SA518400245B1 - توصيل ناقل فيروس مرتبط بالغدة لـ b - سركوجليكان وميكرونا-29 وعلاج ضمور العضلات - Google Patents

توصيل ناقل فيروس مرتبط بالغدة لـ b - سركوجليكان وميكرونا-29 وعلاج ضمور العضلات Download PDF

Info

Publication number
SA518400245B1
SA518400245B1 SA518400245A SA518400245A SA518400245B1 SA 518400245 B1 SA518400245 B1 SA 518400245B1 SA 518400245 A SA518400245 A SA 518400245A SA 518400245 A SA518400245 A SA 518400245A SA 518400245 B1 SA518400245 B1 SA 518400245B1
Authority
SA
Saudi Arabia
Prior art keywords
muscle
adenovirus
adeno
associated virus
recombinant
Prior art date
Application number
SA518400245A
Other languages
English (en)
Inventor
– كلاباك لويس رودينو
جيرى ار مينديل
Original Assignee
ريسيرش انستيتيوت ات ناشنوايد شيلدرينز هوسبيتال
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ريسيرش انستيتيوت ات ناشنوايد شيلدرينز هوسبيتال filed Critical ريسيرش انستيتيوت ات ناشنوايد شيلدرينز هوسبيتال
Publication of SA518400245B1 publication Critical patent/SA518400245B1/ar

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

يتعلق الاختراع الحالي بنواقل vectors الفيروس الغدي Adeno-associated virus (AAV)الناتجة عن عودة الاتحاد الجيني recombinant التي تشتمل على متوالية بولي نوكليوتيد polynucleotide تتضمن β-سركوجليكان β-sarcoglycan وطرق استخدام النواقل الناتجة عن عودة الاتحاد الجيني recombinant vectors لتقليل أو منع التليف fibrosis لدى الكائنات الثديية التي تعاني من ضمور العضلات muscular dystrophy. كما يصف الاختراع علاجات مشتركة combination therapies تشتمل على إعطاء ناقل (نواقل) الفيروس الغدي التي تعبر عن β-سركوجليكان وmiR-29c إلى الكائنات الثديية التي تعاني من ضمور العضلات. شكل 5أ

