CN118159656A

CN118159656A - 肌营养不良的治疗

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Publication number: CN118159656A
Application number: CN202280068850.8A
Authority: CN
Inventors: K·J·布朗; J·格林
Original assignee: Solid Biotechnology
Current assignee: Solid Biotechnology
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2024-06-07
Also published as: IL310725A; KR20240095165A; JP2024532758A; EP4384628A2; TW202328446A; AU2022328215A1; WO2023018854A3; CA3228365A1; WO2023018854A2

Abstract

本文所述的发明提供一种具有减少的CpG岛的编码微肌营养不良蛋白的密码子优化的多核苷酸，以及其在治疗肌营养不良如DMD/BMD中的用途。

Description

肌营养不良的治疗

相关申请的引用

本申请要求2021年8月11日提交的美国临时专利申请第63/231,720号的提交日的优先权和权益，包括任何附图和序列表的所述申请的全部内容通过引用并入本文中。

背景技术

肌营养不良(MD)是一组导致进行性无力和肌肉质量损失的疾病。在肌营养不良中，异常基因(突变型基因)不产生形成健康肌肉所需的功能性野生型蛋白质。

肌营养不良对受影响患者的生活质量具有严重致衰弱影响。杜氏型肌营养不良(DMD)是最具破坏性的肌肉疾病之一，每5,000名新生儿中就有1人受到影响。它是最典型的肌营养不良，由编码肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)的成员的基因中的突变引起。这些MD由通过DAPC键结的肌纤维膜-细胞骨架的损失相关的膜脆性引起。

具体地，DMD由DMD基因中的突变引起，导致DMD mRNA的减少以及肌营养不良蛋白或功能性肌营养不良蛋白(一种与肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)相关的427kDa肌纤维膜蛋白)的缺乏(Hoffman等人，Cell 51(6):919-928，1987)。DAPC由肌肉肌纤维膜处的多种蛋白质组成，所述蛋白质通过肌营养不良蛋白(一种肌动蛋白结合蛋白)和α-肌营养不良蛋白聚糖(一种层粘连蛋白结合蛋白)在细胞外基质(ECM)与细胞骨架之间形成结构连接。这些结构连接在收缩期间起到稳定肌细胞膜的作用，并且防止收缩诱导的损伤。

由于DMD基因突变所致的肌营养不良蛋白的损失破坏肌营养不良蛋白糖蛋白复合物，从而导致肌膜脆性增加。包括钙流入肌浆、蛋白酶和促炎性细胞因子的活化以及线粒体功能障碍在内的一系列事件导致进行性肌肉退化。此外，神经元一氧化氮合酶(nNOS)的置换促成组织缺血、氧化应激增加和修复失败。疾病进展的特征在于肌肉坏死、纤维化和脂肪组织替代增加，以及在随后的肌肉活检中观察到的更大程度的纤维大小变化。

目前尚无法治愈DMD。护理标准包括施用皮质类固醇(如泼尼松或地夫可特)以稳定肌肉强度和功能，延长独立步行，以及延缓脊柱侧凸和心肌病；双膦酸盐；以及地诺单抗和重组甲状旁腺激素。

随着基因疗法的出现，DMD治疗的研究和临床试验集中在基因替代或其它旨在至少部分恢复肌营养不良蛋白功能的遗传疗法上。这些包括提供肌营养不良蛋白基因的功能拷贝，如肌营养不良蛋白小基因；或通过外显子跳跃和无义突变抑制来修复缺陷型肌营养不良蛋白基因产物。

腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度是约4.7kb，包括145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。

AAV具有独特的特征，所述特征使其成为有吸引力的用于将外来DNA递送至细胞的载体，例如在基因疗法中。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人和其它动物的自然感染是沉默且无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而允许在体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可作为转录活性核附加体(染色体外元件)在这些细胞的整个生命周期内持续存在。AAV原病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得重组基因组的构建可行。此外，由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此一些或全部内部大约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可被外来DNA如含有启动子、目标DNA和聚腺苷酸化信号的基因盒替代。rep和cap蛋白可以反式提供。AAV的另一个显著特征是它是极其稳定和强大的病毒。它容易地耐受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃持续数小时)，从而使AAV的冷藏变得不那么重要。AAV甚至可被冻干。最后，AAV感染的细胞对重复感染没有抵抗力。

多项研究表明，肌肉中存在长期(>1.5年)重组AAV介导的蛋白质表达。参见Clark等人，Hum Gene Ther 8:659-669(1997)；Kessler等人，Proc Nat.Acad Sc.U.S.A.93:14082-14087(1996)；和Xiao等人，J Virol 70:8098-8108(1996)。还参见Chao等人，MolTher2:619-623(2000)和Chao等人，Mol Ther 4:217-222(2001)。此外，因为肌肉高度血管化，重组AAV转导导致在肌肉内注射后在体循环中出现转基因产物，如Herzog等人，ProcNatl Acad Sci U.S.A.94:5804-5809(1997)和Murphy等人，Proc Natl Acad SciU.S.A.94:13921-13926(1997)中所描述。此外，Lewis等人，J Virol 76:8769-8775(2002)证明骨骼肌纤维具有正确抗体糖基化、折叠和分泌所必需的细胞因子，从而表明肌肉能够稳定表达分泌的蛋白质治疗剂。

为了优化AAV递送的微肌营养不良蛋白构建体的表达水平，可对微肌营养不良蛋白编码序列进行密码子优化，以在例如肌肉细胞的靶细胞中实现最佳表达。然而，许多传统的密码子优化过程无意中将CpG基序引入到密码子优化的编码序列中。甲基化CpG基序或CpG岛往往会抑制基因表达，而未甲基化CpG基序往往会引发针对病毒构建体的高免疫原性。

发明内容

本发明的一个方面提供一种编码SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或99.9％同一的核苷酸序列。

在某些实施方案中，多核苷酸在每个大写核苷酸处与SEQ ID NO:1同一，或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大写核苷酸。

在某些实施方案中，多核苷酸基本上缺乏CpG岛(例如，基于EMBOSS Cpgplot分析，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CpG岛)。

在某些实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少95％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少97％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少99％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

在某些实施方案中，多核苷酸由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成。

本发明的另一方面提供一种腺相关病毒(AAV)载体基因组，其包含本发明的多核苷酸，其中AAV载体基因组能够包装在AAV衣壳内。

本发明的另一方面提供一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含AAV衣壳和包含本发明的多核苷酸的AAV载体基因组，其中AAV载体基因组被包裹在AAV衣壳内。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，多核苷酸可操作地连接至转录调控元件。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，转录调控元件包含启动子。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，启动子为肌肉特异性启动子。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，肌肉特异性启动子为CK8启动子、心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子、CK7启动子、CK9启动子、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)启动子、混合α-肌球蛋白重链增强子-/MCK增强子-启动子(MHCK7)、肌肉特异性肌酸激酶(MCK)启动子、人类骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心肌肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素反应元件(gre)。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，肌肉特异性启动子为CK8启动子；任选地，所述CK8启动子包含SEQ ID NO:3或4的核苷酸序列。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，载体基因组还包含聚腺苷酸化信号序列，例如SEQ ID NO:8的polyA信号序列。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，聚腺苷酸化信号序列包含SV40聚腺苷酸化信号序列(例如SEQ ID NO:9)、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号序列(例如SEQ ID NO:10)或兔β珠蛋白(rBG)聚腺苷酸化信号序列(例如SEQ ID NO:11)。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，载体基因组还包含3’ITR序列，例如AAV2 3’ITR序列。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，载体基因组还包含5’ITR序列，例如AAV2 5’ITR序列。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，5’ITR序列和/或3’ITR序列分别包含或者是SEQ ID NO:12和13。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，载体基因组还包含增强微肌营养不良蛋白表达的内含子和/或外显子序列。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，内含子包含SEQ ID NO:14。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，载体基因组还包含5’UTR序列和/或3’UTR序列。

在某些实施方案中，在本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒中，本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列，或与其至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％同一的核苷酸序列，基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成。

在某些实施方案中，病毒颗粒的衣壳具有以下血清型：SLB-101、AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV 13、AAVrh10、AAVrh74、AAVhu32或AAVhu37。

在某些实施方案中，衣壳为SLB-101或AAV9血清型。

本发明的另一方面提供一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒，其包含SLB-101或AAV9衣壳，以及包裹于其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含编码SEQ ID NO:2的MD5微肌营养不良蛋白的多核苷酸序列。

在某些实施方案中，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

在某些实施方案中，多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1至少95％、96％、97％、98％、99％同一的核苷酸序列，并且在每个大写的核苷酸处与SEQ ID NO:1同一。

在某些实施方案中，载体基因组包含可操作地连接至多核苷酸序列的肌肉特异性控制元件。

在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件包含CK8启动子，例如SEQ ID NO:3或4的核苷酸序列的CK8启动子。

在某些实施方案中，载体基因组还包含聚腺苷酸化信号序列，例如包含SEQ IDNO:8的polyA信号序列。

在某些实施方案中，聚腺苷酸化信号序列包含SV40聚腺苷酸化信号序列(SEQ IDNO:9)、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号序列(SEQ ID NO:10)或兔β珠蛋白(rBG)聚腺苷酸化信号序列(SEQ ID NO:11)。

在某些实施方案中，载体基因组还包含3’ITR序列，例如SEQ ID NO:3’ITR；和5’ITR序列，例如SEQ ID NO:5’ITR。

在某些实施方案中，本发明的AAV病毒颗粒包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列，或与其至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％同一的核苷酸序列，基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成。

本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的多核苷酸、本发明的rAAV载体基因组或rAAV病毒颗粒、以及药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，药物组合物适合于或配制用于静脉内、皮下、肌内、真皮内、腹膜内或鞘内施用。

本发明的另一方面提供一种治疗有需要的人类的肌营养不良的方法，所述方法包括向所述人类施用治疗有效量的本发明的多核苷酸、本发明的rAAV载体基因组或rAAV病毒颗粒、或本发明的药物组合物。

在某些实施方案中，肌营养不良的特征在于肌营养不良蛋白基因的功能丧失突变。

在某些实施方案中，肌营养不良是杜氏肌营养不良(DMD)、贝氏肌营养不良(BMD)或X连锁扩张型心肌病。

在某些实施方案中，rAAV病毒颗粒以约1×10¹²至约1×10¹⁶个载体基因组(vg)/kg、或约1×10¹³至约1×10¹⁵个载体基因组(vg)/kg的剂量施用。

本发明的另一方面提供一种包含本发明的多核苷酸、或本发明的rAAV载体基因组或rAAV病毒颗粒的宿主细胞。

在某些实施方案中，宿主细胞是HeLa细胞、Cos7细胞、HEK293细胞、A549细胞、BHK细胞、Vero细胞、RD细胞、HT-1080细胞、ARPE-19细胞或MRC-5细胞。

在某些实施方案中，宿主细胞是HeLa细胞或293/293T细胞。

应理解，本文所述的本发明的任一个实施方案可与本发明的任何一个或多个另外的实施方案组合，包括仅在实施例中描述或仅在上文或下文部分之一或本发明的一方面中描述的那些实施方案。

附图说明

图1显示了从EMBOSS Cpgplot在线工具输出的、针对编码SEQ ID NO:2的天然(未密码子优化的)人类微肌营养不良蛋白编码序列的结果。通过在线工具鉴定了一(1)个CpG岛。选择的参数：窗口大小＝100，最小长度＝100，最小观察值＝0.6，最小百分比＝50。

图2显示了从EMBOSS Cpgplot在线工具输出的、针对编码SEQ ID NO:2的第一密码子优化的人类微肌营养不良蛋白编码序列的结果。通过在线工具鉴定了九(9)个CpG岛。使用Gene Art进行密码子优化。选择的参数：窗口大小＝100，最小长度＝100，最小观察值＝0.6，最小百分比＝50。

图3显示了从EMBOSS Cpgplot在线工具输出的SEQ ID NO:1的结果，其是通过去除编码SEQ ID NO:2的第一密码子优化的人类微肌营养不良蛋白编码序列中的9个鉴定的CpG岛而得到的。没有(0)CpG岛屿是通过在线工具鉴定的。选择的参数：窗口大小＝100，最小长度＝100，最小观察值＝0.6，最小百分比＝50。

