JP2000504931A

JP2000504931A - ウトロピン遺伝子の発現

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Publication number: JP2000504931A
Application number: JP09522591A
Authority: JP
Inventors: ティンスレー，ジョナソン，マーク; デイビス，ケイ，エリザベス
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1995-12-19
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 2000-04-25
Also published as: WO1997022696A1; DE69629586D1; EP0868511B1; DE69629586T2; AU724525B2; ATE247710T1; EP0868511A1; US6518413B1; ES2205070T3; AU1164497A; GB9622174D0; DK0868511T3

Abstract

(57)【要約】ウトロピン機能を有するポリペプチドが発現され得る核酸、特にミニ−遺伝子及びキメラ構造体が供給される。発現は、動物モデルにおいてジストロフィー筋肉表現型の重度を有意に減じ、これは筋ジストロフィーの処置に有用であることを示す。核酸及びコードされたポリペプチドはまた、アクチン及び／又はジストロピンタンパク質複合体に結合するウトロピンを変性するための物質についてのスクリーニングにおいても有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ウトロピン遺伝子の発現本発明は一般的に、ウトロピン（utrophin）機能を有するポリペプチドを発現させ得る核酸、特にミニ−遺伝子及びキメラ構造体の提供に関する。ウトロピントランスジーンの発現は、動物モデルにおいてジストロフィー筋肉表現型の重症度を有意に減じる。重度の筋消耗障害、Duchenne筋ジストロフィー(DMD)及び低い消耗性のBecker 筋ジストロフィー(BMD)は、ジストロピン（dystrophin）遺伝子における突然変異によるものである。ジストロピンは、筋細胞膜、神経筋接合部(NMJ)及び筋鍵接合部(MTJ)の細胞質表面に位置する大きな細胞骨格タンパク質である。前記タンパク質は次の４つのドメインから構成される：アクチン−結合ドメイン（アクチンを結合することがインビトロで示されている）、３個のらせん形反復体を含む棒状ドメイン、システインに富む（CR）ドメイン、及びカルボキシ−末端（CT ）ドメイン。CRCTの大部分は、筋細胞膜にわたる、タンパク質及び糖タンパク質の複合体（ジストロピンタンパク質複合体、DPCと呼ばれる）に結合する。この複合体は、細胞骨格シントロピン及びジストロブレビン、トランスメンブラン、 β−ジストログリカン、α−，β−δ−，γ−サルコグリカン及び細胞外α−ジストログリカンから成る。DPCは、細胞外マトリックスにおけるラミニン−α２（メロシン）に、及び細胞内のジストロピンを通してアクチン細胞骨格に結合する。ジストロピン機能の欠失、又は障害によるDPCの統合の分解は、筋肉退化及びDMD表現型を導びく。ジストロピンの構造及びDPC内のタンパク質相互作用は最近、総説されている〔１，２，３〕。 DMDの遺伝子療法のために採用され得る種々のアプローチが存在する。それらは、筋芽細胞トランスファー、レトロウィルス感染、アデノウィルス感染、及びプラスミドDNAの直接的な注入を包含する。ほとんどの場合、その実験に使用されるジストロピン遺伝子は、完全な大きさのタンパク質の大きさの約半分が切断されたタンパク質を生成する。このジストロピンミニ遺伝子は、ひじょうに軽い Becker患者において同定される天然の突然変異に基づいてモデル化された〔４〕。この切断されたミニ遺伝子のクローン化されたバージョンは、ジストロピン欠失mdxマウスにおいて病理学的表現型を逆転することができ〔５，６，７〕、そしてウィルスベクターによりmdx筋肉に供給される場合、制限された成功をもたらした〔８，９，10〕。いくらかの進歩は、モデルシステムとしてmdxマウスを用いて、それらの個々の分野においてなされているが、ジストロピンを陽性にする筋肉細胞の数、遺伝子の発現のレベル、及び発現の期間に関する問題が存在する〔11〕。取り組まれるべきもう１つの問題は、免疫学的不耐性のために、ジストロピンを発現する細胞の拒絶であり、すなわちそれらの細胞内のジストロピンが、ほとんどのDMD患者がジストロピンを決っして発現していない場合、宿主免疫系に対して外来性になるであろう〔12，13〕。それらの問題のいくつかを回避するためには、関連するタンパク質、すなわちウトロピンを用いてジシトロピン損失を補足する可能性が調査された。ウトロピンは、染色体6q24上に位置する遺伝子によりコードされる395kDaのタンパク質であり、そしてジストロピンに対して強い配列類似性を有することが示されている〔14〕。ジストロピン及びウトロピンのアクチン結合ドメインは85％の類似性を有し、そしてＤPC結合領域は88％の類似性を有する。それらのドメインの両者は、インビトロで予測されるように機能することが示されている。その構造及び可能性あるタンパク質の相互作用は、総説に詳細に記載されている〔１，２，３〕。ウトロピンが筋細胞膜に局在化することができることを示す実質的な一連の証拠が存在する。正常な胎児の筋肉成長の間、それぞれヒト及びマウスにおける18 週及び20日間の妊娠まで、筋細胞膜に局在化する、高められたウトロピン発現が存在する。この時期の後、ウトロピン筋細胞膜染色が、ウトロピンがNMJ及びMTJ にほとんど独占的に局在化する出生の直前、有意に低い成人レベルまで一定して低下する〔15，16，17〕。ウトロピン発現の低下は、ジストロピンの高められた発現と同時発生する〔17〕。多くの研究は、ウトロピンがDMD及びBMD患者における筋細胞膜に結合されていることを示している。しかしながら、筋細胞膜に局在化されるウトロピンのレベルは、報告ごとに異なっている〔18，19，20，21〕。他のいくつかの非Xp21筋障害においては、ウトロピン及びジストロピンは、成人の骨格筋の筋細胞膜に同時に結合されている〔22〕。高レベルのウトロピンが、ジストロピン欠失の結果から筋肉を保護することができる。Matsumaraなど．〔23〕は、mdxマウスからの精製された膜がウトロピン及びDPCの複合体を含むことを示した。それらのマウスからの四頭筋（壊死を示す）がイムノブロットにより分析される場合、ウトロピンのレベルはほぼ同じに存続したが、しかしながら、α−ジストログリカンのレベルは激的に減じられた。心筋（病理学を示さない）においては、ウトロピンのレベルは４倍、高められ、そしてα−ジストログリカンの損失は存在しなかった。また、病理学を有さない他のmdx小内径骨格筋（眼球外及び足指）の免疫細胞学的分析は、高められたウトロピン発現及び通常レベルのα−サルコグリカンを示す。この結果は、高められたレベルのウトロピンが、筋細胞膜でDPC（又は抗原的に関連する複合体）と相互作用し、そして前記複合体の損失を妨げ、従ってそれらの細胞の構造体は正常のまま存続することを示す。mdxマウスにおいては、筋肉におけるウトロピンレベルは、正常なマウスと比較して、生後すぐに高められたまま存続し；しかしながら、ウトロピンレベルが成人レベル（生後、約１週目）に低下するとすぐに、筋繊維壊死の最初の徴候が検出される〔15，16〕。従って、ある環境下で、ウトロピンは、たぶんシストロピン、すなわちアクチン及びDPCと同じ結合部位で筋細胞膜に局在化することができる。ウトロピンの発現が十分に高い場合、それはDPCを維持することができ、そして従ってDMD表現型を緩和する。そのような外部アップレギュレーションが確実に制御され、細胞内のウトロピンのレベルを可能性ある高レベルに高めることはありそうもない。しかしながら、これは、Coxなど．〔24〕が、トランスジェニックmdxマウスの筋肉におけるジストロピンの全体的過剰発現が、明白な有害副作用を伴わないで、筋肉病理学を正常に転じることを示しているので、問題ではないかも知れない。本発明は、種々の種からのウトロピン及びそのフラグメントをコードする核酸のクローニングから発生する。最初の目的は、ヒトウトロピンをコードする核酸をクローン化することであったが、しかし主要問題が遭遇した。これまでの文献（14）は、オーバーラップするcDNAのクローニングにより得られる、ウトロピン（いわゆる、“ジストロピン関連タンパク質”）のアミノ酸配列を報告している。しかしながら、アミノ末端アクチン結合ドメインのまわりの２つの領域が、それらのクローンに表わされなかった。それらの領域は、PCRにより増幅され、そして配列決定されたが、しかしそれらをクローン化することは可能でないことがわかった。それらの領域を含むべきであったいづれかのクローンが再配列され（制限マッピングにより決定されるように）、又は単純に、クローンは、高い組換え欠失性Ｅ．コリ宿主株(S URE及びSTBL2)が使用される場合でさえ、単離されなかった。配列におけるギャップが、公開されたヒトジストロピン配列とウトロピンcDNAから生成された配列とを比較することによって同定された。追加のウトロピンクローンが単離される場合、それらの２つのギャップは少しも広がらなかったことが明らかになった。ヒトcDNAのアミノ末端から得られた配列の情報がプローブを企画するために使用され、そしてラット及びマウスcDNAライブラリーがスクリーンされた。