００８）。この試験は、未治療及びＡＡＶ９−μユートロフィン治療ｍｄｘマウス間の客観的、劇的、及び統計的に有意な差を示したが、後者の群は、野生型マウスと区別できなかった（図７Ｆ）。また、治療したｍｄｘマウスは、無治療マウスと比較して、随意車輪（８週間）及び下り丘トレッドミル走行（１６週間）距離の増加を示しただけでなく、それらのエクスビボ単離したＥＤＬ筋肉は、力把持試験により、偏心収縮誘発損傷に対する増強された抵抗、及びインビボでの増強された筋パフォーマンスを示した。これらの知見は、μユートロフィンの早期過剰発現が、アクチン細胞骨格への逆操作タンパク質のロッド様結合の比較的短い長さ及びＲ１６−１７ ｎＮＯＳ結合モチーフの欠如にもかかわらず、全長ジストロフィンの非存在下で完全な表現型改善が可能であることを示唆する。
これらの結果は、全身性筋肉伝達を介したＤＭＤの病態生理のＢＭＤ様部分的逆転ではなく完全な達成の希望を提起した；しかしながら、小型及び大型のジストロフィー動物間のスケール依存性差異が、このアプローチの限界を明らかにするかどうかは明らかではなかった。μユートロフィン遺伝子導入の組織学的及び免疫学的結果を、５匹のゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌ４〜７日齢を、免疫抑制なしに、注射時に１×１０１３及び３．２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量でのＡＡＶ９−μユートロフィンの静脈内投与に無作為に割り付けた盲検試験においてさらに調査した。注射から６週間後、本発明者らは、筋細胞膜における強固なμユートロフィン発現と野生型レベルのサルコグリカン発現の安定化を観察した（データは示さず）。さらに、これらの治療イヌは、同じ
ＧＲＭＤモデルにおける異種ヒトジストロフィンの全身投与後の免疫性筋炎に関連する以前に報告された体重減少とは対照的に、キャリアメスと同様の体重の４倍の増加を達成した（Ｋｏｒｎｅｇａｙ， Ｊ． Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｍｕｓｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＡＡＶ９ ｈｕｍａｎ ｍｉｎｉ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｏｇｓ．
Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８， １５０１−１５０８， ２０１０）。この持続したμユートロフィン発現は、筋壊死のレベルの明らかな低下、筋線維最小Ｆｅｒｅｔ直径の単核浸潤正常化と関連していた（データは示さず）。ベクター投与後５週及び８週に、イヌインターフェロン−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、本発明者らの非免疫抑制処理ＧＲＭＤイヌにおいて、ＡＡＶカプシド又はμユートロフィン導入遺伝子産物のいずれに対しても細胞媒介免疫を示さなかった（データは示さず）。この概念証明研究の主な限界は、各々２５ｇ及び２５ｋｇのｍｄｘマウスとＧＲＭＤイヌの成体体重の１０００倍の差異に由来し、イヌにおける本発明者らの達成可能なＡＡＶ９用量を、予想される成体体重に基づいて２．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇに制限する。この用量では、イヌは５ｇｍの新生仔として２．１５×１０１１ｖｇで治療したｍｄｘマウスと同様に、必然的にベクターを「増殖」させるであろう（データは示さず）。そこで、本発明者らは、組換えμユートロフィン発現、筋細胞保護及び全身ベクター投与に対する免疫応答を検出するための比較的早期の組織学的分析に焦点を当てた。
本発明者らの新生仔アプローチは、いずれも、非可逆的な筋損傷の発症前の早期予防治療の可能性を提供し、ベクターカプシド抗原に対する免疫反応のリスクを最小限にする。なぜなら、野生型ＡＡＶを認識する記憶Ｔ細胞は、連続的な環境曝露を介して発達するからである（Ｎｉｃｈｏｌｓ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａ ｆｒｏｍ ＡＡＶ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｉｎ Ｄｏｇｓ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ， ２０１４； Ｃａｌｃｅｄｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎｓ， ｃｈｉｌｄｒｅｎ， ａｎｄ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ． Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８， １５８６−１５８８， ２０１１）。しかしながら、ＤＭＤ患者の大多数は、２歳以降に診断されるのが典型的であり、それまでに大量の筋線維変性、単核球浸潤を伴う壊死、及び線維の大きさのばらつきの増大がすでに生じている（Ｙｉｕ， Ｅ． Ｍ． ＆ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ， Ａ． Ｊ． Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｃｈｉｌｄ ｈｅａｌｔｈ ５１， ７５９−７６４， ２０１５）。ＤＭＤの少年における本発明者らのアプローチの実現可能性を探求するために、７．５週齢の若年ＧＲＭＤイヌ２匹（Ｈａｎｎ及びＢｅｅｔｌｅ）に、抗炎症用量のプレドニゾン１日１ｍｇ／ｋｇを一過性に使用している間、注射時にＡＡＶ９−μユートロフィンを１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇの高用量で静脈内投与した（Ｌｉｕ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ ｉｎ ｃａｎｉｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ
ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ３０， ７６７−７７３， ２００４））（図８Ａ）。注射後４週間で採取した筋肉生検の免疫染色は、μユートロフィンの均一な筋細胞膜発現（図９Ａ、データは示さず）、天然のユートロフィンの抑制（図９Ａ）、及びＤＧＣのレスキュー（図９Ｂ）を示した。これは、ウェスタンブロットによってさらに確認された（図９Ｄ）。
治療したＧＲＭＤイヌからの肢筋の組織病理学的特徴付けは、高率の筋壊死線維、過剰なカルシウム蓄積（図８Ｃ及び図８Ｅ）、クラスター化した再生筋線維（図８Ｄ及び図８Ｆ）、豊富な炎症細胞浸潤及び脂肪浸潤（図１０Ｂ、データは示さず）によって、未治療の年齢適合対照において証明されるように、進行中の筋肉損傷のほぼ完全な抑制を実証す
る。印象的に、ＡＡＶ９−μユートロフィン治療イヌはまた、咀嚼筋における筋変性及び再生のほぼ完全な予防を示し（図８Ｂ、データは示さず）、これらは、独特の強力なＭＹＨ１６ミオシンアイソフォームを発現するため、未治療イヌにおいて重度の影響を受ける（Ｓｔｅｄｍａｎ， Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｍｙｏｓｉｎ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｌｉｎｅａｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４２８， ４１５−４１８
（２００４）； Ｔｏｎｉｏｌｏ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｓｔｉｃａｔｏｒｙ ｍｙｏｓｉｎ ｕｎｖｅｉｌｅｄ： ｆｉｒｓｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒｓ ｆｒｏｍ ｃａｒｎｉｖｏｒｅ ｊａｗ ｍｕｓｃｌｅｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９５， Ｃ１５３５−１５４２ （２００８））。剖検時のさらなるウェスタンブロット分析（３．５ヶ月齢）は、骨格筋及び心筋におけるμユートロフィンの持続的な広範な発現を示した（図９Ｃ）。本発明者らの以前のＧＲＭＤ新生イヌ研究と一致して、インターフェロン−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、μユートロフィンに対してバックグラウンド以上のシグナルを示さなかった（データは示さず）、さらに、ＧＲＭＤイヌ及び非ヒト霊長類における以前の研究とは対照的に、重度の急性毒性の徴候は見られなかった（Ｋｏｒｎｅｇａｙ， Ｊ． Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｍｕｓｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＡＡＶ９ ｈｕｍａｎ
ｍｉｎｉ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｏｇｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８， １５０１−１５０８ （２０１０）； Ｈｉｎｄｅｒｅｒ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｖｅｒｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ
Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｌｅｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ
Ｈｉｇｈ−Ｄｏｓｅ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＳＭＮ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， （２０１８）； Ｈｏｒｄｅａｕｘ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ Ａｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｍｉｃｅ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， （２０１８））。重要なことに、血清ＣＫレベルの８０％の低下が、両方のイヌにおいてＡＡＶ９−μユートロフィンの注入の１週間後に測定され（図８Ｇ）、観察された組織学的改善と一致する知見である。乳仔期から骨格成熟までの筋発育を通して持続的な筋保護を達成するために、ジストロフィーのイヌ及びＤＭＤの男児は、最も重度に罹患した筋肉、横隔膜において（Ｓｔｅｄｍａｎ， Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎａｔｕｒｅ ３５２， ５３６−５３９， （１９９１））、強固で均一な発現を維持するために、ｍｄｘマウス仔に必要とされる用量に比例した用量、例えば、１ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ新生仔体重のＡＡＶベクターの全身投与を必要とする場合がある（データは示さず）。
ベクター及び／又は導入遺伝子免疫毒性の厳密な前臨床評価のために、本発明者らは、独特のＧｅｒｍａｎ Ｓｈｏｒｔｈａｉｒｅｄ Ｐｏｉｎｔｅｒ（ＧＳＨＰＭＤ）欠失ヌルイヌモデル（Ｓｃｈａｔｚｂｅｒｇ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ‘ｋｎｏｃｋｏｕｔ’ ｄｏｇ． Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ９， ２８９−２９５． （１９９９）； ＶａｎＢｅｌｚｅｎ， Ｄ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｒｅｍｏｖｉｎｇ Ａｌｌ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｅｘｏｎｓ ｉｎ ａ Ｃａｎｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＤＭＤ Ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｘ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅ
ｖ ４， ６２−７１， （２０１７））を利用した。ＧＳＨＰＭＤは、中枢性寛容性の研究のための優れたプラットフォームを提供する。それは、以前に実証されたＡＡＶコード化イヌマイクロジストロフィンの治療的な長期の体全体にわたる発現を容易にすると予想され得るように、ＧＲＭＤモデルの選択的スプライシングにより、潜在的に許容できるレベルでほぼ全長のジストロフィンの検出可能な読み遠しが可能となるためである（Ｓｃｈａｔｚｂｅｒｇ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｇｏｌｄｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ２１， ９９１−９９８． （１９９８）； Ｙｕｅ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｓａｆｅ ａｎｄ
ｂｏｄｙｗｉｄｅ ｍｕｓｃｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ａｄｕｌｔ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ
２４， ５８８０−５８９０， （２０１５）； Ｌｅ Ｇｕｉｎｅｒ， Ｃ． ｅｔ
ａｌ． Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，
１６１０５， （２０１７））。成体ＧＳＨＰＭＤイヌ（Ｎｅｄ及びＧｒｉｎｃｈ）は、各々、等用量（２×１０１２ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ９−μジストロフィン及びＡＡＶ９−μユートロフィンの両方を、対側脛骨区画への筋肉内注射によって受けた（図１０Ａ）。ＥＬＩＳＰＯＴを介したインターフェロン−γ検出により、μジストロフィンに対する強い全身細胞性免疫応答の存在が注射後２週間という早い時期に明らかになったが、構成的ＣＭＶプロモーターからの発現にもかかわらずμユートロフィンに対しては認められず、中枢性免疫寛容の強さが示された（図１０Ｂ）。注射後４週間に採取した筋肉生検の免疫染色では、μユートロフィンの持続的な発現が認められたが、μジストロフィンの発現量はわずかであった（図１０Ｃ）。Ｈ＆Ｅは、μユートロフィン注入側でのそれらの事実上の欠如と比較して、μジストロフィン注入側で重篤な炎症及び単核細胞浸潤を示した（図１０Ｄ、データは示さず）。これらの知見は、ベクターの等用量が両肢に注入されたため、観察された免疫応答がベクターカプシドではなくμジストロフィンによって駆動されることを示している。
