KR102502091B1 - β-사르코글리칸 및 마이크로RNA-29의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달 및 근이영양증의 처리 - Google Patents

β-사르코글리칸 및 마이크로RNA-29의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달 및 근이영양증의 처리 Download PDF

Info

Publication number
KR102502091B1
KR102502091B1 KR1020187032688A KR20187032688A KR102502091B1 KR 102502091 B1 KR102502091 B1 KR 102502091B1 KR 1020187032688 A KR1020187032688 A KR 1020187032688A KR 20187032688 A KR20187032688 A KR 20187032688A KR 102502091 B1 KR102502091 B1 KR 102502091B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
muscle
delete delete
mice
aav vector
recombinant aav
Prior art date
Application number
KR1020187032688A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180137511A (ko
KR102502091B9 (ko
Inventor
루이스 로디노-클라파크
제리 알. 멘델
Original Assignee
더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 filed Critical 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
Publication of KR20180137511A publication Critical patent/KR20180137511A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102502091B1 publication Critical patent/KR102502091B1/ko
Publication of KR102502091B9 publication Critical patent/KR102502091B9/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Abstract

본 명세서에는 β-사르코글리칸을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터, 및 근이영양증를 앓고 있는 포유류 피험체에서 섬유증을 감소 또는 예방하기 위한 상기 재조합 벡터의 사용 방법이 기재되어 있다. 또한, 근이영양증을 앓고 있는 포유류 피험체에게 β-사르코글리칸 및 miR-29c를 발현하는 AAV 벡터(들)을 투여하는 단계를 포함하는 병용 요법도 기재되어 있다.

