TW202333776A - 用於治療腦白質失養症的方法及組合物 - Google Patents

用於治療腦白質失養症的方法及組合物 Download PDF

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Abstract

本文揭示表現天冬醯轉移酶(aspartoacylase；ASPA)蛋白之重組腺相關病毒載體及用於治療腦白質失養症之相關用途。

Description

用於治療腦白質失養症的方法及組合物
腦白質失養症係一組罕見的主要為遺傳性之神經病症，其由髓磷脂及中樞神經系統(CNS)白質之其他組分(諸如稱為寡樹突神經膠質細胞及星狀細胞之細胞)之異常產生、加工或發展引起。髓磷脂功能降低導致神經功能逐漸喪失。
已鑑別超過50種不同腦白質失養症，其中有：亞歷山大氏病(Alexander disease)、體染色體顯性腦白質失養症伴自主神經疾病(ADLD)、卡納萬氏病(Canavan disease)、腦腱性黃色瘤症(CTX)、異染性腦白質失養症(MLD)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)及雷夫蘇姆氏病(Refsum disease)。腦白質失養症之特定症狀在不同疾病類型中廣泛變化。
對腦白質失養症無顯著改變該疾病過程之治療。實際上，治療旨在緩解症狀且保護一些神經功能。因此，對開發用於腦白質失養症疾病類型(諸如卡納萬氏病)之新穎治療劑存在未滿足之需求。
本發明提供用基因療法治療患有腦白質失養症之個體的方法。基因療法可包含投與重組腺相關病毒載體，該重組腺相關病毒載體包含編碼天冬醯轉移酶(ASPA)之核酸分子。
在一個態樣中，本發明提供一種方法，其包含：向個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼天冬醯轉移酶(ASPA)之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在一相關態樣中，本發明提供一種在有需要之個體中表現天冬醯轉移酶(ASPA)之方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在另一態樣中，本發明提供一種增加有需要個體中天冬醯轉移酶(ASPA)含量的方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地含量連接於啟動子。
在另一態樣中，本發明提供一種治療有需要之個體之腦白質失養症的方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在另一態樣中，本發明提供一種治療有需要之個體之卡納萬氏病的方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在另一態樣中，本發明提供治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體治療腦白質失養症之用途，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在另一態樣中，本發明提供治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體治療卡納萬氏病之用途，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療腦白質失養症之組合物，其包含在治療卡納萬氏病中治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療卡納萬氏病之組合物，其包含在治療卡納萬氏病中治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在另一態樣中，本發明提供一種使用治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體製造供治療腦白質失養症用或產生用於治療腦白質失養症之物質之藥劑的方法，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在另一態樣中，本發明提供一種使用治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體製造供治療卡納萬氏病用或產生用於治療卡納萬氏病之物質之藥劑的方法，其中該rAAV載體包含：(i)包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及(ii)編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
在前述態樣中之任一者之一些實施例中，腦白質失養症與選自由以下組成之群之病狀相關聯：卡納萬氏病、腎上腺脊髓神經病、亞歷山大氏病、腦腱性黃色瘤症、克拉培氏病、異染性腦白質失養症、腎上腺腦白質失養症、佩利措伊斯-梅茨巴赫病及雷夫蘇姆氏病。在一些實施例中，腦白質失養症與卡納萬氏病相關聯。
在前述態樣中之任一者之一些實施例中，治療有效量在約10 13載體基因體/千克(vg/kg)至約10 15vg/kg之範圍內。在一些實施例中，治療有效量在約10 14vg/kg至約5×10 14vg/kg範圍內。在一些實施例中，治療有效量為至少約1.32×10 14vg/kg。在一些實施例中，治療有效量為約3×10 14vg/kg。
在前述態樣中之任一者之一些實施例中，rAAV經由靜脈內輸注投與。
在前述態樣中之任一者之一些實施例中，個體小於或等於30月齡。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2021年10月12日申請之美國臨時申請案第63/254,885號及2022年6月14日申請之美國臨時申請案第63/352,049號的優先權益，該等臨時申請案中之各者之內容以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的。
本發明係關於經工程改造以在有需要之個體中表現天冬醯轉移酶(ASPA)的重組腺相關病毒(AAV)載體。本發明之態樣係關於用於治療有需要之個體之神經退化性疾病(例如腦白質失養症，諸如卡納萬氏病)的方法。在一些實施例中，本文所提供之方法涉及調節個體中之N-乙醯天冬胺酸(NAA)含量。NAA藉由天冬醯轉移酶(ASPA)代謝為乙酸鹽及L-天冬胺酸。
本文使用之章節標題僅出於組織目的而不應被視為限制所述主題。出於任何目的，本文所引用之所有文獻或文獻之部分(包括(但不限於)：專利、專利申請案、文章、書籍及論文)特此以全文引用之方式明確地併入。在所併入之文獻或文獻之部分中之一或多者定義與本申請案中之術語之定義矛盾之術語的情況下，以在本申請案中出現之定義為準。然而，本文所引用之任何參考文獻、文章、公開案、專利、專利公開案及專利申請案之提及並非且不應視為承認或以任何形式表明其構成有效的先前技術或形成全球任何國家之公共常識之一部分。
在本說明書中，除非另外指明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。術語「約」當直接在數目或數字之前時意謂數目或數字範圍加或減10%。應理解，除非另有指示，否則如本文所用之術語「一(a)」及「一(an)」係指所列舉之組分中之「一或多種」。應瞭解替代物(例如「或」)之使用意謂替代物之一者、兩者或其任何組合。術語「及/或」應理解為意謂替代物中之一者或兩者。如本文所用，術語「包括」及「包含」同義地使用。 重組 AAV 載體及粒子
在一態樣中，本發明提供一種病毒載體，其用於將編碼ASPA之核酸序列遞送至細胞，諸如遞送至需要治療之細胞。因此，在一些實施例中，本發明係關於一種重組腺相關病毒(rAAV)載體，其包含：包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及非AAV核苷酸序列(亦稱為異源聚核苷酸)，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。
如本文所用，術語「可操作連接」或「可操作地連接」係指所描述之組分的物理或功能性並接以便允許其按其預期方式起作用。在與聚核苷酸可操作連接之表現控制元件(諸如啟動子或強化子)之實例中，關係使得控制元件調節核酸之表現。更特定言之，例如，兩個可操作地連接之去氧核糖核酸(DNA)序列意謂兩個DNA以使DNA序列中之至少一者能夠對另一序列發揮生理作用的關係佈置(順式或反式)。「可操作地連接」可意謂所連接之核酸序列為連續的或實質上為連續的且必要時接合兩個連續且在閱讀框架中之蛋白質編碼區。
在一些實施例中，rAAV載體表現ASPA蛋白，該ASPA蛋白為人類ASPA蛋白。在一些情況下，由本文所述之rAAV載體表現的ASPA蛋白為原生(例如野生型) ASPA蛋白。由核苷酸序列編碼之ASPA蛋白或多肽包括如同天然存在之蛋白質一樣之全長原生序列以及功能性子序列、經修飾形式或序列變異體，只要該子序列、經修飾形式或變異體保留原生全長ASPA蛋白之一些功能度即可。在本發明之方法及用途中，由rAAV載體中之核苷酸序列編碼之ASPA蛋白及多肽可以與但不需要與所治療之個體缺乏或表現不足或缺失的內源性ASPA蛋白一致。在一些實施例中，ASPA包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 6具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或100%一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列(例如，異源序列)為野生型 ASPA基因序列。在一些實施例中，編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列(例如，異源序列)已相關於野生型 ASPA基因序列進行密碼子優化。在一些實施例中，本發明之ASPA編碼核苷酸序列為密碼子優化序列且包含SEQ ID NO: 1或由其組成。在其他實施例中，編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 1具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或100%一致性之核酸序列。在一些實施例中，編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列(例如，異源序列)為人類 ASPA互補DNA (cDNA)，其視情況連接於編碼血球凝集素(HA)標籤之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列(例如，異源序列)連接於編碼標籤，例如血球凝集素(HA)、UA、cMyc或任何適合標籤之核苷酸序列。
密碼子優化利用遺傳密碼中之冗餘以使得核苷酸序列能夠改變，同時維持所編碼蛋白質之相同胺基酸序列。在一些實施例中，進行密碼子優化以促進所編碼蛋白質之表現的增加或減少。此藉由調整核苷酸序列中之密碼子使用至特定細胞類型之密碼子使用來實現，由此利用與該細胞類型中特定轉移核糖核酸(tRNA)之相對豐度之偏移對應的細胞密碼子偏移。藉由改變核苷酸序列中之密碼子使得其經調整以與相應tRNA之相對豐度匹配，可增加表現。反之，可藉由選擇已知相應tRNA在特定細胞類型中罕見之密碼子來降低表現。
在一些實施例中，編碼ASPA蛋白之密碼子優化核苷酸序列比野生型cDNA序列更穩定，從而避免在將非AAV核苷酸序列經由基因療法引入至轉錄運轉機制時產生替代性剪接變異體或截短蛋白質。 表 1. ASPA 及啟動子序列之非限制性實例
序列描述 序列 SEQ ID NO
密碼子優化 ASPA基因序列 GCCACCATGACAAGCTGCCACATCGCCGAGGAGCACATCCAGAAAGTCGCCATTTTTGGGGGAACTCACGGTAACGAACTCACAGGGGTCTTCCTGGTGAAGCACTGGCTCGAGAACGGCGCAGAAATCCAGAGAACCGGACTGGAGGTGAAACCCTTCATTACAAATCCTCGGGCCGTCAAGAAATGCACTCGCTACATCGACTGTGATCTGAACCGGATTTTTGATCTGGAAAATCTCGGCAAGAAAATGTCCGAGGACCTGCCATACGAAGTGAGGAGAGCTCAGGAGATCAACCACCTCTTCGGACCCAAGGACAGCGAAGATTCCTATGACATCATTTTTGATCTGCATAACACCACATCAAATATGGGGTGCACCCTGATCCTCGAGGACAGCCGCAACAATTTCCTGATCCAGATGTTTCACTATATTAAGACAAGTCTGGCACCACTCCCCTGTTACGTGTATCTGATTGAGCATCCCTCTCTCAAGTACGCTACTACCCGAAGTATCGCAAAATATCCTGTGGGGATTGAAGTCGGTCCTCAGCCACAGGGAGTCCTGCGAGCCGATATCCTCGACCAGATGAGGAAGATGATCAAACATGCTCTGGATTTCATTCACCACTTCAACGAGGGCAAGGAGTTCCCCCCTTGCGCCATCGAGGTGTACAAGATCATTGAAAAAGTCGATTATCCTCGGGACGAGAACGGCGAAATTGCCGCTATCATTCACCCAAATCTGCAGGACCAGGATTGGAAGCCCCTCCATCCTGGGGATCCAATGTTCCTGACACTCGACGGTAAAACTATCCCACTGGGCGGAGACTGTACCGTGTACCCCGTGTTTGTCAATGAGGCAGCCTACTATGAGAAGAAAGAAGCTTTCGCCAAAACAACAAAACTCACTCTCAATGCTAAATCTATTCGGTGCTGCCTCCACTGA 1
CAG啟動子 GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG 2
PGK啟動子 CCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCC 3
CB6啟動子 ccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcggg 4
CBA啟動子 tggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgg 5
ASPA蛋白 MTSCHIAEEHIQKVAIFGGTHGNELTGVFLVKHWLENGAEIQRTGLEVKPFITNPRAVKKCTRYIDCDLNRIFDLENLGKKMSEDLPYEVRRAQEINHLFGPKDSEDSYDIIFDLHNTTSNMGCTLILEDSRNNFLIQMFHYIKTSLAPLPCYVYLIEHPSLKYATTRSIAKYPVGIEVGPQPQGVLRADILDQMRKMIKHALDFIHHFNEGKEFPPCAIEVYKIIEKVDYPRDENGEIAAIIHPNLQDQDWKPLHPGDPMFLTLDGKTIPLGGDCTVYPVFVNEAAYYEKKEAFAKTTKLTLNAKSIRCCLH 6
術語「同源」或「同源性」意謂兩個或更多個所提及之實體在界定區(例如區域、域或部分)上相同(例如當實體進行比對時)。「比對」序列係指相較於參考序列，通常含有對缺失或額外鹼基或胺基酸(間隙)之校正的多個聚核苷酸或蛋白質(胺基酸)序列。當兩個序列至少部分同源時，其共有至少部分一致性。具有同源性或一致性之「區、區域或域」意謂兩個或更多個所提及之實體的一部分相同，使得其共用同源性或一致性。因此，在兩個序列在一或多個序列區域內一致時，其在此等區域中共用一致性。舉例而言，在兩個多肽序列一致時，其至少在所提及之區域或部分內具有相同胺基酸序列。類似地，在兩個聚核苷酸序列一致時，其至少在所提及之區域或部分內具有相同聚核苷酸序列。「實質上同源性」意謂分子在結構上或在功能上保守，以使得其具有或經預測具有參考分子或與其共有同源性之參考分子之相關/對應區域或部分之一或多種結構或功能(例如生物功能或活性)中的至少部分結構或功能。
兩個序列之間的一致性或同源性可在整個序列長度或該序列之一部分上延伸。在一些實施例中，共有一致性百分比之序列長度為2、3、4、5或更多個連續聚核苷酸或胺基酸，例如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個連續胺基酸。在一些實施例中，共有一致性之序列長度為20或更多個連續聚核苷酸或胺基酸，例如至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多個連續胺基酸。在一些實施例中，共有一致性之序列長度為35或更多個連續聚核苷酸或胺基酸，例如至少35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多個連續胺基酸。在一些實施例中，共有一致性之序列長度為50或更多個連續聚核苷酸或胺基酸，例如至少50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-110或更多個連續聚核苷酸或胺基酸。
兩個序列之間的一致性(同源性)程度可使用電腦程式及數學演算法確定。可使用可在www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo獲得之比對程式Clustal Omega，使用預設參數計算一致性百分比。參見例如Sievers等人, 「Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.」 (2011年10月11日) Molecular systems biology7:539。出於計算與序列之一致性的目的，不包括諸如標籤之延伸。
載體基因體序列，包括本文所述之rAAV載體基因體序列，可包括一或多個「表現控制元件」。通常，表現控制元件係影響可操作地連接之聚核苷酸之表現的核酸序列。包括存在於載體內之表現控制元件，包括如本文所闡述之表現控制元件，諸如啟動子及強化子，以促進適當異源聚核苷酸(例如ASPA基因)轉錄及/或轉譯(例如啟動子、強化子、內含子之剪接信號、維持基因之正確閱讀框架以允許mRNA之轉譯等)。表現控制元件包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化(多聚A)信號；使細胞質mRNA穩定之序列；增強轉譯效率之序列(亦即，科紮克共有序列(Kozak consensus sequence))；增強蛋白質穩定性之序列；及在一些情況下增強編碼產物(例如，ASPA)分泌之序列。在一些實施例中，本發明之rAAV載體基因體序列包含共有序列，諸如科紮克序列(例如轉錄為RNA科紮克序列之DNA序列)。在一些實施例中，本發明之rAAV載體基因體序列包含處於編碼ASPA蛋白之核苷酸序列上游的科紮克序列。在一些實施例中，RNA科紮克序列包含ACCAUGG (SEQ ID NO:44)、GCCGCCACCAUGG (SEQ ID NO:45)、CCACCAUG (SEQ ID NO:46)或CCACCAUGG (SEQ ID NO:47)或由其組成。
表現控制可在轉錄、轉譯、剪接、訊息穩定性等層面下進行。通常，調節轉錄之表現控制元件並置於經轉錄聚核苷酸之5'端(亦即，「上游」)附近。表現控制元件亦可位於經轉錄序列之3'端(亦即「下游」)或轉錄本內(例如內含子中)。表現控制元件可位於遠離所轉錄序列之距離處(例如，離表現ASPA之核苷酸序列100至500、500至1000、2000至5000、5000至10,000或更多個核苷酸)，甚至在相當大的距離處。然而，由於聚核苷酸長度之限制，對於AAV載體，此類表現控制元件通常在距編碼ASPA之核苷酸序列1至1000個核苷酸內。
在功能上，編碼ASPA之可操作地連接之核苷酸序列的表現至少部分地可由元件(例如，啟動子)控制，使得該元件調節核苷酸序列之轉錄且適當時調節轉錄本之轉譯。表現控制元件之一特定實例為啟動子，其通常位於經轉錄序列之5'。表現控制元件之另一實例為強化子，其可位於經轉錄序列之5'、經轉錄序列之3'或經轉錄序列內。
如本文所用，「啟動子」可指鄰近於編碼重組產物(例如ASPA)之核酸序列(例如異源聚核苷酸)定位的核酸序列。啟動子通常可操作地連接於相鄰序列，例如異源聚核苷酸。相比於不存在啟動子時表現之量，啟動子通常會增加自異源聚核苷酸表現之量。
如本文所用之「強化子」可指鄰近於編碼ASPA之核苷酸序列定位之序列。強化子元件通常位於啟動子元件上游且亦起作用且可位於DNA序列(例如編碼ASPA之核苷酸序列)下游或其內。因此，強化子元件可位於異源聚核苷酸上游或下游100個鹼基對、200個鹼基對或300個或更多個鹼基對處。強化子元件通常使異源聚核苷酸之表現增加超過由啟動子元件提供之增加之表現量。
在一些實施例中，表現控制元件包括普遍存在、組成型或混雜的啟動子及/或強化子，其能夠驅動許多不同細胞類型中之聚核苷酸之表現。此類元件包括(但不限於)細胞巨大病毒/β-肌動蛋白雜合(例如，CAG、CB6或CBA)啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期啟動子及/或強化子序列、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子及/或強化子序列及在多種哺乳動物細胞類型中具有活性之其他病毒啟動子及/或強化子或在自然界中不存在之合成元件(參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985))、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF 1啟動子(Invitrogen)、與CBA啟動子聯合之即刻早期CMV強化子(Beltran等人, Gene Therapy, 17(9): 1162-1174 (2010))及CBh啟動子(Gray等人, Hum Gene Ther, 22(9): 1143-1153 (2011))。在一些實施例中，本發明之rAAV包含合成CASI啟動子，其含有CMV強化子之一部分、雞β-肌動蛋白啟動子之一部分及UBC強化子之一部分。(參見例如國際專利公開案第WO2012115980號)。在一些實施例中，啟動子為星狀細胞特異性啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子或增強型雞β-肌動蛋白啟動子。在一些實施例中，啟動子為細胞巨大病毒/β-肌動蛋白雜合啟動子或PGK啟動子。在一些實施例中，細胞巨大病毒/β-肌動蛋白雜合啟動子為CAG啟動子、CB6啟動子或CBA啟動子。