要約すると、進化上の制約を同定するための比較系統発生学的アプローチを活用した後、本発明者らは、ＤＭＤのためのマウス及びイヌモデルの筋肉への安全な全身送達のための高度に治療的な３．５ｋｂの合成導入遺伝子をリバースエンジニアリングした。本発明者らの盲検試験は、遺伝子送達の初期レベルがその後の筋肉成長に適応するのに十分である限り、驚くほど完全な筋保護を明らかにする。まとめると、これらの知見は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療としての、機能的に最適化された非免疫原性ユートロフィンベースの遺伝子治療アプローチの使用に向けて、この分野を再注目させる場合がある。
Ｂ． 材料及び方法
ａ． バイオインフォマティクス及び系統発生分析
図の説明と原稿テキストに列挙された種について公に利用可能なゲノムＤＮＡ配列を、全長ヒトジストロフィン及びユートロフィンに相同なコード配列を同定するために、複数のｂｌａｓｔアルゴリズム、特にｔＢＬＡＳＴｎ２６，２７によって照会した。ほとんどの種について、イントロン／エキソン境界を定義するために、ｍＲＮＡ配列からの支持証拠が利用可能であった。このような証拠が欠けている場合、ＦＧＥＮＥＳＨ＋（Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ）を生物特異的遺伝子発見パラメーター及び隠れマルコフモデル＋類似タンパク質ベースの遺伝子予測と共に用いて、集合したコンティグから推定コード配列を同定した。このアプローチの内部試験として、実質的にすべてのトランスクリプトーム定義コード配列が、ＦＧＥＮＥＳＨ＋プログラム２８によって適切に同定された。本発明者らは、これらのｍＲＮＡ及びタンパク質配列ファイルが、公開されているゲノムＤＮＡの不確定
領域において散発性エキソンを欠いていることを認識している。ＨＭＭＥＲ（ｈｍｍｅｒ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／ｓｅａｒｃｈ／ｈｍｍｓｃａｎ）をＥ値定義カットオフと共に使用して、カルポニン相同性、スペクトリン様反復、ＷＷ、ＥＦハンド、及びＺＺドメインについて隠れマルコフモデルにマッチするタンパク質コードドメインを定義した。すべての推定ペプチド配列ファイルを、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン１３．５．１：Ｇｏｎｎｅｔシリーズマトリックス中のデフォルト設定を使用してＣｌｕｓｔａｌＷによって整列させ、対整列オープンギャップペナルティー１０のパラメーター、伸長ギャップペナルティー０．１及び多重整列オープンギャップシリーズ１０のパラメーター、伸長ギャップペナルティー０．２及び遅延発散３０％を用いた。系統発生的再構成は、ツリーの中のタイが無作為に分解され、ギャップが比例的に分布しているか又は無視されている距離ポアソン補正された隣接結合ツリー構築法を使用して、全長配列及び切断配列の両方を用いて生成され、選択がツリートポロジーに影響を及ぼすかどうかを確立した。このようなすべての場合において、ツリートポロジーは、「ベストツリー」モードが選択されたときのギャップの管理に敏感ではなかった。１００００の複製を伴うブートストラップモードの代替的な使用は、距離系統図におけるすべてのノードを確認した。タンパク質及びＤＮＡマトリックス分析は、ｐａｍ２５０スコアリングマトリックスに基づいた。使用した略語：ムラサキウニ、アメリカムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）、Ｓ．ｐｕｒ；ナメクジウオ（Ａｍｐｈｉｏｘｕｓ）、Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ ｆｌｏｒｉｄａｅ、Ｂ．ｆｌｏ；ゾウギンザメ（Ｅｌｅｐｈａｎｔ ｓｈａｒｋ）、Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ ｍｉｌｉｉ、Ｃ．ｍｉｌ；ヨウスコウアリゲーター（Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｌｌｉｇａｔｏｒ）、Ａｌｌｉｇａｔｏｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ａ．ｓｉｎ；マウス、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、Ｍ．ｍｕｓ； イヌ、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｃ．ｆａｍ； ヒト、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｈ．ｓａｐ；グリーンアノール（Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｎｏｌｅ）、Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ、Ａ．ｃａｒ； チンパンジー（ｃｏｍｍｏｎ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｐ．ｔｒｏ；カモノハシ（ｄｕｃｋ−ｂｉｌｌｅｄ ｐｌａｔｙｐｕｓ）、Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｉｄａｅ ａｎａｔｉｎｕｓ、Ｏ．ａｎａ．；トラフグ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐｕｆｆｅｒｆｉｓｈ）、Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ、Ｔ．ｒｕｂ；ネッタイツメガエル（ｔｒｏｐｉｃａｌ ｃｌａｗｅｄ ｆｒｏｇ）、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｘ．ｔｒｏ； Ｄ−ジストロフィン；Ｕ−ユートロフィン。
ｂ． マイクロユートロフィン導入遺伝子設計及びベクター産生
ＢＭＤ／ＤＭＤ患者間の配列保存と遺伝子型−表現型相関の系統発生分析に基づいて、本発明者らは、カルポニン相同ドメイン、最初の３つと最後の３つのスペクトリン様反復、並びにＷＷ、ＥＦハンド、及びＺＺドメインの組合せを保存するＡＡＶコード可能小型化ユートロフィンのスペクトルをインシリコでモデル化した。隣接するスペクトリン様反復のらせん間ループ間のアミノ酸側鎖相互作用を保存するために、本発明者らは、最初又は最後の３つの反復のどちらかが無傷で保存されたμユートロフィンのサブセットのみに焦点を当てた。免疫原性を最小限にするために、本発明者らは、単一の内部欠失及びＣ末端切断の組み合わせによって作製され得るμユートロフィンのみを考慮した。スペクトリン様反復は、コンセンサス配列と相同であるが、相違点は、哺乳類のユートロフィンのいずれにおいても同一のデカペプチド間にスプライスを見つけることができないようなものである。したがって、本発明者らは、ｈｍｍｅｒ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／ｓｅａｒｃｈ／ｈｍｍｓｃａｎでオンラインで実装されているプロファイル隠れマルコフモデルを使用して、全長イヌユートロフィン配列（３４５６ ａａ， ＸＰ＿００５６１５３０６）におけるスペクトリン様三重らせん反復境界を定義し、注釈した。本発明者らは、ＡＡＶ４５の腹腔内注射により抗原特異的耐性が容易に誘導される新生仔マウスにおけるイヌ及びヒトタンパク質に適合するタンパク質をコードする導入遺伝子を使用したが、免疫個体発生の間に同質遺伝子の天然タンパク質へのより早い出生前曝露が必要と予想される新生
仔及び高齢イヌにおけるイヌバージョンのみを使用した（Ｄａｖｅｙ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｉａ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｍｉｄ−Ｇｅｓｔａｔｉｏｎ Ｆｅｔａｌ Ｓｈｅｅｐ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２， ｅ０１７１１３２， （２０１７））。μユートロフィン導入遺伝子は、アクチン結合ドメイン、三重らせん反復１〜３及び２２、「ヒンジ」２として以前に同定されたものに近い無秩序でプロリンに富む領域、並びにＣ末端ＷＷ、ＥＦハンド、及びＺＺドメインを含むように設計され、このように欠失接合部における単一スプライス部位を除いて、イヌ及びヒトユートロフィン配列に適合するように設計された組換えタンパク質を作り出し、それにより、以前に報告された導入遺伝子と比較して、ジストロフィン欠損イヌ及び最終的にヒトにおける潜在的免疫原性を最小限にした（Ｗａｎｇ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９７， １３７１４−１３７１９． （２０００）； Ｈａｒｐｅｒ， Ｓ． Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｄｕｌａｒ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ８， ２５３−２６１． （２００２）； Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｓｔｒｉａｔｅｄ ｍｕｓｃｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １０， ８２８−８３４ （２００４）； Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ｒＡＡＶ６−ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄｓ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｉｃｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １２， ７８７−７８９ （２００６）；及びＯｄｏｍ，
Ｇ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｕｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒＡＡＶ６ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｌｉｆｅｓｐａｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ／ｕｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６， １５３９−１５４５ （２００８））。本発明者らの研究で使用するために選択したコード配列を、競合するバイオテクノロジー企業（ＧｅｎｅＡｒｔ及びＤＮＡ ２．０）によって最適化され、合成されたｃＤＮＡのプールの最高発現候補として選択した。ｍｄｘマウスの脛骨前筋における５０μｇのＤＮＡのエレクトロポレーション後の免疫蛍光染色及びウェスタンブロッティングによって発現を決定した。さらなる使用のために選択された合成コード配列は、同一の一次構造の組換えタンパク質をコードする野生型イヌｃＤＮＡ配列よりも、インビトロ及びインビボアッセイにおいて約３０倍高い発現を駆動することが見出された。最良の合成ｃＤＮＡと野生型との顕著な差は、コドンバイアスのレベルであり、最適化された合成ｃＤＮＡのみが哺乳動物のミオシン重鎖の極端なバイアス（例えば、１５４個のＣＴＧロイシン、０個のＴＴＡロイシン）と密接に一致している。合成イヌμユートロフィンｃＤＮＡを、ＣＭＶ即初期エンハンサー／プロモーターの８３３ｂｐ断片又は合成プロモーターｓｐｃ５−１２（各々ＣＭＶ及びＳＰ）によって駆動されるＡＡＶ２発現ベクターカセットにサブクローニングした。ＡＡＶ９ベクターは、以前に記載したようにＨＥＫ ２９３細胞における三重トランスフェクション法を用いてペンシルバニア大学前臨床ベクターコアにより生成及び精製した（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ， Ｌ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｄｕｒｉｎｇ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒｕｓ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１，
１２５１−１２５７， ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．１０７ （２０１０））。ベクター調製物を、ｍｄｘマウスの脛骨前筋への２ｘ１０１１ ＡＡＶ９ μユートロフィンｖｇの注射のためにプールする前に、品質、純度及びエンドトキシン濃度についてアッセイした（Ｌｏｃｋ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２３， ５６−６４， ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１１．２１７ ［ｐｉｉ］）。
ｃ． 動物 − 一般
Ａ＆Ｍ大学及びペンシルベニア大学の動物管理及び使用委員会は、マウス及びイヌにおけるすべての動物実験プロトコルを承認した。
ｄ． マウスモデルベクター投与
マウス株Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ及びｍｄｘは、Ｊａｃｋｓｏｎ実験室（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。この研究は、２３のＣ５７ＢＬ／１０ＳｎＪマウスと３０ ｍｄｘマウスを含み、すべて９±２日齢で注射した。ＡＡＶ９μユートロフィン又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の腹腔内注射を受ける前に、個々の仔を、Ａｒａｍｉｓ
Ｍｉｃｒｏ ｔａｔｔｏｏキット（Ｋｅｔｃｈｕｍ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｃ、Ｃａｎａｄａ）で足指刺青し、異なる投薬群に無作為に割り当てた。すべての注射及び組織採取の間、治験責任医師は盲検化された。このプロトコルに基づいて、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ及びｍｄｘ仔に、陰性対照としてのＰＢＳ又は３２ゲージインスリンシリンジを介してＰＢＳ中に希釈したＡＡＶ９μユートロフィンのいずれか５０〜２５０μｌを注射した。注射の前に、各マウスを秤量した。ベクター投与後、すべてのマウスを同腹仔に戻し、離乳後に分離した。
ｅ． マウスモデル組織の入手と保存