Description

β-사르코글리칸 및 마이크로RNA-29의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달 및 근이영양증의 처리
본 출원은 2016년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 제62/323,333호 및 2016년 12월 13일자로 출원된 미국 가출원 제62/433,548호의 우선권 이익을 주장하며, 이들 모두는 본원에서 참조로서 포함된다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 통합
이 응용 프로그램은 공개 자료의 별도 부분으로 컴퓨터로 읽을 수 있는 형식의 서열 목록을 포함하며, 이 목록은 전체적으로 참조용으로 포함되며, 다음과 같이 식별된다. [파일 이름: 50622A_Seqlisting.txt; 크기: 21,466 바이트, 2017 년 4 월 13 일 생성).
발명의 분야
β-사르코글리칸을 발현하는 AAV 벡터와 같은 처리 벡터, 및 근이영양증을 앓고 있는 피험체에서 섬유증을 감소시키고 예방하기 위해 이들 벡터를 사용하는 방법이 기재되어 있다. 본 발명은 또한 근이영양증으로 고통받는 환자에서 섬유증을 감소시키고 예방하기 위해 β-사르코글리칸을 발현하는 제1 AAV 벡터 및 miR-29를 발현하는 제2 AAV 벡터의 투여를 포함하는 병용 유전자 치료법을 제공한다.
지대형 근이영양증(Limb-girdle muscular dystrophy, GMD2E)는 β-사르코글리칸(SGCB)을 암호화하는 유전자의 돌연변이로 인해 기능 단백질의 손실을 일으키는 상염색체 열성 장애이다. 1 LGMD2E는 미국에서 비교적 흔하고 심각한 형태의 LGMD를 나타내며, 전세계적으로 1/200,000~1/350,000의 빈도로 보고되었다. (2) β-사르코글리칸의 부재는 만성 근섬유 손실, 염증, 지방 대체 및 섬유증을 수반한 진행성 근위축증을 유발하여, 모두 근육의 힘 및 기능을 약화시킨다. (3,4) 복합체로서 35~50 kD 크기의 ( α-, β-, γ-, δ-) 사르코글리칸(5)은 근육 활동 동안 기계적 스트레스로부터 보호해주는 근초에 안정성을 제공하는 모든 막관통 단백질이다. (3) LGMD2E의 3-사르코글리칸의 손실은 다양한 정도의 다른 사르코글리칸 단백질의 손실을 가져오며, 근막의 취약성에 기여하여 근섬유의 손실을 가져온다. 1) LGMD2E의 임상적 표현형이 가변됨에도 불구하고, 진단은 전형적으로 10세 이전에 이루어지고, 10대 중후반까지 보행의 상실이 발생한다. 1,6,7 환자는 혈청 크레아티닌 키나아제 (CK) 상승, 근위부 근력 약화, 보행 중 바닥 및 진행 시의 손실로 인한 어려움을 나타낸다. 심장 관련은 50%의 경우에서 발생한다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 복제-결핍 파르보바이러스이며, 단일 가닥의 DNA 게놈은 2개의 145개 뉴클레오티드 역방향 말단 반복부 (ITRs)를 포함하여 길이가 약 4.7kb이다. AAV에는 다수의 혈청형이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 수탁번호 NC_002077에서 제공되며; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank 수탁번호 NC_001401 및 Srivastava 등, J. Virol., 45:555-564 (1983)에서 제공되며; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 수탁번호 NC_1829에서 제공되며; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 수탁번호 NC_001829에서 제공되며; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁번호 AF085716에서 제공되며; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 수탁번호 NC_00 1862에서 제공되며; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 수탁번호 AX753246 및 AX753249에서 제공된다. AAV-9 게놈은 Gao 등, J. Virol., 78:6381-6388 (2004)에서 제공되며; AAV-10 게놈은 Mol. Ther., 13(1):67-76 (2006)에서 제공되며; AAV-11 게놈은 Virology, 330(2):375-383 (2004)에서 제공된다. AAV rh.74 게놈의 서열은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제9,434,928호에서 제공된다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡슐화/패키징 및 숙주 세포 염색체로의 통합을 유도하는 시스-작용 서열은 AAV ITR 내에 포함되어 있다. 3개의 AAV 프로모터 (상대적인 지도 위치로 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는, rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 리딩 프레임(reading frame)의 발현을 유도한다. (뉴클레오티드 2107 및 2227에서의) 단일 AAV 인트론의 차별적인 스플라이싱에 의해 결합된 2개의 rep 프로모터 (p5 및 p19)는, rep 유전자에서 4개의 rep 단백질 (rep78, rep68, rep52 및 rep40)을 생성시킨다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈 복제에 책임이 있는 다수의 효소 특성을 가지고있다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 대안적인 스플라이싱 및 비-컨센서스 번역 시작 부위는 3개의 관련된 캡시드 단백질의 생산에 책임이 있다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 지도 위치 95에 위치한다. AAV의 생애 주기 및 유전학은 Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129 (1992)에서 검토된다.
AAV는 예를 들어, 유전자 요법에서 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적으로 만드는 독특한 특징을 가지고 있다. 배양 중 세포의 AAV 감염은 비세포 변성이며, 인간과 다른 동물의 자연 감염은 침묵하고 무증상이다. 또한, AAV는 많은 포유류 세포를 감염시켜, 많은 상이한 조직들을 생체내에서 표적화할 수 있다. 또한, AAV는 천천히 분열하는 세포 및 비분열 세포를 형질도입시키고, 세포의 생존 기간 동안 본질적으로 전사적으로 활성인 핵 에피좀(염색체 외 요소)으로서 지속될 수 있다. AAV 프로 바이러스 게놈은 플라스미드에 복제된 DNA로 삽입되어, 재조합 게놈의 제조를 가능하게 한다. 또한, AAV 복제 및 게놈 캡슐화를 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되기 때문에, (복제 및 구조 캡시드 단백질, rep-cap을 암호화하는) 게놈의 내부 약 4.3kb의 일부 또는 전부가 외래 DNA에 의해 대체된다. AAV 벡터를 생성하기 위해, rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 그것이 매우 안정적이고 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 (수시간 동안 56℃ 내지 65℃에서) 아데노바이러스를 불활성화시키는 조건을 용이하게 견딜 수 있어, AAV의 저온 보존이 덜 중요해진다. AAV는 심지어 동결 건조될 수도 있다. 마지막으로, AAV에 감염된 세포는 과증식에 대한 내성이 없다.
다수의 연구에서 장기간 (> 1.5년) 재조합 AAV 매개 단백질 발현이 근육에서 입증되었다. Clark 등, Hum Gene Ther., 8:659-669 (1997); Kessler 등, Proc Nat. Acad Sc. USA, 93:14082-14087 (1996); 및 Xiao 등, J Virol, 70:8098-8108 (1996)를 참고하라. 또한, Chao 등, Mol Ther, 2:619-623 (2000) 및 Chao 등, Mol Ther, 4:217-222 (2001)도 참고하라. 또한, 근육이 고도로 혈관화되기 때문에, 재조합 AAV 형질도입은 Herzog 등, Proc Natl Acad Sci USA, 94:5804-5809 (1997), 및 Murphy 등, Proc Natl Acad Sci USA, 94:13921-13926 (1997)에 기술된 바와 같이, 근육내 주사 후 전신 순환에서 전이유전자 산물의 출현을 야기하였다. 더욱이, Lewis 등, J Virol, 76:8769-8775 (2002)은 골격근이 올바른 항체 글리코실화, 폴딩 및 분비에 필요한 세포 인자를 보유함을 입증하였는데, 이는 근육이 분비 단백질 치료제의 안정한 발현을 가능하게 한다는 나타낸다.
LGMD2E에 대한 새로운 치료 요법은 야생형 단백질을 영향을 받은 근육으로 회복시켜 근육 기능을 회복시키는 바이러스-매개 유전자 전달이다. 환자의 하위 집합이 심근 병증을 일으킬 수 있다는 점을 감안하면, (8, 9, 10, 13) 이것은 이러한 환자의 장기 관리로 고려되어야 할 것이다. 이전 보고서에서 Sgcb-null 마우스가 특징화되었다. Araishi 등 3은 메르코신(mercosin), 디스트로글리칸(dystroglycan) 및 디스트로핀(dystrophin)을 최소한으로 보존하면서 사르코글리칸 뿐만 아니라 사르간 모두의 손실을 수반하는 β-사르코글리칸-결핍 마우스를 개발하여, LGMD2E에서 볼 수 있는 임상상을 재현했다. 이 동물 모델의 조직학적 변화는 또한 골격근 섬유증의 중요성을 포함하여 임상적 대응을 위한 원형이기도 하다(14). Dressman et al. (25)는 rAAV2.CMV.SGCB를 사용하여 횡복근에 주입했다. 발현은 21개월 동안 지속되었으며, 근섬유는 재발성 괴사로부터 보호받았다. 전이 유전자 발현을 향상시키기 위한 자가-상보성 AAV의 사용, 골격근을 더욱 잘 표적화하기 위한 근육-특이적 프로모터 (20, 26), 및 인간 β-사르코글리칸 유전자 (hSGCB)의 최적화에 대해서도 또한 기술되어 있다.
LGMD 및 기타 근이영양증으로 고통받는 환자의 기능 향상에는 유전자 복원과 섬유증의 감소가 모두 필요하다. LGMD 및 다른 근이영양증의 더욱 효과적인 치료를 위해 유전자 복원 방법과 함께 할 수 있는 섬유증 감소 방법이 필요하다.
발명의 개요
본 명세서에는 β-사르코글리칸 유전자를 발현하는 유전자 치료 벡터, 예를 들어 AAV, 및 β-사르코글리칸을 근육에 전달하여 섬유증을 감소 및/또는 예방; 및/또는 근력 증강 및/또는 근이영양증을 앓고 있는 포유류 피험체에서 β-사르코글리칸 병증을 치료하는 방법이 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 LGMD2E에서 관찰된 유전자 결함을 해결하기 위해 β-사르코글리칸을 전달하는 유전자 치료 벡터, 및 섬유증을 더욱 억제하기 위한 miR-29를 전달하는 유전자 치료 벡터를 사용하는 병용 요법 및 접근법을 제공한다.
한 측면에서, β-사르코글리칸을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터가 본원에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, β-사르코글리칸을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, 서열번호 1의 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85% 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 일반적으로는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 일치하는 서열을 포함하며, β-사르코글리칸 활성을 보유하는 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, β-사르코글리칸을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, β-사르코글리칸을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 재조합 AAV 벡터는 베타-사르코글리칸을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 이는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 전형적으로는 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 더욱더 전형적으로는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 상기 단백질은 β-사르코글리칸 활성을 보유한다.
다른 측면에서, 엄격한 조건하에 서열번호 1의 핵산 서열 또는 이의 상보체와 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 기능적 β-사르코글리칸을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터가 본원에 기술된다.
용어 "엄격한(stringent)"은 당업계에서 통상 엄격한 것으로 이해되는 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 혼성화 엄격성은 주로 온도, 이온 강도 및 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 결정된다. 혼성화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 65-68 ℃에서의 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산 나트륨, 또는 42℃에서의 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산 나트륨 및 50%의 포름아미드이다. 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, NY) 1989)]을 참고하라. 보다 엄격한 조건 (예컨대, 고온, 낮은 이온 강도, 높은 포름아미드 또는 기타 변성제)을 사용할 수도 있지만, 혼성화 속도에 영향을 미칠 것이다. 데옥시올리고뉴클레오타이드의 혼성화와 관련한 추가의 예시적인 엄격한 혼성화 조건은, (14-염기 올리고머에 대해) 37℃, (17-염기 올리고머에 대해) 48℃, (20-염기 올리고머의 경우) 55℃, (23-염기 올리고머의 경우) 60℃에서, 6×SSC 0.05% 소듐 피로포스페이트로 세척하는 것을 포함한다.
비-특이적 및/또는 백그라운드 혼성화를 감소시키기 위한 목적으로, 기타 약제가 혼성화 및 세척 완충액에 포함될 수 있다. 0.1% 소혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 소듐 피로포스페이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, NaDodSO4, (SDS), 피콜, 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 초음파 처리된 연어 정자 DNA (또는 다른 비-상보성 DNA), 덱스트란 황산염이지만, 다른 적합한 제제도 또한 사용될 수 있다. 이들 첨가제의 농도 및 유형은 혼성화 조건의 엄격성에 실질적으로 영향을 미치지 않고 변경될 수 있다. 혼성화 실험은 일반적으로 pH 6.8-7.4에서 수행되지만, 통상의 이온 강도 조건에서 혼성화 속도는 pH와 거의 무관한다. Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation : A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (옥스포드, 영국)를 참고하라. 혼성화 조건은 이들 변수를 수용하고 상이한 서열 관련성의 DNA가 혼성체를 형성할 수 있도록 당업자에 의해 조정될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 재조합 AAV 벡터는 근육-특이적 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 근육-특이적 조절 요소는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF, 근육 크레아틴 키나아제(MCK), tMCK (절단된 MCK), 미오신 중쇄 (MHC), MHCK7 MHC 및 MCK의 혼성화 버전), C5-12 (합성 프로모터), 쥐 크레아틴 키나아제 인핸서 요소, 골격성 빠른-트위치(fast-twitch) 트로포닌 C 유전자 요소, 느린-트위치(slow-twitch)도 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 느린-트위치 트로포닌 I 유전자 요소, 저산소-유도성 핵 인자, 스테로이드-유도성 요소 또는 글루코코르티코이드 반응요소 (GRE)를 포함한다.
일부 구현예에서, 근육-특이적 프로모터는 MHCK7 (서열번호 4)이다. 본원에 기재된 예시적인 rAAV는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pAAV.MHCK7.hSCGB이고; MCHK7 프로모터는 뉴클레오티드 130-921에 걸쳐 있고, SV40 키메라 인트론은 뉴클레오티드 931-1078에 걸쳐 있고, β-사르코글리칸 서열은 뉴클레오티드 1091-2047에 걸쳐 있고, 폴리 A는 뉴클레오티드 2054-2106에 걸쳐 있다.
일부 구현예에서, 근육-특이적 프로모터는 tMCK (서열번호 6)이다. 본원에 기재된 예시적인 rAAV는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pAAV.tMCK.hSCGB이고; tMCK 프로모터는 뉴클레오티드 141-854에 걸쳐 있고, SV40 키메라 인트론은 뉴클레오티드 886-1018에 걸쳐 있고, β-사르코글리칸 서열은 뉴클레오티드 1058-2014에 걸쳐 있고, 폴리 A는 뉴클레오티드 2021-2073에 걸쳐있다.
AAV는 임의의 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 및 AAV rh.74일 수 있다. 슈도타입 rAAV의 생산은, 예를 들어 WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV도 또한 고려된다. 예를 들어 Marsic et al., Molecular Therapy, 22 (11): 1900-1909 (2014)를 참고하라.
본원에 기재된 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물도 또한 고려된다.
본원에 기재된 임의의 재조합 AAV 벡터로 형질 감염된 세포를 배양하고, 상기 형질전환된 세포의 상등액으로부터 재조합 AAV 입자를 회수하는 것을 포함하는, 재조합 AAV 벡터 입자의 생산 방법이 또한 제공된다. 본원에 기재된 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자도 또한 고려된다.
이를 필요로 하는 포유류 피험체에서 섬유증을 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 이와 관련하여, 상기 방법은 본원에 기술된 AAV 벡터 (또는 본원에 기재된 AAV 벡터를 포함하는 조성물)의 치료 유효량을 포유류 피험체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 포유류 환자는 근이영양증을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 AAV 벡터 (또는 본원에 기술된 AAV 벡터를 포함하는 조성물)의 투여는 피험체의 골격근 또는 심장 근육에서 섬유증을 감소시킨다. 이들 방법은 miR29C를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "근이영양증(muscular dystrophy)"은 근력 및 근육 부피가 점차적으로 감소하는 질환을 말한다. 근이영양증의 비제한적 예로는, 베커 근이영양증(Becker muscular dystrophy), 경골 근이영양증(tibial muscular dystrophy), 두시헨 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 에머리-드레이프스 근이영양증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 상안 견갑상완 근이영양증(facioscapulohumeral muscular dystrophy), 사르코글리칸 병증(sarcoglycanopathy), 부분적인 LAMA2 결핍에 의한 선천성 근이영양증, 메로신-결핍 선천성 근이영양증, 1D형 선천성 근이영양증, 후쿠야마 선천성 근이영양증, 지대형 1A 근이영양증, 지대형 2A 근이영양증, 지대형 2B 근이영양증, 지대형 2C 근이영양증, 지대형 2D 근이영양증, 지대형 2E 근이영양증, 지대형 2F 근이영양증, 지대형 2G 근이영양증, 지대형 2H 근이영양증, 지대형 2I 근이영양증, 지대형 2I 근이영양증, 지대형 2J 근이영양증, 지대형 2K 근이영양증, 지대형 1C 근이영양증, 단순 수포성 표피박리증에 의한 강직 척추 근이영양증(rigid spine muscular dystrophy with epidermolysis bullosa simplex), 눈인두형 근이영양증(oculopharyngeal muscular dystrophy), 울리히 선천성 근이영양증(Ullrich congenital muscular dystrophy), 울리히 공막이완성 근이영양증(Ullrich scleroatonic muscular dystrophy)을 포함된다. 일부 구현예에서, 피험체는 지대형 근이영양증을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 피험체는 지대형 근이영양증 2E (LGMD2E)를 앓고 있다.
본원에서 사용된 용어 "섬유증(fibrosis)"은 골격근, 심장 근육, 간, 폐, 신장 및 췌장을 포함하는 상해시 조직에서 세포외 기질 (ECM) 성분 및 비정상적인 수선 산물의 과도하거나 또는 조절되지 않은 침착을 의미한다. 침착되는 ECM 성분은 콜라겐, 예컨대 콜라겐 1, 콜라겐 2 또는 콜라겐 3, 및 피브로넥틴을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 AAV 벡터 (또는 본원에 기재된 AAV 벡터를 포함하는 조성물)의 치료 유효량을 포유류 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류 피험체에서 근력 및/또는 근육량을 증가시키는 방법이 본원에 기술된다.
본 발명의 방법 중 임의의 것에서, 피험체는 지대형 근이영양증 또는 임의의 다른 디스포로핀-관련 근이영양증과 같은 근이영양증을 앓고 있을 수 있다.
또한, 포유류 피험체에 (여기서 기술된 AAV 벡터를 포함하는 조성물 또는) AAV 벡터를 본원에 기재된 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 근이영양증의 치료 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 근이영양증은 지대형 근이영양증이다. 본원에 기술된 임의의 방법은 miR29C를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
병용 요법도 고려된다. 이와 관련하여, 본원에 기재된 전술한 방법 중 임의의 것은 miR29C를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 AAV 벡터를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, miR29C를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 근육-특이적 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 근육-특이적 조절 요소는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근육 세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF, 근육 크레아틴 키나아제 (MCK), tMCK (절삭 MCK), 미오신 중쇄 (MHC), MHCK7 MHC 및 MCK의 혼성형), C5-12 (합성 프로모터), 쥐 크레아틴 키나아제 요소, 골격성 빠른 트위치 트로포닌 C 유전자 요소, 느린-트위치 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 느린-트위치 트로포닌 I 유전자 요소, 저산소-유도성 핵 인자, 스테로이드-유도성 요소 또는 글루코코르티코이드 반응요소(GRE)를 포함한다. 일부 실시예들에서, 제2 재조합 벡터는 (그 내용이 전체로서 본원에 포함된) 미국 가출원 제62/323,163호에 기재된 바와 같은, 서열번호 9 또는 서열번호 8에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
β-사르코글리칸을 발현하는 rAAV 벡터 및 miR29c를 발현하는 rAAV 벡터 모두가 포유류 피험체에게 투여되는 본원에 기재된 병용 요법에서, 상기 rAAV 벡터들은 동시에 투여될 수 있거나, miR29c를 발현하는 rAAV의 직전 또는 직후에 β-사르코글리칸을 발현하는 rAAV 벡터가 연속적으로 투여될 수 있다. 대안적으로는, β-사르코글리칸을 발현하는 AAV 벡터는 rAAV 발현 miR-29를 투여한 후 약 1-24 시간 내 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간)에 투여되거나, 또는 본 발명의 방법이 투여되는데, 여기에서 β-사르코글리칸을 발현하는 AAV 벡터는 miR-29를 발현하는 rAAV를 투여하기 전 약 1-24 시간 이내 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간) 에 투여된다. 일부 구현예에서, β-사르코글리칸을 발현하는 AAV 벡터는 rAAV 발현 miR-29를 투여한 후 약 1-5 시간 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 시간) 내에 투여되거나, 본 발명의 방법이 수행되는데, 여기에서 β-사르코글리칸을 발현하는 AAV 벡터는 miR-29c를 발현하는 rAAV를 투여하기 전 약 1 내지 5 시간 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 시간) 내에 투여된다.
본 발명의 임의의 방법에서, rAAV는 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 또한, 본 발명의 임의의 방법에서, rAAV는 주사, 투입(infusion) 또는 w피하 주입(implantation)에 의한 비경구 투여와 같은 전신 투여된다.
본 발명의 조성물은 근육내 주사 또는 정맥내 주사용으로 제형화된다. 또한, 본 발명의 조성물은 주사, 투입 또는 피하 주입에 의한 비경구 투여와 같은 전신 투여용으로 제형화된다.
또한, 상기 조성물 중 어느 것도 근이영양증 (예를 들어, 지대형 근이영양증 또는 임의의 다른 디스트로핀 관련 근이영양증)을 앓고 있는 피험체에게 투여하도록 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 9 또는 서열번호 8에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 AAV 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명 중 어느 용도에서도, 약제는 근육내 주사 또는 정맥내 주사용으로 제형화된다. 또한, 본 발명 중 어느 용도에서도, 약제는 주사, 투입 또는 피하 주입에 의한 비경구 투여와 같은 전신 투여용으로 제형화된다. 또한, 임의의 약제는 근이영양증 (예를 들어, 지대형 근이영양증 또는 임의의 다른 디스트로핀-관련 근이영양증)을 앓고 있는 피험체에게 투여하도록 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 의약은 서열번호 9 또는 서열번호 8에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 AAV 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
전술한 단락은 본 발명의 모든 양상을 정의하는 것이 아니며, 추가적인 양태는 상세한 설명과 같은 다른 절편에서 설명된다. 전체 문서는 통합된 문헌으로서 관련되는 것으로 의도되며, 비록 이 특징의 조합이 본 명세서에서 동일한 문장이나 단락 또는 절편에서 함께 발견되지 않더라도, 여기에 기술된 특징의 모든 조합이 고려될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명은 부가적인 양태로서, 상기 특정 단락에 의해 정의된 변형보다 임의의 방식으로 범위가 더 좁은 본 발명의 모든 구현예를 포함한다. 예를 들어, 속(genus)으로 기술된 본 발명의 특정 측면에서, 속(genus)의 모든 구성원은 개별적으로 본 발명의 일 양태라는 것을 이해해야 한다.
도 1a 내지 도 1d는 AAV 매개 β-사르코글리칸 발현이 디스트로핀-관련 단백질을 복원하고, 막 무결성을 보호한다는 것을 보여준다. (a) 근육-특이적 tMCK 프로모터에 의해 유도된 코돈-최적화된 인간 β-사르코글리칸 유전자 (hSGCB)를 함유하는 자기-상보성 AAV 벡터. 또한, 카세트에는 안정성을 위해 가공 및 폴리아데닐화 신호를 보강하기 위한 키메라 인트론이 포함된다. (b) 항-β-SG 항체로 면역형광 염색한 결과, 주사 후 6주 및 12주 모두에 5주령 마우스에서 SGCB 전이유전자에 대한 높은 수준의 근초 염색이 나타났다. ×20 이미지가 표시되었다. TA 근육 당 베타-사르코글리칸을 발현하는 섬유의 퍼센트는, 6주 후 평균 88.4±4.2% (n = 9, 수컷 4 마리, 암컷 5 마리), 12주 후 평균 76.5±5.8% (n = 6, 수컷 4 마리, 암컷 2 마리)였다. 단백질 발현은 로딩 조절을 위해 나타낸 감마-튜불린을 포함하는 웨스턴 블랏에서 확인되었다. (c) β-사르코글리칸의 AAV 전달은 사르코글리칸 복합체; β-사르코글리칸, 디스트로핀의 다른 멤버의 회복을 유도한다. ×20 이미지. (d) scAAVrh.74.hSGCB는 sgcb-/- 막을 손상으로부터 보호한다. 에반스 블루 염료 혼입으로부터 보호된 β-사르코글리칸 양성 섬유군에 병치된, 에반스 블루 양성 섬유 (적색)의 넓은 영역을 보여주는 이미지. ×40 이미지가 표시된다.
도 2a 내지 도 2d는 β-SG-결핍 처리된 골격근의 조직학적 분석을 나타낸다. scAAVrh.74.hSGCB 처리는 sgcb - /- 마우스의 조직학적 매개 변수를 정상화한다. 정상 대조군 C57/BL6 마우스 및 scAAVrh.74.hSGCB-처리 마우스와 함께, sgcb - /- 마우스의 TA 근육에서 헤마톡실린 & 에오신 염색 및 피크로시리우스 레드(Picrosirius Red) 염색을 수행한 후, 조직학적 파라미터 및 콜라겐 염색(%)을 정량화하였다. (a) H & E 염색은 중심핵 생성 섬유, 염증 세포의 존재, 및 β-SG-결핍 근육에서의 섬유 직경 분포가 크고 유전자 전달 후 조직 병리학이 개선되었음을 보여준다. (b) 피르크로시리우스 레드 염색은 처리된 근육에서 적색 콜라겐 염색의 감소를 보여준다. (c) 중심 핵 생성 섬유의 정량화 (P<0.0001, 일방 ANOVA)는 처리 후 감소 (P<0.0005, 일원 분산 분석)를 나타내며, 및 (d) 처리된 마우스와 비교할 때의, C57/BL6 대조군 및 sgcb - /- 마우스 유래 TA 근육에서의 섬유 크기 분포 및 의 평균 섬유 크기 증가를 나타낸다. (e) sgcb - /-처리 마우스 (P <0.0001, 일회 ANOVA)와 비교할 때의, C57/BL6 대조군과 sgcb - /- 마우스 유래 TA 근육 내 콜라겐 (%)의 정량화. ×20 이미지로 표시되는 100 μm 축적자. ***P <0.001; ****P <0.0001.
도 3a 내지 3c는 scAAVrh.74.hSGCB 근육 내 전달이 강직력 및 수축-유도성 상해에 대한 내성을 교정함을 보여준다. IM 주사를 통해 3×1010 vg로 처리된 sgcb -/- 마우스의 TA 근육은, 유전자 전달된 지 6주 후에 수집되었고, 강직력을 평가하기 위한 프로토콜 및, 원심성 수축 프로토콜을 평가하는 프로토콜이 수행되었다. (a) AAVrh.74.hSGCB 처리된 TA는 절대 강직력 (P <0.01, 양방향 t-test) 및 (b) 정규화된 비력(P <0.05, 양방향 t-test)은 모두에서 유의한 개선을 보였으며, 상기 정규화된 비력은 야생형 힘 (C57/BL6)과는 다르다. (c) AAVrh.74.hSGCB 처리된 TA는 비처리 sgcb - /- 대조군 (P <0.01, 양방향 ANOVA)과 비교하여, 수축 유도 손상에 대한 내성에서 유의한 개선을 나타내었다. 10회의 수축 이후의 힘 유지가 표시된다. *P <0.05; **P <0.01.
도 4a 내지 도 4c는 scAAVrh.74.tMCK.hSGCB로 근육내 투여된 성숙한 마우스의 분석 결과를 나타낸다. (a) 주사 후 12주에서 6개월령 sgcb - /-마우스(n = 5, 수컷 5마리)의 TA 근육의 면역형광 염색은, 주사된 마우스에서 비처리 마우스(n = 4, 수컷 4마리)에 비해 평균 80% 수준으로 SGCB 전이유전자의 근초(sarcolemmal) 발현을 보여 주었다. (b) 처리 및 비처리된 TA 근육의 피크로시리우스 레드 염색. (c) 피크로시리우스 레드 염색된 조직에 존재하는 콜라겐의 정량화는 rAAVrh.74.tMCK. hSGCB를 사용한 처리 후 콜라겐 양의 상당한 감소를 보여준다(P <0.0001, 일방향 ANOVA). ×20 이미지로 표시되는 100μm 축적자. ****P <0.0001.
