ES2452890T3 - Variantes de factor VIII optimizadas mediante codones y promotor sintético específico para el hígado - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácidos nucleicos aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y que codifica factor VIII funcional

Description

Variantes de factor VIII optimizadas mediante codones y promotor sintético específico para el hígado

5 Campo de la invención

La invención se refiere a una secuencia codificadora optimizada de factor ocho (VIII) de coagulación sanguínea humana. Además, la invención se refiera a vectores como rAAV para la introducción de la secuencia de factor VIII optimizado en células para llevar a cabo su expresión. La invención se refiere también a células transformadas con estos vectores, animales transgénicamente modificados que contienen células modificadas usando los vectores y usos terapéuticos que utilizan los vectores en una propuesta de sustitución génica.

Antecedentes de la invención

15 Los inventores están interesados en el desarrollo de una estrategia de transferencia génica segura y eficaz para el tratamiento de la hemofilia A (HA), el trastorno sanguíneo heredado más común. Esto representaría un avance clínico considerable con implicaciones significativas para otros trastornos congénitos que carecen de tratamiento eficaz. Los inventores ya han desarrollado una propuesta alentadora de terapia génica para la hemofilia B usando vectores virales recombinantes adeno-asociados (rAAV). La hemofilia A plantea varios retos nuevos debido a las propiedades moleculares y bioquímicas distintas del factor VIII humano (hFVIII), una molécula que es mutada en esta enfermedad. Estas incluyen el tamaño relativamente grande del hFVIII cDNA y el hecho de que la expresión de proteínas de hFVIII es altamente ineficaz. Los inventores han comenzado a abordar algunas de estas limitaciones a través de avances de la tecnología de vectores y el desarrollo de una variante de hFVIII nueva más potente (codophFVIII) que puede ser eficazmente envasada en rAAV.

25 La hemofilia A (HA) es un trastorno sanguíneo conectado a x que afecta aproximadamente a uno de cada uno 5.000 varones, que está provocada por mutaciones en el gen de factor VIII (FVIII), que codifica un cofactor esencial en la cascada de coagulación. Los pacientes de HA grave (>50% de los pacientes) tienen menos de 1% de la actividad normal de FVIII y adolescen de hemorragias espontáneas en articulaciones que soportan peso y tejidos blandos, que provocan una incapacidad permanente y ocasionalmente la muerte. El patrón habitual para el cuidado de la HA consiste en concentrados de proteína de hFVIII recombinante, que puede detener la hemorragia pero que no evita el deterioro crónico que surge después de una hemorragia. La administración profiláctica de concentrados de factor para mantener los niveles de FVIII en plasma por encima de 1% (>2 ng/ml) conduce a una reducción considerable de la hemorragia espontánea y la artropatía crónica. Sin embargo, la semivida del FVIII es corta (8-12 horas)

35 necesitando tres administraciones intravenosas de concentrados por semana. Esto es prohibitivamente caro (>100 mil libras esterlinas/año/paciente), es altamente invasiva y requiere tiempo. Debido al coste y el suministro limitado, por encima de un 75% de los pacientes de HA grave no reciben ningún tratamiento o solamente exporádicos con concentrados de FVIII. Estos individuos se enfrentan a una vida enormemente acortada con dolor e incapacidad.

Por lo tanto, se ha prestado atención a una terapia génica somática para HA debido a su capacidad potencial para una curación a través de la producción endógena continua de FVIII a continuación de una administración única de vector. La hemofilia A está de hecho bien adecuada para una propuesta de sustitución génica porque sus manifestaciones clínicas son completamente atribuibles a la falta de un producto de gen único (FVIII) y circula en cantidades diminutas (200 ng/ml) en el plasma. No es esencial un control estrictamente regulada de la expresión

45 génica y un aumento modesto en el nivel de FVIII (>1% del normal) puede mejorar el fenotipo grave. La disponibilidad de modelos animales que incluyen ratones desprovistos de FVIII y perros con hemofilia A puede facilitar una evaluación preclínica extensiva de estrategias de terapias génicas. Finalmente, las consecuencias de la transferencia de genes puede ser valorada usando una cuantificación simple en lugar de puntos finales cualitativos, que puede ser fácilmente ensayada en la mayoría de los laboratorios clínicos, lo que contrasta con otros objetivos de terapias génicas en los que la expresión es difícil de valorar o está influenciada por factores adicionales como el flujo de sustrato.

Han sido realizado tres ensayos de fase I de transferencia génica hasta ahora para la HA usando un suministro de genes in vivo directo de vectores onco-retro-o adeno-virales así como un trasplante autólogo de fibroblastos

55 autólogos modificados mediante plásmidos. No se consiguió la expresión estable de hFVIII por encima de 1%. Estos estudios preclínicos y los posteriores resaltaron los obstáculos biológicos críticos graves para una terapia génica satisfactoria de la HA.

El tratamiento celular de la molécula de FVIII de longitud completa de tipo salvaje es altamente complejo y la expresión se confunde con la inestabilidad de mRNA, la interacción con acompañantes del retículo endoplásmico (ER), y una necesidad de un transporte facilitado desde el ER hasta el aparato de Golgi a través de una interacción con lectina LMAN1 de unión a manosa. Sin embargo, han sido desarrolladas variantes de FVIII más potentes y nuevas a través de avances progresivos en la comprensión de la biología de la expresión de FVIII. Por ejemplo, los estudios bioquímicos demostraron que el dominio B de FVIII era suministrable para la actividad del cofactor VIII. La 65 supresión del dominio B dio lugar a un aumento de 17 veces en los niveles de mRNA sobre el FVIII de tipo salvaje y de longitud completa y un aumento de 30% en la proteína secretada. Esto condujo al desarrollo de concentrado de

proteína FVIII desprovista de dominio B (BDD), que es ampliamente usada en la actualidad en el campo clínico. Sin embargo, unos estudios recientes indican que el hFVIII de longitud completa y BDD se pliegan mal en el Lumen del ER, dando lugar a la activación de la respuesta de proteínas no plegadas (UPR) y la apoptosis de hepatocitos de múridos. Sin embargo, la adición de un separador de dominios B corto, con elevado contenido de oligosacáridos

5 conectados a asparagina, a BDD-FVIII (=N6-FVIII) resuelve este problema en parte a través de un transporte mejorado desde el ER hasta el aparato de Golgi. El N6-FVIII es secretado a niveles 100 veces superiores al FVIII de tipo salvaje y de longitud completa, pero los inventores creen que la secreción de FVIII puede ser mejorada adicionalmente a través de la modificación del genoma de FVIII.

10 El rAAV muestra habitualmente las mejores previsiones para los trastornos crónicos como la HA debido a su excelente perfil de seguridad. Además, los inventores y otros han mostrado que una administración única de vector rAAV es suficiente para dirigir la expresión transgénica a largo plazo sin una toxicidad significativa en una diversidad de modelos animales que incluyen primates no humanos. La integración del provirus rAAV ha sido descrita, pero a una frecuencia que es excesivamente baja y comparable a la del DNA de plásmido. Por lo tanto, la expresión

15 transgénica estable está mediada principalmente por genomas de rAAV episomalmente retenidos en los tejidos postmitóticos, reduciendo así el riesgo de una oncogénesis insercional. Esto contrasta con los vectores integrantes que se ha mostrado que provocan un trastorno linfoproliferativo en niños con SCID-XI. Aunque recientemente se ha informado de resultados alentadores en pacientes que sufren enfermedad de Parkinson y amaurosis congénita de Lever a continuación de una transferencia génica mediada por rAAV, hasta recientemente el tamaño grande del

20 hFVIII c de NA (-7 Kb), que sobrepasa la capacidad de envasado relativamente pequeña de rAAV de ~ 4,7 a 4,9 Kb, a limitado el uso de este vector para la HA. Un informe reciente de Pierce y colaboradores demostró la expresión a largo plazo (>4 años) de FVIII canino con supresión de dominio B (BDD) a un 2,5-5% de lo normal a continuación de una administración única de rAAV en perros con hemofilia A. Sin embargo, la expresión mediada por rAAV de FVIII humano no ha sido establecida hasta el mismo grado.

25 Actualmente, la complicación más grave y comprometedora del tratamiento con concentrados de FVIII es el desarrollo de anticuerpos neutralizantes para FVIII (inhibidores de FVIII) que se produce en hasta un 30% de pacientes con HA. Estos inhibidores anulan los efectos biológicos de los concentrados de FVIII y hacen que sea difícil tratar episodios de hemorragias, excepto con agentes de derivación como factor VII activado recombinante

30 (rFVIIa). El csoste significativo del rFVIIa (~ 500.000 libras esterlinas por episodio de cirigía ortopédica) y la toxicidad (por ejemplo, trombosis) Excluyen el uso profiláctico. La inducción de la tolerancia inmune (ITI) es un objetivo alternativo, pero es menos eficaz en pacientes con inhibidores de titulación elevada de permanencia prolongada. De hecho, se ha conseguido una tolerancia periférica en algunos pacientes con inhibidores de FVIII irresolubles a continuación de un trasplante de hígado, sugiriendo que la expresión endógena a largo plazo y estable de hFVIII

35 puede ser importante para conseguir la tolerancia. Los datos de los inventores en ratones y primates no humanos y los de otros muestran que la transferencia génica dirigida al hígado con rAAV favorecen un estado de tolerancia permanente hacia el transgen a través de la expresión de células T reguladoras específicas de transgenes (Tregs).

Por lo tanto, la transferencia génica puede proporcionar un medio alternativo para la prevención y erradicación de 40 inhibidores irresolubles.

Una lección clave de los ensayos clínicos previos con rAAV es que los estudios clínicos previos necesitan ser evaluados en un contexto relevante para seres humanos. Por lo tanto, han sido enfocados en primates no humanos para la evaluación de vectores rAAV porque, como en seres humanos, los macacos son hospedantes naturales para

45 una infección de AAV. Esto proporciona un oportunidad importante para evaluar la eficacia de la transferencia génica con vectores de rAAV en animales de raza no pura previamente sensibilizados con AAV de tipo salvaje, lo que no es posible con modelos de múridos o caninos. Finalmente, las autoridades reguladoras en Europa y los estados Unidos están requiriendo ahora estudios preclínicos de seguridad y eficacia en primates no humanos como una condición para la autorización de un ensayo clínico.

50 Para superar las desventajas anteriormente mencionadas, los inventores han creado una secuencia mejorada de nucleótidos aislados que codifican el factor VIII junto con un nuevo promotor.

Sumario de la invención

55 En un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y que codifica factor VIII funcional (fVIII o FVIII).

60 La presente invención proporciona también un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y que codifica factor VIII funcional.

Además, la presente invención proporciona un célula hospedante que comprende una molécula de ácido nucleico 65 como se describió anteriormente o un vector como se describió anteriormente.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un animal transgénico que comprende células que comprenden una molécula de ácido nucleico o un vector como se describió anteriormente.

Además, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico como se describió anteriormente o un 5 vector como se describió anteriormente para un uso en terapia.

Adicionalmente, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico como se describió anteriormente

o un vector como se describió anteriormente para un uso en el tratamiento de hemofilia.

La molécula de ácido nucleico anteriormente descrita puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos 85% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3. Esta secuencia de nucleótidos es un promotor.

La presente invención proporciona también un método para la preparación de un vector de suministro de genes 15 parvovirales, comprendiendo el método las etapas de:

(a)

proporcionar una célula de insecto que comprende uno o más constructos de ácidos nucleicos que comprenden:

(i)

una molécula de ácido nucleico como se describió anteriormente que está flanqueada por al menos una secuencia de nucleótidos repetida, terminal, invertida y parvoviral;

(ii)

un primer cassette de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas Rep parvovirales que está funcionalmente conectado a un promotor que es capaz de conducir la expresión de la(s) proteína(s) Rep en la célula de insecto;

(iii) un segundo cassette de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas de la capsid que está funcionalmente conectado a un promotor que es capaz de conducir la expresión de la(s) proteína(s) de la cápside en la célula de insecto;

(b)

cultivar la célula de insecto definida en el apartado (a) bajo condiciones que conduzcan a la expresión de la Rep y las proteínas de la cápside; y, opcionalmente,

(c)

recuperar el vector de suministro de gen parvoviral.

35 Descripción detallada de la invención

Según un aspecto de la invención, se proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una homología sustancial respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1. La expresión “homología sustancial” puede ser adicionalmente definida con respecto a una homología porcentual. Esto se expone más en detalle con posterioridad pero, de forma breve, la secuencia de nucleótidos tiene una homología de al menos 90% (también definida como identidad) respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

El término “aislada”, cuando se usa en relación con una molécula de ácidos nucleicos de la invención, se refiere

45 normalmente a una secuencia de ácidos nucleicos que está identificada y separa de al menos un ácido nucleico contaminante que está ordinariamente asociado en su fuente natural. El ácido nucleico aislado puede estar presente en una forma o ajuste que es diferente del que se encuentra en la naturaleza. Por el contrario, los ácidos nucleicos no aislados son ácidos nucleicos como DNA y RNA que se encuentran en el estado que existe en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de DNA dada (por ejemplo, un gen) se encuentra en el cromosoma de células hospedantes en las proximidades de genes vecinos; las secuencias de RNA, como una secuencia de mRNA específica que codifica una proteína específica, se encuentran en la célula en forma de una mezcla con otros numerosos mRNAs que codifican una multitud de proteínas. La molécula de ácidos nucleicos aislada de la invención puede estar presente en una forma de cadena única o de cadena doble. Cuando una molécula de ácidos nucleicos aislada va a ser utilizada para expresar una proteína, normalmente contendrá como mínimo la cadena de sentido o codificadora

55 (es decir, la molécula de ácidos nucleicos puede ser de cadena única), pero puede contener las cadenas tanto de sentido como de anti-sentido (es decir, la molécula de ácidos nucleicos puede ser de cadena doble).

La molécula de ácidos nucleicos de la invención tiene una homología de al menos 90% y, más preferentemente, al menos 95%, por ejemplo una homología de al menos 98% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº

1. Preferentemente tiene también una homología de al menos 70%, más preferentemente al menos 75% y más preferentemente al menos 80% respecto al factor VIII de tipo salvaje. Además, la molécula de ácidos nucleicos codifica una proteína de factor VIII funcional, es decir, codifica el cofactor VIII que cuando es expresado tiene la funcionalidad del factor VIII de tipo salvaje. La Molécula de ácidos nucleicos, cuando es expresada en un sistema adecuado (por ejemplo, una célula hospedante), produce una proteína de factor VIII funcional a un nivel

65 relativamente elevado. Como el factor VIII que es producido es funcional, tendrá una conformación que es la misma que al menos una parte del factor VIII de tipo salvaje. En una realización, el factor VIII producido mediante el ácido nucleico tendrá la misma conformación que el factor VIII N6 que ha sido previamente descrito. Una proteína de factor VIII funcional producida mediante la invención permite que tenga lugar al menos algo de coagulación de sangre en un sujeto. Esto provoca una disminución en el tiempo que tarda la sangre en coagular en un sujeto que padezca de hemofilia. El factor VIII normal participa en la coagulación sanguínea a través de la cascada de

5 coagulación. El factor VIII normal es un cofactor para el factor IXa que, en presencia de Ca+2 y fosfolípidos forma un complejo que convierte el factor X en la forma Xa activada. Por lo tanto, una proteína de factor VIII funcional según la invención puede formar un complejo funcional con el factor IXa que puede convertir el factor X en forma Xa activada.

10 Las secuencias de nucleótidos de factor XVIII previamente usadas han tenido problemas con la expresión de la proteína funcional. Esto se cree que es debido a un expresión ineficaz de mRNA, plegado erróneo de la proteína con posterior degradación intracelular y transporte ineficaz del producto de traducción primaria desde el retículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi. Los inventores han encontrado que la molécula de ácidos nucleicos proporcionada por la invención provoca niveles sorprendentemente elevados de expresión de una proteína de factor

15 VIII tanto in vitro como in vivo. Esto significa que esta molécula de ácidos nucleicos podría ser usada en terapia génica para tratar hemofilia como la hemofilia A.

La secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 es una secuencia de ácidos nucleicos de factor VIII humano optimizado mediante codones que está basada en la secuencia correspondiente a la secuencia de nucleótidos de

20 factor VIII N6. La secuencia de nucleótidos de factor VIII N6 es una secuencia de factor VIII de la que el dominio B ha sido agotado y sustituido con un separador corto de dominio B, con elevado contenido de oligosacáridos conectados a asparagina, que mejora el transporte de N6-FVIIII desde el ER hasta el aparato de Golgi.

Los inventores han mostrado que la SEC ID Nº 1 y las secuencias que son similares a la misma, es decir, las

25 secuencias que tienen un nivel relativamente elevado de homología, muestran todas sorprendentemente unos niveles elevados de expresión de proteína funcional. A este respecto, las SEC ID Nº 4, 5, 6 y 7 son también secuencias de ácidos nucleicos de factor VIII optimizadas mediante codones, cuyo % de homología es 88%, 77%, 82% y 97%, respectivamente, en comparación con la SEC ID Nº 1.

30 Una secuencia de nucleótidos de la invención puede tener al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 650, al menos aproximadamente 890, al menos aproximadamente 1140, al menos aproximadamente 1380, al menos aproximadamente 1530 de todos los codones que codifican el factor VIII funcional que es idéntico a los codones (en las posiciones correspondientes) en la SEC ID Nº 1.

35 La secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 4 es una secuencia de ácidos nucleicos de factor VIII optimizada mediante codones que está basada en la secuencia de una secuencia de nucleótidos de factor VIII SQ N6. La secuencia de nucleótidos de factor VIII SQ N6 es una secuencia de factor VIII de la que el dominio B ha sido agotado y suprimido con una conexión SQ de 14 aminoácidos entre los dominios a2 y a3. En la conexión SQ, ha sido insertado un dominio N6 B.

40 La secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 5 es una secuencia de ácidos nucleicos de factor VIII optimizada mediante codones que está basada en la secuencia de una secuencia de nucleótidos de factor VIII SQ. La secuencia de nucleótidos de factor VIII SQ es una secuencia de factor VIII de la que el dominio B ha sido agotado y sustituido con una conexión SQ de 14 aminoácidos entre los dominios a2 y a3. La presencia de la conexión SQ en el

45 complejo favorece una escisión intracelular eficaz del producto de traducción de cadena única primario de 170 kDa debido a los residuos básicos de arginina que forman un resto de reconocimiento para la escisión proteolítica mediante la proteasa furina de tipo subtilisina unida a membrana.

La secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 6 es una secuencia de ácidos nucleicos de factor VIII optimizado

50 mediante codones que está basada en una secuencia de la secuencia de nucleótidos de factor VIII de factor B SQ. PEZ teleósteo Fugu rubripes. El dominio de Fugu B tiene una concentración de sitios de glicosilación conectados a N que mejora grandemente el tráfico intracelular y la expresión de la secuencia.

La secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 7 es una secuencia de ácidos nucleicos de factor VIII optimizado 55 mediante codones que está basada en la secuencia de la secuencia de nucleótidos de factor VIII N6.

En una realización, cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una conexión SQ en la proteína de factor VIII. La secuencia de aminoácidos del conector SQ es preferentemente la secuencia de la SEC ID Nº 18.

60 En otra realización, cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio b N6 en la proteína de factor VIII.

En una realización adicional, cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos de la invención puede comprender una 65 secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Fugu B en la proteína de factor VIII.

El ácido nucleico de la invención puede comprender una conexión SQ y un dominio B N6 en la proteína de factor VIII, o una conexión SQ y un dominio Fugu B en la proteína de Factor VIII.

Generalmente, la optimización mediante codones no cambia el aminoácido para el que codifica cada codón.

5 Simplemente cambia la secuencia de nucleótidos de forma que es más probable que sea expresada a un nivel relativamente elevado en comparación con la secuencia no optimizada con codones. Por lo tanto, en una realización, la molécula de ácidos nucleicos de la invención codifica una proteína que tiene entre 0 y 350, entre 0 y 300, entre 0 y 250, entre 0 y 200, entre 0 y 150, entre 0 y 100, entre 0 y 50, entre 0 y 30, entre 0 y 20, entre 0 y 15, entre 0 y 10, entre 0 y 5 cambios de aminoácidos para la proteína codificada mediante la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 7. Esto significa que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de la invención puede ser diferente pero cuando son traducidas a la secuencia de aminoácidos de la proteína que es producida difiere solamente en entre 0 y 10 aminoácidos. Preferentemente, cualesquiera cambio de aminoácidos codificados para el ácido nucleico de la invención, en comparación con la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 7 están en la parte de la secuencia que sustituyó el dominio B de la proteína de factor VIII, es decir, los cambios no se producen en otros

15 dominios de la proteína como los dominios A1, a1, A2, a2, a3, A3, C1 o C2. Los cambios de aminoácidos en los otros dominios de la proteína de factor VIII afectan a la actividad biológica de la proteína de factor VIII.

Además, la molécula de ácidos nucleicos de la invención puede codificar una proteína que es codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 7. Esto significa que las secuencias de nucleótidos del ácido nucleico de la invención pueden ser diferentes, pero cuando son traducidas, la secuencia de aminoácidos de la proteína que es producida es la misma.

En una realización preferida de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica un factor VIII funcional tiene una desviación mejorada del uso de codones para la célula humana en comparación con la secuencia de 25 nucleótidos que se produce de forma natural que codifica la correspondiente secuencia no optimizada mediante codones. La adaptabilidad de una secuencia de nucleótidos que codifica un factor VIII funcional para el uso de codones de células humanas puede ser expresada en forma de un índice de adaptación de codones (CAI). Un índice de adaptación de codones se define en la presente memoria descriptiva como una medición de la adaptabilidad relativa del uso de codones de un gen hacia el uso de codones de genes humanos altamente expresados. La adaptabilidad relativa (w) de cada codón es la relación del uso de cada codón, respecto a la del codón más abundante para el mismo aminoácido. El CAI se define como la media geométrica de estos valores de la adaptabilidad relativa. Los codones no sinónimos y los codones de terminación (dependientes del código genético) son excluidos. Los valores del CAI varían en el intervalo de 0 a 1, en que los valores suprimidos indican una proporción superior de los codones más abundantes (véase Sharp and Li , 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281

35 1295; véase también: Kim et al., Gene. 1997, 199:293-301; zur Megede et al., Journal of Virology, 2000, 74: 26282635). Preferentemente, una molécula de ácidos nucleicos que codifica un factor VIII tiene un CAI de al menos 0,8, 0,85, 0,90, 0,92, 0,94, 0,95, 0,96 o 0,97.

En una realización particular, la molécula de ácidos nucleicos codifica una proteína que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 21 que tiene entre 0 y 250, entre 0 y 200, entre 0 y 150, entre 0 y 100, entre 0 y 50, entre 0 y 30, entre 0 y 20, entre 0 y 15, entre 0 y 10 o entre 0 y 5 cambios de aminoácidos en la misma. Si la molécula de ácidos nucleicos codifica una proteína que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 21 que tiene cambios para cualquiera de los aminoácidos, la proteína debe ser todavía una proteína funcional. Un experto en la técnica apreciará que se pueden hacer cambios menores para algunos de los aminoácidos de la

45 proteína sin afectar a la función de la proteína. Preferentemente, los cambios de aminoácidos están en la parte de la secuencia que sustituye al dominio B de la proteína del factor VIII, es decir, los cambios no se producen en otros dominios de la proteína como los dominios A1, a1, A2, a2, a3, A3, C1 o C2. En otras realizaciones, la molécula de ácidos nucleicos puede codificar una proteína que comprende o consiste en la secuencia de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 21.

Estaría dentro de las capacidades de un experto en la técnica producir una molécula de ácidos nucleicos según la invención. Esto se podría hacer, por ejemplo, usando una síntesis química de una secuencia dada.

Además, un experto en la técnica sería capaz fácilmente de determinar si un ácido nucleico según la invención

55 expresa una proteína funcional. Los métodos adecuados serían evidentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, un método in vitro adecuado incluye insertar el ácido nucleico en un vector, como un vector lentiviral o AAW transducir células hospedantes, como células 293T o HeLa con el vector y valorar la actividad de factor VIII. Alternativamente, un método in vivo adecuado incluye transducir un vector que contiene el ácido nucleico en ratones hemofílicos y valorar el factor VIII funcional en el plasma de los ratones. Se describen métodos adecuados más en detalle con posterioridad.

El ácido nucleico puede ser cualquier tipo de ácido nucleico compuesto por nucleótidos. El ácido nucleico debe ser capaz también de ser expresado de forma que se produzca una proteína. Preferentemente, el ácido nucleico es DNA o RNA.

65 La molécula de ácidos nucleicos comprende preferentemente una secuencia de nucleótidos seleccionada entre la secuencia de la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 7. La molécula de ácidos nucleicos puede consistir en una secuencia de nucleótidos seleccionada entre la secuencia de la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 7. En una realización, la molécula de ácidos nucleicos consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

5 También se proporciona un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos de la invención. El vector puede ser cualquier vector apropiado, incluidos vectores virales y no virales. Los vectores virales incluyen vectores lentiadeno- y herpes-virales. Preferentemente es un vector viral recombinante adeno-asociado (rAAW) o un vector lentiviral. Alternativamente, pueden ser usados sistemas no virales que incluyen DNA purificado (con o sin regiones de unión a cromatina) o DNA conjugado que es introducido en la células mediante diversos métodos de transfección como lípidos o electroporación.

El vector comprende también preferentemente otros componentes necesarios para la expresión de la molécula de ácidos nucleicos, como promotores. Pueden ser usados cualesquiera promotores, como LP1, HCR-hAAT, ApoEhAAT y LSP. Estos promotores se describen más en detalle en las siguientes referencias: LP1: Nathwani A. et al.

15 Blood. 2006 April 1; 107(7): 2653-2661; HCR-hAAT: Miao CH et al. Mol Ther. 2000;1: 522-532; ApoE-hAAT: Okuyama T et al. Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996); and LSP: Wang L et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 March 30; 96(7): 3906-3910..

Se proporciona un promotor particular preferido particular. Este es un promotor que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una homología sustancial a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3. El promotor es específico para el hígado. En una realización, la molécula de ácidos nucleicos anteriormente descrita comprende además una secuencia de nucleótidos que tiene una homología sustancial a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3. La expresión “homología sustancial” puede ser definida adicionalmente con referencia a un porcentaje de homología. Esto se expone más en detalle con posterioridad.

25 Un vector según la invención puede ser un vector de suministro de genes. Este vector de suministro de genes puede ser un vector de suministro de genes viral o un vector de suministro de genes no viral.

El suministro de genes no viral se puede llevar a cabo usando DNA purificado que es el método más simple de transfección no viral. Puede ser posible, por ejemplo, administrar un ácido nucleico de la invención usando un DNA de plásmido purificado. Alternativamente, pueden ser usados métodos como electroporación, sonoporación o mediante el uso de una “pistola de genes”, que dispara partículas de oro revestidas con DNA en la célula usando, por ejemplo, un gas a presión elevada o una pistola de calibre 22 invertida.

35 Para mejorar el suministro de un ácido nucleico a una célula, puede ser necesario protegerlo del deterioro y puede ser facilitada su entrada en la célula. Con esta finalidad, pueden ser usados lipoplejos y poliplejos que tienen la capacidad de proteger un ácido nucleico de una degradación no deseable durante el procedimiento de transfección.

El DNA de plásmido puede ser revestido con lípidos en una estructura organizada como una micela o un liposoma. Cuando la estructura organizada es complejada con DNA se denomina lipoplejo. Pueden ser usados lípidos aniónicos y neutros para la construcción de lipoplejos para vectores sintéticos. Sin embargo, preferentemente, pueden ser usados lípidos catiónicos, debido a su carga positiva, para condensar negativamente moléculas de DNA con carga negativa con el fin de facilitar la encapsulación de DNA en forma de liposomas. Puede ser necesario añadir lípidos Helper (habitualmente lípidos eléctricamente neutros como DOPE) a lípidos catiónicos con el fin de

45 formar lipoplejos.

Los complejos de polímeros con DNA, denominado poliplejos, pueden ser usados para suministrar un ácido nucleico de la invención. La mayoría de los poliplejos consisten en polímeros catiónicos y su producción está regulada mediante interacciones iónicas. Los poliplejos normalmente no pueden liberar su contenido de DNA en el citoplasma. Por tanto, puede ser necesaria una co-transfección con agentes endosoma-liticos (para lisar el endosoma que se prepara durante la endocitosis, el procedimiento mediante el cual el poliplejo entra en la célula), como adenovirus inactivados.

Pueden ser usados métodos híbridos para suministrar un ácido nucleico de la invención que combine dos o más

55 técnicas. Los virosomas son un ejemplo, combinan liposomas con un HIV inactivado o virus gripal. Otros métodos incluyen la mezcla de otros vectores virales con lípidos catiónicos o virus hibridantes y pueden ser usados para suministrar un ácido nucleico de la invención.

Puede ser usado un dendrímero para suministrar un ácido nucleico de la invención, en particular, un dendrímero catiónico, es decir, uno con una carga superficial positiva. Cuando esté en presencia de un material genético como DNA o RNA, la complementaridad de la carga conduce a una asociación temporal del ácido nucleico con el dendrímero catiónico. Al alcanzar su destino, el complejo de dendrímero-ácido nucleico es seguidamente importado a la célula a través de endocitosis.

65 Más normalmente, puede ser usado un vector de suministro de genes virales adecuado para suministrar un ácido nucleico de la invención. Los vectores virales adecuados para ser usados en la invención pueden ser un parvovirus, un adenovirus, un retrovirus, un lentivirus o un virus simple de herpes. El parvovirus puede ser un virus asociado a adenovirus (AAW).

Como se usa en la presente invención, en el contexto del suministro de genes, el término “vector” o la expresión

5 “vector de suministro de genes” se puede referir a una partícula que funciona como un vehículo de suministro de genes y que comprende ácido nucleico “es decir, el genoma del vector) envasado, por ejemplo, en una envoltura o cápside. Alternativamente, en algunos contextos, el término “vector” puede ser usado para hacer referencia solamente al genoma del vector.

Consecuentemente, la presente invención proporciona vectores de suministro de genes (que comprenden un ácido nucleico de la invención) basados en parvovirus de animales, en particular dependovirus como AAW humano infeccioso o de simio y sus componentes (por ejemplo, un genoma de parvovirus animal) para ser usado como vectores para la introducción y/o expresión de un polipéptido de factor VIII en una célula de mamífero. El término parvoviral”, como se usa en la presente memoria descriptiva, abarca por tanto a dependovirus como cualquier tipo

15 de AAW.

Los virus de la familia de parvovirídos son virus de animales de DNA pequeños. La familia de los parvovíridos puede ser dividida en dos subfamilias: los parvovirídos, que infectan a vertebrados y los densovíridos que infectan a insectos. Los miembros de la subfamilia de los parvoviríridos se denominan en la presente memoria descriptiva parvovirus e incluyen el género dependovirus. Como se puede deducir a partir del nombre de su género, los miembros de los dependovirus son únicos en cuanto que habitualmente requieren una co-infección con un virus Helper como un adenovirus o un virus del herpes para una infección productiva en el cultivo celular. El género dependovirus incluye AAW, que normalmente infecta seres humanos (por ejemplo, serotipos, 2, 3a, 3b, 4, 5 y 6) o de primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4) y virus relacionados que infectan otros animales de sangre caliente (por

25 ejemplo, virus de adenovirus bovinos, caninos, equinos, y ovinos. Otra información sobre parvovirus y otros miembros de los parvovíridos se describe por Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," capítulo 69 en Fields Virology (3d Ed. 1996). Por motivos de conveniencia, la presente invención se ilustra adicionalmente como se describe en la presente memoria descriptiva en relación a los AAV. Sin embargo, debe entenderse que la invención no está limitada a los AAW sino que puede ser igualmente aplicada a otros parvovirus.

La organización genómica de todos los serotipos de AAW conocidos es muy similar. El genoma de un AAW es una molécula de DNA de cadena única lineal, que tiene menos de aproximadamente 5 mil nucleótidos (nt) de longitud. Repeticiones terminales invertidas (ITRs) flanquean las secuencias de nucleótidos de codificación única para las proteínas de replicación no estructurales (Reb) y las proteínas estructurales (VP). Las proteínas VP (VB1, -2 y -3)

35 forman la cápside IDE. Los 145 nt son auto-complementarios y están organizados de forma que se puede formar un dúplex intramolecular energéticamente estable que forma una horquilla en forma de T. Estas estructuras de horquillas funcionan como n origen para la replicación de DNA viral, sirviendo como cebadores para el complejo celular de DNA-polimerasa. A continuación de una infección de AAV de tipo salvaje (WT) en células de mamíferos, los genes de Rep (es decir, que codifican proteínas Rep78 y Rep52) son expresados a partir del promotor P5 y el promotor P19, respectivamente, y ambas proteínas de Rep tienen una función en la replicación del genoma viral. Un acontecimiento de escisión en el Rep o RF da lugar a la expresión de realmente cuatro proteínas de Rep (es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep 40). Sin embargo, se ha mostrado que el eRNA no escindido, que codifica proteínas de Rep78 y Rep52, en células de mamíferos, es suficiente para la producción del vector de AAV. También, en células de insectos, las proteínas de Reo 78 y Rep52 son suficientes para la producción de vector de AAV.

45 En un AAV adecuado para ser usado como un vector de terapia génica el genoma del vector comprende normalmente un ácido nucleico de la invención (como se describe en la presente memoria descriptiva) que va a ser envasado para un suministro a una célula diana. Según esta realización particular, la secuencia de nucleótidos heterólogos está ubicada entre las ITRs virales en cualquier extremo del genoma del vector. En realizaciones preferidas adicionales, los genes CAP de parvovirus (por ejemplo, AAV) y los genes Rep de parvovirus (por ejemplo AAV) son suprimidos del genoma de la plantilla (y, por tanto del DNA de virión producido a partir del mismo). Esta configuración maximiza el tamaño de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que se puede(n) llevar a cabo por la cápside del parvovirus.

55 Según esta realización particular, el ácido nucleico de la invención está ubicado entre las ITRs virales en cualquier extremo del sustrato. Es posible que un genoma parvoviral funcione como solamente una ITR. Por tanto, en un vector de terapia génica de la invención basado en un parvovirus, el genoma del vector esta flanqueado por al menos una ITR pero, más normalmente, por dos ITRs de AAV (generalmente con un lado del genoma del vector, es decir, uno en el extremo 5’ y uno en el extremo 3’). Puede haber secuencias que intervienen entre el ácido nucleico de la invención en el genoma del vector y una o más de las ITRs.

Preferentemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor VII funcional (para la expresión en la célula de mamífero) será incorporado en un genoma parvoviral ubicado entre dos ITRs regulares o ubicado en cualquier lado de ITR tratada por ingeniería genética con dos regiones D.

65 Las secuencias de AAV que pueden ser usadas en la presente invención para la producción de vectores de terapia génica de AAV pueden ser derivadas del genoma de cualquier serotipo de AAV. Generalmente, los serotipos de AAV tienen secuencias genómicas de una homología significativa en los niveles de aminoácidos y ácidos nucleicos, proporcionan un conjunto idéntico de funciones genéticas, producen viriones que son de forma esencial física y funcionalmente equivalentes y se replican y ensamblan mediante mecanismos prácticamente idénticos. Para la

5 secuencia genómica de los diversos serotipos de AAV y para una visión global de las analogías genómicas, véase, por ejemplo, GenBank Accession number U89790; GenBank Accession number J01901; GenBank Accession number AF043303; GenBank Accession number AF085716; Chiorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chiorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72:309-319); and Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47). Pueden ser usados serotipos de AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 en la presente invención. Sin embargo, los serotipos de AAV 1, 5 ó 8 son fuentes preferidas de secuencias de AAV para ser usadas en el contexto de la presente invención.

Preferentemente, las secuencias de ITR de AAV para ser usadas en el contexto de la presente invención son derivadas de AA V1, AAV2, AAV4 y/o AAv6. Análogamente, las secuencias codificadoras de Rep (Rep78 y Rep52)

15 son preferentemente derivadas de AAv1, AAV2, AAV4 y/o AAV6. Las secuencias que codifican las proteínas de cápsides VP1, VP2 y VP3 para ser usadas en el contexto de la presente invención, sin embargo, pueden ser tomadas de cualquiera de los 42 serotipos conocidos, más preferentemente de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 o partículas de tipo AAV nuevamente desarrolladas obtenidas, por ejemplo, mediante técnicas de recomposición de cápsides y bibliotecas de cápsides de AAV.