約８週齢で、ｍｄｘ及びＣ５７ＢＬ／１０ＳｎＪマウスは、施設の方針に従ってＣＯ２安楽死を受けた。心臓、前脛骨筋、腓腹筋、大腿四頭筋、三頭筋、腹部、横隔膜、側頭筋及び肝臓を採取し、さらに処理した。その他は保存したが、マウスにおけるＡＡＶ９の標的外遺伝子発現が１００倍未満低いことを示した研究に基づいて利用しなかった（Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １−９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６， １０７３−１０８０ （２００８））。指定された組織学的組織サンプルを、包埋用モールド（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に入れ、液体窒素冷却イソペンタン中で急速に凍結させた。追加の指定された生物学的組織サンプルを組織容器に入れ、液体窒素中で急速に凍結させた。すべての試験片を−８０℃で保存した。厚さ５〜７μｍの凍結切片を、クライオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ５５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）上で−２５℃で切断し、スライドガラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）上にマウントした。
ｆ． 基本的組織学−ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）並びにアリザリンレッド染色（ＡＲＳ）
７μｍ厚の断面を室温で１５分間風乾した。次に、スライドをＨａｒｒｉｓ’ヘマトキシリン染料で２．５分間染色し、蒸留水ですすぎ、０．１％酢酸に１５秒間浸漬し、続いて水道水で４分間繰り返しすすぎ、１％エオシンで１分間対比染色した。最終ステップとして、スライドをエタノール中で３回、各々２分間脱水した。代表的な非重複高倍率視野
（ＨＰＦ）を、スコアリングのために写真撮影した（データは、現在示されている）。アリザリンレッド染色も厚さ７μｍの断面で行った。１０％緩衝リン酸ホルマリンによる１０分間の固定後、切片をＰＢＳで３×５分間洗浄し、アリザリンレッド染料と共に室温で１５分間インキュベートした。この手順の後、スライドをエタノール中で３回洗浄し、サイトシール６０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってマウントした。
ｇ． 形態測定分析
３群のマウス、Ｃ５７ＢＬ／Ｓｎ１０Ｊ（対照）、及びｍｄｘを、ＰＢＳ又はＡＡＶ９μユートロフィンのいずれかの注射に無作為化して、標本同定を盲検化した研究者によって研究した。前脛骨筋、腓腹筋、四頭筋、三頭筋、側頭筋及び腹筋の各々から無作為に選択した４〜５の領域をＨ＆Ｅで染色し、中心核形成筋線維の定量のために光学顕微鏡でスクリーニングした。筋腱接合部の領域は、ｍｄｘ及び対照の両方において中心核形成繊維が豊富であるため、測定から除外した。全１１，６４９本の繊維を評価した。
ｈ． 免疫蛍光染色法：Ｎ末端及びＣ末端ユートロフィン二重染色
すべての筋肉標本からの切片を、Ｎ末端ポリクローナル抗体（全長及び組換えユートロフィンに対する）及びＣ末端モノクローナル抗体（全長ユートロフィンに対する）の両方を使用することによって、ユートロフィン免疫染色のために処理した。０．０１Ｍ ＰＢＳ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に希釈したＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の１％溶液中で２０分間の初期インキュベーション後、標本をＰＢＳ中で各々５分間（３×５分間）３回すすいだ。次いで、切片を５％正常ロバ血清中で１５分間インキュベートし、続いてＮ末端ユートロフィン抗体（Ｎ−１９、ｓｃ−７４６０、ヤギポリクローナルＩｇＧ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ、希釈１：５０）と共に３７℃で６０分間インキュベートした。第２サイクルの３×５分間のＰＢＳ洗浄後、スライドを５％正常ロバ血清と共に室温で１５分間インキュベートした。次いで、調製した切片をロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（ｓｃ−２０２４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ、希釈１：３００）中で３７℃で３０分間インキュベートした。３回目のＰＢＳ洗浄を３×５分間行った後、切片を最初に１０％正常ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫ）と共に１５分間、次いでＣ末端ユートロフィン抗体（ＭＡＮＣＨＯ７、マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ、希釈１：２５）と共に３７℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで３×５分間洗浄し、１０％正常ヤギ血清と共にインキュベートした後、切片をヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ａ−２１１４０、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ、１：３００希釈）中で３７℃で３０分間インキュベートした。切片を再びＰＢＳ中で３×５分間洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ−１０００）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）又はＤＡＰＩを有するＭｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ−１５００）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にマウントした。写真は、Ｌｅｉｃａ ＤＭ６０００Ｂ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮った。
ｉ． 免疫蛍光染色法：γ−サルコグリカン／ラミニン、ＭｕＲＦ−１／ラミニン及びＭｙＨＣ胚／ラミニンに対する二重免疫蛍光染色
これらのタンパク質の染色手順は、以前に記載されたのと同じプロトコルに従った（Ｓｏｎｇ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ
ｍｕｓｃｌｅｓ ａｆｔｅｒ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｅｒｃｉｓｅ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７， ｅ５２２３０， ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５２２３０ （２０１２））。ウサギ抗γ−サルコグリカン（ＮＢＰ１−５９７４４、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）及びＭＵＲＦ１（ＮＢＰ１−
３１２０７、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）ポリクローナル抗体を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中１：５０の希釈で使用した。ＭｙＨＣ−胚性モノクローナル抗体（Ｆ１．６５２）（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ
ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）を、ＰＢＳ中１：５０〜１：１００の希釈で使用した。１：５００〜１：１０００希釈のラミニンニワトリポリクローナル抗体（ａｂ１４０５５−５０、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、第２のヤギ抗ニワトリＩｇＹ（ＴＲ）抗体（ａｂ７１１６、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ、希釈１：３００）と一緒に適用して、筋線維を同定した。ＭＹＨ１６ウサギポリクローナル抗体ペプチド配列を、ＭＹＨ１６「ループ２」領域のヒトイヌ配列を使用して生成した。ペプチド配列：ＬＬＡＬＬＦＫＥＥＥＡＰＡＧＳ
ｊ． ＴＵＮＥＬアッセイ
切片を最初に１０％緩衝リン酸ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）中で２０分間固定した。次いで、製造業者の説明書に記載されているように、ＴＡＣＳ ２ ＴｄＴ蛍光アポトーシス検出キット（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて、断片化ＤＮＡのインサイチュニックエンド標識を行った。
ｋ． 血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アッセイ
５ｍｍの動物ランセット（Ｇｏｌｄｅｎｒｏｄ Ａｎｉｍａｌ Ｌａｎｃｅｔ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ）を用いて顎下静脈の静脈穿刺により血清を採取した。合計１５０μＬをヘパリン処理した血液収集チューブ（Ｔｅｒｕｍｏ、カタログ番号：ＴＭＬＨ）に収集した。マウスは、苦痛の潜在的徴候を観察するために、採血後３０分間注意深く監視された。ＣＫ値は、ペンシルベニア大学のＭａｔｔｈｅｗ Ｊ．Ｒｙａｎ獣医病院の臨床病理検査室で測定した。
ｌ． ＥＤＬ筋収縮特性のエクスビボ評価
エクスビボ評価は、ペンシルベニア大学のＭｕｓｃｌｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｃｏｒｅが行った。等尺性単収縮力、等尺性強縮力、及びＥＣＣ後の力低下を含む生理学的特性を、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｖ．５．３ソフトウェアを装備したＡｕｒｏｒａ Ｍｏｕｓｅ １２００Ａ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、２ヶ月齢のｍｄｘマウスから新たに単離したＥＤＬ筋肉上で定量した。これらのマウスのすべては、安楽死の２４時間前に、インビボ把持試験及びエクスビボ試験を受けた。ＥＤＬ筋を、２４℃で、常時酸素化リンゲル液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ
ＫＣｌ、３．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び５．５ｍＭ Ｄ−グルコース）中に維持した。適用した単収縮刺激プロトコルは、持続時間０．２ｍｓの単一刺激であった。最大強縮力発生を測定するために、同じ刺激を１２０Ｈｚの周波数で５００ｍｓ繰り返した。筋肉の回復を確実にするために、２回の強縮収縮の間に５分間を許容した。最大単収縮反応を得るために筋長を調整し、この長さを筋腱接合部の最も外側の可視先端間で測定し、最適な長さ（Ｌ０）として記録した。筋肉密度係数（１．０６ｇ／ｃｍ３）、筋肉Ｌ０、及び繊維長係数（ＥＤＬについて０．４５）の積で筋肉量を割ることによって、ＥＤＬ筋肉の筋断面積（ＣＳＡ）を計算した。比力は、力をＣＳＡに正規化することによって決定した。
ＥＤＬの等尺性を試験した後、一連の５つの偏心収縮（ＥＣＣ−５分毎に１つ）を、５００ｍｓの等尺性収縮の反復で開始し、続いて最大恐縮刺激を与えながら、筋肉をＬ０の１０％伸長させた。各ＥＣＣについて報告された絶対力は、ＥＣＣの等尺相中のピーク力に対応する。
ｍ． 垂直活動及び握力試験
マウスを注意深くオープンフィールドケージに入れ、それらのベースライン垂直活動を
５分間測定した。次に、マウスを元のケージに戻し、３分間休ませた。軸方向力トランスデューサを使用して力を測定する（Ｖｅｒｎｉｅｒ ＬａｂＰｒｏ ＆ Ｖｅｒｎｉｅｒ
Ｄｕａｌ−Ｒａｎｇｅ Ｆｏｒｃｅ Ｓｅｎｓｏｒ ±１０Ｎ， Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ
Ｏｒｅｇｏｎ）と共に、付随するソフトウェア（Ｌｏｇｇｅｒ Ｌｉｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．８．１）を使用してデータを収集した。すべての実験は、盲検様式で同じ実験者によって行われた。偏りの機会を減らし、盲検実験の堅牢性を確実にするために、本発明者らは、記載されるようなアプローチを使用した（Ｓｏｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ａｄｄｒｅｓｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ． Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２２， ５９３−６０２， ｄｏｉ：１０．１１５２／ｊａｐｐｌｐｈｙｓｉｏｌ．００７７６．２０１６ （２０１７））。
ｎ． イヌモデル
２群のイヌを本発明者らの実験に使用した。第１群は、Ａ＆Ｍ大学のコロニーで繁殖させ、ペンシルバニア大学で仔を産んだ。本研究では、罹患したＧＲＭＤイヌ５匹と、対照群とした野生型１匹と雌キャリア３匹を含む４匹の年齢をマッチさせた同腹仔を含んでいた。すべてのジストロフィーイヌを、血清クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）レベルの上昇によって同定し、ＰＣＲアッセイによって遺伝子型を決定した。すべての仔動物を無作為に治療群に割り付け、治験責任医師は、臨床的及び組織学的評価の間、盲検化されたままであった。仔に、６〜１０日齢でＡＡＶ９μユートロフィンを、１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ及び１．０ｘ１０１３．５ｖｇ／ｋｇの用量で、外頚静脈法により注射した。２匹の仔に低用量のＡＡＶ９μユートロフィンを注射し、２匹に高用量を注射し、残りの１匹に生理食塩水のみを注射した。各イヌを、最初の６週間は毎日、その後は毎週秤量した。
第２のイヌ群は、約７．５週齢の２匹のＧＲＭＤイヌを含んでいた。ベクター投与の３日前に、イヌを２５日間、経口プレドニゾロン１ｍｇ／ｋｇレジメンに入れた。ＡＡＶ９μユートロフィンは、各々１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇと５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの２つの異なる単一用量で同じ方法を用いて注入した。イヌを用量に無作為に割り付け、臨床的及び組織学的評価の間、治験責任医師を盲検化した。