在一些實施例中，rAAV載體包括包含SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%或100%一致性之核苷酸序列的CAG啟動子序列。在一些實施例中，rAAV載體包括包含SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%或100%一致性之核苷酸序列的PGK啟動子序列。在一些實施例中，rAAV載體包括包含SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%或100%一致性之核苷酸序列的CB6啟動子序列。在一些實施例中，rAAV載體包括包含SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%或100%一致性之核苷酸序列的CBA啟動子序列。表1包括啟動子序列之非限制性實例。
誘導型啟動子允許基因表現之調控且可藉由以下調控：外源供應之化合物；環境因素，諸如溫度；或特定生理狀態、急性期、特定細胞分化狀態之存在，或僅在複製細胞中。誘導型啟動子及誘導型系統可自多種商業來源獲得，包括(但不限於) Invitrogen及Clontech。已描述許多其他系統且可供使用。藉由外源供應之啟動子調控的誘導型啟動子之實例包括鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白(metallothionine，MT)啟動子、地塞米松(dexamethasone，Dex)誘導型小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統；蛻皮激素昆蟲啟動子、四環素可抑制型系統、四環素誘導型系統、RU486誘導型系統及雷帕黴素誘導型系統。可使用緊密調控且對表現ASPA之特定目標細胞類型具有特異性的任何類型之誘導型啟動子。
表現控制元件(例如，啟動子)包括在特定組織或細胞類型中具有活性者，在本文中稱為「組織特異性表現控制元件/啟動子」。組織特異性表現控制元件通常在特定細胞或組織(例如腦、中樞神經系統、脊髓等)中具有活性。表現控制元件通常在此等細胞、組織或器官中具有活性，因為其由轉錄活化蛋白或特定細胞、組織或器官類型所特有之其他轉錄調控因子識別。因此，在一些情況下，本發明之rAAV載體包含引導宿主細胞(例如神經細胞，諸如寡樹突神經膠質細胞、許旺氏細胞(Schwann cell)、微膠質細胞、星狀細胞或神經元；或非神經細胞，諸如肝細胞)中編碼ASPA蛋白之核苷酸序列之表現的啟動子。
在一些實施例中，適用於本發明之rAAV載體之調控序列亦含有內含子，該內含子視情況位於啟動子/強化子序列與ASPA基因之間。在一些實施例中，內含子序列來源於SV-40，且為100 bp微型內含子剪接供體/剪接受體，稱為SD-SA。在一些實施例中，rAAV載體包含轉錄後調控元件。轉錄後調控元件之一個實例為土撥鼠肝炎病毒轉錄後元件(WPRE)。(參見例如Wang及Verma, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96: 3906-3910 (1999))。在某些實施例中，轉錄後調控元件為B型肝炎病毒轉錄後調控元件(HBVPRE)或RNA轉運元件(RTE)。在一些實施例中，WPRE或HBVPRE序列為美國專利第6,136,597號或美國專利第6,287,814號中所揭示之WPRE或HBVPRE序列中之任一者。在一些實施例中，WPRE序列包含以下或由其組成： aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccaactggat cctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggctctc aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt cgctttcggc ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg   (SEQ ID NO:51)。
在一些實施例中，rAAV載體包含多聚A信號。多聚A信號可來源於許多適合物種，包括(但不限於)兔、SV-40、人類及牛類動物。在一些實施例中，rAAV載體包含兔球蛋白多聚A信號，諸如兔β-球蛋白多聚A信號。在一些實施例中，兔β-球蛋白多聚A信號具有SEQ ID NO: 101之核酸序列或與SEQ ID NO: 101至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%或100%一致之核苷酸序列(SEQ ID NO: 101 - aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca)。
可包括於rAAV載體中之另一適用調控組件為內部核糖體進入位點(IRES)。IRES序列或其他適合之系統可用於自單一基因轉錄本產生超過一種多肽。IRES (或其他適合序列)用於自同一細胞或在同一細胞內產生含有超過一條多肽鏈之蛋白質或表現兩種不同蛋白質。示例性IRES為脊髓灰白質炎病毒內部核糖體進入序列。IRES可相對於rAAV載體中之ASPA轉殖基因位於5'或3'。在其他實施例中，rAAV載體可包含編碼2A肽之核苷酸序列，其允許自單一啟動子表現多種多肽。
如本文所用，重組「載體」或「rAAV載體」係指來源於諸如AAV之病毒之野生型基因體的載體，其藉由使用分子方法自病毒移除野生型基因體且用諸如異源聚核苷酸序列(例如，表現ASPA之治療性基因表現卡匣)非原生核酸替換其而獲得。通常，對於AAV，野生型AAV基因體之一個或兩個反向末端重複(ITR)序列保留在AAV載體中。rAAV載體可與病毒基因體不同，因為病毒基因體之全部(或一部分)相對於病毒基因體核酸已經非原生序列置換。因此，諸如異源聚核苷酸之非原生序列之併入將病毒載體界定為「重組」載體，在AAV情況下可稱為「rAAV載體」。包含編碼ASPA之核酸分子的rAAV載體亦可稱為「scAAV9-CB6-h ASPAopt」或「ASPA載體」。如將自上下文顯而易見，「載體」可指經分離之重組核苷酸序列或包含重組核苷酸序列之AAV粒子或病毒體。
在一些實施例中，rAAV載體不包含miRNA (微小RNA)之任何結合位點。在一些實施例中，rAAV載體包含一個、兩個、三個、四個、五個或更多個針對在不期望ASPA蛋白表現(亦即，解除靶向)之細胞中表現之miRNA的結合位點。在一些實施例中，rAAV載體包含一或多個針對miR-122之結合位點。miR-122與ASPA編碼序列之結合可減少此序列在肝細胞中之表現，其中miR-122非常普遍(Thakral及Ghoshal, Curr Gene Ther. 2015; 15(2): 142-150)。
rAAV核酸序列可包裝至病毒(在本文中亦稱為「粒子」或「病毒體」)中以用於離體、活體外或活體內之後續細胞感染。在重組載體序列衣殼化或封裝於AAV粒子中時，粒子可稱為「rAAV」。此類粒子或病毒體通常包括衣殼化或封裝載體基因體之蛋白質。特定實例包括病毒包膜蛋白，且在AAV情況下，包括衣殼蛋白。
本文所述之rAAV載體及粒子之AAV組分可選自各種AAV血清型。在一些實施例中，rAAV載體包含來自rh10、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或rh74血清型之AAV核酸序列。在一些實施例中，rAAV載體包含來自AAV9血清型之AAV核酸序列。此等AAV組分容易使用各種技術自AAV血清型分離。此類AAV可自學術、商業或公開來源(例如，美國菌種保存中心(the American Type Culture Collection), Manassas, VA)分離或獲得。或者，AAV序列可經由合成或其他適合方式參考公開序列，諸如文獻或資料庫(諸如GenBank™、PubMed或其類似物)中可用之公開序列獲得。
在某些實施例中，rAAV載體或rAAV粒子包含如例如美國專利第7,906,111號或美國專利第7,629,322號(以全文引用的方式併入本文中)中所揭示之AAV核酸序列或AAV蛋白。在一些實施例中，rAAV載體或rAAV粒子包含如例如美國專利第7,282,199號、第9,587,250號或第9,677,089號(以全文引用的方式併入本文中)中所揭示的來自AAV血清型AAV8或其變異體之AAV核酸序列或AAV蛋白。在一些實施例中，rAAV載體或rAAV粒子包含如例如美國專利第7,198,951號(以全文引用的方式併入本文中)中所揭示的來自AAV血清型AAV9或其變異體之AAV核酸序列或AAV蛋白。在一些實施例中，rAAV載體或rAAV粒子包含來自AAV血清型rh74或其變異體之AAV核酸序列或AAV蛋白。
在一些實施例中，本發明之rAAV載體包括包含至少一個AAV ITR序列之核酸分子。在某些實施例中，rAAV載體包含兩個ITR序列，該等ITR序列可具有相同或不同AAV血清型。AAV ITR可選自任何適用AAV血清型，包括(但不限於) rh10、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh74及其他AAV。在一些實施例中，本文所述之rAAV載體包括包含一或兩個AAV2 ITR之序列的基因體。
本發明進一步提供一種rAAV粒子，其包含本文所述之rAAV載體。因此，在一些態樣中，本發明係關於一種rAAV粒子，其包括包含至少一個AAV ITR之核酸分子及編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列(亦稱為異源聚核苷酸)，該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。在一些實施例中，rAAV粒子包含至少一種選自由以下組成之群的衣殼蛋白：AAV血清型rh10、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh74及其他AAV血清型。在一些實施例中，rAAV粒子包含至少一種AAV9衣殼蛋白。
在一些實施例中，rAAV載體或粒子包含AAV9衣殼蛋白，及包含人類 ASPAcDNA、CAG、PGK、CBA或CB6啟動子及視情況一或兩個AAV2 ITR序列之核酸分子。在一些實施例中，rAAV載體或粒子為AAV9-CAG-h ASPAopt、AAV9-PGK-h ASPAopt、AAV9-CBA-h ASPAopt或AAV9-CB6-h ASPAopt載體。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，rAAV載體包含科紮克序列。在一些實施例中，科紮克序列包含或能夠轉錄成SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47。在一些實施例中，rAAV載體進一步包含HBVPRE序列或WPRE序列(例如，SEQ ID NO: 51)。
在一些實施例中，rAAV載體或rAAV粒子包含衣殼(「Cap」)蛋白(例如，包括vp1、vp2、vp3及高變區)、病毒複製(「Rep」)蛋白(例如，rep 78、rep 68、rep 52或rep40)及/或編碼一或多種此類蛋白質之序列。此等AAV組分容易用於多種載體系統及宿主細胞中。此類組分可單獨使用，與其他AAV血清型序列或組分組合使用，或與來自非AAV病毒序列之元件組合使用。如本文所用，人造AAV血清型包括(但不限於)具有非天然存在之衣殼蛋白之AAV。此類人造衣殼可藉由任何適合技術，使用所選AAV序列(例如，vp1衣殼蛋白之片段)與異源序列組合產生，該異源序列可自不同的所選AAV血清型、相同AAV血清型之非連續部分、非AAV病毒來源或非病毒來源獲得。人造AAV血清型可為(不限於)假型AAV、嵌合AAV衣殼、重組AAV衣殼或「人類化」AAV衣殼。假型載體適用於本發明，其中一種AAV之衣殼經異源衣殼蛋白置換。在一些實施例中，AAV為AAV2/5。在一些實施例中，AAV為AAV2/8。參見例如Mussolino等人, Gene Therapy, 18(7): 637-645 (2011)；Rabinowitz等人, J Virol, 76(2): 791-801 (2002)。
在一些實施例中，適用於本文所述之組合物及方法中的載體最少含有編碼所選AAV血清型衣殼之序列或其片段。在一些實施例中，適用載體最少含有編碼所選AAV血清型rep蛋白之序列或其片段。視情況，此類載體可含有AAV cap蛋白及rep蛋白兩者。在提供AAV rep及cap之載體中，AAV rep及AAV cap序列兩者可屬於一種血清型。或者，可使用rep序列來自一種AAV血清型且cap序列來自不同AAV血清型之載體。在一些實施例中，rep及cap序列由單獨來源(例如，單獨載體，或宿主細胞及載體)表現。在一些實施例中，此等rep序列與不同AAV血清型之cap序列同框融合以形成嵌合AAV載體，諸如美國專利第7,282,199號(以全文引用的方式併入本文中)中所述之AAV2/8。
適合之rAAV可藉由培養宿主細胞來產生，該宿主細胞含有如本文所定義之編碼AAV血清型衣殼蛋白之核酸序列或其片段；功能性rep基因；最少由AAV反向末端重複序列(ITR)及ASPA編碼核酸序列之構成的核酸分子；及足夠允許核酸分子封裝至AAV衣殼蛋白之輔助功能。在一些態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含本文所揭示之rAAV載體或rAAV粒子。宿主細胞中存在以將rAAV載體封裝於AAV衣殼中所需的組分可以反式方式提供給宿主細胞。或者，所需組分(例如載體、rep序列、cap序列及/或輔助功能)中之任一或多者可由穩定宿主細胞提供，該宿主細胞已經工程改造以使用各種方法含有所需組分中之一或多者。最適當地，此類穩定宿主細胞在誘導型啟動子之控制下含有所需組分。然而，所需組分可處於組成型啟動子之控制下。本文中在上文關於適合與非AAV核苷酸序列，亦即ASPA一起使用之調控元件的論述中提供適合誘導型及組成型啟動子之實例。在又一替代方案中，所選之穩定宿主細胞可含有處於組成型啟動子控制下之所選組分及處於一或多個誘導型啟動子控制下之其他所選組分。舉例而言，可產生穩定宿主細胞，其來源於293細胞(其含有處於組成型啟動子控制下之E1輔助功能)，但其含有處於誘導型啟動子控制下之rep及/或cap蛋白。可產生其他穩定宿主細胞。
用於產生本發明之rAAV的rAAV載體、rep序列、cap序列及輔助功能可以傳遞其上攜帶之序列的任何基因元件形式遞送至封裝宿主細胞。可藉由任何適合之方法(包括本文所述之彼等方法)來遞送所選基因元件。用於構築本發明之任何實施例之方法，包括產生rAAV粒子，為核酸操縱領域之技術人員已知的，且包括基因工程改造、重組工程改造及合成技術。參見例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Fisher等人, J. Virol., 70:520-532 (1993)；及US 5,478,745，其中各者均以全文引用的方式併入本文中。
在一態樣中，本發明提供一種產生rAAV粒子之方法，該方法包含培養宿主細胞，該宿主細胞含有：(a)包含如本文所述之表現ASPA之rAAV載體基因體或由其組成的核酸分子；(b)編碼AAV rep之核酸分子；(c)編碼至少一種AAV衣殼蛋白之核酸分子；及(d)足夠將rAAV載體基因體封裝至rAAV粒子中之輔助功能。
本發明之rAAV粒子可藉由各種方法來純化。在一些實施例中，rAAV病毒可藉由陰離子交換層析法純化。參見例如美國專利公開案第2018/0163183 A1號。關於本文所揭示之AAV載體及粒子之構築及表徵的其他細節描述於國際專利公開案第WO 2019/143803號(以全文引用的方式併入本文中)中。關於編碼ASPA之rAAV粒子的其他細節可見於美國專利第9,102,949號、美國專利公開案第2019/0125899A1號及美國專利公開案第US 2018/0311323A1號，各者之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，包含本文所揭示之含有人類 ASPA轉殖基因之表現卡匣的非複製重組AAV血清型9 (AAV9)載體的組合物具有 圖 2中描繪之AAV-h ASPAopt-Opt載體設計。在一些實施例中，rAAV載體之表現卡匣包含5' ITR，其包含SEQ ID NO: 102之核酸序列(SEQ ID NO: 102 -  ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt  gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct)。在一些實施例中，rAAV載體之表現卡匣包含編碼SEQ ID NO: 1之hASPA之密碼子優化核酸序列。在一些實施例中，rAAV載體之表現卡匣包括包含SEQ ID NO: 101之核酸序列的兔β-球蛋白多聚A。在一些實施例中，rAAV載體之表現卡匣包含3' ITR，其包含SEQ ID NO: 103之核酸序列(SEQ ID NO: 103 - aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag)。 醫藥組合物
本發明之rAAV載體或粒子可併入至適合於投與之醫藥組合物中。在一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之rAAV載體或rAAV粒子(例如，包含編碼ASPA之核酸序列的rAAV粒子)及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係指當使用已確立途徑投與時一般不產生過敏或其他嚴重不良反應的分子實體及組合物。經美國聯邦政府或美國州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他一般公認之藥典中列出之用於動物，且更特定言之用於人類之分子實體及組合物視為「醫藥學上可接受的」。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」意欲包括與醫藥投與相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。適合載劑描述於領域中之標準參考文本-Remington's Pharmaceutical Sciences之最新版中，其以引用之方式併入本文中。此類載劑或稀釋劑之一些實例包括(但不限於)水、生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液、5%人類血清白蛋白及其他緩衝劑(例如HEPES)以將pH維持在適當生理水平下。除非任何介質或藥劑與活性組分不相容，否則考慮在組合物中使用其。亦可將補充活性化合物併入組合物中。
在整個本說明書中，「vg」可指「病毒基因體」或「載體基因體」。
可用於投與本文所揭示之rAAV的醫藥組合物及遞送系統之實例可見於Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 第20版, Mack Publishing Co., Easton, Pa.；Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 第18版, Mack Publishing Co., Easton, Pa.；The Merck Index (1996) 第12版, Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.；Ansel及Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 第11版, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md.；及Poznansky等人, Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano編, Oxford, N.Y., 第253-315頁。
本發明之醫藥組合物可調配成與其預期投與途徑相容。投與途徑之實例包括非經腸投與，例如靜脈內投與或注射。用於非經腸(例如，靜脈內或經由注射)應用之溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、生理食鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，及用於調整張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或鹼，諸如鹽酸或氫氧化鈉加以調節。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
適於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投與，適合載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL ®(BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物應為無菌的且流動性應達到易於注射之程度。組合物在製造及儲存條件下應為穩定的，且應加以保存以防微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。舉例而言，可藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、在分散液情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當之流動性。可藉由例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物之各種抗微生物劑及抗真菌劑來實現阻止微生物作用。在許多情況下，組合物中較佳包括等張劑，諸如糖、多元醇(例如多元醇，諸如甘露糖醇及山梨糖醇)及氯化鈉。可藉由在組合物中包括例如單硬脂酸鋁及明膠之吸收延遲劑來實現可注射組合物之延長吸收。
無菌可注射溶液可藉由如下方法製備：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中，視需要隨後進行過濾滅菌。通常，藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質及來自上文所列舉之成分之其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，該等製備方法由其先前經無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何額外所需成分之粉末。
