RS65490B1 - Vektor adeno-asociranog virusa za isporuku β-sarkoglikana i mikrorna-29 i tretman mišićne distrofije - Google Patents

Vektor adeno-asociranog virusa za isporuku β-sarkoglikana i mikrorna-29 i tretman mišićne distrofije

Info

Publication number
RS65490B1
RS65490B1 RS20240504A RSP20240504A RS65490B1 RS 65490 B1 RS65490 B1 RS 65490B1 RS 20240504 A RS20240504 A RS 20240504A RS P20240504 A RSP20240504 A RS P20240504A RS 65490 B1 RS65490 B1 RS 65490B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
muscle
mice
aav
sgcb
aav vector
Prior art date
Application number
RS20240504A
Other languages
English (en)
Inventor
Louise Rodino-Klapac
Jerry R Mendell
Original Assignee
Res Inst Nationwide Childrens Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Res Inst Nationwide Childrens Hospital filed Critical Res Inst Nationwide Childrens Hospital
Publication of RS65490B1 publication Critical patent/RS65490B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PREDMETNOG PRONALASKA
[0001] Ovde su opisani terapijski vektori kao što su AAV vektori koji eksprimiraju βsarkoglikan i njihova upotreba za smanjenje i sprečavanje fibroze kod subjekata koji pate od mišićne distrofije. Opisane su i metode kombinovane genske terapije koje obuhvataju primenu prvog AAV vektora koji eksprimira β-sarkoglikan i drugog AAV vektora koji eksprimira miR-29 za smanjenje i sprečavanje fibroze kod pacijenata koji pate od mišićne distrofije.
POZADINA
[0002] Mišićna distrofija udovi-pojas (LGMD) tipa 2E (LGMD2E) je autosomno recesivni poremećaj koji je rezultat mutacija u genu koji kodira β-sarkoglikan (SGCB), uzrokujući gubitak funkcionalnog proteina.1 LGMD2E predstavlja relativno čest i težak oblik LGMD u Sjedinjenim Državama sa svetskim izveštajima o incidenciji od 1/200.000-1/350.000.(2) Odsustvo β-sarkoglikana dovodi do progresivne distrofije sa hroničnim gubitkom mišićnih vlakana, upalom, zamenom masti i fibrozom, što sve dovodi do pogoršanja mišićne snage i funkcije. (3,4) Kao kompleks, sarkoglikani (α-, β, γ-, δ-), veličine između 35 i 50 kD,(5) su svi transmembranski proteini koji pružaju stabilnost sarkolemi i pružaju zaštitu od mehaničkog stresa tokom mišićne aktivnosti.(3) Gubitak 3-sarkoglikana u LGMD2E obično rezultira različitim stepenima istovremenog gubitka drugih sarkoglikanskih proteina koji doprinose krhkosti mišićne membrane što dovodi do gubitka miofibera.1 Iako se opseg kliničkog fenotipa LGMD2E razlikuje, dijagnoza se obično javlja pre 10. godine života i sa gubitkom ambulacije koja se javlja od sredine do kasnog tinejdžerskog doba.1 ,6,7 Pacijenti imaju povišenu serumsku kreatin kinazu (CK), slabost proksimalnih mišića, teškoće pri podizanju sa poda i progresivni gubitak ambulacije. Srčana zahvaćenost javlja se u čak pedeset odsto slučajeva
[0003] Adeno-asocirani virus (AAV) je parvovirus sa nedostatkom replikacije, čiji je jednolančani DNK genom dužine oko 4,7 kb, uključujući dva 145 nukleotidna invertna terminalna ponavljanja (ITR). Postoji više serotipova AAV. Poznate su nukleotidne sekvence genoma AAV serotipova. Na primer, kompletan genom AAV-1 obezbeđen je u GenBank pristupnom br. NC_002077; kompletan genom AAV-2 obezbeđen je u GenBank pristupnom br. NC_001401 and Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 {1983); kompletan genom AAV-3 obezbeđen je u GenBank pristupnom br. NC_1829; kompletan genom AAV-4 obezbeđen je u GenBank pristupnom br. NC_001829; AAV-5 genom je obezbeđen u GenBank pristupnom br. AF085716; kompletan genom AAV-6 obezbeđen je u GenBank pristupnom br. NC_00 1862; najmanje delovi AAV-7 i AAV-8 genoma su obezbeđeni u GenBank pristupnim br. AX753246 i AX753249, respektivno; AAV -9 genom je obezbeđen u Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); AAV-10 genom je obezbeđen u Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); i AAV-11 genom je obezbeđen u Virology, 330(2): 375-383 (2004). Sekvenca AAV rh.74 genoma je obezbeđena u videti američki patent 9,434,928. Cis-delujuće sekvence koje usmeravaju replikaciju virusne DNK (rep), enkapsidaciju/pakovanje i integraciju ćelijskog hromozoma domaćina sadržane su u AAV ITR. Tri AAV promotera (nazvana p5, p19 i p40 za njihove relativne lokacije na mapi) pokreću ekspresiju dva AAV unutrašnja otvorena okvira za čitanje koji kodiraju rep i cap gene. Dva rep promotera (p5 i p19), zajedno sa diferencijalnim spajanjem pojedinačnog AAV introna (npr. na nukleotidima 2107 i 2227), rezultiraju proizvodnjom četiri rep proteina (rep 78, rep 68, rep 52 i rep 40) iz rep gena. Rep proteini poseduju višestruka enzimska svojstva koja su na kraju odgovorna za replikaciju virusnog genoma. Cap gen je eksprimiran iz promotera p40 i kodira tri kapsidna proteina VP1, VP2 i VP3. Alternativna mesta spajanja i translaciona početna mesta bez konsenzusa odgovorna su za proizvodnju tri povezana kapsidna proteina. Jedinstveno konsenzusno mesto poliadenilacije nalazi se na mapi pozicije 95 AAV genoma. Životni ciklus i genetika AAV su razmatrani u Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).
[0004] AAV poseduje jedinstvene karakteristike koje ga čine privlačnim kao vektor za isporuku strane DNK ćelijama, na primer, u genskoj terapiji. AAV infekcija ćelija u kulturi je necitopatska, a prirodna infekcija ljudi i drugih životinja je tiha i asimptomatska. Štaviše, AAV inficira mnoge ćelije sisara omogućavajući mogućnost ciljanja mnogih različitih tkiva in vivo. Štaviše, AAV transdukuje ćelije koje se polako dele i koje se ne dele, i može da opstane u suštini tokom života tih ćelija kao transkripciono aktivna nuklearna epizoda (ekstrahromozomski element). AAV provirusni genom se ubacuje kao klonirana DNK u plazmide, što čini izgradnju rekombinantnih genoma izvodljivom. Štaviše, pošto su signali koji usmeravaju AAV replikaciju i enkapsidaciju genoma sadržani u ITR AAV genoma, neki ili svi interni približno 4,3 kb genoma (koji kodiraju replikaciju i strukturne kapsidne proteine, rep-cap) mogu se zameniti stranom DNK. Da bi se generisali AAV vektori, proteini rep i cap mogu biti obezbeđeni u trans. Još jedna značajna karakteristika AAV je da je izuzetno stabilan i snažan virus. Lako podnosi uslove koji se koriste za inaktivaciju adenovirusa (56° do 65°C tokom nekoliko sati), što hladnu konzervaciju AAV čini manje kritičnom. AAV može čak biti liofilizovan. Konačno, ćelije zaražene sa AAV nisu otporne na superinfekciju.
[0005] Višestruke studije su pokazale dugoročnu (> 1,5 godina) rekombinantnu ekspresiju proteina posredovanu AAV u mišićima. Videti, Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); i Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). Videti takođe, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) i Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001). Štaviše, pošto je mišić visoko vaskularizovan, rekombinantna transdukcija AAV rezultirala je pojavom transgenskih proizvoda u sistemskoj cirkulaciji nakon intramuskularne injekcije kako je opisano u Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) i Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997).
Štaviše, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002) pokazali su da skeletna miofibra poseduju neophodne ćelijske faktore za ispravnu glikozilaciju, savijanje i sekreciju antitela, ukazujući da je mišić sposoban za stabilnu ekspresiju izlučenih proteinskih terapeuta.
[0006] Novi oblik terapije za LGMD2E je isporuka gena posredovana virusom za obnavljanje proteina divljeg tipa u zahvaćenom mišiću, što rezultira obnavljanjem funkcije mišića. S obzirom na to da podskup pacijenata može razviti kardiomiopatiju, (8, 9, 10, 13) to bi trebalo uzeti u obzir u dugotrajnom tretmanu ovih pacijenata. U prethodnim izveštajima Sgcb-null miš je bio dobro okarakterisan. Araishi et al.3 su razvili miša sa nedostatkom β-sarkoglikana sa pratećim gubitkom svih sarkoglikana, kao i sarkospana, sa najmanje manjim očuvanjem merozina, distroglikana i distrofina, reprodukujući kliničku sliku koja se vidi u LGMD2E. Histološke promene u ovom životinjskom modelu takođe su bile prototip za klinički pandan, uključujući istaknutost fibroze skeletnih mišića.(14) Dressman et al. (25) su injektirali poprečni abdominalni mišić koristeći rAAV2.CMV.SGCB. Ekspresija je trajala 21 mesec i mišićna vlakna su bila zaštićena od rekurentne nekroze. Takođe je opisana upotreba samokomplementarnog AAV za poboljšanje ekspresije transgena, 16 promotera specifičnog za mišiće za bolje ciljanje skeletnih mišića (20, 26) i optimizaciju humanog βsarkoglikanskog gena (hSGCB).
[0007] Funkcionalno poboljšanje kod pacijenata koji pate od LGMD i drugih mišićnih distrofija zahteva obnovu gena i smanjenje fibroze. Postoji potreba za metodama smanjenja fibroze koje se mogu upariti sa metodama restauracije gena za efektivnije tretmane LGMD i drugih mišićnih distrofija.
SAŽETAK
[0008] Ovde su opisani vektori genske terapije, npr. AAV, koji eksprimiraju β-sarkoglikanski gen i metode isporuke β-sarkoglikana u mišić kako bi se smanjila i/ili sprečila fibroza; i/ili za povećanje mišićne sile i/ili za tretman β-sarkoglikanopatije kod subjekta koji boluje od mišićne distrofije.
[0009] Ovde su takođe opisani vektori genske terapije za upotrebu koji isporučuju βsarkoglikan u kombinovanim terapijama i pristupima za rešavanje genskog defekta uočenog u LGMD2E i vektori genske terapije koji isporučuju miR-29 za dalje suzbijanje fibroze.
[0010] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja kodira β-sarkoglikan, pri čemu polinukleotidna sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO.: 1. U nekim otelotvorenjima, polinukleotidna sekvenca koja kodira β-sarkoglikan obuhvata sekvencu npr. najmanje 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnu nukleotidnoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO.: 1 i kodira protein koji zadržava aktivnost β-sarkoglikana. U nekim otelotvorenjima, polinukleotidna sekvenca koja kodira β-sarkoglikan obuhvata nukleotidnu sekvencu navedenu u SEQ ID NO.: 1. U nekim otelotvorenjima, polinukleotidna sekvenca koja kodira β-sarkoglikan sastoji se od nukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO.: 1.
[0011] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja kodira β-sarkoglikan koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO.: 2.
[0012] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža kompoziciju koja se sastoji od rekombinantnog AAV vektora predmetnog pronalaska.
[0013] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža kompoziciju koja se sastoji od rekombinantnog AAV vektora predmetnog pronalaska za upotrebu u smanjenju fibroze kod subjekta kome je to potrebno.
[0014] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža kompoziciju koja se sastoji od rekombinantnog AAV vektora predmetnog pronalaska za upotrebu u tretmanu βsarkoglikanopatije kod subjekta kome je to potrebno.
[0015] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža kompoziciju koja se sastoji rekombinantnog AAV vektora predmetnog pronalaska za tretman mišićne distrofije.
[0016] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža kompoziciju koja se sastoji rekombinantnog AAV vektora predmetnog pronalaska za upotrebu u tretmanu mišićne distrofije, opciono pri čemu je mišićna distrofija mišićna distrofija udovi-pojas (LGMD), i opciono pri čemu je LGMD LGMD2E.
[0017] U drugom otelotvorenju, ovde opisani rekombinantni AAV vektor obuhvata polinukleotidnu sekvencu koja kodira β-sarkoglikan koja ima najmanje 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 2, a protein zadržava aktivnost β-sarkoglikana.
[0018] U drugom otelotvorenju, ovde opisan je rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja kodira funkcionalni β-sarkoglikan koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja se hibridizuje pod strogim uslovima na sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO.: 1, ili njen komplement.
[0014] Termin „strog“ se koristi da se odnosi na uslove koji se u struci obično shvataju kao strogi. Strogost hibridizacije je uglavnom određena temperaturom, jonskom čvrstoćom i koncentracijom denaturacionih agenasa kao što je formamid. Primeri strogih uslova za hibridizaciju i pranje su 0,015 M natrijum hlorida, 0,0015 M natrijum citrata na 65-68°C ili 0,015 M natrijum hlorida, 0,0015M natrijum citrata i 50% formamida na 42°C.
VidetiSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y.1989). Mogu se koristiti i stroži uslovi (kao što su viša temperatura, niža jonska jačina, viši formamid ili drugo sredstvo za denaturiranje), međutim, to će uticati na brzinu hibridizacije. U slučajevima kada je u pitanju hibridizacija deoksioligonukleotida, dodatni primerni strogi uslovi hibridizacije uključuju pranje u 6x SSC 0,05% natrijum pirofosfata na 37°C (za 14-bazne oligose), 48°C (za 17-bazne oligose), 55°C (za 20-bazne oligose) i 60°C (za 23-bazne oligose).
[0020] Drugi agensi mogu biti uključeni u pufere za hibridizaciju i pranje u svrhu smanjenja nespecifične i/ili pozadinske hibridizacije. Primeri su 0,1% albumin goveđeg seruma, 0,1% polivinil-pirolidon, 0,1% natrijum pirofosfat, 0,1% natrijum dodecilsulfat, NaDodSO4, (SDS), fikol, Denhardtov rastvor, sonikovana DNK sperme lososa (ili druga nekomplementarna DNK) i dekstran sulfat, iako se mogu koristiti i druga pogodna sredstva. Koncentracija i vrste ovih aditiva mogu se menjati bez značajnog uticaja na strogost uslova hibridizacije. Eksperimenti hibridizacije se obično izvode na pH 6,8-7,4, međutim, u tipičnim uslovima jonske čvrstoće, brzina hibridizacije je skoro nezavisna od pH. Videti Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch.4, IRL Press Limited (Oxford, England). Uslovi hibridizacije mogu se podesiti od strane jednog stručnjaka kako bi se prilagodile ove varijable i omogućile DNK različite srodnosti sekvenci da formiraju hibride.
[0021] U drugom otelotvorenju, polinukleotidna sekvenca može biti operativno povezana sa kontrolnim elementom specifičnim za mišiće. Na primer, kontrolni element specifičan za mišiće je element gena aktina ljudskog skeleta, element gena srčanog aktina, faktor vezivanja miocitnog specifičnog pojačivača MEF, mišićna kreatin kinaza (MCK), tMCK (skraćeni MCK), teški lanac miozina (MHC), MHCK7 (hibridna verzija MHC i MCK), C5-12 (sintetički promoter), element pojačivača mišje kreatin kinaze, element gena za skeletni brzotrzajni troponin C, element gena za srčani sporotrzajni troponin C, element gena za sporotrzajni troponin I, nuklearni faktori indukovani hipozijom, element indukovan steroidima ili glukokortikoid-responsivni element (GRE).
[0022] U nekim otelotvorenjima, mišićno-specifični promoter je MHCK7 (SEQ ID NO.: 4). Primerni rAAV opisan u ovom dokumentu je pAAV.MHCK7.hSCGB koji obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO.: 3; pri čemu MCHK7 promoter obuhvata nukleotide 130-921, SV40 himerni intron obuhvata nukleotide 931-1078, β-sarkoglikanska sekvenca obuhvata nukleotide 1091-2047, a poli A obuhvata nukleotide 2054-2106.
[0023] U nekim otelotvorenjima, mišićno-specifični promoter je tMCK (SEQ ID NO.: 6). Primerni rAAV opisan u ovom dokumentu je pAAV.tMCK.hSCGB koji se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO.: 5; pri čemu tMCK promoter obuhvata nukleotide 141-854, SV40 himerni intron obuhvata nukleotide 886-1018, β-sarkoglikanska sekvenca obuhvata nukleotide 1058-2014, a poli A obuhvata nukleotide 2021-2073.
[0024] AAV može biti bilo koji serotip, na primer AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8,AAV9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 i AAV rh.74.
Proizvodnja pseudotipiziranog rAAV je obelodanjena u, na primer, WO 01/83692.
Razmatraju se i druge vrste rAAV varijanti, na primer rAAV sa kapsidnim mutacijama.
Videti, na primer, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014).
[0025] Razmatraju se i kompozicije koje se sastoje od bilo kog ovde opisanog rAAV vektora.
[0026] Opisane su i metode proizvodnje rekombinantne AAV vektorske čestice koja se sastoji od kultivacije ćelija koja je transfektovana bilo kojim rekombinantnim AAV vektorom opisanim u ovom dokumentu i oporavka rekombinantnih AAV čestica iz supernatanta transfektovanih ćelija. Razmatraju se i virusne čestice koje se sastoje od bilo kog ovde opisanog rekombinantnog AAV vektora
[0027] Predmetni pronalazak takođe pruža kompozicije predmetnog pronalaska za upotrebu u metodama smanjenja fibroze kod subjekta sisara kome je to potrebno. U tom smislu, metoda se sastoji od primene terapeutski efektivne količine AAV vektora opisanog u ovom dokumentu (ili kompozicije koja se sastoji od AAV vektora opisanog u ovom dokumentu) na subjekte sisare. U nekim otelotvorenjima, subjekt sisar pati od mišićne distrofije. U nekim otelotvorenjima, primena AAV vektora opisanog u ovom dokumentu (ili kompozicije koja se sastoji od AAV vektora opisanog u ovom dokumentu) smanjuje fibrozu u mišićnom tkivu subjekta. Ove metode mogu dalje da obuhvataju korak primene drugog rekombinantnog AAV vektora koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja se sastoji od miR29C.
[0028] Termin „mišićna distrofija“ koji se ovde koristi odnosi se na poremećaj u kojem snaga i mišićna masa postepeno opadaju. Neograničavajući primeri bolesti mišićne distrofije mogu uključivati Beckerovu mišićnu distrofiju, tibijalnu mišićnu distrofiju, Duchenne mišićnu distrofiju, Emery-Dreifuss mišićnu distrofiju, facioscapulohumeral mišićnu distrofiju, sarkoglikanopatije, kongenitalnu mišićnu distrofiju kao što je kongenitalna mišićna distrofija usled delimičnog nedostatka LAMA2, kongenitalnu mišićnu distrofiju sa nedostatkom merosina, tip 1D kongenitalnu mišićnu distrofiju, Fukuyama kongenitalnu mišićnu distrofiju, tip 1A mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2A mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2B mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2C mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2D mišićnu distrofiju udovipojas, tip 2E mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2F mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2G mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2H mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2I mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2I mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2J mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip 2K mišićnu distrofiju udovi-pojas, tip IC mišićnu distrofiju udovi-pojas, rigidnu mišićnua distrofiju kičme sa buloznom epidermolizom simpleks, okulofaringealnu mišićnu distrofiju, Ullrichovu kongenitalnu mišićnu distrofiju i Ullrichovu skleroatoničnu mišićnu distrofiju. U nekim otelotvorenjima, subjekt pati od mišićne distrofije udovi-pojas. U nekim otelotvorenjima, subjekt pati od mišićne distrofije udovi-pojas tipa 2E (LGMD2E).