图4显示了从EMBOSS Cpgplot在线工具输出的、针对编码SEQ ID NO:2的第二密码子优化的人类微肌营养不良蛋白编码序列的结果。通过在线工具鉴定了四(4)个CpG岛。使用GenScript进行密码子优化。选择的参数：窗口大小＝100，最小长度＝100，最小观察值＝0.6，最小百分比＝50。

图5显示了从EMBOSS Cpgplot在线工具输出的、针对编码SEQ ID NO:2的第三密码子优化的人类微肌营养不良蛋白编码序列的结果。通过在线工具鉴定了十一(11)个CpG岛。使用DNA2.0进行密码子优化。选择的参数：窗口大小＝100，最小长度＝100，最小观察值＝0.6，最小百分比＝50。

图6显示了从EMBOSS Cpgplot在线工具输出的、针对编码SEQ ID NO:2的第四密码子优化的人类微肌营养不良蛋白编码序列的结果。通过在线工具鉴定了十(10)个CpG岛。使用DNA2.0，使用第一个密码子优化的人类微肌营养不良蛋白编码序列(通过Gene Art优化的密码子)作为输入来进行密码子优化。选择的参数：窗口大小＝100，最小长度＝100，最小观察值＝0.6，最小百分比＝50。因此，使用不同方法进行的连续几轮密码子优化并没有消除CpG岛。

图7显示实施例2中描述的TLR9测定的示意图。

具体实施方式

1.综述

本文所述的发明提供了某些密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列的CpG岛减少或基本上消除的型式，以及其在触发非所需宿主免疫和/或表达沉默的风险最小化的情况下的用途。

本发明部分基于以下发现：为了在哺乳动物细胞中最佳表达而优化的某些密码子优化的序列无意中引入了CpG基序或CpG岛，并且可显著减少或消除此类CpG基序以避免触发非所需宿主免疫反应，同时基本上维持密码子优化产生的增强表达。

CpG基序含有胞嘧啶三磷酸脱氧核苷酸(“C”)，随后是鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸(“G”)。之间的“p”是指连续核苷酸之间的磷酸二酯键。当这些CpG基序被甲基化时，其可抑制包含或邻近于甲基化CpG基序的编码序列的表达。在另一方面，当CpG基序未甲基化时，其可充当免疫刺激剂，所述免疫刺激剂可诱导非所需宿主免疫反应。

CpG基序被视为病原体相关分子模式(PAMP)，因为其在微生物基因组中丰富，但在脊椎动物基因组中很少见。CpG PAMP被模式识别受体(PRR)Toll样受体9(TLR9)识别，所述受体仅在人类和其它高等灵长类动物的B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)中组成型表达。在非临床模型中，未甲基化CpG基序对TLR9的结合和激活可促进CTL对AAV载体的反应。含有未甲基化CpG的多核苷酸已被用作疫苗开发中的佐剂，以刺激强烈的细胞免疫反应。同时，许多使用不同密码子修饰策略的基因治疗试验在各自的开放阅读框(ORF)中产生了广泛的CpG含量(野生型的0至5倍)，并且已发现低CpG含量与长期表达之间有很强的相关性。

许多序列已被证明可通过CpG二聚体的数量和位置以及侧接CpG二聚体的精确碱基序列的变化来刺激TLR9。因此，CpG基序可基于其序列、二级结构以及对人类外周血单核细胞(PBMC)的影响而大致分为5个种类或类别。

例如，使用合成的寡脱氧核苷酸(ODN)，含有ODN的A类CpG基序具有以下结构特征：(1)在5'端、3'端或两者处存在poly G序列；(2)内部回文序列；(3)内部回文内包含的GC二核苷酸；以及(4)部分PS修饰的主链。此类ODN刺激大量I型干扰素(其中最重要的是IFNα)的产生，并诱导浆细胞样树突状细胞的成熟。A类ODN也是通过间接细胞因子信号传导强效NK细胞激活剂。

相比之下，含有ODN的B类CpG基序具有以下结构特征：(1)一个或多个6聚体CpG基序5'-Pu Py C G Py Pu-3'；(2)完全硫代磷酸酯化(PS修饰)的主链；以及(3)长度通常为18至28个核苷酸。B类ODN(即ODN 2007)是人类B细胞和单核细胞成熟的强刺激剂。它们还刺激pDC的成熟，但程度低于A类ODN和极少量的IFNα。

存在本领域技术人员已知的软件或在线工具来预测可能在宿主中引起各种免疫反应的不同类别的CpG基序的存在。例如，EMBOSS Cpgplot是一种在线工具，网址为URLebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot，其需要输入核苷酸序列。典型参数包括约100nt的窗口大小、约200nt的最小长度(在一些实施方案中其可调整至例如100)、约0.6的最小观察值和约50(％)的最小百分比。返回结果将包括许多结果，包括假定的CpG岛或不存在所述CpG岛。

通过检查编码SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白的密码子优化的多核苷酸，鉴定了许多潜在的CpG基序，并手动消除，同时保持所得序列编码SEQ ID NO:2的能力。

本发明的一种示例性多核苷酸包含许多诸如下文所述的“大写核苷酸”的核苷酸序列变化，如以下部分中所述。此类大写核苷酸的集合构成了SEQ ID NO:1中核苷酸序列变化的特征，以减少任何CpG基序的影响。本发明的其它多核苷酸含有相同的特征改变，尽管其与SEQ ID NO:1在许多其它核苷酸上不同，例如低至约70％的序列同一性，但由于密码子简并性，其仍可编码SEQ ID NO:2。

因此，在一个方面，本发明提供一种编码SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或99.9％同一的核苷酸序列。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸在每个大写核苷酸处与SEQ ID NO:1同一，或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大写核苷酸。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸基本上缺乏CpG岛，例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CpG岛。可使用本领域认可的软件，例如EMBOSS Cpgplot在线工具，基于多核苷酸序列来预测CpG基序或岛的存在或不存在。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少95％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少97％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少99％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，多核苷酸可操作地连接至转录调控元件。在某些实施方案中，转录调控元件包含启动子，例如组成型启动子或肌肉特异性启动子。

许多肌肉特异性启动子可用于表达本发明的CpG减少的密码子优化的多核苷酸，包括但不限于CK8启动子、心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子、CK7启动子、CK9启动子、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)启动子、混合α-肌球蛋白重链增强子-/MCK增强子-启动子(MHCK7)、肌肉特异性肌酸激酶(MCK)启动子、人类骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心肌肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素反应元件(gre)。

在某些实施方案中，肌肉特异性启动子为CK8启动子。

在某些实施方案中，CK8启动子包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

在某些实施方案中，CK8启动子为包含额外增强子元件的修饰的CK8启动子。在某些实施方案中，修饰的CK8启动子包含SEQ ID NO:6(基础CK8启动子，SEQ ID NO:3的CK8启动子的269-bp片段)，以及在5’端的130-bp增强子(SEQ ID NO:5)的一个额外拷贝。在某些实施方案中，修饰的CK8启动子为包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列的CK8e启动子。

在某些实施方案中，载体基因组进一步包含聚腺苷酸化信号序列。

在某些实施方案中，polyA信号序列包含SEQ ID NO:8。

在某些实施方案中，polyA信号序列包含SV40聚腺苷酸化信号序列(例如SEQ IDNO:9)。

在某些实施方案中，polyA信号序列包含牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号序列(例如SEQ ID NO:10)。

在某些实施方案中，polyA信号序列包含兔β珠蛋白(rBG)聚腺苷酸化信号序列(例如SEQ ID NO:11)。

在某些实施方案中，载体基因组还包含3’ITR序列。ITR序列可来自任何AAV，例如AAV2 3’ITR序列。

在某些实施方案中，载体基因组还包含5’ITR序列。ITR序列可来自任何AAV，例如AAV2 5’ITR序列。

在某些实施方案中，载体基因组还包含5’ITR序列和3’ITR序列。ITR序列可来自任何AAV，例如AAV2 5’和3’ITR序列。

反向末端重复(ITR)序列对于病毒DNA复制的启动和腺相关病毒基因组的环化非常重要。在ITR序列内，二级结构(例如由回文序列形成的茎和环)是病毒复制和/或包装中重要的一种或多种ITR功能。此类序列元件包括RBE序列(Rep结合元件)、RBE’序列和TRS(末端解析序列)。

在某些实施方案中，5’和/或3’ITR序列是野生型序列。

在某些实施方案中，5’和/或3’ITR序列是修饰的ITR序列。例如，野生型ITR序列的最5’端或最3’端可缺失。缺失至多可达18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。

在某些实施方案中，野生型AAV2 ITR的最5’端核苷酸的至多15个(例如正好15个)核苷酸，和/或最3’端核苷酸的至多15个(例如正好15个)核苷酸序列可缺失。

因此，5’和/或3’修饰的ITR可包含145-nt野生型AAV ITR序列的至多144、143、142、141、140、139、138、137、136、135、134、133、132、131、130、129、128或127-nt(例如130个核苷酸)。

在某些实施方案中，修饰的ITR序列包含wt ITR序列的RBE序列、RBE’序列和/或TRS。

在某些实施方案中，修饰的ITR序列包含RBE序列和RBE’序列两者。

在某些实施方案中，修饰的ITR序列赋予包含AAV载体基因组(见下文)的本发明质粒在细菌中的稳定性，例如质粒产生期间的稳定性。

在某些实施方案中，修饰的ITR不干扰包含AAV载体基因组的本发明的质粒的测序验证。

在某些实施方案中，修饰的5’ITR序列包含不是野生型AAV 5’ITR序列的一部分的5’异源序列。在某些实施方案中，修饰的3’ITR序列包含不为野生型AAV 3’ITR序列的一部分的3’异源序列。

在某些实施方案中，修饰的5’ITR序列包含不为野生型AAV(例如wt AAV2)5’ITR序列的一部分的5’异源序列，并且修饰的3’ITR序列包含不为野生型AAV(例如wt AAV2)3’ITR序列的一部分的3’异源序列，其中5’异源序列和3’异源序列彼此互补。

在某些实施方案中，5’异源序列和3’异源序列各自包含II型限制性内切核酸酶识别序列，例如Sse8387I的识别序列(CCTGCAGG)或PacI的识别序列(TTAATTAA)。

在某些实施方案中，5’异源序列包含CCTGCAGGCAG(SEQ ID NO:19)、基本上由其组成或由其组成，并且3’异源序列包含SEQ ID NO:19的反向互补序列、基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，5’异源序列包含TTAATTAAGG(SEQ ID NO:22)、基本上由其组成或由其组成，并且3’异源序列包含SEQ ID NO:22的反向互补序列、基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR均为上翻(flip)ITR。

在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR均为下翻(flop)ITR。

在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR独立地为上翻或下翻ITR。

在某些实施方案中，5’ITR为上翻ITR，并且3’ITR为下翻ITR。

在某些实施方案中，5’ITR为下翻ITR，并且3’ITR为上翻ITR。

在某些实施方案中，5’ITR为上翻ITR，并且3’ITR为上翻ITR。

在某些实施方案中，5’ITR为下翻ITR，并且3’ITR为下翻ITR。

如本文所用，5’上翻ITR具有比C:C’区段更靠近5’-末端的B:B’区段。3’上翻ITR具有比C:C’区段更靠近3’-末端的B:B’区段。5’下翻ITR具有比B:B’区段更靠近5’-末端的C:C’区段。3’下翻ITR具有比B:B’区段更靠近3’-末端的C:C’区段。

在某些实施方案中，修饰的5’ITR和修饰的3’ITR均为下翻ITR，修饰的5’ITR包含不为野生型AAV2 5’ITR序列的一部分的5’异源序列(例如SEQ ID NO:19或22)，并且修饰的3’ITR序列包含不为野生型AAV2 3’ITR序列的一部分的3’异源序列，其中5’异源序列和3’异源序列彼此互补，并且各自包含II型限制性内切核酸酶识别序列，例如Sse8387I或PacI的识别序列；任选地，所述修饰的5’ITR序列还包含C:C’区段中的缺失，例如11-nt缺失AAAGCCCGGGC(SEQ ID NO:23)。

在某些实施方案中，5’ITR包含SEQ ID NO:12、基本上由其组成、或由其组成。

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGAC CTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCAT CACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO:12)

在某些实施方案中，5’ITR包含SEQ ID NO:24、基本上由其组成、或由其组成。

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGG CGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTG GCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO:24)