對於注射，醫藥學上可接受之載劑可為液體。示例性生理學上可接受之載劑包括無菌、無熱原質水及無菌、無熱原質、磷酸鹽緩衝生理食鹽水。美國專利第7,629,322號中提供多種此類已知載劑，該專利以全文引用的方式併入本文中。在一個實施例中，載劑為等張氯化鈉溶液。在一些實施例中，載劑為平衡鹽溶液。在一些實施例中，載劑包括TWEEN ®(聚山梨醇酯)。若rAAV可長期儲存，則其可在甘油或TWEEN ®(聚山梨醇酯) 20存在下加以冷凍。
就容易投藥及均一給藥而言，非經腸組合物調配成單位劑型特別有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為用於待治療之個體之單位劑量的物理離散單元；各單元含有與所需醫藥載劑相關聯的經計算以產生所要治療作用之預定量之活性劑(例如，rAAV)。本發明之單位劑型之規格係由以下指定且直接視以下而定：活性劑(例如，rAAV)之獨特特徵及欲實現之特定治療作用，及用於治療個體之此類活性劑(例如，rAAV)之混配技術中的固有限制。單位劑型可在例如安瓿及小瓶內，其可包括液體組合物或呈冷凍乾燥或凍乾狀態之組合物；無菌液體載劑例如可在活體內投與或遞送之前添加。個別單位劑型可包括於多劑量套組或容器中。重組載體(例如，rAAV)序列、質體、載體基因體、重組病毒粒子(例如，rAAV)及其醫藥組合物可包裝成單一或多個單位劑型以便於投與及劑量均一性。
包括包含編碼ASPA之核酸序列之rAAV載體或rAAV粒子的醫藥組合物可與投藥說明書一起包括於容器、包裝或分配器中。
在一些實施例中，組合物包括界面活性劑。在一些實施例中，組合物包括泊洛沙姆(poloxamer)，諸如泊洛沙姆188。在一些實施例中，組合物包括增稠劑、塑化劑及/或低溫保護劑。在一些實施例中，組合物包括糖醇，諸如山梨糖醇。在一些實施例中，組合物包括緩衝液。在一些實施例中，組合物調配為磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.0、5%重量/體積(w/v)山梨糖醇、0.001% w/v泊洛沙姆188中之無菌溶液。其可以2.5 mL之填充體積供應於5毫升(mL)無熱原質小瓶中且用無乳膠橡膠塞及鋁易拉密封件密封。在一些實施例中，組合物調配為無菌溶液，該無菌溶液包含137毫莫耳(mM)氯化鈉、8.1 mM磷酸氫二鈉、1.47 mM磷酸二氫鉀、2.7 mM氯化鉀、5% w/v山梨糖醇、0.001% w/v泊洛沙姆188及注射用水。調配產物之載體濃度不受限制，且可在約10 12vg/mL至約10 15vg/mL，例如約5×10 12vg/mL、約1×10 13vg/mL、約5×10 13vg/mL、約1×10 14vg/mL、約5×10 14vg/mL範圍內，包括處於其間之所有值及子範圍。在一些實施例中，調配產物之載體濃度在約1.8×10 13vg/mL至約5.0×10 13vg/mL範圍內。在一些實施例中，調配產物之載體濃度在約1.8×10 13vg/mL至約4.2×10 13vg/mL範圍內。小瓶可冷凍儲存在≤-60℃下直至即用。
在一個態樣中，本發明提供一種套組，其包含rAAV載體或包含其之粒子，其中該rAAV載體包括包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子。在一些實施例中，套組進一步包含關於向個體投與rAAV載體之說明書。在一些實施例中，套組進一步包含關於藉由靜脈內輸注投與rAAV載體之說明書。
在另一態樣中，本發明提供一種單位劑量，其包含rAAV載體或包含其之粒子，其中該rAAV載體包括包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且其中治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內。在一些實施例中，治療有效量為約1.32×10 14vg/kg。在一些實施例中，治療有效量為約3×10 14vg/kg。在一些實施例中，單位劑量包含液體調配物。在一些實施例中，單位劑量經組態用於藉由靜脈內輸注向個體投與。
在以上態樣之一些實施例中，ASPA蛋白為人類ASPA蛋白。在以上態樣之一些實施例中，編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列包含人類 ASPAcDNA或由其組成。在以上態樣之一些實施例中，編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列包含密碼子優化之核苷酸序列或由其組成。在以上態樣之一些實施例中，編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1或由其組成。在以上態樣之一些實施例中，編碼ASPA蛋白之非AAV核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 1至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之胺基酸序列。在以上態樣之一些實施例中，啟動子引導ASPA蛋白在諸如神經細胞之宿主細胞中的表現。在以上態樣之一些實施例中，啟動子為細胞巨大病毒/β-肌動蛋白雜合啟動子或PGK啟動子。在以上態樣之一些實施例中，細胞巨大病毒/β-肌動蛋白雜合啟動子為CAG、CB6或CBA啟動子。在以上態樣之一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之核苷酸序列或由其組成。在以上態樣之一些實施例中，ITR為AAV、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型ITR。在以上態樣之一些實施例中，rAAV為AAV、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型。在以上態樣之一些實施例中，rAAV為AAV9血清型。在以上態樣之一些實施例中，其中核酸分子進一步包含科紮克序列。在以上態樣之一些實施例中，核酸分子進一步包含miR-122結合位點。 使用重組 AAV 載體及粒子之方法
本發明提供涉及AAV (例如，重組AAV)載體諸如用於有需要之個體之治療之用途的方法。本文所提供之方法包含例如向個體投與治療有效量的本文所揭示之rAAV或組合物中之任一者。在一些實施例中，rAAV載體之投與引起ASPA在個體之組織中表現。在一些實施例中，組織為周邊組織或中樞神經系統(CNS)組織。在一些實施例中，rAAV載體之投與引起ASPA在個體之細胞中表現。在一些實施例中，細胞為神經細胞，諸如寡樹突神經膠質細胞。
在一些實施例中，個體為人類、非人類靈長類動物、豬、馬、牛、犬、貓、兔、天竺鼠、倉鼠、小鼠或大鼠。在特定實施例中，個體為人類。人類個體可為人類女性或人類男性。在一些實施例中，個體為先前已進行激素療法方案之人類。在一些實施例中，個體進行激素療法方案。在一些實施例中，個體已進行或正進行物理療法或其他物理介入，諸如支持性護理或使用飼管(feeding tube)。在一些實施例中，個體正進行或已進行針對卡納萬氏病之一或多種症狀的治療，諸如抗癲癇藥物或抗痙攣藥物。在一些實施例中，個體已進行或正進行針對卡納萬氏病之研究性療法，諸如葡糖酸鋰、三乙酸甘油酯(GTA)、臍帶血細胞療法或ASPA基因療法。在一些實施例中，個體為人類嬰兒。在某些情況下，個體為約1月齡、約2月齡、約3月齡、約4月齡、約5月齡、約6月齡、約7月齡、約8月齡、約9月齡、約10月齡、約11月齡或約1歲之人類嬰兒。在一些實施例中，個體為小於3月齡、小於6月齡、小於9月齡、小於1歲或小於18月齡之人類嬰兒。在一些實施例中，個體為小於或等於30月齡之人類。在一些實施例中，個體為人類兒童(例如，＜18歲)，諸如13-18、12-18、10-18、8-18、6-18、2-18、10-13、8-13、6-13、2-13、10-12、8-12、6-12、2-12、6-12、2-12、2-10、2-8或2-6歲或其中任何範圍之間的兒童。在一些實施例中，個體為成人(例如≥18歲)。
如本文所用，術語「有需要之患者」或「有需要之個體」係指處於疾病、病症或病狀之風險下或罹患疾病、病症或病狀的患者或個體，該疾病、病症或病狀能夠用本文所提供之包含編碼ASPA之核酸序列的rAAV或包含此類rAAV之組合物治療或改善，諸如腦白質失養症。在一些實施例中，「有需要之患者或個體」為處於顯現與ASPA功能障礙相關之疾病，諸如卡納萬氏病之風險下或罹患該疾病的患者或個體。在一些實施例中，「有需要之患者」或「有需要之個體」具有ASPA基因中之一或多個胺基酸突變，引起ASPA功能之改變。「個體」及「患者」在本文中可互換地使用。
如本文所用，術語「有效量」或「治療有效量」係指醫藥劑、例如rAAV足以實現以下之量：減少或改善病症、例如腦白質失養症(諸如卡納萬氏病)或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；阻止病症進展；引起病症消退；阻止與病症相關之一或多種症狀復發、發展、發作或進展；偵測病症；或增強或改善另一療法(例如，預防劑或治療劑)之預防或治療作用。在一些實施例中，有效量之rAAV可例如增加ASPA之表現，及/或在一定程度上減輕與疾病相關之一或多種症狀，該疾病與足夠ASPA含量及/或足夠ASPA功能缺乏相關聯。
本發明提供包含如本文所述之編碼ASPA之核酸分子的rAAV之方法及用途，其用於向患有特徵為ASPA缺乏或功能障礙之病症或疾病的個體提供治療益處。在一些態樣中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所述之rAAV或組合物，藉此治療特徵為個體中ASPA之缺乏或功能障礙的病症或疾病。
在一些情況下，本發明提供一種在有需要之個體中表現ASPA的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之rAAV粒子或本文所述之醫藥組合物，藉此在該個體中表現ASPA。在某些實施例中，本發明提供一種增加有需要之個體中ASPA之表現的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物，藉此增加該個體中ASPA之表現。在一些實施例中，本文所揭示之方法引起個體神經細胞中ASPA之表現或增加ASPA之表現。
在一些實施例中，個體需要ASPA之表現。在一些實施例中，個體患有ASPA缺乏症。本發明提供治療患有ASPA缺乏症之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物，藉此治療個體之ASPA缺乏症。本發明提供治療患有腦白質失養症(諸如卡納萬氏病)之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物，藉此治療個體之腦白質失養症。
腦白質失養症可為經醫師鑑定之任何腦白質失養症，包括影響髓磷脂功能，引起神經功能逐漸喪失之超過50種類型腦白質失養症。在一些實施例中，腦白質失養症包含成年發作型體染色體顯性腦白質失養症(ADLD)、艾卡迪-古蒂埃症候群(Aicardi-Goutieres syndrome)、亞歷山大氏病、伴有皮質下梗死及腦白質病之腦體染色體顯性動脈病(CADASIL)、卡納萬氏病、伴有皮質下梗死及腦白質病之腦體染色體隱性動脈病(CARASIL)、腦腱性黃色瘤症、兒童共濟失調、腦髓鞘形成不良(CACH)/消融性白質病(VWMD)、法布立病(Fabry disease)、岩藻糖沈積症、GM1神經節苷脂貯積病、克拉培氏病、L-2-羥基戊二酸尿症、伴皮質下囊腫之巨腦性腦白質病、異染性腦白質失養症、多種硫酸酯酶缺乏症、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Pol III相關腦白質失養症、雷夫蘇姆氏病、薩拉氏病(Salla disease) (游離唾液酸貯積病)、肖格倫-拉爾森症候群(Sjogren-Larsson syndrome)、X性聯腎上腺腦白質失養症或澤爾韋格症候群譜系障礙(Zellweger syndrome spectrum disorder)。
本發明進一步提供治療、減少、改善患有腦白質失養症之個體之腦白質失養症(例如，卡納萬氏病)之症狀、減緩其進展或預防其之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物，藉此治療、減少、改善個體之腦白質失養症(例如，卡納萬氏病)之症狀、減緩其進展或預防其。腦白質失養症之症狀之非限制性實例包括以下中之一或多者的問題：平衡、呼吸、認知(學習、思考、記憶)、進食及吞咽、聽覺、運動、平衡及協調、言語及視力。
在一些實施例中，腦白質失養症為卡納萬氏病。本發明提供治療患有卡納萬氏病之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物，藉此治療個體之卡納萬氏病。在一些實施例中，方法進一步包含在投與rAAV載體之前，挑選患有卡納萬氏病之個體。本發明進一步提供治療、減少、改善患有卡納萬氏病之個體之卡納萬氏病之症狀、減緩其進展或預防其之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物，藉此治療、減少、改善個體之卡納萬氏病之症狀、減緩其進展或預防其。卡納萬氏病之症狀之非限制性實例可包括以下中之一或多者：缺少運動發展；餵養困難；異常肌肉張力(無力或僵硬)；異常大的控制不良之頭部；癱瘓、失明；或聽力損失。在一些實施例中，卡納萬氏病之症狀為頭部控制不良、大頭畸形(異常大的頭部)、低張症(肌肉張力減少)、冷漠(無反應)、嗜睡、易怒、咽下困難(吞咽困難)、餵養困難、達到發育里程碑延遲、未能獨立行走、精神運動退化(能力及協調逐漸喪失)、智力遲鈍、智能障礙、癲癇、睡眠紊亂、鼻腔反流、有時與嘔吐相關之反流、視神經退化、視神經萎縮、視覺反應性降低、聽力損失、痙攣、去大腦僵直、癱瘓或尿液中NAA增加。
在一些實施例中，方法進一步包含在投與rAAV載體之前，挑選患有腦白質失養症之個體。在一些實施例中，即使個體不具有疾病之一或多種症狀，個體亦可經篩選及鑑別或診斷為患有腦白質失養症(例如藉由基因或生理學測試)。在其他實施例中，個體具有腦白質失養症之一或多種症狀。在某些實施例中，個體在與腦白質失養症(諸如卡納萬氏病)相關聯之基因中具有突變。在一些實施例中，個體在控制天冬醯轉移酶(ASPA)之表現及/或功能的基因(諸如編碼ASPA之基因)中具有功能喪失型突變。在一些實施例中，基於產前血液測試，個體經診斷患有卡納萬氏病，該測試篩選ASPA含量及/或編碼ASPA之基因中之突變。
在一些實施例中，方法包含與以下相比，降低自個體獲得之生物樣品中N-乙醯天冬胺酸(NAA)之含量：(a)在投與本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物之前，個體之生物樣品中之NAA含量；及/或(b)對照個體之生物樣品中之NAA含量，其中對照個體患有腦白質失養症(諸如卡納萬氏病)且不投與本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物。在一些實施例中，方法包含與以下相比，使自個體獲得之生物樣品中N-乙醯天冬胺酸(NAA)之含量降低至少約2%(例如約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%，包括位於其間之所有值及子範圍)：(a)在投與本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物之前，個體之生物樣品中之NAA含量；及/或(b)對照個體之生物樣品中之NAA含量，其中對照個體患有腦白質失養症(諸如卡納萬氏病)且不投與本文所述之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物。在一些實施例中，生物樣品為血液、尿液、周邊組織、CNS體液或CNS組織。
在一些實施例中，已確定個體中存在包含從糖酵解作用轉變成β-氧化作用的代謝失衡。在一些實施例中，方法進一步包含藉由評估一或多種糖酵解作用及/或β-氧化作用因子之含量來偵測代謝失衡。在一些實施例中，使用自個體獲得之中樞神經系統(CNS)體液評估一或多種糖酵解作用及/或β-氧化作用因子之含量。在一些實施例中，方法進一步包含：(a)自個體獲得CNS體液；(b)偵測CNS體液中經增加之β-氧化作用；及(c)基於(b)中之偵測，向個體投與rAAV。在一些實施例中，方法進一步包含：(a)量測自個體獲得之生物樣品之代謝概況；及(b)基於該代謝概況鑑別包含從糖酵解作用轉變成β-氧化作用的代謝失衡。在一些實施例中，量測代謝概況包含使用液相層析(LC)、質譜分析(MS)、液相層析/質譜分析(LC/MS)或超高效液相層析-串聯質譜分析(UPLC-MS/MS)分析生物樣品。在一些實施例中，生物樣品包含CNS組織或腦脊髓液(CSF)。在一些實施例中，CNS組織為腦組織。在一些實施例中，代謝概況包含選自由以下組成之群之第一生物標記物的含量：葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、3-磷酸甘油酸、丙酮酸鹽、乳酸鹽及磷酸烯醇丙酮酸鹽。在一些實施例中，代謝概況包含選自由以下組成之群之第二生物標記物的含量：肉鹼、丙二醯肉鹼、肉豆蔻醯肉鹼、棕櫚醯肉鹼、丙二醯肉鹼及β-羥基丁酸鹽。
在一些實施例中，包含編碼ASPA之核酸分子之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物全身性地投與個體。在一些實施例中，包含編碼ASPA之核酸分子之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物靜脈內投與個體；經由開放手術或腹腔鏡術直接注射；經由導管插入術注射至動脈或靜脈中。在本文所述之治療方法中之任一者中，本文所揭示的包含編碼ASPA之核酸分子之rAAV粒子或包含該粒子之醫藥組合物可使用靜脈內輸注投與個體。
本發明進一步考慮本文所述之醫藥劑(例如rAAV或包含rAAV之醫藥組合物)之用途，其用於製造供治療個體之特徵為ASPA之功能障礙或缺乏的病症或疾病用之藥劑。本發明亦包括本文所述之醫藥劑(例如rAAV或包含rAAV之醫藥組合物)之用途，其用於治療個體之特徵為ASPA之功能障礙或缺乏的病症或疾病。
組合物可以約50微升(µL)至約1 mL之體積遞送，包括該範圍內之所有數值，視待治療之區域的尺寸、所用病毒力價、投藥途徑及該方法之所需作用而定。在一些實施例中，體積為約50 µL。在另一實施例中，體積為約70 µL。在另一實施例中，體積為約100 µL。在另一實施例中，體積為約125 µL。在另一實施例中，體積為約150 µL。在另一實施例中，體積為約175 µL。在又一實施例中，體積為約200 µL。在另一實施例中，體積為約250 µL。在另一實施例中，體積為約300 µL。在另一實施例中，體積為約450 µL。在另一實施例中，體積為約500 µL。在另一實施例中，體積為約600 µL。在另一實施例中，體積為約750 µL。在另一實施例中，體積為約850 µL。在另一實施例中，體積為約1000 µL。
在一些實施例中，利用最低有效濃度之病毒以降低非所需作用(諸如毒性或不良免疫反應)之風險。在此等範圍內之其他劑量可由主治醫師考慮所治療個體(例如人類)之身體狀態、個體之年齡、特定ASPA缺乏病症及病症(若進展)發展之程度來選擇。
在一些實施例中，包含編碼ASPA之核酸序列之rAAV載體或rAAV粒子以在約10 12至約10 16vg/kg個體體重、諸如約10 13vg/kg至約10 15vg/kg個體體重範圍內之劑量投與個體。在一些實施例中，包含編碼ASPA之核酸序列之rAAV載體或rAAV粒子以在約10 14vg/kg至約5×10 14vg/kg範圍內之劑量投與個體。在一些實施例中，包含編碼ASPA之核酸序列之rAAV載體或rAAV粒子以約1.32×10 14vg/kg之劑量投與個體。在一些實施例中，包含編碼ASPA之核酸序列之rAAV載體或rAAV粒子以約3×10 14vg/kg之劑量投與個體。
在一些實施例中，治療有效量在約10 14vg/kg至約5×10 14vg/kg，例如約1.1×10 14vg/kg、約1.2×10 14vg/kg、約1.3×10 14vg/kg、約1.4×10 14vg/kg、約1.5×10 14vg/kg、約2×10 14vg/kg、約2.5×10 14vg/kg、約3×10 14vg/kg、約3.5×10 14vg/kg、約4×10 14vg/kg、約4.5×10 14vg/kg或約5×10 14vg/kg範圍內，包括位於其間之所有值及子範圍。在一些實施例中，治療有效量為約1.32×10 14vg/kg。在一些實施例中，治療有效量為約3×10 14vg/kg。在一些實施例中，治療有效量在約1.32×10 14vg/kg至約3×10 14vg/kg範圍內。
在一些實施例中，向個體投與單次劑量的本文所揭示之rAAV載體、rAAV粒子或組合物。在一些實施例中，向個體投與超過一次劑量的本文所揭示之rAAV載體、rAAV粒子或組合物，例如兩次、三次、四次或五次劑量。在一些實施例中，經由靜脈內輸注向個體投與單次劑量的本文所揭示之rAAV載體、rAAV粒子或組合物。
本文所揭示之組合物可以任何頻率向個體投與。在一些實施例中，組合物可一天一次或一天超過一次投與個體。在一些實施例中，組合物可一天投與個體兩次、三次、四次、五次、六次、7次、8次、9次或10次。在一些實施例中，組合物可每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天或每六天向個體投與。在一些實施例中，組合物可每週、每兩週或每三週投與個體。在一些實施例中，組合物可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個月投與個體。在一些實施例中，組合物可每年投與個體。在一些實施例中，組合物可每1、2、3、4、5、10、15或20年投與個體。在一特定實施例中，組合物可在個體壽命期間單次投與個體。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中之任一者進一步包含投與治療有效量之免疫抑制劑。在一些實施例中，方法包含向個體投與治療有效量之本文揭示之rAAV或組合物，及治療有效量之免疫抑制劑。本發明提供治療方法，其向個體投與治療有效量之本文所揭示之rAAV或組合物及治療有效量之免疫抑制劑。
在一些實施例中，免疫抑制劑在投與rAAV載體之前、與其同時及/或在其之後投與。在一些實施例中，免疫抑制劑在投與rAAV載體之前投與。在一些實施例中，免疫抑制劑在投與rAAV載體之前至少12小時投與。在一些實施例中，免疫抑制劑在投與rAAV載體之前約2天投與。
