KR20210131236A - Aav9을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그의 이용 - Google Patents
Aav9을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그의 이용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 골 질환을 치료하기 위한 유전자 전달을 위해, AAV9를 이용한 골 질환 치료제 및 이를 포함하는 골 대체제에 관한 것이다. 본 발명의 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용하면, 우수한 골 전도성, 골 유도성, 골 형성성을 바탕으로 기존 골 질환 치료제와 비교하여 현저한 골 예방 또는 치료효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 AAV9은 다른 유전자 도입 벡터와 달리, 인체에서 부작용을 거의 일으키지 않으며, 본 발명의 골 대체제는 국소적인 적용이 가능하여 부작용 발생 가능성이 현저히 낮다. 또한, 본 발명의 골 대체제는 유전자 도입 벡터인 AAV9의 소모량을 현저히 줄일 수 있어, 생산비용을 현저히 낮출 수 있다. 따라서, 상기와 같은 특성을 바탕으로 본 발명은 의약업계에서 널리 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 골 질환을 치료하기 위한 유전자 전달을 위해, AAV9를 이용한 골 질환 치료제 및 이를 포함하는 골 대체제에 관한 것이다.
골다공증은 골량의 소실을 특징으로 하는 질병이며, 노화와 연관이 있는 노쇠 및 고통의 주요 원인이다. 1,000만 명으로 추정되는 50세 이상의 미국인이 골다공증을 앓고 있고, 매년 대략 150만 명의 사람에서 골다공증-관련 골절이 발생하며, 이는 심각한 건강 결과를 초래한다. 골다공증에 대한 기존의 대부분의 치료제는 파골세포(OC)에 의한 뼈의 재흡수를 억제하고, 이러한 억제는 턱의 비전형 골절 및 골괴사를 비롯한 수많은 부작용을 동반한다. 간헐적 부갑상선 호르몬(PTH)은 골아세포(OB) 기능을 촉진하는 동화제(anabolic agent)이며, 골다공증을 앓고 있는 환자의 치료에 이용가능하다. 그러나, 이러한 약제는 PTH-유도 골 종양에 대한 두려움으로 인해 그 사용이 제한된다. 또한, 새로 개발된 동화제인 항-스클레로스틴 항체(anti-sclerostin antibody)는 향상된 Wnt 신호전달을 통해 OB 분화를 촉진한다. 그러나, 이러한 약제는 TNF-의존성 염증의 증가 및 뇌졸중 발병의 증가로 인한 염증성 관절염-유도 골 소실을 치료하는데 문제가 될 것이다. 마지막으로, 카텝신 K(Cathepsin K)의 소분자 억제제(즉, 오다나카팁(odanacatib))은 새로 개발된 약제로서, 골 리모델링 및 재생 활성에 미치는 악영향을 제한하면서 파골세포 활성을 억제함으로써 골다공증에서의 골 소실을 예방한다. 그러나, 이는 뇌졸중 발병의 증가로 인해 FDA 고려 사항으로부터 철회되었다. 따라서, 비-골격 조직에 미치는 악영향을 제한하면서 골 형성을 촉진하는 골다공증에 대한 신규한 치료 전략을 개발하는 것이 시급하다.
큰 골 결손(large bone defects)의 치유는 정형 외과적 관리에서 가장 어려운 문제점들 중 하나로 남아 있다. 이 같은 상처는 고에너지 외상, 골수염의 골 또는 외과적 관리를 수반하는 종양의 외과적 절제 이후에 야기될 수 있다. 이들 결과로 인해, 정의에 따르면 골 이식편의 삽입과 같은 중재 없이 치유할 수 없는 소의 임계 크기의 골격 결함(critical sized skeletal defects)이 초래할 수 있다. 유사하게, 복합 외상 중 15% 이상은 종종 글루코코르티코이드 사용, 흡연 또는 혈관 질병과 같이 골 수선(bone repair)의 내생성 기작을 억제하는 환자 요인으로 인해 골격 골절의 지속적 불유합이 초래한다. 특히, 이들 병태와 연관이 있는 높은 수준의 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality)이 초기 상처 동안에 일어나는 것이 아니라, 장기간의 요양 기간 동안에 일어나며, 이때 운동 장애로 인해 환자는 추가의 상태악화, 폐렴 또는 폐색전증에 노출되게 된다. 따라서, 이들 시나리오에서 환자 결과의 개선은 운동 회복을 가속화시키기 위해 골격 치유의 가속화에 의존한다. 현재, 미국에서만 매년 500,000회 초과의 골 이식편 수술이 수행되고 있다.
자가 골 이식편(autologous bone graft)은 골전도, 골유도 및 골발생을 비롯한 3개의 주요 요소를 구현하고, 가장 중요하게는 동종성 또는 이종성 골 이식편에 대한 숙주 면역 반응의 위험성 없이 골발생을 촉진할 수 있기 때문에 가장 적합하다. 그러나, 환자의 경우 전신 마취가 요구되며, 채취 현장에서의 합병증, 및 수술 동안의 통증 및 수술 이후의 걷기를 견뎌야 한다는 점에서 환자의 신체로부터 자가 골 이식편을 수득하는데 있어서 제한이 있다. 또한, 자가 골 이식편은 노인 환자, 및 골질이 나쁜 만성 질병을 갖는 환자에는 적합하지 않다. 최종적으로, 자가 골 이식편의 채취를 위한 전신 마취는 노인 환자의 경우 마취에서 회복할 수 없기 때문에 노인 환자에게는 권장되지 않는다. 따라서, 새로운 골 이식편 대체물의 개발이 이들 환자를 치료하는데 있어 충족되지 않은 요구이다.
골 대체물로서, 골유도 능력을 갖는 동종 골은 구조적 지지체를 제공하기 위해 사용된다. 그러나, 단독으로 사용되는 경우, 골유도 또는 골발생 기능의 결여로 인해 감염 영역에서의 골 형성이 억제된다. 또한, 높은 관리 및 보관 비용 및 잠재적인 감염 위험성은 상업용 사용에 있어 단점으로서 알려졌다. 탈회된 골 물질(demineralized bone material; DBM)은 동종 골로서 흔히 사용된다. 임상전 연구에서의 이의 상당한 치료 효과에도 불구하고, 임상 시험에서의 이들의 효과를 증명하기 위한 증거가 여전히 불충분한 상황이다. 최근, 골 형성 단백질-2(BMP-2)을 보충하면 DBM의 골유도와 우수한 생체 적합성 및 골발생이 향상될 수 있다. 그러나, 골유도 물질이 필요 시 확산 없이 상처 부위에 남아 있는 것이 불가능하므로 골 치유에 대한 높은 치료 효능을 달성하기 어렵다. 비수술적 골발생 촉진 물질로서, 부갑상선 호르몬(PTH) 및 혈소판 풍부 혈장(PRP)이 또한 제안되고 있지만, 이들의 치료 효과는 여전히 충분하지 않다. 최종적으로, 중간엽 줄기 세포(MSC)가 자가 재생 특성 및 골 형성 골아세포로 분화하는 전분화능(pluripotency)을 갖고 있으므로, 유전 물질을 이들 세포에 도입하여 골발생 인자를 생산할 수 있다. 그러나, 최근 한국에서 대내 문제가 되었던 Invossa로부터 알 수 있는 바와 같이, 유전적으로 변형된 줄기 세포를 사용할 때에는 임상적 사용 이전에 많은 안전성 문제를 해결해야 한다.
재조합 아데노-부속 바이러스(rAAV)는 관련 임상전 및 임상 연구에서 안전성 및 효능에 대한 장기간의 추적 기록이 있으며, 전 세계에 걸쳐 130회 초과의 임상 시험 및 2,000명의 환자에서 평가되었다. 길이가 대략 4.7 kb인 단일 가닥 유전체를 갖는 소형(26 ㎚)의 비외피성 파보바이러스인 AAV는 높은 형질 도입 효율, 지속적인 이식 유전자 발현, 및 감염 후 면역원성 및 병원성 결여를 나타내며, 이로 인해 AAV는 유전자 요법에 사용하기 위한 매력적인 바이러스 벡터가 된다. 이 방법은 세포를 직접 주입하지 않기 때문에 기존의 세포 기반 유전자 치료 방법에서 제기되었던 안전 문제가 해결되며, 그 유전자 도입 효율과 발현 또한 우수하다. 또한 AAV는 아직까지 인체에 질병과 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 있고, 독립된 episome 형태로 유전자 발현을 하기 때문에 환자의 유전자 변이 (genotoxicity)의 위험성 또한 매우 낮다. 이러한 AAV 매개 유전자 도입의 강점을 바탕으로 이미 다른 영역에서는 임상적 치료제 개발에 적용되고 있으며, 현재 Parkinson disease, Spinal muscular atrophy, Choroideraemia, Haemophilia B 등의 질환에서 I/II상 또는 III상의 임상 실험이 시행되고 있다. 그리고, 최근에 선천적 실명 치료제 '럭스터나'와 지단백지질분해효소 결핍 치료제 '글리베라', 척수성 근위축증 치료제 '졸겐스마' 등이 US food and drug administration (FDA)에서 AAV 매개 유전자 치료제로 통과되었다.
최근, 본 발명자들은 rAAV9 벡터가 골 형성 골아세포(OB)의 형질 도입에 매우 효과적이며, 이 벡터는 Shn3 발현을 사일런싱하는 인공-마이크로 RNA를 시험관 내에서 OB로 전달할 수 있고, 또한 골 표면 상에 상주하는 OB로 전달할 수 있다는 것을 증명한 바 있다(Y. S. Yang et al., Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis. Nat
Commun 10, 2958 (2019)).
또한, 골 표적화 펩티드 모티프((AspSerSer)6, DSS)를 VP2 캡시드 단백질의 N-말단(rAAV9.DSS-Nter) 상에 이식하면 rAAV9가 골 조직 내의 주요 무기 성분인 하이드록시아파타이트(HA)의 부착이 가능하게 되고, 마우스에 전신 투여되는 경우에 rAAV9의 골-특이적 굴성(bone-specific tropism)의 개선이 가능하게 된다.
이러한 골 표적화 rAAV9-매개 유전자 사일런싱 기술을 사용하여 본 발명자들은 골 형성 억제제인 Schurri-3(SHN3) 및/또는 스클레로스틴(SOST)의 골 표적화 rAAV9-매개 사일런싱에 의해 OB에서의 WNT 신호전달이 향상되고, OB 활성이 증가되며, 골 형성이 촉진된다는 것을 증명하였다.
게다가, 본 발명자의 연구에 따르면 폐경 후 및 노화 연관 골다공증의 마우스 모델에서의 이의 전신 전달로 인해 골 소실이 반전되는 것으로 증명되었다. 골 증가에 미치는 이의 전신 효과 이외에도, 골 표적화 rAAV9 벡터의 전신 전달은 또한 골 재생을 촉진함으로써 골 골절 및 임계 크기 골 결함(critical sized-bone defect)에 미치는 국부적 치료 효과를 나타낸다. 최종적으로, 마우스의 임계 크기의 골 결함 영역에 이식하는 경우, SHN3 또는 SOST 사일런서를 갖는 rAAV9.DSS-Nter 벡터는 OB 활성을 증가시킴으로써 골 치유를 촉진한다.
본 발명자들은 골 질환 치료를 위한 유전자 치료 방법을 연구하던 중, AAV의 혈청형 중에서 AAV9이 조골세포와 파골세포에 가장 효율적으로 형질도입을 하는 것을 확인하였으며, RANK,
ctsk
,
Shn3 또는
SOST(Sclerostin)의 발현을 억제하는 것을 통해 골 질환의 치료가 가능한 것을 확인하여, RANK,
ctsk
,
shn3, SOST(Sclerostin) 또는 shn3
및
SOST(Sclerostin)의 발현 억제용 miRNA를 담지하는 AAV9를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료제를 완성하였다.
또한, 골 표적 펩티드 모티프를 AAV9에 삽입하여 골 조직에 대한 전달 특이성을 높일 수 있음을 확인하여, AAV9를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료제의 골 표적 특이성을 높이는데 성공하였다.
또한, AAV9를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료제를 골 대체제에 부착시켜, 국소적으로 적용가능하며 효과적으로 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 골 대체제를 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 AAV9을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 골 대체제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miRNA-RANK, miRNA-ctsk, miRNA-shn3, miRNA-SOST(sclerostin) 또는 miRNA-SOST
/
shn3을 담지하는 AAV을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 AAV9의 캡시드에 골 표적 단백질 모티프(bone-targeting peptide motifs)가 삽입된 AAV9을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함하는 골 대체제를 제공한다.
본 발명의 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용하면, 우수한 골 전도성, 골 유도성, 골 형성성을 바탕으로 기존 골 질환 치료제와 비교하여 현저한 골 예방 또는 치료효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 AAV9은 다른 유전자 도입 벡터와 달리, 인체에서 부작용을 거의 일으키지 않으며, 본 발명의 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함하는 골 대체제는 국소적인 적용이 가능하여 부작용 발생 가능성이 현저히 낮다.
또한, 본 발명의 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함하는 골 대체제는 전신적 정맥 투여로 적용하는 방식과 비교하여, 유전자 도입 벡터인 AAV9의 소모량을 10 내지 20% 까지 줄일 수 있어, 생산비용을 현저히 낮출 수 있다.
따라서, 상기와 같은 특성을 바탕으로 본 발명은 의약업계에서 널리 사용될 수 있다.
도 1a은 COB, BM-OCP, ATDC5 세포에 대한 14종의 AAV 혈청형의 형질 도입능을 EGFP 발현을 통해 확인한 도이다.
도 1b는 COB, BM-OCP, ATDC5 세포에 대한 14종의 AAV 혈청형의 형질 도입능을 평가하기 위해, Hsp90단백질에 대한 EGFP의 상대적 발현을 비교한 도이다.
도 2a는 투여 2주 후, 마우스 뒷다리(hind limb)에서의 EGFP 발현을 IVIS-100 광학 이미지로 확인한 도이다.
도 2b는 냉동 절단(cryo-sectioned)된 대퇴골의 EGFP 발현을 형광 현미경으로 확인한 도이다(TB, trabecular bone; BM, bone marrow; GP, growth plate; CB, cortical bone. Scale bars: 500μm).
도 2c는 대퇴골에서 EGFP를 발현하는 세포를 고배율 이미지(High magnification image)로 확인한 도이다(Scale bars: 100μm).
도 2d는 냉동 절단된 대퇴골의 조골세포, 성숙 파골세포 및 골세포를 확인하기 위해, Bglap, Runx2, Ctsk 및 SOST에 대한 면역염색 후 관찰한 도이다(Scale bars: 25μm).
도 3a는 투여 2주 후, 각각의 조직에 대한 EGFP 발현을 형광 현미경으로 관찰한 도이다.