ラット cDNAはまた、ヒト配列におけるクローン化できない領域に対応する領域において不安定性であり、又は再配置されなかった。それらの領域を包含するいくつかの大きなラットクローンが得られたが、しかしサブクローンを生成するためのすべての試みは、制限マッピングにより決定される場合、挿入体の再配列のために失敗した。驚くべきことには、ヒト及びラット配列に関する困難性を考慮して、問題の領域を包含する、マウスライブラリーからのcDNAは、安定性であり、且つ、より小さなサブクローンの生成を包含するさらなる操作を行いやすいことが見出された。図１は、それぞれのタンパク質のアミノ末端部分の一部をコードする、ヒト、ラット及びマウスウトロピンヌクレオチド配列間の比較を示す。ヒト遺伝子のヌクレオチド領域は、下線が引かれている。このクローニング操作は、ウトロピン機能を有するポリペプチドが発現され得る核酸分子の構成を最初に可能にする。さらに、ジストロピンミニ−遺伝子（これから、ジストロピンの切断されたバージョンが発現される）により達成される好結果との類似性のために、本発明は、“ウトロピンミニ−遺伝子”及びそれによりコードされるポリペプチドを供給する。ヒトウトロピン遺伝子配列の領域の非クローン化性の問題を克服するために、本発明は、ウトロピン機能を有するポリペプチドの発現を提供するためにキメラ構造体におけるマウスウトロピン遺伝子に由来するヌクレオチドの配列を使用することが可能であることを実現した。本発明の第１の観点によれば、ウトロピン機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含んで成る核酸分子が供給される。ウトロピン機能を有するポリペプチドは、アクチンを結合することができ、そしてジストロピンタンパク質複合体(DPC)を結合することができる。ウトロピン機能を有するポリペプチドは一般的に、ジストロピンポリペプチドから免疫学的に区別できる。たとえば、それらは、ジストロピンに見出されない少なくとも１つのエピトープを含んで成る。ウトロピン機能を有するポリペプチドは、ジストロピンと交差反応しない特定のポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いて同定され得る。ポリペプチドがアクチンを結合することができ、そしてジストロピンタンパク質複合体を結合することができ、そして少なくとも１つの抗体が、ジストロピンを結合することができないポリペプチドを結合することができる場合、前記ポリペプチドはウトロピン機能を有する。好ましい態様においては、ポリペプチドは、ウトロピンを結合するが、しかしジストロピンを結合しない抗体により結合され得、換言すれば、ポリペプチドは、そのエピトープがジストロピンに見出されないウトロピンと少なくとも１つのエピトープを共有する。もう１つの態様においては、ポリペプチドは、ジストロピンを結合する抗体により結合されないように、ジストロピンに見出されるエピトープを含まない。そのような場合、ジストロピンを結合する抗体により認識されるエピトープは、ウトロピンに見出され得ない。ポリペプチドは、ジストロピンに見出されるエピトープを含むことができない。免疫学的比較が、特にウトロピン機能を有するポリペプチドがヒト使用のために意図される場合、ヒトウトロピン及び／又はジストロピンにより、又はその使用が意図される種、たとえばマウスのウトロピン及び／又はジストロピンにより行なわれ得る。マウスモノクローナル抗体MANCHO7及びMANNUT1〔31〕が、本明細書に記載される研究に使用された。標準のインビトロ結合アッセイが、ポリペプチドの免疫学的交差−反応性を評価するために使用され得る。従って、ポリペプチドは、アクチン−結合ドメイン及びジストロピンタンパク質複合体(DPC)−結合ドメイン、並びに、たとえば免疫学的に決定される場合、ジストロピン様分子に対立するものとしてウトロピン様分子を含んで成る。好ましくは、コード配列は、ヒト配列、すなわちヒト細胞のゲノムから得られる配列を含んで成る。種々のアミノ酸配列の比較は、次の％類似性（Winsconsin Package vB，Genet ics Computer Group，575 Science Drive，Madison,Wisconsin 53711，USAからのGAPプログラムを用いて行なわれる、Needleman and Wunsch（1974）J.Mol.Bio l．48：443-453の方法を用いて計算された）及び同一性を示す： −十分な長さのヒトジストロピン対ヒトウトロピン、69％の類似性、50.7％の同一性； −十分な長さのヒトウトロピン対ラットウトロピン、93.2％の類似性、87.1％の同一性； −十分な長さのヒトジストロピン対マウスジストロピン、95.4％の類似性、91.2％の同一性； −ヒトジストロピンＣ−末端対ヒトウトロピンＣ−末端、84.1％の類似性、73.6％の同一性。示されるように、本発明は、“ジストロピン様”分子ではなく、“ウトロピン様”分子のみに関する。従って、本発明のポリペプチド（たとえば、本発明の核酸によりコードされるような）は、完全な長さに対して取られる場合、図３のアミノ酸配列又は図９のアミノ酸配列に対して約75％以上の類似性、好ましくは約 80％、約85％、約90％、約95％又は約98％以上の類似性を有するアミノ酸配列を有することができる。前記ポリペプチドは、完全な長さに対して、約55％以上の同一性、好ましくは、約60％以上の同一性、約70％、約80％、約90％、約95％又は約98％の同一性のアミノ酸同一性を有することができる。類似性及び／又は同一性のレベルは、Ｃ−末端CDP−結合ドメイン外で低いが、但し前記DPC−結合ドメインは、図３又は図９のDPC−結合ドメインアミノ酸配列に対して約85％以上の類似性、好ましくは約90％以上、約95％又は約98％の類似性を有し、又は図３又は図９のDPC−結合ドメインアミノ酸配列に対して、約80％以上、好ましくは約85％以上、約90％、約95％又は約98％の同一性を有する。特定のアミノ酸配列変異体又は誘導体は、１個のアミノ酸、２，３，４，５〜10，10〜20，20〜30， 30〜50，50〜100，100〜150、又は150個以上のアミノ酸の１又は複数の挿入、付加、置換又は欠失により、図３又は図９の配列とは異なる配列を有することができる。この核酸は、単離体であり、あるいは単離された及び／又は精製された形態であり、それが天然に存在する環境中にはなく、その天然環境から取り出されている。それは、例えば、他のポリペプチドをコードする同一種から得られる他の核酸を含有しない。核酸分子は、天然に見出されない分子であり得る。たとえば、ヌクレオチドの配列は、下記でさらに論ぜられるように、クローニングベクター及び／又は発現ベクターの一部を形成することができる。ヌクレオチドの配列は、天然の配列に対して１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失及び／又は置換を含んで成ることによって、天然に存在する配列の変異体又は誘導体を表わすことができるが、但し、好ましくは、コードされたポリヌクレオチドは特定の特徴を有する。１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失及び／又は置換は、遺伝子コードに依存して、コードされたアミノ酸配列における変更に影響されても又はされなくても良い。好ましくは、核酸分子は、“ミニ−遺伝子”であり、すなわちコードされるポリペプチドは、完全な長さのウトロピンに対応しないが、しかしむしろ、より短い切断されたバージョンである。たとえば、ポリペプチドがアクチン−結合ドメイン及びDPC−結合ドメインを含んで成るが、しかし天然に存在するウトロピンよりも短いように、棒状ドメインの一部又はすべてを失うことができる。完全な長さのウトロピン遺伝子においては、アクチン−結合ドメインはヌクレオチド１〜739によりコードされるが、しかしDPC−結合ドメイン（CRCT）はヌクレオチド 8499−10301によりコードされる（ここで、１は翻訳の開始を表わす；図２Ａ）。本発明のミニ−遺伝子によりコードされるポリペプチドにおけるそれぞれのドメインは、完全な長さのコード配列におけるそれらのヌクレオチドにコードされるアミノ酸に対応するアミノ酸を含むことができる。ジストロピンミニ−遺伝子は、動物モデルにおいて活性的であることが示された（論ぜられるように）。完全な長さのウトロピン分子又はその誘導体をコードする配列に対するミニ−遺伝子の利点は、供給及び発現のために、ベクター、たとえばアデノウィルス及びレトロウィルスベクターにおいてより容易な操作及び封入を包含する。特定の特徴を有するポリペプチドをコードする、さらに好ましい天然に存在しない分子はキメラ構造体であり、ここでそのコード配列は、１種の哺乳類、好ましくはヒト（“ヒト配列”）から得られる配列、及び他の哺乳類、好ましくはマウス（“マウス配列”）から得られる配列を含んで成る。そのようなキメラ構造体はもちろん、それが由来する親哺乳類配列に関して、１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、置換及び／又は欠失を含んで成る。好ましくは、アクチン結合ドメインをコードするコード配列の一部は、マウス又は他の非ヒト哺乳類から得られるヌクレオチドの配列、又はマウス、又は他の非ヒト哺乳類から得られる配列に由来するヌクレオチドの配列を含んで成る。