BR112020020223A2 - Sorotipo de vírus adeno-associado híbrido recombinante entre aav9 e aavrh74 com tropismo pelo fígado reduzido - Google Patents

Sorotipo de vírus adeno-associado híbrido recombinante entre aav9 e aavrh74 com tropismo pelo fígado reduzido Download PDF

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Evelyne Gicquel
Frederico Mingozzi
Giuseppe Ronzitti
Patrice Vidal
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Abstract

sorotipo de vírus adeno-associado híbrido recombinante entre aav9 e aavrh74 com tropismo pelo fígado reduzido. a invenção se refere a uma proteína do capsídeo de vírus adeno-associado (aav) recombinante, que é um híbrido entre as proteínas de capsídeo de aav do sorotipo 9 (aav9) e de aav do sorotipo 74 (aavrh74), em que a referida proteína de capsídeo de aav híbrida recombinante possui um tropismo pelo fígado reduzido em comparação com as proteínas do capsídeo de aavrh74 e aav9 precursoras. a invenção se refere também às partículas derivadas de vetor do sorotipo de aav híbrida que empacota um gene de interesse e seu uso em terapia gênica, particularmente para o tratamento de doenças genéticas neuromusculares.

Description

SOROTIPO DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADO HÍBRIDO RECOMBINANTE ENTRE AAV9 E AAVrh74 COM TROPISMO PELO FÍGADO REDUZIDO
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a um capsídeo de vírus adeno- associado (AAV) recombinante, que é um híbrido entre as proteínas de capsídeo de AAV do sorotipo 9 (AAV9) e de AAV do sorotipo rh74 (AAVrh74) possuindo um tropismo pelo fígado reduzido em comparação com as proteínas de capsídeo de AAVrh74 e AAV9 precursoras. A invenção se refere também às partículas derivadas de vetor do sorotipo de AAV híbrida empacotando um gene de interesse e seu uso em terapia gênica, particularmente para o tratamento de doenças genéticas neuromusculares.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Os vetores do vírus adeno-associado recombinante (AAVr) são amplamente usados para a transferência de genes in vivo. Os vetores AAVr são vetores não envelopados compostos por um capsídeo de 20 nm de diâmetro e um DNA de cadeia simples de 4,7 kb. O genoma transporta dois genes, rep e cap, flanqueados por duas regiões palindrômicas denominadas Repetições Terminais Invertidas (RTI). O gene cap codifica três proteínas estruturais VP1, VP2 e VP3 que compõem o capsídeo de AAV. VP1, VP2 e VP3 compartilham a mesma extremidade C-terminal que é toda de VP3. O uso de AAV2 possui uma referência, VP1 possui uma sequência de 735 aminoácidos (GenBank YP_680426); VP2 (598 aminoácidos) começa na Treonina 138 (T138) e VP3 (533 aminoácidos) começa na metionina 203 (M203). Os sorotipos de AAV são definidos por seu capsídeo. Existem sorotipos diferentes, cada um deles exibindo sua própria especificidade de direcionamento de tecido. Portanto, a escolha do uso de um sorotipo depende do tecido a ser transduzido. Os tecidos musculares esquelético e hepático são infectados e transduzidos de forma eficiente por diferentes sorotipos de vetores de AAV, como AAV8, AAV9 e AAV-rh74.
[003] Os sorotipos de AAV quiméricos ou híbridos foram gerados trocando fragmentos de sequências de capsídeo entre capsídeos de diferentes sorotipos de AAV de ocorrência natural, a fim de aumentar a eficiência de transdução de AAV ou aumentar o tropismo de AAV para uma célula ou um tipo de tecido de interesse.
[004] Os capsídeos de AAV híbridos foram gerados por meio da combinação de domínios estruturais de capsídeos do sorotipo AAV8 e AAV isolados de cérebro de primata. Os sorotipos de AAV híbridos resultantes podem transduzir o tecido da retina em humanos e camundongos sem aumento em eficiência em comparação com os vetores AAV2 e AAV5 (Charbel Issa et al., PLOS ONE, 2013, 8, e60361). No entanto, um dos sorotipos AAV híbrido mostra eficiência de transdução aprimorada para o tecido adiposo em comparação com AAV1, AAV8 e AAV9 (Liu et al., Molecular Therapy, 2014, 1, 8, doi:10. 1038/mtm). O documento WO 2015/191508 revela capsídeos de AAV híbridos recombinantes gerados por meio de troca de regiões variáveis dos capsídeos de AAV de várias espécies (humano, primata, ave, cobra, bovino.), particularmente capsídeos de AAV com tropismo pelo sistema nervoso central para gerar capsídeos quiméricos específicos do SNC.
[005] O documento WO 2017/096164 revela capsídeos de AAV híbridos recombinantes entre os sorotipos AAV1, AAV2, AAV3b, AAV6 e AAV8 exibindo tropismo aumentado pelo músculo esquelético humano. No entanto, todos os sorotipos e variantes de AAV de ocorrência natural testados até o momento possuem uma propensão a se acumular no fígado. Isso provoca problemas, particularmente quando o vetor de AAV é administrado por via sistêmica. Em primeiro lugar, um transgene destinado a ser expresso no músculo pode ter efeitos tóxicos no fígado. Em segundo lugar, a entrada do vetor de AAV no fígado reduz a quantidade de vetor disponível para os músculos esqueléticos. Consequentemente, doses mais altas de vetores de AAV são necessárias. Isso aumenta a toxicidade no fígado e o custo de produção do vetor.
[006] Promotores específicos de tecido e estratégias de regulação gênica baseadas em microRNA têm sido usados para segregar padrões de expressão gênica entre diferentes tipos de tecido. No entanto, tais estratégias regulatórias não impedem o sequestro de genomas de vetores de AAV em órgãos fora do alvo, como o fígado, após a administração sistêmica.
[007] A atenuação da ligação da heparina por mutação dos resíduos básicos R585 ou R588 da proteína de capsídeo demonstrou abolir a ligação do sulfato de heparina e reduzir o tropismo pelo fígado de vetores derivados de AAV2 (Asokan et al., Nat. Biotechnol., 2010, 28, 79-82). No entanto, essa estratégia só pode funcionar para sorotipos como AAV2 e AAV6 cujo tropismo pelo fígado é determinado pela ligação de resíduos básicos à heparina.
[008] Portanto, há uma necessidade de novos vetores de AAV, com um tropismo pelo fígado que é muito inferior ao tropismo muscular. Além disso, novos vetores que pudessem infectar os músculos de forma eficiente, mas não infectassem o fígado nem o cérebro, seriam ainda mais desejáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] Os inventores geraram novos sorotipos de AAV híbridos usando uma combinação de dois sorotipos que infectam eficientemente os tecidos muscular e hepático, AAV9 e AAV-rh74. Dois novos sorotipos de AAV híbridos foram gerados usando a troca de uma região variável do gene cap entre os sorotipos AAV9 e AAVrh74 ( - Figura 1A e 1B). Surpreendentemente, o tropismo pelo fígado do precursor AAV9 e AAVrh74 foi perdido no sorotipo de AAV híbrido (Figura 4C e 4D). Ao mesmo tempo, o sorotipo de AAV híbrido exibiu produção do vetor de AAV de alto título e eficiências de transdução de gene de alto nível em tecidos musculares esquelético e cardíaco.
[0010] Os novos sorotipos de AAV híbridos são úteis na terapia gênica de distúrbios neuromusculares, incluindo doenças genéticas, doenças autoimunes, doenças neurodegenerativas e câncer.
[0011] Portanto, a invenção abrange um capsídeo de AAV híbrido recombinante entre os capsídeos de AAV9 e AAVrh74 com tropismo pelo fígado reduzido, partículas de vetor de AAV compreendendo o capsídeo de AAV recombinante híbrido, composições compreendendo as partículas de vetor de sorotipo de AAV híbrido e métodos para fabricar e usar as referidas partículas e composições de vetor de sorotipo de AAV híbrido, particularmente em terapia gênica.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Proteína de capsídeo de AAV híbrida recombinante
[0012] A invenção se refere a uma proteína de capsídeo de vírus adeno- associado (AAV) recombinante, que é um híbrido entre as proteínas de capsídeo de AAV do sorotipo 9 (AAV9) e AAV do sorotipo 74 (AAVrh74), em que a referida proteína de capsídeo de AAV híbrida recombinante possui tropismo pelo fígado reduzido em comparação com suas proteínas de capsídeo do AAV9 e AAVrh74 precursoras.
[0013] Conforme usado na presente invenção, o termo “tropismo” se refere à especificidade de uma proteína de capsídeo de AAV presente em uma partícula viral de AAV, para infectar um tipo específico de célula ou tecido.
[0014] O tropismo de um capsídeo de AAV para um tipo específico de célula ou tecido pode ser determinado ao medir a capacidade das partículas de vetor de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV híbrida para infectar ou transduzir um tipo específico de célula ou tecido, usando ensaios padrão que são bem conhecidos no estado da técnica, tais como aqueles divulgados nos exemplos do presente pedido.
[0015] Como usado na presente invenção, o termo “tropismo pelo fígado” ou “tropismo hepático” refere-se ao tropismo para o fígado ou tecido e células hepáticas, incluindo hepatócitos.
[0016] De acordo com a invenção, o tropismo pelo fígado da proteína de capsídeo de AAV híbrida é reduzido por pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou mais; preferencialmente pelo menos 50%, 60% 70%, 80%, 90% ou 99% em comparação com o tropismo pelo fígado da proteína de capsídeo deAAV9 ou AAVrh74 precursora.
[0017] De acordo com a invenção, a proteína de capsídeo de AAV híbrida possui tropismo para células e tecidos musculares.
[0018] Os tecidos musculares incluem particularmente os tecidos do músculo cardíaco e esquelético.
[0019] Como usado na presente invenção, o termo “células musculares” refere-se à miócitos, miotubos, mioblastos e/ou células satélites.
[0020] Em algumas modalidades, o tropismo muscular da proteína de capsídeo de AAV híbrida é semelhante ao de suas proteínas de capsídeo de AAV9 e/ou de AAVrh74 precursoras. Preferencialmente, o tropismo muscular da proteína de capsídeo de AAV híbrida é equivalente a pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou mais daquela proteína de capsídeo de AAV9 ou AAVrh74 precursora.
[0021] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de AAV híbrida é uma proteína VP1, VP2 ou VP3 híbrida.
[0022] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de AAV híbrida possui pelo menos tropismo pelo tecido muscular esquelético. Em algumas modalidades preferenciais, a proteína de capsídeo de AAV híbrida possui tropismo pelos tecidos muscular esquelético e cardíaco. Um exemplo deste tipo de híbrido é o capsídeo de AAV híbrido da SEQ ID NO: 3 (denominado Cap9-rh74 Híbrido nos exemplos). Esse tipo de capsídeo de AAV híbrido é útil para o tratamento de distúrbios do músculo cardíaco e esquelético.
