ES2616016T3 - Clados de virus adeno-asociados (AAV), secuencias, vectores que las contienen y usos de los mismos - Google Patents

Clados de virus adeno-asociados (AAV), secuencias, vectores que las contienen y usos de los mismos Download PDF

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ES2616016T3 ES10182587.5T ES10182587T ES2616016T3 ES 2616016 T3 ES2616016 T3 ES 2616016T3 ES 10182587 T ES10182587 T ES 10182587T ES 2616016 T3 ES2616016 T3 ES 2616016T3
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Abstract

Un virus adeno-asociado recombinante que comprende una cápsida de AAV que tiene la secuencia de aminoácidos 1 a 731 de SEC ID N°: 95 (AAVpi.2) o una cápside de AAV funcional que tiene al menos una identidad de 99% con la misma, en el que el AAV comprende además un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterólogo unido operativamente con secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula hospedadora neuronal.

Description

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DESCRIPCION
Clados de virus adeno-asociados (AAV), secuencias, vectores que las contienen y usos de los mismos
La presente solicitud contiene trabajo apoyado por subvenciones NIDDK P30 DK47757 y NHLBI P01 HL59407 de los Institutos Nacionales de Salud INS (National Institutes of Health (NIH)). El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en esta invencion.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El virus adeno-asociado (AAV), un miembro de la familia de Parvovirus, es un virus icosahedrico, sin envoltura, pequeno, con genomas de ADN lineal monocatenario de 4,7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV se asigna al genero Dependovirus, porque se ha descubierto en virus como un contaminante en reservas de adenovirus purificadas. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, despues de la infeccion, se integran de forma espedfica para el sitio en cromosomas hospedadores y una fase infecciosa en la que, despues de infeccion por adenovirus o virus del herpes simple, los genomas integrados posteriormente se rescatan, replican y empaquetan en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, amplio rango de hospedador de infecciosidad, incluyendo celulas no en division, e integracion cromosomica espedfica de sitio potencial hacen al AAV una herramienta atractiva para transferencia genica.
Estudios recientes sugieren que los vectores de AAV pueden ser el vehmulo preferido para suministro genico. Hasta la fecha, ha habido varios aAv bien caracterizados diferentes aislados de seres humanos o primates no humanos (NHP).
Se ha descubierto que los AAV de diferentes serotipos muestran diferentes eficacias de transfeccion, y tambien muestran tropismo para diferentes celulas o tejidos. Sin embargo, la relacion entre estos serotipos diferentes no se ha explorado previamente.
La solicitud anterior del solicitante, publicada como el documento EP 1.310.571, desvela metodos para detectar AAV en una muestra y metodos para identificar el serotipo de secuencias de AAV en una muestra. Tambien desvela varias secuencias de AAV pero no las de la presente invencion.
Para el suministro de moleculas heterologas son deseables construcciones basadas en AAV.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion implica “superfamilias” o “clados” de AAV de secuencias filogeneticamente relacionadas. Estos clados de AAV proporcionan una fuente de secuencias de AAV utiles para dirigir y/o suministrar moleculas a celulas o tejidos diana deseados.
En un aspecto, la invencion proporciona un virus adeno-asociado recombinante que comprende una capsida de AAV que tiene la secuencia de aminoacidos 1 a 731 de SEC ID N°: 95 (AAVpi.2) o una capsida de AAV funcional que tiene al menos una identidad de 99% con la misma, en el que el AAV comprende ademas un minigen que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterologo unido operativamente con secuencias reguladoras que dirigen su expresion en una celula hospedadora neuronal.
La invencion tambien se extiende a una capsida de virus adeno-asociado aislada que comprende una protema de capsida de AAV que tiene la secuencia de aminoacidos 1 a 731 de SEC ID N°: 95; a un virus adeno-asociado recombinante que comprende una protema de capsida que tiene la secuencia de aminoacidos 1 a 731 de SEC ID N°: 95, y a una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una protema que tiene la secuencia de aminoacidos 1 a 731 de SEQ ID NO:95.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para generar un virus adeno-asociado recombinante que comprende una capsida de AAV que comprende las etapas de cultivar una celula hospedadora que contiene: (a) una molecula que codifica una protema de capsida de AAV que tiene la secuencia de aminoacidos 1 a 731 de SEQ ID NO:95; (b) un gen de rep funcional; (c) un minigen que comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un transgen; y (d) suficientes funciones auxiliares para permitir el empaquetamiento del minigen en la protema de la capsida de aAv.
La presente invencion tambien proporciona celulas hospedadoras in vitro que comprenden los AAV reivindicados, asf como composiciones que contienen los AAV y usos para las mismas. Provechosamente, estas composiciones estan particularmente bien adaptadas para su uso en composiciones que requieren la re-administracion de vectores de AAV para fines terapeuticos o profilacticos.
Estos y otros aspectos de la invencion resultaran facilmente evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de la invencion.
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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 es un arbol que muestra la relacion filogenetica construida usando la heunstica de Union de Vecinos con medicion de distancia de correccion de Poisson. La relacion se determino basandose en la protema de la capsida vp1 de AAV aislado, con el AAV aislado agrupados en clados. Los grupos de clones de capsida individuales se clasifican en clados basandose en su ascendencia comun. La nomenclatura de clados va de A a F; los subtipos se representan por la letra del clado seguida de un numero.
Las Figs. 2A-2AE son un alineamiento de las secuencias de aminoacidos de protemas de la capsida vp1 de AAV, con la numeracion de las secuencias individuales indicada, y previamente publicada AAV1 [SEC ID N°: 219]; AAV2 [SEC ID N°: 221]; AAV3-3 [SEC ID N°: 217]; AAV4-4 [SEC ID N°: 218]; AAV5 [SEC ID N°: 216]; AAV6 [SEC ID N°: 220]; AAV7 [SEC ID N°: 222]; AAV8 [SEC ID N°: 223], y; rh. 25/42-15; 29.3/bb.1; cy.2; 29.5/bb.2; rh.32, rh.33, rh.34, rh.10; rh.24; rh14, rh.16, rh.17, rh.12, rh.18, rh.21 (anteriormente denominada 41.10); rh.25 (anteriormente denominada 41.15); rh2; rh.31; cy.3; cy.5; rh.13; cy.4; cy.6; rh.22; rh.19; rh.35; rh.37; rh.36; rh.23; rh.8; y ch.5 [Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos N.° 2003/0138772 A1 (24 jul, 2003)]. Las secuencias incluyen hu.14/AAV9 [SEC ID N°: 123]; hu.17 [SEC ID N°: 83], hu. 6 [SEC ID N°: 84], hu.42 [SEC ID N°: 85], rh.38 [SEC ID N°: 86], hu.40 [SEC ID N°: 87], hu.37 [SEC ID N°: 88], rh.40 [SEC ID N°: 92], rh.52 [SEC ID N°: 96]; rh.53 [SEC ID N°: 97]; rh.49 [SEC ID N°: 103]; rh.51 [SEC ID N°: 104]; rh.57 [SEC ID N°: 105]; rh.58 [SEC ID N°: 106 ], rh.61 [SEC ID N°: 107]; rh.50 [SEC ID N°: 108 ]; rh.43 [SEC ID N°: 163]; rh.62 [SEC ID N°: 114 ]; rh.48 [SEC ID N°: 115]; 4-9/rh.54 (SEC ID N°: 116); y4-19/rh.55 (SEC ID N°: 117); hu.31 [SEC ID N°: 121]; hu.32 [SEC ID N°: 122]; hu.34 [SEC ID N°: 125]; hu.45 [SEC ID N°: 127]; hu.47 [SEC ID N°: 128]; hu.13 [SEC ID N°: 129]; hu.28 [SEC ID N°: 130]; hu.29 [SEC ID N°: 132]; hu.19 [SEC ID N°: 133]; hu.20 [SEC ID N°: 134]; hu.21 [SEC ID N°: 135]; hu.23.2 [SEC ID N°: 137]; hu.22 [SEC ID N°: 138]; hu.27 [SEC ID N°: 140]; hu.4 [SEC ID N°: 141]; hu.2 [SEC ID N°: 143]; hu.1 [SEC ID N°: 144]; hu.3 [SEC ID N°: 145]; hu.25 [SEC ID N°: 146]; hu.15 [SEC ID N°: 147]; hu.16 [SEC ID N°: 148]; hu.18 [SEC ID N°: 149]; hu.7 [SEC ID N°: 150]; hu.11 [SEC ID N°: 153]; hu.9 [SEC ID N°: 155]; hu.10 [SEC ID N°: 156]; hu.48 [SEC ID N°: 157]; hu.44 [SEC ID N°: 158]; hu.46 [SEC ID N°: 159]; hu.43 [SEC ID N°: 160]; hu.35 [SEC ID N°: 164]; hu.24 [SEC ID N°: 136]; rh.64 [SEC ID N°: 99]; hu.41 [SEC ID N°: 91]; hu.39 [SEC ID N°: 102]; hu.67 [SEC ID N°: 198]; hu.66 [SEC ID N°: 197]; hu.51 [SEC ID N°: 190]; hu.52 [SEC ID N°: 191]; hu.49 [SEC ID N°: 189]; hu.56 [SEC ID N°: 192]; hu.57 [SEC ID N°: 193]; hu.58 [SEC ID N°: 194]; hu.63 [SEC ID N°: 195]; hu.64 [SEC ID N°: 196]; hu.60 [SEC ID N°: 184]; hu.61 [SEC ID N°: 185]; hu.53 [SEC ID N°: 186]; hu.55 [SEC ID N°: 187]; hu.54 [SEC ID N°: 188]; hu.6 [SEC ID N°: 84]; y rh.56 [SEC ID N°: 152]. Estas secuencias de la capsida tambien se reproducen en el Listado de Secuencias adjunto.
Las Figs. 3A- 3CN son un alineamiento de las secuencias de acido nucleico de protemas de la capsida vp1 de AAV, con la numeracion de las secuencias individuales indicada, y previamente publicada AAV5 (SEC ID N°: 199); AAV3-3 (SEC ID N°: 200); AAV4-4 (SEC ID N°: 201); AAV1 (SEC ID N°: 202); AAV6 (SEC ID N°: 203); AAV2 (SEC ID N°: 211); AAV7 (SEC ID N°: 213) y AAV8 (SEC ID N°: 214); rh. 25/42-15; 29.3/bb.1; cy.2; 29.5/bb.2; rh.32, rh.33, rh.34, rh.10; rh.24; rh14, rh.16, rh.17, rh.12, rh.18, rh.21 (anteriormente denominada 41.10); rh.25 (anteriormente denominada 41.15; referencia de GenBank AY530557); rh2; rh.31; cy.3; cy.5; rh.13; cy.4; cy.6; rh.22; rh.19; rh.35; rh.37; rh.36; rh.23; rh.8; y ch.5 [Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos N.° 2003/0138772 A1 (24 jul, 2003)]. Las secuencias de acido nucleico incluyen, hu.14/AAV9 (SEC ID N°: 3); LG- 4/rh.38 (SEC ID N°: 7); LG-10/rh.40 (SEC ID N°: 14); N721-8/rh.43 (SEC ID N°: 43); 1-8/rh.49 (SEC ID N°: 25); 2- 4/rh.50 (SEC ID N°: 23); 2-5/rh.51 (SEC ID N°: 22); 3-9/rh.52 (SEC ID N°: 18); 3-11/rh.53 (SEC ID N°: 17); 5- 3/rh.57 (SEC ID N°: 26); 5-22/rh.58 (SEC ID N°: 27); 2-3/rh.61 (SEC ID N°: 21); 4-8/rh.64 (SEC ID N°: 15); 3.1/hu.6 (SEC ID N°: 5); 33.12/hu.17 (SEC ID N°: 4); 106.1/hu.37 (SEC ID N°: 10); LG-9/hu.39 (SEC ID N°: 24); 114.3/hu.40 (SEC ID N°: 11); 127.2/hu.41 (SEC ID N°: 6); 127.5/hu.42 (SEC ID N°: 8); y hu.66 (SEC ID N°: 173 ); 2-15/ rh.62 (SEC ID N°: 33); 1-7/rh.48 (SEC ID N°: 32); 4-9/rh.54 (SEC ID N°: 40); 4-19/rh.55 (SEC ID N°: 37); 52/hu.19 (SEC ID N°: 62), 52.1/hu.20 (SEC ID N°: 63), 54.5/hu.23 (SEC ID N°: 60), 54.2/hu.22 (SEC ID N°: 67), 54.7/hu.24 (SEC ID N°: 66), 54.1/hu.21 (SEC ID N°: 65), 54.4R/hu.27 (SEC ID N°: 64); 46.2/hu.28 (SEC ID N°: 68); 46.6/hu.29 (SEC ID N°: 69); 128.1/hu.43 (SEC ID N°: 80); 128.3/hu.44 (SEC ID N°: 81) y 130.4/hu.48 (SEC ID N°: 78); 3.1/hu.9 (SEC ID N°: 58); 16.8/hu.10 (SEC ID N°: 56); 16.12/hu.11 (SEC ID N°: 57); 145.1/hu.53 (SEC ID N°: 176); 145.6/hu.55 (SEC ID N°: 178); 145.5/hu.54 (SEC ID N°: 177); 7.3/hu.7 (SEC ID N°: 55); 52/hu.19 (SEC ID N°: 62); 33.4/hu.15 (SEC ID N°: 50); 33.8/hu.16 (SEC ID N°: 51); 58.2/hu.25 (SEC ID N°: 49); 161.10/hu.60 (SEC ID N°: 170); H-5/hu.3 (SEC ID N°: 44); H-1/hu.1 (SEC ID N°: 46); 161.6/hu.61 (SEC ID N°: 174); hu.31 (SEC ID N°: 1); hu.32 (SEC ID N°: 2); hu.46 (SEC ID N°: 82); hu.34 (SEC ID N°: 72); hu.47 (SEC ID N°: 77); hu.63 (SEC ID N°: 204); hu.56 (SEC ID N°: 205); hu.45 (SEC ID N°: 76); hu.57 (SEC ID N°: 206); hu.35 (SEC ID N°: 73); hu.58 (SEC ID N°: 207); hu.51 (SEC ID N°: 208); hu.49 (SEC ID N°: 209); hu.52 (SEC ID N°: 210); hu.13 (SEC ID N°: 71); hu.64 (SEC ID N°: 212); rh.56 (SEC ID N°: 54); hu.2 (SEC ID N°: 48); hu.18 (SEC ID N°: 52); hu.4 (SEC ID N°: 47); y hu.67 (SEC ID N°: 215). Estas secuencias tambien se reproducen en el Listado de Secuencias adjunto.
Las Figs. 4A - 4D proporcionan una evaluacion de la eficacia de transferencia genica de vectores basados en AAV de primates in vitro e in vivo. Los vectores de AAV se pseudotiparon como se ha descrito [Gao et al, Proc Natl Acad Sci USA, 99:11854-11859 (3 sep, 2002)] con capsidas de AAV 1, 2, 5, 7, 8 y 6 y ch.5, rh.34, cy.5, rh.20, rh.8 y AAV9. Para estudio in vitro, Fig. 4A, se infectaron celulas 84-32 (celulas 293 que expresan E4 de serotipos de adenovirus) sembradas en una placa de 95 pocillos con vectores AAVCMVEGFp pseudotipados a una MoI de 1x104 GC por celula. La eficacia de transduccion de EGFP relativa se estimo como porcentaje de celulas verdes usando un microscopio de UV a las 48 horas despues de la infeccion y se mostro en el eje Y. Para estudio in vivo, los vectores que expresan el gen indicador secretado A1AT se administraron al Imgado (Fig.
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4B), pulmon (Fig. 4C) y musculo (Fig. 4D) de ratones desnudos NCR (4-6 semanas de edad) a una dosis de 1 x 10” GC por animal por inyecciones intraportal (Fig. 4B), intratraqueal (Fig. 4C) e intramuscular (Fig. 4D), respectivamente. Los niveles de A1AT en suero (ng/ml) se compararon el dfa 28 despues de la transferencia genica y se presentaron en el eje Y. El eje X indica los AAV analizados y los clados a los que pertenecen.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
En cualquier arsenal de vectores utiles en la terapia o en la profilaxis, es deseable una diversidad de vectores distintos capaces de portar una macromolecula a una celula diana, para permitir la seleccion de una fuente de vector para una aplicacion deseada. Hasta la fecha, una de las preocupaciones con respecto al uso de AAV como vectores fue la falta de una diversidad de fuentes de virus diferentes. Los clados de AAV analizados en el presente documento son utiles para seleccionar AAV filogeneticamente relacionados, o cuando se desee para un regimen seleccionado, filogeneticamente distintos, y para predecir la funcion.
La expresion “homologfa sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se hace referencia a un acido nucleico, o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de forma optima con inserciones o deleciones de nucleotidos apropiadas con otro acido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleotidos en al menos aproximadamente 95 a 99 % de las secuencias alineadas. Preferentemente, la homologfa es sobre la secuencia de longitud completa, o una fase abierta de lectura de la misma, u otro fragmento adecuado que es de al menos 15 nucleotidos de longitud. Se describen en el presente documento ejemplos de fragmentos adecuados.
Las expresiones “identidad de secuencia” “porcentaje de identidad de secuencia” o “porcentaje identico” en el contexto de las secuencias de acido nucleico se refieren a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para maxima correspondencia. La longitud de la comparacion de identidad de secuencias puede ser sobre la longitud completa del genoma, la longitud completa de una secuencia que codifica un gen, o se desea un fragmento de al menos aproximadamente 500 a 5000 nucleotidos. Sin embargo, tambien puede desearse una identidad entre fragmentos mas pequenos, por ejemplo de al menos aproximadamente nueve nucleotidos, habitualmente de al menos aproximadamente 20 a 24 nucleotidos, al menos aproximadamente 28 a 32 nucleotidos, al menos aproximadamente 36 o mas nucleotidos. De forma similar, el “porcentaje de identidad de secuencia” puede determinarse facilmente para secuencias de aminoacidos, sobre la longitud completa de una protema, o un fragmento de la misma. Convenientemente, un fragmento es de al menos aproximadamente 8 aminoacidos de longitud, y puede ser de hasta aproximadamente 700 aminoacidos. Se describen en el presente documento ejemplos de fragmentos adecuados.
La expresion “homologfa sustancial” o “similitud sustancial” cuando se hace referencia a aminoacidos o fragmentos de los mismos, indica que, cuando se alinean de forma optima con inserciones o deleciones de aminoacidos apropiadas con otro aminoacido (o su cadena complementaria) hay identidad de secuencia de aminoacidos en al menos aproximadamente 95 a 99 % de las secuencias alineadas. Preferentemente, la homologfa es sobre la secuencia de longitud completa, o una protema de la misma, por ejemplo, una protema cap, una protema rep, o un fragmento de las mismas que es de al menos 8 aminoacidos, o mas convenientemente, al menos 15 aminoacidos de longitud. Se describen en el presente documento ejemplos de fragmentos adecuados.
Por la expresion “altamente conservado” se entiende al menos 80 % de identidad, preferentemente al menos 90 % de identidad, y mas preferentemente, mas de 97 % de identidad. La identidad se determina facilmente por un experto en la materia acudiendo a algoritmos y programas informaticos conocidos por los expertos en la materia.
Generalmente, cuando se hace referencia a “identidad”, “homologfa”, o “similitud” entre dos virus adeno-asociados diferentes, la “identidad”, “homologfa” o “similitud” se determina en referencia a secuencias “alineadas”. Las secuencias “alineadas” o “alineamiento” se refieren a multiples secuencias de acido nucleico o secuencias de protemas (de aminoacidos), que contienen con frecuencia correcciones para bases o aminoacidos ausentes o adicionales en comparacion con una secuencia de referencia. En los ejemplos, se realizan alineamientos de AAV usando las secuencias de AAV2 o AAV1 publicadas como un punto de referencia. Sin embargo, un experto en la materia puede seleccionar facilmente otra secuencia de AAV como referencia.
Se realizan alineamientos usando cualquiera de una diversidad de programas de alineamientos de secuencias multiples disponibles en el mercado o publicamente. Los ejemplos de dichos programas incluyen “Clustal W”, “CAP Sequence Assembly”, “MAP” y “MEME”, que son accesibles a traves de Servidores Web en Internet. Otras fuentes de dichos programas se conocen por los expertos en la materia. Como alternativa, tambien se usan utilidades de Vector NTI. Tambien hay varios algoritmos conocidos en la tecnica que pueden usarse para medir la identidad secuencia de nucleotidos, incluyendo los contenidos en los programas descritos anteriormente. Como otro ejemplo, las secuencias polinucleotidicas pueden compararse usando Fasta™, un programa en GCC Version 6.1. Fasta™ proporciona alineamientos y porcentaje de identidad secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de busqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de acido nucleico puede determinarse usando Fasta™ con sus parametros por defecto (un tamano de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuacion) como se proporciona en GCG Version 6.1. Tambien estan disponibles multiples programas de alineamiento de secuencias para secuencias de aminoacidos, por ejemplo, los programas
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“Clustal X”, “MAP”, “PIMA”, “MSA”, “BLOCKMAKER”, “MEME” y “Match-Box”. En general, se usa cualquiera de estos programas en sus ajustes por defecto, aunque un experto en la materia puede alterar estos ajustes segun sea necesario. Como alternativa, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa informatico que proporcione al menos el nivel de identidad o alineamiento que el proporcionado por los algoritmos y programas a los que se ha hecho referencia. Vease, por ejemplo, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13): 2682-2690 (1999).