欠失ヌルＧｅｒｍａｎ Ｓｈｏｒｔ Ｈａｉｒｐｏｉｎｔｅｒ（ＧＳＨＰＭＤ）イヌを、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ大学において繁殖させ、収容した。２匹の７歳齢の罹患したＧＳＨＰＭＤイヌ、Ｎｅｄ及びＧｒｉｎｃｈは、各々体重２１ｋｇ及び２４．２ｋｇであり、各イヌは、それらの脛骨前区画に、１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇの等しい総用量で、ＡＡＶ９−μジストロフィン（右）及びＡＡＶ９−μユートロフィン（左）の５回の筋肉内注射を受けた。５カ所の注射部位すべてに刺青を入れ、注射後４週間の筋肉生検のための注射部位を特定することができた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取するため、注射前、２、４、６、８週後に末梢血を採取した。
ｏ． イヌ組織の入手及び保存
ＧＲＭＤイヌの第１群は、ベクター注射後約６週で頭蓋縫工筋、外側広筋、上腕三頭筋の針生検を受けた。分析及び解釈中の偏りを防ぐために、標本を一組の盲検コードと共に保存した。生検は、ばね荷重１４ゲージ針トロカールを通して得られ、それによって動物における治療後の疼痛を有意に最小限にした。次いで、筋肉生検を液体窒素冷却イソペンタン中で急速凍結し、ＯＣＴ媒体（Ｓａｋｕｒｕ、ＵＳＡ）中に包埋し、−８０℃で保存した。盲検コードは、本研究の著者と関連していない個人による組織分析後に破壊した。ベクター曝露の１ヵ月後に、注射されたイヌの第２群は、同じ筋肉の開放筋肉生検を受け
た。ベクター投与の７週間後、これらのイヌを安楽死させ、採取した組織を同じ方法で凍結保存した。
ｐ． イヌの組織学的分析
横方向に切断した７μｍ連続切片を明視野顕微鏡分析及び免疫蛍光（ＩＦ）染色に使用して、マイクロユートロフィン発現及びサルコグリカンレスキューを調べた。筋肉切片を明視野顕微鏡検査のためにＨ＆Ｅで染色し、パーマウントでマウントした。ＩＦ染色のために、切片をＰＢＳ中の５％ロバ血清中で４５分間ブロックし、続いて１：３５０希釈のポリクローナルヤギ抗ユートロフィン抗体（Ｎ−１９、ｓｃ−７４６０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）及び１：２５０希釈のモノクローナルγ−サルコグリカン抗体（ａｂ５５６８３、Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）を使用して、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳ中で３回リンスし、Ａｌｅｘａ４８８ロバ抗ヤギ二次抗体又はＡｌｅｘａ５４０ロバ抗マウス二次抗体中で１：１０００の希釈で４５分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで５分間２回洗浄し、続いて水で１回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｈ−１５００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を含有する耐退色性マウント媒体でマウントした。画像は同じ設定で捕捉され、オリンパスＢ−６５蛍光顕微鏡を使用して、ＩＦ画像におけるいかなる不一致も回避するために、限界及び利得を全体を通して設定することによって、同一の方法を介して処理された。最小フェレット直径及び分散係数は、２０１４年１月２８日に更新されたＴＲＥＡＴ＿ＮＭＤプロトコルＤＭＤ＿Ｍ．１．２．００１に従って計算された。
ｑ． 免疫ブロット分析
免疫ブロット分析は、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル上に２０〜４０μｇ／レーンの全細胞又は全筋肉溶解物を負荷することによって行った。タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜に移した。１：５００希釈のＮ末端エピトープ（Ｎ−１９、ｓｃ−７４６０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）に対するヤギポリクローナル抗体、及び１：５０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と結合したロバ抗ヤギ抗体である二次抗体により、マイクロユートロフィンを検出した。タンパク質の検出及び定量は、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて行った。ガンマ−サルコルギカン（ｓａｒｃｏｌｇｙｃａｎ）を、マウスモノクローナル抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ ＶＰ−Ｇ８０３）及びロバ、抗マウスＨＲＰ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって検出した。
ｒ． 中和抗ＡＡＶ抗体の検出
ＡＡＶ ９カプシドタンパク質に対する体液性免疫応答を評価するために、血清を出生日に採取し、次いで末梢静脈を介して４週目と８週目に採取した。ＨＥＫ ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含む２００μＬのＤＭＥＭ中、１０５細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種した。細胞を３７℃で３〜４時間培養し、ウェルに接着させた。
ＡＡＶ９−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクター（１×１０８粒子）を、ＰＢＳで段階希釈したマウス血清と共に４℃で２時間、総容量２５μＬでインキュベートした。次いで、この混合物をＡＡＶ９の４×１０６粒子を含有する２００μＬの最終容量で細胞に添加し、３７℃で２４又は４８時間インキュベートした。ＧＦＰを発現している細胞を蛍光顕微鏡下で計数した。中和抗体力価は、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが血清を含まない対照よりも５０％少ない最高希釈を用いて計算した。
ｓ． カプシド由来ペプチドに対するＴ細胞反応性の評価
新規ＡＡＶカプシド抗原に対する末梢血Ｔ細胞応答を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより定量した（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． ＡＡＶ−１−ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｄｏｓｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ １１４， ２０７７−２０８６ （２００９））。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ ｈｙｐａｑｕｅ勾配上で単離し、ＶＰ１カプシドタンパク質に及ぶ合成ペプチド（長さ２０アミノ酸、１０残基重複）と共に培養した。ＩＦＮ−γ活性を誘発するプール内の個々のペプチドを同定するために、各ペプチドを交差するマッピングサブプールのうちの２つに存在させた。３７℃で３６時間インキュベートした後、ＩＦＮ−γＳＦＵを計数した。対照プール（増強ＧＦＰ）由来のペプチドでは、１０ＳＦＵ／ウェル未満が観察された。重複ウェルでＳＦＵが５０／１０６ ＰＢＭＣを超えた場合、応答は陽性とみなされた。
ｔ． 統計分析
ｍｄｘマウスへのＡＡＶベクター注入のための情報的なグループサイズを、利用可能な最も感度が高く広く使用されている組織学的アッセイの１つに基づいて推定した：８週齢で剖検したマウスからの中心有核筋線維の割合。使用した動物数の統計的検出力を最大にするために、Ａａｒｔｓら（Ａａｒｔｓ、Ｅ．、ｅｔ ａｌ、Ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ：ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｌｅｖｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｎｅｓｔｅｄ ｄａｔａ、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１４．１７（４）：ｐ．４９１−６）によって記載されたアプローチを採用して、マウス内の複数の高倍率フィールド（ＨＰＦ）間の依存性を適合させた。交換可能な相関構造を使用して、マウス内のクラスター化を説明する混合効果モデルを使用して遺伝子型及び治療によって定義される３つの群を比較した。これらのモデルからのクラスター内相関（ＩＣＣ）の推定は低い値（＜１０％）を示し、群当たりのマウスの数が必然的に少ない（少なくとも４匹）にもかかわらず、比較的高い有効サンプルサイズを示唆した。この分析で計算された他の無作為効果パラメーターは、クラスター間の分散、σ２ ｕ、クラスター内の分散、σ２ ｅ、及び実効標本数ｎｅｆｆを含む。
野生型、治療及び未治療のジストロフィーイヌにおける最小フェレット直径の分布を特徴付けるために、代表的なＨＰＦからの個々の測定値を表す点をプロットした。イヌの数が少ないため、この分析は完全に説明的である。
中心有核筋線維の割合を除くすべての分析を、平均± Ｓ．Ｄ．として示した。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて処理した。ｐ値の統計的有意性を図に示す：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ、有意ではない。
実施例３−ナノ−ユートロフィン及びナノ−ジストロフィンのＡＡＶ媒介送達を用いるＤＭＤの全身遺伝子治療
Ａ．ヒトナノユートロフィン設計
ロッドドメインの主要な役割は、力の縦方向の伝達であり、ジストロフィンの異常な長さは、タンパク質の進化の遺産を反映している。この洞察の結果、本発明者らは、他のアプローチの中心的限界に対処する方法を同定し、野生型と区別できないレベルで力伝達と筋保護を達成するための新規導入遺伝子を設計した。
本発明者らのジストロフィン遺伝子のオルソログ及びパラログの配列及び後生動物分類群の広範なサンプリングからの転写産物の分析から、本発明者らは、フレーム保存欠失又は重複を有する患者におけるＢＭＤは、機械的負荷時のロッドドメインの局所的不安定化に起因すると仮定した。この仮説は、ジストロフィン及び三重らせん反復ドメインを含む他のタンパク質からの結晶学的データ、隣接する三重らせん反復におけるアミノ酸間の進
化的結合のバイオインフォマティクス分析、並びに機械的負荷筋肉における小型化組換えタンパク質の本発明者らの研究からの未発表データによって支持される。今日までに報告された組換えミニ−ジストロフィンのいずれも、内部欠失部位における最も弱い結合の可能性を回避していないが、これは、用いられた設計アプローチのすべてが、交換可能なモジュラー単位として三重らせん反復をモデル化したためである。動物モデルにおける顕著な表現型の改善にもかかわらず、マイクロユートロフィンでさえこの制限のリスクとなる。この可能性に対処し、導入遺伝子をさらに短縮するために、本発明者らは、三重スプライスされた「ナノユートロフィン」（図４）のためのモデルを開発した。本発明者らは、隣接する反復間のより保存されていない負荷ループ−ループ界面における進化的に結合したアミノ酸側鎖相互作用のすべてを保存するために、２つの非隣接三重らせん反復の構造的に最も保存された三次元平面を横切って、ジストロフィン及びユートロフィンロッドを「切断」及び「溶接」する。これは、ドミノ・メタファを使用して図４にモデル化されている。次のセクションでは、これを、分子モデリングからのグラフィック表現を使用してより詳細に説明する。ジストロフィン欠損マウス（即時型）及びラット（ＤＭＤ線維症、変性、及び脱力のより良い病因モデルであるが、１０倍以上のベクターを必要とする）における連続的試験を通して、治療導入遺伝子を同定するために、マイクロユートロフィンを上回る潜在的改善のために、三重スプライスナノユートロフィンに関して評価を実施する。
Ｂ． ＤＭＤにおける全身送達のためのＡＡＶのスケーラブルな生産
ジストロフィーマウス及びイヌにおける本発明者らの前臨床試験において現在まで利用されているＡＡＶ９及びＡｎｃ８０ベクターは、三重プラスミドトランスフェクション法を適用することによってヒトＨＥＫ ２９３細胞において調製されている。この技術は、最終生成物が潜在的に免疫原性の細菌ＤＮＡメチル化パターンを保持するように、トランスフェクションの前に細菌株中で大規模に増殖させた投入プラスミドを用いて、豊富な培養培地中での足場依存性細胞の増殖に依存する。広範囲のカプシド及びプラットフォームを用いたＡＡＶベクターの発見及び生産は、足場依存性及び浮遊ＨＥＫ ２９３細胞、並びにバキュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞を含んで行った。
Ｃ． 動物モデル
ＡＡＶμ対ｎ−ユートロフィン全身療法の厳密な盲検試験は、今後の臨床試験の設計と実施に情報を与える一次、二次、及び探索的エンドポイントを用いて検討される。２つの主要エンドポイントを選択する：ｍｄｘマウスにおける統合的生理学的アッセイの本発明者らの公表されたスイートにおける最も感度の高い性能（ハイブリッド肢力垂直活動試験、（Ｓｏｎｇ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｉｔｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｓａｙｓ ｔｏ Ａｄｄｒｅｓｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｉｎ ｔｈｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｄｘ Ｍｏｕｓｅ． Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０１６： ｐ． ｊａｐ ００７７６ ２０１６）の図面を参照、及びタイチンのＮ末端２５ｋＤａ断片の定量的免疫検出（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ａ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｒａｍａｔｉｃ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ａｍｉｎｏ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｉｔｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｄｅｎｔｓ． Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ，
２０１７． ２７（７）： ｐ． ６３５−６４５）。例えば、図１２Ａ〜１２Ｄ及び図１３を参照されたい。後者は、異常なダイナミックレンジを有し、筋壊死の全身レベルを独自に反映し、筋原線維形成におけるタイチンアイソフォームの役割を基盤とする、非侵襲的で尿に基づくバイオアッセイである（実施例１）。本プロジェクトのこの目的の主要な目標は、ＤＭＤの主要な病理学的特徴を再現する費用効果の高いモデルにおいて、表
