JP2022084940A - β－サルコグリカン及びマイクロＲＮＡ－２９のアデノ随伴ウイルスベクター送達ならびに筋ジストロフィーの治療 - Google Patents

Abstract

【課題】β－サルコグリカンを含むポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクター、及び筋ジストロフィーに罹患している哺乳類の対象における線維症を軽減または予防するために組換えベクターを使用する方法を提供すること。【解決手段】また、β－サルコグリカン及びｍｉＲ－２９ｃを発現するＡＡＶベクター（複数可）を筋ジストロフィーに罹患している哺乳類の対象に投与することを含む併用療法が本明細書に記載される。本明細書には、β－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターのような治療ベクター、ならびに筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を軽減及び予防するためにこれらのベクターを使用する方法が記載される。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１６年４月１５日に出願された米国仮出願第６２／３２３，３３３号及び２０１６年１２月１３日に出願された米国仮出願第６２／４３３，５４８号の優先権を主張するものであり、その両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、ファイル名：５０６２２Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：２１，４６６バイト、作成：２０１７年４月１３日として認識されるコンピュータ可読形態の配列表を含む。

本明細書には、β－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターのような治療ベクター、ならびに筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を軽減及び予防するためにこれらのベクターを使用する方法が記載される。本発明はまた、筋ジストロフィーに罹患している患者における線維症を軽減及び予防するための、β－サルコグリカンを発現する第１のＡＡＶベクター及びｍｉＲ－２９を発現する第２のＡＡＶベクターの投与を含む、併用遺伝子療法を提供する。

肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）２Ｅ型（ＬＧＭＤ２Ｅ）は、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）をコードする遺伝子の突然変異に起因する常染色体劣性障害であり、機能性タンパク質の喪失を引き起こす。１ ＬＧＭＤ２Ｅは、米国におけるＬＧＭＤの比較的に一般的かつ重度の形態を表し、世界的に１／２０万～１／３５万の発生率が報告されている。（２）β－サルコグリカンの不在は、すべて筋肉の強度及び機能の悪化をもたらす、慢性的な筋線維の喪失、炎症、脂肪置換、及び線維症を伴う進行性ジストロフィーを引き起こす。（３、４）複合体として、３５～５０ｋＤのサイズの範囲内である、（５）サルコグリカン（α－、β、γ－、δ－）はすべて、筋活動中の機械的応力からの保護を提供する筋鞘に安定性をもたらす膜貫通タンパク質である。（３）ＬＧＭＤ２Ｅにおける３－サルコグリカンの喪失は、通常、筋線維の喪失に至る筋膜の脆性に寄与する様々な程度の他のサルコグリカンタンパク質の付随する喪失を引き起こす。１ ＬＧＭＤ２Ｅの臨床的表現型の範囲は様々であるが、診断は典型的には１０歳までに行われ、１０代半ばから後半までに歩行の喪失が起こる。１、６、７患者は、上昇した血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、近位筋の衰弱、床からの立ち上がり困難、及び進行性歩行喪失の症状を示す。症例の５０％において心臓障害が発生する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部分は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一ＡＡＶイントロンの差異的スプライシングにより（ヌクレオチド２１０７及び２２２７において）連結された２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の生成をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）においてレビューされる。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド内のクローニングされたＤＮＡとして挿入される。さらに、ＡＡＶ複製及びゲノムカプシド形成を指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部または全てが、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。

複数の研究は、筋肉内での長期（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉が高度に血管新生されるため、組換えＡＡＶ形質導入により、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されるように、筋肉内注射後に体循環に導入遺伝子産物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現することができることを示す。

ＬＧＭＤ２Ｅのための療法の新たに出現した形態は、罹患した筋肉への野生型タンパク質を回復するためのウイルス媒介遺伝子送達であり、筋機能の回復をもたらす。患者のサブセットが心筋症を発症する可能性があることを考慮すると（８、９、１０、１３）、これらの患者の長期ケアにおいて考慮する必要がある。以前の報告では、Ｓｇｃｂヌルマウスは十分に特徴付けられていた。Ａｒａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．３は、サルコスパンだけでなくサルコグリカンすべての喪失を伴い、メロシン、ジストログリカン、及びジストロフィンを少なくともわずかに保存し、ＬＧＭＤ２Ｅにおいて見られる臨床像を再現する、β－サルコグリカン欠損マウスを開発した。この動物モデルにおける組織学的変化は、顕性の骨格筋線維症を含む、臨床的対応のプロトタイプでもあった。（１４）Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２５）は、ｒＡＡＶ２．ＣＭＶ．ＳＧＣＢを用いて腹横筋を注射した。発現は２１ヶ月間持続し、筋線維は再発性壊死から保護された。導入遺伝子発現を増強するための自己相補的ＡＡＶの使用、１６、骨格筋をより良好に標的化する筋特異的プロモーター（２０、２６）、及びヒトβ－サルコグリカン遺伝子（ｈＳＧＣＢ）の最適化も記載されている。
ＬＧＭＤ及び他の筋ジストロフィーに罹患している患者における機能改善には、遺伝子回復及び線維症の軽減の両方が必要である。ＬＧＭＤ及び他の筋ジストロフィーのより効果的な治療のための遺伝子回復法で修復され得る線維症を軽減する方法が必要とされている。

米国特許第９，４３４，９２８号明細書

Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３） Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４） Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４） Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２） Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７） Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６） Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６） Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００） Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１） Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７） Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７） Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）

本明細書には、β－サルコグリカン遺伝子を発現する遺伝子療法ベクター、例えば、ＡＡＶ、ならびに筋肉にβ－サルコグリカンを送達して、筋ジストロフィーに罹患している哺乳類の対象において線維症を軽減及び／もしくは予防、ならびに／または筋力を増加、ならびに／またはβ－サルコグリカン異常症を治療する方法が記載されている。
さらに、本発明は、ＬＧＭＤ２Ｅで観察される遺伝子欠損に対処するためのβ－サルコグリカンを送達する遺伝子療法ベクター及び線維症をさらに抑制するためのｍｉＲ－２９を送達する遺伝子療法ベクターを用いる併用療法及びアプローチを提供する。

一態様では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列を含み、β－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる。

別の太陽では、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性である、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含み、タンパク質は、β－サルコグリカン活性を保持する。

別の態様では、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む機能性β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列、またはその補体を含む、組換えＡＡＶベクターが本明細書に記載される。

「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、及びホルムアミド等の変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、及び４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤等）も使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度に影響が及ぼされるであろう。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが懸念される例では、追加の例示のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴ）、４８℃（１７塩基オリゴ）、５５℃（２０塩基オリゴ）、及び６０℃（２３塩基オリゴ）での６×ＳＳＣ ０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。

非特異的及び／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的のために、他の薬剤がハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中に含まれ得る。例には、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランがあるが、他の好適な薬剤を使用することもできる。これらの添加物の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく変化させることができる。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨとほぼ無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの可変物を適応し、かつ異なる配列関連性を有するＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために、当業者によって調整され得る。

別の態様では、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、筋特異的制御要素に作動可能に連結され得る。例えば、筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（短縮ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７（ＭＨＣ及びＭＣＫのハイブリッドバージョン）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である。

いくつかの実施形態では、筋特異的プロモーターは、ＭＨＣＫ７（配列番号４）である。本明細書に記載される例示的なｒＡＡＶは、配列番号３のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢであり、ＭＣＨＫ７プロモーターはヌクレオチド１３０～９２１に、ＳＶ４０キメライントロンはヌクレオチド９３１～１０７８に、β－サルコグリカン配列はヌクレオチド１０９１～２０４７に、ポリＡはヌクレオチド２０５４～２１０６に及ぶ。

いくつかの実施形態では、筋特異的プロモーターは、ｔＭＣＫ（配列番号６）である。本明細書に記載される例示的なｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢであり、ｔＭＣＫプロモーターはヌクレオチド１４１～８５４に、ＳＶ４０キメライントロンはヌクレオチド８８６～１０１８に、β－サルコグリカン配列はヌクレオチド１０５８～２０１４に、ポリＡはヌクレオチド２０２１～２０７３に及ぶ。

ＡＡＶは、いずれかの血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５，ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、及びＡＡＶｒｈ．７４であり得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示される。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。

本明細書に記載のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物もまた企図される。

本明細書に記載される任意の組換えＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の上清から組換えＡＡＶ粒子を回収することとを含む、組換えＡＡＶベクター粒子を産生する方法も提供される。本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子組成物もまた企図される

それを必要とする哺乳類の対象における線維症を軽減する方法も提供される。この点について、方法は、治療有効量の、本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を、哺乳類の対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、哺乳類の対象は、筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）の投与は、対象の骨格筋または心筋における線維症を軽減する。これらの方法は、ｍｉＲ２９Ｃを含むポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターを投与するステップをさらに含むことができる。

本明細書で使用される「筋ジストロフィー」という用語は、力及び筋肉量が徐々に低下する障害を指す。筋ジストロフィー疾患の非限定的な例としては、ベッカー型筋ジストロフィー、脛骨筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、サルコグリカン異常症、部分的ＬＡＭＡ２欠損による先天性筋ジストロフィーのような先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、１Ｄ型先天性筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、肢帯型１Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｂ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｃ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｄ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｅ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｆ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｇ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｈ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｊ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｋ型筋ジストロフィー、肢帯型ＩＣ型筋ジストロフィー、単純型表皮水疱症を伴う強直性脊椎型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、及びウルリッヒ型スクレロアトニック筋ジストロフィーを挙げることができる。いくつかの実施形態では、対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型（ＬＧＭＤ２Ｅ）に罹患している。

本明細書で使用する「線維症」という用語は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰または未制御沈着ならびに骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓を含む損傷後の組織における異常な修復プロセスを指す。沈着するＥＣＭ成分には、コラーゲン、例えば、コラーゲン１、コラーゲン２、またはコラーゲン３、及びフィブロネクチンが含まれる。

別の態様では、治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳類の対象に投与することを含む、哺乳類の対象における筋力及び／または筋肉量を増加する方法が本明細書に記載される。

本発明の方法のいずれにおいても、対象は、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーのような筋ジストロフィーに罹患している可能性がある。

治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳類の対象に投与することを含む、哺乳類の対象における筋ジストロフィーを治療する方法も提供される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。本明細書に記載の方法のいずれも、ｍｉＲ２９Ｃを含むポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターを投与するステップをさらに含むことができる。

併用療法も企図される。これに関して、本明細書に記載される前述の方法のいずれかは、ｍｉＲ２９Ｃを含むポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターを投与することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ２９Ｃを含むポリヌクレオチドは、筋特異的制御要素に作動可能に連結される。例えば、筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（短縮ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７（ＭＨＣ及びＭＣＫのハイブリッドバージョン）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である。いくつかの実施形態では、第２の組換えベクターは、米国仮出願第６２／３２３，１６３号（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、配列番号９または配列番号８に記載のポリヌクレオチド配列を含む。

β－サルコグリカンを発現するｒＡＡＶベクター及びｍｉＲ２９ｃを発現するｒＡＡＶベクターの両方が哺乳類の対象に投与される本明細書に記載の併用療法では、ｒＡＡＶベクターは同時投与してもよく、またはｍｉＲ２９ｃを発現するｒＡＡＶの直前もしくは直後にβ－サルコグリカンを発現するｒＡＡＶベクターを投与して、連続投与してもよい。あるいは、β－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターは、ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクターの投与後約１～２４時間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間）以内に投与され、β－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクターの投与前約１～２４時間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間）以内に投与される本発明の方法が実施される。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターは、ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶの投与後約１～５時間（例えば、１、２、３、４、または５時間）以内に投与され、β－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９ｃを発現するｒＡＡＶの投与前約１～５時間（例えば、１、２、３、４、または５時間）以内に投与される本発明の方法が実施される。

本発明の方法のうちのいずれかでは、ｒＡＡＶは、筋肉内注射または静脈内注射により投与される。加えて、本発明の方法のうちのいずれかでは、ｒＡＡＶは、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与される。

本発明の組成物は、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化される。加えて、本発明の組成物は、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与用に製剤化される。

さらに、組成物のいずれかは、筋ジストロフィー（例えば、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィー）に罹患している対象への投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号９または配列番号８に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターをさらに含み得る。

本発明の使用のうちのいずれかにおいて、薬剤は、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化される。加えて、本発明の使用のうちのいずれかにおいて、薬剤は、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与用に製剤化される。さらに、薬剤のいずれかは、筋ジストロフィー（例えば、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィー）に罹患している対象への投与のために調製され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号９または配列番号８に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターをさらに含み得る。