도 5a 내지 도 5c는 scAAVrh.74.hSGCB의 혈관 전달 결과를 나타낸다. 4주령(n = 5, 수컷 5마리) 및 5주령(n = 2, 수컷 2마리, 암컷 2마리)의 β-SG 결핍 마우스에 대퇴 동맥을 통해 벡터를 처리하여, 하지 근육에 벡터를 전달하였다. 5×1011 vg 투여량에서, β-SG의 발현은 TA에서 90.6±2.8%, GAS에서 91.8±4.7%로, 조직 병리학적 개선을 수반하여 심지어 상해 파라다임 이후 비처리된 동물에 비해 비력이 상당히 향상되었다. (a) 3마리의 대표적인 마우스에서의 β-SG 단백질 발현. β-SG KO 미처리 마우스의 근육을 삽도 (우측 하단)에 비교를 위해 나타내었다. ×20 이미지가 표시된다. 웨스턴 블롯 및 감마-튜뷸린을 통해 확인된 처리된 근육에서의 발현이 로딩 대조군으로 나타난다. (b) 고투여량 처리 후에, 조직 병리학이 크게 개선된다. 상부 패널-처리 TA 및 비복근. 하부 패널-비처리된 β-SG-결핍 대조군 근육. ×20 이미지로 표시되는 100μm 축적자. (c) 10주기의 원심성 수축-유발성 상해 이후, EDL 근육에 보유된 비력의 백분율. 5×1011 vg의 AAVrh.74.hSGCB로 처리하면 힘에서 상당히 개선되며, 이는 WT (정상) 대조군 근육과 동등하다 (P <0.05, 일원 분산 분석). *P <0.05.
도 6a 내지 도 6b는 ILP-처리된 β-SG KO 마우스에서 섬유증의 감소를 나타낸다. (a) 피크로시리우스 레드 염색은 처리된 마우스의 섬유증이 감소되었음을 보여주는데, 이는 비처리된 sgcb - /-마우스에 비해 콜라겐 침착이 감소된 것에 의해 나타난다. (b) BL6 WT, 비처리 sgcb - /-마우스 및 처리된 마우스 유래 TA 및 GAS 근육에서 콜라겐 수준의 정량으로, 처리된 마우스에서 콜라겐 수준의 감소를 확인하였다 (P<0.001, 일방향 ANOVA). ×20 이미지로 표시되는 100μm 축적자. ***P<0.001.
도 7a 및 7b는 벡터 생체 분포 및 단백질 발현을 나타낸다. (a) ILP 처리된 마우스 유래 조직에서의 벡터 평균 분포의 히스토그램으로, qPCR에 첨가된 DNA 1 마이크로그램 당 전사물 카피수로 주어진다. 좌측 사지에 처리되었다. (b) 표적외 장기에서는, 웨스턴 블럿을 통해 단백질 발현이 나타나지 않음.
도 8a 내지 도 8d는 7개월령의 sgcb - /- 마우스에서 조직학적 및 기능적 결손을 제공한다. SGCB-/- 마우스의 횡격막 (A) 및 심장 (C)에서의 트리콤(trichome) 염색은 광범위한 섬유증(적색)을 나타낸다. 횡격막 유래의 힘 출력값은 횡격막 (B)에서 크게 감소하고, 또한 심장 박출률도 sgcb- /- 마우스 (D)에서 감소한다.
도 9는 치료용 β-사르코글리칸 전이유전자 카세트의 개략도를 제공한다. 코돈-최적화된 인간 β-사르코글리칸 유전자 (hSGCB)를 포함하는 자가-상보성 AAV 벡터. 근육-특이적인 MHCK7 프로모터가 발현을 촉진한다. 또한 카세트에는 안정성을 위해 가공 및 폴리아데닐화 신호를 보강하기 위한 키메라 인트론이 포함된다.
도 10은 다양한 골격근에서 β-사르코글리칸에 대한 면역 형광 염색을 제공하여 1, 4 또는 6 개월의 처리 후 희귀 음성 섬유로 강력한 발현을 나타된다 (1개월 표시).
도 11은 횡격막 및 심장에서 β-사르코글리칸에 대한 면역 형광 염색을 제공하여 1, 4 또는 6 개월의 처리 후 희귀 음성 섬유로 강력한 발현을 나타된다 (1개월 표시).
도 12a 내지 12d는 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB의 정맥내 전달 후의 SGCB 발현의회복을 나타낸다. (A) scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 카세트. (b) 1e12 vg 총 투여량 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB로 정맥내 주입된, sgcb - /- 마우스 유래의 골격근, 횡격막, 및 심장의 주입 6개월 후의 면역형광 이미지화. 평균 98.13±0.31%의 형질도입을 나타내는 골격근의 대표 이미지. 20×이미지가 표시된다. 높은 수준의 hSGCB 전이유전자 발현을 나타내는 심장 조직의 대표적인 이미지. 10×이미지가 표시된다. (c) 처리된 한 마리의 sgcb-/- 마우스의 모든 근육을 웨스턴 블로팅하여 hSGCB 전이유전자 발현을 확인하였다. (d) 5마리의 sgcb - /-처리 마우스의 심장에서의 hSGCB 발현을 위한 웨스턴 블랏팅은, 농도 정량화에서 최대 72.0%의 BL6 WT 수준의 hSGCB의 과발현을 나타내었다.
도 13a 내지 13d는 근육 병리학에서 scAAVrh74.MHCK7.hSGCB를 사용한 전신 처리의 효과를 나타낸다. (a) C57BL/6 WT, sgcb - /-, 및 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 처리 마우스에서 횡격막의 H & E 염색 및 QUAD 근육이 정상화된 조직 병리를 보였다. sgcb (b) 비처리 sgcb-/- 근육과 비교한, sgcb-/- 처리된 근육에서의 중심핵 생성 섬유 감소의 정량화(TA, GAS, GLUT, 횡격막, p<0.0001) (QUAD, 요근, TRI, p<0.05). (c) GAS, PSOAS 및 TRI에서의 섬유 분포의 정상화, 및 (d) 비처리 sgcb-/- 근육 (p<0.001)과 비교한, 처리된 근육의 평균 섬유 크기의 증가 (일방향 ANOVA) (그룹당 n = 5).
도 14a 및 14b는 정맥내 처리된 β-SG KO 마우스에서 감소된 콜라겐 침착을 나타낸다. (a) 피크로시리우스 레드 염색은 처리된 마우스에서 섬유증 감소를 보였으며, 이는 횡격막 및 GAS에서 비처리 sgcb - /- 마우스와 비교하여 콜라겐 침착의 감소로 나타났다. (b) C57BL/6 WT 마우스 (n = 4), 비처리 sgcb - /- 마우스 (n = 4) 및 처리된 sgcb-/- 마우스 (n = 5) 유래의 횡격막 및 GAS 근육에서의 콜라겐 수준의 정량화로, 처리된 근육에서 콜라겐 수준의 감소를 확인하였다 (p <0.0001, 일방향 ANOVA). 20×이미지용으로 표시된 100μm 축적자.
도 15는 sgcb -/- 마우스의 꼬리 정맥을 통한 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB의 전달이 횡격막의 힘을 완전히 회복시키는 것을 보여준다. 6개월의 처리 후 (IV 투여 (1e12vg)). 횡격막 근육 스트립을 처리 및 대조 SGCB-/- 마우스 및 WT 마우스에서 수집하고 힘 측정에 적용하였고, 처리는 힘을 WT 수준으로 회복시켰다.
도 16은 천연 miR-30 골격에서 rAAV 벡터 scAACrh.74.CMV.miR29c 및 miR-29c의 뉴클레오타이드 서열을 개략적으로 도시한다.
도 17은 AAVrh.74.CMV.miR29C로 3개월간 처리한 후, TA 근육을 처리 및 대조 SGCB-/-마우스 및 WT 마우스로부터 수집하고, 섬유증 (콜라겐 수준)을 분석하였다(그룹당 n = 5). 시리우스 레드 염색법과 정량법을 사용하였고, 처리 후 콜라겐 수치는 감소되었다 (도 18 참조). Col1A, Col3A 및 Fbn의 전사 수준이 정상화되었고, 근섬유 크기가 증가한 것으로 나타났다.
도 18은 시리우스 레드로 염색된 비처리 및 AAVrh.74.CMV.miR29C 처리된 전경골근의 스캔된 전체 절편의 대표 이미지를 제공하며, 콜라겐 1과 3에 염색되었다. 정량화는 도 17에 나와 있다.
도 19a 및 도 19b는 흉추의 척추 후만증(kyophoscoliosis)의 교정을 설명한다. (a) x-선 촬영으로 입증된 sgcb - /- 마우스의 척추 후만증. (b) sgcb - /- 마우스 (3.69)의 후만 지수(KI) 점수는 C57BL/6 WT (6.01)(p <0.01)에 비해 낮지만, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB)로 처리할 때 상승한다(p <0.05 sgcb -/-) (일방향 ANOVA) (그룹당 n = 6).
도 20a 내지 도 20d는 심근에서의 심근 병증의 평가를 제공한다. (a) 7개월령 BL6 WT, sgcb - /-, 및 AAV.MHCK7.hSGCB 처리된 sgcb-/- 심장의 H & E 및 피콜로시리우스 레드 염색은, 처리한 지 6개월 후에, 비처리된 sgcb - /- 근육에서 심근 변성 및 처리 후 개선을 나타낸다. (b) sgcb - /- 심장에서 박동량 (p <0.01), 심박출량 및 박출률 (p <0.05) (일방향 ANOVA)에서의 감소, 및 처리 6개월 후의 개선(그룹당 n = 6)을 나타낸다. (c) 2개의 C57BL/6 WT 심장, 2개의 sgcb - /- 심장, 및 5개의 AAV.MHCK7.hSGCB 처리된 sgcb-/- 심장의 웨스턴 블롯팅은 병에 걸린 마우스에서 감소된 심장 트로포닌 I 수준을 나타낸다. (d) 농도 정량화는 트로포닌 I (cTrpI)이 BL6 WT 수준의 최대 60.38%까지 감소하고, BL6 WT 수준의 135.8%까지의 과발현하는 것으로 나타났다.
도 21a 내지 도 21b는 횡격막 기능 보정 및 증가된 개방장 케이지 활성을 설명한다. BL6 WT 마우스(n = 5), sgcb - / - 마우스 (n = 4) 및 AAV.MHCK7.hSGCB 처리된 sgcb- / - 마우스 (n = 5)에서 횡격막 근육 스트립을 수집하여, 힘 및 피로 내성을 측정하였다. 처리 6개월 후에는 WT 수준으로 회복되었고 (sgcb - / - 와 비교하여 p <0.01) 피로 내성이 향상되었다. (b) x 및 y 면에서의 총 보행은 sgcb - / - 마우스에서 유의하게 감소하였고 (p<0.0001), MCHK7 처리 마우스에서 약간 향상되었다 (p <0.05). 또한 뒷다리(hindlimb)에 의지한 수직 활동도 sgcb - / - 마우스에서 감소하였고 (p<0.01), MCHK7 처리 마우스에서 유의하게 증가하였다 (p <0.05) (일방향 ANOVA) (n = 6).
도 22a 내지 도 22b는 전신 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 전달에 대한 생체 분포 및 표적외 전이유전자 발현 분석을 제공한다. (a) 총 투여량 1e12 vg에서 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB의 IV 전달 후, 2마리 sgcb - /- 마우스 유래의 다양한 조직에서 qPCR 반응에 첨가된 1㎍ DNA 당 평균 전사체 vg 카피수의 분포 히스토그램. (b) scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 전신 주입된 sgcb - /- 마우스 유래의 근육 및 장기 상의 생체분포 웨스턴 결과는, 모든 비-근육 샘플에서 hSGCB 전이유전자의 발현이 없다는 것을 나타내었다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 β-사르코글리칸을 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 벡터의 투여가 지대형 근이영양증 동물 모델에서 근섬유증의 감소 또는 완전한 역전을 초래한다는 발견에 기초한다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 본원에 기재된 AAV 벡터의 투여는 퇴행성 섬유의 감소, 염증의 감소 및 힘 증가로 인한 원심성 수축에 대한 보호에 의한 기능회복의 개선을 포함하는 근위축 특징의 역전을 초래하였다.
본 명세서에 사용된 용어 "AAV"는 아데노-관련 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노-관련 바이러스는 단일 가닥 DNA 파보바이러스로서, 헬퍼 바이러스와 공동 감염에 의해 특정 기능이 제공되는 세포에서만 성장한다. 현재, 특징화된 AAV의 13가지 혈청형이 있다. AAV에 대한 일반적인 정보 및 리뷰는 예를 들어 Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp.169-228 및 Berns, 1990, Virology, pp.1743-1764, Raven Press, (New York)에서 찾을 수 있다. 그러나, 유전적 수준에서도 다양한 혈청형이 구조적 및 기능적으로 매우 밀접하게 관련되어 있다고 잘 알려져 있기 때문에, 이러한 동일한 원리가 추가적인 AAV 혈청형에 적용될 것으로 기대된다. (Blacklowe, 1988, Parvoviruses and Human Disease, J. R.의 pp.165-174, Pattison, ed.; 및 Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)를 참고하라). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 상동 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 성질을 나타내는 것으로 보인다. 모두 AAV2에서 발현된 것과 같은 3개의 관련된 캡시드 단백질을 가지고있다. 관련성의 정도는 유전체의 길이에 따른 혈청형 간의 광범위한 교차-혼성화를 나타내는 이종이중체(heteroduplex) 분석에 의해 더 제안되며; "역순 말단 반복 서열"(ITR)에 상응하는 말단에서의 유사한 자기-어닐링 부분의 존재를 암시한다. 유사한 감염 패턴은 또한 각 혈청형의 복제 기능이 유사한 조절하에 있음을 시사한다.
본원에 사용된 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열 (ITR)이 측면에 위치하는 하나 이상의 관심있는 폴리뉴클레오타이드 (또는 전이유전자)를 포함하는 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 산물을 암호화하고 발현하는 벡터로 형질 감염된 숙주 세포에 존재할 때, 복제 및 감염성 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다.
"AAV 비리온(virion)" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 이루어진 바이러스 입자를 의미한다. 상기 입자가 이종 폴리뉴클레오타이드 (즉, 포유류 세포에 전달되는 전이유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 경우, 이는 통상 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"를 말한다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 반드시 AAV 벡터 입자의 생산을 포함하는데, 이는 그러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유되어 있기 때문이다.
AAV
본 발명의 재조합 AAV 게놈은 본 발명의 핵산 분자 및 핵산 분자에 인접한 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. rAAV 게놈 상의 DNA는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 및 AAV rh.74를 포함하지만 이에 제한되지 않는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는, 임의의 AAV 혈청형에서 유래될 수 있다. 슈도타입 rAAV의 생산은 예를 들어 WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV도 또한 고려된다. 예를 들어 Marsic et al., Molecular Therapy, 22 (11):1900-1909 (2014)를 참조하라. 상기 배경 절편에서 언급한 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 골격근 특이적 발현을 촉진하기 위해, AAV1, AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9를 사용할 수 있다.
본 발명의 DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 감염성 바이러스 입자로 조립하기 위해 AAV의 헬퍼 바이러스 (예: 아데노바이러스, E1-결실 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)로 감염 가능한 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자 생산 기술은 당업계에서 표준이다. rAAV의 생산은 이하의 구성 요소가 단일 세포(본 명세서에서는 패키징 세포라고 지칭함) 내에 존재할 것을 요구한다: rAAV 게놈, 상기 rAAV 게놈으로부터 분리된(즉, 상기 rAAV 게놈에 있지 않은) AAV rep 및 cap 유전자, 그리고 헬퍼 바이러스 기능. AAV rep 및 cap 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형 유래일 수 있으며, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 및 AAV rh.74를 포함하나 이에 한정되지 않는, rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형 유래일 수 있다. 슈도타입 rAAV의 생산은 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 인용된 WO 01/83692에 개시되어 있다.
패키징 세포를 생성하는 방법은 AAV 입자 생성에 필요한 모든 구성 요소를 안정적으로 발현하는 세포주를 만드는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가없는 rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된AAV rep 및 cap 유전자, 및 네오 마이신 내성 유전자와 같은 선택 가능한 마커를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)가 세포의 게놈 내로 혼입된다. AAV 게놈은 GC 테일링 (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 합성 링커의 첨가 (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) 또는 직접적인 무딘-말단 연결 (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259: 4661-4666)과 같은 과정에 의해 박테리아 플라스미드로 도입된다. 패키징 세포주는 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염된다. 이 방법의 장점은 세포를 선택할 수 있고, rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포로 도입하기 위해 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로 바이러스를 사용한다.
rAAV 생산의 일반 원칙은 예를 들어 Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; 및 Muzyczka, 1992, Curr. 미생물학의 주제. and Immunol., 158:97-129] 참조에 검토되어 있다. 다양한 접근법이 Ratschin et al., Mol. 세포. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); 및 Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988)], Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); 미국 특허 제 5,173,414 호; WO 95/13365 및 대응 미국 특허 제5,658,776호; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; 미국 특허 제5,786,211호; 미국 특허 제5,871,982호; 및 미국 특허 제6,258,595호에 기재되어 있다. 상기 문헌은 rAAV 생산과 관련된 문헌의 해당 부분을 특히 강조하여, 본원에서 참고로 인용된다.
따라서, 본 발명은 감염성 rAAV를 생성하는 패키징 세포를 제공한다. 한 구현예에서, 패키징 세포는 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포 (동족체 293 세포주)와 같은 안정적으로 형질전환된 암세포일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 패키징 세포는 형질전환되지 않은 세포, 예컨대 저 패키지 293개 세포 (아데노바이러스의 E1로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포 (인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포 (인간 태아 섬유아세포), 베로 세포 (원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포 (붉은털 원숭이 태아 폐 세포)이다.
본 발명의 재조합 AAV (즉, 감염성 캡슐화된 rAAV 입자)는 rAAV 게놈을 포함한다. 구현예는 서열번호 3에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pAAV.MHCK7.hSCGB; 및 서열번호 5에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pAAV.tMCK.hSCGB로 명명된 rAAV을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
rAAV는 칼럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Clark et al., Hum. Gene Ther ., 10 (6):1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol . Med ., 69 427-443 (2002); 미국 특허 제6,566,118호 및 WO 98/09657에 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물을 고려한다. 본원에 기재된 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 rAAV를 포함한다. 상기 조성물은 또한 희석제 및 보조제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 허용 가능한 담체, 희석제 및 보조제는 수여자에게 비-독성이며, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이고, 인산염, 시트르산염 또는 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저 분자량 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는, 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 및/또는 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제를 포함한다.
본 발명의 방법에서 투여될 rAAV의 역가는 예를 들어 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목표, 개체 및 표적화되는 세포 유형에 따라 달라질 것이며, 당업계의 표준 방법에 의해 결정된다. rAAV의 역가를 1㎖당 약 1×106, 약 1Х10, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약 1×1013, 약 1×1014 또는 그 이상의 DNase 저항성 입자(DRP)의 범위일 수 있다. 이다. 투여량은 또한 바이러스 게놈 의 단위(vg)로 발현될 수도 있다.
생체내 또는 시험관내에서 rAAV로 표적 세포를 형질전환시키는 방법이 본 발명에 의해 고려된다. 생체내 방법은 유효 투여량 또는 유효 다중 투여량의 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물을, 이를 필요로 하는 동물 (인간 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 투여량이 질환/질환의 발병 이전에 투여되는 경우, 투여는 예방적이다. 투여량이 질환/질환의 발병 후 투여되는 경우, 투여는 치료적이다. 본 발명의 구현예에서, 유효 투여량은 치료되는 장애/질환 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 경감 (제거 또는 감소)시키고, 장애/질병 상태로의 진행을 늦추거나 예방하고, 장애/질병 상태의 진행을 늦추거나 방지하고, 한다 질병의 정도를 감소시키고, 질병의 차도 있음 (부분 또는 전체)을 초래하고, 및/또는 생존을 연장시키는 투여량이다. 본 발명의 방법으로 예방 또는 치료하기 위해 고려되는 질환의 예는 근이영양증, 예컨대 지대형 근이영양증이다.
병용 요법도 본 발명에 의해 고려된다. 본원에서 사용된 조합은 동시 치료 또는 순차 치료를 모두 포함한다. 본 발명의 방법과 표준 의학적 치료 (예를 들어, 코르티코스테로이드)와의 조합이 구체적으로 고려되며, 신규한 치료법과의 조합도 고려된다.
rAAV 벡터의 치료 유효량은 약 1e13 vg/kg 내지 약 5e14 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 2e13 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 3e13 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 4e13 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 5e13 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 6e13 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 1e13 vg/약 7e13 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 8e13 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 9e13 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 1e14 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 약 2e14 vg/kg, 또는 1e13 vg/kg 내지 약 3e14 vg/kg, 또는 약 1e13 내지 약 4e14 vg/kg, 또는 약 3e13 vg/kg 내지 약 4e13 vg/kg, 또는 약 3e13 vg/kg 내지 약 5e13 vg/kg, 또는 약 3e13 vg/kg 내지 약 6e13 vg/kg, 또는 약 3e13 vg/kg 내지 약 7e13 vg/kg, 또는 약 3e13 vg/kg 내지 약 8e13 vg/kg, 또는 약 3e13 vg/kg 약 9e13 vg/kg, 또는 약 3e13 vg/kg 내지 약 1e14 vg/kg, 또는 약 3e13 vg/kg 내지 약 2e14 vg/kg, 또는 3e13 vg/kg 내지 약 3e14 vg/kg, 또는 약 3e13 vg/kg 내지 약 4e14 vg/kg, 약 3e13 vg/kg 내지 약 5e14 vg/kg, 또는 약 5e13 vg/kg 내지 약 6e13 vg/kg, 또는 약 5e13 vg/kg 내지 약 7e13 vg/kg, 또는 약 5e13 vg/kg 내지 약 8e13 vg/kg, 또는 약 5e13 vg/kg 내지 약 9e13 vg/kg, 또는 약 5e13 vg/kg 내지 약 1e14 vg/kg, 또는 약 5e13 vg/kg 내지 약 2e14 vg/kg, 또는 5e13 vg/kg 내지 약 3e14vg/kg, 또는 약 5e13 내지 약 4e14 vg/kg, 또는 약 5e13 vg/kg 내지 약 5e14 vg/kg, 또는 약 1e14 vg/kg 내지 약 2e14 vg/kg, 또는 1e14 vg/kg 내지 약 3e14 vg/kg 또는 약 1e14 vg/kg 내지 약 4e14 vg/kg, 또는 약 1e14 vg/kg 내지 약 5e14 vg/kg의 투여량이다. 본 발명은 또한 이러한 범위의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
예를 들어, rAAV 벡터의 치료 유효량은 1e13 vg/kg, 약 2e13 vg/kg, 약 3e13 vg/kg, 약 4e13 vg/kg, 약 5e13 vg/kg, 약 6e13 vg/kg, 약 7e13 vg/kg, 약 8e13 vg/kg, 약 9e13 vg/kg, 약 1e14 vg/kg, 약 2e14 vg/kg, 약 3e14 vg/kg, 약 4e14 vg/kg 및 5e14 vg/kg의 투여량이다. 본 발명은 또한 이들 투여량의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
조성물의 유효량의 투여는 근육내, 비경구, 정맥내, 구강, 협측, 비강, 폐, 두개내, 골내, 안구 내, 직장 또는 질 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계의 표준 경로에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 rAAV의 AAV 성분 (특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 및 혈청형(들)은 치료될 감염 및/또는 질병 상태 및 β-사르코글리칸을 발현하는 표적 세포/조직을 고려하여 당업자에 의해 선택 및/또는 정합될 수 있다.
본 발명은 유효량의 rAAV 및 본 발명의 조성물의 국소 투여 및 전신 투여를 제공한다. 예를 들어, 전신 투여는 순환계로의 투여로 전신이 영향을 받는다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수 및 주사, 투입 또는 피하 주입을 통한 비경구 투여와 같은 경장 투여를 포함한다.
특히, 본 발명의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직으로 수송할 임의의 물리적 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 투여는 근육, 혈류 및/또는 직접 간으로의 주입을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 인산염 완충 생리 식염수에 rAAV를 단순히 재현탁시키는 것으로 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분하다는 것이 입증되었고, (비록 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV에 의한 정상적인 방법에서 피해야 하기는 하지만) rAAV와 함께 투여될 수 있는 담체 또는 다른 성분에 대한 알려진 제한은 없다. rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 근육과 같은 관심있는 특정 표적 조직을 표적화하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, WO 02/053703 (이의 개시 내용은 본원에 참고로 인용됨)을 참조하라. 약학적 조성물은 주사 가능한 제제 또는 경피 수송에 의해 근육에 전달되는 국소 제제로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송을 위한 다수의 제제가 이전에 개발되었으며, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. rAAV는 투여 및 취급을 용이하게 하도록 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 사용될 수 있다.
근육내 주사의 목적을 위해, 참기름 또는 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜과 같은 보조제 중의 용액, 뿐만 아니라 멸균 수용액을 사용할 수 있다. 이러한 수용액은 원한다면 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 식염수 또는 포도당으로 등장성이 된다. 유리산 (DNA는 산성 인산염 기를 포함함) 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서 rAAV의 용액은 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서 이러한 제제에는 미생물의 성장을 막기 위해 방부제가 함유되어 있다. 이와 관련하여, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 용이하게 얻을 수 있다.
주사 용도에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 상기 형태는 멸균되어야 하며, 쉽게 주사할 수 있는 정도까지 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항박테리아 및 항진균제에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장 화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 이루어질 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요에 따라 필요량의 rAAV를 적절한 용매에 상기 열거한 여러 가지 다른 성분과 혼합한 다음, 멸균 여과하여 제조한다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 성분을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 필수 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 분말 및 그 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 바람직한 추가 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