[0023] A proteína de capsídeo de AAV híbrida de acordo com a invenção pode ser derivada a partir de quaisquer sequências de proteína de capsídeo de AAV9 e AAVrh74; tais sequências são bem conhecidas no estado técnica e estão disponíveis em base de dados de sequência pública. Por exemplo, a proteína de capsídeo AAV9 corresponde aos números de acesso do GenBank: AY530579. 1; à SEQ ID NO: 123 do WO 2005/033321; à SEQ ID NO: 1 do WO 2012/112832; variantes de capsídeo AAV9 nos quais um ou mais dos resíduos nativos nas posições 271 (D), 446 (Y) e 470 (N) são substituídos por outro aminoácido, preferencialmente alanina como divulgado no pedido WO 2012/112832; variantes de capsídeo AAV9 em uma ou mais dentre as posições K143R, T251A, S499A, S669A e S490A conforme divulgado no pedido US 2014/0162319. A proteína de capsídeo AAVrh74 corresponde à SEQ ID NO: 1 do WO 2015/013313; à SEQ ID NO: 6 do WO 2006/110689; à SEQ ID NO: 1 do WO 2013/123503; à SEQ ID NO: 4 do documento WO 2013/158879; e variantes de K137R, K333R, K550R, K552R, K569R, K691R, K695R, K709R e combinações dos mesmos.
[0024] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de AAV híbrida de acordo com a invenção é derivada da proteína de capsídeo AAV9 da SEQ ID NO: 1 (GenBank AY530579. 1) e da proteína AAVrh74 da SEQ ID NO: 2.
[0025] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de AAV híbrida de acordo com a invenção resulta a partir da substituição de uma região variável na sequência de capsídeo de AAV9 ou AAVrh74 com a região variável correspondente da outra sequência de capsídeo do sorotipo de AAV, em que a região variável do capsídeo de AAV9 corresponde à sequência situada a partir de qualquer uma das posições 331 a 493 a qualquer uma das posições 556 a 736 no capsídeo de AAV9 da SEQ ID NO: 1 (sequência de referência) ou em um fragmento de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 aminoácidos consecutivos da sequência situada a partir das posições 493 a 556 no capsídeo de AAV9 da SEQ ID NO: 1, e a região variável do capsídeo de AAVrh74 corresponde à sequência situada a partir de qualquer uma das posições 332 a 495 a qualquer uma das posições 558 a 738 no capsídeo de AAVrh74 da SEQ ID NO: 2 (sequência de referência), ou em um fragmento de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 aminoácidos consecutivos da sequência situada a partir das posições 495 a 558 no capsídeo de AAVrh74 da SEQ ID NO: 2.
[0026] A invenção abrange as proteínas de capsídeo de AAV híbrido recombinante a partir de quaisquer sequências de proteína de capsídeo de AAV9 e AAVrh74 por substituição de uma região de cadeia variável na sequência de capsídeo de AAV9 ou de AAVrh74 com a região variável correspondente da outra sequência de capsídeo do sorotipo de AAV, como definido acima. De acordo com a invenção, a região variável é definida usando o capsídeo de AAV9 da SEQ ID NO: 1 e o capsídeo de AAVrh74 da SEQ ID NO: 2 como referência. Após o alinhamento de sequência de qualquer outra sequência de capsídeo de AAV9 com a SEQ ID NO: 1 ou qualquer outra sequência de capsídeo de AAVrh74 com a SEQ ID NO: 2, usando programas de alinhamento de sequência de proteínas padrão que são bem conhecidos no estado da técnica, como por exemplo BLAST, FASTA, CLUSTALW e semelhantes, um técnico no assunto pode obter facilmente as posições correspondentes da região variável em outras sequências de capsídeo de AAV9 ou de AAVrh74.
[0027] Em algumas modalidades preferenciais, a proteína de capsídeo de AAV híbrida de acordo com a invenção resulta a partir da substituição da região variável correspondente àquela situada nas posições 449 a 609 na sequência de capsídeo de AAV9 da SEQ ID NO: 1 ou a partir das posições 450 a 611 na sequência de capsídeo de AAVrh74 da SEQ ID NO: 2 com a região variável correspondente do outro sorotipo.
[0028] Em algumas modalidades, a referida proteína de capsídeo de AAV híbrida compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências da SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, as sequências tendo pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98 % ou 99% de identidade com as referidas sequências e o fragmento das mesmas correspondendo à proteína de capsídeo VP2 ou VP3. VP2 corresponde à sequência de aminoácidos a partir de T138 ao final da SEQ ID NO: 3 ou 4. VP3 corresponde à sequência de aminoácidos a partir de M203 ao final da SEQ ID NO: 3 ou a partir de M204 ao final da SEQ ID NO: 4.
[0029] A SEQ ID NO: 3 é derivada a partir da proteína de capsídeo de AAV9 da SEQ ID NO: 1 por substituição da região variável de AAV9 (posições 449 a 609 da SEQ ID NO: 1) com a região variável da proteína de capsídeo de AAVrh74 (posições 450 a 611 da SEQ ID NO: 2); o híbrido correspondente é denominado Cap9-rh74 Híbrido nos exemplos. VP2 corresponde à sequência de aminoácidos a partir de T138 ao final da SEQ ID NO: 3. VP3 corresponde à sequência de aminoácidos a partir de M203 ao final da SEQ ID NO: 3.
[0030] A SEQ ID NO: 4 é derivada a partir da proteína de capsídeo de AAVrh74 da SEQ ID NO: 2 por substituição da região variável de rh74 (posições 450 a 611 da SEQ ID NO: 2) com a região variável da proteína de capsídeo de AAV9 (posições 449 a 609 da SEQ ID NO: 1); o híbrido correspondente é denominado Caprh74-9 Híbrido nos exemplos. VP2 corresponde à sequência de aminoácidos a partir de T138 ao final da SEQ ID NO: 4. VP3 corresponde à sequência de aminoácidos a partir de M204 ao final da SEQ ID NO: 4.
[0031] Em algumas modalidades preferenciais, a proteína de capsídeo de AAV híbrida de acordo com a invenção é derivada a partir da proteína de capsídeo de AAV9 por substituição de uma região variável da sequência de capsídeo de AAV9 com a região variável correspondente da sequência de capsídeo de AAVrh74 como definido acima, preferencialmente a proteína de capsídeo de AAV híbrida compreende a substituição da região variável correspondente àquela situada a partir das posições 449 a 609 no capsídeo de AAV9 da SEQ ID NO: 1 com região variável correspondente àquela situada a partir das posições 450 a 611 no capsídeo de AAVrh74 da SEQ ID NO: 2. Preferencialmente, a referida proteína de capsídeo de AAV híbrida compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste na sequência da SEQ ID NO: 3 e as sequências tendo pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98 % ou 99% de identidade com a referida sequência; mais preferencialmente que compreende a sequência da SEQ ID NO: 3.
[0032] O termo “identidade” refere-se à semelhança de sequência entre duas moléculas de polipeptídeo ou entre duas moléculas de ácido nucleico. Quando uma posição nas duas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou pelo mesmo resíduo de aminoácido, então as respectivas moléculas são idênticas nessa posição. A porcentagem de identidade entre duas sequências corresponde ao número de posições correspondentes compartilhadas pelas duas sequências divididas pelo número de posições comparadas e multiplicadas por 100. Geralmente, uma comparação é feita quando duas sequências são alinhadas para fornecer identidade máxima. A identidade pode ser calculada pelo alinhamento usando, por exemplo, o programa de empilhamento GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versão 7, Madison, Wisconsin) ou quaisquer algoritmos de comparação de sequência como BLAST, FASTA ou CLUSTALW.
[0033] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de AAV híbrida da presente invenção gera altos rendimentos de partículas de vetor de AAV recombinante. Preferencialmente, o título do vetor de AAV recombinante de capsídeo híbrido é igual ou superior a 1011 genomas virais por mL (vg/mL). Altos rendimentos de partículas de vetor de AAV recombinante são úteis para aplicações de terapia gênica.
[0034] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo de AAV híbrida da presente invenção compreende modificações adicionais, por exemplo, modificações que aumentam o direcionamento do tecido muscular esquelético ou cardíaco por vetores de AAV. Um exemplo não limitante é a fusão de Antopleurina-B com o terminal N da proteína de capsídeo VP2 de AAV (Finet et al., Virology, 2018, 513, 43-51). Outra modificação é a inserção de um peptídeo em um sítio exposto na superfície do capsídeo, particularmente em torno da posição 588 de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1. Exemplos não limitantes de tais peptídeos são divulgados em Michelfelder et al. (PLoS ONE, 2009, 4, e5122). O sítio de inserção é vantajosamente das posições 587 a 592 de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1. A inserção do peptídeo pode ou não causar a deleção de alguns ou todos os resíduos a partir do sítio de inserção. O peptídeo possui, vantajosamente, uma sequência de não mais que 20 aminoácidos que pode incluir sequências fixas de não mais que cinco aminoácidos em suas extremidades N- e/ou C-terminais, como por exemplo GQSG (SEQ ID NO: 35) e AQAA (SEQ ID NO: 36), respectivamente, na extremidade N-terminal e C-terminal do peptídeo.
[0035] Em algumas modalidades, o peptídeo compreende ou consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 12 a 34. Preferencialmente, o referido peptídeo é flanqueado por GQSG (SEQ ID NO: 35) e AQAA (SEQ ID NO: 36), respectivamente em sua extremidade N- e C-terminal. O peptídeo substitui vantajosamente todos os resíduos a partir das posições 587 a 592 da proteína de capsídeo de AAV de acordo com a numeração na SEQ ID
NO: 1. O peptídeo vantajosamente aumenta o direcionamento do tecido muscular cardíaco e, eventualmente, também do tecido muscular esquelético. Em algumas modalidades preferidas, o peptídeo modificado da proteína de capsídeo de AAV híbrida compreende ou consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 9 e nas sequências tendo pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98 % ou 99% de identidade com a referida sequência; mais preferencialmente que compreende a sequência da SEQ ID NO: 9. A SEQ ID NO: 9 é derivada a partir de Cap9-rh74 híbrido da SeQ ID NO. 3 pela inserção do peptídeo da SEQ ID NO: 12. A invenção abrange também proteínas de capsídeo VP1 e VP2 de AAV quimérico derivadas a partir da proteína de capsídeo VP3 híbrida de AAV9/rh74 de acordo com a invenção, em que a região N-terminal específica de VP1 e/ou região N-terminal específica de VP2 são de sorotipo de AAV natural ou artificial diferente de AAV9 e AAVrh74.
[0036] Em algumas modalidades, a proteína de capsídeo VP1 de AAV quimérico compreende: (i) uma região N-terminal específica de VP1 tendo uma sequência a partir de sorotipo de AAV natural ou artificial diferente de AAV9 e AAVrh74, (ii) uma região N-terminal específica de VP2 tendo uma sequência a partir de AAV9 e AAVrh74 ou do sorotipo natural ou artificial de AAV diferente de AAV9 e AAVrh74, e (iii) uma região C-terminal de VP3 tendo a sequência de uma proteína VP3 híbrida de acordo com a presente invenção.
[0037] Em algumas modalidades, as proteínas de capsídeo VP2 de AAV quimérico compreende (i) uma região N-terminal específica de VP2 tendo uma sequência a partir de sorotipo natural ou artificial de AAV diferente de AAV9 e AAVrh74, e (ii) uma região C-terminal de VP3 tendo a sequência de uma proteína VP3 híbrida de acordo com a presente invenção. Polinucleotídeo, vetor e uso para produção do vetor de AAV
[0038] Outro aspecto da presente invenção é um polinucleotídeo codificando a proteína de capsídeo de AAV híbrida recombinante em forma expressável. O polinucleotídeo pode ser DNA, RNA ou um ácido nucleico sintético ou semissintético.
[0039] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um gene cap de AAV9/rh74 híbrido codificando as proteínas de capsídeo VP1, VP2 e VP3 de acordo com a invenção. Em algumas modalidades preferenciais, o polinucleotídeo compreende a sequência da SEQ ID NO: 5 (codificando a proteína de capsídeo de AAV híbrida da SEQ ID NO: 3) ou a sequência da SEQ ID NO: 7 (codificando a proteína de capsídeo de AAV híbrida da SEQ ID NO: 4).