前述の段落は、本発明の全ての態様を定義することを意図するものではなく、追加の態様は、詳細な説明のような他のセクションに記載される。文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせがこの文書と同じ文章、または段落、またはセクションで一緒に見られない場合でも、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせが考慮されることを理解されたい。本発明は、追加の態様として、上記の特定の段落で定義される変形よりもいくらか範囲が狭い本発明のすべての実施形態を含む。例えば、本発明の特定の態様が属として記載される場合、属の各メンバーが個々に本発明の態様であると理解されるべきである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクター。（項目２）
β－サルコグリカンをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目３）
β－サルコグリカンをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１に記載の前記ヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目４）
前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ ｒｈ．７４である、項目１～３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目５）
前記ポリヌクレオチド配列が、筋特異的制御要素に作動可能に連結される、項目１～４のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目６）
前記筋特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）である、項目５に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目７）
前記筋特異的制御要素が、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）である、項目６に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目８）
前記筋特異的制御要素が、ＭＨＣＫ７である、項目６に記載の組換えＡＡＶベクター。（項目９）
配列番号３に記載の前記ヌクレオチド配列を含む、項目１～８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目１０）
配列番号５に記載の前記ヌクレオチド配列を含む、項目１～８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目１１）
項目１～１０のいずれか一項に記載の前記組換えＡＡＶベクターを含む、組成物。
（項目１２）
対象に治療有効量の項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物を投与することを含む、対象における筋ジストロフィーを治療する方法。
（項目１３）
対象に治療有効量の項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している哺乳類の対象における筋力及び／または筋量を増加する方法。
（項目１４）
対象に治療有効量の項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を軽減する方法。
（項目１５）
対象に治療有効量の項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している対象における収縮誘発性傷害を軽減する方法。
（項目１６）
対象に治療有効量の項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物を投与することを含む、対象におけるβ－サルコグリカン異常症を治療する方法。
（項目１７）
前記対象が、肢帯筋ジストロフィーに罹患している、項目１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、筋肉内注射または静脈内注射により投与される、項目１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、全身投与される、項目１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、注射、注入、または移植によって非経口投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
ｍｉＲ２９Ｃを含むポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターを投与することをさらに含む、項目１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記第２の組換えベクターが、配列番号９に記載の前記ヌクレオチド配列または配列番号８に記載の前記ヌクレオチド配列を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記第２の組換えＡＡＶベクターが、筋肉内注射または静脈内注射により投与される、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
それを必要とする哺乳類の対象における線維症を軽減するための、項目１～１０のいずれか一項に記載の前記組換えＡＡＶベクターを含む、組成物。
（項目２５）
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
それを必要とする哺乳類の対象におけるβ－サルコグリカン異常症を治療するための、項目１～１０のいずれか一項に記載の前記組換えＡＡＶベクターを含む、組成物。
（項目２７）
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
筋ジストロフィーに罹患している哺乳類の対象における筋力を増加するための、項目１～１０のいずれか一項に記載の前記組換えＡＡＶベクターを含む、組成物。
（項目２９）
筋ジストロフィーの治療のための、項目１～１０のいずれか一項に記載の前記組換えＡＡＶベクターを含む、組成物。
（項目３０）
前記筋ジストロフィーが、肢帯筋ジストロフィーである、項目２４～２９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３１）
ｍｉＲ－２９ヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターをさらに含む、項目２４～３０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
前記第２のｒＡＡＶが、配列番号９に記載の前記ヌクレオチド配列または配列番号８に記載の前記ヌクレオチド配列を含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化される、項目２４～３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３４）
全身投与用に製剤化される、項目２４～３４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５）
前記全身投与が、注射、注入、または移植による非経口投与である、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）
それを必要とする哺乳類の対象における線維症を軽減するための薬剤の調製における、項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物の使用。
（項目３７）
それを必要とする哺乳類の対象における筋力を増加するための薬剤の調製における、項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物の使用。
（項目３８）
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、項目３６または３７に記載の使用。
（項目３９）
哺乳類の対象における筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製における、項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物の使用。
（項目４０）
前記筋ジストロフィーが、肢帯筋ジストロフィーである、項目３８または３９に記載の使用。
（項目４１）
前記薬剤は、前記ｍｉＲ－２９ヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターをさらに含む、項目３６～４０のいずれか一項に記載の使用。
（項目４２）
それを必要とする哺乳類の対象における線維症を軽減するための薬剤の調製における、ｍｉＲ２９Ｃを含むポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターと組み合わされた項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物の使用。
（項目４３）
前記第２の組換えベクターが、配列番号９に記載の前記ヌクレオチド配列または配列番号８に記載の前記ヌクレオチド配列を含む、項目４１または４２に記載の使用。
（項目４４）
それを必要とする哺乳類の対象における筋力を増加するための薬剤の調製における、ｍｉＲ－２９ｃを含むポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターと組み合わされた項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物の使用。
（項目４５）
前記第２の組換えベクターが、配列番号９に記載の前記ヌクレオチド配列または配列番号８に記載の前記ヌクレオチド配列を含む、項目４４に記載の使用。
（項目４６）
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、項目３９～４５のいずれか一項に記載の使用。
（項目４７）
哺乳類の対象における筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製における、ｍｉＲ－２９ｃを含むポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターと組み合わされた項目１～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目１１に記載の組成物の使用。
（項目４８）
前記第２の組換えベクターが、配列番号９に記載の前記ヌクレオチド配列または配列番号８に記載の前記ヌクレオチド配列を含む、項目４７に記載の使用。
（項目４９）
前記筋ジストロフィーが、肢帯筋ジストロフィーである、項目４７または４８に記載の使用。