好ましい態様において、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列は、残基331−337で配列GAGGCAC、及び／又は残基1453−1475で配列GATTGTGGATGAAAACA GTGGG（開始コドンATGからの従来の番号づけを用いて）、及びヒトから得られる配列を含んで成る。核酸分子は、図１に示されるアミノ酸の配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成る。論ぜられるように、そのコード配列は、キメラ性であり、すなわち異なった種からのヌクレオチドの配列、たとえばヒトからか、又はヒトに由来できる配列、及びマウス又は他の非ヒト哺乳類からか又はそれに由来できる配列を含んで成る。本発明の配列をコードするキメラ性ミニ−遺伝子は図３に示されている。本発明の好ましい態様は、アクチン−結合ドメイン及びDPC−結合ドメインを有し、そして図３に示されるヌクレオチドの配列によりコードされるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含んで成る核酸分子、１又は複数のアミノ酸の付加、置換、挿入及び／又は欠失によるそのようなポリペプチドの変異体、対立遺伝子又は誘導体をコードするヌクレオチドの配列を含んで成る核酸分子、及び図３に示されるヌクレオチドの配列によりコードされるアミノ酸配列に対してそのコードされたアミノ酸配列の変更を伴って又は変更を伴わないで、１又は複数のヌクレオチドの付加、置換、挿入及び／又は欠失による、図３に示される配列の変異体、対立遺伝子又は誘導体であるヌクレオチドの配列を含んで成る核酸分子を包含する。但し、コードされたポリペプチドは、たとえば論ぜられるように免疫学的に決定される場合、“ジストロピン様”であるよりもむしろ “ウトロピン様”である。図３の配列の１つの特定の変異体又は誘導体は、図３のミニ−遺伝子に包含されない棒状ドメイン配列を含む、“完全な長さ”のウトロピン構造体である、図９に示されるような配列を有する。図３及び図９の配列は、正確な残基が未決定のまま残されているいくつかの位置を含む（ヌクレオチド配列においては“Ｎ”及びアミノ酸配列においては“Ｘ ”により示される）。この領域におけるヒト、マウス及びラットウトロピン配列の比較（図10）は、ヒト及びラットアミノ酸配列がここに絶対的に保存されていることを示す。従って、図３及び９における12個の“Ｘ′”は、アミノ酸配列DK KSIIMYLTSLを表わすことができる。代わりに、本明細書における変異体及び誘導体の議論によれば、本発明のポリペプチド（本発明の核酸によりコードされるような）は、図３及び９におけるＸ’により示される位置において、配列DKKSIIMY LTSLの１又は複数のアミノ酸の１又は複数の挿入、付加、置換又は欠失による変異体又は誘導体配列を包含することができる。本発明の核酸は、図１，３又は９に示される配列の情報に基づいて企画された配列を有する１又は複数のオリゴ−又はポリ−ヌクレオチドにより、標的細胞（たとえば、ヒト、マウス、ラット）の核酸をハイブリダイズすることによって得られる。従って、完全なマウス配列、又は図３及び図９におけるＸ’により示される領域における配列は、本明細書に提供される配列の情報（たとえば図１）を用いて、プロービング又はPCRにより得ることができる。本発明の核酸は、コドン使用法又は統計学的分析に基づいて、図１，３又は９に示される核酸配列の１又は複数のフラグメント、特に比較的まれな配列のフラグメントによりハイブリダイズするよう企画された１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを用いて得ることができる。提供されるアミノ酸配列情報は、変性プローブ／プライマ一又は“長い”プローブの企画に使用され得る。核酸配列のフラグメントとハイブリダイズするよう企画されたプライマーは、標的核酸がクローン化されているクローニングベクターにおける、又はライブラリーにおけるcDNAがオリゴヌクレオチドリンカーに連結され、そしてPCRが、図に示される配列とハイブリダイズするプライマー及びオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするプライマーを用いて実施される、いわゆる“RACE”(c DNA末端の急速な増幅)における、配列にハイブリダイズするよう企画された１又は複数のオリゴヌクレオチドと共に使用され得る。１又は複数の細胞（たとえばヒト、マウス）から単離され、そして／又は精製された核酸、又は細胞から単離され、そして／又は精製された核酸に由来する核酸ライブラリー（たとえば、細胞から単離されたmRNAに由来するcDNAライブラリー）は、選択ハイブリダイゼーションのための条件下でプローブされ、そして／又は特定の核酸増幅反応、たとえばポリメラーゼ鎖反応(PCR)にゆだねられ得る。方法は、標的核酸への１又は複数（たとえば２種）のプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションを包含することができる。核酸が二本鎖 DNAである場合、一本鎖DNAを生成するためには、変性が一般的にハイブリダイゼーションを先行するであろう。ハイブリダイゼーションは、PCR方法の一部として、又はPCRを包含しないプロービング方法の一部として存在することができる。典型的な方法は、PCR及び低い緊縮性のハイブリダイゼーションの組合せである。当業者に入手できる多くの方法から選択されたスクリーニング方法は、好結果をもたらすハイブリダイゼーション現象及び単離された、ハイブリダイズされた核酸を同定するために使用される。プロービングは、標準のサザンブロット技法を用いることができる。たとえば、DNAが細胞から抽出し、そして異なった制限酵素により消化され得る。次に、制限フラグメントが、アガロースゲル上での電気泳動により分離され、その後、変性され、そしてニトロセルロースフィルター上に移される。ラベルされたプローブがフィルター上でDNAフラグメントにハイブリダイズされ、そして結合決定され得る。プロービングのためのDNAは、細胞からのRNA調製物から調製され得る。予備実験が、制限酵素により消化されたDNAのサザンブロットに種々のプローブを低い緊縮条件下でハイブリダイズすることによって行なわれ得る。適切な条件は、多数のハイブリダイズするフラグメントが得られ、且つバックグラウンドハイブリダイゼーションが低い場合に達成される。それらの条件を用いて、核酸ライブラリー、たとえば発現された配列を表わすcDNAライブラリーが研究され得る。完全な長さのコード配列を生成するためには、連結されるべき１又は複数の遺伝子フラグメントが必要である。また、完全な長さのコード核酸分子が得られていない場合、その完全な分子の一部を表わすより小さな分子が、完全な長さのクローンを得るために使用され得る。挿入体は、部分的なcDNAクローンから調製され、そしてcDNAライブラリーをスクリーンするために使用され得る。当業者は、要因、たとえばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成、温度及び同様のものを考慮して、選択ハイブリダイゼーションのための所望する緊縮性の適切な条件を十分に使用することができる。種々の異なった宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のためのシステムは良く知られている。適切な宿主細胞は、細菌、哺乳類細胞、酵母及びバキュロウィルス系を包含する。異種ポリペプチドの発現のために当業界において入手できる哺乳類細胞系は、チャイニーズハムスターの卵巣細胞、HeLa細胞、子供のハムスター腎細胞及び多くの他の細胞を包含する。通常の好ましい細菌宿主は、Ｅ．コリである。本発明の核酸は、クローニングベクター、及び／又はコードされたポリペプチドが発現され得るべクターの一部を形成することができる。適切な、及び適切に位置する調節配列、たとえばプロモーター配列、ターミネーターフラグメト、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適切な他の配列を含む適切なベクターが選択され、又は構成され得る。ベクターは、適切な場合、プラスミド、ウィルス、たとえばファージ、又はファージミド(phargemid）であり得る。さらなる詳細のためには、たとえば、Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition，Sambrookなど.，1989，Cold Spring Horbor Laboratory Pressを参照のこと。たとえば核酸構造体の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのDNAの導入及び遺伝子発現、及びタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの既知の技法及びプロトコールは、Short Protocols in Molecular Biology，Second Edition，Ausubelなど．eds.，John Wiley & So ns，1992に詳細に記載されている。Sambrookなど．及びAusubelなど．の開示は、引用により本明細書に組込まれる。従って、本発明のさらなる観点は、本明細書に開示されるような核酸を含む宿主細胞を提供する。さらに追加の観点は、そのような核酸を宿主細胞中に導入することを含んで成る方法を提供する。前記導入は、いづれの利用できる技法でも使用できる。