ES2970216T3 - Constructos de terapia génica para tratar la enfermedad de Wilson - Google Patents
Constructos de terapia génica para tratar la enfermedad de Wilson Download PDFInfo
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Abstract
Esta solicitud se refiere a vectores virales adenoasociados que codifican un ATP7B truncado pero funcional para su uso en terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (EW). El ATP7B truncado descrito en este documento tiene varias ventajas sobre el ATP7B de tipo salvaje, como una mayor eficacia y un mejor rendimiento de fabricación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Constructos de terapia génica para tratar la enfermedad de Wilson
Campo técnico de la invención
Esta solicitud se refiere generalmente a vectores virales adenoasociados y métodos de su uso en la terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD).
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Wilson (WD, por sus siglas en inglés) es un trastorno genético autosómico recesivo que causa acumulación de cobre principalmente en el hígado y posteriormente en el sistema neurológico y otros tejidos. La WD es un trastorno poco común que afecta aproximadamente a 1 de cada 30.000 individuos, causado por mutaciones en el gen ATPasa 2 (ATP7B) transportador de cobre en el cromosoma 13. Hay más de 600 mutaciones únicas de ATP7B. El ATP7B se expresa principalmente en hepatocitos y funciona en el transporte transmembrana de cobre. La ausencia o disminución de la función de la proteína ATP7b da como resultado una disminución de la excreción hepatocelular de cobre en la bilis, causando la enfermedad hepática. Con el tiempo, sin un tratamiento adecuado, los niveles altos de cobre pueden causar daños a los órganos potencialmente mortales.
Los pacientes con WD hepática generalmente se presentan en la niñez tardía o la adolescencia, y presentan características de hepatitis aguda, insuficiencia hepática fulminante o enfermedad hepática crónica progresiva. Las manifestaciones neurológicas de WD se presentan típicamente más tarde que la enfermedad hepática, más a menudo en la segunda o tercera década, e incluyen síntomas extrapiramidales, cerebelosos y relacionados con el cerebro.
El objetivo del tratamiento médico de la WD es eliminar el depósito tóxico de cobre del cuerpo y evitar su reacumulación. Los métodos actuales de tratamiento para la WD son la terapia oral diaria con agentes quelantes (D-penicillamina, trientina y sales de zinc). La terapia médica es efectiva en la mayoría, pero no en todos los pacientes con WD. El trasplante hepático es una opción terapéutica en pacientes con WD que presentan insuficiencia hepática fulminante o insuficiencia hepática progresiva. Sin embargo, se requiere que los receptores de trasplante mantengan un régimen de inmunosupresión constante para prevenir el rechazo.
La presente invención aborda la necesidad de un tratamiento mejorado y sostenible de WD mediante el suministro de un gen que expresa ATP7B truncado, pero funcional, a pacientes con un vector viral adenoasociado. El ATP7B truncado de la presente invención ha mejorado la eficacia en el tratamiento de la WD y posee una ventaja de la facilidad de fabricación y la eficiencia sobre el tipo silvestre y otras formas truncadas de la proteína ATP7B.
Breve descripción de la invención
Esta invención proporciona composiciones y métodos de su uso en la terapia génica. En la presente se proporcionan vectores de virus adenoasociados (AAV) útiles para el tratamiento de W<d>. En un aspecto, la presente invención proporciona un virus adenoasociado recombinante (rAAV) útil para el tratamiento de la enfermedad de Wilson, en el que el rAAV comprende una cápside AAV y un genoma vectorial empaquetado en ella, el genoma vectorial comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5'; una secuencia de promotor; una secuencia de ácido nucleico que codifica una ATPasa 2 truncada que transporta cobre humana (ATP7B) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 8; y una secuencia de ITR 3'.
Estos y otros aspectos y características de la invención se describen en las siguientes secciones de la solicitud.
Breve descripción de las figuras
La invención se puede entender más completamente con referencia a los siguientes dibujos. LaFIGURA1 es un diagrama ilustrativo que muestra un constructo ejemplar del genoma vectorial que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica una ATPasa 2 truncada transportadora de cobre humana (ATP7B), en la que se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 está presente (“ATP7B A1-3-SS” o “ATP7B dell-3 nativo”). Las características del constructo ejemplar del genoma vectorial se proporcionan a continuación:
Inicio (Posición de nucleótido) Término (Posición de nucleótido) Descripción
1 145 Repetición termina invertida (ITR) 146 245 Potenciador
246 435 Promotor
436 530 Intrón
Inicio (Posición de nucleótido) Término (Posición de nucleótido) Descripción
531 536 Secuencia Kozak de consenso
540 4142 ADNc de ATP7B del1-3 nativo (tipo silvestre)
4143 4340 Señal Poli A
4341 4485 Repetición termina invertida (ITR)
LaFIGURA 2es una representación esquemática de un vector AAV ejemplar (DTC319), con varios componentes clave mostrados en la misma.
LaFIGURA 3es una representación esquemática de un plásmido ejemplar, el plásmido Rep/Cap AAV pAAV2/8.KanR (p2123FH), que proporciona la función Rep y Cap en el empaque de rAAV cuando se transfecta junto con vectores AAV en células hospederas.
LaFIGURA 4es una representación esquemática de un plásmido ejemplar, el plásmido auxiliar de adenovirus pAdDeltaF6 (Kan), para la producción de rAAV cuando se transfecta conjuntamente con vectores AAV y plásmidos Rep/Cap en células hospederas.
LaFIGURA 5es un gráfico de dispersión de cobre hepático (pg/g) en ratones hembra C3He-Atp7btx-j (representados por círculos) inyectados con 1109, 1010, o 1011 copias del genoma (GC)/kg de ratones macho ATP7BcoFL (ATP7B humano de longitud completa que ha sido optimizado para codones) y C3He-Atp7btx-j (representados por cuadrados) inyectados con 1010 o 1011 GC/kg del mismo vector. Los niveles de cobre de los ratones heterocigotos (Het) machos y hembras sin inyectar y ratones C3He-Atp7btx-j también están representados en el gráfico de dispersión.
LaFIGURA 6es un gráfico de barras que muestra el rendimiento total de rAAV (títulos en GC) producido a partir de células hospederas después de la transfección de vectores AAV que codifican secuencias codificantes completas o parciales de ATP7B humano (vector AAV que porta la secuencia de nucleótidos para codificar ATP7B humano de longitud completa (FL); vector AAV que porta la secuencia de nucleótidos para codificar ATP7B humano con deleción de MBD 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 (ATP7B A1-3-SS); o vector AAV que porta la secuencia de nucleótidos para la codificación de ATP7B humano con deleción de MBD 1-4 (ATP7B A1-4).
LaFIGURA 7es un diagrama de dispersión de los niveles de cobre en orina e hígado, cuadrados y círculos, respectivamente (pg/g), evaluado después de que se inyectaran ratones C3He-Atp7btx'j con AAV8 que transportaban ATp7B humano de longitud completa (ATP7B FL), ATP7B A1-3-SS, o ATP7B A1-4. Los ratones C3He-Atp7btx'j que recibieron disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) actuaron como controles (vehículo).
LaFIGURA 8es un gráfico de barras que muestra el rendimiento total de rAAV (títulos en GC) producido a partir de células hospederas después de la transfección del vector AAV (DTC319) que codifica un ATP7B humano truncado, con deleción de los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 está presente, codificando la cápside AAV8 o AAV9.
LaFIGURA 9es un gráfico de barras de los niveles de acumulación de cobre hepático (pg/g de peso seco) en ratones C3He-Atp7btx'j a los que se les administró una inyección intravenosa de un control de vehículo (disolución amortiguadora de dilución; WD) o una infusión de AAV8 que transportaba ATP7B A1-3-SS nativo (DelA). Los niveles de acumulación de cobre en el hígado en ratones de tipo silvestre (WT) no inyectados representados en el gráfico de barras actuaron como un control negativo. Valores expresados como media ± EEM (error estándar de la media).
LaFIGURA 10es un gráfico de barras de la actividad de la ceruloplasmina en ratones C3He-Atp7btx'j a los que se les administró una inyección intravenosa de un control de vehículo (disolución amortiguadora de dilución; WD) o una infusión de AAV8 que transportaba ATP7B A1-3-SS nativo (DelA), según lo medido mediante un ensayo de actividad colorimétrica basado en reacciones enzimáticas. La actividad de la ceruloplasmina en ratones de tipo silvestre (WT) no inyectados, medida por el mismo ensayo de actividad colorimétrica basado en reacciones enzimáticas, también se representa en el gráfico de barras.
LaFIGURA 11es un gráfico de barras del puntaje promedio después de la valoración estándar de las diapositivas de Hematoxilina y Eosina (H&E) para el agrandamiento nuclear e hipertrofia hepatocelular, desorganización, infiltrado inflamatorio y necrosis hepatocelular.
LaFIGURA 12es un diagrama ilustrativo que muestra un constructo de genoma vectorial ejemplar DTC327 que comprende una cápside AAV9 con PPIA poliA, AAV2 Rep/ITR con un promotor p5 completo que comprende ITR 145 pb, y una secuencia de nucleótidos que codifica una ATPasa 2 truncada transportadora de cobre humana (ATP7B), con deleción de los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 está presente.
Descripción detallada de la invención
Esta invención proporciona agentes y composiciones para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD). Las secuencias de ácido nucleico, vectores, virus recombinantes y composiciones asociadas de esta invención como se describe en la presente se pueden utilizar para mejorar, prevenir o tratar la WD.