ＡＡＶ媒介β－サルコグリカン発現がジストロフィン関連タンパク質を回復し、膜の完全性を保護することを示す。（ａ）筋特異的ｔＭＣＫプロモーターによって駆動されるコドン最適化ヒトβ－サルコグリカン遺伝子（ｈＳＧＣＢ）を含む自己相補的ＡＡＶベクター。カセットは、安定性のためにプロセシング及びポリアデニル化シグナルを増強するキメライントロンも含む。（ｂ）抗β－ＳＧ抗体による免疫蛍光染色は、注射の６週間後及び１２週間後の両方の５週齢のマウスにおけるＳＧＣＢ導入遺伝子の高レベルの筋鞘染色を示す。２０倍画像を示す。各ＴＡ筋のβ－サルコグリカンを発現する線維の割合は、６週間後に平均８８．４±４．２％（ｎ＝９、４匹の雄、５匹の雌）及び１２週間後に７６．５±５．８％（ｎ＝６、４匹の雄、２匹の雌）であった。タンパク質発現は、ウエスタンブロットにおいてローディングコントロールについて示されるγ－チューブリンブロットで確認された。（ｃ）β－サルコグリカンのＡＡＶ送達は、サルコグリカン複合体の他のメンバー、α－サルコグリカン、ジストロフィンの回復をもたらす。２０倍画像。（ｄ）ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｈＳＧＣＢはｓｇｃｂ－／－膜を損傷から保護する。画像はエバンスブルー染料組み込みから保護されているβ－サルコグリカン陽性線維のクラスターに隣接する広範囲のエバンスブルー陽性線維（赤色）を示す。４０倍画像を示す。 β－ＳＧ欠損治療骨格筋の組織学的分析を示す。ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｈＳＧＣＢ治療は、ｓｇｃｂ^－／－マウスの組織学的パラメータを正常化する。ヘマトキシリン＆エオシン染色及びピクロシリウスレッド染色は、正常対照Ｃ５７／ＢＬ６マウス及びｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｈＳＧＣＢ治療マウスと共にｓｇｃｂ^－／－マウスからのＴＡ筋に対して行い、続いて組織学的パラメータ及びコラーゲン染色％を定量化した。（ａ）Ｈ＆Ｅ染色は、β－ＳＧ欠損筋における中心核形成線維、炎症細胞、及び大線維直径分布の存在ならびに遺伝子導入後の組織病理の改善を示す。（ｂ）ピクロシリウスレッド染色は、被治療筋肉における赤色コラーゲン染色の減少を示す。（ｃ）治療後の減少を示す中心核形成線維の定量化（Ｐ＜０．０００５、一元配置ＡＮＯＶＡ）、ならびに（ｄ）線維サイズ分布及び被治療マウスと比較したＣ５７／ＢＬ６対照及びｓｇｃｂ^－／－マウスからのＴＡ筋の平均線維サイズの増加の提示（Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。（ｅ）ｓｇｃｂ^－／－被治療マウスと比較したＣ５７／ＢＬ６対照及びｓｇｃｂ^－／－マウスからのＴＡ筋中のコラーゲン％の定量化（Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。２０倍画像で示される１００μｍスケールバー。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｈＳＧＣＢ筋肉内送達が、強縮力及び収縮誘発性損傷に対する耐性を補正することを示す。ＩＭ注射を介して３×１０^１０ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｈＳＧＣＢで治療されたｓｇｃｂ^－／－マウスのＴＡ筋は、遺伝子導入の６週間後に採取し、強縮力を評価するためのプロトコル及び収縮誘発性損傷に対する耐性を評価するための伸張性収縮プロトコルに供した。（ａ）ＡＡＶｒｈ．７４．ｈＳＧＣＢ治療ＴＡは、絶対強縮力（Ｐ＜０．０１、対応ｔ検定）及び（ｂ）正規化比力（Ｐ＜０．０５、対応ｔ検定）の両方において有意な改善を示し、これは野生型力（Ｃ５７／ＢＬ６）と変わらなかった。（ｃ）ＡＡＶｒｈ．７４．ｈＳＧＣＢ治療ＴＡは、未治療ｓｇｃｂ^－／－対照と比較して、収縮誘発性損傷に対する耐性の有意な改善を示した（Ｐ＜０．０１、二元配置ＡＮＯＶＡ）。１０回の収縮後の力の保持を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢを筋肉内投与した老齢マウスの分析結果を示す。（ａ）注射の１２週間後の６ヶ月齢の被治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝５、５匹の雄）からのＴＡ筋の免疫蛍光染色は、未治療（ｎ＝４、４匹の雄）と比較して注射されたマウスにおける平均８０％のレベルでのＳＧＣＢ導入遺伝子の筋鞘発現を示す。（ｂ）被治療及び未治療ＴＡ筋のピクロシリウスレッド染色。（ｃ）ピクロシリウスレッド染色組織に存在するコラーゲンの定量化は、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢでの治療後のコラーゲン量の有意な減少を示す（Ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。２０倍画像で示される１００μｍスケールバー。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｈＳＧＣＢの血管送達の結果を示す。４週齢（ｎ＝５、５匹の雄）及び５週齢（ｎ＝４、２匹の雄、２匹の雌）のβ－ＳＧ欠損マウスに、大腿動脈を介してベクターを投与し、下肢筋にベクターを送達した。５×１０^１１ｖｇの用量では、β－ＳＧ発現は、被治療マウスのＴＡにおいて９０．６±２．８％、ＧＡＳにおいて９１．８±４．７％であり、損傷パラダイム後も未治療の動物と比較して比力の有意な改善をもたらす組織病理の改善を伴った。（ａ）３匹の代表マウスからのβ－ＳＧタンパク質発現。β－ＳＧ ＫＯ未治療マウスからの筋肉を、挿入図（右下）に比較のために示す。２０倍画像を示す。ウエスタンブロット及びγ－チューブリンを介して確認された被治療筋肉における発現を、ローディングコントロールとして示す。（ｂ）高用量治療後に組織病理が有意に改善される。上パネル－被治療ＴＡ及び腓腹筋。下パネル－未治療β－ＳＧ欠損対照筋肉。２０倍画像で示される１００μｍスケールバー。（ｃ）伸張性収縮誘発性損傷の１０サイクル後にＥＤＬ筋に保持された比力の割合。５×１０^１１ｖｇのＡＡＶｒｈ．７４．ｈＳＧＣＢでの治療は、ＷＴ（正常）対照筋肉に相当する力の有意な改善をもたらした（Ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ）。＊Ｐ＜０．０５。 ＩＬＰ治療β－ＳＧ ＫＯマウスにおける線維症の軽減を示す。（ａ）ピクロシリウスレッド染色は、未治療ｓｇｃｂ^－／－マウスと比較したコラーゲン沈着の減少によって示される、被治療マウスにおける線維症の軽減を示す。（ｂ）ＢＬ６ ＷＴ、未治療ｓｇｃｂ^－／－マウス、及び被治療マウスからのＴＡ及びＧＡＳ筋におけるコラーゲンレベルの定量化は、被治療マウスにおけるコラーゲンレベルの減少を確認する（Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。２０倍画像で示される１００μｍスケールバー。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ベクター生体分布及びタンパク質発現を示す。（ａ）ｑＰＣＲに添加されたＤＮＡマイクログラム当たりの転写物のコピーで与えられるＩＬＰ治療マウスから採取された組織におけるベクターの平均分布のヒストグラム。左肢を治療した。（ｂ）オフターゲット器官にウエスタンブロットによるタンパク質発現は見られなかった。 ７ヶ月齢のｓｇｃｂ^－／－マウスにおける組織学的及び機能的欠損を提供する。ＳＧＣＢ^－／－マウスの横隔膜（Ａ）及び心臓（Ｃ）におけるトリクローム染色は、広範な線維症（赤色）を示す。横隔膜からの力出力は横隔膜において著しく減少し（Ｂ）、心駆出率もｓｇｃｂ^－／－マウスにおいて減少する（Ｄ）。 ７ヶ月齢のｓｇｃｂ^－／－マウスにおける組織学的及び機能的欠損を提供する。ＳＧＣＢ^－／－マウスの横隔膜（Ａ）及び心臓（Ｃ）におけるトリクローム染色は、広範な線維症（赤色）を示す。横隔膜からの力出力は横隔膜において著しく減少し（Ｂ）、心駆出率もｓｇｃｂ^－／－マウスにおいて減少する（Ｄ）。 ７ヶ月齢のｓｇｃｂ^－／－マウスにおける組織学的及び機能的欠損を提供する。ＳＧＣＢ^－／－マウスの横隔膜（Ａ）及び心臓（Ｃ）におけるトリクローム染色は、広範な線維症（赤色）を示す。横隔膜からの力出力は横隔膜において著しく減少し（Ｂ）、心駆出率もｓｇｃｂ^－／－マウスにおいて減少する（Ｄ）。 ７ヶ月齢のｓｇｃｂ^－／－マウスにおける組織学的及び機能的欠損を提供する。ＳＧＣＢ^－／－マウスの横隔膜（Ａ）及び心臓（Ｃ）におけるトリクローム染色は、広範な線維症（赤色）を示す。横隔膜からの力出力は横隔膜において著しく減少し（Ｂ）、心駆出率もｓｇｃｂ^－／－マウスにおいて減少する（Ｄ）。 治療用β－サルコグリカン導入遺伝子カセットの概略図を提供する。コドン最適化ヒトβ－サルコグリカン遺伝子（ｈＳＧＣＢ）を含む自己相補的ＡＡＶベクター。筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーターが発現を駆動する。カセットはまた、安定性のためにプロセシング及びポリアデニル化シグナルを増強するキメライントロンを含む。 様々な骨格筋におけるβ－サルコグリカンの免疫蛍光染色を提供し、治療の１、４、または６ヶ月後（１ヶ月後を図示する）の稀な陰性線維でのロバストな発現を示す。 横隔膜及び心臓におけるβ－サルコグリカンの免疫蛍光染色を提供し、治療の１、４、または６ヶ月後（１ヶ月後を図示する）の稀な陰性線維でのロバストな発現を示す。 ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの静脈内送達後のＳＧＣＢ発現の回復を示す。（Ａ）ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢカセット。（ｂ）総用量１ｅ１２ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを静脈内注射したｓｇｃｂ^－／－マウスからの骨格筋、横隔膜、及び心臓の注射の６ヶ月後の免疫蛍光イメージング。平均９８．１３±０．３１％の形質導入を示す骨格筋の代表的な画像。２０倍画像を示す。高レベルのｈＳＧＣＢ導入遺伝子発現を示す心臓組織の代表的な画像。１０倍画像を示す。（ｃ）ｈＳＧＣＢ導入遺伝子発現を確認する１匹の被治療ｓｇｃｂ^－／－マウスからのすべての筋肉のウエスタンブロッティング。（ｄ）ＢＬ６ ＷＴレベルの７２．０％までのｈＳＧＣＢの過剰発現を示すデンシトメトリー定量化での５匹のｓｇｃｂ^－／－被治療マウスの心臓におけるｈＳＧＣＢ発現のウエスタンブロッティング。 同上 同上 同上 筋病理に対するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢでの全身治療の効果を示す。（ａ）正常化した組織病理を示すＣ５７ＢＬ／６ ＷＴ、ｓｇｃｂ^－／－、及びｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ治療マウスからの横隔膜及びＱＵＡＤ筋のＨ＆Ｅ染色。（ｂ）未治療ｓｇｃｂ^－／－筋肉と比較してｓｇｃｂ^－／－被治療筋肉における中心核形成線維の減少の定量化（ＴＡ、ＧＡＳ、ＧＬＵＴ、横隔膜、Ｐ＜０．０００１）（ＱＵＡＤ、ＰＳＯＡＳ、ＴＲＩ、Ｐ＜０．０５）。（ｃ）ＧＡＳ、ＰＳＯＡＳ、及びＴＲＩにおける繊維分布の正常化、ならびに（ｄ）未治療ｓｇｃｂ－／－筋肉と比較した被治療筋肉における平均線維サイズの増加（ｐ＜０．００１）（一元配置ＡＮＯＶＡ）（各群ｎ＝５）。 同上 同上 同上 静脈内治療β－ＳＧ ＫＯマウスにおけるコラーゲン沈着の減少を示す。（ａ）ピクロシリウスレッド染色は、横隔膜及びＧＡＳにおいて未治療ｓｇｃｂ^－／－マウスと比較したコラーゲン沈着の減少によって示される、被治療マウスにおける線維症の軽減を示した。（ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウス（ｎ＝４）、未治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝４）、及び被治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝５）からの横隔膜及びＧＡＳ筋におけるコラーゲンレベルの定量化は、両方の被治療筋肉におけるコラーゲンレベルの減少を確認する（ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。２０倍画像で示される１００μｍスケールバー。 静脈内治療β－ＳＧ ＫＯマウスにおけるコラーゲン沈着の減少を示す。（ａ）ピクロシリウスレッド染色は、横隔膜及びＧＡＳにおいて未治療ｓｇｃｂ^－／－マウスと比較したコラーゲン沈着の減少によって示される、被治療マウスにおける線維症の軽減を示した。（ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウス（ｎ＝４）、未治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝４）、及び被治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝５）からの横隔膜及びＧＡＳ筋におけるコラーゲンレベルの定量化は、両方の被治療筋肉におけるコラーゲンレベルの減少を確認する（ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。２０倍画像で示される１００μｍスケールバー。 ｓｇｃｂ^－／－マウスの尾静脈を介したｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの送達が、治療（ＩＶ投与（１ｅ１２ｖｇ））の６ヶ月後、横隔膜における力を完全に回復させることを示す。被治療及び対照ＳＧＣＢ^－／－マウスならびにＷＴマウスから横隔膜筋条片を採取して力測定に供し、治療は力をＷＴレベルに回復させた。 ｒＡＡＶベクターｓｃＡＡＣｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃ及び天然ｍｉＲ－３０骨格中のｍｉＲ－２９ｃのヌクレオチド配列の概略図を提供する。 ＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９Ｃでの３ヶ月間の治療後、被治療及び対照ＳＧＣＢ^－／－マウスならびにＷＴマウスからＴＡ筋を採取し、線維症（コラーゲンレベル）について分析したことを示す（各群ｎ＝５）。シリウスレッド染色及び定量化を用いて、コラーゲンレベルは治療後に減少した（図１８参照）。結果は、Ｃｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、及びＦｂｎの転写物レベルが正常化し、筋線維サイズが増加したことを示した。 コラーゲン１及び３について染色するシリウスレッドで染色された未治療及びＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９Ｃ治療前脛骨筋の走査された全切片の代表的な画像を提供する。定量化を図１７に示す 胸椎における後弯症の補正を示す。（ａ）Ｘ線撮影法によって確認されたｓｇｃｂ^－／－マウスにおける後弯症。（ｂ）ｓｇｃｂ^－／－マウス（３．６９）の後弯指数（ＫＩ）スコアは、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ（６．０１）と比較して低いが（ｐ＜０．０１）、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢでの治療後増加する（５．３９）（ｓｇｃｂ^－／－と比較してｐ＜０．０５）（一元配置ＡＮＯＶＡ）（各群ｎ＝６）。 胸椎における後弯症の補正を示す。（ａ）Ｘ線撮影法によって確認されたｓｇｃｂ^－／－マウスにおける後弯症。（ｂ）ｓｇｃｂ^－／－マウス（３．６９）の後弯指数（ＫＩ）スコアは、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ（６．０１）と比較して低いが（ｐ＜０．０１）、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢでの治療後増加する（５．３９）（ｓｇｃｂ^－／－と比較してｐ＜０．０５）（一元配置ＡＮＯＶＡ）（各群ｎ＝６）。 心筋における心筋症の評価を提供する。（ａ）未治療ｓｇｃｂ^－／－筋肉における心筋変性及び治療後の改善を示す、７ヶ月齢のＢＬ６ ＷＴ、ｓｇｃｂ^－／－、及び治療の６ヶ月後のＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ治療ｓｇｃｂ^－／－心臓のＨ＆Ｅ及びピクロシリウスレッド染色。（ｂ）ｓｇｃｂ^－／－心臓における１回拍出量（ｐ＜０．０１）、心拍出量、及び駆出率（ｐ＜０．０５）の減少（一元配置ＡＮＯＶＡ）ならびに治療の６ヶ月後の改善（各群ｎ＝６）を示す心臓ＭＲＩ分析。（ｃ）罹患マウスにおける心筋トロポニンＩレベルの低下を示す、２つのＣ５７ＢＬ／６ ＷＴ心臓、２つのｓｇｃｂ^－／－心臓、及び５つのＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ治療ｓｇｃｂ^－／－心臓のウエスタンブロッティング。（ｄ）ＢＬ６ ＷＴレベルの６０．３８％までの心筋トロポニンＩ（ｃＴｒｐＩ）の減少及びＢＬ６ ＷＴレベルの１３５．８％までの過剰発現を示すデンシトメトリー定量化。 同上 同上 同上 横隔膜機能の補正を示し、オープンフィールドケージ活動が増加した。（ａ）横隔膜筋条片を採取し、すべて７ヶ月齢のＢＬ６ ＷＴマウス（ｎ＝５）、ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝４）、及びＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝５）における力及び疲労に対する耐性を測定した。６ヶ月間の治療により、力がＷＴレベルに回復し（ｓｇｃｂ^－／－と比較してｐ＜０．０１）、疲労に対する耐性が改善した。（ｂ）ｘ及びｙ平面における全体的な歩行は、ｓｇｃｂ^－／－マウスにおいて有意に減少し（ｐ＜０．０００１）、ＭＣＨＫ７治療マウスにおいてわずかに改善した（ｐ＜０．０５）。後肢で立ち上がる垂直活動もまた、ｓｇｃｂ^－／－マウスにおいて減少し（ｐ＜０．０１）、ＭＣＨＫ７治療マウスにおいて有意に増加した（ｐ＜０．０５）（一元配置ＡＮＯＶＡ）（各群ｎ＝６）。 横隔膜機能の補正を示し、オープンフィールドケージ活動が増加した。（ａ）横隔膜筋条片を採取し、すべて７ヶ月齢のＢＬ６ ＷＴマウス（ｎ＝５）、ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝４）、及びＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝５）における力及び疲労に対する耐性を測定した。６ヶ月間の治療により、力がＷＴレベルに回復し（ｓｇｃｂ^－／－と比較してｐ＜０．０１）、疲労に対する耐性が改善した。（ｂ）ｘ及びｙ平面における全体的な歩行は、ｓｇｃｂ^－／－マウスにおいて有意に減少し（ｐ＜０．０００１）、ＭＣＨＫ７治療マウスにおいてわずかに改善した（ｐ＜０．０５）。後肢で立ち上がる垂直活動もまた、ｓｇｃｂ^－／－マウスにおいて減少し（ｐ＜０．０１）、ＭＣＨＫ７治療マウスにおいて有意に増加した（ｐ＜０．０５）（一元配置ＡＮＯＶＡ）（各群ｎ＝６）。 全身ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ送達の生体分布及びオフターゲット導入遺伝子発現分析を提供する。（ａ）総用量１ｅ１２ｖｇでのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢのＩＶ送達後の２匹のｓｇｃｂ^－／－マウスからの様々な組織におけるｑＰＣＲ反応に添加されたＤＮＡマイクログラム当たりの転写物の平均コピーｖｇの分布ヒストグラム。（ｂ）いずれの非筋肉試料にもｈＳＧＣＢ導入遺伝子の発現がないことを示す、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを全身注射したｓｇｃｂ^－／－マウスからの筋肉及び器官についての生体分布ウエスタン。 全身ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ送達の生体分布及びオフターゲット導入遺伝子発現分析を提供する。（ａ）総用量１ｅ１２ｖｇでのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢのＩＶ送達後の２匹のｓｇｃｂ^－／－マウスからの様々な組織におけるｑＰＣＲ反応に添加されたＤＮＡマイクログラム当たりの転写物の平均コピーｖｇの分布ヒストグラム。（ｂ）いずれの非筋肉試料にもｈＳＧＣＢ導入遺伝子の発現がないことを示す、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを全身注射したｓｇｃｂ^－／－マウスからの筋肉及び器官についての生体分布ウエスタン。

本開示は、β－サルコグリカンを発現するポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの投与が、肢帯型筋ジストロフィー動物モデルにおける筋線維症の軽減または完全な回復をもたらすという発見に基づいている。実施例に示されているように、本明細書に記載のＡＡＶベクターの投与は、変性線維の減少、炎症の軽減、及び増大した力発生による伸張性収縮に対する保護による機能回復の改善を含む、ジストロフィー特徴の回復をもたらした。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型が１３存在する。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った遺伝子型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。

本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（またはトランス遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染ウイルス粒子に複製及びパッケージングされ得る。

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから成るウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達されるトランス遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。

ＡＡＶ
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型 ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、及びＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示される。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景部分に記載されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を使用することができる。

本発明のＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に導入される。ＡＡＶゲノムがパッケージングされるｒＡＡＶ粒子、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技法は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型であり得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、及びＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な成分を全て安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）等の手法によって細菌プラスミドに導入されている。その後、パッケージング細胞株は、アデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。

ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）に記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。

したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）等の安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低通路２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

本発明の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。実施形態としては、これらに限定されないが、配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢ、及び配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢと呼ばれるｒＡＡＶが挙げられる。

ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準の方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ｒＡＡＶベクターをヘルパーウイルスから精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法が含まれる。

別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体中にｒＡＡＶを含む。本組成物は、希釈剤及びアジュバント等の他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プルロニクス、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。