Las secuencias de Rep e ITR de AAV son particularmente conservadas entre las mayorías de los serotipos. Las proteínas de Rep78 de diversos serotipos de AAV son, por ejemplo, más de un 89% idénticas y la identidad de la secuencia de nucleótidos totales al nivel del genoma entre AAV2, AAV3a, AAV3b y AAV6 es de aproximadamente 82% % (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73(2):939-947). Además, las secuencias de Rep y las ITRs de muchos

25 serotipos de AAV se conoce que se cruzan-complementan eficazmente (es decir, sustituyen funcionalmente) a las secuencias correspondientes de otros serotipos en la producción de partículas de AAV en células de mamíferos. El documento US 2003148506 refiere que las secuencias de Rep y de ITR de AAV también se cruzan-complementan, eficazmente respecto a otras secuencias de Rep y de ITR de AAV en células de insectos.

Las proteínas VP de AAV se conoce que determinan la tropicidad células del virión de AAV. Las secuencias que codifican proteínas de VP son significativamente menos conservadas que las proteínas de Reb y los genes entre diferentes serotipos de AAV. La capacidad de secuencias de Rep y de ITR para conocer-complementar las correspondientes secuencias de otros serotipos permite la producción de partículas de AAv pseudo-tipadas que comprenden las proteínas de cápsides de un serotipo (por ejemplo AAV1, 5 o 8) y las secuencias de Rep y/o ITR de

35 otro serotipo AAV (por ejemplo, AAV2). Estas partículas de rAAV pseudotipadas son una parte de la presente invención.

Las secuencias de “AAV” modificadas puedes ser también en el contexto de la presente invención, por ejemplo para la producción de vectores de terapia génica de AAV. Estas secuencias modificadas incluyen, por ejemplo, secuencias que tienen al menos aproximadamente 75%, al menos es aproximadamente 80%, al menos aproximadamente, 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o más identidad de secuencias de nucleótidos y/o amino vacíos (por ejemplo, una secuencia que tiene una identidad de secuencias de nucleótidos de aproximadamente 75-99%)respecto a un AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 ITR, Rep o VP pueden ser usadas en lugar de las secuencias de AAV ITR, Rep o Vp de tipo salvaje.

45 Aunque es similar a otros serotipos de AAW en muchos aspectos, el AAV5 difiere de otros serotipos de AAV humanos y de simios más que otros serotipos humanos y de simios conocidos. Considerando esto, la producción de AAV5 puede diferir de la producción de otros serotipos en células de insectos. Cuando los métodos de la invención son empleados para producir rAAV5, es preferido que uno o más constructos que comprendan, colectivamente en el caso de más de un constructo, una secuencia de nucleótidos que comprende una IPR de AAV5, una secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora Rep de AAV5 (es decir, una secuencia de nucleótidos comprende una Rep78 de AAV5). Estos ITR y secuencias de Rep pueden ser modificadas en la medida deseada para obtener una producción eficaz de AAV5 o vectores de AAV5 pseudotipados. Por ejemplo, el codón de comienzo de las secuencias de Rep puede ser modificado, los sitios de escisión de VP pueden ser modificados o

55 eliminados y/o el codón de comienzo de VP1 y los nucleótidos cercanos pueden ser modificados para mejorar la producción de vectores de AAV5.

Por tanto, la cápside viral usado en la invención puede ser de cualquier parvovirus, ya sea un parvovirus autónomo o un dependovirus, como se describió anteriormente. Preferentemente, la cápside viral es un cápside de AAV (por ejemplo, cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 o AAV6). En general, se prefieren la cápside de AAV1 o cápside de AAV6. La elección de la cápside parvovirus puede estar basada en un cierto número de consideraciones como es conocido en la técnica, por ejemplo, el tipo de célula diana, el nivel de expresión deseado, la naturaleza de la secuencia de nucleótidos heteróloga que va a ser expresada, cuestiones relacionadas con la producción viral y similares. Por ejemplo, la cápside de AAV1 y AAV6 pueden ser ventajosamente empleados para músculos 65 esqueléticos; AAV1, AAV5 y AAV8 para el hígado y células del sistema nervioso central (por ejemplo, cerebro); AAV5 para células en las vías respiratorias y el pulmón o cerebro; AAV3 para células de médula ósea; y AAV4 para

células particulares en el cerebro (por ejemplo, células adjuntables).

Está dentro de los conocimientos técnicos de un experto en la técnica, seleccionar el virus, subtipo de virus o serotipo de virus más apropiado. Algunos subtipos o serotipos pueden ser más apropiados que otros para un cierto 5 tipo de tejido.

Por ejemplo, la expresión específica para el hígado de un ácido nucleico de la invención puede ser ventajosamente inducida mediante la transducción mediada por AAV de células de hígado. El hígado es susceptible a una transducción mediada por AAV y pueden ser usados muchos serotipos diferentes (por ejemplo, AAV1, AAV5 o

10 AAV8). La transducción de músculos puede ser realizada mediante la administración de un AAV que codifique un ácido nucleico de la invención a través de la corriente sanguínea. Por tanto, es aplicable la administración intravenosa o intra-arterial.

Un vector de terapia génica de parvovirus preparado según la invención puede ser una partícula “híbrida” en la que

15 las TRs virales y la cápside viral son de parvovirus diferentes. Generalmente, las TRs virales y la cápside son de serotipos diferentes de AAV. Análogamente, el parvovirus puede tener un cápside “quimérico” (por ejemplo, que contiene secuencia de parvovirus diferentes, preferentemente diferentes serotipos de AAV) o un cápside “hecho diana” (por ejemplo, un tropismo dirigido).

20 En el contexto de la invención, “al menos una secuencia de nucleótidos de IPR parvoviral” se entiende que significa una secuencia palindrómica, que comprende principalmente secuencias dispuestas de forma complementaria o simética también denominadas regiones “A”, “B” y “C”. La ITR funciona como un origen de replicación, un sitio que tiene una función “cis” en la replicación, es decir, que es un sitio de reconocimiento para proteínas de replicación de actuación en trans, como, por ejemplo, Rep78 (o Rep68) que reconoce el palíndrome y las secuencias específicas

25 internas para el palíndrome. Una excepción a la simetría de la secuencia de ITR es la región “D” de la ITR. Es única (que no tiene un complemento en una ITR). El mellado de DNA de cadena única se produce en la unión entre las regiones A y D. Es la región en la que se inicia la síntesis de nuevo DNA. La región D normalmente se sitúa en un lado del palíndrome y proporciona direccionalmente la etapa de replicación del ácido nucleico. Un parvovirus replicante en una célula de mamífero tiene normalmente dos secuencias de ITR. Sin embargo, es posible tratar por

30 ingeniería genética una ITR de forma que los sitios de unión estén en las dos cadenas de las regiones A y regiones D ubicadas simétricamente, una a cada lado del palíndrome. En una plantilla de DNA circular de cadena doble (por ejemplo, un plásmido), la replicación de ácido nucleico asistida por Rep78 o Rep68 tiene lugar entonces en ambas direcciones y es suficiente una ITR única para la replicación parvoviral de un vector circular. Por tanto, puede ser usada una secuencia de nucleótidos de ITR en el contexto de la presente invención. Sin embargo, preferentemente,

35 se usan dos o incluso otro número de ITRs regulares. Lo más preferentemente, se usan dos secuencias de ITR. Una ITR parvoviral preferida es una ITR de AAV. Por razones de seguridad puede ser deseable construir un vector parvoviral (AAV) qiue es incapaz de propagarse adicionalmente después de la introducción inicial en una célula. Este mecanismo de seguridad para limitar la propagación no deseable del vector en un receptor puede ser proporcionado usando AAV con ITR quimérica como se describe en el documento US 2003148506.

40 Los expertos en la técnica apreciarán que la(s) proteína(s) de Rep usada(s) para producir un vector de AAV de la invención se pueden seleccionar teniendo en consideración la fuente de las ITRs virales. Por ejemplo, la ITR de AAV5 interacciona normalmente más eficazmente con la proteína Rep de AAV5, aunque no es necesario que el serotipo de la ITR y la proteína de Rep sea(n) coincidente(s).

45 La(s) ITR(s) usada(s) en la invención es (o son) normalmente funcional(es), es decir, pueden ser completamente resolubles y son preferentemente secuencias de AAV, siendo preferidos los serotipos 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Las ITRs de AAV resolubles según la presente invención no necesitan una secuencia de ITR salvaje (es decir, una secuencia de tipo salvaje puede ser alterada mediante inserción, deleción, truncación o mutaciones sin sentido), en la medida en

50 que la ITR medie las funciones deseadas, por ejemplo, envasado de virus, integración y/o rescate de provirus, y similares.

Ventajosamente, usando el vector de terapia génica en comparación con propuestas previas, las restauración de la proteína de síntesis, es decir, la síntesis de factor VIII, es una característica que las células transduccidas adquieren

55 permanentemente o durante un período de tiempo sostenido, evitando así la necesidad de una administración continua para conseguir un efecto terapéutico.

Consecuentemente, los vectores de la invención representan por lo tanto una herramienta para el desarrollo de estrategias para el suministro in vivo de un ácido nucleico de la invención, tratando por ingeniería genética el ácido

60 nucleico con un vector de terapia génica que transduce eficazmente el tipo de célula apropiada, como una célula de hígado.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un hospedante que comprende el vector anteriormente descrito. Preferentemente, el vector es capaz de expresar la molécula de ácido nucleico de la invención en el

65 hospedante. El hospedante puede ser cualquier hospedante adecuado.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “hospedante” se refiere a organismos y/o células que albergan una molécula de ácido nucleico o un vector de la invención, así como organismos y/o células que son adecuados para ser usados en la expresión en un gen o proteína recombinante. No está previsto que la presente invención esté limitada a algún tipo particular de célula u organismo. De hecho, está contemplado que cualquier

5 organismos y/o célula adecuados encuentren uso en la presente invención como un hospedante. Una célula hospedante puede estar en la forma de una célula única, una población de células similares o diferentes, por ejemplo en la forma de un cultivo (como un cultivo líquido o un cultivo en un sustrato celular sólido), un organismo o parte de los mismos.

Una célula hospedante según la invención puede permitir la expresión de una molécula de ácido nucleico de la invención. Por tanto, la célula hospedante puede ser, por ejemplo, una bacteria, una levadura, un insecto o una célula de mamífero.

Cualquier célula de insecto que permita la replicación de un vector parvoviral recombinante (rAAV) y que pueda ser

15 mantenida en un cultivo puede ser usada de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la línea celular usada puede ser de Spodoptera frugiperda, líneas celulares de drosofilas, líneas celulares de mosquito, por ejemplo, líneas celulares derivadas de Aedes albopictus. La células de insectos o líneas celulares preferidas son células de las especies de insectos que son susceptibles de infección con baculovirus que incluyen, por ejemplo, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, Ha2302, Hz2E5, High Five (Invitrogen, CA, USA) y expresSF+® (US 6.103.526; Protein Sciences Corp., CT, USA)..

Además, la invención proporciona un método para la preparación de un vector de suministro de genes parvovirales, comprendiendo el método las etapas de:

25 (a) proporcionar una célula de insecto que comprende uno o más constructos de ácidos nucleicos que comprenden:

(i)

una molécula de ácido nucleico de la invención que está flanqueada por al menos una secuencia de nucleótidos repetida terminal invertida parvoviral;

(ii)

un primer cassette de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas Rep parvovirales que está funcionalmente conectado a un promotor que es capas de conducir la expresión de la(s) proteína(s) Rep en la célula de insecto;

(iii) un segundo cassette de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más

35 proteínas de cápsides parvovirales que está funcionalmente conectada a un promotor que es capaz de conducir la expresión de la(s) proteína(s) de la cápside en la célula de insecto;

(b)

cultivar la célula de insecto definida en el apartado (a) bajo condiciones que conduzcan a la expresión del Rep y las proteínas de cápside; y opcionalmente,

(c)

recuperar el vector de suministro de genes parvovirales.

Por lo tanto, en general, el método de la invención permite la producción de un vector de suministro de genes parvovirales (que comprende un ácido nucleico de la invención) en una célula de insecto. Preferentemente, el

45 método comprende las etapas de: (a) cultivar una célula de insecto como se definió anteriormente bajo condiciones tales que se produzca el vector parvoviral (por ejemplo, AAV); y (b) recuperar el vector parvoviral recombinante (por ejemplo, AAV). Preferentemente, el vector de suministro de genes parvovirales es un vector de suministro de genes AAV.

Debe entenderse que el vector (AAV) producido en este método es preferentemente un virión parvoviral o AAV infeccioso que comprende un genoma parvoviral, que comprende en sí mismo un ácido nucleico de la invención. Las condiciones de crecimiento para células de insectos en un cultivo, y la producción de productos heterólogos en células de insectos en cultivo, son bien conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, en las referencias anteriormente citadas sobre tratamiento por ingeniería molecular de células de insectos.

55 En un método de la invención, se proporciona un ácido nucleico de la invención que está flanqueado por al menos una secuencia de ITR parvoviral. Este tipo de secuencia se describe en detalle con anterioridad. Preferentemente, el ácido nucleico de la invención está ubicado entre dos secuencias ITR parvovirales.

El primer cassette de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas Rep parvovirales que están funcionalmente conectadas a un primer promotor que es capaz de conducir la expresión de la(s) proteína(s) Rep en la célula de insecto.

Una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas Rep de parvovirus de animales es entendida en la presente

65 memoria descriptiva como una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales que son necesarias y suficientes para la producción de vector parvoviral en células de insectos como las proteínas Rep78 y Rep52 o las proteínas Rep68 y Rp 40 o las combinaciones de dos o más de las mismas.

La secuencia de nucleótidos de parvovirus animal es preferentemente de un dependovirus, más preferentemente de un virus adeno-asociado (AAV) humano o de simio y, lo más preferentemente, de un AAV que normalmente infecta

5 seres humanos (por ejemplo, serotipos, 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 y 6) o primates (por ejemplo serotipos 1 y 4). Las secuencias que codifican Rep son bien conocidas por los expertos en la técnica y se mencionan y se describen en detalle secuencias adecuadas en el documento WO 2007/148971 y también en el WO 2009/14445.

Preferentemente, la secuencia de nucleótidos codifica proteínas Rep de parvovirus de animales que son necesarias y suficientes para la producción de vectores parvovirales en células de insectos.

El segundo cassette de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas de cápsides parvovirales que está funcionalmente conectada a un promotor que es capaz de conducir la expresión de la(s) proteína(s) de la cápside en la célula de insecto. La(s) proteína(s) de cápside expresada puede ser una o más

15 de las anteriormente descritas.

Preferentemente, la secuencia de nucleótidos codifica proteínas cap de parvovirus de animales que son necesarias y suficientes para la producción del vector parvoviral en células de insectos.

Estas tres secuencias (genoma, codificación, rep y codificación cap) son proporcionadas en una célula de insecto por medio de uno o más constructos de ácidos nucleicos, por ejemplo, uno, dos o tres constructos de ácidos nucleicos. Así, preferentemente, el uno o más constructos de ácidos nucleicos para el genoma y expresión del vector del Rep parvoviral y proteínas cap en células de insecto es un vector compatible con células de insectos. Un “Vector compatible con células de insectos” o “vector” se entiende que es una molécula de ácido nucleico capaz de

25 una transformación productora o transfección de un insecto o célula de insecto. Ejemplos de vectores biológicos incluyen plásmidos, moléculas de ácidos nucleicos lineales y virus recombinantes. Puede ser empleado cualquier vector en la medida en que sea compatible con células de insectos. El vector se puede integrar en el genoma de las células de insectos, pero la presencia del vector en la célula de insecto necesita ser permanente y son incluidos también vectores episomales transitorios. Los vectores pueden ser introducidos por cualquier medio conocido, por ejemplo, mediante tratamiento químico de las células, electroporación o infección. En una realización preferida, el vector es un vaculovirus, un vector viral o un plásmido. En una realización más preferida, el vector es un vaculovirus, es decir, el constructo es un vector vaculoviral. Los vectores vaculovirales y los métodos para su uso son bien conocidos por los expertos en la técnica.

35 Por tanto, normalmente un método de la invención para producir un vector de suministro de genes parvovirales comprende: proporcionar a una célula permisiva para la replicación de parvovirus (a) una secuencia de nucleótidos que codifica una plantilla para producir genoma de vector de la invención (como se describe en detalle en la presente memoria descriptiva); (b) secuencias de nucleótidos suficientes para la replicación de la plantilla para producir un genoma de vector (el primer cassette de expresión anteriormente definido); (c) secuencias de nucleótidos suficientes para envasar el genoma del vector en un cápside de parvovirus (el segundo cassette de expresión anteriormente definido), bajo condiciones suficientes para la replicación y envasado del genoma de vector en la cápside de parvovirus, con lo que se producen en la célula partículas de parvovirus que comprenden el genoma del vector encapsidado en la cápside de parvovirus. Preferentemente, la replicación de parvovirius y/o secuencias codificadoras de la cápside son secuencias de AAV.

45 Un método de la invención puede comprenden preferentemente la etapa de purificación por afinidad del vector parvoviral recombinante (rAAV) (viriones que lo comprenden) usando un anticuerpo anti-AAV, preferentemente un anticuerpo inmovilizado. El anticuerpo anti-AAV es preferentemente un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo particularmente adecuado es un anticuerpo de camélida de cadena única o un fragmento del mismo que puede ser obtenido, por ejemplo a partir de camellos o llamas (véase, por ejemplo, Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277302). El anticuerpo para la purificación por afinidad de rAAV es preferentemente un anticuerpo que se une a un epitopo en una proteína de cápside de AAV, con lo que el epitopo es preferentemente un epitopo que está presente en la proteína de cápside y más de un serotipo de AAV. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser constituido o seleccionado sobre la base de unión específica a cápside AAV2 pero, al mismo tiempo, se puede unir también

55 específicamente a cápsides AAV1, AAV3, AAV5, AAV6, AAV8 o AAV9.

La invención proporciona también un medio para suministrar un ácido nucleico de la invención en una amplia gama de células, incluidas células en división y que no están en división. La presente invención puede ser empleada para suministrar un ácido nucleico de la invención a una célula in vitro, por ejemplo, para producir un polipéptido codificado mediante esta molécula de ácido nucleico in vitro o para una terapia génica ex vivo.

La molécula de ácido nucleico, vector, células y usos de la presente invención son adicionalmente útiles en un método para suministrar un ácido nucleico de la invención a un hospedante que lo necesita, normalmente un hospedante que padece de hemofilia A.