도 3b는 투여 2주 후, 냉동 절단된 심장과 간의 EGFP 발현을 형광 현미경을 통해 확인한 도이다(Scale bars: 50μm).
도 3c는 투여 2주 후, 냉동 절단된 대퇴골의 EGFP 발현을 형광 현미경을 통해 확인한 도이다. (Scale bars: 500μm(좌), 75 μm(우))
도 3d는 투여 2주 후, 각각의 조직 용해물을 항-GFP 항체로 면역 블롯한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 타목시펜 투여 2개월 후, 냉동 절단된 대퇴골의 EGFP 발현 조골세포를 확인한 도이다(Scale bars: 25μm).
도 4b는 타목시펜 투여 2개월 후, 대퇴골 소주골을 microCT를 이용하여 확인한 도이다(Scale bars: 1mm).
도 4c는 타목시펜 투여 2개월 후, 대퇴골 소주골을 상대적으로 정량한 것을 나타낸 도이다(Trabecular bone volume/total volume (Tb. BV/TV), trabecular thickness (Tb.Th), trabecular number per cubic millimeter (Tb.N), and trabecular space (Tb. Sp) (n=6 per group)).
도 5a는 투여 2개월 후, 경골 RNA에서 cre 및 shn3 mRNA의 발현을 측정하고, hprt 유전자로 정규화하여 비교한 도이다.
도 5b는 주사 2개월 후, 냉동 절단된 대퇴골을 형광현미경으로 관찰하여 EGFP 발현 세포를 나타낸 도이다(Scale bars: 250μm).
도 5c는 투여 2개월 후, 대퇴골의 소주골을 microCT를 이용하여 확인한 도이다(Scale bars: 1 mm).
도 5d는 투여 2개월 후, 대퇴골 소주골을 상대적으로 정량한 것을 나타낸 도이다(Trabecular bone volume/total volume (Tb. BV/TV), trabecular thickness (Tb. Th), trabecular number per cubic millimeter (Tb. N), and connective density (Conn. Dn) (n=6 per group)).
도 6은 shn3을 표적으로 하는 amiR 카세트(amiR-shn3) 및 대조군 카세트(amiR-ctrl)를 도식화하여 나타낸 도이다.
도 7a는 투여 2개월 후, EGFP 발현을 IVIS-100 광학 이미지를 통해 확인한 도이다.
도 7b는 투여 2개월 후, 냉동 절단된 대퇴골의 EGFP 발현을 형광현미경으로 확인한 도이다(Scale bars: 250μm).
도 8은 대퇴골의 FACS로 분류된 EGFP 발현 세포에서 EGFP 단백질(상)과 hprt로 정규화된 shn3 mRNA(하) 수준을 나타낸 도이다.
도 9a는 투여 2개월 후, 대퇴골 소주골을 microCT를 이용하여 확인한 도이다(Scale bars: 1mm).
도 9b는 투여 2개월 후, 대퇴골 소주골을 상대적으로 정량한 것을 나타낸 도이다(n=6 per group).
도 10a는 투여 2개월 후, 경골 RNA내 shn3 mRNA 수준을 hprt로 정규화하여 나타낸 도이다(n=8 per group).
도 10b는 투여 2개월 후, 대퇴골 소주골을 microCT를 이용하여 확인한 도이다(Scale bars: 1 mm).
도 10c은 투여 2개월 후, 대퇴골 소주골을 상대적으로 정량한 것을 나타낸 도이다(n=8 per group).
도 10d는 칼세인/알리자린을 붉게 표시하여 나타낸 도이다(Scale bars: 50μm).
도 10e는 조직형태를 수치화하여 나타낸 도이다(BFR/BS, bone formation rate/bone surface; MAR, mineral apposition rate; Ob.S/BS, osteoblast surface/bone surface).
도 11a는 난소 절제술 2 개월 후, 대퇴골 소주골을 microCT를 이용하여 확인한 도이다(Scale bars: 1mm).
도 11b는 난소 절제술 2 개월 후, 대퇴골 소주골의 BV/TV를 측정하여 나타낸 도이다.
도 12a는 골다공증에서 rAAV9-amiR-shn3의 치료 효과를 시험하기 위한 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 12b는 투여 7주 후, 냉동 절단된 대퇴골의 EGFP 발현 세포를 확인한 도이다(Scale bars: 250μm).
도 12c는 투여 7주 후, 경골에서 발현된 shn3 mRNA를 hprt로 정규화하여 나타낸 도이다(n=8 ~ 12).
도 12d는 투여 7주 후, 대퇴골 소주골을 microCT를 이용하여 확인한 도이다(Scale bars: 1mm).
도 12e는 투여 7주 후, 대퇴골 소주골을 상대적으로 정량한 것을 나타낸 도이다(n=7 ~ 8 per group).
도 12f는 투여 7주 후, 칼세인/알리자린을 붉게 표시하여 나타낸 도이다(Scale bars: 50μm)(화살표는 칼세인과 알리자린 사이의 거리를 의미).
도 12g는 투여 7주 후, 조직형태를 수치화하여 나타낸 도이다.
도 12h는 투여 7주 후, 대퇴골의 기계적 특성을 정량화하여 나타낸 도이다.
도 13은 AAV9 캡시드의 DSS 삽입위치를 도식화하여 나타낸 도이다.
도 14a는 벡터 처리 2일 후, EGFP의 발현을 나타낸 도이다.
도 14b는 벡터 처리 2일 후, EGFP의 발현을 형광 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 도이다.
도 15는 벡터 처리 2일 후, fast blue 염색을 통해 ALP 활성을 측정한 것을 나타낸 도이다.
도 16a는 투여 2주 후, 각 조직에서의 EGFP 발현을 IVIS-100 광학 이미지로 확인한 도이다.
도 16b는 투여 2주 후, 조직 용해물에서 EGFP 발현을 면역 블롯을 이용하여 나타낸 도이다.
도 16c는 조직 용해물에서 EGFP 발현을 면역 블롯을 이용하여 측정한 것을 정량한 도이다(n=3 per group).
도 16d는 투여 2주 후, 냉동 절단된 대퇴골에서 EGFP 발현 세포를 형광현미경으로 확인한 것을 나타낸 도이다.
도 16e는 투여 2주 후, 골 표면당 냉동 절단된 대퇴골에서 EGFP 발현세포의 수를 정량하여 나타낸 도이다(n= 5 per group).
도 17a는 투여 7주 후, 경골에서의 shn3 mRNA 수준을 나타낸 도이다(n= 10 per group).
도 17b는 투여 7주 후, 대퇴골의 소주골을 microCT를 이용하여 정량한 것을 나타낸 도이다(n= 6 ~ 8 per group).
도 17c는 투여 7주 후, 대퇴골의 소주골을 microCT를 이용하여 확인한 도이다.
도 17d는 투여 7주 후, 요추의 소주골을 microCT를 이용하여 확인한 도이다.
도 17e는 투여 7주 후, 요추의 소주골을 microCT를 이용하여 정량한 것을 나타낸 도이다(n= 6 ~ 8 per group).
도 18은 rAAV9.EGFP 투여 후, 마우스 대퇴골에서 EGFP 발현 세포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 rAAV9.EGFP 투여 후, EGFP를 발현하는 골수세포의 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 rAAV9.EGFP 투여 후, EGFP 발현을 통해 형질도입에 효과적인 세포군을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 파골 세포를 표적으로하는 Cre- 결실 마우스(Rankfl
/fl; Ctsk)에서 RANK 대립 유전자를 조건부 결실시켰을 때, 마우스의 뼈에 나타나는 변화를 확인한 도이다.
도 22는 Cre 재조합 효소를 발현하는 rAAV9 벡터(rAAV9.Cre)를 생성하여 파골 세포 계통 세포에서 RANK의 결실을 유도하였으며, Cre 유전자와 RANK 유전자의 발현을 측정한 도이다.
도 23은 rAAV9.Cre 투여에 의한 RANK 결실 및 이에 의한 대퇴골 분석결과를 나타낸 도이다.
도 24는 RANK (tnfrsf11a) 및 카텝신 K (ctsk)를 사일런싱시키기 위한 벡터 및 이에 의한 녹다운 효율을 나타낸 도이다.
도 25a는 rAAV9.amiR-RANK 또는 rAAV9.amiR-ctsk 벡터 처리에 의한 골 재흡수 활성 변화를 확인한 도이다.
도 25b는 rAAV9.amiR-RANK 또는 rAAV9.amiR-ctsk
투여에 의한 대퇴골의 EGFP 발현을 확인한 도이다.
도 25c는 rAAV9.amiR-Ctrl 처리된 대퇴골과 비교하여, rAAV9.amiR-RANK 또는 rAAV9.amiR-ctsk 처리된 대퇴골에서 RANK 또는 ctsk mRNA 발현을 측정한 도이다.
도 25d 및 도 25e는 rAAV9.amiR-Ctrl 처리된 대퇴골과 비교하여, rAAV9.amiR-RANK 또는 rAAV9.amiR-ctsk 처리된 대퇴골을 분석한 도이다.
도 26은 rAAV9.amiR-RANK 또는 rAAV9.amiR-ctsk 벡터 처리된 대퇴골의 골간단에서 조직형태측정(histomophometry) 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14의 구조를 나타낸 도이다.
도 28a은 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14의 HA-결합 친화도를 측정한 도이다.
도 28b는 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14의 파골세포에 대한 형질도입능을 측정한 도이다.
도 29는 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14 투여 시 생체 내 분포를 측정한 도이다.
도 30은 폐경기 이후 골다공증 모델에 AAV9.DSS-amiR-ctsk
투여시 ctsk mRNA의 발현 변화 및 대퇴골의 변화를 나타낸 도이다.
도 31은 노인성 골다공증 모델에 AAV9.DSS-amiR-ctsk
투여시 ctsk mRNA의 발현 변화 및 대퇴골의 변화를 나타낸 도이다.
도 32는 rAAV9 매개 골질환 치료제와 골 대체제가 적용되는 것을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 33은 골 대체제에 대한 rAAV9의 부착/친화력을 평가하기 위한 실험 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 34는 타가골에 대한 rAAV9의 친화력 시험 결과를 나타낸 도이다(회색: rAAV9, 파란색: rAAV9.DSS, 붉은색: rAAV9.D14).
도 35는 합성골에 대한 rAAV9의 친화력 시험 결과를 나타낸 도이다(Values represent mean ± SD: **, P < 0.01; ***, P < 0.001 by an unpaired two-tailed Student's t-test)
도 36은 rAAV9가 부착된 HA-scaffold에 대한 조골세포 형질도입능을 나타낸 도이다((A) Quantitative RT-PCR analysis. Egpf mRNA는 Hprt (house keeping gene)에 의해 정규화. (B) 항-EGFP 항체를 이용한 면역 블롯 결과. (C) DSS.rAAV9이 부착된 HA-scaffold 표면의 EGFP 발현 COB을 형광 현미경으로 관찰. Scale bar: 1 mm. Values represent mean ± SD: *, P < 0.05; ****, P < 0.0001 by an unpaired two-tailed Student's t-test).
도 37은 rAAV9가 부착된 HA-granule에 대한 조골세포 형질도입능을 나타낸 도이다((A) Quantitative RT-PCR analysis. Egpf mRNA는 Hprt (house keeping gene)에 의해 정규화. (B) DSS.rAAV9이 부착된 HA-granule 표면의 EGFP 발현 COB을 형광 현미경으로 관찰. Scale bar: 1 mm. Values represent mean ± SD: ****, P < 0.0001 by an unpaired two-tailed Student's t-test).
도 38은 마우스 모델에 수술을 통해 유도한 골 결손 부위를 나타낸 도이다.
도 39는 마우스 대퇴골 골절 수술 직후, 2주 후, 6주 후 X-ray 사진을 나타낸 도이다.
도 40은 임계 크기 골 결손 마우스 모델 (mouse model of critical-sized bone defect)을 나타낸 도이다(화살표 머리: 23~25G 니들로 고정된 이식 골).
도 41A는 2월령 및 22월령 마우스의 경골 RNA에서 Shn3 및 Sost의 mRNA 수준을 qPCR 분석에 의해 측정하고 Hprt로 정규화하였다(n = 5마리/그룹).
도 41B는 경골 골절 치유의 동력학을 나타내는 사진 및 X-선 이미지이다.
도 41C는 부상당한 부위로부터 수확된 조직 RNA에 적용하여 Shn3 및 Sost의 mRNA 수준을 측정하였다(n = 5마리/그룹).
도 41D 내지 41E는 amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3(D) 또는 amiR
-
sost 2(F)를 갖는 rAAV9로 처리된 경골 또는 5월령 Shn3
Prx1 마우스(E, n = 5마리 내지 8마리/그룹)의 경골에서 Shn3 및 Sost의 mRNA 수준을 나타낸 것이다. .
도 41G는 CMV 증진제/닭 β-액틴 프로모터(CBA), amiR
-
sost, hs-
amiR
-
shn3 또는 amiR
-
Sost
/hs-
amiR
-
shn3, Egfp 리포터 유전자(EGFP), β-글로빈 폴리A 서열(폴리A) 및 말단 반복서열(TR)을 함유하는 AAV 벡터 유전제의 도면이다.
도 41H는 miR-33의 성숙한 서열 및 종자 서열을 포함하는 마우스 및 인간 miR-33의 뉴클레오티드 서열이다.
도 41I는
amiR
-
ctrl
, amiR
-
shn3, 또는 hs-
amiR
-
shn3을 갖는 단일 투여량(5 x 1013 vg/㎏)의 gffp가 2월령 마우스에 정맥 주사되었고, 2개월 후 경골에서 shn3의 mRNA 수준을 qPCR 분석에 의해 측정하고, Bact에 정규화하였다.
도 41J는 AAV-처리된 마우스에서 대퇴부 골량을 나타내는 마이크로 CT 분석. 상대적 정량화(J, 좌측) 및 대표적인 3D-재구성(J, 우측)이 표시된다. 지주골 부피/총 부피(Tb. BV/TV)를 측정하였다. 스케일 바, 500 ㎛(f).
도 41K는 Ocy454 골세포성 세포주는 AAV 벡터와 함께 인큐베이션하고, 6일 동안 배양되고 표시된 항체로 면역블로팅하였다.
도 41L은 AAV-처리된 Ocy454 세포는 β-카테닌-반응성 리포터 유전자(탑-플래시 Luc)로 형질 감염하고, rWNT3a의 존재 하에서 6일 동안 배양하였으며, 루시페라아제 활성을 측정하였다.
도 41M은 대안적으로, β-카테닌 표적 유전자인 Axin2 및 Lef1의 mRNA 수준을 qPCR 분석에 의해 평가하였다(n = 5/그룹).
값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정(A, C, D-F) 및 원-웨이 ANOVA 검정(I, J, L, M)에 의해 평균 ± SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음.