在某些实施方案中，5’ITR包含SEQ ID NO:25、基本上由其组成、或由其组成。

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGAC CTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCAT CACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO:25)

在某些实施方案中，5’ITR包含SEQ ID NO:26、基本上由其组成、或由其组成。

TTAATTAAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGC GTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG CCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO:26)

在某些实施方案中，3’ITR包含SEQ ID NO:13、基本上由其组成、或由其组成。

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACT GAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAG(SEQ ID NO:13)

在某些实施方案中，3’ITR包含SEQ ID NO:27、基本上由其组成、或由其组成。

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACT GAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG(SEQ ID NO:27)

在某些实施方案中，3’ITR包含SEQ ID NO:28、基本上由其组成、或由其组成。

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACT GAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAA(SEQ ID NO:28)

在某些实施方案中，5’ITR序列为或包含SEQ ID NO:12，并且3’ITR序列为或包含SEQ ID NO:13。

在某些实施方案中，5’ITR序列为或包含SEQ ID NO:24，并且3’ITR序列为或包含SEQ ID NO:27。

在某些实施方案中，5’ITR包含145-nt wt AAV2 5’ITR的最3’核苷酸的至多141nt(例如，145-nt wt AAV2 5’ITR的4个或更多个最5’端的缺失)。

在某些实施方案中，5’ITR包含145-nt wt AAV2 5’ITR的最3’核苷酸的至多130nt(例如，145-nt wt AAV2 5’ITR的15个或更多个最5’端的缺失)。

在某些实施方案中，3’ITR包含145-nt wt AAV2 3’ITR的最5’核苷酸的至多141nt(例如，145-nt wt AAV2 3’ITR的4个或更多个最3’端的缺失)。

在某些实施方案中，3’ITR包含145-nt wt AAV2 3’ITR的最5’核苷酸的至多130nt(例如，145-nt wt AAV2 3’ITR的15个或更多个最3’端的缺失)。

在某些实施方案中，5’和3’ITR序列与基于三重转染的哺乳动物细胞中的AAV产生相容。

在某些实施方案中，5’和3’ITR序列与基于杆状病毒载体的昆虫细胞(例如Sf9)中的AAV产生相容(见下文)。

在某些实施方案中，5’和3’ITR序列与基于HSV载体的哺乳动物细胞中的AAV产生相容(见下文)。

在某些实施方案中，载体基因组还包含增强微肌营养不良蛋白表达的内含子和/或外显子序列。在某些实施方案中，内含子/外显子使微肌营养不良蛋白的表达增加至多2-10倍。

在某些实施方案中，内含子包含β-珠蛋白剪接供体/IgG剪接受体嵌合内含子的序列(参见例如Promega pCMVTnT载体(目录号L5620)中的嵌合内含子。

在某些实施方案中，内含子包含SEQ ID NO:14。

gtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgaga cagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcc tttctctccacag(SEQ ID NO:14)

在某些实施方案中，启动子为CK8e启动子(下文)，其包含增强表达的48bp(SEQ IDNO:7)或50bp(SEQ ID NO:8)MCK UTR外显子序列。

在某些实施方案中，载体基因组不包含潜在增强微肌营养不良蛋白的表达的内含子和/或外显子序列。消除内含子/外显子序列可提高包装效率并增加其它序列元件的包装能力。

在某些实施方案中，载体基因组还包含5’UTR序列和/或3’UTR序列。

在某些实施方案中，本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒从5’至3’包含以下序列元件、基本上由以下序列元件组成或由以下序列元件组成：(1)5’ITR(例如野生型或修饰的AAV2 5’ITR，例如145-nt野生型AAV2 5’ITR，或141-nt修饰的AAV2 5’ITR(例如SEQ IDNO:12))，(2)肌肉特异性启动子(例如CK8启动子(例如SEQ ID NO:3)或修饰的CK8蛋白，例如本文所述的CK8e(SEQ ID NO:4))；(3)本发明的任何一种CpG减少/消除密码子优化的多核苷酸(例如SEQ ID NO:1或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或99.9％同一的核苷酸序列)；(4)polyA信号序列(例如SEQ ID NO:8-11中的任一者)；和(5)3’ITR(例如野生型或修饰的AAV2 3’ITR，例如145-nt野生型AAV2 3’ITR，或141-nt修饰的AAV2 3’ITR(例如SEQ ID NO:13))；或与AAV载体基因组至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％同一的核苷酸序列。任选地，紧接在(3)之前，存在包含紧邻ATG起始密码子的5’的ACC的KOZAK序列。

在某些实施方案中，本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒从5’至3’包含以下序列元件、基本上由以下序列元件组成或由以下序列元件组成：(1)5’ITR(例如SEQ ID NO:12)，(2)CK8启动子(例如SEQ ID NO:3)；(3)本发明的任何CpG减少/消除密码子优化的多核苷酸(例如SEQ ID NO:1)；(4)polyA信号序列(例如SEQ ID NO:8)；(5)3’ITR(例如SEQ IDNO:13)；或与AAV载体基因组至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％同一的核苷酸序列。任选地，紧接在(3)之前，存在包含紧邻ATG起始密码子的5’的ACC的KOZAK序列。

在某些实施方案中，本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列，或与其至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％同一的核苷酸序列，基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成。

在某些实施方案中，本发明的rAAV病毒颗粒包含以下血清型的衣壳：SLB-101、AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV13、AAVrh10、AAVrh74、AAVhu32或AAVhu37。

在某些实施方案中，血清型为SLB-101(例如VP1衣壳序列为SEQ ID NO:21)或AAV9(例如VP1衣壳序列为SEQ ID NO:20)。

在某些实施方案中，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或99.9％同一的核苷酸序列。

在某些实施方案中，多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一的核苷酸序列，并且在每个大写核苷酸处与SEQ ID NO:1同一或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大写核苷酸。

在某些实施方案中，多核苷酸序列基本上缺乏CpG岛(例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CpG岛)。

在某些实施方案中，载体基因组还包含聚腺苷酸化信号序列，例如SEQ ID NO:8-11中的任一者。

在某些实施方案中，载体基因组还包含3’ITR序列，例如SEQ ID NO:13；和5’ITR序列，例如SEQ ID NO:12。

在某些实施方案中，宿主细胞是HeLa细胞或293/293T细胞。

对于上文概括描述的本发明，以下部分提供了对本发明的特定方面的更详细的描述。因此，除非明确声明或不适当，否则本文描述的任何一个实施方案，包括仅在实施例或权利要求书中描述的那些实施方案均可与本发明的任何一个或多个额外实施方案组合。

2.CpG密码子优化的编码微肌营养不良蛋白的多核苷酸，AAV载体基因组

在一个方面，本文所述的发明提供了密码子优化的多核苷酸序列，例如SEQ IDNO:1，其编码SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白，并且其具有减少的CpG位点/岛的数量，或基本上消除了CpG岛。下面提供了SEQ ID NO:1的多核苷酸序列和SEQ ID NO:2的蛋白质序列。

atgctgtggtgggaggaagtggaagattgctacgagcgcgaggacgtgcagaagaaaaccttcaccaaatgggtcaacgcccagttcagcaagttcggcaagcagcacatcgagaacctgttcagcgacctgcaggacggcagacggctgctggatctgctggaaggcctgaccggacagaagctgcccaaagagaagggcagcaccagagtgcacgccctgaacaacgtgaacaaggccctgcgggtgctgcagaacaacaaTgtggacctGgtgaacatTggcagcacAgacatTgtggaTggcaaccacaagctgaccctgggcctgatctggaacatcatcctgcactggcaagtgaagaacgtgatgaagaacatcatggccggcctgcagcagaccaacagcgagaagatcctgctgagctgggtgcgccagagcaccagaaactacccccaagtgaacgtgatcaacttcaccacctcttggagcgacggcctggccctgaatgccctgatccacagccacagacccgacctgttTgactggaacagTgtGgtgtgtcagcagagcgccacccagaggctggaacacgccttcaatatcgccagataccagctgggcatTgagaagctgctggaccccgaggatgtggacaccacctaccccgacaagaaatccatcctgatgtatatcaccagcctgttccaggtgctgcctcagcaggtgtccatcgaggccatccaggaagtggaaatgctgcccagaccccccaaagtgaccaaagaggaacacttccagctgcaccaccagatgcactactctcagcagatcaccgtgtccctggcccagggctacgagagaaccagcagccccaagccccggttcaagagctacgcctatacccaggccgcctacgtgaccaccagcgaccctaccagaagcccattccccagccagcatctggaagcccccgaggacaagagcttcggcagcagcctgatggaaagcgaagtgaacctggatagataccagaccgccctggaagaggtgctgtcctggctgctgagcgccgaggatacactgcaggctcagggcgagatcagcaaTgaTgtggaagtGgtgaaggaccagttccacacccacgagggctacatgatggacctgacagcccaccagggcagagtgggcaacattctgcagctgggctccaagctgatcggcaccggcaagctgagcgaggacgaagagacagaggtgcaggaacagatgaacctgctgaacagcagatgggagtgcctgagagtggccagcatggaaaagcagagcaacctgcacagctacgtgcccagcacctacctgaccgagatcacccatgtgtcccaggccctgctggaagtggaacagctgctgaacgcccccgatctgtgcgccaaggacttcgaggatctgttcaagcaggaagagagcctgaagaatatcaaggactctctgcagcagtccagcggcagaatcgacatcatccacagcaagaaaacagccgccctgcagtccgccacccccgtggaaagagtgaagctgcaggaagccctgtcccagctggacttccagtgggagaaagtgaacaagatgtacaaggaccggcagggcagattTgaccgcagTgtggaaaagtggAggAggttccactacgacatcaagatcttcaaccagtggctgacAgaggccgagcagttcctgagaaagacccagatccccgagaactgggagcacgccaagtacaagtggtatctgaaagaactgcaggatggcatTggccagagacagacAgtGgtgcggacactgaatgccaccggcgaggaaatcatccagcagagcagcaagaccgacgccagtattctgcaggaaaagctgggcagcctgaacctgagatggcaggaagtgtgcaagcagctgtccgaccggaagaagagactggaagaacagagTgaccagtggaagcggctgcatctgtcactgcaggaactgctGgtgtggctgcagctgaaggaTgaTgagctgagcagacaggcccctatTggcggcgattttcccgcAgtgcagaaacagaacgaTgtgcaccgggccttcaagagagagctgaaaacaaaagaaccAgtgatcatgagcaccctggaaacAgtgcggatctttctgaccgagcagcccctggaaggactggaaaaactgtaccaggaacccagagagctgccccctgaagaacgggcccagaacgtgaccagactgctgAggaagcaggccgaggaagtgaacacAgaatgggagaagctgaacctgcactcTgcTgactggcagAggaagatTgaTgagacactggaacggctgcaggaactgcaggaggccacAgacgagctggacctgaaactgagacaggccgaagtgatcaagggcagctggcagccagtgggcgacctgctgatcgacagcctgcaggatcacctggaaaaagtgaaagccctgagaggcgagatTgcccccctgaaagaaaaTgtgtcccaTgtgaacgacctggcccggcagctgacaacactgggcatccagctgagcccctacaacctgtccacactggaagatctgaacacccggtggaaactgctgcaggtggccgtggaagatagagtgcggcagctgcacgaggcccacagagattttggccctgcctcccagcacttcctgagcacatctgtgcagggcccctgggagagagccatctcccccaacaaggtgccctactacatcaaccacgagacacagaccacctgttgggaccaccccaagatgacAgagctgtaccagagcctggccgacctgaacaatgtgAggttcagTgcctacAggaccgccatgaagctgcggagactgcagaaagctctgtgcctggacctgctgtccctgtccgccgcttgtgatgccctggaccagcacaacctgaagcagaacgaccagcccatggatatcctgcagatcatcaactgcctgaccaccatctacgaccgcctggaacaggaacacaacaacctGgtgaatgtgcccctgtgTgtggacatgtgcctgaattggctgctgaatgtgtacgacaccggccggacaggccggatcagagtgctgagcttcaagaccggcatcatcagcctgtgcaaggcccacctggaagataagtaccgctacctgttcaaacaggtggccagctccaccggcttttgcgaccagagaaggctgggcctgctgctgcacgacagcatccagatccctagacagctgggcgaggtggcctctttTggcggcagcaatatTgagcctagTgtgcggagctgcttccagttTgccaacaacaagcccgagatTgaggccgccctgttcctggactggatgcggctggaaccccagagcatggtgtggctgcctgtgctgcatagagtggccgctgccgagacagccaagcaccaggccaagtgcaacatctgcaaagagtgccccatcatcggcttccggtacagaagcctgaagcacttcaactacgatatctgccagagctgctttttcagcggacgggtggccaagggccacaaaatgcactaccccatggtggaatactgcacccccaccacctccggggaggatgtgcgggattttgccaaggtgctgaaaaacaagttccggaccaagcgctacttTgccaaacacccccggatgggctatctgcccgtgcagacagtgctggaaggcgacaacatggaaaccgacaccatgtag(SEQ ID NO:1)

MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHSYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPAVQKQNDVHRAFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNVTRLLRKQAEEVNTEWEKLNLHSADWQRKIDETLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETDTM(SEQ ID NO:2)

如本文所用，“密码子优化的”多核苷酸编码序列是指在某些方面已被更改/改变的多核苷酸序列，使得所得密码子最适合在特定细胞、宿主或系统中，例如在特定哺乳动物(人类)细胞类型，例如肌肉细胞中表达。密码子优化不更改所编码蛋白质的氨基酸序列，即密码子优化的多核苷酸编码序列和进行密码子优化所基于的天然序列编码相同的氨基酸序列。

本发明的多核苷酸，例如SEQ ID NO:1编码被称为“microD5”、“MD5”或“μD5”的微肌营养不良蛋白(参见SEQ ID NO:2)。微肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间为肌膜提供稳定性，例如，微肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间充当减震器。MD5是特异性工程化的5-重复序列微型肌营养不良蛋白，其从N末端至C末端含有N末端肌动蛋白结合结构域、铰链区1(H1)、血影蛋白样重复序列R1、R16、R17、R23和R24、铰链区4(H4)和人全长肌营养不良蛋白的C末端肌营养不良蛋白聚糖结合域。US10,479,821和WO2016/115543(通过引用并入本文)中描述了这种5-重复序列微型肌营养不良蛋白和相关的肌营养不良蛋白小基因的蛋白质序列。

在上文所示的SEQ ID NO:1中，某些核苷酸被标记为大写字母，并且这些核苷酸在本文中统称为“SEQ ID NO:1的大写核苷酸”。具体地，SEQ ID NO:1的大写核苷酸包括SEQID NO:1的核苷酸264、273、282、291、297、303、543、555、558、627、1110、1113、1122、1656、1665、1678、1681、1722、1815、1830、1833、1989、2031、2052、2055、2079、2097、2115、2157、2181、2290、2316、2343、2346、2356、2364、2367、2406、2532、2550、2559、2844、2881、2889、2896、3081、3099、3339、3354、3363、3384、3405和3735。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸不仅编码相同的蛋白质(即SEQ ID NO:2)，而且共享SEQ ID NO:1的同一组大写核苷酸，但其在除了SEQ ID NO:1的大写核苷酸之外的核苷酸位置与SEQ ID NO:1不同。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸不仅编码相同的蛋白质(即SEQ ID NO:2)，而且在SEQ ID NO:1的大写核苷酸处也与SEQ ID NO:1基本上相同，尽管在除大写核苷酸之外的SEQ ID NO:1的位置中有额外的序列改变(例如，产生70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或99.9％的整体序列同一性)。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸在每个大写核苷酸处与SEQ ID NO:1同一，或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大写核苷酸。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少95％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。也就是说，本发明的多核苷酸编码SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白，并且进一步地，本发明的多核苷酸(1)在每个大写核苷酸处与SEQ ID NO:1同一，或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大写核苷酸；和/或(2)基本上缺乏CpG岛(例如，基于EMBOSS Cpgplot分析，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CpG岛)。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少97％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。也就是说，本发明的多核苷酸编码SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白，并且进一步地，本发明的多核苷酸(1)在每个大写核苷酸处与SEQ ID NO:1同一，或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大写核苷酸；和/或(2)基本上缺乏CpG岛(例如，基于EMBOSS Cpgplot分析，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CpG岛)。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少99％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。也就是说，本发明的多核苷酸编码SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白，并且进一步地，本发明的多核苷酸(1)在每个大写核苷酸处与SEQ ID NO:1同一，或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大写核苷酸；和/或(2)基本上缺乏CpG岛(例如，基于EMBOSS Cpgplot分析，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CpG岛)。

可比对任何两个或更多个相关或不相关多核苷酸之间或任何两个或更多个相关或不相关蛋白质序列之间的序列百分比同一性，并且可使用任何技术公认的方法分别计算核苷酸或氨基酸残基之间的匹配百分比，例如NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-10，1990)，所述工具可从例如美国国家生物中心信息(NCBI)网站的在线资源获得，根据查询和数据库的类型，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。类似的基于网络的工具可在EMBL-EBI网站上找到。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸基本上缺乏CpG岛(例如，基于EMBOSSCpgplot分析，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CpG岛)。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸基本上不能诱导TLR9激活，例如在如实施例2中所述的体外测定中。

本发明的另一方面提供一种腺相关病毒(AAV)载体基因组，其包含本发明的任何多核苷酸，其中AAV载体基因组能够包装在AAV衣壳内。

典型AAV的包装容量一般为约4.7kb，包括约0.2-0.3kb的5’和3’ITR序列，其中至少一者(可能两者)是AAV载体基因组包装至衣壳中所需的结构元件。

在某些实施方案中，AAV载体基因组包含某些ITR结构元件，例如Rep结合元件(RBE)、TR内的内部发夹(RBE’)和末端解析位点(TRS)。

本发明的另一方面提供一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含AAV衣壳和包含本发明的任何多核苷酸的AAV载体基因组，其中AAV载体基因组被包裹在AAV衣壳内。

在某些实施方案中，(CpG密码子优化的)多核苷酸可操作地连接至转录调控元件。在某些实施方案中，转录调控元件包含启动子，例如组成型启动子，或组织特异性启动子(例如肌肉特异性启动子)(见下文)。示例性启动子为CK8或其变体(见下文)。

在某些实施方案中，载体基因组还包含聚腺苷酸化信号序列，例如SEQ ID NO:8-11中的任一者的polyA信号序列(见下文)。

在某些实施方案中，载体基因组还包含3’ITR序列，例如AAV23’ITR序列。在某些实施方案中，载体基因组还包含5’ITR序列，例如AAV2 5’ITR序列。在某些实施方案中，5’ITR序列和/或3’ITR序列分别包含或为SEQ ID NO:12和13。

在某些实施方案中，载体基因组还包含增强微肌营养不良蛋白表达的内含子和/或外显子序列。在某些实施方案中，载体基因组不包含另外增强微肌营养不良蛋白的表达的内含子和/或外显子序列。

在某些实施方案中，本发明的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒从5’至3’包含以下序列元件、基本上由以下序列元件组成或由以下序列元件组成：(1)5’ITR(例如野生型或修饰的AAV2 5’ITR，例如145-nt野生型AAV2 5’ITR，或141-nt修饰的AAV2 5’ITR)，(2)肌肉特异性启动子(例如CK8启动子或修饰的CK8蛋白，例如本文所述的CK8e)；(3)本发明的任何一种CpG减少/消除密码子优化的多核苷酸(例如SEQ ID NO:1或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或99.9％同一的核苷酸序列)；(4)polyA信号序列(例如SEQ ID NO:8-11中的任一者)；和(5)3’ITR(例如野生型或修饰的AAV2 3’ITR，例如145-nt野生型AAV2 3’ITR，或141-nt修饰的AAV2 3’ITR)。

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGGCGCGCCACTTTAGACTAGCATGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGCATGCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAAAACTAGAACCATGCTGTGGTGGGAGGAAGTGGAAGATTGCTACGAGCGCGAGGACGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAACGCCCAGTTCAGCAAGTTCGGCAAGCAGCACATCGAGAACCTGTTCAGCGACCTGCAGGACGGCAGACGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACCGGACAGAAGCTGCCCAAAGAGAAGGGCAGCACCAGAGTGCACGCCCTGAACAACGTGAACAAGGCCCTGCGGGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTGAACATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAACGTGATGAAGAACATCATGGCCGGCCTGCAGCAGACCAACAGCGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTGCGCCAGAGCACCAGAAACTACCCCCAAGTGAACGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGCGACGGCCTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCCGACCTGTTTGACTGGAACAGTGTGGTGTGTCAGCAGAGCGCCACCCAGAGGCTGGAACACGCCTTCAATATCGCCAGATACCAGCTGGGCATTGAGAAGCTGCTGGACCCCGAGGATGTGGACACCACCTACCCCGACAAGAAATCCATCCTGATGTATATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCTCAGCAGGTGTCCATCGAGGCCATCCAGGAAGTGGAAATGCTGCCCAGACCCCCCAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACCGTGTCCCTGGCCCAGGGCTACGAGAGAACCAGCAGCCCCAAGCCCCGGTTCAAGAGCTACGCCTATACCCAGGCCGCCTACGTGACCACCAGCGACCCTACCAGAAGCCCATTCCCCAGCCAGCATCTGGAAGCCCCCGAGGACAAGAGCTTCGGCAGCAGCCTGATGGAAAGCGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACCGCCCTGGAAGAGGTGCTGTCCTGGCTGCTGAGCGCCGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGCGAGATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTGAAGGACCAGTTCCACACCCACGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGCAACATTCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATCGGCACCGGCAAGCTGAGCGAGGACGAAGAGACAGAGGTGCAGGAACAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGCCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGCTACGTGCCCAGCACCTACCTGACCGAGATCACCCATGTGTCCCAGGCCCTGCTGGAAGTGGAACAGCTGCTGAACGCCCCCGATCTGTGCGCCAAGGACTTCGAGGATCTGTTCAAGCAGGAAGAGAGCCTGAAGAATATCAAGGACTCTCTGCAGCAGTCCAGCGGCAGAATCGACATCATCCACAGCAAGAAAACAGCCGCCCTGCAGTCCGCCACCCCCGTGGAAAGAGTGAAGCTGCAGGAAGCCCTGTCCCAGCTGGACTTCCAGTGGGAGAAAGTGAACAAGATGTACAAGGACCGGCAGGGCAGATTTGACCGCAGTGTGGAAAAGTGGAGGAGGTTCCACTACGACATCAAGATCTTCAACCAGTGGCTGACAGAGGCCGAGCAGTTCCTGAGAAAGACCCAGATCCCCGAGAACTGGGAGCACGCCAAGTACAAGTGGTATCTGAAAGAACTGCAGGATGGCATTGGCCAGAGACAGACAGTGGTGCGGACACTGAATGCCACCGGCGAGGAAATCATCCAGCAGAGCAGCAAGACCGACGCCAGTATTCTGCAGGAAAAGCTGGGCAGCCTGAACCTGAGATGGCAGGAAGTGTGCAAGCAGCTGTCCGACCGGAAGAAGAGACTGGAAGAACAGAGTGACCAGTGGAAGCGGCTGCATCTGTCACTGCAGGAACTGCTGGTGTGGCTGCAGCTGAAGGATGATGAGCTGAGCAGACAGGCCCCTATTGGCGGCGATTTTCCCGCAGTGCAGAAACAGAACGATGTGCACCGGGCCTTCAAGAGAGAGCTGAAAACAAAAGAACCAGTGATCATGAGCACCCTGGAAACAGTGCGGATCTTTCTGACCGAGCAGCCCCTGGAAGGACTGGAAAAACTGTACCAGGAACCCAGAGAGCTGCCCCCTGAAGAACGGGCCCAGAACGTGACCAGACTGCTGAGGAAGCAGGCCGAGGAAGTGAACACAGAATGGGAGAAGCTGAACCTGCACTCTGCTGACTGGCAGAGGAAGATTGATGAGACACTGGAACGGCTGCAGGAACTGCAGGAGGCCACAGACGAGCTGGACCTGAAACTGAGACAGGCCGAAGTGATCAAGGGCAGCTGGCAGCCAGTGGGCGACCTGCTGATCGACAGCCTGCAGGATCACCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGAGGCGAGATTGCCCCCCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAACGACCTGGCCCGGCAGCTGACAACACTGGGCATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGTCCACACTGGAAGATCTGAACACCCGGTGGAAACTGCTGCAGGTGGCCGTGGAAGATAGAGTGCGGCAGCTGCACGAGGCCCACAGAGATTTTGGCCCTGCCTCCCAGCACTTCCTGAGCACATCTGTGCAGGGCCCCTGGGAGAGAGCCATCTCCCCCAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCACGAGACACAGACCACCTGTTGGGACCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGCCTGGCCGACCTGAACAATGTGAGGTTCAGTGCCTACAGGACCGCCATGAAGCTGCGGAGACTGCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTGTCCCTGTCCGCCGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAACCTGAAGCAGAACGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATCATCAACTGCCTGACCACCATCTACGACCGCCTGGAACAGGAACACAACAACCTGGTGAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTACGACACCGGCCGGACAGGCCGGATCAGAGTGCTGAGCTTCAAGACCGGCATCATCAGCCTGTGCAAGGCCCACCTGGAAGATAAGTACCGCTACCTGTTCAAACAGGTGGCCAGCTCCACCGGCTTTTGCGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTGCTGCACGACAGCATCCAGATCCCTAGACAGCTGGGCGAGGTGGCCTCTTTTGGCGGCAGCAATATTGAGCCTAGTGTGCGGAGCTGCTTCCAGTTTGCCAACAACAAGCCCGAGATTGAGGCCGCCCTGTTCCTGGACTGGATGCGGCTGGAACCCCAGAGCATGGTGTGGCTGCCTGTGCTGCATAGAGTGGCCGCTGCCGAGACAGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATCGGCTTCCGGTACAGAAGCCTGAAGCACTTCAACTACGATATCTGCCAGAGCTGCTTTTTCAGCGGACGGGTGGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCCACCACCTCCGGGGAGGATGTGCGGGATTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCCGGACCAAGCGCTACTTTGCCAAACACCCCCGGATGGGCTATCTGCCCGTGCAGACAGTGCTGGAAGGCGACAACATGGAAACCGACACCATGTAGGAAGTCTTTTAATAAAAGATCCTTATTTTCATTGGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTCAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG(SEQ ID NO:15)