El termino “serotipo” es una distincion con respecto a un AAV que tiene una capsida que es serologicamente distinta de otros serotipos de AAV. La distincion serologica se determina basandose en la falta de reactividad cruzada entre anticuerpos para el AAV en comparacion con otro AAV.
La reactividad cruzada se mide tipicamente en un ensayo de anticuerpos de neutralizacion. Para este ensayo se genera suero policlonal contra un AAV espedfico en un conejo u otro modelo animal adecuado usando los virus adeno-asociados. En este ensayo, el suero generado contra un AAV espedfico se ensaya despues en su capacidad para neutralizar el mismo AAV (homologo) o un AAV heterologo. La dilucion que consigue el 50 % de neutralizacion se considera el tftulo de anticuerpo de neutralizacion. Si para dos AAV el cociente del tftulo heterologo dividido por el tftulo homologo es menor de 16 de una manera redproca, se considera que esos dos vectores son el mismo serotipo. Por el contrario, si la relacion del tftulo heterologo sobre el tftulo homologo es de 16 o mas de una manera redproca los dos AAV se consideran serotipos distintos.
Como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, los terminos “comprender” e “incluir” incluyen otros componentes, elementos, numeros enteros, etapas y similares. Por el contrario, el termino “consistir” y sus variantes son exclusivos de otros componentes, elementos, numeros enteros, etapas y similares.
I. Clados
Un clado es un grupo de AAV que estan filogeneticamente relacionados entre sf, como se determina usando un algoritmo de Union de Vecinos, por un valor operativo de al menos 75 % (de al menos 1000 repeticiones) y una medicion de distancia de correccion de Poisson de no mas del 0,05, basandose en el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de vp1 de AAV.
El algoritmo de Union de Vecinos se ha descrito exhaustivamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, M. Nei y S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetic (Oxford University Press, Nueva York (2000). Estan disponibles programas informaticos que pueden usarse para implementar este algoritmo. Por ejemplo, el programa MEGA v2.1 implementa el metodo de Nei-Gojobori modificado. Usando estas tecnicas y programas informaticos, y la secuencia de una protema de capsida vp1 de AAV, un experto en la materia puede determinar facilmente si un AAV seleccionado esta contenido en uno de los clados identificados en el presente documento, en otro clado, o esta fuera de estos clados.
Aunque los clados definidos en el presente documento se basan principalmente en las capsidas vp1 de AAV de origen natural, los clados no estan limitados a AAV de origen natural. Los clados pueden abarcar AAV de origen no natural incluyendo, sin limitacion, AAV recombinantes, modificados o alterados, quimericos, hftbridos, sinteticos, artificiales, etc., que estan relacionados filogeneticamente como se determina usando un algoritmo de Union de Vecinos de al menos 75 % (o al menos 1000 repeticiones) y una medicion de distancia de correccion de Poisson de no mas de 0,05, basandose en el alineamiento de la secuencia de aminoacidos vp1 de AAV.
Los clados descritos en el presente documento incluyen el Clado A (representado por AAV1 y AAV6), Clado B (representado por AAV2) y Clado C (representado por el hftbrido AAV2-AAV3), Clado D (representado por AAV7), Clado E (representado por AAV8), y Clado F (representado por AAV9 humano). Estos clados estan representados por un miembro del clado que es un serotipo de AAV previamente descrito. Los AAV1 y AAV6 previamente descritos son miembros de un unico clado (Clado A) en el que se recuperaron 4 aislados de 3 seres humanos. Los serotipos AAV3 y AAV5 previamente descritos son claramente distintos entre sf, pero no se detectaron en la exploracion descrita en el presente documento, y no se han incluido en ninguno de estos clados.
El Clado B (AAV2) y Clado C (el hftbrido AAV2-AAV3) son los mas abundantes de los hallados en seres humanos (22 aislados de 12 individuos para AAV2 y 17 aislados para 8 individuos para el Clado C).
Existe un gran numero de secuencias agrupadas en el Clado D (AAV7) o Clado E (AAV8). Resulta interesante que ambos de estos clados son prevalentes en especies diferentes. El Clado D es unico de macacos rhesus y cynomolgus aislandose 15 miembros de 10 animales diferentes. El Clado E es interesante porque se encuentra en primates tanto humanos como no humanos: se recuperaron 9 aislados de 7 humanos y se obtuvieron 21 aislados en 9 primates no humanos diferentes incluyendo macacos rhesus, un babuino y un mono de cola de cerdo.
En otros dos animales se ha demostrado la naturaleza hubrida de ciertas secuencias, aunque en este caso, todas las secuencias parecen haberse originado mediante recombinaciones individuales y diferentes de dos virus co- infecciosos (en ambos animales un Clado D con un virus de Clado E). Ninguno de estos recombinantes se identifico
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en otros animales o sujetos.
Ya que el Clado C (el hforido AAV2-AAV3) se identifico en 6 sujetos humanos diferentes, el acontecimiento de recombinacion dio como resultado una descendencia sana. En el caso de los hforidos AAV7-AAV8 por otro lado, solo pueden extraerse algunas conclusiones con respecto a la implicacion de la recombinacion en la evolucion de AAV. Estos acontecimientos de recombinacion muestran que AAV es capaz de recombinar, creando de este modo genes en fase y en algunos casos estructuras de capsida empaquetables y/o infecciosas. El Clado C (el clado hforido AAV2-AAV3) por otro lado es un grupo de virus que ha adquirido una ventaja selectiva mediante recombinacion que los hace soportar ciertas presiones ambientales.
A. Clado A (representado por AAV1 y AAV6):
El Clado A se caracteriza por contener los AAV1 y AAV6 previamente publicados. Vease, por ejemplo, Publicacion Internacional N.°WO 00/28061, 18 de mayo de 2000; Rutledge et al, J Virol, 72(1): 309-319 (ene 1998). Ademas, este clado contiene AAV incluyendo, sin limitacion, 128.1/hu. 43 [SEC ID N°: 80 y 160]; 128.3/hu. 44 [SeC ID N°: 81 y 158]; 130.4/hu.48 [SEC ID N°: 78 y 157]; hu.46 [SEC ID N°: 82 y 159]; capsida hu. 43 modificada [SEC ID N°: 236]; y capsida hu. 46 modificada [SEC iD N°: 224].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capsida con una identidad de aminoacidos de al menos 85 % de identidad, al menos 90 % de identidad, al menos 95 % de identidad, o al menos 97 % de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capsida de AAV1 y/o AAV6.
El Clado A tambien contiene AAV que no comprende una capsida de ninguno de AAV1 o AAV6. Estos AAV pueden incluir, sin limitacion, un AAV que tiene una capsida derivada de uno o mas de 128.1/hu. 43 [SEC ID N°: 80 y 160]; hu.43 [SEC ID N°: 236] 128.3/hu. 44 [SEC ID N°: 81 y 158]; hu.46 [SEC ID N°: 82 y 159]; hu. 46 modificado [SEC ID N°: 224]; y 130.4/hu.48 [SEC ID N°: 78 y 157].
B. Clado B (Clado AAV2):
El Clado B se caracteriza por contener, como mmimo, el AAV2 previamente descrito y AAV que incluye, 52/hu.19 [SEC ID N°: 62 y 133], 52.1/hu.20 [SEC ID N°: 63 y 134], 54.5/hu.23 [SEC ID N°: 60 y 137], 54.2/hu.22 [SEC ID N°: 67 y 138], 54.7/hu.24 [SEC ID N°: 66 y 136], 54.1/hu.21 [SEC ID N°: 65 y 135], 54.4R/hu.27 [SEC ID N°: 64 y 140]; 46.2/hu.28 [SEC ID N°: 68 y 130]; 46.6/hu.29 [SEC ID N°: 69 y 132]; hu. 29 modificado [SEC ID N°: 225]; 172.1/hu.63 [SEC ID N°: 171 y 195; n.° de referencia de GenBank AY530624]; 172.2/hu. 64 [SEC ID N°: 172 y 196; n.° de referencia de GenBank AY530625]; 24.5/hu.13 [SEC ID N°: 71 y 129; n.° de referencia de GenBank AY530578]; 145.6/hu.56 [SEC ID N°: 168 y 192]; hu.57 [SEC ID N°: 169 y 193]; 136.1/hu.49 [SEC ID N°: 165 y 189]; 156.1/hu.58 [SEC ID N°: 179 y 194]; 72.2/hu.34 [SEC ID N°: 72 y 125; n.° de referencia de GenBank AY530598]; 72.3/hu.35 [SEC ID N°: 73 y 164; n.° de referencia de GenBank AY530599]; 130.1/hu.47 [SEC ID N°: 77 y 128]; 129.1/hu.45 (SEC ID N°: 76 y 127; n.° de referencia de GenBank AY530608); 140.1/hu.51 [Sec ID N°: 161 y 190; n.° de referencia de GenBank AY530613]; y 140.2/hu.52 [SEC ID N°: 167 y 191; n.° de referencia de GenBank AY530614].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capsida con una identidad de aminoacidos de al menos 85 % de identidad, al menos 90 % de identidad, al menos 95 % de identidad, o al menos 97 % de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capsida de AAV2.
El Clado B tambien contiene AAV que no tiene una capsida de AAV2. Estos AAV pueden incluir, sin limitacion, un AAV que tiene una capsida derivada de uno o mas de las siguientes: 52/hu.19 [SEC ID N°: 62 y 133], 52.1/hu.20 [SEC ID N°: 63 y 134], 54.5/hu.23 [SEC ID N°: 60 y 137], 54.2/hu.22 [SEC ID N°: 67 y 138], 54.7/hu.24 [SEC ID N°: 66 y 136], 54.1/hu.21 [SEC ID N°: 65 y 135], 54.4R/hu.27 [SEC ID N°: 64 y 140]; 46.2/hu.28 [SEC ID N°: 68 y 130]; 46.6/hu.29 [SEC ID N°: 69 y 132]; hu. 29 modificada [SEC ID N°: 225]; 172.1/hu.63 [SEC ID N°: 171 y 195]; 172.2/hu. 64 [SEC ID N°: 172 y 196]; 24.5/hu.13 [SEC ID N°: 71 y 129]; 145.6/hu.56 [SEC ID N°: 168 y 192; n.° de referencia de GenBank AY530618]; hu.57 [SEC ID N°: 169 y 193; n.° de referencia de GenBank AY530619]; 136.1/hu.49 [SEC ID N°: 165 y 189; n.° de referencia de GenBank AY530612]; 156.1/hu.58 [SEC ID N°: 179 y 194; n.° de referencia de GenBank AY530620]; 72.2/hu.34 [SEC ID N°: 72 y 125]; 72.3/hu.35 [SEC ID N°: 73 y 164]; 129.1/hu.45 [SEC ID N°: 76 y 127]; 130.1/hu.47 [SEC ID N°: 77 y 128; n.° de referencia de GenBank AY530610]; 140.1/hu.51 [SEC ID N°: 161 y 190; n.° de referencia de GenBank aY530613]; y 140.2/hu.52 [SEC ID N°: 167 y 191; n.° de referencia de GenBank AY530614].
C. Clado C (Clado Mbrido AAV2-AAV3)
El Clado C se caracteriza por contener AAV que son hforidos de los AAV2 y AAV3 previamente publicados tales como H-6/hu.4; H-2/hu.2 [Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0138772 (24 jun, 2003). Ademas, este clado contiene AAV que incluyen, sin limitacion, 3.1/hu.9 [SEC ID N°: 58 y 155]; 16.8/hu.10 [SEC iD N°: 56 y 156]; 16.12/hu.11 [SEC ID N°: 57 y 153]; 145.1/hu.53 [SEC ID N°: 176 y 186]; 145.6/hu.55 [SEC ID N°: 178 y 187]; 145.5/hu.54 [SEC ID N°: 177 y 188]; 7.3/hu.7 [SEC ID N°: 55 y 150; ahora depositado como n.° de referencia de GenBank AY530628]; hu. 7 modificado [SEC ID N°: 226]; 33.4/hu.15 [SEC ID N°: 50 y 147]; 33.8/hu.16 [SEC ID N°:
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51 y 148]; hu.18 [SEC ID N°: 52 y 149]; 58.2/hu.25 [SEC ID N°: 49 y 146]; 161.10/hu.60 [SEC ID N°: 170 y 184]; H- 5/hu.3 [SEC ID N°: 44 y 145]; H-1/hu.1 [SEC ID N°: 46 y 144]; y 161.6/hu.61 [SEC ID N°: 174 y 185].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capsida con una identidad de aminoacidos de al menos 85 % de identidad, al menos 90 % de identidad, al menos 95 % de identidad, o al menos 97 % de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capsida hu.4 y/o hu.2.
El Clado C (el clado hforido AAV2-AAV3) tambien contiene AAV que no comprenden una capsida de hu.2 o hu.4. Estos AAV pueden incluir, sin limitacion, un AAV que tiene una capsida derivada de una o mas de 3.1/hu.9 [SEC ID N°: 58 y 155]; 16.8/hu.10 [SEC ID N°: 56 y 156]; 16.12/hu.11 [SEC ID N°: 57 y 153]; 145.1/hu.53 [SEC ID N°: 176 y 186]; 145.6/hu.55 [SEC ID N°: 178 y 187]; 145.5/hu.54 [SEC ID N°: 177 y 188]; 7.3/hu.7 [SEC ID N°: 55 y 150]; hu.7 modificado [SEC ID N°: 226]; 33.4/hu.15 [SEC ID N°: 50 y 147]; 33.8/hu.16 [SEC ID N°: 51 y 148]; 58.2/hu.25 [SEC ID N°: 49 y 146]; 161.10/hu.60 [SEC ID N°: 170 y 184]; H-5/hu.3 [SEC ID N°: 44 y 145]; H-1/hu.1 [SEC ID N°: 46 y 144]; y 161.6/hu.61 [SEC ID N°: 174 y 185].
D. Clado D (Clado AAV7)
El Clado D se caracteriza por contener el AAV7 previamente descrito [G. Gao et al, Proc. Natl Acad. Sci USA, 99:11854-9 (3 sep., 2002)]. Las secuencias de acido nucleico que codifican la capsida de AAV7 se reproducen en SEC ID N°: 184; las secuencias de aminoacidos de la capsida de AAV7 se reproducen en SEC ID N°: 185. Ademas, el clado contiene varias secuencias de AAV previamente descritas, incluyendo: cy.2; cy.3; cy.4; cy.5; cy.6; rh.13; rh.37; rh. 36; y rh.35 [Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos N.° 2003/0138772 A1 (24 de julio de 2003)]. Adicionalmente, el clado de AAV7 contiene secuencias de AAV, incluyendo, sin limitacion, 2-15/ rh.62 [SEC ID N°: 33 y 114]; 1-7/rh.48 [SEC ID N°: 32 y 115]; 4-9/rh.54 [SEC ID N°: 40 y 116]; y 4-19/rh.55 [SEC ID N°: 37 y 117]; cy. 5 modificada [SEC ID N°: 227]; rh.13 modificada [SEC ID N°: 228]; y rh. 37 modificada [SEC ID N°: 229].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capsida con una identidad de aminoacidos de al menos 85 % de identidad, al menos 90 % de identidad, al menos 95 % de identidad, o al menos 97 % de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capsida de AAV7, SEC ID N°: 184 y 185.
El Clado D tambien contiene AAV que no comprenden una capsida de ninguna de cy.2; cy.3; cy.4; cy.5; cy.6; rh.13; rh.37; rh. 36; y rh.35. Estos AAV pueden incluir, sin limitacion, un AAV que tiene una capsida derivada de una o mas de las siguientes 2-15/ rh.62 [SEC ID N°: 33 y 114]; 1-7/rh.48 [SEC ID N°: 32 y 115]; 4-9/rh.54 [SEC ID N°: 40 y 116]; y 4-19/rh.55 [SEC ID N°: 37 y 117].
E. Clado E (Clado AAV8)
El Clado E se caracteriza por contener el AAV8 previamente descrito [G. Gao et al, Proc. Natl Acad. Sci USA, 99:11854-9 (3 sep. 2002)], 43.1/rh.2; 44.2/rh.10; rh. 25; 29.3/bb.1; y 29.5/bb.2 [Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos N.° US 2003/0138772 A1 (24 de julio de 2003)].
Este clado comprende secuencias de AAV, incluyendo, sin limitacion, por ejemplo, 30.10/pi.1 [SEC ID N°: 28 y 93], 30.12/pi.2 [SEC ID N°: 30 y 95, 30.19/pi.3 [SEC ID N°: 29 y 94], LG-4/rh.38 [SEC ID N°: 7 y 86]; LG-10/rh.40 [SEC ID N°: 14 y 92]; N721-8/rh.43 [SEC ID N°: 43 y 163]; 1-8/rh.49 [SEC ID N°: 25 y 103]; 2-4/rh.50 [SEC ID N°: 23 y 108]; 2- 5/rh.51 [SEC ID N°: 22 y 104]; 3-9/rh.52 [SEC ID N°: 18 y 96]; 3-11/rh.53 [SEC ID N°: 17 y 97]; 5-3/rh.57 [SEC ID N°: 26 y 105]; 5-22/rh.58 [SEC ID N°: 27 y 58]; 2-3/rh.61 [SEC ID N°: 21 y 107]; 4-8/rh.64 [SEC ID N°: 15 y 99]; 3.1/hu.6 [SEC ID N°: 5 y 84]; 33.12/hu.17 [SEC ID N°: 4 y 83]; 106.1/hu.37 [SEC ID N°: 10 y 88]; LG-9/hu.39 [SEC ID N°: 24 y 102]; 114.3/hu. 40 [SEC ID N°: 11 y 87]; 127.2/hu.41 [SEC ID N°: 6 y 91]; 127.5/hu.42 [SEC ID N°: 8 y 85]; hu. 66 [SEC ID N°: 173 y 197]; y hu.67 [SEC ID N°: 174 y 198]. Este clado incluye ademas rh. 2 modificado [SEC ID N°: 231]; rh. 58 modificado [SEC ID N°: 232]; rh. 64 modificado [SEC ID N°: 233].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capsida con una identidad de aminoacidos de al menos de 85 % de identidad, al menos 90 % de identidad, al menos 95 % de identidad, o al menos 97 % de identidad sobre la longitud completa de la vp 1, la vp2 o la vp3 de la capsida de AAV8. Las secuencias de acido nucleico que codifican la capsida de AAV8 se reproducen en SEC ID N°: 186 y las secuencias de aminoacidos de la capsida se reproducen en SEC ID N°: 187.
El Clado E tambien contiene AAV que no comprende una capsida de AAV8, rh.8; 44.2/rh.10; rh. 25; 29.3/bb.1; y 29.5/bb.2 [Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos N.° US 2003/0138772 A1 (24 jul 2003)]. Estos AAV pueden incluir, sin limitacion, un AAV que tiene una capsida derivada de una o mas de las siguientes: 30.10/pi.1 [SEC ID N°: 28 y 93], 30.12/pi.2 [SEC ID N°: 30 y 95, 30.19/pi.3 [SEC ID N°: 29 y 94], LG-4/rh.38 [SEC ID N°: 7 y 86]; LG-10/rh.40 [SEC ID N°: 14 y 92]; N721-8/rh.43 [SEC ID N°: 43 y 163]; 1-8/rh.49 [SEC ID N°: 25 y 103]; 2-4/rh.50 [SEC ID N°: 23 y 108]; 2-5/rh.51 [SEC ID N°: 22 y 104]; 3-9/rh.52 [SEC ID N°: 18 y 96]; 3-11/rh.53 [SEC ID N°: 17 y 97]; 5-3/rh.57 [SEC ID N°: 26 y 105]; 5-22/rh.58 [SEC ID N°: 27 y 58]; rh. 58 modificado [SEC ID N°: 232]; 2-3/rh.61 [SEC ID N°: 21 y 107]; 4-8/rh.64 [SEC ID N°: 15 y 99]; rh. 64 modificado [SEC ID N°: 233]; 3.1/hu.6 [SEC ID N°: 5 y 84]; 33.12/hu.17 [SEC ID N°: 4 y 83]; 106.1/hu.37 [SEC ID N°: 10 y 88]; LG-9/hu.39 [SEC ID N°: 24 y 102]; 114.3/hu.
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40 [SEC ID N°: 11 y 87]; 127.2/hu.41 [SEC ID N°: 6 y 91]; 127.5/hu.42 [SEC ID N°: 8 y 85]; hu. 66 [SEC ID N°: 173 y 197]; y hu.67 [SEC ID N°: 174 y 198].
F. Clado F (Clado de AAV 9)
Este clado se identifica por el nombre de un serotipo de AAV identificado en el presente documento como hu.14/AAV9 [SEC ID N°: 3 y 123]. Ademas, este clado contiene otras secuencias incluyendo hu.31 [SEC ID N°: 1 y 121]; y hu.32 [SEC ID N°: 2 y 122].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capsida con una identidad de aminoacidos de al menos 85 % de identidad, al menos 90 % de identidad, al menos 95 % de identidad, o al menos 97 % de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capsida de AAV9, SEC ID N°: 3 y 123.
El Clado F incluye, sin limitacion, un AAV que tiene una capsida derivada de una o mas de hu.14/AAV9 [SEC ID N°: 3 y 123], hu.31 [SEC ID N°: 1 y 121] y hu.32 [SEC ID N°: 1 y 122].