도 42A는 CMV 증진제/닭 β-액틴 프로모터(CB), amiR
-
ctrl, amiR
-
Sost1, 또는 amiR
-
Sost2, an Egfp 리포터 유전자(EGFP), β-글로빈 폴리A 서열(폴리A), 및 말단 반복(TR)을 함유하는 rAAV9 구조체의 도면이다.
도 42B는 amiR
-
ctrl
, amiR
-
Sost1, 또는 amiR
-
Sost2를 갖는 단일 투여량(5 x 1013 vg/㎏)의 rAAV9.egfp를 12-주령 마우스에 정맥 내 주사하고, 2개월 후에 EGFP 발현을 동결-절단된 대퇴골의 형광 현미경검사에 의해 평가하였다(스케일 바, 250 ㎜(B, 좌측) 및 25 ㎜(B, 우측). BM, 골수; M, 근육; Cb, 피질 뼈)
도 42C는 AAV-처리된 마우스의 경골에서 Sost
mRNA 수준이 RT-PCR에 의해 평가되었다.
도 42D는 AAV-처리된 마우스에서 대퇴부 골량을 나타내는 마이크로 CT 분석. 상대적 정량화(D, 좌측) 및 대표적인 3D-재구성(D, 우측)이 표시된다. 지주골 부피/총 부피(Tb. BV/TV), 지주골 개수(Tb. N), 및 지주골 두께(Tb.Th)를 측정하였다. 스케일 바, 500 ㎛.
값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정 및 원-웨이 ANOVA 검정에 의해 평균 ± SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음.
도 43A는 HEK293 세포는 Flag-SHN3-발현 플라스미드와 함께 hs-amiR-shn3 또는 amiR-ctrl을 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질 감염시켰다. 2일 후, 세포를 용해하고, 항-Flag 항체로 면역블로팅하였다. Hsp90에 대한 면역블로팅을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 43B는 Ocy454 골세포 세포주를 AAV 벡터와 함께 인큐베이션하고, 6일 동안 배양하였으며, Sost 및 Shn3의 mRNA 수준을 qPCR 분석에 의해 측정하였다.
값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정 및 원-웨이 ANOVA 검정에 의해 평균 ± SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음.
도 44A 및 도 44B는 amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3
,
amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3을 갖는 단일 투여량(5 x 1013 vg/㎏)의 rAAV9.DSS를 3월령 수컷 마우스에 정맥 내 주사하였다. 2개월 후, Shn3 및 Sost
(A) 및 β-카테닌 표적 유전자 Axin2 및 Lef1(B)의 mRNA 수준을 경골 RNA에서 평가하고, Gapdh에 정규화하였다(A, n = 8/그룹).
도 44C 및 도 44D는 대퇴부 지주 골량d을 마이크로 CT에 의해 평가하였다. 대표적인 3D-재구성(C) 및 상대적인 정량화(D)가 표시된다(n = 8/그룹). 골지주 부피/총 부피(Tra.BV/TV), 지주골 개수(Tra.N), 지주골 두께(Tra.Th) 및 피질 두께(Cort.Th)를 측정하였다. 스케일 바, 1 ㎜.
값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정 및 원-웨이 ANOVA 검정에 의해 평균 ± SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음.
도 45A는 연구 및 치료 방법의 도면이다.
도 45B는 3월령 암컷 마우스에 대해 모의 또는 OVX 수술을 수행하고, 6주 후에 amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3
,
amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3을 갖는 단일 투여량(5 x 1013 vg/㎏)의 rAAV9.DSS를 정맥 내 주사하였다. 주사 7주 후, 경골 RNA에서 Shn3 및 Sost의 mRNA 수준을 Bact에 대해 정규화한 후 표시하였다(n = 9/그룹).
도 45C 및 도 45D는 대퇴부 지주 골량을 마이크로 CT에 의해 평가하였다. 대표적인 3D-재구성(C) 및 상대적인 정량화(D)가 표시된다(n = 5 내지 10/그룹).
도 45E 및 도 45F는 칼세인/알리자린 레드 라벨링의 대표적인 이미지(E) 및 BFR/BS 및 MAR의 상대적인 조직형태학적 정량화(F). 화살표는 칼세인과 알리자린 레드 라벨링 사이의 거리를 나타낸다.
도 45G는
amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3
,
amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3을 갖는 단일 투여량(5 x 1013 vg/㎏)의 rAAV9.DSS를 18월령 수컷 마우스에 정맥 내 주사하였다. 2개월 후, 경골 RNA에서 Shn3
및
Sost의 mRNA 수준을 qPCR에 의해 평가하고, hprt에 대해 정규화하였다(n = 6/그룹).
도 45H 내지 도 45J는 대퇴골에서 지주 골량(H, I) 및 요추 척추골(L4, J)을 마이크로 CT에 의해 평가하였다. 대표적인 3D-재구성(I) 및 상대적인 정량화(H, J)가 표시된다(n = 8 내지 10/그룹). 스케일 바: 1 ㎜.
스케일 바: 1 ㎜. 값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정 및 원-웨이 ANOVA 검정(B, D, F, G, H, J)에 의해 평균 ± SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음.
도 46은 3월령 암컷 마우스에 대해 모의 또는 OVX 수술을 수행하고, 6주 후에 amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3
,
amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3을 갖는 단일 투여량(5 x 1013 vg/㎏)의 rAAV9.DSS를 정맥 내 주사하였다. 주사 7주 후, 대퇴부 지주골 두께를 마이크로 CT에 의해 평가하였다(n = 5 내지 10/그룹). 값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정 및 원-웨이 ANOVA 검정에 의해 평균 ± SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음.
도 47A는 연구 및 치료 방법의 도면이다.
도 47B는 rAAV9.DSS-amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3
,
amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3을 단일 투여량(5 x 1013 vg/㎏)으로 2월령 암컷 마우스에 정맥 내 주사하였다. 주사 2주 후, 3 ㎜ 길이의 단피질 골 결함이 좌측 대퇴골의 측면 측 상에 생성되었다.
도 47C는 수술 2주 후, 동결-절단된 대퇴골 상의 EGFP 발현을 형광 현미경검사에 의해 평가하였다. 스케일 바: 500 ㎛.
도 47D는 경골 RNA에서 Shn3 및 Sost의 mRNA 수준을 Actb에 대해 정규화한 후 표시하였다.
도 47E는 단피질 결손 영역에서 골 재생을 마이크로 CT에 의해 평가하였다. 대표적인 시상 섹션 이미지(E, 좌측) 및 관심 있는 영역 및 골 부피의 상대적인 정량화(ROI, E, 우측)가 표시된다(n = 8 내지 11/그룹).
도 47F 내지 도 47H는 단피질 골 결함 영역에서 대퇴골의 대표적인 H&E-(F), 톨루이딘 블루-(G, 상단) 및 TRAP(G, 하단)-염색된 세로 단면 및 골 표면당 골아세포 표면의 상대적인 정량화(Ob.S/BS)(n = 5/그룹) 및 골 표면당 파골세포의 개수(Oc.N/B.S)(n = 6/그룹)(H)가 표시되었다. 스케일 바: F, 200 ㎛; G, 100 ㎛. 값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정 및 원-웨이 ANOVA 검정에 의해 평균 ± SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음.
도 48A는 연구 및 치료 방법의 도면이다.
도 48B는 rAAV9.DSS-amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3
,
amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3의 ㅈ전맥 내 주사 2주 후 3월령 암컷 마우스에 대해 대퇴부 골절제술 및 수질 내 고정을 수행하였다. 골절 영역에서 AAV-형질 도입된 세포를 모니터링하기 위해, 동결-절단된 대퇴골 상의 EGFP 발현을 수술 후 1주, 2주, 3주 및 4주째 날에 형광 현미경검사에 의해 평가하였다. 스케일 바, 600 ㎛.
도 48C는 경골 RNA에서 β-카테닌 표적 유전자 Lef1의 mRNA 수준을 평가하고, Gapdh에 대해 정규화하였다(n = 6/그룹).
도 48D는 반대측 대퇴골의 지주 골량을 마이크로 CT에 의해 평가하였다(n = 7 내지 8/그룹). 지주골 개수(Tra.N), 지주골 두께(Tra.Th) 및 피질 두께(Cort.Th).
도 49A는 대퇴부 골절제술 및 수질 내 고정은 rAAV9.DSS 벡터의 정맥 내 주사(5 x 1013 vg/㎏) 2주 후 3월령 암컷 마우스에 대해 수행하였다. 골절 영역에서 AAV-형질 도입된 세포를 모니터링하기 위해, 동결-절단된 대퇴골 상의 EGFP 발현을 수술 후 1주, 2주 및 4주째 날에 형광 현미경검사에 의해 평가하였다.
도 49B 및 도 49C는 경골 RNA에서 shn3
,
sost의 mRNA 수준(B) 및 β-카테닌 표적 유전자 Axin2(C)를 평가하고, Gapdh에 대해 정규화하였다(n = 7 내지 8/그룹).
도 49D는 반대측 대퇴골의 지주 골량은 마이크로 CT에 의해 평가되었다(n = 6 내지 9/그룹).
도 49E는 골절 후 상이한 시점에서 부상당한 대퇴골의 대표적인 X-방사선촬영 및 마이크로 CT 이미지이다.
도 49F 및 도 49I는 골절 부위에서 캘러스 형성을 나타내는 대표적인 마이크로 CT 이미지(F) 및 캘러스 총 부피와 캘러스 무기질 밀도의 상대적인 정량화(I)를 표시하였다(n = 4 내지 7/그룹).
도 49H는 골절 부위 6주 후-골절에서 대퇴골의 대표적인 H&E-염색된 세로 단면이다. *는 불유합 섬유 조직을 나타낸다.
도 49I는 골절 부위에서 유합율을 마이크로 CT에 의해 정량화하였다(I).
도 49J는 골 표면당 골아세포 표면의 정적 조직형태학적 정량화(Ob.S/BS)(n = 7 내지 8/그룹) 및 골 표면당 파골세포 표면(Oc.S/B.S)(n = 5/그룹)을 표시하였다. 스케일 바: A, 25 ㎛; E, 1 ㎜; F, 1 ㎜; H, 200 ㎛. 값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정 및 원-웨이 ANOVA 검정에 의해 평균 ± SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음.
도 50A는 rAAV 벡터(109 GC)를 37℃에서 1시간 동안 탈세포화 마우스 골 또는 HA-스캐폴드와 함께 인큐베이션하고 미결합된 rAAV 벡터를 원심분리에 의해 제거하였다. 벡터 역가를 ddPCR에 의해 측정하고, PBS 대조군에 대해 정규화하였다.
도 50B는 마우스 및 인간 BMSC를 PBS 또는 rAAV9.DSS.egfp로 처리하고(5 x 106 MOI), 2일 후에 EGFP 발현을 형광 현미경검사에 의해 평가하였다. 스케일 바, 500 ㎜.
도 50C는 PBS 또는 rAAV9.DSS.egfp(4 x 1011 GC)를 새롭게 수확된 인간 골 조직과 함께 인큐베이션하고, 2일 후에 EGFP 발현을 qPCR 분석에 의해 측정하고, hprt에 대해 정규화하였다(n = 4/그룹).
도 50D는 연구 및 치료 방법의 도면이다.
도 50E는 HA-스캐폴드를 rAAV9.egfp, rAAV9.DSS.egfp 또는 rAAV9.D14.egfp와 함께 인큐베이션하고, 1시간 후에 마우스 BMSC를 AAV-처리된 HA-스캐폴드 상에서 배양하였다. 2일 후, EGFP 발현을 항-EGFP 항체를 이용한 면역블로팅(왼쪽) 및 형광 현미경검사(오른쪽)에 의해 평가하였다. 스케일 바, 500 ㎛(상단부) 및 100 ㎛(하단부).
도 50F는 인간 BMSC를 AAV-처리된 HA-스캐폴드 상에서 배양하고, 2일 후에 EGFP 발현을 형광 현미경검사(왼쪽) 및 qPCR 분석(오른쪽)에 의해 평가하였다. 스케일 바, 100 ㎛(상단부) 및 25 ㎛(하단부).
도 50G는 새롭게 수확된 인간 골 조직에서의 BGLAP 및 SHN3의 mRNA 수준(n = 6/그룹).
도 50H 및 50I는 인간 BMSC를 벡터 대조군(Vec), SHN3, 대조군-shRNA(Sh-con) 또는 Shn3-shRNA(Sh-shn3)를 발현하는 렌티바이러스로 형질 도입하고, 골발생 조건 하에서 배양하였으며, SHN3 및 IBSP의 mRNA 수준을 qPCR 분석에 의해 측정하였다. 대안적으로, 무기화 활성을 알리자린 레드 염색에 의해 평가하였다(n = 3/그룹).
도 50J는 CBA 프로모터, hs-
amiR
-
hSHN3, Egfp 리포터 유전자, 및 β-글로빈 폴리A 서열을 함유하는 rAAV9.DSS 구조체의 도면.
값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정(C, F, G, H, I) 및 원-웨이 ANOVA 검정(A)에 의해 평균 ± SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음.
도 51A는 마우스 탈세포화 골이식 및 HA-스캐폴드의 대표적인 사진.
도 51B는 HA-스캐폴드를 rAAV9.egfp, rAAV9.DSS.egfp 또는 rAAV9.D14.egfp와 함께 인큐베이션하고, 1시간 후에 마우스 BMSC를 AAV-처리된 HA-스캐폴드 상에서 배양하였다. 2일 후, EGFP mRNA 수준을 qPCR 분석에 의해 측정하였다.
값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정 및 원-웨이 ANOVA 검정에 의해 평균 ± SD를 나타낸다.
도 52A 내지 도 52C는 PBS-처리된 또는 rAAV9.DSS.egfp-부착된 동종 골(AB) 중 어느 하나를 임계 크기의 대퇴부 골 결함의 영역 내에 이식하고, 3주 후에 개별 조직에서 EGFP 발현을 IVIS-100 광학 영상(A) 및 형광 현미경검사(B, C)로 모니터링하였다. 양성 대조군으로서, 단일 투여량(5 x 1013 vg/㎏)의 rAAV9.DSS.egfp를 정맥 내 주사하였다(n = 3/그룹).
도 52D 내지 도 52F는 임계 크기의 대퇴부 골 결함 영역 내로의 rAAV9.DSS-부착된 AB의 이식을 3월령 수컷 마우스에 수행하고, 12주 후에 숙주 골에 이식된 AB의 비이온화를 X-방사선촬영 및 마이크로 CT에 의해 평가하였다. 양성 대조군으로서, 자생 골 이식편(ABG)을 부상당한 부위 내에 이식하였다. 대표적인 이미지(D) 및 자생 골 이식편에 대한 총 브릿징의 백분율(E)을 표시하였다(n = 15/그룹). 임계 크기의 대퇴부 골 결함의 영역에서 H&E-염색된 세로 단면(F).