本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的される個体、及び細胞型（複数可）に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３～約１×１０^１４以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。

インビボまたはインビトロでのｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数回用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態において、「有効用量」は、治療される障害／疾患状態と関連付けられる少なくとも１つの症状を軽減する（排除または低減する）、障害／疾患状態への進行を遅らせるか、もしくは予防する、障害／疾患状態の進行を遅らせるか、もしくは予防する、疾患の程度を縮小させる、疾患の緩解（部分的または完全）をもたらす、及び／または生存を延長する、用量である。本発明の方法による予防または治療のために企図される疾患の例は、筋ジストロフィー、例えば肢帯型筋ジストロフィーである

併用療法も本発明によって企図される。本明細書で使用される併用療法は、同時治療または連続治療を含む。新規の療法との併用等の本発明の方法と標準の医療処置（例えば、コルチコステロイド）との併用が特に企図される。

ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇまたは約１ｅ１４～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。本発明はまた、これらの範囲のｒＡＡＶベクターを含む組成物も含む。

例えば、ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、及び５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量である。本発明はまた、これらの用量のｒＡＡＶベクターを含む組成物も含む。

本組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むが、これらに限定されない当該技術分野で標準の経路により得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）及び血清型（複数可）は、治療される感染症及び／または疾患状態、ならびにβ－サルコグリカンを発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択及び／または適合され得る。

本発明は、有効量のｒＡＡＶ及び本発明の組成物の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与は、体全体が影響を受けるように循環系への投与である。全身投与には、胃腸管を通した吸収のような経腸投与及び注射、注入、または移植による非経口投与が含まれる。

具体的には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、及び／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉等の目的とする特定の標的組織を標的とするように修飾され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。薬学的組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取扱い易くするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用され得る。

筋肉内注射の目的のために、例えば、ゴマ油もしくはピーナッツ油等のアジュバント中の溶液、または水性プロピレングリコール中の溶液、ならびに滅菌水溶液が用いられ得る。かかる水溶液は、所望の場合、緩衝され、液体希釈剤は、最初に生理食塩水またはグルコースで等張性にする。遊離酸としてのｒＡＡＶ溶液（ＤＮＡが酸性リン酸基を含有する）または薬理学的に許容される塩は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合された水中で調製され得る。ｒＡＡＶ分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中でも調製され得る。通常の保管及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を阻止するために防腐剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準の技法によって容易に得ることが可能である。

注射可能な使用に好適な薬学的形態としては、滅菌水溶液または分散剤、及び注射可能な滅菌溶液または分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の保護は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗細菌剤及び抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。

注射可能な滅菌溶液は、必要に応じて、必要量のｒＡＡＶを、上に列挙される様々な他の成分を有する適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、滅菌活性成分を、塩基性分散媒体及び上に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えて、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を産生する、真空乾燥及びフリーズドライ技法である。

ｒＡＡＶでの形質導入もインビトロで行われ得る。一実施形態では、所望の標的筋細胞は、対象から除去され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同系または異種筋細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合、同系または異種筋細胞が使用され得る。

対象への形質導入細胞の形質導入及び再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地中でｒＡＡＶを筋細胞と組み合わせ、サザンブロット及び／またはＰＣＲ等の従来の技法を使用して目的とするＤＮＡを持つ細胞についてスクリーニングすることによって、または選択可能なマーカーを使用することによってインビトロで形質導入され得る。その後、形質導入された細胞は、薬学的組成物に製剤化され得、この組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射等の様々な技法によって、または例えばカテーテルを使用して、平滑心筋に注射することによって対象に導入される。

本発明のｒＡＡＶでの細胞の形質導入は、β－サルコグリカンの持続発現をもたらす。したがって、本発明は、β－サルコグリカンを発現するｒＡＡＶを哺乳類の対象、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、本発明の１つ以上のｒＡＡＶでの形質導入組織（筋肉等の組織、肝臓及び脳等の器官、ならびに唾液腺等の腺を含むが、これらに限定されない）を含む。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、本発明の一実施形態は、これらに限定されないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリー、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格筋アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心筋アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい］、及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素に由来する制御要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子、及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘発性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、ステロイド誘発性要素、及びグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい）、ならびに他の制御要素を含む、筋特異的制御要素によって誘導される筋細胞及び筋組織を形質導入する方法を提供する。

筋組織は、重要な器官ではなく、アクセスが容易であるため、インビボＤＮＡ送達のための魅力的な標的である。本発明は、形質導入筋原線維由来のｍｉＲＮＡの持続発現を企図する。

「筋細胞」または「筋組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織由来の、例えば、骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。かかる筋細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞等の分化または未分化のものであり得る。

「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるβ－サルコグリカンの発現をもたらす、記載の複製欠損ｒＡＡＶを介するインビボまたはインビトロのいずれかでのレシピエント細胞への目的のポリヌクレオチド（例えば、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列）の投与／送達を指すために使用される。

したがって、本明細書では、有効用量（または本質的に同時に投与される用量もしくはある間隔で与えられる用量）の、β－サルコグリカンをコードするｒＡＡＶを、それを必要とする哺乳類の対象に投与する方法も記載される。

本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本出願が、本明細書中のいかなる定義も含み、優先される。

本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

材料及び方法
動物モデル－すべての手順は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（プロトコルＡＲ１２－０００４０）によって承認された。Ｂ６．１２９－Ｓｇｃｂ ^{ｔｍ１Ｋｃａｍ／１Ｊ}ヘテロ接合マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ、株＃００６８３２）から購入した。Ｓｇｃｂ^－／－マウスは、ヘテロ接合マウスを繁殖させることにより作製した。ＫＯマウスを繁殖させ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅにおいて標準条件下でホモ接合型動物として維持した。マウスを、１２：１２時間の暗所：明所サイクルで、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ（３．８ｚ５食物繊維、１８．８％タンパク質、５％脂肪飼料）で維持した。ＳＧＣＢ^－／－マウスの同定は、ＰＣＲを用いた遺伝子型判定により行った。すべての動物を、標準的なマウスケージに入れ、自由に摂食摂水させた。

β－サルコグリカン遺伝子構築。全長ヒトβ－サルコグリカンｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００３４９９４．３）をコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡにより合成した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによるコドンの最適化は、転写、ｍＲＮＡプロセシング及び安定性、翻訳、ならびにタンパク質フォールディングを含むパラメータを考慮するアルゴリズムを使用し、筋組織で最大の発現をもたらすｃＤＮＡ配列を設計する（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）。

ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢ構築物について、ｃＤＮＡは次にＡＡＶ２ ＩＴＲを含むプラスミドにクローニングし、カセットはコンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、及び合成ポリアデニル化部位（５３ｂｐ）を含んだ。組換えｔＭＣＫプロモーターは、Ｄｒ Ｘｉａｏ Ｘｉａｏ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）からの寄贈であった。これは以前に記載されたＣＫ６プロモーター２７の改変であり、転写因子結合部位を含むプロモーター領域のエンハンサー上流における改変を含む。エンハンサーは２つのＥボックス（右及び左）で構成される。ｔＭＣＫプロモーター改変は、左のＥボックスを右のＥボックスへ変換（２Ｒ改変）し、６ｂｐを挿入（Ｓ５改変）する変異を含む。ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢベクターは、ｐＵＣ５７－ＢＳＧ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．）からの１０４０ｂｐのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片のｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ．２６のＫｐｎＩ／ＸｂａＩ部位へのライゲーションによって構築した。

ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターは、ＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ部位を有するｔＭＣＫプロモーター及びＳＶ４０キメライントロンを除去し、ＭＨＣＫ７プロモーター及びＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ部位を有する同一のＳＶ４０キメライントロンを含むＰＣＲ増幅断片を挿入することにより構築した。ＭＨＣＫ７は、近位プロモーターを有する内因性筋クレアチンキナーゼ遺伝子（ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、５８４－ｂｐ）内の転写開始部位の～１．２ｋｂの５’から取った２０６－ｂｐエンハンサーを利用するＭＣＫベースのプロモーターである^３、１２。ＭＨＣＫ７プロモーター自体は、心筋発現を増強するためにＣＫ部分の１８８－ｂｐのα－ＭｙＨＣ（αミオシン重鎖）エンハンサー５’に連結した遺伝子のＭＣＫファミリーからのこの改変ＣＫ７カセットを含む^１２。プロモーター（ＣＫ）のクレアチンキナーゼ部分は、ｔＭＣＫとＭＨＣＫ７との間で９６％同一である。最後に、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターは、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ５’ＤＶ４４由来の９６０ｂｐのＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ ＭＨＣＫ７＋イントロン断片のｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢのＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ部位へのライゲーションによって構築した（Ｐｏｚｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３：５７－６６，２０１６）

ｒＡＡＶ産生。以前にＲｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５：４５，２００７）によって報告された、改変クロスパッケージングアプローチを用いてｒＡＡＶベクターを産生した。ここで、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣａＰＯ_４沈殿を伴うトリプルトランスフェクション法は、ＡＡＶ２ ＩＴＲを異なるＡＡＶカプシド血清型にパッケージングすることを可能にする。（２８、２９）産生プラスミドは、（ｉ）ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢまたはｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ、（ｉｉ）ｃａｐ血清型８様単離ｒｈ．７４をコードするｒｅｐ２－ｃａｐｒｈ．７４改変ＡＡＶヘルパープラスミド、ならびに（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６、及びＶＡ Ｉ／ＩＩ ＲＮＡ遺伝子を発現するアデノウイルス５型ヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）であった。ベクターを精製し、カプシド化ｖｇ力価を、（Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｔａｑｍａｎ検出器システム、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡを使用して）以前に記載されたように決定した。３０
プライマー及び蛍光プローブは、ｔＭＣＫプロモーターを標的とし、以下の通りであった：ｔＭＣＫフォワードプライマー、５’－ＡＣＣ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＴＴＡ ＴＡＡ ＴＴ－３’（配列番号１０）、ｔＭＣＫリバースプライマー、５’－ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＴＡＡ ＧＡＣ－３’（配列番号１１）、及びｔＭＣＫプローブ、５’－ＦＡＭ－ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＡＧＣＣＴ ＧＡＧ ＣＧＧ ＴＴＡ Ｃ－ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号１２）。プライマー及び蛍光プローブは、ＭＨＣＫ７プロモーターを標的とし、以下の通りであった：ＭＨＣＫ７フォワードプライマー、５’－ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＡＡＡ－３’（配列番号１６）、ＭＨＣＫ７リバースプライマー、５’－ＧＴＣ ＣＣＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＴＴ Ｃ－３’（配列番号１７）、及びＭＨＣＫ７プローブ、５’－ＦＡＭ－ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ－Ｚｅｎ－ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＡＧＡ ＴＣ－３ＩＡＢＫＦＱ－３’（配列番号１８）。

筋肉内遺伝子送達。筋肉内注射のために、マウスに麻酔をかけ、１～４％イソフルラン（Ｏ^２中）下に維持した。４～６週齢のＳＧＣＢ^－／－マウスの左下肢の前区画を９５％ＥｔＯＨで洗浄し、次いで腹横（ＴＡ）筋に、体積３０μｌの生理食塩水で希釈した３×１０^１１ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢを、３０ゲージ超微細インシュリンシリンジを用いて注射した。反対側の筋肉を未治療のままにして対照とした。遺伝子導入効率を評価するために、両肢からのＴＡ筋を、注射の６週間後（ｎ＝９、４匹の雄、５匹の雌）または１２週間後（ｎ＝６、４匹の雄、２匹の雌）のいずれかに取り出した。６ヶ月齢のマウス（ｎ＝５、５匹の雄）に関する実験では、治療は、左ＴＡへの３×１０^１１ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢの筋肉内注射で構成された。分離式肢灌流実験のために、ｓｇｃｂ^－／－マウスを、４週齢（ｎ＝５、５匹の雄）及び５週齢（ｎ＝４、２匹の雄、２匹の雌）で、以前に記載されたように大腿動脈への注射によって５×１０^１１ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＢＢで灌流した。１９動物を安楽死させ、筋肉を遺伝子導入の８週間後に分析した。

全身遺伝子送達：全身送達は、ｓｇｃｂ^－／－マウスの尾静脈へのベクターの注射によって達成した。マウスに、体積２１２μＬの生理食塩水で希釈した１×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを、３０ゲージ超微細インシュリンシリンジを用いて注射した。マウスを保持チューブ内に拘束し、尾を尾部スロットに入れ、注射を容易にするために温めて血管を拡張させた。動脈を尾の中心線の下方に配置した後、尾動脈に沿って走る紫／青色の側静脈の１つに注射を行った。被治療マウスはすべて４～５週齢で注射し、注射の６ヶ月後に安楽死させた。

ＥＤＬ力発生及び伸張性収縮からの保護。分離式灌流（ＩＬＰ）によって治療されたマウスからのＥＤＬ筋の生理学的分析を行った。被治療マウスの両方の後下肢からのＥＤＬ筋を腱で切除し、我々の実験室及びその他（１９、３１）によって以前に記載された機能を評価する生理学プロトコルをいくらか適合させて行った。伸張性収縮プロトコル中、５％伸長再長期化手順を５００～７００ミリ秒間実行した（１００ミリ秒にわたって５％伸長し、続いて、１００ミリ秒後に最適な長さに戻す）。強縮及び伸張性収縮プロトコル後、筋肉を取り出し、湿潤秤量し、トラガカントガムを使用してチャック上に取り付け、その後、液体窒素中で冷却したメチル－ブタン中で凍結した。