Los clados de AAV son utiles para una diversidad de fines, incluyendo proporcionar colecciones listas de AAV relacionados para generar vectores virales, y para generar moleculas de direccion. Estos clados tambien pueden usarse como herramientas para una diversidad de fines que resultaran evidentes para un experto en la materia.
II. NUEVAS SECUENCIAS DE AVV
La invencion proporciona los AAV recombinantes, protemas de la capsida aisladas, acidos nucleicos, metodos de generacion, celulas hospedadoras transfectadas y composiciones, como se definen en las reivindicaciones, se caracterizan por capsidas de AAV serotipo pi.2.
Las secuencias de acido nucleico y secuencias de aminoacidos de varios AAV tambien son interes. Muchas de estas secuencias incluyen las descritas anteriormente como miembros de un clado, como se resume posteriormente.
128.1/hu. 43 [SEC ID N°: 80 y 160 n.° de referencia de GenBank AY530606]; hu. 43 modificado [SEC ID N°: 236]; 128.3/hu. 44 [SEC ID N°: 81 y 158; n.° de referencia de GenBank AY530607] y 130.4/hu.48 [SEC ID N°: 78 y 157; n.° de referencia de GenBank aY530611]; del Clado A;
52/hu.19 [SEC ID N°: 62 y 133; n.° de referencia de GenBank AY530584], 52.1/hu.20 [SEC ID N°: 63 y 134; n.° de referencia de GenBank AY530586], 54.5/hu.23 [SEC ID N°: 60 y 137; n.° de referencia de GenBank AY530589], 54.2/hu.22 [SEC ID N°: 67 y 138; n.° de referencia de GenBank AY530588], 54.7/hu.24 [SEC ID N°: 66 y 136; n.° de referencia de GenBank AY530590], 54.1/hu.21 [SEC ID N°: 65 y 135; n.° de referencia de GenBank AY530587], 54.4R/hu.27 [SEC ID N°: 64 y 140; n.° de referencia de GenBank AY530592]; 46.2/hu.28 [SEC ID N°: 68 y 130; n.° de referencia de GenBank aY530593]; 46.6/hu.29 [SEC ID N°: 69 y 132; n.° de referencia de GenBank AY530594]; hu.29 modificado [SEC ID N°: 225]; 172.1/hu.63 [SEC ID N°: 171 y 195]; y 140.2/hu.52 (SEC ID N°: 167 y 191; del Clado B;
3.1/hu.9 [SEC ID N°: 58 y 155; n.° de referencia de GenBank AY530626]; 16.8/hu.10 [SEC ID N°: 56 y 156; n.° de referencia de GenBank AY530576]; 16.12/hu.11 [SEC ID N°: 57 y 153; n.° de referencia de GenBank AY530577]; 145.1/hu.53 [SEC ID N°: 176 y 186; n.° de referencia de GenBank AY530615]; 145.6/hu.55 [SEC ID N°: 178 y 187; n.° de referencia de GenBank AY530617]; 145.5/hu.54 [SEC ID N°: 177 y 188; n.° de referencia de GenBank AY530616]; 7.3/hu.7 [SEC ID N°: 55 y 150; n.° de referencia de GenBank AY530628]; hu.7 modificado [SEC ID N°:
226]; hu.18 [SEC ID N°: 52 y 149; n.° de referencia de GenBank AY530583]; 33.4/hu.15 [SEC ID N°: 50 y 147; n.° de
referencia de GenBank AY530580]; 33.8/hu.16 [SEC ID N°: 51 y 148; n.° de referencia de GenBank AY530581]; 58.2/hu.25 [SEC ID N°: 49 y 146; n.° de referencia de GenBank AY530591]; 161.10/hu.60 [SEC ID N°: 170 y 184; n.° de referencia de GenBank AY530622]; H-5/hu.3 [SEC ID N°: 44 y 145; n.° de referencia de GenBank AY530595]; H- 1/hu.1 [SEC ID N°: 46 y 144; n.° de referencia de GenBank AY530575]; y 161.6/hu.61 [SEC ID N°: 174 y 185; n.° de referencia de GenBank AY530623] del Clado C;
2-15/ rh.62 [SEC ID N°: 33 y 114; n.° de referencia de GenBank AY530573]; 1-7/rh.48 [SEC ID N°: 32 y 115; n.° de referencia de GenBank AY530561]; 4-9/rh.54 [SEC ID N°: 40 y 116; n.° de referencia de GenBank AY530567]; y 4- 19/rh.55 [SEC ID N°: 37 y 117; n.° de referencia de GenBank AY530568]; cy.5 modificado [SEC ID N°: 2 7]; rh.13 modificado [SEC ID N°: 228]; y rh. 37 modificado [SEC ID N°: 229] del Clado D;
30.10/pi.1 [SEC ID N°: 28 y 93; n.° de referencia de GenBank AY53055], 30.12/pi.2 [SEC ID N°: 30 y 95; n.° de
referencia de GenBank AY 530554], 30.19/pi.3 [SEC ID N°: 29 y 94; n.° de referencia de GenBank AY530555], LG- 4/rh.38 [SEC ID N°: 7 y 86; n.° de referencia de GenBank AY 530558]; LG-10/rh.40 [SEC ID N°: 14 y 92; n.° de referencia de GenBank AY530559]; N721-8/rh.43 [SEC ID N°: 43 y 163; n.° de referencia de GenBank AY530560];1- 8/rh.49 [SEC ID N°: 25 y 103; n.° de referencia de GenBank AY530561]; 2-4/rh.50 [SEC ID N°: 23 y 108; n.° de referencia de GenBank AY530563]; 2-5/rh.51 [SEC ID N°: 22 y 104; n.° de referencia de GenBank 530564]; 3-9/rh.52 [SEC ID N°: 18 y 96; n.° de referencia de GenBank AY530565]; 3-11/rh.53 [SEC ID N°: 17 y 97; n.° de referencia de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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GenBank AY530566]; 5-3/rh.57 [SEC ID N°: 26 y 105; n.° de referencia de GenBank AY530569]; 5-22/rh.58 [SEC ID N°: 27 y 58; n.° de referencia de GenBank 530570]; rh. 58 modificado [SEC ID N°: 232]; 2-3/rh.61 [SEC ID N°: 21 y 107; n.° de referencia de GenBank AY530572]; 4-8/rh.64 [SEC ID N°: 15 y 99; n.° de referencia de GenBank AY530574]; rh. 64 modificado [SEC ID N°: 233]; 3.1/hu.6 [SEC ID N°: 5 y 84; n.° de referencia de GenBank AY530621]; 33.12/hu.17 [SEC ID N°: 4y 83; n.° de referencia de GenBank AY530582]; 106.1/hu.37 [SEC ID N°: 10 y 88; n.° de referencia de GenBank AY530600]; LG-9/hu.39 [SEC ID N°: 24 y 102; n.° de referencia de GenBank AY530601]; 114.3/hu. 40 [SEC ID N°: 11 y 87; n.° de referencia de GenBank AY530603]; 127.2/hu.41 [SEC ID N°: 6 y 91; n.° de referencia de GenBank AY530604]; 127.5/hu.42 [SEC ID N°: 8 y 85; n.° de referencia de GenBank AY530605]; y hu. 66 [SEC ID N°: 173 y 197; n.° de referencia de GenBank AY530626]; y hu.67 [SEC ID N°: 174 y 198; n.° de referencia de GenBank AY530627]; y rh.2 modificado [SEC ID N°: 231]; del Clado E; hu.14/AAV9 [SEC ID N°: 3 y 123; n.° de referencia de GenBank AY530579], hu.31 [SEC ID N°: 1 y 121; AY530596] y hu.32 [SEC ID N°: 1 y 122; n.° de referencia de GenBank AY530597] del Clado F.
Ademas, secuencias de AAV que incluyen rh.59 [SEC ID N°: 49 y 110]; rh.60 [SEC ID N°: 31 y 120; n.° de referencia de GenBank AY530571], ch.5 modificado [SEC ID N°: 234]; y rh. 8 modificado [SEC ID N°: 235], estan fuera de la definicion de los clados descritos anteriormente.
Tambien son relevantes fragmentos de las secuencias de AAV. Cada uno de estos fragmentos puede utilizarse facilmente en una diversidad de sistemas de vector y celulas hospedadoras. Entre los fragmentos de AAV deseables estan las protemas cap, incluyendo las vp1, vp2, vp3 y regiones hipervariables. Cuando se desee, puede usarse la metodologfa descrita en la Publicacion de Patente de Estados Unidos publicada N.° US 2003/0138772 A1 (24 de julio de 2003)] para obtener las secuencias de rep para los clones de AAV identificados anteriormente. Dichas secuencias de rep incluyen, por ejemplo, rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40 y las secuencias que codifican estas protemas. De forma similar, pueden obtenerse otros fragmentos de estos clones usando las tecnicas descritas en la publicacion de patente referida, incluyendo la repeticion terminal invertida (ITR) de AAV, secuencias de P 19 de AAV, secuencias de P40 de AAV, el sitio de union a rep, y el sitio de resolucion terminal (TRS). Otros fragmentos adecuados mas estaran disponibles facilmente para los expertos en la materia.
La capsida de la invencion puede utilizarse facilmente en una diversidad de sistemas de vector y celulas hospedadoras. Dichos fragmentos pueden usarse solos, en combinacion con otras secuencias o fragmentos de AAV, o en combinacion con elementos de otras secuencias virales de AAV o no AAV. En una realizacion particularmente deseable, un vector contiene las secuencias de cap y/o rep de AAV de la invencion.
Las secuencias y fragmentos de AAV de las mismas son utiles en la produccion de rAAV, y tambien son utiles como vectores de suministro antisentido, vectores de terapia genica o vectores de vacuna. La invencion proporciona ademas moleculas de acido nucleico, vectores de suministro genico y celulas hospedadoras que contienen las secuencias de AAV de la invencion.
Los fragmentos adecuados pueden determinarse usando la informacion proporcionada en el presente documento.
Como se describe en el presente documento, los vectores de la invencion que contienen las protemas de la capsida de AAV de la invencion estan particularmente bien adaptados para su uso en aplicaciones en las que los anticuerpos neutralizantes reducen la eficacia de otros vectores basados en serotipo de AAV, asf como otros vectores virales. Los vectores de rAAV de la invencion son particularmente ventajosos en la readministracion de rAVV y terapia genica de repeticion.
Estas y otras realizaciones y ventajas de la invencion se describen en mas detalle posteriormente.
A. Secuencias de serotipo 9/hu14 de AAV
Son de interes las secuencias de acido nucleico y aminoacidos de un AAV, que se denomina indistintamente en el presente documento clon hu. 14 (anteriormente denominado 28.4) y huAAV9. Como se define en el presente documento, el serotipo AAV9 se refiere a AAV que tiene una capsida que genera anticuerpos que reaccionan de forma cruzada serologicamente con la capsida que tiene la secuencia de hu. 14 [SEC ID N°: 123] y cuyos anticuerpos no reaccionan de forma cruzada serologicamente con anticuerpos generados para las capsidas de cualquiera de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 o AAV8.
1. Secuencias de acido nucleico
Las secuencias de acido nucleico de AAV9 incluyen las secuencias de ADN de SEC ID N°: 3, que consiste en 2211 nucleotidos.
Las secuencias de acido nucleico abarcan ademas la cadena que es complementaria de SEC ID N°: 3, asf como las secuencias de ARN y ADNc correspondientes a SEC ID N°: 3, y su cadena complementaria. Tambien se incluyen en las secuencias de acido nucleico variantes naturales y modificaciones obtenidas tecnicamente de SEC ID N°: 3, y su cadena complementaria. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores que se conocen en la tecnica,
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metilacion y sustitucion de uno o mas de los nucleotidos de origen natural con un nucleotido degradado.
Se incluyen ademas secuencias de acido nucleico que son mayores de aproximadamente 90 %, mas preferentemente al menos aproximadamente 95 % y mas preferentemente al menos aproximadamente 98 a 99 %, identicas u homologas de SEC ID N°: 3.
Tambien se incluyen fragmentos de SEC ID N°: 3, su cadena complementaria y ADNc y ARN complementario del mismo. Los fragmentos adecuados son de al menos 15 nucleotidos de longitud, y abarcan fragmentos funcionales, es decir, fragmentos que son de interes biologico. Dichos fragmentos incluyen las secuencias que codifican las tres protemas variables (vp) de la capsida de AAV/HU.14 que son variantes de corte y empalme alternativo: vp1 [nt 1 a 2211 de SEC ID N°: 3]; vp2 [aproximadamente nt 411 a 2211 de SEC ID N°: 3]; y vp 3 [aproximadamente nt 609 a 2211 de SEC ID N°: 3]. Otros fragmentos adecuados de SEC ID N°: 3, incluyen el fragmento que contiene el codon de partida para la protema de la capsida de AAV9/HU.14, y los fragmentos que codifican las regiones hipervariables de la protema de la capsida de vp1, que se describen en el presente documento.
Ademas de incluir las secuencias de acido nucleico proporcionadas en las figuras y el Listado de Secuencias, la presente divulgacion incluye moleculas y secuencias de acido nucleico que estan disenadas para expresar las secuencias de aminoacidos, protemas y peptidos de los serotipos de AAV descritos en el presente documento. Por lo tanto, la divulgacion incluye secuencias de acido nucleico que codifican las siguientes secuencias de aminoacidos de AAV y serotipos de AAV artificiales generados usando estas secuencias y/o fragmentos unicos de las mismas.
Como se usa en el presente documento, los serotipos de AAV artificiales incluyen, sin limitacion, AAV con una protema de la capsida de origen no natural. Dicha capsida artificial puede generarse por cualquier tecnica adecuada, usando secuencias de AAV descritas en el presente documento (por ejemplo, un fragmento de una protema de la capsida de vp1) en combinacion con secuencias heterologas que pueden obtenerse de otros serotipos de AAV (conocido o nuevo), partes no contiguas del mismo serotipo de AAV, de una fuente viral no AAV o de una fuente no viral. Un serotipo de AAV artificial puede ser, sin limitacion, una capsida de AAV quimerica, una capsida de AAV recombinante o una capsida de AAV “humanizada”.
2. Secuencias de aminoacidos, protemas y peptidos de HU.14/AAV9
Son de interes protemas y fragmentos de las mismas que estan codificados por los acido nucleicos de hu.14/AAV9 y protemas y fragmentos de hu.14/AAV9 que se generan por otros metodos. Como se usa en el presente documento, estas protemas incluyen la capsida ensamblada. La divulgacion abarca ademas serotipos de AAV generados usando secuencias de los serotipos de AAV descritos en el presente documento, que se generan usando tecnicas sinteticas, recombinantes u otras conocidas por los expertos en la materia. La divulgacion no se limita a secuencias de aminoacidos, peptidos y protemas de AAV expresados a partir de secuencias de acido nucleico de AAV desveladas en el presente documento, sino que abarca las secuencias de aminoacidos, peptidos y protemas generados por otros metodos conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, por smtesis qmmica, por otras tecnicas sinteticas o por otros metodos. Las secuencias de cualquiera de las capsidas de AAV proporcionadas en el presente documento pueden generarse facilmente usando una diversidad de tecnicas.
Se conocen bien por los expertos en la materia tecnicas de produccion adecuadas. Vease, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Como alternativa, tambien pueden sintetizarse peptidos por los metodos de smtesis de peptidos de fase solida bien conocidos (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1962); Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pp. 27-62). Estos y otros metodos de produccion adecuados estan dentro del conocimiento de los expertos en la materia.
Las protemas particularmente deseables incluyen las protemas de la capsida de AAV, que se codifican por las secuencias de nucleotidos identificadas anteriormente. La capsida de AAV esta compuesta de tres protemas, vp1, vp2 y vp3, que son variantes de corte y empalme alternativo. La secuencia de longitud completa proporcionada en la Fig. 2 es la de vp1. Las protemas de la capsida AAV9/HU.14 incluyen vp1 [aminoacidos (aa) 1 a 736 de SEC ID N°: 123], vp2 [aproximadamente aa 138 a 736 de SEC ID N°: 123], vp3 [aproximadamente aa 203 a 736 de SEC ID N°: 123], y fragmentos funcionales de las mismas. Otros fragmentos deseables de la protema de la capsida incluyen las regiones constante y variable, localizadas entre regiones hipervariables (HVR). Otros fragmentos deseables de la protema de la capsida incluyen las HVR en sf mismas.
Un algoritmo desarrollado para determinar areas de divergencia de secuencia en AAV2 ha producido 12 regiones hipervariables (HVR) de las que 5 solapan o son parte de las cuatro regiones variables previamente descritas [Chiorini et al, J. Virol, 73: 1309-19 (1999); Rutledge et al, J. Virol., 72: 309-319]. Usando este algoritmo y/o las tecnicas de alineamiento descritas en el presente documento, se determinan las HVR de los serotipos de AAV. Por ejemplo, las HVR estan localizadas de la siguiente manera: HVR1, aa 146-152; HVR2, aa 182-186; HVR3, aa 262264; HVR4, aa 381-383; HVR5, aa 450-474; HVR6, aa 490-495; HVR7, aa 500-504; HVR8, aa 514-522; HVR9, aa 534-555; HVR10, aa 581-594; HVR11, aa 658-667; y HVR12, aa 705-719 [el sistema de numeracion se basa en un alineamiento que usa la vp1 de AAV2 como punto de referenda]. Usando el alineamiento proporcionado en el
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presente documento realizado usando el programa Clustal X con ajustes por defecto, o usando otros programas de alineamiento disponibles en el mercado o publicamente con ajustes por defecto tales como los descritos en el presente documento, un experto en la materia puede determinar facilmente los fragmentos correspondientes del AAV.
Otros fragmentos deseables mas de la protema de la capsida AAV9/HU.14 incluyen los aminoacidos 1 a 184 de SEC ID N°: 123, aminoacidos 199 a 259; aminoacidos 274 a 446; aminoacidos 603 a 659; aminoacidos 670 a 706; aminoacidos 724 a 736 de SEC ID N°: 123; aa 185-198; aa 260-273; aa 447-477; aa 495-602; aa 660-669; y aa 707723. Adicionalmente, los ejemplos de otros fragmentos adecuados de capsidas de AAV incluyen, con respecto a la numeracion de AAV9 [SEC ID N°: 123], aa 24-42, aa 25-28; aa 81-85; aa 133-165; aa 134-165; aa 137-143; aa 154156; aa 194-208; aa 261-274; aa 262-274; aa 171-173; aa 413-417; aa 449-478; aa 494-525; aa 534-571; aa 581601; aa 660-671; aa 709-723. Usando el alineamiento proporcionado en el presente documento realizado usando el programa Clustal X con ajustes por defecto, o usando otros programas de alineamiento disponibles en el mercado o publicamente con ajustes por defecto, un experto en la materia puede determinar facilmente los fragmentos correspondientes de las nuevas capsidas de AAV de la invencion.
Otras protemas de AAV9/HU.14 deseables mas incluyen las protemas rep incluyendo rep68/78 y rep40/52.
Convenientemente, los fragmentos son de al menos 8 aminoacidos de longitud. Sin embargo, pueden utilizarse facilmente fragmentos de otras longitudes deseadas. Dichos fragmentos pueden producirse de forma recombinante o por otro medio adecuado, por ejemplo, smtesis qmmica.
Tambien son de interes otras secuencias de AAV9/HU.14 que se identifican usando la informacion de secuencia proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, dadas las secuencias de AAV9/HU.14 proporcionadas en el presente documento, puede aislarse AAV9/HU.14 infeccioso usando tecnologfa de avance de genoma (Siebert et al., 1995, Nucleic Acid Research, 23: 1087-1088, Friezner-Degen et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). El avance de genoma es particularmente adecuado para identificar y aislar las secuencias adyacentes a las secuencias identificadas de acuerdo con el metodo descrito en el presente documento. Esta tecnica tambien es util para aislar repeticiones terminales invertidas (ITR) del serotipo AAV9/HU.14, basandose en las secuencias de rep y la capsida de AAV proporcionadas en el presente documento.
Las secuencias, las protemas y los fragmentos de la invencion pueden producirse por cualquier medio adecuado, incluyendo produccion recombinante, smtesis qmmica u otros medios sinteticos. Dichos metodos de produccion estan dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no son una limitacion de la presente invencion.
III. Produccion de rAAV con nuevas capsidas de AAV
La invencion abarca nuevas secuencias de la capsida de AAV que estan libres de ADN y/o material celular con las que estos virus se asocian en la naturaleza.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona moleculas que utilizan las nuevas secuencias de AAV de la invencion, para la produccion de moleculas utiles en el suministro de un gen heterologo u otras secuencias de acido nucleico a una celula diana.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona moleculas que utilizan las secuencias de AAV de la invencion, para la produccion de vectores virales utiles en el suministro de un gen heterologo u otras secuencias de acido nucleico a una celula diana.