도 52G 및 도 52H는 임계 크기의 대퇴부 골 결함의 영역 내로 AB의 이식을 rAAV9.DSS-amiR-ctrl,
amiR
-
shn3, amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3의 정맥 내 주사액의 단일 투여(5 x 1013 vg/㎏) 2주 후 3월령 수컷 마우스에 대해 수행하였다. 12주 후, 숙주 골에 이식된 AB의 비이온화를 마이크로 CT에 의해 평가하였다. 대표(G) 및 총 브릿징의 백분율(H)을 표시하였다(n = 5 내지 6/그룹). 스케일 바: B, 25 ㎛; C, 100 ㎛; D, 1 ㎜; E 상단부, 400 ㎛; E 하단부, 100 ㎛; G, 1 ㎜. 값은 쌍을 이루지 않은 2-테일드 스튜던트t-검정 및 원-웨이 ANOVA 검정에 의적인 이미지해 평균 ± SD를 나타낸다.
도 53A는 rAAV.DSS 벡터가 부착된 동종 골의 제조. 동종 골을 30분 동안 DSS.rAAV9(2.5 x 1011 GC)로 처리하였다.
도 53B는 PBS-처리된 또는 rAAV9.DSS.egfp-부착된 동종 골 중 어느 하나를 임계 크기의 대퇴부 골 결함의 영역 내에 이식하고, 3주 후에 전신에서 EGFP 발현을 IVIS-100 광학 영상으로 모니터링하였다. 양성 대조군으로서, 단일 투여량(5 x 1013 vg/㎏)의 rAAV9.DSS.egfp를 정맥 내 주사하였다(n = 3/그룹).
도 53C는 임계 크기의 대퇴부 골 결함의 영역 내로의 동종 골의 이식을 rAAV9.DSS-amiR-ctrl,
amiR
-
shn3, amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3의 정맥 내 주사액의 단일 투여(5 x 1013 vg/㎏) 2주 후 3월령 수컷 마우스에 대해 수행하였다. 12주 후, H&E 염색을 부상당한 대퇴골의 세로 단면 상에 수행하여 숙주 골에 이식된 AB의 비이온화를 평가하였다. HB: 숙주 골, AB: 동종 골. 스케일 바: 상단부, 400 ㎛; 하단부, 100 ㎛.
WNT 경로는 골발생을 증가시킴으로써 골 항상성 및 재생에 중요하며, 이로 인해 이러한 경로가 골다공증 및 임계 크기 골 결함(critical sized-bone defect)과 같은 골격 질병에 대한 매력적인 치료 표적이 된다. 그러나, 기타 생물학적 과정에서 임의의 악영향을 야기하지 않으면서 골격에서의 최적의 WNT 활성화를 제공하기 위해 치료적 중재가 요구된다.
여기서, 본 발명자들은 골 리모델링 및 골절 치유 동안에 골발생 및 골 형성에 효과적인 WNT 신호전달의 미세 조정자로서의 WNT 길항제의 골-귀소(bone-homing) 재조합 아데노-부속 바이러스(rAAV)-매개 사일런싱을 확인하였다. 2개의 길항제, 즉 schnurri-3(SHN3) 및 스클레로스틴(SOST)의 발현이 음성 피드백 기작을 통해 연결되어 있으므로, 이들 인자 둘 모두의 2중 사일런싱에 의해 건강한 마우스 및 골다공증 마우스에서 WNT 신호전달 및 골 증가가 추가로 향상되었다. 놀랍게도, 이들 마우스는 생체 내 OB 활성이 생체 내 OC 기능의 현저한 감소와 함께 빠르게 쇠퇴하였으며, 그 결과 골 리모델링의 억제가 초래된다는 것을 보였다. 이에 반해, 단일 사일런서로 처리하면 OC 기능의 감소가 없거나 완만한 감소와 함께 OB 활성의 증가가 유지되었다. 골 재생 및 리모델링은 둘 모두 골절 수선에 필요하므로, 골절 치유는 2중 사일런서로 처리되는 경우에 현저하게 지연되는 반면, 단일 사일런서로 처리하면 골절 치유가 촉진된다. 본 발명자의 골-귀소 rAAV가 동종 골(allogenous bone) 내의 수산화인회석(Hydroxyapatite)에 부착하는 능력을 이용함으로써, WNT-조절 유전자 사일런서는 골격 오르가노이드(organoid) 또는 AAV-부착 동종 골을 이식함으로써 상처 부위에 직접 절단되어, 임계 크기 골 결함(critical sized-bone defect)의 치료를 촉진하였다. 종합하면, 본 발명자의 결과는 낮은 골량 및 골절 수선 손상과 연관된 골격 질환의 치료를 위한 골 표적화 WNT-조절 유전자 사일런서의 가능성을 지지한다.
골 리모델링은 골 형성 골아세포와 골 재흡수 파골세포 사이의 일련의 작용에 의해 조절되는 연속적인 골 치환이며, 최고의 골질 및 적절한 골절 치유에 중요하다. 골흡수 억제제를 이용한 장기간의 처리로 인해 골다공증 및/또는 골절을 갖는 환자에서 골 리모델링이 손상되는 동안에도 골 리모델링은 동화 약물의 존재 하에서 비교적 활성이며, 따라서 동화 약물은 골다공증 및 골절에 대한 유망한 치료적 중재로서 간주된다. WNT 신호전달은 증가된 골발생을 통해 골량 및 강도를 증가시키는 중요한 골 형성 조절자이다. 다수의 WNT 길항제가 골발생 및 골 형성을 억제하는 것으로 확인되었다. 스클레로스틴은 골세포에 의해 생산되는 분비 인자로서, WNT와 저밀도 지질 단백질 수용체-관련 단백질 5 및 6(LRP5/6)의 공동 수용체에 대한 결합에 의해 프리즐링(frizzling)된 WNT 수용체와의 WNT의 연계를 방해한다. 이의 결실은 마우스 및 인간에서의 골 형성 증가로 인해 골량 표현형의 증가로 이어진다 특히, 스클레로스틴은 항-스클레로스틴 항체가 골 형성을 촉진함에 따라 골다공증을 앓는 환자에서 치료적 중재를 위한 새로운 표적으로서 인식되어 왔다. 그러나, 골 형성 마커가 처리 이후 시간이 지남에 따라 쇠퇴하기 때문에 1년 이상의 치료는 권장되지 않는다. Schnurri-3(SHN3)은 세포 내 어댑터 단백질(adaptor protein)로서, OB에서 WNT 신호전달 하류에 있는 β-카테닌의 발현을 하향 조절한다. SHN3-결핍은 골량의 점진적인 증가를 초래하며, 이의 효과는 비-골격 조직에서의 임의의 표현형 없는 OB에 특이적이다. shn3
-l- 마우스에서 형성된 골은 정상적인 생체 역학적 특성을 갖는 성숙한 층판골(lamellar bone)이다. 이들 특성들은 함께 SHN3 억제를 골 형성을 촉진하여 골다공증을 치료하기 위한 매력적인 접근법으로 만든다. 스클레로스틴 또는 SHN3의 억제에 의해 골절 치유 시에 초기에 골 형성이 촉진될 수 있다는 것을 보여주는 몇몇 연구에도 불구하고, 이의 치료 효능은 여전히 논란거리이며, 충분히 규명될 필요가 있다.
아데노-부속 바이러스(AAV)는 길이가 대략 4.7 kb인 단일 가닥 유전체를 갖는 소형(26 ㎚)의 비외피성 파보바이러스이다. 높은 형질 도입 효율, 지속적인 이식 유전자 발현, 및 감염 후 면역원성 및 병원성의 결여로 인해 AAV는 유전자 요법에 사용하기 위한 매력적인 바이러스 벡터가 된다. AAV 유전체는 조절(Rep) 및 구조 캡시드(Cap) 단백질을 암호화하고, 2개의 역위 말단 반복서열(ITR)이 측면에 있다. Rep 및 Cap 유전자를 관심 있는 이식 유전자로 치환하면 강력한 벡터로서 표적 조직을 형질 도입할 수 있는 복제 결손 재조합 AAV(rAAV) 유전체가 생성된다. 이중 가닥 DNA 유전체를 패키징하는 2세대 자기 상보성 AAV(scAAV)를 조작하여 rAAV 이식 유전자의 발현을 위해 요구되는 속도 조절용 제2 가닥 합성 단계를 우회하였다. 그 결과, scAAV 벡터는 시험관 내 및 생체 내에서 형질 도입 효능이 향상되었다. 그러나, 골 질환 및 관절 질환용 AAV 기반 유전자 요법은 제한되어 있다. 지금까지, AAV 벡터는 전 세계에 걸쳐 130회 초과의 임상 시험에서 평가되었다. 이러한 연구에서, 본 발명자들은 WNT 길항제의 골-귀소 rAVV-매개 사일런싱에 의해 골다공증 및 골절 치유에서의 골 재생이 향상된다는 것을 보여주었다. 본 발명자들은 SOST의 발현 수준이 SHN3의 음성 피드백 기작을 통해 증가된다는 것을 증명하였다. WNT 신호전달을 추가로 향상시키기 위해, 본 발명자들은 SHN3 및 SOST 둘 모두를 억제하는 2중 사일런서를 설계하였다. 따라서, 본 발명자들은 2중 사일런서가 골다공증 및 골절 치유에서 SHN3 또는 SOST의 단일 사일런서보다 골 형성을 더 증가시킨다는 가설을 세웠다. 이어, 본 발명자들은 골-귀소 rAAV의 능력을 이용함으로써 유전자 사일런서를 동종 골에 부착시키고, 임계 크기의 골 결함에서의 골 치유 효율을 시험하였다.
본 발명은 miRNA-RANK, miRNA-ctsk, miRNA-shn3
, miRNA-SOST(sclerostin) 또는 miRNA-SOST
/
shn3을 담지하는 AAV9을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 AAV9의 캡시드에 골 표적 단백질 모티프(bone-targeting peptide motifs)가 삽입된 AAV9을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 골 질환 예방 또는 치료에 효과를 나타내는 트랜스진(transgene)을 담지하는 AAV9를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 트랜스진은 shn3 또는 SOST 유전자의 발현을 억제하는 유전자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 miRNA-shn3
, miRNA-SOST
, miRNA-SOST/shn3일 수 있다.
본 발명에 있어서, miRNA(microRNA)는 19-25 nt 길이의 단일 가닥 RNA 분자로서 내재적(endogenous) 헤어핀-구조 전사체에 의해 생성되고, 타겟 서열을 포함하는 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR)에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억제자(post-transcriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도함으로써 표적 유전자를 억제하는 것 일 수 있다. miRNA는 발달, 분화, 증식, 세포사멸 및 물질대사와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, shn3(schnurri-3)는 아연 집게 단백질(Zn finger proteins)의 ZAS 패밀리에 속하는 단백질로써, 생 후 골격을 재구성하는데 필수적인 조절자로 기능하는 것일 수 있으며, shn3를 암호화하는 유전자의 발현을 억제하면 골 증식이 촉진되어, 골 질환 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, SOST(Sclerostin)는 SOST 유전자에 의해 코딩되는 단백질로써 C- 말단 시스테인 매듭-유사 (C-terminal cysteine knot-like, CTCK) 도메인 및 골 형태 형성 단백질 (bone morphogenetic protein, BMP) 길항제의 DAN(differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma) 패밀리와 서열 유사성을 갖는 당 단백질일 수 있으며, SOST의 발현을 억제하면, 골 형성을 촉진하는 효과가 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, RANK(Receptor activator of nuclear factor
K
B)는 골 재형성, 면역 세포 기능, 림프절 발달, 체온 조절 및 유선 발달과 관련된 유전자로써, 골다공증 모델에서 RANK의 발현을 억제하면 파골 세포 분화 및 재흡수 활성이 억제되어, 골다공증에 치료 효과가 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, ctsk(cathepsin K)는 골 재형성 및 재흡수에 관여하는 리소좀 시스테인 프로테나제를 암호화하는 유전자로써, ctsk의 발현을 억제하면 파골 세포-매개 골 흡수를 억제하고, 조골 세포-매개 골 형성을 동시에 촉진하여, 골다공증 치료에 효과가 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 AAV9(Adeno-associated virus serotype 9)은 표적 세포에 DNA를 전달하도록 조작된 엔벨로프가 없는(Non-enveloped) 바이러스일 수 있으며, 상기 miRNA-shn3
, miRNA-SOST
또는 miRNA-SOST
/
shn3을 전달하도록 조작되어, 골 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 것 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 AAV9의 캡시드는 골 조직에 대한 특이성을 높이기 위하여 변형된 것일 수 있으며, 바람직하게는 골 표적 단백질 모티프(bone-targeting peptide motifs)를 삽입한 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 골 표적 단백질 모티프는 DSS((AspSerSer)6) 또는 D14(Asp14) 일 수 있으며, 상기 DSS는 AAV9 캡시드 펩타이드의 VP2 펩타이드의 N 말단에 삽입되거나, AAV9 캡시드 펩타이드의 글루타민 587과 알라닌 588 사이의 루프 IV 도메인에 삽입되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 AAV9 캡시드 펩타이드의 VP2 펩타이드의 N 말단에 삽입되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 D14는 AAV9 캡시드 단백질 서브 유닛 VP2의 N-말단에 삽입되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 miRNA-shn3
, miRNA-SOST
또는 miRNA-SOST
/
shn3을 담지하는 AAV9는 손상된 골 부위에 적용되어, 우수한 골 전도성, 골 유도성, 골 형성성을 바탕으로 골 질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있으며, AAV9의 캡시드 변형에 의해 개선된 골 조직에 대한 특이성을 바탕으로 효과적으로 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 것 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 골 질환은 골과 관련된 질환을 말하며, 예를 들어, 조골세포와 파골세포의 불균형이 원인이 되는 질환일 수 있으며, 바람직하게는 골다공증, 파제트병, 신부전 환자의 신성골이영양증, 골절, 골 결손, 불유합, 류마티스성 골질환, 양성 또는 악성 종양에 의한 골 결손 및 치주질환일 수 있으며, 바람직하게는 골다공증 또는 골절일 수 있다.
본 발명의 상기 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 유효성분 이외에, 골 질환 예방 또는 치료 효과의 상승·보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 골 질환 예방 또는 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 경피 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있으며 바람직하게는 골 대체제와 함께 투여되는 것 일 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 투여시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 상기 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함하는 골 대체제를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 골 대체제는 자가골, 타가골, 동종골, 이종골 또는 합성골일 수 있으며, 바람직하게는 타가골 또는 합성골일 수 있다. 상기 타가골은 신선 냉동(Fresh frozen) 방법 또는 건조 냉동(Dried frozen) 방법으로 제조되는 것 일 수 있으며, 상기 합성골은 수산화인회석으로 제조되는 것 일 수 있다.