[0040] Em algumas outras modalidades, o polinucleotídeo é um gene cap quimérico que codifica uma proteína de capsídeo VP3 híbrido de AAV9/rh74 de acordo com a presente invenção e uma proteína de capsídeo VP1 quimérico, e talvez também uma proteína de capsídeo VP2 quimérico, em que a região N- terminal específica para VP1, e talvez também a região N-terminal específica para VP2, são de um sorotipo natural ou artificial de AAV diferente de AAV9 e AAVrh74. Tal gene cap quimérico pode ser gerado por qualquer técnica adequada, usando a sequência de codificação para uma proteína de capsídeo VP3 híbrido de AAV9/rh74 de acordo com a presente invenção em combinação com sequências heterólogas que podem ser obtidas a partir de diferentes sorotipos selecionados de AAV, porções não contíguas do mesmos sorotipos de AAV, a partir de uma fonte de AAV não viral ou de uma fonte não viral.
[0041] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica, adicionalmente, a proteína Replicase (Rep) de AAV em forma expressável, preferencialmente Rep a partir de AAV2.
[0042] O polinucleotídeo é vantajosamente inserido em um vetor recombinante, que inclui, de uma maneira não limitante, DNA linear ou circular ou moléculas de RNA consistindo em ácidos nucleicos cromossômicos, não cromossômicos, sintéticos ou semissintéticos, tais como, particularmente, vetores virais, plasmídeo ou vetores de RNA.
[0043] Vários vetores nos quais uma molécula de ácido nucleico de interesse pode ser inserida a fim de introduzi-la e mantê-la em uma célula hospedeira eucariótica são conhecidos per se; a escolha de um vetor apropriado depende do uso previsto para esse vetor (por exemplo, replicação da sequência de interesse, expressão dessa sequência, manutenção dessa sequência na forma extracromossômica, ou então integração no material cromossômico do hospedeiro), e também sobre a natureza da célula hospedeira.
[0044] Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo.
[0045] O vetor recombinante para uso na presente invenção é um vetor de expressão que compreende meios apropriados para expressar a proteína de capsídeo de AAV híbrida, e talvez também a proteína Rep de AAV. Normalmente, cada sequência de codificação (Cap de AAV híbrido e Rep de AAV) é inserida em um cassete de expressão separado no mesmo vetor ou separadamente. Cada cassete de expressão compreende a sequência de codificação (quadro de leitura aberta ou ORF) funcionalmente ligada às sequências regulatórias que permitem a expressão da proteína correspondente em células produtoras de AAV, tais como, particularmente, promotor, promotor/intensificador, códon de iniciação (ATG), códon de parada, sinal terminador de transcrição. Alternativamente, as proteínas Cap de AAV híbrido e Rep de AAV podem ser expressas a partir de um único cassete de expressão usando um Sítio de Entrada Ribossomal Interno (SERI) inserido entre as duas sequências de codificação ou um peptídeo 2A viral. Além disso, as sequências de códons codificando o Cap de AAV híbrido e Rep de
AAV, se presente, são vantajosamente otimizados para expressão em células produtoras de AAV, particularmente células produtoras humanas.
[0046] O vetor, preferencialmente um plasmídeo recombinante, é útil para produzir vetores de AAV híbridos compreendendo a proteína de capsídeo de AAV híbrida da presente invenção, usando métodos de produção de AAV padrão que são bem conhecidos no estado da técnica (Revisão em Aponte-Ubillus et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102: 1045-1054).
[0047] Após a cotransfecção, as células são incubadas por um tempo suficiente para permitir a produção de partículas de vetor de AAV, as células são então colhidas, lisadas e as partículas de vetor de AAV são purificadas por métodos de purificação padrão, como por exemplo, ultracentrifugação de gradiente de densidade de Cloreto de Césio. Partícula de AAV, composição farmacêutica e usos terapêuticos
[0048] Outro aspecto da presente invenção é uma partícula de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV híbrida recombinante da presente invenção. A partícula de AAV pode compreender proteínas de capsídeo VP1, VP2 e VP3 híbrido codificadas por um gene cap híbrido de acordo com a presente invenção. Alternativamente ou adicionalmente, a partícula de AAV pode compreender proteínas de capsídeo VP1 e VP2 quimérico e uma proteína VP3 híbrida codificada por um gene cap quimérico de acordo com a presente invenção.
[0049] Em algumas modalidades, a partícula de AAV é uma partícula de AAV mosaico que compreende, adicionalmente, outra proteína de capsídeo de AAV a partir de um sorotipo natural ou artificial de AAV diferente do sorotipo AAV9 e AAVrh74, em que a partícula de AAV mosaico possui um tropismo pelo fígado reduzido em comparação com os sorotipos AAV9 e AAVrh74. Um sorotipo artificial de AAV pode ser, sem limitação, um capsídeo de AAV quimérico, um capsídeo de AAV recombinante ou um capsídeo de AAV humanizado. Tal capsídeo artificial pode ser gerado por qualquer técnica adequada, usando uma sequência selecionada de AAV (por exemplo, um fragmento de uma proteína de capsídeo VP1) em combinação com sequências heterólogas que podem ser obtidas a partir de diferentes sorotipos de AAV selecionados, porções não contíguas do mesmos sorotipos de AAV, a partir de uma fonte de AAV não viral ou de uma fonte não viral.
[0050] Preferencialmente, a partícula de AAV é uma partícula de vetor de AAV. O genoma do vetor de AAV pode ser um genoma de filamento simples ou de filamento duplo autocomplementar (McCarty et al, Gene Therapy, 2003, Dec., 10(26), 2112-2118). Os vetores autocomplementares são gerados pela deleção do sítio de resolução do terminal (trs) a partir de uma das repetições do terminal de AAV. Esses vetores modificados, cujo genoma de replicação tem metade do comprimento do genoma de AAV de tipo selvagem, têm a tendência de empacotar dímeros de DNA. O genoma AAV é flanqueado por RTIs. Em modalidades particulares, o vetor de AAV é um vetor pseudotipado, i.e, seu genoma e capsídeo são derivados a partir de AAVs de diferentes sorotipos. Em algumas modalidades preferenciais, o genoma do vetor pseudotipado é derivado a partir de AAV2.
[0051] Em algumas modalidades preferenciais, a partícula de vetor de AAV está empacotando um gene de interesse.
[0052] A partícula de AAV pode ser obtida usando o método de produção de partículas de vetor de AAV recombinante da invenção.
[0053] Por “gene de interesse”, entende-se um gene útil para uma aplicação específica, tal como, sem limitação, diagnóstico, relatório, modificação, terapia e edição de genoma.
[0054] Por exemplo, o gene de interesse pode ser um gene terapêutico, um gene repórter ou uma enzima de edição de genoma.
[0055] Por “gene de interesse para terapia”, “gene de interesse terapêutico” ou “gene heterólogo de interesse”, entende-se um gene terapêutico ou um gene codificando uma proteína, peptídeo ou RNA terapêutico.
[0056] O gene de interesse é qualquer sequência de ácido nucleico capaz de modificar um gene alvo ou da via celular alvo, particularmente em células musculares. Por exemplo, o gene pode modificar a expressão, a sequência ou a regulação do gene alvo ou da via celular. Em algumas modalidades, o gene de interesse é uma versão funcional de um gene ou um fragmento do mesmo. A versão funcional do referido gene inclui o gene de tipo selvagem, um gene variante, como variantes pertencentes à mesma família e outras, ou uma versão truncada, que preserva a funcionalidade da proteína codificada pelo menos parcialmente. Uma versão funcional de um gene é útil para a terapia gênica aditiva ou de substituição para substituir um gene, que é deficiente ou não funcional em um paciente. Em outras modalidades, o gene de interesse é um gene que inativa um alelo dominante causando uma doença genética autossômica dominante. Um fragmento de um gene é útil como modelo de recombinação para uso em combinação com uma enzima de edição de genoma.
[0057] Alternativamente, o gene de interesse pode codificar uma proteína de interesse para uma aplicação específica, (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, uma enzima de edição de genoma) ou um RNA. Em algumas modalidades, a proteína é uma proteína terapêutica incluindo um anticorpo terapêutico ou fragmento de anticorpo, ou uma enzima de edição de genoma. Em algumas modalidades, o RNA é um RNA terapêutico. O gene de interesse é um gene funcional capaz de produzir a proteína, o peptídeo ou o RNA codificado nas células-alvo da doença, particularmente em células musculares.
O vetor viral de AAV compreende o gene de interesse em uma forma expressável em células musculares, incluindo células musculares cardíacas e esqueléticas. Particularmente, o gene de interesse é operacionalmente ligado a um promotor ubíquo, tecido específico ou induzível que é funcional em células musculares. O gene de interesse pode ser inserido em um cassete de expressão compreendendo, adicionalmente, sequências poliA.
[0058] O RNA é vantajosamente complementar a uma sequência de DNA ou RNA alvo ou se liga a uma proteína alvo. Por exemplo, o RNA é um RNA interferente, como um shRNA, um microRNA, um RNA guia (gRNA) para uso em combinação com uma enzima Cas ou enzima semelhante para edição de genoma, um RNA antissenso capaz de salto de exon, tal como um RNA nuclear pequeno (snRNA) ou um RNA não codificante longo. O RNA interferente ou microRNA pode ser usado para regular a expressão de um gene alvo envolvido na doença muscular. O RNA guia em complexo com uma enzima Cas ou enzima semelhante para edição de genoma pode ser usado para modificar a sequência de um gene alvo, particularmente para corrigir a sequência de um gene mutado/deficiente ou para modificar a expressão de um gene alvo envolvido em uma doença, particularmente uma doença neuromuscular. O RNA antissenso capaz de salto de exon é usado particularmente para corrigir um quadro de leitura e restaurar a expressão de um gene deficiente com um quadro de leitura interrompida. Em algumas modalidades, o RNA é um RNA terapêutico.
[0059] A enzima de edição de genoma de acordo com a presente invenção é qualquer enzima ou complexo de enzima capaz de modificar um gene alvo ou da via celular alvo, particularmente em células musculares. Por exemplo, a enzima de edição de genoma pode modificar a expressão, a sequência ou a regulação do gene alvo ou da via celular. A enzima de edição de genoma é vantajosamente uma nuclease manipulada, tal como, sem limitações, uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma nuclease à base de efetor tipo ativador de transcrição (TALENs), enzima Cas a partir de Sistema Cas de Repetições Palindrômicas Agrupadas Regularmente Espaçadas (CRISPR) e enzimas semelhantes. A enzima de edição de genoma, particularmente uma nuclease manipulada, como a enzima Cas e enzimas semelhantes, pode ser uma nuclease funcional que gera uma quebra de filamento duplo (QFD) no locus genômico alvo e é usada para aplicações de edição de genoma sítio-específico, incluindo sem limitações: correção de gene, substituição de gene, knock-in de gene, knock-out de gene, mutagênese, translocação de cromossomo, deleção de cromossomo e semelhantes. Para aplicações de edição de genoma sítio- específico, a enzima de edição de genoma, particularmente uma nuclease manipulada, como a enzima Cas e enzimas semelhantes, pode ser usada em combinação com uma matriz ou modelo de recombinação homóloga (RH) (também denominado modelo doador de DNA) que modifica o locus genômico alvo por recombinação homóloga induzida por quebra de filamento duplo (QFD). Particularmente, o modelo de RH pode introduzir um transgene de interesse no locus genômico alvo ou reparar uma mutação no locus genômico alvo, preferencialmente em um gene anormal ou deficiente causando uma doença neuromuscular. Alternativamente, a enzima de edição de genoma, como a enzima Cas e enzimas semelhantes podem ser manipuladas para se tornarem nuclease-deficientes e usadas como proteína de ligação de DNA para várias aplicações de engenharia de genoma, tais como, sem limitação: ativação transcricional, repressão transcricional, modificação de epigenoma, imageamento do genoma, pull-down de DNA ou RNA e assim por diante.