A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se utilizan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (I<s>B<n>1-56081-569-8).
A fin de facilitar el examen de las diversas realizaciones de la divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos: Virus adenoasociado (AAV): Un virus pequeño, incapaz de replicarse, sin envoltura que infecta a los humanos y algunas otras especies de primates. No se sabe que el AAV cause enfermedad y provoca una respuesta inmunitaria muy leve. Los vectores de terapia génica que utilizan AAV pueden infectar tanto células en división como en reposo y pueden persistir en un estado extracromosómico sin integrarse en el genoma de la célula hospedera. Estas características hacen del AAV un vector viral atractivo para la terapia génica. Actualmente existen 12 serotipos reconocidos de AAV (AAV1 - 12).
Administración/administrar: Proporcionar o dar a un sujeto un agente, tal como un agente terapéutico (por ejemplo, un AAV recombinante), por cualquier vía efectiva. Las vías ejemplares de administración incluyen, pero no se limitan a, la inyección (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intravenosa), vía oral, intraductal, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal y por inhalación.
ATP7B A1-3-SS: Como se usa en la presente, ATP7B A1-3-SS se refiere a una ATPasa 2 truncada transportadora de cobre humana (ATP7B), en la que se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 está presente
Optimizado por codones: Un ácido nucleico “optimizado por codones” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que ha sido alterada de tal manera que los codones son óptimos para la expresión en un sistema particular (tal como una especie o grupo de especies en particular). Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico puede optimizarse para su expresión en células de mamíferos o en una especie de mamíferos en particular (tales como células humanas). La optimización por codones no altera la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.
Potenciador: Secuencia de ácido nucleico que aumenta la velocidad de transcripción al aumentar la actividad de un promotor.
Intrón: Un tramo de ADN dentro de un gen que no contiene información codificante para una proteína. Los intrones se eliminan antes de la traducción de un ARN mensajero.
Repetición termina invertida (ITR): Secuencias simétricas de ácido nucleico en el genoma de virus adenoasociados requeridas para una replicación eficiente. Las secuencias de ITR se encuentran en cada extremo del genoma del ADN AAV. Las ITR actúan como los orígenes de la replicación para la síntesis de ADN viral y son necesarias para la encapsidación vectorial.
Aislados: Un componente biológico “aislado” (tal como una molécula de ácido nucleico, proteína, virus o célula) ha sido sustancialmente separado o purificado lejos de otros componentes biológicos en la célula o tejido del organismo, o el propio organismo, en el que el componente es de origen natural, tales como otros cromosomas y extracromosomas ADN y ARN, proteínas y células. Las moléculas y proteínas de ácido nucleico que han sido “aisladas” incluyen las purificadas por métodos estándar de purificación. El término también abarca moléculas de ácido nucleico y proteínas preparadas por expresión recombinante en una célula hospedera, así como moléculas y proteínas de ácido nucleico sintetizadas químicamente.
Ligado operativamente: Una primera secuencia de ácido nucleico está ligada operativamente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está ligado operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN ligadas operativamente son contiguas y, cuando es necesario, para unir dos regiones de codificación de proteínas, en el mismo marco de lectura.
Portador farmacéuticamente aceptable: Los portadores farmacéuticamente aceptables (vehículos) útiles en esta divulgación son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15a edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de uno o más compuestos, moléculas o agentes terapéuticos.
En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales usualmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, disolución salina fisiológica, disoluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como un vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, formas en polvo, píldora, comprimido, o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, o estearato de magnesio de grado farmacéutico. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrarse pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes, y agentes amortiguadores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.
Prevenir, tratar o mejorar una enfermedad: “Prevenir” una enfermedad (tal como WD) se refiere a la inhibición del desarrollo completo de una enfermedad. "Tratar" se refiere a una intervención terapéutica que alivia un signo o síntoma de una enfermedad o afección patológica (tal como WD) después de que ha comenzado a desarrollarse. “Mejora” se refiere a la reducción en el número o la gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad (tal como WD).
Promotor: Una región de ADN que dirige/inicia la transcripción de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen). Un promotor incluye las secuencias necesarias de ácido nucleico cerca del sitio de inicio de la transcripción.
Purificado: El término “purificado” no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende como un término relativo. Así, por ejemplo, un péptido purificado, proteína, virus, u otro compuesto activo es aquel que se aísla en su totalidad o en parte de proteínas asociadas naturalmente y otros contaminantes. En ciertas realizaciones, el término “sustancialmente purificado” se refiere a un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo que ha sido aislado de una célula, medio de cultivo celular, u otra preparación en bruto y se ha sometido a fraccionamiento para eliminar varios componentes de la preparación inicial, tales como proteínas, residuos celulares, y otros componentes.
Recombinante: Una molécula de ácido nucleico recombinante es aquella que tiene una secuencia que no es de origen natural o tiene una secuencia que está hecha por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otra manera. Esta combinación artificial se puede lograr mediante la síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de moléculas de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética.
Del mismo modo, un virus recombinante es un virus que comprende una secuencia (tal como la secuencia genómica) que no es de origen natural o está hecho por una combinación artificial de al menos dos secuencias de origen diferente. El término “recombinante” también incluye ácidos nucleicos, proteínas y virus que han sido alterados únicamente por adición, sustitución o deleción de una porción de una molécula de ácido nucleico natural, proteína o virus. Como se usa en la presente, “AAV recombinante” se refiere a una partícula AAV en la que se ha empaquetado una molécula de ácido nucleico recombinante como una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un ATP7B humano truncado (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15).
Identidad de secuencia: La identidad o similitud entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos, o dos o más secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de la identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de la secuencia se puede medir en términos de identidad porcentual; cuanto mayor sea el porcentaje, más idénticas serán las secuencias. La similitud de secuencia puede medirse en términos de similitud porcentual (que tiene en cuenta las sustituciones conservativas de aminoácidos); cuanto mayor sea el porcentaje, más similares serán las secuencias. Los homólogos u ortólogos de las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos poseen un grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencia cuando se alinean utilizando métodos estándar. Esta homología es más significativa cuando las proteínas ortólogas o ADNc se derivan de especies que están más estrechamente relacionadas (tales como las secuencias humanas y de ratón), en comparación con especies más distantemente relacionadas (tales como las secuencias humanas y deC. elegans).
Los métodos de alineamiento de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineamiento se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970: Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.<u>U. 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins y Sharp, CABI<o>S5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992: y Pearson et al., Meth. Mol. Rio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, presenta una consideración detallada de los métodos de alineamiento de secuencia y los cálculos homológicos.
The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) está disponible en varias fuentes, incluido el Centro Nacional de Información Biológica (NCBI) y en Internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencias BLASPT, BLASTOST, BL<a>S<t>OX, TBSTOST y TBLASX. Se puede encontrar información adicional en el sitio web de NCBI.
Serotipo: Grupo de microorganismos estrechamente relacionados (tales como virus) que se distinguen por un conjunto característico de antígenos.
Secuencia de relleno: Se refiere a una secuencia de nucleótidos contenidos dentro de una molécula de ácido nucleico más grande (tal como un vector) que se utiliza típicamente para crear el espaciamiento deseado entre dos características de ácido nucleico (tal como entre un promotor y una secuencia codificante), o extender una molécula de ácido nucleico para que sea de la longitud deseada. Las secuencias de relleno no contienen información de codificación de proteínas y pueden ser de origen desconocido/sintético y/o no relacionadas con otras secuencias de ácido nucleico dentro de una molécula de ácido nucleico más grande.
Sujeto: Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye mamíferos humanos y no humanos.
Sintético: Producido por medios artificiales en un laboratorio, por ejemplo, un ácido nucleico sintético puede ser sintetizado químicamente en un laboratorio.
Cantidad terapéuticamente eficaz: Una cantidad de un agente farmacéutico o terapéutico específico (por ejemplo, un AAV recombinante) suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto, o en una célula, que se está tratando con el agente. La cantidad eficaz del agente dependerá de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, el sujeto o las células que se están tratando, y la forma de administración de la composición terapéutica.
Vector: Un vector es una molécula de ácido nucleico que permite la inserción de ácido nucleico extraño sin alterar la capacidad del vector para replicarse y/o integrarse en una célula hospedera. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula hospedera, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos. Un vector de expresión es un vector que contiene las secuencias reguladoras necesarias para permitir la transcripción y la traducción de genes o genes insertados. En algunas realizaciones en la presente, el vector es un vector AAV.
A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la cual pertenece esta divulgación. Los términos singulares “un”, “una”, “el” y “ la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por “que comprende A o B” se entenderá que todos los tamaños de base o de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos, son aproximados y se proporcionan para su descripción. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente divulgación, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las explicaciones de términos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Vectores virales:
La presente divulgación proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) recombinante que contiene un genoma que comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' AAV, una secuencia de promotor, una secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B A1-3-SS (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15), y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3' AAV.
En algunas realizaciones, el genoma puede comprender además un potenciador, un intrón, una secuencia Kozak de consenso y/o una señal de poliadenilación como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el vector recombinante puede incluir además una o más secuencias de ácido nucleico de relleno. En una realización, una secuencia de ácido nucleico de relleno se sitúa entre el intrón y la secuencia codificante parcial o completa para ATP7B.