rAAV에 의한 형질도입은 시험관 내에서도 수행될 수 있다. 한 구현예에서, 원하는 표적 근육 세포는 피험체에서 제거되고, rAAV에 의해 형질도입되고, 피험체으로 재도입된다. 또는 동종 또는 이종 근육 세포는 그 세포가 피험체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 경우 사용될 수 있다.
형질도입 및 상기 형질도입된 세포의 피험체 내로의 재도입에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일 실시예에서, 세포는 rAAV를, 예를 들어 적절한 매체 중에서 근육 세포와 조합하고, 서던 블랏 및/또는 PCR과 같은 종래의 기술을 사용하여 관심있는 DNA를 갖는 이들 세포를 스크리닝하고, 또는 선별 마커를 사용함으로서, 시험관내에서 형질도입될 수 있다. 형질도입된 세포는 그 다음 약학적 조성물로 제형화되고, 상기 조성물은 다양한 기술, 예컨대 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해, 또는 카테터 등을 이용하여 평활근 및 심근에 주입함에 의해 피험체에 도입된다.
본 발명의 rAAV로 세포를 형질도입하면, β-사르코글리칸이 지속적으로 발현된다. 따라서, 본 발명은 β-사르코글리칸을 발현하는 rAAV를 포유류 피험체, 바람직하게는 인간에게 투여/전달하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 본 발명의 하나 이상의 rAAV로 (근육, 기관 및 간 및 뇌, 및 타액선과 같은 조직을 포함하지만 이에 제한되지는 않는) 조직을 형질도입시키는 것을 포함한다. 형질도입은 조직 특이적 조절 요소를 포함하는 유전자 카세트로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 구현예는 액틴 및 마이오신 유전자 패밀리, 예컨대 myoD 유전자 [Weintraub et al., Science , 251: 761-766 (1991) 참고], 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2 [Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], 인간 골격 액틴 유전자 유래의 조절 인자 [Muscat et al. (1989), Mol Cell Biol ., 7:4089-4099 (1987)], 심장 액틴 유전자, 근육 크레아틴 키나아제 서열 요소 [Johnson et al., Mol Cell Biol ., 9:3393-3399, (1989) 참고], 및 쥐의 크레아틴 키나아제 인핸서 (mCK) 요소, 골격 빠른-트위치 트로포닌 C 유전자, 느린-트위치 심장 트로포닌 C 유전자 및 느린-트위치 트로포닌 I 유전자로부터 유도된 조절 요소로부터 유래한 것: 저산소-유발성 핵 인자 (Semenza 등, Proc Natl Acad Sci USA, 88:5680-5684 (1991)), 스테로이드-유도성 글루코코르티코이드 반응요소 (GRE)를 포함하는 프로모터 (Mader and White, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5603-5607 (1993)) 및 다른 조절 요소를 포함하나, 이에 제한되지 않는 근육-특이적 조절 요소에 의해 유도되는 근육 세포 및 근육 조직의 형질도입 방법을 제공한다.
근육 조직은 생체내 DNA 전달에 있어 매력적인 표적인데, 왜냐하면 이는 중요한 기관이 아니고 접근하기 용이하기 때문이다. 본 발명은 형질도입된 근섬유로부터의 miRNA의 지속적인 발현을 고려한다.
"근육 세포" 또는 "근육 조직"의 어떠한 종류의 근육(예컨대, 소화관, 방광, 혈관 또는 심장 조직 유래의 예를 들어, 골격근, 평활근)에서 유래된 세포 또는 세포의 그룹을 의미한다. 근육아세포, 근관, 근육 세포, 심근 세포 및 심근아세포와 같은 이러한 근육 세포는 분화되거나 미분화될 수 있다.
용어 "형질도입(transduction)"은 생체내 또는 시험관내에서 복제 결핍 rAAV를 통해 관심있는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, β-사르코글리칸 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열)를 수여자 세포에 투여/전달하는 것을 말하며, 이로 인하여 β-사르코글리칸이 발현된다.
따라서, β-사르코글리칸을 암호화하는 rAAV의 유효 투여량 (또는 투여량들, 본질적으로 동시에 투여되거나, 간격을 두고 투여됨)을 이를 필요로 하는 포유류 피험체에게 투여하는 방법도 본원에 기술되어 있다.
여기에 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것처럼 본원에 참고로 인용된다. 충돌이있는 경우, 여기에 정의된 내용을 포함하여 본 발명이 우선한다.
본 발명은 청구 범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 기술된다.
실시예
재료 및 방법
동물 모델-모든 절차는 전국 어린이 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회 (Nationwide Children’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committee)(AR12-00040 프로토콜)의 연구소에서 승인했다. B6.129-Sgcbtm1Kcam/1J 이형접합체 마우스를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA, Strain # 006832)로부터 구입하였다. Sgcb-/- 마우스는 이형접합체 마우스를 사육하여 생성되었다. KO 마우스는 전국 어린이 병원(Nationwide Children's Hospital) 연구소의 동물 자원 핵심 부서에서 표준화한 조건으로 동형 접합체 동물로 사육 및 유지되었다. 마우스는 텍라드 세계 설치류 식이(Teklad Global Rodent Diet) (3.8z5 섬유질, 18.8% 단백질, 5% 지방 음식)에서 12:12-시간 명암 사이클을 유지했다. SGCB-/- 마우스의 동정은 PCR을 이용한 genotyping으로 수행하였다. 모든 동물을 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있는 표준 마우스 케이지에 넣었다.
베타- 사르코글리칸 유전자 구축. 전장 인간 베타-사르코글리칸 cDNA (GenBank 수탁번호 NM_0034994.3)는 코돈 최적화되고, GenScript Inc 사 (Piscataway, NJ, USA)에서 합성되었다. GenScript를 통한 코돈 최적화는 전사, mRNA 프로세싱 및 안정성, 번역 및 단백질 폴딩을 포함하는 매개 변수를 고려하여, 근육 조직에서 최대 발현을 유도하도록 cDNA 서열을 설계하는 알고리즘을 사용한다 (www.genscript.com).
pAAV.tMCK.hSGCB 작제물의 경우, cDNA를 AAV2 ITR을 포함하는 플라스미드에 클로닝하고 카세트에는 컨센서스 코작(Kozak) 서열 (CCACC), SV40 키메라 인트론 및 합성 폴리아데닐화 부위(53bp)가 포함된다. 재조합 tMCK 프로모터는 Dr. Xiao Xiao (North Carolina 대학)의 선물이었다. 이것은 이전에 기술된 CK6 프로모터 27의 변형이며, 전사 인자 결합 부위를 함유하는 프로모터 부위의 상류에서 인핸서의 변형을 포함한다. 인핸서는 2개의 E 박스(좌측 및 우측)로 구성된다. tMCK 프로모터 변형은 좌측 E-박스를 우측 E-박스의 변형시키고 (2R 변형) 및 6-bp 삽입 (S5 변형)시키는 돌연변이를 포함한다. pAAV.tMCK.hSGCB 벡터는 pUC57-BSG (Genscript Inc.)로부터 1040bp KpnI/XbaI 단편을 pAAV tMCK.hSGCA.26의 KpnI/XbaI 부위에 연결시킴으로써 제조하였다.
NotI/KpnI 부위를 갖는 tMCK 프로모터 및 SV40 키메라 인트론을 제거하고 NotI/KpnI 부위를 갖는 MHCK7 프로모터 및 동일한 SV40 키메라 인트론을 함유하는 PCR 증폭 단편을 삽입함으로써 pAAV.MHCK7.hSGCB 벡터를 작제하였다. MHCK7는 MCK 기반 프로모터로서, 내재성 심장 크레아틴 키나아제 유전자 내부의 전사 개시 부위의 5'로부터 ~1.2kb 떨어진 206-bp 인핸서, 및 근위 프로모터(enh358MCK, 584-bp)를 사용한다.3 ,12 MHCK7 프로모터 자체는 CK 부분의 188-bp α-MyHC (α-미오신 중쇄) 인핸서 5’에 MCK 패밀리의 유전자를 연결한 변형 CK7를 포함하여, 심장 발현을 향상시킨다. 프로모터 (CK)의 크레아틴 키나아제 부분은 tMCK와 MHCK7 간에 96% 동일하다. 마지막으로, pAAV.MHCK7.hSGCB 벡터를 pAAV.MHCK7.DYSF5'DV44로부터의 960bp NotI/KpnI MHCK7 + Intron 단편을 pAAV.tMCK.hSGCB의 NotI/KpnI 부위 내로 연결함으로써 작제되었다 [Pozgai et al., Gene Ther. 23: 57-66, 2016).
rAAV 생성. Rodino-Klapac et al.에 의해 이전에 보고된 변형된 교차 패키징 접근법(J. Trans. Med. 5:45, 2007)는, rAAV 벡터를 작성하는데 사용되었다. 여기, HEK293 세포에서 CaPO4 침전에 의한 삼중 형질감염 방법은, AAV2 ITRs가 다른 AAV 캡시드 혈청형으로 패키징될 수 있도록 한다. 생산 플라스미드는 (i) pAAV.tMCK.hSGCB 또는 pAAV.MHCK7.hSGCB, (ⅱ) cap 혈청형 8-유사 분리물 rh.74를 암호화하는 rep2-caprh.74 변형 AAV 헬퍼 플라스미드, 및 (ⅲ) 아데노바이러스 E2A, E4 ORF6 및 VA I/II RNA 유전자를 발현하는 아데노바이러스 5형 헬퍼 플라스미드(pAdhelper)이다. 벡터를 정제하고, 캡슐화된 vg 역가(titer)는 전술한 바와 같이 결정하였다(Prism 7500 Taqman 검출기 시스템을 사용함; PE Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). 프라이머 및 형광 프로브는 tMCK 프로모터를 표적으로 하고, 다음과 같았다: tMCK 정방향 프라이머, 5'-ACC CGA GAT GCC TGG TTA TAA TT-3 '(서열번호 10); tMCK 역방향 프라이머, 5'-TCC ATG GTG TAC AGA GCC TAA GAC-3 '(서열번호 11); 및 tMCK 프로브, 5'-FAM-CTG CTG CCT GAG CCT GAG CGG TTA C-TAMRA-3 '(서열번호 12). 프라이머 및 형광 프로브는 MHCK7 프로모터를 표적으로 하고 다음과 같다: MHCK7 정방향 프라이머, 5'-CCA ACA CCT GCT GCC TCT AAA-3 '(서열번호 16); MHCK7 역방향 프라이머, 5'-GTC CCC CAC AGC CTT GTT C-3'(서열번호 17); 및 MHCK7 프로브, 5'-FAM-TGG ATC CCC-Zen-TGC ATG CGA AGA TC-3IABKFQ-3'(서열번호 18).
근육 내 유전자 전달. 근육내 주사의 경우, 마우스를 마취시키고 (O2 중의) 1-4% 이소플루란 하에 유지시켰다. 4주 내지 6주령 SGCB-/- 마우스의 좌측 하지를 95% EtOH로 세척한 후, 횡복(TA)근에 30 게이지의 초정밀 인슐린 주사기를 사용하여 30㎕ 부피의 식염수로 희석한 3×1011 VG의 scAAVrh.74.tMCK.hSGCB를 주사하였다.
대측근은 대조군 역할을 하기 위해 비처리된 상태로 두었다. 두 사지의 TA 근육은 유전자 전달 효율을 평가하기 위해, 주사한 지 6주 (n = 9, 4마리의 수컷, 5명의 암컷) 또는 12주 (n = 6, 4마리의 수컷, 2마리의 암컷) 후에 제거하였다. 6개월령 마우스 (n = 5, 5마리의 수컷)에 관한 실험에서, 치료는 3×1011 vg scAAVrh.74.tMCK.hSCGB를 좌측 TA에 근육내 주사하는 것으로 이루어진다. 고립된 사지 관류 실험을 위해, sgcb-/- 마우스는 이전에 기재된 대퇴 동맥으로의 주사에 의해, 4주 (n = 5, 5마리의 수컷) 및 5주 (n = 4, 2명의 수컷, 2마리의 암컷)에 5 x 1011 vg의 scAAVrh.74.tMCK.hSCBB로 관류시켰다. 동물을 안락사시키고, 유전자 전달 8주 후에 근육을 분석하였다.
전신 유전자 전달: 전신 전달은 sgcb - /- 마우스의 꼬리 정맥에 벡터를 주입하여 이루어졌다. 마우스에 30 게이지 초정밀 인슐린 주사기를 사용하여 212μL 부피의 식염수에 희석한 1×1012 VG의 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB를 주사하였다. 쥐는 꼬리 구멍을 통해 꼬리를 다시 넣는 유지 튜브에 구속되어, 주사를 용이하게 하기 위해 혈관을 확장시키기 위해 데워졌다. 동맥을 꼬리의 중심선 아래로 위치시킨 후, 꼬리 동맥을 따라 움직이는 보라색/파란색 측면 정맥 중 하나에 주사하였다. 모든 처리된 마우스는 4-5 주령에 주사하고, 주사한 지 6개월 후에 안락사시켰다.
EDL 힘 생성 및 원심성 수축으로부터의 보호. 고립 관류 (ILP)로 처리한 마우스의 EDL 근육의 생리학적 분석을 수행하였다. 처리된 쥐의 양쪽 하지의 EDL 근육을 힘줄에서 절개하고, 생리학적 프로토콜을 적용하여, 이전에 본 발명자들의 연구실과 다른 사람들(19,31)에 의해 기술된 기능을 일부 변형하여 평가했다. 원심성 수축 프로토콜 동안, 500 내지 700ms에서 실행되는 5% 스트레치-재-연장 절차 (100ms 동안 5% 스트레치한 후, 100ms에서 최적 길이로 복귀). 강직 및 원심성 수축 프로토콜 이후, 근육을 제거하고, 습윤-칭량하고, 트라가칸트 검을 사용하여 척(chuck)에 장착한 다음, 액체 질소로 냉각시킨 메틸-부탄 중에서 동결시켰다.
TA 강제 생성 및 원심성 수축으로부터의 보호. TA 근육의 기능적 결과를 평가하기 위한 프로토콜은 IM 주사로 처리한 마우스로부터 추출한 근육에서 수행되었다. 이 TA 과정은 이전의 여러 연구에 요약되어 있다. (32,33) 원심성 수축 후에 마우스를 안락사시키고, TA 근육을 해부하고, 무게를 측정하고, 분석을 위해 동결시킨다. 데이터 분석은 맹검으로 수행되었지만, 무작위로 수행되지는 않았다.
면역 형광법. 동결 절편 (12 μm)은 블로킹 버퍼(1×TBS, 10% 염소 혈청, 0.1% 트윈) 중에 1:50으로 희석하여, 습식 챔버에서 실온에서 1시간 동안 단일클론 인간 β-사르코글리칸 1차 항체(Leica Biosystems, New Castle, UK; Cat. No. NCL-L-b-SARC)와 함께 항온처리하였다. 이어서, 절편을 TBS로 3회, 각각 20분 동안 세척하고, 30분 동안 다시 블로킹하였다. AlexaFluor 594 접합된 염소 항-마우스 2차 IgG1 항체 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA; Cat. No. A21125)을 45분 동안 1:250 희석액에 적용하였다. 절편을 TBS로 20분간 3회 세척하고 벡타쉴드(Vectashield) 장착 배지 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 함께 장착하였다. Zeiss AxioCam MRC5 카메라를 사용하여 근육 절편의 4가지 상이한 사분면을 포괄하는 4개의 무작위 ×20 이미지를 촬영했다. β-사르코글리칸 염색에 양성인 섬유의 백분율 (근막 염색 강도의 450%)을 각 이미지에 대해 결정하고, 각 근육에 대해 평균을 구했다.
웨스턴 염색 분석. 좌측 처리 TA 근육과 우측 대측 TA 근육 (20-20 미크론 두께)로부터의 조직 절편을 마이크로-원심분리기에 수집하고, 11 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (Roche, Indianapolis, IN, USA)의 존재하에 00μl 균질화 버퍼 (125 mM 트리스-HCl, 4% SDS, 4M 우레아)와 함께 균질화하였다. 균질화 후, 샘플을 4℃에서 10,000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 단백질을 NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 정량화하였다. 단백질 샘플 (20μg)을 150 V에서 1시간 5분 동안 3-8% 폴리아크릴아마이드 트리스-아세테이트 겔 (NuPage, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 전기영동한 후, PVDF 멤브레인 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 35V에서 1시간 15분 동안 트랜스퍼하였다. 막을 TBST 중 5% 탈지분유에서 1시간 동안 블로킹한 후, 토끼 다클론성 인간 베타-사르코글리칸 항체 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA; Cat. No. NBP-1-90300 1:100 또는 1:250 희석) 및 1:5000의 단일 클론 마우스 감마-튜불린 항체 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA; Cat. No. T6557) 또는 마우스 단일클론 마우스 α-액티닌 항체 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA; Cat. No. A7811)의 1:5000 희석액과 함께 항온처리하였다. 토끼 다클론성 마우스 심장 트로포닌 I 항체 (Abcam, Cambridge, MA; Cat. ab47003) 및 토끼 단일클론 빈큘린 항체 (Invitrogen, Frederick, MD; Cat. No. 70062)를 사용하였다. 항-마우스 (Millipore, Billerica, MA, USA, Cat. No. AP308P) 및 항-토끼 (Life Technologies; Cat. No. 656120) 2차 HRP 항체를 ECL 면역 검출에 사용하였다.
EBD 분석. 3×1010 vg의 scAAVrh.74.tMCK.hSGCB를 근육내 주사를 통해 4주령 sgcb-/- 마우스 좌측 TA로 전달하였다. 주사한 지 4주 후에, 마우스에 1×인산 완충액 중의 필터 멸균된 10mg/ml EBD를 5㎕/g 체중으로 우측 복강 내에 주사하였다. 주사 후 24시간 후에 마우스를 사멸시키고, 조직을 수집하여, 절편을 만들었다. 절편을 차가운 아세톤에서 10분 동안 고정시킨 후, 면역 형광 프로토콜을 사용하여 인간 베타-사르코글리칸을 염색하였다.
형태 분석. 중심부에 위치하는 핵을 포함하는 근섬유의 근육 직경과 백분율은, 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색된 TA와 GAS 근육에서 결정되었다. Zeiss AxioCam MRC5 카메라로, 동물당 1 절편 당 4개의 랜덤 ×20 이미지를 촬영했다. NIH ImageJ 소프트웨어 (Bethesda, MD, USA)를 사용하여, 중심핵 생성 섬유를 정량화하였다. 섬유 직경은 Zeiss Axiovision LE4 소프트웨어 (Carl Zeiss Microscopy, Munich, Germany)를 사용하여, 근섬유를 통해 최단 직경으로 측정되었다.
생체 분포 qPCR 분석. Taqman 정량적 PCR은 이전에 기술된 바와 같이, 표적 및 비 표적화된 대측근 및 비-표적 장기에 존재하는 벡터 게놈 카피수를 정량하기 위해 수행되었다. (18,30) 벡터-특이적 프라이머 프로브 세트를 사용하여, 고유하고 scAAVrh.74.tMCK.hSGCB 전이유전자 카세트 내에 위치하는 tMCK 프로모터 바로 하류의 인트론 영역의 서열을 증폭하였다. 하기 프라이머 및 프로브를 본 연구에서 사용하였다: tMCK 및 MHCK7 인트론 전방 프라이머 5'-GTG AGG CAC TGG GCA GGT AA-3'(서열번호 13); tMCK 및 MHCK7 인트론 역방향 프라이머 5'-ACC TGT GGA GAG AAA GGC AAA G-3 '(서열번호 14); 및 tMCK 및 MHCK7 인트론 프로브 5'-6FAM-ATC AAG GTT ACA AGA CAG-GTT TAA GGA GAC CAA TAG AAA-tamra-3 '(IDT) (서열번호 15). 카피수는 게놈 DNA 1 마이크로그램 당 벡터 게놈으로 보고된다.
면역 세포 염색을 위한 면역조직화학 염색. 면역조직화학법이 면역 세포를 확인하는데 사용되었다. Fisherbrand Superfrost 차지된(charged) 현미경 슬라이드 상의 동결 조직 절편은, 항-래트 Ig HRP 검출 키트 (BD Pharmagen, 미국 캘리포니아 산호세, Cat: 551013): CD3 (Cat: 555273), CD4 (Cat 550280), CD8 (Cat 550281) 및 대식세포에 대해서는 Mac-3 (Cat 550292)를 사용하여, 랫트 항-마우스 단일 클론 항체와 함께 항온처리되었다. 모든 1차 항체를 인산-완충 식염수로 1:20으로 희석하였다. 양성 면역 염색은 스트렙타비딘-HRP 퍼옥시다아제 엑티스타틴 ABC 퍼옥시다아제가 포함된 DAB 완충액으로 희석된 DAB 색소를 사용하여 시각화하였다. 10개의 랜덤×40개의 이미지가 각 근육 및 각각의 대응하는 염색에 대해 취해졌다. 단일-핵 세포의 수를 계수하고, 1mm2 당 총 수로서 표현하였다.
피크로시리우스 레드 염색 및 콜라겐 정량화. Fisherbrand Superfrost 차지된 현미경 슬라이드 상의 동결 조직 절편은, 10% 중성 완충된 포르말린 중에서 5분 동안 고정된 후, 증류수로 씻어 내었다. 상기 슬라이드는 이후 피크로시리우스 레드 염색 키트 (Polysciences Inc., Warrington, PA, USA, Catalog # 24901)의 용액 A (Phosphomolydbic acid) 중에서 2분 동안 항온처리되었다. 증류수로 철저히 헹군 후, 상기 슬라이드를 용액 B (다이렉트 레드 80/2 4 6-트리니트로 페놀)에 15분 동안 넣고 증류수로 추가로 헹군 후, 용액 C (0.1 N 염산 용액) 중에서 2분 동안 항온처리하였다. 상기 슬라이드는 DI 물에서 1:10 희석을 사용하여 Poly Scientific 사의 1% 빙초산(Catalog # S2114) 중의 1% Fast Green으로 2.5분 동안 대조 염색되었다. 마지막으로, 슬라이드를 증류수로 다시 헹구고, 고급 에탄올에서 탈수시키고, 자일렌으로 세척하고 Thermo-Scientific 사의 Cytoseal 60 배지(Waltham, MA, USA, Cat # 8310)를 사용하여 커버립(coverslips)과 함께 장착하였다. AxioVision 4.9.1 소프트웨어 (Carl Zeiss Microscopy)를 사용하여 이미지를 촬영했다. 시리우스 레드 염색 및 콜라겐 정량(%) 분석을 위해 어도비 포토샵을 사용하여, 적색과 녹색의 대비를 향상시켰다. ImageJ 소프트웨어 프로그램의 색상 디콘볼루션 플러그인이 선택되었으며, RGB 색상 디콘볼루션 옵션이 사용되었다. 빨간색 이미지에는 시리우스 레드 염색으로부터 모든 결합 조직이 포함된다. 녹색 이미지에는 Fast Green 대조 염색으로부터 모든 근육이 포함된다. 빨간색 이미지와 원본 이미지만 사용되었다. 이후 임계값을 이미지에 적용하여, 흑백 이미지를 수득하였는데, 흑색에는 콜라겐에 양성인 영역이고 백색에는 음성 영역이다. 측정 기능을 사용하여 콜라겐의 면적을 계산했다. 이후, 전체 조직 면적은 원본 이미지를 '8 비트'로 변환하고, 임계 값을 254로 조정하여 결정되는데, 이 값은 이미지를 완전히 포화시키는 한 단위 미만일 것이다. 이후, 전체 조직 면적을 이전과 같이 측정하고, 총 면적을 기록했다. 콜라겐의 백분율은 콜라겐의 면적을 전체 조직 면적으로 나눔으로써 계산하였다. 각 피험체의 평균 백분율을 계산했다.
기능 평가를 위한 횡격막 강직 수축: 마우스를 안락사시킨 후, 횡격막을 갈비뼈 부착물과 중심 건을 손상없이 절개하여, Beastrom 등 (Am.J. Pathol . 179: 2464-74, 2011), Rafael-Forney et al. (Circulation 124: 582-8, 2011, 및 Moorwood et al. (J. Visualized Experiments 71: e50036, [year?])이 이전에 설명한 것처럼 KH 완충액에 넣었다. 2~4 mm 폭의 횡격막 절편이 분리되었다.　 횡격막 스트립은 편조된 외과용 실크 (6/0; Surgical Specialties, Reading, PA)로 중앙 힘줄에 단단히 묶고, 스트립의 말단부에 고정된 늑골의 일부를 통해 봉합하였다.　 각 근육은 37℃에서 유지되는 산소가 공급되고 KH 용액으로 채워진 수조로 옮겼다. 　근육을 수평으로 정렬하고, 고정 핀과 듀얼 모드 힘 전달기-서보 모터(force transducer-servomotor)(305C; Aurora Scientific, Aurora, Ontario, Canada)의 사이에 직접 묶었다.　2개의 백금 플레이트 전극을 근육의 길이에 접하도록 장기 수조에 두었다. 근육을 트위치 수축의 측정을 위해 최적의 길이로 늘인 후 강직의 시작 전에 10분 동안 휴식을 취했다.　 일단 근육이 안정화되면, 근육은 1g의 최적 길이로 설정되고, 매 30초마다 3회의 1Hz 트위치 이후 매분 3회의 150Hz 트위치로 구성된 워밍업을 받게 된다.　 3분의 휴식 기간 후에, 횡격막은 20, 50, 80, 120, 150, 180Hz에서 자극되어 최대 강직력을 결정하기 위해 250ms의 지속 시간으로 각각의 자극 사이에 2분의 휴식 기간을 허용한다.　 근육 길이와 체중을 측정했다.　 힘은 근육 중량과 길이에 대해 정상화되었다.
심장 자기 공명 영상: 9.4T 수평 자기공명 영상 (MRI) 시스템과 마우스 볼륨 코일 (Bruker BioSpin, Billerica, MA, USA)을 사용하여 심장 기능을 분석했다. 마우스를 영상화 베드에 놓기 전에, 3분 동안 카르보겐 (1 L/분)과 혼합된 2.5% 이소플루란으로 마취시켰다. 영상화 장치에 마우스를 배치하고 이미징을 시작하면, 이소플루란/카르보겐 혼합물은 나머지 연구 기간 동안 1.5%로 떨어졌다. EKG와 호흡은 MRI-호환 시스템 (Model 1025, Small Animal Instruments, Stonybrook, NY, USA)을 사용하여 모니터링했다. 동기화 심장 단-축 FLASH 사인 T1 강조 영상(Gated cardiac short-axis FLASH cine T1-weighted image)은 마우스의 전체 좌심실 (LV)에서 획득되었다 (TR = 8 ms, TE = 2.8 ms, □ = 18o, matrix = 256 × 256, FOV = 3.0 × 3.0 cm, 슬라이스 두께 = 1 mm, n슬라이스 = 7, 심장주기 당 최대 20 프레임). 화상 분석의 경우, 각각의 단-축 이미지의 확장-말기 및 수축-말기 시점이 식별되고, 심장 내막과 심장 외막 경계를 수동으로 추적하였다. 유두근은 LV의 심내 경계에서 제외되었다. 상기 측정된 면적으로부터, 이완기 말기 수축량 (ESV), 수축기 혈량 (SV), 심박출량 (CO), 박출률 (EF) 및 평균 LV 질량을 계산했다.
면역 형광법: 전경골근(TA), 비복근(GAS), 사두근(QUAD), 장요근(PsoAS), 둔근, 삼두박근(TRI), 횡격막, 뿐만 아니라 심장으로부터의 동결 절편 (12μm)은, Pozgai et al., Gene Therap. 23: 57-66, 2016에 기재된 바와 같은 본 발명자들이 이전에 사용한 프로토콜을 통해 hSGCB 전이유전자에 대한 면역형광 염색을 수행하였다. 절편을 1:100으로 희석하여, 마우스 단일클론 인간 베타-사르코글리칸 일차 항체 (Leica Biosystems, New Castle, UK, Cat. No. NCL-Lb-SARC)와 함께 항온처리하였다. Zeiss AxioCam MRC5 카메라를 사용하여, 근육 절편의 4가지 사분면을 포괄하는 4개의 무작위 20×이미지를 촬영했다. β-사르코글리칸 염색에 양성인 섬유의 백분율 (근막 염색의> 50%)을 각 이미지에 대해 결정하고, 각 근육에 대해 평균을 구했다.
형태측정 분석(Morphometric Analysis): 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색은 근육의 분석을 위해, 7개월령 C57BL6 WT 마우스 (n = 5), sgcb - / -마우스 (n = 5) 및 rAAV.MHCK7.hSGCB 6개월령 처리된 sgcb - / -마우스 (n = 5) 유래의 12μm 두께의 동결 절편 상에서 수행되었다. TA, GAS, QUAD, PSOAS, GLUT, TRI 및 횡격막 근육에서 중심 핵을 가진 근섬유의 백분율이 결정되었다. 또한, 근섬유 직경은 GAS, PSOAS 및 TRI 근육에서 측정되었다. Zeiss AxioCam MRC5 카메라로 동물 1마리당 근육 당 무작위 20×이미지 4개를 촬영했다. 중심핵 생성된 섬유는 NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었고, 섬유 직경은 Zeiss Axiovision LE4 소프트웨어를 사용하여 측정되었다.
엑스레이 영상: 전신 엑스레이는 마취된 7개월령 C57BL6 WT 마우스 (n = 6), 비처리 sgcb - / - 마우스 (n = 6) 및 rAAV.MHCK7.hSGCB 6개월령 sgcb- 마우스 상에서 수행되었고, Faxitron MX-20 디지털 엑스레이 시스템을 사용하여 26kV에서 3초간 (Faxitron X-Ray Corp, Lincolnshire, USA)를 사용하였다.
개방장 케이지 활성의 레이저 모니터링 : 개방장 활성 챔버는 실험 마우스의 전반적인 활동을 결정하는데 사용되었다. C57BL6 WT (n = 6) 및 비처리된 sgcb - / -(n = 6) 대조군, 및 rAAV . MHCK7.hSGCB 6개월령 처리된 sgcb- / -마우스 (n = 6)는, 이전에 기술된 프로토콜(이전에 다음 고바야시 등, Nature 456: 511-5, 2008 Beastrom 등, 암 J.을 파올. 179:2464-74, 2011)을 몇몇 변형하여 분석에 적용하였다. 모든 마우스는 마우스가 가장 활동적인 야간 사이클이 끝난 후 이른 아침에 같은 시간에 테스트되었다. 모든 마우스는 희미한 조명 하에서 매번 동일한 핸들러로 격리된 방에서 테스트를 받았다. 불안을 줄이고 마우스의 정상적인 활동 및 결과적으로 분석 결과에 영향을 미칠 수 있는 행동 변수를 최소로 유지하기 위해, 시험한 마우스는 개별적으로 수용되지 않았다 (Voikar et al., Genes Brain Behav . 4:240-52, 2005). 마우스는 Photobeam Activity System (San Diego Instruments, San Diego, CA)을 사용하여 활동 모니터링되었다. 이 시스템은 X-Y-Z 평면 내에서 마우스의 위치와 움직임을 모니터링하기 위해, 동물을 챔버 전방에서 후방으로, 그리고 좌측에서 우측으로 가로지르는 가시광 적외선 빔의 격자를 사용한다. 활성은 5분 간격으로 1시간 주기 동안 기록되었다. 마우스는 데이터 수집을 시작하기 며칠 전에, 처음 1시간 세션 동안 활성 시험실에 적응했다. 마우스는 개별 챔버에서 4세트로 시험되었다. 시험 장비는 본 발명자의 결과를 바꿀 수 있는 마우스 반응 행동 변수를 줄이기 위해, 각 사용 사이에 청소되었다. 수집된 데이터는 마이크로소프트 엑셀 워크 시트로 변환되었으며, 모든 계산은 엑셀 프로그램 내에서 수행되었다. 총 보행을 나타내기 위해, 각 마우스마다 X 및 Y 평면에서 이동을 위한 개별 빔 브레이크를 추가하고, Z 평면의 빔 브레이크는 1시간 간격 내에서 수직 활성을 얻기 위해 추가되었다.
실시예 1: scAAVrh . 74.tMCK . hSGCB 구축 및 벡터 효능
도 1a에 나타낸 바와 같이 코돈 최적화된 전장 인간 SCGB cDNA를 함유하는 전이유전자 카세트를 제작하였다. 카세트에는 컨센서스 코작 서열 (CCACC), SV40 키메라 인트론, 합성 폴리아데닐화 부위 및 카세트의 발현을 유도하는데 사용되는 근육-특이적 tMCK 프로모터 (20)가 포함되어 있다. 카세트는 AAV8에 93% 상동성이 있는 자가-상보성 (sc) AAVrh.74 벡터로 패키징되었다. AAVrh.74는 마우스와 비인간 영장류에서 안전하고 효과적이며, 특히 혈액 순환을 통해 근육으로 전달될 때 혈관 장벽을 가로지르는 것으로 나타났다. (17, 18, 21) 벡터의 효능은 Sgcb-null 마우스에서 근육내 주사에 의해 좌측 TA 근육으로 확립되었다. 유전자 전달 3주 후에, 3×1010 VG의 전달은 70.5±2.5%의 근섬유를 형질도입시키고, 1×10 11 VG의 전달은 89.0±4.0%의 근섬유를 형질도입시켰다.
실시예 2: scAAVrh . 74.tMCK . hSGCB의 근육 내 전달
벡터 효능에 따라, 연구는 유전자 전달 6주 및 12주 후에 처리의 효능을 분석하기 위해 확장되었다. 짧은 3주 효능 연구 후 높은 수준의 발현 결과로, 최저 유효 투여량을 사용하기 위한 후속 연구에서 3×1010 vg 총 투여량을 선택했다. 5주령 sgcb-/- 마우스는 좌측 횡복근(TA)에 근육내 주사된 3×1010 VG의 scAAVrh.74.tMCK.hSCGB로 처리되었고, β-사르코글리칸 발현은 면역 형광을 사용하여 주사 6주 후 88.4±4.2%의 근섬유(n = 9)에서, 및 주사 12주 후 근섬유의 76.5±5.8% (n = 6)에서 입증되었고, 발현은 웨스턴 블랏팅을 통해 확인되었다 (도 1b). β-사르코글리칸 발현은 디스트로핀-관련 단백질 복합체 (β-사르코글리칸 및 디스트로핀)의 구성 요소의 복원을 수반했다 (도 1c). 에반스 블루 염료(EBD)를 막 투과성의 마커로 사용하여 (22, 23), 본 발명자들은 외인성 β-사르코글리칸을 발현하는 모든 섬유가 누출 및 EBD 봉입(inclusion)으로부터 보호된다는 것을 발견했다 (도 1d). sgcb-/-마우스의 근육은 중심 핵 생성 섬유, 빈번한 근섬유 괴사, 섬유증 조직, 및 위축성 및 비후성 섬유에 의해 나타나는 현저한 섬유 크기 가변성을 갖는 심각한 근이영양증을 나타낸다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, 헤마톡실린 & 에오신 염색은 중심핵의 감소를 포함하는 질병 근육의 위축성 표현형의 전반적인 개선을 나타낸다(sgcb-/- 비처리―76.8±2.3% 대 AAV.hSCGB 처리―38.86±3.5%; P <0.0001) (도 2c). 처리 후 평균 섬유 직경의 증가와 함께 섬유 크기 분포의 정상화도 관찰되었다 (sgcb-/- 비처리―32.6±0.31 μm 대 AAV.hSGCB 처리―35.56±0.22 μm; P <0.0001) (도 2d).