65 La presente invención encuentra uso en aplicaciones veterinarias y médicas. Los sujetos adecuados para métodos de suministro génico como se describen en la presente memoria descriptiva incluyen aves y mamíferos, siendo preferidos los mamíferos. El término “ave” como se usa en la presente memoria descriptiva incluye, pero sin limitación, pollos, patos, gansos, codornices, pavos y faisanes. El término mamífero, como se usa en la presente memoria descriptiva incluye pero sin limitación seres humanos, bovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos,

5 lagomorfos, etc. Los más preferidos son los sujetos humanos. Los sujetos humanos incluyen neonatos, niños, jóvenes y adultos.

Por tanto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico o un vector de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y/o otro agente medicinal, agente o adyuvante

10 farmacéutico, etc.

Para una inyección, el vehículo será normalmente un líquido. Para otros métodos de administración el vehículo puede ser sólido o líquido. Para una administración por inalación, el vehículo será respirable y, preferentemente, estará en forma de partículas sólidas o líquidas. Como un medio de inyección, es preferido usar agua que contenga

15 los aditivos habituales para soluciones de inyección, como agentes estabilizantes, sales o solución salina y/o tampones.

En general, un vehículo “farmacéuticamente aceptable es uno que es no tóxico ni indebidamente perjudicial para las células. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen agua esteriliada exenta de pirógenos y

20 solución salina tamponada de fosfato esterilizada y exenta de pirógenos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen vehículos fisiológicamente aceptables. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y la totalidad de disolventes, medios dispersantes, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, que sean fisiológicamente compatibles.

25 Mediante “farmacéuticamente aceptable” se quiere indicar que no es biológicamente o de alguna otra forma no desable, es decir, el material puede ser administrado a un sujeto sin provocar ningún efecto biológico no deseable. Por tanto, esta composición farmacéutica puede ser usada, por ejemplo, en la transfección de una célula ex vivo o en la administración de una partícula viral o célula directamente a un sujeto.

30 Un vehículo puede ser adecuado para una administración parenteral, que incluye una administración intravenosa, intraperitoneal o intramuscular. Alternativamente, el vehículo puede ser adecuado para una administración sublingual u oral. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esterilizadas y polvos esterilizados para una preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables esterilizadas. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la

35 técnica. Salvo que muchos medios o agentes convencionales sean incompatibles con el compuesto activo, está contemplado su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención.

Las composiciones farmacéuticas están normalmente esterilizadas y son estables bajo las condiciones de elaboración y uso. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas como una solución, microemulsión, 40 liposoma u otra estructura ordenada adecuada para acomodar una concentración de fármaco elevada. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será 45 preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongadas de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Un ácido nucleico o vector de la invención puede ser administrado en un período de tiempo o en una formulación de liberación controlada, por ejemplo, en una composición que incluya un polímero de liberación lenta u otros vehículos que

50 protejan el compuesto frente a una liberación rápida, que incluyen implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden ser usados, por ejemplo, polímeros biodegradables o biocompatibles como etilenoacetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, poli(ácido láctico) y copolímeros poliglicólicos (PLG).

55 El vector parvoviral, por ejemplo AAV de la invención, puede ser usado para transferir material genético a una célula. Esta transferencia puede tener lugar in vitro, ex vivo o in vivo.

Consecuentemente, se proporciona un método para suministrar una secuencia de nucleótidos a una célula, método que comprende poner en contacto un ácido nucleico, un vector o una composición farmacéutica como se describe

60 en la presente memoria descriptiva bajo condiciones tales que el ácido nucleico o vector de la invención entre en la célula. La célula puede ser una célula in vitro, ex vivo o in vivo.

También se proporciona un método para tratar la hemofilia que comprende administrar una cantidad eficaz de un ácido nucleico, una proteína o un vector a un paciente que padece hemofilia. Preferentemente, el paciente está

65 padeciendo hemofilia A. Preferentemente, el paciente es un ser humano.

Adicionalmente, se proporciona también un método para suministrar o administrar una secuencia de nucleótidos a un sujeto, método que comprende administrar a dicho sujeto un ácido nucleico, un vector o una composición farmacéutica como se describe en en la presente memoria descriptiva. En particular, se proporciona un método para administrar una molécula de ácido nucleico de la invención a un sujeto, que comprende administrar al sujeto un

5 vector de terapia génica parvoviral según la invención, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el vector de terapia génica parvoviral es administrado en una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto que lo necesita. Es decir, la administración según la invención se lleva a cabo normalmente bajo condiciones que dan lugar a la expresión de factor VIII funcional a un nivel que proporciona un efecto terapéutico en un sujeto que lo necesita.

El suministro de un ácido nucleico o vector de la invención a una célula hospedante in vivo puede dar lugar a un aumento de factor VIII funcional en el hospedante, por ejemplo, hasta un nivel que mejore uno o más síntomas de un trastorno de coagulación sanguínea como la hemofilia A.

15 El nivel de factor VIII que se produce de forma natural en un sujeto que padece hemofilia A varía dependiendo de la gravedad de la hemofilia. Los pacientes con una forma grave de la enfermedad tienen niveles de factor VIII de menos de aproximadamente 1% del nivel encontrado en un sujeto sano normal (denominado en la presente memoria descriptiva “un nivel normal”, un nivel normal es de aproximadamente 50-150 IU/dl). Los pacientes con una forma moderada de la enfermedad tienen niveles de factor VIII entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5% de un nivel normal. Los pacientes con una forma leve de la enfermedad tienen niveles de factor VIII de más de aproximadamente 5% de un nivel normal; normalmente entre aproximadamente 5% y aproximadamente 30% de un nivel normal.

Se ha encontrado que cuando se usa el método de tratamiento anteriormente descrito, puede provocar un aumento

25 en el nivel de factor VIII funcional de al menos 1% de los niveles normales, es decir, además del nivel de factor VIII presente en el sujeto antes del tratamiento. En un sujeto que padece hemofilia, este aumento puede provocar una mejora de un síntoma de la hemofilia. En particular, un aumento de al menos 1% puede reducir la frecuencia de la hemorragia que se produce en pacientes de hemofilia, especialmente aquellos con una forma grave de la enfermedad. En una realización, el método de tratamiento provoca un aumento en el nivel de factor VIII funcional de al menos aproximadamente 5% de los niveles normales. Esto podría cambiar el fenotipo de la enfermedad de grave hasta leve. Los pacientes con una forma leve de la enfermedad raramente tienen hemorragias espontáneas. En otras realizaciones, el método de tratamiento de la invención provoca un aumento en el nivel de factor VIII funcional de al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 3%, al menos aproximadamente 4%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20% o al menos

35 aproximadamente 25% de los niveles normales. En una realización particular, el método de tratamiento de la invención provoca un aumento en el nivel de factor VIII funcional de al menos aproximadamente 30% de los niveles normales. Este nivel de aumento normalizaría virtualmente la coagulación de sangre en sujetos que padecen hemofilia. Estos sujetos es improbable que requieran concentrados de factor VIII a continuación de un trauma o durante una cirugía.

En otra realización, el método de tratamiento puede provocar un aumento en el nivel de factor VIII funcional hasta al menos aproximadamente un 1% de los niveles normales. El método de tratamiento puede provocar un aumento en el nivel de factor VIII funcional hasta al menos aproximadamente un 5% de los niveles normales. En otras realizaciones, el método de tratamiento puede provocar un aumento en el nivel de factor VIII funcional hasta al

45 menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 3% al menos aproximadamente 4%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20 % o al menos aproximadamente 25% de los niveles normales. En una realización particular, el método de tratamiento provoca un aumento en el nivel de factor VIII funcional hasta al menos aproximadamente 30% de los niveles normales. Un sujeto cuyo nivel de factor VIII funcional ha sido aumentado hasta 30% o más tendrá una coagulación de sangre virtualmente normal.

En una realización, el método de tratamiento provoca un aumento en el nivel de factor VIII funcional, como máximo, hasta los niveles normales.

55 El nivel de factor VIII funcional puede ser medido de forma relativamente fácil y son conocidos métodos para medir los niveles de factor VIII por los expertos en la técnica. Están disponibles muchos ensayos de coagulación, que incluyen ensayos cromogénicos y basados en la coagulación. Están también ampliamente disponibles ensayos ELISA. Un método particular es medir el nivel de factor VIII: C que es una medida de laboratorio de la actividad coagulante del factor VIII. Un nivel normal de factor VIII: C es 46,8 a 141,8 IU/dl o 0,468-1,4 IU/ml.

Un método adicional es medir el tiempo de tromboblastina parcial activado (aPTT) que es una medida de la capacidad de la sangre para coagular. Un aPTT normal es entre aproximadamente 24 y aproximadamente 34 segundos. Un sujeto que padece hemofilia tendrá un aPTT más largo. Este método puede ser usado en combinación con la medición de tiempo de protrombina.

65 También se proporciona una molécula de ácido nucleico o vector de la invención para uso en terapia, especialmente en el tratamiento de hemofilia, particularmente hemofilia A.

Se proporciona también ll uso de una molécula de ácido nucleico o vector de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hemofilia, particularmente hemofilia A.

5 La invención proporciona también un ácido nucleico o vector de la invención para ser usado en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. En particular, se proporciona un ácido nucleico o vector de la invención para ser usado en el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre como hemofilia, por ejemplo, hemofilia

A. Se proporciona un ácido nucleico o un vector de la invención para ser usado en la mejora de uno o más síntomas

10 de un trastorno de coagulación de la sangre, por ejemplo, reduciendo la frecuencia y/o la gravedad de episodios de hemorragia.

Puede ser usado un método de tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre, método que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un ácido nucleico o vector de la invención a un sujeto que lo necesita.

15 Consecuentemente, la invención proporciona adicionalmente el uso de un ácido nucleico o vector como se describe en la presente memoria descriptiva en la fabricación de un medicamento para ser usado en la administración de un ácido nucleico a un sujeto. Además, la invención proporciona un ácido nucleico o vector como se describe en la presente memoria descriptiva en la fabricación de un medicamento para ser usado en el tratamiento de un trastorno

20 de coagulación de la sangre.

Normalmente, un ácido nucleico o vector de la invención puede ser administrado a un sujeto mediante terapia génica, en particular, mediante el uso de un vector de terapia génica parvoviral como AAV. Los métodos generales para una terapia génica son conocidos en la técnica. El vector, composición o composición farmacéutica puede ser

25 suministrado a una célula in vitro o ex vivo o a un sujeto in vivo mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Alternativamente, el vector puede ser suministrado a una célula ex vivo, y la célula puede ser administrada a un sujeto, como es conocido en la técnica. En general, la presente invención puede ser empleada para suministrar cualquier ácido nucleico de la invención a una célula in vitro, ex vivo o in vivo.

30 También se proporciona un método para suministrar un ácido nucleico a una célula. Normalmente, para métodos in vitro, el virus puede ser introducido en la célula mediante métodos de transducción viral estándar, como son conocidos en la técnica.

Preferentemente, las partículas de virus son añadidas a las células a la multiplicidad apropiada de infección según

35 métodos de transducción estándar apropiados para las células dianas particulares. Los títulos del virus que va a ser administrado pueden variar, dependiendo del tipo de célula diana y el vector del virus particular y pueden ser determinados por los expertos en la técnica sin experimentación excesiva.

Las células pueden ser retiradas de un sujeto, el vector de parvovirus es introducido en las mismas y las células se

40 vuelven a colocar seguidamente en el sujeto. Los métodos para retirar células de un sugeto para un tratamiento ex vivo, seguido de nueva introducción en el sujeto, son conocidos en la técnica. Alternativamente, un vector AAV puede ser introducido en las células de otros sujetos, en células cultivadas o en células de cualquier otra fuente adecuada y las células son administradas a un sujeto que lo necesita.

45 Un aspecto adicional es un método para tratar sujetos in vivo con un ácido nucleico o vector de la invención. La administración de un ácido nucleico o vector de la presente invención a un sujeto humano o un animal que lo necesita pueden ser cualesquiera medios conocidos en la técnica para administrar vectores de virus.

Un ácido nucleico o vector de la invención será incluido normalmente en una composición farmacéutica como se

50 expuso con anterioridad. Estas composiciones incluyen el ácido nucleico o vector en una cantidad eficaz, suficiente para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico deseado y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Una “cantidad eficaz” incluye una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad profilácticamente eficaz.

55 Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado, como elevar el nivel de factor VIII funcional en un sujeto (con el fin de conducir a una producción de factor VIII funcional hasta un nivel suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad asociada con una falta de esa proteína).

60 Una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de ácido nucleico o vector de la invención puede variar según factores como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad de la molécula de ácido nucleico o vector para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también normalmente una en la que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales de la molécula de ácido nucleico o vector

65 sean sobrepasados por los efectos terapéuticos beneficiosos.

Los vectores de terapia génica viral pueden ser administrados a una célula u hospedante en una cantidad biológicamente eficaz. Una cantidad “biológicamente eficaz” del vector de virus es una cantidad que sea suficiente para dar lugar a la infección (o transducción) y la expresión de la secuencia de ácido nucleico heterólogo en la célula. Si el virus es administrado a una célula in vivo (por ejemplo, el virus es administrado a un sujeto) una

5 cantidad biológicamente eficaz” del vector del virus es una cantidad que sea suficiente para dar lugar a la transducción y expresión del ácido nucleico según la invención en una célula diana.

Para una molécula de ácido nucleico o vector de la invención, como un vector de terapia génica, la dosificación que va a ser administrada puede depender en gran medida del estado y el tamaño del sujeto que esté siendo tratado, así como de la formulación terapéutica, frecuencia de tratamiento y la vía de administración. Los regímenes para continuar la terapia, que incluyen la dosis, formulación y frecuencia, pueden estar guiados por la respuesta inicial y el criterio clínico. La vía parenteral de inyección en el espacio intersticial del tejido puede ser preferida, aunque pueden ser necesarias otras vías parenterales, como la inhalación de una formulación de aerosol en una administración específica. En algunos protocolos, una formulación que comprende el gen y el sistema de suministro

15 de genes en un vehículo acuoso es inyectada en el tejido en cantidades apropiadas.

Ejemplos de modos de administración incluyen la administración oral, rectal, transmucosal, tópica, transdermal, inhalación, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradermal, intramuscular e intraarticular), y similares, así como una inyección directa en tejidos u órganos alternativamente, inyecciones intratecal, intramuscular directa, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular. Los productos inyectables pueden ser preparados en formas convencionales, como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para una solución o suspensión en un líquido antes de la inyección o como emulsiones. Alternativamente, se puede administrar el virus de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, en un depósito o una formulación de liberación sostenida.

25 El tipo de tejido/célula al que va a ser administrado una molécula de ácido nucleico o vector de la invención puede ser de cualquier tipo pero, normalmente, será una célula hepática/de hígado. No está previsto que la presente invención esté limitada a ninguna vía particular de administración. Sin embargo, con el fin de que las células de hígado sean transducidas, puede ser satisfactoriamente administrada una molécula de ácido nucleico o vector de la presente invención a través de la vasculatura portal o arterial. Alternativamente, la célula puede ser cualquier célula progenitora. Como una alternativa adicional, la célula puede ser una célula madre (por ejemplo, una célula madre del hígado). El tejido diana puede ser específico o puede ser una combinación de diversos tejidos, por ejemplo tejidos de hígado y músculos.

35 En el caso de un vector de terapia génica, el intervalo de dosis eficaz varía para animales pequeños como ratones, a continuación de una inyección intramuscular, puede ser entre aproximadamente 1 x 1011 y aproximadamente 1 x 1012

copias de genoma (gc)/kg y para animales mayores (gatos) y posiblemente para seres humanos, entre aproximadamente 1 x 1010 y aproximadamente 1 x 1013 gc/kg. Las dosificaciones de vector de terapia génica de parvovirus de la invención dependerán del modo de administración, la enfermedad o estado que esté siendo tratado, el estado del sujeto individual y el vector de virus particular y pueden ser determinadas de una manera rutinaria. Normalmente, puede ser adecuada una cantidad de aproximadamente 103 a aproximadamente 1016 partículas de virus por dosis. Preferentemente, se usa una cantidad de aproximadamente 109 a aproximadamente 1014 partículas de virus por dosis. Cuando es tratado de esta forma, un sujeto puede recibir una dosis única de partículas de virus de forma que las partículas virales efectúen el tratamiento en una administración única.

45 La cantidad de compuesto activo en las composiciones de la invención puede variar según factores como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, puede ser administrado un bolo único, pueden ser administradas varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o aumentada según esté indicado por las exigencias de la situación terapéutica.

Puede ser ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para una mayor facilidad de la administración y uniformidad de la dosificación. “forma unitaria de dosificación” como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los

55 sujetos que van a ser tratados conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención puede estar dictada por las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se quiere conseguir y por las limitaciones inherentes en la técnica de componer este compuesto activo para el tratamiento de un estado en individuos.

Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica.

Se proporciona adicionalmente un animal transgénico que comprende células que comprenden un vector según la

65 invención. Preferentemente, el animal es un mamífero no humano, especialmente un primate como un macaco. Alternativamente, el animal puede ser un roedor, especialmente un ratón o puede ser canino, felino, ovino o porcino.

En el aspecto de la invención en el que se proporciona un promotor que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una homología sustancial respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3, el promotor tiene preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, incluso más preferentemente al menos

5 un 95% de homología respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3. El promotor tiene preferentemente menos de 400 bp, más preferentemente menos de 350 bp, incluso más preferentemente menos de bp de tamaño.

Se proporciona también una segunda molécula de ácidos nucleicos aislada. La molécula de ácidos nucleicos aislada comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% respecto a la secuencia

10 de nucleótidos de la SEC ID Nº 1; y una secuencia de nucleótidos que tiene homología sustancial respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3. La expresión “homología sustancial” puede ser adicionalmente definida con referencia al porcentaje de homología. Esto se expone más en detalle en la presente memoria descriptiva.

En la segunda molécula de ácidos nucleicos (también denominadas anteriormente en el primer aspecto de la

15 invención), las dos secuencias pueden ser contiguas o pueden estar separadas por un cierto número de nucleótidos. Por ejemplo, las dos secuencias pueden estar separadas por una secuencia kozak o uno o más intrones. Las secuencias preferentemente están funcionalmente conectadas, es decir, la segunda secuencia, que codifica un promotor, está conectada a la primera secuencia de forma que la primera secuencia puede ser expresada cuando es introducida en una célula usando un vector.

20 También se proporciona un vector que comprende la segunda molécula de ácidos nucleicos de la invención.

Se proporciona adicionalmente una célula hospedante que comprende un vector según la invención. La célula hospedante puede ser cualquier célula apropiada pero, preferentemente, es una célula de mamífero no humano,

25 especialmente una célula de primate. Pueden ser usadas células para producir la proteína de forma recombinante, y puede ser usada cualquier célula apropiada, como una célula CHO.