3.启动子

在某些实施方案中，密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列可操作地连接至转录调控元件，所述转录调控元件包括可操作地连接至本发明的微肌营养不良蛋白编码序列并能够驱动其转录的启动子。转录调控元件还可包含增强由本发明的CpG减少的多核苷酸编码的微肌营养不良蛋白的表达的一个或多个内含子或外显子。

在某些实施方案中，转录调控元件包含组成型启动子，例如CMV启动子、CAG启动子、EF-1α启动子、CB启动子或其衍生物。

在某些实施方案中，转录调控元件包含肌肉特异性控制元件。

例如，肌肉特异性控制元件可为：CK8启动子、心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子、CK7启动子、CK9启动子、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)启动子、混合α-肌球蛋白重链增强子-/MCK增强子-启动子(MHCK7)、肌肉特异性肌酸激酶(MCK)启动子、人类骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心肌肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素反应元件(gre)。

在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件位于异源内含子序列(其增强微肌营养不良蛋白表达)的5’，所述异源内含子序列位于本发明的微肌营养不良蛋白编码序列的5’，所述微肌营养不良蛋白编码序列位于任选的3’-UTR区的5’，所述区包括翻译终止密码子(例如TAG)、聚腺苷酸化信号(例如AATAAA)和mRNA切割位点(例如CA)。

在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件包含CK8启动子，例如具有以下序列的启动子：

TAGACTAGCATGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGCATGCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCA(CK8启动子，SEQ ID NO:3)

在某些实施方案中，CK8启动子可以在5’端包含额外的C和/或在3’端包含额外的二核苷酸GC。CK8启动子包含5’端130-bp增强子元件，随后是269-bp基础CK8启动子，随后是位于CK8启动子最3’端的48bp或50bp MCK外显子1UTR序列。5’端130-bp增强子元件可被复制(例如，与CK8中的一个拷贝相比，具有两个串联拷贝)以进一步增强子转录。

因此，在某些实施方案中，CK8启动子被修饰为CK8e启动子(SEQ ID NO:4)，其包含SEQ ID NO:5的130-bp增强子的两个拷贝、SEQ ID NO:3的基础CK8启动子的269-bp片段(SEQ ID NO:6)、以及48-bp或50-bp MCK外显子1UTR区序列(SEQ ID NO:7或16)。

TAGACTAGCATGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGCATGTAGACTAGCATGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGCATGCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCA(SEQ ID NO:4)

tagactagcatgctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgcatg(SEQ ID NO::5，130-bp增强子)

ccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctc(SEQ ID NO:6，269-bp基础CK8启动子)

attctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagcca(UTR 48bp MCK外显子1，SEQ ID NO::7)。

attctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagc(UTR 50bp MCK外显子1，SEQ ID NO:16)。

在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件包含WO2017/181015的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO::11的核苷酸序列。

WO2017/181015的SEQ ID NO:10(SEQ ID NO:17)：

WO2017/181015的SEQ ID NO:11(SEQ ID NO:18)：

在某些实施方案中，本发明的rAAV载体能够可操作地连接至包含MCK增强子核苷酸序列(参见通过引用并入本文中的WO2017/181015的SEQ ID NO:10)和/或MCK启动子的肌肉特异性控制元件序列(参见通过引用并入本文中的WO2017/181015的SEQ ID NO:11)。

4.PolyA信号序列、内含子、外显子、UTR

在某些实施方案中，rAAV还包含用于将polyA序列插入转录的mRNA中的聚腺苷酸化(polyA)信号序列。

在某些实施方案中，polyA信号序列为SEQ ID NO:8，其中AATAAA序列大写并加双下划线：

在某些实施方案中，polyA序列为197-bp SV40 polyA信号序列：

在某些实施方案中，polyA序列为230-bp bGH polyA信号序列：

在某些实施方案中，polyA序列为127-bp rBG polyA信号序列：

5.AAV和衣壳

如本文所用，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是单链DNA细小病毒，其仅在细胞中生长，其中某些功能由共同感染的辅助病毒提供。

指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装以及宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在所述ITR内。三种AAV启动子(出于它们的相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两种AAV内部开放阅读框的表达。

两种rep启动子(p5和p19)加上单个AAV内含子的差异剪接(例如，在AAV2核苷酸2107和2227)使得从rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶促性质。

cap基因由p40启动子表达，并且它编码三种框内翻译的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。

单个共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。Muzyczka，CurrentTopics in Microbiology and Immunology158:97-129(1992)中综述了AAV的生命周期和遗传学。

存在至少13种已被表征的AAV血清型。AAV的一般信息和综述可在例如Carter，1989，Handbook of Parvoviruses，第1卷，第169-228页；和Berns，1990，Virology，第1743-1764页，Raven Press，(New York)(通过引用并入本文)中找到。然而，完全可预期这些相同的原则将适用于另外的AAV血清型，因为众所周知，即使在遗传水平下，各种血清型在结构和功能上非常密切相关。参见例如，Blacklowe，1988，Parvoviruses and Human Disease，J.R.Pattison，编的第165-174页；和Rose，Comprehensive Virology 3:1-61(1974)。例如，所有AAV血清型明显表现出非常相似的由同源rep基因介导的复制性质；并且全部携带三种相关的衣壳蛋白，如在AAV2中表达的那些。异源双链体分析进一步表明了相关性程度，所述分析揭示了沿基因组长度的血清型之间的广泛交叉杂交；并且在对应于“反向末端重复序列”(ITR)的末端存在类似的自退火区段。相似的感染模式也表明每种血清型中的复制功能都处于相似的调控控制之下。

如本文所用的“AAV载体”或“(AAV)载体基因组”可互换地指包含侧接AAV末端重复序列(ITR)的一种或多种目标多核苷酸(或转基因)的载体。当存在于已用编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时，此类AAV载体能够复制并包装成感染性AAV病毒颗粒。

本发明的重组AAV载体基因组包含本发明的核酸分子和侧接本发明的核酸分子的一个或多个AAV ITR。

“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“重组AAV(rAAV)病毒颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，例如用于递送至哺乳动物(肌肉)细胞的主题CpG减少的密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列)，则其典型地被称为“AAV载体/病毒颗粒”。因此，AAV病毒颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为此类载体包含于AAV病毒颗粒内。

存在多种AAV血清型，并且AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列呈现于Srivastava等人，J Virol 45:555-564(1983)中，由Ruffing等人，J Gen Virol 75:3385-3392(1994)校正。两者均通过引用并入本文。作为其它实例，AAV-1的完整基因组提供于GenBank登录号NC_002077(通过引用并入本文)中；AAV-3的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001829(通过引用并入本文)中；AAV-4的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001829(通过引用并入本文)中；AAV-5基因组提供于GenBank登录号AF085716(通过引用并入本文)中；AAV-6的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001862(通过引用并入本文)中；AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分分别提供于GenBank登录号AX753246(通过引用并入本文)和AX753249(通过引用并入本文)中(还参见与AAV-8有关的美国专利第7,282,199号和第7,790,449号)；AAV-9基因组提供于通过引用并入本文的Gao等人，J.Virol 78:6381-6388(2004)中；AAV-10基因组提供于通过引用并入本文的Mol.Ther.13(1):67-76(2006)中；并且AAV-11基因组提供于通过引用并入本文的Virology 330(2):375-383(2004)中。AAVrh74血清型描述于Rodino-Klapac等人，J.Trans.Med.5:45(2007)中，其通过引用并入本文中。

rAAV基因组中的AAV DNA可来自可衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAVrh74、AAVrh32、AAVrh34和AAV-2i8。

在某些实施方案中，为了促进骨骼肌特异性表达，可使用AAV1、AAV6、AAV8或AAVrh.74。

在某些实施方案中，AAV具有AAV9血清型，或者衣壳具有SEQ ID NO:20的多肽(AAV9 VP1)：

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:20)

假型rAAV和其产生也适合于本发明，并且公开于例如WO 01/83692中(通过引用整体并入本文中)。

还考虑了其它类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如Marsic等人，Molecular Therapy，22(11):1900-1909(2014)。各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域中已知的。

在某些实施方案中，衣壳为SLB-101衣壳，其中VP1衣壳具有SEQ ID NO:21的序列：

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQRGDLGLSAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ IDNO:21)

6.rAAV和宿主细胞的产生

包含主题CpG耗尽的密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列的rAAV病毒颗粒和载体基因组可通过任何标准rAAV产生方法，典型地使用产生细胞系来产生。

rAAV产生的一般原理综述于例如Carter，Current Opinions in Biotechnology1533-1539，1992；和Muzyczka，Curr.Topics in Microbial.and Immunol.158:97-129，1992)中。各种方法描述于Ratschin等人，Mol.Cell.Biol.4:2072，1984；Hermonat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466，1984；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.5:3251，1985；McLaughlin等人，J.Virol.62:1963，1988；和Lebkowski等人，Mol.Cell.Biol.7:349，1988；Samulski等人，J.Virol.63:3822-3828，1989；美国专利第5,173,414号；WO 95/13365和相应的美国专利第5,658,776号；WO95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人，Vaccine13:1244-1250，1995；Paul等人，Human Gene Therapy 4:609-615，1993；Clark等人，Gene Therapy3:1124-1132，1996；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；和美国专利第6,258,595号中。前述文件特此通过引用整体并入本文，特别强调与rAAV产生相关的文件的那些部分。

总体而言，许多原理不同的策略已用于rAAV产生，所有所述策略均可用于产生主题rAAV。

在某些实施方案中，主题rAAV是基于无辅助病毒瞬时转染方法产生的，其中所有顺式和反式组分(载体质粒和包装质粒，以及从腺病毒分离的辅助基因)在合适的宿主细胞，例如293细胞中。瞬时转染方法在载体质粒构建中是简单的，并产生不含腺病毒的高滴度AAV载体。VP1衣壳蛋白可由用于瞬时转染产生细胞系的质粒之一编码。