En varias realizaciones descritas en la presente, el vector de virus recombinante es un vector de virus adenoasociado (AAV). El vector AAV puede ser un vector AAV del serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 (es decir, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV1 1, o AAV12), así como cualquiera de las más de 100 variantes aisladas de tejidos de primates humanos y no humanos.Véase, por ejemplo,Choi et al., 2005, Curr Gene Ther. 5: 299 310, 2005 and Gao et al., 2005, Curr Gene Ther. 5: 285-297. Los vectores de AAV de cualquier serotipo se pueden utilizar en la presente invención, y la selección de serotipo AAV dependerá en parte del tipo de célula(s) que son el objetivo de la terapia génica. Para el tratamiento de WD, el hígado es uno de los órganos objetivo relevantes. En algunas realizaciones, el vector AAV se selecciona a partir del serotipo 9 (AAV9), el serotipo 8 (AAV8), el serotipo 5 (AAV5), o una variante de los mismos. En una realización ejemplar, el vector AAV es de serotipo 9 (AAV9) o una variante del mismo.
El vector AAV recombinante incluye una secuencia ITR AAV, que funciona como el origen de la replicación del ADN vectorial y la señal de empaque del genoma vectorial, cuando las funciones AAV y adenovirus auxiliares se proporcionan entrans.Además, la ITR actúa como el objetivo para el rascado endonucleático de cadena única por las proteínas Rep grandes, resolviendo genomas individuales a partir de intermedios de replicación.
En algunas realizaciones, la secuencia de ITR 5' es de AAV2. En algunas realizaciones, la secuencia de ITR 3' es de AAV2. En algunas realizaciones, la secuencia ITR 5' y la secuencia ITR 3' son de AAV2. En algunas realizaciones, la secuencia ITR 5' y/o la secuencia ITR 3' son de<a>AV2 y comprenden o consisten en la SEQ ID NO:2. En otras realizaciones, la secuencia ITR 5' y/o la secuencia ITR 3' son de una fuente no AAV2.
En algunas realizaciones ejemplares, el vector AAV es un vector de serotipo AAV 9 (AAV9), y el vector incluye un potenciador, un promotor, un intrón, una secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B A1-3-SS (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15), y una señal de poliadenilación descrita en la presente. En algunas realizaciones, el vector AAV9 incluye además dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) AAV2, AAV8 o AAV9: una 5' del potenciador y otra 3' de la señal de poliadenilación. En una realización ejemplar, el vector AAV9 incluye dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) AAV2: una 5' del potenciador y otra 3' de la señal de poliadenilación. En algunas realizaciones, las secuencias ITR AAV2 comprenden o consisten en la SEQ ID NO:2. En otra realización ejemplar, el vector AAV9 incluye dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) AAV9: una 5' del potenciador y otra 3' de la señal de poliadenilación.
En algunas realizaciones ejemplares, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' AAV, una secuencia de promotor, una secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 1, que codifica ATP7B A1-3-SS nativo , y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3' AAV. En algunas realizaciones ejemplares, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' AAV, una secuencia de promotor, una secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 15, que codifica un ATP7B A1-3-SS optimizado para codones, y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3' AAV. En algunas realizaciones ejemplares, la presente divulgación proporciona un genoma vectorial que comprende la SEQ ID NO: 14, que comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' AAV, una secuencia de promotor, una secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 1, que codifica el ATP7B A1-3-SS nativo, o un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende el mismo.
En aspectos adicionales, la aplicación divulga secuencias de ácido nucleico recombinante correspondientes a genomas vectoriales útiles en el tratamiento de WD. En algunas realizaciones, la solicitud divulga un ácido nucleico recombinante que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntico a la SEQ ID NO:14. Por lo tanto, la solicitud divulga ácidos nucleicos recombinantes que son al menos 80 % (por ejemplo, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, 99,9 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:14. En una realización ejemplar, la solicitud divulga una secuencia de ácido nucleico recombinante correspondiente a un genoma vectorial que comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' AAV, una secuencia de promotor, una secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO:1, que codifica ATP7B A1-3-SS nativo, y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3' AAV, en donde el genoma vectorial comprende o consiste en la SEQ ID NO:14. En una realización ejemplar, la solicitud divulga una secuencia de ácido nucleico recombinante correspondiente a un genoma vectorial que comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' AAV, una secuencia de promotor, una secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO:15, que codifica un ATP7B A1-3-SS optimizado para codones, y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3' AAV.
Promotor:
En varios aspectos descritos en la presente, se proporcionan vectores AAV que comprende una secuencia de promotor que ayuda a impulsar y regular la expresión transgénica, por ejemplo, la expresión de ATP7B A1-3-SS (por ejemplo, secuencia de aminoácidos de ATP7B A1-3-SS representada por la SEQ ID NO:8). En realizaciones ejemplares, la secuencia de promotor se encuentra entre la secuencia ITR 5' seleccionada y la secuencia codificante para ATP7B A1-3-SS (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15). En algunas realizaciones, la secuencia de promotor se encuentra en cadena abajo de una secuencia de potenciador. En algunas realizaciones, la secuencia de promotor se encuentra cadena arriba de una secuencia de intrón. En algunas realizaciones ilustrativas, un vector descrito en la presente utiliza el promotor de la transtiretina (TTR), que de manera opcional puede estar ubicado cadena abajo de un potenciador de la transtiretina (enTTR).
En algunas realizaciones, el promotor se selecciona de un promotor de la transtiretina (TTR), un promotor de la p-actina de pollo (CBA), un promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), un promotor de la globulina de unión a tiroxina (TBG), un promotor de la alfa-1 anti-tripsina (A1AT), y un promotor de CAG (constructo usando el elemento potenciador temprano del CMV, el promotor, el primer exón y el primer intrón del gen CBA, y el aceptor de empalme del gen de beta-globina de conejo). En una realización ejemplar, el promotor es el promotor TTR. En una realización, el promotor TTR comprende o consiste en la SEQ ID NO:12.
Además de un promotor, un vector AAV puede contener otras señales apropiadas de iniciación de transcripción, terminación, secuencia de potenciador y procesamiento de ARN eficiente. Como se describe más detalladamente a continuación, tales secuencias incluyen señales de empalme y poliadenilación (poli A), elementos reguladores que mejoran la expresión (es decir, WPRE), secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático, secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (es decir, la secuencia Kozak de consenso), y secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas.
En algunas realizaciones, el vector AAV contiene un genoma vectorial que comprende además una secuencia Kozak de consenso. En algunas realizaciones, la secuencia Kozak de consenso se encuentra cadena abajo de una secuencia de intrón. En una realización, la secuencia Kozak de consenso es GCCGCC (SEQ ID NO:11). Como entenderán los expertos en la técnica, la secuencia Kozak de consenso típicamente se encuentra inmediatamente cadena arriba de una secuencia codificante; en este caso, inmediatamente cadena arriba de una secuencia codificante de ATP7B truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15). Como entenderá un experto en la técnica, la secuencia Kozak de consenso se puede considerar para compartir un residuo de ATG correspondiente al codón de inicio del polipéptido terapéutico, por ejemplo, ATP7B truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo,<s>E<q>ID NO:1 o SEQ ID NO:15). Para simplificar la divulgación, la secuencia Kozak de consenso, como se describe en la presente, comprende una secuencia de seis nucleótidos correspondiente a la región no compartida con el ácido nucleico que codifica el polipéptido terapéutico, por ejemplo, ATP7B truncado (ATP7B A1-3-SS codificado por SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15).
Polipéptidos ATP7B:
Como se describe en la presente, los aspectos de la invención proporcionan vectores recombinantes que incluyen un genoma que comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' AAV, una secuencia de promotor, una secuencia codificante para ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID<n>O:15), y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3' AAV. ATP7B tiene ocho dominios transmembranales que forman un camino a través de las membranas celulares para la translocación de cobre; y un extremo N-terminal grande con seis dominios de unión a metales (MBDS), cada uno comprende aproximadamente 70 aminoácidos y el motivo de unión a metales altamente conservado GMxCxxC (en donde x es cualquier aminoácido). Además de la secuencia canónica (también denominada isoforma A, que es la isoforma más larga; Secuencia de Referencia NCBI: NP_000044.2), se conocen cuatro isoformas adicionales: Se conocen cuatro isoformas adicionales de las Secuencias de Referencia NCBI: Secuencias de Referencia NCBI NP_ 001005918.1, NP _001230111.1, NP _001317507.1, NP_ 001317 508.1. Las composiciones y métodos descritos en la presente pueden usarse para tratar a sujetos que tienen una proteína variante ATP7B no funcional que causa enfermedad.
En una realización, una secuencia codificante para ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 15) codifica una proteína con aminoácidos como se describe en la SEQ ID n O:8. SEQ ID NO: 1 proporciona el ADNc para el ATP7B humano nativo con deleción de MBD 1-3. SEQ ID NO: 8 representa la proteína DEL1-3 Nativa o ATP7B A1-3-SS, en la que están presentes dos residuos de serina correspondientes a las posiciones 340 y 341 de la secuencia de proteína de longitud completa ATP7B de tipo silvestre.
En varias realizaciones descritas en la presente, se divulgan vectores que contienen un genoma que comprende una secuencia codificante para ATP7B truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID No : 15).
En algunas realizaciones, se divulgan vectores que contienen un genoma que comprende un ADNc diseñado para ATP7B humano, que ha sido optimizado para codones (por ejemplo, SEQ ID NO: 15). Los polipéptidos suministrados con los vectores descritos en la presente incluyen ATP7B truncado en el que MBD 1-3 ha sido delecionado (ATP7B A1-3-SS), que son adecuados para su uso en el tratamiento de la WD.