Se proporciona adicionalmente un animal transgénico que comprende células que comprenden un vector según la invención. Preferentemente, el animal es un mamífero no humano, especialmente un primate como un macaco.

30 Alternativamente, el animal puede ser un roedor, especialmente un ratón.; o puede ser canino, felino, ovino o porcino.

En la descripción que antecede, el término “homología se usa para hacer referencia a la analogía de dos secuencias. Esto puede ser descrito también usando el término “identidad”. Los términos “homología” y “identidad” 35 pueden ser usados de forma intercambiable en la presente memoria descriptiva. Para los fines de esta invención, se define en la presente memoria descriptiva que, con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias están alineadas para fines de comparación óptima (por ejemplo, las separaciones pueden ser introducidas en la secuencia de un primer ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia amino o de ácidos nucleicos). Seguidamente se comparan los residuos de nucleótidos en 40 las partes de nucleótidos. Cuando una posición en la primera en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % identidad= número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones solapadas) x 100). Preferentemente, las dos secuencias

45 tienen la misma longitud.

Se puede llevar a cabo una comparación de secuencias sobre las longitudes completas de las dos secuencias que están siendo comparadas o sobre un fragmento de las dos secuencias. Normalmente, la comparación se llevará a cabo sobre la longitud completa de las dos secuencias que están siendo comparadas. Sin embargo, la identidad de

50 secuencias se puede llevar a cabo sobre una región, por ejemplo, de aproximadamente veinte, aproximadamente cincuenta, aproximadamente cien, aproximadamente doscientos, aproximadamente quinientos, aproximadamente 1.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 4.000, aproximadamente 4.500, aproximadamente 5.000 o más residuos de ácidos nucleicos contiguos.

55 El experto en la técnica será consiente del hecho de que están disponibles varios programas de ordenador diferentes para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, se puede realizar una comparación de secuencias y una determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias aminoácidos o ácidos nucleicos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. MoI. Biol. (48): 444-453 (1970)), que ha sido incorporado

60 en el programa GAP en un paquete de software Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando una matriz aproximadamente Blosum 62 o una matriz PAM250 y un peso de la separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. El experto en la técnica apreciará que estos diferentes parámetros producirán resultados ligeramente diferentes pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no está significativamente alterado cuando se usan algoritmos

65 diferentes.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser adicionalmente usadas como una “secuencia de consulta” para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas se pueden realizar usando los programas BLASTN y BLASTP (versión 2.0) de Altschul, et al. Las búsquedas de proteínas de BLAST se pueden realizar 5 también con el programa BLASTP, puntuación = 50, longitud de palabras=3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas respecto a las moléculas de proteínas anteriormente descritas. Para obtener alineaciones separadas para fines de comparación se puede utilizar BLAST separada como se describe por Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan programas BLAST y BLAST separado, pueden ser usados los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTP y BLASTN). Véase la página

10 principal de la entidad National Center for Biotechnology Information en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Salvo que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente memoria descriptiva es para los

15 fines de describir realizaciones particulares solamente y no está previsto que limite la invención.

En este documento y en las reivindicaciones, el verbo “comprender” y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para indicar que están incluidos los objetos que siguen a la palabra pero los objetos que no estén específicamente mencionados no están excluidos. Además, la referencia a un elemento mediante el artículo

20 indefinido “uno” o “una” no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, salvo que el contexto requiera claramente que hay solamente uno de los elementos. El artículo indefinido “uno” o “una” indica por tanto habitualmente “al menos uno.

Un experto en la técnica apreciará que todos los aspectos de la invención, ya se refieran, por ejemplo al ácido

25 nucleico, al vector a la célula hospedante o al uso, son igualmente aplicables a todos los otros aspectos de la invención. En particular, algunos aspectos del método de tratamiento, por ejemplo, la administración del ácido nucleico o vector, pueden haber sido descritos más en detalle en alguno de los otros aspectos de la invención, por ejemplo, relativos al uso del ácido nucleico o vector para tratar la hemofilia. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará cuando que se haya proporcionado más información detallada para un aspecto de la invención, esta

30 información probablemente es igualmente aplicable a otros aspectos de la invención. Por ejemplo, el experto en la técnica apreciará que la descripción relativa a los vectores y las células hospedantes para el primer aspecto de la invención es aplicable a todos los vectores y células hospedantes de la invención. Además, el experto en la técnica apreciará también que la descripción relativa al método de tratamiento es igualmente aplicable al uso del ácido nucleico o vector en el tratamiento de la hemofilia.

35 La invención se describirá seguidamente en detalle, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos en los cuales:

Figura 1: Expresión de FVIII humano en ratones con hemofilia A. Zona superior: un esquema de vector rAAV que

40 codifica el BDD hFVIII bajo el control del promotor específico del hígado LP1. Zona inferior: actividad de FVIII humano en plasma de ratón a las ocho semanas posteriores a la administración en vena de la cola de dos x 109 vg/ratón (n = 4). Ratones inmunológicamente desprotegidos fueron inyectados con excipiente.

Figura 2: A. Actividad de FVIII humano en plasma de ratón a los 30 días posteriores a la administración en vena

45 temporal de 1 x 108 TU de vectores lentivirales que codifican el BDD, N6 o el codop-FVIII bajo el control del promotor SFFV (N = 4). B. Actividad de hFVIII en materia sobrenadante recolectada a partir de células HepG2 transfectadas con plásmido rAAV que codifica variantes de FVIII bajo el control del promotor LP1 o el cassette de expresión más pequeño rAAV HLP-codop-FVIII (N = 3).

50 Figura 3: A. Rendimiento de rAAV-HLP-codop-hFVIII (n = 5) pseudotipado con cápside de serotipo 5 en comparación con el rendimiento de scAAV-FIX que contiene un cassette auto-complementario de 2,3 kb y vectores de rAAV de cadena única que contienen un cassette de expresión de 4,6 kb. B. gel nativo teñido con bromuro de etidio y C. Análisis Southern en gel alcalino del genoma viral rAAV-HLP-codop-hFVIII derivado de dos preparaciones separadas (1 y 2).

55 Figura 4: A. Niveles medios de FVIII ± SEM en plasma de múridos después de una administración única en vena de cola de constructos de rAAV-hFVIII pseudotipados con cápside de serotipo 5 (dosis=4 x 1011 uvg/ratón, N = 3). B. número de copias provirales medias (± SEM) en hígado de múridos transducido con variantes de rAAV5-hFVIII.

60 Figura 5: A. transferencia Southern: la zona izquierda muestra el digesto doble (Kpn-1) de DNA genómico de hígado derivado de ratones (M1 y M2) transduccido con rAAV-HLP-codo-HFVIII. La zona derecha muestra DNA no cortado

o el digerido con un cortador único (Not-1). HH y HT = con cantémeros de cabeza a cabeza y cabeza a cola. B. Transferencia Western que muestra una banda única de ~ 210 Kd en el plasma de ratón transducido con rAAV-HLP-codop-HFVIII que no está presente en plasma de ratón inmunológicamente desprotegido o testigo positivo que

65 consiste en FVIII humano recombinante de longitud completa (rhFVIII) diluido con plasma de ratón.

Figura 6: A. relación entre dosis de rAAV5-HLP-codop-hFVIII y niveles de hFVIII en plasma de múridos y número de copias de transgenes a las 6 semanas posteriores a la transferencia génica. B. Características cinéticas de la expresión de hFVIII a continuación de una administración única en vena de cola de 4 x 1012 vg/ratón de rAAV-HLP-codop-hFVIII pseudotipado con cápside de serotipo 5 o 8. Se muestran niveles medios ± SEM.

5 Figura 7: A. Actividad de FVIII y nivel de antígeno en ratones F8-/- a continuación de una administración única en vena de cola de una dosis baja y elevada de rAAV HLP codop-hFVIII. B y C. tiempo de hemorragia y pérdida de sangre en ratones F8/-a continuación de transferencia génica de rAAV-HLP-codop-hFVIII en comparación con ratones F8/- no transducidos y animales normales y de tipo salvaje.

10 Figura 8: (A) Representación esquemática de variantes de FVIII humano diseñadas y clonadas en una cadena principal de vector lentiviral SIN. Se diseñaron nueve variantes de FVIII humano diferentes y se clonaron en plásmido de cadena principal de vector lentiviral: BDD FVIII; FVIII humano suprimido en dominio B (tamaño total 4,3 kb). Fugu B de FVIII; BDD FVIII que contiene el dominio B de Fugu (4,9 kb de tamaño total). FVIII N6; FVIII de BDD

15 que contiene el dominio B de N6 humano (tamaño total de 5,0 kb). SQ FVIII; FVIII de BDD que contiene una versión modificada de la secuencia de aminoácidos SQm (tamaño total de 4,4 kb). SQ FVIII Fugu B; FVIII de SQ que contiene el dominio B de Fugu entre la secuencia SQm para crear la secuencias SQa de N-terminal y SQb C-terminal (tamaño total de 5,0 kb). SQ FVIII N6; FVIII de SQ que contiene el dominio B humano (tamaño total de 5,1 kb). Constructos SQ FVIII (ca) (tamaño total de 4,4 kb), SQ FVIII Fugu B (ca) (tamaño total de 5,0 kb) y SQ FVIII N6 (co)

20 (tamaño total de 5,1 kb) son la misma estructura de aminoácidos que los constructos SQ FVIII, SQ FVIII Fugu B y SQ FVIII N6, respectivamente, pero son producidos a partir de una secuencia de cDNA optimizada mediante codones. El tamaño del dominio relativo no es exacto. Las rayas en los constructos marcan los sitios de glicosilación (N)-conectados a asparagina en el dominio B solamente. (B) representaciones esquemáticas de secuencias de SQ y SQ modificada; SQm, SQa y SQb. La secuencia de SQ es un puente de 14 aminoácidos entre los dominios a2 y a3

25 de FVIII creada mediante fusión de Ser 743 y Gln 1638 en el dominio B. La secuencia favorece una escisión intracelular eficaz conteniendo el sitio de reconocimiento de proteasa de 4 aminoácidos RHQR. Se creó una secuencia SQ modificada (SQm) que contenía una mutación sin sentido de Lys 1644 a Thr 1644 provocada por la creación de un sitio de enzima de restricción MluI en la secuencia de cDNA para la inserción de Fugu y dominios B de N6. SQa es la secuencia 11aa creada en el N terminal del dominio B después de la inserción de las secuencias

30 de N6 o de dominio B Fugu en el constructo SQ FVIII. SQb es la secuencia de 5 aminoácidos creada en el C terminal del dominio B después de la inserción de las secuencias N6 o de dominio B Fugu en el constructo SQ FVIII, esta secuencia retiene el sitio de reconocimiento de proteasa de 4 aminoácidos. Los sitios de restricción MluI se muestran subrayados y la mutación sin sentido de K a T está en la posesión de los aminoácidos del lado izquierdo del sitio de restricción MluI.

35 Figura 9: Actividad de FVIII humano relativa de constructos de FVIII in vitro determinada mediante ensayo cromogénico. Se transdujeron 1 x 105 células 293T con diluciones en serie de BDD FVIII, FVIII Fugu B, FVIII N6, SQ FVIII, SQ FVIII Fugu B, SQ FVIII N6, SQ FVIII (co), SQ FVIII Fugu B (co) o SQ FVIII N6 (co). A las 48 horas se cambiaron 500 μl de medios exentos de suero con medios celulares. Después de 24 horas adicionales se recogieron

40 medios de incubación de todos los pocillos y se valoraron en cuanto a la expresión de factor VIII usando un ensayo basado en cromogénesis la actividad de cofactor de factor VIII. Los resultados fueron seguidamente normalizados en un número de copias por célula determinados mediante qPCR. Se muestran medias y SD para m = 5. Las barras anteriores de los valores representan el aumento en veces de la expresión de FVIII a partir de constructos optimizados mediante codones en comparación con secuencias equivalentes no optimizadas mediante codones. Se

45 realizaron análisis estadísticos usando el modelo lineal general (GLM) basado en un análisis de dos vías de la varianza (ANOVA) con comparaciones por pares de individuos realizadas usando ensayos simultáneos de Bonferroni (Minitab software, Myerstown, PA). Los resultados muestran un aumento altamente significativo para SQ FVIII (co) SQ FVIII Fugu B (co) y SQ FVIII N6 (co) en comparación con sus equivalentes no optimizados mediante codones SQ FVIII, SQ FVIII Fugu B, SQ FVIII N6, respectivamente (P<0,001). Además, los resultados para vectores

50 optimizados mediante codones muestran también un aumento significativo para SQ FVIII N6 (co) en comparación con SQ FVIII (co) (p< 0,0001) y un aumento significativo para SQ FVIII Fugu B (co) en comparación con SQ FVIII (co) y SQ FVIII N6 (co) (B< 0,0001).

Figura 10: Expresión de actividad de FVIII humano in vivo en plasma sanguíneo en ratones hemofílicos después de

55 una inyección intravenosa de vectores lentivirales SIN que expresan constructos de FVIII tratados por bioingeniería. Seis a diez ratones neonatos hemofílicos F8tm2Kaz fueron inyectados por vía intravenosa a través de la vena temporal superficial con vectores lentivirales SIN que expresan constructos de FVIII humanos tratados por bioingeniería. Se tomó sangre de los ratones para diversos valores de tiempo durante aproximadamente 250 días y se usó un ensayo cromogénico para calcular la actividad de FVIII humano en plasma sanguíneo tomado de cada ratón como un

60 porcentaje de los niveles humanos normales. (A) SQ FVIII (rombos blancos) frente SQ FVIII (co) (triángulos negros). SQ FVIII Fugu B (rombos blancos) frente a SQ FVIII Fugu B (co) (triángulos negros). SQ FVIII N6 (rombos blancos) frente a SQ FVIII N6 (co) (triángulos negros). Los puntos en las gráficas representan la media. Las barras de error representan la desviación típica. Se realizaron análisis estadísticos usando el modelo lineal general (GLM) basado en un análisis por dos vías de la varianza (ANOVA) con comparaciones emparejadas individuales realizadas usando

65 ensayos simultáneos de Bonferroni (Minitab software, Myerstown, PA).

Figura 11: Niveles de actividad de FVIII in vivo en plasma tomado de ratones inyectados con vector que expresa FVIII a partir de secuencias de cDNA optimizadas mediante codones. La actividad de FVIII humano en plasma sanguíneo tomado de ratones inyectados con vector lentiviral que expresa SQ FVIII (co) (círculos grises), SQ FVIII Fugu B (Co) (rombos blancos) y SQ FVIII N6 (co) (triángulos negros fue cotejada. Los puntos en los gráficos

5 representan la media, las barras de error representan la SD (desviación típica). No se apreció ninguna diferencia significativa en la expresión entre constructos que expresan dominios B diferentes (P>0,5, ensayo simultáneo de Bonferroni).

Figura 12: Cuantificación de número de copias de vectores en tejidos de ratones hemofílicos después de una inyección intravenosa de vectores lentivirales SIN que expresan constructos de FVIII tratados por bioingeniería. Se tomó tejido de hígado, corazón, pulmón y riñón de ratones sacrificados ~ 250 días después de una inyección neonatal de vectores lentivirales que expresan SQ FVIII, SQ FVIII Fugu B, SQ FVIII N6, SQ FVIII (co), SQ FVIII Fugu B (co) y SQ FVIII N6 (co). Se Extrajo DNA genómico y el número de copias virales se determinó usando qPCR. La línea representa la media de todos los puntos. No se observó ninguna diferencia significativa en el número de copias

15 entre cualquier grupo de vectores (P> 0,1, ensayo simultáneo de Bonferroni).

Ejemplo 1

Envasado de cassette de expresión de hFVIII en r AAV

Los inventores han establecido que un cassette de expresión de 6,0 kb que contiene el BDD-FVIII cDNA bajo el control del promotor específico de hígado anteriormente descrito (LP1) puede ser eficazmente envasado en vectores rAAV pseudotipados con proteínas de cápsides de serotipo 5 (rAAV5-LP1-BDD-h FVIII) usando el método de transfección transitoria de 3 plásmidos convencional. La administración en vena de solamente 2 x 109 partículas de

25 rAAV-LP1-BDD-HFVIII en ratones FVIII KO machos adultos dio lugar a una actividad de coagulación de FVIII de 18 ± 5,3% usando un ensayo cromogénico (Figura 1), que está significativamente por encima del nivel requerido para una mejora de la diátesis hemorrágica en seres humanos (> 1% de lo normal).

Adaptación escala de producción de vector de rAAV-hFVIII

Los inventores han establecido un método de producción de rAAV adaptable a escala, sencillo y compatible con GMP usando el vector de expresión de vaculovirus y células de insectos. Una ventaja clave del sistema de vaculovirus es la facilidad con que la producción se puede llevar a escala. Ha sido posible generar 1 x 1014 genomas de vectores (vg) a partir de un único ensayo de producción usando un bio-reactor. Esta cantidad sería suficiente

35 para un ensayo clínico de HA de fase I/II. Los rendimientos iniciales en el vector de FVIII de primera generación (rAAV5-LP1-BDD-hFVIII) son del orden de 5 x 1011 uvg a partir de 1 litro de cultivo celular.