[0060] Outro aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de partículas de AAV compreendendo a proteína de capsídeo de AAV recombinante híbrido da presente invenção, preferencialmente partículas de vetor de AAV empacotando um gene terapêutico de interesse.
[0061] Em algumas modalidades da presente invenção, a composição farmacêutica da presente invenção é para uso como um medicamento, particularmente em terapia gênica. A presente invenção abrange o uso da composição farmacêutica da invenção como um medicamento, particularmente para o tratamento de uma doença por terapia gênica.
[0062] A terapia gênica pode ser realizada por transferência de gene, edição de genes, salto de exon, interferência de RNA, trans-splicing ou qualquer outra modificação genética de qualquer codificação ou sequências regulatórias na célula, incluindo aquelas incluídas no núcleo, mitocôndria ou como ácido nucleico comensal, tal como, sem limitação, as sequências virais contidas nas células.
[0063] Os dois principais tipos de terapia gênica são os seguintes: - uma terapia que visa fornecer um gene de substituição funcional para um gene deficiente/anormal: esta é a terapia gênica de substituição ou aditiva; - uma terapia que visa a edição de um gene ou genoma: nesse caso, o objetivo é fornecer a uma célula as ferramentas necessárias para corrigir a sequência ou modificar a expressão ou regulação de um gene deficiente/anormal para que um gene funcional seja expresso ou um gene anormal seja suprimido (inativado): esta é a terapia de edição de genes.
[0064] Na terapia gênica aditiva, o gene de interesse pode ser uma versão funcional de um gene, que é deficiente ou mutado em um paciente, como é o caso, por exemplo, em uma doença genética. Nesse caso, o gene de interesse irá restaurar a expressão de um gene funcional.
[0065] A edição de genes ou de genoma usa um ou mais genes de interesse, tais como:
(i) um gene codificando um RNA terapêutico conforme definido acima tal como um RNA interferente como um shRNA ou um microRNA, um RNA guia (gRNA) para uso em combinação com uma enzima Cas ou enzima semelhante, ou um RNA antissenso capaz de salto de exon, como um RNA nuclear pequeno (snRNA); e (ii) um gene codificando uma enzima de edição de genoma, como definido acima, como uma nuclease manipulada como uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma nuclease baseada em efetor tipo ativador de transcrição (TALENs), enzima Cas ou enzimas semelhantes; ou uma combinação de tais genes, e talvez também um fragmento de uma versão funcional de um gene para uso como modelo de recombinação, conforme definido acima.
[0066] A terapia gênica é usada para o tratamento de várias doenças, incluindo, sem limitações, doenças genéticas, particularmente distúrbios genéticos neuromusculares, câncer, doenças neurodegenerativas e doenças autoimunes.
[0067] Em algumas modalidades, a terapia gênica é usada para tratar doenças que afetam os tecidos musculares, particularmente o tecido muscular esquelético e/ou tecido cardíaco, tais como sem limitações: distúrbios genéticos neuromusculares, cardiomiopatias, rabdomiossarcomas, Polimiosite, Dermatomiosite, polimiosite juvenil e outros.
[0068] Exemplos de genes mutados em distúrbios genéticos neuromusculares que podem ser alvos por terapia gênica usando a composição farmacêutica da invenção estão listados nas seguintes tabelas: Distrofias musculares Gene Proteína DMD Distrofina EMD Emerina
FHL1 Quatro e meio LIM domínio 1 LMNA Lamina A/C SYNE1 Envelope nuclear 1 contendo repetição de espectrina (nesprina 1) SYNE2 Envelope nuclear 2 contendo repetição de espectrina (nesprina 2) TMEM43 Proteína 43 transmembrana TOR1AIP1 Proteína 1 de interação com a torsina A DUX4 Homeobox dupla 4 SMCHD1 Manutenção estrutural de domínio de dobradiça flexível de cromossomos contendo 1 PTRF Polimerase I e fator de liberação de transcrição MYOT Miotilina CAV3 Caveolina 3 DNAJB6 HSP-40 homólogo, subfamília B, número 6 DES Desmina TNPO3 Transportina 3 HNRNPDL Ribonucleoproteína nuclear heterogênea tipo D CAPN3 Calpaína 3 DYSF Disferlina SGCG Sarcoglicano gama SGCA Sarcoglicano alfa SGCB Sarcoglicano beta SGCD Sarcoglicano delta TCAP Teletonina TRIM32 Motivo tripartido contendo 32
FKRP Proteína relacionada a fucutina TTN Titina POMT1 Proteína-O-manosiltransferase 1 ANO5 Anoctamina 5 FKTN Fucutina POMT2 Proteína-O-manosiltransferase 2 POMGNT1 Manose beta1,2-N-acetilglucosaminiltransferase O-ligada PLEC Plectina TRAPPC11 Proteína de tráfico de partículas do complexo 11 GMPPB GDP-manose pirofosforilase B DAG1 Distroglicano1 DPM3 Polipeptídeo de dolicil-fosfato manosiltransferase 3 ISPD Contendo domínio sintase de isoprenoide VCP Proteína contendo valosina LIMS2 LIM e domínios tipo antígeno de célula senescente 2 GAA Glucosidase alfa, ácido Distrofias musculares congênitas Gene Proteína LAMA2 Cadeia de laminina alfa 2 de merosina COL6A1 Colágeno alfa 1 tipo VI COL6A2 Colágeno alfa 2 tipo VI COL6A3 Colágeno alfa 3 tipo VI SEPN1 Selenoproteína N1 FHL1 Quatro e meio LIM domínio 1 ITGA7 Precursor de integrina alfa 7 DNM2 Dinamina 2
TCAP Teletonina LMNA Lamina A/C FKTN Fucutina POMT1 Proteína-O-manosiltransferase 1 POMT2 Proteína-O-manosiltransferase 2 FKRP Proteína relacionada a fucutina POMGNT1 Manose beta1,2-N-acetilglucosaminiltransferase O-ligada ISPD Contendo domínio sintase de isoprenoide POMGNT2 Proteína manose N-acetilglucosaminiltransferase 2 O-ligada B3GNT1 UDP-GlcNAc: betaGal beta-1,3-N-acetilglucosaminil-transferase 1 GMPPB GDP-manose pirofosforilase B LARGE Tipo glicosiltransferase DPM1 Polipeptídeo de manosiltransferase de fosfato de dolicil 1, subunidade catalítica DPM2 Polipeptídeo de manosiltransferase de fosfato de dolicil 2, subunidade regulatória ALG13 UDP-N-acetilglucosami-niltransferase B3GALNT2 Beta-1,3-N-acetilgalacto-saminiltransferase 2 TMEM5 Proteína 5 transmembrana POMK Proteína quinase-O-manose CHKB Colina quinase beta ACTA1 Alfa actina, músculo esquelético TRAPPC11 Proteína de tráfico de partículas do complexo 11 Miopatias congênitas Gene Proteína
TPM3 Tropomiosina 3 NEB Nebulina ACTA1 Alfa actina, músculo esquelético TPM2 Tropomiosina 2 (beta) TNNT1 Troponina lenta T KBTBD13 Repetição Kelch e domínio BTB (POZ) contendo 13 CFL2 Cofilina 2 (músculo) KLHL40 Membro da família tipo Kelch 40 KLHL41 Membro da família tipo Kelch 41 LMOD3 Leiomodina 3 (fetal) SEPN1 Selenoproteína N1 RYR1 Receptor de rianodina 1 (esquelético) MYH7 Miosina, polipeptídeo 7 pesado, músculo cardíaco, beta MTM1 Miotubularina DNM2 Dinamina 2 BIN1 Anfifisina TTN Titina SPEG Locus SPGE complexo MEGF10 Múltiplos domínios tipo EGF 10 MYH2 Miosina, polipeptídeo 2 pesado, músculo esquelético MYBPC3 Proteína C de ligação à miosina cardíaca CNTN1 Contactina-1 TRIM32 Motivo tripartido contendo 32 PTPLA Proteína tirosina tipo fosfatase (3-hidroxiacil-CoA desidratase) CACNA1S Canal de cálcio, voltagem dependente, tipo L, subunidade alfa 1S Miopatias distais
Símbolo do gene proteína DYSF Disferlina TTN Titina GNE UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase/N- acetilmanosamina quinase MYH7 Miosina, polipeptídeo 7 pesado, músculo cardíaco, beta MATR3 Matrina 3 TIA1 Proteína de ligação de RNA citotóxica grânulo-associada MYOT Miotilina NEB Nebulina CAV3 Caveolina 3 LDB3 Domínio de ligação LIM 3 ANO5 Anoctamina 5 DNM2 Dinamina 2 KLHL9 Homólogo tipo Kelch 9 FLNC Filamina C, gama (proteína de ligação à actina - 280) VCP Proteína contendo valosina Outras miopatias Símbolo do gene proteína ISCU Cluster de ferro-enxofre homólogo (E. coli) MSTN Miostatina FHL1 Quatro e meio LIM domínio 1 BAG3 Atanogene 3 associado a BCL2 ACVR1 Receptor de ativina A, quinase semelhante ao tipo II 2 MYOT Miotilina FLNC Filamina C, gama (proteína de ligação à actina - 280)
LDB3 ligação de domínio LIM 3 LAMP2 Precursor da proteína 2 de membrana associada ao lisossoma VCP Proteína contendo valosina CAV3 Caveolina 3 SEPN1 Selenoproteína N1 CRYAB Cristalina, alfa B DES Desmina VMA21 Homólogo VMA21 Vacuolar H+-ATPase (S.