真核細胞のためには、適切な技法は、レトロウィルス、又は他のウィルス、たとえばワクシニアを用いて（又は昆中細胞のためには、バキュロウィルスを用いて）の、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-Dextran、エレクトロポレーション、リポソーム−介在トランスフェクション及びトランスダクションを包含することができる。細菌細胞のためには、適切な技法は、バクテリオファージを用いての、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びトランスフェクションを包含することができる。導入に続いて、たとえば遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現が引き起こされ又は可能にされる。１つの態様において、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（たとえば染色体）中に組込まれる。組込みは、標準の技法に従って、前記ゲノムとの組換えを促進する配列の包含により促進され得る。本発明はまた、提供されるような宿主細胞を含んで成る、哺乳類、たとえばヒト、霊長類、ゲッ歯動物、好ましくはラット又はマウス、及びそのような哺乳類の生成及び使用方法を提供する。哺乳類は、非ヒトであり得る。トランスジェニック動物、特にマウスは、いづれかの利用できる技法を用いて生成され得る。ジストロピン性表現型を有するmdxマウス又は他の動物が、研究のために特に適切である。核酸によりコードされるポリペプチドは、インビトロ、たとえば細胞フリーのシステム又は培養された細胞において、又はインビボにおいて前記核酸から発現され得る。インビトロ発現は、アクチン及び／又はDPCに結合するポリペプチドの能力を決定することにおいて有用であり得る。これは、それらの結合活性の１つ又は両者を調節することができる物質についての試験又はスクリーニングにおいて有用であり得る。特に、ポリペプチドのアクチン及び／又はDPC結合を高めることができる物質は、可能性ある医薬／治療活用のために利用できる分子のレパートリーに添加するであろう。そのためのコードする核酸からのポリペプチドの発現に続いて、ポリペプチドの結合活性の１つ又は両者のモジュレーターとして同定されるそのような物質がさらに研究され、そして製造され、そして／又は続いて個人に投与され得る、薬剤、医薬組成物又は薬物の調製に使用され得る。インビボ発現は、下記においてさらに論ぜられる。本発明のさらなる観点によれば、ウトロピン機能（ウトロピン自体以外の）を有するポリペプチドが供給される。そのようなポリペプチドは、アクチン−結合ドメイン及びDPC−結合ドメインを含んで成り、そしてジストロピン様よりもむしろウトロピン様として免疫学的に認識でき、すなわち論ぜられるように、天然に存在するポリペプチドではない。そのポリペプチドは、本発明の核酸によりコードされるものとして上記で論ぜられたいづれかのものであり得る。特に、ポリペプチドは、たとえば、棒状ドメインのすべて又は一部を欠くことにより天然に存在する完全な長さのウトロピンよりも短い。アクチン−結合及びDPC−結合ドメインは、ヒト、マウス又は他の非ヒトウトロピンのものに対応することができ、又は１又は複数のアミノ酸の付加、置換、挿入及び／又は欠失によりそれらに由来することができる。ポリペプチドは、論ぜられるように、異なった種、たとえばヒト及びマウスからの又はそれに由来するアミノ酸の配列を含んで成るキメラ性であり得る。本発明のポリペプチドを生成するための便利な手段は、それをコードする核酸を発現することである。従って、コード核酸からの発現によりそのようなポリペプチドを製造するための方法は、インビトロ、たとえば細胞フリーシステムにおいて、又は発現のための適切な条件下で宿主細胞を培養することにより、又はインビボにおいて、本発明により提供される。本発明のポリペプチド及び核酸は、ポリペプチド、筋ジストロフィー及びその治療の研究のためのモデルとして、個人、たとえば筋ジストロフィーを有するヒト又は非ヒト哺乳類、たとえばマウスへの供給のための、薬剤、組成物、たとえば医薬製剤、及び薬物の製造に使用され得る。たとえば、本発明に従ってヒト又は動物本体に対して実施される処理方法は、本明細書に開示されるようなポリペプチドをコードする核酸の個人への投与を含んで成る。核酸は、個人の細胞内での発現を可能にする構造体の一部を形成することができる。核酸は、レトロウィルスベクター、好ましくは細胞を形質転換しないであろうベクターを用いて、又はリポソーム技法を用いて、細胞中に導入され得る。投与は、好ましくは、“治療的有効量”で存在し、これは患者に対する有益性を示すために十分な量である。そのような有益性は、少なくとも１つの徴候の少なくとも改善であり得る。投与される実際の量、及び投与の速度及び時間は、処理されるものの性質及び重度に依存するであろう。処置の処方、たとえば用量等の決定は、一般的な開業医及び他の医師の責任内にある。組成物は、単独で又は他の処置と組合して、処置されるべき条件に依存して、同時に又は連続的に投与され得る。本発明の及び本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分の他に、医薬的に許容できる賦形剤、キャリヤー、緩衝液、安定剤又は当業者に良く知られている他の材料を含むことができる。そのような材料は、非毒性であるべきであり、そして活性成分の効能を妨害すべきではない。キャリヤー又は他の材料の正確な性質は、経口、又は注射、たとえば皮膚、皮下又は静脈内注射であり得る、投与の経路に依存するであろう。経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形で存在することができる。錠剤は、固体キャリヤー、たとえばゼラチン又はアジュバントを含むことができる。液体医薬組成物は一般的に、液体キャリヤーたとえば水、石油、動物又は植物油、鉱油又は合成油を含んで成る。生理食塩水、デキストロース又は他の糖溶液、又はグリコール、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールが含まれ得る。静脈内、皮膚又は皮下注射、又は病巣の部位での注射のためには、活性成分は、発熱物質を有さず、そして安定したpH、等張性及び安定性を有する、非経口的に許容できる水溶液の形で存在することができる。当業者は、たとえば等張ビークル、たとえば塩化ナトリウム注射剤、リンガー注射剤、乳酸塩化されたリンガー注射剤を用いて適切な溶液を十分に調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。注射は、疾病部位に核酸を供給するために使用され得る。内部的には、適切な画像化装置が、所望する部位に注射針を案内するために使用され得る。本体から細胞を除去し、それらを処理し、次に本体にそれらを戻すこと、又は個人から除去された細胞に由来する細胞を投与することが所望される。これは、たとえば、筋肉幹細胞が単離され得る場合、適切であり得る。筋肉前駆体細胞（ “mpc”）は、mdxマウスにおける細胞治療に使用されて来ており、ここで正常な mpcの移植が実質的な量のジストロピンを生ぜしめた〔25，26，27〕。免疫抑制は、細胞移植方法の成功を高める〔13〕。筋芽細胞が、組織培養における増殖する筋原細胞中にミニ−ジストロピン構造体を導入するために複製−欠損性レトロウィルスベクターを用いて示されたように、成長又は修復の間、筋繊維中に遺伝子を導入するために使用され得る〔28〕。従って、培養における細胞は、患者における筋肉中に細胞が移植される前、それらの中に導入された本発明の核酸を有することができる。ドナー中への細胞の戻し移植は、遺伝的に正しくされた自己由来の移植片の利点を有する。核酸は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム、リポフェクチング、又は裸のDNA又はRNAを用いて、又はいづれか他の適切な技法を用いて、細胞中に局部的に導入され得る。レトロウィルスベクターはまた、ジストロピン−陽性繊維を生成するためにmd xマウスの自発的に再生する筋肉の筋芽細胞中にジストロピンミニ−遺伝子を導入するためにも使用されて来た〔８〕。組換え複製欠損性アデノウィルスは、持続した発現のために骨格筋繊維中に構造体を導入する効果的な手段として特に効果的であるように見える〔29〕。筋芽細胞に基づく遺伝子療法のレビューのためには、参照文献11を参照のこと。アデノウィルス、レトロウィルス又は他のウィルスベクターは、筋肉細胞中への本発明のウトロピン配列の導入のために都合良く使用され得る。インビボトランスダクションが増殖する又は再生する筋肉繊維に制限されても、レトロウィルス的に導入された構造体は、宿主細胞のゲノム中に組込まれるようになる利点を有し、すなわち終生の発現を潜在的に付与する。リポソームは、骨格働への核酸構造体の供給のためのビークルとして使用され得る。カチオン性リポソームにおける構造体の静脈内注射は、骨格筋を含むほとんどの組織の広いトランスフェクションをもたらして来た〔30〕。免疫原性の欠失は、反復された投与を可能にし、そして組織特異性の欠失は、発現を駆動するための筋肉−特異的プロモーターを選択することによって適応され得る。ジストロピン及び関連するポリペプチドとウトロピン機能を有するポリペプチドとを区別することへの使用のためには、抗体は当業界において標準である技法を用いて得られる。抗体を生成するための方法は、前記タンパク質又はそのフラグメント、又は前記タンパク質又はフラグメントを発現する細胞又はウィルスにより哺乳類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、馬、ヤギ、羊又はモンキー）を免疫化することを包含する。