ＴＡ力発生及び伸張性収縮からの保護。ＴＡ筋における機能的結果を評価するプロトコルを、ＩＭ注射によって治療されたマウスから抽出した筋肉について実施した。このＴＡ手順は、いくつかの以前の研究において概説されている。（３２、３３）伸張性収縮後、マウスを次に安楽死させ、ＴＡ筋を切除し、秤量し、分析のために凍結した。データの分析は盲目的に行われたがランダムには行われなかった。

免疫蛍光。クリオスタット切片（１２μｍ）を、モノクローナルヒトβ－サルコグリカン一次抗体（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＵＫ、Ｃａｔ番号ＮＣＬ－Ｌ－ｂ－ＳＡＲＣ）で、ブロック緩衝液（１×ＴＢＳ、１０％ヤギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ）中での１：５０の希釈で、１時間、室温で、湿潤チャンバにおいてインキュベートした。次いで切片をＴＢＳで３回、それぞれ２０分間洗浄し、３０分間再ブロック化した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４複合ヤギ抗マウス二次ＩｇＧ１抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ、Ｃａｔ番号Ａ２１１２５）を、１：２５０の希釈で４５分間適用した。切片をＴＢＳで２０分間３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）でマウントした。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラを使用して、筋肉切片の４つの異なる象限をカバーする４つのランダムな２０倍画像を撮影した。β－サルコグリカン染色（４５０％の筋膜染色強度）の陽性線維の割合を各画像について決定し、各筋肉について平均した。

ウエスタンブロット分析。左の被治療ＴＡ筋及び右の反対側のＴＡ筋からの組織切片（２０－２０ミクロン厚）を微量遠心分離機に回収し、１００μｌの均質化緩衝液（１２５ｍＭトリス－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、４Ｍ尿素）で、１つのプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）の存在下で均質化した。均質化後、試料を１０，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離した。タンパク質をＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で定量化した。タンパク質試料（２０μｇ）を３－８％ポリアクリルアミドトリス－アセテートゲル（ＮｕＰａｇｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で１時間５分間１５０Ｖで電気泳動し、その後ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に１時間１５分間３５Ｖで移した。膜をＴＢＳＴ中の５％脱脂粉乳中で１時間ブロックし、次いでウサギポリクローナルヒトβ－サルコグリカン抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ、Ｃａｔ番号ＮＢＰ－１－９０３００、１：１００または１：２５０希釈）及び１：５０００のモノクローナルマウスγ－チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、Ｃａｔ 番号Ｔ６５５７）または１：５０００希釈のマウスモノクローナルマウスα－アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、Ｃａｔ 番号Ａ７８１１）でインキュベートした。１：５００希釈のウサギポリクローナルマウス心筋トロポニンＩ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、Ｃａｔ番号ａｂ４７００３）及び１：１０００希釈のウサギモノクローナルマウスビンクリン抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ、Ｃａｔ番号７００６２）を使用した。抗マウス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ、Ｃａｔ番号ＡＰ３０８Ｐ）及び抗ウサギ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号６５６１２０）二次－ＨＲＰ抗体をＥＣＬ免疫検出に使用した。

ＥＢＤアッセイ。３×１０^１０ｖｇの用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢを、４週齢のｓｇｃｂ^－／－マウスに、筋肉内注射によって左ＴＡに送達した。注射の４週間後、マウスの腹膜腔の右側に、５μｌ／体重ｇの１倍リン酸緩衝液中の濾過滅菌した１０ｍｇ／ｍｌのＥＢＤを注射した。次いでマウスを注射の２４時間後に殺し、組織を採取し、切片にした。切片を冷アセトン中で１０分間固定し、次いで免疫蛍光プロトコルを用いてヒトβ－サルコグリカンを染色した。

形態計測分析。中心に位置する核を有する筋線維の筋線維直径及び割合を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色したＴＡ及びＧＡＳ筋から決定した。各動物の切片当たり４つのランダム２０倍画像をＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラで撮影した。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて中心核形成線維を定量化した。線維直径を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ＬＥ４ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して筋線維を通して最も短い直径として測定した。

生体分布ｑＰＣＲ分析。Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲを行って、以前に記載したような標的化及び未標的化反対側筋肉ならびに非標的化器官に存在するベクターゲノムコピーの数を定量化した。（１８、３０）ベクター特異的プライマープローブセットを使用して、特異的であり、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢ導入遺伝子カセット内に位置するｔＭＣＫプロモーターからすぐ下流のイントロン領域の配列を増幅した。以下のプライマー及びプローブをこの研究に使用した：ｔＭＣＫ及びＭＨＣＫ７イントロンフォワードプライマー５’－ＧＴＧ ＡＧＧ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＣＡ ＧＧＴ ＡＡ－３’（配列番号１３）、ｔＭＣＫ及びＭＨＣＫ７イントロンリバースプライマー５’－ＡＣＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＡＡ Ｇ－３’（配列番号１４）、ならびにｔＭＣＫ及びＭＨＣＫ７イントロンプローブ５’－６ＦＡＭ－ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＴＴ ＡＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ－ＧＴＴ ＴＡＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＡＡ ＴＡＧ ＡＡＡ－ｔａｍｒａ－３’（ＩＤＴ）（配列番号１５）。コピー数は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムとして報告される。免疫細胞染色のための免疫組織化学。免疫組織化学を用いて免疫細胞を同定した。Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ帯電顕微鏡スライド上の凍結組織切片を、抗ラットＩｇ ＨＲＰ検出キット（ＢＤ Ｐｈａｒｍａｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ、Ｃａｔ：５５１０１３）：ＣＤ３（Ｃａｔ：５５５２７３）、ＣＤ４（Ｃａｔ：５５０２８０）、ＣＤ８（Ｃａｔ：５５０２８１）、及びマクロファージ用のＭａｃ－３（Ｃａｔ：５５０２９２）を使用して、ラット抗マウスモノクローナル抗体でインキュベートした。すべての一次抗体をリン酸緩衝生理食塩水で１：２０に希釈した。陽性免疫染色を、ストレプトアビジン－ＨＲＰペルオキシダーゼｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣペルオキシダーゼを含むＤＡＢ緩衝液で希釈したＤＡＢクロモゲンを用いて可視化した。１０個のランダム４０倍画像を各筋肉及び各対応する染色について撮影した。単核細胞の数を数え、１ｍｍ^２当たりの総数として表した。

ピクロシリウスレッド染色及びコラーゲン定量化。Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ帯電顕微鏡スライド上に配置された凍結切片を、１０％中性緩衝ホルマリン中で５分間固定し、次いで蒸留水ですすいだ。次いでスライドを、Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ、カタログ番号２４９０１）の溶液Ａ（リンモリブデン酸）中で２分間インキュベートした。蒸留水で完全にすすいだ後、スライドを溶液Ｂ（Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｄ ８０／２ ４ ６－トリニトロフェノール）中に１５分間置き、続いて蒸留水でさらにすすぎ、次に溶液Ｃ（０．１Ｎ塩酸）で２分間インキュベートした。スライドを、ＤＩ水中１：１０希釈を用いてＰｏｌｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号Ｓ２１１４）からの１％氷酢酸中の１％Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎで２．５分間対比染色した。最後に、スライドを再度蒸留水ですすぎ、グレードエタノール中で脱水し、キシレンで清澄化し、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ、Ｃａｔ＃８３１０）のＣｙｔｏｓｅａｌ ６０培地を用いてカバーガラスを載せた。画像を、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ４．９．１ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して撮影した。シリウスレッド染色及びコラーゲン％定量化の分析のために、赤色と緑色との間のコントラストをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて増強した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアプログラムのカラーデコンボリューションプラグインを選択し、ＲＧＢカラーデコンボリューションオプションを使用した。赤色画像は、シリウスレッド染色からのすべての結合組織を含む。緑色画像は、ファストグリーン対比染色からのすべての筋肉を含む。赤色画像及び元の画像のみを使用した。次いで、閾値を画像に適用して、コラーゲン陽性領域が黒で陰性領域が白の白黒画像を得た。測定機能を使用して、コラーゲンの面積を計算した。次いで、元の画像を「８ビット」に変換し、閾値を、画像を完全に飽和するものより１単位低い、２５４に調整することにより、全組織面積を決定した。次いで、以前に行ったように全組織面積を測定し、総面積を記録した。次いで、コラーゲンの割合を、コラーゲンの面積を全組織面積で割ることによって計算した。各個体の平均割合を次に計算した。

機能評価のための横隔膜強縮性収縮：マウスを安楽死させ、横隔膜を、肋骨が付着し、腱中心が無傷の状態で切断し、Ｂｅａｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７９：２４６４－７４，２０１１）、Ｒａｆａｅｌ－Ｆｏｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２４：５８２－８，２０１１、及びＭｏｏｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ７１：ｅ５００３６，［ｙｅａｒ？］）によって先に記載されたようにＫ－Ｈ緩衝液に入れた。２～４ｍｍ幅の横隔膜切片を単離した。横隔膜条片を腱中心で編組外科用絹糸（６／０、Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いてしっかり結び、条片の遠位端に取り付けられた肋骨の一部分を通して縫合した。各筋肉を、３７℃で維持した酸素化Ｋ－Ｈ溶液を充填した水浴に移した。筋肉を水平に整列させ、固定ピンとデュアルモード力変換器サーボモーター（３０５Ｃ、Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）との間で直接結んだ。２つの白金プレート電極を、筋肉の長さに隣接するように器官浴内に位置付けた。筋肉を攣縮収縮の測定のために最適な長さに伸長させ、その後、１０分間静置させた後に、強縮プロトコルを開始した。筋肉が安定した時点で、筋肉を１ｇの最適な長さに設定し、３０秒毎に３回の１Ｈｚ攣縮、続いて、１分毎に３回の１５０Ｈｚ攣縮からなるウォームアップに供する。３分間の休止期間後、横隔膜を、各刺激間に２分間の休止期間を設けて、２０、５０、８０、１２０、１５０、１８０Ｈｚで各々２５０ミリ秒間刺激して、最大強縮力を決定する。筋肉の長さ及び重量を測定した。力を、筋肉の重量及び長さに対して正規化した。

心臓磁気共鳴イメージング：９．４Ｔ水平ボア磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）システム及びマウスボリュームコイル（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて心機能を分析した。撮影台上に配置する前に、カルボゲン（１Ｌ／分）と混合した２．５％イソフルランで３分間マウスを麻酔した。イメージング装置へのマウスの配置及びイメージングの開始後、イソフルラン／カルボゲン混合物は、実験の残りの期間にわたって１．５％に低下させた。ＥＫＧ及び呼吸は、ＭＲＩ適合システム（Ｍｏｄｅｌ １０２５，Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｏｎｙｂｒｏｏｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて監視した。ゲーテッド心臓短軸ＦＬＡＳＨシネＴ１強調画像を、マウスの左心室（ＬＶ）全体にわたって取得した（ＴＲ＝８ｍｓ、ＴＥ＝２．８ｍｓ、α＝１８ｏ、マトリックス＝２５６×２５６、ＦＯＶ＝３．０×３．０ｃｍ、スライス厚＝１ｍｍ、ｎスライス＝７、心周期当たり最大２０フレーム）。画像分析のために、各短軸画像の拡張末期及び収縮末期の時点を特定し、心内膜及び心外膜の心臓境界を手動でトレースした。乳頭筋は、ＬＶの心内膜境界から除外した。これらの測定された領域から、拡張末期容積（ＥＤＶ）、収縮末期容積（ＥＳＶ）、１回拍出量（ＳＶ）、心拍出量（ＣＯ）、駆出率（ＥＦ）、及び平均ＬＶ質量を算出した。

免疫蛍光：心臓と共に、前脛骨（ＴＡ）、腓腹（ＧＡＳ）、四頭（ＱＵＡＤ）、大腰（ＰＳＯＡＳ）、臀（ＧＬＵＴ）、三頭（ＴＲＩ）、及び横隔膜筋からのクリオスタット切片（１２μｍ）を、Ｐｏｚｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２３：５７－６６，２０１６に記載されているような我々の以前に使用したプロトコルを介して、ｈＳＧＣＢ導入遺伝子の免疫蛍光染色に供した。切片を、マウスモノクローナルヒトβ－サルコグリカン一次抗体（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＵＫ、Ｃａｔ番号ＮＣＬ－Ｌ－ｂ－ＳＡＲＣ）で、１：１００の希釈でインキュベートした。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラを使用して、筋肉切片の４つの異なる象限をカバーする４つのランダムな２０倍画像を撮影した。β－サルコグリカン染色（＞５０％の筋膜染色）の陽性線維の割合を各画像について決定し、各筋肉について平均した。