Description

توصيل ناقل فيروس مرتبط بالغدة ل ]-سركوجليكان وميكرونا-29 وعلاج ضمور العضلات ‎ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR DELIVERY OF B-SARCOGLYCAN‏ ‎AND MICRORNA-29 AND THE TREATMENT OF MUSCULAR DYSTROPHY‏ الوصف الكامل خلفية الاختراع يستند هذا الطلب في الأسبقية إلى الطلب الأمريكي المؤقت رقم 62/323.333؛ المودّع بتاريخ 15 أبريل 2016 والطلب الأمريكي المؤقت رقم 62/433.548 المودّع بتاريخ 13 ديسمبر 2016 حيث يتم تضمينهما كمرجع هنا في مجملهما. تضمين الإشارة إلى المواد المقدّمة إلكترونيا يحتوي هذا التطبيق» كجزء منفصل من ‎(RES‏ على سلسلة متواليات في صورة مقروءة بواسطة الكمبيوتر يتم تضميئها بالإشارة إليها في مجملها ويتم تحديدها على النحو التالي: اسم الملف: ‎£50622A_Seqlisting.txt‏ الحجم: 21.466 بايت؛ تاريخ الإنشاء: 13 أبريل لعام 2017. يتم في هذه الوثيقة وصف نواقل علاجية ‎fie therapy vectors‏ نواقل الفيروس الغدي ‎Adeno-‏ ‎(AAV) associated virus 0‏ التي تعبر عن م-سركوجليكان ‎B-sarcoglycan‏ وطريقة استخدام هذه النواقل لتقليل ومنع التليف ‎fibrosis‏ في المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات ‎muscular‏ ‎.dystrophy‏ يوفر الاختراع أيضًا طرق علاج جيني مشترك ‎combination gene therapy‏ تشتمل على إعطاء ناقل ‎vector‏ الفيروس الغدي أول يعبر عن م-سركوجليكان وناقل الفيروس الغدي ثاني يعبر عن 08-29 لتقليل ومنع التليف في المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات. 5 إن ضمور عضلات حزام الأطراف ‎(LGMD) Limb-girdle muscular dystrophy‏ من النوع ‎2E‏ ‏(ضمور عضلات ‎ahs‏ الأطراف من التوع ‎Limb-girdle muscular dystrophy type 2E 2E‏ اختصارًا ‎(LGMD2E)‏ عبارة عن اضطراب وراثي صبغي جسدي متنحي ‎autosomal recessive‏ :©1800 ناتج عن طفرات ‎mutations‏ في تشفير الجين م]-سركوجليكان ‎¢(SGCB) B-sarcoglycan‏ مما يتسبب في فقدان البروتين الوظيفي ‎functional protein‏ 1 يمثل ضمور عضلات ‎aba‏ ‏0 الأطراف من النوع 28 ‎SKE‏ شائعًا وشديدًا ‎Ga‏ من مرض ضمور عضلات حزام الأطراف في الولايات المتحدة مع وجود تقارير تشير إلى حدوثه في جميع أنحاء العالم بنسبة 200.000/1- 1 . (2) يؤدي غياب م-سركوجليكان إلى الإصابة بالضمور التدريجي ‎progressive‏ ‎dystrophy‏ مع فقدان الألياف العضلية المزمن ‎«chronic muscle fiber loss‏ الالتهابات
)4 3) ‏استبدال الدهون والتليف» وكلها تؤدي إلى تدهور قوة العضلات ووظيفتها.‎ cinflammation ‏(-ه» 8 - 5-)؛ التي تتراوح في حجمها ما بين‎ sarcoglyeans ‏كمعقد؛ تتسم مركبات سركوجليكان‎ ‏توفر الثبات‎ transmembrane proteins ‏و50 كيلو دالتون» )5( بأنها كلها بروتينات عبر الغشاء‎ 5 mechanical stress ‏بما يوفر الحماية من الإجهاد الميكانيكي‎ sarcolemma ‏إلى الغلاف العضلي‎ ‏في ضمور عضلات حزام‎ 3-sarcoglycan ‏خلال نشاط العضلة. (3) يؤدي فقدان 3-سركوجليكان‎ 5 ‏من النوع 28 عادة إلى درجات متفاوتة من_الفقد المتزامن لبروتينات سركوجايكان‎ GLY) fragility of muscle membrane ‏أخرى تساهم في هشاشة غشاء العضلات‎ sarcoglycan proteins ‏الظاهري‎ hall ‏على الرغم من تباين نطاق‎ myofibers ‏مما يؤدي إلى فقدان الألياف العضلية‎ ‏يحدث التشخيص عادة قبل سن العاشرة‎ QE ‏السريري لضمور عضلات حزام الأطراف من النوع‎ ‏وفقدان المشي في منتصف إلى أواخر سن المراهقة. (1؛ 6؛ 7) المرضى الذين يعانون من ارتفاع‎ 0 ‏(016)؛ ضعف العضلات القريبة؛ صعوية ناشئة‎ serum creatine kinase ‏كرباتين كيناز في المصل‎ ‏في ما يصل إلى خمسين‎ Cardiac involvement ‏عن الفقدان التدريجي للمشي . تحدث إصابة بالقلب‎
بالمائة من الحالات. إن الفيروس الغدي عبارة عن فيروس صغير يعاني من نقص في النسخ ‎replication-deficient‏ ‎cparvovirus 1 5‏ وجينوم ‎genome‏ الحمض النووي مفرد الجديلة الخاص به حوالي 4.7 كيلو قاعدة من حيث الطول متضمنا اثنين من متواليات تكرار طرفية عكسية ‎(ITRs) inverted terminal repeat‏ ذي 145 نوكليوتيد ‎nucleotide‏ هناك أنماط مصلية متعددة من الفيروس الغدي. ومتواليات التوكليوتيد للجينوم الخاص بأنواع المصل للفيروس الغدي معروفة. على سبيل المثال؛ يتم تقديم ‎psu‏ كامل للفيروس الغدي- 1 برقم قيد ‎GenBank‏ هو ‎No.
NC_001401‏ و ‎Srivastava et al., J.‏ ‎¢(Virol., 45: 555-564 {1983 20‏ يتم تقديم الجينوم الكامل للفيروس الغدي-3 في رقم قيد ‎GenBank‏ ‏هو ‎NC_1829‏ يتم تقديم الجينوم الكامل للفيروس الغدي-4 .في رقم قيد ‎GenBank‏ هو ‎¢NC_001829‏ يتم تقديم الجينوم الفيروس الغدي-5 في رقم قيد ‎GenBank‏ هو ‎¢AF085716‏ يتم تقديم الجينوم الكامل للفيروس الغدي-6 في رقم قيد ‎GenBank‏ هو 1862 810-00 يتم تقديم ‎shal‏ ‏على الأقل من الجين الفيروس الغدي-7 والفيروس الغدي-8 في أرقام قيد ‎GenBank‏ هي ‎(AX753249 5 AX753246 5‏ على التوالي؛ وبتم تقديم جينوم الفيروس الغدي-9 في ‎Gao ef al., J.‏ ‎¢Virol, 78: 6381-6388 (2004)‏ وبتم تقديم جينوم الفيروس الغدي-10 في -67 :)13(1 ,70:67 ‎Mol.‏
)2006( £76 وبتم تقديم الجينوم الفيروس الغدي-11 في )2004( 375-383 :)330(2 ‎Virology,‏ يتم تقديم متوالية 111.74 ‎AAV‏ في البراءة الأمريكية رقم 9.434.928 التي يتم تضمينها هنا كمرجع. يتم تضمين المتواليات الفاعلة عند سيس ‎Cis-acting sequences‏ التي توجه نسخ ‎(rep) replication‏ الحمض التووى الريبوزىي منقوص الأكسجين ‎Deoxyribonucleic acid‏ (0118)_الفيروسي؛ التغليف/التغليف وتكامل الكروموسوم للخلية المضيفة ‎host cell chromosome‏ في الفيروس الغدي متواليات تكرار طرفية عكسية. يقوم ثلاثة من معززي ‎promoters‏ الفيروس الغدي (وهي 05 019 و40 لمواقع الخريطة النسبية) بدفع التعبير عن إطارين للقراءة المفتوحة الفيروس الغدي الداخلية التي تقوم بتشفير الجينات نسخ و كابسيد ‎capsid‏ (600). يقوم معززان النسخ (وهما 5م و19م)؛ المقترنين بالتضفير التفاضلي ‎differential splicing‏ للإنترون ‎intron‏ الفيروس الغدي الواحد (على ‎Jun 0‏ المثال؛ في نوكليوتيد 2107 و2227)؛ بإنتاج أربعة بروتينات النسخ (هي نسخ 78( نسخ 8؛ نسخ 52؛ و نسخ 40( من جين النسخ. تمتلك بروتينات النسخ العديد من الخصائص الأنزيمية المسؤولة في النهاية عن تكرار الجينوم الفيروسي ‎viral genome‏ يتم التعبير عن جين كابسيد من المعزز ‎aging p40‏ بتشفير ثلاثة بروتينات كابسيد ‎capsid proteins capsid‏ فى بى 1 ‎«VPL‏ فى بى ‎<VP2 2‏ 5 فى بى 3 703. تعد عمليات الجدل البديلة ومواقع بدء الترجمة غير التوافقية مسؤولة 5 عن إنتاج بروتينات كابسيد الثلاثة ذات الصلة. ‎dag‏ موقع واحد توافقي متعدد التذييل بعديد الأدينيلات ‎single consensus polyadenylation site‏ على موضع الخريطة 95 لجينوم الفيروس الغدي. يتم استعراض دورة حياة وعلم الوراثة للفيروس الغدي في المرجع ‎Muzyczka, Current‏
‎Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)‏ يمتلك الفيروس الغدي ميزات فريدة تجعله موضع جذب كناقل لتوصيل الحمض النووي الخارجي ‎(DAN 0‏ على سبيل المثال؛ في العلاج الجيني ‎-gene therapy‏ إن عدوى ‎infection‏ الفيروس الغدي للخلايا في المستنبت ‎culture‏ تكون غير معدية خلويا ‎cnoncytopathic‏ وتكون العدوى الطبيعية ‎natural infection‏ للبشر والحيوانات الأخرى صامتة وبلا أعراض. علاوة على ذلك يصيب الفيروس الغدي العديد من ‎LAS‏ الثدييات ‎mammalian cells‏ مما يسمح بإمكانية استهداف العديد من الأنسجة ‎tissues‏ المختلفة في داخل جسم الكائن. علاوة على ذلك؛ يقوم الفيروس الغدي بتحويل 5 الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة ببطء؛ وبمكن أن يستمر بشكل أساسي في دورة عمر هذه الخلايا كإبيسوم نووي نشيط ‎active nuclear episome‏ تكاثريًا (عنصر خارج الكروموسوم
‎.(extrachromosomal element‏ يتم إدخال الجينوم طليعة الفيروس ‎proviral genome‏ للفيروس الغدي كحمض نووي مستنسخ في البلازميدات ‎plasmids‏ مما يجعل إنشاء ‎asim‏ متحور ‎Why‏ ‎recombinant genomes‏ ممكنا. وعلاوة على ‎Blas dll‏ للإشارات التي توجه تكرار الفيروس الغدي؛ يتم تضمين تغليف الجينوم في متواليات تكرار طرفية عكسية لجينوم الفيروس الغدي؛ حيث يمكن أن يتم استبدال بعض أو كل ال 4.3 كيلو قاعدة الداخلية للجينوم (تكرار تشفيري ‎encoding replication‏ وبروتينات كابسيد ‎estructural capsid proteins Aol‏ نسخ كابسيد) بحمض نووي خارجي. لتوليد نواقل الفيروس الغدي؛ يمكن توفير بروتينات نسخ وكابسيد في ‎trans‏ ميزة أخرى هامة للفيروس الغدي تكمن في أنه فيروس مستقر ومعافى للغاية. من السهل مقاومته للظروف المستخدمة لإبطال نشاط الفيروس الغدي )56 إلى 65 درجة مئوية لعدة ساعات)؛ مما يجعل الاحتفاظ البارد بالفيروس 0 الغدي أقل أهمية. يمكن تجفيف الفيروس الغدي بالتجميد. وأخيرًاء لا تكون ‎WAY‏ المصابة بالتهاب ‎infected cells‏ الفيروس الغدي مقاومة للإصابة بعدوى إضافية ‎-superinfection‏ ‏أظهرت دراسات متعددة التعبير طويلة المدى عن بروتين بوساطة الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ )< 1.5 سنة) في العضلات. انظر ‎Clark et al., Hum Gene Ther,‏ ‎Kessler et al., Proc Nat.
Acad Sc.
USA, 93: 14082-14087 (1996)‏ ;)1997( 659-669 :¢8 و ‎J Virol, 70: 8098-8108 (1996) 15‏ .اه ‎Xiao et‏ انظر أيضًا 2:619-623 ‎Chao et al., Mol Ther,‏ )2000( و )2001( 4:217-222 ‎Chao er al., Mol Ther,‏ علاوة على ‎«eld‏ نظرا لأن ‎CO lanl)‏ تكون أوعية دموية بغزارة ‎<highly vascularized‏ فقد أدى تحويل الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني إلى ظهور نواتج جين محور ‎transgene products‏ في الدورة الجهازية ‎systemic‏ ‎circulation‏ بعد الحقن في العضل ‎intramuscular injection‏ كما هو موصوف في ‎Herzog eral,‏ ‎Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) 20‏ و ‎Proc Natl Acad Sci‏ مله ‎Murphy et‏ ‎USA, 94: 13921-13926 (1997)‏ علاوة على ‎Ay‏ أثبت 8769-8775 :76 ‎J Virol,‏ مله ‎Lewis et‏ (2002) أن ألياف العضلة الهيكلية ‎skeletal myofibers‏ تمتلك العوامل الخلوية ‎cellular factors‏ اللازمة من أجل الارتباط الصحيح بالجليكوزيل للجسم المضاد ‎«antibody glycosylation‏ والطي؛ والإفراز «0نا:»»»؛ مما يشير إلى أن العضلات قادرة على التعبير عن علاجات البروتين التي يتم 5 إفرازها ‎.secreted protein therapeutics‏ تتمثل الصورة الناشئة لعلاج مرض ضمور عضلات حزام الأطراف من النوع 28 في التوصيل
الجيني بوساطة فيروسية ‎viral-mediated gene delivery‏ لاستعادة البروتين من النوع غير المعالج ‎wild-type protein‏ إلى العضلات المصابة ‎affected muscle‏ مما يؤدي إلى استعادة وظيفة العضلات. وبالنظر إلى إمكانية إصابة مجموعة ‎dep‏ من المرضى بمرض القلب ‎«cardiomyopathy‏ )8 9< 10< 13( فيتوجب أخذ هذا في الاعتبار خلال الرعاية طويلة الأجل لهؤلاء المرضى. في تقارير سابقة؛ تم تمييز فأرة ‎Sgeb-null‏ بشكل جيد. وقام ‎Araishi‏ وآخرون )3( بتطوير فأر لديه نقص في م]-سركوجليكان مصحويًا بفقدان جميع جزيئات سركوجليكان فضلا عن سركوسبان ‎csarcospan‏ مع احتفاظ ضئيل على الأقل بالميروسين ‎cmerosin‏ جزيئات ديستروجليكان ‎dystroglycans‏ والديستروفين ‎cdystrophin‏ مما يعيد إنتاج الصورة السريرية الملحوظة في ضمور عضلات حزام الأطراف من النوع ‎OF‏ وكانت التغيرات النسيجية ‎histological changes‏ في هذا 0 النموذج الحيواني أيضًا نموذجا أوليا لنظيره السريري؛ بما في ذلك ظهور تليف العضلات الهيكلية ‎skeletal muscle fibrosis‏ )14( قام ‎Dressman‏ وآخرون (25) بحقن عضلة البطن العرضية ‎transverse abdominal muscle‏ باستخدام ‎.rAAV2.CMV.SGCB‏ استمر التعبير لمدة 21 ‎Bed‏ ‏وتم حماية ألياف العضلات ‎muscle fibers‏ من النخر المتكرر ‎recurrent necrosis‏ وأدى استخدام ‎ug dll‏ الغدي المتمم ذاتيًا إلى تحسين التعبير عن الجين المتحور ‎«transgene‏ )16( معزز ‎promoter 5‏ خاص بعضلة معينة لتحسين العضلة الهيكلية المستهدفة ‎target skeletal muscle‏ )20 26( وقد تم ‎Lad‏ وصف تحسين جين م -سركوجليكان البشري ‎human B-sarcoglycan gene‏ ‎.(hSGCB)‏ ‏إن التحسن الوظيفي في المرضى الذين يعانون من ضمور عضلات حزام الأطراف وأنواع ضمور العضلات الأخرى يتطلب كلا من استعادة الجينات وتقليل التليف. هناك حاجة إلى طرق للحد من 0 التليف التي قد تكون مقترنة بطرق استعادة الجينات لعلاج أكثر فعالية لمرض ضمور عضلات حزام الأطراف وغيره من أنواع ضمور العضلات. الوصف العام للاختراع يتعلق الاختراع ‎all‏ بوصف نواقل العلاج الجيني ‎therapy vectors‏ 06ع» على سبيل المثال الفيروس الغدي؛ التي تعبر عن جين م-سركوجليكان وطرق توصيل م-سركوجليكان إلى العضلة 5 تلتقليل و/أو منع التليف؛ و/أو زيادة القوة العضلية ‎«muscular force‏ و/أو علاج ‎Oia Symp‏ لدى شخص من الثدييات يعاني من ضمور العضلات.
بالإضافة إلى ذلك؛ يوفر الاختراع علاجات مشتركة ‎combination therapies‏ وطرق تستخدم نواقل العلاج الجيني لتوصيل م-سركوجليكان لمعالجة عيوب الجينات الملحوظة في ضمور عضلات
حزام الأطراف من النوع 28 ونواقل العلاج الجيني التي توصل 18-29 لمزيد من تثبيط التليف. في أحد الجوانب؛ يتعلق الاختراع بوصف ناقل الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني يشتمل على متوالية بولي نوكليوتيد ‎polynucleotide‏ تشفر 8]-سركوجليكان. في بعض التجسيدات؛ تشتمل متوالية البولي نوكليوتيد التي تشفر م]-سركوجليكان على متوالية تتطابق بنسبة تبلغ على سبيل المثال 5 على ‎JN‏ 770 على الأقل» 775 على ‎«JN‏ 780على ‎«JV‏ 381 382 383 84 5) 86 387 88 أو 789 ‎Lad‏ أكثر ‎dws‏ 90ن 91ت 792 93ن 94ن 5و9 6؛ 297 198 799 أو أكثر مع متوالية النوكليوتيد المذكورة في رقم تعريف المتوالية: 1
0 وتشفر البروتين الذي يحتفظ بنشاط م-سركوجليكان. في بعض التجسيدات؛ تشتمل متوالية البولي نوكليوتيد التي تشفر م]-سركوجليكان على متوالية النوكليوتيد المذكورة في رقم تعريف المتوالية: 1. في بعض التجسيدات؛ تتكون متوالية ‎doll‏ نوكليوتيد التي تشفر م]-سركوجليكان من متوالية النوكليوتيد المذكورة في رقم تعريف المتوالية: 1. في جانب آخرء يشتمل ناقل الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني الموصوف هنا على
5 متوالية بولي نوكليوتيد تشفر م-سركوجليكان تتطابق بنسبة 765 على ‎JY‏ 770 على الأقل؛ 5 على ‎JN‏ 780 على ‎J 83 382 81 JN‏ 84/ 385 3786 3187 17188 أو 9 أكثر من 790 على ‎«(JN‏ 791 792 293 أو 794 و795 على ‎(IN‏ 796 على الأقل أو 797 أو 798 أو 799 مع متوالية الحمض الأميني ‎amino acid‏ ذات رقم تعريف المتوالية: 2 ويحتفظ البروتين بنشاط م]-سركوجليكان.
0 في جانب آخرء يتعلق الاختراع بوصف ناقل الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني يشتمل على متوالية بولي نوكليوتيد تشفر 8-السركوجليكان الوظيفي الذي يشتمل على متوالية نوكليوتيد تتجهن في ظل ظروف صارمة إلى متوالية حمض نووي ‎nucleic acid‏ برقم تعريف المتوالية: 1 أو متمم لها. يُستخدم مصطلح 'صارم” للإشارة إلى الظروف المفهومة بشكل شائع في المجال على أنها صارمة.
5 يتم تحديد صرامة التهجين ‎Hybridization‏ بشكل أساسي من خلال درجة الحرارة والقوة الأيونية ‎ionic strength‏ وتركيز عوامل تغيير الدنترة ‎denaturing agents‏ مثل الفورماميد ‎formamide‏ تتمثل
أمثلة للشروط الصارمة للتهجين والغسيل ‎Lad‏ يلي: 0.015 مولار من كلوريد الصوديوم ‎sodium‏ ‎«chloride‏ 0.0015 مولار من سيترات الصوديوم ‎sodium citrate‏ عند 68-65 درجة ‎Liga‏ أو مولار من كلوريد الصوديوم» 0.0015 مولار من سيترات الصوديوم» و50 فورماميد عند 2 درجة ‎Age‏ انظر ‎Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,‏ ‎٠ (Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 5‏ يمكن أيضًا استخدام ظروف أكثر صرامة ‎Jie)‏ ارتفاع درجة الحرارة»؛ وانخفاض القوة الأيونية؛ وارتفاع الفورماميد؛ أو غيرها من عوامل الدنترة)؛ ومع ذلك؛ فإن معدل التهجين سيتأثر. في الحالات التي يكون فيها تهجين وحدات ديوكسي أوليجو نوكليوتيد ‎deoxyoligonucleotides‏ معنيًا؛ تشتمل حالات التهجين الصارمة الإضافية التوضيحية على الغسل في أس أس سى ‎SSC X6‏ بنسبة 70.05 من بيروفوسفات الصوديوم ‎sodium pyrophosphate‏ عند 37 درجة مثوية ‎J)‏ 4-أوليجو قاعدة ‎«(base oligos‏ 48 درجة مئوية ‎J)‏ 17-أوليجو قاعدة)» 55 درجة مئوية ‎J)‏ 20-أوليجو 5228( و60 درجة مئوية ‎J)‏
3-أوليجو قاعدة). يمكن تضمين عوامل أخرى في المحاليل المنظمة ‎buffers‏ للتهجين والغسيل بغرض تقليل التهجين غير المحدد و/أو في الركيزة. وتتضمن الأمثلة على ذلك 70.1 من ألبومين المصل البقري ‎bovine‏ ‎«serum albumin 5‏ £0.15 من ‎Je‏ قينيل بيروليدون ‎cpolyvinyl-pyrrolidone‏ و70.1 من بيروفوسفات الصوديوم» £0.15 من دوديسيل سلفيت الصوديوم ‎«sodium dodecylsulfate‏ و دوديسيل سلفيت الصوديوم ‎¢(NaDodSO4) sodium dodecylsulfate‏ _دوديسيل سلفيت الصوديوم ‎cficolly «(SDS) sodium dodecylsulfate‏ ومحلول ‎Denhardt‏ و الحمض النووى الريبوزىي منقوص الأكسجين للحيوانات المنوية للسالمون المعرض للموجات الصوتية ‎sonicated salmon‏ ‎sperm 0‏ (أو غيره من الحمض النووي غير التكميلي)» وديكستران سلفات ‎dextran sulfate‏ برغم إمكانية استخدام عوامل أخرى مناسبة. يمكن تغيير تركيز وأنواع هذه المضافات دون التأثير بشكل كبير على صرامة ظروف التهجين. عادة ما يتم إجراء تجارب التهجين عند الرقم الهيدروجيني 6.8- 4 ومع ذلك» في ظروف القوة الأيونية النموذجية؛ يكون معدل التهجين مستفلًا تقريبًا عن الرقم الهيدروجيني . ‎Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. dl‏ ‎IRL Press Limited (Oxford, England) 5‏ .4. يمكن تعديل ظروف التهجين من قبّل الشخص الماهر في المجال من أجل استيعاب هذه المتغيرات والسماح بقيام الأحماض النووية من مختلف المتواليات
ذات الصلة بتشكيل أنواع الهجين. في جانب ‎AT‏ يمكن ربط نواقل الفيروس الغدي الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ ‎(rAAV) Adeno-associated virus‏ الناتجة عن عودة الاتحاد الجيني الموصوفة هنا بعنصر مقارنة خاص بعضلة محددة يفعالية ‎.muscle-specific control element‏ على سبيل المثال» يكون عنصر ‎4d 5‏ الخاص بالعضلة عنصر جين أكتين هيكلي بشري ‎chuman skeletal actin gene‏ عنصر جين أكتين قلبي ‎¢cardiac actin gene‏ عامل ارتباط ‎binding factor‏ محسن خاص بخلية عضلية معينة ‎al myocyte-specific enhancer‏ إى أف ‎(MEF‏ كرياتين كيناز عضلي ‎muscle creatine‏ ‎«(MCK) kinase‏ 1016 (كرياتين كيناز عضلي مقتضب ‎«(truncated muscle creatine kinase‏ سلسلة ثقيلة للميوسين ‎MHCK7 (MHC) myosin heavy chain‏ (نسخة مهجنة ‎hybrid version‏ 0 من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرباتين كيناز عضلي)» 12 ‎C5-‏ (معزز تخليقي ‎«(synthetic promoter‏ عنصر محسن ‎enhancer element‏ كرياتين كيناز فأري ‎pale «murine creatine kinase‏ جين ‎gene element‏ تروبونين © هيكلي سريع التحويل © ‎cskeletal fast-twitch troponin‏ عنصر جين ترويونين © قلبي بطيء التحويل © ‎«slow-twitch cardiac troponin‏ عنصر ‎(pa‏ ترويونين ‎I‏ ‏بطيء التحويل 1 ‎alse slow-twitch troponin‏ نووية قابلة للحث بنقص التأكسج ‎hypozia-‏ ‎nuclear factors 5‏ 00001016 عنصر قابل للحث بالستيرويد ‎steroid-inducible element‏ أو عنصر استجابة للجلوكوكورتيكويد ‎.(GRE) glucocorticoid response element‏ في بعض التجسيدات؛ يكون المعزز الخاص بعضلة معينة ‎muscle-specific promoter‏ هو نسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرياتين كيناز عضلي (رقم تعريف المتوالية: 4). هناك الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني توضيحي موصوف هنا هو ‎pAAV.MHCK7.hSCGB‏ الذي 0 يشتمل على ‎Alle‏ النوكليوتيد برقم تعريف المتوالية: 3؛ حيث يمتد المعزز أم سى اتش كيه 7 7©_بطول 921-130 نوكليوتيد؛ يمتد الإنترون الخيمري أس فى 40 51740 5740 ‎chimeric intron‏ بطول 1078-931 نوكليوتيد» يمتد م8-سركوجليكان بطول 2047-1091 نوكليوتيد ويمتد ‎poly A‏ بطول 2106-2054 نوكليوتيد. في بعض التجسيدات؛ يكون المعزز الخاص بعضلة معينة هو كرياتين كيناز عضلي مقتضب (رقم تعريف المتوالية: 6). هناك الفيروس الغدي ‎alll‏ عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني توضيحي موصوف هنا هو 210615065 7اخدم الذي يشتمل على متوالية النوكليوتيد برقم تعريف المتوالية: 3؛ ‎Cua‏
يمتد المعزز 14011167 بطول 854-141 نوكليوتيد؛ يمتد الإنترون الخيمري 53740 بطول 886- 8 نوكليوتيد؛ يمتد ]-سركوجليكان_ ‎Joka‏ 2014-1058 نوكليوتيد ‎A Ys‏ 01«7م_بطول
2073-1 نوكليوتيد. يمكن أن يكون الفيروس الغدي أي نمط مصلي؛ على سبيل المثال الفيروس الغدي 1؛ الفيروس الغدي 2 الفيروس الغدي 3؛ الفيروس الغدي 4؛ الفيروس الغدي 5؛ الفيروس الغدي 6؛ الفيروس الغدي 7 الفيروس الغدي 8؛ الفيروس الغدي 9؛ الفيروس الغدي-10؛ الفيروس الغدي-11؛ ‎ag dll‏ الغدي-12؛ الفيروس الغدي-13 و110.74 ‎LAAV‏ يتم الكشف عن إنتاج الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني الكاذب في؛ على سبيل المثال؛ الطلب الدولي 01/83692. كما يتم مراعاة أنواع أخرى من الصور المتغيرة للفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني؛ على سبيل
0 المثال الفيروس الغدي ناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني مع طفرات كابسيد ‎mutations‏ 00510». انظر على سبيل المثال ‎-Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014) as yell‏ يتم أيضًا مراعاة تركيبات تشتمل على أي من نواقل الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني الموصوفة هنا. يقدم الاختراع ‎Wad‏ طرق إنتاج ناقل الفيروس الغدي ناتج عن ‎sae‏ الاتحاد الجيني يشتمل على
5 استنبات خلية تم تحويرها وراثيا بأي ناقل الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني موصوف هنا واستخلاص جسيمات الفيروس الغدي الناتجة عن عودة الاتحاد الجيني من المادة الطافية للخلايا المتحورة وراثيا ‎.supernatant of transfected cells‏ يراعي ‎J‏ لاختراع ‎Lad‏ الجسيمات الفيروسية ‎Viral particles‏ التي تشمل أي من نواقل الفيروس الغدي الناتجة عن عودة الاتحاد الجيني الموصوفة هنا.
0 يتم أيضًا توفير طرق تقليل التليف في كائن ثديي في حاجة لذلك. في هذا الصدد؛ تشتمل الطريقة على إعطاء كمية فعالة علاجيًا من ناقل الفيروس الغدي الموصوف هنا (أو التركيبة التي تشتمل على ناقل الفيروس الغدي الموصوف هنا) إلى الخاضع للعلاج الثديي. في بعض التجسيدات؛ يعاني الخاضع للعلاج الثديي من ضمور عضلي. في بعض التجسيدات؛ يقلل إعطاء ناقل الفيروس الغدي الموصوف هنا (أو التركيبة التي تشتمل على ناقل الفيروس الغدي الموصوف هنا) من التليف في
5 العضلات الهيكلية ‎skeletal muscle‏ أو في العضلة القلبية ‎cardiac muscle‏ للكائن. قد تشتمل هذه الطرق أيضًا على خطوة إعطاء ناقل الفيروس الغدي ثانٍ ناتج عن عودة الاتحاد الجيني يشتمل على
متوالية بولي نوكليوتيد متضمنة ل 0012296. يشير مصطلح 'ضمور العضلات” كما هو مستخدم هنا إلى اضطراب_تتدهور فيه قوة وكتلة العضلات ‎muscle bulk‏ تدريجيًا. يمكن أن تشتمل الأمثلة غير المقيدة لأمراض ضمور العضلات ‎muscular dystrophy diseases‏ على ضمور العضلات ‎«Becker muscular dystrophy Sul‏ ضمور العضلات الظنبوبي ‎ctibial muscular dystrophy‏ ضمور العضلات ل ‎«Duchenne‏ ضمور العضلات ل ‎Emery-Dreifuss‏ ضمور العضلات الوجهي الكتفي العضدي ‎facioscapulohumeral‏ ‎dystrophy‏ تمادتون» اعتلال مرتبط بالسركوجليكان ‎sarcoglycanopathies‏ ضمور العضلات الخلقي ‎Jie congenital muscular dystrophy‏ ضمور العضلات الخلفي الناجم عن نقص أل أيه ‎al‏ ‏أيه 2 ‎LAMA2‏ الجزئي؛ ضمور العضلات الخلقي الناجم عن نقص الميروسين» ضمور العضلات 0 الخلقي من النوع 110 ضمور العضلات الخلقي لفوكوياما ‎Fukuyama congenital muscular‏ ‎dystrophy‏ ضمور العضلات في حزام الطرف من النوع ‎(JA‏ ضمور العضلات في ‎aha‏ الطرف من نوع ‎QA‏ ضمور العضلات في حزام الطرف من نوع ‎2B‏ ضمور العضلات في حزام الطرف من نوع ‎2C‏ ضمور العضلات في حزام الطرف من نوع ‎2D‏ ضمور العضلات في ‎aha‏ الطرف من النوع 21 ضمور العضلات في حزام الطرف من النوع ‎OF‏ ضمور العضلات في ‎aha‏ الطرف 5 من النوع ‎2G‏ ضمور العضلات في حزام الطرف من النوع 211 ضمور العضلات في ‎aha‏ الطرف من النوع 20 ضمور العضلات في حزام الطرف من النوع 21 ضمور العضلات في حزام الطرف من النوع ‎2J‏ ضمور العضلات في حزام الطرف من النوع بى سى ‎dC‏ ضمور العضلات الفقري المتصلب ‎rigid spine muscular dystrophy‏ مع انحلال البشرة الفقاعي البسيط ‎epidermolysis‏ ‎cbullosa simplex‏ ضمور العضلات العيني المريثي ‎coculopharyngeal muscular dystrophy‏ ضمور العضلات الخلقي ل ‎Ullrich congenital muscular dystrophy Ullrich‏ ضمور العضلات. في بعض التجسيدات؛ يعاني الخاضع للعلاج من ضمور عضلات حزام الأطراف. في بعض التجسيدات؛ يعاني الخاضع للعلاج من ضمور عضلات ‎aha‏ الأطراف من النوع ‎2B‏ (اختصارًا ‎(LGMD2E‏ ‏يشير مصطلح 'تليف" كما هو مستخدم هنا إلى الترسيب المفرط أو غير المنظم لمكونات المصفوفة 5 خارج الخلية ‎(ECM) extracellular matrix‏ وعمليات الإصلاح غير الطبيعية في الأنسجة عند الإصابة بما في ذلك العضلات الهيكلية والعضلة القلبية والكبد ‎liver‏ والرثة ‎Tung‏ والكلى ‎kidney‏
والبنكرياس 0800:888. تشتمل مكونات المصفوفة خارج الخلية التي يتم ترسيبها على الكولاجين ‎ccollagen‏ على سبيل المثال الكولاجين 1؛ الكولاجين 2 أو الكولاجين 3؛ والفيبرونكتين ‎.fibronectin‏ ‏في جانب ‎AT‏ ¢ يصف الاختراع هنا طريقة لزيادة القوة العضلية و/أو كتلة العضلات في كائن ثديي تشتمل على إعطاء كمية فعالة علاجيًا من ناقل الفيروس الغدي الموصوف هنا (أو التركيبة التي تشتمل على ناقل الفيروس الغدي الموصوف هنا) إلى الخاضع للعلاج الثديي. في أي من طرق الاختراع؛ قد يعاني الخاضع للعلاج من ضمور عضلي مثل ضمور عضلات حزام الأطراف أو أي ضمور عضلي آخر متعلق بالديستروفين. كما تم توفير طريقة لعلاج ضمور العضلات في خاضع للعلاج ثديي تشتمل على إعطاء كمية 0 فعالة علاجيًا من ناقل الفيروس الغدي الموصوف هنا (أو التركيبة التي تشتمل على ناقل الفيروس الغدي الموصوف هنا) إلى الخاضع للعلاج الثديي. في بعض التجسيدات؛ يكون ضمور العضلات هو ضمور عضلات الأطراف. قد تشمل أي من الطرق الموصوفة هنا كذلك خطوة إعطاء ناقل ثانٍ الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎daily‏ على متوالية ‎Jo‏ نوكليوتيد متضمنة ‎-miR29C‏ ‏5 كما يتم مراعاة العلاجات المشتركة. في هذا الصدد؛ قد تشتمل أي من الطرق السابقة الموصوفة هنا على إعطاء ناقل ثان الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني يشتمل على متوالية بولي نوكليوتيد متضمِنة ‎.miR29C‏ في بعض التجسيدات؛ يكون البولي نوكليوتيد المتضمن 001296 مرتبطًا بشكل فعال بعنصر مقارنة ‎ald‏ بعضلة معينة. على سبيل المثال» عنصر المقارنة الخاص بعضلة معينة هو عنصر جين أكتين هيكلي بشري؛ عنصر جين أكتين قلبي؛ عامل ارتباط محسن 0 خاص بخلية عضلية معينة ‎(MEF‏ كرياتين كيناز عضلي؛ كرياتين ‎JUS‏ عضلي مقتضب؛ سلسلة ثقيلة للميوسين» 14110167 (نسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرياتين كيناز عضلي)؛ ‎C5-‏ ‏2 (معزز تخليقي)» عنصر محسن ‎(ELS‏ كيناز ‎(ol‏ عنصر جين تروبونين © هيكلي سريع التحويل» عنصر جين تروبونين © قلبي بطيء التحويل» عنصر جين تروبونين 1 بطيء التحويل؛ عوامل نووية قابلة للحث بنقص التأكسج؛ عنصر قابل للحث بالستيرويد أو عنصر استجابة 5 للجلوكوكورتيكويد. في بعض التجسيدات؛ يشتمل الناقل الثاني الناتج عن عودة الاتحاد الجيني على متوالية البولي نوكليوتيد المذكورة في رقم تعريف المتوالية: 9 أو رقم تعريف المتوالية: 8؛ كما هو
موضح في الطلب الأمريكي المؤقت رقم 62/323.163 (تم تضمين الكشف عنه هنا بالإشارة إليه في مجمله). في طرق العلاج المشترك ‎combination therapy‏ الموصوفة هنا والتي يتم فيها توجيه كل من ناقل الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني يعبر عن م-سركوجليكان وناقل الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني يعبر عن ‎miR29c‏ إلى الخاضع للعلاج الثديي؛ يمكن أن تُعطى نواقل الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني بشكل متزامن أو بالتتابع مع ناقل الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني الذي يعبر عن 8- السركوجليكان مباشرة قبل أو بعد الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني الذي يعبر عن ع#29ن. أو كبديل لذلك؛ يتم إعطاء ناقل الفيروس الغدي الذي يعبر عن م-سركوجليكان في غضون ‎Jia‏ 24-1 ساعة (على سبيل المثال» 1 2 0 3 4 5 6 7 8 9 10 لل 12 13 14 ذاء ¢16 17« 18 19 20 21 22 23 أو 4 ساعة) بعد إعطاء الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني معريا عن 018-29 أو طرق الاختراع التي تتم فيها حيث يتم إعطاء نواقل الفيروس الغدي الذي يعبر عن - السركوجليكان في حدود 1 24 ساعة (على ‎Jal dns‏ 1ء 2 3 4 5 6؛ 7 8 9 10 11« 12( 13 14« 15» 16« 17 18« ¢19 20 21 22 23 أو 24 ساعة) قبل إعطاء الفيروس الغدي ناتج 5 عن عودة الاتحاد الجيني الذي يعبر عن 0018-29. في بعض التجسيدات؛ يتم إعطاء ناقل الفيروس الغدي الذي يعبر عن م-سركوجليكان في غضون حوالي 5-1 ساعات ‎de)‏ سبيل ‎Jal‏ 1؛ 2 3 أو 5 ساعات) بعد إعطاء الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني معربًا عن ‎miR-29‏ ‏أو يتم تنفيذ طرق الاختراع حيث يتم إعطاء متجه الفيروس الغدي الذي يعبر عن م-سركوجليكان خلال حوالي 5-1 ساعات (على سبيل ‎(Jad)‏ 1 2 3 4 أو 5 ساعات) قبل إعطاء الفيروس 0 الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني الذي يعبر عن ع0118-29. في أي من طرق الاختراع؛ يتم إعطاء الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني عن ‎Gob‏ ‏الحقن في العضل أو الحقن في الوريد ‎injection‏ 005د10007©00. بالإضافة إلى ذلك؛ في أي طريقة من الاختراع؛ يتم إعطاء الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني بطريقة منتظمة؛ مثل إعطاء بطريق غير الجهاز الهضمي ‎parental administration‏ عن طريق الحقن أو التسريب أو الغرس. 5 يتم صياغة تركيبات الاختراع للحقن في العضل أو الحقن في الوريد. بالإضافة إلى ذلك؛ يتم تكوين تركيبات الاختراع من أجل الإعطاء الجهازي ‎Jie systemic administration‏ إعطاء بطريق غير
الجهاز الهمضمي عن طريق الحقن أو التسريب أو الغرس. بالإضافة إلى ذلك؛ أي تركيبة من التركيبات المصممة للإعطاء إلى خاضع للعلاج يعاني من ضمور العضلات (مثل ضمور عضلات حزام الأطراف أو أي ضمور عضلي آخر متعلق بالديستروفين). في بعض التجسيدات؛ قد تشتمل التركيبة ‎Load‏ على ناقل الفيروس الغدي ثاني ناتج عن عودة الاتحاد الجيني يشتمل على متوالية البولي نوكليوتيد المذكورة في رقم تعريف المتوالية: 9 أو رقم تعريف المتوالية: 8. في أي من استخدامات الاختراع؛ يتم صياغة الدواء من أجل الحقن في العضل أو الحقن في الوريد. بالإضافة إلى ذلك؛ في أي من استخدامات الاختراع» يتم صياغة الدواء من أجل الإعطاء العام؛ مثل إعطاء بطريق غير الجهاز الهضمي عن طريق الحقن أو التسربب أو الغرس. بالإضافة إلى 0 ذلك؛ قد يتم تحضير أي من الأدوية للإعطاء إلى خاضع للعلاج يعاني من ضمور العضلات (مثل ضمور عضلات حزام الأطراف أو أي ضمور عضلي آخر متعلق بالديستروفين). في بعض التجسيدات؛ قد يشتمل الدواء أيضًا على ناقل الفيروس الغدي ثان ناتج عن عودة الاتحاد الجيني يشتمل على متوالية البولي نوكليوتيد المذكورة في رقم تعريف المتوالية: 9 أو رقم تعريف المتوالية: 8 5 لا ‎Gag‏ الفقرات السابقة إلى تعريف كل جانب من جوانب الاختراع؛ ويتم وصف جوانب إضافية في أقسام أخرى؛ ‎Jie‏ الوصف التفصيلي. من المفترض أن تكون الوثيقة الكاملة ذات صلة ككشف موحد؛ ويجب أن يكون مفهومًا أنه تم تناول جميع توليفات الميزات الموضحة هناء حتى إذا لم يتم العثور على توليفة من الميزات معًا في نفس الجملة؛ أو الفقرة؛ أو قسم من هذا الوثيقة. يتضمن الاختراع» كجانب إضافي؛ جميع تجسيدات الاختراع الأضيق في النطاق بأي طريقة من التنويعات 0 المحددة بواسطة الفقرات المحددة أعلاه. على سبيل المثال عندما يتعلق الأمر ببعض جوانب الاختراع الموصوفة على أنها جنس؛ يجب أن يكون مفهوما أن كل عضو في جنس ‎op‏ بشكل فردي؛ جانب من الاختراع. شرح مختصر. للرسومات توضح الأشكال 1أ-1د أن التعبير عن م-سركوجليكان بوساطة الفيروس الغدي يعيد البروتينات 5 المرتبطة بالديستروفين ‎dystrophin-associated proteins‏ ويحمي سلامة الغشاء . 0( ناقل الفيروس الغدي المتمم ذاتيا الذي يحتوي على جين م سركوجليكان البشري المحسّن بالكودون يتم تحفيزه
بمعزز كرياتين كيناز عضلي مقتضب خاص بعضلة محددة. يحتوي الكاسيت ‎Lad‏ على إنترون خيمري ‎chimeric intron‏ لزيادة إشارة المعالجة وتذييل بعديد الأدينيلات ‎polyadenylation signal‏ من أجل الثبات. )= يُظهر الصبغ التألقي المناعي ‎Immunofluorescence staining‏ بجسم مضاد لذ بيتا-56 ‎antibody‏ 2010-8-56 مستويات عالية من صبغ الغشاء الخلوي ‎sarcolemmal staining‏ لجين متحور م-سركوجليكان في فثران بالغة 5 أسابيع من العمر بعد الحقن ب 6 و12 أسبوع. يتم عرض تكبير 20% للصورة. النسبة المئوية للألياف التي تعبر عن م-سركوجليكان لكل لعضلة الظنبوب الأمامي ‎(TA) tibialis anterior‏ بلغ متوسطها 88.4 + 74.2 بعد 6 أسابيع ‎=n)‏ 9 4 ذكور؛ 5 إناث) و76.5 + 75.8 بعد 12 أسبوعًا ‎=n)‏ 6؛ 4 ذكورء؛ أنثى 2). تم تأكيد التعبير عن البروتين في بقعة ويسترن مع وجود بقع جاما -توبيولين ‎gamma-tubulin blot‏ الموضحة للتحكم في