現型改善の程度及び耐久性を定量的に特徴付けることである。ｍｄｘマウスにおける研究は、ジストロフィン欠損ラットに系統的に拡張されている。なぜなら、この後者のモデルは、進行性筋力低下及び心筋症の容易に定量される指標に見られる特徴的な病的な筋変性及び線維症に、よりよく似ているからである。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ａ．Ｓ．， ｅｔ
ａｌ．， Ｄｒａｍａｔｉｃ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ａｍｉｎｏ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｉｔｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｄｅｎｔｓ。Ｐｅｔｒｏｆ， Ｂ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ ｆｒｏｍ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， １９９３． ９０： ｐ． ３７１０−１４； Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ， ２０１７． ２７（７）：
ｐ． ６３５−６４５； Ｌａｒｃｈｅｒ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｔｓ：
ａ ｎｅｗ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１４． ９（１０）： ｐ． ｅ１１０３７１；
Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｏｄｅｌ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ２０１４． ４： ｐ． ５６３５； Ｓｔｅｄｍａｎ， Ｈ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９１． ３５２（６３３５）： ｐ． ５３６−９； Ｓｈｒａｇｅｒ， Ｊ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｍｄｘ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．， ｉｎ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ａ．Ｍ． Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， Ｅｄｉｔｏｒｓ． １９９２， Ｒａｖｅｎ
Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ｐ． ３１７−３２８； Ｋｒｕｐｎｉｃｋ， Ａ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｄｉａｐｈｒａｇｍ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００３． ９４（２）： ｐ． ４１１−９； ａｎｄ Ｓｏｎｇ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓａｙｓ
ｔｏ ａｄｄｒｅｓｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ． Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０１７． １２２（３）： ｐ． ５９３−６０２．いくつかのイヌのモデルは（Ｃｏｏｐｅｒ， Ｂ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｌｏｃｕｓ ｉｓ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｏｆ ｄｏｇｓ． Ｎａｔｕｒｅ， １９８８． ３３４（６１７８）： ｐ． １５４−６； Ｓｍｉｔｈ， Ｂ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ
ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｍｕｓｃｌｅ ｔｙｐｅ ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９６． ２７１（３３）： ｐ． ２００７０−４； Ｂｒｉｄｇｅｓ， Ｃ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｏｂａｌ ｃａｒｄｉａｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｗｉｔｈ ｃａｒｄｉａｃ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ． Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ， ２００２． ７
３（６）： ｐ． １９３９−４６； Ａｒｒｕｄａ， Ｖ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ−２−Ｆ．ＩＸ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｉｎ ａ ｌａｒｇｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ． Ｂｌｏｏｄ， ２００４． Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ； Ａｒｒｕｄａ， Ｖ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｒａｎｓｖｅｎｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｓ
ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ． Ｂｌｏｏｄ， ２０１０． １１５（２３）： ｐ． ４６７８−８８； Ｍｅａｄ， Ａ．Ｆ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ
ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｊ
Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ （１９８５）， ２０１４． １１６（７）： ｐ． ８０７−１５； ａｎｄ Ｓｕ， Ｌ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｎｉｆｏｒｍ ｓｃａｌｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｓｔｒｉａｔｅｄ
ｍｕｓｃｌｅ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｖｅｎｕｌａｒ ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ
ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ２００５． １１２（１２）： ｐ． １７８０−８）を使用し、また、ＬＧＭＤのハムスターモデル（図１４Ａ〜図１４Ｇの組織学的アッセイ、Ｇｒｅｅｌｉｓｈ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， （Ｇｒｅｅｌｉｓｈ， Ｊ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｂｌｅ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ
ａｎｄ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ． Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９９． ５（４）： ｐ． ４３９−４３）より）を使用し、これは、人筋ジストロフィーにおいてＡＡＶベクターを使用した遺伝子療法の第１相臨床試験のための背景の腫瘍な部分を形成した：Ｓｔｅｄｍａｎ， ｅｔ
ａｌ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｓｔｅｄｍａｎ， Ｈ．， ｅｔ
ａｌ．， Ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｉｍｂ ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ： ａｌｐｈａ− ， ｂｅｔａ−， ｇａｍｍａ−， ｏｒ ｄｅｌｔａ−ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２０００． １１（５）： ｐ．
７７７−９０）。
Ｄ． 生成物プロファイル
Figure 2021521782
上のチャートは、ＡＡＶμユートロフィン又はＡＡＶｎユートロフィンの標的生成物プロフィールを示している。ＤＭＤにおける横紋筋細胞の進行性喪失及び線維脂肪置換に関する本発明者らの現在の理解は、高齢対象におけるこの疾患の有意な逆転が限られている場合があるが、さらなる筋細胞喪失の予防は、組換えμ−又はｎ−ユートロフィン発現の
開始後のどの段階でも可能である場合があることを示唆している。実験は、主にジストロフィン欠損マウス及びラットに向けて行われて、乳児期に治療されたＤＭＤ患者における理想的なパラメーターに対する期待を知らせる。乳児期に十分なＡＡＶμ−又はｎ−ユートロフィンを用いて形質導入して、成長を通してサルコグリカンの発現を骨格成熟まで正常化することにより、筋肉の比較的正常な成長、ひいては筋力の正常な成熟的増加が可能になる場合がある。少なくとも４つの因子が高齢患者における治療上の利益を制限する場合がある：１）治療前の不可逆的な筋細胞喪失の程度、２）筋線維脂肪置換がベクター送達及び筋細胞形質導入を損なう程度、３）ベクターに対する内皮透過性の成熟的低下、高齢患者における止血帯より遠位の血管内腔からの強制血管外漏出を潜在的に必要とすること、並びに４）患者の年齢が進むにつれてＡＡＶウイルスへの自然曝露が増加することが予想されること、それにより、複数のＡＡＶ血清型に対する高力価抗体及び保存されたＡＡＶカプシド由来ペプチドに対する記憶Ｔ細胞の両方を伴う割合が増加すること。用量制限毒性には、先天性免疫系及び／又は肝臓が関与する場合がある。
Ｅ． ジストロフィン欠乏症におけるμ−又はｎ−ユートロフィン置換の実験的及び理論的基礎
ユートロフィンは、元々、ジストロフィンとのコード配列相同性に基づいて発見された（Ｌｏｖｅ， Ｄ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ， １９８９． ３３９（６２１９）： ｐ． ５５−８）。本発明者らは、最近、広範な分類群からの公に利用可能な全ゲノム配列に基づいてジストロフィン及びユートロフィンの進化史を再構築した。２つの観察が関連している：１）両タンパク質のロッド様ドメインの「ドナー」遺伝子は、部分的遺伝子重複により、横紋筋の出現に先立ってＤｐ７１様ドメインにそれが連結される前に、少なくとも２１の縦列スペクトリン様反復ドメインを有していた、２）ユートロフィン及びジストロフィンの別々の遺伝子は、顎無し及び顎のある脊椎動物の共通祖先に至る系統に沿って、及びオリゴデンドロサイトの進化的出現前に、頭索動物の分岐後に固定された（Ｐｕｔｎａｍ， Ｎ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ａｍｐｈｉｏｘｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｏｒｄａｔｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ． Ｎａｔｕｒｅ， ２００８． ４５３（７１９８）： ｐ． １０６４−７１；及びＳｍｉｔｈ， Ｊ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅａ ｌａｍｐｒｅｙ （Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ） ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２０１３． ４５（４）： ｐ． ４１５−２１， ４２１ｅ１−２）。両タンパク質は、細胞骨格アクチンとジストロフィン（／ユートロフィン）関連タンパク質複合体（Ｄ／ＵＡＰＣ）の膜貫通糖タンパク質に対する結合界面を保持している。ユートロフィンの全長組換え誘導体は、マウスにおいて重度の筋ジストロフィー表現型さえ逆転できることは、十分に確立されている（Ｔｉｎｓｌｅｙ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９８． ４（１２）： ｐ． １４４１−４； Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅｓ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， １９９９． １０（８）： ｐ． １２９９−３１０； 及びＯｄｏｍ， Ｇ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｕｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒＡＡＶ６ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｌｉｆｅｓｐａｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ／ｕｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００８． １６（９）： ｐ． １５３９−４５）。本発明者らの知識における未解決のギャップは、祖先タンパク質の三重らせん反復の当初の縦列反復をもたらした選択圧の性質であり、また、ジストロフィンの現在の生理学的役割が、推定６ｎｍ／反復ｘ２４、又はネイティブタンパク質Ｄｐ４２７の１４４ｎｍ長さを「必要」とするか否かであった。小さな内部欠失を有する一部のＢＭＤ患者の重度の臨床的表現型は、Ｄｐ４２７の長さがショック吸収材としてのその役割に不可欠であることを示唆しているが、重複ＢＭＤは、これらの患者が野生型よりも長いジストロフィンを有するため、この解釈に挑む。本発明らのジストロフィンの遠隔進化史の再構築から別の解釈が浮かび上がる（実施例１）。