En algunas realizaciones, el polipéptido expresado con un vector descrito en la presente es un ATP7B humano truncado (SEQ ID NO:8).
Elementos vectoriales:
En algunas realizaciones, el vector AAV contiene un genoma que comprende además una o más secuencias de potenciador. En una realización, el potenciador se selecciona de un potenciador de la transtiretina (enTTR), un potenciador inmediato del gen temprano del citomegalovirus (CMV), un potenciador de la p-actina de pollo (CBA), un potenciador En34 y un potenciador de la apolipoproteína (ApoE). En una realización ejemplar, el potenciador es el potenciador enTTR. En una realización, el potenciador enTTR comprende o consiste en la SEQ ID NO:3.
En algunas realizaciones, el vector AAV contiene un genoma que comprende además una o más secuencias de intrón. En una realización, el intrón se selecciona de un intrón T pequeño SV40, un intrón beta de la subunidad de hemoglobina de conejo (rHBB), un intrón IVS2 de la beta globina humana, un intrón quimérico de p-globina/IgG (intrón promega quimérico) o un intrón hFIX. En una realización ejemplar, el intrón es el intrón T pequeño de SV40. En una realización, la secuencia de intrón T pequeños de SV40 comprende o consiste en la SEQ ID<n>O:4. En otra realización ejemplar, el intrón es el intrón rHBB. En una realización, la secuencia intrónica rHBB comprende o consiste en la SEQ ID NO:5.
En algunas realizaciones, el vector AAV contiene un genoma que comprende además una secuencia de señal de poliadenilación. En una realización, la secuencia de señal de poliadenilación se selecciona de una secuencia de señal de poliadenilación SV40, una secuencia de señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH), y una secuencia de señal de poliadenilación de beta globina de conejo. En una realización ejemplar, la secuencia de señal de poliadenilación es la secuencia de señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH). En una realización, la secuencia de señal de poliadenilación BGH comprende o consiste en la SEQ ID NO: 6. En otra realización ejemplar, la secuencia de señal de poliadenilación es la secuencia de señal de poliadenilación SV40. En una realización, la secuencia de señal de poliadenilación SV40 comprende o consiste en la SEQ ID NO:7.
Cápsides AAV:
En otro aspecto, la solicitud proporciona el virus adenoasociado recombinante (rAAV) útil como agentes para la terapia génica en el tratamiento de WD, en donde dicho rAAV comprende una cápside AAV, y un genoma vectorial como se describe en la presente. En algunas realizaciones, la cápside AAV es de un AAV de serotipo 9, 8, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, rh10, o hu37 (es decir, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, o AAVhu37). En una realización ejemplar, el vector AAV es un vector AAV de serotipo 9 (AAV9), un vector de variante AAV9, un vector AAV de serotipo 8 (AAV8), un vector AAV de serotipo 5 (AAV5) o un vector AAV de serotipo 2 (AAV2). En ciertas realizaciones, la cápside AAV y el vector son de un serotipo AAV9. En ciertas realizaciones, la cápside AAV y el vector son de un serotipo AAV8.
La cápside AAV9 es una cápside AAV autoensamblada compuesta de múltiples proteínas VP AAV9. Las proteínas AAV9 VP se expresan típicamente como variantes de empalme alternativas codificadas por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:9 o una secuencia que es al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 99 % de la misma, que codifica la secuencia de aminoácidos VP1 de la proteína de la cápside de la SEQ ID NO:10 (Acceso GenBank: AAS99264). Estas variantes de empalme dan como resultado proteínas de diferente longitud de la SEQ ID NO:10. En ciertas realizaciones, una cápside AAV9 incluye una proteína de la cápside AAV9 que tiene una secuencia de aminoácidos que es 99 % idéntica a AAS99264 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO:10. Véase también, la patente de EE. UU. No. 7.906.111, y la publicación internacional No. WO/2005/033321. Como se usa en la presente, una variante AAV9 incluye las descritas en, por ejemplo, la publicación internacional No. WO/2016/049230, la patente de EE. UU. No. 8.927.514, la publicación de patente de EE. UU. No. 2015/0344911, y la patente de EE. UU. No. 8.734.809.
Como se indica en la presente, las secuencias de las cápsides AAV9 y las proteínas de la cápside codificadas por las secuencias (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:9 o secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 que codifican la proteína de la cápside AAV9 VP1) son útiles en la producción de rAAV. Sin embargo, en otras realizaciones, se selecciona otra cápside AAV. La especificidad tisular está determinada por el tipo de cápside. Los serotipos de AAV que transducen un objetivo adecuado (por ejemplo, hígado, músculo, pulmón o SNC) pueden seleccionarse como fuentes de cápsides de vectores virales de AAV, incluyendo, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVrh64R1, AAVrh64R2, AAVrh8. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. No. 2007/0036760; la publicación de patente de EE. UU. No. 2009/0197338; y EP1310571. Véase también, la solicitud internacional No. WO 2003/042397 (AaV7 y otros AAV símicos), las patentes de EE. UU. Nos.
7.282.199 y 7.790.449 (AAV8). Además, se puede utilizar AAV aún por descubrir, o un AAV recombinante basado en él, como una fuente para la cápside AAV. Estos documentos también describen otros AAV que pueden seleccionarse para generar AAV y se incorporan como referencia. En algunas realizaciones, una cápside AAV para su uso en el vector viral puede ser generada por mutagénesis (es decir, por inserciones, deleciones o sustituciones) de una de las cápsides AAV antes mencionadas o su ácido nucleico codificante.
Células hospederas que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante:
En la presente se divulgan células hospederas que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante, vector viral, por ejemplo, un vector AAV, o un rAAV divulgado en la presente. En realizaciones específicas, las células hospederas pueden ser adecuadas para la propagación de AAV.
Se puede utilizar una amplia gama de células hospederas, tales como células de bacterias, levaduras, insectos, mamíferos, etc. En algunas realizaciones, la célula hospedera puede ser una célula (o una línea celular) apropiada para la producción de AAV recombinante (rAAV), por ejemplo, una célula HeLa, Cos-7, HEK293, A549, Bh K, Vero, RD, HT-1080, ARPE-19, o MRC-5. En ciertas realizaciones, la línea celular hospedera es una línea de célula HeLa (por ejemplo, HeLa S3). En otra realización, la línea celular hospedera es una línea celular HEK293.
Las moléculas o vectores de ácido nucleico recombinante pueden suministrarse al cultivo celular hospedero usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, se genera una línea celular hospedera estable que tiene la molécula o vector de ácido nucleico recombinante insertado en su genoma. En algunas realizaciones, se genera una línea celular hospedera estable, que contiene un vector AAV descrito en la presente. Después de la transfección del vector AAV al cultivo hospedero, la integración del rAAV en el genoma del hospedero puede ser evaluada por varios métodos, tales como selección antibiótica, clasificación celular activada por fluorescencia, southern blot, detección basada en PCR, hibridación fluorescentein situdescritos por Nakai et al., Nature Genetics (2003) 34:297-302; Philpott et al., Journal of Virology (2002) 76(11):5411-5421, y Howden et al., J. Gene Med. (2008) 10:42-50. Además, se puede establecer una línea celular estable de acuerdo con protocolos bien conocidos en la técnica, tales como los descritos en Clark, Kidney International Vol. 61 (2002):S9-S15, y Yuan et al., Human Gene Therapy (2011) 22(5):613-24.
AAV recombinante para terapia génica:
El virus adenoasociado (AAV) pertenece a la familiaParvoviridaey al géneroDependovirus.El AAV es un virus pequeño y sin envoltura que empaqueta un genoma lineal de ADN de cadena única. Tanto las cadenas sentido como antisentido del ADN AAV se empaquetan en cápsides AAV con la misma frecuencia.
El genoma AAV se caracteriza por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean dos marcos de lectura abiertos (ORF). El genoma AAV2, por ejemplo, los primeros 125 nucleótidos de iTr son un palíndromo, que se pliega sobre sí mismo para maximizar el emparejamiento de la base y forma una estructura de horquilla en forma de T. Las otras 20 bases de la ITR, denominada secuencia D, permanecen sin emparejarse. Las ITR son secuencias de acción en cis importantes para la replicación del ADN AAV; la ITR es el origen de la replicación y actúa como cebador para la síntesis de segunda cadena por ADN polimerasa. El ADN de doble cadena formado durante esta síntesis, que se llama monómero de forma replicante, se utiliza para una segunda ronda de replicación auto-cebadora y forma un dímero de forma replicante. Estos intermedios de doble cadena se procesan a través de un mecanismo de desplazamiento de cadena, lo que da como resultado un ADN de cadena única utilizado para el envasado y ADN de doble cadena utilizado para la transcripción. Dentro de la ITR se encuentran los elementos de unión a Rep y un sitio de resolución terminal (TRS). Estas características son utilizadas por la proteína reguladora viral Rep durante la replicación AAV para procesar los intermedios de doble cadena. Además de su papel en la replicación de AAV, la ITR también es esencial para el empaque del genoma AAV, la transcripción, la regulación negativa en condiciones no permisivas y la integración específica del sitio (Days and Berns, Clin. Microbiol. Rev. (2008) 21(4):583-593).