0 التحميل. (ج) يؤدي توصيل الفيروس الغدي من م-سركوجليكان إلى استعادة أعضاء آخرين من معقد السركوجليكان؛ ه-سركوجليكان «د»راع0:0-»؛ ديستروفين. يتم عرض تكبير *20 للصورة. ‎scAAVIh.74.hSGCB (9)‏ يحمي أغشية -/-0عع» من التلف. صورة توضح مساحة كبيرة من ألياف موجبة ‎positive fibers‏ أزرق ‎lal‏ (أحمر) مترافقة مع مجموعة من أ لألياف موجبة ‎PB‏ ‏سركوجليكان التي تم حمايتها من تضمين صبغ أزرق إيفانز. يتم عرض تكبير ‎X‏ 40 للصورة.
5 توضح الأشكال 2-0 التحليل النسيجي ‎histological analysis‏ للعضلة الهيكلية المعالجة التي ‎Jl‏ من نقص في بيتا-806. يقيس العلاج 7:0.74800©8»_المتغيرات النسيجية ‎histological parameters‏ لفثران 607عع98. تم إجراء صبغ هيماتوكسيلين ‎Hematoxylin‏ ويوزين ‎(H&E) Eosin‏ وصبغ بيكروسيريوس ‎Pircrosirius‏ الأحمر على عضلة الظنبوب ‎١‏ لأمامي من ‎Oly‏ ‎Lis 07‏ إلى جنب مع ‎die‏ المقارنة العادية ‎Ohi‏ 57/816 والفئران المعالجة ب
‎edie scAAVTh.74hSGCB 0‏ بالقياس الكمي للمتغيرات النسيجية والنسبة المثوية للصبغ بالكولاجين. 0( يبين الصبغ بهيماتوكسيلين ويوزين وجود ألياف منواة مركزيًا ‎centrally nucleated‏ ‎«fibers‏ خلايا التهابية ‎¢inflammatory cells‏ وتوزيع قطر ألياف كبير في عضلات بها نقص في بيتا-50 ‎B-SG-deficient muscle‏ وتحسن في علم الأنسجة بعد انتقال الجينات. (ب) يظهر صبغ بيركروسيريوس الأحمر انخفاض في الكولاجين الأحمر في العضلات المعالجة ‎treated muscle‏
‏5 (ج) التحديد الكمي للألياف المنواة مركزيًا الذي يظهر نقصا بعد العلاج ‎P)‏ > 0.0005؛ تحليل التباين ‎(ANOVA) Analysis of variance‏ في اتجاه واحد) و(د) تمثيل توزيع حجم الألياف وزيادة
متوسط حجم الألياف لعضلة الظنبوب الأمامي من عينات المقارنة 057/816 وفتئران 8807 مقارنة بالفتران المعالجة ‎P)‏ >0.0001< تحليل التباين في اتجاه واحد). (ه) القياس الكمي ل 7 للكولاجين في العضلات الظنبوب الأمامي من عينات المقارنة 0657/81/6 وفتئران ‎sgeb™‏ مقارنة بفئران ‎seb”‏ ‏المعالجة ‎P)‏ <0.0001؛ تحليل التباين في اتجاه واحد). شريط مقياس ‎scale bar‏ 100 ميكرو متر لتكبير 20% للصورة. *** ‎P‏ <0.001؛ **** ‎p‏ > 0.0001. تظهر الأشكال 23-13 أن التوصيل في العضل ل ‎scAAVTh.74hSGCB‏ يصحح القوة الكزازية ‎tetanic force‏ والمقاومة للضرر الناجم عن التقلص ‎injury‏ 0000:8010100-0002©0. .تم حصد العضلة الظنبوب الأمامي لفتران 8657 ‎dalled‏ ب 3 * 10" ‎asin‏ فيروسي من ‎scAAVIh.74.hSGCB‏ عبر حقنة في العضل بعد 6 أسابيع من نقل الجين؛ وتم إخضاعها لبروتوكول لتقييم القوة الكزازية ويدروتوكول تقلص لامركزي ‎eccentric contraction protocol‏ لتقييم المقاومة للإصابة الناجمة عن التقلص. (أ) أظهرت العضلة المعالجة ب ‎Guns AAVTh.74.hsGCB‏ ملحوظًا في كل من القوة الكزازية المطلقة ‎P)‏ <0.01؛ اختبار تي مقترن) و(ب) قوة محددة مقاسة ‎P)‏ >0.05< اختبار تي مقترن)؛ الذي لم يختلف عن القوة من النوع غير المعالج (657/81/6). ‎(z)‏ ‏أبدت الظنبوب الأمامي المعالجة ب 8817:1.7415008 تحسنًا ملحوظًا في مقاومة الإصابات 5 الناجمة عن التقلص مقارنة بعينات المقارنة غير المعالجة ل 58657 ‎P)‏ <0.01؛ تحليل التباين في اتجاهين). يتم عرض قوة الاحتفاظ بعد 10 تقلصات ‎P * .contractions‏ <0.05؛ ** ‎P‏ <0.01. ‎mag‏ الأشكال. 4-4ج_تتائج تحليل الفئران التي عولجت ‏ في العضل باستخدام 15008 1:.74.406/اههء:. () الصبغ التألقي المناعي لعضلة الظنبوب الأمامي من ‎OE‏ ‎sgeb—/—‏ البالغة 6 أشهر من العمر المعالجة بعد 12 أسبوع من الحقن ‎=n)‏ 5؛ 5 ذكر) يظهر 0 التعبير في الغشاء الخلوي ‎sarcolemmal expression‏ عن الجين المتحور ‎Wily‏ سركوجليكان عند مستويات بمتوسط 80 7 في الفئران المحقونة مقارنة بغير المعالجة ‎=n)‏ 4 4 ذكور). (ب) الصبغ ببيكروسيريوس الأحمر لعضلات الظنبوب الأمامي المعالجة وغير المعالجة. (ج) القياس الكمي للكولاجين الموجود الأنسجة المصبوغة ببيكروسيريوس الأحمر ‎Picrosirius red stained tissue‏ يبين انخفاضًا كبيرًا في كمية الكولاجين بعد العلاج باستخدام ‎(P‏ 1.74.0065008/اخش 5 <0.0001؛ تحليل التباين في اتجاه واحد). شربط مقياس 100 ميكرو ‎jie‏ موضح لتكبير 20% للصورة. * * * * © <0.0001.
تظهر الأشكال من ‎z5-15‏ نتائج توصيل الأوعية الدموية ‎vascular delivery‏ ل 71.74.5008 ههء؟. تم علاج فتران عمرها أريعة ‎=n)‏ 5؛ 5 ذكر) وخمسة ‎=n)‏ 4؛ 2 ذكراء 2 أنثى) أسابيع بها نقص في 8-56 باستخدام ناقل عبر الشريان الفخذي ‎femoral artery‏ لتوصيل الناقل إلى عضلات الأطراف السفلية ‎lower limb muscles‏ عند جرعة بمقدار 5 ‎H10 x‏ جينوم فيروسي؛ كان التعبير عن 8-56 بمقدار 90.6 + 72.8 في الظنبوب الأمامي و91.8 + 74.7 في عضلة الساق ‎hall (GAS) gastrocnemius‏ المعالجة مصحويًا بتحسينات في ‎ple‏ الأنسجة مما أدى إلى تحسن كبير في قوة محددة مقارنة بالحيوانات غير المعالجة حتى بعد نموذج الإصابة. (أ) التعبير عن البروتين 8-56 من ثلاثة فئران تمثيلية. يتم عرض العضلات من ‎Jl‏ 160 8-56 غير المعالج للمقارنة في اللوحة الداخلية (أسفل اليمين). يتم التكبير *20 للصورة. يتم عرض التعبير في 0 العضلات المعالجة ‎treated muscles‏ المؤكدة عن طريق بقعة ويسترن وجاما-تويولين كعينة تحميل مقارنة. (ب) تحسن بشكل ملحوظ علم أمراض الأنسجة بعد العلاج بجرعة عالية ‎high dose‏ ‎treatment‏ اللوحات العلوية: عضلات الظنبوب ‎١‏ لأمامي وعضلات ساق ‎gastrocnemius dallas‏ ‎muscles‏ اللوحات السفلية: عينات مقارنة غير معالجة بها نقص في 8-56. شربط مقياس 100 ميكرو متر موضح للتكبير *20 للصورة. (ج) النسبة المئوية للقوة النوعية المحتفظ بها في عضلة 5 باسطة إيهام اليد ‎(EDL) extensor digitorum longus‏ بعد 10 دورات من الإصابة الناشئة عن التقلص. العلاج باستخدام 5 ‎X‏ 110 جينوم فيروسي باستخدام 2417:0:.74150601 أدى إلى تحسن كبير في القوة التي كانت تعادل عضلات العينة المقارنة (العادية) من النوع غير المعالج دبليو تى ‎WT‏ (©<0.05؛ تحليل التباين في اتجاه واحد). * © <0.05 تظهر الأشكال 6-16 انخفاضًا في التليف في ‎KO‏ 8-56 المعالجة بالتروية المعزولة ‎isolated‏ ‎perfusion 0‏ (11). () يظهر الصبغ ببيكروسيريوس الأحمر انخفاض التليف في الفئران المعالجة كما هو مبين بانخفاض ترسيب الكولاجين مقارنة بالفئران ‎sgeb™‏ غير المعالجة. (ب) القياس الكمي لمستويات الكولاجين في الظنبوب الأمامي وعضلات عضلة الساق من ‎WT‏ 81/6؛ فئران ‎sgcb”‏ ‏غير المعالجة والفثئران المعالجة يؤكد وجود انخفاض في مستويات الكولاجين في الفئران المعالجة ‎P)‏ ‏<0.001؛ تحليل التباين في اتجاه واحد). شريط مقياس 100 ميكرو ‎jie‏ موضح للتكبير 20% 5 للصورة. *** ‎P‏ <0.001. يوضح الشكلان 7 أ و7 ب التوزبع الحيوي للناقل والتعبير عن البروتين. (أ) المخطط التكراري
لمتوسط توزيع الناقل في الأنسجة المحصودة من الفئران المعالجة ‎dug lls‏ المعزولة الواردة في نسخ من نسخة لكل ميكرو ‎dba‏ من الحمض النووي المضافة إلى تفاعل_البوليميراز المتسلسل الكمى ‎(QPCR) quantitative polymerase chain reaction‏ تم علاج الطرف الأيسر ‎٠‏ (ب) لا يوجد تعبير بروتيني عن طريق بقعة ويسترن التي ثرى في الأعضاء المستهتفة ‎target organs‏ يقدم الشكل 218 أوجه نقص نسيجية ووظيفية فثران 8607 عند عمر 7 أشهر. يبين الصبغ
بالترايكوم 11160006 في الحجاب الحاجز ‎diaphragm‏ (أ) والقلب (ب) لفتران 88607 تليف واسع ‎extensive fibrosis‏ (أحمر). يتم تخفيض مخرجات القوة ‎force output‏ من الحجاب الحاجز بشكل ملحوظ في الحجاب الحاجز (ب) ويتم تخفيض نسبة الانقباض القلبي ‎Wail cardiac ejection‏ في فثران ‎seb”‏ 9
0 يقدم الشكل 9 مخططًا لطقم جين متحور علاجي هو م]-سركوجليكان ‎therapeutic B-sarcoglycan‏ ‎transgene‏ يحتوي الناقل المتمم ‎Self-complementary vector Wild‏ للفيروس الغدي على جين ‎—B‏ ‏ل ‏خاص بعضلة معينة إلى التعبير. يحتوي الطقم أيضًا على إنترون خيمري لزيادة إشارة المعالجة والتذييل بعديد الأدينيلات للثبات.
5 يقدم الشكل 10 إجراء صبغ تألق مناعي ل م-سركوجليكان في مختلف العضلات الهيكلية بما يوضح التعبير القوي باستخدام الألياف السالبة النادرة ‎rare negative fibers‏ بعد 1 أو 4 أو 6 أشهر من العلاج (موضح 1 شهر). يقدم الشكل 11 إجراء صبغ تألق مناعي ل م-السركوجليكان في الحجاب الحاجز والقلب بما يوضح التعبير القوي باستخدام الألياف السالبة النادرة بعد 1 4؛ أو 6 أشهر من العلاج (موضح 1 شهر).
0 يوضح الشكل 12أ-د استعادة التعبير عن م-سركوجليكان بعد توصيل ل ‎scAAVrh.74 MHCK7hSGCB‏ في الوريد. (أ) طقم ‎-scAAVih.74 MHCK7.hSGCB‏ (ب) تصوير التألق المناعي 6 أشهر بعد الحقن للعضلات الهيكلية؛ والحجاب الحاجز» والقلب من ‎Ol‏ ‎sged”‏ تم حقنها ‎bay‏ بجرعة بإجمالي 1612 جينوم فيروسي من ‎.scAAVrh.74 MHCK7.hSGCB‏ تبدي الصور التمثيلية للعضلات الهيكلية متوسط 98.13 +
5 70.31 من التحوير الوراثي ‎transduction‏ يتم عرض الصورة مكبرة *20. تبدي الصور التمثيلية لأنسجة القلب ‎heart tissue‏ مستويات عالية من التعبير عن الجين المتحور م-سركوجليكان البشري.
يتم عرض الصور بتكبير *10. (ج) تؤكد بقعة ويسترن لكل العضلات من فأر ‎sgeb™‏ واحد معالج التعبير عن جين متحور وراثيا ]-سركوجليكان البشري. (د) تبين ‎dai‏ ويسترن للتعبير عن م]- سركوجليكان البشري في قلوب خمسة من الفثران ‎sgeb”‏ المعالجة بالقياس الكمي للكثافة التعبير المفرط عن 8]-سركوجليكان البشري حتى 72.0 7 من مستويات ‎BLOWT‏ ‏5 يوضح الشكل 13أ-د تأثير المعالجة الجهازية ‎systemic treatment‏ باستخدام ‎scAAVIh74 MHCK7.hSGCB‏ على أمراض العضلات. (أ) ‎jaa‏ هيماتوكسيلين ويوزين للحجاب الحاجز والعضلات رباعية الرؤوس ‎(QUAD) quadriceps‏ من ‎csgeb” 5731/6 WT‏ والفئران المعالجة ب 1.74.11016715005تتهه»؟ تبدي ‎ale‏ أمراض أنسجة مقاسة ‎normalized‏ ‎histopathology‏ (ب) القياس الكمي للانخفاض في الألياف المنواة مركزيًا في العضلات المعالجة ‎sgeb” 0‏ مقارنة بالعضلات 8607 غير المعالجة (الظنبوب الأمامي؛ عضلة الساق؛ العضلة الألوية ‎gluteal‏ (61101)»؛ الحجاب الحاجزء © <0.0001) (العضلة رباعية الرؤوس؛ العضلة القطنية الكبرى ‎psoas major‏ (05085)؛ العضلة ثلاثية الرؤوس ‎P (TRI) triceps‏ <0.05). (ج) قياس توزيع الألياف في عضلة الساق؛ العضلة القطنية الكبرى؛ والعضلة ثلاثية الرؤوس؛ و(د) زيادة في متوسط حجم الألياف في العضلات المعالجة مقارنة بعضلات ‎sgeb™‏ غير المعالجة ‎P)‏ <0.001) (تحليل التباين في اتجاه واحد) (« = 5) لكل مجموعة). يوضح الشكل 14 أ و14 ب ترسب كولاجين مخفض في ‎KO oli‏ 8-56 المعالجة وريديا. (أ) أظهر صبغ بيكروسيريوس الأحمر انخفاض التليف في ‎hl‏ المعالجة وهو ما دل عليه انخفاض في ترسب الكولاجين مقارنة بفئران 58607 غير المعالجة في الحجاب الحاجز وعضلة الساق. (ب) القياس الكمي لمستويات الكولاجين في الحجاب الحاجز وعضلات عضلة الساق من الفئران ‎n=) 5781/6 WT 0‏ 4)؛ غير المعالجة ‎n=) sgeb” hid‏ 4(« وفتران ‎sgeb”‏ المعالجة ‎n)‏ = 5( انخفاض في مستويات الكولاجين في كل من العضلات المعالجة ‎P)‏ <0.0001؛ تحليل التباين في ‎ola)‏ واحد). شريط مقياس 100 ميكرو متر موضح لتكبير الصور ‎20X‏ ‏يوضح الشكل 15 أن توصيل ‎scAAVTh.74 MHCK7.hSGCB‏ عبر الوريد الذيلي ‎tail vein‏ لفئران 7 يعيد القوة تمامًا في الحجاب الحاجز. بعد 6 أشهر من العلاج (إعطاء ‎ans‏ (1612»8)). 5 تم حصد شرائط عضلات الحجاب الحاجز ‎Diaphragm muscle strips‏ من الفئران المعالجة وعينات المقارنة ‎sgeb™‏ وفئران من النوع غير المعالج ‎WT‏ وتعريضها لقياسات ‎coil]‏ استعاد العلاج القوة
إلى مستويات النوع غير المعالج. يقدم الشكل 16 مخططًا لرسومات ‎rAAV scAACTh.74.CMV.miR29¢‏ ومتوالية نوكليوتيد ل ‎miR-‏ ‏90 في السلسلة الرئيسية الطبيعية ل 01118-30. يوضح الشكل 17 أنه بعد 3 أشهر من العلاج باستخدام ‎a3 (AAV T4.CMV.mIR29C‏ حصد عضلات الظنبوب الأمامي من ‎Oh‏ معالجة ومقارنة 5807 وفتران من النوع غير المعالج ‎WT‏ ‏وتحليلها للكشف عن التليف (مستويات الكولاجين) ‎=n)‏ 5 لكل مجموعة). باستخدام الصبغ بسيربوس الأحمر وقياس حجمه؛ تم تخفيض مستويات الكولاجين بعد العلاج (انظر الشكل 18). أشارت النتائج إلى أن مستويات النسخ من ‎Fbng «Col3A «CollA‏ كانت طبيعية وتم زيادة حجم ألياف العضلات ‎.muscle fiber‏ 0 يقدم الشكل 18 ‎hoa‏ تمثيلية للأقسام الكاملة الممسوحة ‎scanned full sections‏ ضوئيًا لعضلات الطنبوب الأمامية غير المعالجة والمعالجة ب ‎ACRh.74.CMV.miR29C‏ المصبوغة بسيريوس الأحمر التي تصبغ الكولاجين 1 و3. ويرد القياس الكمي في الشكل 17. يوضح الشكل 19 أ و19[ب تصحيح الجنف الحدابي ‎kyphoscoliosis‏ في العمود الفقري الصدري ‎thoracic spine‏ (أ) الإصابة بالجنف الحدابي في فتران 8607 كما يتضح من الأشعة السينية. (ب) درجة مؤشر الجنب الحدابي ‎sgeb” oh (KI) Kyphotic Index‏ (3.69) منخفض مقارنة ب ‎p) (6.01) C57BL/6 WT‏ <0.01)» ولكنها تزيد عند العلاج ب ‎scAAVTh.74 MHCK7.hSGCB‏ )5.39( (م <0.05 مقارنة ب ‎(sgeb”‏ (تحليل التباين في اتجاه واحد) (عدد = 6 لكل مجموعة). يقدم الشكل 20-د تقييم اعتلال عضلة القلب ‎cardiomyopathy‏ في عضلة القلب ‎muscle‏ اتقعط. (أ) إجراء صبغ باستخدام هيماتوكسيلين ويوزين وبيكروسيريوس الأحمر لفئران بالغة 7 أشهر من 0 العمر من نوع ‎csgeb™ (BLE WT‏ وفتران ‎dallas sgeb™‏ ب ‎AAV.MHCK7.hSGCB‏ بعد 6 أشهر من العلاج بما يدل على تنكس عضلة القلب في عضلات “800 غير المعالجة وتحسن العلاج التالي. (ب) يبين تحليل التصوير بالرنين المغناطيسي ‎(MRI) magnetic resonance imaging‏ القلبي انخفاض في قلوب ‎GHB‏ 58667 من حيث حجم السكتة ‎stroke‏ (م > 0.01(¢ وخزج القلب ‎cardiac output‏ ونسبة الانقباض القلبي ‎p)‏ > 0.05( (تحليل التباين في اتجاه واحد) والتحسن بعد 5 6 أشهر من المعالجة ‎n=)‏ 6 لكل مجموعة). (ج) ‎shal‏ بقعة ويسترن لقلبي فأرين من 5781/6 7» وقلبي فأرين من 88607؛ و5 ‎sgeb™ ol‏ معالجة باستخدام ‎AAV.MHCK7hSGCB‏ يظهر
انخفاض مستويات التروبونين القلبي 1 في الفئران المصابة. (د) القياس الكمي لقياس الكثافة يظهر انخفاض التروبونين القلبي 1 ‎(cTrpl) cardiac troponin I‏ إلى 760.38 من مستويات ‎BL6 WT‏ وتعبير مفرط عن نسبة تصل إلى 7135.8 من مستويات ‎WT‏ 81/6. يوضح الشكل 21أ-ب تصحيح وظيفة الحجاب الحاجز وزيادة نشاط القفص في الحقل المفتوح. (أ) تم حصاد أشرطة عضلات الحجاب الحاجز لقياس القوة ومقاومة الإرهاق في ‎n) 316 WT Chill)‏ = 5(« فثران ‎n) sgeb”‏ = 4(« وفتران ‎sgeb™‏ المعالجة ب ‎n) AAV.MHCK7.hSGCB‏ = 5( وكلها في الشهر السابع من العمر. أدى ستة أشهر من العلاج إلى استعادة القوة إلى مستويات ‎WT‏ ‎P)‏ <0.01 مقارنة بفثران ‎(sgeb®‏ وتحسين مقاومة الإرهاق. (ب) انخفض المشي العام على المستويين ‎x‏ ور بشكل كبير في ‎sgeb™ Ol‏ (م <0.0001) وظهور تحسن طفيف في الفئران 0 المعالجة ب 140167 ‎P)‏ <0.05). كما انخفض نشاط النشاط العمودي على الأطراف الخلفية في فئران ‎p) sgeb™‏ <0.01) وزاد بشكل ملحوظ في الفئران المعالجة ب 11011167 ‎P)‏ <0.05) (تحليل التباين في اتجاه واحد) (عدد = 6 لكل مجموعة). يقدم الشكل 22-ب توزيعًا حيويًا وتحليلًا بعيدًا عن الهدف للتعبير عن جين محور ‎Gy‏ لتوصيل جهازي ‎.scAAVTh74.MHCK7.hSGCB‏ )1( مخطط مكرر_لتوزيع نسخ جينوم فيروسي في 5 المتوسط للنسخ لكل ميكرو جرام من الحمض النووى ‎Gell‏ منقوص الأكسجين المضاف إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمى في الأنسجة المختلفة من اثنين من ‎sgeb™ (hE‏ بعد التوصيل وريديًا لعلاج ‎scAAVH.74 MHCK7.hSGCB‏ بجرعة إجمالية 1612 جينوم فيروسي. (ب) يدل التوزيع الحيوي لبقع ‎(jing‏ على العضلات والأعضاء من ‎sgeb® hE‏ المحقونة بشكل نظامي ب ‎le scAAVh.74 MHCK7.hSGCB‏ عدم التعبير عن الجين المتحور وراثيا م سركوجليكان 0 البشري في أي عينات ‎pal‏ العضلات ‎.non-muscle samples‏ الوصف ‎١‏ لتفصيلي : يستند الكشف الحالي على اكتشاف أن إعطاء ناقل الفيروس الغدي يحتوي على بولي نوكليوتيد يعبر عن م-سركوجليكان يؤدي إلى انخفاض أو عكس كامل للتليف العضلي ‎muscle fibrosis‏ في نموذج حيواني لضمور عضلات حزام الأطراف. كما هو موضح في الأمثلة؛ فإن إعطاء ناقل 5 الفيروس الغدي الموصوف هنا أدى إلى عكس مظاهر الضمور بما في ذلك عدد أقل من الألياف المتحللة ‎degenerating fibers‏ وانخفاض الالتهابات وتحسين الاستعادة الوظيفية عن طريق الحماية
ضد التقلص اللامركزي مع زيادة في توليد القوة. كما هو مستخدم هناء فإن المصطلح ‎TAA‏ يشير إلى اختصار قياسي لفيروس مرتبط بالغدة. إن الفيروس المرتبط بالغدة هو طليعة فيروس حمض نووي أحادي الجديلة ينمو فقط في الخلايا التي يتم فيها توفير وظائف معينة بواسطة فيروس مساعد يصيب بعدوى مشتركة ‎co-infecting helper‏ ‎virus 5‏ هناك ‎Wa‏ ثلاثة عشر أنماط مصلية من الفيروس الغدي التي تم وصفها. يمكن الاطلاع على معلومات عامة ومقالات مرجعية عن الفيروس الغدي في؛ على سبيل المثال» ,1989 ‎Carter,‏ ‎Berns, 1990, Virology, pp. 1743- «Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228‏ ‎Raven Press, (New York)‏ ,1764. ومع ذلك؛ فمن المتوقع ‎Lila‏ أن هذه المبادئ نفسها قابلة للتطبيق على أنماط مصلية الفيروس الغدي إضافية لأنه من المعروف جيدا أن الأنماط المصلية
0 المختلفة ترتبط ارتباطا وثيقاء سواء من التاحية الهيكلية والوظيفية؛ حتى على المستوى الجيني ‎genetic level‏ (انظرء على سبيل المثال؛ ‎Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and‏ ‎(Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974) ¢ Human Disease, J.
R.
Pattison, ed.‏ . على سبيل ‎(Jal‏ تظهر جميع الأنماط المصلية الفيروس الغدي على ما يبدو خصائص تكرار مشابهة جدا بوساطة جينات تماثلية متماثلة؛ وتحمل جميعها ثلاثة بروتينات كابسيد مثل تلك التي تم
التعبير عنها في الفيروس الغدي 2. يتم اقتراح درجة الصلة كذلك من خلال تحليل المزدوجات المتغايرة ‎heteroduplex analysis‏ والتي تكشف عن التهجين الشامل بين الأنماط المصلية بطول الجينوم؛ إن وجود قطاعات متناظرة ذاتية التلدين ‎analogous self-annealing segments‏ في الأطراف يناظر 'متواليات تكرار طرفية عكسية". وتشير أنماط العدوى المماثلة أيضًا إلى أن وظائف النسخ المتماثل في كل نمط مصلي تخضع لسيطرة تنظيمية مماثلة.
يشير 'ناقل الفيروس الغدي" كما هو مستخدم في هذه الوثيقة إلى ناقل يحتوي على واحد أو أكثر من البولي نوكليوتيدات ‎polynucleotides‏ محل الاهتمام (أو الجينات المحورة ‎(transgenes‏ التي تحيط بها بشكل مجائح متواليات تكرار طرفية الفيروس الغدي. يمكن تكرار مثل هذه النواقل الفيروس الغدي وتعبتتها في ‎Cline‏ فيروسية معدية ‎infectious viral particles‏ عندما تكون موجودة في خلية مضيفة ‎host cell‏ تم تحويرها ‎Why‏ بواسطة ناقل يشفر ويعبر عن منتجات جينات نسخ
5 وكابسيد. يشير ‎ond‏ الفيروس الغدي" أو "جسيم فيروسي ‎vector particle‏ للفيروس الغدي” أو "جسيم ناقل
الفيروس الغدي" إلى جسيم فيروسي يتكون من بروتين كابسيد الفيروس الغدي واحد على الأقل وناقل الفيروس الغدي بولي نوكليوتيد مغلف ‎polynucleotide‏ 00805108160©. إذا كان الجسيم يشتمل على بولي نوكليوتيد غير متجانس ‎heterologous polynucleotide‏ (أي بولي نوكليوتيد خلاف جينوم الفيروس الغدي من النوع غير المعالج ‎die‏ جين متحور ‎Why‏ ليتم تسليمه إلى خلية ثديية ‎(mammalian cell 5‏ فإنه يشار إليه ‎sale‏ باسم "جسيم ناقل الفيروس الغدي " أو ببساطة ‎Jil‏ ‏الفيروس الغدي". وبالتالي» فإن إنتاج جسيم ناقل الفيروس الغدي يتضمن بالضرورة إنتاج ناقل الفيروس الغدي؛ حيث أن ‎Jie‏ هذا الناقل موجود داخل جسيم ناقل الفيروس الغدي. الفيروس الغدي تشتمل جينومات الفيروس الغدي الناتجة عن عودة الاتحاد الجيني ‎Gy‏ للاختراع على جزيء حمض 0 نووي ‎Gy‏ للاختراع وواحد أو أكثر من الفيروس الغدي متواليات تكرار طرفية عكسية يحيط بجزيء الحمض النووي. يمكن أن يكون الحمض النووي الفيروس الغدي في جينوم الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني من أي نمط مصلي الفيروس الغدي يمكن اشتقاق فيروس ناتج عن عودة الاتحاد الجيني له؛ على سبيل المثال لا الحصرء أنماط مصلية للفيروس الغدي: الفيروس الغدي-1؛ الفيروس الغدي-2؛ الفيروس الغدي-3؛ الفيروس الغدي-4؛ الفيروس الغدي-5؛ الفيروس الغدي-6؛ الفيروس الغدي-7؛ الفيروس الغدي-8؛ الفيروس الغدي-9؛ الفيروس الغدي-10 الفيروس الغدي-11؛ الفيروس الغدي-12؛ الفيروس الغدي-13؛ و110.74 ‎LAAV‏ يتم الكشف عن إنتاج الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني الكاذب في؛ على سبيل المثال» الوثيقة الدولية 01/83692. يتم أيضًا مراعاة أنواع أخرى من متغيرات الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني؛ على سبيل المثال الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني ذات طفرات كابسيد. انظر على سبيل المثال؛ ‎.Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014) 0‏ كما لوحظ في قسم الخلفية التقنية للاختراع أعلاه؛ فإن متوالية النوكليوتيد للجينومات من أنواع مصلية مختلفة الفيروس الغدي معروفة في المجال. لتعزيز التعبير التوعي عن العضلات الهيكلية؛ يمكن استخدام الفيروس الغدي 1( الفيروس الغدي 5؛ الفيروس الغدي 6؛ الفيروس الغدي 8 أو الفيروس الغدي 9. تشتمل بلازميدات الحمض النووى الرببوزى منقوص الأكسجين على جينومات الفيروس الغدي ناتج 5 عن عودة الاتحاد الجيني. يتم نقل البلازميدات الحمض النووى ‎(Gis‏ منقوص الأكسجين إلى الخلايا المسموح بها للعدوى بفيروس مساعد الفيروس الغدي (على سبيل المثال؛ فيروس غدي
‎«adenovirus‏ أو فيروس غدي محذوف ‎El-deleted adenovirus El‏ أو فيروس الهريس ‎(herpesvirus‏ لتجميع جينوم الفيروس الغدي ناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني في جسيم فيروسي معدي ‎infectious viral particles‏ تُعد تقنيات إنتاج جسيمات الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني؛ حيث يتم توفير جينوم الفيروس الغدي المراد تعبئته وجينات نسخ وكابسيد»؛ ووظائف الفيروس المساعد في الخلية؛ موحدة في المجال. يتطلب إنتاج الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني أن تكون المكونات التالية موجودة داخل خلية (يشار إليها هنا كخلية تغليف ‎agua :(packaging cell‏ الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني وجينات نسخ وكابسيد للفيروس الغدي منفصلة عن (أي ليست في) جينوم الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني؛ ووظائف الفيروس المساعد. يمكن أن تكون جينات نسخ وكابسيد للفيروس الغدي من أي نمط مصلي الفيروس الغدي يمكن اشتقاق الفيروس الناتج عن عودة الاتحاد الجيني؛ وربما يكون من نمط مصلي الفيروس الغدي مختلف عن جينوم الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد ‎«all‏ متواليات تكرار طرفية عكسية؛ بما في ذلك ولكن ليس على سبيل الحصرء الأنماط المصلية للفيروس الغدي وهي: الفيروس الغدي-1؛ الفيروس الغدي-2؛ الفيروس الغدي-3؛ الفيروس الغدي-4» الفيروس الغدي-5؛ الفيروس الغدي-6؛ الفيروس الغدي-7» 8771-74 الفيروس الغدي-8؛ الفيروس الغدي- 5 9 الفيروس الغدي-10» الفيروس الغدي-11 الفيروس الغدي-12. الفيروس الغدي-13 و ‎AAV‏ ‏4. يتم الكشف عن إنتاج الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني الكاذب في؛ على سبيل
‏المثال؛ في الطلب الدولي 01/83692 الذي يتم تضمينه بالإشارة إليه هنا في مجمله. تتمثل طريقة توليد خلية التغليف في إنشاء خط خلوي ‎cell line‏ يعبر بشكل ثابت عن جميع المكونات الضرورية لإنتاج جسيمات الفيروس الغدي. على سبيل المثال؛ يتم دمج البلازميد ‎plasmid‏ ‏0 (و البلازميدات متعددة) التي تشتمل على جينوم الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني تفتقر جينات نسخ وكابسيد للفيروس الغدي؛ جينات نسخ وكابسيد للفيروس الغدي منفصلة عن الجينوم الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني؛ وواسم قابل للاختيار» ‎ie‏ جينات مقاومة نيوميسين ‎neomycin resistance gene‏ وذلك في ‎agua‏ خلية ‎genome of cell‏ تم إدخال الجينوم الفيروس الغدي في البلازميدات البكتيرية ‎bacterial plasmids‏ عن طريق إجراءات ‎GC tailing Jie‏ ‎Proc.
Natl.
Acad. 56. USA, 79:2077-2081) 25‏ ,1982 لة ‎(Samulski et‏ إضافة روابط تخليقية ‎synthetic linkers‏ تحتوي على مواقع تقييد نوكلياز داخلي ‎restriction endonuclease cleavage‏
Senapathy & ( ‏أو إلحاق طرف متلبد مباشر‎ (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73( sites ‏يتم إدخال عدوى إلى سلالة خلية‎ Xam (Carter, 1984, 1. Biol.
Chem., 259:4661-4666 ‏فيروس مرتبط بالغدة. وتتمثل مزايا هذه الطريقة‎ Jie ‏بفيروس مساعد‎ packaging cell line ‏التغليف‎ ‏في أن الخلايا قابلة للاختيار وهي مناسبة للإنتاج على نطاق واسع للفيروس الغدي ناتج عن عودة‎ baculovirus ‏الاتحاد الجيني. تستخيم أمثلة أخرى للطرق المناسبة فيروس غدي أو فيروس عصوي‎ 5 ‏بدلا من بلازميدات لإدخال جينومات الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني و/أو جينات‎
نسخ وكابسيد في خلايا التغليف ‎-packaging cells‏ يتم مراجعة المبادئ العامة لإنتاج الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني في؛ على سبيل المثال» 1533-539 ‎¢Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology,‏ و ,1992 ‎Muzyczka,‏
‎Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129 10‏ .77(©)._يتم وصف أساليب مختلفة في ‎Ratschin et al., Mol.
Cell.
Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.‏ ‎USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol.
Cell.
Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et‏ ‎Lebkowski et al., 1988 Mol.
Cell.
Biol., 7:349 (1988). ¢ al., J.
Virol., 62:1963 (1988)‏ ‎«Samulski et al. (1989, J.
Virol., 63:3822-3828)‏ البراءة الأمريكية رقم 5.173.414؛ البراءة
‏5 الدولية 95/13365 والبراءة الأمريكية المناظرة رقم ¢5.658.776 البراءة الدولية 95/13392؛ البراءة الدولية 96/17947؛ منشور طلب البراءة الأمريكية 0 البراءة الدولية 97/09441 (منشور طلب البراءة الأمريكية 3 البراءة الدولية 97/08298 (منشور طلب البراءة الأمريكية 2 م البراءة الدولية 97/21825 (منشور طلب البراءة الأمريكية 6)7)))) البراءة الدولية 97/06243 (منشور طلب البراءة الفرنسية 96/01064)؛ البراءة الدولية
‎Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene ¢99/11764 0‏ ‎¢Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132‏ البراءة الأمريكية رقم 71 لبراءة الأمريكية رقم 5.871.982؛ والبراءة الأمريكية رقم 6.258.595. ويتم تضمين الوثائق المذكورة أعلاه بالإشارة إليها في هذه الوثيقة بأكملهاء مع التركيز بشكل خاص على تلك الأجزاء من الوثائق المتعلقة بإنتاج الفيروس الغدي ناتج عن عودة الاتحاد الجيني.
‏25 يوفر الاختراع بالتالي خلايا تغليف تنتج الفيروس الغدي الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني المعدية. في أحد التجسيدات؛ يمكن أن تتحول الخلايا المغلفة بشكل ثابت إلى خلايا سرطانية ‎Jie cancer cells‏ خلايا ‎(HeLa‏ وخلايا 293 وخلايا ‎PerC.6‏ (سلالة مماثلة ل 293( ‎٠‏ في تجسيد آخرء تكون خلايا
التغليف عبارة عن خلايا لا يتم تحويلها إلى خلايا سرطائية؛ ‎Jie‏ خلايا المسار المنخفض 293 (خلايا الكلى البشرية الجنينية ‎human fetal kidney cells‏ التي تم تحويلها ب ‎ET‏ للفيروس الغدي)؛ وخلايا ‎LDA) MRC-5‏ ليفية أولية جنينية بشرية ‎«(human fetal fibroblasts‏ وخلايا ‎WI-38‏ (خلايا ليفية أولية جنينية بشرية)؛ ‎WA‏ فيرو ‎AS LDA) Vero cells‏ التسناس ‎(monkey kidney cells‏ وخلايا ‎FROL-2‏ (خلايا الرئة الجنينية للرنسوس ‎(rhesus fetal lung cells‏ يشتمل الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني (أي؛ جسيمات الفيروس الغدي الناتج عن ‎sae‏ الاتحاد الجيني مغلفة معدية) وفقًا للاختراع على جينوم الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني. تتضمن تجسيدات؛ على سبيل المثال وليس الحصرء الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني التي تُدعى ‎A) pAAV.MHCK7hSCGB‏ تشتمل على متوالية البولي 0 نوكليوتيد المذكورة في رقم تعريف المتوالية: ¢3 5 ‎pAAV.IMCKhSCGB‏ التي تشتمل على متوالية البولي نوكليوتيد المذكورة في رقم تعريف المتوالية: 5. يمكن تنقية الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني بواسطة الطرق القياسية في المجال مثل الاستشراب بالعمود ‎column chromatography‏ أو تدرجات كلوريد السيزيوم ‎chloride‏ 10170وع. إن طرق تنقية نواقل الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني من الفيروس المساعد معروفة في 5 المجال وتشمل الطرق التي تم الكشف عنها في؛ على سبيل المثال» ‎Hum.
Gene‏ ماه ‎Clark et‏ ‎Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol.
Med., 69 427-443‏ (2002)؛ البراءة الأمريكية رقم 6.566.118 والطلب الدولي 98/09657. في تجسيد آخرء يراعي الاختراع تركيبات تشتمل على الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني وفقًا للاختراع الحالي. تشتمل التركيبات الموصوفة هنا على الفيروس الغدي الناتج عن عودة 0 الاتحاد الجيني ومادة حاملة مقبولة صيدلانيًً ‎pharmaceutically acceptable carrier‏ قد تشتمل التركيبات أيضًا على مكونات أخرى ‎Jie‏ المواد المخففة ‎diluents‏ والمواد المساعدة ‎adjuvants‏ تتسم ‎gall‏ الحاملة ‎carriers‏ المواد المخففة والمواد المساعدة بأنها غير سامة للمستقبلين وبفضل أن تكون خاملة في الجرعات ‎dosages‏ والتركيزات المستخدمة؛ وتتضمن محاليل منظمة ‎Jie‏ الفوسفات ‎phosphate‏ أو السيترات ‎citrate‏ أو الأحماض العضوية ‎organic acids‏ الأخرى؛ مضادات أكسدة ‎Jie antioxidants 5‏ حمض الأسكورييك ‎lady de ascorbic acid‏ ذات وزن جزيئي منخفض ‎¢low molecular weight polypeptides‏ بروتينات» ‎Jie‏ ألبومين مصلي ‎serum albumin‏ جيلاتين
‎«gelatin‏ أو جلوبيولينات مناعية ‎timmunoglobulins‏ بوليمرات آلفة تلماء ‎hydrophilic polymers‏ ‎Jie‏ بولي ‎(uid‏ بيروليدون ‎¢polyvinylpyrrolidone‏ أحماض أمينية ‎Jie amino acids‏ جليسين ‎glycine‏ أو جلوتامين ‎glutamine‏ أو هليونين ‎asparagine‏ أو أرجينين ‎arginine‏ أو ليسين ‎¢lysine‏ ‏موتو سكاريد ‎«monosaccharides‏ داي مكاريد ‎Wye «disaccharides‏ من الكريوهيدرات ‎Wo carbohydrates 5‏ في ذلك الجلوكوز ‎cglucose‏ المانوز ‎«mannose‏ أو الديكسترون ‎¢dextrins‏ ‏عوامل خلابية ‎Jie chelating agents‏ ثثاثي أمين الإيثيلين رياعي ‎aes‏ الأسيتيك ‎¢(EDTA) Ethylenediaminetetraacetic acid‏ كحوليات سكرية ‎Jie sugar alcohols‏ المانيتول ‎mannitol‏ أو السوربيتول ‎¢sorbitol‏ أيونات مضادة لتشكيل الملح ‎Jie salt-formig counterions‏ الصوديوم ‎sodium‏ و/أو مواد خافضة للتوتر السطحي غير أيونية ‎nonionic surfactants‏ مثل توين ‎«Tween 0‏ بلورونيك وعنده«:1م» أو بولي إيثيلين جليكول ‎-(PEG) polyethylene glycol‏ سوف تتباين عيارات الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني المراد إعطاؤها بطرق ‎By‏ ‏للاختراع؛ على سبيل المثال؛ على الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني المعين؛ ووضع الإعطاء؛ والهدف العلاجيء والمره؛ ونوع ‎(pls)‏ الخلية المستهدفة؛ ويمكن تحديدها من خلال الأساليب القياسية في المجال. يمكن أن تتراوح عيارات الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني من حوالي ‎x1‏ 10 حوالي ‎x1‏ 10 حوالي 0*1 حوالي ‎x1‏ 10 حوالي ‎x1‏ 10 حوالي ‎x1‏ 10ل حوالي ‎x1‏ 210ل حوالي ‎x1‏ 10 إلى حوالي ‎x1‏ 10" أو أكثر من جزيئات ديوكسي ‎gu)‏ نوكلياز ‎(DNase) deoxyribonuclease‏ المقاومة ‎(DRP) DNase resistant particles‏ لكل ملليلتر. يمكن ‎Lal‏ التعبير عن الجرعات بوحدات الجينوم الفيروسي ‎viral genomes‏ (78). يتم مراعاة طرق تحوير خلية مستهدفة ‎target cell‏ باستخدام الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد 0 الجيني؛ في داخل جسم الكائن أو في ‎dal‏ بواسطة الاختراع. تشتمل الطرق في داخل جسم ‎SII‏ على خطوة إعطاء جرعة فعالة ‎ceffective dose‏ أو جرعات متعددة فعاتلة ‎effective multiple‏ ‎cdoses‏ من تركيبة تشتمل على الفيروس الغدي الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني ‎Gy‏ للاختراع إلى كائن حيواني (بما في ذلك الإنسان) في ‎dala‏ إليه. إذا كانت الجرعة تُعطى قبل الإصابة باضطراب/مرض» فإن الإعطاء يكون وقائيًا. إذا كانت الجرعة تُعطى بعد حدوث اضطراب/مرض؛ 5 فإن الإعطاء يكون علاجيًا. في تجسيدات الاختراع» تكون الجرعة الفعالة ‎deja‏ لتخفيف (إزالة أو تقليل) عرض واحد على الأقل مرتبط بحالة الاضطراب/المرض المراد ‎cade‏ حيث تبطئ أو تمنع
تقدم ‎Als‏ الاضطراب/المرض؛ حيث تبطئ أو تمنع تقدم ‎Als‏ اضطراب/مرض» حيث تقلل من نطاق ‎(papell‏ حيث تؤدي إلى سكون المرض (جزثيًا أو ‎(WS‏ و/أو حيث تطيل البقاء على قيد الحياة. يُعد ضمور العضلات؛ على سبيل المثال ضمور العضلات لحزام ‎(GHEY‏ مثالا على مرض يُراعى منعه أو علاجه بطرق الاختراع.