[0029] Termin „fibroza“ se odnosi na prekomerno ili neregulisano taloženje komponenti ekstracelularnog matriksa (ECM) i abnormalne procese reparacije u tkivima nakon povrede, uključujući skeletne mišiće, srčane mišiće, jetru, pluća, bubrege i pankreas. Komponente ECM koje se deponuju uključuju kolagen, npr. kolagen 1, kolagen 2 ili kolagen 3 i fibronektin.
[0030] Ovde opisana je efektivna količina AAV vektora opisanog ovde (ili kompozicije koja se sastoji od AAV vektora opisanog ovde) za upotrebu u povećanju mišićne sile/mišićne mase kod subjekta sisara.
[0031] U bilo kojoj od ovde opisanih metoda, subjekt može patiti od mišićne distrofije kao što je mišićna distrofija udovi-pojas ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom.
[0032] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije predmetnog pronalaska za upotrebu u metodi tretmana mišićne distrofije kod subjekta sisara koja se sastoji od primene terapeutski efektivne količine AAV vektora opisanog u ovom dokumentu (ili kompozicije koja se sastoji od AAV vektora opisanog u ovom dokumentu) kod subjekta sisara. U nekim otelotvorenjima, mišićna distrofija je mišićna distrofija udovi-pojas. Bilo koja od ovde opisanih metoda može dalje da obuhvata korak primene drugog rekombinantnog AAV vektora koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja se sastoji od miR29C.
[0033] Razmatraju se i kombinovane terapije. U tom smislu, bilo koja od gore opisanih metoda može dalje da obuhvata primenu drugog rekombinantnog AAV vektora koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja se sastoji od miR29C. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid koji sadrži miR29C je operativno povezan sa kontrolnim elementom specifičnim za mišić. Na primer, kontrolni element specifičan za mišiće je element gena aktina ljudskog skeleta, element gena srčanog aktina, faktor vezivanja miocitnog specifičnog pojačivača MEF, mišićna kreatin kinaza (MCK), tMCK (skraćeni MCK), teški lanac miozina (MHC), MHCK7 (hibridna verzija MHC i MCK), C5-12 (sintetički promoter), element pojačivača mišje kreatin kinaze, element gena za skeletni brzotrzajni troponin C, element gena za srčani sporotrzajni troponin C, element gena za sporotrzajni troponin I, nuklearni faktori indukovani hipozijom, element indukovan steroidima ili glukokortikoid-responsivni element (GRE). U nekim otelotvorenjima, drugi rekombinantni vektor se sastoji od polinukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO.: 9 ili SEQ ID NO.: 8, kao što je opisano u američkoj privremenoj primeni br.62/323,163.
[0034] U ovde opisanim metodama kombinovane terapije u kojima se i rAAV vektor koji eksprimira β-sarkoglikan i rAAV vektor koji eksprimira miR29c primenjuju kod subjekta sisara, rAAV vektori se mogu primenjivati istovremeno ili uzastopno sa rAAV vektorom koji eksprimira β-sarkoglikan koji se primenjuje neposredno pre ili posle rAAV koji eksprimira miR29c. Alternativno, AAV vektor koji eksprimira β-sarkoglikan se primenjuje u roku od oko 1-24 sata (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ili 24 sata) nakon primene rAAV koji eksprimira miR-29 ili ovde opisanih metoda, pri čemu se AAV vektor koji eksprimira β-sarkoglikan primenjuje u roku od oko 1-24 sata (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ili 24 sata) pre primene rAAV koji eksprimira miR-29. U nekim otelotvorenjima, AAV vektor koji eksprimira β-sarkoglikan se primenjuje u roku od oko 1-5 sati (npr.1, 2, 3, 4 ili 5 sati) nakon primene rAAV koji eksprimira miR-29 ili se sprovode ovde opisane metode pri čemu se AAV vektor koji eksprimira β-sarkoglikan primenjuje u roku od oko 1-5 sati (npr.1, 2, 3, 4 ili 5 sati) pre primene rAAV koji eksprimira miR-29c.
[0035] U bilo kojoj od ovde opisanih metoda, rAAV se primenjuje intramuskularnom injekcijom ili intravenskom injekcijom. Pored toga, u bilo kojoj od ovde opisanih metoda, rAAV se primenjuje sistemski, kao što je parentalna primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom.
[0036] Kompozicija predmetnog pronalaska može se formulisati za intramuskularnu injekciju ili intravensku injekciju. Pored toga, kompozicije predmetnog pronalaska su formulisane za sistemsku primenu, kao što je parentalna primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom.
[0037] Pored toga, bilo koja od kompozicija formulisanih za primenu na subjektu koji pati od mišićne distrofije (kao što je mišićna distrofija udovi-pojas ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom). U nekim otelotvorenjima, kompozicija može dalje da sadrži drugi rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO.: 9 ili SEQ ID NO.: 8.
[0038] U bilo kojoj od ovde opisanih upotreba, lek je formulisan za intramuskularnu injekciju ili intravensku injekciju. Pored toga, u bilo kojoj od ovde opisanih upotreba, lek je formulisan za sistemsku primenu, kao što je parentlana primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom. Pored toga, bilo koji od lekova može biti pripremljen za primenu kod subjekta koji pati od mišićne distrofije (kao što je mišićna distrofija udovi-pojas ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom). U nekim otelotvorenjima, lek može dalje da sadrži drugi rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO.: 9 ili SEQ ID NO.: 8.
KRATAK OPIS SLIKA
[0039]
Slike 1A-1D pokazuju da eksprmovanje β-sarkoglikana posredovano AAV obnavlja proteine povezane sa distrofinom i štiti integritet membrane. (a) Samokomplementarni AAV vektor koji sadrži kodon-optimizovani humani β-sarkoglikanski gen (hSGCB) vođen mišićnospecifičnim tMCK promoterom. Kaseta takođe sadrži himerni intron za povećanje obrade i signal poliadenilacije za stabilnost. (b) Imunofluorescentno bojenje anti-β-SG antitelima pokazuje visok nivo sarkolemmalnog bojenja SGCB transgena kod 5 nedelja starih miševa, 6 i 12 nedelja nakon injekcije, prikazane slike × 20. Procenat vlakana koja eksprimiraju betasarkoglikan po TA mišiću u proseku je iznosio 88,4±4,2% nakon 6 nedelja (n=9, 4 mužjaka, 5 ženski) i 76,5±5,8% nakon 12 nedelja (n=6, 4 mužjaka, 2 ženke). Ekspresija proteina potvrđena u Western blotu sa gama-tubulin blotom prikazanim za kontrolu punjenja. (c) AAV isporuka β-sarkoglikana dovodi do obnove drugih članova sarkoglikanskog kompleksa; αsarkoglikan, distrofin, × 20 slika. (d) scAAVrh.74.hSGCB štiti sgcb-/- membrane od oštećenja. Slika prikazuje veliku površinu Evans plavo-pozitivnih vlakana (crvenih) nasuprot klasteru β-sarkoglikan-pozitivnih vlakana koja su zaštićena od ugradnje Evans plave boje, prikazana je slika × 40.
Na slikama 2a-2d prikazana je histološka analiza β-SG deficitarno tretiranog skeletnog mišića. scAAVrh.74.hSGCB tretman normalizuje histološke parametre sgcb<-/->miševa.
Bojenje hematoksilinom i eozinom i Picrosirius crveno bojenje izvršeno je na TA mišiću sgcb-</->miševa zajedno sa normalnom kontrolnom grupom C57/BL6 miševa i scAAVrh.74.hSGCB tretiranih miševa, nakon čega je usledila kvantifikacija histoloških parametara i % bojenja kolagena. (a) H&E bojenje pokazuje prisustvo vlakana sa centralnim jezgrom, inflamatornih ćelija i distribucije velikog prečnika vlakana u mišićima sa nedostatkom β-SG i poboljšanje histopatologije nakon transfera gena. (b) Pircrosirius crveno bojenje pokazuje smanjenje crvenog bojenja kolagena u tretiranom mišiću. (c) Kvantifikacija vlakana sa centralnim jezgrom pokazuje smanjenje nakon tretmana (P<0,0005, jednosmerna ANOVA) i (d) prikaz distribucije veličine vlakana i povećanje prosečne veličine vlakana TA mišića C57/BL6 kontrolnih grupa i sgcb<-/->miševa u poređenju sa tretiranim miševima (P<0,0001, jednosmerna ANOVA). (e) Kvantifikacija % kolagena u TA mišiću C57/BL6 kontrolnih grupa i sgcb<-/->miševa u poređenju sa sgcb<-/->tretiranim miševima (P<0,0001, jednosmerna ANOVA). Skala od 100 µm prikazana za × 20 slika. ***P<0,001;
****P<0,0001.
Na slikama 3A-3C vidi se da scAAVrh.74.hSGCB intramuskularna isporuka koriguje tetaničnu silu i otpornost na povredu izazvanu kontrakcijom. TA mišić sgcb<-/->miševa tretiranih sa 3 x 10<10>vg scAAVrh.74.hSGCB putem IM injekcije sakupljen je 6 nedelja nakon transfera gena i podvrgnut protokolu za procenu tetanične sile i protokolu ekscentrične kontrakcije za procenu otpornosti na povredu izazvanu kontrakcijom. (a) AAVrh.74.hSGCB tretirani TA pokazali su značajno poboljšanje i apsolutne tetanične sile (P<0,01, upareni ttest) i (b) normalizovane specifične sile (P<0,05, upareni t-test), što se nije razlikovalo od sile divljeg tipa (C57BL6). (c) AAVrh.74.hSGCB tretirani TA pokazali su značajno poboljšanje otpornosti na povredu izazvanu kontrakcijom u poređenju sa netretiranim sgcb<-/->kontrolnim grupama (P<0,01, dvosmerna ANOVA). Prikazano je zadržavanje sile nakon 10 kontrakcija. *P<0,05; **P<0,01.
Na slikama 4A-4C prikazani su rezultati analize ostarelih miševa tretiranih intramuskularno sa scAAVrh.74.tMCK.hSGCB. (a) Imunofluorescentno bojenje TA mišića kod 6-mesečnih tretiranih sgcb<-/->miševa 12 nedelja nakon injekcije (n=5, 5 mužjaka) pokazuje sarkolemalnu ekspresiju SGCB transgena na nivoima u proseku 80% kod injektiranih miševa u poređenju sa netretiranim (n=4, 4 mužjaka), (b) Pikrosirius crveno bojenje tretiranog i netretiranog TA mišića. (c) Kvantitacija kolagena prisutnog u Picrosirius crveno obojenom tkivu pokazuje značajno smanjenje količine kolagena nakon tretmana sa rAVrh.74.tMCK.hSGCB (P<0,0001, jednosmerna ANOVA). Skala od 100 µm prikazana za × 20 slika. ****P<0,0001.
Na slikama 5A-5C prikazani su rezultati vaskularne isporuke scAAVrh.74.hSGCB. Četiri (n=5, 5 mužjaka) i pet (n=4, 2 mužjaka, 2 ženke) nedelja stari miševi sa nedostatkom β-SG tretirani su vektorom preko femoralne arterije kako bi se vektor isporučio u mišiće donjih udova. Pri dozi od 5 x 10<11>vg, ekspresija β-SG bila je 90,6±2,8% u TA i 91,8±4,7% u GAS tretiranih miševa, praćena poboljšanjima histopatologije koja su rezultirala značajnim poboljšanjem specifične sile u poređenju sa netretiranim životinjama čak i nakon paradigme povrede, (a) ekspresija β-SG proteina od tri reprezentativna miša. Mišić iz β-SG KO netretiranog miša prikazan je za poređenje u umetku (dole desno), prikazano je × 20 slika. Ekspresija u tretiranim mišićima potvrđena putem Western blot testa i gama-tubulina prikazana je kao kontrola punjenja. (b) Histopatologija se značajno poboljšava nakon tretmana visokim dozama. Gornji paneli-tretirani TA i gastroknemius mišići. Donji panelinetretirani kontrolni mišić sa nedostatkom β-SG. Skala od 100 µm prikazana za × 20 slika. (c) Procenat specifične sile zadržane u EDL mišiću nakon 10 ciklusa povrede izazvane ekscentričnom kontrakcijom. Tretman sa 5 x 10<11>vg AAVrh.74.hSGCB doveo je do značajnog poboljšanja snage koja je bila ekvivalentna WT (normalnom) kontrolnom mišiću (P<0,05, jednosmerna ANOVA). *P<0,05.
Slike 6A-6B pokazuju smanjenje fibroze kod ILP tretiranih β-SG KO miševa. (a) Picrosirius crveno bojenje pokazuje smanjenu fibrozu kod tretiranih miševa što je pokazano smanjenjem taloženja kolagena u poređenju sa netretiranim sgc<-/->miševima. (b) Kvantifikacija nivoa kolagena u TA i GAS mišićima iz BL6 WT, netretiranih sgcb<-/->miševa i tretiranih miševa potvrđuje smanjenje nivoa kolagena kod tretiranih miševa (P<0,001, jednosmerna ANOVA). Skala od 100 µm prikazana za × 20 slika. ***P<0,001.
Na slikama 7A i 7B prikazana je biodistribucija vektora i ekspresija proteina. (a) Histogram prosečne distribucije vektora u tkivima sakupljenim od miševa tretiranih sa ILP dat je u kopijama transkripta po mikrogramu DNK dodatog u qPCR. Levi ud je tretiran. (b) U ciljnim organima nije uočena ekspresija proteina putem Western blot testa.
Slika 8A-D daje histološke i funkcionalne deficite kod sgcb<-/->miševa starosti od 7 meseci. Bojenje trihomom u dijafragmi (A) i srcu (C) SGCB<-/->miševa pokazuje ekstenzivnu fibrozu (crveno). Izlazna sila iz dijafragme je značajno smanjena u dijafragmi (B), a ejekciona frakcija srca je takođe smanjena kod sgcb<-/->miševa (D).
Na slici 9 prikazan je šematski prikaz terapijske kasete β-sarkoglikan transgena.
Samokomplementarni AAV vektor koji sadrži kodon-optimizovani humani β-sarkoglikanski gen (hSGCB). Promoter MHCK7 specifičan za mišiće pokreće ekspresiju. Kaseta takođe sadrži himerni intron za povećanje obrade i poliadenilacioni signal za stabilnost.
Slika 10 prikazuje imunofluorescentno bojenje za β-sarkoglikan u različitim skeletnim mišićima pokazuje robusnu ekspresiju sa retkim negativnim vlaknima nakon 1, 4 ili 6 meseci tretmana (prikazan je 1 mesec).
Slika 11 prikazuje imunofluorescentno bojenje za β-sarkoglikan u dijafragmi i srcu pokazuje robusnu ekspresiju sa retkim negativnim vlaknima nakon 1, 4 ili 6 meseci tretmana (prikazan je 1 mesec).
Slika 12A-D prikazuje restauraciju ekspresije SGCB nakon intravenske isporuke scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB. (A) scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB kaseta. (b) Imunofluorescentno snimanje 6 meseci nakon injekcije skeletnih mišića, dijafragme i srca sgcb<-/->miševa intravenski injektiranih sa 1e12 vg ukupne doze scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB. Reprezentativne slike skeletnih mišića sa prosečnom transdukcijom 98,13 ± 0,31%. Prikazano je 20X slika. Reprezentativne slike srčanog tkiva koje pokazuju visok nivo ekspresije hSGCB transgena. Prikazano je 10X slika. (c) Western blot test svih mišića jednog tretiranog sgcb<-/->miša koji potvrđuje ekspresiju transgena hSGCB. (d) Western blot test za ekspresiju hSGCB u srcima petsgcb<-/->tretiranih miševa sa kvantifikacijom denzitometrije koja pokazuje prekomernu ekspresiju hSGCB do 72,0% nivoa BL6 WT.
Slika 13A-D prikazuje efekat sistemskog tretmana sa scAAVrh74.MHCK7.hSGCB na patologiji mišića, (a) H&E bojenje dijafragme i QUAD mišića C57BL/6 WT, sgcb<-/->i scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB tretirani miševi koji pokazuju normalizovanu histopatologiju. (b) Kvantifikacija smanjenja vlakana sa centralnim jezgrom u sgcsgcb<-/->tretiranim mišićima u poređenju sa netretiranimsgcb<-/->mišićima (TA, GAS, glut, dijafragma, p<0,0001) (QUAD, PSOAS, TRI, p<0,05). (c) Normalizacija distribucije vlakana u GAS, PSOAS i TRI, i (d) povećanje prosečne veličine vlakana u tretiranim mišićima u poređenju sa netretiranim sgcb-/-mišićima (p<0,001) (jednosmerna ANOVA) (n=5 po grupi).
Slika 14A i 14B prikazuju smanjeno taloženje kolagena kod intravenski tretiranih β-SG KO miševa. (a) Picrosirius crveno bojenje pokazalo je smanjenu fibrozu kod tretiranih miševa, što je pokazano smanjenjem taloženja kolagenau poređenju sa netretiranim sgcb<-/->miševima u dijafragmi i GAS. (b) Kvantifikacija nivoa kolagena u dijafragmi i GAS mišićima kod C57BL/6 WT miševa (n=4), netretiranih sgcb<-/->miševa (n=4) i tretiranih sgcb<-/->miševa (n=5) potvrđuju smanjenje nivoa kolagena u oba tretirana mišića (p<0,0001, JEDNOSMERNA ANOVA). Skala od 100 µm prikazana je za 20X slike.
Na slici 15 prikazana je isporuka scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB putem repne vene sgcb-/-miševa potpuno vraća silu u dijafragmu, nakon 6 meseci tretmana (intravenska primena (1e12vg)). Mišićne trake dijafragme su sakupljene od tretiranih i kontrolnih SGCB<-/->miševa i WT miševa i podvrgnute merenju sile, tretman je vratio silu na nivoe WT.
Slika 16 prikazuje šemu rAAV vektora scAACrh.74.CMV.miR29c i nukleotidna sekvenca miR-29c u prirodnoj okosnici miR-30.
Slika 17 pokazuje tretman sa AAVrh.74 nakon 3 meseca.CMV.miR29C, TA mišići su sakupljeni od tretiranih i kontrolnih SGCB<-/->miševa i WT miševa i analizirani na fibrozu (nivo kolagena) (n=5 po grupi). Korišćenjem sirius crvenog bojenja i kvantifikacije, nivo kolagena je smanjen nakon tretmana (videti sliku 18). Rezultati su pokazali da su nivoi transkripta Col1A, Col3A i Fbn normalizovani i da je veličina mišićnih vlakana povećana.