Cerevisiae) PLEC plectina PABPN1 Proteína de ligação de poli(A), nuclear 1 TTN Titina RYR1 Receptor de rianodina 1 (esquelético) CLN3 Lipofuscinose ceróide, neuronal 3 (=batenina) TRIM54 TRIM63 Motivo tripartido contendo 63, proteína ligase ubiquitina E3 Síndromes miotônicas Gene proteína DMPK Proteína quinase de distrofia miotônica CNPB Proteína celular de ligação ao ácido nucleico CLCN1 Canal de cloreto 1, músculo esquelético (doença de Thomsen, autossômica dominante) CAV3 Caveolina 3 HSPG2 Perlecano ATP2A1 ATPase, transporte de Ca++, contração rápida 1 Doenças musculares dos canais iônicos
Gene proteína CLCN1 Canal de cloreto 1, músculo esquelético (doença de Thomsen, autossômica dominante) SCN4A Canal de sódio, controlado por voltagem, tipo IV, alfa SCN5A Canal de sódio, controlado por voltagem, tipo V alfa CACNA1S Canal de cálcio, voltagem dependente, tipo L, subunidade alfa 1S CACNA1A Canal de cálcio, voltagem dependente, tipo P/Q, subunidade alfa 1A KCNE3 Canal de potássio controlado por voltagem, família relacionada à Isk, membro 3 KCNA1 Canal de potássio controlado por voltagem, subfamília relacionada ao agitador, membro 1 KCNJ18 Kir2.6 (canal de potássio de retificação interna 2.6) KCNJ2 Canal de potássio de retificação interna de J2 KCNH2 Canal de potássio controlado por voltagem, subfamília H, membro 2 KCNQ1 Canal de potássio controlado por voltagem, subfamília tipo KQT, membro 1 KCNE2 Canal de potássio controlado por voltagem, família relacionada à Isk, membro 2 KCNE1 Canal de potássio controlado por voltagem, família relacionada à Isk, membro 1 Hipertermia maligna Gene proteína RYR1 Receptor de rianodina 1 (esquelético) CACNA1S Canal de cálcio, voltagem dependente, tipo L, subunidade alfa 1S Miopatias metabólicas
Gene proteína GAA Pré-proproteína de alfa-glucosidase ácida AGL Amilo-1,6-glucosidase, 4-alfa-glucanotransferase GBE1 Glucano (1,4-alfa-), enzima de ramificação 1 (enzima de ramificação de glicogênio, doença de Andersen, doença de armazenamento de glicogênio tipo IV) PYGM Glicogênio fosforilase PFKM Fosfofrutocinase, músculo PHKA1 Fosforilase b quinase, subunidade alfa PGM1 Fosfoglucomutase 1 GYG1 Glicogenina 1 GYS1 Glicogênio sintase 3 glicogênio sintase 1 (músculo) glicogênio sintase 1 (músculo) PRKAG2 Proteína quinase, ativada por AMP, subunidade gama não catalítica 2 RBCK1 Dedo de zinco tipo RanBP e tipo C3HC4 contendo 1 (ligase 1 de ubiquitina IRP2 heme oxidada) PGK1 Fosfoglicerato quinase 1 PGAM2 Fosfoglicerato mutase 2 (músculo) LDHA Lactato desidrogenase A ENO3 Enolase 3, músculo beta específico CPT2 Carnitina palmitoiltransferase II SLC22A5 Carreador de soluto família 22 membro 5 SLC25A20 Carnitina-acilcarnitina translocase ETFA Flavoproteína de transferência de elétrons, polipeptídeo alfa ETFB Flavoproteína transferidora de elétrons, polipeptídeo beta
ETFDH Flavoproteína desidrogenase transferidora de elétrons ACADVL Acil-coenzima A desidrogenase, cadeia muito longa ABHD5 Domínio abidrolase contendo 5 PNPLA2 Lipase de triglicerídeo adiposo (desnutrina) LPIN1 Lipina 1 (fosfatase de ácido fosfatídico 1) PNPLA8 Domínio de fosfolipase tipo patatina contendo 8 Cardiomiopatias hereditárias Gene proteína MYH6 Cadeia pesada de miosina 6 MYH7 Miosina, polipeptídeo pesado 7, músculo cardíaco, beta TNNT2 Troponina T2, cardíaca TPM1 Tropomiosina 1 (alfa) MYBPC3 Proteína C de ligação à miosina cardíaca PRKAG2 Proteína quinase, ativada por AMP, subunidade gama não catalítica 2 TNNI3 Troponina I, cardíaca MYL3 Miosina de cadeia leve 3 TTN Titina MYL2 Miosina de cadeia leve 2 ACTC1 Actina, alfa, precursor do músculo cardíaco CSRP3 Proteína rica em cisteína e glicina 3 (proteína LIM cardíaca) TNNC1 Troponina lenta C VCL Vinculina MYLK2 Miosina de cadeia leve quinase 2 CAV3 Caveolina 3 MYOZ2 Miozenina 2, ou calsarcina 1, uma proteína do disco Z
JPH2 Junctofilina-2 PLN Fosfolambano NEXN Nexilina (proteína de ligação à actina F) ANKRD1 Domínio de repetição de anquirina 1 (músculo cardíaco) ACTN2 Actinina alfa2 NDUFAF1 NADH-ubiquinona oxidoredutase 1 subcomplexo alfa TSFM Fator de alongamento de tradução Ts, mitocondrial AARS2 Alanil-tRNA sintetase 2, mitocondrial MRPL3 Proteína ribossomal mitocondrial L3 COX15 Homólogo COX15, proteína de montagem de citocromo c oxidase (levedura) MTO1 Otimização de tradução de tRNA mitocondrial 1 MRPL44 Proteína ribossomal mitocondrial L44 LMNA Lamina A/C LDB3 Ligação de domínio LIM 3 SCN5A Canal de sódio, controlado por voltagem, tipo V alfa DES Desmina EYA4 Olhos ausentes 4 SGCD Sarcoglicano delta TCAP Teletonina ABCC9 Cassete de ligação de ATP, subfamília C (membro 9) TMPO Polipeptídeo associado a lamina 2 PSEN2 Presenilina 2 CRYAB Cristalina, alfa B FKTN Fucutina TAZ Tafazina
DMD Distrofina LAMA4 Laminina alfa 4 ILK Quinase ligada à integrina MYPN Miopaladina RBM20 Proteína de motivo de ligação de RNA 20 SYNE1 Envelope nuclear 1 contendo repetição de espectrina (nesprina 1) MURC Proteína helicoidal relacionada ao músculo DOLK Dolicol quinase GATAD1 Domínio de dedo de zinco GATA contendo 1 SDHA complexo de succinato desidrogenase, subunidade A, flavoproteína (Fp) GAA Pré-proproteína de alfa-glucosidase ácida DTNA Distrobrevina, alfa FLNA Filamina A, alfa (proteína de ligação à actina 280) TGFB3 Fator de transformação de crescimento, beta 3 RYR2 Receptor de rianodina 2 TMEM43 Proteína transmembrana 43 DSP Desmoplaquina PKP2 Placofilina 2 DSG2 Desmogleína 2 DSC2 Desmocolina 2 JUP Placoglobina de junção CASQ2 Calsequestrina 2 (músculo cardíaco) KCNQ1 Canal de potássio controlado por voltagem, subfamília tipo KQT, membro 1 KCNH2 Canal de potássio controlado por voltagem, subfamília H, membro
ANK2 Anquirina 2 KCNE1 Canal de potássio controlado por voltagem, família relacionada à Isk, membro 1 KCNE2 Canal de potássio controlado por voltagem, família relacionada à Isk, membro 2 KCNJ2 Canal de potássio de retificação interna J2 CACNA1C Canal de cálcio, voltagem dependente, tipo L, subunidade alfa 1C SCN4B Canal de sódio, controlado por voltagem, tipo IV, subunidade beta AKAP9 Uma proteína de ancoragem à quinase (PRKA) (yotiao) 9 SNTA1 Sintrofina, alfa 1 KCNJ5 Canal de potássio de retificação interna, subfamília J, membro 5 NPPA Precursor de peptídeo natriurético A KCNA5 Canal de potássio controlado por voltagem subfamília relacionada ao agitador, membro 5 GJA5 Conexina 40 SCN1B Canal de sódio, controlado por voltagem, tipo I, subunidade beta SCN2B Canal de sódio, controlado por voltagem, tipo II, subunidade beta NUP155 Nucleoporina 155 kDa GPD1L Glicerol-3-fosfato desidrogenase tipo 1 CACNB2 Canal de cálcio, voltagem dependente, subunidade beta 2 KCNE3 Canal de potássio controlado por voltagem, família relacionada à Isk, membro 3 SCN3B Canal de sódio, controlado por voltagem, tipo III, subunidade beta HCN4 Canal de potássio controlado por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização 4 Síndromes miastênicas congênitas
Gene proteína CHRNA1 Receptor colinérgico, nicotínico, polipeptídeo alfa 1 CHRNB1 Receptor colinérgico, nicotínico, beta 1 músculo CHRND Receptor colinérgico, nicotínico, delta CHRNE Receptor colinérgico, nicotínico, épsilon RAPSN Rapsina CHAT Isoforma de colina acetiltransferase COLQ Subunidade de acetilcolinesterase de cauda tipo colágeno MUSK músculo, esquelético, receptor tirosina quinase DOK7 Proteína de ancoragem 7 AGRN Agrina GFPT1 Glutamina-frutose-6-fosfato transaminase 1 DPAGT1 Doliquil-fosfato (UDP-N-acetilglucosamina) N- acetilglucosaminafosfotransferase 1 (GlcNAc-1-P transferase) LAMB2 Laminina, beta 2 (laminina S) SCN4A Canal de sódio, controlado por voltagem, tipo IV, alfa CHRNG Receptor colinérgico, nicotínico, polipeptídeo gama PLEC plectina ALG2 Alfa-1,3/1,6-manosiltransferase ALG14 UDP-N-acetilglucosaminiltransferase SYT2 Sinaptotagmina II PREPL Prolila tipo endopeptidase Doenças do neurônio motor Gene proteína SMN1 Sobrevivência do neurônio motor 1, telomérico IGHMBP2 Proteína de ligação de imunoglobulina mu 2
PLEKHG5 Domínio de homologia a Pleckstrina contendo membro de família G (com domínio RhoGef) 5 HSPB8 Proteína de choque térmico 27kDa 8 HSPB1 Proteína de choque térmico 27kDa 1 HSPB3 Proteína de choque térmico 27kDa 3 AARS Alanil-tRNA sintetase GARS Glicil-tRNA sintetase BSCL2 Seipina REEP1 Proteína receptora acessória 1 SLC5A7 Carreador de soluto família 5 (co-transportador de sódio/colina), membro 7 DCTN1 Dinactina 1 UBA1 enzima de ativação de ubiquitina 1 ATP7A ATPase, transporte de Cu++, polipeptídeo alfa DNAJB2 Homólogo de DnaJ (Hsp40), subfamília B, número 2 TRPV4 Canal de cátion de receptor de potencial transiente, subfamília V, membro 4 DYNC1H1 Dineína, citoplasmática 1, cadeia pesada 1 BICD2 Homólogo Bicaudal D (Drosophila) 2 FBXO38 Proteína f-box 38 ASAH1 N-acilsfingosina amidohidrolase (ácido ceramidase) 1 VAPB Proteína B e C associada à proteína de membrana associada à vesícula EXOSC8 Componente de exossomo 8 SOD1 Superóxido dismutase 1, solúvel ALS2 Alsina
SETX Senataxina FUS Fusão (envolvida em t(12; 16) em lipossarcoma maligno) ANG Angiogenina TARDBP Proteína TAR de ligação de DNA FIG4 Domínio Sac contendo inositol fosfatase 3 OPTN Optineurina ATXN2 Ataxina 2 VCP Proteína contendo valosina UBQLN2 Ubiquilina 2 SIGMAR1 Receptor sigma intracelular não opioide 1 CHMP2B Proteína corporal multivesicular carregada 2B PFN1 Profilina 1 MATR3 Matrina 3 NEFH Neurofilamento, polipeptídeo pesado PRPH Periferina C9orf72 Cromossomo 9 quadro de leitura aberta 72 CHCHD10 Domínio helicoidal-helicoidal contendo 10 SQSTM1 Sequestosoma 1 AR Receptor andrógeno GLE1 Mediador homólogo de exportação de RNA GLE1 (levedura) ERBB3 V-erb-b2 de leucemia eritroblástica viral de oncogene homólogo 3 (aviário) PIP5K1C Fosfatidilinositol-4-fosfato 5-quinase, tipo I, gama EXOSC3 Componente de exossomo 3 VRK1 Quinase relacionada à vaccínia 1 SLC52A3 Carreador de soluto família 52, transportador de riboflavina,