يتم ‎Wad‏ مراعاة العلاجات المشتركة من خلال الاختراع. تشتمل التوليفة طبقًا لما هو مستخدم هنا على كل من العلاجات المتزامنة ‎simultaneous treatment‏ والعلاجات التتابعية. يتم بشكل خاص مراعاة توليفات من طرق الاختراع باستخدام العلاجات الطبية القياسية ‎standard medical‏ ‎treatments‏ (مثل الكورتيكوستيرويدات ‎(corticosteroids‏ وكذلك التوليفات باستخدام العلاجات الجديدة.
0 الكمية الفعالة علاجيا من ناقل الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني عبارة عن جرعة من الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني تتراوح من حوالي 1613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي ‎agin Seld‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1613 ‎asin‏ فيروسي/كجم إلى حوالي 2013 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 3013 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 4813 ‎agua‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1813 جينوم
5 فيروسي/كجم إلى حوالي 5013 ‎agin‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 6013 ‎agin‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 7013 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 8013 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 9813 ‎asin‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 1614 جيئوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1613 جينوم فيروسي/كجم إلى
0 حوالي ‎2eld‏ جينوم فيروسي/كجم؛ أو 1613 ‎asin‏ فيروسي/كجم إلى ‎Jon‏ 3614 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1613 إلى حوالي 4214 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3813 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 4213 ‎agin‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 513 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3613 ‎asin‏ فيروسي/كجم إلى حوالي 6813 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 7013 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي
‎asus 3613 5‏ فيروسي/كجم إلى حوالي 8613 ‎agus‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 9613 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3013 جينوم فيروسي/كجم إلى
حوالي 1614 ‎asin‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3013 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 2014 جينوم فيروسي/كجم؛ أو 3013 ‎agin‏ فيروسي/كجم إلى حوالي 314 ‎agin‏ فيروسي/كجم» أو حوالي 3613 إلى حوالي 4214 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 3813 ‎agin‏ فيروسي/كجم إلى حوالي ‎Seld‏ جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 5013 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 6013 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي ‎agua 5613 5‏ فيروسي/كجم إلى حوالي 7813 ‎agua‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 5813 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 8613 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 5013 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 9813 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 5813 ‎asin‏ فيروسي/كجم إلى حوالي 1614 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 5013 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 2014 ‎asin‏ فيروسي/كجم؛ أو 5613 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 3014 جينوم فيروسي/كجم» أو حوالي 5013 إلى حوالي 4614 جينوم
0 فيروسي/كجم؛ أو حوالي 5013 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 5614 جينوم فيروسي/كجم؛ أو حوالي 4 جينوم فيروسي/كجم إلى حوالي 2014 جينوم فيروسي/كجم,؛ أو 1814 جينوم فيروسي/كجم إلى ‎agin 3614 sa‏ فيروسي/كجم؛ أو حوالي 1614 إلى حوالي 4214 جينوم فيروسي/كجم» أو حوالي 4 جيئوم فيروسي/كجم إلى ‎asin 5014 Jon‏ فيروسي/كجم. يشتمل الاختراع أيضًا على تركيبات تتضمن هذه النطاقات لناقل الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني.
على سبيل المثال؛ الكمية الفعالة علاجيا من ناقل الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني عبارة عن جرعة تبلغ 1613 ‎agua‏ فيروسي/كجم»؛ حوالي 2013 جينوم فيروسي/كجم» حوالي 3613 ‎agin‏ فيروسي/كجم؛ حوالي 4813 جينوم فيروسي/كجم؛ حوالي 5613 جينوم فيروسي/كجم»؛ حوالي ‎agin 3‏ فيروسي/كجم؛ حوالي 7013 جينوم فيروسي/كجم؛ حوالي 8613 ‎asin‏ فيروسي/كجم؛ حوالي 9813 ‎asim‏ فيروسي/كجم؛ ‎asin 1614 sn‏ فيروسي/كجم؛ ‎asin 2014 sn‏
0 فيروسي/كجم» حوالي 3014 جينوم فيروسي/كجم؛ حوالي 4614 ‎asin‏ فيروسي/كجم و5014 جينوم فيروسي/كجم. يشتمل الاختراع ‎Wad‏ تركيبات تتضمن هذه الجرعات من ناقل الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني. يمكن أن يتم إعطاء جرعة فعالة من التركيبات من خلال مسارات قياسية في المجال بما في ذلك؛ على سبيل المثال لا الحصر؛ الحقن في العضل أو الحقني أو الوريدي أو فمويًا أو في الشدق
‎buccal 5‏ أو في الأنف ‎nasal‏ أو في الرثئة ‎pulmonary‏ أو داخل الجمجمة ‎intracranial‏ أو داخل الجنين ‎intraosseous‏ أو داخل العين ‎intraocular‏ أو في المستقيم ‎rectal‏ أو في المهبل ‎-vaginal‏
يمكن اختيار و/أو مواءمة مسار (مسارات) الإعطاء والنمط المصلي (الأنماط المصلية) لمكونات الفيروس الغدي للفيروس الغدي الناتج عن ‎sae‏ الاتحاد الجيني ‎lo)‏ وجه الخصوص؛ الفيروس الغدي متواليات تكرار طرفية عكسية ويروتين كابسيد) ‎Gy‏ للاختراع من ‎JB‏ المهرة في المجال مع الأخذ في الاعتبار العدوى و/حالة المرض الذي يتم علاجه والخلايا/الأنسجة المستهدفة التي تعبر عن 8-سركوجليكان.
يراعي الاختراع الإعطاء الموضعي والجهازي لجرعة فعالة من الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني وتركيبات ‎Bay‏ للاختراع. على سبيل المثال؛ يشير الإعطاء الجهازي إلى إعطاء في الجهاز الدوري ‎circulatory system‏ بحيث يتأثر الجسم بأكمله. يشمل الإعطاء الجهازي الإعطاء المعوي ‎enteral administration‏ على سبيل ‎Jad‏ الامتصاص عبر الجهاز الهضمي ‎gastrointestinal tract 0‏ والإعطاء بغير مسار الجهاز الهضمي من خلال الحقن أو التسريب أو
الغرس. على ‎dag‏ الخصوص؛ يمكن تحقيق الإعطاء الفعلي للفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎Gg‏ للاختراع الحالي باستخدام أي طريقة جسدية تنقل ناقل الفيروس الغدي الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني الناتج عن عودة الاتحاد الجيني إلى النسيج المستهدف لكائن حيواني. يشمل الإعطاء طبقًا 5 للاختراع» على سبيل المثال لا الحصر؛ الحقن في العضلات» و/أو مجرى الدم ‎bloodstream‏ و/أو في الكبد مباشرة. ببساطة؛ لقد ثبت أن إعادة تعليق الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني في محلول ملحي منظّم بالفوسفات ‎phosphate buffered saline‏ يكفي لتوفير ناقل مفيدة لتعبير عن ‎dal‏ العضلات ‎tissue‏ 005218 ولا توجد قيود معروفة على الناقلات أو المكونات الأخرى التي يمكن إعطاؤها بشكل مشترك مع الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني (على الرغم من أن 0 التركيبات التي تحلل الحمض النووي يجب تجنبها بطريقة طبيعية مع الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني). يمكن تعديل بروتينات كابسيد للفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني بحيث يتم توجيه الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني إلى نسيج مستهدف معين محل الاهتمام ‎Jie‏ العضلات. انظرء على سبيل المثال؛ الطلب الدولي 02/053703؛ حيث يتم تضمين الكشف الخاص به هنا كمرجع. يمكن تحضير التركيبات الصيدلانية ‎Pharmaceutical‏ ‎compositions 5‏ كتركيبات قابلة ‎injectable formulations (gall‏ أو كتركيبات موضعية ‎topical‏ ‎formulations‏ لتوصيلها إلى العضلات عن طريق النقل عبر الجلد ‎transdermal transport‏ وقد تم
تطوير العديد من الصيغ لكل من الحقن في العضل والنقل عبر الجلد ويمكن استخدامها في ممارسة الاختراع عمليًا. يمكن استخدام الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني مع أي مادة ‎ela‏ ‏مقبولة صيدلانيًا لسهولة الإعطاء والمناولة. لأغراض الحقن في العضل؛ يمكن استخدام المحاليل في مادة مساعدة ‎Jie adjuvant‏ زيت السمسم أو زبت الفول السوداني أو في بروييلين جليكول ‎caqueous propylene glycol le‏ بالإضافة إلى المحاليل المائية المعقمة ‎Lsterile aqueous solutions‏ يمكن تنظيم هذه المحاليل الماتية بمحاليل منظمة؛ إذا رغبت في ذلك» ويتم جعل المادة المخففة السائلة ‎liquid diluent‏ متساوية التوتر ‎isotonic‏ أولا باستخدام محلول ملحي أو جلوكوز. يمكن تحضير محاليل الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني كحمض حر ‎free acid‏ (الحمض النووى الرببوزى منقوص الأكسجين يحتوي 0 على مجموعات فوسفات حمضي ‎(acidic phosphate‏ أو ملح مقبول ‎a Yaa‏ ‎pharmacologically acceptable salt‏ في الماء المخلوط بشكل مناسب مع مادة خافضة للتوتر السطحي ‎Jie surfactant‏ هيدروكسي بروييل سيليولوز ©0108نل©1170:0*0:0016. ويمكن أيضًا أن يتم تحضير مشتت الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني في جليسرول ‎cglycerol‏ بولي إيثيلين جليكول سائل ‎liquid polyethylene glycols‏ وخلائط منها وزيبوت. تحت الظروف العادية 5 للتخزين والاستخدام» تحتوي هذه المستحضرات على مواد حافظة ‎preservative‏ لمنع نمو الكائنات الحية الدقيقة. وفي هذا الصدد؛ يمكن الحصول بسهولة على وسائط مائية معقمة ‎sterile aqueous‏ ‎media‏ باستخدام تقنيات قياسية معروفة جيدا لأولئك المهرة في المجال. تشتمل الصور الصيدلانية المناسبة للاستخدام عن طريق الحقن على محاليل مائية معقمة أو مشتتات ‎dispersions‏ ومساحيق معقمة ‎sterile powders‏ لتحضير محاليل أو مشتتات معقمة قابلة 0 للحقن. في جميع الحالات» يجب أن يكون شكل الجرعة معقما ويجب أن يكون سائلًا إلى الحد الذي توجد فيه قابلية سهلة لنشره. يجب أن يكون مستقرًا في ظل ظروف التصنيع والتخزين ويجب الحفاظ عليه ضد التلوث الذي قد تحدثه كائنات حية دقيقة ‎ie‏ البكتيريا والفطريات. يمكن أن يكون الناقل عبارة عن مذيب ‎solvent‏ أو وسط تشتيت ‎dispersion medium‏ يحتوي على سبيل ‎JB‏ على ‎cola‏ إيثانول امصفطاء؛ بوليول ‎Ae) polyol‏ سبيل المثال؛ جليسيرول؛ بروبيلين جليكول ؛ بولي ‎pli) 5‏ جليكول سائل ‎liquid polyethylene glycol‏ وما شابه)؛ خلائط مناسبة منهاء وزبوت نباتية ‎oils‏ ع86181©». يمكن الحفاظ على السيولة المناسبة؛ على سبيل ‎(JB‏ عن طريق استخدام غلاف
‎Jie coating‏ الليسيثين ‎dlecithin‏ عن طريق الحفاظ على حجم الجسيمات المطلوية في حالة التشتيت واستخدام المواد الخافضة للتوتر السطحي. يمكن تحقيق الوقاية من تأثيرات الكائنات الحية الدقيقة من خلال عوامل مضادة للجراثيم ومضادة للفطريات؛ على سبيل المثال» بارابين ‎«parabens‏ ‏كلورويوتاتول ‎cchlorobutanol‏ فينول ‎phenol‏ حمض السوربيك ‎acid‏ عنط:ه؟»_الثيمروزال ‎thimerosal 5‏ وما شابه. في كثير من الحالات؛ سيكون من الأفضل تضمين عوامل متساوية التوتر
‎agents‏ ع901001»_ على سبيل ‎(JB‏ السكريات أو كلوريد الصوديوم. يمكن أن يحدث الامتصاص المطول ‎Prolonged absorption‏ للتركيبات القابلة للحقن عن طريق استخدام عوامل تأخير الامتصاص ‎cagents delaying absorption‏ على ‎(Jil Jue‏ أحادي ستيارات الألومنيوم ‎aluminum monostearate‏ والجيلاتين.
‏10 يتم تحضير المحاليل القابلة للحقن المعقمة ‎Sterile injectable solutions‏ من خلال دمج الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني بالكمية المطلوبة في المذيب المناسب مع المكونات ‎GAY)‏ ‏المختلفة المذكورة أعلاه ؛ كما هو مطلوب؛ يتبعها تعقيم المرشح ‎filter sterilization‏ بشكل عام؛ يتم تحضير التشتيت عن طريق دمج المادة الفعالة المعقمة ‎sterilized active ingredient‏ في ناقل معقم ‎sterile vehicle‏ يحتوي على وسط التشتيت ‎١‏ لأساسي ‎basic dispersion medium‏ والمكونات الأخرى
‏5 المطلوية من تلك المذكورة أعلاه. في حالة المساحيق المعقمة لتحضير المحاليل القابلة للحقن المعقمة؛ فإن الطرق المفضلة للتحضير هي التجفيف بالتفريغ والتجفيف بالتجميد التي تنتج مسحوقًا من المكون النشط بالإضافة إلى أي مكون مرغوب إضافي من المحلول المرشح بالتعقيم ‎sterile-‏ ‎(FIN filtered solution‏ . يمكن أيضًا إجراء عملية تحوير باستخدام الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني في
‏0 المختبر. في أحد التجسيدات» تتم إزالة الخلايا العضلية المستهدفة ‎target muscle cells‏ المرغوية من الخاضع للعلاج؛ وبتم تحويرها باستخدام الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني وإعادة إدخالها في الخاضع للعلاج. وكبديل لذلك؛ يمكن استخدام ‎WIA‏ العضلات المتماثلة أو غير المتماثلة النمط الجيني؛ حيث لا ‎Ag‏ هذه ‎LIAL‏ استجابة مناعية ‎immune response‏ مناسبة في الخاضع للعلاج.
‏5 من المعروف أن الطرق المناسبة لتحوير الخلايا المحورة ‎transduced cells‏ وإعادة إدخالها في خاضع للعلاج معروفة في المجال. في أحد التجسيدات؛ يمكن تحوير الخلايا في المختبر عن طريق
الجمع بين الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني وخلايا العضلات؛ على سبيل المثال» في الأوساط المناسبة؛ وفرز تلك الخلايا التي تؤوي الحمض النووي محل الاهتمام باستخدام التقنيات التقليدية ‎Jie‏ بقع سزرن و/أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ‎«(PCR) polymerase chain reaction‏ أو باستخدام علامات الوسم القابلة للاختيار. يمكن بعد ذلك صياغة الخلايا التي يتم تحويرها إلى تركيبات صيدلانية؛ ويتم إدخال التركيبة إلى الخاضع للعلاج عن طريق تقنيات مختلفة؛ مثل الحقن في العضل أو الوويدي أو تحت الجلد أو داخل الغشاء البربتوني ‎«intraperitoneal injection‏ أو عن
طريق الحقن في العضلات الملساء والقلبية؛ باستخدام قسطرة ‎«catheter‏ ‏ينتج عن تحوير الخلايا ذات الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎Gy‏ للاختراع تعبير مستمر عن م-سركوجليكان. يوفر الاختراع الحالي بالتالي طرق إعطاء/توصيل الفيروس الغدي 0 الناتج عن عودة الاتحاد الجيني التي تعبر عن م-سركوجليكان لكائن ثديي؛ وبفضل أن يكون إنساثًا. وتشمل هذه الأساليب الأنسجة المحوّرة ‎transducing tissues‏ (بما في ذلك؛ على سبيل المثال لا الحصر؛ أنسجة مثل العضلات والأعضاء مثل الكبد والدماغ والغدد ‎Jie glands‏ الغدد اللعابية ‎(salivary glands‏ مع واحد أو أكثر من الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎Gy‏ ‏للاختراع الحالي. يمكن إجراء التحوير باستخدام أطقم الجينات التي تحتوي على عناصر تحكم ‎control elements 5‏ خاصة بالنسيج. على سبيل ‎JE‏ يوفر أحد التجسيدات للاختراع طرقًا لتحويل الخلايا العضلية والأنسجة العضلية ‎muscle tissues‏ الموجهة بواسطة عناصر التحكم العضلية المحددة؛ ‎Lay‏ في ذلك؛ على سبيل المثال لا الحصر؛ تلك المشتقة من عائلات جينات الأكتين والميوسين» ‎Jie‏ عائلة جين ‎myoD‏ [انظر )1991( 761-766 :251 ‎Science,‏ مله ‎[Weintraub et‏ عامل ربط محسن خاص بخلية عضلية | 4854-4862 :11 ‎Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol‏ (1991)]؛ عناصر تحكم مشتقة من جين الأكتين العظمي البشري [ ‎Muscat ef al., Mol Cell Biol,‏ )1987( 4089-4099 :7] جينة الأكتين القلبي ‎ccardiac actin gene‏ عناصر متوالية كرياتين كيناز العضلات ‎muscle creatine kinase‏ [أنظر )1989( 9:3393-3399 ‎Mol Cell Biol,‏ ماه ‎[Johnson et‏ وعنصر الكرياتين كيناز المحسن للفئران ‎«(mCK) murine creatine kinase enhancer‏ عناصر التحكم المشتقة من جين ترويونين © الهيكلي سريع التحويلء جين تروبونين © القلبي بطيء 5 التحويل»؛ وجين تروبونين 1 بطيء التحويل: عوامل نووية قابلة للحث بنقص الأكسجين ( ‎Semenza‏ ‎lias «(ef al, Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)‏ وعناصر قابلة للحث
بالاستيرويد بما في ذلك عنصر استجابة للجلايكورتيكود (انظر ‎Mader and White, Proc.
Natl.‏
‎(Acad.
Sci.
USA 90: 5603-5607 (1993)‏ ؛ وعناصر تحكم أخرى .
‏النسيج العضلي هدف جذاب لتوصيل الحمض النووي في داخل جسم الكائن؛ لأنه ليس عضو حيوي
‎vital organ‏ وسهل الوصول إليه. يراعي الاختراع التعبير المستمر عن أحماض ‎Lys)‏ نووية ميكروية ‎(miRNAs) microRibonucleic acids‏ من الألياف العضلية المحورة وراقيا ‎transduced‏
‎.myofibers
‏يقصد بالمصطلح "خلية عضلية" أو 'أنسجة عضلية' خلية أو مجموعة ‎WIA‏ مشتقة من العضلات
‏من أي نوع (على سبيل المثال؛ العضلات الهيكلية والعضلات الملساء ‎csmooth muscle‏ على سبيل
‏المثال من الجهاز ‎oad‏ أو المثانة البولية ‎urinary bladder‏ أو الأوعية الدموية ‎blood vessels‏
‏0 أو أنسجة القلب ‎(cardiac tissue‏ قد تكون ‎WA‏ العضلات متمايزة أو غير متمايزة؛ ‎Jie‏ الخلايا العضلية الليفية ‎(myoblasts‏ الخلايا العضلية ‎(myocytes‏ الخلايا العضلية الأنبوبية ‎«myotubes‏ ‏الخلايا العضلية القلبية ‎cardiomyocytes‏ الخلايا العضلية القلبية الأولية ‎.cardiomyoblasts‏ ‏يُستخدم مصطلح "تحوير” أو تحوير ‎Jy‏ للإشارة إلى إعطاء/توصيل بولي نوكليوتيد محل اهتمام (على سبيل المثال» متوالية بولي نوكليوتيد مشفرة ل ]-سركوجليكان) إلى خلية مستقيلة ‎recipient‏
‏5 ااء» إما في داخل جسم الكائن أو في المختبرء عن طريق الفيروس الغدي الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني ناقص التكرار تم وصفه مما يؤدي إلى التعبير عن ]-سركوجليكان من قبل الخلية المستقبلة. من هناء يصف الاختراع هنا ‎Bla‏ لإعطاء جرعة فعالة (أو جرعات؛ يتم إعطاؤها بشكل أساسي في وقت واحد أو جرعات تعطى على فترات) من الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني الذي يشفر م-سركوجليكان إلى كائن ثديي في حاجة إلى ذلك.
‏0 يتم تضمين جميع المطبوعات وبراءات الاختراع المذكورة هنا بالإحالة إليها في مجملها كما لو أن كل منشور أو براءة اختراع قد تم ذكرها بشكل محدد أو فردي لتضمينها. في ‎Ala‏ التعارض؛ فإن الطلب الحالي يسود بما في ذلك أي تعريفات هنا. يتم أيضا وصف الاختراع في الأمثلة التالية؛ التي لا تقيد نطاق الاختراع الموصوف في عناصر الحماية.
‏5 الأمثلة المواد والطرق
نماذج حيوانية - تمت الموافقة على جميع الإجراءات من ‎JB‏ معهد البحوث في لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية لمستشفى الأطفال على الصعيد الوطني (البروتوكول 112-00040م). تم شراء ‎(hi‏ متغايرة الزيجوت من نوع ‎B6.129-SgebtmlKeam/1J‏ من مختبر جاكسون (بار هاربور» أم إى ‎(ME‏ الولايات المتحدة الأمريكية؛ سلالة # 006832). تم إنشاء فئران 8607 عن طريق تربية الفئران متغايرة الزيجوت. تم تربية فئران كيه أوه ‎KO‏ والحفاظ عليها كحيوانات متماثلة الزيجوت في ظل ظروف موحدة في مركز الثروة الحيوانية في معهد البحوث بمستشفى الأطفال على الصعيد الوطني. تم الحفاظ على الفتران وفقًا للنظام الغذائي العالمي ‎Teklad Global Rodent Diet‏ (ألياف 3.825 718.8 بروتين» 75 طعام دهني) مع دورة ليل ظلام بمقدار 12: 12 ساعة. تم إجراء تحديد فثران ‎sgeb®‏ بواسطة التنميط الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم إيواء 0 جميع الحيوانات في أقفاص الفئران القياسية مع حرية وصولها للطعام والشراب. ‎eli]‏ جين م-سركوجليكان. تم إخضاع الحمض النووى الريبوزى متقوص الأكسجين_المتمم ‎(cDNA) complementary Deoxyribonucleic acid‏ ل م-سركوجليكان بشري كامل الطول (برقم وصول ‎GenBank‏ هو ‎(NM_0034994.3‏ لتحسن بالكودون وتخليقه بواسطة ‎cav;m GenScript Inc‏ ‎(Piscataway‏ نيوجيرسي؛ _الولايات المتحدة الأمريكية. إن عملية التحسين الكودوني من خلال ‎GenSeript 15‏ تستخدم خوارزمية تأخذ بعين الاعتبار المتغيرات التي تشمل النسخ؛ ومعالجة واستقبال الحمض النووى الريبوزى المرسل ‎(MRNA) Messenger Ribonucleic acid‏ والترجمة الوراثية وطي البروتين لتصميم متوالية الحمض النووى الرببوزى منقوص الأكسجين المتمم ينتج عنها أقصى تعبير في الأنسجة العضلية ‎-(www.genscript.com)‏ ‏بالنسبة للجزء ‎pAAV.IMCKASGCB Laid‏ 5 استنساخ الحمض النووى الريبوزي منقوص 0 الأكسجين المتمم بعد ذلك إلى بلازميدة تحتوي على متواليات تكرار طرفية عكسية للفيروس الغدى 2 وتضمن الطقم متوالية ‎Kozak‏ توافقية ‎«(CCACC) consensus Kozak sequence‏ إنترون خيمري 0م وموقع تذييل بعديد الأدينيلات تخليقي (53 زوج قاعدة). كان معزز كرياتين كيناز عضلي مقتضب الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎date‏ من الدكتور شياو شياو (جامعة نورث كارولينا). وهو تعديل للمعزز كرياتين كيناز 6 الموصوف مسبقًا ويشتمل على تعديل في مُعزّز قبل منطقة المعزز 5 التي تحتوي على مواقع ربط عوامل النسخ. يتكون المعزز من مربعي 5 ‎Gal)‏ وأيسر) يتضمن تعديل معزز كرياتين كيناز عضلي مقتضب طفرة في تحويل مربع ‎BE‏ الأيسر إلى مريع 5 أيمن
(تعديل ‎(2R‏ وإدخال 6 زوج قاعدة (تعديل 55). تم إنشاء ناقل 17.040615008ههم عن طريق ربط شظية ‎Kpnl/Xbal‏ 1040 زوج قاعدة من ‎(Genscript Inc) «pUCS7-BSG‏ بمواقع مواقع ‎Kpnl/Xbal‏ ل ‎tMCK.hSGCA.26‏ .لاههم. تم إنشاء ‎pAAV.MHCK7hSGCB (BU‏ عن طريق إزالة معزز كرياتين كيناز عضلي مقتضب وإنترون خيمري 5740 بمواقع ‎Notl/Kpnl‏ وإدخال شظية متضخمة ‎amplified fragment‏ تفاعل البوليميراز المتسلسل تحتوي على معزز نسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرياتين كيناز عضلي وإنترون خيمري 5740 متطابق مع مواقع 1100/16001. يُعد نسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرياتين كيناز عضلي مُعزّز أساسه كرياتين كيناز عضلي يستخدم محسن 206 زوج قاعدة مأخوذ من؛ 1.2كيلو بايت عند 5” لموقع بدء النسخ داخل جين كرياتين كيناز العضلة ذاتي ‎Lindl 0‏ مع معزز قريب 312(م584-05 ,60:35811016). يحتوي المعزز نسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرباتين كيناز عضلي نفسه على هذا الطقم المعدل كرياتين كيناز 7 من عائلة جينات كرياتين كيناز عضلي المرتبطة بمحسن ‎o-MyHC o-MyHC‏ (سلسلة ثقيلة ل 188 ‎(o-MyHC‏ عند 5 لبروتين كرياتين كيناز لتعزيز التعبير القلبي'. إن جزءِ كرياتين كيناز للمعزز يتطابق بنسبة 6 بين كرباتين كيناز عضلي مقتضب ونسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرباتين كيناز 5 عضلي. وأخيرًا؛ تم إنشاء ‎pAAV.MHCK7.hSGCB Jil‏ عن طريق ربط شظية إنترون ‎Notl/Kpnl MHCK7 +‏ ذات 960 زوج قاعدة من ‎pAAV.MHCK7DYSF5DV44‏ بمواقع ‎Notl/Kpnl‏ من ‎(Pozgai et al., Gene Ther. 23: 57-66, 2016) pAAV.tIMCK.hSGCB‏ . إنتاج الفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني. تم استخدام طريقة تغليف تبادلي معدل؛ سبق وصفها بواسطة )2007 ,5:45 ‎cRodino-Klapac et al. (J.
Trans.
Med.‏ وذلك لإنتاج ناقل الفيروس 0 الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني. في هذه الوثيقة؛ تسمح طريقة التحوير الوراثي الثلاثية التي تتضمن ترسيب فوسفات الكالسيوم ‎(CaPOs) calcium orthophosphates‏ في ‎LIA‏ كلوية جنينية بشرية 293 ‎(HEK293) Human embryonic kidney 293 cells‏ بتجميع وحدات متواليات تكرار طرفية عكسية للفيروس الغدي 2 في نوع مصلي مختلف من كابسيد الفيروس الغدي. )28 29). كانت بلازميدات الإنتاج ‎production plasmids‏ (1) 5008 ك1 لاههم أو ‎¢pAAV.MHCK7.hSGCB 25‏ (2) بلازميدات مساعدة الفيروس الغدي معدلة ب ‎rep2-caprh.74‏ تشفر نمط مصلي كابسيد عازلة ل 01-74 و(3) بلازميدة مساعدة من النمط الفيروسي الغدي 5
E4 ORF6 E1A E2A (pall ‏التي تعبر عن‎ ¢(pAdhelper) adenovirus type 5 helper plasmid ‏تم تنقية النواقل وتم تحديد عيار جينوم فيروسي مغلف (باستخدام نظام كاشف‎ LVA 1/11 ‏و1/11‎ ‏كاليفورنياء‎ (Carlsbad «PE Applied Biosystems ¢Prism 7500 Taqman detector system ‏والمسبار المتألق‎ primer ‏الولايات المتحدة الأمريكية) كما هو موضح مسبقًا. )30( استهدف البادئ‎ forward ‏أمامي‎ teal : ‏معزز كرباتين كيناز عضلي مقتضب وكان كالتالي‎ fluorescent probe 5 ' 5-ACC CGA GAT GCC TGG TTA TAA 11-3 ‏كرياتين كيناز عضلي مقتضب؛‎ primer 5-TCC ‏كرياتين كيناز عضلي مقتضب»؛‎ reverse primer ‏(رقم تعريف المتوالية: 10(¢ بادئ عكسي‎ ‏(رقم تعريف المتوالية: 11)؛ ومسبار كرياتين كيناز‎ ' ATG 616 TAC AGA GCC TAA GAC-3 ‏(رقم‎ 5-1-0160 016 CCT GAG CCT GAG CGG TTA C-TAMRA-3' (aie ‏عضلي‎ ‏تعريف المتوالية: 12). استهدف البادئ والمسبار المتألق معزز نسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة‎ 0 ‏للميوسين وكرياتين كيناز عضلي وكان على النحو التالي: بادئ أمامي نسخة مهجنة من سلسلة‎ ‏(رقم‎ 5-CCA ACA CCT GCT GCC TCT AAA-3' ‏ثقيلة للميوسين وكرباتين كيناز عضلي؛‎ ‏تعريف المتوالية: 16)؛ بادئ عكسي نسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرياتين كيناز‎ ‏(رقم تعريف المتوالية: 17)؛ ومسبار نسخة‎ 5-GTC CCC CAC AGC CTT GTT C-3 ‏عضلي»‎ ‎5:-171/1-1706 ATC CCC-Zen-TGC «hae SUS ‏مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرياتين‎ 5
.)18 ‏(رقم تعريف المتوالية:‎ ATG CGA AGA TC-31ABKFQ-3' ‏توصيل الجين العضلي. للحقن في العضل؛ تم تخدير الفئران والاحتفاظ بها تحت 4-1 #7 من أيزو‎ ‏_للطرف السفلي‎ anterior compartment ‏(في ?0( تم تنظيف الحجيرة الأمامية‎ isoflurane ‏فلوران‎ ‎(EtOH) Ethanol ‏الأيسر لفئران 8657 البالغة من العمر 6-4 أسابيع باستخدام 795 من إيثانول‎ ‏جينوم‎ 10 x 3 ‏باستخدام‎ transverse abdominal muscle ‏ثم تم حقن عضلة البطن العرضية‎ 20 ‏المخفف في محلول ملحي بحجم 30 ميكرو لتر‎ scAAVIRTAMCKHSGCB ‏فيروسي من‎ ‏بمقياس 30. تُركت العضل في‎ ultra-fine insulin syringe ‏باستخدام حقنة إنسولين دقيقة للغاية‎ ‏عضلة الظنبوب الأمامي من كلا‎ All) ‏الجانب المقابل دون علاج لتكون بمثابة عينة مقارنة. تمت‎ ‏6؛ 4 ذكور؛ إناث 2) أسابيع من الحقن‎ =n) 12 ‏ذكور؛ 5 إناث) أو‎ 4 9 =n) 6 ‏الطرفين بعد‎ ‏5؛‎ =n) ‏لتقييم كفاءة نقل الجينات. في التجارب التي شملت الفئران البالغة من العمر 6 أشهر‎ 5 asin !!10 X 3 ‏ذكور)؛ تكون العلاج من الحقن في العضل في الظنبوب الأمامي الأيسر بمقدار‎
فيروسي من 11.74.010161500[3/اهخه؟. لتجارب تروية الطرف المعزول؛ تم تروية ‎Gh‏ ماع ©” عند 4 ‎=n)‏ 5؛ 5 ذكور) و5 ‎=n)‏ 4 2 ذكورء أنثى 2) أسابيع من العمر بمقدار 5 ‎x‏ 10!! جينوم فيروسي من 11016150813 .84171.74 عن طريق الحقن في الشريان الفخذي كما هو موضح مسبقًا. تم التخلص من الكائنات الحيوانية بالموت الرحيم وتم تحليل العضلات بعد 8 أسابيع من تقل الجينات. توصيل الجينات جهازيًا : تم تحقيق التوصيل الجهازي من خلال حقن الناقل في الوريد الذيلي لفثران ‎.sgeb”‏ تم حقن الفئران باستخدام 1 ‎x‏ 1110 جينوم فيروسي من ‎SCAAVTh.74. MHCK7.hSGCB‏ المخفف في محلول ملحي بحجم 212 ميكرو لتر باستخدام حقنة إنسولين دقيقة للغاية بمقياس 30. تم الاحتفاظ بالفئران في أنبوب احتفاظ ‎holding tube‏ بحيث وُضع الذيل مرة أخرى خلال فتحة الذيل 0 لتدفئته من أجل توسيع الأوعية الدموية لتيسير الحقن. بعد تحديد موقع الشريان أسفل خط المنتصف للذيل» تم إجراء الحقن في أحد الأوردة الجانبية ‎lateral veins‏ الأرجوانية/الزرقاء التي تمتد بطول الوريد الذيلي ‎artery‏ [نها. تم حقن جميع الفئران المعالجة عند 5-4 أسابيع من العمر والتخلص منها بالقتل الرحيم بعد 6 أشهر من الحقن. توليد قوة باسطة إبهام اليد وحمابتها من التقلصات اللامركزية ‎contractions‏ -1+وردهمم. تم إجراء 5 تحليل فسيولوجي لعضلات باسطة إبهام اليد من ‎OLA‏ التي عولجت بالتروية المعزولة. تم تشريح العضلات باسطة إبهام اليد من كل من الطرفين الخلفيين السفليين من الفئران التي عولجت في أوتارها ‎tendons‏ وخضعت لبروتوكول الفسيولوجيا لتقييم وظيفة سبق وصفها من ‎JB‏ المختبر لدينا وغيره (19؛ 31) مع بعض التعديلات. خلال بروتوكول التقلص اللامركزي؛ تم تنفيذ عملية إعادة إطالة بنسبة 75 بين 500 و700 مللي ثانية (إطالة بنسبة 75 لأكثر من 100 ‎Ae‏ ثانية؛ متبوعةً بالعودة إلى الطول الأمثل في 100 مللي ثانية). بعد بروتوكول الكزاز والتقلص اللامركزي؛ تمت ‎all)‏ العضلات» ووزنها في الحالة الرطبة؛ وتم تثبيتها على ‎dels‏ باستخدام صمغ الكثيراء ‎gum‏ ‎ctragacanth‏ ثم تجميدها في ميثيل-بيوتان ‎ym methyl-butane‏ في نيتروجين سائل ‎liquid‏ ‎-nitrogen‏ ‏توليد قوة الظنبوب الأمامي وحمايتها من التقلصات اللامركزية. تم تنفيذ بروتوكول لتقييم النتائج 5 الوظيفية في عضلات الظنبوب الأمامي على العضلات المستخلصة من ‎OLA‏ التي عولجت بحقنة في العضل. تم توضيح هذا الإجراء الظنبوب الأمامي في العديد من الدراسات السابقة. )32 33(
بعد التقلص اللامركزي؛ تم التخلص من الفتران بالقتل الرحيم ثم تم تشريح عضلات الظنبوب الأمامي» وزنها وتجميدها لتحليلها. تم إجراء تحليل للبيانات بشكل محجوب عن الخاضع للتجرية ولكن ليس بشكل عشوائي. التألق المناعي. تم تحضين مقاطع محفوظة عند درجة حرارة مخفضة (12 ميكرو متر) باستخدام أجسام مضادة أولية بشرية أحادية النسيلة من م سركوجليكان ( ‎Leica Biosystems, New Castle,‏ ‎(UK; Cat.
No.
NCL-L-b-SARC‏ عند تخفيف بنسبة 1: 50 في محلول منظم كتلة ‎block buffer‏ ‎x 1(‏ تيرت-بيوتيل ‎(gla‏ ميثيل سيليل ‎(TBS) rert-butyldimethylsilyl‏ 710 من مصل الماعزء 70.1 من توين) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الحجيرة في حجيرة رطبة ‎chamber‏ 6». ثم تم غسل المقاطع باستخدام تيرت-بيوتيل داى ميثيل سيليل ثلاث مرات»؛ كل منها لمدة 20 دقيقة وإعادة 0 الإعاقة ‎sad‏ 30 دقيقة. تم استخدام جسم مضاد جلوبولين مناعي ج1 ‎Immunoglobulin G1‏ ‎(IgGl)‏ ثانوي ضد فأري من ماعز مرتبط ب 594 ‎Life Technologies, Grand ) ¢AlexaFluor‏ ‎(Island, NY, USA; Cat.
No.
A21125‏ عند تخفيف بنسبة تخفيف 1: 250 لمدة 45 دقيقة. تم غسل المقاطع في تيرت-بيوتيل ‎(gh‏ ميثيل سيليل ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة؛ وتثبيتها باستخدام وسط تثبيت ‎Vector Laboratories, ) Vectashield mounting medium Vectashield‏ ‎(Burlingame, CA, USA 5‏ تم التقاط أربع صور عشوائية 20% تغطي الأرباع ‎dasyy)‏ المختلفة لمقطع العضلات باستخدام كاميرا ‎Zeiss AxioCam MRCS‏ تم تحديد النسبة المئوية للألياف الإيجابية ل م -سركوجليكان (7450 لشدة صبغ غشاء العضلات ‎(muscle membrane‏ لكل صورة ومتوسطها لكل عضلة. تحليل بمعة ويسترن. تم جمع مقاطع الأنسجة من عضلة الظنبوب الأمامي المعالجة اليسرى وعضلة 0 الظنبوب الأمامي المقابلة (بسمك 20-20 ميكرون) في جهاز الطرد المركزي الدقيق ‎micro-‏ ‎centrifuge‏ والوصول_بها إلى تجانس باستخدام 100 ميكرو لتر من محلول منظم التجانس ‎homogenization buffer‏ (تريس-حمض الهيدروكلوريك ‎(Tris-HCI) Tris Hydrochloric acid‏ بتركيز 125 مللي مولارء؛ 74 من دوديسيل سلفيت الصوديوم؛ يوريا بتركيز 4 مولار) في وجود قرص كوكتيل مثبط 1 بروتياز ‎.(Roche, Indianapolis, IN, USA) 1 protease inhibitor‏ بعد 5 التجانس؛ تم طرد العينات عند 10.000 لفة في الدقيقة ‎sad‏ 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم تحديد كمية البروتين باستخدام جهاز ‎.NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)‏ تم
نقل ‎cle‏ البروتين كهريائيا )20 ميكرو جرام) على هلام بولي أكريلاميد تريس-أسيتات ‎polyacrylamide Tris-acetate gel‏ بنسبة 78-3 ‎(NuPage, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)‏ ‎sad‏ 1 ساعة و5 دقائق عند 150 فولط ثم تقله إلى غشاء بولى فينيليدين داى فلوريد ‎(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) (PVDF) polyvinylidene difluoride‏ لمدة ‎lS‏ ساعة و15 دقيقة عند 35 فولط. تم إعاقة الغشاء في حليب جاف غير دهني بنسبة 75 في تى بى أس تى ‎TBST‏ لمدة ساعة واحدة؛ ثم تم تحضينه باستخدام جسم مضاد بشري متعدد النسائل أرنبي من 8 سركوجليكان )-1 ‎Novus Novus Biologicals, Littleton, CO, USA; Cat.
No.
NBP-‏ ‎or 1:250 dilution‏ 1:100 90300( وتخفيف بنسبة 1: 5000 من جسم مضاد فأري أحادي النسيلة من جاما تويولين ‎(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA; Cat.
No.
T6557)‏ أو تخفيف بنسبة 1: 0 5000 من جسم مضاد فأري أحادي النسيلة من ألفا-أكتينين ‎Sigma-Aldrich, St ) o-actinin‏ ‎.(Louis, MO, USA; Cat.
No.
A7811‏ تم استخدام تخفيف بنسبة 1: 500 من جسم مضاد فأري متعدد النسائل أرنبي من تريونين قلبي ‎(Abcam, Cambridge, MA; Cat.
No. ab47003) I‏ وتخفيف بنسبة 1: 1000 من جسم مضاد فأري متعدد النسائل أرنبي من فينكولين ‎Invitrogen, ) vinculin‏ ‎(Frederick, MD; Cat.
No. 70062‏ . تم استخدام أجسام مضادة تفأر ( ‎Millipore, Billerica, MA,‏ ‎(USA; Cat.
No.
AP308P 5‏ ولأرنب )656120 ‎(Life Technologies; Cat.