Slika 18 prikazuje reprezentativne slike skeniranih punih preseka netretiranih i AAVrh.74.CMV.miR29C je tretirao mišiće tibialis anterior obojene Sirius crvenim bojama koje sadrže kolagen 1 i 3. Kvantifikacija je prikazana na slici 17
Slika 19A i 19B pokazuju korekciju kifoskolioze u torakalnoj kičmi. (a) Kifoskolioza kod sgcb<-/->miševa što je dokazano rentgenskom radiografijom. (b) Rezultat Kifotičkog indeksa (KI) sgcb<-/->miševa (3,69) je nizak u poređenju sa C57BL/6 WT (6,01) (p<0,01), ali se povećava nakon tretmana sa scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB (5,39) (p<0.,05 u poređenju sa sgcb<-/>-) (jednosmerna ANOVA) (n=6 po grupi).
Slika 20A-D prikazuje procenu kardiomiopatije u srčanom mišiću. (a) H&E i picrosirius crveno bojenje 7 meseci starih BL6 WT, sgcb<-/->i AAV.MHCK7.hSGCB tretiranih sgcb<-/->srca 6 meseci nakon tretmana što ukazuju na degeneraciju miokarda netretiranogsgcb<-/->mišića i poboljšanje nakon tretmana. (b) MR analiza srca pokazuje smanjenje udarnog volumena sgcb<-/->srca (p<0,01), minutni volumen srca i ejekcionua frakciju (p<0,05) (JEDNOSMERNA ANOVA) i poboljšanja 6 meseci nakon tretmana (n= 6 po grupi). (c) Western blot test dva C57BL/6 WT srca, dva sgcb<-/->srca i pet AAV.MHC7.hSGCB tretiranih sgcb<-/->srca prikazuju smanjene nivoe srčanog troponina I kod obolelih miševa. (d) Kvantifikacija denzitometrije pokazuje smanjenje srčanog troponina I (cTrpI) na 60,3% nivoa BL6 WT i prekomernu ekspresiju do 135,8% nivoa BL6 WT.
Slika 21A-B pokazuje korekciju funkcije dijafragme i povećanu aktivnost kaveza na otvorenom terenu. (a) Sakupljene su trake mišića dijafragme da bi se izmerila snaga i otpornost na zamor kod BL6 WT miševa (n=5), sgcb<-/->miševa (n=4) i AAV.MHCK7.hSGCB tretiranih sgcb<-/->miševa (n=5) u starosti od 7 meseci. Šestomesečni tretman je vratilo silu na nivo WT (p<0,01 u poređenju sa sgcb<-/->) i poboljšao otpornost na zamor, (b) Ukupna ambulacija u x i y ravni je značajno smanjena kod sgcb<-/->miševa (p<0,0001) i neznatno poboljšana kod miševa tretiranih sa MCHK7 (p<0,05). Vertikalna aktivnost podizanja na zadnje udove takođe se smanjila kod sgcb<-/->miševa (p<0,01) i značajno povećala kod miševa tretiranih MCHK7 (p<0,05) (JEDNOSMERNA ANOVA) (n=6 po grupi).
Slika 22A-B prikazuje analizu biodistribucije i ekspresije transgena van cilja za sistemski scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB isporuka. (a) Distribucioni histogram prosečnih vg kopija transkripta po mikrogramu DNK dodat u qPCR reakciju u različitim tkivima od dva sgcb<-/->miša nakon IV isporuke scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB u ukupnoj dozi od 1e12 vg. (b) Western blot testovi biodistribucije na mišićima i organima iz scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB sistemski injektirani sgcb<-/->miševi koji ne ukazuju na ekspresiju hSGCB transgena u uzorcima koji nisu mišićnog porekla.
DETALJAN OPIS
[0040] Ovo obelodanjivanje se zasniva na otkriću da primena AAV vektora koji se sastoji od polinukleotida koji eksprimira β-sarkoglikan rezultira smanjenjem ili potpunim preokretom mišićne fibroze u životinjskom modelu mišićne distrofije udovi-pojas. Kao što je prikazano u primerima, primena AAV vektora opisanog u ovom dokumentu rezultirala je preokretom distrofičnih karakteristika, uključujući manje degenerativnih vlakana, smanjenu upalu i poboljšani funkcionalni oporavak zaštitom od ekscentrične kontrakcije sa povećanim generisanjem sile.
[0041] Kao što se ovde koristi, termin „AAV“ je standardna skraćenica za adeno-asocirani virus. Adeno-asocirani virus je jednolančani DNK parvovirus koji raste samo u ćelijama u kojima određene funkcije pruža pomoćni virus. Trenutno postoji trinaest serotipova AAV koji su okarakterisani. Opšte informacije i pregledi AAV mogu se naći u, na primer, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol.1, pp.169-228, i Berns, 1990, Virology, pp.1743-1764, Raven Press, (New York). Međutim, u potpunosti se očekuje da će ovi isti principi biti primenljivi na dodatne AAV serotipove jer je dobro poznato da su različiti serotipovi prilično blisko povezani, kako strukturno tako i funkcionalno, čak i na genetskom nivou. (Videti, na primer, Blacklowe, 1988, pp.165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; i Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Na primer, svi AAV serotipovi očigledno pokazuju veoma slične replikacione osobine posredovane homolognim rep genima; i svi nose tri srodna kapsidna proteina kao što su oni eksprimirani u AAV2. Stepen srodnosti dalje se sugeriše heterodupleks analizom koja otkriva opsežnu unakrsnu hibridizaciju između serotipova duž dužine genoma; i prisustvo analognih samokalećih segmenata na krajevima koji odgovaraju „invertnim terminalnim ponavljajućim sekvencama“ (ITR). Slični obrasci infektivnosti takođe sugerišu da su funkcije replikacije u svakom serotipu pod sličnom regulatornom kontrolom.
[0042] „AAV vektor“ kao što se ovde koristi odnosi se na vektor koji se sastoji od jednog ili više polinukleotida od interesa (ili transgena) koji su okruženi AAV terminalnim ponavljajućim sekvencama (ITR). Takvi AAV vektori se mogu replicirati i upakovati u zarazne virusne čestice kada su prisutni u ćeliji domaćinu koja je transfektovana vektorom koji kodira i eksprimira rep i cap genske proizvode.
[0043] „AAV virion“ ili „AAV virusna čestica“ ili „AAV vektorska čestica“ odnosi se na virusnu česticu koja se sastoji od najmanje jednog AAV kapsidnog proteina i inkapsidiranog polinukleotidnog AAV vektora. Ako čestica sadrži heterologni polinukleotid (tj. polinukleotid koji nije divlji tip AAV genoma kao što je transgen koji se isporučuje u ćeliju sisara), obično se naziva „AAV vektorska čestica“ ili jednostavno „AAV vektor“. Dakle, proizvodnja AAV vektorske čestice nužno uključuje proizvodnju AAV vektora, jer je takav vektor sadržan u AAV vektorskoj čestici.
AAV
[0044] Rekombinantni AAV genomi obuhvataju molekul nukleinske kiseline kako je definisano u predmetnom pronalasku i jedan ili više AAV ITR koji okružuju molekul nukleinske kiseline. AAV DNK u genomima rAAV može biti iz bilo kog AAV serotipa za koji se može izvesti rekombinantni virus, uključujući, ali ne ograničavajući se na, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 i AAV rh.74. Proizvodnja pseudotipiziranog rAAV je obelodanjena u, na primer, WO 01/83692. Razmatraju se i druge vrste rAAV varijanti, na primer rAAV sa kapsidnim mutacijama. Videti, na primer, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). Kao što je navedeno u odeljku Pozadina iznad, nukleotidne sekvence genoma različitih AAV serotipova su poznate u struci. Da bi se promovisala ekspresija specifična za skeletne mišiće, mogu se koristiti AAV1, AAV5, AAV6, AAV8 ili AAV9.
[0045] Ovde opisani DNK plazmidi sadrže rAAV genome. DNK plazmidi se transferuju u ćelije dozvoljene za infekciju pomoćnim virusom AAV (npr. adenovirusom, adenovirusom E1 ili herpes virusom) za sklapanje rAAV genoma u zarazne virusne čestice. Tehnike za proizvodnju rAAV čestica, u kojima se AAV genom koji se pakuje, rep i cap geni, i funkcije pomoćnog virusa pružaju ćeliji su standardne u struci. Proizvodnja rAAV zahteva da su sledeće komponente prisutne unutar jedne ćelije (ovde označene kao ćelija za pakovanje): rAAV genom, AAV rep i cap geni odvojeni od (tj. ne u) rAAV genoma i funkcije pomoćnog virusa. AAV rep i cap geni mogu biti iz bilo kog AAV serotipa za koji se rekombinantni virus može izvesti i mogu biti iz drugačijeg AAV serotipa od rAAV genoma ITR, uključujući, ali ne ograničavajući se na, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 i AAV rh.74. Proizvodnja pseudotipiziranog rAAV je obelodanjena u, na primer, WO 01/83692.
[0046] Metoda generisanja ćelije za pakovanje je stvaranje ćelijske linije koja stabilno eksprimira sve neophodne komponente za proizvodnju AAV čestica. Na primer, plazmid (ili višestruki plazmidi) koji se sastoji od rAAV genoma bez AAV rep i cap gena, AAV rep i cap gena odvojenih od rAAV genoma, i selektabilnog markera, kao što je gen otpornosti na neomicin, integrisani su u genom ćelije. AAV genomi su uvedeni u bakterijske plazmide procedurama kao što su GC repovi (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), dodavanje sintetičkih linkera koji sadrže restrikciona mesta za cepanje endonukleaze (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65 -73) ili direktnom, tupom ligacijom (Senapathy& Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259: 4661-4666). Linija ćelija za pakovanje se zatim inficira pomoćnim virusom kao što je adenovirus. Prednosti ove metode su da se ćelije mogu izabrati i pogodne su za proizvodnju rAAV velikih razmera. Drugi primeri pogodnih metoda koriste adenovirus ili baculovirus umesto plazmida za uvođenje rAAV genoma i/ili rep i cap gena u ćelije za pakovanje.
[0047] Opšti principi proizvodnje rAAV razmatraju se u, na primer, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; i Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Različiti pristupi su opisani u Ratschin et al., Mol. Cell. Biol.4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol.5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); i Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); američki patent br.5,173,414; WO 95/13365 i odgovarajući američki patent br.5,658.776 ; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; američki patent br.5,786,211; američki patent br.5,871,982; i američki patent br.6,258,595.
[0048] Ovde su opisane ćelije za pakovanje koje proizvode infektivni rAAV. Ćelije za pakovanje mogu biti stabilno transformisane ćelije raka kao što su HeLa ćelije, 293 ćelije i PerC.6 ćelije (srodna linija 293). Ćelije za pakovanje mogu biti ćelije koje nisu transformisane ćelije raka, kao što su ćelije niske prolaznosti 293 (ćelije humanog fetalnog bubrega transformisane sa E1 adenovirusa), MRC-5 ćelije (humani fetalni fibroblasti), WI-38 ćelije (humani fetalni fibroblasti), Vero ćelije (ćelije bubrega majmuna) i FRhL-2 ćelije (rezus fetalne ćelije pluća)
[0049] Rekombinantni AAV (tj., infektivne inkapsulirane rAAV čestice) predmetnog pronalaska obuhvata rAAV genom. Otelotvorenja uključuju, ali nisu ograničena na, rAAV nazvan pAAV.MHCK7.hSCGB koji se sastoji od polinukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO.: 3; i pAAV.tMCK.hSCGB koji se sastoji od polinukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO.: 5.
[0050] RAAV se može prečišćavati metodama koje su standardne u struci, kao što su kolonska hromatografija ili gradijenti cezijum hlorida. Metode za prečišćavanje rAAV vektora iz pomoćnog virusa poznate su u struci i uključuju metode otkrivene u, na primer, Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69427-443 (2002); američki patent br.6,566,118 i WO 98/09657.
[0051] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak razmatra kompozicije koje sadrže rAAV ovog predmetnog pronalaska. Ovde opisane kompozicije sadrže rAAV u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Kompozicije mogu da sadrže i druge sastojke kao što su razblaživači i adjuvansi. Prihvatljivi nosači, razblaživači i adjuvansi nisu toksični za primaoce i poželjno su inertni u primenjenim dozama i koncentracijama, a uključuju pufere kao što su fosfat, citrat ili druge organske kiseline; antioksidante kao što su askorbinska kiselina; polipeptide niske molekulske mase; proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; sredstva za heliranje kao što je EDTA; šećerne alkohole kao što su manitol ili sorbitol; protuterione soli kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante kao što su Tween, pluronika ili polietilen glikol (PEG).
[0052] Titri rAAV koji će se primenjivati u metodama će varirati u zavisnosti, na primer, od određenog rAAV, načina primene, cilja tretmana, pojedinca i tipa ćelije koji se cilja, i mogu se odrediti metodama standardnim u struci. Titri rAAV mogu biti u rasponu od oko 1x10<6>, oko 1×10<7>, oko 1×10<8>, oko 1×10<9>, oko 1×10,<10>, oko 1×10<11>, oko 1×10<12>, oko 1x10<13>do oko 1 ×10<14>ili više čestica otpornih na DNazu (DRP) po ml. Doze se takođe mogu izraziti u jedinicama virusnih genoma (vg).
[0053] Razmatraju se metode transdukcije ciljne ćelije sa rAAV, u in vivo ili in vitro. Metode in vivo obuhvataju korak primene efektivne doze, ili efektivne višestruke doze, kompozicije koja se sastoji od rAAV predmetnog pronalaska na životinju (uključujući i ljudsko biće) kojoj je to potrebno. Ako se doza daje pre razvoja poremećaja/bolesti, primena je profilaktička. Ako se doza daje nakon razvoja poremećaja/bolesti, primena je terapeutska. U otelotvorenjima predmetnog pronalaska, efektivna doza je doza koja ublažava (eliminiše ili smanjuje) najmanje jedan simptom povezan sa poremećajem/stanjem bolesti koja se tretira, koja usporava ili sprečava napredovanje u poremećaj/stanje bolesti, koja usporava ili sprečava napredovanje poremećaja/stanja bolesti, koja smanjuje obim bolesti, koja rezultira remisijom (delimičnom ili potpunom) bolesti i/ili koja produžava preživljavanje. Primer bolesti koja se razmatra za prevenciju ili tretman ovde opisanim metodama je mišićna distrofija, kao što je mišićna distrofija udovi-pojas.
[0054] Razmatraju se i kombinovane terapije. Kombinacija koja se ovde koristi uključuje i istovremeni tretman i sekvencijalne tretmane. Posebno se razmatraju kombinacije ovde opisanih metoda sa standardnim medicinskim tretmanima (npr. kortikosteroidi), kao i kombinacije sa novim terapijama.
[0055] Terapijski efektivna količina rAAV vektora je doza rAAV u rasponu od oko 1e13 vg/kg do oko 5e14 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 2e13 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 3e13 vg /kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 4e13 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 5e13 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 6e13 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 7e13 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 8e13 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 9e13 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 1e14 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 2e14 vg/kg, ili oko 1e13 vg/kg do oko 3e14 vg/kg, ili oko 1e13 do oko 4e14 vg/kg, ili oko 3e13 vg/kg do oko 4e13 vg/kg, ili oko 3e13 vg/kg do oko 5e13 vg/kg, ili oko 3e13 vg/kg do oko 6e13 vg/kg, ili oko 3e13 vg/kg do oko 7e13 vg/kg, ili oko 3e13 vg/kg do oko 8e13 vg/kg, ili oko 3e13 vg/ kg do oko 9e13 vg/kg, ili oko 3e13 vg/kg do oko 1e14 vg/kg, ili oko 3e13 vg/kg do oko 2e14 vg/kg, ili 3e13 vg/kg do oko 3e14 vg/kg, ili oko 3e13 do oko 4e14 vg/kg, ili oko 3e13 vg/kg do oko 5e14 vg/kg, ili oko 5e13 vg/kg do oko 6e13 vg/kg, ili oko 5e13 vg/kg do oko 7e13 vg/kg, ili oko 5e13 vg/ kg do oko 8e13 vg/kg, ili oko 5e13 vg/kg do oko 9e13 vg/kg, ili oko 5e13 vg/kg do oko 1e14 vg/kg, ili oko 5e13 vg/kg do oko 2e14 vg/kg, ili 5e13 vg/kg do oko 3e14 vg/kg, ili oko 5e13 do oko 4e14 vg/kg, ili oko 5e13 vg/kg do oko 5e14 vg/kg, ili oko 1e14 vg/kg do oko 2e14 vg/kg, ili 1e14 vg/kg do oko 3e14 vg/kg, ili oko 1e14 do oko 4e14 vg/kg, ili oko 1e14 vg/kg do oko 5e14 vg/kg. Predmetni pronalazak takođe obuhvata kompozicija koje se sastoje od ovih opsega rAAV vektora.
[0056] Na primer, terapijski efektivna količina rAAV vektora je doza od 1e13 vg/kg, oko 2e13 vg/kg, oko 3e13 vg/kg, oko 4e13 vg/kg, oko 5e13 vg/kg, oko 6e13 vg/kg, oko 7e13 vg/kg, oko 8e13 vg/kg, oko 9e13 vg/kg, oko 1e14 vg/kg, oko 2e14 vg/kg, oko 3e14 vg/kg, oko 4e14 vg/kg i 5e14 vg/kg. Predmetni pronalazak se takođe sastoji od kompozicija koje se sastoje od ovih doza rAAV vektora.
[0057] Primena efektivne doze kompozicija može biti putem standardnih ruta u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, intramuskularne, parenteralne, intravenske, oralne, bukalne, nazalne, plućne, intrakranijalne, intraosne, intraokularne, rektalne ili vaginalne. Rute primene i serotip(i) AAV komponenti rAAV (posebno, AAV ITR i kapsidni protein) predmetnog pronalaska mogu biti izabrani i/ili podudarni od strane stručnjaka uzimajući u obzir infekciju i/ili stanje bolesti koja se tretira i ciljne ćelije/tkiva koje treba da eksprimiraju β-sarkoglikan.
[0058] Efektivna doza rAAV i kompozicija predmetnog pronalaska može se primeniti, na primer, lokalnom primenom ili sistemskom primenom. Na primer, sistemska primena je aprimena u cirkulacioni sistem tako da je pogođeno celo telo. Sistemska primena uključuje enteralnu primenu kao što je apsorpcija kroz gastrointestinalni trakt i parenteralnu primenu kroz injekciju, infuziju ili implantaciju.
[0059] Konkretno, stvarna primena rAAV ovog predmetnog pronalaska može se postići korišćenjem bilo koje fizičke metode koja će transportovati rAAV rekombinantni vektor u ciljno tkivo životinje. Primena prema predmetnom pronalasku uključuje, ali nije ograničena na, injektiranje u mišić, krvotok i/ili direktno u jetru. Jednostavno resuspendovanje rAAV u fosfatnom puferiranom fiziološkom rastvoru je dokazano dovoljno da obezbedi sredstvo korisno za ekspresiju mišićnog tkiva, i ne postoje poznata ograničenja za nosače ili druge komponente koje se mogu primeniti istovremeno sa rAAV (mada kompozicije koje razgrađuju DNK treba izbegavati na normalan način sa rAAV). Kapsidni proteini rAAV mogu biti modifikovani tako da je rAAV usmeren na određeno ciljano tkivo od interesa, kao što je mišić. Videti, na primer, WO 02/053703. Farmaceutske kompozicije se mogu pripremiti kao injekcione formulacije ili kao topikalne formulacije koje se isporučuju mišićima transdermalnim transportom. Brojne formulacije za intramuskularno injektiranje i transdermalni transport su prethodno razvijene i mogu se koristiti u praksi predmetnog pronalaska. rAAV se može koristiti sa bilo kojim farmaceutski prihvatljivim nosačem radi lakše primene i rukovanja.