본 발명의 상기 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함하는 골 대체제는 국소적인 적용이 가능하여 부작용 발생 가능성이 현저히 낮으며, 유전자 도입 벡터인 AAV9의 소모량을 10 내지 20% 까지 줄일 수 있어, 생산비용을 현저히 낮출 수 있는 것 일 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
rAAV 벡터의 디자인 및 생산
마우스 타겟 유전자에 대한 인공 miRNA는 miR-33 스캐폴드 설계 규칙을 고려하여 최적화 amiR 카세트를 생성하는 맞춤형 엑셀 매크로(custom excel macro)를 사용하여 설계하였다. 플라스미드는 깁슨 조립(Gibson assembly) 및 표준 분자 생물학적 방법에 의해 구축하였다. amiR-33-ctrl, amiR-33-RANK-1, amiR-33-RANK-2, amiR-33-ctsk-1, amiR-33-ctsk-2, amiR-33-sost 및 amiR-33-shn3에 대한 DNA 서열을 gBlocks로 합성하고, 제한 효소 부위(PstI 및 BglII)에서 pAAVsc-CB6-Egfp 플라스미드의 인트론 영역에 클로닝하여 형질전환용 플라스미드를 제조하였다. pAAVsc-CB6-Cre는 Egfp 리포터를 Cre 재조합효소(Cre recombinase)로 대체하여 제조하였으며, 제조물을 시퀀싱하여 확인하였다. Shim, J. H. et al. Schnurri-3 regulates ERK downstream of WNT signaling in osteoblasts. J. Clin. Investig 123, 4010-4022. (2013)에 기재된 표적화 서열과 동일한 표적화 서열을 사용하여 amiR-33-shn3에 대한 카세트를 제조하였다. pAAV-amiR-ctrl 및 pAAV-amiR-shn3을 AAV9 캡시드에 패키지하였다. 또한, pAAVsc-CB6-Egfp는 AAV1 (1.8E + 13GC / ml), AAV2 (1.5E + 12GC / ml), AAV3 (6E + 12GC / ml), AAV4 (6.5E + 12GC / ml), AAV5 (2.4E + 13GC / ml), AAV6 (8E + 12GC / ml), AAV6.2 (8E + 12GC / ml), AAV7 (1.5E + 13GC / ml), AAV8 (7E + 12GC / ml), AAV9 (1.5E + 13GC / ml), AAVrh8 (8E + 12GC / ml), AAVrh10 (8E + 12GC / ml), AAVrh39 (1.0E + 13GC / ml) 및 AAVrh43 (6E + 12GC / ml) 캡시드에 패키징하였다. Egfp prime/probe 세트를 이용한 QX200 ddPCR 시스템 (Bio-Rad)으로 적정하고, CsCl 침강으로 정제한 HEK293 세포에 형질감염하여 rAAV를 생산하였다. 본 실시예에서 사용한 amiR-ctrl 서열을 서열번호 1에 나타내었고, amiRNA-33-shn3 서열을 서열번호 2에 나타내었고, amiR-33-sost 서열을 서열번호 3에 나타내었고, amiR-33-RANK-1 서열을 서열번호 4에 나타내었고, amiR-33-RANK-2 서열을 서열번호 5에 나타내었고, amiR-33-ctsk-1 서열을 서열번호 6에 나타내었고, amiR-33-ctsk-2 서열을 서열번호 7에 나타내었고, AAV 캡시드 서열을 서열번호 8 내지 24로 나타내었으며, 이를 표 1 및 표 2에 나타내었다.
서열번호(서열 명) | 염기서열 (5' -> 3') |
서열번호 1(amiR-ctrl) | tttgtcttttatttcaggtcccAGATCTAGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGTTACTGTAGGATCGAGAGGGATGTTCTGGCAATACCTGTCCCTCTCCTTACTACAGTAACACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCCCTGCAGgggatccggtggtggtgcaaatca |
서열번호 2(amiRNA-33-shn3) | tttgtcttttatttcaggtcccAGATCTAGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGTACAAACTACTTGAGAGCAGGTGTTCTGGCAATACCTGCCTGCTCTGTAATAGTTTGTACACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCCCTGCAGgggatccggtggtggtgcaaatca |
서열번호 3(amiR-33-sost) | tttgtcttttatttcaggtcccAGATCTAGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGtgacctctgtggcatcattccTGTTCTGGCAATACCTGGGAATGATCGCGCAGAGGTCACACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCCCTGCAGgggatccggtggtggtgcaaatca |
서열번호 4(amiR-33-RANK-1) | AGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGAATGGTCCACATTTCAGGGACTGTTCTGGCAATACCTGGTCCCTGATTTATGGACCATTCACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCC |
서열번호 5(amiR-33-RANK-2) | AGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGACAAATTAGCTGTCAGCGCTGTTCTGGCAATACCTGGCGCTGACTGCAAATTTGTCACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCC |
서열번호 6(amiR-33-ctsk-1) | tttgtcttttatttcaggtcccAGATCTAGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGTTTCATCATAGTACACACCTCTGTTCTGGCAATACCTGGAGGTGTGATCCATGATGAAACACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCCCTGCAGgggatccggtggtggtgcaaatca |
서열번호 7(amiR-33-ctsk-2) | tttgtcttttatttcaggtcccAGATCTAGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGTTACTGTAGGATCGAGAGGGATGTTCTGGCAATACCTGTCCCTCTCCTTACTACAGTAACACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGG |
서열번호(서열 명) | 아미노산 서열 |
서열번호 8(AAV Cap1) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL |
서열번호 9(AAV Cap2) | MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 10(AAV Cap3b) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGVPQPKANQQHQDNRRGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRILEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 11(AAV Cap4) | MTDGYLPDWLEDNLSEGVREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQQRLQGDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEQAGETAPGKKRPLIESPQQPDSSTGIGKKGKQPAKKKLVFEDETGAGDGPPEGSTSGAMSDDSEMRAAAGGAAVEGGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGHVTTTSTRTWVLPTYNNHLYKRLGESLQSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGMRPKAMRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSSYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMVPQYGYCGLVTGNTSQQQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEITYSFEKVPFHSMYAHSQSLDRLMNPLIDQYLWGLQSTTTGTTLNAGTATTNFTKLRPTNFSNFKKNWLPGPSIKQQGFSKTANQNYKIPATGSDSLIKYETHSTLDGRWSALTPGPPMATAGPADSKFSNSQLIFAGPKQNGNTATVPGTLIFTSEEELAATNATDTDMWGNLPGGDQSNSNLPTVDRLTALGAVPGMVWQNRDIYYQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLIGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPATTFSSTPVNSFITQYSTGQVSVQIDWEIQKERSKRWNPEVQFTSNYGQQNSLLWAPDAAGKYTEPRAIGTRYLTHHL |
서열번호 12(AAV Cap5) | MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL |
서열번호 13(AAV Cap6) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL |
서열번호 14(AAV Cap6.2) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL |
서열번호 15(AAV Cap7) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPAKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSSVGSGTVAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSETAGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLRFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTIQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQSVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYSFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSNPGGTAGNRELQFYQGGPSTMAEQAKNWLPGPCFRQQRVSKTLDQNNNSNFAWTGATKYHLNGRNSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKTGATNKTTLENVLMTNEEEIRPTNPVATEEYGIVSSNLQAANTAAQTQVVNNQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPEVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNFEKQTGVDFAVDSQGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 16(AAV Cap8) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 17(AAV Cap9) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 18(AAV Cap rh8) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGLGPNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMANQARNWVPGPCYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDDDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 19(AAV Cap rh10) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYQFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFSQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTDGTYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 20(AAV Cap rh39) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTQGTQQLLFSQAGPANMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGRDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQTNTGPIVGNVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFSQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 21(AAV Cap rh43) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLEAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 22(AAV2/2-66) | MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHQDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPAEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTNAPSGTTTMSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTAADNNNSDYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKYFPQSGVLIFGKQDSGKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATTDVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 23(AAV2/2-84) | MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHQDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPAEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTNAPSGTTTMSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTAADNNNSDYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKYFPQSGVLIFGKQDSGKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATTDVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
서열번호 24(AAV2/2-125) | MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLARAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPAEPDSSSGTGKSGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMASGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQTVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLRFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTAADNNNSDYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGTAMASHKDDEEKYFPQSGVLIFGKQDSGKTNVDIERVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATSDVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
amiR-33-ctrl, amiR-sost, amiR-shn3, hs-amiR-shn3 및 amiR-sost / shn3에 대한 DNA 서열을 gBlock으로 합성하고, 제한 효소 부위(PstI 및 BglII)에서 pAAVsc-CB6-Egfp 플라스미드의 인트론 영역에 클로닝하여 AAV9.DSS-Nter 캡시드로 패키징되었다.
rAAV 생산은 CsCl 침강에 의해 정제된 HEK293 세포의 일시적 형질 감염에 의해 수행되었으며, Egfp 프라임/프로브 세트를 사용하여 QX200 ddPCR 시스템(Bio-Rad)에서 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해 적정되었다. ddPCR에 대한 gBlock 및 올리고 뉴클레오티드의 서열은 표 3 및 표 4에 나타내었다.
Gene | Forward | Reverse |
Human Shn3 | GCCCTATGTGTGCAAGCACTGT | AGTCCTGGAACAGGTCGTCACT |
Mouse Shn3 | AGAGGCCATTCAGACGAGTGT | CTGCGGAAGCTGAGAGATGT |
Mouse Gapdh | ACTGAGCAAGAGAGGCCCTA | TATGGGGGTCTGGGATGGAA |
Mouse Actb | AGGGAAATCGTGCGTGACAT | GAACCGCTCGTTGCCAATAG |
Mouse Lef1 | CCAAGCAAGGCATGTCCAGACACC | GCCTGACAGTGAGGATGGGTAGGG |
Mouse Axin2 | GCAGATGAACCTGAAGGATACC | TTGATGCCATCTCGTATGTAGG |
Mouse Sost | CTTCAGGAATGATGCCACAGAGGT | ATCTTTGGCGTCATAGGGATGGTG |
Mouse Hprt | CTGGTGAAAAGGACCTCTCGAAG | CCAGTTTCACTAATGACACAAACG |
EGFP | AGCAAAGACCCCAACGAGAA | GGCGGCGGTCACGAA |
EGFP-probe | 6FAM-CGCGATCACATGGTCCTGCTGG-TAMRA | |
(AspSerSer)6 | GATTCATCAGATTCTTCTGATTCATCCGACTCTTCTGACAGTTCAGACAGCTCT | |
(Asp)14 | GATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGAT |
서열번호(서열 명) | 염기서열 (5' -> 3') |
서열번호 25amiR-33-ctrl(amiR - ctrl) | tttgtcttttatttcaggtcccagatctagggctctgcgtttgctccaggtagtccgctgctcccttgggcctgggcccactgacagccctggtgcctctggccggctgcacacctcctggcgggcagctgtgttactgtaggatcgagagggatgttctggcaatacctgtccctctccttactacagtaacacggaggcctgccctgactgcccacggtgccgtggccaaagaggatctaagggcaccgctgagggcctacctaaccatcgtggggaataaggacagtgtcacccctgcaggggatccggtggtggtgcaaatca |
서열번호 26Human amiR-33-mouse shn3(hs-amiR - shn3) | gatctggcagccttggagtgggttcctgccccctcgggcacacaaacagagctgaagaccaccctgggcacctccttggctggccgcatacctcctggcgggcagctgtgtacaaactacttgagagcaggtgttctggtggtacccacctgctctgtaatagtttgtacacagaggcctgcctggccctcgagagactgccctgactgaaggccctatcaggtgggggaggggatcctgatagagggcactgctgccactgttggggcccaagctgca |
서열번호 27amiR-33-mouse shn3 (amiR-shn3) | tttgtcttttatttcaggtcccagatctagggctctgcgtttgctccaggtagtccgctgctcccttgggcctgggcccactgacagccctggtgcctctggccggctgcacacctcctggcgggcagctgtgtacaaactacttgagagcaggtgttctggcaatacctgcctgctctgtaatagtttgtacacggaggcctgccctgactgcccacggtgccgtggccaaagaggatctaagggcaccgctgagggcctacctaaccatcgtggggaataagg acagtgtcacccctgcaggggatccggtggtggtgcaaatca |
서열번호 28amiR-33-humanshn3 (amiR - hshn3) | gtcttttatttcaggtcccagatcttagggctctgcgtttgctccaggtagtccgctgctcccttgggcctgggcccactgacagccctggtgcctctggccggctgcacacctcctggcgggcagctgtgtttccatggtaagttcaaggctgttctggcaatacctggccttgaagatgccatggaaacacggaggcctgccctgactgcccacggtgccgtggccaaagaggatctaagggcaccgctgagggcctacctaaccatcgtggggaataaggacagtgtcacccccctgcaggggatccggtggtggtgcaaat |
서열번호 29amiR-33-mouse sost (amiR-sost) | gatctagggctctgcgtttgctccaggtagtccgctgctcccttgggcctgggcccactgacagccctggtgcctctggccggctgcacacctcctggcgggcagctgtgtgacctctgtggcatcattcctgttctggcaatacctgggaatgatcgcgcagaggtcacacggaggcctgccctgactgcccacggtgccgtggccaaagaggatctaagggcaccgctgagggcctacctaaccatcgtggggaataaggacagtgtcacccctgca |
서열번호 30amiR-33-mouse sost (amiR-sost)and human amiR-33-mouse shn3(hs-amiR - shn3) | gatctagggctctgcgtttgctccaggtagtccgctgctcccttgggcctgggcccactgacagccctggtgcctctggccggctgcacacctcctggcgggcagctgtgtgacctctgtggcatcattcctgttctggcaatacctgggaatgatcgcgcagaggtcacacggaggcctgccctgactgcccacggtgccgtggccaaagaggatctaagggcaccgctgagggcctacctaaccatcgtggggaataaggacagtgtcacccctgcaggggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttacttctgctctaaaagctgcggaattgtacccgcggccgatccaccggtcgccaccatggggcagccttggagtgggttcctgccccctcgggcacacaaacagagctgaagaccaccctgggcacctccttggctggccgcatacctcctggcgggcagctgtgtacaaactacttgagagcaggtgttctggtggtacccacctgctctgtaatagtttgtacacagaggcctgcctggccctcgagagactgccctgactgaaggccctatcaggtgggggaggggatcctgatagagggcactgctgccactgttggggcccaagaagct |
서열번호 31Human amiR-33-human shn3-1(hs-amiR-hshn3-1) | ggcagccttggagtgggttcctgccccctcgggcacacaaacagagctgaagaccaccctgggcacctccttggctggccgcatacctcctggcgggcagctgtgtttccatggtaagttcaaggctgttctggtggtacccagccttgaagatgccatggaaacacagaggcctgcctggccctcgagagactgccctgactgaaggccctatcaggtgggggaggggatcctgatagagggcactgctgccactgttggggcccaag |
서열번호 32Human amiR-33-human shn3-2(hs-amiR-hshn3-2) | ggcagccttggagtgggttcctgccccctcgggcacacaaacagagctgaagaccaccctgggcacctccttggctggccgcatacctcctggcgggcagctgtgtccatggtaagttcaaggctgtgttctggtggtacccacagccttgttcctaccatggacacagaggcctgcctggccctcgagagactgccctgactgaaggccctatcaggtgggggaggggatcctgatagagggcactgctgccactgttggggcccaag |
골
타겟팅
rAAV9
벡터의 제조
골-표적화 펩티드 모티프 DSS(AspSerSer)6
또는 D14(Asp)14를 암호화하는 DNA 서열을 코돈-최적화하였다.