Expresión a partir de hFVIII optimizado mediante codones

Los inventores han diseñado un constructo de hFVIII alternativo (codop-FVIII) para ensayar la hipótesis de que sustituyendo codones infrecuentemente usados en el cDNA con los más comúnmente encontrados en genes de mamíferos (“optimización mediante codones”) generará una expresión aumentada de hFVIII a continuación de la transferencia génica. Un ejercicio similar para los factores de coagulación IX y VII mejoró la expresión hasta 10 veces en comparación con los cognados de tipo salvaje. La estrategia para el diseño del codop-h FVIII implicó volver 45 a traduvcir la secuencia de aminoácidos de hFVIII con un conjunto de codones más frecuentemente encontrados en genes de mamíferos altamente expresados. Esta secuencia modificada seguidamente fue cuidadosamente explorada y los codones fueron adicionalmente modificados para mejorar la estabilidad de mRNA y suprimir secuencias no deseables, como nucleótidos de CpG en exceso y sitios de empalme crípticos. La secuencia de codop-h FVIII diseñada final contiene 1076 cambios bp únicos a partir de la secuencia de N6-FVIII de tipo salvaje y es un 42% a+t con relación a un 56% de contenido de A + T de la secuencia de tipo salvaje. La secuencia de FVIII codop es la secuencia de la SEC ID Nº 1. Inicialmente, esta variante de codop- FVIII fue clonada en un vector lentiviral en dirección descendente del promotor del virus formador de focos de bazo constitutivo (SFFV) y su potencia es valorada en ratones FVIII KO recién nacidos inyectando 1 x 108 TQ en la vena temporal. Para hacer una comparación, dos grupos separados de ratones FVIIIKO recién nacido fueron transducidos con un título equivalente

55 de vector idéntico que codifica las variantes de FVIII BDD o la más potente N6. Como se muestra en la Figura 2ª, y de forma congruente con informes previos, los vectores lentivirales que codifican el N6-FVIII (15 ± 0,8% de lo normal) mediaron niveles cinco veces superiores de expresión transgénica en comparación con la variante BDDD (3 ± 0,6% de lo normal). En comparación, la expresión de hFVIII en el plasma del grupo de codop-FVIII de ratones (283 ± 0,21% de lo normal) era al menos 18 veces mayor que el conseguido con el N6-FVIII. Los inventores han clonado las variantes de FVIII BDD, N6 y codop en su vector rAAV estándar (Nathwani A. et al. Blood. 15 de Febrero de 2007; 109(4): 1414-1421) bajo el promotor LP1. Además, el codop-FVIII ha sido clonado también en dirección descendente de un nuevo promotor específico para el hígado híbrido y más pequeño (HLP). El promotor HLP tiene la secuencia de la SEC ID Nº 3. La evaluación de estos plásmidos de vectores rAAV en un ensayo de transfección transitoria en la línea celular de hígado HepG2 (Figura 2b) mostró que los vectores LP1 rAAV que codificaban la

65 expresión de FVIII mediada por codop-FVIII (0,38 ± 0,06 IU/ml) a niveles que estaban entre 4 (0,09 ± 0,02 IU/ml) y 8 (0,05 ± 0,02 IU/ml) veces mayor que la conseguida con rAAV-LP1-N6-FVIII y rAAV-LP1-BDD-FVIII, respectivamente. Por lo tanto, colectivamente, estos datos sugieren que la molécula de codop-FVIII de los inventores es más potente que la variante N6-FVIII. Apreciablemente, el plásmido de vector rAAV-HLP-codop-FVIII ligeramente más pequeño genera consistentemente rendimientos entre 30-50% superiores de vector que el rAAV-LP1-codop-FVIII.

5 El cassette de expresión de HLP-codop- H FVIII puede ser envasado en viriones AAV

Los cassettes de expresión de rAAV-HLP-codop-HFVIII de 5,6 kb sobrepasaron el límite de envasado de 4,6 kb de vectores AAV pero fueron satisfactoriamente envasados en viriones AAV con la misma eficacia que el vector scAAV10 FIX que está siendo usado en ensayos clínicos continuados (Figura 3A)Usando el método de transfección transitoria HEK293T convencional. Otros han mostrado que una secuencia de vector de 6,6kb puede ser envasado en viriones AAV. Adicionalmente, el grupo del High de la Universidad de Pensilvania verificó independientemente que hasta 6 c 1013 partículas pseudotipadas de rAAV 8 de rAAV-HEDP-codop-hFVIII podían ser derivadas a continuación de una transfección transitoria a partir de justo 20 botellas en rodillos de células HEK293 (rendimiento = 6 x 104 uvg/célula

15 293t). Para demostrar que el genoma del vector rAAV-HLP-codop-hFVIII era envasado en su totalidad, se extrajo DNA de viriones derivados a partir de dos tandas separadas, tratamiento con DNasel y separadas en agarosa nativa y alcalina y seguidamente valoradas siguiendo un teñido con bromuro de etidio o análisis de transferencia Southern, respectivamente. Se apreció una banda prominente de aproximadamente 5,7 kb con ambos métodos de valoración (Figura 3B y C).

20 El codop-hFVIII es más potente pero igual de seguro que las variantes de hFVIII N6 o BDD

Vectores rAAV pseudotipados con cápside de serotipo 5 que codifican la variante de hFVIII codop N6 y BDD bajo el control de los promotores Lp1 o HLP fueron inyectados a través de la vena de la cola (4 x 1011 uvg/ratón, N = 25 3/grupo) de ratones C57B1/6 de 4-semanas machos. Como se muestra en la figura 4, una administración única en la vena de cola de rAAV-LP1-codop-hFVIII dio lugar 0,20 ± 0,03 IU/ml (= 20% de los niveles normales) de hFVIII en plasma de múridos sin toxicidad alguna- las expresión de hFVIII fue 10 veces inferior en ratones transducidos con 4 x 1011 uvg/ratón de rAAV-LP1-N6-hFVIII (0,02 ± 0,0003 IU/ml = 2% de lo normal) que codifica la secuencia de DNA de hFVIII de tipo salvaje en lugar de la secuencia de nucleótidos de FVIII optimizada con codones en codop hFVIII. 30 Esta diferencia de expresión entre estos dos vectores que por lo demás son idénticos es altamente significativa (p = 0,0003, ANOUVA de una vía). La sustitución del promotor LP1 con el promotor HLP específico de hígado más pequeño dio lugar a niveles marginalmente superiores (0,22 ± 0,04 IU/ml) de hFVIII en el plasma de ratones transducidos con 4 x 1011 uvg/kg de rAAV-HLP-codop-hFVIII en comparación con el grupo de rAAV-LP1-codophFVIII pero esta diferencia no fue significativa (p = 0,6). El nivel más bajo de expresión de hFVIII fue observado en el 35 plasma de ratones que recibieron 4 x 1011 uvg/ratón de rAAV LP1-BDD-hFVIII (0,01 ± 0,001 IU/ml), que se aproxima a un 1% de los niveles normales. De forma importante, estas diferencias en el nivel de expresión de hFVIII no estaban relacionadas con el número de copias de vectores, ya que el análisis PCR muestra un número de copias de vectores similar en el DNA genómico extraído del hígado de animales en cada grupo, que varían en el intervalo de 0,9-1 copias provirales/célula. El análisis por transferencia Southern del DNA genómico de los hígados de ratones 40 tranducidos con LP1-codop-hFVIII a las seis semanas después de la transferencia génica digerida con Kpn-1, que corta dos veces en el cassette de expresión codop-hFVIII, liberó una banda del tamaño esperado de aproximadamente 1,9 kb (Figura 5 A). La digestión con Not-I, que es un cortador único, generó dos bandas de ~ 5 kb y de ~ 10 kb correspondientes a fragmentos de concatémeros de cabeza a cola y de cabeza a cabeza en una relación de 3:1, respectivamente. Los análisis de transferencia Western mostraron que el codop-hFVIII es secretado

45 en forma de una proteína de 210 kd de cadena única, que como era de esperar tiene un tamaño más pequeño en comparación con el FVIII recombinante de longitud completa (Helixate, Figura 5B, columna izquierda) ya que dos tercios del dominio B han sido suprimidos de codop-hFVIII.

Seguidamente, se administraron dosis diferentes de rAAV5-HLP-codop-hFVIII a través de la vena de la cola a

50 ratones C57B1/6 machos y se valoraron los niveles de hFVIII en plasma a las 6 semanas. Como se muestra en la Figura 6ª, se observó una relación relativamente lineal entre la dosis de vector, niveles en plasma de hFVIII y número de copias de transgenes sin ninguna evidencia de cinéticas de saturación incluso a los niveles de dosis más elevados. La administración de 4 x 1010 uvg/ratón de rAAV5-HLP-codop-hFVIII dio lugar a una expresión baja pero detectable de hFVIII a un 0,5% de lo normal. El número de copias de transgenes de rAAV-HLP-codop-hFVIII en el

55 hígado de estos animales fue también 7 veces inferior (0,12 ± 0,06 copias/células) al de 4 x 1011 uvg/ grupo de dosis de ratones. Un aumento en la dosis de vector de 4 x 1012 uvg/ratón dio lugar a niveles de hFVIII en plasma de aproximadamente un 190% de los niveles fisiológicos (1,9 ± 0,3 IU/ml). El número de copias de transgenes de rAAV-HPL-codop-hFVIII en el hígado de estos ratones rea por encima de 330 veces superior (43,5 ± 2,5 copias provirales/célula) a los niveles observados en animales transducidos con 4 x 1011 uvg/ratón y aproximadamente en

60 el hígado. No se observó ninguna toxicidad a cualquiera de los niveles de dosis y un examen histológico del órgano después de necropsia a las 6 semanas no mostró ninguna patología significativa. El perfil de expresión de transgenes se valoró seguidamente en dos grupos de ratones (n = 3) a continuación de una administración en la vena de la cola de 4 x 1012 uvg/ratón de rAAV-HLP-codop-hFVIII pseudotipado con proteínas de cápsides de serotipo 5 y 8. Como para los informes previos por los inventores con otros vectores rAAV de cadena única, el hFVIII

65 fue detectable en dos semanas de transferencia génica antes de alcanzar niveles de estado estacionario de 23 + 6 IU/ml y 54 ± 12 IU/ml en 10 semanas en ratones transducidos con rAAV-HLP-codop-hFVIII pseudotipado con cápside de serotipo 5 y 8, respectivamente (Figura 6B). En todos los valores de tiempo, el nivel de hFVIII en el grupo de rAAV8-HLP-codop-hFVIII era entre 2-10 veces superior en comparación con los niveles conseguidos en ratones que recibieron vector pseudotipado de cápside de serotipo 5. Esta diferencia es altamente significativa (p< 0,001) y

5 es congruente con diferencias específicas de serotipos similares en transducción mediada por rAAV previamente descritas. Los complejos en plasma de trombina-antitrombina (2,2 ± 0,2 μg/l) no eran elevados, indicando que los niveles suprahistológicos de hFVIII no inducen un estado hipercoagulable apreciable en ratones. Finalmente, los anticuerpos anti-FVIII no fueron detectados en los ratones de rAAV-HLP-codop-hFVIII en ninguna fase después de la transferencia génica.

10 El rAAV-HLP-codon-hFVIII corrige la diátesis de hemorragia en ratones con hemofilia A

Para confirmar la corrección del fenotipo de hemorragia, los inventores inyectaron 4 x 1011 (grupo de dosis baja, n = 3) o 5 x 1012 (grupo de dosis elevada, n = 3) de genomas de vector rAAV5-HLP-codop-hFVIII en la vena de la cola 15 ratones con desprotección inmunológica con hemofilia A, que son de fondo C57B16/J-129 Sv y contienen una deleción en el exon 16 de FVIII de múridos. Los niveles picos de hFVIII, según se determinaron mediante un ensayo de coagulación en una fase, fueron 137 ± 27% y 374 ± 18% de los niveles normales en los grupos de dosis baja y elevada de ratones, respectivamente (Figura 7A). Estos niveles estaban significativamente por encima del fondo (ratones hemofílicos HA sin tratar (FVIIIKO) nivel de hFVIII: C = < 2% de la normal) y eran significativamente 20 superiores al terapéutico de >5% de lo normal. Hubo una concordancia muy estrecha entre la actividad de hFVIII y los niveles de antígeno en todos los valores de tiempo examinados con una relación media de 1,16. El tiempo de hemorragia en los ratones F8-/- tratados con AAV y sin tratar, así como los ratones testigos de tipo salvaje, se valoró usando un ensayo de pinza en la cola. El tiempo para la primera detención de la hemorragia en el rAAV5-HLP-codop-hFVIII fue significativamente más corto (p = 0,003) a 114 ± 3 y 74 ± 14 segundos en los grupos de dosis baja 25 y elevada, respectivamente, en comparación con los ratones F8-/- sin tratar (311 ± 3 segundos) y comparable al de los animales de tipo salvaje testigos (74 ± 20 segundos). Análogamente, la cantidad de pérdida de sangre valorada mediante un análisis espectrofotométrico del contenido de hemoglobina en solución salina en la que es sumergida la cola del ratón con pinzas fue significativamente inferior (p = 0,002) en los ratones rAAV5-HLP-codop-hFVIII en comparación con los animales F8-/- sin tratar. Los anticuerpos anti-h-FVIII no fueron detectados en ratones HA

30 tratados con rAAV en ninguna fase después de la transferencia génica.

Por lo tanto, colectivamente, estos datos sugieren que la molécula de codop-hFVIII es más potente que la variante N6-hFVIII. Adicionalmente, el cassette de expresión de codop-hFVIII parece que está bien envasado en los viriones rAAV a pesar de un tamaño relativamente grande en comparación con el genoma de AAV de tipo salvaje. El hFVIII

35 es expresado como una proteína biológicamente activa de cadena única a continuación de la transferencia génica de rAAV que es capaz de corregir el fenotipo de la hemorragia en animales con hemofilia A inmunológicamente desprotegidos.

Ejemplo 2

40 Introducción

La hemofilia A es un trastorno de hemorragia grave provocado por una deficiencia o ausencia completa del factor VIII de coagulación sanguínea (FVIII). Es el trastorno de coagulación hereditario más común con una incidencia que 45 se acerca a aproximadamente uno de cada 5.000 varones1. El trastorno es un candidato atractivo para una terapia génica, porque solamente es necesario un aumento modesto de la concentración en plasma de FVIII para un beneficio terapéutico, y los niveles de <1% son capaces de conseguir tazas considerablemente reducidas de hemorragia espontánea y artropatía2 a largo plazo. Sin embargo, aunque los resultados preclínicos usando una terapia génica en modelos de animales de hemofilia A han sido alentadores, ninguna propuesta se ha traducido

50 todavía en un éxito clínico cuando se han observado niveles insuficientes de expresión de FVIII3.

La baja expresión de FVIII está causada principalmente por una expresión ineficaz del mNRA4-6, una proporción significativa del mal plegado de proteínas con degradación intracelular consiguiente y transporte ineficaz del producto de traducción primario desde el retículo endoplásmico (ER) hasta el aparato de Golgi7;8. Esto da lugar a 55 niveles de expresión de FVIII de aproximadamente 2 a 3 de magnitud inferior a los de otras proteínas secretadas de tamaño comparable4. Los estudios durante las dos últimas décadas sobre la trayectoria de secreción, estructura y función de proteína de FVIII y mecanismos del desarrollo inhibidor han conducido a la incorporación de formas tratadas por bioingeniería de FVIII en los sistemas de transferencia génica. La bioingeniería está dirigida a mejorar propiedades cono la biosíntesis, eficacia de secreción, actividad funcional, semivida en plasma y a reducir la 60 antigenicidad/inmunogenicidad 9. El FVIII es producido en forma de una glicoproteína larga de 330 kDa con la estructura de dominios A1-A2-B-A3-C1-C210;11, en la que los dominios A y C tienen una homología de secuencias internas y una identidad de secuencias de aproximadamente 40% para los dominios A y C de factor V (FV), que comparte la misma estructura de dominios12;13. El dominio B, que constituye un 38% de la secuencia total, no comparte identidad de secuencia de aminoácidos con otras proteínas conocidas, incluido el dominio B de FV. Sin 65 embargo, está extensivamente glicosilado y contiene 19 de los 26 sitios de glicosilación de asparagina unidos a (N)

en la molécula de FVIII completa. El dominio B de FVIII es suministrable para la actividad pro-coagulante. El FVIII en el que es suprimido el dominio B (BDD) y sustituido con un conector corto de 11 aminoácidos (FVIII SQ; Figura 8b) es de uso clínico como un producto de FVIII recombinante de sustitución (Refacto, Wyeth Pharma)15.

5 Se ha mostrado que la deleción del dominio B completo conduce a un aumento de 17 veces en el mRNA y producto de traducción primario, sin embargo, solamente un aumento de 30% en los niveles de protenína secretada, sugiriendo que la velocidad de transporte de PR-Golgi es realmente reducida16. La secreción eficaz de FVIII requiere un transporte facilitado por hidratos de carbono mediante LMAN1 (enmascaramiento-1 de lectina-manosa) mediado por residuos de manosa de oligosacáridos unidos en N post-translacionalmente unidos al dominio B. para construir sobre las ventajas de BDD-FVIII mientras se ayuda al transporte mediado por LMAN1, Miao et al. (2004) 17 volvieron a añadir una secuencia corta de dominio B al BDD-FVIII, óptimamente 226 aminoácidos y reteniendo 6 sitios para la glicosilación unida a N (226/N6). Esto dio lugar a un aumento de 10 veces en la secreción in vitro a partir de células COS-1 transfectadas y un aumento de 5 veces in vivo a continuación de un suministro de genes hepáticos hidrodinámicos 17.

15 El teleósteo pez globo Fugu rubripes es un organismo comúnmente usado para la investigación de características genéticas. El Fugu tiene un genoma de vertebrado básico y contiene un repertorio similar de genes respecto a seres humanos, sin embargo, en 1993 se mostró que el genoma del Fugu es de solamente 390 mb, aproximadamente una octava parte del tamaño del genoma humano 18. Esto hace que el Fugu sea un modelo extremadamente útil para anotar el genoma humano y un genoma “de referencia” valioso para identificar genes y otros elementos funcionales. El análisis de secuencia de genes en el sistema de coagulación sanguínea mostró que las secuencias de aminoácidos del Fugu están altamente conservadas con relación a sus ortólogos humanos. Para secuencias de FVIII cDNA, Los dominios de Fugu A1, A2, A3, C1 y C2 muestran una identidad de secuencias de 46, 43, 47, 52 y 50% respecto a los ortólogos humanos, respectivamente. Inversamente, el dominio B de factor VIII del Fugu

25 comparte solamente un 6% de identidad de secuencias respecto a su correspondiente humano. Sin embargo, aunque no hay una conservación de secuencias evidente entre los dominios B, el dominio B del Fugu está también altamente glicosilado con 11 sitios de unión de glicosilación unidos a asparagina (N) a través de su longitud de 224 aminoácidos 19.