scgb-/-마우스의 조직 병리학적 특징은 피브로넥틴, 엘라스틴, 라미닌 및 데코린과 같은 다른 세포외기질 구성 요소와 함께, 주로 콜라겐에 의한 근육 조직의 광범위한 대체로써 특징화되는 섬유증(fibrosis)이다. (14) 결합 조직에 의한 근육 조직의 이러한 대체는 유전자 대체의 잠재적 가치에 어려움을 주며, 개선의 정도를 제한할 수 있다. (24) 이것을 시험하기 위해, 12주 동안 처리된 마우스를 섬유증의 감소를 위해 검정하였다. TA 근육은 섬유질의 고유한 정도가 KO 모델에서 확립되었고, 그것이 혈관 ILP 유전자 전달 후 잠재적 표적이 되기 때문에 구체적으로 평가되었다. TA 근육의 콜라겐 I형과 III형에 대한 피크로시리우스 레드 염색은 scAAVrh.74.tMCK.hSGCB-처리된 근육 내에 존재하는 콜라겐의 양이 비처리 sgcb-/-마우스 근육과 비교하여 유의한 감소(52.74%)를 보였다 (각각 20.7±0.57% 대 43.8±2.3%, AAV.hSGCB 처리 대 sgcb-/- 비처리, P <0.0001) (도 2b 및 e). 주사한 나이에서 5주령 마우스 유래의 비처리 sgcb-/- 근육은 24.05±1.5%의 콜라겐 침착을 보였으며, 처리 12주 후 콜라겐 양이 약간 감소했다 (14.0%).
실시예 3: scAAVrh . 74.tMCK . hSGCB 유전자 전사 이후 골격근의 기능 보정
hSGCB 유전자 전달이 근육 기능을 향상시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 scAAVrh.74.tMCK.hSCGB로 처리한 sgcb-/- 마우스의 TA 근육의 기능적 특성을 평가했다. 4주령 sgcb-/-마우스의 TA에 3×1010 vg의 scAAVrh.74.tMCK.hSCGB를 근육내 전달한 후, 처리 6주 후에 TA 근육을 제자리(in-situ) 힘 측정을 하였다 (n = 4). 처리된 근육은 비처리 대측근 및 C57BL/6 WT 마우스의 것과 비교되었다. scAAVrh.74.tMCK.hSCGB-처리된 근육은 절대 강직력 및 정상화된 비력 모두에서 유의한 개선을 보였다 (도 3a 및 3b). 처리된 근육은 1436.9±199.5 mN의 평균 절대 힘을 가졌지만, 비처리 sgcb-/- 대조군의 경우 770.9±118.3 mN이었다 (P<0.01). 유사하게, 처리된 TA 근육에 의해, 254.01±6.9 mN의/mm2의 평균 비력을 생성하였고, 미처리 근육은 124.2±13.9 mN/mm2의 힘을 생성하였다(P<0.01). 마지막으로, scAAVrh.74.tMCK.hSCGB로 처리한 근육은, 비처리 대조군 근육에 비해, 수축-유발성 상해에 대해 더 큰 저항성을 보였다 (도 3c). 처리된 TA 근육은 제1 수축 후에 생성된 힘의 34.0±5.1%의 힘을 잃었으며, 반면 비처리된 질병 근육은 원심성 수축 프로토콜 후 힘의 54.1±3.8% (P<0.01)를 잃었다. 이 데이터는 hSGCB 유전자 전이가 β-사르코글리칸이 결핍된 병든 근육에 기능적 이점을 제공함을 보여준다.
실시예 4: sc scAAVrh . 74.tMCK . hSGCB에 의한 고령화된 근육의 처리
LGMD2E의 본 마우스 모델에서 질병 진행에 대한 연구에 따르면, 근육에서 가장 심각한 조직 개조가 6주 내지 20주 사이에 발생하지만, 환자의 질병 진행과 유사하게 근육의 조직 병리학은 나이에 따라 계속 악화되고 있다 (3, 4, 14). 결과적으로, 더 심한 근육의 악화와 근내막 섬유증을 가진 더 나이가 든 개체에 대한 치료가 발생할 수 있는 임상 환경을 모방하기 위해, 본 발명자들은 6개월령 sgcb-/- 마우스 (n = 5)를 3×1010 vg의 scAAVrh.74.tMCK.hSCGB로 TA 중에 근육내 처리하였다. 처리 12주 후, 9개월령에서, 근섬유의 80.1±4.8%가 형질도입되었다 (도 4a). 콜라겐 I형 및 III형에 대한 피크로시리우스 레드 염색은, 비처리 sgcb-/- 마우스 근육 (AAV.hSGCB 처리―20.0±0.80% 대 sgcb-/- 비처리―34.6±1.4%, P <0.0001)과 비교하여, 처리된 마우스에 존재하는 콜라겐 양에서 42.2% 감소를 나타내었다(도 4b 및 도 4c). 처리 연령에서, 6개월령 sgcb-/- 마우스는 30.8±2.0%의 콜라겐 침착 (n = 4, 수컷 4마리)을 보였고; 따라서 이러한 결과는 scAAVrh.74.tMCK.hSCGB 처리가 기존의 섬유증을 예방할 뿐만 아니라 역전시킬 가능성이 있는 것을 나타난다.
실시예 5: sgcb -/-마우스에서 cAAVrh . 74.tMCK . hSGCB의 ILP
한 사지에서 여러 개의 근육을 표적화하는 능력은 LGMD2E 환자에게 보다 임상적으로 관련된 전달 방법을 허용한다. 4주 내지 6주령의 sgcb-/- 마우스 (n = 9, 수컷 7마리, 암컷 2마리)에서 ILP에 의한 5×10 11 vg의 scAAVrh.74.tMCK.hSGCB의 전달을 유전자 전달 2개월 후에 분석하였다. β-사르코글리칸의 발현율은 비복근(GAS)에서 91.8±4.7%, TA에서 90.6±2.8%로 나타났다 (도 5a). scAAVrh.74. tMCK.hSGCB의 ILP 전달은 비처리된 반대쪽 근육과 비교하여, 원심성 수축 유도성 상해로부터 유의한 보호를 가져 왔는데(P <0.05), 이는 WT와 다르지 않았다 (도 5c). 혈관 전달은 또한 근육 조직병리학적 매개 변수를 회복시켰다 (도 5b). 중심핵은 TA (sgcb-/- 비처리―76.9±2.8% 대 AAV.hSGCB 처리―23.2±5.7%, P <0.001) 및 GAS (sgcb-/- 비처리―78.2±2.4% 대 AAV.hSGCB 처리―16.8±6.6%, P <0.001)에서 감소하였다. 유전자 전이는 또한 섬유 직경 분포의 정규화에 의해, TA (sgcb-/-비처리―30.53±0.52 μm 대 AAV.hSGCB 처리―41.9±0.46 μm; P <0.0001) 및 GAS (sgcb-/- 비처리―38.9±0.37 ㎛ 대 AAV.hSGCB 처리―33.3±0.44 ㎛; P <0.0001)에서 평균 섬유 크기가 증가하였다. CD3 세포, CD4 세포 및 대식세포 (표 1)의 수에서 상당한 감소 (~ 60%)가 관찰되었다.
scAAVrh.74.tMCK.hSCGB ILP-처리 마우스에서의 면역 반응
세포 유형 처리된 좌측 TA 세포/㎟ 비처리된 우측 TA 세포/㎟ 비주입된 SGCB-/- TA
세포/㎟
CD3
CD4
CD8
대식세포		 15.6±3.2
20.9±4.7
8.2±1.8
28.2±5.0		 37.85±6.2
58.1±2.9
12.7±2.4
75.2±5.6		 29.8±1.7
49.0±0.8
15.5±5.8
100.2±5.9
약어: ANOVA, 가변성 분석; ILP, 분리된-사지 관류; SGCB, β-사르코글리칸; TA, 전경골근. 비주입된 SGCB-/- 마우스, 및 scAAVrh.74.tMCK.hSCGB 처리 및 비처리된 근육에 존재하는 면역 세포의 정량화. 나타낸 데이터는 바이러스의 ILP 전달 이후의 것이고, 세포/㎟±s.e.m의 평균 수 (그룹당 n=8)로 나타난다. 일방향 ANOVA는 3개의 상이한 코호트 유래의 값을 비교하는데 사용되었다. 면역 세포의 수준은 처리된 좌측 TA와 비처리 우측 TA 간에, 및/또는 처리된 좌측 TA와 비주입 TA 간에 통계적으로 유의한 차이(p<0.01)를 갖고 감소하였다.
TA와 GAS 근육의 피크로시리우스 레드 염색은, 또한 혈관 전달 이후에 비처리 sgcb-/- 근육과 비교하여, 콜라겐 양을 유의하게 감소시켰다 (도 6a). TA의 콜라겐 수치는 종말점 (P <0.0001)에서 비처리된 sgcb-/- 마우스에서는 40.2±1.5%와 비교하여, 처리된 근육에서 21.6±1.3%로 감소하였다. 이전에 언급했듯이, 주사한 나이에 sgcb-/- 마우스는 TA 근육에서 24.1±1.5%의 콜라겐을 나타내었으며, 8주간의 처리 후에 콜라겐 침착에서 약간의 감소 (10.0%)를 나타냈다. 유사하게, GAS 근육의 염색은 처리된 마우스가 22.9±0.99%의 콜라겐을 보였고, 종말점에서 비처리된 sgcb-/- 마우스의 37.9±1.3% (P <0.0001)를 보였다. 정성 PCR은 근육의 콜라겐 전 사체 수준을 검출하기 위해 수행되었으며, 이는 시리우스 레드 염색의 결과와 관련이 있다. 종합적으로 말하자면, 이들 데이터는 인간 β-사르코글리칸의 AAV 매개 전달이 근섬유증을 감소시키고, 근육 기능을 개선하며, sgcb-/- 병든 근육의 영양 장애 병리학을 역전 시킨다는 것을 보여준다.
실시예 6: rAAVrh . 74.tMCK . hSGCB의 안전 및 생체내 분포
초기에 3×1010 vg의 scAAVrh.74.tMCK.hSGCB를 TA에 근육내 주사한 정상 WT 마우스는 H & E 염색에 의한 독성 징후가 보이지 않아 바이러스로 인한 악영향을 나타내지 않았다. 이전 섹션에서 설명한 바와 같이 5×1011 vg의 총 투여량의 scAAVrh.74.tMCK.hSGCB의 ILP 혈관 전달 후, 이 코호트 (n = 4)의 소규모 그룹에서 안전성을 평가하였다. 먼저, 중요한 유전자 발현이 있는 표적화된 근육, 뿐만 아니라 조직, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 생식선 및 횡격막을 포함하는 표적외 장기도 분석하였다. 파라핀 절편은 수의병 병리학자에 의해 공식적으로 검토되었으며, 주목된 모든 기관에서 독성의 증거는 없었다 (데이터는 표시되지 않음). 단백질 발현 및 벡터 생체 분포는 또한 상기 모든 조직 및 기관에서 웨스턴 블랏팅 및 qPCR로 각각 평가하였다. 시험된 모든 기관에서 벡터 게놈 카피가 검출되었다. 그러나, 처리된 근육 이외의 어떠한 샘플에서도 단백질 발현은 검출되지 않았다 (도 7). 마지막으로, 코호트 (데이터 표시되지 않음)의 평균 중량을 비교할 때 처리 및 비처리된 근육의 습윤 중량의 분석은 유의한 차이 또는 경향을 보이지 않았다. 이러한 데이터는 근육-특이적 tMCK 프로모터가 골격근으로의 발현을 제한하고, 벡터가 무독성이라는 증거를 제공한다.
실시예 7: SGCB -/-마우스의 심장 및 횡격막에서의 조직학적 및 기능적 결핍
비처리 WT 및 7개월령 SGCB-/-마우스 (품종당 6 마리)를 심장 MRI 및 횡격막 생리학으로 분석하여 결손을 조사하였다. 이 분석에 이어 동물을 희생시키고 조직 병리학을 평가했다 (도 8). 트리크롬(trichrome) 염색은 횡격막 (도 8a)과 심장 (도 8c) 모두에서 광범위한 섬유증(적색 염색)를 보였다. 이는 횡격막에서의 비력의 기능적 결핍 (116.24 mN/mm2 SGCB -/- 대 236.67 mN/mm2 WT, 도 8b), 및 MRI로 측정했을 때 박출률에서 유의한 결핍 (WT, 78% 대 SGCB-/-65%, 도 8d)을 수반한다.
실시예 8: scAAVrh . 74.MHCK7.hSGCB 구축 및 벡터 효능
도 9a에 나타낸 바와 같이, 코돈 최적화된 전장 인간 SCGB cDNA를 함유하는 전이유전자 카세트를 제작하였다. 카세트는 컨센서스 코작 서열 (CCACC), SV40 키메라 인트론, 합성 폴리아데닐화 부위, 및 카세트의 발현을 유도하는데 사용되는 근육-특이적 MHCK7을 포함한다. 이는 근위 프로모터 (enh358MCK 584-BP)와 함께 내인성 근육 크레아틴 키나아제 유전자 내에 전사 개시 부위의 5'에서 ~1.2kb 떨어진 206-bp 인핸서를 사용하는 MCK 기반 프로모터이다3 ,12. 카세트는 AAV8에 93% 상동성이 있는 자가-상보성 (sc) AAVrh.74 벡터로 패키징되었다. AAVrh.74는 마우스와 비인간 영장류에서 안전하고 효과적이며, 특히 혈액 순환을 통해 근육으로 전달될 때 혈관 장벽을 가로지르는 것으로 나타났다. (17, 18, 21) 벡터의 효능은 Sgcb-null 마우스의 좌측 TA 근육으로의 근육내 주사에 의해 확립되었다. 3×1010 vg의 전달은 유전자 전달 4주 후에 근섬유의 90% 이상을 형질도입했다.
실시예 9: scAAV . MHCK7.hSGCB의 전신 전달
본 발명자들은 장기간 6개월의 시점에서 전신 전달시 전이유전자 발현 및 본 발명의 벡터의 효능을 평가하기 위해, 꼬리 정맥내 주사를 통해 1×1012 vg의 총 투여량(5×1013 vg/kg)으로 14 마리의 SGCB-/- 마우스에 벡터를 전달했다. 마우스를 4주령에 주사하고, 주사 6개월 후 완전 검시를 실시하였다 (1 마리는 1개월에, 2 마리는 4개월에 발현의 중간 평가로 실시하였다). 횡격막과 심장과 함께 상기에서 설명한 모든 골격근이 분석을 위해 추출되었다. 장기는 독성학 및 생체 분포 분석을 위해 제거되었다. 인간 베타-사르코글리칸에 대한 면역 형광 염색법을 사용하여, hSGCB 벡터를 전신 주입한 KO 마우스 6마리의 횡격막과 심장에 추가하여, 좌우 사지 모두의 5개 근육에서 hSGCB 전이유전자 발현을 측정하였다. 이 근육들은 TA, 비복근(GAS), 사두근 (QUAD), 둔근(GLUT)(데이터는 표시하지 않음), 장요근(PSOAS) 및 삼두박근 (TRI)를 포함한다(도 10). 심장 조직의 정성 분석은 또한 전달시 심근에서의 전이유전자 발현의 상대적인 수준을 평가하는데 사용되었다.
4개의 20×이미지를 각 근육에서 취하고, hSGCB 양성 섬유의 퍼센트를 각 이미지에 대해 결정하여, 각 마우스의 각 근육에 대한 평균 형질도입 백분율을 얻었다. 도 10과 도 11에 나타난 결과는 횡격막과 심장을 포함한 분석된 모든 근육에서 ≥98%의 형질도입을 보여준다. 면역 형광법으로 분석했을 때, β-사르코글리칸이 결핍된 마우스는 단백질이 전혀 존재하지 않았다. 1x1012 vg 총 투여량의 처리 투여량은 횡격막을 포함한 모든 골격근에서 평균 97.96±0.36% (±SEM)의 벡터 전달을 가져왔고, 심장 근육에서는 약 95% 이상을 나타냈다 (데이터는 표시되지 않음).
실시예 10: SGCB - / -마우스에서 scAAVrh . 74.MHCK7.hSGCB의 장기 전신 전달
실시예 9에서 기술된 1개월 효능 분석의 결과를 바탕으로, β-사르코글리칸 전이 카세트의 sgcb - / -마우스로의 장기간 (6개월간) 전신 전달이 조사되었다. 4마리의 5주령의 sgcb - / - 마우스는 꼬리 정맥을 통해 1×1012 VG 총 투여량의 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB를 정맥내 처리하였다 (n = 5). 마우스는 주입 6개월 후 검시되고, hSGCB 전이유전자 발현은 모든 처리 마우스의 횡격막과 심장, 뿐만 아니라 좌우측 사지 모두의 6개 골격 근육에서 면역 형광을 이용하여 증명되었다. 분석된 골격근에는 TA, GAS, QUAD, 둔근(GLUT), PSOAS 및 TRI가 포함되었다. 처리 마우스에서 전신 전달로 인한 평균 hSGCB 발현은 횡격막을 포함한 모든 골격근에서 98.13±0.31% (± SEM)이었고, 심장에서 >95%를 초과하는 발현을 보였다. 대표적인 이미지가 도 12b에 나와 있다. 처리된 모든 마우스로부터 평균된각 근육 유형의 발현 수준을 표 2에 나타내었다. 도 12c의 웨스턴 블랏팅으로 모든 근육에서 전이유전자 발현을 확인한다. 표 2의 발현값은 전신 주입 마우스 (n = 5)의 좌측 및 우측 근육의 평균으로서 다양한 근육에 대해 제시된다. 값은 AVG±SEM으로 표시된다. 또한 웨스턴 블랏팅과 밀도 측정을 통해 처리된 마우스의 심장에서 hSGCB 전이유전자 발현을 정량화하면, 골격근에서 정량화된 높은 수치와 관련하여 BL6 WT 발현 수준보다 최대 72.0% 높은 hSGCB의 과발현이 나타난다(도 12d).
Figure 112018111795018-pct00001
이전 보고서 (Araishi et al, Hum. Mol. Genet 8: 1589-98, 1999, Durbeej et al., Mol. Cell. 5:141-51, 2000)에서 설명하였고, 도 13a의 GAS 및 횡격막의 헤마톡실린 및 에오신 염색에 의해 예시되는 바와 같은, sgcb - /-근육의 중요한 특징은, 중심핵 생성, 괴사, 염증 침윤 및 섬유증을 포함하는 심한 근위축성 병리학이다. 유전자 전달은 이러한 병리학적 증상을 상당히 개선시켜서 많은 근위축성 특성을 완화시켰다 (도 13a). 조직학적 매개 변수의 정량화는 유전자 전이의 결과로 분석된 다양한 골격근에서 중심핵 생성에 유의한 감소를 보였다 (도 13b). 분석한 모든 근육을 고려하여, 여기에 언급된 바와 같이, BL6 WT 마우스에서 모든 근육에 걸쳐 중심핵 생성은 기대되는 평균 1.89±0.39%의 낮은 수준으로, AAV.MHCK7.hSGCB 처리된 근육에서의 36.30±5.16%에 비교하여, 비처리된 sgcb - /-마우스에서는 평균 66.85±1.86% 중심핵을 나타내었다(p<0.0001). 아래의 표 3은 BL6 WT, sgcb -/-, 및 전신 주입된 마우스 (그룹당 n=5) 유래의 좌우측 근육의 평균 (± SEM)으로서 다양한 근육에 대해 주어진 중심핵 계수 및 섬유 직경을 제공한다. 주목할 것은 중앙에 놓인 핵으로 표시되는 퇴행/재생의 가장 중요한 물결은 sgcb - /- 근육에서 3주에 발생한다는 것이다. 동물은 이러한 인설트(insult)에 따라 처리되었으므로, 중심핵의 완전한 역전은 예상되지 않았다. 근육 조직 병리학에 대한 보다 심층적인 분석으로, 조사된 3가지 근육 모두에서 섬유 크기 분포의 정상화를 나타내었으며, 이는 비처리 sgcb-/-마우스와 비교하여 벡터로 처리된 질병 쥐에서 평균 섬유 직경의 증가를 수반한다 (GAS: sgcb-/- 비처리―28.37±0.23μm 대 AAV.hSGCB-처리―36.04±0.17μm, p<0.0001) (PSOAS: sgcb-/- 비처리―24.75±0.23μm 대 AAV.hSGCB 처리―38.43±0.28μm, p<0.0001) (TRI: sgcb - /-비처리―28±0.31μm 대 AAV.hSGCB 처리―35.56±0.22μm; p<0.0001) (도 13c, 13d, 표 3).
Figure 112018111795018-pct00002
섬유증이 LGMD2E의 병인과 처리 효과에 중요한 역할을 하기 때문에, 섬유증을 줄이는데 동일한 효능을 입증하는 것이 중요했다. 이것은 scAAVrh.74.MHCK7. hSGCB의 전신 전달 후, 국소화된 β-사르코글리칸 유전자 전달과 함께 나타났다. 콜라겐 I형과 III형에 대한 피크로시리우스 레드 염색을 사용하여, 비복근 및 횡격막 근육에서의 콜라겐 수준을 주사한 지 6개월 후 7개월령 BL6 WT 마우스 (n = 4), 비처리된 sgcb - /- 마우스 (n = 4), 및 sgcb - /- 마우스 (n = 5)에서 분석한 결과를 본 발명자들은 분석하였다. 처리된 근육은 비처리 sgcb - /- 근육에 비해 콜라겐 침착이 현저히 적게 나타났다 (도 14a). 벡터로 형질도입된 GAS 근육은 비처리된 sgcb-/- GAS 근육에서 43.55±3.33% 콜라겐과 비교하여 17.55±0.59% 콜라겐을 함유했다 (p<0.0001). 또한, 처리된 횡격막 근육은 비처리 sgcb-/- 근육 (p<0.0001)에서의 44.05±2.39%와 비교하여 21.67±1.09%의 콜라겐을 나타내었고, 이는 hSGCB 유전자 전달의 LGMD2E 표현형의 섬유성 구성 요소를 완화시키기 위한 능력을 입증하였다 (도 14b).
실시예 11: 전신 전달 후 횡격막 기능 회복
hSGCB 유전자 전달이 근육 기능을 향상시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 scAAVrh.74.MHCK7.hSCGB로 처리한 SGCB-/- 마우스 유래의 횡격막 근육의 기능적 특성을 평가했다 (방법에 대해서는 Griffin et al.를 참조하라). SGCB-/- 마우스의 횡격막에서 기능적 결핍이 처음 확립되었다. KO 횡격막은 BL6 WT 마우스와 비교하여 50.9% 감소된 비력 출력값(116.24 mN/mm2)(116.24 mN/mm2 대 236.67 mN/mm2), 및 엄격한 피로 프로토콜에 따른 더 큰 힘 감소 (SGCB-/-에서 23% 손실; BL6 WT에서 7% 감소)을 나타냈다. scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB의 꼬리 정맥 전달은, 횡격막에서의 거의 100% hSGCB 발현으로 나타나고, 이는 비력에 의한 횡격막 기능 회복을 226.07 mN의/mm2까지 개선시키고, 힘의 단지 12% 손실만을 갖는 더 큰 피로 내성을 가져왔다 (n = 5) (도 15).
실시예 12: scAAVrh . 74.CMV . miR29C의 전달은 SGCB -/-마우스에서의 섬유증을 감소시킨다
골격근 (도 2, 4, 6)과 심장 및 횡격막 (도 8)에서 확인된 광범위한 섬유증은 LGMD2E에서 콜라겐 침착 (섬유증)을 처리할 필요가 있음을 입증했다. 본 발명자들은 이전에 듀헨 근이영양증에서 (Mir29A, B 및 C 중) Mir29C가 가장 심하게 감소되었음을 발견했다. 그는 또한 Mir-29C가 베타-사르코글리칸 결핍 마우스 (LGMD2E 마우스 모델)에서도 감소될 것이라는 가설을 세웠다. 본 발명자들은 이것이 사실임을 입증했다 (도 15). Mir-29C 수준이 감소하였고, 섬유증(콜라겐) 수준이 증가하였고, 섬유증의 3가지 성분(Co1A, Col3A 및 Fbn)이 RNA 수준에서 증가되었다. 본 발명자들이 Mir29C로 섬유증을 예방할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 유전자 치료 벡터인 scrAAVrh.74.CMV.miR29c (3×1011 vgs)를 4주령 SGCB-/-마우스 (n = 5)의 전경골근에 주사하였다. scrAAVrh.74.CMV.miR29c는 도 16에 도시되어 있고, 그 전문이, 본원에 참고로 인용된 미국 가출원 제62/323,163호에 기술되어 있다. AAVrh.74.CMV.miR29C로 2개월간 처리한 후, 처리 및 조절된 SGCB-/- 마우스 및 WT 마우스로부터 TA 근육을 수집하고, 섬유증 (콜라겐 수준) (그룹당 n = 5)을 분석하였다. 시리우스 레드 염색법과 정량법을 사용하여, 처리 후 콜라겐 수치가 감소하였다 (도 17 참조). Col1A, Col3A 및 Fbn의 전사 수준은 정상화되었고, 근섬유 크기는 증가했다. 되었고, 시리우스 레드로 염색된(콜라겐 1 및 3에 대해 염색됨), 비처리 및 AAVrh.74.CMV.miR29C 처리된 전경골근의 스캐닝 전체 단면의 대표 이미지는 도 118에 나타나있다. 이것은 scAAVrh.74.CMV.miR29C가 SGCB-/-마우스에서 섬유증을 줄이고, scAAVrh.74.tMCK.hSGCB 또는 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB로의 유전자 교체와 조합하여 사용될 수 있다는 원칙의 증거를 보여준다.
실시예 13: 정맥 내로의 SGCB -/-마우스 전이가 흉부 척수의 척추 측만증을 감소시킨다
LGMD2E로 고통받는 환자의 조직 병리가 악화됨에 의한 몸통 근육의 퇴행은, 후만증에 기여할 수 있다. 척추를 지지하는 근육의 약화로 인해 흉추의 척추 측만증이 생기면, 횡격막이 앞으로 밀려, 폐 기능과 횡격막 기능을 더욱 손상시킬 수 있다. 척추 후만증의 총 해부학적 외관을 보이는 sgcb - /- 마우스의 표현형의 결과로, 7개월령 BL6 WT 마우스(n = 6), sgcb - /- 마우스 (n = 6) 및 주사 6개월 후 처리된 sgcb -/- 마우스(n = 6)에서 후만증의 정도를 결정하기 위해 전신 엑스레이 촬영이 사용되었다. 후만 지수 (KI) 점수는 척추 측만증의 수준에 대한 정량적 값을 결정한다 (Laws et al. J. Appl . Physiol . 97:1970-7, 2004). 도 19a의 WT 패널에 표시된 바와 같이, KI 점수는 앞다리부터 뒷발까지의 길이와 척추의 곡률의 정점까지의 중간선의 길이의 백분율이다. sgcb - /- 마우스는 심하게 굽은 척추 및 3.64±0.16 (n = 6)의 더 낮은 KI 점수를 나타내는 반면, BL6 WT 마우스는 척추가 상당히 더 바로서고, 6.01±0.41 (n = 6)의 높은 KI 점수를 나타된다 (p<0.01) (도 19b). 처리된 sgcb-/- 마우스는 척추에서 후만의 정도에 상당한 감소를 나타내며, KI 점수의 증가가 5.39±0.58 (n = 6)(p<0.05)로 상승하였다(도 19b). 이 데이터는 scAAVrh. 74.MHCK7.hSGCB의 정맥 내 전달이 척추의 전체적인 무결성에 유익하며, 질병에 존재하는 후만 변형과 관절의 수축을 완화시킬 수 있음을 나타된다. 이 데이터는 본 발명의 rAAV 벡터의 전신 전달 후 sgcb - /-마우스에서 후만증의 완화 및 신체 활성의 증가를 입증하였다. 이 데이터는 본 발명의 유전자 처리가 LGMD2E 환자의 삶의 질을 향상시킨다는 추가적인 증거이다.
실시예 14: 심근 병증 평가
사지와 횡격막 근육의 조직학적 파괴는 또한 7개월령 sgcb - /-마우스의 심근에서, 특히 H & E 및 피콜로시리우스 레드 염색 (도 20a)에 의해 나타난 바와 같이 심근 괴사 및 섬유증의 존재로 검출된다. 손상된 심장 기능의 발현은 종종 감소된심박출량 및 더 낮은 박출율을 갖는 확장된 심근 병증의 형태로 나타난다 (Semplicini et al., Neurology 84:1772-81, 2015, Fanin et al., Neuromuscul Disorder 13:303-9, 2003). 심장 자기공명 영상(MRI)은 BL6 WT 마우스와 비교하여 sgcb- /-마우스의 심근 기능 이상을 확립하여 기능적 결과 측정법으로 사용하기 위해, 심장의 여러 기능적 매개 변수를 평가하는데 사용되었다. 7개월령 대조군 마우스의 영상화는, 박동량이 29.4% 감소하여 sgcb - /- 심장에서의 0.041±0.0019mL에서 BL6 WT 심장에서 0.029±0.0024mL로 감소하였으며 (p<0.01), 심박출량은 31.7% 감소하여 sgcb - /- 심장에서 14.70±0.74mL/분에서 BL6 WT 심장에서 12.72±0.97mL/분으로 감소하였으며, 최종적으로, BL6 WT 심장에서의 76.35±1.67%에 비해 sgcb-/- 심장에서 66.21±3.83%로 14.3% 낮은 박출률(p <0.05) (도 20b)을 나타낸다. 이는 이 연령대의 전반적인 심장 기능의 완만한 감소와 심근 병증으로의 발전 경향을 나타내었다. 전신 전달을 통한 KO 마우스의 심장에서 hSGCB 발현을 회복시키면, 박동량을 0.032±0.0027mL로, 심박출량을 14.66±0.75mL/분으로, 그리고 박출률을 68.16±2.31%로 부분적으로 교정했다 (도 19b). 여기에 보고된 심장 조직의 조직학적 및 기능적 장애와의 상관 관계로, 심장 기능의 중요한 조절 인자이자 심근 손상의 바이오마커(biomarker)인 심장 트로포닌 I (cTrpI) 발현에 대한 웨스턴 블랏팅은, 병이 있는 sgcb-/- 심장에서, BL6 WT 마우스에서 볼 수 있는 수준의 60.38%로 감소되었다 (도 20c). 처리 후에 cTrpI의 수준은, WT 심장에서 나타나는 발현의 35.80%의 수준으로 복구된다 (도표 20d).
실시예 15: 신체 활성의 증가에 의한 횡격근의 기능회복
LGMD2E의 횡격막 기능 장애 및 호흡 부전증의 중요한 관련은, 임상적 전신 요법의 유효성에 필수적인 횡격막에 대한 기능적 이점을 요구한다. 횡격막 근육에서 채취한 스트립에 대한 생체외 실험 프로토콜을 사용하여 베타-사르코글리칸 복원이 심하게 손상된 근육에 기능적 이점을 제공하는지 여부를 평가했다. 병이 있는 마우스에서 7개월령 횡격막에서 확인된 중요한 조직 병리학에 따라, sgcb -/- 횡격막(n = 4)은 BL6 WT 마우스(n = 5)에 비해 비력 출력값에서 유의한 감소(51%)를 갖는 기능 결손 (각각 116.24±10.49 mN/mm2 대 236.67±15.87 mN/mm2, p<0.001), 뿐만 아니라 격렬한 피로 프로토콜에 따른 제1 수축 이후 생성된 더욱 큰 힘의 손실(sgcb -/-에서 23±1.0% 손실; BL6 WT에서 7.0±3.0% 손실, p<0.05)을 나타내었다(도 6a). scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB의 꼬리 정맥 전달의 6개월 후, 비력 출력의 극적인 개선이 관찰되었다. 226.07±27.12mN/mm2 (n= 5)로 증가된 비력 출력값(sgcb -/- 에 비하여 p <0.05) 및 반복 피로로부터의 근육 보호는, 단지 12.0±4.0%의 힘의 손실로 관찰되었다(sgcb- /-와 비교하여 p<0.05) (도 21a). 전반적으로, 이러한 데이터는 TA 근육에서 본 발명자들의 이전 결과를 뒷받침하고, β-사르코글리칸을 복원하면 횡격막 근육에서 기능회복을 제공한다는 것을 보여준다.
증가된 피로 및 전반적인 활성 감소의 증상은 부분적으로 후만증의 발생에 기여하는 많은 신경근 질환에서 보고된다. 결과적으로 LGMD2E의 표현형을 고려할 때, KO 마우스가 건강한 WT 마우스에 비해 자연적으로 활성이 낮고, 나아가 sgcb - /-마우스에 rAAV.MHCK7.hSGCB를 전신 전달하면 신체적으로 더욱 활성인 마우스를 생성할 것이라는 가설을 세웠다. 이 가설과 유전자 전달의 추가 잠재적 기능상의 이점을 시험하기 위해, Kobayashi 등, Nature 456: 511-5, 2008 및 Beastrom et al. Am. J. Pathol. 179:2464-74, 2011에 기재된 것과 유사한 개방-장 케이지 활성 프로토콜의 레이저-모니터링을 모든 마우스 그룹에서 수행하였다. 도 21b의 그래프는 전체 보행 (x 및 y 평면에서의 수평 운동) 및 하지 수직 들기(rearing) 모두에서 WT에 비해 KO 마우스에서 유의한 감소 (55.5%)를 나타낸다. WT 마우스에서 1시간 동안 수평 이동식 레이저 광선 차단의 평균 수는 KO 마우스에서 3271±483.8 (n = 6)에 비해 7355±400.8 (n = 6)이었다 (p<0.0001). 또한, WT 마우스에 기록된 수직 들기 빔 차단의 평균 수는 KO 마우스에서 264.5±63.36 (p <0.01)과 대조적으로 626.7±53.76이었다 (도 21b). 초기 가설에 따르면, rAAV.MHCK7.hSGCB 처리 마우스는 활성의 정량화에서 설명된 바와 같이 KO와 비교하여 눈에 띄게 활성적이었는데, 총 보행이 5143±293.2개의 빔 차단 (p<0.05)로 22.0% 증가하였고, 사지 수직 들기는 처리된 마우스 (n = 6)에서 615.3±95.93의 빔 차단 (p<0.05)으로 75%까지 급격히 증가했다 (도 21b).
실시예 16: rAAVrh . 74.MHCK7.hSGCB의 안전성 및 생체 분포 분석
hSGCB 유전자 처리의 잠재적인 독성 또는 안전성에 대한 우려는, 1.0×1012 vg 총 투여량 (5×1013 vg/kg)으로 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB를 전신 투여한 지 6개월 후에 sgcb -/- 마우스에서 평가되었다. qPCR 및 웨스턴 블랏팅을 사용하여, 벡터 투여된 sgcb - /- 동물 유래의 조직 샘플 (TA, TRI, 횡격막, 심장, 생식선, 폐, 신장, 간 및 비장)에서, 벡터 생체 분포 및 표적외 전이유전자 발현을 분석하였다. 벡터 특이적인 프라이머 프로브 세트를 사용하여, 모든 수집된 조직에서 다양한 수준의 MHCK7.hSGCB 벡터 게놈이 검출되었다. 예상대로, 최고 수준은 간세포 뿐만 아니라 골격근 및 심장에서도 관찰되었으며, 이는 시험 약물이 벡터 투여된 마우스의 모든 의도된 근육으로 효율적으로 전달되었음을 나타낸다 (도 22a). 또한, hSGCB 단백질 발현을 검출하기 위한 웨스턴 블랏팅은 근육-특이적인 MHCK7 프로모터의 기능 및 심장 및 골격근으로 제한된 형질전환 유전자의 발현을 확인하였다. 베타-사르코글리칸 단백질 발현은 심장 샘플뿐만 아니라 모든 골격근 샘플에서 다양한 양으로 관찰되었으며, 중요한 것은 비 근육 조직에서는 검출되지 않았다는 것인데, 이는 베타-사르코글리칸이 근육-특이적 단백질로 알려져 있다는 사실에 의해 뒷받침되었다 (도 22b). 마지막으로 헤마톡실린 & 에오신 염색은 5마리의 sgcb - /- 마우스 및 본 연구에서 사용된 처리 투여량으로 본 발명의 벡터로 전신 처리된 5마리의 C57BL6 WT 마우스에서 채취한 근육 조직 및 모든 표적외 장기의 절편에서 수행되었다. 이 절편은 수의학 병리학자가 독성에 대해 정식으로 검토하였으며, 어떤 마우스의 샘플에서도 부작용이 발견되지 않았다. 종합하면, 이 자료는 이 시험 물품이 시험 동물에 잘 견딘다는 것을 나타낸다.
상대적으로 낮은 투여량 (1×1012 vg 총 투여량, 5×1013 vg/kg)을 사용하여 부작용없이 신체의 모든 근육에서 이러한 높은 수준의 형질도입이 달성되었다는 사실은, LGMD2E 환자에 대한 번역을 위한 큰 가능성을 제공한다. 임상적 관점에서, 본원에 기술된 실험에서 사용된 투여량은 현재 임상 시험중인 SMA를 갖는 아기에 전달된 SMN1 발현 AAV 처리의 전신 전달에 사용된 투여량보다 훨씬 낮다(Mendell et al., Mol. Ther. 24: S190, 2016). 기능상의 이점을 수반한 MHCK7 프로모터를 이용한 β-사르코글리칸 발현의 고효율적 복원은 임상적으로 적용될 수 있는 투약 수준에서 매우 고무적이며, LGMD2E 환자의 β-사르코글리칸 결핍에서의 심장 관련 요인이 높은 경우 전신 전달은 이러한 환자에게 큰 이점을 제공한다.
참고문헌
Figure 112018111795018-pct00003
Figure 112018111795018-pct00004
Figure 112018111795018-pct00005
Figure 112018111795018-pct00006