Q588-DSS-A589 캡시드 (DSS-588)를 생성하기 위해, AAV2 rep 유전자 및 AAV9 cap 유전자(pAAV2/9)를 발현하는 플라스미드를 Q588 및 A589 코돈 사이의 AAV9 cap 유전자에 DSS 서열을 삽입하는 방법으로 변형하여 AAV2/9.Q588-DSS-A589를 제조하였다. 이 플라스미드는 rAAV 생산에 사용하였다.
DSS-Nter 캡시드를 생성하기 위해 한 쌍의 플라스미드를 사용하였다. 우선, pAAV2/9에서 VP2의 시작 코돈을 ACG에서 ACC으로 변이시켜, VP1 및 VP3만이 발현되도록 한 pAAV2/9.noVP2 플라스미드를 제조하였다. 그 다음, DSS 서열을 AAV9-VP2 ORF의 N-말단에 융합시키고, Kozak 서열 및 ATG 시작 코돈을 DSV 서열의 바로 상류에 위치시켜 CMV 프로모터에 의해 발현이 최적화된 pcDNA.DSS-VP2(AAV9) 플라스미드를 제조하였다. pAAV2/9.noVP2 및 pcDNA.DSS-VP2(AAV9) 플라스미드를 rAAV 생산에 사용하였다.
D14 펩티드 모티프를 AAV9 캡시드 단백질 서브 유닛 VP2의 N-말단에 이식하여 AAV9.D14-Nter (rAAV9.D14)를 제조하였다.
세포
연골 형성 ATDC5 세포를 시그마(Sigma)로부터 구매하고, 2 % FBS, 2mM 1- 글루타민 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM/Ham's F12배지에서 배양하였다. 또한, collagenase type II (50 mg/ml, Worthington, LS004176) 및 Dispase II (100mg/ml, Roche, 10165859001))를 사용하여 5일령 야생형 C57BL/6J의 칼바리아에서 조골세포(calvarial osteoblast, COB)를 분리하고, 10 % FBS (Gibco), 2mM L-글루타민(Corning), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Corning) 및 1% 비-필수 아미노산(Corning)을 함유하는 α-MEM 배지(Gibco)에서 배양하였다. COB는 아스코르브 산(200μM, Sigma, A8960) 및 β- 글리세로포스페이트 (10μmM, Sigma, G9422)에 의해 분화되었다. 마지막으로, BM-OCP를 수득하기 위해, 골수 세포를 2 개월령 마우스(C57BL/6J)의 대퇴골 및 경골에서 플러싱하고, 10% FBS 및 20ng/ml의 M-CSF를 갖는 α-MEM 배지에서 배양하였다. 12시간 후, 비-부착성 세포를 조직 배양 접시에 다시 플레이팅하고, 3일 동안 동일한 배지에서 배양하였다. 그 후, BM-OCP를 RAMKL(20ng/ml, R&D 시스템) 및 M-CSF(20ng/ml, R&D 시스템)에 의해 6일 동안 파골 세포(osteoclast)로 분화시켰다.
세포주, 플라스미드 및 항체
Ocy454 세포는 Massachusetts General Hospital(MGH, Boston, MA)에서 입수하여 10 % FBS(Corning) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신(Corning)을 함유하는 α-MEM 배지(Corning)에서 33 ℃, 5 % CO2로 유지되었다. 골 세포 분화를 위해 세포는 33 ℃에서 컨플루언트(confluent) 상태가 되었을 때, 37 ℃로 옮기고, 골 세포 유전자 발현 분석을 위해 6~12일 동안 배양하였다. HEK293T 세포 또는 C2H10T1/2 세포는 ATCC에서 구입하여 10 % FBS(Corning), 2mM L-글루타민(Corning), 1 % 비 필수 아미노산(Corning) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신(Corning)을 함유하는 DMEM (Corning)에서 배양하였다. 마우스 Shn3 cDNA의 전장 또는 말단절단된 돌연변이를 PCR로 증폭하고 pEF-Nuc 포유류 발현 벡터(Invitrogen) 또는 pHASE/PGK-PURO 렌티바이러스 벡터에 클로닝했다. 인간 SHN3 shRNA 서열 (CCGGGCCTTGAACTTACCATGGAAACTCGAGTTTCCATGGTAAGTTCAAGGCTTTTT)을 pLK0.1 렌티바이러스 벡터에 클로닝하였다. Flag(Sigma, F1804), HSP90α/β(Biolegend, 675402), GAPDH(EMD Millipore, CB1001) 및 GFP (Takara, 632381)에 특이적인 항체가 사용되었다. 수산화인회석(Hydroxyapatite) 기반 스캐 폴드는 Osteogene Tech으로부터 입수하였다.
마우스
성숙한 조골세포(osteoblast)에서 타목시펜-유도 Cre 재조합 효소(tamoxifen-induced Cre recombinase) 발현을 갖는 osteocalcin-ERT/Cre 마우스를 Shn3fl
/fl 마우스와 교배하여 Shn3fl
/
fl;Ocn-ERT/Cre 마우스(C57BL/6J)를 수득하였다. Cre-발현 세포를 표지하기 위해, Shn3fl
/
fl;Ocn-ERT/Cre 마우스를 RosamT
/
mG
cre 리포터 마우스(C57BL/6J)와 추가로 교배시켰다. ERT/Cre의 출생 후 활성화(postnatal activation)를 위해, corn oil(Sigma) 중 100㎍/kg 타목시펜 (Sigma)을 2 개월령 암컷 마우스에 5회/일, 연속하여 5 일간 복강 내 주사하였다. 꼬리 유전자 DNA(tail genomic DNA)를 PCR하여 마우스 유전자형을 확인하였다.
Shn3fl/fl 마우스는 D. C. Jones et al., Uncoupling of growth plate maturation and bone formation in mice lacking both Schnurri-2 and Schnurri-3. Proc
Natl
Acad
Sci
U S A 107, 8254-8258에 설명한 대로 생성하였고, Prx1-cre 마우스(Jackson 실험실)와 교배하여 C57BL/6J 배경에서 유지하였다. 야생형 C57BL/ 6J 및 SCID 마우스는 Jackson 실험실에서 구입하였다. 마우스 유전자형은 꼬리 게놈 DNA에 대해 PCR에 의해 결정하였다. 프라이머 서열은 요청시 입수가능하였다.
동물 프로토콜은 동물 관리에 관한 매사추세츠 의과 대학 (IACUC)에 의해 검토 및 승인되었으며, 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드를 준수하였다.
MicroCT 분석
소뇌 및 대뇌 피질골 미세 구조의 정성적 및 정량적 평가를 위해 MicroCT를 사용하였으며, 이는 분석 대상 동물의 유전자형을 모르는 조사자에 의해 수행되었다. 마우스로부터 절제된 대퇴골을 10 % 중성 완충 포르말린으로 고정시키고, 공간 해상도(spatial resolution) 7μm의 microCT 35(Scanco Medical)를 사용하여 스캔하였다. 원위 대퇴골의 골 분석을 위해, 성장판 근위부 280μm부터 상단 2.1μm 영역을 측정하였다. 대퇴골의 대뇌 피질 골 분석을 위해, 0.6mm의 중간-축 영역(mid-shaft region of 0.6mm in length)을 측정하였다. L4 척추의 MicroCT 스캔은 12μm의 등방성 복셀 크기(isotropic voxel size)를 사용하여 수행하였다. 이진화된(binaized) 이미지의 거리 변환에 기초한 방법에 의해, 2차원 이미지로부터 3차원 이미지를 구현하였다. 또는 Inveon multimodality 3D 시각화 프로그램을 사용하여 여러 정적 또는 동적 볼륨의 microCT 양식(Siemens Medical Solutions USA, Inc)을 생성하였다. 제시된 모든 이미지는 각각의 유전자형을 나타낸다(n> 5).
조직학, 조직형태측정 및
면역형광법
조직학적 분석을 위해, 대퇴골 및 척추를 rAAVs 벡터 처리된 마우스로부터 채취하여 2일 동안 10 % 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 2-4 주 동안 5 % 테트라나트륨 EDTA를 사용하여 칼슘을 제거하였다. 에탄올을 이용하여 조직을 탈수시키고, 자일렌에서 2회 세척하고, 파라핀에 포매하였다. 그 후, 코로날 플레이트를 따라 6μm의 두께로 전방에서 후방으로 절편화하였다. 칼슘이 제거된 대퇴부 단면을 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 또는 TRAP으로 염색하였다.
동적 조직형태 분석을 위해, 2 % 중탄산나트륨 용액에 용해된 25mg/kg 칼세인(Sigma, C0875) 및 50mg/kg 알리자린-3-메틸이미노디아세트산(Sigma, A3882)을 6 일 간격으로 마우스에 피하 주사하였다. 2일 동안 10 % 중성 완충 포르말린에 고정시킨 후, 칼슘이 제거되지 않은 대퇴골 샘플을 메틸메타크릴레이트에 포매하고 근위부 골간단(proximal metaphysis)을 종 방향으로 5μm 절단하였다. 유골(osteoid) 평가를 위해 McNeal's trichrome으로 염색하고, 조골 세포(osteoblast) 평가를 위해 톨루이딘 블루 염색하였으며, 파골 세포 평가를 위해 TRAP으로 염색하였다. 관심 영역은 골간단의 소주골로 정의하며, BFR/bone surface(BS), MAR, BS, Ob.S/BS 및 파골 세포 표면(osteoclast surface, Oc.S/BS)은 Nikon Optiphot 2 현미경을 사용하여 측정하였다. ASBMR 표준에 따라 단일 측정/샘플을 얻기 위해, 2단면/샘플(25μm 이하로 분리)에서 측정을 수행하고, 정규화(normalization) 전에 합산하였다.
면역 형광법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. rAAV-처리된 마우스로부터 신선한 대퇴골 및 척추를 채취하고, 2일 동안 아이스-콜드 4 % 파라포름알데히드 용액에 즉시 고정시켰다. 4℃, 0.5M EDTA pH 7.4에서 5 일간 반탈칼슘화(semidecalcification)를 수행하고 일정하게 흔들어주었다. 그리고, 1 일간 20% 수크로스 포스페이트 완충액에서 침윤시키고, 25% 수크로스 포스페이트 완충액에서 1일간 침윤시켰다. 모든 샘플을 25 % 수크로스 용액 및 OCT 화합물 (Sakura)의 50/50 혼합물에 매립하고, 크라이오 스탯 (Leica)을 사용하여 두께 12㎛로 시상면 방향으로 절단하였다. 면역형광염색 및 분석은 10 분 동안 0.2% Triton X-100으로 처리한 후, 절편을 실온에서 30 분 동안 5 % 당나귀 혈청으로 차단하고, 항-BGLAP 항체(sc-365797, Santa Cruz, 1: 150)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 1차 항체를 당나귀 항-랫트 IgG Alexa-594(1 : 500, Molecular probe)로 시각화하였다. 핵을 4-6,디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하였다. 샘플을 이미지화하기 위해, Olympus IX81 공초점 현미경 또는 Leica TCS SP5 II Zeiss LSM-880 초점 현미경을 사용하였다.
발광효소 리포터 분석(
Luciferase
Reporter Assay)
AAV 처리된 Ocy454 골 세포주를 Effectene 형질 감염 시약(Qiagen)을 사용하여 β-catenin 반응성 리포터 유전자(TopFlash-luc)로 형질 감염시키고, 재조합 WNT3a(25 ㎍/ml, R & D 시스템)의 존재하에 6 일 동안 배양하였다. 발광효소 분서은 제조업체의 프로토콜 (Promega)에 따라 수행하였다.
생체 역학 분석
골격 연구 영상 및 생체 역학 시험 코어 센터에서 전기 기계 시험기 (Electroforce 3230, Bose Corporation, MN, Eden Prairie, MN)를 사용하여 3 점 굽힘으로 대퇴골을 기계적으로 시험하였다. 굽힘 고정구의 바닥 스팬 길이는 8mm이다. 60Hz 및 0.05/s의 속도로 이동하는 변위 제어의 하중 점에서 힘과 변위 데이터를 수집하였다. 시험하는 동안 모든 뼈는 동일한 방향으로 위치되었다. 굽힘 강성 (EI, N-mm2), 겉보기 탄성 계수 (Eapp, MPa), 궁극 모멘트 (Mult, N-mm), 겉보기 궁극 응력 (σapp, MPa), 파단 에너지 (Work to fracture, Wfrac, mJ) 및 겉보기 인성(Uapp, mJ/mm3)은 측정한 힘 및 변위 데이터와 microCT로 측정한 미드-샤프트 지오메트리를 기반으로 계산하였다. 파단 에너지는 대퇴골이 파열되는 데 필요한 에너지이며, Riemann Sum 방법을 사용하여 힘-변위 곡선 아래 면적을 찾아 계산하였다. 굽힘 강성은 힘-변위 곡선의 선형 부분을 사용하여 계산하였다. 겉보기 탄성 계수를 계산할 때 최소 관성 모멘트를 사용하였다.
ELISA 분석
CTX1 ELISA (Abclonal MC0850) 분석은 사용자 매뉴얼에 따라 실시하였다.
파골세포 및 조골세포 분화 분석
파골 세포 분화를 위해, 골수 세포를 2 개월령 마우스(C57BL/6J)의 대퇴골 및 경골로부터 플러싱하여 수득하고, 골수 유래 단핵구(BMM)를 수득하기 위해, 10 % FBS 및 20 ng/ml의 M-CSF(R&D system)를 포함하는 α-MEM 배지에서 배양하였다. 12시간 후, 비-부착성 세포를 조직 배양 접시에 다시 도말하고 동일한 배지에서 2일 동안 배양하였다. 이어서 수득한 BMM을 RANKL (20 ng / ml; R&D system) 및 M-CSF (20 ng / ml; R&D system) 존재하에서 6일간 파골 세포로 분화시켰다. 대안적으로, 세포를 Osteo Assay Surface plate(3987, Corning)에 도말하고, 파골 세포 흡수 활성을 제조사 메뉴얼에 따라 측정할 수 있다.