在一些實施例中，免疫抑制劑為非糖皮質激素免疫抑制劑。在一些實施例中，免疫抑制劑為鈣調神經磷酸酶抑制劑。在一些實施例中，免疫抑制劑為環孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、依維莫司(everolimus)、佐他莫司(zotarolimus)或其任何組合。在一些實施例中，免疫抑制劑為他克莫司。免疫抑制劑之其他非限制性實例包括烷基化劑，諸如氮芥(環磷醯胺)、亞硝基脲、鉑化合物、葉酸類似物(諸如甲胺喋呤(methotrexate))、嘌呤類似物(諸如硫唑嘌呤(azathioprine)及巰基嘌呤(mercaptopurine))、嘧啶類似物(諸如氟尿嘧啶(fluorouracil))、蛋白質合成抑制劑、細胞毒性抗體(諸如放線菌素D(dactinomycin))、蒽環黴素(anthracycline)、絲裂黴素C (mitomycin C)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)、抑制T淋巴球之多株抗體、針對IL-2受體之單株抗體(諸如巴利昔單抗(basiliximab)或達利珠單抗(daclizumab))、抗CD3單株抗體(諸如莫羅單抗(muromonab))、類鴉片、TNF-α結合蛋白(諸如英利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercept)或阿達木單抗(adalimumab))、黴酚酸酯、芬戈莫德(fingolimod)及多球殼菌素(myriocin)。生物免疫抑制劑之其他實例包括(但不限於)單株抗體，諸如阻斷共刺激路徑之單株抗體(例如，針對CTLA4、ICOS、CD80、OX40或其他目標之適當抗體)、靶向免疫刺激分子(例如，細胞介素)之干擾RNA (例如，siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA等)及蛋白質(例如，蛋白酶體抑制劑)。
在一些實施例中，免疫抑制劑經口投與。在一些實施例中，免疫抑制劑之治療有效量在約0.005毫克/公斤(mg/kg)至約0.1 mg/kg範圍內，例如約0.01 mg/kg、約0.015 mg/kg、約0.02 mg/kg、約0.025 mg/kg、約0.03 mg/kg、約0.035 mg/kg、約0.04 mg/kg、約0.045 mg/kg、約0.05 mg/kg、約0.06 mg/kg、約0.07 mg/kg、約0.08 mg/kg、約0.09 mg/kg或約0.1 mg/kg，包括位於其間之所有值及子範圍。在一些實施例中，免疫抑制劑之治療有效量在約0.01 mg/kg至約0.05 mg/kg範圍內。在一些實施例中，免疫抑制劑之治療有效量為約0.025 mg/kg。在一些實施例中，免疫抑制劑之治療有效量每天投與兩次。
在一些實施例中，方法包含向個體投與治療有效量之類固醇。在一些實施例中，類固醇為鹽皮質激素。在一些實施例中，類固醇為糖皮質激素。在一些實施例中，糖皮質激素為普賴蘇穠(prednisolone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、皮質醇(cortisol)、可體松(cortisone)、普賴松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍氯米松(beclomethasone)、氟可體松(fludrocortisone)、去氧皮質酮(DOCA)、醛固酮或其任何組合。在一些實施例中，類固醇為氫化可體松。在一些實施例中，類固醇在投與rAAV載體之前、與之同時及/或在其之後投與。在一些實施例中，在投與rAAV載體之前向個體投與之類固醇的治療有效量高於在投與rAAV之後向個體投與之類固醇的治療有效量。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中之任一者進一步包含投與治療有效量之抗組織胺。在一些實施例中，抗組織胺在投與rAAV載體之前、與之同時及/或在其之後投與。在一些實施例中，抗組織胺為苯海拉明(diphenhydramine)、羥嗪(hydroxyzine)、氯菲安明(chlorpheniramine)或其任何組合。
在一些實施例中，方法進一步包含：(a)向該個體投與小分子代謝調節劑；(b)向該個體指定膳食干預，其中該膳食干預促進該個體中之糖酵解作用及/或減少β-氧化作用；及/或(c)向該個體投與免疫抑制劑。
在一些實施例中，在投與如本文所述之載體之後，尿液、腦脊髓液(CSF)及/或腦組織中之N-乙醯天冬胺酸(NAA)含量降低。在一些實施例中，在投與之後，尿液中之NAA含量降低。在一些實施例中，尿液中之NAA含量降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，尿液中之NAA含量相對於治療前含量保持降低至少6個月、9個月、12個月、18個月、24個月或更長時間。在一些實施例中，在投與之後，CSF中之NAA含量降低。在一些實施例中，CSF中之NAA含量降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，CSF中之NAA含量保持相對於治療前含量降低至少6個月、9個月、12個月、18個月、24個月或更長時間。在一些實施例中，在投與之後，腦組織中之NAA含量降低。在一些實施例中，腦組織中之NAA含量降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，腦組織中之NAA含量保持相對於治療前含量降低至少6個月、9個月、12個月、18個月、24個月或更長時間。
在一些實施例中，在投與如本文所述之載體後，可使用磁共振成像(MRI)觀測到新的髓鞘形成。
實例 實例 1 ： 卡納萬氏病之 BBP-812 基因療法載體
BBP-812活性物質為含有人類 ASPA轉殖基因之自互補表現卡匣的非複製型rAAV血清型9 (AAV9)載體。 圖 1中描繪scAAV9-CB6-h ASPAopt載體設計。其含有在CB6啟動子，包括細胞巨大病毒即刻早期強化子控制下，側接5'及3'末端重複序列之密碼子優化人類天冬醯轉移酶轉殖基因。在5'反向末端重複序列中移除Rep切口位點，藉此建立自互補AAV基因體。
BBP-812調配為磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.0、5%重量/體積(w/v)山梨糖醇、0.001% w/v泊洛沙姆188中之無菌注射溶液。其以2.5 mL之填充體積供應於5毫升(mL)無熱原質小瓶中且用無乳膠橡膠塞及鋁易拉密封件密封。調配產物之載體濃度介於1.8 × 10 13與5.0 × 10 13vg/mL之間。小瓶冷凍儲存在≤-60℃下直至即用。
BBP-812藥品(DP)為濃度為1.8 × 10 13至4.2 × 10 13vg/mL之非複製型重組AAV9載體的單劑量、無防腐劑、無菌溶液、靜脈內(IV)注射液。BBP-812 DP溶液含有137 mM氯化鈉、8.1 mM磷酸氫二鈉、1.47 mM磷酸二氫鉀、2.7 mM氯化鉀、5% w/v山梨糖醇、0.001% w/v泊洛沙姆188及注射用水。將BBP-812 DP填充至5 mL Crystal Zenith® (CZ，環烯烴聚合物)小瓶中，其標稱填充體積為2.5 mL，且儲存在≤60℃下。
該研究評估編碼ASPA之AAV9載體之2種劑量水平對患有卡納萬氏病之小於或等於30月齡兒科患者的安全性、耐受性藥效學(PD)活性及臨床活性( 圖 1中所示)。進行給藥直至且包括在參與者變成31月齡之前的日期。在前6名參與者中BBP-812之安全性、耐受性、PD活性及初步臨床活性之評估告知劑量選擇及登記擴增至在所選擇劑量下多達共15名參與者。在用BBP-812進行治療之日期之後追蹤所有參與者至少5年。
BBP-812以1.32×10 14載體基因體(vg)/公斤(kg)體重之劑量給與至隊列1，且以3.0×10 14vg/kg體重之劑量投與隊列2。在此研究中不投與安慰劑。登記至多18名參與者進行研究，且以所選擇劑量治療樣品大小為15之參與者。
關於藥效學分析，量測BBP-812投與尿液及CNS組織之後N-乙醯天冬胺酸(NAA)含量之變化。對於臨床變化，運動、認知及語言發展及功能將在投與BBP-812之後，例如使用腦成像來評估。 實例 2 ： BBP-812 之非臨床研究
藉由非臨床研究證明BBP-812治療卡納萬氏病之治療潛能及安全性，該等非臨床研究檢查在卡納萬氏病之 Aspa-/-小鼠模型中之功效及在野生型小鼠及非人類靈長類動物中之安全性評估。對於下文所述之功效研究，培育異型接合 Aspa+/-小鼠以產生同型接合幼鼠。使用基於聚合酶鏈式反應(PCR)之分析，利用由尾巴組織樣品製備之基因體去氧核糖核酸(gDNA)模板，對出生之後不久(PND0/1)之動物進行基因分型。對於功效研究，PND1經由IV注射至面靜脈中來處理所有小鼠。用BBP-812進行之非臨床安全性及藥理學研究概述於表2中。在以下部分中論述研究之主要結果。 表 2. 非臨床安全性及藥理學研究
研究類型 / 研究數目 GLP 狀態 物種、品系 ( 每組動物之數目、性別及年齡 ) 載體來源 持續時間 研究結果
劑量範圍發現研究 非GLP Aspa-/-小鼠    N = 41    PND1 UMass載體中心 365天 正常腦NAA含量及運動功能之劑量相依性恢復
生物分佈 非GLP WT小鼠 N = 120    6-8週齡 UMass載體中心 28天 腦中之載體基因體及轉殖基因mRNA的劑量依賴性增加
載體可比較性/等效性研究 非GLP WT小鼠    N = 30    6-8週齡 CMO Catalent 28天 與UMass生產之載體下觀測到的轉導含量類似
生物分佈/安全性 非GLP NHP (食蟹獼猴(cynomolgus monkeys))    N = 12    2-2.5歲 UMass載體中心 21及56天 藥物依賴性生物分佈至腦及周邊組織，未觀測到安全性問題
縮寫：CMO：合同製造組織；GLP：優良實驗室實踐；mRNA：信使核糖核酸；NAA：N-乙醯天冬胺酸；NHP：非人類靈長類動物；PND：出生後天數；UMass：University of Massachusetts；WT：野生型 卡納萬氏病小鼠模型
卡納萬氏病之 Aspa-/-小鼠模型用於檢查BBP-812之安全性及功效。 Aspa-/-小鼠為卡納萬氏病之第一動物模型，其經研發且模擬卡納萬氏病患者之臨床表型，該等臨床表型呈現共濟失調、失衡、肌無力、發育不良、顱面異常及生命第一個月內之認知障礙。無干預下， Aspa-/-小鼠在約PND28死亡(Ahmed 2013)。
雖然已報導卡納萬氏病之若干其他小鼠模型，但其呈現不太嚴重之表型(Carpinelli 2014, Mersmann 2011, Traka 2008)。值得注意地，此等其他模型均展現正常壽命，且直至數週齡才出現可量測之運動功能缺陷。此表型暗示卡納萬氏病之更溫和形式(Janson 2006a, Mendes 2017, Yalcinkaya 2005)。
對於PoC研究，對於初始實驗，在PND 0與20之間，且對於最小有效劑量(MED)之測定，在PND 1，注射 Aspa-/-小鼠。根據文獻，PND 0至PND 20範圍內小鼠之神經發展相當於35週妊娠至約2.5歲人類之神經元發展(Dutta 2016)。因此，PoC研究中之治療時序支持BBP-812用於1/2期兒科臨床試驗(CVN 102)中年齡≤30月齡之兒科患者中。 產後第 1 天 Aspa-/- 小鼠中之劑量範圍發現功效研究
開始進行劑量範圍發現研究(Gessler 2017)以在動物疾病模型中建立MED且確定所提出之1/2期兒科臨床試驗CVN 102之起始劑量。用於確定MED之關鍵參數包括存活率及體重增加、CNS NAA含量降低、運動功能改善及腦組織病理學改善。亦評估腦內之生物分佈。 研究設計：隨機化及劑量調整
研究中評估之劑量為2.6 × 10 13、8.8 × 10 13及2.6 × 10 14vg/kg。最高劑量係基於早期一代載體之先前研究(Ahmed 2013)。中間劑量及低劑量表示載體降低3倍及10倍。小鼠在PND 1時接受單次IV注射至面靜脈中。
對於此等研究，動物在2014年3月與2016年1月之間出生。藉由對一窩中之所有動物進行類似給藥來隨機分組。一窩中之幼鼠僅25%為 Aspa-/-；因此在同一窩中測試多個劑量並非始終可行。初始給藥包括最高劑量、媒劑(0.9% NaCl)處理及未處理之動物。當產生功效資料時，測試較低劑量，因為額外幼仔出生以建立最小有效劑量。然而，在整個研究持續期間，隨機幼仔接受最高劑量或媒劑或保持未處理以證明隨時間推移及在載體批次之間結果的一致性。表3中列出用於BBP-812之開發及MED建立的動物之完整清單。 表 3. 用於 BBP-812 測試中之動物
處理 / 劑量 (vg/kg) 小鼠基因型 載體 經處理之動物數目 持續時間
2.6 × 10 14 Aspa-/- BBP-812 32 長達一年
8.8 × 10 13 Aspa-/- BBP-812 42 長達一年
2.6 × 10 13 Aspa-/- BBP-812 8 28天
0.9%生理食鹽水 Aspa-/- BBP-812 12 28天
未處理 Aspa-/- N/A 25 28天
2.6 × 10 14 野生型 BBP-812 12 長達一年
未處理 野生型 N/A 61 長達一年
研究設計 ： 在研究中量測之功效參數
存活率及體重增加：每日監測存活率且自PND 1至PND 32，每隔一天量測體重，接著自PND 42 (6週)至PND 364 (1年)每隔一週量測體重。
CNS 及周邊 NAA 含量之降低：藉由磁共振光譜法(MRS)及質譜分析量測CNS及周邊NAA含量之降低。
運動功能及空間記憶測試：針對運動功能及持久性使用加速旋轉桿，針對前庭功能及共濟失調使用平衡樑，且針對握力使用倒置篩網來評估小鼠運動效能。除旋轉桿(旋轉桿系列8, IITC Life Science, Woodland Hills, CA)以外，藉由University of Massachusetts Medical School Machine Shop建構該設備。對於各運動功能測試，注射小鼠且獨立地測試。此等實驗之對照包括未處理之 Aspa-/-小鼠、用0.9%生理食鹽水處理之 Aspa-/-小鼠及野生型(WT)小鼠。評估者對動物接受之處理不知情且在研究中針對所有評估，在＞2年時段內測試動物。
加速旋轉桿：在測試日之前2天訓練小鼠，每次進行3次操作。在測試當天，將小鼠置放於旋轉桿上以適應新環境1分鐘。各小鼠測試3次且最佳值用於分析。加速度及時序設定為5分鐘內4至40 rpm。
平衡樑：將動物置於水平木製平衡樑(1.5×100 cm)中間，下面有襯墊以保護可能自橫樑跌落之小鼠。記錄下降之延遲，各試驗具有5分鐘時間限制。為提高此測試之嚴格性，將切斷時間自先前使用之3分鐘增加至5分鐘。對動物進行三次測試且對最佳值進行計數。
倒置篩網：將小鼠置放於水平位置之柵格(30平方公分(cm²)，具有25平方毫米(mm²)孔)中心，且使其適應新環境1分鐘。柵格在15秒內緩慢轉動至125度，使得小鼠倒掛。量測至落下之時間。如先前公開，PND 27測試之截止值為3分鐘。在所有其他時間點，截止值為5分鐘以提高測試嚴格性。對各動物進行三次測試且對最佳值進行計數。
藉由蘇木精及伊紅(H&E)染色評估腦組織病理學。
藉由微滴式數位聚合酶鏈式反應(ddPCR)確定生物分佈。 研究結果：存活率及體重增加
與未處理之 Aspa-/-動物相比時，BBP-812處理提高存活率且促進體重增加( 圖 2)。未處理之動物(紅線)在約2週齡開始體重減輕且在4週齡死亡。經處理動物增加之體重與野生型動物相當且存活至實驗結束。
在研究期間未報導歸因於處理之計劃外死亡，如表4中所概述。死亡原因包括咬合不良(n=2)及殺嬰(n=5)。鑒於此等事件之性質，未進行其他病理學或組織病理學評估。 表 4. 計劃外死亡清單
ID 性別 DOB 組 死亡原因 天
97a-8 F 14-4-23 BBP-812 - 高劑量 咬合不良 56
135b-4 M 14-7-16 BBP-812 - 高劑量 咬合不良 70
179a-2 F 14-10-7 BBP-812 - 高劑量 均被母鼠殺死 1
179a-7 F 14-10-7 BBP-812 - 高劑量 均被母鼠殺死 1
179b-6 F 14-10-7 BBP-812 - 高劑量 均被母鼠殺死 1
179a-1 F 14-10-7 UT 均被母鼠殺死 1
179a-5 F 14-10-7 UT 均被母鼠殺死 1
縮寫：DOB：出生日期；F：雌性；M：雄性；UT：未處理 研究結果： CNS NAA 含量之降低
使用MRS分析，監測接受BBP-812之動物之CNS NAA含量( 圖 3及表5)。接受8.8×10 13vg/kg及2.6×10 14vg/kg劑量之BBP-812之動物的CNS NAA減少，且2.6×10 14vg/kg處理組在統計學上優於8.8×10 13vg/kg組。與未處理之 Aspa-/-動物相比，在較低2.6×10 13vg/kg下未觀測到NAA變化。 表 5. 未處理及經 BBP-812 處理之小鼠之 CNS 中的 NAA/ 肌酸比率
動物 ID 動物品系 BBP-812 劑量 (vg/kg) tNAA/tCr 組平均值
204b_1 WT - 0.971 0.841
204a-10 WT - 0.846
208b-4 WT - 0.706
220a-3 Aspa -/- - 2.294 2.033
204a-6 Aspa -/- - 1.883
211a_5 Aspa -/- - 1.922
259N_R Aspa -/- 2.6×10 13 2.344 2.359
393b_5_O Aspa -/- 2.6×10 13 2.25
441a_1_O Aspa -/- 2.6×10 13 2.484
390a_4_O Aspa -/- 8.8×10 13 1.649 1.659
392a_4_O Aspa -/- 8.8×10 13 1.621
392a_5_O Aspa -/- 8.8×10 13 1.706
213b-7 Aspa -/- 2.6×10 14 0.764 0.680
228a_3 Aspa -/- 2.6×10 14 0.52
227a_4 Aspa -/- 2.6×10 14 0.755
縮寫：tCr：總肌酸；tNAA：總N-乙醯天冬胺酸；vg/kg：載體基因體/公斤；WT：上表中之野生型個體資料對應於來自 圖 4之資料。 功能及空間記憶測試
測試小鼠在三個運動功能評估方面改善。在PND 27，接受2.6×10 13vg/kg之動物顯示與未處理之 Aspa-/-小鼠相比有所改善，但效能不如野生型動物佳。在所有3個評估中在PND 27及PND 90用8.8×10 13vg/kg或2.6×10 14vg/kg處理之小鼠中之運動功能測試(旋轉桿、平衡樑及倒置篩網)與野生型小鼠相當。PND 180及PND 360之結果顯示用2.6×10 14vg/kg BBP-812維持運動功能救援。接受8.8×10 13vg/kg之小鼠在PND 180展現運動功能有限改善且在最終時間點未展現益處( 圖 4)。 研究結果：腦 組織病理學
藉由H&E染色評估接受BBP-812之動物中之腦組織病理學且與野生型及未處理之 Aspa-/-小鼠相比( 圖 5A及 圖 5B)。接受2.6×10 14vg/kg劑量之動物之病理學與野生型動物不可區分。接受8.8×10 13vg/kg劑量之動物顯示顯著改善，且空泡形成減少，但仍存在一些疾病(請注意腦橋(Po)、小腦(Ce)及紋狀體(St)作為實例)。與未處理之 Aspa-/-小鼠相比時，用2.6×10 13vg/kg處理之小鼠展示極少(若存在)改善。 研究結果：生物分佈
在來自腦不同區域之樣品中藉由ddPCR測定每個二倍體細胞之載體基因體(vg/細胞)( 圖 6)。在給藥後1年偵測到0.5至1.5 vg/細胞，表明IV投與BBP-812可進入所測試之所有腦區且存留於其中。
作為功效之最終測定，藉由H&E染色評估接受BBP-812之 Aspa-/-小鼠中之腦組織病理學且與野生型及未處理之 Aspa-/-小鼠相比( 圖 7A及 圖 7B)。接受2.6×10 14vg/kg劑量之 Aspa-/-動物之組織病理學與野生型動物不可區分。與未處理之對照相比，接受8.8×10 13vg/kg劑量之動物顯示顯著改善，且空泡形成減少，但仍存在一些疾病特徵(請注意腦橋(Po)、小腦(Ce)及紋狀體(St)作為實例)。與未處理之小鼠相比時，用2.6×10 13vg/kg處理之 Aspa-/-小鼠展示極少(若存在)改善。
來自此等分析之結果證明疾病表型之完全恢復可用2.6×10 14vg/kg劑量實現，且低10倍之劑量提供運動功能之最小益處，但未提供NAA代謝或組織病理學之益處。8.8×10 13vg/kg之中間劑量足以顯著改善所有療效終點，但不如最高劑量那麼好。基於此等發現，BBP-812之MED為大約8.8×10 13vg/kg。 在非人類靈長類動物中之安全性及生物分佈 研究目的為評估BBP-812在CNS及周邊組織中之安全性(臨床觀測結果、臨床化學[血清、尿液及CSF]、血液學、免疫反應及組織病理學)及生物分佈。該研究比較3個投與途徑：IV至隱靜脈中，鞘內(IT)至腰椎蛛膜下腔中，及腦室內(ICV)至左側腦室中。在給藥後第3週及第8週處死動物。表6中概述總體研究設計。 表 6. 食蟹獼猴中之 8 週安全性及生物分佈研究之設計
組 處理 ROA 劑量 1,2,3,4 雄性 / 雌性 屍檢時間間隔 ( 雄性 / 雌性 )
3 週 ( 第 22 天 ) 8 週 ( 第 57 天 )
1 BBP-812 IV 3.14×10 13vg/kg 1 / 2 0 / 0 1 / 2
2 BBP-812 IV 1.05×10 14vg/kg 1 / 2 0 / 0 1 / 2
3 BBP-812 IV 3.14×10 14vg/kg 2 / 4 1 / 2 1 / 2
4 媒劑 ICV 0 1 / 1 0 / 0 1 / 1
5 BBP-812 ICV 3.59×10 11總vg 1 / 2 0 / 0 1 / 2
6 BBP-812 ICV 1.79×10 12總vg 1 / 2 0 / 0 1 / 2
7 BBP-812 ICV 8.98×10 12總vg 2 / 4 1 / 2 1 / 2
8 Vehicle IT 0 1 / 1 0 / 0 1 / 1
9 BBP-812 IT 8.98×10 12總vg 2 / 4 1 / 2 1 / 2
10 BBP-812 IT 1.79×10 12總vg 1 / 2 0 / 0 1 / 2
11 AAV9-CB6-食蟹獼猴 ASPA 5 IV 1.69-1.75×10 14vg/kg 2 / 2 1 / 1 1 / 1
縮寫：ICV：腦室內；IT：鞘內；IV：靜脈內；NHP：非人類靈長類動物；ROA：投與途徑 1. IV第1組至第3組及第11組以vg/kg給出BBP-812劑量 2. ICV第5組至第7組以總vg/腦給出BBP-812劑量 3. IT第9組及第10組以總vg/鞘內空間給出BBP-812劑量 4. 基於合格ddPCR分析調整BBP-812劑量 5. 接受NHP ASPA之對照動物 研究設計：劑量調整