[0060] Za potrebe intramuskularnog injektiranja mogu se koristiti rastvori u adjuvantu kao što je susamovo ili kikirikijevo ulje ili u vodenom propilen glikolu, kao i sterilni vodeni rastvori. Takvi vodeni rastvori mogu biti puferovani, po želji, a tečni razblaživač se prvo može učiniti izotoničnim sa fiziološkim rastvorom ili glukozom. Rastvori rAAV kao slobodne kiseline (DNK sadrži kisele fosfatne grupe) ili farmakološki prihvatljive soli mogu se pripremiti u vodi koja je odgovarajuće pomešana sa surfaktantom kao što je hidrokspropilceluloza.
Disperzija rAAV se takođe može pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama i u uljima. U uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji sprečava rast mikroorganizama. S tim u vezi, sterilni vodeni medijum koji se koristi lako se može dobiti standardnim tehnikama poznatim stručnjacima.
[0061] Farmaceutski oblici pogodni za injekcionu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za privremenu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan u meri u kojoj se lako može ubrizgati. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora se čuvati od kontaminacije mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i polietilen glikol i slično), njihove pogodne smeše i biljna ulja. Pravilna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za premazivanje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.
Prevenciju delovanja mikroorganizama mogu da izazovu različita antibakterijska i antifungalna sredstva, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, benzil alkohol, sorbinska kiselina, timerosal i slično. U mnogim slučajevima, biće razumno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Dugotrajna apsorpcija kompozicija koje se injektiraju može se postići upotrebom sredstava koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostarat i želatin.
[0062] Sterilni rastvori za injektiranje se pripremaju uključivanjem rAAV u potrebnu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa različitim drugim gore navedenim sastojcima, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtera. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog sastojka u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injektiranje, poželjni načini pripreme su vakuumsko sušenje i zamrzavanje koje daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilnog filtriranog rastvora.
[0063] Transdukcija sa rAAV se takođe može izvršiti in vitro. U jednom otelotvorenju, željene ciljne mišićne ćelije se uklanjaju iz subjekta, transdukuju sa rAAV i ponovo uvode u subjekt. Alternativno, singenske ili ksenogenske mišićne ćelije se mogu koristiti tamo gde te ćelije neće generisati neprikladan imuni odgovor kod subjekta.
[0064] Pogodne metode za transdukciju i ponovno uvođenje transdukovanih ćelija u subjekt poznate su u struci. U jednom otelotvorenju, ćelije se mogu transdukovati in vitro kombinovanjem rAAV sa mišićnim ćelijama, npr. u odgovarajućim medijima, i skriningom za one ćelije koje sadrže DNK od interesa koristeći konvencionalne tehnike kao što su Southern blot i/ili PCR, ili korišćenjem markera koji se mogu izabrati. Transdukovane ćelije se zatim mogu formulisati u farmaceutske kompozicije, a kompozicija koja se u subjekt uvodi različitim tehnikama, kao što su intramuskularna, intravenska, subkutana i intraperitonealna injekcija, ili injekcijom u glatki i srčani mišić, koristeći npr. kateter.
[0065] Transdukcija ćelija sa rAAV predmetnog pronalaska rezultira održivim ekspreimovanjem β-sarkoglikana. Opisane su metode primene/isporuke rAAV koje eksprimiraju β-sarkoglikan subjektu sisaru, po mogućnosti ljudskom biću. Ove metode uključuju transdukciju tkiva (uključujući, ali ne ograničavajući se na, tkiva kao što su mišići, organi kao što su jetra i mozak, i žlezde kao što su pljuvačne žlezde) sa jednim ili više rAAV ovog predmetnog pronalaska. Transdukcija se može vršiti sa genskom kasetom koja se sastoji od kontrolnih elemenata specifičnih za tkivo. Na primer, opisane su metode transdukcije mišićnih ćelija i mišićnih tkiva usmerene kontrolnim elementima specifičnim za mišiće, uključujući, ali ne ograničavajući se na, one izvedene iz porodica gena aktina i miozina, kao što su iz porodice gena myoD [videti Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)], faktor vezivanja pojačivača specifičan za miocite MEF-2 [Cserjesii Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], kontrolni elementi izvedeni iz gena humanog skeletnog aktina [Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], gen za srčani aktin, elementi sekvence mišićne kreatin kinaze [videti Johnson et al., Mol Cell Biol, 9: 3393-3399 (1989)] i elementa za pojačavanje mišje kreatin kinaze (mCK), element gena za skeletni brzotrzajni troponin C, element gena za srčani sporotrzajni troponin C, element gena za sporotrzajni troponin I: nuklearni faktori indukovani hipoksijom (Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), element indukovan steroidima ili glukokortikoid-responsivni element (GRE) (videti Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)) i drugi kontrolni elementi.
[0066] Mišićno tkivo je atraktivna meta za isporuku in vivo DNK, jer nije vitalni organ i lako je dostupan. Predmetni pronalazak razmatra kontinuiranu ekspresiju mikrodistrofina iz transdukovanih miofibera.
[0067] Pod „mišićna ćelija“ ili „mišićno tkivo“ podrazumeva se ćelija ili grupa ćelija izvedenih iz mišića bilo koje vrste (na primer, skeletni mišić i glatki mišić, tj. iz digestivnog trakta, mokraćne bešike, krvnih sudova ili srčanog tkiva). Takve mišićne ćelije mogu biti diferencirane ili nediferencirane, kao što su mioblasti, miociti, miotube, kardiomiociti i kardiomioblasti.
[0068] Termin „transdukcija“ se koristi za primenu/isporuku polinukleotida od interesa (npr. polinukleotidne sekvence koja kodira β-sarkoglikan) u ćeliju primaoca bilo in vivo ili in vitro, putem opisanog rAAV sa nedostatkom replikacije koji rezultira ekspresijom β-sarkoglikana od strane ćelije primaoca.
[0069] Dakle, ovde je takođe opisana efektivna doza (ili doze koje se primenjuju u suštini istovremeno ili doze date u intervalima) rAAV koji kodira β-sarkoglikan za primenu na subjektu kod sisara kome je to potrebno
[0070] Predmetni pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima, koji ne ograničavaju obim predmetnog pronalaska opisanog u patentnim zahtevima.
PRIMERI
Materijali i metode
[0071] Životinjski modeli - Sve procedure je odobrio The Research Institute at Nationwide Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (protokol AR12-00040). B6.129-Sgcb<tm1Kcam/1J>heterozigotni miševi kupljeni su u Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA; soj br.006832). Sgcb<-/->miševi su generisani uzgojem heterozigotnih miševa. KO miševi su uzgajani i održavani kao homozigotne životinje u standardizovanim uslovima u Animal Resources Core u Research Institute at Nationwide Children's Hospital. Miševi su održavani na Teklad Global dijeti za glodare (3,8% vlakana, 18,8% proteina, 5% masti) sa 12:12-časovnim tamno:svetlo ciklusom. Identifikacija SGCB-</->miševa izvršena je genotipizacijom pomoću PCR. Sve životinje su bile smeštene u standardne kaveze za miševe sa hranom i vodom ad libitum.
[0072] Konstrukcija gena beta-sarkoglikana. Humani beta-sarkoglikan cDNK u punoj dužini (GenBank pristupni br. NM_0034994.3) je optimizovan i sintetizovan od strane GenScript Inc, Piscataway, NJ, USA. Optimizacija kodona kroz GenScript koristi algoritam koji uzima u obzir parametre koji uključuju transkripciju, obradu i stabilnost mRNK, translaciju i savijanje proteina kako bi se dizajnirala cDNK sekvenca koja rezultira maksimalnom ekspresijom u mišićnom tkivu (www.genscript.com).
[0073] Za konstrukt pAAV.tMCK.hSGCB, cDNK je zatim klonirana u plazmid koji sadrži AAV2 ITR, a kaseta je uključivala konsenzusnu sekvencu Kozak (CCACC), himerni intron SV40 i sintetičko mesto poliadenilacije (53 bp). Rekombinantni tMCK promoter je poklon od dr Dr Xiao Xiao (University of North Carolina). Reč je o modifikaciji prethodno opisanog promotera CK627 i uključuje modifikaciju u pojačivaču uzvodno od regiona promotera koji sadrži mesta vezivanja transkripcionog faktora. Pojačivač se sastoji od dva E-boksa (desnog i levog). Modifikacija tMCK promotera uključuje mutaciju koja pretvara levi E-boks u desni E-boks (2R modifikacija) i umetanje 6-bp (S5 modifikacija). Vektor pAAV.tMCK.hSGCB je konstruisan ligacijom 1040 bp KpnI/XbaI fragmenta iz pUC57-BSG (Genscript Inc.) u KpnI/XbaI lokacije pAAV. tMCK.hSGCA.26
[0074] Vektor pAAV.MHCK7.hSGCB je konstruisan uklanjanjem tMCK promotera i SV40 himernog introna sa Notl/Kpnl lokacijama i umetanjem PCR pojačanog fragmenta koji sadrži MHCK7 promoter i identičan SV40 himerni intron sa Notl/Kpnl lokacijama. MHCK7 je promoter zasnovan na MCK koji koristi pojačivač od 206 bp uzet iz ~ 1,2 kb 5' mesta početka transkripcije unutar gena endogene mišićne kreatin kinaze sa proksimalnim promoterom (enh358MCK, 584-bp)<3,12>. Sam MHCK7 promoter sadrži ovu modifikovanu CK7 kasetu iz MCK porodice gena vezanih za pojačivač 188-bp α-MyHC (α-miozin teški lanac) 5'CK dela za poboljšanje srčane ekspresije<12>. Kreatin kinaza promotera (CK) je 96% identična između tMCK i MHCK7. Konačno, pAAV.MHCK7.hSGCB vektor je konstruisan ligacijom 960 bp NotI/KpnI MHCK7+Intron fragmenta iz pAAV.MHCK7.DYSF5'DV44 u Notl/Kpnl lokacije pAAV.tMCK.hSGCB (Pozgai et al., Gene Ther.23: 57-66, 2016)
[0075] Proizvodnja rAAV. Modifikovani pristup unakrsnom pakovanju, koji su prethodno prijavili Rodino-Klapac et al. (J. Trans. Med.5:45, 2007), korišćen je za proizvodnju rAAV vektora. Ovde, metoda trostruke transfekcije sa precipitacijom CaPO4u HEK293 ćelijama omogućava da se ITR AAV2 pakuju u drugi AAV kapsidni serotip. (28,29) Proizvodni plazmidi su bili (i) pAAV.tMCK.hSGCB ili pAAV.MHCK7.hSGCB, (ii) rep2-caprh.74 modifikovani AAV pomoćni plazmidi koji kodiraju izolat nalik cap serotipu 8 rh.74 i (iii) adenovirus tipa 5 pomoćni plazmid (pAdhelper) koji eksprimira adenovirus E2A, E4 ORF6 i VA I/II RNK gene. Vektori su prečišćeni i inkapsulirani vg titar (korišćenjem Prism 7500 Taqman detektorskog sistema; PE Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) je određen kao što je prethodno opisano. 30 Prajmer i fluorescentna sonda su bili usmereni na tMCK promoter i bili su sledeći: tMCK prednji prajmer, 5'-ACC CGA GAT GCC TGG TTA TAA TT-3' (SEQ ID NO.: 10); tMCK obrnuti prajmer, 5'-TCC ATG GTG TAC AGA GCC TAA GAC-3' (SEQ ID NO.: 11); i tMCK sonda, 5'-FAM-CTG CTG CCT GAG CCT GAG CGG TTA C-TAMRA-3' (SEQ ID NO.: 12). Prajmer i fluorescentna sonda su bili usmereni na MHCK7 promoter i bili su sledeći: MHCK7 prednji prajmer, 5'-CCA ACA CCT GCT GCC TCT AAA-3' (SEQ ID NO.: 16); MHCK7 obrnuti prajmer, 5'-GTC CCC CAC AGC CTT GTT C-3' (SEQ ID NO.: 17); i MHCK7 sonda, 5'-FAM-TGG ATC CCC-Zen-TGC ATG CGA AGA TC-3IABKFQ-3' (SEQ ID NO.: 18).
[0076] Intramuskularna isporuka gena. Za intramuskularnu injekciju, miševi su anestezirani i održavani pod 1-4% izoflurana (u O<2>). Prednji odeljak donjeg levog uda miševa starih od 4 do 6 nedelja SGCB<-/->očišćen je sa 95% EtOH, a zatim je transverzalni abdominalni (TA) mišić injektiran sa 3 × 10<11>vg scAAVrh.74.tMCK.hSGCB razblažen u fiziološkom rastvoru u zapremini od 30 µl koristeći ultrafini insulinski špric kalibra 30. Kontralateralni mišić je ostavljen netretiran da služi kao kontrolna grupa. TA mišić iz oba uda je uklonjen ili 6 (n = 9, 4 mužjaka, 5 ženki) ili 12 (n = 6, 4 mužjaka, 2 ženki) nedelja nakon injekcije kako bi se procenila efektivnost transfera gena. U eksperimentima u kojima su učestvovali 6-mesečni miševi (n = 5, 5 mužjaka), tretman se sastojao od intramuskularne injekcije u levu TA sa 3 × 10<11>vg scAAVrh.74.tMCK.hSCGB. Za izolovane eksperimente perfuzije udova, sgcb<-/->miševi su perfuzovani u starosti od 4 (n =5, 5 mužjaka) i 5 (n =4, 2 mužjaka, 2 ženke) nedelja sa 5 x 10<11>vg scAAVrh.74.tMCK.hSCBB injekcijom u femoralnu arteriju kao što je prethodno opisano. 19 životinja je eutanazirano i mišići su analizirani 8 nedelja nakon transfera gena.
[0077] Sistemska isporuka gena: Sistemska isporuka je postignuta injektiranjem vektora u repnu venu sgcb<-/->miševa. Miševima je injektiran 1x10<12>vg scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB razblažen u fiziološkom rastvoru u zapremini od 212 µL koristeći ultrafini insulinski špric kalibra 30. Miševi su bili u epruveti za držanje, postavljajući rep nazad kroz prorez za rep kako bi se zagrejao kako bi se proširili krvni sudovi radi lakšeg injektiranja. Nakon lociranja arterije niz centralnu liniju repa, injekcija je izvršena u jednoj od ljubičastih/plavih bočnih vena koje teku duž repne arterije. Svi tretirani miševi su injektirani u dobi od 4-5 nedelja i eutanazirani 6 nedelja nakon injektiranja.
[0078] EDL generacija sile i zaštita od ekscentričnih kontrakcija. Izvršena je fiziološka analiza EDL mišića miševa tretiranih izolovanom perfuzijom (ILP). EDL mišić iz oba donja zadnja uda tretiranih miševa je seciran na tetivama i podvrgnut fiziološkom protokolu za procenu funkcije koja je prethodno opisana od strane naše laboratorije i drugih (19,31) uz neke adaptacije. Tokom ekscentričnog protokola kontrakcije, procedura rastezanja od 5% vrši se između 500 i 700 ms (5% se proteže na 100 ms, nakon čega sledi povratak na optimalnu dužinu za 100 ms). Nakon protokola tetanusa i ekscentrične kontrakcije, mišić je uklonjen, mokro izmeren, montiran na steznu glavu koristeći tragakant gumu, a zatim zamrznut u metilbutanu ohlađenom u tečnom azotu.
[0079] TA generacija sile i zaštita od ekscentričnih kontrakcija. Protokol za procenu funkcionalnih ishoda u TA mišiću izvršen je na mišićima izvađenim iz miševa tretiranih IM injekcijom. Ova procedura TA je navedena u nekoliko prethodnih studija.(32,33) Nakon ekscentričnih kontrakcija, miševi su zatim eutanazirani i TA mišić je seciran, izmeren i zamrznut za analizu. Analiza podataka je vršena slepo, ali ne nasumično.
[0080] Imunofluorescencija. Kriostatski preseci (12 µm) inkubirani su monoklonskim humanim beta-sarkoglikanskim primarnim antitelima (Leica Biosystems, New Castle, UK; kat. br. NCL-L-b-SARC) u razblaženju 1:50 u blok puferu (1 × TBS, 10% kozji serum, 0,1% Tween) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u vlažnoj komori. Preseci su zatim oprane u TBS tri puta, svaka po 20 min i ponovo blokirane tokom 30 min. AlexaFluor 594 konjugovano kozje anti-mišje sekundarno IgG1 antitelo (Life Technologies, Grand Island, NY, USA; kat. br. A21125) primenjeno je u razblaženju 1:250 tokom 45 min. Preseci su oprane u TBS tri puta po 20 min i montirane sa Vectashield montažnim medijumom (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Četiri nasumične ×20 slike koje pokrivaju četiri različita kvadranta mišićnog dela snimljene su Zeiss AxioCam MRC5 kamerom. Procenat vlakana pozitivnih na bojenje beta-sarkoglikana (450% intenziteta bojenja mišićne membrane) određen je za svaku sliku i izračunat je prosek za svaki mišić.
[0081] Western blot analiza. Preseci tkiva iz levog tretiranog TA mišića i desnog kontralateralnog TA mišića (debljine 20-20 mikrona) sakupljeni su u mikrocentrifugu i homogenizovani sa 100 µl homogenizacionog pufera (125 mM Tris-HCl, 4% SDS, 4 M urea) u prisustvu 1 koktel tablete inhibitora proteaze (Roche, Indianapolis, IN, USA). Nakon homogenizacije, uzorci su centrifugirani na 10.000 o/min 10 min na 4°C. Protein je kvantifikovan na NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Uzorci proteina (20 µg) su elektroforezirani na 3-8% poliakrilamid tris-acetat gelu (NuPage, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) tokom 1 h 5 min na 150 V, a zatim prebačeni na PVDF membranu (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) tokom 1 h 15 min na 35 V. Membrana je blokirana u 5% nemasnog suvog mleka u TBST tokom 1 h, a zatim inkubirana sa zečjim poliklonskim humanim beta-sarkoglikanskim antitelima (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA; kat. br. NBP-1-90300 1:100 ili 1:250 razblaženje) i 1:5000 monoklonskog mišjeg gama-tubulinskog antitela (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA; kat. br. T6557) ili 1:5000 razblaženje mišjeg monoklonskog mišjeg α-aktininskog antitela (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA; kat. br. A7811). A 1:500 razblaženje zečjeg poliklonskog mišjeg srčanog troponin I antitela (Abcam, Cambridge, MA; kat. br. ab47003) i 1:1000 razblaženjem zečjeg monoklonskog mišjeg vinkulinskog antitela (Invitrogen, Frederick, MD; kat. br.70062) su korišćeni. Anti-mišja (Millipore, Billerica, MA, USA; kat. br. AP308P) i anti-zečja (Life Technologies; kat. br. 656120) sekundarna-HRP antitela za ECL imunodetekciju su korišćena.