SEQUENCE LISTING <110> Research Institute at Nationwide Children's Hospital <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR DELIVERY OF B-SARCOGLYCAN AND MICRORNA-29 AND THE TREATMENT OF MUSCULAR DYSTROPHY <130> 28335/50622A <150> US 62/433,548 <151> 2016-12-13 <150> US 62/323,333 <151> 2016-04-15 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 957 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Beta-sarcoglycan <400> 1 atggcagcag cagccgccgc agccgccgag cagcagtcaa gcaatggacc agtgaaaaaa 60 tcaatgagag aaaaagccgt cgagaggaga tcagtgaata aggagcacaa cagcaatttc 120 aaagccggct acatccctat tgacgaagat cgcctgcata agacaggcct gagggggcgc 180 aaaggaaacc tggcaatctg cgtcatcatt ctgctgttta tcctggccgt gattaatctg 240 atcattactc tggtgatttg ggctgtcatc cgcattggcc caaacgggtg tgactctatg 300 gagttccacg aaagtggcct gctgcgattt aagcaggtgt ccgatatggg ggtcatccat 360 ccactgtaca aatctactgt cggcgggcgg agaaacgaga atctggtgat caccgggaac 420 aatcagccca ttgtgttcca gcagggaacc acaaagctgt ctgtggaaaa caataaaaca 480 tcaatcacta gcgacattgg catgcagttc tttgatcccc ggacccagaa tatcctgttc 540 agtaccgact atgagacaca cgaatttcat ctgccttccg gggtgaagtc tctgaacgtc 600 cagaaagcca gcactgagag aatcaccagt aacgctacat cagacctgaa tatcaaggtg 660 gatggacgag ctattgtccg gggaaatgag ggcgtgttca tcatgggcaa gacaattgaa 720 tttcacatgg gaggcaacat ggagctgaaa gcagaaaaca gcatcattct gaatgggagc 780 gtgatggtct ccactaccag actgcccagc tcctctagtg gagaccagct ggggtccgga 840 gattgggtca ggtataagct gtgcatgtgt gccgatggca ccctgtttaa agtgcaggtc 900 accagccaga atatgggatg tcagattagc gataaccctt gtgggaatac tcattaa 957 <210> 2 <211> 318 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Beta-sarcoglycan <400> 2 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Gln Gln Ser Ser Asn Gly 1 5 10 15 Pro Val Lys Lys Ser Met Arg Glu Lys Ala Val Glu Arg Arg Ser Val 20 25 30 Asn Lys Glu His Asn Ser Asn Phe Lys Ala Gly Tyr Ile Pro Ile Asp 35 40 45 Glu Asp Arg Leu His Lys Thr Gly Leu Arg Gly Arg Lys Gly Asn Leu 50 55 60 Ala Ile Cys Val Ile Ile Leu Leu Phe Ile Leu Ala Val Ile Asn Leu 65 70 75 80 Ile Ile Thr Leu Val Ile Trp Ala Val Ile Arg Ile Gly Pro Asn Gly 85 90 95 Cys Asp Ser Met Glu Phe His Glu Ser Gly Leu Leu Arg Phe Lys Gln 100 105 110 Val Ser Asp Met Gly Val Ile His Pro Leu Tyr Lys Ser Thr Val Gly 115 120 125 Gly Arg Arg Asn Glu Asn Leu Val Ile Thr Gly Asn Asn Gln Pro Ile 130 135 140 Val Phe Gln Gln Gly Thr Thr Lys Leu Ser Val Glu Asn Asn Lys Thr 145 150 155 160 Ser Ile Thr Ser Asp Ile Gly Met Gln Phe Phe Asp Pro Arg Thr Gln 165 170 175 Asn Ile Leu Phe Ser Thr Asp Tyr Glu Thr His Glu Phe His Leu Pro 180 185 190 Ser Gly Val Lys Ser Leu Asn Val Gln Lys Ala Ser Thr Glu Arg Ile 195 200 205 Thr Ser Asn Ala Thr Ser Asp Leu Asn Ile Lys Val Asp Gly Arg Ala 210 215 220 Ile Val Arg Gly Asn Glu Gly Val Phe Ile Met Gly Lys Thr Ile Glu 225 230 235 240 Phe His Met Gly Gly Asn Met Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ser Ile Ile 245 250 255 Leu Asn Gly Ser Val Met Val Ser Thr Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser 260 265 270 Ser Gly Asp Gln Leu Gly Ser Gly Asp Trp Val Arg Tyr Lys Leu Cys 275 280 285 Met Cys Ala Asp Gly Thr Leu Phe Lys Val Gln Val Thr Ser Gln Asn 290 295 300 Met Gly Cys Gln Ile Ser Asp Asn Pro Cys Gly Asn Thr His 305 310 315 <210> 3 <211> 2306 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> pAAV.MHCK7.hSCGB <400> 3 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt aaccaattgg 120 cgcggccgca agcttgcatg tctaagctag acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag 180 ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc tcctgtctct cctctatctg cccatcggcc 240 ctttggggag gaggaatgtg cccaaggact aaaaaaaggc catggagcca gaggggcgag 300 ggcaacagac ctttcatggg caaaccttgg ggccctgctg tctagcatgc cccactacgg 360 gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat 420 taacccagac atgtggctgc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct 480 gtccctggtg gatcccctgc atgcgaagat cttcgaacaa ggctgtgggg gactgagggc 540 aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt atacgtgcct gggactccca aagtattact 600 gttccatgtt cccggcgaag ggccagctgt cccccgccag ctagactcag cacttagttt 660 aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg cagcccatac aaggccatgg ggctgggcaa 720 gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg tgcccgggca acgagctgaa agctcatctg 780 ctctcagggg cccctccctg gggacagccc ctcctggcta gtcacaccct gtaggctcct 840 ctatataacc caggggcaca ggggctgccc tcattctacc accacctcca cagcacagac 900 agacactcag gagcagccag cggcgcgccc aggtaagttt agtctttttg tcttttattt 960 caggtcccgg atccggtggt ggtgcaaatc aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt 1020 tacttctagg cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccgg 1080 taccgccacc atggcagcag cagccgccgc agccgccgag cagcagtcaa gcaatggacc 1140 agtgaaaaaa tcaatgagag aaaaagccgt cgagaggaga tcagtgaata aggagcacaa 1200 cagcaatttc aaagccggct acatccctat tgacgaagat cgcctgcata agacaggcct 1260 gagggggcgc aaaggaaacc tggcaatctg cgtcatcatt ctgctgttta tcctggccgt 1320 gattaatctg atcattactc tggtgatttg ggctgtcatc cgcattggcc caaacgggtg 1380 tgactctatg gagttccacg aaagtggcct gctgcgattt aagcaggtgt ccgatatggg 1440 ggtcatccat ccactgtaca aatctactgt cggcgggcgg agaaacgaga atctggtgat 1500 caccgggaac aatcagccca ttgtgttcca gcagggaacc acaaagctgt ctgtggaaaa 1560 caataaaaca tcaatcacta gcgacattgg catgcagttc tttgatcccc ggacccagaa 1620 tatcctgttc agtaccgact atgagacaca cgaatttcat ctgccttccg gggtgaagtc 1680 tctgaacgtc cagaaagcca gcactgagag aatcaccagt aacgctacat cagacctgaa 1740 tatcaaggtg gatggacgag ctattgtccg gggaaatgag ggcgtgttca tcatgggcaa 1800 gacaattgaa tttcacatgg gaggcaacat ggagctgaaa gcagaaaaca gcatcattct 1860 gaatgggagc gtgatggtct ccactaccag actgcccagc tcctctagtg gagaccagct 1920 ggggtccgga gattgggtca ggtataagct gtgcatgtgt gccgatggca ccctgtttaa 1980 agtgcaggtc accagccaga atatgggatg tcagattagc gataaccctt gtgggaatac 2040 tcattaaaag cttggccgca ataaaagatc tttattttca ttagatctgt gtgttggttt 2100 tttgtgtgtc ctgcaggggc gcgcctctag agcatggcta cgtagataag tagcatggcg 2160 ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 2220 ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg 2280 cggcctcagt gagcgagcga gcgcgc 2306 <210> 4 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> MHCK7 promoter <400> 4 aagcttgcat gtctaagcta gacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt 60 aggggaggtg gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga 120 ggaggaatgt gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga 180 cctttcatgg gcaaaccttg gggccctgct gtctagcatg ccccactacg ggtctaggct 240 gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca cccgagatgc ctggttataa ttaacccaga 300 catgtggctg cccccccccc cccaacacct gctgcctcta aaaataaccc tgtccctggt 360 ggatcccctg catgcgaaga tcttcgaaca aggctgtggg ggactgaggg caggctgtaa 420 caggcttggg ggccagggct tatacgtgcc tgggactccc aaagtattac tgttccatgt 480 tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca gctagactca gcacttagtt taggaaccag 540 tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata caaggccatg gggctgggca agctgcacgc 600 ctgggtccgg ggtgggcacg gtgcccgggc aacgagctga aagctcatct gctctcaggg 660 gcccctccct ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc tctatataac 720 ccaggggcac aggggctgcc ctcattctac caccacctcc acagcacaga cagacactca 780 ggagcagcca gc 792 <210> 5 <211> 2244 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> pAAV.tMCK.hSGCB <400> 5 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt aaccaattgg 120 cggccgcaaa cttgcatgcc ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc 180 tggggacacc cgagatgcct ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc 240 aacacctgct gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg 300 tacaccatgg aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tccactacgg 360 gtctatgctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat 420 taaccccaac acctgctgcc cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc tgagcggtta 480 ccccaccccg gtgcctgggt cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc tcgctctaaa 540 aataaccctg tccctggtgg accactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc 600 ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc 660 aacacctgct gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg 720 tacaccatgg aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtcct ccctggggac 780 agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc 840 tgcccccggg tcacctgcag aagttggtcg tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt 900 acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg 960 cgtttctgat aggcacctat tggtcttact gacatccact ttgcctttct ctccacaggt 1020 gtccactccc agttcaatta cagcgcgtgg taccaccatg gcagcagcag ccgccgcagc 1080 cgccgagcag cagtcaagca atggaccagt gaaaaaatca atgagagaaa aagccgtcga 1140 gaggagatca gtgaataagg agcacaacag caatttcaaa gccggctaca tccctattga 1200 cgaagatcgc ctgcataaga caggcctgag ggggcgcaaa ggaaacctgg caatctgcgt 1260 catcattctg ctgtttatcc tggccgtgat taatctgatc attactctgg tgatttgggc 1320 tgtcatccgc attggcccaa acgggtgtga ctctatggag ttccacgaaa gtggcctgct 1380 gcgatttaag caggtgtccg atatgggggt catccatcca ctgtacaaat ctactgtcgg 1440 cgggcggaga aacgagaatc tggtgatcac cgggaacaat cagcccattg tgttccagca 1500 gggaaccaca aagctgtctg tggaaaacaa taaaacatca atcactagcg acattggcat 1560 gcagttcttt gatccccgga cccagaatat cctgttcagt accgactatg agacacacga 1620 atttcatctg ccttccgggg tgaagtctct gaacgtccag aaagccagca ctgagagaat 1680 caccagtaac gctacatcag acctgaatat caaggtggat ggacgagcta ttgtccgggg 1740 aaatgagggc gtgttcatca tgggcaagac aattgaattt cacatgggag gcaacatgga 1800 gctgaaagca gaaaacagca tcattctgaa tgggagcgtg atggtctcca ctaccagact 1860 gcccagctcc tctagtggag accagctggg gtccggagat tgggtcaggt ataagctgtg 1920 catgtgtgcc gatggcaccc tgtttaaagt gcaggtcacc agccagaata tgggatgtca 1980 gattagcgat aacccttgtg ggaatactca ttaaaagctt ggccgcaata aaagatcttt 2040 attttcatta gatctgtgtg ttggtttttt gtgtgtcctg caggggcgcg cctctagagc 2100 atggctacgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga 2160 tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 2220 tcgcccgacg cccgggcttt gccc 2244 <210> 6 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> tMCK promoter <400> 6 ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60 ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 120 gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct 180 cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tccactacgg gtctatgctg cccatgtaag 240 gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc 300 cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc tgagcggtta ccccaccccg gtgcctgggt 360 cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc tcgctctaaa aataaccctg tccctggtgg 420 accactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc 480 tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 540 gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct 600 cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtcct ccctggggac agcccctcct ggctagtcac 660 accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc tgcccccggg tcac 714 <210> 7 <211> 296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> miR29c <400> 7 ggccggcctg tttgaatgag gcttcagtac tttacagaat cgttgcctgc acatcttgga 60 aacacttgct gggattactt cttcaggtta acccaacaga aggctcgaga aggtatattg 120 ctgttgacag tgagcgcaac cgatttcaaa tggtgctaga gtgaagccac agatgtctag 180 caccatttga aatcggttat gcctactgcc tcggaattca aggggctact ttaggagcaa 240 ttatcttgtt tactaaaact gaataccttg ctatctcttt gatacattgg ccggcc 296 <210> 8 <211> 3384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> pAAV.CMV.Mir29C <400> 8 cagcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 60 acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggggttaaac 120 tcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 180 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 240 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 300 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 360 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 420 ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 480 gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 540 gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 600 tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac 660 gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccggactc 720 tagaggatcc ggtactcgag gaactgaaaa accagaaagt taactggtaa gtttagtctt 780 tttgtctttt atttcaggtc ccggatccgg tggtggtgca aatcaaagaa ctgctcctca 840 gtggatgttg cctttacttc taggcctgta cggaagtgtt acttctgctc taaaagctgc 900 ggaattgtac ccggggccga tccaccggtc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 960 aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca 1020 tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa 1080 gctggccggc ctgtttgaat gaggcttcag tactttacag aatcgttgcc tgcacatctt 1140 ggaaacactt gctgggatta cttcttcagg ttaacccaac agaaggctcg agaaggtata 1200 ttgctgttga cagtgagcgc aaccgatttc aaatggtgct agagtgaagc cacagatgtc 1260 tagcaccatt tgaaatcggt tatgcctact gcctcggaat tcaaggggct actttaggag 1320 caattatctt gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat tggccggcct 1380 gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc 1440 cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga tggccgcttc ccggccctgc tgcagggagc 1500 tcaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa 1560 agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc 1620 aggcacctcg attagttctc gagcttttgg agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg 1680 ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag tgggtggaga ctgaagttag gccagcttgg 1740 cacttgatgt aattctcctt ggaatttgcc ctttttgagt ttggatcttg gttcattctc 1800 aagcctcaga cagtggttca aagttttttt cttccatttc aggtgtcgtg aaaagctagc 1860 gctaccggac tcagatctcg agctcaagct gcggggatcc agacatgata agatacattg 1920 atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt 1980 gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca 2040 attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt tcactagtag 2100 catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg 2160 atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 2220 gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgccagctg 2280 gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg 2340 cgaatggaat tccagacgat tgagcgtcaa aatgtaggta tttccatgag cgtttttcct 2400 gttgcaatgg ctggcggtaa tattgttctg gatattacca gcaaggccga tagtttgagt 2460 tcttctactc aggcaagtga tgttattact aatcaaagaa gtattgcgac aacggttaat 2520 ttgcgtgatg gacagactct tttactcggt ggcctcactg attataaaaa cacttctcag 2580 gattctggcg taccgttcct gtctaaaatc cctttaatcg gcctcctgtt tagctcccgc 2640 tctgattcta acgaggaaag cacgttatac gtgctcgtca aagcaaccat agtacgcgcc 2700 ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 2760 tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 2820 cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 2880 acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 2940 ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 3000 gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 3060 tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 3120 ttttaacaaa atattaacgt ttacaattta aatatttgct tatacaatct tcctgttttt 3180 ggggcttttc tgattatcaa ccggggtaca tatgattgac atgctagttt tacgattacc 3240 gttcatcgat tctcttgttt gctccagact ctcaggcaat gacctgatag cctttgtaga 3300 gacctctcaa aaatagctac cctctccggc atgaatttat cagctagaac ggttgaatat 3360 catattgatg gtgatttgac tgtc 3384 <210> 9 <211> 296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> miR29c <400> 9 ggccggcctg tttgaatgag gcttcagtac tttacagaat cgttgcctgc acatcttgga 60 aacacttgct gggattactt cttcaggtta acccaacaga aggctcgaga aggtatattg 120 ctgttgacag tgagcgcaac cgatttcaaa tggtgctaga gtgaagccac agatgtctag 180 caccatttga aatcggttat gcctactgcc tcggaattca aggggctact ttaggagcaa 240 ttatcttgtt tactaaaact gaataccttg ctatctcttt gatacattgg ccggcc 296 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> tMCK forward primer <400> 10 acccgagatg cctggttata att 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> tMCK reverse primer <400> 11 tccatggtgt acagagccta agac 24 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> tMCK probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' FAM <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> 3' TAMRA <400> 12 ctgctgcctg agcctgagcg gttac 25 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> tMCK intron Forward Primer <400> 13 gtgaggcact gggcaggtaa 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> tMCK intron Reverse Primer <400> 14 acctgtggag agaaaggcaa ag 22 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> tMCK intron Probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' 6FAM <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> 3' TAMRA <400> 15 atcaaggtta caagacaggt ttaaggagac caatagaaa 39 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 ccaacacctg ctgcctctaa a 21 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> MHCK7 reverse primer <400> 17 gtcccccaca gccttgttc 19 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <223> MHCK7 probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' FAM <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Zen <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> 3IABKFQ <400> 18 tggatcccct gcatgcgaag atc 23