No.‏ من اتش أر بى ‎HRP‏ تانوي من أجل الكشف المناعي ‎immunodetection‏ إى سى أل ‎ECL‏ ‏اختبار صبغة ابفائز الزرقاء ‎(EBD) Evans blue dye‏ تم توصيل جرعة من 3 ‎X‏ 10" جينوم فيروسي من 1.74.401615003/اههه: إلى فتران -/-0عع» عمرها 4 أسابيع إلى عضلة الظنبوب الأمامي اليسرى من خلال الحقن في العضل. بعد الحقن بأربعة أسابيع؛ تم حقن الفتران في 0 التجويف داخل الغشاء البريتوني على الجانب الأيمن في 5 ميكرو لتر/جرام من وزن الجسم لمرشح تعقيم 10 مجم/ملليلتر من صبغة ايفائز الزرقاء في ‎x]‏ محلول منظم فوسفات. بعدهاء تم التخلص من الفئران بالقتل الرحيم بعد 24 ‎dele‏ من الحقن وتم حصد الأنسجة وتقطيعها إلى مقاطع. تم تثبيت المقاطع في الأسيتون البارد ‎cold acetone‏ لمدة 10 دقائق ثم تم استخدام بروتوكول التألق المناعي لصبغ م-سركوجليكان البشري. تحليل مورفومترىي ‎«Morphometric analysis‏ تم تحديد أقطار الألياف العضلية والنسبة المثوية للألياف العضلية ذات النويات المركزية من عضلات الظنبوب الأمامي وعضلات عضلة الساق
المصبوغة بالهيماتوكسيلين واليوزين. تم ‎LED‏ أريع صور عشوائية 20% لكل مقطع لكل حيوان باستخدام كاميرا ‎Zeiss AxioCam MRCS‏ تم تحديد كمية الألياف ذات النويات المركزية باستخدام برنامج ‎(Bethesda, MD, USA) NIH Image]‏ تم قياس أقطار الألياف كأقصر قطر من خلال الألياف العضلية باستخدام برنامج ‎Carl Zeiss Microscopy, Munich, ) «Zeiss Axiovision LE4‏ ‎.(Germany 5‏
تحليل التوزيع الحيوي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمى. تم إجراء تقييم قياس كمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل لتاكمان من أجل تحديد عدد نسخ جينوم الناقل الموجود في العضلة المقابلة المستهدفة وغير المستهدفة؛ وكذلك الأعضاء غير المستهدفة ‎non-targeted organs‏ كما هو موضح مسبقًا ‎٠‏ ؛ 30( تم استخدام مسبارات بادئة ‎primer probe‏ خاصة بناقل معين لتضخيم سلسلة من 0 منطقة إنترون ‎intronic region‏ تقع بعد معزز كرياتين كيناز عضلي مقتضب مباشرة يتسم بأنه فريد من نوعه ويقع ضمن طقم الجين المتحور ‎.scAAVIh.74.MCK.hSGCB Lily‏ تم استخدام البوادئ والمسبارات التالية في هذه الدراسة: بادئ أمامي للإنترون كرياتين كيناز عضلي مقتضب ونسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرباتين كيناز عضلي: ‎AGG CAC TGG GCA GOT‏ 5-010 ‎AA -3'‏ (رقم تعريف المتوالية: 13)؛ بادئ أمامي للإنترون كرياتين كيناز عضلي مقتضب ونسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرباتين كيناز عضلي: ‎5-ACC TGT GGA GAG AAA GGC‏ ‎AAA 6 3‏ (رقم تعريف المتوالية: 14)؛ ومسبار إنترون ‎intron Probe‏ كرياتين كيناز عضلي مقتضب ونسخة مهجنة من سلسلة ‎AL‏ للميوسين وكرياتين كيناز عضلي: ‎5-6FAM-ATC AAG‏ ‎GTT ACA AGA CAG-GTT TAA GGA GAC CAA TAG AAA -tamra-3' (IDT)‏ (رقم تعريف المتوالية: 15). يتم ذكر عدد النسخة كجينومات ناقل ‎vector genomes‏ لكل ميكرو جرام من
0 الحمض النووي الجينومي. الخصائص الكيميائية النسيجية ‎Lio lial)‏ لصبغ خلية مناعية ‎immune cell‏ تم استخدام خصائص الكيمياء النسيجية المناعية ‎Immunohistochemistry‏ لتحديد الخلايا المناعية ‎immune cells‏ تم تحضين مقاطع من الأنسجة المجمدة ‎Frozen tissue sections‏ على شرائح_مجهر مشحونة ‎Fisherbrand Superfrost‏ باستخدام أجسام مضادة للفئران أحادية النسيلة من جرذان تستخدم طقم كشف ‎HRP‏ ع1 المضادة للفئران )551013 ‎¢(BD Pharmagen, San Jose, CA, USA; Cat:‏ الفئة: ‎CD3 3‏ (الفئة: 555273(« ‎CD4‏ (الفئة: 550280( ‎CD85‏ (الفئة: 550281( 5 ‎Mac-3‏
للخلايا الملتهمة الكبيرة ‎macrophages‏ (الفئة: 550292). تم تخفيف جميع الأجسام المضادة الأولية ‎primary antibodies‏ في 1:20 باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات. تم تصور الصبغ المناعي الموجب باستخدام دى أيه بى ‎DAB‏ كروماجين ‎chromagen‏ مخفف في محلول منظم ‎DAB‏ يتضمن سترتبافيدين ‎HRP-Streptavidin‏ بيروكسيداز إكتاستاتين ‎peroxidase ectastain‏ أيه بى سى ‎ABC‏ بيروكسيداز. تم التقاط عشرة صور عشوائية *40 لكل عضلة وكل صبغ مناظر. تم
حساب عدد الخلايا أحادية النواة ‎mono-nuclear cells‏ والتعبير عنها كإجمالي لكل مم2. صبغ بكروسيريوس الأحمر ‎lilly‏ الكمي للكولاجين. تم تثبيت المقاطع المجمدة الموضوعة على شرائح مجهر مشحونة ‎Fisherbrand Superfrost‏ في 0 من فورمالين منظّم متعادل ‎Neutral‏ ‎sad Buffered Formalin‏ 5 دقائق؛ ثم شطفه بالماء المقطر ‎٠‏ تم تحضين الشرائح في المحلول أ 0 (حامض فوسفوموليدبيك ‎(Oe (Phosphomolydbic acid‏ طقم صبغ بيكروسيربوس الأحمر ‎(Polysciences Inc., Warrington, PA, USA; Catalog # 24901)‏ لمدة دقيقتين. بعد الشطف ‎Jalal)‏ في الماء المقطرء تم وضع الشرائح في المحلول ب )-6 4 80/2 ‎Direct Red‏ ‎(Trinitrophenol‏ لمدة 15 دقيقة؛ ثم تم إجراء شطف إضافي في الماء المقطر ثم تم التحضين في المحلول ج )0.1 عياري من حمض هيدروكلوريد ‎(hydrochloride acid‏ لمدة 2 دقيقة. تم صبغ 5 الشرائح بشكل مقابل لمدة 2.5 دقيقة باستخدام 71 أخضر سريع في 71 حمض أسيتيك الجليدي ‎Glacial Acetic Acid‏ من ‎Poly Scientific‏ (كتالوج # ‎(S2114‏ باستخدام تخفيف بنسبة 1: 10 في ماء منزوع الأيونات. وأخيراء تم شطف الشرائح مرة أخرى في الماء المقطرء تجفيفها في الإيثانول المتدرج ‎«graded ethanol‏ تصفيتها في زبلين ‎xylene‏ وتثبيتها باستخدام أغطية شرائح باستخدام أوساط 60 ‎Cytoseal‏ من ‎(Waltham, MA, USA; 128310( Thermo-Scientific‏ تم التقاط 0 الصور باستخدام برنامج ‎AxioVision‏ الإصدار 5,5.1» ‎Zeiss Microscopy)‏ 1:ه©). لتحليل صبغ سيريوس الأحمر والقياس الكمي لنسبة 7 للكولاجين» تم تحسين التباين بين اللونين الأحمر والأخضر باستخدام ‎Adobe Photoshop‏ . تم اختيار التطبيق الصغير المتعلق بإزالة الالتفاف اللوني في برنامج ‎Image]‏ وتم استخدام خيار ‎color deconvolution‏ 1203. تتضمن الصورة الحمراء جميع الأنسجة الضامة ‎connective tissue‏ من صبغ سيريوس الأحمر ‎٠.‏ وتتضمن الصورة الخضراء جميع العضلات 5 من الصبغ المقابل للأخضر السريع. تم استخدام الصورة الحمراء والصورة الأصلية فقط. ثم تم تطبيق عتبة حدية على الصور للحصول على صور بالأبيض والأسود ذات مناطق موجبة للكولاجين
في المناطق السوداء والسالبة في الأبيض. باستخدام دالة القياس؛ تم حساب مساحة الكولاجين. ثم تم تحديد إجمالي مساحة الأنسجة بتحويل الصورة الأصلية إلى "8 بت" وضبط القيمة الحدية إلى 254؛ والتي ستكون وحدة واحدة أقل من تشبع الصورة تمامًا. ثم تم قياس إجمالي مساحة الأنسجة كما أجري مسبقًا وشجلت المساحة الإجمالية. ثم تم حساب النسبة المئوية للكولاجين عن طريق قسمة منطقة الكولاجين على مجموع مساحة الأنسجة. ثم تم حساب متوسط النسبة المثوية لكل فرد.
التقلص الكزازي للحجاب الحاجز ‎Diaphragm Tetanic Contraction‏ للتقييم الوظيفي: تم التخلص من الفئران بالقتل الرحيم وتم تشريح الحجاب الحاجز مع عدم المسام بالملحقات الضلعية ‎rib‏ ‎attachments‏ والأوتار الوسطى ‎central tendon‏ ووضعها في محلول منظم ‎K-H‏ كما سبق وصفه من قبل بواسطة ‎Beastrom‏ وآخرون. ( ,)2011 ,2464-74 :179 ‎Beastrom et al. (Am.
J.
Pathol.‏ ‎Rafael-Forney et al. (Circulation 124: 582-8, 2011 0‏ و ‎Moorwood e t al. (J.
Visualized‏ ‎(Experiments 71:¢50036, [year?])‏ تم عزل مقطع من الحجاب الحاجز بعرض 4-2 ملليمتر؛ وتم ربط أشرطة الحجاب الحاجز بثبات بخيوط حرارية جراحية مضفرة ‎braided surgical silk‏ ) ;6/0 ‎(Surgical Specialties, Reading, PA‏ في الوتر المركزي ‎ccentral tendon‏ والتخييط من خلال جزء من عظمة الضلع ‎rib bone‏ المثبت بالطرف البعيد للشريط. تم نقل كل عضلة إلى حمام مائي مملوء 5 بمحلول 1611 بالأكسجين تم الحفاظ عليه في 37 درجة مثوية. تم محاذاة العضلات أفقيا وريطها مباشرة بين دبوس ثابت ومحرك تحويل تأزري لقوة مزدوجة ‎dual-mode force transducer-‏ ‎٠. (305C; Aurora Scientific, Aurora, Ontario, Canada) servomotor‏ تم وضع ‎Cpl‏ من إلكترودات لوح البلاتين ‎platinum plate electrodes‏ في حمام العضو ‎organ bath‏ لتمديد العضلة. تم إطالة العضلة إلى الطول الأمثل لقياس التقلصات المنقبضة؛ ثم السماح بالراحة لمدة 10 دقائق 0 قبل البدء في بروتوكول كزازي. وبمجرد ثبات العضلة؛ تم ضبط العضلة على طول مثالي ل آجم وإخضاعها للتدفئة الذي يتكون من ثلاث انقباضات 1 هرتز كل 30 ثانية تليها ثلاث انقباضات 0 هرتز كل دقيقة. بعد فترة ‎dal)‏ لمدة 3 دقائق؛ يتم تنبيه الحجاب الحاجز عند 20 50 80؛ 120« 150« 180 هرتزء مما يسمح بفترة راحة لمدة دقيقتين بين كل منبه؛ كل منها لمدة 250 مللي ثانية لتحديد أقصى قوة كزازية. تم قياس طول العضلات والوزن. تم قياس القوة لوزن العضلات
5 وطولها. التصوير بالرنين المغناطيسي للقلب: تم تحليل وظيفة القلب باستخدام نظام التصوير بالرنين
المغناطيسي لفتحة أفقية بقدرة 9.41 وملف بحجم فأري ‎Bruker BioSpin, ) mouse volume coil‏ ‎(Billerica, MA, USA‏ تم ‎hall yas‏ باستخدام 5 7 أيزو فلوران ‎isofluorane‏ مختلط بالكريوجين ‎carbogen‏ )1 لتر/دقيقة) لمدة 3 دقائق قبل وضعه على سرير التصوير. عند وضع الفئران في جهاز التصوير ‎imaging aparatus‏ وبدء التصوير» انخفض خليط الأيزوفلوران/الكريوجين إلى 1.5 7 لبقية الدراسة. تم رصد إى كيه جى ‎EKG‏ والتنفس باستخدام نظام متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي ‎«(Model 1025, Small Animal Instruments, Stonybrook, NY, USA)‏ تم الحصول على صور مرجحة ب 11 بنظام فلاش قصيرة المحور للقلب على كامل البطين الأيسر ‎left‏ ‎la (LV) ventricle‏ (تى آر ‎TR‏ = 8 مللي ثانية؛ تى إى ‎A 2.8 = TE‏ ثانية؛ 0 = 180( المصفوفة = 256 ‎x‏ £256 أف أوه فى ‎X 3.0 = FOV‏ 3.0 سم؛ سمك الشريحة = 1 مم؛ الشرائح ‎oT = 10‏ حتى 20 ‎GB)‏ لكل دورة قلبية). بالنسبة لتحليل الصورء تم تحديد النقطة الزمنية الانبساطية النهائية والانقباضية النهائية لكل صورة قصيرة المحور وتم تتبع حدود القلب الشغافية والنخابية ‎Gyn‏ ‏تم استبعاد العضلات الحليمية ‎papillary muscles‏ من حدود الشغاف ‎JY endocardial boundary‏ فى ‎(LV‏ من هذه المناطق المقاسة؛ تم حساب حجم الانبساط النهائي ‎end-diastolic volume‏ ‎(EDV)‏ حجم ‎=a!‏ النهائي ‎end-systolic volume‏ (257) حجم النفضة ‎stroke volume‏ ‎(SV) 5‏ المخرجات القلبية ‎¢(CO) cardiac output‏ نسبة الانقباض القلبي ‎«(EF) ejection fraction‏
ومتوسط ‎LV AK‏ التألق المناعي: تم إخضاع مقاطع مخفضة درجة ‎Cryostat sections Shall‏ )12 ميكرو متر) من الظنبوب الأمامي؛ عضلة الساق؛ العضلة رباعية الرؤوس» العضلة القطنية الكبرى؛ العضلة الألوية؛ العضلة ثلاثية الرؤوسء وعضلات الحجاب الحاجز ‎Lis diaphragm muscles‏ إلى جنب مع القلب 0 وثذلك_للصبغ المتألق المناعي للجين المتحور ‎Why‏ م-سركوجليكان البشري عبر البروتوكول المستخدم مسبقًا كما هو موضح في ‎Pozgai‏ وأخرون؛ 2016 ,57-66 :23 ‎a «Gene Therap.‏ تحضين المقاطع باستخدام جسم مضاد حيوي أولي ضد بشري أحادي النسيلة من فأر من نوع بيتا- لسركوجليكان ‎Leica Biosystems, New Castle, UK; Cat.
No.
NCL-L-b-) beta-sarcoglycan‏ ‎(SARC‏ بتخفيف 1: 100 تم التقاط أريع صور عشوائية ‎20X‏ تغطي الأرباع الأربعة المختلفة 5 لمقطع العضلات باستخدام كاميرا ‎Zeiss AxioCam MRCS‏ تم تحديد النسبة المئوية للألياف الموجبة لبيتا-لسركوجليكان (> 50 7 من صبغ الغشاء العضلي) لكل صورة وأخذ المتوسط لكل
التحليل المورفومتري : تم إجراء صبغ هيماتوكسيلين ويوزين على مقاطع مخفضة درجة الحرارة بسمك 12 ميكرو متر لعضلات ‎C57BL6 WT (ly‏ بالغة من العمر 7 أشهر ‎n)‏ -5)ء فتران ‎n) sgeb”‏ <5)» وفثران ‎sgeb”‏ معالجة ب 6 ‎n) rAAV.MHCK7.hSGCB‏ <5) لستة أشهر لتحليلها. تم تحديد النسبة المئوية للألياف العضلية المنواة مركزيًا في عضلات الظنبوب ‎ale)‏ عضلة الساق؛ العضلة رباعية الرؤوس» العضلة القطنية الكبرى؛ العضلة الألوية؛ العضلة ثلاثية الرؤوس؛ والحجاب الحاجز. بالإضافة إلى ذلك؛ تم قياس أقطار الألياف العضلية في العضلات عضلة الساق؛ العضلة القطنية الكبرى» والعضلة ثلاثية الرؤوس. تم التقاط أريع صور عشوائية 206 لكل عضلة لكل حيوان باستخدام كاميرا 11805 ‎Zeiss AxioCam‏ تم قياس كمية الألياف المنواة مركزيًا باستخدام برنامج ‎NIH ImageJ 0‏ وتم قياس أقطار الألياف باستخدام برنامج ‎Zeiss Axiovision LE4‏ صور الأشعة السينية: تم ‎shal‏ أشعة سينية للجسم بالكامل على فتئران ‎WT‏ 0571/6 البالغة من العمر 7 أشهر («ه = 6) ولم يتم علاج ‎OE‏ تمع (ه = 6)» وفثران معالجة ب ‎rAAV.MHCK7.hSGCB‏ ل 6 أشهر ‎n) sgeb”‏ = 6) باستخدام نظام الأشعة السينية الرقمية ‎MX-‏ ‎Faxitron‏ 20 في 26 كيلو فولط لمدة 3 ثوانٍ ‎.(Faxitron X-Ray Corp, Lincolnshire, USA)‏ 5 المراقبة بالليزر لنشاط الققص الميداني المفتوح: تم استخدام حجيرة نشاط مجال مفتوح لتحديد النشاط الكلي للفئران التجريبية. تم إخضاع الفئران عند عمر 7 أشهر من مجموعات المقارنة ‎CSTBL6 WT‏ (ه = 6) ومجموعات ‎sgeb”‏ غير المعالجة ‎Wis )6 = n)‏ إلى جنب مع الفثران المعالجة ب ‎rAAV.MHCK7.hSGCB‏ لمدة 6 أشهر من ‎n) sgeb”‏ = 6( لتحليلها ‎Wy‏ لبروتوكول تم وصفه مسبقًا ) :179 ‎Kobayashi et al., Nature 456: 511-5, 2008, Beastrom et al., Am.
J.
Pahol.‏ 0 2011 ,2464-74) مع العديد من التعديلات. تم اختبار جميع الفتران في نفس الوقت من اليوم في الصباح الباكر بالقرب من نهاية دورة الظلام عندما تكون الفئران في ‎ml‏ نشاطها. تم اختبار جميع الفئران في حجيرة معزولة؛ تحت ضوءٍ خافت وينفس المعالج في كل مرة. للحد من القلق والحفاظ على المتغيرات السلوكية عند الحد الأدنى؛ والتي يمكن أن تؤثر على النشاط الطبيعي للفتئران وبالتالي نتائج الفحص» لم يتم تبييت الفئران التي خضعت للاختبار بشكل فردي ( ‎Voikar et al.,‏ ‎(Genes Brain Behav. 4: 240-52, 2005 5‏ تم رصد نشاط الفئران باستخدام نظام نشاط ‎Photobeam‏ ‎Diego Instruments, San Diego, CA)‏ «ه8). يستخدم هذا النظام شبكة من أشعة الضوءء غير
المرئية بالأشعة تحت الحمراء ‎infrared‏ التي تخترق حجيرة الحيوانات من الأمام إلى الخلف ومن اليسار إلى اليمين لمراقبة موضع وحركة الفئران ضمن مستوى ‎XYZ‏ تم تسجيل النشاط لدورات مدتها 1 ساعة في فترات زمنية 5 دقائق. تأقلمت الفئران مع حجيرة اختبار النشاط لجلسة أولية مدتها ساعة واحدة قبل عدة أيام من بدء الحصول على البيانات. تم اختبار الفئران في حجيرات فردية في مجموعات من 4. تم تنظيف معدات الاختبار بين كل استخدام للحد من المتغيرات السلوكية الرجعية للفئران التي يمكن أن ‎pis‏ نتائجنا. تم تحويل البيانات التي تم جمعها إلى ورقة عمل ‎Microsoft‏ ‎Excel‏ وتم إجراء جميع العمليات الحسابية داخل برنامج ‎Excel‏ تمت إضافة فواصل شعاع ‎beam‏ ‎breaks‏ فردية للحركة في المستويين 7 و7 لكل فأر لتمثيل المشي الكلي؛ وتمت إضافة فواصل شعاع في المستوى 7 للحصول على نشاط رأسي خلال فاصل زمني قدره ساعة واحدة.
‎Jel‏ 1 إنشاء ‎scAAVIh. 74. t(MCK.hSGCB‏ وفعالية الناقل تم إنشاء طقم جين محور وراثيا يحتوي على الحمض النووى الرببوزى منقوص الأكسجين المتمم ل 8 بشري كامل الطول محسن بالكودون كما هو موضح في الأشكال 1أ. يحتوي الطقم على 5 متوالية كوزاك توافقية ‎((CCACC)‏ وإنترون خيمري 51740؛ وموقع تذييل بعديد الأدينيلات التخليقي ‎synthetic polyadenylation site‏ ومعزز كرياتين كيناز عضلي مقتضب خاص بعضلة محددة (20) يُستخدم للتعبير عن الطقم. تم تغليف الطقم إلى ناقل متمم ذاتيًا 171:.74مم والذي يتطابق بنسبة 793 مع الفيروس الغدي 8. تم إثبات أن 17:1:.74م8م فعال وآمن في الفتران والرئيسيات لغير ‎(olay)‏ وبخاصة في عبور حاجز الأوعية الدموية عند توصيله إلى العضلات من خلال الدورة 0 الدموية. )17( 18 21). تم تحديد قوة الناقل عن طريق الحقن في العضل إلى عضلة الظنبوب الأمامي يسرى في فأر ‎.Sgebnull‏ أدى توصيل 3 ‎X‏ 10" جينوم فيروسي إلى التحوير ‎Shall‏ ل 5 + 72.5 من الألياف العضلية و1 * 10" ‎asin‏ فيروسي إلى التحوير الوراثي ل 89.0 + 0 من الألياف العضلية؛ بعد 3 أسابيع من نقل الجين. المثال 2 التوصيل في العضل ل ‎scCAAVTh.74.tMCK.hSGCB‏ ‏بعد قوة الناقل» تم تمديد الدراسات لتحليل ‎dled‏ العلاج بعد 6 و12 أسبوعًا من نقل الجين. نتيجة
لمستويات عالية من التعبير في أعقاب دراسة فعالية قصيرة على مدى 3 أسابيع؛ تم اختيار جرعة من 3 * 10"! جينوم فيروسي إجمالا للدراسات اللاحقة لاستخدام أقل جرعة فعالة. تم علاج ‎Ob‏ ‏57 لمدة 5 أسابيع باستخدام 3 ‎X‏ 10" جينوم فيروسي من 8817:1.74.1016.150013» في العضل إلى عضل البطن العرضي الأيسر وتم توضيح التعبير عن م]-سركوجليكان باستخدام التألق المناعي في 88.4 + 74.2 من الألياف العضلية بعد 6 أسابيع من الحقن ‎=n)‏ 9)؛ وفي 76.5 + 8 7 من ألياف العضلات 12 أسبوعا بعد الحقن ‎=n)‏ 6)؛ وتم تأكيد التعبير عن طريق بقعة ويسترن (الشكل 1ب). ترافق التعبير عن م-سركوجليكان عن طريق ترميم مكونات مركب البروتين المرتبط بالديستروفين (0-سركوجليكان وديستروفين) (الشكل 1ج). باستخدام صبغة ايفانز الزرقاء كعلامة لنفاذية الغشاء )22 23) وجدنا أن جميع الألياف التي تعبر عن م-سركوجليكان كانت
0 محمية من التسرب وتضمين صبغة ايفانز الزرقاء (الشكل 1د). وتبدي عضلة من فتئران ‎sgeb”‏ ‏ضمور عضلي حاد بألياف منوّاة مركزياء نخر متكرر ‎GLY‏ العضلات»؛ أنسجة متليفة ‎fibrotic‏ ‎tissue‏ وتقلبات كبيرة في حجم الألياف الممثلة بكل من الألياف الضمورية والتضخمية ‎atrophic and‏ ‎-hypertrophic fibers‏ )3 4) كما يظهر في الشكل 2 أ ‎٠‏ يظهر الصبغ بالهيماتوكسيلين واليوزين تحسنا عاما في النمط الظاهري للعضلة المريضة بما في ذلك انخفاض في النواة المركزية ‎central‏
‎sgeb”) nuclei 5‏ غير المعالجة - 76.8 + 2.3 7 مقابل الفيروس الغدي ل 15065 المعالجة- ‎P <7 3.5 + 38.86‏ >0.0001( (الشكل 2ج). وقد تم أيضًا مراقبة قياس توزيع حجم الألياف؛ مع زيادة في متوسط قطر الألياف بعد العلاج (80057: غير المعالجة - 32.6 + 0.31 ميكرومتر مقابل الفيروس الغديم .-سركوجليكان البشري المعالجة - 35.56 + 022 ميكرو متر؛ © <0.0001) (الشكل 2د).
‏0 السمة المرضية النسيجية ‎segb LU‏ -/- هي التليف الذي يتميز باستبدال واسع لنسيج العضلة بالدرجة الأولى بالكولاجين جنبا إلى جنب مع مكونات أخرى خارج ‎Jie LIN‏ الفبرونيكتين ‎fibronectin‏ والإيلاستين ‎elastin‏ والليمينين ‎laminin‏ والديكورين ‎.decorin‏ (14) هذا الاستبدال للأنسجة العضلية للنسيج الضام يتحدى القيمة المحتملة لاستبدال الجين وقد يحد من درجة التحسن. (24) لاختبار ذلك؛ تم اختبار الفثران التي تمت معالجتها لمدة 12 أسبوعًا لتقليل الإصابة بالتليف.
‏5 تم تقييم عضلة الظنبوب الأمامي تحديدًا نظرًا لتحديد درجة تليفها الكامنة في نموذج ‎KO‏ ولأنها تمثل ‎oa‏ محتملًا بعد توصيل الجين التروية المعزولة الوعائي. وأظهر الصبغ ببيكروسيريوس الأحمر
لكل من الكولاجين؛ النوعين الأول والثالث؛ لعضلات الظنبوب الأمامي وجود انخفاض كبير (52.74 7( في كمية الكولاجين الموجودة داخل العضلات ‎scAAVTh.74tIMCK hSGCB‏ المعالجة مقارنة بعضلات الفأر 7ع غير المعالجة )207 + 70.57 مقابل 43.8 + 22.3 7.508هه المعالجة مقابل 58607 غير المعالجة؛ على التوالي؛ ‎Jal) )0.0001 >P‏ 2 ب وه). إن العضلة غير المعالجة ل ‎sgeb”‏ البالغ عمرها 5 أسابيع في وقت الحقن حققت 24.05 + 5 7 من ترسب الكولاجين؛ مما يشير إلى وجود انخفاض طفيف (14.0 7( في كمية الكولاجين بعد 12 أسبوعا من العلاج. ‎Jud‏ 3 التصحيح الوظيفي في العضلة الهيكلية بعد نقل جين ‎scCAAVIh.74.tMCK.hSGCB‏ ‏0 لتحديد ما إذا كان نقل الجين م]-سركوجليكان البشري يمكن أن يحسن وظيفة العضلات؛ قمنا بتقييم الخصائص الوظيفية لعضلة الظنبوب الأمامي ‏ من فتران 58657 المعالجة باستخدام 658 1.74.06تاهه:._بعد التوصيل العضلي .ل 3 ‎x‏ 10" جينوم فيروسي من ‎hSCGB‏ 74.0016-/اههه» إلى الظنبوب الأمامي لفئران 7 0ء8» التي عمرها أربعة أسابيع؛ تم خضوع عضلات الظنبوب الأمامي بعد 6 أسابيع بعد العلاج لقياسات القوة في الموقع ‎=n)‏ 4). تم 5 مقارنة العضلات المعالجة بالعضلات المقابلة غير المعالجة وتلك من ‎.C5TBL/6 WT lal‏ أظهرت العضلات المعالجة ب 817:11.74.010161:50013هه؟ ‎Goad‏ كبيرًا في كل من القوة الكزازية المطلقة والقوة النوعية المعدلة (الشكلين 3ا-3ب). تتضمن العضلات المعالجة متوسط قوة مطلقة 9 + 199.5 مللي نيوتن مقارنة ب 770.9 + 118.3 مللي نيوتن لعينات المقارنة ‎sgeb™™‏ ‏غير المعالجة (م<0.01). وبالمثل؛ أنتجبت عضلات الظنبوب الأمامي المعالجة قوة متوسطة محددة 0 تبلغ 254.01 + 6.9 مللي نيوتن/مم” وتنتج العضلات غير المعالجة 124.2 + 13.9 مللي نيوتن/مم من القوة (م<0.01). ‎aly‏ أظهرت العضلات المعالجة باستخدام 1.74.0158 اهه»: مقاومة أكبر للإصابة الناجمة عن التشنج مقارنة بعضلات التحكم غير المعالجة ‎untreated contralateral muscles‏ (الشكل 3ج). فقدت عضلات الظنبوب الأمامي المعالجة 34.0 + 75.1 من القوة الناتجة عن ذلك بعد التشنج الأول بينما فقدت العضلات المريضة 5 غير المعالجة 54.1 + 73.8 (م<0.01) من القوة ‎By‏ لبروتوكول التقلص اللامركزي. توضح هذه البيانات أن نقل الجين |-سركوجليكان البشري يوفر فائدة وظيفية للعضلات المريضة التي تعاني من
نقص في ]-سركوجليكان. ‎Jud‏ 4 علاج العضلات الهرمة باستخدام ‎scAAVTh.74 tIMCK.hSGCB‏ أظهرت الدراسات تطور المرض في هذا النموذج من ‎JB‏ ضمور عضلات ‎alia‏ الأطراف من النوع 28 أنه على الرغم من أن إعادة تشكيل الأنسجة الأكثر شدة في العضلات يستغرق بين 6 و20 أسبوعًاء فإن تشريح الأنسجة العضلي يستمر في التفاقم مع التقدم في السن؛ مما يشبه تطور المرض لدى المرضى (3؛ 4؛ 14). وبالتالي؛ لمحاكاة الإعداد السريري حيث يمكن أن يحدث العلاج في سن أكبر مع حدوث تدهور أكثر تقدمًا في العضلات وتليفًا خارجًاء قمنا بعلاج ‎sgeb™™ Gh‏ البالغة من العمر 6 أشهر ‎=n)‏ 5) عضليًا في الظنبوب الأمامي باستخدام 3 ‎asin 010 x‏ فيروسي من ‎.scAAVINTAMMCKSCGB 0‏ بعد 12 أسبوع من العلاج؛ في 9 أشهر من العمر؛ تم التحوير ‎As‏ ل 80.1 + 74.8 من ألياف العضلات (الشكل 4أ). أوضحت صبغ بيكروسيريوس الحمراء لأنواع الكولاجين 1 و111 انخفاض 742.2 في النوعان الأول والثالث في كمية الكولاجين الموجودة في عضلات الفئران المعالجة ‎Lyles‏ بعضلات ‎sgeb™ oly‏ غير المعالجة ‎AAV.hSGCB)‏ المعالجة- 20.0 + 70.80 مقابل ‎sgeb™™‏ غير المعالجة - 34.6 + 1.4« م<0.0001) (الشكلان 4ب- 5 4ج). في عمر العلاج»؛ تضمنت ‎oh‏ 7 0عع» ذات ال 6 أشهر ترسب الكولاجين 30.8 + 72.0 (ه = 4 4 الذكور)؛_وبالتالي؛ ‎gli‏ هذه _النتائج تشير إلى أن العلاج باستخدام ‎scAAVTh.74.(MCK.hSCGB‏ لا يمنع فقط التليف الموجود؛ ولكن ‎Load‏ لديه القدرة على عكسه. ‎Jul‏ 5 التروية المعزولة ل ‎scAAVTh.74.tMCK.hSGCB‏ في ‎sgeb -/- Ob‏ 0 تكون القدرة على استهداف عضلات متعددة في أحد الأطراف متاحة لطريقة توصيل أكثر ملائمة من الناحية السريرية للنقل ‎J‏ مرضى ضمور عضلات ‎aha‏ الأطراف من النوع 28. تم تحليل توصيل 5 ‎X‏ 110 جينوم فيروسي ل ©8817:.74.4016150»» بواسطة التروية المعزولة في فئران 8607 التي يتراوح عمرها من 4 إلى 6 أسابيع ‎=n)‏ 9< 7 ذكورء 2 إناث) لمدة شهرين بعد نقل الجين. وصل التعبير عن بيتا-سركوجليكان 72.8+91.8 في الظنبوب الأمامي (الشكل 5أ). 5 أدى توصيل [74.01021500.تتتتهى» إلى حماية كبيرة من الإصابات الناجمة عن التقلص اللامركزي (م<0.05)؛ التي لم تكن مختلفة عن ‎(WT‏ مقارنة بالعضلات المقابلة غير المعالجة
‎untreated contralateral muscles‏ (الشكل 5ج). قام التوصيل عبر الأوعية الدموية أيضًا باستعادة المتغيرات المرضية للأنسجة العضلية ‎histopathological parameters‏ عاءمن (الشكل 5<( انخفضت النوى المركزية ‎nuclei‏ ل68000 .في الظنبوب الأمامي ‎sgeb™)‏ غير معالج - 09 مقابل م-سركوجليكان البشري للفيروس الغدي. معالج - 75.7+23.2؛ ‎(0.001>p‏ ‏5 وعضلة الساق ‎sgeb™)‏ غير معالج - 72.8478.2 مقابل ]-سركوجليكان البشري للفيروس الغدي. معالج - 76.616.8؛ م<0.001). يؤدي تقل الجين ‎Wad‏ إلى زيادة متوسط حجم الألياف في الظنبوب الأمامي ( 86057 غير معالج - 0.52430.53 ميكرو متر مقابل ]-سركوجليكان البشري للفيروس الغدي. معالج - 0.46241.9 ميكرو مترء ‎(0.0001>p‏ وعضلة الساق ( 58807 غير معالج - 0.37+38.9 ميكرو متر مقابل م-سركوجليكان البشري للفيروس الغدي. معالج - 0 0.44+33.3 ميكرو مترء؛ ‎¢(0.0001>p‏ مع ضبط توزيع قطر الألياف؛ تم ملاحظة انخفاض كبير ‎(Lyi 760(‏ في عدد ‎«CD3 WA‏ 004 والخلايا الملتهمة الكبيرة (الجدول 1). وع الخلية ‎gall‏ الأمامي الظنبوب الأمامي الظنبوب الأمامي ‎(ged‏ المعالجة ليمنى غير غير المعالجة ل خلية/مم“) لمعالجة 6001 (خلية/مم) خلية/مم“)
لاختصارات: ‎(ANOVA‏ تحليل التباين؛ ‎(ILP‏ تروية طرف معزول؛ ‎—B SGCB‏
كوجليكان؛ ‎(TA‏ الظنبوب الأمامي. القياس الكمي للخلايا المناعية الموجودة في فتران
5007 غير المحقونة؛ والعضلة المعالجة ب 711.74.010.1:50013تهم» وغير المعالجة.
+ ‏البيانات المبينة توصيل التروية المعزولة للفيروس وتمثل متوسط عدد الخلايا/مم*‎ a
لس إى أم ‎=n SEM‏ 8 لكل مجموعة. تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه لمقارنة
لقيم من ثلاث مجموعات مختلفة. تم تخفيض مستويات الخلايا المناعية باستخدام فرق
لالي إحصائيا ‎P)‏ > 0.01) بين العضلة الظنبوب الأمامي اليسرى المعالجة والظنبوب لأمامي اليمنى غير المعالجة و/أو الظنبوب الأمامي اليسرى المعالجة والظنبوب الأمامي غير المحقونة في كل الصبغ باستثناء 008. أوضح صبغ بيكروسيريوس الأحمر للظنبوب الأمامي وعضلة ‎Wad lal)‏ انخفاضًا ‎DS‏ في كمية الكولاجين مقارنة بعضلة 80 غير المعالجة بعد التوصيل الوعائي (الشكل 6أ). تم تخفيض مستويات الكولاجين في الظنبوب الأمامي إلى 21.6 + 71.3 في العضلات المعالجة مقارنة ب 402 + 71.5 في فثران ‎spe‏ غير المعالجة في ‎jee‏ نقطة النهاية ‎.(0.0001>p)‏ كما هو مذكور مسبقًاء تدل ‎sgeb™ Ohi‏ التي تكون في ‎jee‏ الحقن المقدم بالكولاجين 24.1 + 71.5 في عضلة الظنبوب الأمامي مرة أخرى على انخفاض طفيف (710.0) في ترسب الكولاجين بعد 8 أسابيع من العلاج. وبالمثل» أظهر صبغ عضلة عضلة الساق أن الفئران المعالجة كانت تحتوي على كولاجين 22.9 + 70.99 مقارنة ب 37.9 + 71.3 في ‎oly‏ غير المعالجة عند نقطة النهاية 0 (م<0.0001). تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي للكشف عن مستويات تسخ الكولاجين في العضلات؛ والتي ترتبط بنتائج صبغ سيريوس الأحمر. عند دمجهما ‎cle‏ أوضحت هذه البيانات أن التوصيل المتوسط بالفيروس الغدي لبيتا-سركوجليكان للإنسان يقلل من التليف العضلي؛ ‎rng‏ ‏وظيفة العضلات ويعكس مرض ‎tin‏ لعضلة ‎sgeb™ hyd‏ المريضة. المثال 6 5 السلامة والتوزيع الحيوي ل ‎rAAVrh. 74 tMCK.hSGCB‏ في البداية؛ لم تظهر فتران ‎WT‏ العادية التي تم حقنها ب 3 * 10" جينوم فيروسي من 8171.74.001620500©8»» في العضل في الظنبوب الأمامي أي علامات للسمية من صبغ بهيماتوكسيلين ويوزين مما يشير إلى عدم وجود آثار عكسية بسبب الفيروس. بعد التوصيل الوعائي للتروية المعزولة لإجمالي جرعة 5 ‎asin 110 X‏ فيروسي من ‎scAAVTh.74.MMCK.hSGCB‏ كما 0 هو موضح في الجزء السابق» تم تقييم السلامة في مجموعة صغيرة من ‎Oh‏ في هذه المجموعة (« = 4). أولا؛ تم تحليل العضلات المستهدفة بالتعبير عن الجين بشكل كبير؛ وكذلك خارج الأجهزة المستهدفة ‎Ly‏ في ذلك القلب؛ الرئة؛ ‎call‏ الكلى» الطحال ‎spleen‏ الغدد التناسلية ‎«gonads‏ ‏والحجاب الحاجز. تمت مراجعة مقاطع البارافين ‎Law) Paraffin‏ من قبل طبيب بيطري؛ ولم يكن
هناك أي دليل على وجود سمية في أي جهاز تم ملاحظته (البيانات غير موضحة). تم أيضًا تقييم البروتين والتوزيع الحيوي للناقل في جميع الأنسجة والأعضاء المذكور أعلاه مع بقعة وسترن وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمى؛ على التوالي. تم الكشف عن ‎asia fad‏ ناقل في جميع الأعضاء التي تم اختبارها؛ ومع ذلك؛ لم يتم الكشف عن أي تعبير عن البروتين في أي عينة أخرى غير العضلة المعالجة ‎treated muscle‏ (الشكل 7). ‎Baily‏ لا يظهر تحليل الأوزان الرطبة للعضلات المعالجة وغير المعالجة فرقًا أو ميلا كبيرًا عند مقارنة متوسط أوزان أي منهما (البيانات غير موضحة). توفر هذه البيانات ‎Sls‏ على أن معزز كرياتين كيناز عضلي مقتضب النوعي تجاه العضلات قام بتقييد التعبير بالعضلة الهيكلية ويكون الناقل غير سام. المثال 7 0 القصور النسيجي والوظيفي في القلب والحجاب الحاجز ‎TOS SB Od‏ تم تحليل ‎WT‏ وفتران م-سركوجليكان البالغة من العمر 7 أشهر ‎=n)‏ 6 لكل سلالة) التي لم يتم علاجها بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي للقلب وعلم وظائف الأعضاء للحاجز للبحث عن القصور. بعد تلك التحاليل المذكورة؛ تم التضحية بالحيوانات وتقييمها لأمراض الأنسجة (الشكل 8). أظهر الصبغ ثلاثي الألوان تليفًا كبيرًا (باللون الأحمر) في كل من الحجاب الحاجز (الشكل 8أ) 5 والقلب (الشكل 8ج). قد يكون ذلك مصحوبًا بالقصور الوظيفي لقوة محددة في الحجاب الحاجز )116.24 مللي نيوتن/مم" لفئران م-سركوجليكان” مقابل 236.67 ‎Ale‏ نيوتن/متر من ‎WT‏ ‏الشكل 8ب) والقصور الكبير في نسبة الانقباض القلبي مقاسًا بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي ‎WT)‏ 778 مقابل 765 لفئران م-سركوجليكان؛ الشكل 8د). المتال 8 0 فعالية الناقل وإنشاء ‎scAAVrh.74 MHCK7.hSGCB‏ تم إنشاء طقم الجين المتحور ‎Gly‏ الذي يحتوي على الحمض النووى الريبوزى منقوص الأكسجين المتمم ل ‎SCGB‏ بشري كامل الطول ‎Glad‏ بواسطة كودون كما هو موضح بالشكل 9أ. يشتمل الغلاف على متوالية كوزاك التوافقية ‎((CCACC)‏ إنترون خيمري ‎Jul alge (SVAD‏ بعديد الأدينيلات تخليقي؛ ونسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرياتين كيناز عضلي خاص بعضلة 5 محددة لتوجيه التعبير عن الغلاف. يكون ذلك عبارة عن محفز متوقف على كرياتين كيناز عضلي يستخدم مُحسن ‎206-bp‏ المأخوذ من 1.2 كيلو قاعدة ‎GE‏ 5 من ‎alse‏ بدء ‎Flat)‏
‎transcription start site‏ داخل جين كيناز الكرياتين للعضلة داخلية المنشاً التي بها محفز قريب ‎.(enh358MCK, 584-bp)*'?‏ تم تعبئة الطقم في ناقل :تازه لمتمم ذاتي ‎self-complementary‏ ‏)50( الذي يكون متجانس بنسبة 793 للفيروس الغدي 8. تم توضيح الفيروس الغدي 8 في الفئران والرئيسات غير البشرية لتكون آمنة وفعالة. وبشكل محدد في عبور الحاجز الوعائي ‎vascular‏ ‎barrier 5‏ عند توصيله إلى العضلات من خلال الدوران. تم تأسيس فعالية الناقل )¢17 18 21) عن طريق الحقن في العضل إلى عضلة الظنبوب الأمامي اليسرى في فأر ‎-Sgeb-null‏ إن توصيل 3 جينوم فيروسي قد أدى إلى تحويل أكثر من 790 من الألياف العضلية بعد 4 أسابيع من نقل الجين. ‎Judi‏ 9 0 التوصيل الجهازي ل ‎SCAAV.MHCK7.hSGCB‏ ‏قمنا بتوصيل ناقل من خلال حقن الوريد الذيل إلى 14 فأر م-سركوجليكان* بجرعة مقدارها 10*1 *' جينوم فيروسي من الجرعة الإجمالية (10*5 ‎BP‏ جينوم فيروسي/كيلو جرام) لتقييم التعبير عن الجين المتحور ‎hy‏ وفعالية ناقلنا عند توصيله بشكل نظامي لمدة طويلة الأجل تكون 6 أشهر. تم حقن الفئران في عمر 4 أسابيع وتم إجراء تشريح كامل بعد 6 أشهر بعد الحقن (تم أخذ فأر واحد عمره شهر واحد وتم أخذ ‎Ghd‏ عمرهما 4 أشهر كتقييمات وسيطة للتعبير). تم استخراج جميع العضلات الهيكلية ‎skeletal muscles‏ نوقشت أعلاه ‎Gin‏ إلى جنب مع الحجاب الحاجز والقلب للتحليل. كما تم إزالة الأعضاء لتحليل السموم وتحليل التوزيع الحيوي. تم استخدام الصبغ المناعي الوميضي للبيتا-سركوجليكان البشرية لتحديد التعبير عن الجين المتحور ‎Uy‏ جين م-سركوجليكان البشري في 5 عضلات طرفية ‎dimb muscles‏ اليسار واليمين» بالإضافة إلى أنه تم إعطاء الحجاب الحاجز وقلب 6 من فثران ‎KO‏ حقن نظامية من ناقل م]-سركوجليكان البشري. تضمنت هذه العضلات الظنبوب الأمامي؛ عضلة ‎(lal‏ عضلات الفخذء العضلة الألوية (غير موضحة)؛ العضلة القطنية الرئيسية؛ العضلة ثلاثية الرؤوس (الشكل 10). تم استخدام تحليل نوعي لنسيج القلب ‎Lad‏ لتقييم المستوى النسبي للتعبير عن الجين المتحور ‎Gy‏ في عضلة القلب عند التوصيل. تم التقاط ‎of‏ صور 2076 لكل عضلة وتم تحديد النسبة المئوية للألياف الإيجابية ل م سركوجليكان 5 البشري لكل صورة مما أدى إلى تحويل متوسط النسبة المئوية لكل عضلة من كل فأر. تظهر النتائج الموضحة في الشكل 10 والشكل 11 تحويل أكبر من أو يساوي 798 في جميع العضلات ‎Aaa)‏
بما في ذلك الحجاب الحاجز والقلب. كانت الفثران التي تفتفر بيتا-سركوجليكان غير موجودة تمامًا بالبروتين عند تحليلها بواسطة الوميضية المناعية ‎immunofluorescence‏ أدت الجرعة العلاجية ‎therapeutic dose‏ من إجمالي جرعة ‎210x1‏ جينوم فيروسي إلى متوسط تحويل ناقل بنسبة ‎(SEM #) 20.36 + 97.96‏ عبر جميع العضلات الهيكلية بما في ذلك الحجاب ‎Oalall‏ وحوالي 795 أو أكثر في عضلة القلب ‎cardiac muscle‏ (البيانات غير موضحة). المثال 10 التوصيل الجهازي ‎dish‏ الأجل ل ‎scAAVTh.74.MHCK7.hSGCB‏ في فتئران م-سركوجليكان 7 للبناء على نتائج اختبار الفعالية لشهر واحد الموصوفة في المثال رقم 9؛ تم التحقق من التوصيل الجهازي طويل الأمد (لمدة 6 أشهر) لطقم الجين المتحور ‎Why‏ للبيتا -سركوجليكان إلى ‎sgeb™ Ob‏ 0 © تم علاج ‎sgeb™ ol‏ التي تتراوح أعمارها من 4 إلى 5 أسابيع ب 10*71 ‎asin‏ فيروسي ‎scAAVTh.74 MHCK7.hSGCB‏ عبر وريد الذيل ‎=n)‏ 5). تم تشريح الفئران بعد 6 أشهر من الحقن وتم توضيح التعبير عن الجين المتحور ‎Why‏ -سركوجليكان البشري عن طريق استخدام الفلورة المناعية في ستة عضلات هيكلية؛ كل من اليسرى واليمنى؛ بالإضافة إلى الحجاب الحاجز والقلب لجميع ‎hl‏ المعالجة. تضمنت العضلات الهيكلية المُحللَة الظنبوب ‎ool)‏ عضلة 5 الساق؛ العضلة رباعية ‎(agi ll‏ الألوية؛ العضلة القطنية الكبرى؛ والعضلة ثلاثية الرؤوس. كانت ‎dad‏ متوسط التعبير عن م-سركوجليكان البشري الناتج عن التوصيل الجهازي في الفثران المعالجة هي 98.13 + 70.31 )2 ‎(SEM‏ عبر جميع العضلات الهيكلية العظمي بما في ذلك الحجاب الحاجز؛ باستخدام التعبير في القلب الذي يزيد عن 795. يتم إظهار الصور التوضيحية في الشكل 2ب. تظهر مستويات التعبير في كل نوع من أنواع العضلات الفردية من جميع ‎hal‏ المعالجة 0 الموضحة في الجدول 2. تؤكد بقعة ويسترن الموضحة في الشكل 12ج التعبير عن الجين المتحور يكون في جميع العضلات. توجد قيم التعبير الموضحة في الجدول 2 للعضلات المختلفة كمتوسط العضلات اليسرى واليمنى من الفئران المحقونة جهازيًا ‎=n)‏ 5). يتم تحديد القيم باسم ‎SEM‏ + أيه فى جى ‎AVG‏ بالإضافة إلى ذلك؛ فإن قياس التعبير عن الجين المتحور ‎Why‏ ]-سركوجليكان البشري في قلوب الفثران المعالجة عن طريق بقعة ويسترن وقياس الكثافة يدل على الإفراط في 5 التعبير عن م-سركوجليكان البشري لما يصل إلى 772.0 فوق مستوبات التعبير عن ‎WT‏ 31.6 (الشكل 12د)؛ ويرتبط بمستويات عالية كميًا في العضلات الهيكلية.