Las moleculas de la invencion que contienen secuencias de AAV incluyen cualquier elemento genetico (vector) que pueda suministrarse a una celula hospedadora, por ejemplo, ADN desnudo, un plasmido, fago, transposon, cosmido, episoma, una protema en un vehmulo de suministro no viral (por ejemplo, un vehmulo basado en lfpidos), virus, etc., que transfiera las secuencias portadas en el mismo. El vector seleccionado puede suministrarse por cualquier metodo adecuado, incluyendo transfeccion, electroporacion, suministro de liposomas, tecnicas de fusion de membrana, microgranulos recubiertos con ADN de alta velocidad, infeccion viral y fusion de protoplastos. Los metodos usados para construir cualquier realizacion de la presente invencion se conocen por los expertos en la materia de la manipulacion de acidos nucleicos e incluyen ingeniena genetica, ingeniena recombinante y tecnicas sinteticas. Vease, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
En una realizacion, los vectores de la invencion contienen, entre otras, secuencias que codifican una capsida de AAV de la invencion. Opcionalmente, los vectores de la invencion pueden contener protemas tanto cap como rep de AAV. En vectores en los que se proporcionan tanto rep como cap de AAV, las secuencias de rep de AAV y cap de AAV pueden originarse de un AAV del mismo clado. Como alternativa, la presente invencion proporciona vectores en los que las secuencias de rep son de una fuente de AAV que difiere de la que proporciona las secuencias de cap. En una realizacion, secuencias de rep y cap se expresan de fuentes separadas (por ejemplo, vectores separados o una celula hospedadora y un vector). En otra realizacion, estas secuencias de rep se fusionan en fase de
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secuencias de cap de una fuente de AAV diferente para formar un vector de AAV quimerico. Opcionalmente, los vectores de la invencion son vectores empaquetados en una capsida del AAV de la invencion. Estos vectores y otros vectores descritos en el presente documento pueden contener adicionalmente un minigen que comprende un transgen seleccionado que esta flanqueado por AAV 5' ITR y AAV 3' ITR.
Por lo tanto, los vectores descritos en el presente documento contienen secuencias de acido nucleico que codifican una capsida de AAV intacta que puede ser de una unica secuencia de AAV (por ejemplo, AAV9/HU.14). Dicha capsida puede comprender los aminoacidos 1 a 736 de SEC ID N°: 123. Como alternativa, estos vectores contienen secuencias que codifican capsidas artificiales que contienen uno o mas fragmentos de la capsida de AAV9/HU.14 fusionada con protemas de la capsida AAV o no AAV heterologas (o fragmentos de las mismas). Estas protemas de la capsida artificiales se seleccionan de partes no contiguas de la capsida de AAV9/HU.14 o de capsidas de otros AAV. Por ejemplo, un rAAV puede tener una protema de la capsida que comprende una o mas de las regiones de la capsida de AAV9/HU.14 seleccionadas de la vp2 y/o vp3, o de vp 1, o fragmentos de las mismas seleccionadas de los aminoacidos 1 a 184, aminoacidos 199 a 259; aminoacidos 274 a 446; aminoacidos 603 a 659; aminoacidos 670 a 706; aminoacidos 724 a 738 de la capsida de AAV9/HU.14, SEC ID N°: 123. En otro ejemplo, puede ser deseable alterar el codon de partida de la protema vp3 a GTG. Como alternativa, el rAAV puede contener una o mas de las regiones hipervariables de la protema de la capsida de serotipo 9 de AAV que se identifican en el presente documento, u otro fragmento incluyendo, sin limitacion, aa 185-198; aa 260-273; aa 447-477; aa 495-602; aa 660669; y aa 707-723 de la capsida de AAV9/HU.14. Vease, SEC ID N°: 123. Estas modificaciones pueden ser para aumentar la expresion, el rendimiento y/o para mejorar la purificacion en los sistemas de expresion seleccionados, o para otro fin deseado (por ejemplo, para cambiar el tropismo o alterar los epftopos de anticuerpos de neutralizacion).
Los vectores descritos en el presente documento, por ejemplo, un plasmido, son utiles para una diversidad de fines, pero son particularmente bien adecuados para su uso en la produccion de un rAAV que contiene una capsida que comprende secuencias de AAV o un fragmento de las mismas. Estos vectores, incluyendo rAAV, sus elementos, construccion, y uso se describen en detalle en el presente documento.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para generar un virus adeno-asociado (AAV) recombinante de acuerdo con la reivindicacion 13.
Los componentes requeridos para cultivar en la celula hospedadora para empaquetar un minigen de AAV en una capsida de AAV pueden proporcionarse en la celula hospedadora en trans. Como alternativa, puede proporcionarse uno cualquiera o mas de los componentes requeridos (por ejemplo, minigen, secuencias de rep, secuencias de cap y/o funciones auxiliares) por una celula hospedadora estable que se ha modificado tecnicamente para contener uno o mas de los componentes requeridos usando metodos conocidos por los expertos en la materia. Mas convenientemente, dicha celula hospedadora estable contendra el componente o los componentes requeridos bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el componente o los componentes requeridos pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo. Se proporcionan en el presente documento ejemplos de promotores inducibles y constitutivos, en el analisis de elementos reguladores adecuados para su uso con el transgen. En otra alternativa mas, una celula hospedadora estable seleccionada puede contener un componente o componentes seleccionados bajo control de un promotor constitutivo y otro componente o componentes seleccionados bajo el control de uno o mas promotores inducibles. Por ejemplo, puede generarse una celula hospedadora estable que deriva de celulas 293 (que contienen funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contiene las protemas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Otras celulas hospedadoras estables mas pueden generarse por un experto en la materia.
El minigen, secuencias de rep, secuencias de cap, y funciones auxiliares requeridas para producir el rAAV de la invencion pueden suministrarse a la celula hospedadora de empaquetamiento en la forma de cualquier elemento genetico que transfiere las secuencias transportadas en la misma. El elemento genetico seleccionado puede suministrarse por cualquier metodo adecuado, incluyendo los descritos en el presente documento. Los metodos usados para construir cualquier realizacion de la presente invencion se conocen por los expertos en la materia de la manipulacion de acido nucleico e incluyen ingeniena genetica, ingeniena recombinante y tecnicas sinteticas. Vease, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. De forma similar, se conocen bien metodos para generar viriones de rAAV y la seleccion de un metodo adecuado no es una limitacion en la presente invencion. Vease, por ejemplo, K. Fisher et al, J. Virol., 70: 520-532 (1993) y Patente de Estados Unidos N.° 5.478.745.
A no ser que se especifique de otro modo, las ITR de AAV, y otros componentes de AAV seleccionados descritos en el presente documento, pueden seleccionarse facilmente de entre cualquier AAV, incluyendo, sin limitacion, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AaV5, AAV6, AAV7, AAV9. Estas ITR u otros componentes de AaV pueden aislarse facilmente usando tecnicas disponibles para los expertos en la materia a partir de una secuencia de AAV. Dicho AAV puede aislarse u obtenerse de fuentes academicas, comerciales o publicas (por ejemplo, la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA). Como alternativa, las secuencias de AaV pueden obtenerse mediante medios sinteticos u otros adecuados por referencia a secuencias publicadas tales como las que estan disponibles en la bibliograffa o en bases de datos tales como, por ejemplo, GenBank®, PubMed® o similares.
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A. El minigen
El minigen esta compuesto de, como mmimo, un transgen y sus secuencias reguladoras y repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV 5' y 3'. En una realizacion deseable, se usan las ITR de AAV de serotipo 2. Sin embargo, pueden seleccionarse ITR de otras fuentes adecuadas. Es este minigen el que se empaqueta en una protema de la capsida y se suministra una celula hospedadora seleccionada.
1. El transgen
El transgen es una secuencia de acido nucleico, heterologa de las secuencias de vectores que flanquean el transgen, que codifica un polipeptido, una protema u otro producto de interes. La secuencia codificante de acido nucleico esta unida operativamente con componentes reguladores de manera que permita la transcripcion, traduccion y/o expresion de transgenes en una celula hospedadora.
La composicion de la secuencia transgenica dependera del uso que se le de al vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia transgenica incluye una secuencia indicadora, que tras su expresion produce una senal detectable. Dichas secuencias indicadoras incluyen, sin limitacion, secuencias de ADN que codifican p-lactamasa, p- galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina quinasa, protema verde fluorescente (GFP), GFP potenciada (EGFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, protemas unidas a membrana incluyendo, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la protema hemaglutinina de la gripe, y otras bien conocidas en la tecnica, para las que existen anticuerpos de alta afinidad dirigidos a las mismas o pueden producirse por medios convencionales, y protemas de fusion que comprenden una protema unida a membrana fusionada de forma apropiada con un dominio marcador de antfgeno de, entre otros, hemaglutinina o Myc.
Estas secuencias codificantes, cuando se asocian con elementos reguladores que conducen su expresion, proporcionan senales detectables por medios convencionales, incluyendo ensayos enzimaticos, radiograficos, colorimetricos, de fluorescencia u otros espectrograficos, ensayos de separacion de celulas activadas por fluorescencia y ensayos inmunologicos, incluyendo ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) e inmunohistoqmmica. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen de LacZ, la presencia del vector que porta la senal se detecta por ensayos con respecto a la actividad beta-galactosidasa. Cuando el transgen es protema verde fluorescente o luciferasa, el vector que porta la senal puede medirse visualmente por el color o la produccion de luz en un luminometro.
Sin embargo, convenientemente, el transgen es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es util en biologfa y medicina, tales como protemas, peptidos, ARN, enzimas, mutantes negativos dominantes, o ARN catalfticos. Las moleculas de ADN convenientes incluyen ARNt, ARNbc, ARN ribosomico, ARN catalftico, ARNip, ARN en horquilla pequeno, ARN de corte y empalme en trans, y ARN antisentido. Un ejemplo de una secuencia de ARN util es una secuencia que inhibe o extingue la expresion de una secuencia de acido nucleico diana en el animal tratado. Tfpicamente, las secuencias diana adecuadas incluyen dianas oncologicas y enfermedades virales. Vease, como ejemplo de dichas dianas las dianas oncologicas y virus identificados posteriormente en la seccion que se refiere a inmunogenos.
El transgen puede utilizarse para corregir o aliviar deficiencias genicas, que pueden incluir deficiencias en las que se expresan genes normales a niveles menores que los niveles normales o deficiencias en las que el producto genico funcional no se expresa. Como alternativa, el transgen puede proporcionar un producto a una celula que no se expresa de forma nativa en el tipo celular o en el hospedador. Un tipo preferido de secuencia transgenica codifica una protema o un polipeptido terapeutico que se expresa en una celula hospedadora. La invencion incluye ademas usar multiples transgenes. En ciertas situaciones, un transgen diferente puede usarse para codificar cada subunidad de una protema, o para codificar diferentes peptidos o protemas. Esto es deseable cuando el tamano del ADN que codifica la subunidad proteica es grande, por ejemplo, para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, o una protema distrofina. Para que la celula produzca la protema multi-subunidad, se infecta una celula con el virus recombinante que contiene cada una de las subunidades diferentes. Como alternativa, diferentes subunidades de una protema pueden codificarse por el mismo transgen. En este caso, un unico transgen incluye el ADN que codifica cada una de las subunidades, con el ADN para cada subunidad separado por un sitio de entrada de ribozimas interno (IRES). Esto es deseable cuando el tamano del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeno, por ejemplo, el tamano total del ADN que codifica las subunidades y el IRES es menor de cinco kilobases. Como alternativa a un IRES, el ADN puede separarse por secuencias que codifican un peptido 2A, que se auto-escinde en un acontecimiento postraduccional. Vease, por ejemplo, M.L. Donnelly, et al, J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 3-21 (ene 1997); Furler, S., et al, Gene Ther., 8(11): 864-873 (junio 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10): 811817 (mayo 2001). Este peptido 2A es significativamente mas pequeno que un IRES, haciendolo adecuado para su uso cuando el espacio es un factor limitante. Con mas frecuencia, cuando el transgen es grande, consiste en multiples subunidades, o se suministran conjuntamente dos transgenes, se administran conjuntamente rAAV que porta el transgen o los transgenes deseados o subunidades para permitirles concatemerizar in vivo para formar un unico genoma de vector. En una de dichas realizaciones, un primer AAV puede portar un casete de expresion que expresa un unico transgen y un segundo AAV puede portar un casete de expresion que expresa un transgen diferente para co-expresion en la celula hospedadora. Sin embargo, el transgen seleccionado puede codificar
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cualquier producto biologicamente activo u otro producto, por ejemplo, un producto conveniente para su estudio.
Pueden seleccionarse facilmente transgenes adecuados por un experto en la materia. La seleccion del transgen no se considera una limitacion de la presente invencion.
2. Elementos reguladores
Ademas de los principales elementos identificados anteriormente para el minigen, el vector tambien incluye elementos de control convencionales que estan unidos operativamente con el transgen de manera que permite su transcripcion, traduccion y/o expresion en una celula transfectada con el vector plasirndico o infectada con el virus producido por la invencion. Como se usa en el presente documento, las secuencias “unidas operativamente” incluyen tanto secuencias de control de la expresion que son contiguas con el gen de interes como secuencias de control de la expresion que actuan en trans o a una distancia para controlar el gen de interes.
Las secuencias de control de la expresion incluyen secuencias de inicio de la transcripcion, terminacion, promotoras y potenciadoras apropiadas; senales de procesamiento de ARN eficaces tales como senales de corte y empalme y poliadenilacion (poliA); secuencias que estabilizan ARNm citoplasmatico; secuencias que potencian la eficacia de traduccion (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad proteica; y cuando se desee, secuencias que potencien la secrecion del producto codificado. Un gran numero de secuencias de control de la expresion, incluyendo promotores que son nativos, constitutivos, inducibles y/o espedficos de tejido, se conocen en la tecnica y pueden utilizarse.
Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitacion, el promotor de LTR del virus de sarcoma de Rous (VSR) retroviral (opcionalmente con el potenciador de VSR), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [vease, por ejemplo, Boshart et al, Cell, 41: 521-530 (1985)], el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de p-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), y el promotor de EF1 [Invitrogen]. Los promotores inducibles permiten la regulacion de la expresion genica y pueden regularse por compuestos proporcionados de forma exogena, factores ambientales tales como la temperatura, o la presencia de un estado fisiologico espedfico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciacion particular de la celula, o en celulas de replicacion solamente. Los promotores inducibles y sistemas inducibles estan disponibles de una diversidad de fuentes comerciales, incluyendo, sin limitacion, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y pueden seleccionarse facilmente por un experto en la materia. Los ejemplos de promotores inducibles regulados por compuestos proporcionados de forma exogena incluyen el promotor de metalotionina de oveja inducible por cinc (MT), el promotor del virus del tumor mamario de raton inducible por dexametasona (Dex) (MMTV), el sistema de promotor de polimerasa T7 [Publicacion de Patente Internacional N.° WO 98/10088]; el promotor de ecdisona de insectos [No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al, Science, 268: 1766-1769 (1995), vease tambien Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)], el sistema inducible por RU486 [Wang et al, Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) y Wang et al, Gene Ther., 4: 432-441 (1997)] y el sistema inducible por rapamicina [Magari et al, J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser utiles en este contexto son los que estan regulados por un estado fisiologico espedfico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciacion particular de la celula, o en celulas de replicacion solamente.
En otra realizacion, se usara el promotor nativo para el transgen. El promotor nativo puede preferirse cuando se desee que la expresion del transgen imite la expresion nativa. El promotor nativo puede usarse cuando la expresion del transgen debe regularse temporalmente o por el desarrollo, o de una manera espedfica de tejido, o en respuesta a estfmulos transcripcionales espedficos. En una realizacion adicional, otros elementos de control de la expresion nativos, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilacion o secuencias consenso de Kozak, tambien pueden usarse para imitar la expresion nativa.
Otra realizacion del transgen incluye un gen unido operativamente con un promotor espedfico de tejido. Por ejemplo, si se desea la expresion en musculo esqueletico, debena usarse un promotor activo en el musculo. Estos incluyen los promotores de genes que codifican p-actina esqueletica, cadena ligera 2A de miosina, distrofina, creatina quinasa de musculo, asf como promotores de musculo sintetico con actividades mayores que los promotores de origen natural (vease Li et al., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)). Se conocen para el Idgado ejemplos de promotores que son espedficos de tejido (albumina, Miyatake et al., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor del nucleo del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfa-fetoprotema (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteocalcina de hueso (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 18596 (1997)); sialoprotema de hueso (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena de receptor de linfocitos T), promotor neuronal tal como de enolasa espedfica de neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 50315 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)), y el gen de vgf espedfico de neurona (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)), entre otros.
Opcionalmente, los plasmidos que portan transgenes terapeuticamente utiles tambien pueden incluir marcadores
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seleccionables o genes indicadores que pueden incluir secuencias que codifican resistencia a geneticina, higromicina o puromicina, entre otros. Dichos indicadores seleccionables o genes marcadores (preferentemente localizados fuera del genoma viral para rescatar por el metodo de la invencion) pueden usarse para senalizar la presencia de los plasmidos en celulas bacterianas, tales como resistencia a ampicilina. Otros componentes del plasmido pueden incluir un origen de replicacion. La seleccion de estos y otros promotores y elementos vectores son convencionales y estan disponibles muchas de dichas secuencias [vease, por ejemplo, Sambrook et al, y referencias citadas en el mismo].
La combinacion del transgen, promotor/potenciador, e ITR 5' y 3' de AAV se denomina “minigen” para facilitar la referencia en el presente documento. Provisto de las ensenanzas de la presente invencion, puede realizarse el diseno de dicho minigen acudiendo a tecnicas convencionales.
3. Suministro del minigen a una celula hospedadora de empaquetamiento
El minigen puede transportarse en cualquier vector adecuado, por ejemplo, un plasmido, que se suministra a una celula hospedadora. Los plasmidos utiles en la presente invencion pueden modificarse tecnicamente de modo que sean adecuados para replicacion y, opcionalmente, integracion en celulas procariotas, celulas de mairnfero o ambas. Estos plasmidos (u otros vectores que portan el ITR 5' de AAV-molecula heterologa-ITR 3' de AAV) contienen secuencias que permiten la replicacion del minigen en eucariotas y/o procariotas y marcadores de seleccion para estos sistemas. Los marcadores seleccionables o genes indicadores pueden incluir secuencias que codifican resistencia a geneticina, higromicina o purimicina, entre otros. Los plasmidos tambien pueden contener ciertos indicadores o genes marcadores seleccionables que pueden usarse para senalizar la presencia del vector en celulas bacterianas, tales como resistencia a ampicilina. Otros componentes del plasmido pueden incluir un origen de replicacion y un amplicon, tal como el sistema de amplicon que emplea el antfgeno nuclear de virus de Epstein Barr. Este sistema de amplicon, u otros componentes de amplicon similares permiten una replicacion episomica de alto numero de copias en las celulas. Preferentemente, la molecula que porta el minigen se transfecta a la celula, en la que puede existir de forma transitoria. Como alternativa, el minigen (que porta el ITR 5' de AAV-molecula heterologa- ITR 3') puede estar integrado de forma estable en el genoma de la celula hospedadora, bien de forma cromosomica o como un epitoma. En ciertas realizaciones, el minigen puede estar presente en multiples copias, opcionalmente en concatemeros cabeza a cabeza, cabeza a cola o cola a cola. Se conocen tecnicas de transfeccion adecuadas y pueden utilizarse facilmente para suministrar el minigen a la celula hospedadora.
Generalmente, cuando se suministra el vector que comprende el minigen por transfeccion, el vector se suministra en una cantidad de aproximadamente 5 |ig a aproximadamente 100 |ig de ADN, de aproximadamente 10 |ig a aproximadamente 50 |ig de ADN a aproximadamente 1 x 104 celulas a aproximadamente 1 x 1013 celulas, o aproximadamente 1 x 105 celulas. Sin embargo, las cantidades relativas de ADN de vector para celulas hospedadoras pueden ajustarse, teniendo en consideracion factores tales como el vector seleccionado, el metodo de suministro y las celulas hospedadoras seleccionadas.
B. Secuencias de Rep y Cap
Ademas del minigen, la celula hospedadora contiene las secuencias que conducen la expresion de una nueva protema de capsida de AAV de la invencion (o una protema de capsida que comprende un fragmento de la misma) en la celula hospedadora y secuencias de rep de la misma fuente que la fuente de las ITR de AAV halladas en el minigen, o una fuente de complementacion cruzada. Las secuencias de cap y rep de AAV pueden obtenerse de forma independiente de una fuente de AAV como se ha descrito anteriormente y pueden introducirse en la celula hospedadora de cualquier manera conocida por un experto en la materia como se ha descrito anteriormente. Adicionalmente, cuando se pseudotipe un vector de aAv en (por ejemplo, una capsida de AAV9/HLJ.14), las secuencias que codifican cada una de estas protemas rep esenciales puede proporcionarse por diferentes fuentes de AAV (por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAv5, AAV6, AaV7, AAV8). Por ejemplo, las secuencias de rep78/76 pueden ser de AAV2, mientras que las secuencias de rep52/40 pueden ser de aAV8.
En una realizacion, la celula hospedadora contiene de forma estable la protema de la capsida bajo el control de un promotor adecuado, tal como los descritos anteriormente. Mas convenientemente, en esta realizacion, la protema de la capsida se expresa bajo el control de un promotor inducible. En otra realizacion, la protema de la capsida se proporciona a la celula hospedadora en trans. Cuando se suministra la celula hospedadora en trans, la protema de la capsida puede suministrarse mediante un plasmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir la expresion de la protema de la capsida seleccionada en la celula hospedadora. Mas convenientemente, cuando se suministra a la celula hospedadora en trans, el plasmido que porta la protema de la capsida tambien porta otras secuencias requeridas para el empaquetamiento del rAAV, por ejemplo, las secuencias de rep.