標的ポリペプチドをコードするDNAによる免疫化はまた、可能である（たとえば、Wolff、など．Science 247：1465-1468（1990 ）；Tang、など．Nature 356：152-154（1992）；Ulmer J B,など．Science 259 ：1745-1749(1993)を参照のこと）。抗体は、当業界において知られている種々の技法のいづれかを用いて、免疫化された動物から得られ、そして好ましくは、興味ある抗原に対する抗体の結合を用いて、スクリーンされ得る。たとえば、ウェスターンプロット技法又は免疫沈澱法が使用され得る（Armitageなど．1992， Nature 357；80-82）。モノクローナル抗体の生成は、当業界において十分に確立されている。モノクローナル抗体は、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を生成するために組換えDNA技術の技法にゆだねられ得る。そのような技法は、不変領域に対する抗体の、免疫グロブリン可変領域、又は相補的決定領域(C DR)、又は異なった免疫グロブリンの不変領域及び骨格領域をコードするDNAを導入することを包含する。たとえば、EP184187A，GB2188638A又はEP-A-0239400を参照のこと。モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、生成される抗体の結合特異性を変更することができるか又は変更することができない、遺伝子突然変異又は他の変更を受けやすい。ペプチドによる哺乳類の免疫化の他の手段又は補足物として、タンパク質に対して特異的な抗体は、それらの表面上で機能的な免疫グロブリン結合ドメインを示すλバクテリオファージ又は線状バクテリオファージを用いて、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え的に生成されたライブラリーから得られる；たとえばWO92／01047を参照のこと。ライブラリーは純粋であり、すなわち標的物により免疫化されていない生物から得られた配列から構成され得、又は興味あるもの（又はそのフラグメント）の抗原に対して暴露された生物から得られた配列を用いて構成され得る。抗体は、多くの手段により修飾され得る。実際、用語“抗体”とは、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有するいづれかの特定の結合物質を包含するものとして構成されるべきである。従って、これは、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的同等物、及び相同性の、たとえば免疫グロブリン結合ドメインを含んで成るいづれかのポリペプチド（天然又は合成のいづれかの）を包含する。従って、もう１つのポリペプチドに融合される免疫グロブリン結合ドメイン又は同等物を含んで成るキメラ分子が包含される。キメラ抗体のクローニング及び発現は、EP-A-0120694及びEP-A-0125023に記載されている。結合抗原の機能は完全な抗体のフラグメントにより実施され得ることが示されている。典型的な結合フラグメントは、（ｉ）VL，VH，CL及びCH１ドメインからなるFabフラグメント；（ii）VH及びCH１ドメインから成るFdフラグメント；（i ii）単一抗体のVL及びVHドメインから成るFvフラグメント；（iv）VHドメインから成るdAbフラグメント（Ward，E.S.など．Nature 341，544-546(1989)）；（ｖ）単離されたCDR領域；（vi）F2(ab’)₂フラグメント、すなわち２つの結合されたFabフラグメントを含んで成る二価フラグメント；（vi）VHドメイン及びVLドメインが、抗原結合部位を形成するために２種のドメインの会合を可能にするペプチドリンカーにより連結されている、一本鎖Fv分子(scFv)(Birdなど．Science ，242，423-426，1988；Hustonなど．PNAS USA，85，5879-5883，1988）；（vii i)二特異的一本鎖Fvダイマー(PCT/US92／09965)；及び（ix）遺伝子融合により構成される“ジアボディズ(diabodies)”多価又は多特異的フラグメント(WO94／ 13804；P.Holligerなど．Proc.Natl．Acad．Sci．USA 90：6444-6448，1993)である。本発明のさらなる観点及び態様、及び本明細書に開示される観点及び態様に対する修飾は、当業界に明らかであろう。次の図が本明細書に添付される：図１：図１ａは、第１のアミノ酸から出発し、そしてアクチン結合ドメイン及び棒状ドメインの開始を包含する、マウス（Moutro）、ラット(ratutro)及びヒト(humutro)のヌクレオチド配列のその対応する部分を示す。濃い線は、ラット及びヒトにおけるクローン化できない領域を示す。図１ｂは、第２のクローン化できない領域の配列を示す。図２は、PCR6.0のクローニングエ程の図である。図２Ａ：太字の数字は、Kbでのウトロピン転写体を表わし、そしてその線下の数字は問題のヌクレオチド位置を表わし、ここで１は翻訳の開始であり；図２ＢはPCRのための鋳型として使用されるcDNAを表わし；図２ＣはPCR6.0を形成するために生成された２種のPCRフラグメントを表わす。図３は、本発明の“ウトロピンミニ−遺伝子”のヌクレオチド配列（両鎖）を示し、そして完全な構成が本明細書に記載されている。図４は、種々のドメイン、及び完全な長さの分子の一部のみを含んで成る“ミニ−遺伝子”を示す、ジストロピン及びウトロピンポリペプチドの表示である。図５：ウトロピントランスジーン構成及び発現、Ａ，ジストロピン、ウトロピン及び２種の切断されたトランスジーンの縮尺表示。反復されたスペクトリン様反復体（Ｒ）及び可能性あるヒンジ部位（Ｈ）が示されている。Ｂ，ウトロピントランスジーンベクター、ウトロピンのＮ−及びＣ−末端部分が、鋳型としてオーバーラップするcDNAを用いてPCR生成物としてクローン化された。使用される領域は、点線により示される。PCR生成物は、2.2Kbのヒト骨格α−アクチン(HSA )プロモーター及び調節領域20，21及びSV40の大きなＴポリＡ部位を含むベクター中にクローン化された。クローニング部位は、トランスジーンが第２のHSA非翻訳エキソンの開始近くに位置するように存在し、そしてAsp715／NotI部位は完全なフラグメントを生成するために使用された。Ｃ，ウトロピントランスジェニック系Ｆ−３及び非−トランスジェニックＣ（57BL／10同腹子からの筋肉のイムノブロット。Ｍ，骨格筋；Ｈ，心臓；Ｄ，横隔膜。図６：トランスジェニックmdxマウスにおける血清CKレベル及び中心集中された筋原繊維の低下。Ａ．ウトロピントランスジーンを発現する雄mdxマウスにおける血清クレアチンキナーゼレベル。生後５週目のマウスからの血清クレアチンキナーゼレベルは、雌mdxにより支配された雄のトランスジェニックマウスに起因する４匹の−腹子から生成された。子孫は、雄のヘミ結合性mdx（Ｍ mdx），雄のウトロピントランスジェニックmdx(Ｍ Tg mdx)及びヘテロ接合性雌（Ｆ mdx）から成った。雌のヘテロ接合体は野生型とは有意に異ならず、その結果、正常な対照として使用され得る。個々のグループにおけるマウスの数（ｎ）は括弧で示されており、そして平均SEはＴ−バーにより示される。Ｂ．中心集中された核を含有する筋繊維の比率、平均SEはＴ−バーで示される。図７：他の切断されたウトロピントランスジェニックmdx系(Gerald，George， Grant，Gavin)、正常（ｎ）及びmdx(mdx)からの横隔膜及びTA筋における中心集中された核の低下。平均SEは、Ｔ−バーにより示される。図８：他のウトロピントランスジェニック系、正常（ｎ）及びmdx(mdx)からの血清クレアチンキナーゼの低下。個々のグループにおけるマウスの数は、括弧で示される。図９：完全な長さのウトロピンコード配列及びコードされるアミノ酸配列。図10：ヒト、マウス及びラットウトロピンのＮ−末端領域についての一連のアミノ酸配列。引用されるすべての文書は、引用により本明細書に組込まれる。例１ウトロピンミニ遺伝子のクローニングヒトウトロピン転写体の後方半分を包含する４種のcDNAを、オーバーラッピング制限エンドヌクレアーゼ部位を用いて一緒に連結した。アミノ末端領域を、安定したマウスcDNAクローン、すなわちJT1に通常のEco RＩ制限部位により連結されるヒト92.2cDNAを用いて再構成した。次に、それらの２種の構造体を、PCR増幅のための鋳型として使用した（図２Ｂ）。プライマーを、ウトロピンコード配列の最初の約２Kb及び最後の約４kbを含むウトロピンミニ遺伝子を生成するために読取り枠を整合して連結され得る未翻訳領域を含まない２種のフラグメント、すなわちPCR2.0及びPCR4.0を生成するよう企画した（図２Ｃ）。２種のPCRフラグメントを、HpaＩ部位を用いて一緒に連結した。6.0Kbのミニ遺伝子の完全なDNA配列が図３に示されている。その完全な６Kbのミニ遺伝子をベクターから切断し、そして真核性発現ベクター中に連結した。SV40−pAは、エキソン１に連結されるSV40初期プロモーター、及びいづれかのクローン化された挿入体のスプライシングを促進するためのウサギβグロビンのエキソン２（イントロンを含む）の部分から成る。これは、構造体がトランスジェニック系を生成するために使用される予定である場合に特に重要である。クローニングのための単一のユニークブラント制限部位の挿入の後、SV40の小ＴポリＡシグナル配列が存在する。