— 5 5 — الجدول 2: التعبير المتألق المناعي عن م-سركوجليكان د ‎deal‏ (إجمالي لنسبة ‎dst‏ ل م- ‎Ml aba ©‏ ّ لعضلة ‎ley dua)‏ جينوم 0 كوجليكان ‎SI‏ ‎Deliver‏ شهر : ‎ably‏ ‎Routq‏ > وسي) بر عن الالياف ‎I ١‏ ف ب الوريد ‎A lel’‏ لامامي 98.88 + 0.55 ‎gua‏ أي اليد ‎GM‏ 0829824 يودى 00 ‎{wd‏ 01909933 ‎FT wy) eae‏ 0399750 لعضلة القطنية لى الوزيد 0 1613 0 لكبرى 5 + 0.23 ‎٠ i‏ > ثلاثية الوريد ‎lel’‏ 0 لرؤوس 972+ 1.35 لحجاب الحاجز أي ‎J MH esl‏ 12650700 ‎wd‏ إن 10 ال تكون إحدى سمات عضلة ‎sgeb™‏ الموصوفة في التقارير السابقة ‎(Araishi et al, Hum.
Mol.‏ ‎Genet 8: 1589-98, 1999, 10017066 et al., Mol.
Cell. 5:141-51, 2000)‏ والموضحة بواسطة صبغ الهيماتوكسيلين واليوزين لعضلة الساق والحجاب الحاجز في الشكل 13 عبارة عن مرض تشوه الحثل يما في ذلك التنوي المركزي ‎nucleation‏ 0001©©» النخرء تسلل الإتهابات؛ والتليف. حسنت عملية نقل الجينات بشكل كبير هذا المرض؛ مما يخفف من العديد من هذه المزايا التصورية (الشكل 3 1 . أظهر تحديد المتغيرات النسيجية ‎histological parameters‏ انخفاض كبير في التنوي المركزي فى مختلف العضلات الهيكلية المُحلَلَة كنتيجة لنقل الجينات (الشكل 13ب). باستخدام المستويات 0 المنخفضة المتوقعة ‎(gull‏ المركزي في فتران ‎BLO WT‏ عبر جميع العضلات بمتوسط 89. 0.39+1/ كما هو ملاحظط ‎La‏ مع الأخذ في الاعتبار جميع العضلات ‎alla‏ بمتوسط
— 6 5 — 71.86266.85 من النواة المركزية في ‎sgeb® oh‏ غير المعالجة مقارنة ب 75.16+36.30 في الفيروس الغدي. توفر عضلة ‎sgeb”‏ المُعآلجَّة باستخدام ‎(0.0001>p) MHCK7.hSGCB‏ في الجدول 3 أدناه أعداد نواة مركزية وأقطار الألياف الموقَرّة للعضلات المختلفة كمتوسط ‎(ASEM)‏ ‏العضلات اليسرى واليمنى من ‎csgeb” (BLO WT‏ والفئران المحقونة جهازيًا ‎=n)‏ 5 لكل مجموعة). كما هو ملاحظ ‎(lin‏ تحدث الموجة الأكثر أهمية من التنكس/التجدد في 3 أسابيع في عضلة ‎sgeb”‏ ‏المشار إليها بواسطة النواة الموضوعة مركزيًا ‎placed nuclei‏ زالة:0800. تم علاج الحيوانات بعد هذه الأذية؛ ‎Mall‏ لم يكن متوقعا انعكاس كامل للنواة المركزية. أظهر تحليل علم أنسجة العضلات الأكثر عمفًا أن هناك تعديل في توزيع حجم الألياف مصحويًا بزيادة في متوسط قطر الألياف في الفئران المصابة ‎Astle‏ بالناقل مقارنة بفئران 5807 غير المعالجة في جميع العضلات ‎ADE‏ ‏0 التي تم فحصها (عضلة الساق: عدم المعالجة ب ‎sgeb”‏ -0.23+28.37 ميكرو ‎jie‏ مقابل المعالجة ب ‎0.17+36.04-AAV.Hsgeb‏ ميكرو متر؛ ‎(0.0001>p‏ (بى أس أوه ‎:PSOS‏ عدم المعالجة ب 07ع58 -0.23+24.75 ميكرو ‎jie‏ مقابل المعالجة بجين م]-سركوجليكان البشري للفيروس الغدى -0.28+38.43 ميكرو متر؛ ‎(0.0001>p‏ (العضلة ثلاثية الرؤوس: عدم المعالجة ب ‎sgeb™‏ -0.31+28 ميكرو متر مقابل المعالجة بجين م-سركوجليكان البشري للفيروس الغدى- 5 0.22435.56 ميكرو مولار؛ ‎(0.0001>p‏ (الشكلان 13ج؛ 13د؛ الجدول 3). الجدول 3. تحليل النسبة المئوية للتنوي المركزي جرعة ‎A‏ جينوم : لنسبة المئوية 5 الألياف إجمالي ‎eo‏ ‏. تنوي المركزي لميكرو متر جرعة) مدمج ‎de gan‏ الحيوان ‎Co‏ ‎(A‏ جينوم | 1 ‎dg‏ ل ( جينوم ‎C 2‏ يروسي ‎SEM)‏ ‎(SEN +SEM‏ نبوب ‎N/A qd 0.86 +1.7§‏ ‎cs7BLE WT‏ ل _ الأما 18 + يي 0.39 = 8+ 0.41 39.69 0.18
جرعة ‎A‏ جينوم . لنسبة المئوية م الألياف إجمالي يبروسي : تنوي المركزي لميكرو متر جرعة) ‎Fee‏ ‏جموعة الحيوان 2 ‎(A‏ جينوم | \ : ‎dg‏ ل ( جينوم روني ‎C‏ يروسي ‎+SEM)‏ ‎(+SEM +SEM‏ ‎Ce‏ ‏© 03090 ‎N/A 0.68 + 2.5(‏ لالوية قطنية 1.26 + 0.28 6 + 0.22 برى لاثية 2.13 + 0.36 3 + 0.24 ؤوس ‎oi‏ 1302371 نبوب ‏ 70.43 + م لأمامي 3.04 عط 67.26 + ‎١ N‏ 2 283+ 023 3 ‎JE: 63.5 N/A Sgcb-‏ 8 + 1 ‎N/ 1.86 20 9‏ ‎N/A + 61.34‏ لألوية 2.05 62.73 + ‎co] ee‏ ’ > : > 1
— 8 5 — جرعة / جينوم لنسبة ‏ المئوية ا الألياف إجمالي يروسي ٍ. تنوي المركزي لميكرو متر جرعة) مدمج جموعة الحيوان ل" ‎EES (A‏ 1 : ‎dg‏ ل ( جينوم بردي 1 يروسي ‎SEM)‏ ‎+SEM‏ 1 م م" ‎on | aw‏ * 28.74 + 0.22 ؤوس \ 754 + ‎N/ 3 7d DI‏ نبوب ‏ 43.8 + ‎Ns‏ ‏لأمامي 3.89 ‎pos )‏ + 36.04 + 0.18 3 : ‎NJ + 46.10 |‏ 6.26 ‎1.00E+1 AAV.MHCKY7.hS‏ 421 + (36.3 + ‎N/A 514 5.48 ly ] GCB Treated‏ .. . 21.00 + طنية ‎red‏ 38.4 + 0.28 برى 0 483 + 9+ 027 لاغة (6.2
‎Ig‏ لنسبة المئوية ‎J‏ الألياف إجمالي يروسي تنوي المركزي لميكرو متر جرعة) مدمج جموعة الحيوان ‎Co‏ ‏م احم ‎“A,‏ جينوم ل م أيروسي ‎SEM)‏ ‏= 41 +) لشت 2.08 بسبب الدور الهام الذي يلعبه مسبب المرض في نشوءء مرض ضمور عضلات حزام الأطراف من النوع 28 وفعالية العلاج؛ فمن الحاسم إظهار نفس الفعالية في الحد من التليف. تم مشاهدة ذلك مع نقل جين م-سركوجليكان الآن بعد التوصيل الجهازي ل ‎.scAAVrh.74 MHCK7.hSGCB‏ باستخدام صبغ البيروكسيروس الأحمر للكولاجين من الأنواع 1 ‎GIT‏ قمنا بتحليل مستويات الكولاجين في عضلة الساق وتم تحليل عضلات الحجاب الحاجز في ‎BLO WT Olid‏ ذات السبعة أشهر (ه-4)؛ فئران ‎sgeb”‏ غير المعالجة (4<0)؛ وفتران ‎sgeb™‏ المعالجة ذات الستة أشهر ‎(5=n)‏ بعد الحقن. أوضحت العضلات المعالجة على نحو كبير ترسب كولاجين بنسبة ‎J‏ مقارنة بعضلات ‎sgeb™‏ ‏غير المعالجة (الشكل 114). تضمنت عضلة الساق المنتقلة بواسطة ناقل على كولاجين بنسبة ‎Aji. £0.59£17.55‏ بالكولاجين 73.33+43.55 في عضلات ‎sgeb”‏ عضلة الساق غير 0 المعالجة (م<0.0001). علاوة على ذلك؛ أظهرت عضلة الحجاب الحاجز المعالجة كولاجين بنسبة 1.97 كولاجين مقارنة ‏ ب 72.39+44.05 في عضلة 807 غير المعالجة ‎(0.0001>p)‏ (الشكل 14ب) التي أظهرت قدرة ‎JB‏ جين م-سركوجليكان البشري للتخفيف عن المكون المتليف للنمط الظاهري ضمور عضلات ‎aha‏ الأطراف من النوع 28. ‎Ja‏ 11 5 تجديد وظيفة الحجاب الحاجز بعد التوصيل الجهازي لتحديد ما إذا كان نقل جين م]-سركوجليكان البشري يمكن أن يحسن وظيفة العضلات؛ قمنا بتقييم الخصائص الوظيفية لعضلة الحجاب الحاجز ‏ من ‎had‏ 59007_المعالجة باستخدام
‎scAAVrh.74 MHCK7.hSCGB‏ (انظر ‎(Griffin et al. for methods‏ تم حدوث عجز وظيفي أول في عضلات الحجاب الحاجز لفتران م-سركوجليكان”. أظهرت عضلات الحجاب الحاجز ‎KO‏ ‏مخرج قوة محددة منخفض بنسبة 750.9 (11.24 ‎Me‏ نيوتن/مم*) مقارنة بفئران ‎BL6 WT‏ ‎Ale 116.24)‏ نيوتن/مم" مقابل 236.67 ‎Ale‏ نيوتن/مم”) وفقدان أكبر في القوة التالية لبروتوكول التعب الشديد ‎rigorous fatigue protocol‏ (فقدان 723 في م0-سركوجليكان”!؛ فقدان 77 في ‎BL6‏ ‎(WT‏ يؤدي توصيل الوريد الذيلي 171.741110167156©3م»_الناتج في التعبير بنسبة 0 تقريبًا من م-سركوجليكان البشري في الحجاب الحاجز مما يؤدي إلى تجديد وظيفة الحجاب الحاجز بمخرج قوة معينة مُحسٌنَة إلى 226.07 مللي نيوتن/مم” ومقاومة أكبر للتعب عن طريق فقدان القوة بنسبة 712 ‎(5=n)‏ (الشكل 15). 0 المثال 12 توصيل 0186290 7:1.74.01117اههه: يحد من التليف في ‎Gl‏ م]-سركوجليكان7 أظهر التليف الهائل الذي حددناه في كل من العضلات الهيكلية (الأشكال 2 و4 و6) وكذلك القلب والحجاب الحاجز (الشكل 8) الحاجة إلى علاج ترسب الكولاجين (التليف) في ضمور عضلات ‎aba‏ الأطراف من النوع 28. ‎Lang‏ مسبقًا أن ‎Mir29C‏ هو أكثر ما تم تخفيضه من ‎(Mir29A)‏ ‎ (Mir29C 5 Mir29B 5‏ ضمور العضلات ‎muscular dystrophy‏ بافتررض أن ‎Mir-29C‏ _سيتم تخفيضه أيضًا في الفئران التي تعاني من نقص في بيتا-سركوجليكان (نموذج فأر خاص بضمور عضلات ‎aha‏ الأطراف من النوع ‎L(2F‏ لقد تم إثبات صحة ذلك (الشكل 15). تم تخفيض مستويات ©29» تم زيادة مستويات التليف (الكولاجين)؛ وتم زيادة مكونات التليف ‎«Col3A «ColA)‏ و20) عند مستوى الحمض النووى الرببوزى. لاختبار ما إذا كان يمكننا ‎aie‏ التليف باستخدام ©10:29؛ تم حقن ناقل العلاج الجيني ‎scrAAVIh.74.CMV.miR29¢‏ (1073' جينوم فيروسي) في عضلة الظنبوب الأمامية لفئران م-سركوجليكان7 ذات ‎jee‏ الأربعة أسابيع («<5). تم توضيح ‎scrAAVHh.74.CMV.miR29c‏ في الشكل 16 ووصفه في البراءة الأمريكية رقم 62/323.163؛ ‎Cas‏ يتم تضمينه هنا بالكامل كمرجع. ‏ بعد شهرين من العلاج باستخدام ©17.74.014177.01829»_تم تجميع عضلات الظنبوب الأمامي من ‎OE‏ م]-سركوجليكان 7 5 المعالجة والمتحكم بها وفثران ‎WT‏ وتحليلها للتليف (مستويات الكولاجين) ‎=n)‏ 5 لكل مجموعة). باستخدام قياس وصبغ سيريوس ‎«peal‏ تم تخفيض مستويات الكولاجين بعد العلاج (انظر الشكل
7). تم ضبط مستويات نص ‎«CollA‏ 0138©» و« وتم زيادة حجم ألياف العضلات. يتم توضيح الصورة التوضيحية للمقاطع الممسوحة ضوئيًا بالكامل من ‎AAVTh.74.CMV.miR29C‏ ‏غير المعالجة والعضلات الأمامية الظنبوطية المعالجة الملونة بسيريوس الأحمر الذي يتلون بالكولاجين 1 و3 في الشكل 118. يدل ذلك على ‎Tae‏ أن ‎scAAVTh.74.CMV.miR29C‏ يقلل من التليف في فتران م-سركوجليكان” ‎(Sey‏ استخدامه ‏ في توليفة ‎ae‏ الاستبدال الجيني ب ‎.scAAVrh.74 MHCK7.hSGCB i scAAVrh.74.tMCK.hSGCB‏ ‎Jud‏ 13 نقل جين وريدي إلى فئران م سركوجليكان” يقلل من تقوس العمود الفقري ‎Kyphoscoliosis‏ للعمود الفقري الصدري 0 يمكن أن يرجع تنكس عضلات الجذع ‎torso muscles‏ بسبب تدهور الحالة المرضية للمرضى الذين يعانون من مرضى ضمور عضلات ‎aba‏ الأطراف من النوع 28 إلى حداب ‎kyphosis‏ يمكن أن يؤدي قصور العمود الفقري الصدري إلى إضعاف العضلات التي تدعم العمود الفقري إلى دفع الحجاب إلى الأمام»؛ مما يزيد من قدرة الرئة ووظيفة الحجاب الحاجز. ونتيجة لشدة النمط الظاهري في فأر 7( مع ظهور التشريحي العياني ‎gross anatomical appearance‏ لتقوس العمود الفقري؛ 5 وكان يستخدم لكامل الجسم الأشعة السينية التصوير الشعاعي ‎x-ray radiography‏ لتحديد درجة الحداب في فتران ‎BLO WT‏ ذات السبعة أشهر («<6). قامت درجة مؤشر الحدابية ‎kyphotic‏ ‎(KI) index‏ بتحديد قيمة كميّة لمستوى ‎Call‏ الحدابي -1970 :97 ‎(Laws et al.
J.
Appl.
Physiol.‏ )2004 ,7. كما هو موضح باللوحة ‎WT‏ في الشكل 119, تكون درجة مؤشر الحدابية عبارة عن نسبة طول من القائمة الأمامية إلى القائمة الخلفية مقارنةً بطول الخط الأوسط إلى قمة انحناء العمود 0 الفقري. في حين وجود ‎OE‏ 88007 مع مع العمود الفقري المنحني بشدة وانخفاض درجة مؤشر الحدابية 0.162+3.64 ‎¢(6=n)‏ تتضمن الفئران ‎BLO WT‏ عمود فقري أكثر استقامة على نحو كبير مما يؤدي إلى درجة مؤشر الحدابية أعلى 0.41+6.01 ‎(0.01>p) (6 =n)‏ (الشكل 19ب). تُظهر ‎sgeb” of‏ المعالجة انخفاض كبير في درجة حداب العمود الفقري مع زيادة في درجة مؤشر الحدابية إلى 5.39 + 0.58 ‎P<) )6 =n)‏ 0.02( (الشكل 19ب). تشير هذه البيانات إلى أن 5 التوصيل الوربدي ل ‎scAAVTH. 74. MHCK7.hSGCB‏ مفيد للتكامل الشامل للعمود الفقري ويمكن أن يخفف من الحداب والتقلصات المشتركة الموجودة في هذا المرض. أوضحت هذه البيانات التخفيف
من الحداب وزيادة النشاط البدني في فتران 8607 بعد تسليم التوصيل الجهازي التالي للناقل الفيروس الغدي الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني وفقًا للاختراع. تُعد هذه البيانات دليل إضافي على أن العلاج الجيني للاختراع يحسن نوعية الحياة لمرضى ضمور عضلات ‎alia‏ الأطراف من النوع ‎2E‏ ‏5 المثال 14 تقييم اعتلال عضلة ‎Cardiomyopathy «all‏ تم الكشف أيضًا عن التدمير النسيجي ‎histological destruction‏ للعضلة وعضلة الحجاب الحاجز في عضلة القلب ‎myocardium‏ لفتران 58607 ذات 7 أشهر خاصة مع وجود نخر عضلة القلب ‎myocardial necrosis‏ والتليف كما يتضح من هيماتوكسيلين وبوزين وصبغ بيكروسيريوس الأحمر 0 (الشكل 20). تقديم وظيفة القلب الضعيف ‎We‏ في شكل اعتلال عضلة القلب المتوسعة مع انخفاض النتاج القلبي وانخفاض نسبة القذف -1772 :84 ‎fraction (Semplicini et al., Neurology‏ ‎Fanin et al., Neuromuscul Disorder 13:303-9, 2003)‏ ,2015 ,81. تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي للقلب لتقييم العديد من المتغيرات الوظيفية ‎functional parameters‏ للقلب من أجل إحداث عجز وظيفي في عضلة القلب لفئران ‎sgeb™‏ مقارنة بفئران ‎BLO WT‏ للاستخدام كقياس ناتج وظيفي ‎functional outcome‏ أظهر تصوير فتران عينات المقارنة ذات السبعة أشهر انخفاضًا 4 7 من حجم السكتة الدماغية من 0.041 + 0.0019 ملليلتر في قلوب ‎sgeb”‏ إلى 0.029 + 0.0024 ملليلتر في قلوب ‎BL6 WT‏ (م<0.01)؛ وهو انخفاض ناتج القلب بنسبة 731.7 من 0 + 0.74 ملليلتر/دقيقة في قلوب 8857 إلى 12.72 + 0.97 ملليلتر/دقيقة في قلوب ‎BLO‏ ‎WT‏ وفي النهاية انخفاض الطرد بنسبة 714.3 66.21+ 73.83 في قلوب 98607 مقارنة ب 0 £76.90 21.67 في قلوب ‎(0.05>p) 81.6 WT‏ (الشكل 20ب). يشير هذا إلى انخفاض متواضع في وظيفة القلب الكلية في هذا الوقت ويتجه نحو تطور اعتلال عضلة القلب. قام تجديد التعبير عن م-سركوجليكان البشري في قلوب الفئران ‎KO‏ من خلال التوصيل الجهازي ‎Wn‏ بتصحيح هذا القصور؛ وتحسين حجم السكتة الدماغية إلى 0.032 + 0.0027 ملليلتر؛ والناتج القلبي إلى 14.66 + 0.75ملليلتر/دقيقة؛ وتجزئة الطرد إلى 68.16 + 72.31 (الشكل 19 ب). بينما ترتبط بالتوزيع 5 الوظيفي والنسيجي للنسيج القلبي الوارد تقرير عنه هناء يتم تخفيض النشاف الغربي للتعبير عن ترويونين 1 القلبي» وهو منظم ‎regulator‏ مهم لوظيفة القلب ومؤشر (المؤشرات الحيوية ‎(biomarker‏
حدوث ‎Cali‏ للقلب؛ في قلوب ‎sgeb™‏ المريضة إلى 760.38 للمستويات الملاحظة في ‎BL6 (ll‏ ‎WT‏ (الشكل 20ج). يتم استعادة مستويات التروبونين القلبي 1 بعد العلاج إلى مستويات 35.80 7 من التعبير الملاحظ في قلوب ‎WT‏ (الشكل 20د). المثال 15 استعادة وظيفية في عضلات الحجاب الحاجز مع زيادة في النشاط البدني ‎[ag‏ المشاركة الهامة للاضطراب الوظيفي للحجاب الحاجز وفشل الجهاز التنفسي ‎respiratory‏ ‎failure‏ في ضمور عضلات حزام الأطراف من النوع 28 الفائدة الوظيفية إلى الحجاب الحاجز الضروري للتحقق من العلاج السريري الشامل ‎systemic therapy‏ لدعنصناء. مع استخدام بروتوكول تجريبي خارج جسم الكائن الحي على شرائط مأخوذة من عضلة الحجاب الحاجز؛ تم تقييم ما إذا 0 كانت استعادة بيتا-سركوجليكان توفر فائدة وظيفية لهذه العضلة شديدة الاختراق. وفقًا للإصابة المرضية الكبيرة المصابة بها الفئران ذات عمر السبعة أشهر في الحجاب الحاجزء أظهرت الحجابات الحاجزة ‎(4=n) sgcb” diaphragms‏ عجزًا وظيفيًا مع انخفاض كبير (751) في ناتج قوة محدد بالمقارنة بفئران ‎Ale 10.49 + 116.24( (5=n) BL6 WT‏ نيوتن/مم* مقابل 236.67 + 7 ملي نيوتن/مم”؛ على التوالي» > م 0.001( بالإضافة إلى خسارة أكبر للقوة الناتجة عن 5 ذلك بعد الانكماش الأول بعد بروتوكول التعب الشديد (خسارة 23 + 71.0 في ‎ssgeb™‏ 73.027.0 ‎sla‏ في ‎BL6 WT‏ م<0.05) ‎(I 6 SA)‏ بعد _ستة أشهر من توصيل ‎scAAVTh.74 MHCK7.hSGCB‏ عبر وريد ذيل تالي؛ لوحظ تحسن كبير في إنتاج قوة محددة. تم ملاحظة زيادة إنتاج القوة المعينة إلى 226.07 + 27.12 ‎Ale‏ نيوتن/ممة ‎=n)‏ 5( (م<0.05 مقارنة ب ‎(sgeb”‏ وحماية أفضل للعضلات من الإجهاد المتكرر مع فقدان قوة 12.0 + 74.0 فقط 0 (م<0.05 مقارنة ب ‎(sgeb”‏ (الشكل 21 أ). بصفة عامة؛ تدعم هذه البيانات النتائج التي توصلنا إليها مسبقًا في العضلات الظنبوب الأمامي وتبين أن استعادة بيتا-سركوجيليكان يوفر الانتعاش الوظيفي ‎functional recovery‏ في عضلة حجاب حاجز. كثيرا ما يتم ورود تقارير عن أعراض ‎sal)‏ التعب وانخفاض النشاط العام في العديد من الأمراض العصبية والعضلية؛ ويرجع ذلك ‎Lida‏ إلى حدوث حداب. ونتيجة لذلك؛ ومع الأخذ في الاعتبار 5 اللنمط الظاهري لضمور عضلات حزام الأطراف من النوع ‎OF‏ تم الافتراض بأن الفثئران ‎KO‏ سيكون من الطبيعي أن تكون أقل نشاطًا مقارنة بفئران ‎WT‏ الصحية؛ وعلاوة على ذلك؛ فإن التوصيل
الجهازي ل ‎rAAV.MHCK7.hSGCB‏ إلى فتران ‎sgeb”‏ سيؤدي إلى فئران أكثر نشاطًا جسديًا. من أجل اختبار هذه الفرضية والفوائد الوظيفية الإضافية المحتملة لنقل الجينات؛ يتم إجراء مراقبة بالليزر لبروتوكول نشاط القفص في الحقول المفتوحة بشكل مماثل لما هو موصوف في ‎Kobayashi et al.,‏ ‎Nature 456: 511-5, 2008‏ و 2011 ,2464-74 :179 ‎«Beastrom et al., Am.
J.
Pathol.‏ الذي تم اجراءه على جميع مجموعات الفتئران. توضح الرسوم البيانية في الشكل 21ب انخفاضا كبيرا )755.5( في الفئران ‎KO‏ بالمقارنة مع ‎WT‏ في كل من التمشي الكلي (الحركة الأفقية في اللوحات ‎(ys x‏ والوقوف العمودي على الطرف الخلفي. إن متوسط عدد فواصل أشعة الليزر المتحركة ‎ambulatory laser beam breaks‏ الأفقية على مدى فترة ساعة واحدة في فثران 15771 هي ‎(6=n) 400.8+7355‏ مقارنة ب 3271 + 483.8 ‎=n)‏ 6( في ‎KO ly‏ (م<0.0001). علاوة على ذلك؛ كان متوسط عدد فترات تنشئة فواصل الشعاع الرأسية ‎vertical rearing beam breaks‏ المسجلة في فتران ‎WT‏ 53.76+626.7 بدلا من 264.5 + 63.36 في فثران ‎KO‏ (م<0.01) (الشكل 21 ب). ‎Gy‏ للفرضية الأولية» كانت الفئران المعالجة ‎RAAV.MHCK7hSGCB‏ أكثر ‎tals‏ بشكل ملحوظ مقارنة بفئران ‎KO‏ التي تم توضيحها في تقدير النشاطء حيث ازداد التجميع الكلي بنسبة 722 إلى 5143 + 293.2 فواصل شعاع ‎(0.05>p)‏ ووقوف عمودي على الطرف 5 الخلفي بشكل كبير بنسبة 777 إلى 615.3 + 95.93 فواصل شعاع (م<0.05) في الفئران المعالجة ‎n)‏ = 6) (الشكل 21 ب). المثال 16 الأمان والتوزيع الحيوي ل ‎rAAVrh.74 MHCK7.hSGCB‏ تم تقييم مخاوف السمية أو السلامة المحتملة للعلاج الجيني م-سركوجليكان البشري في ‎sgeb” Ol‏ 0 * التي عمرها 6 ‎jell‏ بعد التوصيل الجهازي ل ‎ve scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB‏ الجرعة الإجمالية (10*75"' ميكرو جرام/كيلو جرام). تم تحليل التوزيع الحيوي للناقل والتعبير عن جين متحور ‎hy‏ خارج النطاق المستهدف على عينات الأنسجة ‎tissue samples‏ (الظنبوب الأمامي؛ العضلة ثلاثية الرؤوس؛ الحجاب الحاجزء ‎call‏ الغدد التناسلية؛ الرئتين؛ الكلى؛ ‎call‏ الطحال) من حيوانات ‎sgeb”‏ التي تم اعطاءها جرعة من ناقل باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمى 5 وبقعة وبسترن؛ على التوالي. باستخدام مجموعات مسبار أولي محدد لناقل؛ تم الكشف عن جينومات ناقل ‎MHCK7.hSGCB‏ عند مستويات مختلفة في جميع الأنسجة التي تم جمعها. كما هو متوقع؛
تم رؤية أعلى المستويات في الكبد وكذلك عضلات الهيكل العظمي والقلب؛ مما يدل على أن ‎sale‏ ‏الاختبار قد تم توصيلها بكفاءة بجميع عضلات الفتئران التي تم إعطاءها جرعة بها ناقل (الشكل 2). علاوة على ذلك أكدت بقعة ويسترن للكشف عن تعبير بروتين جين م]-سركوجليكان البشري وظيفة محفز نسخة مهجنة من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرياتين كيناز عضلي محدد للعضلة والتعبير عن الجينات المحولة وراثيًا المقيدة بعضلة القلب والعضلة الهيكلية. تم ملاحظة التعبير عن بروتين م-سركوجليكان بكميات متفاوتة في جميع عينات العضلات الهيكلية وكذلك عينات من القلب؛ والأهم من ذلك أنه لم يتم اكتشافه في أي نسيج غير عضلي ‎non-muscle tissue‏ (الشكل 22 ب)ء؛ مدعومًا بحقيقة أن بيتاسركوجليكان معروف بأنه البروتين العضلي المحدد. وأخيراء تم ‎shal‏ عملية صبغ باستخدام الهيماتوكسيلين واليوزين للمقطع البارد من الأنسجة العضلية وتم حصد جميع أعضاء 0 الجسم التي لا تكون موجودة بمكانها من خمسة فتران 8607 ‎Gis‏ إلى جنب مع خمسة ‎Ob‏ ‎WT‏ 0716 معالجة ‎Giles‏ باستخدام الناقل الخاص بنا في الجرعة العلاجية المستخدمة في هذه الدراسة. تم بعد ذلك مراجعة هذه المقاطع بشكل أساسي كشفا عن التسمم من قبل أخصائي الأمراض البيطرية ولم يتم اكتشاف أي آثار ضارة في أي عينة من أي من الفئران. عند النظر إلى كل ذلك مجتمعين» تدل هذه البيانات على أن ‎sale‏ الاختبار هذه كانت جيدة التحمل من ‎JB‏ حيوانات
5 الاختبار. تم تحقيق حقيقة أن هذه المستويات العالية من التحوير الوراثي في جميع العضلات في جميع أنحاء الجسم قد تم إدراكها دون أي آثار سلبية ويؤدي استخدام جرعة منخفضة ‎Jal) Gow‏ جرعة 11" جينوم فيروسي؛ 10*75 جينوم فيروسي/كيلوجرام) إلى تقديم بشرى كبيرة بالانتقال إلى مرضى ضمور عضلات حزام الأطراف من النوع ‎2E‏ من الناحية السريرية؛ تكون الجرعة 0 المستخدمة في التجارب الموصوفة هنا أقل بكثير من الجرعة المستخدمة في التوصيل الجهازي لأس أم أن 1 580801 الذي يعبر عن علاج الفيروس الغدي الموصّل إلى الأطفال الرضع الذين يعانون من أس ‎al‏ أيه ‎SMA‏ وهو حاليا في التجارب السريرية ‎«Mol.
Ther 24: S190 «Mendel et al.)‏ 6) إن استعادة الكفاءة بشكل عالي للتعبير عن م]-سركوجليكان باستخدام معزز نسخة ‎Linge‏ ‏من سلسلة ثقيلة للميوسين وكرياتين كيناز عضلي المصاحب للفوائد الوظيفية هو أمر مشجع جدَّا في 5 مستويات الجرعات التي ‎(Se‏ تطبيقها سريريًاء ونظرا لارتفاع نسبة إصابة القلب في نقص م- سركوجليكان في مرضى ضمور عضلات حزام الأطراف من النوع ‎QF‏ يوفر التوصيل الجهازي فائدة
— 6 6 — ‏كبيرة لهؤلاء المرضى.‎ ‏المراجع:‎ ‎1 Bonnemann CG, Modi R, Noguchi S, Mizuno Y, Yoshida M, Gussoni E et al. Beta- sarcoglycan (A3b) mutations cause autosomal recessive muscular dystrophy with loss of 5 the sarcoglycan complex. Nat Genet 1995; 11: 266-273. 2 Moore SA, Shilling CJ, Westra S, Wall C, Wicklund MP, Stolle C et al. Limb-girdle muscular dystrophy in the United States. J Neuropathol Exp Neurol 2006; 65: 995-1003. 3 Araishi ‏كا‎ Sasaoka T, Imamura M, Noguchi S, Hama H, Wakabayashi E et al. Loss of the sarcoglycan complex and sarcospan leads to muscular dystrophy in beta-sarcoglycan- 10 deficient mice. Hum Mol Genet 1999; 8: 1589-1598. 4 Durbeej M, Cohn RD, Hrstka RF, Moore SA, Allamand V, Davidson BL et al.
Disruption of the beta-sarcoglycan gene reveals pathogenetic complexity of limb-girdle muscular dystrophy type 2E. Mol Cell 2000; 5: 141-151.
Bonnemann CG, Passos-Bueno MR, McNally EM, Vainzof M, de Sa Moreira E, Marie 1 5
SK et al. Genomic screening for beta-sarcoglycan gene mutations: missense mutations may cause severe limb-girdle muscular dystrophy type 2E (LGMD 2E). Hum Mol Genet 1996; 5: 1953-1961. 6 Angelini C, Fanin M, Freda MP, Duggan DJ, Siciliano G, Hoffman EP. The clinical spectrum of sarcoglycanopathies. Neurology 1999; 52: 176-179. 20 7 Sandona D, Betto R. Sarcoglycanopathies: molecular pathogenesis and therapeutic prospects. Exp Rev Mol Med 2009; 11: 28. 8 Fanin M, Melacini P, Boito C, Pegoraro E, Angelini C. LGMD2E patients risk developing dilated cardiomyopathy. Neuromusc Disord 2003; 13: 303-309. 9 Sveen ML, Thune JJ, Kober L, Vissing J. Cardiac involvement in patients with limb- 25 girdle muscular dystrophy type 2 and Becker muscular dystrophy. Arch Neurol 2008; 65: 1196-1201.
Melacini P, Fanin M, Duggan DJ, Freda MP, Berardinelli A, Danieli GA et al. Heart involvement in muscular dystrophies due to sarcoglycan gene mutations. Muscle Nerve 1999; 22: 473-479. 30 11 Narayanaswami P, Weiss M, Selcen D, David W, Raynor E, Carter G et al. Evidence- based guideline summary: diagnosis and treatment of limb-girdle and distal dystrophies: report of the guideline development subcommittee of the American Academy of
Neurology and the practice issues review panel of the American Association of
Neuromuscular & Electrodiagnostic Medicine. Neurology 2014; 83: 1453-1463. 5 12 Wong-Kisiel LC, Kuntz NL. Two siblings with limb-girdle muscular dystrophy type 2E responsive to deflazacort. Neuromusc Disord 2010; 20: 122-124. 13 Barresi R, Di Blasi C, Negri T, Brugnoni R, Vitali A, Felisari G et al. Disruption of heart sarcoglycan complex and severe cardiomyopathy caused by beta sarcoglycan mutations. J Med Genet 2000; 37: 102-107. 40 14 Gibertini S, Zanotti S, Savadori P, Curcio M, Saredi S, Salerno F et al. Fibrosis and inflammation are greater in muscles of beta-sarcoglycan-null mouse than mdx mouse.
— 6 7 —
Cell Tissue Res 2014; 356: 427-443.
McCarty DM, Fu H, Monahan PE, Toulson CE, Naik P, Samulski RJ. Adeno- associated virus terminal repeat (TR) mutant generates self-complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo. Gene Ther 2003; 10: 2112-2118. 16 McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Self-complementary recombinant adeno- 5 associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther 2001; 8: 1248-1254. 17 Chicoine LG, Rodino-Klapac LR, Shao G, Xu R, Bremer WG, Camboni M et al.
Vascular delivery of rAAVrh74 MCK.GALGT?2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. 10
Mol Ther 2014; 22: 713-724. 18 Rodino-Klapac LR, Montgomery CL, Bremer WG, Shontz KM, Malik V, Davis N et al. Persistent expression of FLAG-tagged micro dystrophin in nonhuman primates following intramuscular and vascular delivery. Mol Ther 2010; 18: 109-117. 19 Rodino-Klapac LR, Janssen PM, Montgomery CL, Coley BD, Chicoine LG, Clark KR 1 5 et al. A translational approach for limb vascular delivery of the micro-dystrophin gene without high volume or high pressure for treatment of Duchenne muscular dystrophy. J
Transl Med 2007; 5: 45.
Wang B, Li J, Fu FH, Chen C, Zhu X, Zhou L et al. Construction and analysis of compact muscle-specific promoters for AAV vectors. Gene Ther 2008; 15: 1489-1499. 0 21 Chicoine LG, Montgomery CL, Bremer WG, Shontz KM, Griffin DA, Heller KN et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on micro- dystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther 2014; 22: 338-347. 22 Matsuda R, Nishikawa A, Tanaka H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient 25 muscle. J Biochem 1995; 118: 959-964. 23 Straub V, Rafael JA, Chamberlain JS, Campbell KP. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol 1997; 139: 375— 385. 24 Mendell JR, Sahenk Z, Malik V, Gomez AM, Flanigan KM, Lowes LP et al. A phase 30 1/2a follistatin gene therapy trial for becker muscular dystrophy. Mol Ther 2015; 23: 192-201.
Dressman D, Araishi K, Imamura M, Sasaoka T, Liu LA, Engvall E et al. Delivery of alpha- and beta-sarcoglycan by recombinant adeno-associated virus: efficient rescue of muscle, but differential toxicity. Hum Gene Ther 2002; 13: 1631-1646. 3 5 26 Rodino-Klapac LR, Lee JS, Mulligan RC, Clark KR, Mendell JR. Lack of toxicity of alpha-sarcoglycan overexpression supports clinical gene transfer trial in LGMD2D.
Neurology 2008; 71: 240-247. 27 Shield MA, Haugen HS, Clegg CH, Hauschka SD. E-box sites and a proximal reg- ulatory region of the muscle creatine kinase gene differentially regulate expres—sion in 40 diverse skeletal muscles and cardiac muscle of transgenic mice. Mol Cell Biol 1996; 16: 5058-5068. 28 Rabinowitz JE, Rolling F, Li C, Conrath H, Xiao W, Xiao X et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV
— 6 8 — serotypes enables transduction with broad specificity. J Virol 2002; 76: 791-801. 29 Grieger JC, Choi VW, Samulski RJ. Production and characterization of adeno- associated viral vectors. Nat Protoc 2006; 1: 1412-1428.
Clark KR, Liu X, McGrath JP, Johnson PR. Highly purified recombinant adeno- associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild- 5 type viruses. Hum Gene Ther 1999; 10: 1031-1039. 31 Liu M, Yue Y, Harper SQ, Grange RW, Chamberlain JS, Duan D. Adeno-associated virus-mediated microdystrophin expression protects young mdx muscle from contraction- induced injury. Mol Ther 2005; 11: 245-256. 32 Hakim CH, Grange RW, Duan D. The passive mechanical properties of the extensor 10 digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice. J Appl Physiol 2011; 110: 1656-1663. 33 Wein N, Vulin A, Falzarano MS, Szigyarto CA, Maiti B, Findlay A et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nat Med 2014; 20: 992-1000. 15 ‏قائمة التتابع‎ ‏زوج قاعدة‎
ITRA 1 ‏'ب‎ ‎ITR 'z’ 20
GAPDH ‏د‎ ‏كيلو دالتون‎ "a" hSGCB ‏'و‎ ‎AAV.IMCK.hSGCB-12 wks "yy
AAV.tIMCK.hSGCB-6 wks 'z’ 25 ‏غير معالج‎ B-SGKO ‏'ط‎ ‏يي النوع غير المعالج‎
KO " st
AAV.IMCK7.hSGCB "J ‏الازرق‎ la) ‏صبغ‎ ~AAV.IMCK.hSGCB "a 0 ‏أن " الغا “شرك | بك ان‎ ‏ديستروفين‎ TO
ع ‎C57BL/6WT‏ ‎KOTA "dd‏ غير معالج 'لص' ‎BLBWTTA‏ ‎"a‏ اقطار الالياف ر" التكرار النسبي7 لش" نوق مركزية7 ات" 0 7 من الكولاجين 'ث' | 31617717 ‎BSG KO - 5wks "+‏ 0 ذا" القوة النوعية ‎"a‏ القوة المطلقة 1" 7 الكولاجين 1" القوة المطلقة (مللي نيتون) ‎sl‏ النوعية (مللي نيوتن | مم2) ‎"1S 5‏ القوة (جزء من التقلص الاول) "1" التقلص اللامركزي (رقم الدورة) ‎KO 6 Month "14‏ 3-56 ‎TA 1)‏ ‎GAS lf‏ 'ط1" ‎GAPDH48‏ كيلو دالتون ‎"lJ‏ 1560843 كيلو دالتون ‎Tl‏ الحاجب الحاجز ل1' ‎B-SGKO‏ ‏م1" | ‎LTA‏ ‏5 انا" ‎LGAS‏ ‏"س1" النسبة ‎gill‏ للقوة عقب الاصابة
‎Ig!‏ عضلة الساق 1 نسخ / ميكرو جرام من الحمض النووي ‎RTA "lua"‏ ‎"1G‏ الغدة التناسلية 'ر 1" القلب 'لش1" الرئة ‎a‏ الكلية ‎Wl‏ ‏15 الطحال ‎"TY 0‏ الحجاب الحاجز 'أض1" العضو/النسيج 2 كيلو دالتون 2" القوة النوعية ج22" ‎BSGKO‏ ‏5 24 سبة الانقباض القلبي 7 2 .من النوع الغير معالج ‎KO 24‏ 2" نسبة الانقباض القلبي 2 طقم 0 "24" توصيل ‎scAAVIh. 74. MHCK7 hSGCB‏ عبر الوريد الذيلي لفئران -/- ‎SGCB‏ يؤدي الى تحوير وراثي بنسبة حوالي 7100 ‎GLY‏ الغضلات في كل عضلة ‎QUAD "24‏ ك2 ‎PSOAS‏ ‏'ل2' ‎TRI‏ ‏5 24 ايسر ان 2‏ ايمن
2.4" 31677772 ع2" ‎BSGKOTA‏ ‎GLUT "2‏ ‎TRICEP "2 =‏ 23 التعبير عن 1500 في عضلة القلب 'ر2" . التعبير عن 15008 في العضلة "لش 2" التعبير عن جزءِ ‎SGCB‏ القبلى 2" التعبير النسبي "ث2" ‎BSGKO‏ المعالجة 0 “خ2. 8-5060 غير معالجة 23 7 النوي المركزية ‎DIA "2‏ ‎3T‏ قطر الالياف (ميكرو ‎(Jie‏ ‏'ب3' . 685 معالجة 5 "ج3' ‎KOGAS‏ غير معالجة ‎BL6 WT GAS 3‏ ‎PSOAS "34‏ معالجة ‎KOPSOAS "35‏ غير معالجة ‎BL6 WT PSOAS 3‏ "37" 1817 معالجة ‎KOTRI "3%‏ غير معالجة ي3' ‎BL6 WT TRI‏ 3 التكرار النسبي (النسب المئوية) 'ل3" - عم متوسط القطر (ميكرو متر) 5 .3 الارهاق 3" القوة النوعية
"س3" ‎MHCK7.hSGCB‏ بعد 6 اشهر من التعطاء في ‎el2vgl call‏ ‎BSGKO "3g"‏ غير معالجة ‎CMV 3d‏ ‎"3a‏ رقم تعريف المتوالية: 9: ‎miR-29C‏ في سلسلة 0118-30 رئيسية ‎CollA "33 5‏ ‎Mir "3‏ نستويات ‎pd "3H‏ متوسط قطر الالياف ات "3 ‎Fbn‏ ‏ث3" ‎ColBA‏ ‏0 "32" التعبير النسبي ‎CollA/Gapdh‏ ‏3" التعبير النسبي ‎Fbn/Gapdh‏ ‏"3" التعبير النسبي ‎Col3A/Gapdh‏ ‏7 7016ي ‎BSGKO "4‏ غير معالجة ‎dg’ 5‏ 856 محقون 356 في الجانب المقابل "هك" ‎cmv.miR.29¢‏ ‏4" فئران -/- ‎dallas SGCB‏ ب ‎AAVh.74.mir29¢‏ ‎SGCB | "7‏ غير معالجة -/- ‎det 0‏ جنف حدابي 41" مؤشر حدابي ‎(ab/CD)‏ ‏'ي4" الهيموتوكسيلين واليوزين ‎4S‏ بيكروسيوس الاحمر ]4 نسبة الانقباض القلبي ‎4d 5‏ خرج قلبي 4 حجم النفضة
4 حجم النفضة (مليلتر) ‎dg‏ خرج قلبي ‎(asf hl)‏ 4" نسبة الانقباض القلبي ‎x‏ ‎Ao‏ التعبير عن بروتين 1101© ‎4G 5‏ التعبير عن 01:01 في العضلة القلبية 4 الفينكولين 100 كيلو دالنون لش 4" 25 ‎cTripl‏ كيلو دالتون 'ات4" فواصل ‎glad‏ ‎ed‏ عد التركيزات 0 "45" النشاط العمودي 43" المشي ‎"4a‏ 1 من القوة المحتجزة 57" توزيع حيوي ‎qPCR‏ ل ‎AAV.MHCK7hSGCB‏ في الوريد 'ب5"' توزيع 150603 حيوي "52" الفينكولين 125 كيلو دالنون .5" الفينكولين 25 كيلو دالنون ‎LTRI "5a"‏ 54" محسن/معزز ‎MCK‏ ‏رذ ‎SynpA‏ ‎scAAVrh.74 tMCK.hSGCB ~~ "57" 20‏ ‎Pa "5k‏ ‎Intron "6‏ ‎MHCK?7 "6‏ ‎h.SGCB cDNA "67"‏ ‎qd "63" 5‏