本発明者らは、「どれが最初にやってきたのか、ジストロフィンか筋節か？」という疑わしい単純な質問をした。目的は、ジストロフィン欠損哺乳類において、筋節の出現から急性損傷を最も受けやすい特殊化した速攣縮筋の最近の進化までの期間にジストロフィンロッドの長さが増加したモデル（（Ｗｅｂｓｔｅｒ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｆａｓｔ ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒｓ ａｒｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｃｅｌｌ， １９８８． ５２（４）： ｐ． ５０３−１３；及びＰｅｔｒｏｆ， Ｂ．Ｊ．，
ｅｔ ａｌ．， Ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｏｕｓｅ ｄｉａｐｈｒａｇｍ． Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １９９３． ２６５： ｐ． Ｃ８３４−Ｃ８４１）と、現存種のゲノム及び推測されるプロテオームから得られる利用可能なエビデンスが一致するかどうかを確認することであった。図１５に示すように、この証拠は、ジストロフィンが筋節に先行する再建を支持する。詳細な分析は、ジストロフィンが図６Ａ〜図６Ｃに示されるような高度に保存された遺伝子構造を有する、現存する脊椎動物及び刺胞動物（クラゲ）種において長さが同一であることを示す。ジストロフィンの長さは、筋節が出現するかなり前、もっとも単純な自由生活動物種であるセンモウヒラムシ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌａｘ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）に代表される門である平板動物門が分岐する前でさえ、達成された可能性が高い。この種は、繊毛ダイニン（ミオシンではない）をその主要な移動力源として使用し、そのボディープランは、４つの細胞型のみを特徴とし、いずれも同定可能な筋節を示さない（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｔｒｉｃｈｏｐｌａｘ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｐｌａｃｏｚｏａｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ， ２００８． ４５４（７２０７）： ｐ． ９５５−６０）。遺伝子構造の革新的な分析は、タンパク質の長さの８０％を占めるジストロフィンのロッド様ドメインが、アクチンフィラメントと微小管（ＭＡＣＦ）を架橋する際に明確な役割を有し、より大きな祖先タンパク質（スペクトリンではない、図６Ｂの明確なパターンに注目）からその全体が選択されたようだという説得力のある証拠を提供する。この発見の本質的な意味は、ジストロフィン自体ではなくＭＡＣＦ様タンパク質が２つのタンパク質の共通祖先のロッドドメインの元の伸長を促す選択圧の対象であったことである。ＭＡＣＦの結晶構造は、縦方向の力伝達の可能性に関してスペクトリンの結晶構造とは異なり、広範囲の分類群におけるジストロフィン及びユートロフィンの長さの保存の説明を提供する。図１６Ａ及び１６Ｂに示されるように、スペクトリン及びジストロプラキンは、重複の程度及び安定化アミノ酸側鎖相互作用の数に関して明確に折り畳まれる三重らせんを有する。図１６Ａ及び図１６Ｂにおいて、本発明者らは、（図１６Ａ）ヒトβ２−スペクトリン（３ＥＤＶ）及び（図１６Ｂ）ヒトプレクチン（５Ｊ１Ｇ）に由来する鋳型を使用して、ヒトユートロフィンの隣接する三重らせん反復をモデル化する。本発明者らのモデルは、筋細胞膜を破壊することなく、細胞内部から細胞外マトリックスに機械的力を伝達するために必要とされるように、力がインビボで広いドメイン間界面を横切って縦方向に伝達されることを予測する。従って、隣接する、潜在的に重なり合う三重らせん反復間の側鎖結合におけるいずれかの主要な破壊は、力伝達の間、ジストロフィン及びユートロフィンを不安定化する。
このモデルは、ロッドドメインの最も重要な特徴は、強度であり、長さではなく、遥かに長いＭＡＣＦホモログの部分的遺伝子重複による誘導体としてのそれらの歴史的遺産に起因するタンパク質の異常なサイズであるという命題と完全に一致する。従って、すべての反復間界面でロッドドメインの構造的完全性を最適化するように特に設計された短い組換えタンパク質は、全長タンパク質、例えばＤｐ４２７の機械的機能を完全に補完するはずである。これにアプローチするための概念的に最も単純な方法は、不適合な三重らせん反復を直接並置する内部再配置を回避することである。問題は、構造に関する結晶学的情報がジストロフィンの２４個の三重らせん反復のうちの１つだけに存在し、らせんＡとＣの中心にある保存されたトリプトファン残基を除いて、反復間の一次構造ホモログは低いということである。本発明者らは、最初に、全長ユートロフィンに対して１つの内部欠失と１つのＣ末端欠失を有する組換えタンパク質に焦点を当てることを選択し、これをマイクロ又はμ−ユートロフィンと命名した。図１７に示されるように、この構築物は、構造化されていない、プロリンに富むらせん間「ヒンジ−２」ドメインを、最後の三重らせん反復（全長ユートロフィンの２２番目）に対して並置する。最良の場合のシナリオでは、「ヒンジ」は、三重らせん反復２２配列に正確に一致することなく、縦方向の力を伝達する能力を有するらせん間スペーサーとして働くことができる。これは、以下及び実施例２に詳細に記載されるように、μユートロフィンの集中的な評価のための本発明者らの理論的根拠であった。
μ−ユートロフィン導入遺伝子最適化への系統的アプローチにより、筋節性ミオシン重鎖に対するコドンバイアスの使用は、インビトロで野生型の３０倍、免疫検出可能なタンパク質発現を増加させることが決定された（レーン５対レーン８、図１８）。実際、発現レベルは非常に高く、共トランスフェクトされたｅ−ｇｆｐ対照の発現と効果的に競合した。ＡＡＶ９へのパッケージング後の最適化されたμＵ構築物の治療効力を分析するために、本発明者らは、実施例２に記載されるように、ＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおいて、一連の無作為化され、盲検化された研究を行った。
最小Ｔ細胞ペプチドエピトープのＭＨＣ結合のインシリコ解析に基づくと、μユートロフィンは、ジストロフィン欠乏宿主のすべての仮想μジストフィンと比較して、１００分の１未満の数の潜在的に免疫優性の外来ペプチドを有する。これにより、ＤＭＤにおける治療後の自己免疫のリスク、及び慢性免疫抑制の潜在的必要性が最小限に抑えられる。非免疫抑制ＧＲＭＤイヌにおける全身μユートロフィン発現に関する本発明者らの盲検試験は、インターフェロンγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより末梢Ｔ細胞反応性が完全に欠如していることを立証することにより、さらなる安心を提供した。これらの試験は、必ずｍｄｘマウスで使用される最大用量の１／１０の用量（成体体重に標準化）で実施され、スケーラブルな生産技術を用いた大型動物ＤＭＤモデルにおける最大耐量を評価するために、将来においてのみ拡張され得る。
Ｆ． ジストロフィンの理論及び構造のメカノバイオロジー−ナノユートロフィン
本発明者らの知見は、臨床研究への移転のために開発されているすべてのＡＡＶサイズのジストロフィン候補に等しく関連するため、全分野に重要な意味を有する。
本発明者らは、ＡＡＶ注入ｍｄｘマウスにおけるμ−ユートロフィンの安定性に取り組むための一連の盲検実験を開始した。これらの定量的研究は、μユートロフィン発現のレベルに関して中間時点で非常に好ましいデータを既に提供している。しかしながら、さらなる分析において、本発明者らは、ユートロフィンのＮ末端に特異的な抗体で染色した後、ウェスタンブロット上に予期しない「余分なバンド」を認めた。図２１に要約されるように、この明瞭なバンドに割り当てられた分子量は、μユートロフィンの７９ｋｄのＮ末端部分の分子量と正確に一致する。換言すれば、この知見は、１３５ｋｄのμユートロフ
ィンが「ヒンジ２」からの部分とスペクトリン様反復２２との間の接合部のすぐ近くで破壊され、全長ユートロフィンに対応するコード配列欠失に隣接し、それによって、断片として７９ｋｄのＮ末端「サブドメイン」を放出することを示唆する。本発明者らの研究では、７９ｋｄバンドの出現及び強度と、筋肉による力変換の最近の最大レベルとの間に相関があるように思われる。次に、本発明者らは、液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析の組み合わせによるプロテオミクス分析に、７９ｋｄ領域の追加のゲルを供した。これにより、図２２に示すように、本発明者らの仮説が確認された。この発見は、スペクトリン反復、特に、ヒンジ２の一次構造のすぐ近くに配置された場合の４及び２２の互換性についての本発明者らの仮定を再考することを強いた。ジストロフィン、ユートロフィン及びタイチンの本発明者らのバイオインフォマティクス分析の知見を再検討したところ、タイチンのポリＩｇＧドメインは、進化的な時間をかけての互換性の強い証拠を示すことが明らかとなったが、同一の種間比較では、他の２つのタンパク質に互換性の証拠は見られない（実施例１）。このことは、ベッカー型ＭＤの選択された症例、特に遺伝子重複に関連した重篤な症例（推測により、ロッドの２つの祖先的に非隣接部分の新規接合部を横切る軸力伝達の最も弱いリンクを有する、野生型よりも長いジストロフィンが存在する）における遺伝子型−表現型相関についての説得力のある説明を提供する。
ＭＡＣＦ／プラキンタンパク質ファミリー由来の１つの結晶構造は、ジストロフィン及びユートロフィンの構造データが最初の三重らせん反復（すなわち、ロッドの極Ｎ末端）に限定され、ヒンジドメインが「非構造化」であると予測されるので、潜在的に有益である。この構造を決定する前に、三重らせん反復間のＳＨ３ドメインもヒンジとして機能し、ロッドの２つの強い部分の間の揺動界面が想起されるという推測があった。構造は、対照的に、ＳＨ３ドメインが両側の隣接する三重らせんからの適合性アミノ酸側鎖との複数の高親和性接触、すなわち、縦方向の力を伝達し、アンフォールディングに抵抗する可能性を有する配置をなすことを明らかにする（図２３は、プラキンドメインの３ＰＥｏ構造ＳＲ４及び５、ＳＨ３：スペースフィル中のＳＲ４／５結合界面を示す）。刺胞動物（クラゲ）の種由来のいくつかのジストロフィン／ユートロフィンオルソログの一次構造の分析は、介在するがＨＭＭ認識可能なドメインの存在を示すが、構造化されていない「ヒンジ」は示さず、ＭＡＣＦ様タンパク質からのジストロフィンロッドドメインの進化的起源とドメイン間界面の広い表面積を横切る長軸力伝達の大きさの両方についての本発明者らの仮説をさらに支持する。
これらの構造的及び機能的制約を念頭に置いて、本発明者らは、Ｄｐ４２７、すなわち全長ジストロフィンのためのＡＡＶ適合性小型化代替物の設計を再検討した。本発明者らは、ドメイン間界面への破壊が最小であるロッドドメインを内部的に再配列する独特の機会を利用するナノユートロフィンを設計した。これは、保存された軸方向断面を横切る異種の三重らせんの対を合体させることによってインシリコで達成され、これは、相互作用する高度に保存されたトリプトファン残基の部位に示され、三重らせんのコアを安定化する（図３）。本発明者らは、この構築物のためにコドン最適化ｃＤＮＡを合成し、２９３細胞の三重トランスフェクションのためにＩＴＲ隣接転写カセットベクターを作製し、マキシプレップした。さらに、本発明者らは、ｍｄｘマウスを、「マイクロ」又は「ナノ」ユートロフィンのいずれかをコードするＡＡＶを受けるように無作為化した盲検実験を行った。結果は、マイクロユートロフィンが７９ｋｄのＮ末端サブ断片の末端で正確に切断されたが、同様の生理学的負荷下でナノユートロフィンの検出可能な切断はなかったことを示した（図２８）。両タンパク質は、ｍｄｘマウスの筋肉で筋細胞膜に適切に局在していた。この実験からの知見は、マイクロユートロフィンと比較してナノユートロフィンの優れた強度がジストロフィンアイソフォームＤｐ４２７のメカノバイオロジーにより近似していることを示している。種々の疾患モデルにおける表現型の改善を評価するために、これらの実施例において上記で使用された方法を利用して、さらなる研究が行われる。並行して、ＡＡＶへの導入遺伝子パッケージングの効率におけるいずれかの改善の程度は、
減少したベクターゲノムサイズに基づいて確立される。
Ｇ． ＤＭＤ治療のための再構築された先祖ＡＡＶカプシド：Ａｎｃ８０、８１、８２
天然に存在するカプシド血清型９に基づくＡＡＶベクターは、イヌ及び非ヒト霊長類において横紋筋への顕著な全体的な生体分布を達成する。これの構造根拠はよく分かっていないが、選択された膜受容体への結合に関与するカプシド残基は、他の血清型については十分に定義されている。ＡＡＶ８は、イヌにおける効率的な心臓遺伝子導入のためのより良い選択であり、ＡＡＶ９が霊長類において心筋の確実な形質導入を提供するため、種差を反映する。ＡＡＶ８及び９の両方は、成人ヒト集団の有意な割合で中和抗体と関連する。横紋筋への全体的な生体分布を維持しながら、この制限を回避する努力において、Ｚｉｎｎら（（Ｚｉｎｎ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｙｉｅｌｄｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ， ２０１５． １２（６）： ｐ． １０５６−６８）は、インシリコでの祖先配列再構築と、インビトロでの遺伝子合成との組み合わせを使用して、「新規な」ベクターカプシド（すなわち、おそらく、天然に存在するが、ずっと前に絶滅したカプシドバリアントを再現する）を有するＡＡＶを調製した。これらの中で、Ａｎｃ８０、８１、及び８２と標識されたものは、詳細に記載されるように（Ｚｉｎｎら、上記に引用）、天然に存在する現存のＡＡＶへの歴史的曝露後に、高力価中和抗体の可能性を有する患者集団からの適格性プールを拡大しながら、ＡＡＶ８及び９の好ましい生体分布を反復又は延長するための最も直接的な機会を表す。
本発明者らは、最近、本発明者らのμユートロフィンゲノムをＡｎｃ８０カプシドにパッケージングし、得られたベクターを用いてｍｄｘマウスにおける関連筋の形質導入を評価した。これらの研究は、Ａｎｃ８０がこの状況において、心筋及び骨格筋の強力な形質導入を伴って、ＡＡＶ９のそれと同等の全体的な生体分布を達成することを示す（図２４Ａ〜２４Ｃ）。
無作為化盲検実験のデータから、Ａｎｃ８０及びＡＡＶ９は、治療導入遺伝子の発現レベルに基づいて、ジストロフィー筋肉においてインビボで同等の感染能を有することが確認されている。
ＡＡＶ９及びＡｎｃ８０を定性的に比較するために設計された実験を、ｍｄｘマウスのコホートにおけるμユートロフィンの生体分布について、これらのベクターを２．５×１０１２ｖｇ／マウスの等用量で全身投与した後に行った。各ベクターについての２匹のマウスからの複数の筋肉からの代表的なウェスタンブロットを図２５に示し、両方のベクターによる横紋筋の広範かつ効率的な形質導入を実証する。