membro 3 SLC52A2 Carreador de soluto família 52, transportador de riboflavina, membro 2 HEXB Hexosaminidase B Neuropatias motoras e sensoriais hereditárias Gene Proteína PMP22 Proteína de mielina periférica 22 MPZ Proteína de mielina zero LITAF Fator TNF induzido por lipopolissacarídeo EGR2 Proteína de resposta de crescimento inicial 2 NEFL Neurofilamento, polipeptídeo leve 68kDa HOXD10 Homeobox D10 ARHGEF10 Fator de troca de nucleotídeo de guanina Rho 10 FBLN5 Fibulina 5 (matriz extracelular) DNM2 Dinamina 2 YARS Tirosil-tRNA sintetase INF2 Formina invertida 2 GNB4 Proteína de ligação de nucleotídeo de guanina, beta-4 GDAP1 Proteína associada à diferenciação induzida por gangliosídeo 1 MTMR2 Proteína relacionada a miotubularina 2 SBF2 Fator de ligação SET 2 SBF1 Fator de ligação SET 1 SH3TC2 Proteína KIAA1985 NDRG1 Gene de N-myc downstream regulado PRX Periaxina HK1 Hexoquinase 1
FGD4 Proteína de ligação de filamento de actina Frabin FIG4 Domínio Sac contendo inositol fosfatase 3 SURF1 surfeit 1 GJB1 Proteína de junção comunicante, beta 1, 32kDa (conexina 32) AIFM1 Fator indutor de apoptose, associado à mitocôndria 1 PRPS1 Fosforibosila pirofosfato sintetase 1 PDK3 Piruvato desidrogenase quinase, isoenzima 3 KIF1B Membro da família quinesina 1B MFN2 Mitofusina 2 RAB7A RAB7, membro da família oncogene RAS TRPV4 Canal de cátion de receptor de potencial transiente, subfamília V, membro 4 GARS Glicil-tRNA sintetase HSPB1 Proteína de choque térmico 27kDa 1 HSPB8 Proteína de choque térmico 27kDa 8 AARS Alanil-tRNA sintetase DYNC1H1 Dineína, citoplasmática 1, cadeia pesada 1 LRSAM1 repetição rica em leucina e motivo alfa estéril contendo 1 DHTKD1 desidrogenase E1 e domínio de transcetolase contendo 1 TRIM2 Motivo tripartido contendo 2 TFG Gene TRK fundido MARS metionil-tRNA sintetase KIF5A Membro da família quinesina 5A LMNA Lamina A/C MED25 Subunidade do complexo mediador 25 DNAJB2 Homólogo de DnaJ (Hsp40), subfamília B, membro 2
HINT1 Proteína de ligação de nucleotídeo da tríade de histidina 1 KARS Lisil-tRNA sintetase PLEKHG5 Domínio de homologia a Pleckstrina contendo membro de família G (com domínio RhoGef) 5 COX6A1 Oxidase de Citocromo c subunidade VIa polipeptídeo 1 IGHMBP2 Proteína de ligação de imunoglobulina mu 2 SPTLC1 Serina palmitoiltransferase subunidade 1 SPTLC2 Serina palmitoiltransferase cadeia longa subunidade base 2 ATL1 Atlastina GTPase 1 KIF1A Membro da família quinesina 1A WNK1 WNK proteína quinase deficiente em lisina 1 IKBKAP Inibidor do potenciador do gene de polipeptídeo kappa leve em células B, proteína associada ao complexo de quinase NGF Fator de crescimento nervoso (polipeptídeo beta) DNMT1 DNA (citosina-5)-metiltransferase 1 SLC12A6 Co-transportador de cloreto de potássio KCC3 GJB3 Proteína de junção comunicante, beta 3, 31kDa (=conexina 31) sept-09 Septina 9 GAN Gigaxonina CTDP1 CTD fosfatase subunidade 1 VRK1 Quinase relacionada à vaccínia 1 Paraplegia hereditária Símbolo do proteína gene ATL1 Atlastina SPAST Spastina
NIPA1 Não impresso na síndrome de Prader-Willi/Angelman 1 KIAA0196 Strumpelina KIF5A Membro da família quinesina 5A RTN2 Reticulona 2 HSPD1 Proteína de choque térmico 60kDa 1(chaperonina) BSCL2 Seipina REEP1 Proteína receptora acessória 1 ZFYVE27 Protrudina SLC33A1 Carreador de soluto família 33 (transportador de acetil-CoA) CYP7B1 Citocromo P450, família 7, subfamília B, polipeptídeo 1 SPG7 Paraplegina SPG11 Spatacsina ZFYVE26 Spastizina ERLIN2 Balsa lipídica ER associada 2 SPG20 Spartina SPG21 Maspardina B4GALNT1 Beta-1,4-N-acetil-galactosaminil transferase 1 DDHD1 Domínio DDHD contendo 1 KIF1A Membro da família quinesina 1A FA2H 2-hidroxilase de ácido graxo PNPLA6 Domínio de fosfolipase tipo patatina contendo 6 C19orf12 cromossomo 19 quadro de leitura aberta 12 GJC2 proteína de junção comunicante, gama 2, 47kDa NT5C2 5'-nucleotidase, citosólica II GBA2 glucosidase, beta (ácido biliar) 2 AP4B1 complexo de proteína 4 relacionado ao adaptador,
subunidade beta 1 AP5Z1 Proteína hipotética LOC9907 TECPR2 repetição de hélice beta de tectonina contendo 2 AP4M1 complexo de proteína relacionado ao adaptador 4, subunidade mu 1 AP4E1 complexo de proteína relacionado ao adaptador 5, subunidade zeta 1 AP4S1 complexo de proteína relacionado ao adaptador 4, subunidade sigma 1 DDHD2 Domínio DDHD contendo 2 C12orf65 complexo de proteína relacionado ao adaptador 4, subunidade sigma 1 CYP2U1 citocromo P450, família 2, subfamília U, polipeptídeo 1 ARL6IP1 Proteína de interação tipo 6 fator de ribosilação de ADP 1 AMPD2 Monofosfato de adenosina deaminase 2 ENTPD1 ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1 ALDH3A2 Aldeído desidrogenase 3A2 ALS2 Alsina L1CAM Molécula de adesão de célula L1 PLP1 Proteína proteolipídica 1 MTPAP poli(A) polimerase mitocondrial AFG3L2 Gene da família AFG3 ATPase tipo 3 2 (S. cerevisiae) 1 SACS Sacsina Outras doenças neuromusculares Gene proteína TOR1A Torsina A
SGCE Sarcoglicano, épsilon IKBKAP Inibidor do potenciador do gene de polipeptídeo kappa leve em células B, proteína associada ao complexo de quinase TTR Transtiretina (pré-albumina, amiloidose tipo I) KIF21A Membro da família quinesina 21A PHOX2A Proteína homeobox sem arista tipo em pares 2A TUBB3 Tubulina, beta 3 TPM2 Tropomiosina 2 (beta) MYH3 Miosina, cadeia pesada 3, músculo esquelético, embrionário TNNI2 Troponina I, tipo 2 TNNT3 Troponina T3, esquelética SYNE1 Envelope nuclear 1 contendo repetição de espectrina (nesprina 1) MYH8 Miosina cadeia pesada, 8, músculo esquelético, perinatal POLG Polimerase (dirigida por DNA), gama SLC25A4 Carreador mitocondrial; translocador de nucleotídeo de adenina C10orf2 cromossomo 10 quadro de leitura aberta 2 POLG2 DNA polimerase mitocondrial, subunidade acessória RRM2B Ribonucleotídeo redutase M2 B (TP53 indutível) TK2 Timidina quinase 2, mitocondrial SUCLA2 Succinato-CoA ligase, formadora de ADP, subunidade beta OPA1 atrofia óptica 1 STIM1 Molécula de interação estromal 1 ORAI1 ORAI modulador de cálcio ativado por liberação de cálcio 1 PUS1 Pseudouridilato sintase 1 CHCHD10 Domínio helicoidal-helicoidal contendo 10
CASQ1 Calsequestrina 1 (contração rápida, músculo esquelético) YARS2 tirosil-tRNA sintetase 2, mitocondrial
[0069] Qualquer um dos genes listados acima pode ser direcionado na terapia gênica de substituição, em que o gene de interesse é uma versão funcional do gene deficiente ou mutado.
[0070] Alternativamente, os genes listados acima podem ser usados como alvo para edição de genes. A edição de genes é usada para corrigir a sequência de um gene mutado ou modificar a expressão ou a regulação de um gene deficiente/anormal de modo que um gene funcional seja expresso nas células musculares. Nesses casos, o gene de interesse é escolhido a partir daqueles que codificam RNAs terapêuticos tais como RNAs interferentes, RNAs guia para edição de genoma e RNAs antissenso capazes de salto de exon, em que os RNAs terapêuticos têm como alvo a lista anterior de genes. Ferramentas tal como CRISPR/Cas9 podem ser usadas para essa finalidade.
[0071] Em algumas modalidades, o gene alvo para terapia gênica (terapia gênica aditiva ou edição de genes) é um gene responsável por uma das distrofias musculares listadas acima, particularmente DMD (genes DMD, BMD); LGMDs (gene CAPN3 e outros); Distrofias fascio-escápulo-umeral, tipo 1 (FSHD1A; gene DUX4 ou FRG1) e tipo 2 (FSHD1B; gene SMCHD1) e titinopatias (gene TTN).
[0072] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da invenção é para uso no tratamento de doenças musculares (ou seja, miopatias) ou lesões musculares, particularmente distúrbios genéticos neuromusculares, sem danos ao fígado, como por exemplo: Distrofias musculares, Distrofias musculares congênitas, Miopatias congênitas, Miopatias distais, Outras miopatias, Síndromes miotônicas, Doenças musculares dos canais iônicos, Hipertermia maligna, Miopatias metabólicas, Cardiomiopatias hereditárias, Síndromes miastênicas congênitas, Doenças do neurônio motor, Paraplegia hereditária,
Neuropatias motoras e sensoriais hereditárias e outros distúrbios neuromusculares.
[0073] As distrofias musculares incluem, particularmente: - Distrofinopatias, um espectro de doenças musculares ligadas ao cromossomo X causadas por variantes patogênicas no gene DMD, que codifica a proteína distrofina. As distrofinopatias compreendem a distrofia muscular de Duchenne (DMD), a distrofia muscular de Becker (DMD) e a miocardiopatia dilatada associada à DMD; - As distrofias musculares do tipo cinturas (LGMDs), que são um grupo de distúrbios clinicamente semelhantes à DMD, mas ocorrem em ambos os sexos como um resultado de herança autossômica recessiva e autossômica dominante. As distrofias do tipo cinturas são causadas por mutação de genes que codificam sarcoglicanos e outras proteínas associadas à membrana da célula muscular, que interagem com a distrofina. O termo LGMD1 se refere a tipos genéticos que mostram herança dominante (autossômica dominante), enquanto LGMD2 se refere a tipos com herança autossômica recessiva. Variantes patogênicas em mais de 50 loci foram relatadas (LGMD1A para LGMD1H; LGMD2A para LGMD2Y). A calpainopatia (LGMD2A) é causada por mutação do gene CAPN3 com mais de 450 variantes patogênicas descritas; - A Distrofia Muscular de Emery-Dreifuss (EDMD) causada por defeitos em um dos genes, incluindo o EMD gene (codificando para emerina), o FHL1 gene e o LMNA gene (codificando a lâmina A e C); - A distrofia muscular relacionada a Nesprina-1 e Nesprina-2 causada por defeitos no gene SYNE1 e SYNE2, respectivamente; Distrofia muscular relacionada a LUMA causada por defeitos no gene TMEM43; Distrofia muscular relacionada ao LAP1B causada por defeitos no gene TOR1AIP1; e - Distrofia muscular fascio-escápulo-umeral, tipo 1 (FSHD1A), como associada a defeito no gene DUX4 (contração da repetição do macrossatélite D4Z4 na região subtelomérica do cromossomo 4q35) ou no FRG1 gene; Distrofia muscular fascio-escápulo-umeral, tipo 2 (FSHD1B) causada por defeitos no gene SMCHD1.