En otra realizacion, la celula hospedadora contiene de forma estable las secuencias de rep bajo el control de un promotor adecuado, tal como los descritos anteriormente. Mas convenientemente, en esta realizacion, las protemas rep esenciales se expresan bajo el control de un promotor inducible. En otra realizacion, las protemas rep se proporcionan a la celula hospedadora en trans. Cuando se suministran a la celula hospedadora en trans, las protemas rep pueden suministrarse mediante un plasmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir la
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expresion de las protemas rep seleccionadas en la celula hospedadora. Mas convenientemente, cuando se suministra a la celula hospedadora en trans, el plasmido que porta la protema de la capsida tambien porta otras secuencias requeridas para el empaquetamiento de rAAV, por ejemplo, las secuencias de rep y cap.
Por lo tanto, en una realizacion, las secuencias de rep y cap pueden transfectarse a la celula hospedadora en una unica molecula de acido nucleico y existen de forma estable en la celula como un episoma. En otra realizacion, las secuencias de rep y cap se integran de forma estable en el cromosoma de la celula. Otra realizacion tiene las secuencias de rep y cap expresadas de forma transitoria en la celula hospedadora. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico util para dicha transfeccion comprende, de 5' a 3', un promotor, un espaciador opcional intercalado entre el promotor y el sitio de inicio de la secuencia del gen rep, una secuencia del gen rep de AAV y una secuencia del gen cap de AAV.
Opcionalmente, las secuencias de rep y/o cap pueden proporcionarse en un vector que contiene otras secuencias de ADN que se van a introducir en las celulas hospedadoras. Por ejemplo, el vector puede contener la construccion de rAAV que comprende el minigen. El vector puede comprender uno o mas de los genes que codifican las funciones auxiliares, por ejemplo, las protemas adenovirales E1, E2a y E4 ORF6, y el gen para ARN de VAI.
Preferentemente, el promotor usado en esta construccion puede ser cualquiera de los promotores constitutivos, inducibles o nativos conocidos por los expertos en la materia o como se ha analizado anteriormente. En una realizacion, se emplea la secuencia promotora de P5 de AAV. La seleccion de AAV para proporcionar cualquiera de estas secuencias no limita la invencion.
En otra realizacion preferida, el promotor para rep es un promotor inducible, tal como se ha analizado anteriormente en relacion con los elementos reguladores del transgen. Un promotor preferido para la expresion de rep es el promotor de T7. El vector que comprende el gen rep regulado por el promotor T7 y el gen cap, se transfecta o transforma en una celula que expresa de forma constitutiva o inducible la T7 polimerasa. Vease Publicacion de Patente Internacional N.° WO 98/10088, publicada el 12 de marzo de 1998.
El espacio por es un elemento opcional en el diseno del vector. El espaciador es una secuencia de ADN intercalada entre el promotor y el sitio de inicio ATG del gen rep. El espaciador puede tener cualquier diseno deseado; es decir, puede ser una secuencia aleatoria de nucleotidos o, como alternativa, puede codificar un producto genico, tal como un gen marcador. El espaciador puede contener genes que incorporan tfpicamente sitios de inicio/terminacion y poliA. El espaciador puede ser una secuencia de ADN no codificante de un procariota o eucariota, una secuencia no codificante repetitiva, una secuencia codificante sin controles de la transcripcion o una secuencia codificante con controles de la transcripcion. Dos fuentes ejemplares de secuencias espaciadoras son las secuencias de escalera de fagos o secuencias de escalera de levadura, que estan disponibles en el mercado, por ejemplo, de Gibco o Invitrogen, entre otros. El espaciador puede ser de cualquier tamano suficiente para reducir la expresion de los productos genicos de rep78 y rep68, dejando los productos genicos de rep52, rep40 y cap expresados a niveles normales. La longitud del espaciador puede variar por lo tanto de aproximadamente 10 pb a aproximadamente 10,0 kpb, preferentemente en el intervalo da aproximadamente 100 pb a aproximadamente 8,0 kpb. Para reducir la posibilidad de recombinacion, el espaciador es preferentemente menor de 2 kpb de longitud; sin embargo, la invencion no esta limitada de este modo.
Aunque la molecula o las moleculas que proporcionan rep y cap pueden existir en la celula hospedadora de forma transitoria (es decir, mediante transfeccion), se prefiere que una o ambas de las protemas rep y cap y el promotor o los promotores que controlen su expresion se expresen de forma estable en la celula hospedadora, por ejemplo, como un episoma o mediante integracion en el cromosoma de la celula hospedadora. Los metodos empleados para construir realizaciones de la presente invencion son tecnicas de ingeniena genetica o ingeniena recombinante convencionales tales como las descritas en las referencias anteriores. Aunque la presente memoria descriptiva proporciona ejemplos ilustrativos de construcciones espedficas, usando la informacion proporcionada en el presente documento, un experto en la materia puede seleccionar y disenar otras construcciones adecuadas, usando una seleccion de espaciadores, promotores P5, y otros elementos, incluyendo al menos una senal de inicio y terminacion de la traduccion y la adicion opcional de sitios de poliadenilacion.
En otra realizacion de la presente invencion, la protema rep o cap puede proporcionarse de forma estable por una celula hospedadora.
C. Las funciones auxiliares
La celula hospedadora de empaquetamiento tambien requiere funciones auxiliares para empaquetar el rAAV de la invencion. Opcionalmente, estas funciones pueden proporcionarse por un herpes virus. Mas convenientemente, las funciones auxiliares necesarias se proporcionan cada una a partir de una fuente de adenovirus de primate humano o no humano, tal como las descritas anteriormente y/o estan disponibles de una diversidad de fuentes, incluyendo la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manassas, VA (Estados Unidos). En una realizacion preferida en la actualidad, la celula hospedadora se proporciona con y/o contiene un producto genico de E1a, un producto genico de E1b, un producto genico de E2a, y/o un producto genico de E4 oRF6. La celula hospedadora puede contener
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otros genes adenovirales tales como ARN de VAI, pero estos genes no son necesarios. En una realizacion preferida, no estan presentes otros genes de adenovirus o funciones genicas en la celula hospedadora.
Por “ADN adenoviral que expresa el producto genico de Ea1” se entiende cualquier secuencia de adenovirus que codifique E1a o cualquier parte de Ela funcional. El ADN adenoviral que expresa el producto genico de E2a y el ADN adenoviral que expresa los productos genicos de E4 ORF6 se definen de forma similar. Tambien se incluye cualquier alelo u otras modificaciones del gen adenoviral o parte funcional del mismo. Dichas modificaciones pueden introducirse deliberadamente acudiendo a tecnicas de ingeniena genetica o mutagenicas convencionales para potenciar la funcion adenoviral de alguna manera, asf como variantes alelicas de origen natural de las mismas. Dichas modificaciones y metodos para manipular el ADN para conseguir estas funciones de genes de adenovirus se conocen por los expertos en la materia.
Los productos genicos de adenovirus E1a, E1b, E2a, y/o E4ORF6, asf como cualquier otra funcion auxiliar deseada, pueden proporcionarse usando cualquier medio que permita su expresion en una celula. Cada una de las secuencias que codifican estos productos pueden estar en un vector separado, o uno o mas genes pueden estar en el mismo vector. El vector puede ser cualquier vector conocido en la tecnica o desvelado anteriormente, incluyendo plasmidos, cosmidos y virus. La introduccion en la celula hospedadora del vector puede conseguirse por cualquier medio conocido en la tecnica o como se ha desvelado anteriormente, incluyendo transfeccion, infeccion, electroporacion, suministro por liposomas, tecnicas de fusion de membrana, microgranulos recubiertos con ADN de alta velocidad, infeccion viral y fusion de protoplastos, entre otros. Uno o mas de los genes adenovirales pueden integrarse de forma estable en el genoma de la celula hospedadora, expresado de forma estable como episomas, o expresado de forma transitoria. Los productos genicos pueden expresarse todos de forma transitoria, en un episoma o integrado de forma estable, o algunos de los productos genicos pueden expresarse de forma estable mientras que otros se expresan de forma transitoria. Ademas, los promotores para cada uno de los genes adenovirales pueden seleccionarse independientemente de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenoviral nativo. Los promotores pueden regularse por un estado fisiologico espedfico del organismo o la celula (es decir, por el estado de diferenciacion o en celulas en replicacion o quiescentes) o mediante factores anadidos de forma exogena, por ejemplo.
D. Celulas hospedadoras y lmeas celulares de empaquetamiento
La celula hospedadora en sf misma puede seleccionarse de cualquier organismo biologico, incluyendo celulas procariotas (por ejemplo, bacterianas), y celulas eucariotas, incluyendo, celulas de insecto, celulas de levadura y celulas de marnffero. Se seleccionan celulas hospedadoras particularmente deseables de entre cualquier especie de mairnfero, incluyendo, sin limitacion, celulas tales como a549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, CoS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, celulas 293 (que expresan E1 adenoviral funcional), Saos, C2C12, celulas L, HT1080, HepG2 y fibroblastos primarios, hepatocitos y celulas mioblasticas derivadas de mamfferos incluyendo ser humano, mono, raton, rata, conejo y hamster. La seleccion de las especies de mamffero que proporcionan las celulas no es una limitacion de la presente invencion; ni lo es el tipo de celulas de mamffero, es decir, fibroblasto, hepatocito, celula tumoral, etc. Los requisitos para la celula usada es que no porte ningun gen de adenovirus distinto de E1, E2a y/o E4 ORF6; no contiene ningun otro gen de virus que pueda dar como resultado recombinacion homologa de un virus contaminante durante la produccion de rAAV; y es capaz de infectar o transfectar ADN y expresar el ADN transfectado. En una realizacion preferida, la celula hospedadora es una que tiene rep y cap transfectado de forma estable en la celula.
Una celula hospedadora util en la presente invencion es una celula hospedadora transformada de forma estable con las secuencias que codifican rep y cap, y que se transfecta con el aDn de adenovirus E1, E2a y E4ORF6 y una construccion que porta el minigen como se ha descrito anteriormente. Tambien pueden emplearse de forma similar lmeas celulares que expresan rep y/o cap, tales como B-50 (Publicacion de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 99/15685) o las descritas en la Patente de Estados Unidos N.° 5.658.785. Otra celula hospedadora deseable contiene el ADN adenoviral mmimo que es suficiente para expresar E4 ORF6. Pueden construirse otras lmeas celulares mas usando las secuencias de cap de AAV9 nuevas de la invencion.
La preparacion de una celula hospedadora de acuerdo con la presente invencion implica tecnicas tales como ensamblaje de secuencias de aDn seleccionadas. Este ensamblaje puede conseguirse utilizando tecnicas convencionales. Dichas tecnicas incluyen clonacion de ADNc y genomico, que se conocen bien y se describen en Sambrook et al., citado anteriormente, uso de secuencias oligonucleotfdicas solapantes de los genomas de adenovirus y AAV, combinado con reaccion en cadena de la polimerasa, metodos sinteticos y cualquier otro metodo adecuado que proporcione la secuencia de nucleotidos deseada.
La introduccion de las moleculas (como plasmidos o virus) en la celula hospedadora tambien puede conseguirse usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia y como se analiza a lo largo de la memoria descriptiva. En una realizacion preferida, se utilizan tecnicas de transfeccion convencionales, por ejemplo, transfeccion con CaPO4 o electroporacion y/o infeccion por vectores de adenovirus tubrido/AAV en lmeas celulares tales como la lmea celular de rinon embrionario humano HEK 293 (una lmea celular de rinon humano que contiene genes E1 de adenovirus funcionales que proporcionan protemas E1 de accion en trans).
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Los vectores basados en AAV9/HU.14 que se generan por un experto en la materia son beneficiosos para el suministro genico a celulas hospedadoras seleccionadas y pacientes de terapia genica ya que no se han descubierto anticuerpos de neutralizacion para AAV9/HU.14 en la poblacion humana. Un experto en la materia puede preparar facilmente otros vectores virales de rAAV que contienen las protemas de la capsida de AAV9/HU.14 proporcionadas en el presente documento usando una diversidad de tecnicas conocidas por los expertos en la materia. Se pueden preparar de forma similar otros vectores virales de rAAV que contienen una secuencia de AAV9/HU.14 y capsidas de AAV de otra fuente.
Un experto en la materia entendera facilmente que las nuevas secuencias del AAV de la invencion pueden adaptarse facilmente para su uso en estos y otros sistemas de vectores virales para suministro genico in vitro, ex vivo o in vivo. De forma similar, un experto en la materia puede seleccionar facilmente otros fragmentos del genoma de AAV de la invencion para su uso en una diversidad de sistemas de vector de rAAV y no rAAV. Dichos sistemas de vector pueden incluir, por ejemplo, lentivirus, retrovirus, poxvirus, virus vaccinia y sistemas adenovirales, entre otros. La seleccion de estos sistemas de vector no es una limitacion de la presente invencion.
Por lo tanto, la invencion proporciona ademas vectores generados usando las secuencias de acido nucleico y aminoacidos del AAV nuevo de la invencion. Dichos vectores son utiles para una diversidad de fines, incluyendo para suministro de moleculas terapeuticas y para su uso en regfmenes de vacuna. Son particularmente convenientes para suministro de moleculas terapeuticas AAV recombinantes que contienen capsidas del nuevo AAV de la invencion. Estas, u otras construcciones de vector que contienen nuevas secuencias de AAV de la invencion pueden usarse en regfmenes de vacuna, por ejemplo, para suministro conjunto de una citocina, o para suministro del inmunogeno en sf mismo.
IV. Virus recombinantes y usos para los mismos
Usando las tecnicas descritas en el presente documento, un experto en la materia puede generar un rAAV que tenga una capsida de un AAV de la invencion o que tenga una capsida que contenga uno o mas fragmentos de un AAV de la invencion. En una realizacion, puede generarse una capsida de longitud completa que contiene uno o mas fragmentos de la nueva capsida de AAV de la invencion fusionada en fase con secuencias de otro AAV seleccionado, o de partes heterologas (es decir, no contiguas) del mismo AAV. Por ejemplo, un rAAV puede contener una o mas de las secuencias de region hipervariable de AAV9/HU.14. Como alternativa, las secuencias de AAV unicas de la invencion pueden usarse en construcciones que contienen otras secuencias virales o no virales. Opcionalmente, un virus recombinante puede portar secuencias de rep de AAV que codifican una o mas de las protemas rep de AAV.
A. Suministro de virus
Se conocen bien por los expertos en la materia metodos para suministro y no son una limitacion de la presente invencion.
En una realizacion conveniente, la invencion permite el suministro mediado por AAV de un transgen a un hospedador.
Opcionalmente, una muestra del hospedador puede ensayarse en primer lugar con respecto a la presencia de anticuerpos para una fuente de AAV seleccionada (por ejemplo, un serotipo). Se conocen bien por los expertos en la materia una diversidad de formatos de ensayo para detectar anticuerpos neutralizantes. La seleccion de dicho ensayo no es una limitacion de la presente invencion. Vease, por ejemplo, Fisher et al, Nature Med., 3(3): 306-312 (marzo de 1997) y W. C. Manning et al, Human Gene Therapy, 9: 477-485 (1 de marzo de 1998). Los resultados de este ensayo pueden usarse para determinar que vector de AAV que contiene protemas de la capsida de una fuente particular se prefiere para suministro, por ejemplo, mediante la ausencia de anticuerpos neutralizantes espedficos para esa fuente de capsida.
En un aspecto de este metodo, el suministro del vector con protemas de la capsida de AAV de la invencion puede preceder o seguir al suministro de un gen mediante un vector con una protema de la capsida de AAV diferente. Por lo tanto, el suministro genico mediante vectores de rAAV puede usarse para repetir el suministro genico a una celula hospedadora seleccionada. Convenientemente, los vectores de rAAV administrados posteriormente portan el mismo transgen que el primer vector de rAAV, pero los vectores administrados posteriormente contienen protemas de la capsida de fuentes (y, preferentemente, serotipos diferentes) que difieren del primer vector. Por ejemplo, si un primer vector tiene protemas de la capsida de AAV9/HU.14, los vectores administrados posteriormente pueden tener protemas de la capsida seleccionadas de entre los otros AAV, opcionalmente, de otro serotipo o de otro clado.
Opcionalmente, pueden usarse multiples vectores de rAAV para suministrar grandes transgenes o multiples transgenes mediante co-administracion de vectores de rAAV que concatemerizan in vivo para formar un unico genoma de vector. En dicha realizacion, un primer AAV puede portar un casete de expresion que exprese un unico transgen (o una subunidad del mismo) y un segundo AAV puede portar un casete de expresion que exprese un segundo transgen (o una subunidad diferente) para co-expresion en la celula hospedadora. Un primer AAV puede
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portar un casete de expresion que es un primer trozo de una construccion policistronica (por ejemplo, un promotor y transgen, o subunidad) y un segundo AAV puede portar un casete de expresion que es un segundo trozo de una construccion policistronica (por ejemplo, transgen o subunidad y una secuencia de poliA). Estos dos trozos de una construccion policistronica concatemerizan in vivo para formar un unico genoma de vector que co-expresa los transgenes suministrados por el primer y segundo AAV. En dichas realizaciones, el vector de rAAV que porta el primer casete de expresion y el vector de rAAV que porta el segundo casete de expresion puede suministrarse en una unica composicion farmaceutica. En otras realizaciones, los dos o mas vectores de rAAV se suministran como composiciones farmaceuticas separadas que pueden administrarse sustancialmente de forma simultanea o uno poco antes o poco despues del otro.
Los vectores recombinantes anteriormente descritos pueden suministrarse a celulas hospedadoras de acuerdo con metodos publicados. El rAAV, preferentemente suspendido en un vehnculo fisiologicamente compatible, puede administrarse a un paciente mairnfero humano o no humano. Los vehnculos adecuados pueden seleccionarse facilmente por un experto en la materia a la vista de la indicacion para la que se dirige el virus de transferencia. Por ejemplo, un vehnculo adecuado incluye solucion salina, que puede formularse con una diversidad de soluciones de tamponamiento (por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato). Otros vehnculos ejemplares incluyen solucion salina esteril, lactosa, sacarosa, fosfato calcico, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sesamo y agua. La seleccion del vehnculo no es una limitacion de la presente invencion.
Opcionalmente, las composiciones de la invencion pueden contener, ademas del rAAV y vehnculo o vehnculos, otros ingredientes farmaceuticos convencionales, tales como conservantes o estabilizantes qmmicos. Los conservantes ejemplares adecuados incluyen clorobutanol, sorbato potasico, acido sorbico, dioxido de azufre, propil galato, los parabenos, etil vainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los estabilizantes qmmicos adecuados incluyen gelatina y albumina.
Los vectores se administran en cantidades suficientes para transfectar las celulas y para proporcionar suficientes niveles de transferencia genica y expresion para proporcionar un beneficio terapeutico sin efectos adversos excesivos, o con efectos fisiologicos medicamente aceptables, que pueden determinarse por los expertos en la tecnica medica. Las vfas de administracion convencionales y farmaceuticamente aceptables incluyen, pero sin limitacion, suministro directo a un organo deseado (por ejemplo, el hngado (opcionalmente a traves de la arteria hepatica) o el pulmon), oral, inhalacion, intranasal, intratraqueal, intraarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica y otras vfas de administracion parenterales. Las vfas de administracion pueden combinarse, si se desea.
Las dosificaciones del vector viral dependeran principalmente de factores tales como la afeccion que se trate, la edad, el peso y la salud del paciente, y pueden por lo tanto variar entre pacientes. Por ejemplo, una dosificacion humana terapeuticamente eficaz del vector viral esta en general en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 100 ml de solucion que contiene concentraciones de aproximadamente 1 x 109 a 1 x 1016 genomas de vector de virus. Una dosificacion humana preferida para el suministro a organos grandes (por ejemplo, hngado, musculo, corazon y pulmon) puede ser de aproximadamente 5 x 1010a 5 x 1013 genomas de AAV por 1 kg, a un volumen de aproximadamente 1 a 100 ml. Una dosificacion preferida para el suministro al ojo es de aproximadamente 5 x 109 a 5 x 1012 copias de genoma, a un volumen de aproximadamente 0,1 ml a 1 ml. La dosificacion se ajustara para equilibrar el beneficio terapeutico frente a cualquier efecto secundario y dichas dosificaciones pueden variar dependiendo de la aplicacion terapeutica para la que se emplee el vector recombinante. Los niveles de expresion del transgen pueden controlarse para determinar la frecuencia de dosificacion que da como resultado vectores virales, preferentemente vectores de AAV que contienen el minigen. Opcionalmente, pueden utilizarse regfmenes de dosificacion similares a los descritos para fines terapeuticos para inmunizacion usando las composiciones de la invencion.
Se proporcionan posteriormente ejemplos de productos terapeuticos y productos inmunogenicos para suministro por los vectores que contienen AAV de la invencion. Estos vectores puedan usarse para una diversidad de regfmenes terapeuticos o de vacuna, como se describe en el presente documento. Adicionalmente, estos vectores pueden suministrarse en combinacion con uno o mas vectores o principios activos adicionales en un regimen terapeutico y/o de vacuna deseado.