因此，在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包括包含本发明的rAAV载体基因组的DNA质粒。此类DNA质粒可用于标准三重转染方法来产生rAAV。具体地，将本发明的DNA质粒转移至允许用AAV的辅助病毒(例如腺病毒、El缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞，用于将rAAV载体基因组组装至感染性病毒颗粒中。用于产生rAAV颗粒的技术是本领域标准的，其中将待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供给细胞。rAAV的产生要求在单个细胞(本文中表示为包装细胞)内存在以下组分：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即不在其中)的AAV rep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可来自重组病毒可来源的任何AAV血清型，并且可来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAVrh.32、AAVrh34或AAVrh.74。在某些实施方案中，衣壳是修饰的衣壳，例如SLB-101。

包装细胞系(HEK293)的瞬时转染

特别地，在某些实施方案中，使用包装细胞系如HEK293细胞的瞬时转染产生AAV载体。这是最成熟的AAV产生方法，包括人胚胎HEK293细胞的质粒转染。通常，使用磷酸钙或聚乙烯亚胺转染(PEI)(一种阳离子聚合物)，HEK293细胞同时被载体质粒(含有目标基因，如编码肌营养不良蛋白小基因和一个或多个另外的编码序列的主题多核苷酸)和一个或两个辅助质粒转染。

辅助质粒允许四种Rep蛋白、三种AAV结构蛋白VP1、VP2和VP3、AAP和腺病毒辅助功能E2A、E4和VARNA的表达。rAAV复制所需的额外腺病毒E1A/E1B辅助因子在HEK293产生细胞中表达。Rep-cap和腺病毒辅助序列克隆到两个单独的质粒上，或者合并到一个质粒上，因此用于转染的三重质粒系统和双质粒系统都是可能的。三重质粒方案通过可容易地从一种血清型切换至另一种血清型的cap基因提供了多功能性。

质粒通常通过常规技术在大肠杆菌中使用细菌来源和抗生素抗性基因或通过微环技术产生。

贴壁HEK293细胞的瞬时转染已被用于大规模制造rAAV载体。最近，HEK293细胞也已适应悬浮条件，以便在长期经济上可行。

HEK293细胞系通常在补充有L-谷氨酰胺、5％-10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的DMEM中繁殖，但保持在无血清悬浮液F17、Expi293或其它制造商特定介质中的悬浮HEK293细胞除外。对于贴壁细胞，在AAV产生过程中可降低FBS的百分比，以限制动物源性组分的污染。

通常，在质粒转染后48–72小时从细胞沉淀和/或上清液中回收rAAV载体，这取决于血清型。

用rHSV载体感染哺乳动物细胞

HSV是用于在许可细胞中复制AAV的辅助病毒。因此，HSV可充当辅助病毒和穿梭载体两者，以将支持AAV基因组复制和包装的所需AAV功能递送至产生细胞。

基于与rHSV共感染的AAV产生可有效地产生大量rAAV。除了高总体产率(高达1.5×10⁵vg/细胞)之外，所述方法的进一步优势在于它产生质量明显提高的rAAV原液，如通过提高的病毒效力所测量。

在这种方法中，将细胞(通常是仓鼠BHK21细胞系或HEK293和衍生物)用两种rHSV感染，一种携带由AAV ITR(rHSV-AAV)圈定的目标基因，并且第二种具有所需血清型的AAVrep和cap ORF(rHSVrepcap)。2-3天后，收集细胞和/或培养基，并通过多个纯化步骤纯化rAAV，以除去细胞杂质、HSV来源的污染物和未包装的AAV DNA。

因此，在一些实施方案中，HSV充当AAV感染的辅助病毒。在一些实施方案中，AAV生长是使用缺失ICP27的HSV的非复制突变体实现的。

在哺乳动物细胞中产生重组AAV病毒颗粒的某些方法是本领域已知的并且在过去十年中得到了改进。例如，美国申请公布第20070202587号描述了基于细胞与两种或更多种复制缺陷型重组HSV载体的共感染，在哺乳动物细胞中产生重组AAV。美国申请公布第20110229971号和Thomas等人(Hum.Gene Ther.20(8):861-870，2009)描述了可扩展的重组AAV产生方法，所述方法使用悬浮适应的哺乳动物细胞的重组HSV 1型共感染。Adamson-Small等人(Hum.Gene Ther.Methods 28(1):1-14，2017)描述一种使用HSV系统在无血清悬浮液制造平台中改进的AAV产生方法。

在某些其它实施方案中，主题rAAV使用基于重组单纯疱疹病毒(rHSV)的AAV产生系统产生，所述系统利用rHSV载体将AAV载体以及Rep和Cap基因(即，本发明的修饰的VP1衣壳基因)带入产生细胞。修饰的cap基因可存在于也可能承载rAAV基因组的rHSV载体中。

在某些实施方案中，本发明的AAV载体是根据Adamson-Small等人(MolecularTherapy-Methods&Clinical Development(2016)3，16031；doi:10.1038/mtm.2016.31，通过引用并入本文)中描述的方法产生的，所述方法是一种使用HSV平台产生高滴度和高质量腺相关9型载体的可规模化方法。它是完整的基于单纯疱疹病毒(HSV)的产生和纯化过程，能够在HEK 293产生细胞的每10层CellSTACK中产生大于1×10¹⁴个rAAV9载体基因组，或在最终完全纯化的产物中每个细胞大于1×10⁵个载体基因组。这表示相对于基于转染的方法的5至10倍增加。此外，与基于转染的产生相比，通过此方法产生的rAAV载体表现出改进的生物学特性，包括如由更高的转导单位与载体基因组比率所显示的感染性增加和总衣壳蛋白量减少，由更低的空与完整比率所示。此方法还可容易地适于rAAV9载体的大规模良好实验室规范(GLP)和良好生产规范(GMP)生产，以实现临床前和临床研究，并为后期阶段和商业生产提供平台。

用重组杆状病毒感染昆虫细胞

在某些另外的实施方案中，使用杆状病毒系统产生主题rAAV，所述系统需要用若干杆状病毒载体同时感染昆虫细胞以递送AAV载体盒以及Rep和Cap基因(即，本发明的修饰的VP1衣壳基因)。

杆状病毒-Sf9平台已被确立为哺乳动物细胞中GMP相容且可扩展的替代AAV产生方法。其可在粗收获物中生成每个细胞多达2×10⁵个载体基因组(vg)。

当前的方案涉及用两种重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，允许合成Rep78/52和Caps的杆状病毒表达载体(BEV)，和携带侧接AAV ITR的目标基因的重组杆状病毒。几种无血清培养基适用于悬浮的Sf9细胞生长。

关于这些安全问题，双杆状病毒-Sf9生产系统比其它生产平台具有许多优势：(1)使用无血清培养基；(2)尽管在Sf细胞系中发现了偶然病毒转录物，但大多数感染昆虫的病毒在哺乳动物细胞中并不活跃复制；以及(3)除杆状病毒外，昆虫细胞中rAAV的产生不需要辅助病毒。

在某些实施方案中，使用表达Rep和Cap蛋白的稳定Sf9昆虫细胞系，因此只需要感染一种重组杆状病毒即可以高产率产生感染性rAAV载体。

哺乳动物稳定细胞系。

rAAV载体也可使用稳定表达rep和cap基因的稳定哺乳动物产生细胞高效且可扩展地产生。此类细胞可被野生型Ad5辅助病毒(其在遗传上稳定并且能够容易地以高滴度产生)感染，以诱导rep和cap的高水平表达。感染性rAAV载体可在用野生型Ad 5型感染这些包装细胞系时产生，并通过质粒转染或在感染重组Ad/AAV杂合病毒后提供rAAV基因组。

或者，Ad可被HSV-1代替作为辅助病毒。

合适的稳定哺乳动物产生细胞可包括HeLa来源的产生细胞系、A549细胞或HEK293细胞。优选的HeLa细胞系是HeLaS3细胞，一种悬浮液适应的HeLa亚克隆。

本文所述的方法可用于在不含动物组分的培养基中制造主题AAV载体，优选以250-L规模或2,000-L商业规模。

不管本发明的rAAV病毒颗粒如何产生，所得的rAAV可通过本领域的标准方法，例如通过柱色谱法或氯化铯梯度纯化。用于从辅助病毒纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包括公开于例如Clark等人，Hum.Gene Ther.10(6):1031-1039，1999；Schenpp和Clark，Methods Mol.Med.69:427-443，2002；美国专利第6,566,118号和WO 98/09657中的方法。

本发明因此提供产生感染性rAAV的包装/产生细胞。在一个实施方案中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一实施方案中，包装细胞是未转化癌细胞的细胞，如低传代293细胞(用腺病毒El转化的人胎肾细胞)、MRC-5细胞(人胚胎成纤维细胞)、WI-38细胞(人胚胎成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胚胎肺细胞)。

在某些实施方案中，主题rAAV基于源自例如HeLa或A549或HEK293细胞的某些AAV产生细胞系产生，所述细胞稳定地携带AAV Rep/cap基因。AAV载体盒可稳定整合至宿主基因组中，或通过含有所述盒的腺病毒引入。

在某些实施方案中，用于rAAV产生的此类产生细胞系包含编码侧接AAV ITR序列的微肌营养不良蛋白的rAAV原病毒，其中rAAV原病毒整合至用于rAAV产生的产生细胞系的基因组中。

产生包装细胞的方法是产生稳定表达用于AAV颗粒产生的所有必需组分的细胞系。例如，将包含缺乏AAV rep和cap基因的rAAV载体基因组、与rAAV基因组分离的AAV rep和cap基因以及选择性标记物(如新霉素抗性基因)的质粒(或多个质粒)整合到细胞的基因组中。AAV基因组已通过诸如GC加尾(Samulski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79:2077-2081，1982)、添加含有限制性内切酶裂解位点的合成接头(Laughlin等人，Gene 23:65-73，1983)或通过直接平末端连接(Senapathy和Carter，J.Biol.Chem.259:4661-4666，1984)的程序引入至细菌质粒中。然后用辅助病毒如腺病毒感染包装细胞系。这种方法的优点是细胞是选择性的并且适合于rAAV的大规模产生。

合适方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒来将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。

因此，任何包装细胞均在包含本发明的多核苷酸、AAV载体基因组或AAV病毒颗粒的本发明的宿主细胞的范围内。

7.使用rAAV治疗肌营养不良

因此，本发明的相关方面提供一种治疗有需要的受试者的肌营养不良(例如DMD和BMD)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的编码肌营养不良缺陷基因的功能型式，例如微肌营养不良蛋白基因的重组AAV(rAAV)载体(例如包裹在AAV9或SLB-101衣壳中的载体)，其中rAAV载体基因组包含任何本发明的CpG减少的密码子优化的多核苷酸(例如SEQ ID NO:1)。

在某些实施方案中，微肌营养不良蛋白基因包含全长肌营养不良蛋白的R1、R16、R17、R23和R24血影蛋白样重复序列的编码序列(例如PCT/US2016/013733中所述的序列)。

在某些实施方案中，微肌营养不良蛋白基因包含SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白的编码序列，并且所述编码序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或99.9％同一的核苷酸序列。任选地，编码序列在每个大写核苷酸处与SEQ ID NO:1同一，或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大写核苷酸，进一步任选地，编码序列基本上缺乏CpG岛(例如，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CpG岛)。

在某些实施方案中，所述方法还包括在向受试者施用如此产生的rAAV之前产生主题rAAV。

在本发明的任何方法中，rAAV载体可通过肌内注射或静脉内注射施用。

在本发明的任何方法中，rAAV载体或组合物是全身施用的。例如，rAAV载体或组合物通过注射、输注或植入肠胃外施用。

8.药物组合物和其用途

本发明的另一方面提供一种组合物，例如药物组合物，其包含任何包含本发明的CpG减少的密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列的rAAV载体、病毒颗粒和载体基因组。

在某些实施方案中，所述组合物是药物组合物，所述药物组合物还可包含治疗相容的载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对接受者是无毒的，并且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如Tween、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。

在另一实施方案中，本发明提供一种包含任何包含本发明的CpG减少的密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列的rAAV载体、病毒颗粒和载体基因组的组合物，用于治疗罹患肌营养不良症或肌营养不良(例如DMD或贝氏肌营养不良)的受试者。

本发明的组合物(例如，药物组合物)可被配制用于肌内注射或静脉内注射。本发明的组合物还可被配制用于全身施用，如通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。另外，任何组合物被配制用于施用至罹患肌营养不良症或肌营养不良，例如DMD、贝氏肌营养不良或任何其它肌营养不良蛋白相关的肌营养不良的受试者。