基於卡納萬氏病之 Aspa-/-小鼠模型中之PoC研究中鑑定之最小有效劑量選擇劑量。IV投與途徑直接與IT及ICV遞送進行比較，以確定在大的動物模型中哪種途徑有助於優良整體CNS生物分佈。 研究設計：結果量測
在整個研究期間常規監測動物，每天臨床觀測一次。在第22天及第57天進行神經評估。在給藥後第-1、3、8、22、36及57天收集血液用於臨床病理學及血液學。在給藥之前及在血清及CSF中給藥後第22天及第57天測定針對AAV9衣殼及ASPA蛋白之抗體反應。使用轉殖基因特異性TaqMan分析，藉由微滴式數位聚合酶鏈式反應(ddPCR)量測，評估生物分佈為每個二倍體細胞之載體基因體。組織病理學包括所有組織之H&E染色且CNS進行針對離子化鈣結合適配分子1 (IBA-1)及膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)之額外免疫染色。每隻動物研究最少八個背根神經節及相關脊神經根。 研究結果：生物分佈 在第1組、第2組、第3組、第7組及第9組中之動物之樣品中評估BBP-812之生物分佈及h ASPAOpt轉殖基因之表現。由3 mm×3 mm組織沖孔評估腦中之表現。自腦收集及分析(加粗)之所有沖孔的清單可見於 圖 8中。所分析之組織，包括脊髓(胸、腰及頸)及周邊器官之完整清單展示於表7中。 表 7. 針對 BBP-812 生物分佈分析之組織
組織 第 22 天 第 57 天
深層額葉皮質 X X
尾核 X X
殼核 X X
丘腦 X X
海馬回 X X
顳葉皮質 X X
中腦 X X
腦橋 X X
髓質 X X
視覺皮質 X X
胸髓 X X
腰髓 X X
頸髓 X X
肝臟 X X
心臟 X X
腎臟 X X
肺部 - X
淋巴結 - X
脾 - X
性腺 - X
經靜脈內處理之動物呈現CNS及周邊組織中載體基因體之劑量依賴性增加。在高劑量組中，在第57天屍檢時，在腦沖孔中，載體基因體在0.26至2.16範圍內。接受IT或ICV投與BBP-812之動物與所有三種IV劑量相比在CNS中具有顯著較低含量之轉導。在最高劑量IV動物中，可在每隻動物中測試之所有腦區中偵測到載體。在IT及ICV給藥組中，分別在5/30及13/30腦沖孔中未偵測到載體。對於IV組，周邊組織中載體基因體之偵測亦為劑量依賴性的，其中在肝臟及心臟中偵測到最高含量。接受IT及ICV投與BBP-812之動物在周邊組織中具有可偵測之基因體，但含量遠低於藉由IV途徑給藥之動物 ( 圖 9A-9E)。觀測到靜脈內給藥遠優於IT或ICV滲透至深皮層白質中，且認為所有其他腦區在卡納萬氏病中最相關。 研究結果 ： 抗 AAV9 及抗 ASPA 抗體之偵測
所有動物在隨機分組及給藥之前對針對AAV9之中和抗體進行陰性篩選。在給藥之前及之後，使用合格酶聯免疫吸附分析(ELISA)量測第1、2、3、7及9組動物中針對AAV9及ASPA之總抗體。對血清之分析包括在給藥之前及給藥後第22天及第57天收集之樣品(表8)。在給藥之前動物經測試無動物對針對AAV9之抗體呈陽性。在給藥後，11/12經IV處理之動物、5/6經IT處理之動物及經5/6經ICV處理之動物產生針對AAV9之抗體。在給藥前，高劑量IV組中之一隻動物具有針可偵測的針對ASPA之抗體。在給藥後，10/12經IV處理、1/6經IT處理及1/6經ICV處理之動物具有針對ASPA之抗體。 表 8. 血清樣品中 AAV9 及 ASPA 抗體之評估
處理組 研究前血清 第 22 天血清 第 57 天血清
AAV9 ASPA AAV9 ASPA AAV9 ASPA
IV-低 0/3 0/3 2/3 2/3 2/3 3/3
IV-中 0/3 0/3 3/3 1/3 3/3 2/3
IV-高 0/6 1/6 6/6 5/6 3/3 2/3
ICV 0/6 0/6 5/6 0/6 3/3 1/3
IT 0/6 0/6 5/6 0/6 3/3 1/3
縮寫：ICV：腦室內；IT：鞘內；IV：靜脈內 研究結果：神經檢查
在第22天及第57天，動物進行神經檢查。此包括評估整體感覺及運動功能、大腦反射及脊髓反射。在此等神經檢查期間未發現BBP-812相關變化。 研究結果 ： 臨床化學及血液學及凝血評估
血液學參數不存在確定性BBP-812相關變化，且所有組之凝血值不顯著。在高劑量IV組中血清化學之變化受限於肝酶之短暫升高。此等值在無干預下返回至正常。對於動物中之任一者，尿分析參數無顯著變化。對於經由IV途徑給藥之動物，在投與BBP-812之後CSF化學物質之變化包括降低第22天及第57天白蛋白降低。 研究結果 ： 屍檢及組織病理學評估及發現
進行徹底的組織病理學檢查。屍檢時，在大腦基質中以3 mm冠狀面切片厚度對大腦進行切割。第一切片及其後之每隔一個切片固定於10%中性緩衝福馬林中以用於組織學分析。將脊髓(頸部、胸部及腰部)切成1 cm切片，其中導管尖端定義為IT動物之零點及IV動物之胸腰接合點。第一切片及其後之每隔一個切片(奇數編號)固定於10%中性緩衝福馬林中以用於組織病理學評估。所分析組織之完整清單及關於取樣及分析之特定資訊提供於表9中。 表 9. 在 NHP 研究期間針對組織病理學收集之組織清單
組織清單
腎上腺* 股骨(具有骨髓) 淋巴結(腸系膜)* 儲精囊 腓腸神經* 尿道
主動脈 剖檢病變* 卵巢* 骨骼肌* 睪丸(具有附睾)* 膀胱
腦* 心臟* 胰臟 皮膚(具有乳腺) 胸腺 子宮
盲腸 迴腸 垂體 脊髓(頸部、胸部及腰部)* 甲狀腺癌(具有副甲狀腺) -
結腸 空腸 前列腺 脊神經根及神經節* 脛骨神經* -
十二指腸 腎臟* 直腸 脾* 氣管 -
食道 肝臟(具有膽囊)* 唾液腺 胸骨(骨骼及骨髓) 三叉神經節* -
眼睛(具有視神經) 肺(具有支氣管)* 坐骨神經(近端及遠端)* 胃 輸尿管 -
*組織係藉由微觀組織病理學評估；其他以福馬林固定之石蠟包埋儲存 研究結果：組織病理學發現
BBP-812 IV投與至多3.14×10 14vg/kg劑量後，NHP無不良的測試物品相關之微觀或功能變化。在第22天及第57天屍檢中，僅給與1.8×10 14vg/kg BBP-812 IV之2/3隻動物之肝臟(肝門浸潤及/或增加之細胞含量[庫弗細胞(Kupffer cell)])中觀測到測試物品相關之變化。此等變化通常在涉及IV投與AAV產品之研究中觀測到且不視為不良。
在6隻BBP-812處理之IV高劑量動物中之3隻中報導背根神經節(DRG)中細胞浸潤之發現，影響48個DRG中總共4個。浸潤不與神經元退化及/或壞死之任何跡象相關且與對照NHP中常規觀測到之相同發現無法區分。接受藉由IV投與之BBP-812之動物的DRG發現無不良，對功能活性無影響，且無毒理學後果。自此研究確定3.14×10 14vg/kg之未觀測到不良作用水平(NOAEL)。
在至多(且包括) 5.0×10 12總vg BBP-812之IT劑量下不存在不良測試物品相關之微觀變化。在5.0×10 12個總vg BBP-812劑量下觀測到2個模棱兩可之測試物品相關之變化。首先，3隻動物中之2隻(第22天處死)的單一背根神經節中存在輕度細胞含量增加。此不與任何神經元變化相關且不應解釋為不良。在第57天屍檢之動物中未觀測到類似變化。第二，在第22天處死時，3隻動物中之1隻中存在腹部灰質之兩側微膠質細胞增生(輕度)。此變化不與任何明顯神經元損失或退化相關，不存在於包括第57天動物之任何其他動物中，且可嚴格地歸因於駐留微神經膠質細胞之增強染色。此程度之微膠質細胞增生不視為不良。 非臨床毒理學：研究設計
在野生型C57BL/6小鼠中進行遵從GLP之安全性及生物分佈研究。此研究之實驗設計展示於表10中。三組C57BL/6小鼠在第0天經由眶後注射接受低(1×10 14vg/kg)或高(3×10 14vg/kg)劑量之BBP-812或媒劑，且監測24週。認為此等BBP-812劑量為臨床上相關的。在研究之持續時間內記錄臨床觀測結果、體重及攝食量。在給藥後4、12及24週對動物進行安樂死。收集組織，稱重且保存用於組織病理學、生物分佈分析及免疫原性。收集血液(終末收集)用於血液學、臨床化學、生物分佈及免疫原性。 表 10. C57BL/6 小鼠中 24 週安全性及生物分佈研究之設計
組編號 描述 BBP-812 劑量 (vg/kg) 每個時間點之數目 (4 、 12 及 24 週 ) 子集 終點
組織 血液
1 媒劑 NA 5M/5F 1-1 免疫原性 血液學
5M/5F 1-2 生物分佈 生物分佈 免疫原性
5M/5F 1-3 組織病理學 臨床化學
2 低 1×10 14 5M/5F 2-1 免疫原性 血液學
5M/5F 2-2 生物分佈 生物分佈 免疫原性
5M/5F 2-3 組織病理學 臨床化學
3 高 3×10 14 5M/5F 3-1 免疫原性 血液學
5M/5F 3-2 生物分佈 生物分佈 免疫原性
5M/5F 3-3 組織病理學 臨床化學
縮寫：F：雌性；M：雄性；vg/kg：載體基因體/公斤；NA：不適用；wk：週 劑量調整
基於在卡納萬氏病之 Aspa-/-小鼠模型中進行之劑量範圍發現研究選擇劑量。由於 Aspa-/-小鼠中產生之功效資料且由於當與在NHP中觀測到之IT及ICV給藥相比時，CNS分佈有所改善，故選擇IV投與途徑。進行眶後途徑以允許基於PoC研究中所用之載體濃度在小鼠中投與達成期望較高劑量所需的較大體積。GLP毒理學研究中投與之劑量支持所提出之臨床給藥方案。干預年齡亦為在校正潛在疾病病理學之後成功長期結果之關鍵因素。 至第 24 週之結果量測
每天且隨後每週動物進行臨床觀測。在給藥後第4週、第12週及第24週處死動物，接著收集周邊血液樣品用於臨床病理學及血液學。在各屍檢時免疫分析評估針對AAV9及ASPA之抗體且T細胞反應性藉由在所有時間點的針對全長AAV9及人類ASPA之肽池的酶聯免疫吸附點(ELISpot)確定。藉由用於載體基因體之定量聚合酶鏈式反應(qPCR)及用於轉殖基因RNA之反轉錄定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)評估生物分佈。收集組織之全面小組用於藉由H&E染色進行組織學檢查。 研究結果 ： 至第 24 週之臨床觀測結果 在隨機化時、在給藥前當天及在第0天、第1天、第2天及第3天給藥後、在前12週每週及在研究之其餘部分兩週一次進行詳細臨床觀測。同樣，在隨機化時、在給藥前當天及在第0天、第1天、第2天及第3天給藥後、在前12週每週及在研究之其餘部分兩週一次量測體重。在屍檢時收集終末體重。最後，在給藥當天開始前12週每週及在研究之其餘部分兩週一次監測每籠及每週之攝食量。未注意到測試物品相關之發現。 研究結果 ： 至第 24 週之血液學及臨床化學
在第4週、第12週及第24週對所有組評估血液學及臨床化學小組。不存在臨床上有意義之測試物品相關之變化。肌酸激酶及乳酸去氫酶存在劑量依賴性降低，其不與任何微觀變化相關( 圖 10A及 圖 10B)。 至第 24 週之組織病理學
所檢查之組織中不存在測試物品相關之觀測結果。 至第 24 週之抗藥物抗體反應
在第4週、第12週及第24週屍檢時收集血液樣品用於分析針對AAV9及人類ASPA之循環抗體。將血液處理成血清且樣品儲存在＜-60℃下直至分析。藉由合格ELISA量測抗體力價。
在第4週時，動物對轉殖基因無抗體反應，且接受BBP-812之所有動物均產生針對AAV9之抗體。
在 第12週及 第24週時，各時間點之1隻經媒劑處理之動物經篩選對針對AAV9之抗體呈陽性，且僅在第12週時，1隻接受BBP-812之動物對轉殖基因產生輕度抗體反應。除1個動物以外所有接受BBP-812之動物產生AAV9抗體(第12週)。資料概述展示於表11中且呈現為陽性動物數目/所測試動物數目。 表 11. 抗 AAV9 及抗 ASPA 抗體之盛行率
處理組 第 4 週 第 12 週 第 24 週
AAV9 ASPA AAV9 ASPA AAV9 ASPA
第1組(媒劑) 0/10 0/10 1/10 0/10 1/10 0/10
第2組(BBP-812，1×10 14) 10/10 0/10 9/10 0/10 10/10 0/10
第3組(BBP-812，3×10 14) 10/10 0/10 10/10 1/10 10/10 0/10
為評估對AAV9及ASPA之細胞免疫反應，在第12週及第24週屍檢，自各劑量組之動物隊列分離脾細胞。細胞用跨越整個AAV9及ASPA長度之15聚體肽池刺激，每個肽有2個胺基酸重疊。藉由ELISpot分析所測定之干擾素γ分泌量測對肽池之反應性。刀豆球蛋白A (ConA)用作陽性對照。所有測試樣品均顯示對ConA之穩固反應，該反應在培養基處理之細胞中不存在，表明細胞健康及反應性。對ASPA肽不存在反應。兩個AAV9肽池在經處理之小鼠中顯示反應，在對照組中未觀測到。觀測到之值略微高於分析之偵測極限且比ConA下觀測到之值低＞20倍( 圖 11)。 至第 24 週之生物分佈
表12中列出收集之組織。在各預定屍檢時收集組織且在液氮中快速冷凍，隨後儲存在＜-60℃下。將血液收集在K 2EDTA管中且在液氮中快速冷凍，隨後儲存在＜-60℃下。 表 12. 收集用於生物分佈分析之組織
器官 / 組織
若可利用足夠組織，則為剖檢病變/異常組織
血液
骨髓
腦
性腺(卵巢/睪丸)
心臟
腎臟
肺
肝臟
淋巴結(腸系膜)
骨骼肌(股二頭肌)
脊髓
脾
子宮
來自經媒劑處理之動物之組織中不存在可偵測之載體。來自經處理之動物之所有組織均對載體基因體及轉殖基因RNA呈陽性( 圖 12)。在肝中偵測到最高含量之載體。最高含量之轉殖基因RNA在心臟、骨胳肌及肝臟中。
歸因於所評估參數中之任一者中缺乏不良發現，在此研究條件下BBP-812之NOAEL確定為3.0×10 14vg/kg。 實例 3 ： 經由投與腺相關病毒 (AAV) ， 針對卡納萬氏病之基因療法之安全性及臨床活性的 1/2 期開放標記研究
進行經由投與基於腺相關病毒血清型9 (AAV9)之編碼人類ASPA基因之重組載體(在本文中亦稱為「BBP-812」)，用於卡納萬氏病之基因療法之安全性及臨床活性的1/2期開放標記研究。研究時間表及總體研究設計描繪於 圖 13。
該開放標記對照研究經設計以評估向≤30月齡之患有卡納萬氏病之兒科參與者投與2次計劃劑量之BBP-812的安全性、耐受性、藥效學(PD)活性及臨床活性。在前6名參與者中BBP-812之安全性、耐受性、PD活性及初步臨床活性之評估將告知劑量選擇及登記擴增至在所選擇劑量下多達共15名參與者。在用BBP-812進行治療之日期之後將追蹤所有參與者至少5年。 篩選期
在患者父母及/或法定監護人提供書面同意書之後，患者變成研究參與者且視為入選該研究。在篩選期期間，將評估研究參與者之治療合格性。對於所有參與者，標準篩選期將在第一次篩選評估時開始。篩選期至多42天，隨後用BBP-812 (第0天)治療。必要時，歸因於短暫疾病、不可避免之後勤挑戰或由研究者決定之其他因素，可延長篩選期。若在關鍵篩選評估之間過去＞90天，則彼等評估將重複(亦即重新篩選)。 基線、治療及急性隨訪期
基線、治療及急性隨訪期之總持續時間計劃為52週。後續長期隨訪期將在急性隨訪期結束之後進行至少4年。用BBP-812進行治療之日期之後追蹤所有參與者總共至少5年。
在完成篩選程序之後，將在基線期期間確認參與者之治療合格性。符合BBP-812治療條件之參與者將在BBP-812給藥之前開始糖皮質激素預防，以預防或減弱BBP-812之潛在免疫反應且在BBP-812給藥當天將接受抗組織胺預防以預防輸注反應。參與者將接受在住院患者環境中在發起人指定治療中心進行之第0天BBP-812之靜脈內(IV)輸注。參與者將僅接受BBP-812之單次投與。接受BBP-812之後，參與者將仍然在發起人指定之治療中心進行安全性觀測，達完成給藥之後至少72小時，或根據研究者判斷醫學上指示更長時間。出院之後，參與者將在BBP-812投與之後第一個月繼續糖皮質激素預防，繼之以方案界定之逐漸減少方案。
該研究將使用一種保守方法來選擇患有超罕見疾病之此兒科/嬰兒患者群體中之病毒載體劑量。總計至少6名參與者將在劑量發現期期間治療，其中在各劑量下計劃至少3名參與者。在第一名參與者接受起始劑量之BBP-812之後，後續參與者之治療將僅在經由至少第28天給藥後訪診審查第一名參與者之安全性資料之後進行。此審查將由發起人以及資料及安全監測委員會(DSMC)進行以評估BBP-812之安全及耐受性。除在各參與者給藥之後進行中之發起人安全性資料審查外，在劑量遞增之前、在劑量隊列中給藥第二名參與者之前及在既定劑量下進行隊列擴增之前需要對所有參與者之累積給藥後安全性資料進行至少4週之DSMC及發起人審查。此外，在劑量遞增進行至第2隊列之前，將評估第1隊列中至少1名參與者之第3個月MRI及CSF結果。對於第2隊列，在已給藥至少3名參與者且已審查至少4週之安全性資料之後，可考慮劑量擴增。在進行劑量擴增之前，將評估第1隊列中至少3名參與者及第2隊列中至少1名參與者的第3個月MRI及CSF結果。在可自第2隊列中所治療之第三名參與者獲得12週給藥後資料之後，將評估來自研究參與者之所有可用資料，包括安全性及NAA含量以告知劑量選擇且支持在所選劑量下至多總共15名參與者之登記擴增。
在處理後前4週期間，所有評估將在治療中心進行。在此時間段之後，在隨訪時，且視評估類型而定，在參與者家中允許後續評估。
將持續監測不良事件(AE)及伴隨藥物治療使用。將進行標準安全性評估、實驗室量測、體檢、標準12導程心電圖(ECG)及基線腦電圖。在與MRI及MRS一致之時間點在參與者處於鎮靜/麻醉下時，將經由腰椎穿刺獲得腦脊髓液(CSF)樣品。將藉由評估針對衣殼及轉殖基因產品之抗體及T細胞反應的產生來評估免疫原性。將監測血液中AAV9載體之生物分佈及唾液、尿液及糞便中之載體脫落。在BBP-812治療之後前12週期間，當接觸與預定研究訪診不一致時，參與者之照護者將每週接觸一次以評估安全狀態。
用BBP-812處理之PD活性將藉由量測尿液及CNS中之NAA含量來評估。將藉由MRS非侵入性地量測腦NAA含量，且亦直接經由藉由與MRS時間點一致之腰椎穿刺獲得之樣品直接量測CSF中之NAA含量。同時，藉由MRI評估BBP-812治療對腦解剖結構及組織組合物之特徵的影響。
將經由精細及總體運動發展及認知及語言發展之量表及測試評估功能量測。參與者之適應行為及家庭/照護者之生活品質(QOL)將涉及在兒科群體中驗證之儀器。卡納萬氏病評定量表將專門用於評估患有卡納萬氏病之參與者的神經域。
將進行標準神經檢查以便評估與卡納萬氏病相關之變化。此外，將進行包括視覺誘發電位(VEP)測試之眼科評估。 長期隨訪期
在治療及急性隨訪期之後，長期隨訪期將進行至少4年。除安全性外，亦將追蹤運動發展、認知及語言發展、家庭/照護者家族之QOL、神經狀態及NAA含量之評估以評估用BBP-812治療之作用的耐久性。在用BBP-812進行治療之日期之後追蹤所有參與者總共至少5年。長期隨訪監管計劃將描述由發起人與DSMC合作執行之持續安全監測的過程。 安全性監測
DSMC將根據研究安全管理計劃及DSMC章程監測及評估在研究期間出現之AE、嚴重不良事件(SAE)及給藥後毒性。在劑量發現期期間第1隊列及第2隊列中之持續治療及登記、劑量選擇及在研究之登記擴增期期間之登記及治療的情況下DSMC將審查累積安全性資料以評估BBP-812之安全性及耐受性。 停止規則、劑量限制毒性、劑量調整
此研究可暫停、暫時中斷或過早地由發起人終止。
毒性將藉由不良事件常見術語標準(CTCAE) v5.0確定。疑似劑量限制毒性將包括(但不限於) SAE、≥3級AE或≥3級實驗室AE，藉由研究者評估為BBP-812相關且不另外可歸因於卡納萬氏病或其他病因。BBP-812劑量將不基於每個參與者進行調整。 禁止藥品
在研究之前及期間禁止使用除BBP-812以外之任何基因療法。在BBP-812投與之前的30天(或5個半衰期，以較長者為準)內不允許使用其他研究性醫藥產品治療卡納萬氏病或其他疾病。在接受BBP-812之前至少4週及之後12週禁用任何肝毒性劑。應建議參與者之父母/照護者避免在相同時段期間給予參與者乙醯胺苯酚。在醫療必要性之情況下，在研究者與發起人之間進行討論之後，將基於個別參與者決定使用具有肝毒性潛力之藥物。研究者將盡一切努力，藉由選擇適當抗癲癇藥物以及方案指定評估所需之鎮靜或麻醉劑來使肝毒性風險降至最低。除非方案中另外定義，否則在研究期間之任何時間可不使用免疫抑制劑。 參與者數目 ( 計劃 )
計劃登記：至多18個給藥參與者(總共)： ● 劑量發現期：至少6名參與者 ● 登記擴增期：至多12名參與者 納入及排除標準
納入標準：
參與者必須滿足所有以下標準以有資格進行此研究： ● 截至BBP-812輸注之預測日期，男性或女性≤30月齡。(亦即，可進行給藥直至且包括參與者變成31月齡之前一天) ● 在研究者看來且經病史及實驗室研究證實，具有穩定健康狀況，其中無急性或慢性血液學、腎、肝、免疫或神經疾病(除卡納萬氏病以外)。 ● 具有卡納萬氏病之生物化學及基因診斷： ● 在篩選時測定或在參與者病史中記錄，ASPA基因之泌尿NAA及雙對偶基因突變升高。 ● 具有卡納萬氏病之臨床診斷及活動徵象(包括(但不限於)低張症、發育延遲及大頭畸形)。 ● 迄今為止，根據地理上適用之準則(例如疾病控制中心、世界衛生組織)，進行所有免疫接種，且參與者之父母及/或法定監護人同意在研究過程期間視需要投與標準以及研究特異性免疫接種。 ● 父母及/或法定監護人願意且能夠在已解釋研究之性質之後且在執行研究相關程序之前讀取/理解且提供書面、簽署之知情同意書。 ● 父母及/或法定監護人願意且能夠允許參與者參與研究且遵守所有研究要求，包括伴隨藥物治療及其他治療限制。
排除準則：
符合以下準則中之任一者的參與者將自此研究中排除： ● 藉由酶聯免疫吸附分析所測定，對全部抗AAV9抗體測試呈陽性(＞1:50)。 ● 接受先前基因療法或涉及AAV之其他療法(包括疫苗)。 ● 接受使用免疫抑制劑之高劑量療法。 ● 具有明顯進展之卡納萬氏病，特徵為： ● 存在連續/持久去大腦或去皮質僵直 ● 反覆持續性癲癇，或 ● 在接受3種或更多種抗癲癇藥物治療時不起反應之頑固性癲癇發作 ● 根據研究者判斷，具有已知與輕度卡納萬氏病表型相關之ASPA基因型。 ● 藉由病史或篩選期間之臨床及/或實驗室發現證明，具有肝病(例如肝硬化或當前活動性肝功能障礙)之任何病史。 ● 具有由研究者考慮為臨床上顯著之異常實驗室值： ● 丙胺酸轉胺酶或天冬胺酸轉胺酶≥正常值上限(ULN) ● 結合膽紅素＞ULN ● γ-麩胺醯轉移酶＞ULN ● 估計腎小球濾過率(eGFR)低於年齡之正常值下限 ● 血紅蛋白 ＜ 8 g/dL ● 白血球(WBC)計數超出年齡正常範圍 ● 血小板計數＜ 150,000/µL ● 部分凝血活酶時間超出參考範圍 ● 國際標準化比率超出參考範圍 ● 藉由臨床及/或實驗室發現，有證據顯示活動性或潛伏感染，包括針對嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS CoV 2；亦即冠狀病毒疾病-2019 [COVID 19])、1或2型人類免疫缺乏病毒(HIV 1或HIV 2)、B型或C型肝炎或肺結核之陽性篩選測試。 ● 基於篩選期間ALDOB基因測試之結果，證實遺傳性果糖不耐受之診斷。 ● 當前正參與另一干預臨床研究或在BBP-812投與之前30天或5個半衰期(根據研究者判斷)內已完成利用研究性藥物或裝置之另一臨床研究。 ● 具有過去或當前醫學或行為病狀、在體檢或其他醫學評估時之發現或可根據研究者判斷之其他情況： ● 在研究期間，不利地影響參與者之安全性及健康， ● 干擾研究程序或隨訪之完成，或 ● 研究結果之解釋混雜。 ● 具有對研究藥物之賦形劑中之任一者的過敏歷史。 研究產品及安慰劑、劑量及給藥模式