[0074] Um exemplo específico de edição de genes seria o tratamento da distrofia muscular do tipo cinturas 2A (LGMD2A), que é causada por mutações no gene calpaína-3 (CAPN3). Outros exemplos seriam o tratamento de mutações nos genes DMD ou TNT.
[0075] Assim, por edição ou substituição de genes, uma versão correta desse gene é provida nas células musculares de pacientes afetados, o que pode contribuir para terapias eficazes contra essa doença. Outras doenças genéticas do músculo, conforme listadas acima, podem ser tratadas por substituição ou edição de genes usando o mesmo princípio.
[0076] A terapia gênica de substituição ou aditiva pode ser usada para tratar o câncer, particularmente rabdomiossarcomas. Os genes de interesse no câncer podem regular o ciclo celular ou o metabolismo e a migração das células tumorais, ou induzir a morte de células tumorais. Por exemplo, a caspase-9 induzível pode ser expressa em células musculares para desencadear a morte celular, preferencialmente em terapia de combinação para induzir respostas imunológicas antitumorais duráveis.
[0077] A edição de genes pode ser usada para modificar a expressão de genes em células musculares, no caso de autoimunidade ou câncer, ou para perturbar o ciclo de vírus em tais células. Em tais casos, preferencialmente, o gene de interesse é escolhido a partir daqueles que codificam o RNA guia (gRNA), as endonucleases específicas ao sítio (TALEN, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, nuclease Cas), os modelos de DNA e os componentes de RNAi, tais como shRNA e microRNA. Ferramentas tal como CRISPR/Cas9 podem ser usadas para essa finalidade.
[0078] Em algumas modalidades, a terapia gênica é usada para tratar doenças que afetam outros tecidos, pela expressão de um gene terapêutico no tecido muscular. Isto é útil para evitar a expressão do gene terapêutico no fígado, particularmente em pacientes com um distúrbio hepático concomitante, como hepatite. O gene terapêutico codifica preferencialmente uma proteína terapêutica, peptídeo ou anticorpo que é secretado a partir das células musculares para a corrente sanguínea onde pode ser entregue a outros tecidos alvo, como por exemplo o fígado. Exemplos de genes terapêuticos incluem, sem limitação: genes do fator VIII, fator IX e GAA.
[0079] A composição farmacêutica da invenção que compreende partículas de vetor de AAV com tropismo pelo fígado reduzido pode ser administrada a pacientes com doença hepática concomitante, como por exemplo hepatite incluindo hepatite viral ou tóxica.
[0080] No contexto da invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma dose suficiente para reverter, aliviar ou inibir o progresso do distúrbio ou condição a que esse termo se aplica, ou reverter, aliviar ou inibir o progresso de um ou mais sintomas do distúrbio ou da condição a que esse termo se aplica.
[0081] A dose eficaz é determinada e ajustada em função de fatores como a composição usada, a via de administração, as características físicas do indivíduo em consideração, como sexo, idade e peso, medicação simultânea e outros fatores, que os especialistas na área médica as artes reconhecerão.
[0082] Nas várias modalidades da presente invenção, a composição farmacêutica compreende um carreador e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.
[0083] Um “carreador farmaceuticamente aceitável” se refere a um veículo que não produz uma reação adversa, alérgica ou outra reação desagradável quando administrada a um mamífero, especialmente um humano, como apropriado. Um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a um meio sólido, semissólido ou líquido de preenchimento não tóxico, diluente, material de encapsulação ou auxiliar de formulação de qualquer tipo.
[0084] Preferencialmente, a composição farmacêutica contém os veículos os quais são farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação capaz de ser injetada. Estas podem ser particularmente soluções salinas isotônicas, estéreis (fosfato monossódico ou dissódico, sódio, cloreto de potássio, cálcio ou magnésio e afins ou misturas desses sais), ou secas, especialmente composições liofilizadas que mediante a adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou soro fisiológico, permitam a constituição de soluções injetáveis.
[0085] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou suspensões aquosas estéreis. A solução ou suspensão pode compreender aditivos que são compatíveis com os vetores virais e não evitam a entrada de partícula do vetor viral nas células alvo. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida à medida que exista fácil seringabilidade. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias e fungos. Um exemplo de uma solução apropriada é um tampão, como solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou de Ringer com lactato.
[0086] A invenção provê também um método para o tratamento de uma doença que afeta o tecido muscular, particularmente o tecido muscular esquelético e/ou tecido cardíaco, compreendendo: a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica como descrito acima.
[0087] A invenção também provê um método para tratar uma doença pela expressão de um gene terapêutico no tecido muscular, compreendendo: a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica como descrito acima.
[0088] Como usado na presente invenção, o termo “paciente” ou “indivíduo” se refere a um mamífero. Preferencialmente, um paciente ou indivíduo de acordo com a invenção é um humano.
[0089] No contexto da invenção, o termo “tratar” ou “tratamento”, como usado no presente documento, significa reverter, aliviar ou inibir o progresso do distúrbio ou condição a que tal termo se aplica, ou reverter, aliviar ou inibir o progresso de um ou mais sintomas do distúrbio ou da condição a que tal termo se aplica.
[0090] A composição farmacêutica da presente invenção é geralmente administrada de acordo com procedimentos conhecidos, em dosagens e por períodos de tempo eficazes para induzir um efeito terapêutico no paciente.
[0091] A administração pode ser parenteral, oral, local ou loco-regional. A administração parenteral é vantajosamente por injeção ou perfusão, tal como subcutânea (SC), intramuscular (IM), intravascular como intravenosa (IV), intraperitoneal (IP), intradérmica (ID) ou outras. Preferencialmente, a administração produz um efeito sistêmico em todo o corpo, ou seja, todos os músculos do paciente, incluindo o diafragma e o coração. Preferencialmente, a administração é sistêmica, mais preferencialmente parenteral.
[0092] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais, as quais estão dentro da habilidade na técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura.
[0093] A invenção será agora ser exemplificada com os exemplos a seguir, os quais não são limitativos, com referência aos desenhos anexos, nos quais:
LEGENDAS DAS FIGURAS
- Figura 1: Projeto de novos sorotipos híbridos de AAV entre AAV9 e AAVrh74. A. Genes Cap (VP1) de AAV9 e AAVrh74 destacando a sequência da região variável. As sequências do termo N e do termo C da região variável são a SEQ ID NO: 37 e a SEQ ID NO: 38 para AAV9 e a SEQ ID NO: 39 e a SEQ ID NO: 40 para AAVrh74. B. Genes Cap AAV9-rh74 híbridos e AAVrh74-9 híbridos (VP1). - Figura 2: Produções de novos sorotipos híbridos de AAV entre AAV9 e AAVrh74
[0094] Os sorotipos híbridos AAV9-rh74 e AAVrh74-9 e os controles (AAV9, AAVrh74) foram produzidos em células HEK293T. Os genomas virais foram quantificados por PCR em tempo real Taqman. As barras de erro representam SEM. - Figura 3: Desenho do estudo de biodistribuição. Vg: genoma viral. - Figura 4: Quantificação da expressão de transgene em músculos e órgãos após a administração sistêmica de sorotipos híbridos de AAV.
[0095] A expressão de luciferase foi quantificada nos músculos esqueléticos (A e B) e órgãos (C e D) de camundongos injetados (com dose baixa = 2 E10 vg/camundongo (A e C) ou dose alta = 1 E11 vg/camundongo (B e D) de sorotipos e nos controles AAV9-rh74 e AAVrh74-9 híbridos (AAV9, AAVrh74). As barras de erro representam SEM. TA: tibial anterior. Pso: Psoas. Qua: Quadríceps. Dia: Diafragma. RLU: unidades de luz relativa. EXEMPLO 1: Projeto e produção de vetores de sorotipo AAVr híbridos com capsídeos AAV9-rh74 e rh74-AAV9
1. Materiais e Métodos Construção de plasmídeo para novos sorotipos
[0096] Para construir um plasmídeo contendo a sequência AAV2 Rep e Cap
9-rh74 Híbrido, um fragmento de 1029 nt, contendo a parte altamente variável de AAV-rh74 Cap flanqueado com fragmentos de sequência AAV9 Cap e sítios de restrição BsiWI em 5' e Eco47III em 3', foi sintetizado (GENEWIZ) Esse fragmento foi então inserido usando os locais de restrição mencionados no plasmídeo pAAV2-9, que contém AAV2 Rep e AAV9 Cap, para substituir a sequência correspondente de AAV9 Cap.
[0097] Para construir um plasmídeo contendo a sequência AAV2 Rep e Cap rh74-9 Híbrido, um fragmento de 2611 nt, contendo a parte altamente variável de AAV-9 Cap flanqueada com o resto da sequência AAV_rh74 Cap, uma parte da sequência AAV2 Rep e dos sítios de restrição, HindIII em 5’ e PmeI em 3', foi sintetizado (GENEWIZ). Este fragmento foi então inserido usando os sítios de restrição mencionados no plasmídeo pAAV2-9, que contém AAV2 Rep e AAV9 Cap, para substituir a sequência AAV9 Cap completa. Produção de AAV
[0098] Dois protocolos, correspondendo a duas escalas de produção, foram utilizados nesse estudo. Na condição de miniescala, HEK293 aderentes são cultivadas em DMEM adicionado com 10% de soro fetal bovino (FBS), em placas de 6 poços múltiplos. Na condição de escala superior, HEK293T são cultivadas em suspensão em 250 mL de meio sem soro. As células são transfectadas com 3 plasmídeos: i) um plasmídeo transgênico, contendo AAV2 RTIs flanqueando um cassete de expressão codificando para a luciferase de vaga-lume, ii) o plasmídeo auxiliar pXX6, contendo sequências adenovirais necessárias para a produção de AAV, e iii) um plasmídeo contendo os genes Rep e Cap de AAV, definindo o sorotipo de AAV. Dois dias após a transfecção, as células são lisadas para libertar as partículas de AAV.
[0099] O lisado viral é purificado por meio de duas rodadas de ultracentrifugação com gradiente de densidade de cloreto de césio, seguida de diálise ou cromatografia de afinidade. Os genomas virais são quantificados por um ensaio de PCR em tempo real TaqMan usando primers e sondas correspondentes aos RTIs do genoma do vetor de AAV (Rohr et al., J. Virol. Methods, 2002, 106, 81-88).