El ORF izquierdo de AAV contiene el gen Rep, que codifica cuatro proteínas: Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40. El ORF correcto contiene el gen de la caperuza, que produce tres proteínas virales de la cápside (VP1, VP2 y VP3). La cápside AAV contiene 60 proteínas virales de la cápside dispuestas en una simetría icosaédrica. VP1, VP2 y VP3 están presentes en una relación molar 1:1:10 (Daya y Berns, Clin. Microbiol. Rev. (2008) 21(4):583-593).
El AAV es actualmente uno de los virus más utilizados para la terapia génica. Aunque el AAV infecta a los seres humanos y algunas otras especies de primates, no se sabe que cause enfermedades y provoca una respuesta inmunitaria muy leve. Los vectores de terapia génica que utilizan AAV pueden infectar tanto células en división como en reposo y persistir en un estado extracromosómico sin integrarse en el genoma de la célula hospedera. Debido a las características ventajosas de AAV, la presente divulgación contempla el uso de AAV para las moléculas de ácido nucleico recombinante y los métodos divulgados en la presente.
El AAV posee varias características deseables para un vector de terapia génica, incluyendo la capacidad de unirse e ingresar a las células objetivo, entrar en el núcleo, la capacidad de expresarse en el núcleo durante un período prolongado de tiempo y baja toxicidad. Sin embargo, el pequeño tamaño del genoma AAV limita el tamaño del ADN heterólogo que se puede incorporar. Para minimizar este problema, se han construido vectores AAV que no codifican Rep y el elemento de eficiencia de integración (IEE). Las ITR se conservan ya que son señalescisrequeridas para el empaque (Daya and Berns, Clin. Microbiol. Rev. (2008) 21(4):583-593).
Los métodos de producción de rAAV adecuados para la terapia génica son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE. UU: No. 2012/0100606; 2012/0135515; 2011/0229971; y 2013/0072548; y Ghosh et al., Gene Ther. (2006) 13(4):321-329), y puede ser utilizado con las moléculas recombinantes del ácido nucleico y los métodos divulgados en la presente.
En algunos aspectos, la aplicación se refiere al uso de un rAAV divulgado en la presente para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD), en donde el rAAV incluye una cápside AAV y un genoma vectorial empaquetado en el mismo. En algunas realizaciones, el vector contiene un genoma que comprende como componentes ligados operativamente, en el orden de 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de 5', una secuencia de promotor, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15), y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3'. En una realización ejemplar, el genoma vectorial también comprende una secuencia de potenciador cadena arriba de la secuencia de promotor, un intrón cadena abajo del promotor, y una secuencia de poliadenilación cadena arriba de la ITR 3'. Por lo tanto, en otra realización ejemplar, el genoma vectorial comprende como componentes ligados operativamente, en el orden de 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5', una secuencia de potenciador, una secuencia de promotor, una secuencia de intrón, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15), una secuencia de señal de poliadenilación y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3'. En una realización más ejemplar, el genoma vectorial comprende como componentes ligados operativamente, en el orden de 5' a 3': una secuencia ITR 5' AAV2, un potenciador enTTR, un promotor TTR, un intrón T pequeño SV40, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o Se Q ID NO:15), una secuencia de señal de poliadenilación SV40, y una ITR 3' AAV2. En algunas realizaciones, el genoma vectorial comprende además una secuencia Kozak de consenso ubicada cadena abajo de la secuencia de intrón. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.
En algunos aspectos, la aplicación se refiere al uso de un rAAV divulgado en la presente para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD), en donde el rAAV incluye una cápside AAV y un genoma vectorial empaquetado en el mismo. En algunas realizaciones, el genoma vectorial comprende como componentes ligados operativamente, en el orden de 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de 5', una secuencia de promotor, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1), y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3'. En una realización ejemplar, el genoma vectorial también comprende una secuencia de potenciador cadena arriba de la secuencia de promotor, un intrón cadena abajo del promotor, y una secuencia de poliadenilación cadena arriba de la ITR 3'. Por lo tanto, en otra realización ejemplar, el vector contiene un genoma que comprende como componentes ligados operativamente, en el orden de 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5', una secuencia de potenciador, una secuencia de promotor, una secuencia de intrón, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1), una secuencia de señal de poliadenilación y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3'. En una realización más ejemplar, el vector contiene un genoma que comprende como componentes ligados operativamente, en el orden de 5' a 3': una secuencia ITR 5' AAV2, un potenciador enTTR, un promotor TTR, un intrón T pequeño SV40, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1), una secuencia de señal de poliadenilación SV40, y una ITR 3' AAV2. En algunas realizaciones, el genoma empaquetado comprende además una secuencia Kozak de consenso ubicada cadena abajo de la secuencia de intrón. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.
En algunos aspectos, la aplicación se refiere al uso de un rAAV divulgado en la presente para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD), en donde el rAAV incluye una cápside AAV y un genoma vectorial empaquetado. En algunas realizaciones, el vector contiene un genoma empaquetado que comprende como componentes ligados operativamente, en el orden de 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de 5', una secuencia de promotor, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:15), y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3'. En una realización ejemplar, el genoma empaquetado también comprende una secuencia de potenciador cadena arriba de la secuencia de promotor, un intrón cadena abajo del promotor, y una secuencia de poliadenilación cadena arriba de la ITR 3'. Por lo tanto, en otra realización ejemplar, el vector contiene un genoma empaquetado que comprende como componentes ligados operativamente, en el orden de 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5', una secuencia de potenciador, una secuencia de promotor, una secuencia de intrón, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:15), una secuencia de señal de poliadenilación y una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 3'. En una realización más ejemplar, el vector contiene un genoma empaquetado que comprende como componentes ligados operativamente, en el orden de 5' a 3': una secuencia ITR 5' AAV2, un potenciador enTTR, un promotor TTR, un intrón T pequeño SV40, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:15), una secuencia de señal de poliadenilación SV40, y una ITR 3' AAV2. En algunas realizaciones, el genoma empaquetado comprende además una secuencia Kozak de consenso ubicada cadena abajo de la secuencia de intrón. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.
Un diagrama ilustrativo que muestra un constructo de genoma vectorial empaquetado ejemplar para la expresión de ATP7B truncado que retiene MBD 4, 5 y 6 se proporciona en laFIGURA 1.Una iTr 5' está representada por nucleótidos 1-145; un potenciador enTTR está representado por nucleótidos 146-245; un promotor TTR está representado por nucleótidos 246-435; un intrón T pequeño SV40 está representado por nucleótidos 436-530; una secuencia Kozak de consenso está representada por nucleótidos 531-536; una secuencia codificante ATP7B truncada está representada por nucleótidos 540-4142; una secuencia de señal de poliadenilación SV40 está representada por nucleótidos 4143-4340; y una ITR 3' está representada por nucleótidos 4341-4485.
En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B A1-3-SS es la secuencia humana nativa (representada por SEQ ID NO:1). Alternativamente, en algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B A1-3-SS es una secuencia humana optimizada para codones (representada por SEQ ID NO:15).
Eficacia mejorada en el tratamiento de la WD:
En ciertas realizaciones, el ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) codificado por la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15, descrito en la presente, es más eficaz que las formas de longitud completa u otras formas truncadas de ATP7B (por ejemplo, ATP7B A1-4, SEQ ID NO: 13). En algunos aspectos, el ATP7B A1-3-SS de la presente divulgación se localiza en la Red del trans Golgi (TGN, por sus siglas en inglés). En ciertas realizaciones, un rAAV que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, que codifica ATP7B A1-3-SS, al inyectarse a un mamífero diagnosticado con un trastorno del metabolismo del cobre (por ejemplo, la enfermedad de Wilson), disminuye los niveles de cobre en el hígado y la orina del mamífero.
Rendimiento mejorado de los vectores AAV que comprenden ATP7B truncado:
En un aspecto, el rAAV que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B A1-3-SS, empaquetado en AAV8 o AAV9, descrito en la presente, tiene un rendimiento de fabricación de aproximadamente 1,1 veces a aproximadamente 10 veces más alto (por ejemplo, aproximadamente 1,1 veces, aproximadamente 1,2 veces, aproximadamente 1,3 veces, aproximadamente 1,4 veces, aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 1,6 veces, aproximadamente 1,7 veces, aproximadamente 1,8 veces, aproximadamente 1,9 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, o aproximadamente 10 veces) que el de ATP7B de longitud completa o ATP7B A1-4.
Rendimiento mejorado del vector AAV que comprende la cápside AAV9:
En un aspecto, el rAAV que comprende la cápside AAV9 tiene un rendimiento de título de aproximadamente 1,1 veces a aproximadamente 10 veces más alto (por ejemplo, aproximadamente 1,1 veces, aproximadamente 1,2 veces, aproximadamente 1,3 veces, aproximadamente 1,4 veces, aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 1,6 veces, aproximadamente 1,7 veces, aproximadamente 1,8 veces, aproximadamente 1,9 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, o aproximadamente 10 veces) en comparación con el rAAV que comprende la cápside AAV8.
Composiciones Farmacéuticas:
Las composiciones que comprenden el rAAV divulgado en la presente comunicación y un portador farmacéuticamente aceptable se proporcionan en la presente divulgación. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración de rAAV se pueden encontrar, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. 2012/0219528. Los portadores farmacéuticamente aceptables (vehículos) útiles en esta divulgación son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15a edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de uno o más compuestos, moléculas o agentes terapéuticos.