Claims (49)

  1. 서열번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 또는 AAV rh.74의 벡터인 재조합 AAV 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 근육-특이적 조절 요소를 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 근육-특이적 조절 요소가 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 (MEF) 요소, 근육 크레아틴 키나아제 (MCK) 프로모터, 절단된 MCK (tMCK) 프로모터, 마이오신 중쇄 (MHC) 조절 요소, MHCK7 프로모터, C5-12, 쥐 크레아틴 키나아제 인핸서 요소, 골격 빠른-트위치 트로포닌 C 유전자 요소, 느린-트위치 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 느린-트위치 트로포닌 I 유전자 요소, 저산소증 반응 요소 (HRE), 스테로이드-유도성 요소 또는 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE)인 재조합 AAV 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 근육-특이적 조절 요소가 절단된 MCK (tMCK) 프로모터인 재조합 AAV 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 절단된 MCK (tMCK) 프로모터가 서열번호 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 근육-특이적 조절 요소가 MHCK7 프로모터인 재조합 AAV 벡터.
  8. 제7항에 있어서, MHCK7 프로모터가 서열번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
  9. 서열번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  10. 서열번호 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  11. 치료 유효량의 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 포함하는, 피험체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조성물.
  12. 치료 유효량의 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 포유류 피험체에서 근력 및/또는 근육량을 증가시키거나, 섬유증을 감소시키거나, 또는 수축-유발성 상해를 감소시키기 위한 조성물.
  13. 치료 유효량의 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 포함하는, 피험체에서 β-사르코글리칸 병증을 치료하기 위한 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 근이영양증이 지대형 근이영양증(limb-girdle muscular dystrophy)인 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 근이영양증이 지대형 근이영양증인 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 재조합 AAV 벡터가 근육내 주사, 정맥내 주사 또는 전신 투여를 위해 제형화되는 것인 조성물.
  17. 제12항에 있어서, 재조합 AAV 벡터가 근육내 주사, 정맥내 주사 또는 전신 투여를 위해 제형화되는 것인 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 재조합 AAV 벡터가 근육내 주사, 정맥내 주사 또는 전신 투여를 위해 제형화되는 것인 조성물.
  19. 제11항에 있어서, 재조합 AAV 벡터가 주사, 투입(infusion) 또는 피하 주입(implantation)에 의한 비경구 투여를 위해 제형화되는 것인 조성물.
  20. 제12항에 있어서, 재조합 AAV 벡터가 주사, 투입 또는 피하 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화되는 것인 조성물.
  21. 제13항에 있어서, 재조합 AAV 벡터가 주사, 투입 또는 피하 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화되는 것인 조성물.
  22. 제11항에 있어서, miR29C를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 AAV 벡터의 투여를 추가로 포함하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 제2 재조합 AAV 벡터가 서열번호 9에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 제2 재조합 AAV 벡터가 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여되는 것인 조성물.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
KR1020187032688A 2016-04-15 2017-06-20 β-사르코글리칸 및 마이크로RNA-29의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달 및 근이영양증의 처리 KR102502091B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662323333P 2016-04-15 2016-04-15
US62/323,333 2016-04-15
US201662433548P 2016-12-13 2016-12-13
US62/433,548 2016-12-13
PCT/US2017/027583 WO2017180976A1 (en) 2016-04-15 2017-04-14 Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and microrna-29 and the treatment of muscular dystrophy