B. Transgenes terapeuticos
Los productos terapeuticos utiles codificados por el transgen incluyen hormonas y factores de crecimiento y de diferenciacion incluyendo, sin limitacion, insulina, glucagon, hormona de crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberacion de hormona del crecimiento (GRF), hormona folfculo estimulante (FSH), hormona luteinizante (LH), gonadotropina corionica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial y vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblastos acido (aFGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de insulina I y II (IGF-1 e IGF-II), uno cualquiera de la superfamilia del factor de crecimiento transformante a, incluyendo TGFa, activinas, inhibinas, o cualquiera de las protemas morfogeneticas del
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hueso (BMP), BMP 1-15, uno cualquiera de la familia del factor de diferenciacion de heregulina/neuregulina/ARIA/neu (NDF) de factores de crecimiento, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrofico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrofico ciliar (CNTF), factor neurotrofico derivado de la lmea celular glial (GDNF), neurturina, agrina, uno cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), efrinas, noggina, sonic hedgehog y tirosina hidroxilasa.
Otros productos transgenicos utiles incluyen protemas que regulan el sistema inmunitario, incluyendo sin limitacion, citocinas y linfocinas tales como trombopoyetina (TPO), interleucinas (IL) IL-1 a IL-25 (incluyendo, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-12 e IL-18), protema quimioatrayente de monocitos, factor inhibidor de leucemia, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos, ligando de Fas, factores de necrosis tumoral a y p, interferones a, p y y, factor de celulas madre, ligando de flk-2/flt3. Los productos genicos producidos por el sistema inmunitario tambien son utiles en la invencion. Estos incluyen, sin limitacion, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quimericas, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, receptores de linfocitos T, receptores de linfocitos T quimericos, receptores de linfocitos T monocatenarios, moleculas del MHC de clase I y clase II, asf como inmunoglobulinas modificadas tecnicamente y moleculas del MHC. Los productos genicos utiles tambien incluyen protemas reguladoras del complemento tales como protemas reguladoras del complemento, protema de cofactor de membrana (MCP), factor acelerante de la degradacion (DAF), CR1, CF2 y CD59.
Otros productos genicos utiles adicionales incluyen cualquiera de los receptores para las hormonas, factores de crecimiento, citocinas, linfocinas, protemas reguladoras y protemas del sistema inmunitario. La invencion abarca el uso de receptores para regulacion del colesterol y/o modulacion de lfpidos, incluyendo el receptor de lipoprotemas de baja densidad (LDL), receptor de lipoprotemas de alta densidad (HDL), el receptor de lipoprotemas de muy baja densidad (VLDL), y receptores neutralizantes. La invencion tambien abarca el uso de productos genicos tales como miembros de la subfamilia de receptores de hormonas esteroideas incluyendo receptores de glucocorticoides y receptores de estrogenos, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares. Ademas, los productos genicos utiles incluyen factores de transcripcion tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta de suero (SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD y miogenina, protemas que contienen caja ETS, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, protemas de union a caja CCAAT, factor de regulacion de interferon (IRF-1), protema de tumor de Wilms, protemas de union a ETS, STAT, protemas de union a caja GATA, por ejemplo, GATA-3 y la familia de forkhead de protemas de helice winged.
Otros productos genicos utiles incluyen carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, antitripsina alfa-1, glucosa-6- fosfatasa, porfobilinogeno desaminasa, cistation beta-sintasa, cetoacido descarboxilasa de cadena ramificada, albumina, isovaleril-coA deshidrogenasa, propionil CoA carboxilasa, metil malonil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilato, fosforilasa hepatica, fosforilasa quinasa, glicina decarboxilasa, protema H, protema T, una secuencia reguladora transmembrana de fibrosis qrnstica (CFTR) y un producto genico de distrofina [por ejemplo, una mini o micro-distrofina]. Otros productos genicos utiles adicionales incluyen enzimas tales como las que pueden ser utiles en la terapia de reemplazo enzimatico, que es util en diversas afecciones resultantes de actividad deficiente de enzimas. Por ejemplo, pueden utilizarse enzimas que contienen manosa-6-fosfato en terapias para enfermedades de almacenamiento lisosomico (por ejemplo, un gen adecuado incluye el que codifica p-glucuronidasa (GUSB)).
Otros productos genicos utiles adicionales incluyen los usados para el tratamiento de la hemofilia, incluyendo hemofilia B (incluyendo Factor IX) y hemofilia A (incluyendo Factor VIII y sus variantes, tales como la cadena ligera y cadena pesada del heterodfmero y el dominio con B suprimido; Patente de Estados Unidos N.° 6.200.560 y Patente de Estados Unidos N.° 6.221.349). El gen del Factor VIII codifica 2351 aminoacidos y la protema tiene seis dominios, designados desde el extremo amino al extremo carboxilo terminal como A1-A2-B-A3-C1-C2 [Wood et al, Nature, 312:330 (1984); Vehar et al., Nature 312:337 (1984); y Toole et al, Nature, 342: 337 (1984)]. El Factor VIII humano se procesa dentro de la celula para producir un heterodfmero que comprende principalmente una cadena pesada que contiene los dominios A1, A2 y B y una cadena ligera que contiene los dominios A3, C1 y C2. Tanto el polipeptido de cadena sencilla como el heterodfmero circulan en el plasma como precursores inactivos, hasta que se activan por la escision de trombina entre los dominios A2 y B, lo que libera el dominio B y da como resultado una cadena pesada que consiste en los dominios A1 y A2. El dominio B se suprime en la forma pro-coagulante activada de la protema. Adicionalmente, en la protema nativa, dos cadenas polipeptfdicas (“a” y “b”), que flanquean el dominio B, se unen con un cation de calcio divalente.
En algunas realizaciones, el minigen comprender los primeros 57 pares de bases de la cadena pesada del Factor VIII que codifican la secuencia senal de 10 aminoacidos, asf como la secuencia de poliadenilacion de la hormona del crecimiento humana (hGH). En realizaciones alternativas, el minigen comprende ademas los dominios A1 y A2, asf como 5 aminoacidos del extremo N terminal del dominio B, y/u 85 aminoacidos del extremo C terminal del dominio B, asf como los dominios A3, C1 y C2. En otras realizaciones mas, los acidos nucleicos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del Factor VIII se proporcionan en un unico minigen separado por 42 acidos nucleicos que codifica 14 aminoacidos del dominio B [Patente de Estados Unidos N.° 6.200.560].
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Como se usa en el presente documento, una cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad de vector AAV que produce suficientes cantidades de Factor VIII para reducir el tiempo que tarda la sangre de un sujeto en coagular. En general, varios hemofilos que tienen menos del 1 % de niveles normales del Factor VIII tienen un tiempo de coagulacion de sangre completa de mas de 60 minutos en comparacion con aproximadamente 10 minutos para no hemofilos.
La presente invencion no se limita a ninguna secuencia de Factor VIII espedfica. Se han aislado y generado muchas formas naturales y recombinantes del Factor VIII. Pueden encontrarse ejemplos de formas de origen natural y recombinante del Factor VII en la bibliograffa de patentes y cientifica incluyendo, Patente de Estados Unidos N.° 5.563.045, Patente de Estados Unidos N.° 5.451.52l, Patente de Estados Unidos N.° 5.422.260, Patente de Estados Unidos N.° 5.004.803, Patente de Estados Unidos N.° 4.757.006, Patente de Estados Unidos N.° 5.661.008, Patente de Estados Unidos N.° 5.789.203, Patente de Estados Unidos N.° 5.681.746, Patente de Estados Unidos N.° 5.595.886, Patente de Estados Unidos N.° 5.045.455, Patente de Estados Unidos N.° 5.668.108, Patente de Estados Unidos N.° 5.633.150, Patente de Estados Unidos N.° 5.693.499, Patente de Estados Unidos N.° 5.587.310, Patente de Estados Unidos N.° 5.171.844, Patente de Estados Unidos N.° 5.149.637, Patente de Estados Unidos N.° 5.112.950, Patente de Estados Unidos N.° 4.886.876; Publicaciones de Patente Internacional N.° WO 94/11503, WO 87/07144, WO 92/16557, WO 91/09122, WO 97/03195, WO 96/21035 y WO 91/07490; Solicitudes de Patente Europea N.° EP 0 672 138, EP 0 270 618, EP 0 182 448, EP 0 162 067, EP 0 786 474, EP 0 533 862, EP 0 506 757, EP 0 874 057,EP 0 795 021, EP 0 670 332, EP 0 500 734, EP 0 232 112 y EP 0 160 457; Sanberg et al., XXth Int. Congress of the World Fed. Of Hemophilia (1992), y Lind et al., Eur. J. Biochem., 232: 19 (1995).
Pueden obtenerse secuencias de acido nucleico que codifican el Factor VIII anteriormente descrito usando metodos recombinantes o derivando la secuencia de un vector que se sabe que la incluye. Ademas, la secuencia deseada puede aislarse directamente de celulas y tejidos que la contienen, usando tecnicas convencionales, tales como extraccion con fenol y PCR de ADNc o ADN genomico [vease, por ejemplo, Sambrook, et al], Tambien pueden producirse secuencias de nucleotidos de forma sintetica, en lugar de clonarse. La secuencia completa puede ensamblarse a partir de oligonucleotidos solapantes preparados por metodos convencionales y ensamblados en una secuencia codificante completa [vease, por ejemplo, Edge, Nature 292: 757 (1981); Nambari et al, Science, 223: 1299 (1984); y Jay et al, J. Biol. Chem. 259:6 311 (1984).
Ademas, la invencion no se limita al Factor VIII humano. De hecho, se pretende que la presente invencion abarque el uso del Factor VIII de animales distintos de seres humanos, incluyendo pero sin limitacion animales de compafua (por ejemplo, caninos, felinos y equinos), ganado (por ejemplo, bovinos, caprinos y ovinos), animales de laboratorio, mairnferos marinos, grandes felinos, etc.
Los vectores del AAV pueden contener un acido nucleico que codifica fragmentos del Factor VIII que en sf mismo no esta biologicamente activo, pero cuando se administra al sujeto mejora o restaura el tiempo de coagulacion sangumea. Por ejemplo, como se ha analizado anteriormente, la protema del Factor VIII comprende dos cadenas polipeptfdicas: una cadena pesada y una cadena ligera separadas por un dominio B que se escinde durante el procesamiento. Como se demuestra por la presente invencion, la co-transduccion de celulas receptoras con las cadenas pesada y ligera del Factor VIII conduce a la expresion del Factor VIII biologicamente activo. Debido a que la mayona de los hemofilos contienen una mutacion o delecion en solamente una de las cadenas (por ejemplo, cadena pesada o ligera), puede ser posible administrar solamente la cadena defectuosa en el paciente para proporcionar la otra cadena.
Otros productos genicos utiles incluyen polipeptidos de origen no natural, tales como polipeptidos quimericos o hfbridos que tienen una secuencia de aminoacidos de origen no natural que contiene inserciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos. Por ejemplo, las inmunoglobulinas modificadas tecnicamente monocatenarias podnan ser utiles en ciertos pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias genicas de origen no natural incluyen moleculas antisentido y acidos nucleicos catalfticos, tales como ribozimas, que podnan usarse para reducir la sobreexpresion de una diana.
La reduccion y/o modulacion de la expresion de un gen es particularmente conveniente para el tratamiento de afecciones hiperproliferativas caracterizadas por celulas hiperproliferativas, como los canceres y la psoriasis. Los polipeptidos diana incluyen los polipeptidos que se producen exclusivamente o a mayores niveles en celulas hiperproliferativas en comparacion con celulas normales. Los antfgenos diana incluyen polipeptidos codificados por oncogenes tales como myb, myc, fyn, y el gen de traslocacion bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Ademas de productos oncogenicos como antfgenos diana, los polipeptidos diana para tratamientos antineoplasicos y regfmenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos realizados por linfomas de linfocitos B y regiones variables de receptores de linfocitos T de linfomas de linfocitos T que, en algunas realizaciones, tambien se usan como antfgenos diana para enfermedad autoinmunitaria. Otros polipeptidos asociados a tumor pueden usarse como polipeptidos diana tales como polipeptidos que se encuentran a mayores niveles en celulas tumorales incluyendo el polipeptido reconocido por el anticuerpo monoclonal 17-1A y polipeptidos que se unen a folato.
Otros polipeptidos y protemas terapeuticos adecuados incluyen los que pueden ser utiles para el tratamiento de individuos que padecen enfermedades y trastornos autoinmunitarios confiriendo una respuesta inmunitaria
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protectora de base amplia contra dianas que se asocian con autoinmunidad incluyendo receptores celulares y celulas que producen anticuerpos dirigidos “a uno mismo”. Las enfermedades autoinmunitarias mediadas por linfocitos T incluyen artritis reumatoide (RA), esclerosis multiple (MS), smdrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), tiroiditis autoinmunitaria, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, esclerodermia, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por receptores de linfocitos T (TCR) que se unen con antigenos endogenos que inician la cascada inflamatoria asociada con enfermedades autoinmunitarias.
C. Transgenes inmunogenicos
Convenientemente, los vectores de AAV de la invencion evitan la generacion de respuestas inmunitarias a las secuencias de AAV contenidas dentro del vector. Sin embargo, estos vectores pueden no obstante formularse de manera que permita la expresion de un transgen portado por los vectores para inducir una respuesta inmunitaria a un antfgeno seleccionado. Por ejemplo, para promover una respuesta inmunitaria, el transgen puede expresarse a partir de un promotor constitutivo, el vector puede acompanarse de adyuvante como se describe en el presente documento y/o el vector puede ponerse en tejido en degradacion.
Los ejemplos de transgenes inmunogenicos adecuados incluyen los seleccionados de una diversidad de familias virales. Los ejemplos de familias virales deseables contra las que sena deseable una respuesta inmunitaria incluyen la familia de picornavirus, que incluyen el genero rinovirus, que son responsables de aproximadamente 50 % de los casos de resfriado comun; el genero enterovirus, que incluye poliovirus, coxsackievirus, ecovirus y enterovirus humanos tales como virus de la hepatitis A; y el genero aphtovirus, que son responsables de la glosopedia, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia de virus picornavirus, los antfgenos diana incluyen los VP1, VP2, VP3, VP4 y VPG. Otras familias virales incluyen los astrovirus y las familias de calcivirus. La familia de calcivirus abarca el grupo de virus Norwalk, que son un agente causante importante de la gastroenteritis epidemica. Otra familia viral mas conveniente para su uso en la direccion de antfgenos para inducir respuestas inmunitarias en seres humanos y animales no humanos es la familia de togavirus, que incluye los generos alfavirus, que incluye virus Sindbis, virus del no Ross y encefalitis equina venezolana, oriental y occidental, y rubivirus, incluyendo virus de la rubeola. La familia de flaviviridae incluye virus del dengue, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis de St. Luis y encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antfgenos diana pueden generarse a partir de la familia de hepatitis C o el coronavirus, que incluye varios virus no humanos tales como virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral), virus gastroenterico transmisible porcino (cerdo), virus de la encefalomielitis de hemaglutinina porcina (cerdo), virus de la peritonitis infecciosa felina (gato), coronavirus enterico felino (gato), coronavirus canino (perro) y coronavirus respiratorios humanos, que pueden provocar el resfriado comun y/o hepatitis no A, B o C, y que incluyen la causa potencial del smdrome respiratorio agudo repentino (SARS). Dentro de la familia de coronavirus, los antfgenos diana incluyen la glucoprotema E1 (tambien denominada protema M o de matriz), E2 (tambien denominada protema S o Spike), E3 (tambien denominada HE o hemaglutinina-elterosa) (no presentes en todos los coronavirus) o N (nucleocapsida). Otros antfgenos mas pueden dirigirse contra la familia de arterivirus y la familia de rabdovirus. La familia de rabdovirus incluye los generos vesiculovirus (por ejemplo, Virus de la Estomatitis Vesicular) y el lisavirus general (por ejemplo, rabia). Dentro de la familia de rabdovirus, los antfgenos adecuados pueden derivar de la protema G o la protema N. La familia filoviridae, que incluye virus de fiebres hemorragicas tales como virus de Marburg y Ebola puede ser una fuente adecuada de antfgenos. La familia de paramixovirus incluye virus paragripal de Tipo 1, virus paragripal de Tipo 3, virus paragripal bovino de Tipo 3, rubulavirus (virus de las paperas), virus paragripal de Tipo 2, virus paragripal de Tipo 4, virus de enfermedad de Newcastle (pollos), peste bovina, morbilivirus, que incluye sarampion y moquillo, y pneumovirus, que incluye el virus sincitial respiratorio. El virus de la gripe se clasifica dentro de la familia ortomixovirus y es una fuente adecuada de antfgeno (por ejemplo, la protema HA, la protema N1). La familia de bunyavirus incluye los generos bunyavirus (encefalitis de California, La Crosse), flebovirus (Fiebre del Valle del Rift), hantavirus (puremala es un virus de fiebre de hemahagina), nairovirus (enfermedad de las ovejas de Nairobi) y diversos bungavirus no asignados. La familia de arenavirus proporciona una fuente de antfgenos contra LCM y virus de fiebre de Lassa. Otra fuente de antfgenos es la familia de bornavirus. La familia de reovirus incluye los generos reovirus, rotavirus (que provoca gastroenteritis aguda en ninos), orbivirus y cultivirus (fiebre de garrapata de Colorado, Lebombo (seres humanos), encefalosis equina, lengua azul). La familia de retrovirus incluye la subfamilia oncorivirinal que abarca enfermedades humanas y veterinarias tales como virus de leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentivirinal (que incluye VIH, virus de inmunodeficiencia de simios, virus de inmunodeficiencia felina, virus de anemia infecciosa equina y espumavirinal). La familia de papovavirus incluye la sub-familia poliomavirus (virus BKU y JCU) y la subfamilia papilomavirus (asociada con canceres o progresion maligna de papiloma). La familia de adenovirus incluye virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que provocan enfermedad respiratoria y/o enteritis. La familia de parvovirus incluye parvovirus felino (enteritis felina), panleucopeniavirus felina, parvovirus canino y parvovirus porcino. La familia de herpesvirus incluye la subfamilia alfaherpesvirinae, que abarca los generos simplexvirus (HSVI, HSVII), varicelovirus (seudorrabia, varicela zoster) y la subfamilia betaherpesvirinae, que incluye los generos citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, que incluye los generos linfocriptovirus, VEB (linfoma de Burkitt), herpesvirus humano 6A, 6B y 7, herpesvirus asociado con sarcoma de Kaposi y herpesvirus de cercopitecino (virus B), rinotraquettis infecciosa, virus de enfermedad de Marek y rhadinovirus. La familia de poxvirus incluye la subfamilia clordopoxivirane, que abarca los generos ortopoxvirus (Variola mayor (viruela) y Vaccinia (viruela vacuna)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia de hepadnavirus incluye el virus de la Hepatitis B. Un virus
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no clasificado que puede ser una fuente adecuada de antfgenos es el virus de la Hepatitis delta, el virus de la Hepatitis E y priones. Otro virus que es una fuente de antfgenos es el Virus Nipan. Otros fuentes virales mas pueden incluir virus de enfermedad bursal infecciosa aviar y virus de smdrome respiratorio y reproductor porcino. La familia de alfavirus incluye virus de la arteritis equina y diversos virus de Encefalitis.
La presente invencion tambien puede abarcar el uso de inmunogenos que son utiles para inmunizar a un ser humano o animal no humano contra otros patogenos incluyendo bacterias, hongos, microorganismos parasitarios o parasitos multicelulares que infectan a seres humanos y vertebrados no humanos, o de una celula de cancer o celula tumoral. Los ejemplos de patogenos bacterianos incluyen cocos gram-positivos patogenos incluyendo neumococos; estafilococos (y las toxinas producidas por los mismos, por ejemplo, enterotoxina B); y estreptococos. Los cocos gram-negativos patogenos incluyen meningococos; gonococos. Los bacilos gram-negativos entericos patogenos incluyen enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria y eikenella; melioidosis; salmonella; shigella; haemophilus; moraxella; H. ducreyi (que provoca chancroide); especies de brucella (brucellosis); Francisella tularensis (que provoca tularemia); Yersinia pestis (peste) y otras yersinia (pasteurella); Streptobacillus moniliformis y spirillum; los bacilos gram-positivos incluyen Listeria monocytogenes; Erysipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphtheria (difteria); colera; B. anthracis (carbunco); donovanosis (granuloma inguinal); y bartonellosis. Las enfermedades provocadas por bacterias anaerobias patogenas incluyen tetanos; botulismo (Clostridum botulinum y su toxina); Clostridium perfringens y su toxina epsilon; otros clostridios; tuberculosis; lepra; y otras micobacterias. Las enfermedades de espiroquetas patogenas incluyen sffilis; treponematosis; pian, pinta y sffilis endemica; y leptospirosis. Otras infecciones provocadas por bacterias patogenas superiores y hongos patogenos incluyen muermo (Burkholderia mallei); actinomicosis; nocardiosis; criptococcosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidioidomicosis; candidiasis, aspergillosis y mucormicosis; esporotricosis; paracoccidioidomicosis, petriellidiosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis. Las infecciones por Rickettsia incluyen fiebre tifoidea, fiebre moteada de las Montanas Rocosas, fiebre Q (Coxiella burnetti), y viruela por Rickettsias. Los ejemplos de infecciones por micoplasmas y clamidias incluyen: Mycoplasma pneumoniae; linfogranuloma venereo; psittacosis; e infecciones clamidiales perinatales. Los eucariotas patogenos abarcan protozoos patogenos y helmintos e infecciones producidos por los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniosis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; trematodos; e infecciones por cestodos (tenia).