Como se ha señalado en el párrafo anterior, la solicitud se refiere en algunos aspectos a las composiciones farmacéuticas que comprenden un rAAV de la invención. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica además comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para la administración subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o intravenosa. En una realización ejemplar, la composición farmacéutica se formula para la administración intravenosa.
En algunas realizaciones, el rAAV se formula en un amortiguador/portador adecuado para la infusión en sujetos humanos. La disolución amortiguadora/portador debe incluir un componente que evite que el rAAV se adhiera a la tubería de infusión, pero no interfiera con la actividad de unión a rAAVin vivo.Entre las diversas disoluciones adecuadas cabe citar una o varias de las siguientes: una disolución salina amortiguadora, un tensoactivo y una sal o mezcla fisiológicamente compatible de sales ajustada a una fuerza iónica equivalente a aproximadamente 100 mm de cloruro de sodio (NaCl) a aproximadamente 250 mm de NaCl, o una sal fisiológicamente compatible ajustada a una concentración iónica equivalente. El pH puede estar en el rango de 6,5 a 8,5, o 7 a 8,5, o 7,5 a 8. Se puede seleccionar un tensoactivo adecuado, o una combinación de tensoactivos, entre los poloxámeros, es decir, copolímeros tribloque no iónicos compuestos por una cadena hidrófoba central de polioxipropileno 10 (óxido de polipropileno) flanqueados por dos cadenas hidrófilas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)), So Lu TOL HS 15 (Hidroxiestearato Macrogol-15), LABRASOL (Polioxiglicérido caprílico), polioxi 10 oleil éter, TWEEN (ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilenados), etanol y polietilenglicol.
Métodos para tratar la enfermedad de Wilson:
Las referencias a métodos de tratamiento en los siguientes párrafos de esta descripción deben interpretarse como una referencia a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usarse en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia. La solicitud divulga los métodos de tratamiento de WD en un sujeto humano que comprende la administración al sujeto humano de una cantidad terapéuticamente eficaz de un rAAV incluyendo la S<e>Q ID NO: 1 o SEQ ID NO: 15 para la codificación de un ATP7B truncado (ATP7B A1-3-SS), divulgado en la presente.
La solicitud divulga un método de tratamiento de WD que comprende la administración de un rAAV que incluye una cápside de AAV y un genoma vectorial empaquetado, en donde el genoma vectorial comprende una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 15).
La solicitud divulga los métodos de tratamiento de WD en un sujeto humano que comprende la administración a un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un rAAV que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 15). En una realización, la aplicación divulga un método de tratamiento de WD en un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B que comprende la administración de un rAAV que incluye una cápside AAV y un genoma vectorial empaquetado, en donde el genoma vectorial comprende la secuencia codificante de un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 15). La secuencia codificante representada por la SEQ ID NO:1 codifica un ATP7B truncado representado por la SEQ ID NO:8. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.
La solicitud divulga los métodos de tratamiento de WD en un sujeto humano que comprende la administración a un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un rAAV que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). En una realización, la aplicación divulga un método de tratamiento de WD en un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B que comprende la administración de un rAAV que incluye una cápside AAV y un genoma vectorial empaquetado, en donde el genoma vectorial comprende la secuencia codificante de un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). La secuencia codificante representada por la SEQ ID NO: 1 codifica un ATP7B truncado representado por la SEQ ID NO:8. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.
La solicitud se refiere a métodos de tratamiento de WD en un sujeto humano que comprende la administración a un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un rAAV que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO: 15). En una realización, la aplicación divulga un método de tratamiento de WD en un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B que comprende la administración de un rAAV que incluye una cápside AAV y un genoma vectorial empaquetado, en donde el genoma vectorial comprende la secuencia codificante de un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS) (por ejemplo, SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.
Se puede utilizar cualquier método o vía adecuado para administrar un rAAV o una composición que contiene rAAV descrita en la presente. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, la vía sistémica, oral, por inhalación, intranasal, intratraqueal, intraarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica y otras vías de administración parentales. En algunas realizaciones, el rAAV o una composición que comprende un rAAV se administran por vía intravenosa.
La dosis específica administrada puede ser una dosis uniforme para cada paciente, por ejemplo, 1,0 * 1011 - 1,0 * 1014 genoma viral por kilogramo de peso corporal del paciente (vg)/kg. Alternativamente, la dosis del paciente puede adaptarse al peso corporal aproximado o al área superficial del paciente. Otros factores para determinar la dosificación apropiada pueden incluir la enfermedad o afección a tratar o prevenir, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración, y la edad, sexo y condición médica del paciente. Refinamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento es hecho rutinariamente por los expertos en la técnica, especialmente en vista de la información de dosificación y los ensayos divulgados en la presente. La dosificación también se puede determinar mediante el uso de ensayos conocidos para determinar las dosificaciones utilizadas junto con los datos de dosis-respuesta adecuados. La dosificación de un paciente individual también se puede ajustar a medida que se monitorea el progreso de la enfermedad.
En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 1,0 * 1011 vg/kg a aproximadamente 1 * 1014 vg/kg, aproximadamente 5 * 1011 vg/kg a aproximadamente 5 * 1011 vg/kg, o aproximadamente 1 * 1012 a aproximadamente 1 * 1013 vg/kg, medido por qPCR o PCR de gota digital (ddPCR). En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 2*1012 vg/kg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 5*1012 vg/kg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 6*1012 vg/kg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1*1013 vg/kg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 7*1013 vg/kg. El rAAV puede administrarse en una dosis única o en dosis múltiples (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dosis) según sea necesario para obtener los resultados terapéuticos deseados. En algunas realizaciones ejemplares, sólo se administra una dosis única de un rAAV particular.
A lo largo de la descripción, donde las composiciones se describen como que tienen, incluyen, o comprenden componentes específicos, o donde los procesos y métodos se describen como que tienen, incluyen, o comprenden pasos específicos, se contempla que, además, existen composiciones de la presente invención que consisten esencialmente en, o consisten en los componentes enumerados, y que existen procesos y métodos de acuerdo con la presente invención que consisten esencialmente en, o consisten en, los pasos de procesamiento enumerados.
En la solicitud, cuando se dice que un elemento o componente se incluye y/o selecciona de una lista de elementos o componentes enumerados, debe entenderse que el elemento o componente puede ser cualquiera de los elementos o componentes enumerados, o bien, el elemento o componente se puede seleccionar de un grupo formado por dos o más elementos o componentes enumerados.
Además, debe entenderse que los elementos y/o características de una composición o un método descrito en la presente pueden combinarse de diversas maneras sin apartarse del espíritu y el alcance de la presente invención, ya sea de manera explícita o implícita en la presente. Por ejemplo, cuando se hace referencia a un compuesto en particular, dicho compuesto puede utilizarse en diversas realizaciones de composiciones de la presente invención y/o en métodos de la presente invención, a menos que se entienda lo contrario en el contexto. En otras palabras, dentro de esta aplicación, las realizaciones han sido descritas y representadas de una manera que permite escribir y dibujar una aplicación clara y concisa, pero se pretende y se entenderá que las realizaciones puedan combinarse o separarse de diversas formas sin separarse de las enseñanzas e inventos actuales. Por ejemplo, se entenderá que todas las características descritas y representadas en la presente pueden ser aplicables a todos los aspectos de la invención o invenciones descritas y representadas en la presente.
Debe entenderse que la expresión “al menos uno de” incluye individualmente cada uno de los objetos enumerados después de la expresión y las diversas combinaciones de dos o más de los objetos enumerados a menos que se entienda lo contrario a partir del contexto y el uso. Debe entenderse que la expresión “y/o” en relación con tres o más objetos enumerados tiene el mismo significado a menos que se entienda lo contrario a partir del contexto.
El uso del término “ incluir”, “ incluye, “ incluyendo”, “tener”, “tiene”, “contener”, “contiene”, o “conteniendo”, incluyendo equivalentes gramaticales de los mismos, debe entenderse generalmente como abierto y no limitativo, por ejemplo, sin excluir elementos o pasos adicionales no recitados, a menos que se indique específicamente o se entienda lo contrario a partir del contexto.
Cuando el uso del término “aproximadamente” sea anterior a un valor cuantitativo, la presente invención también incluye el valor cuantitativo específico en sí, a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se utiliza en la presente, el término “aproximadamente” se refiere a una variación de ±10 % del valor nominal a menos que se indique lo contrario o se deduzca.
Debe entenderse que el orden de los pasos o el orden para llevar a cabo ciertas acciones es inmaterial, siempre y cuando la presente invención permanezca operativa. Además, se pueden llevar a cabo dos o más pasos o acciones simultáneamente.
El uso de cualquier y todos los ejemplos, o lenguaje que denota ejemplo, por ejemplo, “tal como” o “que incluye/incluyendo”, tiene la intención meramente de ilustrar mejor la presente invención y no representa una limitación en el alcance de la invención a menos que se reclame lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse en el sentido de que indica que algún elemento no reclamado es esencial para la práctica de la presente invención.
Ejemplos
La invención que ahora se describe de manera general, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no tiene la intención de limitar la invención.
Ejemplo 1 - Vectores AAV y rAAV producidos a partir de los vectores
Vector de AAV
Este ejemplo describe la construcción de un vector AAV con la secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO:1, delimitada por dos repeticiones terminales invertidas AAV2 (ITR, SEQ ID NO:2). SEQ ID NO:1 representa el ADNc para el ATP7B humano nativo con deleción de MBD 1-3. Los nucleótidos 223-225 en la SEQ ID NO:1 codifican residuos de serina, S340 y los nucleótidos 226-228 en la SEQ ID NO:1 codifican residuos de serina, S341 (numeración basada en la secuencia de proteínas ATP7B de longitud completa de tipo silvestre).