預防：在第-1天，在用BBP-812給藥之前至少24小時，參與者將經由餵食管(若已存在)饋入普賴蘇穠或經由IV輸注甲基普賴蘇穠開始進行糖皮質激素預防，以預防或減弱與BBP-812投與相關之潛在免疫反應。參與者將在住院持續時間內繼續糖皮質激素預防。在BBP-812給藥當天，參與者將接受抗組織胺預防以預防輸注反應。在出院之後，參與者將在BBP-812投與之後第一個月接受使用普賴蘇穠(藉由餵食管(若已存在)或經口)之糖皮質激素預防。若根據研究者判斷及在與醫學監測者協商之後醫學上指示，則可投與替代性糖皮質激素。在給藥後第28天訪診時，研究者將確定是否根據方案界定之準則開始糖皮質激素逐漸減少。
給藥：治療將如下投與：BBP-812隊列1：1.32×10 14載體基因體(vg)/公斤(kg)體重；BBP-812隊列2：3.0×10 14vg/kg體重。適當時，發起人可基於其累積安全性及活動資料之審查而選擇較低劑量或中等劑量之BBP-812。視治療合格性之確認日期而定，參與者將依序分配至治療隊列1或2。BBP-812將在發起人指定治療中心以1次單一IV輸注在研究之第0天投與。輸注持續時間將視投與之劑量而定。
可進行給藥直至且包括參與者變成31月齡之前一天。
安慰劑：在此研究中將不投與安慰劑。 治療及研究參與之持續時間
各有資格進行治療之參與者將在研究之第0天接受藉由IV輸注投與之單次劑量BBP-812。
參與研究之最大總持續時間將為至少5年。
篩選期：至多42天(必要時，歸因於短暫參與者疾病、不可避免之後勤挑戰或由研究者決定之其他因素，可延長時間)。
治療及急性隨訪期：1年
長期隨訪：至少4年 統計方法
分析群體 ：接受任何量之研究藥物的所有參與者將包括於安全性分析集中。接受任何量之研究藥物且具有至少1個基線後功效評估之所有參與者將包括於修正意向治療(mITT)分析集中。儘管中斷之參與者不進行基線後功效評估，但其將包括於mITT分析集中。mITT分析集中無任何重大方案違規之所有參與者將包括於符合方案分析集中。
資料表格之一般呈現將按年齡組。連續變數之概述將包括總數(N)、平均值、中值、標準偏差、最小值、最大值及雙側95%信賴區間(CI)。分類資料之概述將包括計數及百分比以及雙側95% CI。卡普蘭-邁耶法(Kaplan-Meier method)將用於概述時間事件端點，包括25、50 (中值)及75百分位數與相關雙側95% CI。
功效參數之分析將主要基於各別分析群體中之所有參與者；然而，由於功效可視參與者在診斷時之年齡而定或視診斷至治療之時間而定，因此將進行額外探索性分析，其中參與者將分為適當類別，諸如年齡組及診斷時之時間(例如，診斷時，≤12個月及＞12個月至30個月；≤12個月及＞12個月)。將使用匹配之患者資料進行與自研究CVN-101獲得之自然歷史資料的比較；在統計分析計劃中將指定匹配方法之特定細節，諸如成對匹配、傾向評分組匹配等。
與BBP-812或糖皮質激素給藥相關之AE評估之基線將定義為即將開始投與時；一般而言，AE稱為治療突發(亦即，治療突發不良事件[TEAE])將開始於治療開始之日期/時間。所有其他變數/終點之變化之分析的基線為定義為最接近藥品輸注但在輸注之前的值；因此，基線被視為研究第-1天、第-2天、第-3天、第-4天、第-5天、第-6天、第-7天、第-8天、第-9天、第-10天或篩選某些變數。縱向資料(在研究及隨訪時隨時間推移連續收集)將藉由適當時間間隔呈現，諸如每月、每季度等，視資料性質而定。 參與者處置及人口統計學特徵
參與者處置將包括各年齡組中登記之參與者數目及根據年齡組包括於各分析群體中之參與者數目及百分比。亦將概述過早中斷研究之參與者之頻率及百分比以及中斷之主要原因。將根據年齡組概述人口統計資訊及基線特徵，包括年齡、性別、人種、種族、體重、長度及身體質量指數(BMI)以及臨床徵象診斷及發作之時間。 安全性分析
安全性分析之統計學方法將主要為描述性的且針對安全性分析集進行。除缺失或部分日期以外，將不在統計分析計劃中進一步詳細描述缺失安全性資料之歸因。參與者將按年齡組分類。
監管活動醫學詞典23.1版(或適當時最新版本)將用於對所有AE編碼。不良事件，包括SAE及TEAE，將藉由系統器官類別及較佳術語按年齡組及總體來概述。TEAE定義為BBP-812投與期間或之後發生的任何AE。所有TEAE概述將包括經歷事件之參與者的數目及百分比以及參與者所經歷之AE的數目。百分比將基於各年齡組內安全性分析集中之參與者數目。BBP-812之延遲安全作用之可能性將作為計劃之長期隨訪安全性評價之部分評估。將概述嚴重程度3級或4級之AE及至少5%發生率之AE。將概述TEAE與BBP-812及糖皮質激素之關係。 糖皮質激素
對於所有符合條件之參與者，將投與糖皮質激素預防以預防或減弱與BBP-812投與相關之潛在免疫反應。投與方案展示於 圖 15中。已在接受基因療法之後2至4週，在兒科患者中報導針對AAV載體之抗原特異性T細胞反應(Novartis 2021, Mendell 2017)。
預防：在第-1天，在給與BBP-812之前至少24小時開始且繼續至住院，參與者將經由餵食管(若已存在)餵食普賴蘇穠或經由IV輸注甲基普賴蘇穠進行糖皮質激素預防。在出院之後，參與者將至少至治療後28天訪診經由餵食管口服普賴蘇穠(若已存在)或口服接受糖皮質激素預防。若臨床上指示，則研究者可選擇不同糖皮質激素。參與者之安全性實驗室測試及臨床評估用於指導糖皮質激素預防應逐漸減少，以當前劑量下繼續還是增加(最大2.0 mg/kg/D普賴蘇穠或劑量等同物)。對於當前推薦之給藥及逐漸減少方案參見下文。
參與者將使用基於研究者對個別參與者之臨床狀態的評估及當地最佳實踐的方案接受針對任何間發性發熱疾病或生理應激之應激劑量類固醇。將進行促腎上腺皮質激素(ACTH)刺激測試以判定下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸是否完整且不再需要使用應激類固醇。未預料到研究糖皮質激素方案將引起長期腎上腺功能不全。
基於自第一個給藥參與者之安全性資料的審查(參見實例4)，DSMC推薦移至較高起始劑量之普賴蘇穠以及更長期之逐漸減少及增加之監測，如下文所概述。 ● 至第7天2.0 mg/kg/d ● 至第29天1.5 mg/kg/d ● 至第56天(第2月) 1.0 mg/kg/d ● 開始逐漸減少且繼續至少6週，每週減少不超過15%。 ● 監測安全性實驗室，進行肝功能測試至少每週一次，或若注意到任何令人擔心之趨勢，更頻繁測試。 ● 對於AST/ALT升高之事件，獲得至少1個肌酐激酶含量以評估潛在非肝病因。
上文概述之方案用於第二給藥參與者(參見實例4)且反映當前基礎情況。然而，基於BBP-812下其他臨床經歷之增加，進行額外修改。 逐漸減少
若BBP-812投與之後1個月無臨床上顯著之實驗室或其他發現與肝炎一致，則糖皮質激素預防可經至少28天之時段根據研究者判斷及當地臨床實踐可逐漸減少。若在第28天研究訪診結果時注意到肝異常，則與醫學監測者協商，應繼續每日糖皮質激素預防或增加至等效於2.0 mg/kg/d每天總日劑量口服普賴蘇穠之最大值，直至異常消退，隨後根據研究者及當地臨床實踐基於治療之劑量及持續時間適當逐漸減少。
在糖皮質激素逐漸減少期間推薦參與者之安全性實驗室測試及臨床評估。
將進行ACTH刺激測試以判定HPA軸是否完整。直至已經由上文所概述之測試確認正常HPA軸功能之恢復，參與者將使用基於研究者對個別參與者之臨床狀態的評估及當地最佳實踐的方案接受針對任何間發性發熱疾病或生理應激之應激劑量類固醇。未預料到方案指定之糖皮質激素方案將引起長期腎上腺功能不全。
另外，無論糖皮質激素劑量或持續時間如何，在逐漸減少之後面階段期間及在糖皮質激素預防中斷之前，將進行ACTH刺激測試以判定HPA軸是否完整且糖皮質激素預防是否可完全停止。若HPA軸功能尚未完全恢復，則患者將保持其當前糖皮質激素劑量且第二次ACTH刺激測試應在下一預定研究訪診時(在大約4週或更長時間之後)執行。ACTH刺激測試將在研究訪診時繼續直至HPA功能正常為止，隨後患者可中斷糖皮質激素且不再需要應激類固醇覆蓋(參見下文)。用於測試之特定方法、參考範圍、收集時序及其他細節應遵循當地實踐標準及研究者醫學判斷。直至已經由上文所概述之測試確認正常HPA軸功能之恢復，參與者將使用基於研究者對個別參與者之臨床狀態的評估及當地最佳實踐的方案接受針對任何間發性發熱疾病或生理應激之應激劑量類固醇。未預料到方案指定之糖皮質激素方案將引起長期腎上腺功能不全。 抗組織胺
對於所有符合條件之參與者，抗組織胺預防將用於預防對BBP-812之輸注反應。經批准之抗組織胺包括苯海拉明(IV)、羥嗪(肌肉內[IM])及氯菲安明(IV)或經由餵食管(若已存在)投與之對應口服調配物。抗組織胺、劑量及投與途徑之選擇將基於研究者之醫學判斷及當地機構實踐。 其他預防性治療及急救藥品
在過敏性反應之情況下，根據標準機構程序，在治療中心處，將準備以下療法供使用：腎上腺素、類晶體、抗組織胺藥物(例如苯海拉明、羥嗪或氯菲安明)及氫化可體松。為解決CRS之潛在發展，針對細胞介素之抗體(例如托珠單抗(tocilizumab)，一種IL-6R抗體)可供使用。此外，因為已報導在其他全身性AAV9介導之基因療法產品下與補體介導之血栓性微血管病一致之事件(Pfizer 2019, Solid 2018, Solid 2019)，所以其中一些需要抗補體療法，亦容易利用補體抑制劑(例如艾庫組單抗(eculizumab) (阻斷C5裂解之抗體)，及重組或血漿來源之C1酯酶抑制劑，諸如Berinert®)。關於此等藥物之詳細資訊請參考托珠單抗(Actemra® [Genentech 2019])、艾庫組單抗(Soliris® [Alexion 2020])及C1酯酶抑制劑(Berinert® [CSL Behring 2019])之處方資訊。
值得注意地，艾庫組單抗已與嚴重腦膜炎球菌感染有關，且因此，可僅經由根據風險評估及緩解策略(Alexion 2020)之限定方案訂購。關於腦膜炎球菌預防及獲得艾庫組單抗之註冊要求的資訊參考Soliris® (Alexion 2020)之處方資訊。鼓勵與使用艾庫組單抗及管理補體活化症候群/血栓性微血管病經驗豐富之醫學專家進行協商。
體檢發現、實驗室評估、生命徵象及ECG之臨床上顯著變化將報導為AE。實驗室及生命徵象資料將由年齡組概述。將列出所有實驗室資料及生命徵象。
伴隨藥物治療資料將按年齡組列出及概述。研究藥物暴露將按年齡組概述。 藥效學活性分析
尿液及CNS中之NAA含量(PD標記物)之分析存在若干基本態樣。BBP-812投與之後NAA含量之變化(其與患者隨時間推移之固有變化性可區別)，尤其相對於基線實質性降低，可視為BBP-812基因療法之生理效應之標記物，亦即證實NAA為效應之生物標記物。對於此等分析，相對於基線之變化可使用縱向資料分析方法評估。此外，將對臨床活性量度之絕對值及自基線至治療後之變化進行分析以評估與NAA含量之減少的相關性，亦將分析評估隨時間推移可能與基線NAA含量相關之臨床結果變化之潛在差異。
將使用標準方法，諸如成對t檢驗對NAA含量自基線至特定時間點之變化進行統計分析；主要時間點分析將變為用BBP-812治療後12個月。相對於基線之變化亦可使用縱向重複量度之資料分析方法評估。此外，將對臨床活性量度之絕對值及自基線至治療後之變化進行分析以評估與NAA含量之減少的相關性，亦將分析評估隨時間推移可能與基線NAA含量相關之臨床結果變化之潛在差異。PD及臨床活性評估之其他細節將提供於正式統計分析計劃中。 臨床活性 ： 運動、認知及語言發展及功能 ； 適應性行為
將考慮mITT分析集主要用於評估臨床功效，且在無臨床功效之基線後評估的情況下中斷研究的參與者將被視為對治療無反應。亦可使用用於分析此類完全缺失結果之若干歸因方法，包括在所有經治療參與者中分配最差值(最差情況分析)及排除此類參與者進行分析(最佳情況分析)。對於所有臨床功效分析，參與者將按年齡組及自診斷起之持續時間分類。
臨床分析將基於在發育測試中隨時間推移之絕對資料及相對於基線之變化兩者。為偵測潛在功效信號及評估此等絕對值及相對於基線之變化的臨床重要性，可將臨床活性資料與在研究CVN-101中患有卡納萬氏病之參與者的天然病史資料庫中收集之類似資料進行比較。 其他評估：成像、照護者調查表
將考慮mITT分析集主要用於評估成像及照護者調查表。在無基線後成像評估或調查表反應的情況下中斷研究的參與者將被視為對治療無反應。對於所有成像及調查表分析，參與者將按年齡組進行分類。描述性統計資料將用於按年齡組呈現資料。
分析將與基線處之腦MRI及腦MRS以及基線處之調查表反應及相對於基線之變化相關。 樣品大小
研究登記將至多為18名給藥參與者。基於與先前公開之方案(Leone 2012)中所用類似但略微更保守的假設，在所選劑量下處理之至多15名參與者的樣品大小將適合於評估對NAA之PD作用，其中確定相對於基線之變化的標準偏差為0.493 mmol，且2至3 mmol之相對於基線之差異視為對偵測具有重要意義。針對NAA相對於基線之變化使用此等假設，在1.0 mmol之更保守估計標準偏差及2.0 mmol之臨床上相關差異下，15之樣品大小對於大於90%功率將綽綽有餘。 研究時程
篩選及長期隨訪期之事件時程分別展示於表13及表14中。 表 13. 事件研究時程 ： 篩選、基線及治療及急性隨訪期
研究評估 1,2 SCR 3 Re-SCR 1 基線、治療及急性隨訪期 ET ± 3d
研究天數 研究週數 (W) (± 3d) 研究月 (M)
基線 3,4 給藥日 0 住院患者 門診患者
第 -10 天至給藥前第 0 天 1 2 3 4 5 6 7 10 ± 1 14 ±2 21 ±2 28 ±2 42 ±2 W8 M2 W12 M3 W16 M4 W26 M6 W34 M8 W42 M10 W52 M12
知情同意書 X X                                                                  
人口統計資料 4 X                                                                     
病史/手術史 5 X X                                                                  
確認合格性       X 6                                                               
准許進入住院患者單元       X                                                               
體檢(全面或針對性)    X 7 X 7    X 8    X 8    X 8    X 8    X 7    X 8    X 8    X 8    X 7    X 8    X 7    X 7    X 7    X 7    X 7    X 7    X 7    X 7    X 7    X 7    X 7    X 7
神經檢查 9 X X X          X          X    X X X X X X X X X X X X
眼科檢查 10       X                                                 X       X X
生命徵象及脈搏血氧測定法 11 X 1 1 X 11    X 11    X X 11 X 11 X 11 X 11 X 11 X 11 X 11 X 11 X 11 X X X X X X X X X X X
生長評估 12 X X X    X X X          X    X    X    X X X X X X X X
12導程ECG       X                      X          X       X    X       X X
腦電圖(EEG) 13       X                                                               
實驗室評估 14                                                                        
常規臨床實驗室測試 15 X X X    X X X    X    X    X X X X X X X X X X X X
凝血 16 X X X                                  X    X    X X X X X X
尿液NAA X    X                                  X    X X X X X X X X
基因測試 17 X                                                                     
生物標記物 X 1 8                                                       X X X X X
所存檔之血清樣品          X 19                                                               
免疫原性：中和抗體 20       X                                              X             X          X             X       X
免疫原性：總抗體 21    X X                            X       X    X    X       X    X       X          X    X
免疫原性：T細胞反應性 22    X                                              X       X       X          X    X
病原體篩選 23 X X                                                                  
血液生物分佈 24          X24                                     X             X          X    X
載體脫落 24          X24 X X X          X X X X X    X X X X X X X X 25
腦脊髓液 26       X 27                                           X    X       X X
成像：腦MRI       X 27                                           X    X       X X
成像：腦MRS       X 27                                           X    X       X X
執行之發育測試(遠程及親自) 28 X    X                                        X    X X X X X X
調查表：照護者作為回應人 29 X    X                                        X    X X X X X X
免疫/輸注預防       X30 X30 ,32 X 30＜--------------------------------------------------------------------------------------＞ X                           
類固醇逐漸減少/HPA軸監測                                           X 31＜----------------------------------------------------------------------------------＞ X   
BBP-812投與 33          X 11,33                                                            
自住院患者單元出去                   X 34                                                   
照護者接觸(安全性狀態)                      X 35＜--------------------------------------------------------------------------------------------＞ X                  
存活狀態       X  ＜--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------＞  X X
不良事件 X 36    X  ＜--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------＞  X X
伴隨藥物治療 X    X  ＜--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------＞  X X