在另一实施方案中，本发明提供了包含本发明的CpG减少的密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列的任何rAAV载体、病毒颗粒和载体基因组的用途，其用于制备供减轻罹患肌营养不良症或肌营养不良，例如DMD、贝氏肌营养不良或任何其它肌营养不良蛋白相关的肌营养不良的受试者用的药物。

本发明考虑了包含本发明的CpG减少的密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列的任何rAAV载体、病毒颗粒和载体基因组用于制备向诊断患有DMD的患者施用的药物的用途。

本发明还考虑了包含本发明的CpG减少的密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列的任何rAAV载体、病毒颗粒和载体基因组用于制备向罹患肌营养不良的受试者施用包含本发明的CpG减少的密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列的任何rAAV、病毒颗粒和载体基因组的药物的用途。

在本发明的任何用途中，药物可被配制用于肌内注射。另外，可制备任何药物以施用于患有肌营养不良，例如DMD或任何其它肌营养不良蛋白相关的肌营养不良的受试者。

9.给药和施用

在本发明的方法中施用的rAAV的滴度将根据例如特定的rAAV、施用模式、治疗目标、个体和所靶向的细胞类型而变化，并且可通过本领域中的标准方法来确定。rAAV的滴度可在约1×10⁶、约1×10⁷、约1×10⁸、约1×10⁹、约1×10¹⁰、约1×10¹¹、约1×10¹²、约1×10¹³至约1×10¹⁴或更多DNA酶抗性颗粒(DRP)/ml的范围内。剂量也可以病毒基因组(vg)为单位表示。

本发明考虑了在体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。体内方法包括向有需要的动物(包括人类)施用有效剂量或有效多剂量的包含本发明的rAAV的组合物的步骤。如果在病症/疾病发展之前施用剂量，则所述施用是预防性的。如果在病症/疾病发展之后施用剂量，则所述施用是治疗性的。在本发明的实施方案中，有效剂量是减轻(消除或减少)与所治疗的病症/疾病状态相关的至少一种症状、减缓或预防进展至病症/疾病状态、减缓或预防病症/疾病状态的进展、减轻疾病的程度、产生疾病的缓解(部分或全部)和/或延长存活期的剂量。

对于施用，可基于来自体外测定和/或动物模型研究的结果初始估计有效量和治疗有效量(本文中也称为剂量)。例如，可在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养物中确定的IC50的循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定目标受试者的可用剂量。

有效剂量的组合物的施用可通过本领域的标准途径，包括但不限于肌内、肠胃外、静脉内、口服、经颊、经鼻、肺部、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。本领域技术人员可选择和/或匹配本发明的rAAV的AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的施用途径和血清型，同时考虑所治疗的感染和/或疾病状态和将表达一个或多个编码序列和/或微型肌营养不良蛋白的靶细胞/组织。

具体地，本文所述的配制物可通过但不限于注射、输注、灌注、吸入、灌洗和/或摄取来施用。施用途径可包括但不限于静脉内、真皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌内、囊内、心包内、脐内、眼内、粘膜、口腔、皮下和/或结膜下。

本发明提供有效剂量的rAAV和本发明组合物(包括本发明的组合疗法)的局部施用或全身施用。例如，全身施用是施用到循环系统中，从而影响整个身体。全身施用包括肠内施用，如通过胃肠道吸收和通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。

特别地，本发明的rAAV的实际施用可通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织，如骨骼肌中的任何物理方法来实现。根据本发明的施用包括但不限于注射到肌肉、血流和/或直接注射到肝脏中。简单地将rAAV重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中已被证明足以提供对肌肉组织表达有用的载体，并且对可与rAAV共同施用的载体或其它组分没有已知的限制(尽管降解DNA的组合物应避免以rAAV的正常方式使用)。可修饰rAAV的衣壳蛋白，以使得rAAV靶向目标特定靶组织，如肌肉。参见例如，WO 02/053703，其公开内容通过引用并入本文。

药物组合物可制备为可注射配制物或作为局部配制物以通过透皮转运递送至肌肉。先前已经开发了许多用于肌内注射和经皮转运的配制物并且可用于本发明的实践中。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以便于施用和处理。

在本文公开的方法中施用的rAAV的剂量将根据例如特定rAAV、施用模式、治疗目标、个体和所靶向的细胞类型而变化，并且可通过本领域的标准方法来确定。

还可由医师、兽医或研究人员在考虑诸如但不限于包括受试者的体重、疾患的严重程度、疾病类型、先前或同时的治疗干预、特发性疾病的物理和生理因素和/或施用途径的参数的情况下，确定施用至特定受试者的实际剂量的量。

所施用的每个rAAV的滴度可在约约1×10⁶、约1×10⁷、约1×10⁸、约1×10⁹、约1×10¹⁰、约1×10¹¹、约1×10¹²、约1×10¹³、约1×10¹⁴或至约1×10¹⁵或更多DNA酶抗性颗粒(DRP)/ml的范围内。剂量也可以病毒基因组(vg)的单位表示(即，分别1×10⁷vg、1×10⁸vg、1×10⁹vg、1×10¹⁰vg、1×10¹¹vg、1×10¹²vg、1×10¹³vg、1×10¹⁴vg、1×10¹⁵vg)。剂量也可以每千克(kg)体重的病毒基因组(vg)单位表示(即，分别1×10¹⁰vg/kg、1×10¹¹vg/kg、1×10¹²vg/kg、1×10¹³vg/kg、1×10¹⁴vg/kg、1×10¹⁵vg/kg)。用于滴定AAV的方法描述于Clark等人，Hum.Gene Ther.10:1031-1039，1999中。

示例性剂量可在约1×10¹⁰至约1×10¹⁵个载体基因组(vg)/千克体重的范围内。在一些实施方案中，剂量可包括1×10¹⁰vg/kg体重、1×10¹¹vg/kg体重、1×10¹²vg/kg体重、1×10¹³vg/kg体重、1×10¹⁴vg/kg体重或1×10¹⁵vg/kg体重。剂量可包括1×10¹⁰vg/kg/天、1×10¹¹vg/kg/天、1×10¹²vg/kg/天、1×10¹³vg/kg/天、1×10¹⁴vg/kg/天或1×10¹⁵vg/kg/天。剂量可在0.1mg/kg/天至5mg/kg/天或0.5mg/kg/天至1mg/kg/天或0.1mg/kg/天至5μg/kg/天或0.5mg/kg/天至1μg/kg/天的范围内。在其它非限制性实例中，剂量可包括1μg/kg/天、5μg/kg/天、10μg/kg/天、50μg/kg/天、100μg/kg/天、200μg/kg/天、350μg/kg/天、500μg/kg/天、1mg/kg/天、5mg/kg/天、10mg/kg/天、50mg/kg/天、100mg/kg/天、200mg/kg/天、350mg/kg/天、500mg/kg/天或1000mg/kg/天。治疗有效量可通过在治疗方案的过程中(即，数天、数周、数月等)施用单剂量或多剂量来实现。

在一些实施方案中，药物组合物呈具有至少1.6×10¹³个载体基因组的10mL水溶液的剂型。在一些实施方案中，所述剂量具有每毫升至少2×10¹²个载体基因组的效力。在一些实施方案中，所述剂量包含无菌水溶液，所述无菌水溶液包含pH 6.0的10mM L-组氨酸、150mM氯化钠和1mM氯化镁。在一些实施方案中，药物组合物呈10mL无菌水溶液的剂型，所述无菌水溶液包含pH 6.0的10mM L-组氨酸、150mM氯化钠和1mM氯化镁；并且具有至少1.6×10¹³个载体基因组。

在一些实施方案中，药物组合物可以是包含在10mL水溶液中介于1×10¹⁰与1×10¹⁵个之间的载体基因组；在10mL水溶液中介于1×10¹¹与1×10¹⁴个之间的载体基因组；在10mL水溶液中介于1×10¹²与2×10¹³个之间的载体基因组；或在10mL水溶液中大于或等于约1.6×10¹³个载体基因组的剂量。在一些实施方案中，水溶液是包含约10mM L组氨酸pH6.0、150mM氯化钠和1mM氯化镁的无菌水溶液。在一些实施方案中，剂量具有大于约1×10¹¹个载体基因组/毫升(vg/mL)、大于约1×10¹²vg/mL、大于约2×10¹²vg/mL、大于约3×10¹²vg/mL或大于约4×10¹²vg/mL的效力。

在一些实施方案中，至少一种AAV载体作为药物组合物的一部分提供。药物组合物可包含例如0.1％w/v的AAV载体。在一些其它实施方案中，药物组合物可包含每药物组合物的重量介于2％至75％之间的化合物，或每药物组合物的重量介于25％至60％之间的化合物。

在一些实施方案中，剂量在药盒中。药盒还可包括剂量的使用说明。

为了肌内注射，可采用在佐剂如芝麻油或花生油中或在丙二醇水溶液中的溶液，以及无菌水溶液。如果需要，可缓冲此类水溶液，并且首先使液体稀释剂与盐水或葡萄糖等渗。rAAV作为游离酸(DNA含有酸性磷酸基团)或药理学上可接受的盐的溶液可在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。rAAV的分散液也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。就此而言，所采用的无菌水性介质均可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。

在一些实施方案中，对于注射，配制物可制成水溶液，如在包括但不限于汉克斯溶液、林格溶液和/或生理盐水的缓冲液中。溶液可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，配制物可呈冻干和/或粉末形式，以便在使用前用合适的媒介物对照(例如无菌无热原水)复原。

本文公开的任何配制物可有利地包含任何其它药学上可接受的载体，所述载体包括不会产生显著不利的、过敏或其它可能超过施用益处的不良反应的那些，无论是用于研究、预防性和/或治疗性治疗。示例性的药学上可接受的载体和配制物公开于Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990中，所述文献关于药学上可接受的载体和配制物的其教义通过引用并入本文。此外，可按照美国FDA生物标准和质量控制司和/或其它相关美国和外国监管机构的要求，制备配制物以满足无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

常用的示例性药学上可接受的载体可包括但不限于增积剂或填充剂、溶剂或助溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸和维生素E)、防腐剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、稳定剂、缓冲剂、螯合剂(例如，EDTA)、凝胶、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂。

示例性缓冲剂可包括但不限于柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。

示例性防腐剂可包括但不限于苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵、氯化六烃季铵、对羟基苯甲酸甲酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和/或3-戊醇。

示例性等渗剂可包括多元糖醇，包括但不限于三元或更高级的糖醇(例如，甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和/或甘露糖醇)。

示例性稳定剂可包括但不限于有机糖、多元糖醇、聚乙二醇、含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水性聚合物和/或多糖。

配制物也可以是长效配制物。在一些实施方案中，此类长效配制物可通过但不限于植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，化合物可与合适的聚合材料和/或疏水性材料(例如，配制为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或配制为略微可溶的衍生物(例如，为微溶盐)。

此外，在各种实施方案中，AAV载体可使用缓释系统递送，如包含AAV载体的固体聚合物的半透性基质。各种持续释放材料已经建立并且是本领域普通技术人员所熟知的。取决于其化学性质，持续释放胶囊可在施用数周后直至100天释放载体。

适于可注射用途的药物载体、稀释剂或赋形剂包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有的情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体性的到存在可易于注射性的程度。在制造和储存条件下，所述组合物必须稳定且必须在贮存中防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是含有以下各项的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其适合的混合物、以及植物油。可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等)来预防微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收的剂，例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。

通过将在适当的溶剂中的所需量的rAAV与如上列举的各种其它成分(根据需要)合并，接着过滤灭菌来制备无菌注射液。通常，通过将灭菌活性成分合并到含有基本分散介质和来自以上列举的所需其它成分的无菌媒介物中来制备悬浮液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法可包括真空干燥和冻干技术，其产生一种或多种活性成分外加来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。

还在体外进行用rAAV转导。在一个实施方案中，从受试者取出所需的靶肌细胞，用rAAV转导并重新引入受试者。或者，可使用同种或异种肌细胞，其中这些细胞不会在受试者中产生不适当的免疫应答。

用于转导和将转导的细胞重新引入受试者中的合适方法是本领域已知的。在一个实施方案中，细胞可通过将rAAV与肌细胞合并，例如在适当的培养基中进行体外转导，并使用常规技术如RNA印迹和/或PCR或通过使用选择性标记筛选携带目标DNA的那些细胞。接着可将转导的细胞配制到药物组合物中，并通过各种技术(如通过肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射)或通过使用例如导管注射到平滑肌和心肌中将组合物引入受试者。