2. Resultados Desenho de novos sorotipos
[00100] As sequências de aminoácidos de AAV9 (SEQ ID NO: 1) e AAV-rh74 (SEQ ID NO: 2) proteína VP1 (codificada pelos genes Cap) foram alinhadas usando Blastp, e uma região altamente variável foi detectada, variando de posição 449 no aminoácido para a posição 609 no Cap AAV9, e da posição 450 para a posição 611 no Cap AAV-rh74 (Figura 1A). Em seguida, dois novos genes Cap (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7) foram construídos pela substituição da região altamente variável de cada sorotipo pelo outro (Figura 1B). Esses dois genes Cap híbridos foram inseridos em um plasmídeo contendo a sequência Rep AAV2, permitindo a produção de partículas de AAV recombinantes. Os novos sorotipos foram denominados “AAV 9-rh74 Híbrido” (SEQ ID NO: 3) para aquele contendo a sequência AAV9 cap em sua parte principal, e a parte AAV-rh74 altamente variável, e “AAV rh74-9 Híbrido” (SEQ ID NO: 4) para aquele contendo a sequência AAVrh74 Cap na sua parte principal e a parte AAV9 altamente variável. Produção dos novos sorotipos de AAV híbridos
[00101] A produção de AAV foi realizada em duas escalas diferentes com os novos sorotipos híbridos e os controles (2mL em placa de 6 poços ou 250mL de cultura em suspensão). Como mostrado em Figura 2, os novos sorotipos híbridos podem ser produzidos com um rendimento adequado para aplicações de transferência de genes. EXEMPLO 2: Estudo de biodistribuição de vetores de sorotipo de AAV híbridos com capsídeos AAV9-rh74 e rh74-9
1. Materiais e Métodos Experimentos in vivo
[00102] Os vetores de AAV foram administrados a camundongos B6Albino machos com um mês de idade, por injeção intravenosa na veia da cauda. Duas doses foram avaliadas, uma dose baixa de 2 E10 (2,1010) genomas virais (vg)/camundongo, e uma alta dose de 1 E11 (1011) vg/camundongo. Quinze dias após a injeção, a imagem da luciferase foi realizada usando o dispositivo IVIS Lumina (PERKIN ELMER) em camundongos previamente anestesiados (cetamina + xilazina) e injetados intraperitonealmente por luciferina. Trinta dias após a injeção, os camundongos foram sacrificados e os músculos e órgãos esqueléticos foram amostrados e congelados em nitrogênio líquido. Análise Molecular
[00103] As amostras foram homogeneizadas em tampão de lise [Tris-base 25mM, MgCl2 8mM, DTT 1mM, EDTA 1mM, glicerol 15%, Triton X-100 0,2%] suplementado com Coquetel Inibidor de Protease (Roche). A quantificação da expressão de luciferase foi realizada em lisados de amostra usando o leitor de placas multimodo Enspire (Roche), em Tampão de Ensaio [Tris-base 25mM, MgCl2 8mM, DTT 1mM, EDTA 1mM, glicerol 15%, ATP 2mM] extemporaneamente suplementado com luciferina a 83 µM. A quantidade total de proteína nas amostras foi medida usando o kit de ensaio de proteína Pierce BCA (Thermo Fisher). O resultado da luminescência de luciferase foi normalizado pela quantidade total de proteína.
[00104] Para a quantificação de genomas virais em amostras (VCN para Número de Cópia de Vetor), o DNA foi extraído de amostras usando tecido NucleoSpin (Macherey-Nagel). O PCR em tempo real foi realizado em 100 ng de DNA, usando o mesmo protocolo descrito acima para a titulação de vetores de AAV. O exon Mex5 do gene da titina foi amplificado no mesmo experimento para ser usado como controle genômico.
2. Resultados
[00105] Para avaliar a biodistribuição dos novos sorotipos, foram produzidos AAV híbrido e vetores de controle contendo um cassete de expressão codificando o gene repórter de luciferase sob o controle do promotor CMV ubíquo. Os vetores foram administrados a camundongos em duas doses (dose baixa = 2 E10 vg/camundongo; dose alta = 1 E11 vg/camundongo), por injeção sistêmica. A imagem de corpo inteiro foi realizada 15 dias após a administração, e diferentes músculos e órgãos esqueléticos foram amostrados após um mês de expressão (Figura 3).
[00106] Após a amostragem, a expressão de luciferase em músculos e outros órgãos foi quantificada e então normalizada pela quantidade total de proteína na amostra, em diferentes músculos esqueléticos e órgãos.
[00107] No músculo, o AAV 9-74 híbrido permitiu um bom nível de expressão de transgene em todos os músculos testados, incluindo músculos esqueléticos e cardíacos, de forma semelhante ao AAVrh74 (Figura 4A a 4D). De maneira interessante, ambos os híbridos possuem uma expressão de transgene drasticamente reduzida no fígado, em comparação com o alto nível de expressão de transgene dos controles AAV9 ou AAV-rh74 (Figura 4C e 4D).
[00108] Dois novos sorotipos foram gerados usando uma combinação de AAV9 e AAV-rh74, dois sorotipos que infectam eficientemente o tecido muscular, mas também o fígado. Os híbridos resultantes apresentam transferência gênica no músculo esquelético, sem transdução eficiente do fígado. Esses sorotipos híbridos são, portanto, de interesse quando a transdução do músculo esquelético, mas não do fígado, é necessária. EXEMPLO 3: Vetor de sorotipo AAV9-rh74 híbrido modificado por peptídeo
[00109] A sequência do Cap 9-rh74 híbrido foi modificada com um peptídeo para aumentar o tropismo de vetor de sorotipo de AAV 9-rh74 híbrido para tecido muscular.
A modificação do capsídeo de AAV foi realizada de acordo com Kienle EC (Dissertação para o grau de Doutor em Ciências Naturais, Faculdades Combinadas de Ciências Naturais e de Matemática da Universidade de Heidelberg Ruperto-Carola, Alemanha, 2014) usando um peptídeo conforme divulgado em Michelfelder et al. (PLoS ONE, 2009, 4, e5122). Resumidamente, o hexapeptídeo QQNAAP (SEQ ID NO: 41) presente na VP1 do Cap híbrido9-rh74 (posições 587 a 592 da SEQ ID NO: 3) é mutado para o octapeptídeo GQSGAQAA (SEQ ID NO: 42) e o peptídeo P1 (RGDLGLS; SEQ ID NO: 12) é inserido entre a glicina na posição 4 e a alanina na posição 5. O Cap 9-rh74 híbrido modificado com peptídeo P1 possui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9 e a sequência de codificação correspondente é SEQ ID NO: 10. Os vetores são produzidos por transfecção tripla em células HEK293 cultivadas em suspensão e purificadas por cromatografia de afinidade, conforme descrito no exemplo 1. Os vetores são injetados em camundongos, um mês após a injeção, os camundongos são sacrificados e os tecidos coletados para avaliar a biodistribuição como descrito no exemplo 2. O efeito esperado dessa modificação é o aumento da quantidade de vetor nos tecidos musculares.

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína do capsídeo de vírus adeno-associado (AAV) recombinante, caracterizada pelo fato de ser um híbrido entre as proteínas de capsídeo de AAV do sorotipo 9 (AAV9) e de AAV do sorotipo 74 (AAVrh74), em que a referida proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante possui um tropismo pelo fígado reduzido em comparação com as proteínas de capsídeo de AAVrh74 e AAV9 precursoras.
2. Proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que possui um tropismo muscular semelhante ao das proteínas de capsídeo de AAVrh74 e/ou de AAV9 precursoras.
3. Proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que resulta da substituição de uma região variável na sequência de capsídeo de AAVrh74 ou de AAV9 com a região variável correspondente da outra sequência de capsídeo do sorotipo de AAV, em que a região variável do capsídeo de AAV9 corresponde à sequência situada a partir de qualquer uma das posições 331 a 493 a qualquer uma das posições 556 a 736 no capsídeo de AAV9 da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 aminoácidos consecutivos da sequência situada a partir das posições 493 a 556 no capsídeo de AAV9 da SEQ ID NO: 1, e a região variável do capsídeo de AAVrh74 corresponde à sequência situada a partir de qualquer uma das posições 332 a 495 para qualquer uma das posições 558 a 738 em capsídeo de AAVrh74 da SEQ ID NO: 2 ou um fragmento de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 aminoácidos consecutivos da sequência situada a partir das posições 495 a 558 em capsídeo de AAVrh74 da
SEQ ID NO: 2.
4. Proteína híbrida recombinante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante resulta da substituição da região variável correspondente à sequência situada a partir das posições 449 a 609 no capsídeo de AAV9 da SEQ ID NO: 1 ou a partir das posições 450 a 611 no capsídeo de AAVrh74 da SEQ ID NO: 2 com a região variável correspondente da outra sequência de capsídeo do sorotipo de AAV.
5. Proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e nas sequências possuindo pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as referidas sequências, que compreende preferencialmente uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências da SEQ ID NO: 3 e nas sequências possuindo pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a referida sequência; mais preferencialmente que compreende a sequência da SEQ ID NO:
3.
6. Proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende a inserção de um peptídeo que aumenta o direcionamento do tecido muscular esquelético ou cardíaco por vetores de AAV.
7. Proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o referido peptídeo compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 12 a
34.
8. Proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 9 e as sequências possuindo pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a referida sequência.
9. Proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é uma proteína VP1, VP2 ou VP3 híbrida.
10. Proteína do capsídeo de AAV quimérica recombinante, caracterizada pelo fato de ser selecionada a partir do grupo que consiste em: - uma proteína VP1 quimérica compreendendo: (i) uma região N-terminal específica de VP1 possuindo uma sequência a partir de sorotipo de AAV natural ou artificial diferente de AAV9 e AAVrh74, (ii) uma região N-terminal específica de VP2 possuindo uma sequência a partir de AAV9, AAVrh74 ou sorotipo de AAV natural ou artificial diferente de AAV9 e AAVrh74, e (iii) uma região C-terminal de VP3 possuindo a sequência de uma proteína VP3 híbrida definida na reivindicação 6, e - uma proteína VP2 quimérica compreendendo: (i) uma região N-terminal específica de VP2 possuindo uma sequência a partir de sorotipo de AAV natural ou artificial diferente de AAV9 e AAVrh74, e (ii) uma região C-terminal de VP3 possuindo a sequência de uma proteína VP3 híbrida definida na reivindicação 6.
11. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou a proteína do capsídeo de AAV quimérica recombinante definida na reivindicação 10, em forma expressável e, eventualmente, que codifica adicionalmente a proteína AAV Replicase em forma expressável.
12. Plasmídeo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo definido na reivindicação 11.
13. Partícula do vetor de AAV que empacota um gene de interesse, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína do capsídeo de AAV híbrida recombinante definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e/ou a proteína do capsídeo de AAV quimérica recombinante definida na reivindicação 10, e eventualmente também pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV a partir de sorotipo de AAV natural ou artificial diferente de AAV9 e AAVrh74.
14. Partícula do vetor de AAV de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) genes terapêuticos; (ii) genes que codificam proteínas ou peptídeos terapêuticos, tais como anticorpos terapêuticos ou fragmentos de anticorpos e enzimas de edição de genoma; e (iii) genes que codificam RNAs terapêuticos, tais como RNAs interferentes, RNAs guias para edição de genoma e RNAs antissenso capazes de salto de éxon.
15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de partículas do vetor de AAV definidas na reivindicação 13 ou 14.
16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento em terapia gênica, preferencialmente para tratar doenças genéticas, câncer ou doenças autoimunes que afetam os tecidos musculares.
17. Composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que direciona um gene responsável por um distúrbio genético neuromuscular selecionado a partir do grupo compreendendo: distrofinopatias, distrofias musculares do tipo cinturas, distrofias fascio- escápulo-umeral e titinopatias.
18. Composição farmacêutica para o uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o gene direcionado é selecionado a partir do grupo compreendendo: DMD, BMD, CAPN3, DUX4, FRG1, SMCHD1 e genes TTN.
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