実施例４ − ５反復変異体ユートロフィン及びジストロフィン
本発明者らは、上述した元の「ナノ」変異体に対して追加の三重らせんを含むユートロフィン及びジストロフィン組換えタンパク質を設計した。これらの「５反復」変異体は、Ｎ末端カルポニン相同ドメインと全長タンパク質に存在するＣ末端「ＷＷ−ＥＦ−ＺＺ」ドメインとの間に５つのスペクトリン様三重らせん反復を有する。これらのバリアントはまた、三重スプライス変異の存在により改善された安定性を有し、さらに、ＡＡＶベクターにパッケージングされることが可能である。重要なことに、これらの変異体の開発は、４反復ナノジストロフィン及びナノユートロフィン（本明細書に記載されるものを含む）を設計することに依存する原理が５つのらせん反復を有するバリアントに拡張できることを示す。５反復ジストフィンに対応するアミノ酸配列は、配列番号２２に提供され、ここで、スプライス変異は、全長ジストフィンタンパク質のらせん反復１及び２０を連結することによって形成された（図２９Ａ及び図２９Ｂ）。５反復ユートロフィンに対応するア
ミノ酸配列は、配列番号２１に提供され、ここで、スプライス変異は、全長ユートロフィンタンパク質のらせん反復１及び１８を連結することによって形成された（図３０Ａ及び図３０Ｂ）。
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下にフリーテキストを含む配列について提供されている。
Figure 2021521782
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本出願に引用されたすべての刊行物、特許、特許出願及び本明細書に参照された配列表、並びに２０１８年４月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６５８，４６４号は、各々の個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。多数の修正及び変形が、上記で特定された明細書の範囲に含まれ、当業者には明らかであると予想される。組成物及びプロセスに対するそのような修正及び変形、例えば異なるコード配列の選択、又はベクター若しくは免疫モジュレーターの選択若しくは投与量は、ここに添付される特許請求の範囲の範囲内にあると考えられる。

Claims (84)

  1. ＡＡＶカプシド及びベクターゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ベクターゲノムは、ハイブリッド三重らせんドメインを含むジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質をコードする核酸配列をその発現を指示する調節配列の制御下で含み、ハイブリッド三重らせんドメインは、
    らせんＡ’のＣ末端部分に融合されたらせんＡのＮ末端部分を含む第１のらせんと；
    らせんＢのＣ末端部分に融合されたらせんＢ’のＮ末端部分を含む第２のらせんと；
    らせんＣ’のＣ末端部分に融合されたらせんＣのＮ末端部分を含む第３のらせんと；
    を含み、
    らせんＡ、Ｂ、及びＣは、天然のジストロフィンスーパーファミリータンパク質中のらせんＡ’、Ｂ’、及びＣ’を有する第２の三重らせん反復に隣接しない第１の三重らせん反復中に存在する、ｒＡＡＶ。
  2. ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質が、三重スプライス変異体ジストロフィンである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  3. 三重スプライス変異体タンパク質が、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復３〜らせん反復２１における欠失を含む、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。
  4. 三重スプライス変異体タンパク質が、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復３〜らせん反復２３における欠失を含む、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。
  5. 三重スプライス変異体タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  6. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号２の配列を含む、請求項１〜３及び５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  7. 三重スプライス変異体タンパク質が、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復２〜らせん反復１９における欠失を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  8. 三重スプライス変異体タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１又は７に記載のｒＡＡＶ。
  9. ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質が、三重スプライス変異体ユートロフィンである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  10. ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質が三重スプライス変異体ユートロフィンであり、全長ユートロフィンの少なくともらせん反復３〜らせん反復１９における欠失を含む、請求項１又は９に記載のｒＡＡＶ。
  11. 三重変異体タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
  12. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列が配列番号４の配列を含む、請求項１、９、１０又は１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  13. 三重変異体タンパク質が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１又は１０に記載のｒＡＡＶ。
  14. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列が配列番号１９の配列、又は配列番号１９と約９５％〜約９９％同一の配列を含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶ。
  15. ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質が、三重スプライス変異体ユートロフィンであり、全長ユートロフィンの少なくともらせん反復２〜らせん反復１７における欠失を含む、請求項１又は９に記載のｒＡＡＶ。
  16. 三重変異体タンパク質が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のｒＡＡＶ。
  17. ＡＡＶカプシド及びベクターゲノムを有するｒＡＡＶであって、ベクターゲノムは、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列をその発現を指示する調節配列の制御下で含み、三重スプライス変異体タンパク質は、Ｎ末端らせん反復、ハイブリッド三重らせん反復、及びＣ末端らせん反復を含み、ここで、三重スプライス変異体タンパク質におけるハイブリッド反復を含むらせん反復の総数は、１から、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質のらせん反復数より１小さいいずれかの整数から選択され、ハイブリッド三重らせん反復は、図２Ｆに示されるように、らせん反復をその長軸に垂直に二分する平面上でスプライスされた２つのらせん反復によって形成される、ｒＡＡＶ。
  18. 変異体タンパク質のＮ末端らせん反復が、それが全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質中にある場合、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１に直ちに隣接し；変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が、それが全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質中にある場合、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２に直ちに隣接する、請求項１７に記載のｒＡＡＶ。
  19. 全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質がジストロフィンである、請求項１７又は１８に記載のｒＡＡＶ。
  20. 変異体タンパク質のＮ末端らせん反復が全長ジストロフィン中のらせん反復１を含み、並びに／又は、Ｃ末端らせん反復が全長ジストロフィン中のらせん反復２３及びらせん反復２４を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  21. Ｎ末端らせん反復が全長ジストロフィン中のらせん反復１からなり、Ｃ末端らせん反復が全長ジストロフィン中のらせん反復２３及びらせん反復２４からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１が全長ジストロフィン中のらせん反復２であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２が全長ジストロフィン中のらせん反復２２である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  22. 三重スプライス変異体タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  23. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする配列が、配列番号２の核酸配列を含む、請求項２２に記載のｒＡＡＶ。
  24. 全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質がユートロフィンである、請求項１７又は１８に記載のｒＡＡＶ。
  25. 変異体タンパク質のＮ末端らせん反復が全長ユートロフィン中のらせん反復１を含み、並びに／又は、変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が全長ユートロフィン中のらせん反復２１及び２２を含む、請求項１７、１８、及び２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  26. 変異体タンパク質のＮ末端らせん反復が全長ユートロフィン中のらせん反復１からなり、変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が全長ユートロフィン中のらせん反復２１及びらせん反復２２からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１が全長ユートロフィン中のらせん反復２であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２が全長ユートロフィン中のらせん反復２０である、請求項１７、１８、２４、及び２５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  27. 三重スプライス変異体タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１７、１８、及び２４〜２７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ
  28. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする配列が配列番号４の核酸配列を含む、請求項２７に記載のｒＡＡＶ。
  29. 三重変異体タンパク質が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１７、１８、及び２４〜２６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  30. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号１９、又は配列番号１９と約９５％〜約９９％同一の配列を含む、請求項２９に記載のｒＡＡＶ。
  31. ＡＡＶカプシド及びベクターゲノムを有するｒＡＡＶであって、ベクターゲノムは、ジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列をその発現を指示する調節配列の制御下で含み、三重スプライス変異体タンパク質は、ハイブリッド三重らせん反復及びＣ末端らせん反復を含み、三重スプライス変異体タンパク質におけるハイブリッド反復を含むらせん反復の総数は、５であり、ハイブリッド三重らせん反復は、図２Ｆに示されるように、らせん反復をその長軸に垂直に二分する平面上でスプライスされた２つのらせん反復によって形成される、ｒＡＡＶ。
  32. 変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が全長ジストロフィン中のらせん反復２１、２２、２３、及び２４からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１が全長ジストロフィン中のらせん反復１であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２が、全長ジストロフィン中のらせん反復２０である、請求項３１に記載のｒＡＡＶ。
  33. 三重スプライス変異体タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のｒＡＡＶ。
  34. 変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が全長ユートロフィン中のらせん反復１９、２０、２１、及び２２からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１が全長ユートロフィン中のらせん反復１であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２が全長ユートロフィン中のらせん反復１８である、請求項３１に記載のｒＡＡＶ。
  35. 三重スプライス変異体タンパク質が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のｒＡＡＶ。