Muchos de estos organismos y/o las toxinas producidas por los mismos se han identificado por el Centro de Control de Enfermedades [(CDC), Departamento de Salud y Servicios Humanos, Estados Unidos], como agentes que tienen potencial para su uso en ataques biologicos. Por ejemplo, algunos de esos agentes biologicos incluyen Bacillus anthracis (carbunco), Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (peste), variola mayor (viruela), Francisella tularensis (tularemia), fiebres hemorragicas virales (filovirus [por ejemplo, Ebola, Marburg), y arenavirus [por ejemplo, Lassa, Machupo]), todos los cuales se clasifican en la actualidad como agentes de Categona A; Coxiella burnetti (fiebre Q); especies de Brucella (brucellosis), Burkholderia mallei (muermo), Burkholderia pseudomallei (meloidosis), Ricinus communis y su toxina (toxina ricina), Clostridium perfringens y su toxina (toxina epsilon), especies de Staphylococcus y sus toxinas (enterotoxina B), Chlamydia psittaci (psittacosis), amenazas para la seguridad del agua (por ejemplo, Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), fiebre tifoidea (Richettsia powazekii) y encefalitis viral (alfavirus, por ejemplo, encefalitis equina venezolana; encefalitis equina oriental; encefalitis equina occidental); todos los cuales se clasifican en la actualidad como agentes de Categona B; y virus Nipan y hantavirus, que se clasifican en actualidad como agentes de Categona C. Ademas, otros organismos, que se clasifican de este modo o se clasifican de forma diferente, pueden identificarse y/o usarse para dicho fin en el futuro. Se entendera facilmente que los vectores virales y otras construcciones descritas en el presente documento son utiles para suministrar antfgenos de estos organismos, virus, sus toxinas u otros productos secundarios, que prevendran y/o trataran la infeccion u otras reacciones adversas con estos agentes biologicos.
La administracion de los vectores de la invencion para suministrar inmunogenos contra la region variable de los linfocitos T induce una respuesta inmunitaria incluyendo CTL para eliminar los linfocitos T. En artritis reumatoide (RA), se han caracterizado varias regiones variables espedficas de TCR que estan implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V3, V14, V-17 y V-17. Por lo tanto, el suministro de una secuencia de acido nucleico que codifica al menos uno de estos polipeptidos inducira una respuesta inmunitaria que se dirigira a los linfocitos T indicados en RA. En esclerosis multiple (MS), se han caracterizado varias regiones espedficas variables de TCR que estan implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V-7 y V-10. Por lo tanto, el suministro de una secuencia de acido nucleico que codifica al menos uno de estos polipeptidos inducira una respuesta inmunitaria que se dirigira a linfocitos T implicados en MS. En esclerodermia, se han caracterizado varias regiones variables espedficas de TCR que estan implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V-6, V-8, V-14 y V-16, V-3C, V-7, V-14, V-15, V- 16, V-28 y V-12. Por lo tanto, el suministro de una molecula de acido nucleico que codifica al menos uno de estos polipeptidos inducira una respuesta inmunitaria que se dirigira a linfocitos T implicados en la esclerodermia.
Por lo tanto, un vector viral recombinante derivado de rAAV de la invencion proporciona un veldculo de transferencia genica que puede suministrar un transgen seleccionado a una celula hospedadora seleccionada in vivo o ex vivo incluso cuando el organismo tiene anticuerpos neutralizantes para una o mas fuentes de AAV. En una realizacion, el rAAV y las celulas se mezclan ex vivo. En una realizacion, el rAAV y las celulas se mezclan ex vivo; las celulas infectadas se cultivan usando metodologfas convencionales; y las celulas transducidas se vuelven a infundir en el
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paciente.
Estas composiciones estan particularmente bien adaptadas para el suministro genico para fines terapeuticos y para inmunizacion, incluyendo induccion de inmunidad protectora. Ademas, las composiciones de la invencion tambien pueden usarse para la produccion de un producto genico deseado in vitro. Para la produccion in vitro, puede obtenerse un producto deseado (por ejemplo, una protema) a partir de un cultivo deseado despues de la transfeccion de celulas hospedadoras con un rAAV que contiene la molecula que codifica el producto deseado y cultivar el cultivo celular en condiciones que permiten la expresion. El producto expresado puede despues purificarse y aislarse, segun se desee. Se conocen por los expertos en la materia tecnicas adecuadas para transfeccion, cultivo celular, purificacion y aislamiento.
Los siguientes ejemplos ilustran varios aspectos y realizaciones de la invencion.
EJEMPLO 1 -Analisis computacional de secuencias de AAV de primate
A. Recogida de tejidos de primate
Se han descrito previamente fuentes de tejidos de primate no humano [N. Muzyczka, K. I. Berns, en Fields Virology
D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds. (Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, 2001), vol. 2, pp. 2327-2359]. Se recogieron tejidos humanos de procedimientos quirurgicos o examen post-mortem o donantes de organos a traves de dos proveedores de tejidos humanos nacionales principales, Cooperative Human Tissue Network (CHTN) y National Disease Research Interchange (NDRI). Los tejidos humanos usados para este estudio comprendfan 18 tipos tisulares diferentes que inclrnan colon, tngado, pulmon, bazo, rinon, cerebro, intestino delgado, medula osea, corazon, ganglios linfaticos, musculo esqueletico, ovario, pancreas, estomago, esofago, cuello uterino, testmulo y prostata. Las muestras tisulares vinieron de un grupo de diversos individuos de distinto sexo, razas (caucasicos, afroamericanos, asiaticos e hispanos) y edades (23 - 83 anos). Entre 259 muestras de 250 individuos analizados, aproximadamente el 28 % de los tejidos se asociaron con patologfa.
B. Deteccion y aislamiento de secuencias de AAV
Se extrajeron ADN celulares totales de tejidos de primate humano y no humano como se ha descrito previamente [R. W. Atchison, et al., Science 194, 754-756 (1965)]. La prevalencia molecular y distribucion tisular de AAV en seres humanos se determino mediante PCR de cap de longitud completa o identificacion usando los cebadores y condiciones que fueron similares a los usados para el analisis de primates no humanos. Se desplego la misma estrategia de clonacion de PCR usada para el aislamiento y caracterizacion de una familia expandida de AAV en primates no humanos en el aislamiento de AAV de tejidos humanos seleccionados. Brevemente, se amplifico un fragmento de 3,1 kb que contema una parte de la secuencia de rep y cap de longitud completa a partir del ADN tisular por PCR y se clono con Topo (Invitrogen). Los clones de AAV humanos se analizaron inicialmente por mapeo de restriccion para ayudar a identificar la diversidad de secuencias de AAV, que se sometieron posteriormente a analisis de secuencia completo por SeqWright (SeqWright, Houston, TX) con una precision del 99,9%. Se caracterizaron un total de 67 clones de capsidas aislados de tejidos humanos (hu.1 - hu.67). A partir de tejidos de primate no humanos, se secuenciaron 86 clones de cap, entre los 70 clones fueron de macacos rhesus, 6 clones de macacos cynomolgus, 3 clones de macacos de cola de cerdo, 2 clones de un babuino y 5 clones de un chimpance.
C. Analisis de secuencias de AAV
A partir de todas las secuencias contiguas, se analizaron fases abiertas de lectura (ORF) de protema viral de la capsida de AAV (vp1). Las secuencias de protema VP1 de la capsida de AAV se alinearon con el programa ClustalX1.81™ [H. D. Mayor, J. L. Melnick, Nature 210, 331-332 (1966)] y se produjo un alineamiento de ADN en fase con el paquete de software BioEdit™ [U. Bantel-Schaal, H. Zur Hausen, Virology 134, 52-63 (1984)]. Las filogenias se infirieron con el MEGA™ v2.1 y el paquete TreePuzzle™. Se usaron algoritmos de Union de Vecinos, Maxima Parsimonia y Maxima Probabilidad [M. Nei, S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, Nueva York, 2000); H. A. Schmidt, K. Strimmer, M. Vingron, A. von Haeseler, Bioinformatics 18, 502-4 (Mar, 2002); N. Saitou, M. Nei, Mol Biol Evol 4, 406-25 (jul, 1987)] para confirmar agrupamiento similar de secuencias en grupos monofileticos.
Los clados se definieron despues a partir de un arbol filogenetico de Union de Vecinos de todas las secuencias proteicas. Las distancias de aminoacidos se estimaron haciendo uso de la correccion de Poisson. Se realizo analisis de Bootstrap con 1000 repeticiones. Las secuencias se consideraron monofileticas cuando tuvieron un nodo de conexion a una distancia genetica de 0,05. Un grupo de secuencias que se originaban de 3 o mas fuentes se considero un clado. La filogenia de AAV se evaluo adicionalmente con respecto a pruebas de recombinacion a traves de un analisis secuencial. La homoplasia se exploro por implementacion del algoritmo de Descomposicion Dividido [H. J. Bandelt, A. W. Dress, Mol Phylogenet Evol 1, 242-52 (Sep. 1992)]. Las divisiones que se seleccionaron de esta manera se analizaron adicionalmente despues con respecto a recombinacion haciendo uso del algoritmo de Bootscan en el software Simplot [M. Nei y S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, Nueva York, 2000)]. Se uso una ventana deslizante de 400 nt (10 nt/etapa) para obtener 100
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arboles de union de vecinos de repeticion de boostrap. Posteriormente, se infirieron las filogenias de Descomposicion de Division y de Union de Vecinos a partir de los fragmented de recombinacion potenciales. Las mejoras significativas de los valores de boostrap, reduccion de divisiones y reagrupamiento de las secuencias hteridas con sus fuentes parentales se consideraron el criterio de recombinacion.
Varias secuencias de cap diferentes amplificadas a partir de 8 sujetos humanos diferentes mostraron relacion filogenetica con AAV2 (5') y AAV3 (3') en torno a un punto de rotura comun en la posicion 1400 de la secuencia de ADN de Cap, coherente con la recombinacion y la formacion de un virus hterido. Esta es la region general del gen cap en el que se detecto recombinacion a partir de aislados de un ganglio linfatico mesenterico de un macaco rhesus [Gao et al., Proc Natl Acad Sci USA 100, 6081-6086 (13 de mayo de 2002)]. Se realizo un ensayo Z basado en codones general para seleccion implementando el metodo de Neib-Gojobori [R. M. Kotin, Hum Gene Ther 5, 793801 (jul, 1994)].
Los analisis filogeneticos se repitieron excluyendo los clones que se identificaron positivamente como hteridos. En este analisis, se incluyeron los AAV de ganso y aviar como grupos exteriores [(I. Bossis, J. A. Chiorini, J Virol 77, 6799-810 (jun. 2003)]. La Figura 1 es un arbol de union de vecinos; se obtuvieron relaciones similares usando parsimonia maxima y analisis de probabilidades maximas.
Este analisis demostro 11 grupos filogeneticos, que se resumen en la Tabla 1. El origen de especie de los 6 clados de AAV y 5 clones de AAV individuales (o conjunto de clones) se representa por el numero de fuentes de las que se recuperaron las secuencias en la toma de muestras. El numero total de secuencias reunidas por especie y por agrupamiento se muestra entre parentesis. Las referencias para secuencias previamente descritas por clado estan en la columna derecha. Rhesus - macacos rhesus; cyno - macacos cynomolgus; chimp - chimpances; cola de cerdo - macacos de cola de cerdo.
Tabla 1
Clasificacion del numero de fuentes (secuencias) por especie y por clado o clon
Humano Rhesus Cyno Babuino Chimp Cola de cerdo
Clado/representativo A / AAV1 (AAV6) 3(4)
B / AAV2 12(22)
C / AAV2-AAV3
8(17)
hterido D / AAV7
5(10)
E / AAV8
7(9) 7(16)
F / AAV9
3(3)
Clones AAV3 AAV4
1(3)
AAV5 Ch.5 Rh.8
2(2)
5(5)
1(2)
1(1)
1(3)
Ya que, como se ha indicado anteriormente, la recombinacion no se implementa en los algoritmos filogeneticos convencionales usados, para construir un arbol filogenetico apropiado, esas secuencias se excluyeron del analisis, de lo que se establecio su ascendencia recombinante. Un analisis de union de vecinos de todas las secuencias no recombinadas se representa en paralelo con los clados que sf evolucionaron haciendo uso de la recombinacion. Se genero un resultado similar con el algoritmo diferente usado y con la secuencia de nucleotidos como aportacion.
Se realizaron experimentos adicionales para evaluar la relacion de parentesco filogenetico con respecto a la funcion como se mide por actividad serologica y tropismo, como se describe en los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 2 - Analisis serologico de AAV humanos nuevos
El ultimo clado obtenido como se ha descrito en el ejemplo precedente se derivo de aislados de 3 seres humanos y no contema un serotipo previamente descrito. Se generaron antisueros policlonales contra un miembro representativo de este clado y se realizo un estudio exhaustivo de reactividad cruzada serologica entre los serotipos previamente descritos. Esto mostro que el nuevo clado humano es serologicamente distinto de los otros serotipos conocidos y por tanto se denomina Clado F (representado por AAV9).
Se generaron anticuerpos policlonales de conejo contra los serotipos de AAV 1-9 por inoculacion intramuscular de los animales con 1 x 1013 copias de genoma de cada uno de los vectores de AAV junto con un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund. Las inyecciones se repitieron el dfa 34 para reforzar los tftulos de anticuerpo. La reactividad cruzada serologica entre AAV 1-9 se determino evaluando el efecto inhibidor de antisueros de conejo en la transduccion de celulas 293 por vectores que portaban un gen indicador (AAVCMVEGPF, que porta protetea
verde fluorescente potenciada) pseudotipado con capsidas derivadas de diferentes de fuentes de AAV. La transduccion de 84-31 celulas por vectores AAVCMVEGPF se evaluo con un microscopio UV. En la evaluacion de las relaciones serologicas entre dos AAV, se ensayo la capacidad de sueros tanto heterologos como homologos para neutralizar los vectores de cada AAV. Si la neutralizacion por el suero fue al menos 16 veces menor contra 5 vectores heterologos que frente a vectores homologos de una manera redproca, los dos AAV se consideran serotipos distintos. Los tttulos de neutralizacion se definieron como se ha descrito previamente [(G. P. Gao et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99, 11854-9 (3 sep, 2002)].
Tabla 2
Evaluacion serologica de nuevos vectores de AAV
Pseudotipos de vector usados en el ensayo de neutralizacion
de coneio inmunizado con:
AAV2/1 AAV2/2 AAV2/3 AAV2/4 AAV2/5 AAV2/6 AAV2/7 AAV2/8 AAV2/9
AAV2/1
1/163.840 Sin NAB Sin NAB Sin NAB 1/40.960 1/40.960 1/40 Sin NAB Sin NAB
AAV2/2
1/80 1/81.920 1/5.120 1/20 Sin NAB 1/80 1/40 1/40 Sin NAB
AAV2/3
1/1.280 1/2.560 1/40.960 1/20 1/40 1/2.560 1/1.280 1/1.280 Sin NAB
AAV2/4
1/20 Sin NAB Sin NAB 1/1.280 1/40 Sin NAB Sin NAB Sin NAB 1/40
AAV2/5
1/20.480 Sin NAB 1/80 Sin NAB 1/163.840 1/5.120 1/40 Sin NAB Sin NAB
AAV2/6
1/81.920 Sin NAB 1/640 1/40 1/40 1/327.680 1/40 Sin NAB 1/40
AAV2/7
1/1.280 1/640 1/1.280 1/20 Sin NAB 1/1.280 1/163.840 1/5.120 1/80
AAV2/8
1/20 1/1.280 1/1.280 Sin NAB 1/20 Sin NAB 1/640 1/327.680 1/2.560
AAV2/9
Sin NAB Sin NAB Sin NAB Sin NAB Sin NAB Sin NAB 1/20 1/640 1/20.480
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Estos datos confirman los agrupamientos filogeneticos de los diferentes clones y clados excepto por la reactividad serologica no anticipada de los serotipos de AAV5 y AAV1 estructuralmente distintos (es decir, la relacion de tftulo heterologo/homologo fue de 1/4 y 1/8 en valoraciones redprocas).
El resultado indico ademas que AAVhu.14 tema una propiedad serologica distinta y no tema reactividad cruzada significativa con antisueros generados a partir de cualquier serotipo de AAV conocido. La singularidad serologica de AAVhu.14 se apoyo adicionalmente por su caracter unico en la estructura de la capsida que compartfa menos del 85 % de identidad de secuencia de aminoacidos con todos los otros serotipos de aAv comparados en este estudio. Esos hallazgos proporcionaron la base para que los inventores nombraran AAVhu.14 como un nuevo serotipo, AAV9.
EJEMPLO 3 - Evaluacion de AAV de primate como vectores de transferencia genica
Los tropismos biologicos de AAV se estudiaron generando un vector pseudotipado en el que los genomas de AAV recombinantes que expresan GFP o el gen indicador secretado a-1 antitripsina (A1AT) se empaquetaron con capsidas derivadas de diversos clones y un miembro representativo de cada clado de AAV de primate para comparacion. Por ejemplo, los datos obtenidos de AAV1 se usaron para representar el Clado A, seguido de AAV2 para el Clado B, Rh.34 para AAV4, AAV7 para el Clado D, AAV8 para el Clado E, y AAVHu.14 para el Clado F. AAV5, AAVCh.5 y AAVRh.8 permanecen como genotipos de AAV individuales para la comparacion.
Los vectores se evaluaron con respecto a eficacia de transduccion in vitro, basandose en la transduccion de GFP, y eficacia de transduccion in vivo en hngado, musculo o pulmon (Fig. 4).
A. In Vitro
Se usaron vectores que expresaban protema verde fluorescente potenciada (EGFP) para examinar su eficacia de transduccion in vitro en 84-31 celulas y para estudiar sus propiedades serologicas. Para analisis funcional, se midio la transduccion in vitro de diferentes vectores de AAVCMVEGFP en 84-31 celulas que se sembraron en una placa de 96 pocillos y se infectaron con vectores AAVCMVEGFP pseudotipados a una MOI de 1 x 104 GC por celula. Los vectores de AAV se pseudotiparon con capsidas de AAV 1, 2, 5, 7, 8 y 6 otros nuevos AAV (Ch.5, Rh.34, Cy5, rh.20, Rh.8 y AAV9) usando la tecnica descrita en G. Gao et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99, 11854-9 (3 sep, 2002). La eficacia de transduccion de EGFP relativa se puntuo como 0, 1, 2 y 3 correspondiente a 0-10 %, 10-30 %, 30-70 % y 70-100 % de celulas verdes estimadas usando un microscopio de UV a las 48 horas despues de la infeccion.
B. In Vivo
Para estudios in vivo, se selecciono a-antitripsina humano (A1AT) como un gen indicador sensible y cuantitativo en los vectores y se expreso bajo el control del promotor de p-actina de pollo potenciada por CMV. El empleo del promotor de CB permite conseguir altos niveles de transferencia genica de A1AT no espedfica y constitutiva de tejido y tambien permite el uso de la misma preparacion de vector para estudios de transferencia genica en cualquier tejido de interes. Se trataron ratones desnudos NCR de cuatro a seis semanas de edad con nuevos vectores de AAV (AAVCBhA1AT) a una dosis de 1x1011 copias de genoma por animal a traves de inyecciones intraportal, intratraqueal e intramuscular para transferencia genica dirigida al hngado, pulmon y musculo, respectivamente. Las muestras de suero se recogieron en diferentes puntos temporales despues de la transferencia genica y se determinaron las concentraciones de A1AT por un ensayo basado en ELlSA y se puntuaron como 0, 1, 2 y 3 en relacion con diferentes niveles de A1AT en suero el dfa 28 despues de la transferencia genica, dependiendo de la via de administracion del vector (Hfgado: 0 = A1AT < 400 ng/ml, 1 = A1AT 400-1000 ng/ml, 2 = A1AT 1000-10.000 ng/ml, 3 = A1AT > 10.000 ng/ml; Pulmon: 0 = A1AT < 200 ng/ml, 1 = A1AT 200-1000 ng/ml, 2 = A1AT 1000-10.000 ng/ml, 3 = A1AT > 10.000 ng/ml; Musculo: 0 = A1AT < 100 ng/ml, 1 = A1AT 100-1000 ng/ml, 2 = A1AT 1000-10.000 ng/ml, 3 = A1AT > 10.000 ng/ml).
Un AAV humano, clon 28.4/hu.14 (ahora nombrado AAV9), tiene la capacidad de transducir tngado a una eficacia similar a AAV8, pulmon 2 log mejor que AAV5 y musculo superior a AAV1, mientras que el rendimiento de otros dos clones humanos, 24.5 y 16.12 (hu.12 y hu.13) fue marginal en los 3 tejidos diana. El clon N721.8 (AAVrh.43) tambien tiene alto rendimiento en los tres tejidos.
Para analizar adicionalmente la eficacia de transferencia genica de AAV9 y rh 43 en comparacion con la de marcadores para el hngado (AAV8), pulmon (AAV5) y musculo (AAV1), se llevo a cabo un experimento de respuesta a dosis. Ambos nuevos vectores demostraron al menos 10 veces mas transferencia genica que AAV1 en el musculo, un rendimiento similar a AAV8 en el hngado y 2 log mas eficaz que AAV5 en el pulmon.