Claims (8)

عناصر الحماية
1. ناقل الفيروس الغدي ‎mL (AAV) Adeno-associated virus‏ عن ‎sae‏ الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ يشتمل على متوالية ‎Jol‏ نوكليوتيد ‎polynucleotide‏ التي تشفر م]-سركوجليكان ‎B-‏ ‎Cua csarcoglycan‏ تشتمل متوالية البولي نوكليوتيد ‎polynucleotide‏ على متوالية نوكليوتيد ‎nucleotide‏ تتطابق بنسبة 795 على الأقل مع المتوالية بهوية رقم: 2.
2. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ ‏مشتمل على متوالية بولي نوكليوتيد ‎polynucleotide‏ تشفر م]-سركوجليكان ‎B-sarcoglycan‏ مطابقة بنسبة 795 مع المتوالية بهوية رقم: 1.
0 3. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ ‎Uy‏ لعنصر الحماية 1؛ حيث تشتمل متوالية البولي نوكليوتيد ‎polynucleotide‏ التي تشفر م]- سركوجليكان ‎Brsarcoglycan‏ على متوالية النوكليوتيد ‎nucleotide‏ المذكورة في المتوالية بهوية رقم: 1
4. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ ‎Uy‏ لعنصر الحماية 2 حيث تشفر متوالية البولي نوكليوتيد ‎polynucleotide‏ م]-سركوجليكان ‎B-‏ ‎sarcoglycan‏ من المتوالية بهوية رقم: 2.
5. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ 0 وفقا لأي واحد من عناصر الحماية 4-1؛ حيث يكون الناقل ‎vector‏ من النمط المصلي الفيروس الغدي 1 1 ‎<Adeno-associated virus‏ الفيروس الغدي 2 2 ‎«AAV2 Adeno-associated virus‏ الفيروس الغدي 4 4 ‎<Adeno-associated virus‏ الفيروس الغدي 5 5 ‎«Adeno-associated virus‏ الفيروس الغدي 6 6 ‎<Adeno-associated virus‏ الفيروس الغدي 7 7 ‎«Adeno-associated virus‏ الفيروس الغدي 8 8 ‎<Adeno-associated virus‏ الفيروس الغدي 9 9 ‎«Adeno-associated virus‏ Adeno-associated virus 11 ‏الفيروس الغدي‎ <Adeno-associated virus 10 10 ‏الفيروس الغدي‎ 5
— 5 7 — 1 الفيروس الغدي 12 12 ‎<Adeno-associated virus‏ الفيروس الغدي 13 ‎Adeno-associated‏ ‎sl virus 13‏ 11.74 تتهح.
6. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ ‏5 وفقًا لأي من عناصر الحماية 4-1؛ حيث يتم ربط متوالية البولي نوكليوتيد ‎polynucleotide‏ التي ترمز ]-ساركوجليكان ‎B-sarcoglycan‏ بفعالية بعنصر مقارنة خاص ‎diary‏ معينة ‎muscle-‏
‎.specific control element‏
7. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ ‎Gy 0‏ لعنصر الحماية 6 ‎Cua‏ يكون عنصر المقارنة الخاص بالعضلة ‎muscle-specific control‏ ‎element‏ عبارة عن عنصر جين ‎gene element‏ أكتين هيكلي بشري ‎chuman skeletal actin‏ عنصر جين أكتين قلبي ‎cardiac actin gene element‏ عنصر محسن عامل ارتباط ‎binding factor‏ انتقائي للخلية العضلية ‎cmef myocyte-specific enhancer‏ معزز كرياتين كيناز عضلي ‎muscle creatine‏ ‎jie ((MCK) kinase‏ كرياتين كيناز ‎ae‏ مقتضب ‎truncated muscle creatine kinase‏ ‎(IMCK) 5‏ (كرياتين كيناز عضلي مقتضب ‎¢(truncated muscle creatine kinase‏ معزز سلسلة ثقيلة للميوسين ‎«(MHC) myosin heavy chain‏ معزز ‎MHCK7‏ (نسخة مهجنة ‎hybrid version‏ من سلسلة ثقيلة للميوسين ‎myosin heavy chain‏ وكرباتين كيناز عضلي ‎«(muscle creatine kinase‏ ‎C5- 12‏ (معزز تخليفي ‎«(synthetic promoter‏ عنصر محسن ‎enhancer element‏ كرياتين كيناز فأري ‎wale murine creatine kinase‏ جين ‎gene element‏ تروبونين © هيكلي سريع التحويل ‎skeletal fast-twitch troponin © 0‏ عنصر جين ‎gene clement‏ تروبونين © قلبي بطيء التحويل ‎«slow-twitch cardiac troponin ¢‏ عنصر جين ‎gene element‏ ترويونين ‎I‏ بطيء التحويل ‎slow-‏ ‎pale »1600 troponin i‏ استجابة عامل نووي قابلة للحث بنقص التأكسج ‎hypoxia-inducible‏ ‎nuclear response element‏ عنصر قابل للحث بالستيرويد ‎steroid-inducible element‏ أو عنصر ربط للجلوكوكورتيكويد ‎glucocorticoid response element‏ (عنع).
8. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏
— 6 7 — ‎Gy‏ لعنصر الحماية 7 حيث يكون عنصر المقارنة الخاص بعضلة معينة ‎muscle-specific‏ ‎control element‏ كرياتين كيناز عضلي مقتضب ‎truncated muscle creatine kinase‏
9. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ ‎Gg 5‏ لعنصر الحماية 7( حيث يكون عنصر المقارنة الخاص بعضلة معينة ‎muscle-specific‏ ‎control element‏ لنسخة مهجنة ‎hybrid version‏ من سلسلة ثقيلة للميوسين ‎myosin heavy chain‏ وكرياتين كيناز عضلي ‎-muscle creatine kinase‏
0. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ ‏0 وفًا لأي من عناصر الحماية 4-1 يشتمل على متوالية النوكليوتيد ‎nucleotide‏ المذكورة في المتوالية بهوية رقم . 3
1. الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ ‏وفقًا لأي من عناصر الحماية 4-1 يشتمل متوالية النوكليوتيد ‎nucleotide‏ المذكورة في المتوالية بهوية 1 رقم: 5
2. تركيبة تشتمل على الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني ‎lg recombinant‏ لأي من عناصر الحماية 4-1. 0 13. تركيبة تشتمل على الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ وفقًا لأي من عناصر الحماية 4-1 لتقليل التليف ‎fibrosis‏ في ‎(AS‏ ثديي في حاجة إلى ذلك.
4. التركيبة وفقًا لعنصر الحماية 13؛ حيث يعاني الخاضع الثديي للعلاج من ضمور العضلات
‎.muscular dystrophy 5‏
5. تركيبة تشتمل على الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني ‎ly recombinant‏ لأي من عناصر الحماية 4-1 لعلاج اعتلال م-سركوجليكان ‎B-‏ ‎sarcoglycanopathy‏ في كائن ثديي في حاجة إلى ذلك.
16. التركيبة ‎Lag‏ لعنصر الحماية 15؛ حيث يعاني الخاضع للعلاج من ضمور العضلات ‎muscular‏
‎.dystrophy‏
‏7. تركيبة تشتمل على الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني ‎Gg recombinant‏ لأي من عناصر الحماية 4-1 لزيادة القوة العضلية ‎muscular force‏ في 0 كائن ثديي يعاني من ضمور العضلات ‎-muscular dystrophy‏
8. تركيبة تشتمل على الناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-associated virus‏ الناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني ‎lg recombinant‏ لأي من عناصر الحماية 4-1. 5 19. التركيبة ‎Gy‏ لعنصر الحماية 18 ‎Cua‏ يكون ضمور العضلات ‎muscular dystrophy‏ عبارة عن ضمور عضلات ‎baba‏ لأطراف ‎.limb-girdle muscular dystrophy‏
0. التركيبة ‎Wy‏ لعنصر الحماية 17 حيث تشتمل أيضًا على ناقل الفيروس الغدي ‎Adeno-‏ ‎associated virus‏ ثان ناتج عن ‎sage‏ الاتحاد الجيني ‎recombinant‏ يتضمن متوالية النوكليوتيد
‎.miR-29 nucleotide miR-29 0‏
1. التركيبة ‎Gag‏ لعنصر الحماية 20 حيث يشتمل الناقل الثاني للفيروس الغدي الناتج عن عودة الاتحاد الجيني ‎(rAAV) recombinant Adeno-associated virus‏ على متوالية النوكليوتيد ‎nucleotide‏ المذكورة في المتوالية بهوية رقم : 9 أو متوالية النوكليوتيد ‎nucleotide‏ المذكورة في 5 المتوالية بهوية رقم: 8.
— 8 7 —
2. التركيبة وفقًا لعنصر الحماية 13 حيث يتم صياغتها للحقن في العضل ‎intramuscular‏ ‎injection‏ أو الحقن في الوريد ‎-intravenous injection‏
3. التركيبة ‎Lig‏ لعنصر الحماية 22 التي .يتم صياغتها للإعطاء الجهازي ‎systemic‏
‎.administration ~~ 5‏
4. التركيبة ‎Lig‏ لعنصر الحماية 23 حيث يكون الإعطاء الجهازي ‎systemic administration‏ عبارة عن إعطاء بطريق غير الجهاز الهضمي ‎parenteral administration‏ عن طريق الحقن أو التسريب أو الغرس . 10
5. التركيبة وفقًا لعنصر الحماية 16 التى تتم صياغتها للحقن داخل العضل أو الحقن داخل الوريد.
6. التركيبة ‎Lay‏ لعنصر الحماية 25 والتي تتم صياغتها للإعطاء الجهازي ‎systemic‏ ‏20010150180110 15
7. التركيبة ‎Gig‏ لعنصر الحماية 26 حيث يكون الإعطاء الجهازي ‎systemic administration‏ عبارة عن إعطاء بطريق غير الجهاز الهضمي ‎parenteral administration‏ عن طريق الحقن أو التسريب أو الغرس . 0 28. التركيبة ‎Gd‏ لعنصر الحماية 17 التي تتم صياغتها للحقن داخل العضل أو الحقن داخل الوريد.
9. التركيبة ‎Gay‏ لعنصر الحماية 28 والتي تتم صياغتها للإعطاء الجهازي ‎systemic‏ ‏20010150180110
30. التركيبة ‎Lig‏ لعنصر الحماية 29 حيث يكون الإعطاء الجهازي ‎systemic administration‏ عبارة عن إعطاء بطريق غير الجهاز الهضمي ‎parenteral administration‏ عن طريق الحقن أو
— 9 7 — ا لتسريب ‎i‏ و ا لغرس .
حيو م 317 ينيم كلل“ ‎“Pr wes oo‏ صن اا الشكل ‎iy‏ ‏ا ا 0 سسا لا + ل ل ا ل ل ‎ae‏ ل ان ‎EAA‏ سح ا ل ‎Ba‏ ‎Co EE EE TE aE Le‏ ب تي ‎mea‏ ل ‎Mama‏ ‏الشكا أب
— 8 1 — « » “© { » J i £ 0 ال 3 ‎XY‏ 8 ا 1 : سموووسسسىي اال ا ا ‎rr xX‏ ل
‎a...‏ الشكل ١د‏ الشكل ١ج‏
بين با ‎J‏ » .1 ©« »2 جع ‎o‏ ‏8 : “ ‎NA \ .‏ ‎N‏ \ ‎N\A 3 NE‏ ب" م ات 3 ‎c‏ ‏اا للم ‎rT‏ 7 2 & § ‎SS NE amas‏ الشكل ‎iY‏ ‎aaa Lae aaa‏ ‎HEE aa aE Rha ON‏ ‎Ta Na SR‏ ‎Tha‏ ا ‎La‏ ‎ee Naa aa‏ ‎FE a ae Ree Na‏ ال ا ا ‎aaa‏ ‎EE ERE SR‏ 5 ال ‎Raa Da Se‏ ‎REE NE.
ERE‏ ل ل ‎rT aE ae‏ ل ا د اا ‎SNE EN‏ ‎x‏ ‏| يب ‎Is‏ ‏! ; ¥ -
— 8 3 —
. . . gia Fa : “oy 1 EWC IN LPH ‏ل رما‎ CE wp « gr EEE WY Sofiia الشكل "د الشكل "ج 8 ِ 0 يي 1 = ل" ايسا الشكل ‎AY‏
الل 3 ٍ ض ‎wry wy or i‏ > نا : . ‎J RR‏ ‎ox “3 > or ٍْ =‏ ا ‎RARE‏ » م = = . . 3 ل 0 8 1 : ' جيم "[ 8 000 ] { . ‎SEE‏ 1 . ان نا : ”لد العام ‎“O07‏ ‎d‏ مل رق “ا الشكل ‎bog Y‏ 1“ كل ‎ve‏ { مل ‎whe‏ 3 ‎١ ow J”‏ ير ٍ ايحي فى 5 ‎oe‏ اا ل يي ‎Wy wr‏ علا مي ا المي ل توج“ ‎Fat = TM 3‏ = اال ‎Ly] Age‏ تسسا يتتسل ‎LT‏ ‏8# 6ح 4 + ‎SOT‏ ‏ب ‎iB‏ § ب الشكل اج
£3 Pr © Lu J Bm Ba I Ee ‏وا ال ل ل ا ل ل‎ ed 2 RAE 2 BE HE RRS h 3 mmm 0 ‏اح ا‎ 3 & i 3 0 8 3 XN 2 SR 2 Rn BE IY 3 0 ‏ل‎ Taq al \ . 0 : Co ‏الحا‎ SEE N\ 4 wy ge LIE TE 1 ‏بط الشكل‎ J Sheed El 0 8 ‏عا ——— ل ل ل‎ SHEED ‏ا‎ ‎a a aay ‏لل‎ \ RR Ree ae Vad TRE RR ‏لي الا اج اما اتج الا ا ا ا‎ AR ‏جح‎ Ay t dh SR BT ER RA aes A 3 shan Sa RRR ‏ااا‎ AR RS ete] 3 ps a
Sta. ‏حا ام جح ل امش‎ Ro 3 Rs) ES BR ER ‏ال ا ته‎ 5 Baring? NRA SRE 3 Ta ae wae PE * ‏اع ا‎ ‏لإ ل ال ا ا ا 3 جا‎ > "ّ 5 5 J . RR AAR aaa a 3 - aE SN Erna RR ‏ا‎ ‎TA NB RAR RS RRR A NR a B.S SEER RR RR SE ASR A RO RR Re Bey ‏صر‎ & : i RN Rs SER 3 & RY ‏ا ا ا ا ا أ ا‎ ER CO ‏ا‎ ‎RD ‏ل الي جني م ا ا ل ا‎ RY SN ‏ا ا ا ا‎ aE ERR NER RRC ‏ا ا ال‎ «# wd ‏الشكل‎ ‎+
وا سب" ‎g:‏ موحت ان واه الات ا ا ‎SRE Re Ne‏ لكين لت حلي لحا .اليا لات ل ‎RRR ON‏ ا ا لا ل ل ل ا ل ا ل ال ل ل ‎ley‏ ال ا ا ل ‎i a RET‏ ا ‎ee Bs eats ees‏ ا ‎NIA SRR SRE‏ ل ‎Re tn SR‏ ا مي ل الما ‎ts SRR SAR Be ae‏ جر لحي الح ل ‎AR Ra VION SABA‏ ‎a Re SR RR RR‏ ا ل اا ‎RAR AAR ARRAS ARTO REAR SR‏ ا ا ات مت ا حر الح ‎SEAL SRR ATR ot‏ لل ا ا ا ل الي ا م كز مسي م ال رودت الي حم كا مح ل ال ا ا م ال ا ا ال ا اح ا ا ا ‎rR‏ ال م اي حي ‎RN‏ لماي لت الا ا .المت ا ا م ‎SE ER Tt tat SRA sea‏ الم م ع جروا ميت جحت لج جا اج اال ‎a TR RARE‏ ل اح يح ‎Rn‏ ‎AHR NRK MARY I MRI RSA AROS SERIE SIE ARENA‏ ا ل ا ‎ee BS‏ م حي مات ‎Se St‏ اج ال ‎ae AORN ARUN SIRS‏ ا ال ‎NR 0‏ تو سجن لو لك ا ‎SARA WRT RRs! ERR‏ ا ل ل ا ال ا ل ‎RE‏ ‎ay َ‏ اا ا لاي ل ‎a‏ ل الما مس ل ا م ا ال ل ل ل ال ا ل ا ا ا ‎MRR IDI‏ ل حي الم ا سن ا ا ا اتسيع يميا ت تحر عرسي ل تت ل ‎AER‏ يجري )المت و ةج لا جح ا .الم نج ني :دن وي و ا ل ل ل ا ال ا ا ا ا ‎NS TR I‏ ا ‎Ee Ra‏ ان سين ا ا ‎a‏ ‎a‏ م ل شا ا ار رن ا ا ‎NER‏ ل ا ل ل ا ات تن يي ات بلج الت ان ا ا ا ل ‎NEE SS Se SO‏ ا 1 ‎PR a Re aR. fn Se Sa CR‏ ‎GE Ra ne‏ الت ا ل ‎i‏ ‎RE RE a RR Ee‏ ‎RIA‏ يتارت جح ا ل ا ‎AR LE SIAR AR SU SRA ACIRERA CRY‏ ا ا ‎RR‏ ل الات ات ب ا لي ل ل ل ل ا ل ال ل ل ل ال ل الت ل ا مدب سني الت اما يت حت ب و ا ل ‎IC SAR CA SSIS Bs OUI RIMINI OIA‏ ا ‎ERE‏ ‎Ser SRE UR SLSR‏ ا ‎A SR SR SRR RES SERRE.‏ ‎SERRE EE TN‏ ...مياه الجر ‎I AR SCO RRR DR‏ ا ‎SH SCR SSRIS ERAS SRR | SRA: BR Se HS RR SRR‏ ‎mR TREE‏ ال ا ل ال ل ‎EN Sa‏ ‎I 0‏ الما ا ا ام ل ل ل ‎Et‏ عدج جمد موت ممم ممه ال ل ‎Ae a‏ ا ‎a Me Be SRE YS‏ ا ل ‎iat SEs 0‏ ا ل ل ا ل ل ل ‎Lp ated EE SH SS SABER BS SARK RENEE‏ ال ‎BE‏ ‏ل ا ا ‎SERS AR UNE SRK JL:‏ ل ةي ا ا ل 0 ا ا ‎Re‏ ا الل ا ل ا ا ل 09 ا ال ل ا ا ا ا اح ل ‎SERRA‏ | سا ا سح ل ‎eR‏ ا ا ا لاي م ل ا ا اس لج ‎I‏ ‏ل ا ا ل ا ا ‎RS RN‏ ل ال اح ‎BR‏ الح .اتيج ا اين ال 0 ل حا اس ا ا ا م ا ا ل م ل ل ا ال ا ا ا ا ال ‎NR‏ ‎a‏ ا ا التي ل سي ا مج الي ل ل ل ا اي ل تي ا اال ا ا ل حت الم ل ا ل ا ا ‎RR‏ ال ا انامح ال ا ‎AA‏ ‎RY‏ ‏8 1 ‎EE RR A‏ ل لج ل ااا 33 + \ «“ ‎ln errr, DER ARR‏ ‎RE‏ ل 0 ل 3 ‎a ng A EES SEEN 8‏ \ ب 1155 سس الى ‎or BE‏ امس ا ‎NY‏ ا ااا ‎Cy‏ ‎on wy a “ya”‏ ‎Ia a ¢ «© v1‏ ‎U‏ أ » 3 ‎١ J yx‏ الا % : ل ‎te‏ : ا ا 14
1 1 haa ‏غير‎ 18-513 KG ‏ا‎ NR SRE ‏الاق ا‎ ‏اللي ميت مم ل ا أ ل‎ 555 aE IN Erase ٠ ‏ل مجو‎ 1 ‏ل ا ا‎ ay ‏ال اما ب‎ es Rg Sa EER EA RR 2 AR EP RO ER CERRY Se Sas NEE Ne pe Ras aa REE NRE Rates 8 Te La Re RAR ERR SHR 8 SEAR 5555331331333 ‏لذج‎ RN Ra The Sa aaa Sl A RR a tate: RRR ‏.الما‎ SRR SEE ‏ا ا ا اا‎ DE ‏ا ل‎ ‏اج تي ل ا ا ا‎ a ‏ا ا ا‎ ‏ل‎ TN ashe OR RHR Ne RE SR ON SEER EES NR ER REN a BARRERA a Ray a Raa RR ea NR BE RARER REE ‏لامي‎ ٠ RERRR CE RE ER 30 SRR RRR an AE RR Ra ‏الاي‎ RRR AR RE RRR EA NEE a HEE aa aay ae EE _———. SRNR ‏ل‎ REE Re SY ae Re Re SEE aE EES ET EE So a PRE ER A >, I ‏ا‎ ‏ا‎ Re Naa Minas RRR A 5 ‏ل‎ RR RR 0 ERE ES SERRE RR RR ‏ا الا‎ RE RR Ra TR wo aaa LL Bae Ea a — RR TT RE Rania Na Nae Be ‏ا ا‎ REAR NE RR RE EEE 0 a ‏مد المت نج تا ا ااا اما‎ a a ‏الا انام ااا‎ funny ‏ا ا‎ NEE Re. a SRR RE SE a] RR RE RR a ER Re SNe Ee Hee ae SEN REN NE RR aah RR EN Has RENEE EE ER RR ER ‏لدت‎ RE RR A A Ra a oy A EE ARNE RR RRR 0 1 ‏ا‎ ‏ا‎ DR Chl 8 Taha RR en ‏انا ال اذ ل لا ب ام ا‎ a Re RR Re Nha SaaS.
Ei RI ‏الما نا اا‎ Ra Se eae EO Sse SR 1% te ant ad 1
ْ + ١ va i wlll 8 HEN ©
—_ 9 0 —_ 3 « 8 ‏ل‎ \ UL BE ‏اي‎ Co 8 st Bi ae 5] 0 0 1 0 | ‏ا د لأسي .ن.‎ ‏ااا ا اال‎ 1 ١ 1 5 . 0 ‏ا ب‎ 0 Ne ‏“ا "حك ثيك‎ Ey ya” SES Cg ET NET Va a { 3 or LY ‏الشكل أب الشكل‎
8 REE no No 8 \ NL a . TR aN RN Rais
LL . 5 EE 8 8 ‏ا‎ ‎SRR 8 NR 5 SEER — : LL 3 LN RR 8 ‏ا ا ا‎ Te ٍ ‏ا ا‎ ‏ب اا 1 ا‎ “po 0 = 0 5 Ra 8 EER NE NN RRS ¥ “7 ne LL a ‏ض‎ : XX J Ta eS ‏د‎ , ‏ض‎ : SY RNR nn RR 8 + ‏اج‎ ‎|ّ ٍ ‏ا ا‎ NL CC vo Pi Ra a NN . ‏ض‎ ِْ : 1s x 3 REY RR RRR 3 SER 0 0 ‏ض‎ x § ERA iE a
- . NR 8 ER RRR 0 ٍ a . = Le 8 a a 0 ‏ددر‎ : 8 . EER - ِ : oo a NR 0 ‏ا‎ SR Sa Sg Naas
’ . Lo « Fo a ) nee ; Pea ‏ض‎ ٍ ‏ا‎ ‏ا ا‎ a 3 & wn xR RRS NR oo oo a . NN 8 NER an 8 ND a TR a es 7 Ba 3 LX vo BE an TI “y 1 i a 5»
LL . Th Sh Jn a EN ys” ea Nan 7” 3 NN RN RR 8 a RR NN RN - : : N La ) { 1 ‏ا‎ SOE nih ‏مي‎ : i 0 ' ‏ون‎ ‏ض‎ 3 3 fon” “y x 5 3 A ‏ما‎ }
— 9 2 — iw Qo > » “Pas “fr Lo wR “ VEY af gay “gv ‏ير‎ “Pans TL eens wo ’ - ‏و‎ rn ‏الا‎ ‎ّ ‏ج‎ . 1 “ 2 5 ww ¥ ‏جد‎ ‎i » 8 ‏ع8‎ ‏الشكل ؟‎
— 9 3 — wr gt ‏ا ا‎ nnd ‏بس ا ض‎ “x ‏7ج « ف‎ ِ vi YJ i Le Ee ‏ا أ‎ EEE ae ee Ee a ‏ا‎ ‎ ‎٠١ ‏الشكل‎
‏المع م‎ i Wyo i { $ i Yo Fg” wg i { 44 ‏با ج مداخ‎ 5 J” i Oa $ ‎SEER‏ 5 ل ا ‎Ra RR KAR Se aBIY 1 SRR Ss as‏ ل ‎St ass Daan) ihe Reh RD SI A SR ER IRI‏ ‎HR‏ ا ل ل 5 ‎te CRA‏ ل 5 ل ا ا ‎a‏ ل : ل ا 1 ا 8 ‎I EA SIR a Rss hE‏ ‎RT A‏ ل ‎ACI 5: EB‏ ل ‎BR SSC‏ ال ‎ER SNe Ro oR HIT 8 Fh‏ ‎eA ee‏ ا ‎SR et‏ 1 ل ام ل ا 8 ‎{ER i Cho Se SR‏ ‎BK‏ ل 8 ‎FE Ris‏ ‎TERE Re LE seh Sa‏ 3 8 > الا اماد ل ا ل ا ا ل 5 ‎BE eee‏ معدي لمج الم ل ل ا ‎sy‏ ل ب > 8 ل ا ل ا ا ‎ee‏ ا ‎RRR eI Te BE tN‏ 3 5 8 3 3 فيه تك را اج جا 1 : 0 { : : : : : : إٍْ واي 1 ‎i‏ رخ أ : 1 { : ل 2 ‎ww J”‏ .> ¥ “ ار ‎iw‏ {
$ . + { ‎Yd Z i‏ { ‎EH eT‏ ص ‎Ra RAS‏ 0 ا ا م ل ا 8 8 ‎{ER RRs‏ ‎BE 5 $3 TT Te ee ee Bo XO‏ { 0 ا 2 ل ‎i ER‏ ‎ECR RR as a a Sr Sa 0‏ 1 0 8 8 ل ل ا 0 8 2 ل ل ل ‎Le SA ARI‏ ا ل ‎SR‏ 8 ال ل ‎ER‏ ‏ل ل الا 8 ‎ao‏ ‎a a‏ : ا ‎RR Aa‏ ال ‎Rant a CS SN‏ ا ال ل ا ل 5 ‎SOY‏ ل د ا ا ا 0 8 ‎Ea Gh EE TE‏ ‎2X ‎١١ ‏شكل‎
كرو ‎z‏ ‎ein aw = <x‏ جم ‎ofr ans “i‏ ‎wy TERR ORR III An SII 2 wy ] wt agp >‏ ‎ad 3‏ 2 ‎Fw 5 Ean‏ ‎Ta‏ الشكل ‎NY‏ ‎"ry he‏ ‎iE‏ ممت ااا 58 ‎NS‏ ‎sy‏ ~ = مس لحو مسحت : ممم ‎AEE‏ ميب وي 8 ‎rea‏ ات عي ال ‎CUE YE ra ma a a aE a‏ ‎TT‏ + اا و 2 2 ال من 770 50 ‎Te‏ ‎rE FE‏ ‎es si a —‏ ا و ا ا الشكل ١ج‏ ل ‎vy‏ ‏اا أ — » اا احا اه ل "م ‎CURLER Ee Tae cS‏ ‎Sis‏ ل ‎rear ba FE EE‏ ا ا ‎EE‏ ل 5 - ‎gr : rr‏ > : ‎he! . : EEE Seas‏ اك ‎al ب١7 Jedd!‏ ‎or‏ ‎Spr‏ ‏!2 ‏الشكل ‎YY‏
سل ال
‎oy >‏ 37 بو« ل \ ب صن عي 7 ‎w‏ ‏تج ‎sy . wy‏ ص أ الي . ‎vey‏ فيا 7 + ضر ا 8 + : ‎vad 0 CE wd Tg we Rt‏ ‎i FERC “ 1 i IX > on‏ م 3 > ‎Soy oR‏ : ‎١‏ يي 5 > ‎af £ ¥ Nn = Wo < > § bs EX er 3 id i § NEN‏ > ‎want § UN‏ فى ‎ST etd‏ ا ‎cond fo‏ ‎wa ES 3 aE FOR‏ ل احا ‎HEE‏ ‎SO‏ اا اا لحا ل ‎EE pes SE eee‏ مسي مج ا لا : اماج توي ‎Ar Dh‏ ‎wo P wy i= wap i‏ الشكل 7١ج‏ ‎hd 7 ppt Ye”‏ نب
‎er 3 > + Fa 5
‎3 - od ‏اتا‎ i ‏اسلا‎
‎" ب٠٠‎ i ‏ا‎ SR ed a
‎wT i nN el | ‏اج‎ 7 | nl A Ni . . ‏ال‎ i ] 1 ١ rn at re? CF TE ap ‏جيه‎ orb? “rg ‏ب‎ ‎د١1 ‏الشكل‎
N 8 ) ‏كن‎ ¥ ¥ ‏تح‎ Say Lo Ca X RN RNa Na 3 LL x x RR LL LL . LL ‏ا اا ا ا‎ ‏حاتت احا‎ NE ‏ا ل‎ LL Na a LL LN a SHEN lh a NN LL “yf” a fee ‏م سس‎ ‏ا ااا اا‎ ِ ‏الل اا ا‎ ni TEN ig RRR ON 8 8 SHEEN RR HR 2 RR 8 : aaa 8 BR 0 3 8 8 ‏ا ا اا الا الجا م‎ ‏م ال‎ ‏ا ا‎ 1١٠ 4 ‏الشكل‎ ‎«© 3 wn ‏جح‎ we \ 4 3 $x Xn FE ‏مساق الى‎ nN 0" TR < 9 : ‏وغ‎ 3 ’ 4 8 ‏ا 0 | م "أ"‎ 0 mlm ml « 88 oi \ a 9# Ane ser J wi? ‏كل م تخ ل‎ ‏ب‎ YE ‏الشكل‎
— 9 9 — ‏ف‎ 7 or > << a3 £4 ‏لاو‎ ‎7 ‏ع أ‎ ‏ب ل أ‎ ¢ © J» ‏وق‎ ¥ @ no 1 - ¥ { gry veers > deg an ¢ 3 a» 1 ‏#جممممممممممممر‎ 0" = « v ‏نبب لمعا لب‎ ٍ ٍ bade . ‏ا ٍ ع‎ J € 3 ‏و‎ SM 8 8 WE RU 48 ‏ع 7 حم‎
TT. ‏ا‎ Bo. EE Hah 1 a Yo J IM ST Ee HW 1 0 0 a RRR RE ‏ل‎
‎ْ . Ee “goa le HERR veo 1 top il a § Ee 0 ‏ا‎ or Tg
\ . 5 ْ an 1 ‏يا‎ ‎+ ‏ل‎ 3 2 ! i £ : ‏ب‎ 1 . [4H £ ‏ثب‎ 3 1 an Ys ١٠١ ‏الشكل‎
‎N‏ ‎ro 3‏ , 0 سيم . ‎feo do Ld 3 Ic‏ : | | ال | ‎[HS‏ 7 “ رركي قر رقي يقر ا ركي ‎i Me™ TE‏ وده ‎z‏ 0 ‎Tv 2 >>»‏ 4 ‎GT TECCTOCACA TET TCC AAACACTIREC TEIGAT TAL‏ ل ا ل ا ل اا قا ‎FS AE ALBA AREAS‏ وما حيط ولع ‎AS ANSE‏ رده حي رمعا ديعا جد م ل ا ‎RA‏ ل اتات تتا ا ‎ER ENE‏ ا لا لا ا حا لتاقي بتعا انا لبا لقح لخي 1 ا تت ‎SIECIEE RA TICAMEEEU IAC TTT AGG AGA RA TCT GH TACT AMA CTGAATACCET‏ ال ا ا الشكل ‎١١‏
“pp ‏اق م“‎ PEN 0 werd a Ten . ‏ا و‎ NN Yor Sa Jom 1B ‏ذ‎ 0 11 0 ‏اه ا - ا(‎ ‏ضع حدس‎ ‏يج م‎ 5” RE Cre” | ‏نا‎ ‏ب“ ب 5 3 باد‎ P : 1 ‏ا‎ ِ “opp” ‏ب‎ oz “part wn i \ ny Lal ef NE w 8 “ t 7 ‏ا | 7 ¢ ّ ا‎ : 8 ‏يي ايك الهج اي‎ ey VY ‏الشكل‎
ام م ٍ ته بي الشكل ‎VA‏
: ‏ا‎ Raa Si J Pt al 0 al, + Pid 3 oa SET iM ; bs 5 RCRA LN Ni RR ON RR ra ‏الشكل‎ ‎“opr ‎3 « wo PB t = 11 “TYE” ‏ورم‎ ‏الشكل 195ب‎
‎we 5 7‏ " ض ‎i‏ — سه نيا ‎Le Tes Sve‏ ‎TTT er nl‏ 4 ‎a‏
“p47 “ya” Fa, ws 13 ‏اننا‎ ١ ‏[©-"-“ل -اإاكننتت»‎ - 8 ‏لح‎ 1+ or ote 0 ‏ص" اس ل ا‎ 0 ‏لل ع‎ ‏لاي‎ TT Ts ‏الل‎ ee ١ ‏اا ام‎ 0 Seng . DMM _ o¥ = = 3 cop YE ‏ع ب‎ En {yy ‏الشكل‎ ‎ey “te Yorn Ais . ‏ان لاسي لحك‎ A + ‏الصيا+ا+ا#---ب‎ 9 0 Ly * ‏تت‎ Fear mm te” 0 «» ‏ا يي‎ fren T = To ‏ب بو ا ا وو‎ 0 wom > 8 * ‏“ل‎ w “Tw J” ‏آب‎ ١ Jedd)
“a i » oo) 7 ‏"بره"‎ ‎CIENT - ‏ا لأحم»‎ gig ‏ا لد‎
VE . Tm © Wein 6 ‏ا خط‎ RRS HE ‏ل‎ ER RR “3 \ a BB ‏ال 7 ا د‎ 1 \ ‏لأ‎ Bo a os ewes 0000-0 Ng \ 8 da 8 a ‏ا‎ ‎oy 0 ‏ما م ا‎ met ‏ا‎ « be Ss \ x = TE ‏ال 3 * جد م‎ “ya” " ١ ‏كن‎ ‎© ١ ‏ز‎ 0 v J u 3 7 07 5 or T ‏م‎ ١ ‏ا صن‎ V3 << ١ A » te 3 ‏شن‎ aM iy ¥ I pay ry Cond ‏الشكل‎
الحاضهة الهيلة السعودية الملضية الفكرية ‎Swed Authority for intallentual Property pW‏ ‎RE‏ .¥ + \ ا 0 § ام 5 + < ‎Ne‏ ‎ge‏ ”بن اج > عي كي الج دا لي ايام ‎TEE‏ ‏ببح ةا ‎Nase eg‏ + ‎Ed - 2 -‏ 3 .++ .* وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها ‎of‏ سقوطها لمخالفتها ع لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف ع النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية. »> صادرة عن + ب ب ‎٠.‏ ب الهيئة السعودية للملكية الفكرية > > > ”+ ص ب ‎101١‏ .| لريا ‎1*١ uo‏ ؛ المملكة | لعربية | لسعودية ‎SAIP@SAIP.GOV.SA‏
SA518400245A 2016-04-15 2018-10-15 توصيل ناقل فيروس مرتبط بالغدة لـ b - سركوجليكان وميكرونا-29 وعلاج ضمور العضلات SA518400245B1 (ar)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662323333P 2016-04-15 2016-04-15
US201662433548P 2016-12-13 2016-12-13
PCT/US2017/027583 WO2017180976A1 (en) 2016-04-15 2017-04-14 Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and microrna-29 and the treatment of muscular dystrophy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SA518400245B1 true SA518400245B1 (ar) 2022-11-25