  36. 調節配列がプロモーターを含み、プロモーターが構成的プロモーターであり、又はプロ
    モーターが筋肉特異的プロモーターである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  37. 筋肉特異的プロモーターが、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター又はＳＰｃ５−１２プロモーターである、請求項３６記載のｒＡＡＶ。
  38. 調節配列が、キメラＣＳ−ＣＲＭ４／ＳＰｃ５−１２プロモーターを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  39. 調節配列がエンハンサーを含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  40. エンハンサーが、ＭＣＫエンハンサーの二重又は三重タンデムである、請求項３９に記載のｒＡＡＶ。
  41. 組換えアデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８三重、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１及びＡｎｃ８２から選択される、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  42. ハイブリッド三重らせんドメインを含む組換えジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質であって、
    らせんＡ’のＣ末端部分に融合されたらせんＡのＮ末端部分を含む第１のらせんと；
    らせんＢのＣ末端部分に融合されらせんＢ’のＮ末端部分を含む第２のらせんと；
    らせんＣ’のＣ末端部分に融合されらせんＣのＮ末端部分を含む第３のらせんと；
    を含み、
    らせんＡ、Ｂ、及びＣは、天然のジストロフィンスーパーファミリータンパク質中のらせんＡ’、Ｂ’、及びＣ’を有する第２の三重らせん反復に隣接しない第１の三重らせん反復中に存在する、組換えジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質。
  43. ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質が、三重スプライス変異体ジストロフィンである、請求項４２に記載の組換えタンパク質。
  44. 三重スプライス変異体タンパク質が、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復３〜らせん反復２１における欠失を含む、請求項４２又は４３に記載の組換えタンパク質。
  45. 三重スプライス変異体タンパク質が、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復３〜らせん反復２３における欠失を含む、請求項４２又は４３に記載の組換えタンパク質。
  46. 三重スプライス変異体タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  47. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列が配列番号２の配列を含む、請求項４２〜４４及び４６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  48. 三重スプライス変異体タンパク質が、全長ジストロフィンの少なくともらせん反復２〜らせん反復１９における欠失を含む、請求項４２に記載の組換えタンパク質。
  49. 三重スプライス変異体タンパク質が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項４２又は４８に記載の組換えタンパク質。
  50. ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質が、三重スプライス変異体ユートロフィンである、請求項４２に記載の組換えタンパク質。
  51. ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質が、三重スプライス変異体ユートロフィンであり、全長ユートロフィンの少なくともらせん反復３〜らせん反復１９における欠失を含む、請求項４２又は５０に記載の組換えタンパク質。
  52. 三重変異体タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の組換えタンパク質
  53. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列が配列番号４の配列を含む、請求項４２及び５０〜５２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  54. 三重変異体タンパク質が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項４２又は５１に記載の組換えタンパク質。
  55. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号１９、又は配列番号１９と約９５％〜約９９％同一の配列を含む、請求項５４に記載の組換えタンパク質。
  56. ジストロフィンスーパーファミリー変異体タンパク質が、三重スプライス変異体ユートロフィンであり、全長ユートロフィンの少なくともらせん反復２〜らせん反復１７における欠失を含む、請求項４２又は５０に記載の組換えタンパク質。
  57. 三重変異体タンパク質が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項４２、５０又は５６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  58. Ｎ末端らせん反復、ハイブリッド三重らせん反復、及びＣ末端らせん反復を含む組換えジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質であって、三重スプライス変異体タンパク質におけるハイブリッド反復を含むらせん反復の総数が、１から、全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質のらせん反復数より１小さいいずれかの整数から選択され、ハイブリッド三重らせん反復が、図２Ｆに示されるように、らせん反復をその長軸に垂直に二分する平面上でスプライスされた２つのらせん反復によって形成される、組換えジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質。
  59. 変異体タンパク質のＮ末端らせん反復が、それが全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質中にある場合、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１に直ちに隣接し；変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が、それが全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質にある場合、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２に直ちに隣接する、請求項５８に記載の組換えタンパク質。
  60. 全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質がジストロフィンである、請求項５８又は５９に記載の組換えタンパク質。
  61. 変異体タンパク質のＮ末端らせん反復が全長ジストロフィン中にらせん反復１を含み、及び／又はＣ末端らせん反復が全長ジストロフィン中にらせん反復２３及びらせん反復２４を含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  62. Ｎ末端らせん反復が全長ジストロフィン中のらせん反復１からなり、Ｃ末端らせん反復が全長ジストロフィン中のらせん反復２３とらせん反復２４からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１が全長ジストロフィン中のらせん反復２
    であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２が全長ジストロフィン中のらせん反復２２である、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  63. 三重スプライス変異体タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  64. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする配列が、配列番号２の核酸配列を含む、請求項６３に記載の組換えタンパク質。
  65. 全長ジストロフィンスーパーファミリータンパク質がユートロフィンである、請求項５８又は５９に記載の組換えタンパク質。
  66. 変異体タンパク質のＮ末端らせん反復が全長ユートロフィン中にらせん反復１を含み、及び／又は変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が全長ユートロフィン中にらせん反復２１及び２２を含む、請求項５８、５９、及び６５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  67. 変異体タンパク質のＮ末端らせん反復が全長ユートロフィン中のらせん反復１からなり、変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が全長ユートロフィン中のらせん反復２１及びらせん反復２２からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１が全長ユートロフィン中のらせん反復２であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２が全長ユートロフィン中のらせん反復２０である、請求項５８、５９、６５、及び６６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  68. 三重スプライス変異体タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項５８、５９、及び６５〜６７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質
  69. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする配列が、配列番号４の核酸配列を含む、請求項６８に記載の組換えタンパク質。
  70. 三重変異体タンパク質が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項５８、５９、及び６５〜６７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  71. 三重スプライス変異体タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号１９、又は配列番号１９と約９５％〜約９９％同一の配列を含む、請求項７０に記載の組換えタンパク質。
  72. ハイブリッド三重らせん反復及びＣ末端らせん反復を含む組換えジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質であって、三重スプライス変異体タンパク質におけるハイブリッド反復を含むらせん反復の総数は、５であり、ハイブリッド三重らせん反復は、図２Ｆに示されるように、らせん反復をその長軸に垂直に二分する平面上でスプライスされた２つのらせん反復によって形成される、組換えジストロフィンスーパーファミリー三重スプライス変異体タンパク質。
  73. 変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が全長ジストロフィン中のらせん反復２１、２２、２３、及び２４からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１が全長ジストロフィン中のらせん反復１であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２が、全長ジストロフィン中のらせん反復２０である、請求項７２に記載の組換えタンパク質。
  74. 三重スプライス変異体タンパク質が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載のｒＡＡＶ。
  75. 変異体タンパク質のＣ末端らせん反復が全長ユートロフィン中のらせん反復１９、２０、２１、及び２２からなり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復１が全長ユートロフィン中のらせん反復１であり、ハイブリッド三重らせん反復を形成する２つの反復のらせん反復２が全長ユートロフィン中のらせん反復１８である、請求項７２に記載のｒＡＡＶ。
  76. 三重スプライス変異体タンパク質が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項７５に記載のｒＡＡＶ。
  77. 配列番号１、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は２２のアミノ酸配列を含む新規組換え変異体ジストロフィンタンパク質。
  78. 配列番号３、２０、又は２１のアミノ酸配列を含む新規な組換え変異体ユートロフィン。
  79. 請求項４２〜７８のいずれか一項に記載の変異ジストロフィンスーパーファミリータンパク質をコードする組換え核酸配列。
  80. その発現を指示する調節配列の制御下にある請求項７９に記載の核酸配列を含むプラスミド。
  81. 製剤緩衝剤中に請求項１〜４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物。
  82. デュシェンヌ型筋ジストロフィーと診断された対象を治療する方法であって、請求項８１に記載の組成物に投与することを含む方法。
  83. それを必要とする対象のＭＤＳを治療するための方法において使用するための、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  84. デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造における、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶの使用。
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