Como se ilustra en laFIGURA 1,dentro del vector AAV, el casete de expresión ATP7B contiene un potenciador (EnTTR), un promotor (TTR), un intrón (intrón T pequeño SV40), la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1, que codifica un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS), y una señal poli (A) SV40. Un mapa circular del vector que ilustra varios componentes se muestra en laFIGURA 2.
El vector AAV DTC319 contiene una secuencia de ATP7B humano truncado en la que se conservan los dominios 4, 5 y 6 de unión a metales. La secuencia de ATP7B humano truncado codifica una proteína que comprende dos residuos de serina S340 y S341 (numerados de acuerdo con la Secuencia de Referencia NCBI: NP_000044.2) representado por la SEQ ID NO:8.
La señal de poliadenilación tardía del virus símico 40 (SV40) (No. de Acceso Genbank J02400 (SEQ ID NO:7) proporciona una secuenciacispara la poliadenilación eficiente del ARNm ATP7B. Este elemento funciona como una señal para un evento de escisión específico en el extremo 3' de la transcripción naciente y la adición de una larga cola de poliadenilo.
Cada casete de expresión ATP7B truncada fue clonado en un vector AAV. Todos los vectores AAV tenían una cadena principal que codificaba el gen de resistencia a la kanamicina. Un vector AAV ejemplar DTC319 se ilustra en laFIGURA 2. La FIGURA 1representa la expresión casete de DTC319, para expresar ATP7B (ATP7B A1-3-SS).
Viriones rAAV
El genoma vectorial AAV es un genoma de ADN de cadena única. Sólo las secuencias entre e inclusivas de las secuencias ITR se empaquetan en el virion AAV. Los viriones fueron producidos por transfección de tres plásmidos en células del riñón embrionario humano 293 (HEK293), que proporcionan productos de los genes E1a y E1b. El primer plásmido puede ser un vector AAV descrito en la presente. El segundo plásmido puede ser un plásmido de empaque que contiene los genes de caperuza AAV2 rep y AAV8 o AAV9 de tipo silvestre. El tercer plásmido es un plásmido auxiliar de adenovirus.
La ilustración de un plásmido de empaque ejemplar, pAAV2/8.KanR (p2123FH), se muestra en laFIGURA 3.En este plásmido, el Rep/Cap adenoasociado pAAV2/8.KanR(p2123FH) (8354 pb) codifica las cuatro proteínas de replicación viral AAV2 tipo silvestre (Rep) y las tres proteínas de cápside VP (cap) tipo silvestre del serotipo 8. Dentro del plásmido, el promotor AAV p5 que normalmente impulsa la expresión del gen Rep se ha movido desde el extremo 5' de la región Rep al extremo 3' de la región Cap AAV8. Esta disposición introduce un espaciador entre el promotor y el gen Rep (es decir, la cadena principal del plásmido) que da como resultado una regulación a la baja de la expresión de Rep y un aumento en la capacidad de soportar la producción de rAAV de alto título. El gen para la resistencia a la kanamicina y el origen MB1 se incluyen para la producción de plásmido enE. coli.
La ilustración de un plásmido auxiliar ejemplar, pAdDeltaF6 (KAN), se muestra en laFIGURA 4.En este plásmido, se proporcionan regiones del genoma de adenovirus que son importantes para la replicación de AAV, específicamente, E2A, E4 y ARN VA. Las funciones de adenovirus E1 también son necesarias, pero son proporcionadas por las células hospederas HEK293. El plásmido mostrado en laFIGURA 4no contiene otra replicación de adenovirus, genes estructurales, o los elementos cis críticos para la replicación de adenovirus, tal como ITR adenovirales, y, por lo tanto, no se espera que se genere adenovirus infeccioso. El gen para la resistencia a la kanamicina y el origen MB1 se incluyen para la producción de plásmido enE. coli.
Ejemplo 2 - La deleción de dominios de unión a metales (MBD) 1-3 en ATP7B humano mejora el rendimiento de fabricación
Este ejemplo describe experimentos, que demostraron que ATP7B A1-3-SS tenía mayor rendimiento que el ATP7B de longitud completa o la forma truncada ATP7B A1-4.
La falta de ATP7B funcional da lugar a la acumulación de cobre en el hígado y otros tejidos, que se manifiesta como enfermedad hepática con síntomas neurológicos o psiquiátricos. La WD puede tratarse reduciendo la absorción de cobre o eliminando el exceso de cobre del cuerpo. Los ratones C3He-Atp7btx-j no expresan ATP7B funcional y, por lo tanto, actúan como un modelo de ratón para WD. Se utilizaron vectores AAV que contenían la secuencia de ATP7B humano de longitud completa optimizado para codones para transfeccionar células HEK293 con el plásmido Rep/Cap, que codifica cuatro proteínas de replicación viral AAV2 (Rep) de tipo silvestre y las tres proteínas de la cápside (cap) AAV de tipo silvestre, del serotipo 8 y el plásmido auxiliar para obtener partículas del virus ATP7BFL.
Los ratones machos C3He-Atp7btx-j fueron inyectados por vía intravenosa(i.v.)con 1010 o 1011 GC/kg de ATP7BcoFL (ATP7B humano de longitud completa que ha sido optimizado para codones). Los ratones hembras C3He-Atp7btx-j fueron inyectadosi.v.con 109, 1010, o 1011 GC/kg del mismo vector. Los niveles de cobre hepático en machos (denotados por cuadrados) y hembras (denotados por círculos) se evaluaron mediante espectrometría de masa plasmática acoplada inductivamente (ICP-MS), y se compararon con los niveles de cobre de ratones heterocigotos (Het) machos y hembras no inyectados y ratones CC3He-Atp7btx-j. Los ratones se sometieron a necropsia aproximadamente a los 9 meses de edad y se recolectó el hígado. Los datos se presentan en laFIGURA 5.
La terapia génica que utiliza vectores AAV se puede utilizar para tratar la WD. Sin embargo, hay un límite para el tamaño del ADNc que se puede empaquetar dentro de una cápside de vector AAV. El genoma AAV de tipo silvestre es de 4,7 kb, y el empaque de genomas más grandes puede reducir potencialmente el rendimiento y la integridad de la secuencia de ADN encapsulada dentro de la cápside a Av . Por lo tanto, la codificación de secuencia de nucleótidos ATP7B A1-3-SS se empaquetó dentro de la cápside AAV8, y se probó el rendimiento de fabricación de ATP7B A1-3-SS. Los vectores AAV que codifican tanto el ATP7B humano de longitud completa (FL) como el ATP7B humano con deleción de MBD 1-3, pero el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 está presente (ATP7B A1-3-SS), o ATP7B humano con deleción de MBD 1-4 (ATP7B a 1-4) se transfectaron en células HEK293. El plásmido Rep/Cap, que codifica cuatro proteínas de replicación viral AAV2 (Rep) de tipo silvestre y las tres proteínas de la cápside VP (cap) de tipo silvestre del serotipo 8, y el plásmido auxiliar fueron co-transfectados con los vectores AAV que expresan varias proteínas ATP7B.La FIGURA 6es un gráfico de barras que muestra los títulos de rAAV producidos a partir de células hospederas después de la transfección de varios vectores AAV. El eje Y indica el rendimiento total de cada título de rAAV en copias genómicas (GC). Los datos muestran que ATP7B A1-3-SS tuvo mayor rendimiento que la forma de longitud completa o la forma truncada ATP7B A1-4.
Ejemplo 3 - ATP7B A1-3-SS es más eficaz en la restauración del metabolismo del cobre en comparación con ATP7B FL
Este ejemplo describe un experimento, que demostró que ATP7B A1-3-SS fue más eficaz que ATP7B de longitud completa (ATP7B FL) o ATP7B A1-4, en la restauración del metabolismo del cobre en ratones C3He-Atp7btx'j.
Como se describió anteriormente en elEjemplo 2,empaquetar una secuencia de ADNc voluminosa dentro de una cápside de vector AAV puede reducir la integridad de la secuencia de ADN y tener posibles problemas de calidad. Por lo tanto, las versiones truncadas de ATP7B humano se empaquetaron dentro de la cápside AAV8 y se probó su eficacia en la restauración del metabolismo del cobre. Se administraron 1,0 x 1013 GC/kg de vector AAV8 que abarca tanto ATP7B de longitud completa como ATP7B humano truncado a ratones C3He-Atp7btx_j. Los niveles de cobre en el hígado y la orina se evaluaron mediante espectrometría de masa plasmática acoplada inductivamente.La FIGURA 7es un diagrama de dispersión de los niveles de cobre en orina e hígado, cuadrados y círculos, respectivamente (pg/g), evaluado después de que se inyectaran ratones C3He-Atp7btx'j con AAV8 que transportaban ATP7B humano de longitud completa (ATP7B FL), At P7B A1-3-SS, o ATP7B A1-4.La FIGURA 7muestra que ATP7B A1-3-SS es más eficaz que ATP7B de longitud completa (ATP7B FL) o ATP7B A1-4, en la restauración del metabolismo del cobre en ratones C3He-Atp7btx'j. Los ratones C3He-Atp7btx'j que recibieron disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) actuaron como controles (vehículo).