形態計測分析：分析のために、７ヶ月齢のＣ５７ＢＬ６ ＷＴマウス（ｎ＝５）、ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝５）、及びｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで６ヶ月治療されたｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝５）からの筋肉の１２μｍ厚の凍結切片に対して、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。ＴＡ、ＧＡＳ、ＱＵＡＤ、ＰＳＯＡＳ、ＧＬＵＴ、ＴＲＩ、及び横隔膜筋において、中心核を有する筋線維の割合を決定した。さらに、ＧＡＳ、ＰＳＯＡＳ、及びＴＲＩ筋において、筋線維直径を測定した。各動物の筋肉当たり４つのランダム２０倍画像をＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラで撮影した。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて中心核形成線維を定量化し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ＬＥ４ソフトウェアを用いて線維直径を測定した。

Ｘ線画像：麻酔をかけた７ヶ月齢のＣ５７ＢＬ６ ＷＴマウス（ｎ＝６）、未治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝６）、及びｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで６ヶ月治療されたｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝６）に対して、Ｆａｘｉｔｒｏｎ ＭＸ－２０デジタルＸ線システムを用いて２６ｋＶで３秒間（Ｆａｘｉｔｒｏｎ Ｘ－Ｒａｙ Ｃｏｒｐ，Ｌｉｎｃｏｌｎｓｈｉｒｅ，ＵＳＡ）全身Ｘ線を行った。

オープンフィールドケージ活動のレーザー監視：オープンフィールド活動チャンバを使用して、実験マウスの全体活動を決定した。Ｃ５７ＢＬ６ ＷＴ（ｎ＝６）及び未治療ｓｇｃｂ^－／－（ｎ＝６）対照群からの７ヶ月齢のマウスを、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢで６ヶ月治療されたｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝６）と共に、以前に記載されたプロトコル（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５１１－５，２００８、Ｂｅａｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｈｏｌ．１７９：２４６４－７４，２０１１）に従って、分析に供した。全てのマウスを、マウスが最も活動的である早朝からその夜の終わり間近のサイクルで、毎日同じ時間に試験した。全てのマウスを、毎回薄暗い光下で、かつ同じ飼育係により、隔離室で試験した。不安を軽減し、マウスの通常の行動、ひいてはアッセイの結果に影響を与える可能性があり得る可変的行動を最小限に抑えるために、試験されたマウスは個別に収容されていなかった（Ｖｏｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．４：２４０－５２，２００５）。マウスの行動を、Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して監視した。このシステムは、動物チャンバの前後かつ左右を横断する不可視赤外光線のグリッドを使用して、Ｘ－Ｙ－Ｚ平面内のマウスの位置及び動きを監視する。活動を、５分間間隔の１時間サイクルで記録した。マウスを、データ取得開始の数日前に１時間セッションで活動試験室に順応させた。マウスを、４匹１組で、個別のチャンバ内で試験した。試験機器を使用毎に掃除して、我々の結果を変化させ得るマウスの反動的な可変的行動を低減した。収集したデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌワークシートに変換し、全ての計算をＥｘｃｅｌプログラム内で行った。各マウスのＸ平面及びＹ平面における動きの個々の光線中断を加算して、合計歩行を表し、Ｚ平面における光線中断を加算して、１時間間隔内での垂直活動を得た。

実施例１
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢ構築及びベクター効力
図１Ａに示すコドン最適化全長ヒトＳＣＧＢ ｃＤＮＡを含む導入遺伝子カセットを構築した。カセットは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、合成ポリアデニル化部位、及びカセットの発現を駆動するのに使用される筋特異的ｔＭＣＫプロモーター（２０）を含む。カセットは、ＡＡＶ８に対して９３％相同である自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶｒｈ．７４ベクターにパッケージングした。ＡＡＶｒｈ．７４は、マウス及び非ヒト霊長類において、特に、循環によって筋肉に送達される場合に血液関門を通過する際に、安全かつ効果的であることが示されている。（１７、１８、２１）ベクター効力は、Ｓｇｃｂ－ヌルマウスの左ＴＡ筋への筋肉内注射によって確立した。遺伝子導入の３週間後、３ｘ１０^１０ｖｇの送達は、筋線維の７０．５±２．５％を形質導入し、１ｘ１０^１１ｖｇは、筋線維の８９．０±４．０％を形質導入した。

実施例２
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢの筋肉内送達
ベクター効力に続いて、研究を拡張し、遺伝子導入の６週間後及び１２週間後の療法の有効性を分析した。短い３週間効力試験後の高レベルの発現の結果として、最低有効用量を使用するためにその後の試験には合計３×１０^１０ｖｇの用量を選択した。５週齢のｓｇｃｂ^－／－マウスに、３×１０^１０ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢを左腹横（ＴＡ）に筋肉内投与し、β－サルコグリカン発現を、免疫蛍光を用いて注射の６週間後（ｎ＝９）の筋線維の８８．４±４．２％、及び注射の１２週間後（ｎ＝６）の筋線維の７６．５±５．８％において示し、発現をウエスタンブロッティングによって確認した（図１Ｂ）。β－サルコグリカン発現は、ジストロフィン関連タンパク質複合体（α－サルコグリカン及びジストロフィン）の成分の回復を伴った（図１Ｃ）。エバンスブルー色素（ＥＢＤ）を膜透過性のマーカーとして使用し（２２、２３）、外因性β－サルコグリカンを発現するすべての線維が漏出及びＥＢＤ封入から保護されていることがわかった（図１Ｄ）。ｓｇｃｂ^－／－マウスからの筋肉は、中心核形成線維、頻繁な筋線維壊死、線維性組織、ならびに萎縮性及び肥大性線維の両方によって表される顕著な線維サイズ変動を伴う重度の筋ジストロフィーを示す。（３、４）図２Ａに見られるように、ヘマトキシリン＆エオシン染色は、中心核の減少を含む罹患した筋肉のジストロフィー表現型の全体的な改善を示す（ｓｇｃｂ^－／－未治療－７６．８±２．３％対ＡＡＶ．ｈＳＣＧＢ治療－３８．８６±３．５％、Ｐ＜０．０００１）（図２Ｃ）。治療後の平均線維直径の増加を伴う、線維直径分布の正常化も観察した（ｓｇｃｂ^－／－未治療－３２．６±０．３１μｍ対ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療－３５．５６±０．２２μｍ、Ｐ＜０．０００１）（図２Ｄ）。

ｓｃｇｂ^－／－マウスの組織病理学的特徴は、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、及びデコリンなどの他の細胞外マトリックス成分と共に、主にコラーゲンでの筋組織の広範な置換によって特徴付けられる線維症である。（１４）この結合組織による筋組織の置換は、遺伝子置換の潜在的価値に疑問を呈し、改善の程度を制限し得る。（２４）これを試験するために、１２週間治療されたマウスを線維症の軽減についてアッセイした。ＴＡ筋は、その固有の線維症の程度がＫＯモデルにおいて確立され、それが血管ＩＬＰ遺伝子送達後の潜在的な標的を表すため、特異的に評価した。ＴＡ筋のコラーゲンＩ型及びＩＩＩ型のピクロシリウスレッド染色は、未治療ｓｇｃｂ^－／－マウスの筋肉と比較して、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢ治療筋肉内に存在するコラーゲンの量の有意な減少（５２．７４％）を示した（２０．７±０．５７％対４３．８±２．３％、それぞれ、ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療対ｓｇｃｂ^－／－未治療、Ｐ＜０．０００１）（図２ｂ及びｅ）。注射時に５週齢のマウスからの未治療ｓｇｃｂ^－／－筋肉は、２４．０５±１．５％のコラーゲン沈着を有し、治療の１２週間後コラーゲンの量のわずかな（１４．０％）減少があったことを示した。

実施例３
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢ遺伝子導入後の骨格筋の機能補正
ｈＳＧＣＢ遺伝子導入が筋機能を改善できるかどうかを決定するために、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢで治療したｓｇｃｂ^－／－マウスからのＴＡ筋の機能特性を評価した。４週齢のｓｇｃｂ^－／－マウスのＴＡへの３×１０^１０ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢの筋肉内送達に続いて、治療の６週間後、ＴＡ筋をｉｎ－ｓｉｔｕ力測定に供した（ｎ＝４）。被治療筋肉を、未治療の反対側の筋肉及びＣ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスの筋肉と比較した。ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢ治療筋肉は、絶対強縮力及び正規化比力の両方において有意な改善を示した（図３Ａ及びＢ）。被治療筋肉は、未治療ｓｇｃｂ^－／－対照の７７０．９±１１８．３ｍＮと比較して、１４３６．９±１９９．５ｍＮの平均絶対力を有した（Ｐ＜０．０１）。同様に、被治療ＴＡ筋は２５４．０１±６．９ｍＮ／ｍｍ^２の平均比力を生じ、未治療筋肉は１２４．２±１３．９ｍＮ／ｍｍ^２の力を生じた（Ｐ＜０．０１）。最後に、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢで治療された筋肉は、未治療の対照筋肉と比較して、収縮誘発性損傷に対するより大きな耐性を示した（図３Ｃ）。治療されたＴＡ筋は、最初の収縮後に生成されたものから３４．０±５．１％の力を失ったが、未治療の罹患筋肉は、伸張性収縮プロトコル後に５４．１±３．８％（Ｐ＜０．０１）の力を失った。これらのデータは、ｈＳＧＣＢ遺伝子導入が、β－サルコグリカンが欠損した罹患筋肉に機能的利益をもたらすことを示す。

実施例４
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢでの老化した筋肉の治療
ＬＧＭＤ２Ｅのこのマウスモデルにおける疾患進行の研究は、筋肉における最も重度の組織リモデリングは６～２０週の間に起こるが、筋肉の組織病理は年齢と共に悪化し続け、患者における疾患進行に類似していることを示した。（３、４、１４）その結果、より高度な筋肉の劣化及び内鞘線維症を有するより高齢で治療が行われる臨床現場を模倣するために、６ヶ月齢のｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝５）のＴＡ筋に３×１０^１０ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢを筋肉内投与した。治療の１２週間後、９ヶ月齢で、筋線維の８０．１±４．８％が形質導入された（図４Ａ）。コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型のピクロシリウスレッド染色は、未治療ｓｇｃｂ^－／－マウスの筋肉と比較して、治療されたマウス中に存在するコラーゲンの量の４２．２％の減少を示した（ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療－２０．０±０．８０％対ｓｇｃｂ^－／－未治療－３４．６±１．４％、Ｐ＜０．０００１）（図４Ｂ及びＣ）。治療時に６ヶ月齢のｓｇｃｂ^－／－マウスは、３０．８±２．０％のコラーゲン沈着を有し（ｎ＝４、４匹の雄）、したがって、これらの結果は、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＢ治療が、予防するだけでなく、既存の線維症を回復に向かわせる可能性も有することを示している。

実施例５
ｓｇｃｂ－／－マウスにおけるｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢのＩＬＰ
四肢の１つにおける複数の筋肉を標的化する能力は、ＬＧＭＤ２Ｅ患者への変換のためにより臨床的に適切な送達方法を可能にする。５×１０^１１ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢのＩＬＰによる４～６週齢のｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝９、７匹の雄、２匹の雌）への送達を、遺伝子導入の２ヶ月後に分析した。β－サルコグリカン発現は、腓腹（ＧＡＳ）筋では線維の９１．８±４．７％、ＴＡでは９０．６±２．８％に達した（図５Ａ）。ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢのＩＬＰ送達は、未治療の反対側の筋肉と比較して、ＷＴと変わりない、伸張性収縮誘発性損傷からの有意な保護をもたらした（Ｐ＜０．０５）（図５Ｃ）。血管送達は、筋組織病理学的パラメータも回復させた（図５Ｂ）。中心核がＴＡ（ｓｇｃｂ^－／－未治療－７６．９±２．８％対ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療－２３．２±５．７％、Ｐ＜０．００１）及びＧＡＳ（ｓｇｃｂ^－／－未治療－７８．２±２．４％対ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療－１６．８±６．６％、Ｐ＜０．００１）において減少した。遺伝子導入はまた、線維直径分布の正常化と共に、ＴＡ（ｓｇｃｂ^－／－未治療－３０．５３±０．５２μｍ対ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療－４１．９±０．４６μｍ、Ｐ＜０．０００１）及びＧＡＳ（ｓｇｃｂ^－／－未治療－３８．９±０．３７μｍ対ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療－３３．３±０．４４μｍ、Ｐ＜０．０００１）において平均線維サイズの増加をもたらした。ＣＤ３細胞、ＣＤ４細胞、及びマクロファージの数の実質的な減少（～６０％）（表１）が観察された。

ＴＡ及びＧＡＳ筋のピクロシリウスレッド染色はまた、血管送達後、未治療のｓｇｃｂ^－／－の筋肉と比較してコラーゲンの量の有意な減少を示した（図６ａ）。ＴＡのコラーゲンレベルは、エンドポイント齢の未治療ｓｇｃｂ^－／－マウスにおける４０．２±１．５％と比較して、被治療筋肉において２１．６±１．３％に減少した（Ｐ＜０．０００１）。先に示したように、注射時のｓｇｃｂ^－／－マウスは、ＴＡ筋において２４．１±１．５％のコラーゲンを示し、治療の８週間後に再びコラーゲン沈着のわずかな減少（１０．０％）を示した。同様に、ＧＡＳ筋の染色は、エンドポイントの未治療ｓｇｃｂ^－／－マウスにおける３７．９±１．３％と比較して、被治療マウスが２２．９±０．９９％のコラーゲンを有することを示した（Ｐ＜０．０００１）。定性ＰＣＲを行い、シリウスレッド染色の結果と相関する筋肉中のコラーゲン転写物レベルを検出した。まとめると、これらのデータは、ヒトβ－サルコグリカンのＡＡＶ媒介送達がｓｇｃｂ^－／－罹患筋肉の筋線維症を軽減し、筋機能を改善し、ジストロフィー病理を回復に向かわせることを示す。