[0082] EBD test. Doza od 3 x 10<10>vg scAAVrh.74.tMCK.hSGCB je isporučena 4 nedelje starim sgcb<-/->miševima u levu TA intramuskularnom injekcijom. Četiri nedelje nakon injekcije, miševi su injektirani u intraperitonealnu šupljinu na desnoj strani pri 5 µl/g telesne težine filtera sterilisanog 10 mg/ml EBD u 1x rastvoru fosfatnog pufera. Miševi su zatim eutanazirani 24 sata nakon injektiranja i tkiva su sakupljena i presečena. Preseci su fiksirani u hladnom acetonu 10 minuta, a zatim je imunofluorescentni protokol korišćen za bojenje humanog beta-sarkoglikana.
[0083] Morfometrijska analiza. Prečnici mišićnih vlakana i procenat miofibera sa centralno lociranim jezgrima određeni su iz TA i GAS mišića obojenih hematoksilinom i eozinom (H&E). Četiri nasumične × 20 slika po delu po životinji snimljene su Zeiss AxioCam MRC5 kamerom. Centralno nukleirana vlakna su kvantifikovana pomoću softvera NIH ImageJ (Bethesda, MD, USA). Prečnici vlakana su mereni kao najkraći prečnik kroz mišićno vlakno pomoću softvera Zeiss Axiovision LE4 (Carl Zeiss Microscopy, Minhen, Nemačka).
[0084] Biodistribucija qPCR analiza. Taqman kvantitativni PCR je izvršen kako bi se kvantifikovao broj kopija vektorskog genoma prisutnih u ciljanim i neciljanim kontralateralnim mišićima, kao i neciljanim organima, kao što je prethodno opisano.( 18.30) Komplet sonde prajmera specifičan za vektor korišćen je za pojačavanje sekvence intronskog regiona direktno nizvodno od tMCK promotera koji je jedinstven i nalazi se unutar scAAVrh.74.tMCK.hSGCB transgene kasete. U ovoj studiji korišćeni su sledeći prajmeri i sonda: tMCK i MHCK7 intronski prednji prajmer 5'-GTG AGG CAC TGG GCA GGT AA -3' (SEQ ID NO.: 13); tMCK i MHCK7 intronski obrnuti prajmer 5'-ACC TGT GGA GAG AAA GGC AAA G -3' (SEQ ID NO.: 14); i tMCK i MHCK7 intronska sonda 5'-6FAM-ATC AAG GTT ACA AGA CAG-GTT TAA GGA GAC CAA TAG AAA -tamra-3' (SEQ ID NO.: 15). Broj kopije je prijavljen kao vektorski genom po mikrogramu genomske DNK. Imunohistohemija za bojenje imunih ćelija. Imunohistohemija je korišćena za identifikaciju imunih ćelija. Preseci smrznutog tkiva na Fisherbrand Superfrost naelektrisanim mikroskopskim slajdovima inkubirani su monoklonskim anti-mišjim antitelima pomoću antipacovskog kompleta za detekciju Ig HRP (BD Pharmagen, San Jose, CA, USA; kat: 551013): CD3 (kat: 555273), CD4 (kat: 550280), CD8 (kat: 550281) i Mac-3 za makrofage (kat:
550292). Sva primarna antitela su razblažena u 1:20 fiziološkim rastvorom sa fosfatnim puferom. Pozitivno imunološko bojenje je vizuelizovano korišćenjem DAB hromagena razblaženog u DAB puferu sa Streptavidin-HRP peroksidazom ectastain ABC Peroxidase. Za svaki mišić i svaku odgovarajuću boju snimljeno je deset nasumičnih × 40 slika. Broj mononuklearnih ćelija je prebrojan i eksprimiran kao ukupan broj po mm<2>.
[0085] Picrosirius crvena boja i kvantifikacija kolagena. Smrznuti preseci postavljeni na Fisherbrand Superfrost naelektrisane mikroskopske slajdove fiksirani su u 10% neutralnog puferisanog formalina tokom 5 minuta, a zatim isprani destilovanom vodom. Slajdovi su zatim inkubirani u rastvoru A (fosfomolidbinska kiselina) iz kompleta Picrosirius crvene boje (Polysciences Inc., Warrington, PA, US; katalog br.24901) tokom 2 min. Nakon temeljnog ispiranja u destilovanoj vodi, slajdovi su stavljeni u rastvor B (Direct Red 80/24 6-trinitrofenol) u trajanju od 15 min, nakon čega je usledilo dodatno ispiranje u destilovanoj vodi, a zatim inkubacija u rastvoru C (0,1 N hidrohloridna kiselina) u trajanju od 2 min.
Slajdovi su protivbojeni 2,5 min sa 1% Fast Green u 1% glacijalne sirćetne kiseline iz Poly Scientific (katalog br. S2114) koristeći razblaženje 1:10 u DI vodi. Na kraju, slajdovi su ponovo isprani u destilovanoj vodi, dehidrirani u gradiranom etanolu, očišćeni u ksilenu i montirani sa poklopcima pomoću Citoseal 60 medija od Thermo-Scientific (Waltham, MA, USA; kat. br.8310). Slike su snimljene pomoću softvera AxioVision 4.9.1 (Carl Zeiss Microscopy). Za analizu Sirius crvenog bojenja i % kvantifikacije kolagena, kontrast između crvene i zelene boje je poboljšan koristeći Adobe Photoshop. Izabran je dodatak za dekonvoluciju boja u softverskom programu ImageJ i korišćena je opcija RGB dekonvolucije boja. Crvena slika uključuje sve vezivno tkivo iz Sirius Red boje. Zelena slika uključuje sve mišiće iz Fast Green kontrasta. Korišćena je samo crvena slika i originalna slika. Zatim je na slike primenjen prag za dobijanje crno-belih slika sa područjima pozitivnim na kolagen u crnim i negativnim područjima u beloj boji. Pomoću funkcije merenja izračunata je površina kolagena. Ukupna površina tkiva je zatim određena pretvaranjem prvobitne slike u '8-bitnu' i podešavanjem praga na 254, što će biti jedna jedinica ispod potpunog zasićenja slike. Zatim je izmerena ukupna površina tkiva kao što je prethodno urađeno i zabeležena je ukupna površina. Procenat kolagena je zatim izračunat deljenjem površine kolagena sa ukupnom površinom tkiva. Zatim je izračunat srednji procenat za svakog pojedinčnog subjekta.
[0086] Tetanična kontrakcija dijafragme za funkcionalnu procenu: Miševi su eutanazirani i dijafragma je secirana sa rebrastim dodacima i centralnom tetivom netaknutom, i stavljena u K-H pufer kao što su prethodno opisali Beastrom et al. (Am. J. Pathol.179: 2464-74, 2011), Rafael-Forney et al. (Circulation 124: 582-8, 2011 i Moorwood e t al. (J. Visualized Experiments 71:e50036, [year?]) Izolovan je presek dijafragme širine 2-4 mm. Trake dijafragme su čvrsto vezane pletenom hirurškom svilom (6/0; Hirurški specijaliteti, Reading, PA) na centralnoj tetivi i zašivene kroz deo rebraste kosti pričvršćen na distalni kraj trake. Svaki mišić je prebačen u vodeno kupatilo ispunjeno rastvorom kiseonika K-H koji je održavan na 37°C. Mišići su poravnati horizontalno i vezani direktno između fiksne igle i dvofaznog pretvarača sile-servomotora (305c; Aurora Scientific, Aurora, Ontario, Canada). U kupatilu organa postavljene su dve elektrode od platinaste ploče tako da se pokrije dužina mišića. Mišić je istegnut do optimalne dužine za merenje kontrakcija trzaja, a zatim ostavljen da odstoji 10 minuta pre pokretanja tetaničnog protokola. Kada se mišić stabilizuje, mišić se postavlja na optimalnu dužinu od 1g i podvrgava se zagrevanju koje se sastoji od tri trzaja od 1Hz svakih 30 sekundi, nakon čega slede tri trzaja od 150Hz svakog minuta. Nakon 3 min. odmora, dijafragma se stimuliše na 20, 50, 80, 120, 150, 180Hz, omogućavajući 2 min. odmora između svakog stimulusa, svaki u trajanju od 250ms za određivanje maksimalne tetanične sile. Izmerena je dužina i težina mišića. Sila je normalizovana za težinu i dužinu mišića.
[0087] Snimanje srca magnentom rezonancom: Funkcija srca je analizirana korišćenjem sistema za snimanje magnetnom rezonancom sa horizontalnim otvorom od 9,4 T (MR) i zavojnice za zapreminu miša (Bruker BioSpin, Billerica, MA, USA). Miševi su anestezirani sa 2,5% izofluorana pomešanog sa karbogenom (1 l/min) tokom 3 minuta pre postavljanja na ležište za snimanje. Nakon postavljanja miševa u aparat za snimanje i pokretanja snimanja, smeša izoflurana/karbogena je pala na 1,5% za ostatak studije. EKG i disanje su praćeni pomoću MR kompatibilnog sistema (Model 1025, Small Animal Instruments, Stonybrook, NY, USA). FLASH cine T1-ponderisane slike sinhronizovane srčane kratke ose su dobijene preko cele leve komore (LV) miša (TR = 8 ms; TE = 2,8 ms; □ = 18o; matrica = 256 × 256; FOV = 3,0 × 3.0 cm; debljina preseka = 1 mm, npreseka = 7, do 20 kadrova po srčanom ciklusu). Za analizu slike identifikovana je krajnja dijastolna i krajnja sistolna vremenska tačka svake slike kratke ose i ručno su praćene endokardne i epikardijalne granice srca.
Papilarni mišići su isključeni iz endokardne granice LV. Iz ovih izmerenih područja izračunati su krajnji dijastolni volumen (EDV), krajnji sistolni volumen (ESV), udarni volumen (SV), minutni volumen srca (CO), ejekciona frakcija (EF) i prosečna masa LV.
[0088] Imunofluorescencija: Kriostatski preseci (12 µm) mišića tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GAS), quadriceps (QUAD), psoas major (PSOAS), gluteal (GLUT), triceps (TRI) i mišića dijafragme zajedno sa srcem su podvrgnuti imunofluorescentnom bojenju za hSGCB transgen putem našeg prethodno korišćenog protokola kao što je opisano u Pozgai et al., Genska terapija.23: 57-66, 2016. Preseci su inkubirani mišjim monoklonskim humanim beta-sarkoglikanskim primarnim antitelima (Leica Biosystems, New Castle, UK; kat. br. NCL-L-b-SARC) pri razblaženju 1:100. Četiri nasumične 20X slike koje pokrivaju četiri različita kvadranta mišićnog dela snimljene su Zeiss AxioCam MRC5 kamerom. Procenat vlakana pozitivnih na bojenje beta-sarkoglikana (>50% bojenja mišićne membrane) određen je za svaku sliku i prosečno za svaki mišić.
[0089] Morfometrijska analiza: Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) izvršeno je na krio presecima mišića debljine 12 µm kod miševa starih 7 meseci C57BL6 WT (n=5 ), sgcb<-/->miševa (n=5) i rAAV.MHCK7.hSGCB 6 meseci tretiranih sgcb<-/->miševa (n=5) za analizu. Procenat miofibera sa centralnim jezgrom određen je u TA, GAS, QUAD, PSOAS, GLUT, TRI i mišićima dijafragme. Pored toga, izmereni su prečnici mišićnih vlakana u GAS, PSOAS i TRI mišićima. Četiri nasumične slike od 20X po mišiću po životinji snimljene su Zeiss AxioCam MRC5 kamerom. Centralno nukleirana vlakna su kvantifikovana pomoću softvera NIH ImageJ, a prečnici vlakana su izmereni pomoću softvera Zeiss Axiovision LE4.
[0090] Rendgenski snimci: Snimci celog tela su urađeni na anesteziranim 7-mesečnim C57BL6 WT miševima (n=6), netretiranim sgcb<-/->miševima (n=6) i rAAV.MHCK7.hSGCB 6-mesečnim tretiranim sgcb<-/->miševima (n=6) korišćenjem digitalnog rendgenskog sistema Faxitron MX-20 na 26kV tokom 3 sekunde (Faxitron X-Ray Corp, Lincolnshire, USA).
[0091] Lasersko praćenje aktivnosti kaveza na otvorenom terenu: Za određivanje ukupne aktivnosti eksperimentalnih miševa korišćena je komora za aktivnost na otvorenom terenu. Miševi stari 7 meseci iz C57BL6 WT (n=6) i netretirane scgb<-/->(n=6) kontrolne grupe zajedno sa rAAV.MHCK7.hSGCB 6 meseci tretiranim sgcb<-/->miševima (n=6) podvrgnuti su analizi prema prethodno opisanom protokolu (Kobayashi et al., Nature 456: 511-5, 2008, Beastrom et al., Am. J. Pahol.179: 2464-74, 2011) sa nekoliko izmena. Svi miševi su testirani u isto doba dana, u ranim jutarnjim satim pred kraj noćnog ciklusa, kada su miševi najaktivniji. Svi miševi su testirani u izolovanoj prostoriji pod prigušenim svetlom i sa istim rukovaocem svaki put. Da bi se smanjila anksioznost i održale varijable ponašanja na minimumu, što bi potencijalno moglo uticati na normalnu aktivnost miševa, a samim tim i na rezultate testa, testirani miševi nisu bili pojedinačno smešteni (Voikar et al., Genes Brain Behav.4: 240-52, 2005). Aktivnost miševa je praćena pomoću Photobeam Activity System (San Diego Instruments, San Diego, CA). Ovaj sistem koristi mrežu nevidljivih infracrvenih svetlosnih snopova koji prelaze životinjsku komoru napred-nazad i sleva na desno kako bi pratili položaj i kretanje miša unutar X-Y-Z ravni. Aktivnost je zabeležena za 1-časovne cikluse u 5-minutnim intervalima. Miševi su aklimatizovani u prostoriju za testiranje aktivnosti na početnu jednosatnu sesiju nekoliko dana pre početka prikupljanja podataka. Miševi su testirani u pojedinačnim komorama u setovima od 4 komada. Oprema za testiranje je očišćena između svake upotrebe kako bi se smanjile reakcionarne varijable ponašanja miša koje bi mogle da promene rezultate. Podaci su konvertovani u Microsoft Excel radni list, a svi proračuni su urađeni u okviru Excel programa. Pojedinačni prekidi snopa za kretanje u X i Y ravni sabirani su za svakog miša kako bi predstavljali ukupnu ambulaciju, a prekidi snopa u Z ravni sabirani su kako bi se dobila vertikalna aktivnost u vremenskom intervalu od 1 sata.
Primer 1
scAAVrh.74.tMCK.hSGCB konstrukcija i potencija vektora
[0092] Konstruisana je transgenska kaseta koja sadrži humani SCGB cDNK pune dužine optimizovan kodonom, kao što je prikazano na slikama 1A. Kaseta uključuje konsenzusnu Kozak sekvencu (CCACC), SV40 himerni intron, sintetičko mesto poliadenilacije i mišićnospecifični tMCK promoter (20) koji se koristi za ekspresiju kasete. Kaseta je upakovana u samokomplementarni (sc) AAVrh.74 vektor koji je 93% homologan AAV8. AAVrh.74 je dokazan kod miševa i primata koji nisu ljudi da je bezbedan i efektivan, posebno u prelasku vaskularne barijere kada se isporučuju u mišiće kroz cirkulaciju.(17, 18, 21) Potentnost vektora utvrđena je intramuskularnom injekcijom u levi TA mišić kod Sgcb-null miša.
Isporuka 3 × 10<10>vg transdukovanih 70,5±2,5% mišićnih vlakana i 1 x 10<11>vg transdukovanih 89,0±4,0% mišićnih vlakana, 3 nedelje nakon transfera gena.
Primer 2
Intramuskularna isporuka scAAVrh.74.tMCK.hSGCB
[0093] Nakon potencije vektora, studije su proširene kako bi se analizirala efektivnost terapije 6 i 12 nedelja nakon transfera gena. Kao rezultat visokog nivoa ekspresije nakon kratke tronedeljne studije potencije, izabrana je doza od 3 x 10<10>vg ukupno za naredne studije kako bi se koristila najniža efektivna doza. Pet nedelja stari sgcb<-/->miševi su tretirani sa 3 x 10<0>vg scAAVrh.74.tMCK.hSCGB intramuskularno u levi poprečni abdominalni (TA) i βsarkoglikanskom ekspresijom korišćenjem imunofluorescencije u 88,4±4,2% mišićnih vlakana 6 nedelja nakon injekcije (n=9), i u 76,5±5,8% mišićnih vlakana 12 nedelja nakon injekcije (n=6), a ekspresija je potvrđena zapadnim blotovanjem (slika 1B). β-sarkoglikanska ekspresija je praćena restauracijom komponenti proteinskog kompleksa povezanog sa distrofinom (α-sarkoglikan i distrofin) (slika 1C). Koristeći Evans plavu boju (EBD) kao marker za propusnost membrane (22, 23) pronašli smo da su sva vlakna koja eksprimiraju egzogeni β-sarkoglikan zaštićena od curenja i inkluzije EBD (slika 1D). Mišići sgcb<-/->miševa pokazuju tešku mišićnu distrofiju sa centralno nukleiranim vlaknima, čestu nekrozu mišićnih vlakana, fibrotičko tkivo i značajnu varijabilnost veličine vlakana koju predstavljaju i atrofična i hipertrofična vlakna. (3, 4) Kao što se vidi na slici 2A, bojenje hematoksilinom i eozinom pokazuje ukupno poboljšanje distrofičnog fenotipa obolelog mišića, uključujući smanjenje centralnih jezgara (sgcb<-/->netretirani-76,8 ±2,3% naspram AAV.hSCGB tretirani-38,86 ±3,5%; P<0,0001) (slika 2C). Uočena je i normalizacija raspodele veličine vlakana, sa povećanjem prosečnog prečnika vlakana nakon tretmana (sgcb<-/->netretirani-32,6 ±0,31 µm naspram AAV.hSGCB tretirani-35,56 ±0,22 µm; P<0,0001) (slika 2D).
[0094] Histopatološki znak skgb<-/->miša je fibroza koju karakteriše široko rasprostranjena zamena mišićnog tkiva prvenstveno kolagenima zajedno sa drugim vanćelijskim komponentama matrice kao što su fibronektin, elastin, laminin i dekorin.(14) Ova zamena mišićnog tkiva vezivnim tkivom dovodi u pitanje potencijalnu vrednost zamene gena i može ograničiti stepen poboljšanja. (24) Da bi se ovo testiralo, miševi tretirani 12 nedelja su testirani na smanjenje fibroze. TA mišić je posebno procenjen jer je njegov inherentni stepen fibroze utvrđen u KO modelu i zato što predstavlja potencijalnu metu nakon isporuke vaskularnog ILP gena. Picrosirius crveno bojenje za kolagen, tip I i III, TA mišića pokazalo je značajno smanjenje (52,74%) količine kolagena prisutnog u okviru scAAVrh.74.tMCK.hSGCB tretiranog mišića u poređenju sa netretiranim sgcb<-/->mišjim mišićima (20,7±0,57% naspram 43,8±2,3%, AAV.hSGCB tretirani naspram sgcb<-/->netretirani; P<0,0001) (slike 2b i e). Netretirani sgcb<-/->mišić kod 5 nedelja starih miševa u vreme injekcije imao je 24,05±1,5% taloženja kolagena, što ukazuje na blago (14,0%) smanjenje količine kolagena nakon 12 nedelja tretmana.