조골 세포 분화를 위해, 0.5 mg/ml 콜라게나제-P(Roche) 및 0.05 % 트립신을 함유하는 α-MEM에서 4 일령 마우스의 칼바리아의 조골 세포(COB)를 분리하고, 골 형성 배지(0.1 mg/ml ascorbic acid, 10mM β-glycerophosphate)에서 배양하였다. 알칼린 포스파타제(ALP) 염색의 경우, 조골 세포를 10% 중성 포르말린 완충액으로 고정하고, Fast Blue (Sigma, FBS25) 및 Naphthol AS-MX (Sigma, 855)를 포함하는 용액으로 염색하였다. 대안적으로, 세포 증식을 위해 조골세포를 10배 희석된 알라마르 블루 용액 (Invitrogen, DAL1100)과 함께 배양하였다. 이어서, 세포를 세척하고 6.5mM Na2CO3, 18.5mM NaHCO3, 2mmM MgCl2 및 포스파타제 기질 (Sigma, S0942)을 함유하는 용액으로 배양하고 ALP 활성을 발광계(Biorad)로 측정하였다.
성숙한 조골세포에서 세포 외 매트릭스의 광물화(mineralization)를 평가하기 위해, 세포를 인산 완충 식염수 (PBS)로 2회 세척하고 70% EtOH에서 15분 동안 실온에서 고정하였다. 고정된 세포를 증류수로 2회 세척한 후, 2% 알리자린 레드 용액 (Sigma, A5533)으로 5분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 증류수로 3회 세척하고 칼슘 침착물의 존부를 검사하였다. 아세트산 추출법에 의해 광물화를 정량하였다.
Hydroxyapatite(HA) 결합 분석
HA 비드(1 mg/ml)를 25mM Tris-HCl(PH 7.4)에 현탁시켰다. rAAV9, rAAV9.D14-Nter 및 rAAV9.DSS-Nter의 게놈 카피(108, 109, 1010)를 달리하여 HA와 100㎕로 혼합하여 37℃ 및 300rpm에서 1시간 동안 배양하고, HA 펠렛 내 벡터 역가 및 상층액의 역가를 드로플릿 디지털 PCR (ddPCR)로 측정하였다.
정량적 RT-PCR 분석
QIAzol(QIAGEN)을 사용하여 세포에서 총 RNA를 정제하고 Applied Biosystems의 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 정량적 RT-PCR은 CFX connect RT-PCR 검출 시스템 (Bio-Rad) 및 SYBR® Green PCR Master Mix (Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다. 골 조직에서 shn3 mRNA 수준을 측정하기 위해, 골수를 제거한 후, 경골을 액체 질소에서 30 초 동안 스냅 동결시키고,이어서 1ml의 QIAzol에서 1분 동안 균질화시켰다.
대안적으로, rAAV9-처리된 마우스로부터 채취한 대퇴골 및 경골을 10mM HEPES(pH7.2)(CellGro)가 함유된 행크스 밸런스드 솔트 솔루션(Life Technologies)에서 분쇄하고, 약하게 교반하면서 37℃에서 15 분간, 2.5㎍/mL 콜라게나제 A(Roche) 및 1unit/mL Dispase II (Roche)에 의해 효소적으로 분해되도록 하였다. 생성된 세포 현탁액을 40μm에서 여과하고, 0.5% BSA (Fraction V) 및 2mM EDTA를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 세척하였다. 세척 후, 세포를 2mM EDTA 및 1μg/mL DAPI (생/사 배제)가 함유된 PBS (pH 7.2)에 재현탁시키고, EGFP-발현 세포를 FACS Aria II SORP 세포 분류기 (Becton Dickinson)를 사용하여 분류하였다. QIAzol을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 정제하였다.
면역 블롯팅 분석
세포를 TNT 용해 완충제 (50mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mMM NaCl, 1 % Triton X-100, 1mm EDTA, 1mm EGTA, 50mm NaF, 1mM Na3VO4, 1mm PMSF, 및 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 (Sigma))로 용해시키고, DC 단백질 분석(Bio-Rad)을 사용하여 세포 용해물의 단백질 양을 측정하였다. 동등한 양의 단백질을 SDS-PAGE에 적용하고, 면역 항-GFP 항체(JL-8, 632381, Takara, 1 : 1000), 항-Cre 재조합효소 항체(ab24607, Abcam 1 : 1000)로 면역 블롯된 immunobilon-P membrane (Millipore)으로 옮기고, ECL (Thermo fisher scientific)로 진행하였다. 항-HSP90 항체를 사용한 면역 블롯팅을 로딩 대조군으로서 사용하였다. 대안적으로, 채취한 대퇴골 및 연조직을 RIPA 용해 완충액 (89900, Thermo fisher scientific)에서 균질화하고 조직 용해물을 면역 블롯팅 분석하였다.
rAAV 혈청형의 in vitro 형질 도입 분석
ATDC5 세포 또는 1차 COB는 24-웰 플레이트에서 1×104 개 세포/웰의 밀도로 플레이팅되고 24시간 후에, rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV6.2, rAAV7, rAAV8과 함께 배양되었다. rAAV9, rAAVrh8, rAAVrh10, rAAVrh39 또는 rAAVrh43 벡터를 3 가지 상이한 역가 (109-1011/mL 게놈 카피)에서 CB-Egfp 리포터 트랜스진(transgene)을 패키징하였다. 48 시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 EGFP 발현을 EVOS FL 이미징 시스템 (Thermo fisher scientific)에 의해 모니터링하였다. 대안적으로, 세포를 TNT 용해 완충제에 용해시키고 항-EGFP 항체로 면역 블롯팅하여 EGFP 발현을 평가하고, ImageJ 소프트웨어(http://rsbweb,nih,gov/ij/)를 사용하여 이를 정량화하였다. 마지막으로, 1차 골수 단핵구를 24-웰 플레이트에서 5 × 105 개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 10ng/ml의 RAMKL 및 20ng/ml의 M-CSF의 존재하에 2일 동안 배양하여 파골 세포 전구체(osteoclast precursor)로 분화시켰다. rAAV-Egfp 벡터 처리 3일 후, EVOS FL 이미징 시스템 및 항-EGFP 항체로 면역 블롯팅하여 EGFP 발현을 평가하였다.
생체 내에서 rAAV 벡터를 스크리닝하기 위해, 10㎕의 rAAV-Egfp 벡터 (1×1011GC; 5×1012GC/kg)를 2 개월령 수컷 마우스 (Jackson Laboratory, C57BL/6 J 및 BALB/cJ)의 무릎 관절에 i.a 주사하고, 주사 2주 후, 대퇴골 및 무릎 관절을 해부하여 IVIS-100 광학 영상화를 하거나 냉동 절편을 제조하였다.
Cre 재조합 효소 또는 amiR-shn3의 rAAV9-매개 전달
국소 전달의 경우, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3
(1 × 1011GC; 5 × 1012GC/kg)을 운반하는 10μl의 rAAV9를 2 개월령 수컷 마우스 (Jackson Laboratory, C57BL / 6 J)의 무릎 관절에 i.a 주사하고, 주사 2개월 후, 대퇴골은 microCT 분석을 위해 해부하였다.
전신성(systemic) 전달의 경우, Egfp, Cre, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3 (4 x 1011GC; 2 x 1013GC/kg)를 운반하는 200μl의 rAAV9를 생쥐(Jackson Laboratory, C57BL / 6J)에 주사하고, 2 개월 후, 생쥐에 6 일 간격으로 칼세인 및 알리자린-3-메틸이미노디아세트산을 피하 주사하여 동적 조직형태 분석을 실시하였다. IVIS-100 광학 영상화 또는 냉동 절편을 이용한 EGFP 발현 모니터링에 비 표지 마우스를 사용하였다.
골다공증에서 rAAV9-매개 shn3 사일런싱의 효과
폐경기 골다공증의 마우스 모델은 3개월령 암컷 마우스 (Jackson Laboratory, C57BL/6J)에 마취 및 양측 OVX를 하여 제조하였다. 수술 6주 후, 샴(sham) 또는 OVX 마우스에 amiR-ctrl 또는 amiR-shn3를 운반하는 200㎕의 rAAV9 또는 rAAV9.DSS-Nter (4 × 1010GC; 2 × 1010GC/kg)를 주사하였다. 마우스를 rAAV9 또는 rAAV9.DSS-Nter를 갖는 다음의 6개의 그룹으로 임의로 나누었다. sham+rAAV9-amiR-ctrl, OVX+rAAV9-amiR-ctrl, OVX+rAAV9-amiR-shn3, sham+rAAV9.DSS-Nter-amiR-ctrl, OVX+rAAV9.DSS-Nter-amiR-ctrl, OVX+rAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3. 주사 7주 후, 동적 조직형태 분석을 위해 6 일 간격으로 마우스에 칼세인 및 알리자린-3-메틸이미노디아세트산을 피하주사 하였다. IVIS-100 광학 영상화 또는 냉동 절편을 이용한 EGFP 발현 모니터링에 비 표지 마우스를 사용하였다.
골 형성에 대한
WNT
조절 유전자
사일런서(gene silencer)의
rAAV9
매개 전달의 효과
amiR-ctrl, amiR-sost, amiR-shn3, hs-amiR-shn3 또는 amiR-sost / shn3 (5 x 1013 vg/kg)을 운반하는 rAAV9.DSS 200 μl를 마우스 정맥 내(i.v.)로 주입하고 두 달 후 동적 조직형태계측학적 분석을 위해 칼세인 및 알리자린-3-메틸이미노디아세트산을 6일-간격으로 마우스에 피하로 주사하였다. IVIS-100 광학이미징 또는 동결-절편화를 사용하여 EGFP 발현을 모니터링하기 위해 비라벨링된 마우스를 사용하였다.
골다공증 마우스 모델에서 전신으로 전달된
AAV
벡터의 치료 효과
3개월령 암컷 마우스 (잭슨 래보러토리)를 마취시키고 양측으로 난소절제 (OVX)함으로써 폐경후 골다공증의 마우스 모델을 생성하였다. 수술 6 주 후, sham 또는 OVX 마우스는 amiR-ctrl, amiR-sost, amiR-shn3 또는 amiR-sost / shn3 (5 x 1013 vg/kg)을 운반하는 200 ㎕의 rAAV9.DSS iv 주사하였다. 마우스를 무작위로 5 개 그룹 (sham + rAAV9.DSS-amiR-ctrl, OVX + rAAV9-amiR-ctrl, OVX + rAAV9-amiR-shn3, OVX + rAAV9.DSS.amiR-sost, OVX + rAAV9.DSS.amiR-sost / shn3))으로 나누었다. 주사 8 주 후, 동적 조직형태계측학적 분석을 위해 6일-간IVIS-100 광학 이미징 또는 동결-절편화를 사용하여 EGFP 발현을 모니터링하기 위해 비라벨링된 마우스를 사용하였다. 노인성 골다공증의 마우스 모델로서 18 개월령 수컷 마우스에 200 μl의 rAAV9.DSS 벡터(5 x 1013 vg / kg)를 iv로 주입하고 2 개월 후 microCT, 조직학 및 동적 조직형 분석을 사용하여 골격 분석을 수행했다.
단일 피질 골 결손에서 골
재생에 대한 전신 전달
AAV
벡터의 효과
amiR-ctrl, amiR-shn3, amiR-sost 또는 amiR-sost/shn3(5 x 1013 vg/kg)을 운반하는 200 ㎕의 rAAV9.DSS는 수술 2 주 전에 i.v.로 주사했다. 단일 피질(uni-cortical) 골 결손은 전신 마취(이소플루란, 1 ~ 4 %)하에 시행하였으며, 수술 1 시간 전 부프레노르핀(0.03 mg/kg)을 피하 주사하여 통증을 조절하였다. 2개월 된 암컷 마우스를 측앙와위(lateral decubitus position)에 놓고 수술 부위의 멸균 환경을 소독과 수술용 천으로 유지했다. 대퇴골의 측면에 1.0cm의 피부 절개를 하였고, 외측광근(vastus lateralis)을 통해 접근하여 대퇴골을 노출시켰다. 후 대퇴 신경을 보호하면서 1mm 크기의 전동 연마기(motorized burr)를 사용하여 길이 3mm, 폭 1mm의 골 결손은 만들었다. 결손 부위를 PBS로 세척(irrigate)하여 수질 내의 뼈 조각을 제거하고 근막과 피부를 Vicryl 4/0 및 Nylon 5/0을 사용하여 봉합하였다. 수술 2 주 후, AAV의 형질 도입 및 녹다운 효율을 각각 평가하기 위해 경골 뼈 RNA에서 형광 현미경 및 qPCR 분석을 수행하였다. 골격 분석은 microCT 및 조직학을 사용하여 수행하였다.
골절 치유에 대한 전신으로 전달된
AAV
벡터의 효과
amiR-ctrl, amiR-shn3, amiR-sost 또는 amiR-sost/shn3(5 x 1013 vg/kg)을 운반하는 200 ㎕의 rAAV9.DSS는 수술 2 주 전에 i.v. 로 주사했다. 12 주령 수컷 마우스를 측면 횡와위(lateral recumbency)로 놓고, 멸균 수술용 드레이프로 덮었다.후슬 관절(stifle joint)에서 엉덩이까지 허벅지의 측면을 따라 세로로 피부를 절개했다. 대퇴 신경을 보존하면서 대퇴 광근과 대퇴 직근을 절단하여 대퇴골의 길이를 노출시켜 대퇴부의 측면을 노출시켰다. 대퇴골의 중앙은 수술용 톱으로 절제했다. 골수내 고정(Intramedullary fixation)은 원위 대퇴골의 슬개골 고랑에서 대퇴골의 대퇴 전자 끝까지 관통하는 25G 바늘로 수행하였다. 바늘의 양쪽 끝을 구부린 다음 1mm를 남기고 와이어 커터로 절단했다. 근막은 4/0 Vicryl 봉합사를 사용하여 봉합 한 다음 4/0 나일론 봉합사를 사용하여 피부를 닫았다. 수술 후 2주 동안 골절 치유를 모니터링하기 위해 부상당한 다리의 X-선 촬영을 수행했다. 4주 후, AAV의 형질 도입 및 녹다운 효율을 각각 평가하기 위해 경골 뼈 RNA의 형광 현미경 및 qPCR 분석을 수행했다. 골격 분석을 위해 microCT 및 조직학을 수행했다.