実施例６
ｒＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢの安全性及び生体分布
最初に、３×１０^１０ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢをＴＡに筋肉内注射した正常なＷＴマウスは、Ｈ＆Ｅ染色によって毒性の徴候を示さず、ウイルスによる有害作用はないことを示した。前のセクションで記載されたｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢの総用量５×１０^１１ｖｇのＩＬＰ血管送達後、このコホートの小グループのマウス（ｎ＝４）で安全性を評価した。まず、組織学的に心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、生殖腺、及び横隔膜を含むオフターゲット器官と共に、顕著な遺伝子発現を有する標的化筋肉を分析した。パラフィン切片は、獣医学の病理学者により正式に調査され、いずれの器官にも毒性の証拠は認められなかった（データは示さず）。上記の組織及び器官のすべてにおいて、それぞれ、ウエスタンブロッティング及びｑＰＣＲを用いて、タンパク質発現及びベクター生体分布も評価した。ベクターゲノムコピーは、試験したすべての器官で検出されたが、被治療筋肉以外のいずれの試料でもタンパク質発現は検出されなかった（図７）。最後に、いずれかのコホートからの平均体重を比較すると、被治療及び未治療筋肉の湿潤重量の分析は、有意な差または傾向を示さない（データは示さず）。これらのデータは、筋特異的ｔＭＣＫプロモーターが骨格筋への発現を制限し、ベクターが非毒性であるという証拠を提供する。

実施例７
ＳＧＣＢ－／－マウスの心臓及び横隔膜における組織学的及び機能的欠損
治療されなかったＷＴ及び７ヶ月齢のＳＧＣＢ－／－マウス（各株ｎ＝６）を、心臓ＭＲＩ及び横隔膜生理学によって分析し、欠損を調べた。これらの分析に続いて、動物を犠死させ、組織病理学について評価した（図８）。トリクローム染色は、横隔膜（図８Ａ）及び心臓（図８Ｃ）の両方において広範囲の線維症（赤色染色）を示した。これには、横隔膜における比力の機能的欠損（１１６．２４ｍＮ／ｍｍ^２ ＳＧＣＢ－／－対２３６．６７ｍＮ／ｍｍ^２ ＷＴ、図８Ｂ）及びＭＲＩによって測定される駆出率の有意な欠損（ＷＴ、７８％対ＳＧＣＢ－／－６５％、図８Ｄ）が伴った。

実施例８
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築及びベクター効力
図９Ａに示すコドン最適化全長ヒトＳＣＧＢ ｃＤＮＡを含む導入遺伝子カセットを構築した。カセットは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、合成ポリアデニル化部位、及びカセットの発現を駆動するのに使用される筋特異的ＭＨＣＫ７を含む。これは、近位プロモーターを有する内因性筋クレアチンキナーゼ遺伝子（ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、５８４－ｂｐ）内の転写開始部位の～１．２ｋｂの５’から取った２０６－ｂｐエンハンサーを利用するＭＣＫベースのプロモーターである^３、１２。カセットを、ＡＡＶ８に対して９３％相同である自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶｒｈ．７４ベクターにパッケージングした。ＡＡＶｒｈ．７４は、マウス及び非ヒト霊長類において、特に、循環によって筋肉に送達される場合に血液関門を通過する際に、安全かつ効果的であることが示されている。（１７、１８、２１）ベクター効力は、Ｓｇｃｂ－ヌルマウスの左ＴＡ筋への筋肉内注射によって構築した。遺伝子導入の４週間後、３ｘ１０^１０ｖｇの送達は、筋線維の＞９０％を形質導入した。

実施例９
ｓｃＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの全身送達
６ヶ月の長期の時点で全身送達される場合の導入遺伝子の発現及びベクターの有効性を評価するために、ベクターを１４匹のＳＧＣＢ－／－マウスに総用量１×１０^１２ｖｇの用量（５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）で尾静脈注射によって送達した。マウスは４週齢で注射され、完全剖検は注射の６ヶ月後に実施された（発現の中間評価として１匹のマウスを１ヶ月後に、２匹のマウスを４ヶ月後に殺した）。横隔膜及び心臓と共に上記のすべての骨格筋を分析のために抽出した。毒物学及び生体分布分析のために、器官も取り出した。ヒトβ－サルコグリカンの免疫蛍光染色を使用し、ｈＳＧＣＢベクターの全身注射を与えた６匹のＫＯマウスの横隔膜及び心臓に加えて、左右両方の５つの肢の筋肉におけるｈＳＧＣＢ導入遺伝子発現を決定した。これらの筋肉は、ＴＡ、腓腹筋（ＧＡＳ）、四頭筋（ＱＵＡＤ）、臀筋（ＧＬＵＴ）（図示せず）、大腰筋（ＰＳＯＡＳ）、及び三頭筋（ＴＲＩ）を含んでいた（図１０）。心臓組織の定性分析を用いて、送達後の心筋における導入遺伝子発現の相対的なレベルを評価した。

各筋肉から４つの２０倍画像を撮影し、各画像についてｈＳＧＣＢ陽性線維の割合を決定し、各マウスからの各筋肉についての平均形質導入パーセントを得た。図１０及び図１１に示す結果は、横隔膜及び心臓を含む分析したすべての筋肉における≧９８％形質導入を示す。β－サルコグリカンを欠損したマウスは、免疫蛍光によって分析した場合、タンパク質が完全に存在しなかった。総用量１×１０^１２ｖｇの治療用量は、横隔膜を含むすべての骨格筋にわたる平均９７．９６±０．３６％（±ＳＥＭ）、及び心筋における約９５％以上のベクター形質導入をもたらした（データは示さず）。

実施例１０
ＳＧＣＢ^－／－マウスにおけるｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの長期全身送達
実施例９に記載の１ヶ月効力アッセイの結果の上に蓄積するために、β－サルコグリカン導入遺伝子カセットのｓｇｃｂ^－／－マウスへの長期（６ヶ月間）全身送達について調査した。４～５週齢のｓｇｃｂ^－／－マウスの尾静脈に、総用量１×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢを静脈内投与した（ｎ＝５）。マウスを注射の６ヶ月後に剖検し、ｈＳＧＣＢ導入遺伝子発現を、すべての被治療マウスの横隔膜及び心臓に加えて、左右両方の６つの骨格筋において免疫蛍光を用いて実証した。分析された骨格筋は、ＴＡ、ＧＡＳ、ＱＵＡＤ、臀筋（ＧＬＵＴ）、ＰＳＯＡＳ、及びＴＲＩを含んでいた。被治療マウスにおける全身送達から生じる平均ｈＳＧＣＢ発現は、横隔膜を含むすべての骨格筋にわたって９８．１３±０．３１％（±ＳＥＭ）であり、心臓における発現は＞９５％を超えた。代表的な画像を図１２ｂに示す。すべての被治療マウスから平均した個々の筋肉タイプにおける発現レベルを表２に示す。図１２ｃのウエスタンブロッティングは、すべての筋肉における導入遺伝子の発現を確認する。表２の発現値は、全身注射されたマウス（ｎ＝５）からの左及び右の筋肉の平均として、様々な筋肉について提示される。値はＡＶＧ±ＳＥＭとして示される。さらに、ウエスタンブロッティング及びデンシトメトリーによる被治療マウスからの心臓におけるｈＳＧＣＢ導入遺伝子発現の定量化は、ＢＬ６ ＷＴ発現レベル（図１２ｄ）を超える最大７２．０％のｈＳＧＣＢの過剰発現を示し、骨格筋において定量化された高レベルと相関する。

以前の報告（Ａｒａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ ８：１５８９－９８，１９９９，Ｄｕｒｂｅｅｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５：１４１－５１，２０００）に記載され、図１３ａのＧＡＳ及び横隔膜のヘマトキシリン＆エオシン染色によって示されるｓｇｃｂ^－／－筋肉の重要な特徴は、中心核形成、壊死、炎症性浸潤、及び線維症を含む重度のジストロフィー病理である。遺伝子導入はこの病理を顕著に改善し、これらのジストロフィーの特徴の多くを緩和した（図１３ａ）。組織学的パラメータの定量化は、遺伝子導入の結果として分析された様々な骨格筋における中心核生成の有意な減少を示した（図１３ｂ）。平均して１．８９±０．３９％であるＢＬ６ ＷＴマウスにおけるすべての筋肉にわたる予想された低レベルの中心核形成と共に、ここで記録するように、分析したすべての筋肉、ＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ治療ｓｇｃｂ^－／－筋肉における３６．３０±５．１６％と比較して未治療ｓｇｃｂ^－／－マウスにおける６６．８５±１．８６％の平均中心核（ｐ＜０．０００１）を考慮し、以下の表３は、様々な筋肉についてＢＬ６ ＷＴ、ｓｇｃｂ^－／－、及び全身注射されたマウス（各群ｎ＝５）からの左右の筋肉の平均（±ＳＥＭ）として与えられる中心核数及び線維直径を提供する。注目すべきことに、最も重要な変性／再生の波は、中心にある核によって示されるｓｇｃｂ^－／－筋肉において３週間で生じる。動物はこの損傷後に治療され、したがって集中化した核の完全な逆転は期待されなかった。筋組織病理学のより深い分析により、試験した３つの筋肉（ＧＡＳ：ｓｇｃｂ－／－未治療－２８．３７±０．２３μｍ対ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療－３６．０４±０．１７μｍ、ｐ＜０．０００１）（ＰＳＯＡＳ：ｓｇｃｂ－／－未治療－２４．７５±０．２３μｍ対ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療－３８．４３±０．２８μｍ、ｐ＜０．０００１）（ＴＲＩ：ｓｇｃｂ^－／－未治療－２８±０．３１μｍ対ＡＡＶ．ｈＳＧＣＢ治療－３５．５６±０．２２μｍ、ｐ＜０．０００１）において、未治療ｓｇｃｂ－／－マウスと比較してベクターで治療した罹患マウスにおける平均線維直径の増加を伴う線維サイズ分布の正常化が明らかになった（図１３ｃ、１３ｄ、表３）。

ＬＧＭＤ２Ｅの病因及び療法の有効性において線維症が顕著な影響を及ぼすため、線維症の軽減におけるその効力を実証することは重要であった。それは局在化したβ－サルコグリカン遺伝子導入で、ここではｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの全身送達後に見られた。コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型のピクロシリウスレッド染色を用いて、腓腹及び横隔膜筋中のコラーゲンのレベルを、７ヶ月齢のＢＬ６ ＷＴマウス（ｎ＝４）、未治療のｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝４）、及び注射の６ヶ月後の被治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝５）において分析した。被治療筋肉は、未治療のｓｇｃｂ^－／－の筋肉と比較して有意に少ないコラーゲン沈着を示した（図１４ａ）。ベクター形質導入ＧＡＳ筋は、未治療ｓｇｃｂ－／－ＧＡＳ筋における４３．５５±３．３３％のコラーゲンと比較して、１７．５５±０．５９％のコラーゲンを含んでいた（ｐ＜０．０００１）。さらに、被治療横隔膜筋は、未治療のｓｇｃｂ－／－の筋肉における４４．０５±２．３９％と比較して、２１．６７±１．０９％のコラーゲンを含み、ＬＧＭＤ２Ｅ表現型の線維症成分を緩和するｈＳＧＣＢ遺伝子導入の能力を示した（ｐ＜０．０００１）（図１４ｂ）。

実施例１１
全身送達後の横隔膜機能の回復
ｈＳＧＣＢ遺伝子導入が筋機能を改善できるかどうかを決定するために、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＣＧＢで治療されたＳＧＣＢ^－／－マウスからの横隔膜筋の機能特性を評価した（方法についてはＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。ＳＧＣＢ－／－マウスの横隔膜における機能的欠損をまず確立した。ＫＯ横隔膜は、ＢＬ６ ＷＴマウス（１１６．２４ｍＮ／ｍｍ^２対２３６．６７ｍＮ／ｍｍ^２）と比較して５０．９％減少した比力出力（１１６．２４ｍＮ／ｍｍ^２）及び厳しい疲労プロトコルに従ってより大きな喪失（ＳＧＣＢ^－／－では２３％喪失、ＢＬ６ ＷＴでは７％の喪失）を示した。横隔膜におけるほぼ１００％のｈＳＧＣＢ発現をもたらすｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの尾静脈送達は、２２６．０７ｍＮ／ｍｍ^２に改善された比力出力及びわずか１２％の力の喪失での疲労に対するより大きな耐性を有する横隔膜機能の回復をもたらす（ｎ＝５）（図１５）。