Primer 3
Funkcionalna korekcija u skeletnom mišiću nakon transfera gena scAAVrh.74.tMCK.hSGCB
[0095] Da bismo utvrdili da li transfer gena hSGCB može poboljšati funkciju mišića, procenili smo funkcionalna svojstva TA mišića kod sgcb<-/->miševa tretiranih sa scAAVrh.74.tMCK.hSCGB. Nakon intramuskularne isporuke 3 x 10<10>vg scAAVrh.74.tMCK.hSCGB u TA 4 nedelje starih sgcb<-/->miševa, 6 nedelja nakon tretmana, TA mišići su podvrgnuti merenjima sile in situ (n=4). Tretirani mišići su upoređeni sa netretiranim kontralateralnim mišićima i onima od C57BL/6 WT miševa. scAAVrh.74.tMCK.hSCGB-tretirani mišići su pokazali značajno poboljšanje i apsolutne tetanične sile i normalizovane specifične sile (slike 3A i B). Tretirano mišići su imali prosečnu apsolutnu silu od 1436,9±199,5 mN u poređenju sa 770,9±118,3 mN za netretiranu kontrolnu grupu sgcb<-/->(P<0,01). Slično tome, tretirani TA mišići su proizveli prosečnu specifičnu silu od 254,01±6,9 mN/mm<2>, a netretirani mišići su proizveli 124,2±13,9 mN/mm<2>sile (P<0,01). Konačno, mišići tretirani sa scAAVrh.74.tMCK.hSCGB pokazali su veću otpornost na povrede izazvane kontrakcijom u poređenju sa netretiranim kontrolnim mišićima (slika 3C). Tretirani TA mišići su izgubili 34,0±5,1% sile od one koja je nastala nakon prve kontrakcije, dok su netretirani oboleli mišići izgubili 54,1±3,8% (P<0,01) sile nakon protokola ekscentrične kontrakcije. Ovi podaci pokazuju da transfer gena hSGCB pruža funkcionalnu korist obolelim mišićnim deficitom za β-sarkoglikan.
Primer 4
Tretman ostarelih mišića scAAVrh.74.tMCK.hSGCB
[0096] Studije progresije bolesti u ovom mišjem modelu LGMD2E pokazale su da iako se najteže remodeliranje tkiva u mišićima dešava između 6 i 20 nedelja, histopatologija mišića nastavlja da se pogoršava sa godinama, nalik na progresiju bolesti kod pacijenata.(3, 4, 14) Shodno tome, da bismo imitirali kliničko okruženje u kojem bi se tertman dogodio u starijoj životnoj dobi sa uznapredovalim pogoršanjem mišića i endomizijskom fibrozom, tretirali smo 6-mesečne sgcb<-/->miševe (n=5) intramuskularno u TA sa 3 x 10<10>vg scAAVrh.74.tMCK.hSCGB. Nakon 12 nedelja tretmana, u 9. mesecu starosti, transdukovano je 80,1±4,8% mišićnih vlakana (slika 4A). Picrosirius crvena boja za kolagen tipa I i III pokazala je smanjenje količine kolagena prisutnog kod tretiranih miševa od 42,2% u poređenju sa netretiranim sgcb<-/->mišjim mišićima (AAV.hSGCB tretirani-20,0 ±0,80% naspram sgcb<-/->netretirani-34,6 ±1,4%, P<0,0001) (slike 4B i C). U uzrastu tretmana, 6-mesečni sgcb<-/->miševi imaju 30,8±2,0% taloženja kolagena (n=4, 4 mužjaka); dakle, ovi rezultati ukazuju da scAAVrh.74.tMCK.hSCGB tretman ne samo da sprečava, već ima i potencijal da preokrene postojeću fibrozu.
Primer 5
ILP scAAVrh.74.tMCK.hSGCB kod sgcb -/- miševa
[0097] Sposobnost ciljanja više mišića u jednom udu omogućava klinički relevantniju metodu isporuke za translaciju na pacijente sa LGMD2E. Isporuka 5 × 10<11>vg scAAVrh.74.tMCK.hSGCB od strane ILP kod miševa starih od 4 do 6 nedelja sgcb<-/->(n=9, 7 mužjaka, 2 ženke) analizirana je 2 meseca nakon transfera gena. Ekspresija β-sarkoglikana dostigla je 91,8±4,7% vlakana u gastrocnemius (GAS) mišiću i 90,6±2,8% u TA (slika 5A). Isporuka ILP scAAVrh.74.tMCK.hSGCB rezultirala je značajnom zaštitom od ekscentrične povrede izazvane kontrakcijom (P<0,05), koja se nije razlikovala od WT, u poređenju sa netretiranim kontralateralnim mišićima (slika 5C). Vaskularna isporuka je takođe obnovila histopatološke parametre mišića (slika 5B). Centralna jezgra su smanjena u TA (sgcb<-/->netretirani-76,9 ±2,8% naspram AAV.hSGCB tretirani-23,2 ±5,7%, P<0,001) i GAS (sgcb-</->netretirani-78,2 ±2,4% naspram AAV.hSGCB tretirani-16,8±6,6%, P<0,001). Transfer gena je takođe doveo do povećanja prosečne veličine vlakana u TA (sgcb<-/->netretirani-30,53 ±0,52 µm naspram AAV.hSGCB tretirani-41,9 ±0,46 µm; P<0,0001) i GAS (sgcb<-/->netretirani-38,9 ±0,37 µm naspram AAV.hSGCB tretirani-33,3 ±0,44 µm; P<0,0001), uz normalizaciju raspodele prečnika vlakana, uočeno je značajno smanjenje (~60%) broja CD3 ćelija, CD4 ćelija i makrofaga (tabela 1).
[0098] Picrosirius crveno bojenje TA i GAS mišića takođe je pokazalo značajno smanjenje količine kolagena u poređenju sa netretiranim sgcb<-/->mišićem nakon vaskularne isporuke (slika 6a). Nivoi kolagena u TA smanjeni su na 21,6±1,3% u tretiranom mišiću u poređenju sa 40,2±1,5% kod netretiranih sgcb<-/->miševa u starosti krajnje tačke (P<0,0001). Kao što je prethodno naznačeno, sgcb<-/->miševi u vreme injekcije su dobili 24,1±1,5% kolagena u TA mišiću, što ponovo ukazuje na blago smanjenje (10,0%) taloženja kolagena nakon 8 nedelja tretmana. Slično tome, bojenje GAS mišića pokazalo je da tretirani miševi imaju 22,9±0,99% kolagena u poređenju sa 37,9±1,3% kod netretiranih sgcb<-/->miševa na krajnjoj tački (P<0,0001). Kvalitativni PCR je urađen kako bi se detektovali nivoi kolagena transkripta u mišićima, koji koreliraju sa rezultatima Sirius crvenog bojenja. Zajedno, ovi podaci pokazuju da isporuka humanog β-sarkoglikana posredovana AAV smanjuje mišićnu fibrozu, poboljšava funkciju mišića i poništava distrofičnu patologiju sgcb<-/->obolelog mišića.
Primer 6
Bezbednost i biodistribucija rAAVrh.74.tMCK.hSGCB
[0099] U početku, normalni WT miševi injektirani sa 3 x 10<10>vg scAAVrh.74.tMCK.hSGCB intramuskularno u TA nisu pokazali znake toksičnosti usled H&E bojenja, što ukazuje na to da nema štetnih efekata usled virusa. Nakon vaskularne isporuke ILP od 5 x 10<11>vg ukupne doze scAAVrh.74.tMCK.hSGCB kao što je opisano u prethodnom odeljku, bezbednost je procenjena u maloj grupi miševa u ovoj kohorti (n=4). Prvo su analizirani ciljani mišići sa značajnom ekspresijom gena, kao i histološki isključeni ciljni organi, uključujući srce, pluća, jetru, bubreg, slezinu, gonade i dijafragmu. Parafinski preseci su formalno pregledaniod strane veterinarskog patologa i nije bilo dokaza o toksičnosti ni u jednom zabeleženom organu (podaci nisu prikazani). Ekspresija proteina i vektorska biodistribucija su takođe procenjeni u svim gore navedenim tkivima i organima sa Western blot i qPCR testom, respektivno. Kopije vektorskog genoma otkrivene su u svim testiranim organima; međutim, ekspresija proteina nije otkrivena ni u jednom uzorku osim tretiranog mišića (slika 7). Konačno, analiza mokrih težina tretiranih i netretiranih mišića ne pokazuje značajnu razliku ili trend kada se uporede prosečne težine iz bilo koje kohorte (podaci nisu prikazani). Ovi podaci pružaju dokaze da je mišićno-specifični tMCK promoter ograničio ekspresiju na skeletni mišić i da vektor nije toksičan.
Primer 7
Histološki i funkcionalni deficiti u srcu i dijafragmi SGCB-/- miševa
[0100] WT i 7-mesečni SGCB-/- miševi (n=6 po soju) koji nisu tretirani analizirani su sa MR srca i fiziologijom dijafragme kako bi se potražili deficiti. Nakon ovih analiza, životinje su eutanazirane i procenjene za histopatologiju (slika 8). Trihromatsko bojenje je pokazalo ekstenzivnu fibrozu (crveno bojenje) i u dijafragmi (slika 8A) i u srcu (slika 8C). Ovo je praćeno funkcionalnim deficitima specifične sile u dijafragmi (116,24 mN/mm<2>SGCB-/-naspram 236,67 mN/mm<2>WT, slika 8B) i značajnim deficitom u ejekcionoj frakciji izmerenom MR (WT, 78% naspram SGCB-/- 65%, slika 8D).
Primer 8
scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB konstrukcija i potencija vektora
[0101] Konstruisana je transgenska kaseta koja sadrži humani SCGB cDNK pune dužine optimizovan kodonom, kao što je prikazano na slikama 9A. Kaseta uključuje konsenzusnu Kozak sekvencu (CCACC), SV40 himerni intron, sintetičko mesto poliadenilacije i mišićnospecifični MHCK7 koji se koristi za ekspresiju kasete. Ovo je promoter zasnovan na MCK koji koristi pojačivač od 206 bp uzet iz ~ 1,2 kb 5'mesta početka transkripcije unutar endogenog gena mišićne kreatin kinaze sa proksimalnim promoterom (enh358MCK, 584-b)<3,12>. Kaseta je upakovana u samokomplementarni (sc) AAVrh.74 vektor koji je 93% homologan AAV8. AAVrh.74 je dokazan kod miševa i primata koji nisu ljudi da je bezbedan i efektivan, posebno u prelasku vaskularne barijere kada se isporučuju u mišiće kroz cirkulaciju.(17, 18, 21) Potentnost vektora utvrđena je intramuskularnom injekcijom u levi TA mišić kod Sgcb-null miša. Isporuka 3 × 10<10>vg transdukovanih >90% mišićnih vlakana 4 nedelje nakon transfera gena.
Primer 9
Sistemska isporuka scAAV.MHCK7.hSGCB
[0102] Isporučili smo vektor putem injekcije repne vene na 14 SGCB-/- miševa u dozi od 1×10<12>vg ukupne doze (5×10<13>vg/kg) za procenu ekspresije transgena i efektivnosti našeg vektora kada se isporučuje sistemski u dugoročnoj vremenskoj tački od 6 meseci. Miševi su injektirani u dobi od 4 nedelje, a potpuna nekropsija je urađena 6 meseci nakon injektiranja (1 miš je uklonjen u dobi od 1 meseca, a 2 miša su uklonjena u dobi od 4 meseca kao srednje procene ekspresije). Svi gore navedeni skeletni mišići zajedno sa dijafragmom i srcem ekstrahovani su za analizu. Organi su takođe uklonjeni za toksikologiju i analizu biodistribucije. Imunofluorescentno bojenje za ljudski beta-sarkoglikan korišćeno je za određivanje ekspresije hSGCB transgena u 5 mišića udova, i levog i desnog, pored dijafragme i srca 6 KO miševa kojima je data sistemska injekcija hSGCB vektora. Ovi mišići su uključivali TA, gastrocnemius (GAS), quadriceps (QUAD), gluteal (GLUT) (nije prikazano), psoas major (PSOAS) i triceps (TRI) (slika 10). Kvalitativna analiza srčanog tkiva takođe je korišćena za procenu relativnog nivoa ekspresije transgena u srčanom mišiću nakon isporuke.
[0103] Snimljene su četiri 20X slike svakog mišića i određen je procenat hSGCB pozitivnih vlakana za svaku sliku, što je rezultiralo prosečnom procentualnom transdukcijom za svaki mišić sa svakog miša. Rezultati prikazani na slici 10 i slici 11 pokazuju ≥98% transdukcije u svim analiziranim mišićima, uključujući dijafragmu i srce. Miševi sa nedostatkom βsarkoglikana imali su potpuno odsutan protein kada su analizirani imunofluorescencijom. Terapijska doza od 1x10<12>vg rezultirala je prosečno 97,96 ± 0,36% (± SEM) vektorske transdukcije kroz sve skeletne mišiće, uključujući dijafragmu, i približno 95% ili više u srčanom mišiću (podaci nisu prikazani).
Primer 10
Dugotrajna sistemska isporuka ScAAVrh.74.MHCK7.hSGCB kod SGCB-</->miševa [0104] Da bi se nadogradili rezultati jednomesečnog testa potencije opisanog u primeru 9, istražena je dugoročna (6-mesečna) sistemska isporuka kasete β-sarkoglikan transgena sgcb-/-<-/->miševima. Četiri do pet nedelja stari sgcb<-/->miševi su tretirani sa 1x10<12>vg ukupne doze scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB intravenski u repnu venu (n=5). Miševi su nekropsirani 6 meseci nakon inkjektiranja i pokazana je ekspresija hSGCB transgena korišćenjem imunofluorescencije u šest skeletnih mišića, levog i desnog, pored dijafragme i srca svih tretiranih miševa. Analizirani skeletni mišići uključivali su TA, GAS, QUAD, gluteal (GLUT), PSOAS i TRI. Prosečna ekspresija hSGCB koja je rezultat sistemske isporuke kod tretiranih miševa bila je 98,13 ± 0,31% (± SEM) na svim skeletnim mišićima, uključujući dijafragmu, sa ekspresijom u srcu većom od > 95%. Reprezentativne slike su prikazane na slici 12b. Nivoi ekspresije u svakom pojedinačnom tipu mišića u proseku za sve tretirane miševe prikazani su u tabeli 2. Western blot na slici 12C potvrđuje ekspresiju transgena u svim mišićima. Vrednosti ekspresije u tabeli 2 prikazane su za različite mišiće kao prosek levog i desnog mišića kod sistemski injektiranih miševa (n=5). Vrednosti označene kao prosek ± SEM. Pored toga, kvantifikacija ekspresije hSGCB transgena u srcima tretiranih miševa putem Western blot i denzitometrije ukazuje na prekomernu ekspresiju hSGCB do 72,0% iznad nivoa ekspresije BL6 WT (slika 12d), u korelaciji sa visokim nivoima kvantifikovanim u skeletnim mišićima.
Tabela 2. Imunofluorescentna ekspresija β-sarkoglikana
[0105] Važna karakteristika sgcb<-/->mišića opisana u prethodnim izveštajima (Araishiet al, Hum. Mol. Genet 8: 1589-98, 1999, Durbeej et al., Mol. Cell.5: 141-51, 2000) i ilustrovana bojenjem GAS i dijafragme hematoksilinom i eozinom na slici 13a je teška distrofična patologija koja uključuje centralnu nukleaciju, nekrozu, inflamatornu infiltraciju i fibrozu. Transfer gena značajno je poboljšao ovu patologiju, ublažavajući mnoge od ovih distrofičnih karakteristika (slika 13a). Kvantifikacija histoloških parametara pokazala je značajno smanjenje centralne nukleacije u različitim skeletnim mišićima analiziranim kao rezultat transfera gena (slika 13b). Sa očekivanim niskim nivoima centralne nukleacije kod BL6 WT miševa u proseku 1,89 ± 0,39%, kao što je ovde navedeno, uzimajući u obzir sve analizirane mišiće, u proseku 66,85 ± 1,86% centralnih jezgara kod netretiranih sgcb<-/->miševa u poređenju sa 36,30 ± 5,16% kod AAV.MHCK7.hSGCB tretiranih sgcb<-/->mišića (p<0,0001) Tabela 3 u nastavku prikazuje centralni broj jezgara i prečnike vlakana date za različite mišiće kao prosek (±SEM) levih i desnih mišića iz BL6 WT, sgcb<-/->i sistemski injektiranih miševa (n=5 po grupi). Važno je napomenuti da se najznačajniji talas degeneracije/regeneracije javlja u 3. nedelji u sgcb<-/->mišiću na koji ukazuju centralno postavljena jezgra. Životinje su tretirane nakon ove povrede i stoga se nije očekivalo potpuno preokretanje centralizovanih jezgara. Dublja analiza histopatologije mišića otkrila je normalizaciju raspodele veličine vlakana praćenu povećanjem prosečnog prečnika vlakana kod obolelih miševa tretiranih vektorom u poređenju sa netretiranim sgcb-/- miševima u sva tri ispitivana mišića (GAS: sgcb-/-netretirani - 28,37 ± 0,23µm naspram AAV.hSGCB tretirani - 36,04 ± 0,17µm; p<0,0001) (PSOAS: sgcb-/- netretirani - 24,75 ± 0,23µm naspram AAV.hSGCB tretirani - 38,43 ± 0,28µm; p<0,0001) (tri: sgcb-</- netretirani ->28 ± 0,31µm naspram AAV.hSGCB tretirani - 35,56 ± 0,22µm; p<0,0001) (slike 13c, 13d, tabela 3).
Tabela 3 Analiza procentualne centralne nukleacije
[0106] Zbog značajne uloge fibroze u patogenezi LGMD2E i efikasnosti terapija, bilo je ključno pokazati istu efektivnost u smanjenju fibroze. To je testerisano sa lokalizovanim transferom gena β-sarkoglikana, sada nakon sistemske isporuke scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB. Koristeći Picrosirius crvenu boju za kolagen tipa I i III, analizirali smo nivoe kolagena u gastrocnemius i mišićima dijafragme kod 7 meseci starih BL6 WT miševa (n=4), netretiranih sgcb<-/->miševa (n=4) i tretiranih sgcb<-/->miševa (n=5) 6 meseci nakon injektiranja. Tretirani mišići su pokazali značajno manje taloženja kolagena u poređenju sa netretiranim sgcb<-/->mišićima (slika 14a). Vektorski transdukovani GAS mišić sadržao je 17,55 ± 0,59% kolagena u poređenju sa 43,55 ± 3,33% kolagena u netretiranim sgcb-/- GAS mišićima (p<0,0001). Dalje, tretirani mišić dijafragme pokazao je 21,67 ± 1,09% kolagena u poređenju sa 44,05 ± 2,39% u netretiranom mišiću sgcb-/- (p<0,0001) (slika 14b) koji pokazuje sposobnost transfera gena hSGCB da ublaži fibroznu komponentu fenotipa LGMD2E.