En este estudio los inventores examinaron la expresión de constructos BDD FVIII humano que contienen el elemento de dominio B “SQ” anteriormente descrito, el fragmento del dominio B 226/N6 y el dominio B de Fugu. Los constructos fueron ensayados bajo el control de promotor del virus formador de foco de vaso (SFFV en el contexto de un vector lentiviral (LV) HIV-1 auto-inactivante (SIN). Además de ello, los constructos fueron expresados a partir de su secuencia de cDNA optimizada mediante codones o no optimizada mediante codones. Múltiples silenciadores 35 transcripcionales y restos inhibidores están ampliamente distribuidos a través del FVIII cDNA 4;6;20-22 , y estas secuencias actúan como potentes inhibidores de la producción de RNA y la formación de proteínas que pueden obstaculizar la expresión in vivo. La expresión de FVIII en todos los constructos se comparó in vitro mediante transducción de células 293T y in vivo mediante inyección intravenosa de vector en ratones neonatos con hemofilia

A. La variación del dominio B constituyó una diferencia significativa para la expresión de factor VIII a partir de secuencias de cDNA optimizadas mediante codones in vitro, sin embargo, no se observaron diferencias in vivo. La comparación directa de constructos de FVIII tratados por bioingeniería mostró que se detectaron niveles significativamente mayores (un aumento hasta 44 veces y por encima de 200% de los niveles humanos normales) de proteína de FVIII activa en el plasma de ratones transducidos con vector que expresa FVIII a partir de una secuencia de cDNA optimizada mediante codones, corrigiendo satisfactoriamente el modelo de enfermedad. Hasta

45 la fecha, este es el aumento relativo más elevado en la expresión de FVIII a continuación de un tratamiento por bioingeniería de BDDD FVIII que da lugar a una expresión de FVIII estable sin precedentes in vivo usando una propuesta basada en lentivirales.

Métodos

Construcción de transgen de FVIII y vector lentiviral

El plásmido de expresión pMT2-FVIII fue obtenido por amable donación del Dr. Steven W. Pipe (University of Michigan). El plásmido contiene el gen FVIII humano con un dominio B de Fugu. El gen HFVIII tenía una deleción de 55 dominio B de los aminoácidos 740-1649 y un sitio de restricción MluI (AC’CGT) tratado por ingeniería genética mediante mutagénesis dirigida al sitio en las posiciones de los aminoácidos 739-740 provocando la mutación sin sentido de Pro739 AThr739 en el dominio a2. El dominio B de Fugu había sido clonado usando sitios de restricción MluI en 5’ y 3’ creando un gen de Fugu B HFVIII de 4935 bp. El gen de Fugu B de FVIII fue suprimido en tres partes usando un digesto con XhoI y KpnI para suprimir un fragmento de 1,83 kb, un digesto parcial con KpnI y MluI para suprimir un fragmento de 1,06 kb y una amplificación por PCR de la sección de al menos 2066 kb usando cebadores que crearon sitios MluI and SbfI en los extremos 5’ y 3’ respectivamente. Cada sección fue secuencialmente clonada en pLNT/SFFV-MCS usando las mismas encimas para crear pLNT/SFFV-FVIII Fugu B. El constructo fue completamente secuenciado tras la compleción. Se produjo pLNT/SFFV-BDD FVIII mediante digesto pLNT/SFFV-FVIII Fugu B con MluI para separar el dominio B de Fugu y la religadura. La secuencia del dominio B de 226/N6 fue 65 fabricada por la entidad GeneArt (Regensburg, Alemania) para producir un plásmido de GeneArt estándar que contenía 226/N6; pGA_N6_nonopt, la secuencia fue obtenida tomando los primeros 688 bp del dominio B de FVIII humano (cDNA encontrado en la entidad Genbank: A05328), seguidamente fueron añadidos sitios MluI que flanquean en 5’ y 3’. Seguidamente fue retirado N6 de pGA_N6_nonopt y ligado en pLNT/SFFV-BDD FVIII usando MluI para crear pLNT/SFFV N6. La secuencia de cDNA SQ fue obtenida a partir de 23 y fue modificada para que contuviera un sitio MluI (subrayado) para proporcionar la secuencia de cDNA SQm: 5'5 AGC'TTC'AGC'CAG'AAC'CCC'CCC'GTG'CTG'ACG'CGT'CAC'CAG'CGG-3' (SEC ID Nº 8) (Figura 8b). El Fugu B de LNT/SFFV-SQ FVIII fue producido mediante mutagénesis dirigida al sitio realizada por la entidad Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania) para añadir secuencias SQa y SQb flanqueantes (Figura 8b) en el plásmido pLNT/SFFV-FVIII Fugu B para producir pLNT/SFFV Fugu B. El pLNT/SFFV FVIII fue seguidamente producido mediante supresión del dominio B de Fugu de pLNT/SFFV Fugu B mediante digesto con MluI y religadura. El 10 pLNT/SFFV FVIII N6 fue producido mediante supresión del dominio B de 226/N6 a partir de from pGA_N6_nonopt mediante digestión con MluI y ligadura en pLNT/SFFV FVIII. En este constructo hay una repetición de la secuencia SQa 11 ab provocada por la inserción del dominio B de N6 en la secuencia SQm. Se crearon secuencias optimizadas mediante codones mediante análisis de cDNA de SQ FVIII Fugu B y adaptación del uso de codones a la desviación de Homo sapiens Usando un índice de adaptación de codones (CAI) realizado por la entidad GeneArt (Regensburg, 15 Alemania) usando su Software propiedad de la entidad GeneOptimizer®. La optimización suprimió también restos de secuencias de actuación en cis que incluyen cajas de DATA, sitios chi y sitios de entradas ribosomales, extensiones de secuencias con elevado contenido de AT o GC, elementos con elevado contenido de AU, elementos de secuencias inhibidoras y represoras de actuación en cis, secuencias repetidas, estructuras secundarias de RNA y sitios de escisiones crípticas. La optimización de Fugu B de SQ FVIII incluyó la supresión de 14 sitios de escisión, un 20 aumento en el contenido de GC de ~ 45% a ~ 60% y un aumento en CAI desde 0,74 hasta 0,97. Se introdujo una secuencia KOZAK para aumentar el inicio de la traducción, y se añadieron dos codones de parada para asegurar una terminación eficaz. El gen optimizado retuvo en los sitios de restricción MluI que flanquean el dominio B en el dominio de Fugu b y tiene una analogía de secuencias de 75,8% respecto a la secuencia original no optimizada. El gen optimizado fue clonado en pLNT/SFFV-MCS para proporcionar el plásmido pLNT/SFFV-SQ Fugu B (co). El 25 plásmido pLNT/SFFV FVIII (co) fue creado mediante digestión de Fugu B de TPP con MluI y religadura. La secuencia del dominio B 226/N6 de pGA_N6_nonopt fue optimizada mediante codones y fabricada por la entidad GeneArt. Fue recibida en el plásmido pGA_N6_opt y como los sitios de restricción MluI fueron mantenidos clonados directamente en el plásmido pLNT/SFFV FVIII (co) para obtener el constructo pLNT/SFFV N6(co), nuevamente, este constructo contendrá una secuencia repetida SQa 11 aa causada por la inserción del dominio b en la secuencia SQm.

30 Cada constructo fue completamente secuenciado antes del ensayo. La secuencia SQ FVIII N6 optimizada mediante codones es la secuencia de la SEC ID Nº 4. La secuencia SQ FVIII optimizada mediante codones es la secuencia de la SEC ID Nº 5. La secuencia de SQ FVIII Fugu B mediante codones es la secuencia de la SEC ID Nº 6.

Producción y titulación de vectores lentivirales.

35 Se produjeron vectores lentivirales con transfección transitoria de células HEK293T (293T) con 3 plásmidos (el vector lentiviral), pMD.G2 [plásmido de envoltura de glicoproteína del virus de estomatosis vesicular (VSV-G)] y pCMVL8.91 [plásmido de envoltura, ambos producidos por la entidad Plasmid Factory, Bielefeld, Alemania] empleando polietilenimina (Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido). La materia sobrenadante viral fue recolectada y

40 concentrada usando ultracentrifugación (25.000 x g durante 2 h a 4ºC. Se almacenaron partes alícuotas de los virus a -80ºC. Los títulos de todos los vectores lentivirales se determinaron usando un estuche de ensayo para ensayo inmunoabsorbente asociado a enzima (ELISA) de transcriptasa inversa (TR) colorimétrico (Roche, West Sussex, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante y qPCR para determinar un titulo aproximado en genomas del vector por ml (vg/ml).

45 Medición de la actividad de FVIII

La actividad del cofactor de muestras de plasma sanguíneo y medios de cultivos celulares in vitro se valoró usando el ensayo cromogénico de factor VIII:C Biophen (Biophen, Quadratech Diagnostics, Epsom, Reino Unido) como se

50 dice en las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron diluidas de 1:20 a 1:40 en el diluyente de muestras proporcionado y se analizaron por duplicado. Se construyó una curva estándar en % de actividad de cofactor VIII diluyendo plasma testigo I (Biophen, Quadratech Diagnostics) 1:20, llevando a cabo cuatro diluciones en serie 1:2 y realizando un duplicado. Se usó también plasma testigo anormal (Biophen, Quadratech Diagnostics) como un testigo de calidad adicional para el ensayo.

55 Transducción lentiviral

Se mantuvieron 293T en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies Ltd, Paisley, Reino Unido) y se complementaron 50 IU/ml de penicilina, 50 μg/ml de estreptomicina y 10% de suero de ternera fetal

60 inactivado con calor (FCS; Gibco). Para la transducción lentiviral se transdujeron cinco pocillos de 1 x 105 células 293T con diluciones en serie de vector en un volumen total de 300 μl de DMEM + 10% de FCS. 48 horas después de la transducción, los medios celulares sustituyeron a 500 μl de OptiMEM (Gibco). Después de 24 horas adicionales los medios de incubación fueron recogidos de todos los pocillos y ensayados en cuanto a actividad de factor VIII usando un ensayo cromogénico de FVIII. Seguidamente se extrajo DNA de las fórmulas y el número de

65 copias virales se cuantificó PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR).

Métodos in vivo

Todos los ratones fueron manejados según los procedimientos aprobados por la entidad UK Home Office and the Imperial College London Research Ethics Committee. Ratones con hemofilia A (F8tm2Kaz) generados mediante 5 deleción de exón 1724 fueron mantenidos en un fonde de 129SV. Ratones neonatales de 0-1 día de edad fueron sometidos a anestesia hipotérmica breve (<5 minutos) y se inyectaron 40 μm de vector lentiviarl concentrado (equivalente a 4 x 107-1 x 108 unidades de transducción por ratón) en la vena temporal superficial. Para los ensayos del factor de coagulación se recogieron 100 μl de sangre periférica de ratones anestesiados mediante hemorragia en la vena de la cola. La sangre se mezcló inmediatamente en una relación 1:9 con citrato de sodio, se centrifugó a

13.000 fpm en una microcentrifugadora durante cinco minutos y el plasma se transfirió a tubos de microcentrifugadora nuevos y se almacenó a -20ºC antes de ensayar.

Determinación del número de copias de vectores mediante PCR cuantitativo en tiempo real

15 Se extrajo DNA genómico de células usando un método estándar de desalación 25. La qPCR en tiempo real se llevó a cabo por tiplicado para cada muestra para determinar el número de copias virales. Se realizó una qPCR usando un dispositivo (ABI 7000 Sequence Detection System (ABI, Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido)). El DNA viral total se cuantificó usando los cebadores -TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT-3' (SEC ID Nº 9) y 5'-GAGTCCTGCGTCGAGAGAGC-3' (SEC ID Nº 10) y una sonda Taqman (FAN) 5'-CGCCCGAACAGGGACTTGAA-3' (TAMRA) (SEC ID Nº 11). El gen titin de ratón (Ttn) fue usado como un testigo de gen de 2 copias endógenas para células de ratón y fue cuantificado usando los cebadores 5'-AAAACGAGCAGTGACCTGAGG-3' (SEC ID Nº 12) y 5'-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3' (SEC ID Nº 13) y sonda Taqman (FAM) 5'-TGCACGGAATCTCGTCTCAGTC-3' (TAMRA) (SEC ID Nº 14). Se usó el gen de beta-actina humano ) (ACTV) como testigo génico de dos copias endógenas para células HEK-293T y se cuantificó usando los cebadores 5' -TCACCCACAAGTTGCCCATCTACGA

25 3' (SEC ID Nº 15) y 5' - CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG - 3' (SEC ID Nº 16) y sonda Taqman (FAM) 5'-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT - 3' (TAMRA) (SEC ID Nº 17).

Análisis estadístico

Los datos se expresan como valores medios más o menos SD (desviación típica). Se realizaron análisis estadísticos usando un modelo lineal general (GLN) basado en un análisis de una vía de la varianza (ANOVA) con comparaciones emparejadas individuales realizadas usando ensayos simultáneos de Bonferroni (Minitab software, Myerstown, PA).

35 Resultados

Generación de variantes de FVIII tratadas por bioingeniería y producción de vectores lentivirales SIN que expresan FVIII

Para superar la baja expresión de proteínas asociada con las aplicaciones de transferencias génicas de hemofilia A, los inventores investigaron la expresión de transgenes de FVIII tratados por bioingeniería que contenían varios elementos de dominio B de secuencias de cDNA optimizadas mediante codones o no optimizadas mediante codones. Se generaron las siguientes variantes de FVIII (figura 8ª): FVIII humano BDD que contiene una deleción de dominio B entre los aminoácidos 740-1649 con una mutación sin sentido Pro 739 a Thr 739 en el dominio a2 45 previamente descrito por Miao et al. (2004) 17 (denominada en lo sucesivo BDD rFVIII); BDD FVIII que contiene el dominio B de Fugu 201 aa que contiene 11 sitios de glicosilación unidos en N entre los aa (aminoácidos) 740 y 1469(denominado en la presente memoria descriptiva FVIII Fugu B); BDD FVIII que contiene el fragmento de dominio B humano 226 aa N6 que contiene 6 sitios de glicosilación unidos a N los aa 740 y 1649 previamente descritos por Miao et al. (2004) 17 denominados en la presente memoria descriptiva FVIII N6); BDD FVIII que contiene un péptido de activación SQ de 14 aminoácidos SQnm entre los aa 740 y 1649 (SFSQNPPVLTRHQR) (SEC ID Nº 18) (mutación sin sentido Lys a Thr subrayada), contiene la secuencia de reconocimiento de furina RHQR para aumentar la escisión intracelular, la secuencia del péptido de activación original descrita por Sandberg et al. (2001)23 (denominada en la presente memoria descriptiva SQ FVIII); SQ FVIII que contiene el dominio B de Fugu insertado en la secuencia SQm. Esto provoca que la secuencia SQm se escinda en cada lado del inserto del dominio B con la 55 secuencia N-terminal (SFSQNPPVLTR) (SEC ID Nº 19) que se denomina SQ a y la secuencia C-terminal que contiene el sitio de reconocimiento de furina RHUR como SQb (TRHQR) (SEC ID Nº 20) (denominada en la presente memoria descriptiva SQ FVIII Fugu B); SQ FVIII que contiene el dominio B de 226 aa/N6 insertado en la secuencia SQm creando las secuencias SQa y SQb en los lados N- y C-terminal del dominio B, respectivamente. En este constructo hay una repetición de la secuencia SQa de 11 aa (aminoácidos) provocada por la inserción del dominio B N6 en la secuencia SQm. Es desconocido el efecto que esta repetición tendrá sobre la secreción y función de FVIII (denominada en la presente memoria descriptiva SQ FVIII N6). Los constructos “SQ FVIII (ca)”, “SQ FVIII Fugu B (cb)” y “SQ FVIII N6 (Cb)” son iguales en la estructura de aminoácidos que los constructos “SQ FVIII”, “SQ FVIII Fugu B” y “SQ FVIII N6”, respectivamente, pero están traducidos a partir de una secuencia de cDNA optimizada mediante codones (Figura 8a). La representación de SQ, SQm, SQa y SQb se muestra en la Figura 8b. Todos los

65 constructos fueron clonados en una cadena principal lentiviral SIN bajo el control del promotor SFFV y las secuencias de transgenes fueron confirmadas mediante secuenciado de DNA automatizado.

Los vectores se produjeron para la totalidad de los nueve constructos de factor VIII y se ensayaron en cuanto al título físico usando el ensayo de proteínas de transcriptasa inversa. Seguidamente fueron ensayados usando qPCR para determinar un título aproximado en genomas de vector por ml (uvg/ml) (tabla 1). No hubo diferencia sustancial

5 en el titulo entre los constructos.

Tabla 1. Titulo físico de vectores de FVIII determinados mediante ensayo de transcriptasa inversa y qPCR. Cuantificación de concentración de proteína de transcriptasa inversa (RP) en poblaciones virales, medida realizando un ensayo colorimétrico RT, cuantificada en ng/μl y título estimado calculado a partir de esto. Media mostrada de

10 m=3. Cuantificación de título en genomas de vectores por mel se determinó usando qPCR. Se transdujeron 1 x 105 células 93T con un dilución en células de vector, posteriormente se extrajo DNA genómico después de 72 horas a partir de las células y se llevó a cabo una qPCR para WPRE y el gen de doméstico humano β-actina. Media mostrada de n = 5.

Virus

Transcriptasa inversa media (ng/μl) Titulo estimado (TU/ml) Titulo (vg/ml)

BDD FVIII

10,9 3,71 x 109 1,14 x 108

FVIII Fugu B

46,5 1,58 x 1010 1,58 x 109

FVIII N6

30,7 1,04 x 1010 1,07 x 109

SQ FVIII

68,3 2,32 x 1010 2,91 x 109

SQ FVIII Fugu B

44,8 1,52 x 1010 1,18 x 109

SQ FVIII N6

78,0 2,65 x 1010 2,0 x 109

SQ FVIII (co)

69,6 2,37 x 1010 4,45 x 109

SQ FVIII Fugu B (co)

71,8 2,40 x 1010 2,65 x 109

SQ FVIII N6 (co)

87,9 2,99 x 1010 3,39 x 109

15 Expresión de FVIII in vitro

La expresión de proteínas de FVIII relativa se midió para cada constructo en la línea celular de riñón embriónico humano 293T. Las células fueron transducidas con una dilución en serie de vector y cultivadas durante 48 horas, 20 después de lo cual las células fueron lavadas, se añadieron medios libres de suero de nueva aportación y se realizaron ensayos cromogénicos después de 24 horas adicionales para determinar la actividad de FVIII. Se extrajo también DMA genómico de las células para determinar el número de copias virales mediante qPCR. Los valores de la expresión fueron seguidamente normalizados frente al número de copias, permitiendo que se determinaran valores exactos de expresión de proteínas de FVIII por copia de gen (figura 9). Todos los constructos produjeron

25 actividad de FVIII detectable usando un ensayo cromogénico (Figura 9) y antígeno de FVIII mediante ELISA (datos no mostrados).