縮寫：AAV9：腺相關病毒血清型9；Ab：抗體；AE：不良事件；ALT：丙胺酸轉胺酶；ASPA：天冬醯轉移酶；AST：天冬胺酸轉胺酶；BUN：血尿素氮；COVID-19：冠狀病毒疾病-2019；d：天；CSF：腦脊髓液；ECG：心電圖；eCRF：電子病例報導表；EEG：腦電圖；eGFR：估計腎小球濾過率；ELISA：酶聯免疫吸附分析；ELISpot：酶聯免疫斑點；ET：提前終止(訪診)；GGT：γ-麩胺醯轉移酶；HEENT：頭、耳朵、眼睛、鼻及喉；HIV：人類免疫缺乏病毒；HPA：下丘腦-垂體-腎上腺；IV：靜脈內；IM：肌肉內；LDH：乳酸去氫酶；M：月；MRI：磁共振成像；MRS：磁共振光譜法；NAA：N-乙醯天冬胺酸；SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2；SCR：篩選(期)；VEP：視覺誘發電位；W：週 1.      關於進行評估之額外細節參考現場參考手冊(Site Reference Manual)。 2.      視參與者情況之需要，可在參與者家中由合格的健康護理專業人員進行評估。 3.      篩選期將至多42天且將在第一篩選評估進行時開始。在篩選期期間，適當時，參與者之醫療記錄可用於收集相關資料(例如病史)。 1.      若自初始篩選評估起已過去＞90天，則進行再次篩選評估。獲得知情再次同意書。 2.      在基線期期間，將確認參與者之治療合格性。若自篩選評估之時間＞42天(但≤ 90天)，則研究者及發起人將確定哪些篩選評估需要重複，以確認合格性及在BBP-812給藥之前建立基線。 3.      除免疫/輸注預防(參考註釋33及35)以外，允許基線研究程序進行10天時段(第-10天至第0天[給藥前])，以降低參與者及家庭之身體及/或情感負擔。在開始糖皮質激素預防之前，必須收集基線實驗室樣品。所有基線評估必須在投與BBP-812之前完成。 4.      年齡、性別、種族及人種。 5.      病史及手術史、先前藥物治療及/或物理療法干預；卡納萬氏病史、卡納萬氏病家族病史、癲癇史。 6.自篩選評估以來確認治療合格性。應在進行侵襲性及/或需要鎮靜或麻醉(例如，CSF收集、成像)之基線程序之前確認治療合格性。 7.      包括以下身體系統之全面體檢：皮膚、HEENT、呼吸道、心血管、胃腸道、血液及淋巴及肌肉骨胳。 8.      包括以下身體系統(最少)之針對性體檢/有限物理評估：皮膚、心血管、呼吸道及胃腸道。在第0天(給藥)，在註釋14中指定用於生命徵象收集之相同時間點處視覺評估輸注部位處之皮膚。 9.      神經檢查包括以下域：精神狀態、語言、顱神經、運動功能及肌肉骨胳、反射、感覺及協調。 10.    包括VEP測試之眼科檢查。 11.    血壓、脈搏、直腸溫度及呼吸率。另外，將至第14天訪診量測血氧飽和濃度(脈搏血氧測定法)。在臨床上指示之其他時間允許量測生命徵象。在輸注BBP-812之前15分鐘內記錄生命徵象。一旦已開始給藥，將在輸注持續時間期間每15 (±5)分鐘記錄生命徵象。在輸注結束且已沖洗輸注管線之後，在以下時間點記錄生命徵象，總計14小時：5 (±1)分鐘、15 (±5)分鐘、30 (±5)分鐘、45 (±5)分鐘、1小時(±5分鐘)、1.5小時(±5分鐘)、2小時(±5分鐘)及接著每小時(±5分鐘)，持續下一12小時。其後，將根據當地臨床實踐進行生命徵象評估直至出院且將在eCRF中擷取。 12.    生長評估將包括體重(kg)、高度/長度(cm)及頭圍(cm)。 13.    EEG在BBP-812輸注日期之前儘可能接近進行。根據臨床上指示，由研究者之判斷決定，允許給藥後EEG。 14.    在開始糖皮質激素預防之前，收集基線實驗室樣品。用於實驗室測試之樣品將基於現場參考手冊中指定之體積。可存檔實驗室樣品之殘餘體積以用於額外將來分析。 15.    除非發起人以其他方式說明，否則將自研究第1天-第28天局部進行常規臨床實驗室測試。 血液學評估：白血球計數、紅血球計數、血紅素、血容比、血小板計數、差別(嗜中性球、嗜酸性球、淋巴球、單核球及嗜鹼性球)及周邊血液塗片。 血液化學評估：白蛋白、白蛋白/球蛋白比率(計算)、鹼性磷酸酶、ALT、AST、膽紅素(分級分離及總)、BUN、BUN/肌酐比(計算)、鈣、二氧化碳、氯離子、肌酐與eGFR、GGT、球蛋白(計算)、葡萄糖、LDH、鉀、鈉及總蛋白。 尿分析：外觀、pH、比重、蛋白質、葡萄糖、酮及沈降物之微觀檢查。 16.    研究第1天至第28天局部進行常規臨床實驗室測試。 凝血：部分凝血活酶時間及凝血酶原時間/國際標準化比值。 17.    針對卡納萬氏病之 ASPA基因及針對遺傳性果糖不耐受之 ALDOB基因中之突變的基因測試。 18.    將存檔篩選時之生物標記物/免疫原性樣品用於將來分析。其他生物標記物評估時間點包括血清酮(β-羥基丁酸酯)。 19.    將收集及存檔血清樣品用於未來探索性分析，其可由抗AAV9總抗體及/或其他免疫或卡納萬氏病狀態標記物組成。 20.    免疫原性評估將包括偵測抗AAV9中和抗體之測試。 21.    免疫原性評估將包括藉由ELISA偵測抗AAV9總抗體及藉由ELISA偵測抗ASPA總抗體之測試。 22.    免疫原性評估將包括藉由ELISpot評估對AAV9及ASPA之T細胞反應性。 23.    病原體篩選評估：SARS-CoV-2、HIV-1、HIV-2、B型及C型肝炎及肺結核(藉由皮膚測試)。SARS-CoV-2之任何後續測試將基於研究地點之機構標準及政策進行。 24.    針對BBP-812之血液生物分佈及尿液、糞便及唾液中之載體脫落收集樣品。 25.    在提前終止時，針對尿液、糞便及/或唾液中之載體脫落，收集樣品。 26.    將藉由腰椎穿刺收集CSF以量測NAA、蛋白質、葡萄糖及細胞計數。該程序將在鎮靜/全身麻醉下進行且將需要單獨的知情同意書。 27.    已確認治療合格性之後進行基線評估。 28.    將遠程及親自進行發育評估，視特定測試及當前情形而定，因為其可能影響參與者之健康及安全。盡一切努力使測試藉由同一經訓練之評級者在同一天對同一參與者執行以獲得執行一致性。 29.    將要求參與者之主要照護者提供反應。盡一切努力使測試藉由同一經訓練之評級者對同一回應人執行以獲得執行一致性。 30.    對於所有符合條件之參與者，在用BBP-812給藥之前至少24小時，第-1天開始糖皮質激素預防，在整個參與者住院中繼續預防性方案，且在BBP-812投與之後繼續至少第一個月的預防性方案。 31.    在第28天訪診時，確定是否開始糖皮質激素逐漸減少。開始及管理糖皮質激素逐漸減少、使用應激類固醇以及證實HPA軸恢復。 32.    用於預防輸注反應之抗組織胺預防。 33.    必須僅在所有基線評估已完成之後才進行BBP-812之投與。 34.    參與者將留於單元中以在BBP-812給藥完成之後至少72小時或根據研究者判斷在醫學上指示更長時間進行安全性觀測。 35.    當接觸與預定研究訪診不一致時，參與者之照護者將每週接觸一次以確定參與者之安全狀態。 36.    在篩選及基線期(自簽署知情同意書之時間至BBP-812輸注時間)期間，參與者之健康之任何臨床上顯著變化將記錄為AE。 表 14. 研究事件時程 ： 長期隨訪期
研究評估 1,2 長期隨訪期 ET (± 3d)
研究月 (M) (± 1 週 )
M 15 M 18 M 21 M 24 M 27 M 30 M 33 M 36 M 42 M 48 M 54 M 60
體檢(全面) 3 X X X X    X    X X X X X X
神經檢查 X X X X    X    X X X X X X
眼科檢查 4 X X X X    X    X X X X X X
生命徵象 5 X X X X    X    X X X X X X
生長評估 6 X X X X    X    X X X X X X
12導程ECG X X X X    X    X X X X X X
腦電圖(EEG) 7                                       
實驗室評估 8                                       
常規臨床實驗室測試 9 X X X X    X    X X X X X X
凝血 10 X X X X    X    X X X X X X
尿液NAA X X X X    X    X X X X X X
生物標記物 11 X X X X    X    X X X X X X
免疫原性：中和抗體 12 X X X X    X    X X X X X X
免疫原性：總計 13 X X X X    X    X X X X X X
免疫原性：T細胞反應性 14 X X X X    X    X X X X X X
血液生物分佈 15 X X X X    X    X X X X X X
載體脫落 15 X X X X    X    X X X X X X 16
腦脊髓液 17    X    X    X    X X X X X X
成像：腦MRI    X    X    X    X X X X X X
成像：腦MRS    X    X    X    X X X X X X
執行之發育測試(遠程及親自) 18 X 19 X 19 X 19 X 19 X 19 X 19 X 19 X 19 X 19 X 19 X 19 X 19 X
調查表：照護者作為回應人 20 X X X X X X X X X X X X X
存活狀態 X  ＜-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------＞  X X
嚴重不良事件 X  ＜-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------＞  X X
伴隨藥物治療 X  ＜-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------＞  X X
縮寫：AAV9：腺相關病毒血清型9；Ab：抗體；ALT：丙胺酸轉胺酶；ASPA：天冬醯轉移酶；AST：天冬胺酸轉胺酶；BUN：血尿素氮；CSF：腦脊髓液；d：天；ECG：心電圖；EEG：腦電圖；eGFR：估計腎小球濾過率；ELISA：酶聯免疫吸附分析；ELISpot：酶聯免疫斑點；ET：提前終止(訪診)；GGT：γ-麩胺醯轉移酶；HEENT：頭、耳朵、眼睛、鼻及喉；LDH：乳酸去氫酶；M：月；MRI：磁共振成像；MRS：磁共振光譜法；NAA：N-乙醯天冬胺酸；SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2；VEP：視覺誘發電位 1.      關於進行評估之額外細節參考現場參考手冊。 2.      視參與者情況之需要，可在參與者家中由合格的健康護理專業人員進行評估。 3.      包括以下身體系統之全面體檢：皮膚、HEENT、呼吸道、心血管、胃腸道、血液及淋巴及肌肉骨胳。 4.      包括VEP測試之眼科檢查。 5.      血壓、脈搏、直腸溫度及呼吸率。在臨床上指示之其他時間允許量測生命徵象。 6.      生長評估將包括體重(kg)、高度/長度(cm)及頭圍(cm)。 7.      根據臨床上指示，由研究者之判斷決定，在給藥後允許EEG。 8.      用於實驗室測試之樣品將基於現場參考手冊中指定之體積。可存檔實驗室樣品之殘餘體積以用於額外將來分析。 9. 血液學評估：白血球計數、紅血球計數、血紅素、血容比、血小板計數、差別(嗜中性球、嗜酸性球、淋巴球、單核球及嗜鹼性球)及周邊血液塗片。 血液化學評估：白蛋白、白蛋白/球蛋白比率(計算)、鹼性磷酸酶、ALT、AST、膽紅素(分級分離及總)、BUN、BUN/肌酐比(計算)、鈣、二氧化碳、氯離子、肌酐與eGFR、GGT、球蛋白(計算)、葡萄糖、LDH、鉀、鈉及總蛋白。 尿分析：外觀、pH、比重、蛋白質、葡萄糖、酮及沈降物之微觀檢查。 10. 凝血：部分凝血活酶時間及凝血酶原時間/國際標準化比值。 11.    生物標記物評估包括血清酮(β-羥基丁酸酯)。 12.    免疫原性評估將包括偵測抗AAV9中和抗體之測試。 13.    免疫原性評估將包括藉由ELISA偵測抗AAV9總抗體及藉由ELISA偵測抗ASPA總抗體之測試。 14.    免疫原性評估將包括藉由ELISpot評估對AAV9及ASPA之T細胞反應性。 15.    針對血液生物分佈及尿液、糞便及唾液中之載體脫落，繼續收集樣品。 16.    在提前終止時，針對尿液、糞便及唾液中之載體脫落，收集樣品。 17.    將藉由腰椎穿刺收集CSF以量測NAA、蛋白質、葡萄糖及細胞計數。該程序將在鎮靜/全身麻醉下進行且將需要單獨的知情同意書。 18.    將遠程及親自進行發育評估，視特定測試及當前情形而定，因為其可能影響參與者之健康及安全。盡一切努力使測試藉由同一經訓練之評級者在同一天對同一參與者執行以獲得執行一致性。 19.    在長期隨訪第3年、第4年及第5年期間的評估將經由親自(情況允許)及遠程訪診每6個月進行。 20.    將要求參與者之主要照護者提供反應。盡一切努力使測試藉由同一經訓練之評級者對同一回應人執行以獲得執行一致性。 實例 4 ： 1/2 期開放標記臨床試驗之初步結果
如實例3中所描述向兩名患者給與BBP-812。使用磁共振光譜法(MRS)成像觀測到尿液、腦脊髓液(CSF)及腦組織中之N-乙醯天冬胺酸(NAA)穩固及持久的治療後減少。亦觀測到用磁共振成像(MRI)量測之新髓鞘形成之跡象。腦NAA減少為早期信號，表明靜脈內(IV)投與BBP-812已達到其在血腦屏障後之預期目標且表現功能性天冬醯轉移酶(ASPA)酶。科學文獻中有證據表明，較低NAA含量引起較輕度疾病。將需要更多時間來看NAA之彼等減少如何轉化為臨床結果。
IV輸注BBP-812的耐受性良好，且迄今為止，參與者尚未經歷治療相關之嚴重不良事件。在治療後6個月，參與者1顯示CSF中之NAA降低77%；藉由MRS成像量測，腦白質中之NAA降低15%；及尿NAA降低約50%。在治療後第3個月，參與者2展示CSF中之NAA降低89%；藉由MRS成像量測，腦白質中之NAA降低大於50%；及尿NAA降低81%。此等觀測到之生物化學變化表明BBP-812到達對於卡納萬氏病過程(此疾病中之里程碑)而言關鍵的細胞。此等資料表示初步結果，且研究性基因療法之最終安全性及功效概況仍然有待完整得建立。
本說明書中所引用之所有論文、公開案及專利均以引用之方式併入本文中，如同各個別論文、公開案或專利具體地且個別地指示以引用之方式併入一般，且以引用之方式併入本文中，以揭示及描述與所引用之公開案有關的方法及/或材料。然而，本文所引用之任何參考文獻、文章、公開案、專利、專利公開案及專利申請案之提及並非且不應視為承認或以任何形式表明其構成有效的先前技術或形成全球任何國家之公共常識之一部分。
在本說明書中說明及討論之實施例僅意欲教示熟習此項技術者本發明人已知的進行及使用本發明之最佳方式。熟習此項技術者鑒於上述教示內容所瞭解，在不脫離本發明之情況下，上文所描述之本發明之實施例之修改及變化為可能的。因此，應理解，在申請專利範圍及其同等物之範疇內，本發明可以除特定描述之外的方式實施。 所列舉的實施例實施例1. 一種方法，其包含：向個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及 (ii)  編碼天冬醯轉移酶(ASPA)之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內。 實施例2. 一種在有需要之個體中表現天冬醯轉移酶(ASPA)之方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及 (ii)  編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內，藉此在該個體中表現ASPA。 實施例3. 一種增加有需要之個體中之天冬醯轉移酶(ASPA)含量的方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及 (ii)  編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內，藉此增加該個體中之ASPA含量。 實施例4. 實施例1至3中任一項之方法，其中該個體需要ASPA之表現。 實施例5. 實施例1至4中任一項之方法，其中該個體之ASPA含量及/或功能降低。 實施例6. 實施例1至5中任一項之方法，其中該個體患有腦白質失養症。 實施例7. 一種治療有需要之個體之腦白質失養症的方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及 (ii)  編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內， 藉此治療該個體之腦白質失養症。 實施例8. 實施例6或實施例7之方法，其中該腦白質失養症與選自由以下組成之群之病狀相關聯：卡納萬氏病(Canavan disease)、腎上腺脊髓神經病、亞歷山大氏病(Alexander disease)、腦腱性黃色瘤症、克拉培氏病(Krabbe disease)、異染性腦白質失養症、腎上腺腦白質失養症、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)及雷夫蘇姆氏病(Refsum disease)。 實施例9. 實施例8之方法，其中該腦白質失養症與卡納萬氏病相關聯。 實施例10.     實施例6至9中任一項之方法，其進一步包含在投與該rAAV載體之前挑選患有腦白質失養症之個體。 實施例11.     一種治療有需要之個體之卡納萬氏病的方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及 (ii)  編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內， 藉此治療該個體之卡納萬氏病。 實施例12.     實施例11之方法，其進一步包含在投與該rAAV載體之前挑選患有卡納萬氏病之個體。 實施例13.     實施例1至12中任一項之方法，其中該rAAV載體之投與引起ASPA在該個體之組織中表現。 實施例14.     實施例13之方法，其中該組織為周邊組織或中樞神經系統(CNS)組織。 實施例15.     實施例1至14中任一項之方法，其中已確定該個體中存在包含從糖酵解作用轉變成β-氧化作用之代謝失衡。 實施例16.     實施例15之方法，其中該方法進一步包含藉由評估一或多種糖酵解作用及/或β-氧化作用因子作用之含量來偵測該代謝失衡。 實施例17.     實施例16之方法，其中該等一或多種糖酵解作用及/或β-氧化作用因子之含量係使用獲自該個體之中樞神經系統(CNS)體液評估。 實施例18.     實施例15至17中任一項之方法，其中該方法進一步包含： (a)   自該個體獲得CNS體液； (b)  偵測該CNS體液中經增加之β-氧化作用；及 (c)   基於(b)中之該偵測，向該個體投與該rAAV。 實施例19.     實施例15至18中任一項之方法，其中該方法進一步包含：(a)量測自該個體獲得之生物樣品之代謝概況；及(b)基於該代謝概況鑑別包含從糖酵解作用轉變成β-氧化作用之代謝失衡。 實施例20.     實施例19之方法，其中量測該代謝概況包含使用液相層析(LC)、質譜分析(MS)、液相層析/質譜分析(LC/MS)或超高效液相層析-串聯質譜分析(UPLC-MS/MS)分析該生物樣品。 實施例21.     實施例19或實施例20之方法，其中該生物樣品包含血液、血清、CNS組織或腦脊髓液(CSF)。 實施例22.     實施例21之方法，其中該CNS組織為腦組織。 實施例23.     實施例19至22中任一項之方法，其中該代謝概況包含選自由以下組成之群之第一生物標記物的含量：葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、3-磷酸甘油酸、丙酮酸鹽、乳酸鹽及磷酸烯醇丙酮酸鹽。 實施例24.     實施例19至23中任一項之方法，其中該代謝概況包含選自由以下組成之群之第二生物標記物的含量：肉鹼、丙二醯肉鹼、肉豆蔻醯肉鹼、棕櫚醯肉鹼、丙二醯肉鹼及β-羥基丁酸鹽。 實施例25.     實施例1至24中任一項之方法，其中該治療有效量在約10 14vg/kg至約5×10 14vg/kg範圍內。 實施例26.     實施例25之方法，其中該治療有效量為約1.32×10 14vg/kg。 實施例27.     實施例25之方法，其中該治療有效量為約3×10 14vg/kg。 實施例28.     實施例1至27中任一項之方法，其中該rAAV經由輸注投與。 實施例29.     實施例28之方法，其中該rAAV經由靜脈內輸注投與。 實施例30.     實施例1至27中任一項之方法，其中該rAAV經由注射投與。 實施例31.     實施例30之方法，其中該注射係選自由靜脈內注射、血管內注射及腦室內注射組成之群。 實施例32.     實施例1至31中任一項之方法，其中該個體小於或等於30月齡。 實施例33.     實施例1至32中任一項之方法，其中ASPA包含人類ASPA蛋白。 實施例34.     實施例1至33中任一項之方法，其中ASPA包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 6具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之胺基酸序列。 實施例35.     實施例1至34中任一項之方法，其中該啟動子為星狀細胞特異性啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子或增強型雞β-肌動蛋白啟動子。 實施例36.     實施例1至35中任一項之方法，其中該啟動子為細胞巨大病毒/β-肌動蛋白雜合啟動子或PGK啟動子。 實施例37.     實施例36之方法，其中該細胞巨大病毒/β-肌動蛋白雜合啟動子為CAG啟動子、CB6啟動子或CBA啟動子。 實施例38.     實施例1至37中任一項之方法，其中該編碼ASPA之非AAV核苷酸序列包含人類 ASPAcDNA或由人類 ASPAcDNA組成。 實施例39.     實施例1至38中任一項之方法，其中該編碼ASPA之非AAV核苷酸序列包含密碼子優化之核苷酸序列或由密碼子優化之核苷酸序列組成。 實施例40.     實施例1至39中任一項之方法，其中該編碼ASPA之非AAV核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1或由SEQ ID NO: 1組成。 實施例41.     實施例1至40中任一項之方法，其中該非AAV核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 6具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之胺基酸序列。 實施例42.     實施例1至41中任一項之方法，其中該核酸分子包含細胞巨大病毒即刻早期強化子。 實施例43.     實施例1至42中任一項之方法，其中該核酸分子包含兔β-球蛋白多聚A信號。 實施例44.     實施例1至43中任一項之方法，其中該核酸分子包含科紮克序列(Kozak sequence)。 實施例45.     實施例1至44中任一項之方法，其中該核酸分子包含miR-122結合位點。 實施例46.     實施例1至45中任一項之方法，其中該ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型ITR。 實施例47.     