Primer 11
Vraćanje funkcije dijafragme nakon sistemske isporuke
[0107] Da bismo utvrdili da li transfer gena hSGCB može poboljšati funkciju mišića, procenili smo funkcionalna svojstva mišića dijafragme kod SGCB<-/->miševa tretiranih sa scAAVrh.74. MHCK7.hSCGB (videti Griffin et al. za metode). Prvo je utvrđen funkcionalni deficit u dijafragmama SGCB-/- miševa. KO dijafragme su pokazale 50,9% smanjenu specifičnu izlaznu silu (116,24 mN/mm<2>) u poređenju sa BL6 WT miševima (116,24 mN/mm<2>naspram 236,67 mN/mm<2>) i veći gubitak sile nakon rigoroznog protokola zamora (23% gubitak u SGCB<-/->; 7% gubitak u BL6 WT). Isporuka repne vene scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB rezultira skoro 100% ekspresijom hSGCB u dijafragmi što dovodi do obnavljanja funkcije dijafragme sa specifičnom izlaznom silom poboljšanom na 226,07 mN/mm<2>i većom otpornošću na zamor sa samo 12% gubitka sile (n=5) (slika 15).
Primer 12
Isporuka scAAVrh.74.CMV.miR29C smanjuje fibrozu kod SGCB-/- miševa
[0108] Ekstenzivna fibroza koju smo identifikovali u skeletnom mišiću (slike 2, 4 i 6), kao i u srcu i dijafragmi (slika 8) pokazala je potrebu za tretman taloženja kolagena (fibroze) u LGMD2E. Prethodno smo utvrdili da je Mir29C najteže smanjen (Mir29A, B i C) kod Duchenne mišićne distrofije. Pretpostavio je da će Mir-29C takođe biti smanjen kod miševa sa nedostatkom beta-sarkoglikana (model miša za LGMD2E). Dokazali smo da je to tačno (slika 15). Nivoi Mir29C su smanjeni, nivoi fibroze (kolagena) su povećani, a tri komponente fibroze (Co1A, Col3A i Fbn) su povećane na nivou RNK. Da bi se testiralo da li možemo sprečiti fibrozu sa Mir29C, vektor genske terapije scrAAVrh.74.CMV.miR29c (3 x 10<11>vgs) je injektiran u mišić tibialis anterior 4 nedelje starih SGCB-/- miševa (n=5).
ScrAAVrh.74.CMV.miR29c je prikazan na slici 16 i opisan u američkoj privremenoj primeni br. 62/323,163. Nakon 2 meseca tretmana sa AAVrh.74.CMV.miR29C, TA mišići su sakupljeni od tretiranih i kontrolnih grupa SGCB -/-miševa i WT miševa i analizirani na fibrozu (nivo kolagena) (n=5 po grupi). Korišćenjem sirius crvenog bojenja i kvantifikacije, nivo kolagena je smanjen nakon tretmana (videti sliku 17). Nivoi transkripta Col1A, Col3A i Fbn su normalizovani i veličina mišićnih vlakana je povećana. Reprezentativne slike skeniranih punih preseka netretiranih i AAVrh.74.CMV.miR29C tretirani mišići tibialis anterior obojeni Sirius crvenim bojama koje sadrže kolagen 1 i 3 prikazani su na slici 118. Ovo pokazuje dokaz principa da scAAVrh.74.CMV.miR29C smanjuje fibrozu kod SGCB-/-miševa i može se koristiti u kombinaciji sa zamenom gena sa scAAVrh.74.tMCK.hSGCB ili scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB.
Primer 13
Intravenski transfer gena kod SGCB-/- miševa smanjuju kifoskoliozu torakalne kičme [0109] Degeneracija mišića trupa usled pogoršanja histopatologije kod pacijenata koji pate od LGMD2E može se pripisati kifozi. Kifoskolioza torakalne kičme usled slabljenja mišića koji podržavaju kičmeni stub može dovesti do pomeranja dijafragme napred, što dodatno ugrožava kapacitet pluća i funkciju dijafragme. Kao rezultat težine fenotipa kod sgcb<-/->miša sa bruto anatomskim izgledom kifoskolioze, korišćena je rentgenska radiografija celog tela za određivanje stepena kifoze kod 7-mesečnih BL6 WT miševa (n=6), sgcb<-/->miševa (n=6), i tretiranih sgcb-1- miševa 6 meseci nakon injekcije (n=6). Rezultat kifotičkog indeksa (KI) određuje kvantitativnu vrednost za nivo kifoskolioze (Laws et al. J. Appl. Physiol.97: 1970-7, 2004). Kao što je prikazano na WT panelu na slici 19a, rezultat KI je odnos dužine od prednjeg do zadnjeg uda u poređenju sa dužinom srednje linije do vrha zakrivljenosti kičme. Dok su sgcb<-/->miševi prisutni sa ozbiljno zakrivljenom kičmom i nižim rezultatom KI od 3,64 ± 0,16 (n=6), BL6 WT miševi imaju značajno ravniju kičmu što rezultira višim rezultatom KI od 6,01 ± 0,41 (n=6) (p<0,01) (slika 19b). Tretirani sgcb<-/->miševi pokazuju značajno smanjenje stepena kifoze u kičmi uz povećanje KI rezultata na 5,39 ± 0,58 (n=6) (p<0,05) (slika 19b). Ovi podaci ukazuju da je intravenska isporuka scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB korisna za celokupni integritet kičme i može ublažiti kifozu i kontrakture zglobova prisutne u bolesti. Ovi podaci su pokazali ublažavanje kifoze i povećanu fizičku aktivnost kod sgcb<-/->miševa nakon sistemske isporuke rAAV vektora predmetnog pronalaska. Ovi podaci su dodatni dokaz da genska terapija predmetnog pronalaska poboljšava kvalitet života pacijenata sa LGMD2E.
Primer 14
Procena kardiomiopatije
[0110] Histološko razaranje mišića udova i dijafragme se takođe otkriva u miokardu 7-mesečnih sgcb<-/->miševa, posebno sa prisustvom nekroze i fibroze miokarda, što je vidljivo po H&E i picrosirius crvenom bojenju (slika 20a). Prezentacija oslabljene srčane funkcije često u vidu dilatirane kardiomiopatije sa smanjenim srčanim volumenom i nižom ejekcionom frakcijom (Semplicini etal., Neurology 84: 1772-81, 2015, Fanin et al., Neuromuskularni poremećaj 13:303-9, 2003). Snimanje magnetnom rezonancom srca (MR), korišćeno je za procenu nekoliko funkcionalnih parametara srca kako bi se utvrdili funkcionalni deficiti u miokardu sgcb<-/->miševa u poređenju sa BL6 WT miševima koji se koriste kao mera funkcionalnog ishoda. Snimanje kontrolnih miševa u dobi od 7 meseci pokazalo je smanjenje od 29,4% udarnog volumena sa 0,041 ± 0,0019 mL u sgcb<-/->srcima do 0,029 ± 0,0024mL u BL6 WT srcima (p<0,01), 31,7% niži minutni volumen sa 14,70 ± 0,74mL/min u sgcb<-/->srcima do 12,72 ± 0,97mL/min u BL6 WT srcima, i konačno 14,3% nižu ejekcionu frakciju, 66,21 ± 3,83% u sgcb<-/->srcima u poređenji sa 76,90 ± 1,67% u BL6 WT srcima (p<0,05) (slika 20b). To ukazuje na skroman pad ukupne srčane funkcije u ovom uzrastu i trend razvoja kardiomiopatije. Vraćanje ekspresije hSGCB u srcima KO miševa kroz sistemsku isporuku delimično je korigovalo ove deficite, poboljšavajući udarni volumen na 0,032 ± 0,0027 mL, minutni volumen srca na 14,66 ± 0,75mL/min i ejekcionu frakciju na 68,16 ± 2,31% (slika 19b). Kao korelacija sa histološkim i funkcionalnim poremećajem srčanog tkiva koji je ovde prijavljen, Western blot test za ekspresiju srčanog troponina I (cTrpI), važnog regulatora srčane funkcije i indikatora (biomarkera) srčanog oštećenja, smanjen je kod obolelih sgcb<-/->srca na 60,38% nivoa viđenih kod BL6 WT miševa (slika 20C). Nivoi cTrpI se vraćaju nakon tretmana na nivo od 35,80% ekspresije koja se vidi u srcima WT (slika 20d).
Primer 15
Funkcionalna restauracija u mišiću dijafragme sa povećanjem fizičke aktivnosti [0111] Značajno učešće disfunkcije dijafragme i respiratorne insuficijencije u funkcionalnoj koristi LGMD2E za dijafragmu od suštinskog značaja za validaciju kliničke sistemske terapije. Korišćenjem ex vivo eksperimentalnog protokola na trakama uzetim iz mišića dijafragme, procenjeno je da li obnavljanje β-sarkoglikana pruža funkcionalnu korist ovom ozbiljno kompromitovanom mišiću. U skladu sa značajnom histopatologijom identifikovanom kod 7 meseci starih dijafragmi obolelih miševa, sgcb<-/>-dijafragme (n=4) su pokazale funkcionalni deficit sa značajnim (51%) smanjenjem specifične izlazne sile u odnosu na BL6 WT miševe (n=5) (116,24 ± 10,49mN/mm2 naspram 236,67 ±15,87mN/mm<2>, respektivno, p<0,001), kao i većim gubitkom sile od one proizvedene nakon prve kontrakcije nakon rigoroznog protokola zamora (23 ± 1,0% gubitak kod sgcb<-/->; 7,0 ± 3,0% gubitak kod BL6 WT, p<0,05) (slika 6a). Šest meseci nakon isporuke repne vene scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB, uočeno je dramatično poboljšanje specifične izlazne sile. Specifična izlazna sila povećana je na 226,07 ± 27,12mN/mm<2>(n=5) (p<0,05 u poređenju sa sgcb<-/->) i primećena je bolja zaštita mišića od ponovljenog zamora sa samo 12,0 ± 4,0% gubitka sile (p<0,05 u poređenju sa sgcb<-/->) (slika 21a). Sve u svemu, ovi podaci podržavaju naše prethodne nalaze u TA mišiću i pokazuju da obnavljanje β-sarkoglikana obezbeđuje funkcionalni oporavak u mišiću dijafragme.
[0112] Simptomi povećanog zamora i smanjene ukupne aktivnosti često se prijavljuju kod mnogih neuromuskularnih bolesti, delimično pripisanih pojavi kifoze. Kao rezultat toga i uzimajući u obzir fenotip LGMD2E, pretpostavljeno je da će KO miševi prirodno biti manje aktivni u poređenju sa zdravim WT miševima, a štaviše, sistemska isporuka rAAV.MHCK7.hSGCB sgcb<-/->miševima rezultirala bi fizički aktivnijim miševima. Da bi se testirala ova hipoteza i dodatne potencijalne funkcionalne koristi od transfera gena, lasersko praćenje protokola aktivnosti kaveza na otvorenom terenu slično onom opisanom u Kobayashi et al., Nature 456: 511-5, 2008 i Beastrom et al., Am. J. Pathol.179: 2464-74, 2011, izvršeno je na svim grupama miševa. Grafikoni na slici 21b prikazuju značajno smanjenje (55,5%) KO miševa u poređenju sa WT, kako u ukupnoj ambulaciji (horizontalno kretanje u x i y ravni) tako i u vertikalnom podizanju na zadnje udove. Prosečan broj horizontalnih prekida ambulatornog laserskog snopa tokom perioda od 1 sata kod WT miševa bio je 7355 ± 400,8 (n=6) u poređenju sa 3271 ± 483,8 (n=6) kod KO miševa (p<0,0001). Dalje, prosečan broj prekida snopa kod vertikalnog podizanja zabeležen kod WT miševa bio je 626,7 ± 53,76 za razliku od 264,5 ± 63,36 kod KO miševa (p<0,01) (slika 21b). U skladu sa početnom hipotezom, miševi tretirani rAAV.MHCK7.hSGCB bili su vidno aktivniji u poređenju sa KO što je ilustrovano u kvantifikaciji aktivnosti, gde se ukupna ambulacija povećala za 22% na 5143 ± 293,2 prekida snopa (p<0,05), a vertikalno podizanje na zadnje udove dramatično se povećalo za 77% na 615,3 ± 95,93 prekida snopa (p<0,05) kod tretiranih miševa (n=6) (slika 21b).
Primer 16
Analiza bezbednosti i biodistribucije rAAVrh.74.MHCK7.hSGCB.
[0113] Potencijalni problemi toksičnosti ili bezbednosti hSGCB genske terapije procenjeni su kod sgcb-- miševa 6 meseci nakon sistemske isporuke scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB pri ukupnoj dozi od 1,0x1012 vg (5x1013 vg/kg). Vektorska biodistribucija i vanciljna ekspresija transgena analizirane su na uzorcima tkiva (TA, TRI, dijafragma, srce, gonada, pluća, bubreg, jetra i slezina) od vektorski doziranih sgcb<-/->životinja koristeći qPCR i Western blot, respektivno. Koristeći vektorski specifične setove sondi prajmera, MHCK7.hSGCB vektorski genomi su detektovani na različitim nivoima u svim sakupljenim tkivima. Kao što se i očekivalo, najviši nivoi su uočeni u jetri, kao i skeletnom mišiću i srcu, što ukazuje na to da je testni predmet efikasno isporučen u sve predviđene mišiće vektorski doziranih miševa (slika 22a). Štaviše, Western blot za otkrivanje ekspresije proteina hSGCB potvrdio je funkcionalnost mišićnog specifičnog MHCK7 promotera i ekspresiju transgena ograničenog na srčani i skeletni mišić. Ekspresija proteina beta-sarkoglikana primećena je u različitim količinama u svim uzorcima skeletnih mišića, kao i u uzorcima srca, a što je važno nije otkrivena ni u jednom nemišićnom tkivu (slika 22b), što potkrepljuje činjenica da je poznato da je beta-sarkoglikan protein specifičan za mišiće. Konačno, bojenje hematoksilinom i eozinom izvršeno je na krio presecima mišićnog tkiva i svih organa van lokacije sakupljenih od pet sgcb<-/->miševa zajedno sa pet C57BL6 WT miševa tretiranih sistemski našim vektorom u terapijskoj dozi koja je korišćena u ovoj studiji. Ovi preseci su zatim formalno pregledani zbog toksičnosti od strane veterinarskog patologa i nikakvi neželjeni efekti nisu otkriveni ni u jednom uzorku ni kod jednog miša. Uzeto zajedno, ovi podaci ukazuju na to da su testirane životinje dobro tolerisale ovaj testni artikal.
[0114] Činjenica da su tako visoki nivoi transdukcije u svim mišićima širom tela postignuti bez neželjenih efekata korišćenjem relativno niske doze (1×10<12>vg ukupne doze; 5×10<13>vg/kg) pruža veliku nadu za translaciju na pacijente sa LGMD2E. Iz kliničke perspektive, doza koja se koristi u ovde opisanim eksperimentima je mnogo niža od doze koja se koristi za sistemsku isporuku SMN1 koja izražava AAV terapiju koja se isporučuje bebama sa SMA, koja je trenutno u kliničkom ispitivanju (Mendell et al., Mol. Ther.24: S 190, 2016). Visoko efikasna obnova ekspresije β-sarkoglikana korišćenjem MHCK7 promotera praćenog funkcionalnim koristima je veoma ohrabrujuća na nivoima doziranja koji bi se mogli primeniti klinički, a s obzirom na visoku učestalost učešća srca u nedostatku β-sarkoglikana kod pacijenata sa LGMD2E, sistemska isporuka pruža veliku korist ovim pacijentima.
[0115] Reference:
1 Bonnemann CG, Modi R, Noguchi S, Mizuno Y, Yoshida M, Gussoni E et al. Betasarcoglycan (A3b) mutations cause autosomal recessive muscular dystrophy with loss of the sarcoglycan complex. Nat Genet 1995; 11: 266-273.
2 Moore SA, Shilling CJ, Westra S, Wall C, Wicklund MP, Stolle C et al. Limb-girdle muscular dystrophy in the United States. J Neuropathol Exp Neurol 2006; 65: 995-1003. 3 Araishi K, Sasaoka T, Imamura M, Noguchi S, Hama H, Wakabayashi E et al. Loss of the sarcoglycan complex and sarcospan leads to muscular dystrophy in beta-sarcoglycan-deficient mice. Hum Mol Genet 1999; 8: 1589-1598.
4 Durbeej M, Cohn RD, Hrstka RF, Moore SA, Allamand V, Davidson BL et al. Disruption of the beta-sarcoglycan gene reveals pathogenetic complexity of limb-girdle muscular dystrophy type 2E. Mol Cell 2000; 5: 141-151.
5 Bonnemann CG, Passos-Bueno MR, McNally EM, Vainzof M, de Sa Moreira E, Marie SK et al. Genomic screening for beta-sarcoglycan gene mutations: missense mutations may cause severe limb-girdle muscular dystrophy type 2E (LGMD 2E). Hum Mol Genet 1996; 5: 1953-1961.
6 Angelini C, Fanin M, Freda MP, Duggan DJ, Siciliano G, Hoffman EP. The clinical spectrum of sarcoglycanopathies. Neurology 1999; 52: 176-179.
7 Sandona D, Betto R. Sarcoglycanopathies: molecular pathogenesis and therapeutic prospects. Exp Rev Mol Med 2009; 11: e28.
8 Fanin M, Melacini P, Boito C, Pegoraro E, Angelini C. LGMD2E patients risk developing dilated cardiomyopathy. Neuromusc Disord 2003; 13: 303-309.
9 Sveen ML, Thune JJ, Kober L, Vissing J. Cardiac involvement in patients with limb-girdle muscular dystrophy type 2 and Becker muscular dystrophy. Arch Neurol 2008; 65: 1196-1201.
10 Melacini P, Fanin M, Duggan DJ, Freda MP, Berardinelli A, Danieli GA et al. Heart involvement in muscular dystrophies due to sarcoglycan gene mutations. Muscle Nerve 1999; 22: 473-479.
11 Narayanaswami P, Weiss M, Selcen D, David W, Raynor E, Carter G et al. Evidencebased guideline summary: diagnosis and treatment of limb-girdle and distal dystrophies: report of the guideline development subcommittee of the American Academy of Neurology and the practice issues review panel of the American Association of Neuromuscular & Electrodiagnostic Medicine. Neurology 2014; 83: 1453-1463.
12 Wong-Kisiel LC, Kuntz NL. Two siblings with limb-girdle muscular dystrophy type 2E responsive to deflazacort. Neuromusc Disord 2010; 20: 122-124.
13 Barresi R, Di Blasi C, Negri T, Brugnoni R, Vitali A, Felisari G et al. Disruption of heart sarcoglycan complex and severe cardiomyopathy caused by beta sarcoglycan mutations. J Med Genet 2000; 37: 102-107.
14 Gibertini S, Zanoti S, Savadori P, Curcio M, Saredi S, Salerno F et al. Fibrosis and inflammation are greater in muscles of beta-sarcoglycan-null mouse than mdx mouse. Cell Tissue Res 2014; 356: 427-443.
15 McCarty DM, Fu H, Monahan PE, Toulson CE, Naik P, Samulski RJ. Adeno-associated virus terminal repeat (TR) mutant generates self-complementary vectors to overcome the ratelimiting step to transduction in vivo. Gene Ther 2003; 10: 2112-2118.
16 McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Self-complementary recombinant adenoassociated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther 2001; 8: 1248-1254.
17 Chicoine LG, Rodino-Klapac LR, Shao G, Xu R, Bremer WG, Camboni M et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther 2014; 22: 713-724.
18 Rodino-Klapac LR, Montgomery CL, Bremer WG, Shontz KM, Malik V, Davis N et al. Persistent expression of FLAG-tagged micro dystrophin in nonhuman primates following intramuscular and vascular delivery. Mol Ther 2010; 18: 109-117.