SV40プロモーターは、すべての組織においてミニ遺伝子を発現するであろう。HSA−PA構造体は、類似するが、但し、ヒト骨格のアクチンプロモーター、及び骨格筋においてのみミニ遺伝子生成物の発現を指図するであろう組織特異的調節配列の使用を除く。発現ベクター中にクローン化されるとすぐに、ユニークHpaＩ部位が、ウトロピン棒状ドメインの残りを含むPCR生成されたフラグメントにおいてクローン化するために使用された。本発明者は現在、切断された及び完全な長さのウトロピンコード配列を含む発現ベクターを有する。ユニークHpaＩ制限部位が、また、mycタンパク質に対する特異的な抗体により認識されるアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドにおいてクローン化するために使用されている。これは、myc標識のそれらの発現及び抗体による認識によりミニ遺伝子構造体の局在化を可能にするであろう。ウトロピンのためには、これは、内因性遺伝子がすべての細胞型に発現されるので、問題である。標識の使用は、遺伝子療法プロトコールに供給される場合、ミニ遺伝子の存在を示すであろう。フラッグエピトープ(IBI)、及び類似する態様で使用されるグリーン蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein)(Clontech)を包含する多くの多の標識が入手できる。生成されるウトロピンミニ遺伝子は、ジストロピンミニ遺伝子と同じドメイン及び反復体から成る（図４）。ジストロピンミニ遺伝子は、軽いBecker筋ジストロフィー表現型を生ぜしめる天然に存在するジストロピン突然変異からインビトロで初めてコピーされた。それは、可能性ある遺伝子療法路のために企画される多くのウィルスベクターにおいて、及びmdxマウスにおける異常筋肉表現型を改善するトランスジェニック系において都合良く使用されて来た。従って、ウトロピンミニ遺伝子は、可能性ある遺伝子療法工程において特定の組織発現のために企画されたウィルスベクター中にクローニングするために適切であろう。ミニ遺伝子の統合性の確認突然変異を導入するためのTaq熱安定性ポリメラーゼの傾向が与えられる場合、PCR生成されたたクローンにおける読取り枠の維持についてスクリーンすることが重要であった。PCR生成物を、クローン化された挿入体の転写及び翻訳を可能にするRNAポリメラーゼ結合部位を有するベクター中にクローン化し、放射性ラベルされたタンパク質を生成した。発現されたタンパク質が正しい分子量のものであることが観察されたなら、PCR生成物が停止突然変異を有さないことが推定された。次に、それらの生成物をウェスターンブロットし、それらがウトロピン抗体により認識されるかどうかを見出した。陽性結果は、発現されたタンパク質が抗体により認識されるエピトープを生成するために正しい読取り枠で存在することを示した。PCR2.0及びPCR4.0の両者のための10種の異なったクローンを、この態様でスクリーンした。すべての場合、完全な長さの発現が観察された。すべてのPCR2.0及びPCR4.0クローンを、MANNUT１〔31〕（アクチン結合ドメインを認識する）及びMANCH0１〔18〕（カルボキシ−末端の後者半分を認識する）によりそれぞれ検出した。ミニ遺伝子を、上記基準を満たす２種の異なったPCR2.0及び4.0クローンから構成し、そして発現ベクター中にクローン化した。完結されたミニ遺伝子の統合性を調べるために、COS細胞を、両SV40−PCR6.0ミニ遺伝子（Ａ４及びＢ１）により過渡的にトランスフェクトし、そしてその時点の後、収穫した。PCR6.0ミニ遺伝子タンパク質の発現を、MANNUT１〔31〕及びMANCHO７〔18〕を用いて、ウェスターンブロットにより同定した。類似するトランスフェクションを、それらの構成体を用いて行ない、次に細胞を固定し、そしてMANCHO７〔18〕を用いて免疫染色した。ミニ遺伝子の染色は、結合された膜であるように見え、これはアクチン結合ドメイン又はCRCT、又は両者が見出される染色パターンを説明するために機能的であることを示唆する。 myc標識エピトープをまた、ミニ遺伝子内のユニークHpaＩ部位中に読取枠を整合してクローン化した。この構造体SV40−PCR6.0−mycをまた、COS細胞中にトランスフェクトし、そしてmyc標識マウスモノクローナル抗体９Ｅ10を用いて免疫局在化した。再び、膜局在化が観察され、これは、myc標識エピトープを構成する10個のアミノ酸の導入がミニ遺伝子の性質に影響を及ぼすように見えないことを示す。例２ウトロピン発現によるジストロフィー欠損のためのインビボ補償本発明者は、ジストロピン欠失mdXマウスにおけるウトロピントランスジーンの発現を試験した。１つの結果は、骨格筋におけるウトロピントランスジーンの高い発現がジストロフィー病理学を逆転することができることを示唆する。それらのデータは、DMD患者におけるウトロピンの組織的アップレギュレーションがこの破壊的な障害のための効果的処置の開発のためにひじょうに有望な手段であるとを示唆する。切断されたウトロピントランスジーンを、mdxマウスのジストロフィー表現型を正すことが示されているBeckerジストロピントランスジーンに基づいて形に表わした〔５，６〕（図５Ａ）。高レベルの筋肉発現を生成するために、ウトロピントランスジーンを、ヒト骨格αアクチン(HSA)プロモーターにより駆動した（図５Ｂ）。ウトロピントランスジーンを発現する多くのトランスジェニック系を、異なったレベルのトランスジェニック発現で生成した。高レベルの発現を示すトランスジェニック系からの筋肉サンプルのイムノブロット分析が図５Ｃに示されている。複数のかすかバンドは、たぶん、高く発現されたトランスジーン生成物のタンパク質加水分解による〔24〕。ライン347はまた、心臓におけるトランスジーンの弱い発現を示す。Ｆ−３ラインの分析は、心臓、脳、腎臓、肺、肝臓、腸、皮膚又は膵臓におけるトランスジーン発現の現象が観察されなかったことを示す。ウトロピントランスジーンが筋細胞膜に局在化することを示すために、骨格筋断片の免疫螢光を、ウトロピン及びジストロピン特異的抗体を用いて行なった。連続的な筋肉断片におけるジストロピン及びウトロピントランスジーンの筋細胞膜局在化パターンの試験は、それがインビボで同時局在化することができることを示した。成人骨格筋におけるウトロピンの通常の局在化は、神経筋及び筋鍵接合部で及び毛細管及び神経において独占的に存在する〔３，31〕。固定されていない８μｍのTA筋肉の低温断片の免疫染色を、Ｇ３（抗−ウトロピン）のｌ／25希釈溶液又はＰ６（抗−ジストロピンの１／400希釈溶液により行なった〔33〕。まず、断片を、50m Mのトリス、150mMのNaCl(pH 7.5)(TBS)溶液中、10％の熱不活性化されたウシ胎児血清においてブロックし、次に、TBSに希釈された一次抗体を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。スライドをTBSにおいて４度、それぞれ５分間、洗浄し、次にTBSに希釈された１／1000希釈度のFITC接合された単抗−ウサギIgG（Sigma）と共に室温でさらに１時間インキュベートした。最終的に、スライドを前記のようにして洗浄し、VectaShield（Vector Labs）により固定し、そしてLeica DMRBE顕微鏡及び顕微鏡写真システムを用いて写真を取った。ジストロピン欠失mdxマウスは単に軽く影響されるが、組織学的及び生理学的分析は、筋繊維変性を包含するDMD患者と同じように多くの筋肉欠損を示し、血清クレアチンキナーゼ（CK）の劇的な上昇、及び中心に位置する核を有するほとんどの繊維を伴って大規模な筋繊維再生の現象を生ぜしめた〔34〕。従って、血清CKのレベル、及び中心集中された核の数の変化を用いて、mdxマウスにおけるジストロピントランスジーンを発現する多くのトランスジェニック系における筋肉の病理学をモニターした〔５，６，７，24〕。ウトロピントランスジーンを担持する親のトランスジェニックＦ−３マウスを、ジストロフィン欠失性雌mdxマウスにより交配し、そして得られる子孫を分析した（図６Ａ）。生後５週目の雄のトランスジェニックmdxマウスのCKレベルは、非トランスジェニックmdx雄同腹子の約１／４に低下した。トランスジェニックであろうと又はなかろうと、雌は実質的に正常なレベルの血清CKを有する。トランスジェニック雄mdx同腹子におけるCKの血清レベルの低下は、それらのマウスの筋肉病理学の変化を示し、そして筋肉変性の有意な低下が生じたことを意味する。図６Ｂは、トランスジェニック及び非トランスジェニック雄mdxマウスのヒラメ筋及び脛側前部（TA）筋から凍結断片における中心集中された核の数の比較を示す。中心集中された核を有する筋原繊維の数は試験された２種のタイプにおいて著しく低下され、これは、繊維再生の量が低められたことを示す。トランスジェニックmdx TA（約10％）とヒラメ筋（約30 ％）との間の中心核の数の差異はたぶん、HSAプロモーターが、TAの早い単収縮繊維に比較して、ヒラメ筋の中に実質的に存在する遅い単収縮繊維において遅いレベルで発現される事実により説明される。これは、それが、ウトロピントランスジーンのレベルが筋肉表現型の改善のために重要であることを包含するので、重要な観察である。ジストロピンは、筋細胞膜に包含される大きなオリゴマータンパク質複合体( ジストロピンタンパク質複合体；DPC)に通常関係している〔３，35〕。DMD患者及びmdxマウスにおけるジストロピンの損失はまた、筋細胞膜DPCの劇的な損失をもたらす〔36〕。