Ejemplo 4 - El vector AAV que comprende la cápside AAV9 mostró una mayor producción viral
Este ejemplo describe un experimento que mostró que la producción de un vector AAV que comprende la cápside AAV9 genera un rendimiento más alto en comparación con la producción de un vector AAV que comprende la cápside AAV8. Diferentes vectores de AAV fueron titulados por qPCR cuantificando partículas resistentes a la DNasa (DRP).La FIGURA 8muestra el rendimiento total de rAAV (títulos en copias de genoma (GC)) producidos a partir de células hospederas después de la transfección de un vector AAV (DTC319) que codifica un ATP7B humano truncado, con deleción de los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 está presente, y cotransfectado con un plásmido que codifica ya sea la cápside AAV8 o la cápside AAV9.
Ejemplo 5 - Propiedades terapéuticas de ATP7B A1-3-SS
Este ejemplo describe estudios en animales, que demostraron la eficacia de ATP7B A1-3-SS (por ejemplo, DTC319, un vector rAAV que codifica un ATP7B humano truncado, econ deleción de los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre M BD3 y MBD4 está presente) en la mejora de los síntomas y el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD) en un modelo de ratón (C3He-ATP7Btx'j). En este ejemplo, se evaluaron tres grupos de ratones machos: Los ratones WD (ratones C3He-ATP7Btx-j) recibieron una infusión AAV de ATP7B A1-3-SS (por ejemplo, DTC319) codificada en un vector AAV8 o una inyección intravenosa de control de vehículo (disolución amortiguadora de dilución), y los ratones de tipo silvestre (WT), que actuaron como control negativo. Para la infusión, el rAAV fue producido por transfección transitoria triple de células adherentes de HEK y purificado por ultracentrifugación por gradiente de cloruro de cesio, un método de purificación bien conocido en la técnica. En el criterio de valoración del estudio, 4 semanas después de la infusión, se evaluaron ratones de cada grupo para la acumulación de cobre hepático, actividad de ceruloplasmina y patología hepática.
La acumulación de cobre hepático se midió mediante espectrometría de masa plasmática acoplada inductivamente (ICP-MS), y demostró que el nivel de cobre hepático se redujo significativamente en ratones WD a los que se administró ATP7B A1-3-SS (por ejemplo, DTC319) (véase, laFIGURA 9,barra para DelA), en comparación con el control de vehículo.La FIGURA 9muestra niveles de acumulación de cobre hepático (pg/g) en ratones C3He-Atp7btx'j después de recibir una inyección intravenosa de un control de vehículo (disolución amortiguadora de dilución, barra para WD) o una infusión de a AV8 que transporta ATP7B A1-3-SS nativo (barra para DelA). Los niveles de acumulación de cobre en el hígado en ratones de tipo silvestre (WT) no inyectados representados en el gráfico de barras actuaron como un control negativo. Valores expresados como media±EEM.
La actividad de ceruloplasmina aumentó significativamente en ratones con WD después de recibir ATP7B A1-3-SS (por ejemplo, DTC319) (véase, laFIGURA 10,barra para DelA). La actividad de la ceruloplasmina se detectó mediante un ensayo de actividad colorimétrica basado en reacciones enzimáticas, bien conocido en la técnica (véase, Schosinsky et. Al., Clin Chem. 1974;20(12):1556-63).La FIGURA 10muestra actividad de ceruloplasmina en ratones C3He-Atp7btx'j después de recibir una inyección intravenosa de un control de vehículo (disolución amortiguadora de dilución, barra para WD) o una infusión de AAV de ATP7B A1-3-SS codificado en un vector AAV8 (barra para DelA), según lo medido mediante un ensayo de actividad colorimétrica basado en reacciones enzimáticas. La actividad de la ceruloplasmina en ratones de tipo silvestre (WT) no inyectados, medida por el mismo ensayo de actividad colorimétrica basado en reacciones enzimáticas, también se representa en el gráfico de barras. El gráfico muestra la actividad de ceruloplasmina medida en densidad óptica, OD como leído a 540 nm. Valores expresados como media±EEM.
Se recolectó el hígado de todos los animales de cada grupo y se tiñó con H&E (tinción de hematoxilina y eosina). Los portaobjetos de H&E fueron evaluados por un patólogo certificado por la junta con respecto a la ampliación nuclear y la hipertrofia hepatocelular, la desorganización, el infiltrado inflamatorio y la necrosis hepatocelular de acuerdo con el sistema de puntaje de 0-4. El puntaje de cada ratón en un grupo se promedió.La FIGURA 11muestra el puntaje promedio obtenido después de la valoración estándar de los portaobjetos H&E para los animales de cada grupo.
Ejemplo 6 - Terapia génica AAV9 como una terapia viable para la enfermedad de Wilson (WD)
Este ejemplo describe el uso de partículas de rAAV que comprenden ATP7B A1-3-SS en el tratamiento de la WD en un sujeto. Un vector AAV que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un ATP7B humano truncado (ATP7B A1-3-SS), por ejemplo, DTC319 (FIGURA 2), un plásmido Rep/Cap, que codifica cuatro proteínas de replicación viral AAV2 de tipo silvestre (Rep) y las tres proteínas de la cápside AAV VP de tipo silvestre (cap) del serotipo 9 (AAV9), y un plásmido auxiliar, como se describe en elEjemplo 1, se transfectan en una célula hospedera. Las partículas de rAAV recolectadas se administran por vía intravenosa a un sujeto que necesita terapia para WD. Alternativamente, a un sujeto se le administran partículas de rAAV que se recolectan de la célula hospedera transfectada con vector representado por laFIGURA 12,para tratar WD.
Claims (15)
1. Un virus adenoasociado recombinante (rAAV), en donde dicho AAV comprende una cápside AAV y un genoma vectorial empaquetado en el mismo, en donde dicho genoma vectorial comprende:
a. una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) AAV 5';
b. una secuencia de promotor;
c. una secuencia de ácido nucleico que codifica una ATPasa 2 truncada que transporta cobre humana (ATP7B) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 8, en donde dicho ATP7B truncado carece de los dominios de unión a metales (MBD) 1-3; y
d. una secuencia de ITR 3' AAV.
2. El rAAV de conformidad con la reivindicación 1, en donde la cápside AAV es de un AAV de serotipo 9, 8, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, rh10, o hu37.
3. El rAAV de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de promotor se selecciona de una secuencia de promotor de transtiretina (TTR), una secuencia de promotor de p-actina de pollo (CBA), una secuencia de promotor de gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), una secuencia de promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG), una secuencia de promotor de alfa-1 anti-tripsina (A1AT), y una secuencia de promotor de CAG.
4. El rAAV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la secuencia de ITR 5' AAV es de AAV2; la secuencia de ITR 3' AAV es de AAV2; la secuencia de ITR 5' AAV y la secuencia de ITR 3' AAV son de AAV2; o la secuencia de ITR 5' AAV y/o la secuencia de ITR 3' AAV son de una fuente no AAV2.
5. El rAAV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el genoma empaquetado comprende además una o más secuencias de potenciador, opcionalmente en donde se selecciona una o más secuencias de potenciador de transtiretina (enTTR), una secuencia de potenciador de gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), una secuencia de potenciador de p-actina de pollo (CBA), una secuencia de potenciador En34 y una secuencia de potenciador de apolipoproteína (ApoE).
6. El rAAV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el genoma empaquetado comprende además una o más secuencias de intrón, opcionalmente en donde se selecciona una o más secuencias de intrón de una secuencia de intrón T pequeño SV40, una secuencia de intrón de subunidad beta de hemoglobina de conejo (rHBB), una secuencia de intrón de beta globina humana IVS2, una secuencia de intrón quimérico de p-globina/IgG y una secuencia de intrón hFIX.
7. El rAAV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el genoma empaquetado comprende además una secuencia de señal de poliadenilación, opcionalmente en donde la secuencia de señal de poliadenilación se selecciona de una secuencia de señal de poliadenilación SV40, una secuencia de señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (BGH), y una secuencia de señal de poliadenilación de la beta globina de conejo.
8. El rAAV de conformidad con la reivindicación 1 que comprende una cápside AAV y un genoma vectorial empaquetado en él, en donde dicho genoma vectorial comprende:
a. una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) AAV 5' de SEQ ID NO:2;
b. una secuencia de potenciador de la SEQ ID NO:3;
c. una secuencia de promotor de la SEQ ID NO: 12;
d. una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 15, que codifica una ATPasa 2 truncada que transporta cobre humana (ATP7B); y
e. una ITR 3' AAV de la SEQ ID NO:2.
9. Una composición que comprende el rAAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y un portador farmacéuticamente aceptable.
10. El rAAV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición de conformidad con la reivindicación 9 para usarse en un método de tratamiento de la enfermedad de Wilson en un sujeto humano, en donde el método comprende administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente eficaz del rAAV o la composición.
11. El rAAV o composición para usarse de conformidad con la reivindicación 10, en donde el rAAV o la composición se administra por vía subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o intravenosa.
12. El rAAV o composición para usarse de conformidad con la reivindicación 10 u 11, en donde el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1011 a aproximadamente 1 x 1014 copias del genoma (GC)/kg.
13. El rAAV o composición para usarse de conformidad con la reivindicación 12, en donde el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1012 a aproximadamente 1 x 1013 GC/kg.
14. El rAAV o composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en donde la administración del rAAV comprende la administración de una dosis única de rAAV.
15. El rAAV o composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en donde la administración del rAAV comprende la administración de múltiples dosis de rAAV.
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