實施例1至46中任一項之方法，其中該rAAV為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型rAAV。 實施例48.     實施例1至47中任一項之方法，其中該rAAV為AAV9血清型rAAV。 實施例49.     實施例1至48中任一項之方法，其中該rAAV為自互補rAAV (scAAV)。 實施例50.     實施例1至49中任一項之方法，其中該rAAV為單股rAAV (ssAAV)。 實施例51.     一種方法，其包含： 經由靜脈內輸注向個體投與約1.32×10 14vg/kg之重組自互補腺相關病毒9 (scAAV9)載體，其中該rAAV9載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)、細胞巨大病毒即刻早期強化子、科紮克序列及兔β-球蛋白多聚A信號之核酸分子；及 (ii)  編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於引導該個體中ASPA之表現的CB6啟動子， 其中該個體小於或等於30月齡，且其中該個體患有卡納萬氏病。 實施例52.     一種方法，其包含： 經由靜脈內輸注向個體投與約3×10 14vg/kg之重組自互補腺相關病毒9 (scAAV9)載體，其中該rAAV9載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)、細胞巨大病毒即刻早期強化子、科紮克序列及兔β-球蛋白多聚A信號之核酸分子；及 (ii)  編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於引導該個體中ASPA之表現的CB6啟動子， 其中該個體小於或等於30月齡，且其中該個體患有卡納萬氏病。 實施例53.     實施例1至52中任一項之方法，其進一步包含：(a)向該個體投與小分子代謝調節劑；(b)向該個體指定膳食干預，其中該膳食干預促進該個體中之糖酵解作用及/或減少β-氧化作用；及/或(c)向該個體投與免疫抑制劑。 實施例54.     實施例1至53中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與治療有效量之糖皮質激素。 實施例55.     實施例54之方法，其中該糖皮質激素在投與該rAAV載體之前、與之同時及/或在其之後投與。 實施例56.     實施例54或實施例55之方法，其中該糖皮質激素為普賴蘇穠(prednisolone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)或其組合。 實施例57.     實施例1至56中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與治療有效量之抗組織胺。 實施例58.     實施例57之方法，其中該抗組織胺在投與該rAAV載體之前、與之同時及/或在其之後投與。 實施例59.     實施例57或實施例58之方法，其中該抗組織胺為苯海拉明(diphenhydramine)、羥嗪(hydroxyzine)、氯菲安明(chlorpheniramine)或其任何組合。 實施例60.     實施例1至59中任一項之方法，其中在該投與後，尿液、腦脊髓液(CSF)及/或腦組織中之N-乙醯天冬胺酸(NAA)含量降低。 實施例61.     實施例60之方法，其中在該投與後，尿液中之NAA含量降低。 實施例62.     實施例61之方法，其中尿液中之該等NAA含量降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。 實施例63.     實施例61或62之方法，其中尿液中之該等NAA含量保持相對於治療前含量降低達至少6個月、9個月、12個月、18個月、24個月或更長時間。 實施例64.     實施例60至63中任一項之方法，其中在該投與後，CSF中之NAA含量降低。 實施例65.     實施例64之方法，其中CSF中之該等NAA含量降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。 實施例66.     實施例64或65之方法，其中CSF中之該等NAA含量保持相對於治療前含量降低達至少6個月、9個月、12個月、18個月、24個月或更長時間。 實施例67.     實施例60至66中任一項之方法，其中在該投與後，腦組織中之NAA含量降低。 實施例68.     實施例67之方法，其中腦組織中之該等NAA含量降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。 實施例69.     實施例67或68之方法，其中腦組織中之該等NAA含量保持相對於治療前含量降低達至少6個月、9個月、12個月、18個月、24個月或更長時間。 實施例70.     實施例1至69中任一項之方法，其中在該投與後，可使用磁共振成像(MRI)觀測到新髓鞘形成。
圖 1展示在實例1之研究中使用之自互補AAV (scAAV)載體的設計，該載體稱為「scAAV9-CB6-h ASPAopt」，包含CB6啟動子及經密碼子優化之編碼人類ASPA蛋白之轉殖基因。縮寫：CMV：細胞巨大病毒；IE：即刻早期；ITR：反向末端重複序列。
圖 2展示用BBP-812中間及高劑量方案處理之動物的重量。前32天，每隔一天獲取重量，且之後每兩週獲取重量(各n=10)。
圖 3展示對腦部之磁共振光譜分析，其展示相對於總肌酸(tCr)正規化之總N-乙醯天冬胺酸(tNAA)含量(n=3)。
圖 4展示野生型(WT)小鼠、未處理小鼠及用BBP-812處理之小鼠中出生後第(PND) 27、90、180及364天之測試時間點的運動行為。
圖 5A及 圖 5B展示PND 1用2.6×10 13、8.8×10 13及2.6×10 14載體基因體/千克(vg/kg)之BBP-812處理之野生型及 Aspa-/-(剔除、KO)小鼠中的腦部組織學。(CA3：海馬角3；Ce：小腦；Cx：皮質；DG：齒狀回)。
圖 6展示CNS之十一個不同區域，在投與載體之後第364天使用ddPCR分析該等區域之載體基因體複本數/細胞。(BS：腦幹；CBL：小腦；CSC：頸部脊髓；CNS：中樞神經系統；Cx：皮質；ddPCR：微滴式數位聚合酶鏈式反應；HPC：海馬回；LMN：頂蓋；LSC：腰脊髓；MB：中腦)。
圖 7A及 圖 7B展示PND1 (出生後第1天)用BBP-812處理之野生型 Aspa-/-小鼠中的腦部組織學。
圖 8展示獲取且用於測定BBP-812生物分佈及h ASPAOpt轉殖基因表現之樣品的位置。
圖 9A-9E展示腦( 圖 9A)、脊髓( 圖 9B)、肝臟( 圖 9C)、心臟( 圖 9D)及腎臟( 圖 9E)中之BBP-812的評估。對於腦及脊髓，將各個別組織區域繪製為個別資料點。
圖 10A及 圖 10B展示肌酸激酶( 圖 10A)及乳酸脫氫酶( 圖 10B)之量測。
圖 11展示ELISA結果，其展示來自媒劑(V)、1×10 14vg/kg經處理之動物(L)或3×10 14vg/kg經處理之小鼠(H)的脾細胞對培養基(陰性對照)、ConA (陽性對照)及肽池，對AAV9及ASPA之反應性。(SFU：點形成單位)。
圖 12展示在來自4、12及24週生物分佈樣品之3×10 14vg/kg劑量組中偵測到之載體基因體(上圖)及轉殖基因RNA (下圖)。
圖 13展示治療卡納萬氏病之基因療法之1/2期研究的時間表及總體設計。(d：天數；DSMC：資料及安全性監測委員會；kg：千克；mo：月；N：參與者數目；vg：載體基因體)。
圖 14展示研究劑量發現、觀測及登記擴增順序。
圖 15展示糖皮質激素預防及逐漸減少方案。
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Claims (70)

  1. 一種方法，其包含：向個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus；rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(inverted terminal repeat；ITR)之核酸分子，及 (ii)  編碼天冬醯轉移酶(aspartoacylase；ASPA)之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內。
  2. 一種在有需要個體中表現天冬醯轉移酶(ASPA)之方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及 (ii)  編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內，藉此在該個體中表現ASPA。
  3. 一種增加有需要個體中天冬醯轉移酶(ASPA)含量的方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及 (ii)  編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內，藉此增加該個體中之ASPA含量。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該個體需要ASPA之表現。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該個體具有經降低之ASPA含量及/或功能。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該個體患有腦白質失養症。
  7. 一種治療有需要個體之腦白質失養症的方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及 (ii)  編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內， 藉此治療該個體之腦白質失養症。
  8. 如請求項6或請求項7之方法，其中該腦白質失養症與選自由以下組成之群之病狀相關聯：卡納萬氏病(Canavan disease)、腎上腺脊髓神經病、亞歷山大氏病(Alexander disease)、腦腱性黃色瘤症、克拉培氏病(Krabbe disease)、異染性腦白質失養症、腎上腺腦白質失養症、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)及雷夫蘇姆氏病(Refsum disease)。
  9. 如請求項8之方法，其中該腦白質失養症與卡納萬氏病相關聯。
  10. 如請求項6至9中任一項之方法，其進一步包含在投與該rAAV載體之前挑選患有腦白質失養症之個體。
  11. 一種治療有需要個體之卡納萬氏病的方法，其包含：向該個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)之核酸分子及 (ii)  編碼ASPA之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於啟動子；且 其中該治療有效量在約10 13vg/kg至約10 15vg/kg範圍內， 藉此治療該個體之卡納萬氏病。
  12. 如請求項11之方法，其進一步包含在投與該rAAV載體之前挑選患有卡納萬氏病之個體。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該rAAV載體之投與引起ASPA在該個體組織中表現。
  14. 如請求項13之方法，其中該組織為周邊組織或中樞神經系統(central nervous system；CNS)組織。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中已確定該個體中存在包含從糖酵解作用轉變成β-氧化作用之代謝失衡。
  16. 如請求項15之方法，其中該方法進一步包含藉由評估一或多種糖酵解作用及/或β-氧化作用因子之含量來偵測該代謝失衡。
  17. 如請求項16之方法，其中該等一或多種糖酵解作用及/或β-氧化作用因子之含量係使用獲自該個體之中樞神經系統(CNS)體液進行評估。
  18. 如請求項15至17中任一項之方法，其中該方法進一步包含： (a)   自該個體獲得CNS體液； (b)  偵測該CNS體液中經增加之β-氧化作用；及 (c)   基於(b)中之該偵測結果，向該個體投與該rAAV。
  19. 如請求項15至18中任一項之方法，其中該方法進一步包含：(a)量測獲自該個體之生物樣品之代謝概況；及(b)基於該代謝概況鑑別包含糖酵解作用轉變成β-氧化作用之代謝失衡。
  20. 如請求項19之方法，其中量測該代謝概況包含使用液相層析(liquid chromatography；LC)、質譜分析(mass spectrometry；MS)、液相層析/質譜分析(LC/MS)或超高效液相層析-串聯質譜分析(Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectroscopy；UPLC-MS/MS)分析該生物樣品。
  21. 如請求項19或請求項20之方法，其中該生物樣品包含血液、血清、CNS組織或腦脊髓液(cerebrospinal fluid；CSF)。
  22. 如請求項21之方法，其中該CNS組織為腦組織。
  23. 如請求項19至22中任一項之方法，其中該代謝概況包含選自由以下組成之群之第一生物標記物的含量：葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、3-磷酸甘油酸、丙酮酸鹽、乳酸鹽及磷酸烯醇丙酮酸鹽。
  24. 如請求項19至23中任一項之方法，其中該代謝概況包含選自由以下組成之群之第二生物標記物的含量：肉鹼、丙二醯肉鹼、肉豆蔻醯肉鹼、棕櫚醯肉鹼、丙二醯肉鹼及β-羥基丁酸鹽。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該治療有效量在約10 14vg/kg至約5×10 14vg/kg範圍內。
  26. 如請求項25之方法，其中該治療有效量為約1.32×10 14vg/kg。
  27. 如請求項25之方法，其中該治療有效量為約3×10 14vg/kg。
  28. 如請求項1至27中任一項之方法，其中該rAAV經由輸注投與。
  29. 如請求項28之方法，其中該rAAV經由靜脈內輸注投與。
  30. 如請求項1至27中任一項之方法，其中該rAAV經由注射投與。
  31. 如請求項30之方法，其中該注射係選自由靜脈內注射、血管內注射及腦室內注射組成之群。
  32. 如請求項1至31中任一項之方法，其中該個體小於或等於30月齡。
  33. 如請求項1至32中任一項之方法，其中ASPA包含人類ASPA蛋白。
  34. 如請求項1至33中任一項之方法，其中ASPA包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 6具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之胺基酸序列。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該啟動子為星狀細胞特異性啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein；GFAP)啟動子或增強型雞β-肌動蛋白啟動子。
  36. 如請求項1至35中任一項之方法，其中該啟動子為細胞巨大病毒/β-肌動蛋白雜合啟動子或PGK啟動子。
  37. 如請求項36之方法，其中該細胞巨大病毒/β-肌動蛋白雜合啟動子為CAG啟動子、CB6啟動子或CBA啟動子。
  38. 如請求項1至37中任一項之方法，其中該編碼ASPA之非AAV核苷酸序列包含人類 ASPAcDNA或由人類 ASPAcDNA組成。
  39. 如請求項1至38中任一項之方法，其中該編碼ASPA之非AAV核苷酸序列包含密碼子優化之核苷酸序列或由密碼子優化之核苷酸序列組成。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該編碼ASPA之非AAV核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1或由SEQ ID NO: 1組成。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法，其中該非AAV核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 6具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之胺基酸序列。
  42. 如請求項1至41中任一項之方法，其中該核酸分子包含細胞巨大病毒即刻早期強化子(immediate-early enhancer)。
  43. 如請求項1至42中任一項之方法，其中該核酸分子包含兔β-球蛋白多聚A信號。
  44. 如請求項1至43中任一項之方法，其中該核酸分子包含科紮克序列(Kozak sequence)。
  45. 如請求項1至44中任一項之方法，其中該核酸分子包含miR-122結合位點。
  46. 如請求項1至45中任一項之方法，其中該ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型ITR。
  47. 如請求項1至46中任一項之方法，其中該rAAV為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型rAAV。
  48. 如請求項1至47中任一項之方法，其中該rAAV為AAV9血清型rAAV。
  49. 如請求項1至48中任一項之方法，其中該rAAV為自互補rAAV (self-complementary rAAV；scAAV)。
  50. 如請求項1至49中任一項之方法，其中該rAAV為單股rAAV (single-stranded rAAV；ssAAV)。
  51. 一種方法，其包含： 經由靜脈內輸注向個體投與約1.32×10 14vg/kg之重組自互補腺相關病毒9 (scAAV9)載體，其中該rAAV9載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)、細胞巨大病毒即刻早期強化子、科紮克序列及兔β-球蛋白多聚A信號之核酸分子；及 (ii)  編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於引導該個體中ASPA之表現的CB6啟動子， 其中該個體小於或等於30月齡，且其中該個體患有卡納萬氏病。
  52. 一種方法，其包含： 經由靜脈內輸注向個體投與約3×10 14vg/kg之重組自互補腺相關病毒9 (scAAV9)載體，其中該rAAV9載體包含： (i)   包含至少一個AAV反向末端重複序列(ITR)、細胞巨大病毒即刻早期強化子、科紮克序列及兔β-球蛋白多聚A信號之核酸分子；及 (ii)  編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之非AAV核苷酸序列，其中該非AAV核苷酸序列可操作地連接於引導該個體中ASPA之表現的CB6啟動子， 其中該個體小於或等於30月齡，且其中該個體患有卡納萬氏病。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法，其進一步包含：(a)向該個體投與小分子代謝調節劑；(b)給該個體開立膳食干預，其中該膳食干預促進該個體中糖酵解作用及/或減少β-氧化作用；及/或(c)向該個體投與免疫抑制劑。
  54. 如請求項1至53中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與治療有效量之糖皮質激素。
  55. 如請求項54之方法，其中該糖皮質激素在投與該rAAV載體之前、與之同時及/或在其之後投與。
  56. 如請求項54或請求項55之方法，其中該糖皮質激素為普賴蘇穠(prednisolone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)或其組合。
  57. 如請求項1至56中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與治療有效量之抗組織胺。
  58. 如請求項57之方法，其中該抗組織胺在投與該rAAV載體之前、與之同時及/或在其之後投與。
  59. 如請求項57或請求項58之方法，其中該抗組織胺為苯海拉明(diphenhydramine)、羥嗪(hydroxyzine)、氯菲安明(chlorpheniramine)或其任何組合。
  60. 如請求項1至59中任一項之方法，其中在該投與後，尿液、腦脊髓液(CSF)及/或腦組織中之N-乙醯天冬胺酸(N-acetylaspartate；NAA)含量降低。
  61. 如請求項60之方法，其中在該投與後，尿液中之NAA含量降低。
  62. 如請求項61之方法，其中尿液中之該等NAA含量降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。
  63. 如請求項61或62之方法，其中尿液中之該等NAA含量相對於治療前含量保持降低達至少6個月、9個月、12個月、18個月、24個月或更長時間。
  64. 如請求項60至63中任一項之方法，其中在該投與後，CSF中之NAA含量降低。
  65. 如請求項64之方法，其中CSF中之該等NAA含量降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。
  66. 如請求項64或65之方法，其中CSF中之該等NAA含量相對於治療前含量保持降低達至少6個月、9個月、12個月、18個月、24個月或更長時間。
  67. 如請求項60至66中任一項之方法，其中在該投與後，腦組織中之NAA含量降低。
  68. 如請求項67之方法，其中腦組織中之該等NAA含量降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。
  69. 如請求項67或68之方法，其中腦組織中之該等NAA含量相對於治療前含量保持降低達至少6個月、9個月、12個月、18個月、24個月或更長時間。
  70. 如請求項1至69中任一項之方法，其中在該投與後，可使用磁共振成像(magnetic resonance imaging；MRI)觀測到新髓鞘形成。
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