19 Rodino-Klapac LR, Janssen PM, Montgomery CL, Coley BD, Chicoine LG, Clark KR et al. A translational approach for limb vascular delivery of the micro-dystrophin gene without high volume or high pressure for treatment of Duchenne muscular dystrophy. J Transl Med 2007; 5: 45.
20 Wang B, Li J, Fu FH, Chen C, Zhu X, Zhou L et al. Construction and analysis of compact muscle-specific promoters for AAV vectors. Gene Ther 2008; 15: 1489-1499.
21 Chicoine LG, Montgomery CL, Bremer WG, Shontz KM, Griffin DA, Heller KN et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on micro-dystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther 2014; 22: 338-347.
22 Matsuda R, Nishikawa A, Tanaka H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem 1995; 118: 959-964.
23 Straub V, Rafael JA, Chamberlain JS, Campbell KP. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol 1997; 139: 375-385.
24 Mendell JR, Sahenk Z, Malik V, Gomez AM, Flanigan KM, Lowes LP et al. A phase 1/2a follistatin gene therapy trial for becker muscular dystrophy. Mol Ther 2015; 23: 192-201. 25 Dressman D, Araishi K, Imamura M, Sasaoka T, Liu LA, Engvall E et al. Delivery of alpha- and beta-sarcoglycan by recombinant adeno-associated virus: efficient rescue of muscle, but differential toxicity. Hum Gene Ther 2002; 13: 1631-1646.
26 Rodino-Klapac LR, Lee JS, Mulligan RC, Clark KR, Mendell JR. Lack of toxicity of alpha-sarcoglycan overexpression supports clinical gene transfer trial in LGMD2D.
Neurology 2008; 71: 240-247.
27 Shield MA, Haugen HS, Clegg CH, Hauschka SD. E-box sites and a proximal regulatory region of the muscle creatine kinase gene differentially regulate expression in diverse skeletal muscles and cardiac muscle of transgenic mice. Mol Cell Biol 1996; 16: 5058-5068.
28 Rabinowitz JE, Rolling F, Li C, Conrath H, Xiao W, Xiao X et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. J Virol 2002; 76: 791-801.
29 Grieger JC, Choi VW, Samulski RJ. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc 2006; 1: 1412-1428.
30 Clark KR, Liu X, McGrath JP, Johnson PR. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther 1999; 10: 1031-1039.
31 Liu M, Yue Y, Harper SQ, Grange RW, Chamberlain JS, Duan D. Adeno-associated virusmediated microdystrophin expression protects young mdx muscle from contraction-induced injury. Mol Ther 2005; 11: 245-256.
32 Hakim CH, Grange RW, Duan D. The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice. J Appl Physiol 2011; 110: 1656-1663.
33 Wein N, Vulin A, Falzarano MS, Szigyarto CA, Maiti B, Findlay A et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nat Med 2014; 20: 992-1000.

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja kodira βsarkoglikan, pri čemu polinukleotidna sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO.: 1.
2. Rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja kodira βsarkoglikan koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO.: 2.
3. Rekombinantni AAV vektor iz patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu polinukleotidna sekvenca koja kodira β-sarkoglikan obuhvata nukleotidnu sekvencu navedenu u SEQ ID NO.: 1.
4. Rekombinantni AAV vektor iz patentnog zahteva 2, pri čemu polinukleotidna sekvenca kodira β-sarkoglikan SEQ ID NO.: 2.
5. Rekombinantni AAV vektor iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, pri čemu je vektor serotipa AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 ili AAV rh.74.
6. Rekombinantni AAV vektor iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, pri čemu je polinukleotidna sekvenca operativno povezana sa kontrolnim elementom specifičnim za mišić.
7. Rekombinantni AAV vektor iz patentnog zahteva 6, pri čemu je kontrolni element specifičan za mišić skraćeni MCK promoter (tMCK).
8. Rekombinantni AAV vektor iz patentnog zahteva 6, pri čemu je kontrolni element specifičan za mišić promoter MHCK7.
9. Rekombinantni AAV vektor iz bilo kog od patentnih zahteva 1-8 koji se sastoji od nukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO.: 3
10. Rekombinantni AAV vektor iz bilo kog od patentnih zahteva 1-8 koji se sastoji od nukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO.: 5.
11. Kompozicija koja se sastoji od rekombinantnog AAV vektora iz bilo kog od patentnih zahteva 1-10.
12. Kompozicija koja se sastoji od rekombinantnog AAV vektora iz bilo kog od patentnih zahteva 1-10 za upotrebu u smanjenju fibroze kod subjekta kome je to potrebno.
13. Kompozicija koja se sastoji od rekombinantnog AAV vektora iz bilo kog od patentnih zahteva 1-10 za upotrebu u tretmanu β-sarkoglikanopatije kod subjekta kome je to potrebno.
14. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 ili 13, pri čemu subjekt pati od mišićne distrofije, opciono pri čemu je mišićna distrofija mišićna distrofija udovipojas.
15. Kompozicija koja se sastoji od rekombinantnog AAV vektora iz bilo kog od patentnih zahteva 1-10 za upotrebu u tretmanu mišićne distrofije.
16. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patnentih zahteva 12-15, pri čemu je subjekt ljudsko biće.
17. Kompozicija koja se sastoji od rekombinantnog AAV vektora iz bilo kog od patentnih zahteva 1-10 za upotrebu u tretmanu mišićne distrofije, opciono pri čemu je mišićna distrofija distrofija mišića udovi-pojas (LGMD), i opciono pri čemu je LGMD LGMD2E.
18. Kompozicija za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 12-17, ili kompozicija iz patentnog zahteva 11, koji se dalje sastoji od drugog rekombinantnog AAV vektora koji se sastoji od nukleotidne sekvence miR-29.
19. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, ili kompozicija prema patentnom zahtevu 11, pri čemu drugi rekombinantni AAV vektor sadrži nukleotidnu sekvencu navedenu u SEQ ID NO.: 9 ili nukleotidnu sekvencu navedenu u SEQ ID NO.: 8.
20. Kompozicija za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 12-19, pri čemu je kompozicija formulisana za intramuskularnu injekciju ili intravensku injekciju i/ili formulisana za sistemsku primenu.
21. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, ili kompozicija prema patentnom zahtevu 20, pri čemu je sistemska primena parenteralna primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom.
RS20240504A 2016-04-15 2017-04-14 Vektor adeno-asociranog virusa za isporuku β-sarkoglikana i mikrorna-29 i tretman mišićne distrofije RS65490B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662323333P 2016-04-15 2016-04-15
US201662433548P 2016-12-13 2016-12-13
EP17783207.8A EP3442600B1 (en) 2016-04-15 2017-04-14 Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and microrna-29 and the treatment of muscular dystrophy
PCT/US2017/027583 WO2017180976A1 (en) 2016-04-15 2017-04-14 Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and microrna-29 and the treatment of muscular dystrophy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65490B1 true RS65490B1 (sr) 2024-05-31

Family

ID=60042261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240504A RS65490B1 (sr) 2016-04-15 2017-04-14 Vektor adeno-asociranog virusa za isporuku β-sarkoglikana i mikrorna-29 i tretman mišićne distrofije

Country Status (28)

Country Link
US (3) US11358993B2 (sr)
EP (2) EP3442600B1 (sr)
JP (2) JP7079733B2 (sr)
KR (1) KR102502091B1 (sr)
CN (2) CN117384964A (sr)
AU (2) AU2017250756B2 (sr)
BR (1) BR112018071167A2 (sr)
CA (1) CA3021057A1 (sr)
CO (1) CO2018012082A2 (sr)
DK (1) DK3442600T5 (sr)
ES (1) ES2979174T3 (sr)
FI (1) FI3442600T3 (sr)
HR (1) HRP20240580T1 (sr)
HU (1) HUE066442T2 (sr)
IL (1) IL262262B2 (sr)
LT (1) LT3442600T (sr)
MA (1) MA44681A (sr)
MX (2) MX391208B (sr)
MY (1) MY195439A (sr)
PL (1) PL3442600T3 (sr)
PT (1) PT3442600T (sr)
RS (1) RS65490B1 (sr)
SA (1) SA518400245B1 (sr)
SG (1) SG11201809029RA (sr)
SI (1) SI3442600T1 (sr)
SM (1) SMT202400169T1 (sr)
WO (1) WO2017180976A1 (sr)
ZA (1) ZA201806863B (sr)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3597741A1 (en) 2012-04-27 2020-01-22 Duke University Genetic correction of mutated genes
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
EP3020403A1 (en) 2014-11-14 2016-05-18 Universitat de Valéncia Compounds for the treatment of myotonic dystrophy
JP6929791B2 (ja) 2015-02-09 2021-09-01 デューク ユニバーシティ エピゲノム編集のための組成物および方法
US11970710B2 (en) 2015-10-13 2024-04-30 Duke University Genome engineering with Type I CRISPR systems in eukaryotic cells
US11617783B2 (en) 2015-11-16 2023-04-04 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Repairing a mutant human titin gene using CRISPR technology
KR102787119B1 (ko) 2015-11-30 2025-03-27 듀크 유니버시티 유전자 편집에 의한 인간 디스트로핀 유전자의 교정을 위한 치료용 표적 및 사용 방법
US20190127713A1 (en) 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
PL3442600T3 (pl) * 2016-04-15 2024-07-08 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Dostarczanie za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem wektora b- sarkoglikanu i mikroRNA-29 oraz leczenie dystrofii mięśniowej
JP7153562B2 (ja) * 2016-04-15 2022-10-14 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 筋ジストロフィーを治療するためのマイクロｒｎａ－２９のアデノ随伴ウイルスベクター送達
EP4275747A3 (en) 2016-07-19 2024-01-24 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
WO2019012336A2 (en) 2017-03-17 2019-01-17 Newcastle University ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR DELIVERY OF A MICRO-DYSTROPHIN FRAGMENT FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY
CN111433367A (zh) * 2017-10-20 2020-07-17 全国儿童医院研究所 Nt-3基因疗法的方法和材料
US12509492B2 (en) 2018-01-19 2025-12-30 Duke University Genome engineering with CRISPR-Cas systems in eukaryotes
AU2019216257B2 (en) 2018-01-31 2025-11-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Gene therapy for limb-girdle muscular dystrophy type 2C
EP4591888A3 (en) * 2018-06-18 2026-01-21 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of muscle specific micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
US12391928B2 (en) * 2018-06-29 2025-08-19 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2A
EP3598978B1 (en) 2018-07-26 2024-05-29 EXOFIX S.r.l. Fibroadipogenic progenitor-derived exosomes for regeneration of dystrophic muscles
US20220119489A1 (en) * 2019-01-25 2022-04-21 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating muscular dystrophy and related disorders
CA3146364A1 (en) * 2019-02-02 2020-08-06 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education One-step gene therapy for duchenne muscular dystrophy via gene replacement and anti-inflammation
CN113766935A (zh) 2019-02-26 2021-12-07 全国儿童医院研究所 β-肌聚糖的腺相关病毒载体递送和肌营养不良症的治疗
SI4017871T1 (sl) * 2019-08-21 2024-06-28 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Dostava alfa-sarkoglikana z adeno povezanim virusnim vektorjem in zdravljenje mišične distrofije
US20230040544A1 (en) * 2019-12-16 2023-02-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for restoring and maintaining the dystrophin-associated protein complex (dapc)
WO2021255245A2 (en) * 2020-06-19 2021-12-23 Genethon Gene therapy expression system allowing an adequate expression in the muscles and in the heart of sgcg
EP4219726A1 (en) 2021-10-15 2023-08-02 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Self-complementary adeno-associated virus vector and its use in treatment of muscular dystrophy
EP4544051A2 (en) 2022-06-24 2025-04-30 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
WO2025132132A1 (en) 2023-12-18 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Skeletal muscle-specific promoters
CN118045206B (zh) * 2024-04-12 2024-07-05 四川至善唯新生物科技有限公司 一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
WO1995013392A1 (en) 1993-11-09 1995-05-18 Medical College Of Ohio Stable cell lines capable of expressing the adeno-associated virus replication gene
DE69433592T2 (de) 1993-11-09 2005-02-10 Targeted Genetics Corp., Seattle Die erzielung hoher titer des rekombinanten aav-vektors
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
EP0796339A1 (en) 1994-12-06 1997-09-24 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
AU722196B2 (en) 1995-08-30 2000-07-27 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and AAV
CA2230758A1 (en) 1995-09-08 1997-03-13 Genzyme Corporation Improved aav vectors for gene therapy
US5672694A (en) * 1995-10-24 1997-09-30 University Of Iowa Research Foundation β-sarcoglycan nucleic acid sequence, and nucleic acid probes
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
CN1233291A (zh) 1996-09-06 1999-10-27 宾西法尼亚大学托管会 重组腺伴随病毒定向基因治疗的方法
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
WO1999011764A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
JP4520569B2 (ja) 2000-02-18 2010-08-04 照彦 豊岡 拡張型心筋症の遺伝子治療剤
JP2004514407A (ja) 2000-04-28 2004-05-20 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 異種キャプシド中にシュードタイピングされたａａｖ５キャプシドおよびａａｖ５ベクターを含む組換えａａｖベクター
WO2002053703A2 (en) 2001-01-05 2002-07-11 Children's Hospital, Inc. Aav2 vectors and methods
US20040126762A1 (en) 2002-12-17 2004-07-01 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer
US7858367B2 (en) 2002-04-30 2010-12-28 Duke University Viral vectors and methods for producing and using the same
US20030225260A1 (en) 2002-04-30 2003-12-04 Snyder Richard O. Production of recombinant AAV virions
US7883858B2 (en) 2005-01-27 2011-02-08 Institute For Systems Biology Methods for identifying and monitoring drug side effects
AU2006304605A1 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
WO2008021290A2 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
WO2008088895A2 (en) 2007-01-18 2008-07-24 University Of Missouri-Columbia Synthetic mini/micro-dystrophin genes to restore nnos to the sarcolemma
DK2203173T3 (en) 2007-10-26 2016-02-29 Academisch Ziekenhuis Leiden Materials and methods for prevention of muscle diseases
US8632764B2 (en) 2008-04-30 2014-01-21 University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
US8236557B2 (en) 2008-05-28 2012-08-07 University Of Missouri-Columbia Hybrid-AAV vectors to deliver large gene expression cassette
US8729041B2 (en) 2008-12-03 2014-05-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating hepatic neoplasia
WO2013075008A1 (en) 2011-11-16 2013-05-23 University Of Florida Research Foundation Inc. Aav dual vector systems for gene therapy
US9434928B2 (en) 2011-11-23 2016-09-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
WO2013123503A1 (en) * 2012-02-17 2013-08-22 The Children's Hospital Of Philadelphia Aav vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues
EP2834259A4 (en) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
DK2892617T3 (en) * 2012-09-06 2018-09-03 Univ Chicago ANTISENSE POLYNUCLEOTIDES FOR INDUCTION OF EXON SKIPPING AND PROCEDURES FOR TREATING DYSTROPHIES
US9624282B2 (en) 2012-11-26 2017-04-18 The Curators Of The University Of Missouri Microdystrophin peptides and methods for treating muscular dystrophy using the same
FR3004463A1 (fr) * 2013-04-11 2014-10-17 Genethon Systeme d'expression pour une therapie genique selective
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
WO2015110449A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 Vrije Universiteit Brussel Muscle-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
EP2960336A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Genethon Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
PL3442600T3 (pl) * 2016-04-15 2024-07-08 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Dostarczanie za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem wektora b- sarkoglikanu i mikroRNA-29 oraz leczenie dystrofii mięśniowej
JP2023530974A (ja) * 2020-06-15 2023-07-20 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 筋ジストロフィーのためのアデノ随伴ウイルスベクター送達

Also Published As

Publication number Publication date
JP7079733B2 (ja) 2022-06-02
ZA201806863B (en) 2019-12-18
MY195439A (en) 2023-01-21
EP3442600A1 (en) 2019-02-20
HUE066442T2 (hu) 2024-08-28
AU2021203044A1 (en) 2021-06-10
NZ747137A (en) 2025-06-27
EP4407035A3 (en) 2024-10-30
ES2979174T3 (es) 2024-09-24
HRP20240580T1 (hr) 2024-07-19
EP4407035A2 (en) 2024-07-31
CN109121395A (zh) 2019-01-01
MX391208B (es) 2025-03-21
IL262262B1 (en) 2023-06-01
KR102502091B1 (ko) 2023-02-20
AU2017250756B2 (en) 2021-04-08
EP3442600B1 (en) 2024-03-13
FI3442600T3 (fi) 2024-05-14
DK3442600T3 (da) 2024-05-13
LT3442600T (lt) 2024-05-27
PT3442600T (pt) 2024-05-09
US20240182533A1 (en) 2024-06-06
SI3442600T1 (sl) 2024-08-30
JP7390426B2 (ja) 2023-12-01
SA518400245B1 (ar) 2022-11-25
BR112018071167A2 (pt) 2019-02-05
IL262262B2 (en) 2023-10-01
IL262262A (en) 2018-11-29
US20220251156A1 (en) 2022-08-11
JP2019513399A (ja) 2019-05-30
MA44681A (fr) 2019-02-20
MX2018012605A (es) 2019-07-04
SG11201809029RA (en) 2018-11-29
SMT202400169T1 (it) 2024-07-09
AU2017250756A1 (en) 2018-11-01
JP2022084940A (ja) 2022-06-07
KR20180137511A (ko) 2018-12-27
DK3442600T5 (da) 2024-09-16
CN117384964A (zh) 2024-01-12
PL3442600T3 (pl) 2024-07-08
US11358993B2 (en) 2022-06-14
EP3442600A4 (en) 2019-10-09
CO2018012082A2 (es) 2019-02-08
KR102502091B9 (ko) 2023-04-17
MX2022003857A (es) 2022-05-26
CN109121395B (zh) 2022-08-09
AU2021203044B2 (en) 2023-02-09
WO2017180976A1 (en) 2017-10-19
CA3021057A1 (en) 2017-10-19
US20190202880A1 (en) 2019-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240182533A1 (en) Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and microrna-29 and the treatment of muscular dystrophy
US20230001015A1 (en) Adeno-Associated Virus Vector Delivery of Microrna-29 to Treat Muscular Dystrophy
ES2978666T3 (es) Suministro de alfa-sarcoglicano por vector de virus adenoasociado y tratamiento de la distrofia muscular
US12377170B2 (en) Adeno-associated virus vector delivery of β-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
CN110997923A (zh) 腺相关病毒载体递送肌肉特异性微肌营养不良蛋白以治疗肌营养不良症
AU2020408225A1 (en) Optimized gene therapy for targeting muscle in muscle diseases
US20230139985A1 (en) Self-Complementary Adeno-Associated Virus Vector and its Use in Treatment of Muscular Dystrophy
HK40002237B (en) Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and microrna-29 and the treatment of muscular dystrophy
HK40002237A (en) Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and microrna-29 and the treatment of muscular dystrophy
EA044609B1 (ru) Доставка бета-саркогликана и микрорнк-29 вектором на основе аденоассоциированного вируса и лечение мышечной дистрофии
HK40115222A (zh) 腺相关病毒载体递送肌肉特异性微肌营养不良蛋白以治疗肌营养不良症