完全な長さの及び切断されたジストロピントランスジーンを発現するトランスジェニックmdxマウスにおいては、筋細胞膜でのDPCの成分の再確立は、ジストロピントランスジーンによる筋肉強さの再生のための重要なマーカーである〔５，６，７，24〕。本発明者は、雄mdx、又はウトロピントランスジーンを発現するmdxからのTA筋肉におけるDPCの成分についての免疫染色の結果を調べた。これは上記の通りであった。一次抗体は、α／β−ジストログリカンに対するヤギポリローナル血清〔37〕（FP-B，１／10）、α−サルコグリカンに対するウサギポリクローナル血清〔38〕（１／５）及びγ−サルコグリカンに対する単ポリクローナル血清〔39〕（１／10）であった。ヤギ、ウサギ及び羊に対するFITC 接合の二次抗体は、それぞれ１／50，１／200及び１／50に希釈された。ウトロピン特異的抗体によるすべての筋原繊維の筋細胞膜染色がトランスジェニック筋肉に見出された。しかしながら、非トランスジェニックマウスにおいては、神経筋接合部及びたぶん再生繊維を含む領域を除いて、筋細胞膜染色は実質的に存在しない。α−サルコグリカン、γ−サルコグリカン及びα／β−ジストログリカンに対する特異的なポリクローナル抗体を用いるすべての場合、トランスジェニックTA筋肉の筋細胞膜での染色に著しい上昇が存在し、これは正しく局在化された筋細胞膜結合DPCの上昇を示す。ヒラメ筋におけるそれらの成分の筋細胞膜染色の上昇は、非トランスジェニックmdx雄よりも高いが、しかしTAにおいてはそうではない。この結果は、高められたウトロピントランスジーン発現が筋細胞膜結合DPCの上昇に相互関係していることを示す。 mdx横隔膜の分析は、この筋肉がDMD骨格筋に比較できるmdxマウスの寿命を通しての変性、繊維増多及び機能損失の連続したパターンを表わすことを示している〔40〕。従って、ジストロピンを置換することができるウトロピンのためには、この筋肉におけるウトロピンの過剰発現が、ジストロピントランスジェニック mdxマウスのために示されるのと類似する手段で病理学を変更すべきである〔５，６，７，24〕。ウトロピン抗体を用いての横隔膜断片の免疫染色は、正常マウス及び見られるmdxに比較してトランスジェニックmdxマウス(utro-tg mdx)に発現されるウトロピントランスジーンの筋細胞膜局在化が、正常な横隔膜に類似するレベルでトランスジェニックmdx横隔膜の筋細胞膜でのα−サルコグリカンの回復であることを示す。正常な横隔膜に類似するトランスジェニックmdx横隔膜の筋細胞膜染色はまた、α／β−ジストログリカン及びγ−サルコグリカンに対して特異的な抗体を用いても見出される（データは示されていない）。従って、骨格筋におけるように、横隔膜におけるウトロピントランスジーンの発現が筋細胞膜にDPCを再配置する。mdx横隔膜のヘモトキシリン及びエオシン染色された断片の組織学的分析は、繊維増多、細胞浸潤、及び中心集中された核を含む種々の筋原繊維サイズの多数の領域を示す。しかしながら、ウトロピントランスジェニック横隔膜は、壊死もなく、規則的な筋原繊維サイズを伴って、且つ中心集中された核を実質的に有さない、正常な横隔膜と実質的に同じに見える。mdx横隔膜においては、より高い倍率に基づいて、より組織学的に正常に見える、壊死を有さない領域においてさえ、筋原繊維は、連続した再生の徴候である中心集中された核をしばしば含む種々のサイズのものである。ウトロピントランスジェニック横隔膜においては、高い倍率でさえ、全筋肉は正常に見える。DPCの通常の組織学及び確立への回帰は、ジストロフィー表現型からのウトロピントランスジェニック横隔膜の主要回復を予測するジストロピントランスジェニックマウス〔５，６，７，24〕に関して見出されるような、２種の重要な観察である。本発明者は、骨格筋及び横隔膜において高いレベルでウトロピントランスジーンを発現することによって、mdxマウスのジストロフィー筋肉表現型の有意な低下を示した。最初に、それらの結果は、ウトロピンがインビボでジストロピンを置換できることを強く示唆する。これは、ジストロピンの欠乏の結果を補足し、そして従って緩和するために正常なウトロピン筋肉発現を高める小さな分子の使用が、DMD療法のための有望な手段であることを包含する。このアプローチは、すべての筋肉を潜在的に標的化し、そして従って、呼吸及び心筋肉を保存することによって寿命を長くするであろう。ウトロピンは、多くの組織において発現され、その結果、一般化されたアップレギュレーションは有害な副作用を有さない。本発明の実験動物モデルにおいては、ウトロピントランスジーンを高レベルで発現する正常なマウスは、それらの骨格筋及び横隔膜筋において有害な副作用を有さないように見える。胎児ヘモグロビンをアップレギュレーションするために酪酸塩を用いてそのような遺伝子療法アプローチについての先例は、鎌状赤血球細胞疾患の臨床学的試験において好結果を有している〔41，42〕。mdxマウスにおけるジストロフィー表現型を実質的に減少させるために、ジストロフィンの野性型のレベルのわずか20〜30％が必要であった。類似するレベルのウトロピンがジストロフィー損失を補償するのに適切であるかどうかを決定することが興味の対称である。さらに、ウトロピンは筋肉を包含するすべての組織において通常発現されるので、ウィルス又はリポソームを用いての従来の遺伝子療法アプローチにおいてジストロピントランスジーンよりもむしろこのウトロピントランスジーンの使用が、そのトランスジーンに対するいづれかの可能性ある免疫学的応答を回避することができる。トランスジェニックmdx及びmdxマウスからの筋肉を、インビトロでストレスを与えた。実質的に、試験は、能動収縮の間、延長する力により生成される高い機械的ストレスをモニターし、そして力の低下を測定する。その方法は、Deconinc kなど〔46〕により詳細に、実質的に記載される。悪化の測定は、筋力が適用され得る力の低下である。この力の低下は、不可逆性であり、そして損傷を受けた筋肉繊維の数と相互関係する。Mdx筋肉は、この試験に対して特に敏感であり、そして非常に悪化する〔46〕。本発明者のデータは、mdxマウスにおける力の低下が−55％であることを示す。しかしながら、ウトロピントランスジェニック同腹子においては、その力の低下がわずか−20％であった。正常なマウスの筋肉は通常、−15％の力の低下を有する。従って、mdxマウスにおけるウトロピントランスジーンの発現は、大きな機械的ストレスにより引き起こされる損傷を相当に低める。方法トランスジーンの構成及びマイクロインジェクションウトロピンのアミノ−及びカルボキシ−末端部分を、鋳型としてオーバーラッピングcDNAを用いてPCR生成物としてクローン化し、そして次に、読取り枠を整合して一緒に連結し、切断されたウトロピンcDNAを生成した。次に、PCR生成物を、2.2kbのヒト骨格α−アクチン(HSA)プロモーター及び調節領域〔43，44〕、並びにSV40の大ＴポリＡ部位を含むベクター中にクローン化した。そのクローニング部位は、トランスジーンが第２のHSA未翻訳エキソンの開始部分近くに位置するように存在し、そしてAsp 718／NotＩ部位が完全なフラグメントを生成するために使用された。トランスジェニックマウスを、C57BL／６×CBA／CA親からのＦ₂ハイブリッド卵母細胞の前核中への精製されたHSAトランスジーン挿入体のマイクロインジェクションにより生成した〔45〕。陽性トランスジェニックマウスを、ウトロピントランスジーンの中央部分に対するプローブを用いてサザンブロットすることによって同定した。多くの創始者Ｆ₀雄を繁殖し、分析及び繁殖のためにより多くの子孫を生成した。タンパク質分析全筋肉の抽出物を、１mlの抽出緩衝液（75mMのトリス、pH 6.8、3.8％のSDS、４Ｍの尿素、20％のグリセロール、５％のβ−メルカプトエタノール）における均質化により調製し、次に、95℃で５分間、加熱した。通常50μｇの全タンパク質(Biorad DCタンパク質アッセイキットを用いて定量化された）を、６％ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、そしてニトロセルロースに移した。ウトロピントランスジーン発現を、マウス抗−ウトロピンモノクローナル抗体(MANCHO7〔18〕)の１／200希釈溶液を用いて検定し、そして抗− マウスIgG-POD及び化学ルミネセンス（Boehringer）を用いて可視化した。断片化のために、骨格筋サンプルを除去し、そしてOCT化合物(BDH)に含浸し、そして液体窒素により冷却されたイソペンタンにおいて凍結した。横隔膜を除去し、半分に切断し、次に縦にロールし、そしてOx肝臓間にサンドイッチし、延伸及びより容易な断片化を促進した。次に、そのサンドイッチを凍結した。固定されていない８μｍの低温断片の免疫染色を、50mMのトリス、150mMのNaCl（pH 7.5）溶液(TBS)中、10％の熱不活性化されたウシ胎児血清において断片をブロックすることによって実施し、次にTBSに希釈された一次抗体を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。スライドをTBSによりそれぞれ５分間、４度、洗浄し、次にTBSに希釈された接合される第２の抗体と共に室温でさらに１時間インキュベートした。最終的に、スライドを前記のようにして洗浄し、VectaShield（V ector Labs）により固定し、そしてLeica DMRBE顕微鏡、顕微鏡写真システムを用いて写真を取った。免疫螢光のために使用される抗体抗体を次の希釈度で使用した。