実施例１２
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９Ｃの送達はＳＧＣＢ－／－マウスにおける線維症を軽減する
骨格筋（図２、４、６）ならびに心臓及び横隔膜（図８）の両方において特定された広範囲の線維症は、ＬＧＭＤ２Ｅにおけるコラーゲン沈着（線維症）を治療する必要性を示した。以前に、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、Ｍｉｒ２９Ｃが（Ｍｉｒ２９Ａ、Ｂ、及びＣのうちで）最も重度に減少していることを見出した。β－サルコグリカン欠損マウス（ＬＧＭＤ２Ｅのマウスモデル）においてもＭｉｒ－２９Ｃが減少するであろうと仮定した。これが正しいことが証明された（図１５）。Ｍｉｒ２９Ｃレベルが減少し、線維症（コラーゲン）レベルが増加し、線維症の３つの成分（Ｃｏ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、及びＦｂｎ）がＲＮＡレベルで増加した。Ｍｉｒ２９Ｃで線維症を予防することができるかどうかを試験するために、遺伝子療法ベクターｓｃｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃ（３×１０^１１ｖｇ）を４週齢のＳＧＣＢ－／－マウス（ｎ＝５）の前脛骨筋に注射した。ｓｃｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃは、図１６に示され、米国仮出願第６２／３２３，１６３号に記載され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９Ｃでの２ヶ月の治療後、被治療及び対照ＳＧＣＢ－／－マウスならびにＷＴマウスからＴＡ筋を採取し、線維症（コラーゲンレベル）について分析した（各群ｎ＝５）。シリウスレッド染色及び定量化を用いて、コラーゲンレベルは治療後に減少した（図１７参照）。Ｃｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、及びＦｂｎの転写物レベルが正常化し、筋線維サイズが増加した。コラーゲン１及び３について染色するシリウスレッドで染色された未治療及びＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９Ｃ治療前脛骨筋の走査された全切片の代表的な画像を図１１８に示す。これは、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ＣがＳＧＣＢ－／－マウスにおける線維症を軽減し、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＢまたはｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢでの遺伝子置換と組み合わせて使用することができるという原理の証明である。

実施例１３
ＳＧＣＢ－／－マウスへの静脈内遺伝子導入は胸椎の後弯症を軽減する
ＬＧＭＤ２Ｅに罹患している患者における組織病理の悪化による胴筋の変性は、後弯症に起因し得る。脊柱を支える筋肉の弱化に起因する胸椎の後弯症によって、横隔膜が前方に押し出され、肺容量及び横隔膜機能をさらに損なうことがある。後弯症の肉眼解剖学的外観を有するｓｇｃｂ^－／－マウスにおける表現型の重症度の結果として、全身Ｘ線撮影法を用い、７ヶ月齢のＢＬ６ ＷＴマウス（ｎ＝６）、ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝６）、及び注射の６ヶ月後の被治療ｓｇｃｂ^－／－マウス（ｎ＝６）における後弯症の程度を決定した。後弯指数（ＫＩ）スコアは、後弯症のレベルの定量値を決定する（Ｌａｗｓ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１９７０－７，２００４）。図１９ａのＷＴパネルに示すように、ＫＩスコアは、脊柱の弯曲の頂点までの中間線の長さに対する前肢から後肢までの長さの比である。ｓｇｃｂ^－／－マウスは重度に弯曲した脊椎及び３．６４±０．１６のより低いＫＩスコアを示すが（ｎ＝６）、ＢＬ６ ＷＴマウスは有意にまっすぐな脊椎を有し、６．０１±０．４１のより高いＫＩスコアを得る（ｎ＝６）（ｐ＜０．０１）（図１９ｂ）。被治療ｓｇｃｂ^－／－マウスは、５．３９±０．５８までのＫＩスコアの増加と共に脊柱における後弯症の程度の有意な減少を示した（ｎ＝６）（ｐ＜０．０５）（図１９ｂ）。これらのデータは、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの静脈内送達が、脊椎全体の完全性にとって有益であり、疾患に含まれる後弯症及び関節拘縮を緩和することができることを示した。このデータは、本発明のｒＡＡＶベクターの全身送達後のｓｇｃｂ^－／－マウスにおける後弯症の緩和及び身体活動の増加を示した。このデータは、本発明の遺伝子療法がＬＧＭＤ２Ｅ患者の生活の質を改善するという追加の証拠である。

実施例１４
心筋症の評価
四肢及び横隔膜筋の組織学的破壊もまた、Ｈ＆Ｅ及びピクロシリウスレッド染色によって明らかな心筋壊死及び線維症の存在を特に有する７ヶ月齢のｓｇｃｂ^－／－マウスの心筋において検出される（図２０ａ）。代表的な心機能障害は、しばしば、減少した心拍出量及びより低い駆出率を有する拡張型心筋症の形態である（Ｓｅｍｐｌｉｃｉｎｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８４：１７７２－８１，２０１５、Ｆａｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ １３：３０３－９，２００３）。心臓磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して、ＢＬ６ ＷＴマウスと比較したｓｇｃｂ^－／－マウスの心筋における機能的欠損を確立し、機能的結果尺度として使用するために、心臓のいくつかの機能的パラメータを評価した。７ヶ月齢の対照マウスのイメージングは、ｓｇｃｂ^－／－心臓における０．０４１±０．００１９ｍＬからＢＬ６ ＷＴ心臓における０．０２９±０．００２４ｍＬへの１回拍出量の２９．４％減少（ｐ＜０．０１）、ｓｇｃｂ^－／－心臓における１４．７０±０．７４ｍＬ／分からＢＬ６ ＷＴ心臓における１２．７２±０．９７ｍＬ／分への３１．７％低い心拍出量、及び最後にＢＬ６ ＷＴ心臓における７６．９０±１．６７％と比較してｓｇｃｂ^－／－心臓において６６．２１±３．８３％の、１４．３％低い駆出率（ｐ＜０．０５）を示した（図２０ｂ）。これは、この月齢での全体的な心機能の穏やかな低下及び心筋症の発症への傾向を示す。全身送達によるＫＯマウスの心臓におけるｈＳＧＣＢ発現の回復は、これらの欠損を部分的に補正し、１回拍出量を０．０３２±０．００２７ｍＬに、心拍出量を１４．６６±０．７５ｍＬ／分に、駆出率を６８．１６±２．３１％に改善した（図１９ｂ）。ここで報告される心臓組織の組織学的及び機能的破壊との相関として、心臓機能の重要な調節因子及び心臓損傷の指標（バイオマーカー）である心筋トロポニンＩ（ｃＴｒｐＩ）発現についてのウエスタンブロッティングは、罹患ｓｇｃｂ^－／－心臓においてＢＬ６ ＷＴマウスに見られるレベルの６０．３８％まで減少する（図２０ｃ）。ｃＴｒｐＩのレベルは、治療後、ＷＴ心臓に見られる発現レベルの３５．８０％まで回復する（図２０ｄ）。

実施例１５
身体活動の増加を伴う横隔膜筋の機能回復
ＬＧＭＤ２Ｅにおける横隔膜機能障害及び呼吸不全の重要な関与は、臨床全身療法の有効性確認に必須の横隔膜に対する機能的利益を要求する。横隔膜筋から採取された条片に対するエクスビボ実験プロトコルの使用により、β－サルコグリカンを回復させることが、この重度に損傷した筋肉に機能的利益をもたらすかを評価した。罹患マウスからの７ヶ月齢の横隔膜において特定された有意な組織病理と一致して、ｓｇｃｂ^－／－横隔膜（ｎ＝４）は、ＢＬ６ ＷＴマウス（ｎ＝５）と比較して比力出力の有意な（５１％）減少（それぞれ、１１６．２４±１０．４９ｍＮ／ｍｍ２対±２３６．６７±１５．８７ｍＮ／ｍｍ^２、ｐ＜０．００１）、及び厳しい疲労プロトコルに従って最初の収縮後に生じたものからのより大きな力の喪失（ｓｇｃｂ^－／－では２３±１．０％喪失、ＢＬ６ ＷＴでは７．０±３．０％喪失、ｐ＜０．０５）（図６ａ）を伴う機能的欠損を示した。ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの尾静脈送達の６ヶ月後、比力出力の劇的な改善が観察された。比力出力は２２６．０７±２７．１２ｍＮ／ｍｍ^２に増加し（ｎ＝５）（ｓｇｃｂ^－／－と比較してｐ＜０．０５）、反復疲労からの筋肉のより良好な保護は１２．０±４．０％の力の喪失のみで観察された（ｓｇｃｂ^－／－と比較してｐ＜０．０５）（図２１ａ）。全体として、これらのデータは、ＴＡ筋における我々の以前の所見を支持し、β－サルコグリカンの回復が横隔膜筋における機能回復をもたらすことを示す。

疲労の増加及び全体的な活動の低下の症状は、後弯症の発生に部分的に起因する多くの神経筋疾患において頻繁に報告されている。結果として、ＬＧＭＤ２Ｅの表現型を考慮して、ＫＯマウスは健康なＷＴマウスと比較して自然に活動性が低く、またｓｇｃｂ^－／－マウスへのｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの全身送達はより身体的に活動的なマウスをもたらすだろうという仮説を立てた。この仮説及び遺伝子導入のさらなる潜在的な機能的利益を試験するために、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５１１－５，２００８及びＢｅａｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７９：２４６４－７４，２０１１に記載されるものと同様のオープンフィールドケージ活動のレーザー監視プロトコルを、すべてのマウス群で実施した。図２１ｂのグラフは、総歩行（ｘ平面及びｙ平面における水平運動）及び後肢垂直立ち上がりの両方において、ＷＴと比較してＫＯマウスにおける有意な減少（５５．５％）を示す。ＷＴマウスにおける１時間にわたる水平歩行レーザービームブレークの平均数は、ＫＯマウスにおける３２７１±４８３．８（ｎ＝６）と比較して７３５５±４００．８（ｎ＝６）であった（ｐ＜０．０００１）。さらに、ＷＴマウスにおいて記録された垂直立ち上がりビームブレークの平均数は、ＫＯマウスにおける２６４．５±６３．３６に対し、６２６．７±５３．７６であった（ｐ＜０．０１）（図２１ｂ）。最初の仮説と一致して、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ治療マウスは、活動の定量化において例示されたＫＯと比較して明らかにより活動的であり、総歩行は５１４３±２９３．２ビームブレークまで２２％増加し（ｐ＜０．０５）、後肢垂直立ち上がりは被治療マウス（ｎ＝６）において６１５．３±９５．９３ビームブレークまで７７％劇的に増加した（ｐ＜０．０５）（図２１ｂ）。

実施例１６
ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの安全性及び生体分布分析
総用量１．０×１０１２ｖｇ（５×１０１３ｖｇ／ｋｇ）のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの全身送達の６ヶ月後のｓｇｃｂ－／－マウスにおいて、ｈＳＧＣＢ遺伝子療法の潜在的な毒性または安全性の懸念を評価した。ベクター生体分布及びオフターゲット導入遺伝子発現を、それぞれ、ｑＰＣＲ及びウエスタンブロッティングを用いて、ベクター投与ｓｇｃｂ^－／－動物からの組織試料（ＴＡ、ＴＲＩ、横隔膜、心臓、生殖腺、肺、腎臓、肝臓、及び脾臓）について分析した。ベクター特異的プライマープローブセットを用いて、ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢベクターゲノムを、回収されたすべての組織において様々なレベルで検出した。予想通り、最高レベルは肝臓ならびに骨格筋及び心臓に見られ、試験物品がベクター投与マウスの意図されたすべての筋肉に効率的に送達されたことを示した（図２２ａ）。さらに、ｈＳＧＣＢタンパク質発現を検出するためのウエスタンブロッティングにより、筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーターの機能性ならびに心筋及び骨格筋に限定された導入遺伝子の発現が確認された。β－サルコグリカンタンパク質の発現は、すべての骨格筋試料及び心臓試料において様々な量で観察され、重要なことに、いずれの非筋組織でも検出されず（図２２ｂ）、β－サルコグリカンが筋特異的タンパク質であることが知られているという事実によって支持された。最後に、ヘマトキシリン＆エオシン染色を、この研究で使用される治療用量のベクターで全身治療された５匹のｓｇｃｂ^－／－マウス及び５匹のＣ５７ＢＬ６ ＷＴマウスから採取された筋組織及びすべてのオフサイト器官の凍結切片に対して行った。次いで、これらの切片は、獣医学の病理学者により毒性について正式に調査され、いずれのマウスからのいずれの試料にも有害作用は検出されなかった。まとめると、これらのデータは、この試験物品が試験動物によって十分に忍容されたことを示している。

比較的低い用量（総用量１ｘ１０^１２ｖｇ、５ｘ１０^１３ｖｇ／ｋｇ）を使用して有害作用を伴わずに体全体のすべての筋肉においてこのような高レベルの形質導入が達成されたという事実は、ＬＧＭＤ２Ｅ患者への変換に大きな期待を与える。臨床的観点から、本明細書に記載の実験で使用される用量は、現在臨床試験中である、ＳＭＡを有する乳児に送達されるＳＭＮ１発現ＡＡＶ療法の全身送達に使用される用量よりもずっと低い（Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４：Ｓ１９０，２０１６）。機能的利益を伴うＭＨＣＫ７プロモーターを用いたβ－サルコグリカン発現の高効率な回復は、臨床的に適用可能な投与レベルで非常に有望であり、ＬＧＭＤ２Ｅ患者のβ－サルコグリカン欠損における心臓障害の高発生率を考慮すると、全身投与はこれらの患者に大きな利益をもたらす。

参考文献：
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ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌｉｍｂ
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Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。
   

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