Publications (3)

Publication Number Publication Date
KR20180137511A KR20180137511A (ko) 2018-12-27
KR102502091B1 true KR102502091B1 (ko) 2023-02-20
KR102502091B9 KR102502091B9 (ko) 2023-04-17

Family

ID=60042261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187032688A KR102502091B1 (ko) 2016-04-15 2017-06-20 β-사르코글리칸 및 마이크로RNA-29의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달 및 근이영양증의 처리

Country Status (17)

Country Link
US (2) US11358993B2 (ko)
EP (1) EP3442600B1 (ko)
JP (2) JP7079733B2 (ko)
KR (1) KR102502091B1 (ko)
CN (2) CN117384964A (ko)
AU (2) AU2017250756B2 (ko)
BR (1) BR112018071167A2 (ko)
CA (1) CA3021057A1 (ko)
CO (1) CO2018012082A2 (ko)
IL (1) IL262262B2 (ko)
MA (1) MA44681A (ko)
MX (2) MX2018012605A (ko)
MY (1) MY195439A (ko)
SA (1) SA518400245B1 (ko)
SG (1) SG11201809029RA (ko)
WO (1) WO2017180976A1 (ko)
ZA (1) ZA201806863B (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3020403A1 (en) 2014-11-14 2016-05-18 Universitat de Valéncia Compounds for the treatment of myotonic dystrophy
MA45477A (fr) * 2016-04-15 2019-02-20 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administration à vecteurs de virus adéno-associé de microarn-29 et micro-dystrophine pour traiter la dystrophie musculaire
MX2018012605A (es) * 2016-04-15 2019-07-04 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administracion de vectores del virus adenoasociado de b-sarcoglicano y microarn-29 y el tratamiento de la distrofia muscular.
KR20200083495A (ko) * 2017-10-20 2020-07-08 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 Nt-3 유전자 치료를 위한 방법 및 물질
BR112020025995A2 (pt) * 2018-06-18 2021-03-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital administração de microdistrofina músculo-específica por vetor de vírus adeno-associado para tratar a distrofia muscular
TW202020161A (zh) * 2018-06-29 2020-06-01 美國全美兒童醫院之研究學會 用於治療肢帶型肌營養不良症2a之重組腺相關病毒產品與方法
EP3598978A1 (en) 2018-07-26 2020-01-29 EXOFIX S.r.l. Fibroadipogenic progenitor-derived exosomes for regeneration of dystrophic muscles
WO2020154034A1 (en) * 2019-01-25 2020-07-30 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating muscular dystrophy and related disorders
KR20210133242A (ko) 2019-02-26 2021-11-05 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 B-사르코글리칸의 아데노 관련 바이러스 벡터 전달 및 근이영양증의 치료
TW202120532A (zh) * 2019-08-21 2021-06-01 美國全美兒童醫院之研究學會 α肌聚糖之腺相關病毒載體遞送及肌肉萎縮症之治療
WO2021126880A1 (en) * 2019-12-16 2021-06-24 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for restoring and maintaining the dystrophin-associated protein complex (dapc)
JP2023059858A (ja) 2021-10-15 2023-04-27 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 自己相補的アデノ随伴ウイルスベクター及び筋ジストロフィーの治療におけるその使用

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
PT733103E (pt) 1993-11-09 2004-07-30 Targeted Genetics Corp Criacao de elevados titulos de vectores de aav recombinantes
JP3952312B2 (ja) 1993-11-09 2007-08-01 メディカル カレッジ オブ オハイオ アデノ関連ウイルス複製遺伝子を発現可能な安定な細胞株
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
US6143548A (en) 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
JPH11514853A (ja) 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
US5672694A (en) * 1995-10-24 1997-09-30 University Of Iowa Research Foundation β-sarcoglycan nucleic acid sequence, and nucleic acid probes
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
EP0932418B1 (en) 1996-09-06 2007-12-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
CA2302992C (en) 1997-09-05 2011-11-01 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
JP4520569B2 (ja) 2000-02-18 2010-08-04 照彦 豊岡 拡張型心筋症の遺伝子治療剤
US7056502B2 (en) 2000-04-28 2006-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with AAV5 capsids and AAV5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US6962815B2 (en) 2001-01-05 2005-11-08 Children's Hopital Inc. AAV2 vectors and methods
US20040126762A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer
WO2003092594A2 (en) 2002-04-30 2003-11-13 Duke University Adeno-associated viral vectors and methods for their production from hybrid adenovirus and for their use
US20030225260A1 (en) 2002-04-30 2003-12-04 Snyder Richard O. Production of recombinant AAV virions
US7883858B2 (en) 2005-01-27 2011-02-08 Institute For Systems Biology Methods for identifying and monitoring drug side effects
AU2006304605A1 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
JP5244103B2 (ja) 2006-08-09 2013-07-24 ホームステッド クリニカル コーポレイション 器官特異的蛋白質およびその使用方法
CN101711164B (zh) 2007-01-18 2014-06-04 密苏里-哥伦比亚大学 可修复肌纤维膜中的神经元型一氧化氮合酶的合成小/微-抗肌萎缩蛋白基因
WO2009054725A2 (en) 2007-10-26 2009-04-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
WO2009137006A2 (en) 2008-04-30 2009-11-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
US8236557B2 (en) 2008-05-28 2012-08-07 University Of Missouri-Columbia Hybrid-AAV vectors to deliver large gene expression cassette
WO2010065630A2 (en) * 2008-12-03 2010-06-10 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating hepatic neoplasia
WO2013075008A1 (en) 2011-11-16 2013-05-23 University Of Florida Research Foundation Inc. Aav dual vector systems for gene therapy
US9434928B2 (en) 2011-11-23 2016-09-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
JP6373763B2 (ja) 2012-02-17 2018-08-22 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアＴｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ａａｖベクター成分、及び、細胞、臓器並びに組織への遺伝子導入のための方法
EP2833892A4 (en) 2012-04-02 2016-07-20 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS AND PEPTIDES ASSOCIATED WITH ONCOLOGY
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
US9624282B2 (en) 2012-11-26 2017-04-18 The Curators Of The University Of Missouri Microdystrophin peptides and methods for treating muscular dystrophy using the same
FR3004463A1 (fr) * 2013-04-11 2014-10-17 Genethon Systeme d'expression pour une therapie genique selective
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
JP6626829B2 (ja) 2014-01-21 2019-12-25 フレイエ ユニヴェルシテイト ブリュッセルＶｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ 筋特異的核酸調節エレメント並びにその方法及び使用
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
EP2960336A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Genethon Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
MX2018012605A (es) * 2016-04-15 2019-07-04 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administracion de vectores del virus adenoasociado de b-sarcoglicano y microarn-29 y el tratamiento de la distrofia muscular.
KR20230035043A (ko) * 2020-06-15 2023-03-10 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 근이영양증을 위한 아데노-연관 바이러스 벡터 전달

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank NO_000223.1. beta-sarcoglycan sequence (1999.3.19)*
Gene Therapy (2016, epub 2015.8.20) Vol.23, pp57-66.*
Molecular Therapy, (2012) Vol. 20, No. 6, pp1222-1233.*

Also Published As

Publication number Publication date
BR112018071167A2 (pt) 2019-02-05
MX2018012605A (es) 2019-07-04
IL262262A (en) 2018-11-29
US20190202880A1 (en) 2019-07-04
AU2017250756B2 (en) 2021-04-08
AU2017250756A1 (en) 2018-11-01
AU2021203044B2 (en) 2023-02-09
US20220251156A1 (en) 2022-08-11
CO2018012082A2 (es) 2019-02-08
KR20180137511A (ko) 2018-12-27
CN109121395A (zh) 2019-01-01
KR102502091B9 (ko) 2023-04-17
ZA201806863B (en) 2019-12-18
SG11201809029RA (en) 2018-11-29
CN117384964A (zh) 2024-01-12
AU2021203044A1 (en) 2021-06-10
IL262262B1 (en) 2023-06-01
EP3442600B1 (en) 2024-03-13
CA3021057A1 (en) 2017-10-19
JP2022084940A (ja) 2022-06-07
SA518400245B1 (ar) 2022-11-25
JP2019513399A (ja) 2019-05-30
JP7079733B2 (ja) 2022-06-02
JP7390426B2 (ja) 2023-12-01
WO2017180976A1 (en) 2017-10-19
IL262262B2 (en) 2023-10-01
CN109121395B (zh) 2022-08-09
EP3442600A4 (en) 2019-10-09
MX2022003857A (es) 2022-05-26
EP3442600A1 (en) 2019-02-20
MY195439A (en) 2023-01-21
MA44681A (fr) 2019-02-20
US11358993B2 (en) 2022-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102502091B1 (ko) β-사르코글리칸 및 마이크로RNA-29의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달 및 근이영양증의 처리
CN110997923B (zh) 腺相关病毒载体递送肌肉特异性微肌营养不良蛋白以治疗肌营养不良症
US20200360534A1 (en) Gene therapy for limb-girdle muscular dystrophy type 2c
US20220168447A1 (en) Plakophilin-2 (pkp2) gene therapy using aav vector
TW202000915A (zh) 腺相關病毒載體遞送肌肉特異性微小肌縮蛋白以治療肌肉萎縮症
EP3930765A1 (en) Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
US20230227515A1 (en) Optimized gene therapy for targeting muscle in muscle diseases
US20230139985A1 (en) Self-Complementary Adeno-Associated Virus Vector and its Use in Treatment of Muscular Dystrophy
EA044609B1 (ru) Доставка бета-саркогликана и микрорнк-29 вектором на основе аденоассоциированного вируса и лечение мышечной дистрофии
WO2023205767A2 (en) B-cell lymphoma 2–associated anthanogene 3 (bag3) gene therapy using aav vector

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
G170 Re-publication after modification of scope of protection [patent]