Las células transducidas con constructos expresados a partir de secuencias cDNA no optimizadas mediante codones produjeron como promedio de 1,40 a 2,89% de actividad de FVIII/ml 24 h/número de copias de vector. No

30 hubo diferencia significativa en la expresión de FVIII entre constructos equivalentes en los que estaban presentes las secuencias de péptidos de activación SQm, SQa y SQb (T > 0,05). Además, no hubo ningún aumento significativo en la expresión cuando estaban presentes dominios B de Fugu B o 226/N6 en comparación con constructos de SQ FVIII o BDD FVIII (p> 0,05).

35 Sin embargo, se observó un aumento altamente significativo en la expresión con constructos expresados a partir de secuencias de cDNA optimizadas mediante codones. Las células que expresan SQ FVIII (co), SQ FVIII Fugu B (co) y SQ FVIII N6 (co) produjeron 22,89 ± 3,68, 47,20 ± 2,71 y 35,8 ± 2,39% de actividad de FVIII/ml/24 h/ número de copias de vector, respectivamente, un aumento de 13 a 16 veces en comparación con la expresión a partir de secuencias de cDNA equivalentes no optimizadas mediante codones (P < 0,001). Se observó también un aumento

40 significativo en la expresión a partir de constructos que contenían los dominio B de Fugu y 226/N6 en comparación con SQ FVIII (co) (P < 0,0001), además, la SQ FVIII Fugu B (co) tenía una expresión significativamente mayor que SQ FVIII (co) y SQ FVIII N6 (co) (P < 0,0001).

Comparación de la expresión de FVIII in vivo después de suministro intravenoso de vector en ratones con hemofilia 45 A neonatos

Se ensayaron in vivo cassettes de expresión de FVIII que contienen SQ. Se ensayaron 6 constructos; SQ FVIII, SQ FVIII Fugu B, SQ FVIII N6, SQ FVIII (co), SQ FVIII Fugu B (co) y SQ FVIII N6 (co) mediante inyección intravenosa directa de vector lentiviral en ratones hemofílicos (FVIII KO) neonatos (0-1 día de edad). Todos los ratones recibieron entre 4,72 x 107 y 1,78 x 108 genomas de vectores (vg) con 6 a 10 ratones inyectados con productos de vectores. Se recogieron muestras de plasma sanguíneo a través de hemorragia en la vena de la cola aproximadamente cada 30 días durante un total ~ 250 días. La actividad de FVIII se valoró usando un ensayo cromogénico funcional.

5 El FVIII funcional se detectó en el plasma de todos los ratones transducidos para todos los valores de tiempo (Figura 10). El plasma de ratones transducidos con vector que contenía secuencias de FVIII no optimizadas mediante codones; SQ FVIII, SQ FVIII Fugu B o SQ FVIII N6 contenían una media de 5,72 ± 2,31% 7,79 ± 3,66% y 9,53 ± 2,24% de actividad de FVIII humano normal, respectivamente, para la duración del experimento. La capacidad para coagular rápidamente a continuación de hemorragias de vena de cola indicó que los ratones tratados con secuencias SQ FVIII Fugu B o SQ FVIII N6 eran capaces de conseguir una hemostásis adecuada, sin embargo, cuatro de cada seis ratones inyectados en el grupo de vector SQ FVIII no sobrevivieron, indicando que los niveles de FVIII fueron insuficientes para corregir el fenotipo de hemofilia A de múridos. Ninguno de los grupos de vectores mostró una morbilidad asociada con una baja expresión de FVIII. Para ratones transducidos con vector que contiene

15 secuencias de FVIII cDNA optimizadas mediante codones; SQ FVIII (co), SQ FVIII Fugu B (co) o SQ FVIII N6 (co), se detectaron niveles medios de FVIII a 256,1% ± 63,4%, 230,2% ± 74,1% 283,7% ± 56,2% de actividad normal de FVIII, respectivamente, durante el período del experimento. Es decir, un aumento de 44, 29 y 29 veces en la expresión de SQ FVIII (c), SQ FVIII Fugu B (c) y SQ FVIII N6 (c), respectivamente, en comparación con la expresión a partir de secuencias equivalentes no optimizadas mediante codones (P<0,0001, ensayo simultáneo de Bonferroni). Además, no se observó ninguna pérdida sustancial en la expresión de FVIII en ninguno de los grupos de vectores. De forma importante, no se observón ninguna diferencia significativa en la expresión para constructos que contienen diferentes elementos de dominio B para vectores que contienen secuencias de cDNA optimizadas con codones o no optimizadas con codones (Figura 11).

25 Análisis del número de copias virales en órganos de ratones transducidos

A partir de los 187 y 246 días posteriores a la inyección, los ratones fueron sacrificados para determinar el número de copias de vectores en tejido de hígado, bazo, corazón, pulmón y riñón mediante qPCR en tiempo real (Figura 12). Se detectaron genomas de vectores predominantemente en el tejido del hígado y bazo con copias insignificantes en los tejidos de corazón, pulmón y riñón para todos los ratones en todos los grupos de vectores. El tejido de hígado tomado de ratones transducidos con vector que contiene secuencias de cDNA no optimizadas mediante codones contenía una media de 5,75, 6,97 y 5,25 copias de vectores por célula para SQ FVIII, SQ FVIII Fugu B y SQ FVIII N6, respectivamente. En el tejido de bazo, el número de copias media fue de 1,50, 3,13 y 2,75 copias por célula para SQ FVIII, SQ FVIII Fugu B y SQ FVIII N6, respectivamente. No hubo ninguna diferencia significativa en el número de

35 copias de vectores detectado en tejidos de hígado de animales inyectados con vector que contenía secuencias optimizadas mediante codones (P >0,1, ensayo simultáneo de Bonferroni). El número medio de copias en el tejido de hígado fue detectado a 5,04, 9,17 y 8,80 copias por células y la copia en el tejido de bazo fue de 2,28, 2,57 y 2,60 copias por célula, para SQ FVIII (co), SQ FVIII Fugu B (co) y SQ FVIII N6 (co), respectivamente. En todos los casos, se encontró un número de copias similar en todos los tejidos para los animales independientemente del grupo de vectores.

Explicación

La inestabilidad de mRNA, las interacciones con proteínas, las interacciones con proteínas de chaperona residentes

45 en el ER y el requisito de transporte facilitado de hidratos de carbono desde ER hasta el aparato de Golgi significa que el FVIII es expresado a niveles mucho más bajos a partir de células de mamíferos que otras proteínas de tamaño y complejidad similar 7;26. Esto ha sido un factor limitante para la producción comercial de FVIII recombinante para una terapia de sustitución y en el éxito de una terapia génica para la hemofilia A. Ha sido incorporado un cierto número de formas tratadas por bioingeniería de FVIII humana en sistemas de transferencia génica y se ha mostrado que tienen una expresión mejorada tanto in vitro como in vivo. Los constructos de FVIII con supresión de dominio B (BDD) son usados ampliamente en experimentos de transferencia génica ya que no yay pérdida de la función procoagulante del FVIII y su tamaño más pequeño es más fácilmente incorporado en vectores. Una variación de este constructo es un BDD FVIII que contiene la conexión SQ de 14 aminoácidos entre los dominios A2 y A3, actualmente producido como un producto recombinante y comercializado por la entidad Refacto™ (Wyeth) 23. La

55 conexión SQ se ha mostrado previamente que favorece una escisión intracelular eficaz del producto de traducción de cadena única primario de FVIII ya que contiene el sitio de reconocimiento y escisión de furina intracelular 23;27 . Este constructo ha sido incorporado en vectores de plásmidos en los que ha conferido niveles terapéuticos de expresión 28-30. Miao et al., in 2004 17 han mostrado también que después de la transfección de plásmidos de células COS-1 de un constructo de BDD FVIII humano que contiene los primeros 226 aminoácidos de los 6 sitios de glicosilación de asparaginas unidos en N fue secretado de forma cuatro veces más eficaz en comparación con BDD FVIII y cinco veces más eficaz in vivo a continuación del suministro de genes hepáticos hidrodinámicos 17. Este constructo ha sido actualmente incorporado en muchos vectores de transferencia génica que incluyen plásmidos 31, vectores lentivirales32 y vectores gamma – retrovirales 33 y es más eficazmente secretado tanto in vitro 17; 33-35 como in vivo 17;35 .

65 Una de las limitaciones significativas de la generación de sistemas de suministro de genes virales eficaces para el tratamiento de la hemofilia A mediante terapia génica es el gran tamaño del FVIII cDNA. El objetivo de este estudio es investigar el efecto de los cassettes de expresión FVIII con diversos constructos de dominio B.

Estos consisten en constructo de SQ FVIII, FVIII N6 y BDD FVIII que contienen el dominio B completo del pez globo

5 Fugu rubripes que contiene 11 sitios de glicosilación de asparagina unidos en N que potencialmente podrían favorecer un tráfico más eficaz desde el ER hasta el aparato de Golgi y, por lo tanto, que sean más eficazmente secretados. Se investigó también la expresión de estos constructos a partir de secuencias de cDNA que han sido optimizadas mediante codones para la expresión Homo Sapiens. Todos los constructos fueron ensayados usando un vector lentiviral SIN, sin embargo, los resultados son aplicables a cualquier sistema de suministro génico. El estudio de los solicitantes encontró que in vitro no se encontró ninguna diferencia en la expresión de FVIII entre constructos con o sin la secuencia SQ modificada. La incorporación de regiones de dominio B en constructos no provocó tampoco ningún aumento significativo en la expresión para constructos no optimizados mediante codones en comparación con sus equivalentes con supresión de dominio B. Sin embargo, para secuencias optimizadas mediante codones, se observó una expresión significativamente de SQ FVIII Fugu B (co), así como de SQ FVIII N6

15 (co) en comparación con SQ FVIII (co). Se observó también un aumento de 13 a 16 veces en la expresión de factor VIII funcional por copia de gen integrado a partir de secuencias optimizadas mediante codones.

In vivo, después de una inyección neonatal de un número similar de genomas de vectores lentivirales, la presencia de dominio B no afectó significativamente a los niveles de estado estacionario de la actividad de FVIII en circulación para cualquiera de los constructos optimizados mediante codones o no optimizados mediante codones. Sin embargo, se observó un aumento de 29 a 44 veces en los niveles de plasma en estado estacionario de FVIII funcional en ratones con hemofilia A a niveles por encima de 200% de la expresión FVIII humano normal a partir de constructos optimizados mediante codones en comparación con los equivalentes no optimizados mediante codones. De forma importante, estos niveles de FVIII en circulación estaban asociados con una correlación de las diátesis

25 hemorrágicas. Por el contrario, los niveles de actividad de FVIII observados en ratones tratados con cassettes de expresión de FVIII no optimizados mediante codones están asociados con una hemorragia mortal a continuación de hemorragias en la cola.

Múltiples silenciadores transcripcionales, y secuencias inhibidoras están ampliamente distribuidos en el FVIII cDNA4;6;21;22 y la expresión aumentada que sigue la optimización mediante codones puede ser debida en parte a la eliminación de estas secuencias. Sin embargo, la deleción del dominio B completo que condujo a un aumento de 17 veces en nRNA y producto de traducción primaria solo dio lugar a un aumento de 30% en los niveles de proteína secretada, sugiriendo que la velocidad de transporte de ER-aparato de Golgi se redujo y que los niveles de FVIII nRNA no estaban limitando la expresión. La introducción de múltiples sitios de glicosilación unidos en N que son

35 importantes en el transporte de ER-aparato de Golgi de niveles aumentados de FVIII de FVIII secretado, sugiriendo que la velocidad de transporte de ER-aparato de Golgi puede ser una etapa limitante de la velocidad 17. Sin embargo, una cantidad significativa de FVIII en el ER nunca transita hasta el compartimento de Golgi debido a un fallo para la acumulación de FVIII correctamente plegado y mal plegado en el ER que puede dar lugar a un deterioro oxidativo y apopitosis sugiriendo quizás que el plegado de FVIII es la etapa limitante de la velocidad en la expresión de FVIII 34.

Aunque la estructura secundaria de las proteínas está determinada principalmente por la secuencia de aminoácidos, el plegado de proteínas en la célula está afectado por una gama de factores: estos incluyen la interacción con otras proteínas (chaperonas) y ligandos, tanslocación a través de la membrana del ER y condiciones Redox. La velocidad

45 de traducción puede afectar también al plegado de proteínas y se ha sugerido que el uso de codones puede ser un mecanismo para regular la velocidad de traducción y permitir así un plegado por etapas de dominios de proteínas individuales 36;37. El FVIII es una proteína de dominios múltiples compleja en la que los segmentos no secuenciales de cadena de polipéptidos naciente pueden interaccionar en el plegado tridimensional. El ribosoma inactivado en codones “raros”, por lo tanto, puede conducir a trayectorias de plegado alternativas, generando conformaciones alteradas y una proteína potencialmente mal plegada. Una explicación potencial para el efecto observado de las secuencias optimizadas mediante codones utilizadas en este estudio puede ser que permiten una traducción y transporte eficaz a través de la membrana del E permitiendo que la cadena de polipéptido de FVIII naciente se pliegue correctamente, conduciendo a los niveles aumentados de FVIII secretado observados in vitro e in vivo.

55 La expresión de >200 no es requerida en pacientes de hemofilia y la producción de estos niveles elevados de FVIII puede ser perjudicial para las células productoras 4,34. Sin embargo, una ventaja principal de la secuencia optimizada es la capacidad de minimizar el número de células genéticamente modificadas necesarias para producir niveles terapéuticos, reduciendo así el riesgo de mutagénesis insercional y los efectos posicionales dependientes del sitio de inserción. También, el uso de elementos promotores fuertes o ubicuos como SFFV que eran previamente necesarios para conducir la expresión elevada de constructos de FVIII podrían ser sustituidos por promotores específicos de tejidos más débiles, que son menos propensos a un silenciado transcripcional 31.

Los estudios in vivo previos han demostrado la expresión de niveles terapéuticos de FVIII in vivo en ratones adultos

32;38-40

con hemofilia A después de una inyección sistémica de vector , trasplante de células de médula ósea

65 transducidas 31;33, células de médula ósea trasplantadas o transducidas con expresión específica para plaqueta dirigida a diana 41;42 y trasplante de células endoteliales resultante de la sangre transducida 43. Sin embargo, los niveles de expresión de FVIII mediados a partir de estas propuestas han sido bajos (1-5% del humano normal) y la expresión transitoria debida a la formación de anticuerpos neutralizantes. En este estudio se usó un sistema de suministro de genes lentivirales para investigar la expresión de FVIII a partir de constructos de FVIII que contienen diversos dominios B de secuencias de cDNA no optimizadas mediante codones y optimizadas mediante codones.

5 Se observó un aumento enorme en el nivel de FVIII secretado a partir de un gDNA optimizado mediante codones usando este sistema, sin embargo, como este cassette de expresión tiene un tamaño de solamente ~ 5 kb, es aplicable para cualquier sistema de suministro génico viral (incluido AAV) o no viral y permitirá el desarrollo de vectores más seguros y más eficaces para una terapia génica de hemofilia A.

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Listado de secuencias

<110> UCL Business plc

<120> Secuencia codificadora optimizada y promotor Optimised 5 <130> P524906PCT

<150> GB 0911870.4

<151> 2009-07-08

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5 10 <210> 1

<211> 4890

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de factor VIII modificada optimizada mediante codones

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(4890)

<400> 1

<210> 2

<211> 1629

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de factor VIII modificado

<400> 2

<210> 3

<211> 251

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> modified promoter sequence

<400> 3

10 <210> 4

<211> 5061

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

15 <223> Secuencia de nucleótidos de factor VIII modificada optimizada mediante codones

<400> 4

<210> 5

<211> 4377

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de factor VIII modificada optimizada mediante codones

<400> 5

<210> 6

<211> 4980

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de factor VIII modificada optimizada mediante codones

<400> 6

<210> 7

<211> 5336

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de factor VIII modificada optimizada mediante codones

<400> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

5 <223> Cebador

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

5

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 8

agcttcagcc agaacccccc cgtgctgacg cgtcaccagc gg

42

10

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

15

<223> Cebador

<400> 9

tgtgtgcccg tctgttgtgt 20

<210> 10

<211> 20

20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 10

25

gagtcctgcg tcgagagagc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

30

<220>

<223> Cebador

<400> 11

cgcccgaaca gggacttgaa 20

<210> 12

<400> 12 aaaacgagca gtgacctgag g 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 13 15 ttcagtcatg ctgctagcgc 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 14 tgcacggaat ctcgtctcag tc 22

<210> 15 25 <211> 25

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 15 tcacccacaa gttgcccatc tacga 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA 35 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 16 cagcggaacc gctcattgcc aatgg 25

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220> 45 <223> Cebador

<400> 17 atgccctccc ccatgccatc ctgcgt 26

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 18

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 19

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 20

<210> 21

<211> 1670 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Modified Factor VIII protein

<400> 21

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una molécula de ácidos nucleicos aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y que codifica factor VIII funcional.

2. 2.

   La molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 1, que tiene una identidad de al menos 95% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

3. 3.

   La molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que codifica una proteína que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 21 que tiene entre 0 y 10 cambios de aminoácidos para la misma.

4. 4.

   La molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 3, que codifica una proteína que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 21.

5. 5.

   La molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada entre la secuencia de la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 7.

6. 6.

   La molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 85% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3.

7. 7.

   Un vector, que comprende una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. 8.

   Una célula hospedante que comprende la molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el vector de la reivindicación 7.

9. 9.

   Un animal transgénico que comprenden células que comprenden la molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el vector de la reivindicación 7.

10. 10.

    La molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un vector según la reivindicación 7, para ser usada en terapia.

11. 11.

    Una molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un vector según la reivindicación 7, para ser usados en el tratamiento de hemofilia.

12. 12.

    Un método para la preparación de un vector de suministro de genes parvovirales, comprendiendo el método las etapas de

    (a)

    proporcionar una célula de insecto que comprende uno o más constructos de ácidos nucleicos que comprenden:

    (i)

    una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que está flanqueada por al menos una secuencia de nucleótidos repetida, terminal, invertida y parvoviral;

    (ii)

    un primer cassette de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas Rep parvovirales que está funcionalmente conectado a un promotor que es capaz de conducir la expresión de la(s) proteína(s) Rep en la célula de insecto;

    (iii) un segundo cassette de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas de cápsides parvovirales que está funcionalmente conectado a un promotor que es capaz de conducir la expresión de la(s) proteína(s) de la cápside en la célula de insecto;

    (b)

    cultivar la célula de insecto definida en el apartado (a) bajo condiciones que conduzcan a la expresión de las proteínas Rep y de la cápside; y, opcionalmente,

    (c)

    recuperar el vector de suministro de genes parvovirales.