ウトロピン（Ｇ３、１／25）、ジストロピン（Ｐ６〔33〕、１／400)、β１−シントロピン(syn35、１／50）、α−サルコグリカン（〔38〕、１／５）に対するウサギポリクローナル、α／β−ジストログリカン（FP-B〔37〕、１／10）に対するヤギポリクローナル。ヤギに対するFITC接合の二次抗体（Sigma）及びウサギに対するCy３接合の二次抗体（Jackson Laboratories）を、それぞれ１／50及び１／200に希釈した。クレアチンキナーゼアッセイ雌mdxにより交配された雄のトランスジェニックマウスに起因する４匹のＦ₃− 腹子から生成された生後４〜５週目のマウスからの血清CKレベルをアッセイした。尾の先端を切除し、そしてDNAをサザンブロットのために調製し、個々のマウスのトランスジェニック状態を確立した。血液を同時に採血し、血餅形成を可能にし、そして血清を除去した。血清クレアチンキナーゼレベルを、Boehringer N AC-CKキット及び５μｌの血清を用いて測定した。１分当たりの割合を、４分にわたって平均化し、そしてＵ／ｌとして計算した。例３ウトロピンの発現が再生の工程において筋肉に対して有益であるかどうかを見るために、HSAプロモーター（HSA-PCR6.0-myc）の制御下でのmyc標識された、切断ウトロピンミニ遺伝子を、mdx筋肉中に直接的に注射した。本発明者のデータは、注射部位に隣接する繊維の大部分におけるウトロピンミニ遺伝子の筋細胞膜局在化を示す。ウトロピンミニ遺伝子を、myc標識エピトープに対して特異的である抗体9E10を用いて検出した。重要なことには、9E10が局在化される場合、α−及びγ−サルコグリカンの有意な染色が存在した。α−サルコグリカン染色は、他の繊維においては実質的に陰性であった。ジストロピンタンパク質複合体の再確立は、筋肉回復のための重要なマーカーであることが示された〔５，６，７，24〕。この結果は、疾病工程がそれ自体明白であり、すなわち変性及び再生がmdx筋肉に見られる場合でさえ、ウトロピンの発現は有益であることを示唆する。これは、DMDにおいて、影響された本体の１／３が新規の突然変異であることを考慮する場合に重要である。従って、DMDの最初の徴候が、生後２年の後、それら自体明白である場合でのみ、診断が達成され得る。例４ヒト一本鎖DNAからのフラグメントを生成するためにPCR方法を利用して、PCR6 .0をミッシングするヒトウトロピン配列の残りをクローン化した。そのフラグメントは、完全なウトロピンタンパク質を生成するためのすべてのアミノ酸コード配列を含むクローンを生成するためのユニークHpaＩ制限部位（図２ｃを参照のこと）中への棒状ドメインのクローン化を可能にするプライマーを利用した。図９は、標準の一文字コードを用いて上記に示されるアミノ酸配列を有する完全な長さのウトロピン構造体のDNA配列を示す。ウトロピンの完全な長さの構造体を、図５ｂに示される態様に類似する態様で、ヒト骨格αアクチンプロモーター(HSA)発現構造体中にクローン化した。この完全な長さのウトロピン発現構造体を用いて、マウス筋肉において完全な長さのウトロピンタンパク質を発現することができるトランスジェニックマウスを生成した。類似する実験が例２に記載のようにして実施され、mdxマウスにおける筋肉病理学を改善することにおいて、切断されたウトロピンタンパク質と比較して完全な長さのウトロピンタンパク質の有効性のいづれかの差異が同定され得る。すべての組織における高レベルのウトロピン発現が、計画する治療プロトコールにおいて、及び組織−特異的発現と非特異的発現との間での特定の選択において助けるために有害であるかどうかを評価するために、マウスモデルを、完全な長さのウトロピン構造体を用いて開発している。すべての組織において発現されるプロモーターの調節下で完全な長さのウトロピンタンパク質を発現するトランスジェニックマウスが創造されるであろう。第１の実験のために選択されるプロモーターは、すべての組織において発現することが示されているヒトユビキチン−Ｃプロモーターである。それらのマウスが完全な長さのウトロピントランスジーンを発現することが示されるとすぐに、それらは、絶対的に高いレベルのウトロピンにより引き起こされるいづれかの可能性ある副作用を同定するためにモニターされるであろう。参考文献１．Winderなど．（1995）FEBS Letts 369：27-33．２．Blakaなど．（1994）Trand In Cell Biol 4：19-23．３．Tinsleyなど．(1994)Proc Natl Acad Sci，USA 91：8307-83 13．４．Englandなど．(1990)Nature 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号９６２２１７４．２ (32)優先日平成８年10月24日(1996．10．24) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デイビス，ケイ，エリザベスイギリス国，オックスフォードオーエックス１３キューユー，サウスパークスロード，デパートメントオブバイオケミストリー，ジェネティクスラボラトリー

Claims

【特許請求の範囲】１．図３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を有する核酸単離体。２．前記ヌクレオチドの配列が図３のコードヌクレオチド配列である請求の範囲第１項記載の核酸。３．前記ヌクレオチドの配列が、図３のコードヌクレオチド配列の１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の付加、置換、挿入及び欠失による変異体又は誘導体である請求の範囲第１項記載の核酸。４．アクチンを結合することができ、そしてジストロピンタンパク質複合体を結合することができ、図３のアミノ酸配列の１又は複数のアミノ酸の１又は複数の付加、置換、挿入及び欠失による変異体又は誘導体であるアミノ酸配列を包含し、そしてジストロピンと免疫学的に区別できるポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を有する核酸単離体。５．前記ポリペプチドが図９のアミノ酸配列を包含する請求の範囲第４項記載の核酸。６．図９のコードヌクレオチド配列を有する請求の範囲第５項記載の核酸。７．図９のコード配列の１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の付加、欠失、挿入又は置換による変異体又は誘導体であるコードヌクレオチド配列を有する請求の範囲第５項記載の核酸。８．ベクターに含まれる請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の核酸。９．前記ベクターが発現ベクターである請求の範囲第８項記載の核酸。 10．請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の核酸、及び医薬的に許容できる賦形剤を含む組成物。 11．請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の核酸を含む細胞。 12．筋肉細胞である請求の範囲第11項記載の細胞。 13．前記ポリペプチドが発現される請求の範囲第11又は12項記載の細胞。 14．哺乳類に存在する請求の範囲第11〜13のいづれか１項記載の細胞。 15．請求の範囲第11〜13のいづれか１項記載の細胞を有する哺乳類。 16．請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の核酸を含む哺乳類。 17．細胞中への請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の核酸の導入を包含する方法。 18．前記細胞が筋肉細胞である請求の範囲第17項記載の方法。 19．前記導入がインビトロで起こる請求の範囲第17又は18項記載の方法。 20．請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の核酸のコードヌクレオチド配列の発現を細胞において引き起こし又は可能にすることを包含する方法。 21．前記細胞が哺乳類の一部である請求の範囲第20項記載の方法。 22．前記発現生成物が、発現に続いて精製され、そして／又は単離される請求の範囲第20項記載の方法。 23．前記発現生成物が、発現生成物の精製及び／又は単離に続いて、少なくとも１種の追加の成分を含む組成物中に配合される請求の範囲第22項記載の方法。 24．請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の核酸によりコードされるようなポリペプチド。 25．天然のウトロピンを除く、請求の範囲第４項記載の核酸によりコードされるようなポリペプチド。 26．請求の範囲第24又は25項記載のポリペプチド、及び医薬的に許容できる賦形剤を含む組成物。 27．哺乳類におけるジストロフィー表現型の１又は複数の徴候を改善するための方法であって、請求の範囲第24項記載のポリペプチドを哺乳類の細胞に供給することを包含する方法。 28．哺乳類におけるジストロフィー表現型の１又は複数の徴候を改善するための方法であって、請求の範囲第25項記載のポリペプチドを哺乳類の細胞に供給することを包含する方法。 29．前記ポリペプチドが、哺乳類に投与されるコード核酸からの発現により細胞に供給される請求の範囲第27又は28項記載の方法。 30．哺乳類におけるジストロピン表現型を処置するための薬剤の製造への請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の核酸の使用。