用本发明的rAAV转导细胞导致所述一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白的持续共表达。因此，本发明提供了向动物、优选人施用/递送共表达所述一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白的rAAV的方法。这些方法包括用本发明的一种或多种rAAV转导组织(包括但不限于组织如肌肉、器官如肝脏和脑，以及腺体如唾液腺)。可用包含组织特异性控制元件的基因盒进行转导。例如，本发明的一个实施方案提供了转导由肌肉特异性控制元件指导的肌肉细胞和肌肉组织的方法，所述控制元件包括但不限于来自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族的那些，如来自myoD基因家族的那些(参见Weintraub等人，Science 251:761-766，1991)、肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2(Cserjesi和Olson，MolCell Biol 11:4854-4862，1991)、源自人类骨骼肌动蛋白基因的控制元件(Muscat等人，Mol Cell Biol7:4089-4099，1987)、心脏肌动蛋白基因、肌肉肌酸激酶序列元件(Johnson等人，Mol Cell Biol 9:3393-3399，1989)和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件、源自骨骼快缩肌钙蛋白C基因、慢缩心肌肌钙蛋白C基因和慢缩肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧诱导核因子(Semenza等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.88:5680-5684，1991)、类固醇诱导元件和启动子包括糖皮质激素应答元件(GRE)(参见Mader和White，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5603-5607，1993)和其它控制元件。

肌肉组织是体内DNA递送的有吸引力的靶标，因为它不是重要的器官并且容易接近。本发明考虑了来自转导的肌纤维的miRNA和微型肌营养不良蛋白的持续共表达。

如本文所用，“肌细胞”或“肌肉组织”是指源自任何种类生物肌肉(例如骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)的细胞或一组细胞。此类肌肉细胞可以是分化的或未分化的，如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。

术语“转导”用于指通过本发明的复制缺陷型rAAV在体内或体外向受体细胞施用/递送一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白的编码区，从而导致所述受体细胞共表达所述一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白。

因此，本发明提供了向有需要的患者施用有效剂量(或多个剂量，基本上同时施用或间隔给予的剂量)的编码所述一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白的rAAV的方法。

实施例

实施例1传统密码子优化引入的CpG岛

存在各种传统的密码子优化方法，所有这些方法均旨在提高特定宿主细胞中密码子优化的编码序列的表达水平。然而，这些方法在过程中总是引入CpG岛。

使用EBI网站上的在线工具EMBOSS Cpgplot，有可能预测特定输入核苷酸序列中CpG岛的数量和位置。此分析的结果表明，所有常用的密码子优化方法确实在其各自的输出序列(即密码子优化的多核苷酸)中引入了许多CpG岛，而基于密码子优化的多核苷酸之一编辑去除CpG岛的SEQ ID NO:1不再通过在线工具预测CpG岛。

具体地，使用EMBOSS Cpgplot，使用以下参数来分析编码SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白的天然的、未密码子优化的微肌营养不良蛋白编码序列：窗口大小＝100，最小长度＝100，观察到的最小值＝0.6，最小值百分比＝50。此分析的输出示于图1中。显然，天然人类序列在核苷酸2400-2500之间仅具有一个CpG岛。

接着使用Gene Art对此天然人类MD5编码序列进行密码子优化，以产生SEQ IDNO:2的相同微肌营养不良蛋白的第一密码子优化的编码序列。EMBOSS Cpgplot鉴定出此密码子优化的序列中的九个CpG岛。参见图2。

本申请人在SEQ ID NO:1中的大写核苷酸处对此第一密码子优化的编码序列进行修饰，以得到SEQ ID NO:1。EMBOSS Cpgplot鉴定出此密码子优化的序列中没有CpG岛。参见图3。

接下来，使用GenScript对相同的天然人类MD5进行密码子优化，以产生SEQ IDNO:2的第二密码子优化的编码序列。EMBOSS Cpgplot鉴定出此密码子优化序列中的四个CpG岛。参见图4。

对于另一种密码子优化方法DNA2.0，重复了相同的过程。EMBOSS Cpgplot在此密码子优化序列中鉴定出十一个CpG岛。图5。

有趣的是，使用图2中的Gene Art密码子优化的编码序列(具有9个CpG岛)作为使用DNA2.0的第二轮密码子优化的输入产生了具有10个CpG岛的编码序列，类似于其它DNA2.0产生的密码子优化的序列。参见图6。

这些数据表明，传统的密码子优化方法均倾向于在所得的密码子优化编码序列中产生CpG岛。使用不同方法的多轮密码子优化并没有消除CpG岛。

实施例2TLR9激活测定

CpG PAMP被模式识别受体(PRR)Toll样受体9(TLR9)识别，所述受体仅在人类和其它高等灵长类动物的B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)中组成型表达。在非临床模型中，未甲基化CpG基序对TLR9的结合和激活可促进CTL对AAV载体的反应。

此测定的示意图提供于图7中，可用于评估给定多核苷酸编码序列由于CpG岛的存在而引发非所需宿主免疫反应的潜力和程度。

简而言之，从计划接受具有潜在CpG岛的测试多核苷酸的健康供体的血液样品中分离出的人类浆细胞样树突状细胞(pDC)购自STEMCELL Technologies。将细胞以5x10⁴(5E4)个细胞/孔/100μL细胞培养基涂铺于96孔组织培养板中。添加抗AAV衣壳(例如抗AAV9)IgG3抗体，然后添加测试物或媒介物对照。将组织培养板在37℃下培育约22小时。接着收集细胞培养物上清液，并在ELISA中测量IFN-α的存在和量，作为TLR9激活的读数。

使用此测定，包裹包含绿色荧光蛋白(GFP)的载体基因组的AAV9病毒颗粒被证明可增加TLR9依赖性IFN-a的产生(数据未示出)。另外，不含包裹的载体基因组的空AAV9衣壳不会触发TLR9激活。因此，此测定可用于研究对包裹包含修饰的CpG岛的载体基因组的AAV9病毒颗粒的先天免疫反应。

Claims

1.一种编码SEQ ID NO:2的微肌营养不良蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ IDNO:1的核苷酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或99.9％同一的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸在每个大写核苷酸处与SEQ ID NO:1同一，或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大写核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，所述多核苷酸基本上缺乏CpG岛(例如，基于EMBOSS Cpgplot分析，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CpG岛)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少95％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少97％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少99％同一的核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成。

7.根据权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

8.根据权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成。

9.一种腺相关病毒(AAV)载体基因组，所述腺相关病毒载体基因组包含权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述AAV载体基因组能够包装于AAV衣壳内。

10.一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，所述重组腺相关病毒颗粒包含AAV衣壳和包含权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包裹于所述AAV衣壳内。

11.根据权利要求9所述的AAV载体基因组或根据权利要求10所述的rAAV病毒颗粒，其中所述多核苷酸可操作地连接至转录调控元件。

12.根据权利要求11所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述转录调控元件包含启动子。

13.根据权利要求12所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述启动子为肌肉特异性启动子。

14.根据权利要求13所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述肌肉特异性启动子为CK8启动子、心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子、CK7启动子、CK9启动子、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)启动子、混合α-肌球蛋白重链增强子-/MCK增强子-启动子(MHCK7)、肌肉特异性肌酸激酶(MCK)启动子、人类骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心肌肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素反应元件(gre)。

15.根据权利要求13所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述肌肉特异性启动子为CK8启动子；任选地，所述CK8启动子包含SEQ ID NO:3或4的核苷酸序列。

16.根据权利要求9-15中任一项所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组还包含聚腺苷酸化信号序列，例如SEQ ID NO:8的polyA信号序列。

17.根据权利要求16所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述聚腺苷酸化信号序列包含SV40聚腺苷酸化信号序列(例如SEQ ID NO:9)、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号序列(例如SEQ ID NO:10)或兔β珠蛋白(rBG)聚腺苷酸化信号序列(例如SEQ ID NO:11)。

18.根据权利要求9-17中任一项所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组还包含3’ITR序列，例如AAV2 3’ITR序列。

19.根据权利要求9-18中任一项所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组还包含5’ITR序列，例如AAV2 5’ITR序列。

20.根据权利要求18或19所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述5’ITR序列和/或所述3’ITR序列(1)分别包含或为SEQ ID NO:12和13；或(2)分别包含或为SEQ ID NO:24和27。

21.根据权利要求9-20中任一项所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组还包含增强所述微肌营养不良蛋白的表达的内含子和/或外显子序列。

22.根据权利要求21所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述内含子包含SEQID NO:14。

23.根据权利要求9-20中任一项所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组还包含5’UTR序列和/或3’UTR序列。

24.根据权利要求9-23中任一项所述的AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒，所述AAV载体基因组或rAAV病毒颗粒包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列或与其至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％同一的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成、或由所述核苷酸序列组成。

25.根据权利要求10-24中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述衣壳具有以下血清型：SLB-101、AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV 13、AAVrh10、AAVrh74、AAVhu32或AAVhu37。

26.根据权利要求10-24中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述衣壳具有SLB-101或AAV9血清型。

27.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒，所述重组腺相关病毒病毒颗粒包含SLB-101或AAV9衣壳，以及包裹于其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含编码SEQ ID NO:2的MD5微肌营养不良蛋白的多核苷酸序列。

28.根据权利要求27所述的rAAV病毒颗粒，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

29.根据权利要求27所述的rAAV病毒颗粒，其中所述多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1至少95％、96％、97％、98％、99％同一的核苷酸序列，并且在每个大写核苷酸处与SEQ IDNO:1同一。

30.根据权利要求27-29中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组包含可操作地连接至所述多核苷酸序列的肌肉特异性控制元件。

31.根据权利要求30所述的rAAV病毒颗粒，其中所述肌肉特异性控制元件包含CK8启动子，例如SEQ ID NO:3或4的核苷酸序列的CK8启动子。

32.根据权利要求27-31中任一项所述的AAV病毒颗粒，其中所述载体基因组还包含聚腺苷酸化信号序列，例如包含SEQ ID NO:8的polyA信号序列。

33.根据权利要求32所述的AAV病毒颗粒，其中所述聚腺苷酸化信号序列包含SV40聚腺苷酸化信号序列(SEQ ID NO:9)、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号序列(SEQ ID NO:10)或兔β珠蛋白(rBG)聚腺苷酸化信号序列(SEQ ID NO:11)。

34.根据权利要求27-33中任一项所述的AAV病毒颗粒，其中所述载体基因组还包含3’ITR序列，例如SEQ ID NO:3’ITR；和5’ITR序列，例如SEQ ID NO:5’ITR。

35.根据权利要求27-34中任一项所述的AAV病毒颗粒，所述AAV病毒颗粒包含SEQ IDNO:15的核苷酸序列或与其至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％同一的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成、或由所述核苷酸序列组成。

36.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸、权利要求9-35中任一项所述的rAAV载体基因组或rAAV病毒颗粒、以及药学上可接受的载体。

37.根据权利要求36所述的药物组合物，所述药物组合物适合于或配制用于静脉内、皮下、肌内、真皮内、腹膜内或鞘内施用。

38.一种治疗有需要的人类的肌营养不良的方法，所述方法包括向所述人类施用治疗有效量的权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸、权利要求9-35中任一项所述的rAAV载体基因组或rAAV病毒颗粒、或权利要求36-37所述的药物组合物。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述肌营养不良的特征在于肌营养不良蛋白基因中的功能丧失突变。

40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述肌营养不良是杜氏肌营养不良(DMD)、贝氏肌营养不良(BMD)或X连锁扩张型心肌病。

41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述rAAV病毒颗粒以约1×10¹²至约1×10¹⁶个载体基因组(vg)/kg、或约1×10¹³至约1×10¹⁵个载体基因组(vg)/kg的剂量施用。

42.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸，或权利要求9-35中任一项所述的rAAV载体基因组或rAAV病毒颗粒。

43.根据权利要求42所述的宿主细胞，所述宿主细胞为HeLa细胞、Cos7细胞、HEK293细胞、A549细胞、BHK细胞、Vero细胞、RD细胞、HT-1080细胞、ARPE-19细胞或MRC-5细胞。

44.根据权利要求43所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为HeLa细胞或293/293T细胞。