Family

ID=60042261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SA518400245A SA518400245B1 (ar) 2016-04-15 2018-10-15 توصيل ناقل فيروس مرتبط بالغدة لـ b - سركوجليكان وميكرونا-29 وعلاج ضمور العضلات

Country Status (27)

Country Link
US (3) US11358993B2 (ar)
EP (2) EP4407035A2 (ar)
JP (2) JP7079733B2 (ar)
KR (1) KR102502091B1 (ar)
CN (2) CN117384964A (ar)
AU (2) AU2017250756B2 (ar)
BR (1) BR112018071167A2 (ar)
CA (1) CA3021057A1 (ar)
CO (1) CO2018012082A2 (ar)
DK (1) DK3442600T5 (ar)
ES (1) ES2979174T3 (ar)
FI (1) FI3442600T3 (ar)
HR (1) HRP20240580T1 (ar)
HU (1) HUE066442T2 (ar)
IL (1) IL262262B2 (ar)
LT (1) LT3442600T (ar)
MA (1) MA44681A (ar)
MX (2) MX2018012605A (ar)
MY (1) MY195439A (ar)
PL (1) PL3442600T3 (ar)
PT (1) PT3442600T (ar)
RS (1) RS65490B1 (ar)
SA (1) SA518400245B1 (ar)
SG (1) SG11201809029RA (ar)
SI (1) SI3442600T1 (ar)
WO (1) WO2017180976A1 (ar)
ZA (1) ZA201806863B (ar)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
EP3020403A1 (en) 2014-11-14 2016-05-18 Universitat de Valéncia Compounds for the treatment of myotonic dystrophy
WO2017066497A2 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
MA45477A (fr) 2016-04-15 2019-02-20 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administration à vecteurs de virus adéno-associé de microarn-29 et micro-dystrophine pour traiter la dystrophie musculaire
LT3442600T (lt) * 2016-04-15 2024-05-27 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Su adeno virusu susijusio viruso vektoriaus iš β-sarkoglikano ir mikro- rnr-29 pristatymas ir raumenų distrofijos gydymas
CA3079416A1 (en) * 2017-10-20 2019-04-25 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Methods and materials for nt-3 gene therapy
SG11202012450QA (en) * 2018-06-18 2021-01-28 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Adeno-associated virus vector delivery of muscle specific micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
US20210277362A1 (en) * 2018-06-29 2021-09-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2a
EP3598978B1 (en) 2018-07-26 2024-05-29 EXOFIX S.r.l. Fibroadipogenic progenitor-derived exosomes for regeneration of dystrophic muscles
US20220119489A1 (en) * 2019-01-25 2022-04-21 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating muscular dystrophy and related disorders
JP2022523038A (ja) * 2019-02-02 2022-04-21 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ －オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 遺伝子置換及び抗炎症を介したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する一段階遺伝子療法
US20230241252A1 (en) 2019-02-26 2023-08-03 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
HUE066215T2 (hu) * 2019-08-21 2024-07-28 Res Institute At Nationwide Alfa-szarkoglikán bevitele adenoasszociáltvírus-vektorral és izomdisztrófia kezelése
EP4117783A4 (en) * 2019-12-16 2024-08-21 Res Inst Nationwide Childrens Hospital COMPOSITIONS AND METHODS FOR RESTORING AND MAINTAINING DYSTROPHIN-ASSOCIATED PROTEIN COMPLEX (DAPC)
EP4219726A1 (en) 2021-10-15 2023-08-02 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Self-complementary adeno-associated virus vector and its use in treatment of muscular dystrophy
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
CN118045206B (zh) * 2024-04-12 2024-07-05 四川至善唯新生物科技有限公司 一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ES2220923T3 (es) 1993-11-09 2004-12-16 Medical College Of Ohio Lineas celulares estables capaces de expresar el gen de replicacion del virus adeno-asociado.
DE69433592T2 (de) 1993-11-09 2005-02-10 Targeted Genetics Corp., Seattle Die erzielung hoher titer des rekombinanten aav-vektors
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
CA2207927A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
WO1997008298A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
CA2230758A1 (en) 1995-09-08 1997-03-13 Genzyme Corporation Improved aav vectors for gene therapy
US5672694A (en) * 1995-10-24 1997-09-30 University Of Iowa Research Foundation β-sarcoglycan nucleic acid sequence, and nucleic acid probes
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
AU723497C (en) 1996-09-06 2001-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
DK1944362T3 (en) 1997-09-05 2016-01-25 Genzyme Corp Fremgangsmåder til fremstilling af hjælpevirusfri præparater med høj titer af rekombinante AAV-vektorer
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
JP4520569B2 (ja) 2000-02-18 2010-08-04 照彦 豊岡 拡張型心筋症の遺伝子治療剤
AU2001255575B2 (en) 2000-04-28 2006-08-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US6962815B2 (en) 2001-01-05 2005-11-08 Children's Hopital Inc. AAV2 vectors and methods
US20040126762A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer
US20030225260A1 (en) 2002-04-30 2003-12-04 Snyder Richard O. Production of recombinant AAV virions
US7858367B2 (en) 2002-04-30 2010-12-28 Duke University Viral vectors and methods for producing and using the same
US7883858B2 (en) 2005-01-27 2011-02-08 Institute For Systems Biology Methods for identifying and monitoring drug side effects
AU2006304605A1 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
AU2007284651B2 (en) 2006-08-09 2014-03-20 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
CN101711164B (zh) 2007-01-18 2014-06-04 密苏里-哥伦比亚大学 可修复肌纤维膜中的神经元型一氧化氮合酶的合成小/微-抗肌萎缩蛋白基因
CN101896186A (zh) 2007-10-26 2010-11-24 莱顿教学医院 对抗肌肉病症的方式和方法
US8632764B2 (en) 2008-04-30 2014-01-21 University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
US8236557B2 (en) 2008-05-28 2012-08-07 University Of Missouri-Columbia Hybrid-AAV vectors to deliver large gene expression cassette
US8729041B2 (en) * 2008-12-03 2014-05-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating hepatic neoplasia
WO2013075008A1 (en) 2011-11-16 2013-05-23 University Of Florida Research Foundation Inc. Aav dual vector systems for gene therapy
US9434928B2 (en) 2011-11-23 2016-09-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
ES2752191T3 (es) * 2012-02-17 2020-04-03 Childrens Hospital Philadelphia Composiciones y métodos con vectores de AAV para la transferencia de genes a células, órganos y tejidos
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
US9624282B2 (en) 2012-11-26 2017-04-18 The Curators Of The University Of Missouri Microdystrophin peptides and methods for treating muscular dystrophy using the same
FR3004463A1 (fr) * 2013-04-11 2014-10-17 Genethon Systeme d'expression pour une therapie genique selective
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
SG11201605906UA (en) 2014-01-21 2016-08-30 Univ Bruxelles Muscle-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof
JP6202701B2 (ja) 2014-03-21 2017-09-27 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及びプログラム
EP2960336A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Genethon Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
LT3442600T (lt) * 2016-04-15 2024-05-27 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Su adeno virusu susijusio viruso vektoriaus iš β-sarkoglikano ir mikro- rnr-29 pristatymas ir raumenų distrofijos gydymas
AU2021293197A1 (en) * 2020-06-15 2023-02-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery for muscular dystrophies

Also Published As

Publication number Publication date
EP3442600A1 (en) 2019-02-20
PT3442600T (pt) 2024-05-09
CA3021057A1 (en) 2017-10-19
HUE066442T2 (hu) 2024-08-28
CN117384964A (zh) 2024-01-12
JP2022084940A (ja) 2022-06-07
WO2017180976A1 (en) 2017-10-19
DK3442600T5 (da) 2024-09-16
HRP20240580T1 (hr) 2024-07-19
MX2018012605A (es) 2019-07-04
KR20180137511A (ko) 2018-12-27
FI3442600T3 (fi) 2024-05-14
KR102502091B1 (ko) 2023-02-20
LT3442600T (lt) 2024-05-27
EP3442600B1 (en) 2024-03-13
MA44681A (fr) 2019-02-20
JP7079733B2 (ja) 2022-06-02
ZA201806863B (en) 2019-12-18
US20240182533A1 (en) 2024-06-06
JP7390426B2 (ja) 2023-12-01
AU2021203044B2 (en) 2023-02-09
AU2021203044A1 (en) 2021-06-10
KR102502091B9 (ko) 2023-04-17
CO2018012082A2 (es) 2019-02-08
EP3442600A4 (en) 2019-10-09
JP2019513399A (ja) 2019-05-30
ES2979174T3 (es) 2024-09-24
IL262262B2 (en) 2023-10-01
IL262262A (en) 2018-11-29
AU2017250756A1 (en) 2018-11-01
SG11201809029RA (en) 2018-11-29
RS65490B1 (sr) 2024-05-31
US20220251156A1 (en) 2022-08-11
EP4407035A2 (en) 2024-07-31
MX2022003857A (es) 2022-05-26
PL3442600T3 (pl) 2024-07-08
SI3442600T1 (sl) 2024-08-30
DK3442600T3 (da) 2024-05-13
CN109121395B (zh) 2022-08-09
US20190202880A1 (en) 2019-07-04
US11358993B2 (en) 2022-06-14
CN109121395A (zh) 2019-01-01
BR112018071167A2 (pt) 2019-02-05
IL262262B1 (en) 2023-06-01
MY195439A (en) 2023-01-21
AU2017250756B2 (en) 2021-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SA518400245B1 (ar) توصيل ناقل فيروس مرتبط بالغدة لـ b - سركوجليكان وميكرونا-29 وعلاج ضمور العضلات
EP3194600B1 (en) Compositions and methods for treatment of muscular dystrophy
CA2693178C (en) Myostatin inhibition for enhancing muscle and/or improving muscle function
EP4324845A2 (en) Methods and pharmaceutical composition for the treatment and the prevention of cardiomyopathy due to energy failure
Prasad et al. A single direct injection into the left ventricular wall of an adeno‐associated virus 9 (AAV9) vector expressing extracellular superoxide dismutase from the cardiac troponin‐T promoter protects mice against myocardial infarction
KR20190008237A (ko) Ii형 점액다당류증의 치료를 위한 유전자 요법
JP2022523766A (ja) Ｇｒｎ関連成人発症性神経変性の治療のための組換えアデノ随伴ウイルス
TW202140781A (zh) 有用於治療gm1神經節苷脂症之組成物
JP2021521782A (ja) デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための組成物及び方法
US20240050521A1 (en) Compositions for treating friedreich&#39;s ataxia
JP2011019446A (ja) 筋変性疾患の病態モデル動物およびその製法
JP2024504085A (ja) 筋ジストロフィーを治療するための方法および組成物
KR20210148101A (ko) 폴리뉴클레오티드
WO2024188913A1 (en) Induction of immune tolerance by aav vector comprising the combination of a liver detargeted capsid and a tandem liver-muscle specific promoter
Kim et al. Sarcolemmal nNOSµ targeting in mdx mice improves muscle function and restores dystrophin complex proteins via α-syntrophin
EA044609B1 (ru) Доставка бета-саркогликана и микрорнк-29 вектором на основе аденоассоциированного вируса и лечение мышечной дистрофии