Un grupo de AAV demostro que habfa surgido una transferencia genica eficaz en los 3 tejidos que era similar o superior al rendimiento de su marcador en cada tejido. Hasta la fecha, 3 AAV nuevos han entrado en esta categona, dos de rhesus (rh10 y 43) y uno de ser humano (hu.14 o AAV9). Una comparacion directa de la eficacia de transferencia genica relativa de esos 3 AAV con sus marcadores en el hngado, pulmon y musculo murino sugiere que algunos AAV de primates con el mejor ajuste podnan haber evolucionado a partir de seleccion biologica rigurosa y
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evolucion como “super” virus. Estos son particularmente adecuados para aplicaciones de transferencia genica.
C. Perfiles de Actividad Biologica
Se demostraron perfiles unicos de actividad biologica, con respecto a la eficacia de transferencia genica, para los diferentes AAV con concordancia sustancial dentro de miembros de un conjunto de clones o clado. Sin embargo, la transduccion in vitro no predijo la eficacia de transferencia genica in vivo. Un algoritmo para comparar la actividad biologica entre dos pseudotipos de AAV diferentes se desarrollo basandose en la puntuacion relativa del nivel de expresion de transgen y un analisis acumulativo de diferencias.
Las diferencias acumulativas de las puntuaciones de transferencia genica in vitro e in vivo entre pares de AAV se calcularon y se presentaron en la tabla (ND = no determinado) de acuerdo con la siguiente formula. Diferencia funcional acumulativa con respecto a puntuaciones entre los vectores A y B = (A - B) in vitro + de pulmon (A - B) + de hngado (A - B) + de musculo (A - B). Cuanto mas pequeno sea el numero, mas similar en su funcion son los AAV. En el area sombreada en gris, el porcentaje de diferencia en la secuencia se representa en cursiva y negrita. El porcentaje de diferencia en la estructura de cap se determino dividiendo el numero de diferencias de aminoacidos despues de una delecion por pares de huecos en 750, la longitud del alineamiento de secuencia de protemas VP1.
AAV1
AAV2 AAV3 Ch.5 AAV4 AAV5 AAV7 AAV8 Rh,8 AAV9
AAV1
0 5 ND 4 4 4 2 4 5 4
AAV2
16,3 0 ND 3 2 4 7 7 6 9
AAV3
13,2 12,3 0 ND ND ND ND ND ND ND
Ch,5
15,5 10,5 11,5 0 2 4 6 6 5 8
AAV4
33,7 36,7 34,8 34,9 0 2 7 6 5 8
AAV5
39,1 38,8 38,5 38,4 42,7 0 4 4 3 6
AAV7
14,1 16,7 14,9 15,6 33,2 38,5 0 2 3 2
AAV8
15,6 16,4 14 15,6 33,2 38,9 11,6 0 1 2
Rh,8
14,1 15,2 14,3 14,4 33,7 39,6 12,1 8,8 0 3
AAV9
17,2 17,3 15,6 14,8 34,5 39,7 17,5 14,3 12,5 0
Estos estudios apuntan a varios problemas relevantes para el estudio de parvovirus en seres humanos. La prevalencia de secuencias de AAV endogenas en una amplia serie de tejidos humanos sugiere que las infecciones naturales con este grupo de virus son bastante comunes. La amplia distribucion tisular de secuencias virales y la deteccion frecuente en fngado, bazo e intestino indican que la transmision se produce mediante el tracto gastrointestinal y que la viremia puede ser una caractenstica de la infeccion.
La enorme diversidad de secuencias presentes en primates tanto humanos como no humanos tiene correlacion funcional con respecto a tropismo y serologfa, lo que sugiere que esta conducida por presiones biologicas reales tales como escape inmunitario. Claramente, la recombinacion contribuye a esta diversidad como se demuestra por el segundo clado humano mas comun, que es un hnbrido de dos AAV previamente descritos.
La inspeccion de la topologfa del analisis filogenetico revela informacion acerca de la relacion entre la evolucion del virus y su restriccion de hospedador. El genero completo de dependovirus parece derivar de AAV aviar lo que es coherente con Lukashov y Goudsmit [(V. V. Lukashov, J. Goudsmit, J Virol 75, 2729-40 (mar, 2001)]. Los aislados de AAV4 y AAV5 divergieron pronto a partir del desarrollo posterior de los otros AAV. El siguiente nodo importante divide la especie en dos grupos monofileticos principales. El primer grupo contiene clones aislados solamente de seres humanos e incluye el Clado B, clon de AAV3, Clado C y Clado A; la unica excepcion de la restriccion de especies de este grupo es el clon individual de chimpances, denominado ch.5. El otro grupo monofiletico, que representa los miembros restantes del genero, deriva de primates tanto humanos como no humanos. Este grupo incluye el Clado D y el clon rh.8, que se aislaron exclusivamente de macacos, y el Clado F, que es espedfico humano. El clado restante dentro de este grupo (es decir, Clado E) tiene miembros tanto de seres humanos como varias especies de primates no humanos lo que sugiere la transmision de este clado a traves de barreras de especies. Resulta interesante que las estructuras de capsida de miembros de Clado E aislados de algunos seres humanos son esencialmente identicas a algunos de los primates no humanos, lo que indica que se ha producido muy poca adaptacion a hospedador. El analisis de la bioiogfa de vectores derivados de AAV8 demostro un amplio intervalo de tropismo tisular con altos niveles de transferencia genica, lo que es coherente con un intervalo de infecciosidad mas promiscuo, y puede explicar su aparente zoonosis. Se observo para el Clado F un intervalo y eficacia de transferencia genica aun mayores, lo que destaca el potencial de transmision de especies cruzada, que hasta la fecha no se ha detectado.
La presencia de AAV latentes ampliamente diseminados a lo largo de seres humanos y primates no humanos y su predisposicion aparente para recombinar y para cruzar barreras de especies plantea problemas importantes. Esta combinacion de acontecimientos tiene potencial para conducir a la aparicion de nuevos agentes infecciosos con virulencia modificada. La evaluacion de este potencial esta confundida por el hecho de que las secuelas clmicas de las infecciones por AAV en primates aun no se han definido. Ademas, la alta prevalencia de secuencias de AAV en el hngado puede contribuir a diseminacion del virus en la poblacion humana en la situacion de trasplante de hngado
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alogenico y xenogenico. Finalmente, el hallazgo de AAV endogenos en seres humanos tiene implicaciones en el uso de AAV para terapia genica humana. El hecho de que AAV de tipo silvestre es tan prevalente en primates sin haberse asociado nunca con un tumor maligno sugiere que no es particularmente oncogenico. De hecho, se ha mostrado que la expresion de genes de rep de AAV suprime la transformacion [P. L. Hermonat, Virology 172, 253-61 (sep, 1989)].
EJEMPLO 4 - Vector de AAV 2/9 para el Tratamiento de Enfermedad de las Vfas Respiratorias de Fibrosis Qrnstica
Hasta la fecha, la transferencia genica de CFTR al pulmon para el tratamiento de la enfermedad de las vfas respiratorias CF se ha limitado por escaso rendimiento del vector combinado con las barreras significativas que el epitelio de las vfas respiratorias plantea para la transferencia genica eficaz. El genoma de AAV2 empaquetado en la capsida de AAV9 (AAV2/9) se comparo con AAV2/5 en diversos sistemas de modelo de las vfas respiratorias.
Se instilo por via intranasal una unica dosis de 50 |il de 1 x 1011 copias del genoma (gc) de AAV2/9 que expresan el gen de la p-galactosidasa dirigida al nucleo (nLacZ) o el gen de la protema verde fluorescente (GFP) bajo el control transcripcional del promotor de p-actina de pollo en ratones desnudos y tambien C57B1/6. Veintiun dfas despues, el pulmon y la nariz se procesaron con respecto a expresion genica. En animales de control transducidos con AAV2/9- GFP, no se vieron celulas positivas para LacZ. AAV2/9-nLacZ se transdujo con exito principalmente a las vfas respiratorias, mientras que AAV2/5-nLacZ se transdujo principalmente en los alveolos y algunas vfas respiratorias. A traves del epitelio de las vfas respiratorias nasales, tanto AAV2/5 como AAV2/9 transdujeron celulas epiteliales no ciliadas y ciliadas.
Los promotores espedficos de celulas epiteliales se evaluan en la actualidad para mejorar la direccion a las celulas de las vfas respiratorias in vivo. Basandose en los hallazgos in vivo, la eficacia de transferencia genica de AAV2/9 a celulas epiteliales de las vfas respiratorias humanas se ensayo a continuacion. Se aislaron celulas epiteliales de las vfas respiratorias de traquea y los bronquios humanos y se cultivaron en interfaz de aire-lfquido (ALI) en soportes de membrana recubiertos con colageno. Una vez que las celulas se polarizaron y se diferenciaron, se transdujeron con AAV2/9 o AAV2/5 que expresaban GFP desde el lado apical asf como el basolateral. Tanto AAV2/5 como AAV2/9 tuvieron exito en la transduccion de celulas epiteliales desde la superficie basolateral. Sin embargo, cuando se aplico a la superficie apical AAV2/9 dio como resultado un aumento de 10 veces del numero de celulas transducidas en comparacion con AAV2/5. En la actualidad, el rendimiento de transferencia genica de AAV2/9 en los pulmones y las vfas respiratorias nasales de primates no humanos se esta evaluando.
Este experimento demuestra que AAV2/9 puede transducir de forma eficaz las vfas respiratorias de pulmon murino y celulas epiteliales de las vfas respiratorias humanas bien diferenciadas cultivadas en aLi.
EJEMPLO 5 - Comparacion de inyeccion directa de AAV1 (2/1) y AAV9 (2/9) en corazones de ratas adultas
Dos ratas adultas (de 3 meses de edad) recibieron una unica inyeccion de 5x1011 partfculas de AAV2/1 o AAV2/9 en el ventnculo izquierdo.
Los resultados fueron espectaculares, observandose significativamente mas expresion en el corazon de rata adulto con los vectores de AAV2/9 en comparacion con AAV2/1, como se evaluo con histoqmmica de lacZ. AAV2/9 tambien muestra transferencia genica superior en corazon de raton neonatal.
EJEMPLO 6 - Vector de AAV2/9 para Terapia Genica de Hemofilia B
En este estudio, se muestra que los vectores de AAV 2/9 son vectores mas eficaces y menos inmunogenicos para terapia genica dirigida tanto a hugado como a musculo para hemofilia B que las fuentes de AAV tradicionales.
Para un enfoque dirigido a hugado, se realizo evaluacion del vector pseudotipado AAV2/9 en modelos hemofflicos de raton y perro. En ratones con hemofilia B inmunocompetentes (en fondo de C57BL/6), se han conseguido niveles superfisiologicos a largo plazo de Factor IX canino (cFIX, 41-70 |ig/ml) y tiempo de tromboplastina parcial activada acortada (aPTT) despues de la inyeccion intraportal de 1x1011 copias del genoma (GC)/raton de vectores de AAV2/7, 2/8 y 2/9 en los que el cFlX se expresa bajo un promotor espedfico de hugado (LSP) y elemento sensible post-transcripcional de hepatitis B de marmota (WPRe). Una dosis 10 veces menor (1x1010 GC/raton) del vector de AAV2/8 genero un nivel normal de cFIX y un tiempo de aPTT. En perros con hemofilia B de la Universidad de Carolina del Norte (UNC), se ha demostrado previamente que la administracion de un vector de AAV2/8 en un perro previamente tratado con un vector de AAV2 fue exitosa; la expresion de cFIX alcanzo un maximo a 10 |ig/ml el dfa 6 despues de la 2a inyeccion intraportal (dosis = 5x1012 GC/kg), despues se redujo gradualmente y se estabilizo a aproximadamente 700 ng/ml (16% del nivel normal) a lo largo del estudio (1 1/2 ano). Este nivel fue aproximadamente 3 veces mayor que el de un perro con hemofilia B que recibio una unica inyeccion de AAV2-cFIX a la dosis similar. Recientemente, se inyectaron a dos perros con hemofilia B sin tratamiento previo vectores de AAV2/8 por via intraportal a la dosis de 5,25x1012 GC/kg. Los niveles de cFIX en un perro (macho) alcanzaron el 30 % del nivel normal (1,5 |ig/ml) diez semanas despues de la inyeccion y se ha mantenido a 1,3-1,5 |ig/ml, mientras
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que el segundo perro (hembra) mantuvo la expresion de cFIX a aproximadamente el 10% del nivel normal. El tiempo de coagulacion de sangre completa (WBCT) y aPTT se acortaron ambos despues de la inyeccion, lo que sugiere que el antigeno era biologicamente activo. Las enzimas hepaticas (aspartato amino transferasa (SGOT), alanina amino transferasa (SGPT)) en ambos perros permanecieron en el intervalo normal despues de la cirugfa. Estos AAV tambien se evaluaron con respecto a terapia genica dirigida a musculo de la hemofilia B. AAV-CMV-cFIX- WPRE [un AAV que porta cFIX bajo el control de un promotor de CMV y que contiene el WPRE] empaquetado con seis fuentes de AAV diferentes se comparo en ratones con hemofilia B inmunocompetentes (en fondo de C57BL/6) despues de inyeccion intramuscular a la dosis de 1x1011 GC/raton. Se controlo la expresion genica de cFIX y la formacion de anticuerpos. Se detecto mayor expresion en el plasma de los ratones a los que se inyectaron vectores de AAV2/8 (1460+392 ng/ml el dfa 42), seguido de AAV2/9 (773+171 ng/ml el dfa 42) y AAV2/7 (500+311 ng/ml el dfa 42). Los niveles se mantuvieron durante 5 meses. Sorprendentemente, la expresion de cFIX por AAV2/1 vario de 0 a 253 ng/ml (promedio: 66+82 ng/ml). Se detecto inhibidor anti-cFIX (IgG) en algunos de los ratones a los que se inyecto AAV2/1. Los niveles de expresion de cFIX en estos ratones se correlacionaron bien con los niveles inhibidores. Se realizo exploracion adicional de la formacion de inhibidores en muestras el dfa 28 para todos los AAV. Los ratones con hemofilia B mostraron mayor formacion de inhibidores contra AAV2/2, seguido de AAV2/5 y AAV2/1. Solamente se detectaron inhibidores de nivel bajo y esporadicos en animales a los que se inyecto AAV2/7, AAV2/8 y AAV2/9. Por lo tanto, se muestran las ventajas de los nuevos vectores de AAV de serotipo 2/9 para terapia genica dirigida a musculo para hemofilia B como vectores mas eficaces y seguros sin inducir ninguna formacion de anticuerpo anti-FIX significativa.
EJEMPLO 7 - Vectores de Rh.43
A. Comparacion del vector de expresion A1AT basado en AAVrh.43 con AAV8 y AAV9 en transferencia genica dirigida a h^gado de raton
AAVrh.43, que pertenece al Clado E por vector de analisis filogenetico se comparo con AAV8 y AAV9 con respecto a niveles de hA1AT despues de la infusion intraportal al hngado de raton. Mas particularmente, los vectores AAVrh.43, AAV2/8 y AAV2/9 pseudotipados se compararon en transferencia genica dirigida a hngado de raton. Los vectores pseudotipados a las dosis de 1 x10 GC, 3x10 GC y 1x10 GC por animal se administraron a ratones C57BL/6 de 4-6 semanas de edad por via intramuscular. Se recogieron muestras de suero de animales el dfa 28 despues de la infusion del vector para el ensayo de anti-tripsina alfa 1 humano (hA1AT).
Los datos indicaron que el vector de AAVrh.43 tema de hecho un rendimiento similar al de AAV9 en el modelo de raton.
B. Transferencia genica de LacZ diana nuclear a h^gado y musculo de raton mediado por vectores de AAV pseudotipados
Los vectores basados en AAV9 y AAVrh.43 se compararon con vectores basados en AAV1 y AAV2. Los vectores se inyectaron a una dosis de 1x1011 GC por raton bien por via intraportal para dirigirse al tngado o bien por via intramuscular al musculo tibial anterior derecho de ratones C57BL/6 por via intramuscular. Los animales se sacrificaron el dfa 28 despues de la transferencia genica y los tejidos de interes se recogieron para tincion histoqmmica con X-gal.
El vector de AAVrh.43 demostro eficacia de transferencia genica que era cercana a AAV9 pero al menos 5 veces mayor que AAV1. La propiedad de AAVrh.43 se analizo adicionalmente tanto en hngado como en musculo usando el gen de LacZ diana nuclear como un indicador para visualizar la extension de la transferencia genica de forma histoqmmica.
C. Comparacion del vector de expresion de A1AT basado en AAVrh.43 con AAV5 en transferencia genica dirigida a pulmon de raton
Un vector basado en rh.43 tambien demostro una potencia de transferencia genica estupenda en tejido pulmonar. Se administraron diferentes dosis (1x1010, 3x1010y 1x1011 GC por animal) de vectores pseudotipados a pulmones de ratones C57BL/6 de 4-6 semanas de edad por via intratraqueal. Se recogieron muestras de suero de animales en diferentes puntos temporales para el ensayo de hA1AT.
Este vector se comparo con AAV5 a diferentes dosis con respecto a niveles de hA1AT detectado de forma sistematica despues de la instilacion intratraqueal al pulmon de raton. Los datos indicaron que este nuevo vector era al menos 100 veces mas eficaz que AAV5 en el modelo de raton.
EJEMPLO 8 - Nuevos vectores basados en AAV humano en modelos de raton para transferencia genica dirigida a hngado y pulmon
Los clones humanos, AAVhu.37, AAVhu.41 y AAVhu.47 se pseudotiparon y se examinaron respecto a la potencia de transferencia genica en tejidos de raton. Los vectores de AAVCBA1AT pseudotipados con capsidas de hu.37, hu.41
y hu.47 se prepararon usando los metodos descritos en el presente documento y se administraron a ratones C57BL/6 de 4-6 semanas de edad a traves de inyecciones intraportales e intratraqueales. Se recogieron muestras de suero de animales el dfa 14 despues de la inyeccion del vector para el ensayo de hAIAT, que se realizo de acuerdo con tecnicas publicadas. AAvhu.47 pertenece a la familia de AAV2 (clado B) AAV2 y se aislo de una 5 muestra de medula osea humana. AAVhu.37 y AAVhu.41 vienen de un tejido de testfculo humano y una muestra de medula osea humana respectivamente. Filogeneticamente, quedan en el clado de AAV 8 (clado E).
El analisis de A1AT en suero de animales inyectados indico que AAV hu.41 y AAV hu.47 rindieron poco en los tres tejidos ensayados. Sin embargo, la potencia de transferencia genica del vector derivado de AAVhu.37 fue similar a la 10 de AAV8 en hngado y AAV9 en pulmon.
Aunque la invencion se ha descrito con referencia a realizaciones particularmente preferidas, se apreciara que pueden realizarse modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un virus adeno-asociado recombinante que comprende una capsida de AAV que tiene la secuencia de aminoacidos 1 a 731 de SEC ID N°: 95 (AAVpi.2) o una capside de AAV funcional que tiene al menos una identidad de 99% con la misma, en el que el AAV comprende ademas un minigen que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heterologo unido operativamente con secuencias reguladoras que dirigen su expresion en una celula hospedadora neuronal.
  2. 2. El AAV de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la capsida tiene la secuencia de SEC ID N°: 95.
  3. 3. Un AAV de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicha capsida esta codificada por la secuencia de acido
    nucleico de SEC ID N°: 30.
  4. 4. El AAV de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la capside tiene la secuencia de SEC ID NO: 94.
  5. 5. El AAV de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la capside tiene la secuencia de SEC ID NO: 93.
  6. 6. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las repeticiones terminales
    invertidas son de AAV2.
  7. 7. Una capsida de virus adeno-asociado aislada que comprende una protema de la capsida de AAV que tiene la secuencia de aminoacidos 1 a 731 de SEC ID N°: 95.
  8. 8. Un virus adeno-asociado recombinante que comprende una protema de la capsida que tiene la secuencia de aminoacidos 1 a 731 de SEC ID N°: 95.
  9. 9. Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una protema que tiene la secuencia de aminoacidos 1 a 731 de SEQ ID NO: 95.
  10. 10. Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 9, en la que dicho acido nucleico tiene la secuencia de nt 1 a 2196 de SEQ ID NO: 30.
  11. 11. Una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en la que dicha molecula comprende ademas una secuencia que codifica una protema rep de AAV funcional.
  12. 12. Una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha molecula es un plasmido.
  13. 13. Un metodo para generar un virus adeno-asociado recombinante que comprende una capsida de AAV que comprende las etapas de cultivar una celula hospedadora que contiene: (a) una molecula que codifica una protema de la capsida de aAv, en la que la molecula que codifica la protema de la capsida de AAV es la molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 9 o reivindicacion 10, (b) un gen de rep funcional; (c) un minigen que comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un transgen; y (d) suficientes funciones auxiliares para permitir el empaquetamiento del minigen en la protema de la capsida de AAV.
  14. 14. Una celula hospedadora in vitro que comprende un virus adeno-asociado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
  15. 15. Una composicion que comprende un AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y un vehnculo fisiologicamente compatible.
  16. 16. Un AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el suministro de una molecula a una celula.
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