국소적으로 전달된
AAV
벡터가 임계 크기-골 결함에 미치는 영향
타가(allogenous) 대퇴골 이식편은 초음파 처리를 사용하여 탈세포화하여 준비하고 -80 ℃에서 보관했다. 수술이 시작되기 전에 차가운 PBS에서 해동되었다. 3 개월 된 수컷 마우스를 측면 횡와위(lateral recumbency)로 놓고 멸균 수술용 드레이프로 덮었다. 세로 2.0cm의 피부 절개는 후슬 관절(stifle joint)에서 엉덩이까지 허벅지의 측면을 따라 만들어졌다. 후방에 위치한 신경 혈관 다발을 보호하면서 외측 근육 간 격막에 약간 앞쪽에있는 근막을 절개하여 대퇴골의 축을 노출시켰다. 골 결손을 인위적으로 만들기 위해 진동 톱으로 대퇴골(4mm 길이) 절골술을 시행 하였다. 그런 다음 타가(allogenous) 대퇴골 이식편을 틈새 부위에 삽입하고 23G 바늘을 대퇴골과 동종골의 수질을 통과하여 전체 수술 구조를 고정했다. 근육이나 다른 연조직에서 뼈 조각을 제거하기 위해 수술 부위를 PBS로 세척(irrigate)한 후, 근막과 피부를 Vicryl 4/0 및 Nylon 5/0으로 닫았다. 수술 12주 후 microCT와 조직학을 사용하여 골격 분석을 수행했다.
통계 분석 방법
모든 실험은 IHC, 조직 학적 염색 및 면역 블 롯팅에 대해 최소 2 ~ 3 회 수행되었으며 대표 이미지가 표시되었다.
모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(standard error of the mean, S.E.M)로 표시하였다. 표본 크기는 측정된 모수의 30 % 차이가 예상 평균의 10 -20%의 시그마 추정치(estimate of sigma)와 함께 생물학적으로 중요한 것으로 간주된다는 가정하에 계산하였다. 알파와 베타는 각각 0.05와 0.8의 표준값으로 설정하였다. 분석에서 제외된 동물 또는 샘플은 없으며, 실험군 및 대조군의 동물은 무작위로 선택하였다. 연관성이 있는 데이터 분석을 위해, 정규 분포를 확인하기 위한 Shapiro-Wilk 정규성 테스트를 수행하였다. 정규성 테스트를 통과한 경우, 두 그룹 간의 비교에 two-tailed, unpaired Student's t-test를 사용하였으며, 정규성 테스트를 실패한 경우, 두 그룹 간의 비교에 Mann-Whitney 테스트를 사용하였다. 3개 또는 4개의 그룹을 비교시, 정규성 테스트를 통과한 경우, 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용한 다음, 모든 그룹 쌍에 대해 Tukey의 다중 비교 테스트(Tukey's multiple comparison test)를 수행하였다. 정규성 테스트에 실패한 경우, Kruskal-Wallis 테스트를 수행 한 후, Dunn의 다중 비교 테스트(Dunn's multiple comparison test)를 수행하였다. GraphPad PRISM 소프트웨어 (v6.0a, La Jolla, CA)를 통계 분석에 사용하였다. P <0.05는 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다. (* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; 및 **** P <0.0001)
실시예
1. 생체 외에서 뼈 및 연골 계통 세포 형질 도입에 적합한
AAV
혈청형 선별
1.1 in vitro에서의 AAV 혈청형 별 형질 도입능의 검증
생체 외에서 뼈와 연골 계통의 세포로 형질도입하는데 가장 우수한 AAV 혈청형을 확인하기 위한 실험을 실시하였다. enhanced green fluorescent protein(Egfp) 리포터 유전자를 발현하는 scAAV 벡터를 14개의 AAV 캡시드 (AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh10, AAVrh.39, 및 AAVrh.43) 내에 패키징(packaging)하였다. 마우스 Calvarial 조골 세포(mouse calvarial osteoblasts, COB), 골수 유래 파골 세포 전구체(bone marrow-derived osteoclast precursors, BM-OCP) 및 연골 세포 전구 세포(ATDC5)와 함께 배양하였다. 형질 도입 된 세포에서 EGFP의 발현은 항-EGFP 항체를 이용한 면역 블롯팅에 의해 측정되었으며, 측정 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 8 개의 AAV 혈청형 벡터, rAAV1, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV9, rAAVrh10 및 rAAVrh39는 COB에 형질도입하는 것을 확인하였다. 이들 중에서, rAAV1, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7 및 rAAV9는 또한 BM-OCP에 형질도입한 반면, rAAV1, rAAV6, rAAVrh.10 및 rAAVrh.39는 ATDC5 세포에 형질도입하는 것을 확인하였다. rAAV2 및 rAAV6.2는 ATDC5 세포에 효율적으로 형질 도입하였으나 COB에서는 형질도입을 거의 나타내지 않는 것을 확인하였다.
1.2 in vivo에서의 AAV 혈청형 별 형질 도입능의 검증
생체 외에서의 rAAV의 형질 도입 효율을 통하여 생체 내 기능을 예측하기는 어렵다. 이는 투여 경로, 혈청 인자, 순환 중화 항체 및 세포 외 장벽을 포함한 여러 생리학적 장벽의 존재로 인한 것이다. 따라서, 조직 또는 세포 유형에 따른 형질 도입 능력을 AAV 혈청형 별로 평가하기 위해, in vivo 실험을 수행하였다. 관절 연골 및 뼈에 대한 AAV 캡시드의 성향을 조사하기 위해, in vitro 스크린에 의해 선택된 8개의 rAAV-Egfp 벡터(rAAV1, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV9, rAAVrh.10 및 rAAVrh.39)를 2개월령 마우스의 무릎 관절에 주사하고, 주사 2주 후, EGFP 발현을 IVIS-100 광학이미지 및 형광 현미경으로 모니터링 하였으며, 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2a, 2b, 2c에 나타낸 바와 같이, 대부분의 캡시드에 의해서는 성장판 또는 관절 연골에 EGFP의 발현이 거의 나타나지 않았다. In vitro 실험결과와의 이러한 불일치는 rAAV 벡터가 무혈관 미세 환경에 위치한 연골 세포에 대한 접근성이 낮기 때문일 수 있다. 특히, trabercular 및 cortical bone의 EGFP 발현은 rAAV9로 처리된 뒷다리에서만 검출되었다. 구체적으로, 대퇴골에서의 rAAV9-매개 EGFP 발현은 뼈 표면상의 조골 세포, 파골 세포 및 뼈 매트릭스 내에 위치한 골 세포에서 검출되었다.
도 2d에 나타낸 바와 같이, 특히, 또한 오스테오칼신(Osteocalcin)-양성 조골 세포, Runx2-양성 조골 세포, 카텝신 K(cathepsin K)-양성 파골 세포 및 스클레로스틴(Sclerostin)-양성 파골 세포의 서브 세트에서 EGFP 발현을 검출한 바, AAV9가 생체 내에서 조골 세포, 파골 세포 및 골 세포에 형질 도입하는 능력이 있음을 확인하였다.
실시예 2. AAV9의 전신성(systemic) 전달에 의한 조직 별 발현 평가
전신성으로 전달 될 때 생체 내에서 뼈 조직을 표적화하는 AAV9의 능력을 확인하는 시험을 수행하였다. rAAV9-Egfp를 2개월령 마우스에 주사하고, 주사 2 주 후, rAAV9의 조직 분포를 EGFP 발현을 통해 평가하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, rAAV9-Egfp 처리된 마우스의 전신 및 개별 기관을 영상화 한 결과, 간 및 뒷다리에서 EGFP 발현이 가장 높다는 것을 확인하였다. 심장, 대퇴골에서의 발현은 중간 정도로 나타났으며 폐, 신장 및 비장에서는 발현되지 않았다.
도 3b, 3c, 3d에 나타낸 바와 같이, rAAV9-Egfp 처리에 의한 심장, 간, 대퇴골 및 척추에서의 EGFP의 발현은 형광 현미경 및 면역 블롯 분석시에도 나타나는 것을 확인하였다. 특히, 뒷다리의 EGFP 발현 결과, EGFP 단백질은 주로 피질골과 소주골의 내골(endosteal) 조골세포 및 골 세포에서 발현되었지만 인대, 관절 연골, 성장판, 골막 조골세포 및 슬개골에서는 발현되지 않은 것을 확인하였다. 이러한 결과는 전신적으로 전달된 rAAV9 벡터가 내골 뼈에 존재하는 조골 세포 계통의 세포를 표적으로 한다는 것을 나타낸다.
실시예 3. rAAV9 매개 Shn3 결실을 이용한 골 치료 가능성 검증
3.1 Shn3 결실이 뼈에 미치는 영향의 확인
골 형성에 대한 shn3의 단기 억제 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 성숙 조골 세포에서 타목시펜-유도 Cre 재조합 효소를 발현하는 오스테오칼신-CreERT 마우스와 Shn3fl
/fl 마우스를 교배시킴으로써 유도성, 조골 세포-특이적 shn3-knockout 마우스(Shn3Ocn
-
Ert)를 제조하였다. 상기 마우스를 Cre-리포터 RosamT
/
mG 마우스와 추가로 교배시켜 Shn3;Ocn-Ert;RosamT
/
mG마우스를 제조하였다. 상기 제조한 Shn3;Ocn-Ert;RosamT/mG 마우스에 타목시펜을 처리하고 2달 후, EGFP 발현 및 골의 기계적 변화를 관찰하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 타목시펜 처리된 Shn3;Ocn-Ert;RosamT
/
mG 마우스는 골 및 피질 뼈 표면의 성숙한 조골 세포에서 GFP가 발현되었으며, 이는 shn3의 조골 세포-특이적 결실을 나타낸다.
도 4b, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 상기 마우스는 타목시펜 처리된 대조군 마우스와 비교하여, 소주골 질량이 유의하게 증가하고 골 피질의 두께가 약간 증가한 것을 확인하였다.
이러한 결과는 성숙한 조골 세포에서 Shn3의 결실이 성체 마우스에서 골 질량을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
3.2
rAAV9
-매개
트랜스진
(
transgene
) 전달에 의한 골 질환 치료 가능성 확인
전신적으로 전달된 rAAV9가 조골세포 계통 세포에서 snh3의 결실을 유도하여 뼈 형성을 촉진 할 수 있다는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 Shn3fl
/fl 마우스에서 Cre-재조합 촉진제로 작용하는 Cre-코딩 rAAV9 벡터(rAAV9-Cre)를 제조하였다. 본 발명자들은 Shn3fl
/fl 마우스로부터 분리 배양된 COB에 rAAV9-Cre를 처리하였다. 그 결과, Shn3fl
/fl 유래 COB에서 rAAV9-매개 Cre의 발현은 shn3의 결실을 유도하였고, 조골 세포의 분화를 촉진하는 것을 확인하였다. 다음으로, rAAV9-Cre를 2개월 된 Shn3fl
/fl; RosamT
/
mG 마우스에 정맥 내 주사하였으며, 주사 2개월 후,
Cre
mRNA 및 shn3 mRNA 발현을 RT-PCR로 측정하였고, EGFP 단백질 발현을 형광 현미경으로 측정하였으며, 골 질량의 변화를 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 대퇴골에서 Cre mRNA의 발현을 확인하였다. 또한, rAAV9-Egfp 처리된 대퇴골과 비교하여, rAAV9-Cre 처리된 대퇴골에서 shn3 mRNA 수준이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
도 5b에 나타낸 바와 같이, 뼈 표면 상에 존재하는 조골 세포 계통 세포에서 Cre-매개 EGFP 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
도 5c 및 5d에 나타낸 바와 같이, rAAV9-Egfp 처리된 마우스와 비교하여, rAAV9-Cre 처리된 마우스의 대퇴골 및 요추에서 상대적인 소주골 질량의 증가를 확인하였다. 그러나 대퇴골 골간(diaphysis)에서 피질 뼈의 두께에는 큰 변화가 없는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Shn3fl
/fl 마우스에서 전신적으로 전달된 rAAV9-Cre가 골 세포 계통 세포를 표적화하고 골 질량을 증가시키는 shn3 결실을 매개한다는 것을 나타낸다. 즉, 이러한 결과는 조골 세포 계통 세포에 rAAV9-매개 트랜스진(transgene) 전달이 골 생리를 극적으로 변화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. rAAV9 매개 shn3 표적 amiR에 의한 골 질환 치료 가능성 확인
4.1 shn3 표적 amiR 카세트의 제조
AAV-전달 shRNA는 RNAi 기전을 교란시킴으로써 세포 독성을 유발하거나 표적 외(off-target) 사일런싱을 나타낼 수 있다. 소형 사일런싱 가이드 RNA를 마우스 miR-33 유래 miRNA 스캐폴드에 삽입하여, shRNA 관련 독성을 제한하고, 유전자 녹다운 효율을 높이며, 기존 shRNA와 비교하여 10 배까지 표적 외 사일런싱을 감소시킬 수 있다. 따라서 shn3을 표적으로 하는 amiR 카세트(amiR-shn3) 및 대조군 카세트(amiR-ctrl)을 제조하였으며, 이를 도 6에 나타내었다.
4.2 rAAV9-amiR-shn3의 국소 투여에 의한 shn3 사일런싱 검증
생체 내에서 뼈-동화(bone-anabolic) 활성을 향상시키는 rAAV9-amiR-shn3의 능력을 확인하기 위한 시험을 수행하였다. rAAV9-amiR-shn3 벡터 또는 rAAV9-amiR-Ctrl 벡터를 2 개월령 마우스의 무릎 관절에 투여하였다. 투여 2 개월 후, EGFP 발현을 각각 IVIS 광학 이미지 및 형광 현미경으로 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7a, 도 7b에 나타낸 바와 같이, EGFP 발현이 뒷다리와 대퇴골 부위에서 발현되는 것을 확인하였다.
또한, 대퇴골로부터 EGFP 발현 세포를 분류하여, shn3 mRNA를 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 대퇴골로부터 분리한 EGFP 발현 세포는 rAAV9-amiR-shn3를 투여한 군에서 shn3 mRNA 발현 수준이 대조군 대비 50 % 감소된 것을 확인하였다.
또한, 실험군과 대조군 마우스 대퇴골을 골 질량 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, amiR-Ctrl 처리된 군의 대퇴골과 비교하여, amiR-shn3 처리된 군의 대퇴골은 상대적으로 소주골 질량이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 rAAV9-amiR-shn3의 국소적인 전달이 조골세포 계통 세포에서 shn3 발현을 녹다운시키는데 효과적이며, 생체 내에서 골 질량을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
4.3 rAAV9-amiR-
shn3
의 전신성 투여에 의한
shn3
사일런싱 검증
rAAV9-amiR-shn3의 전신성 전달에 의해 생체 내 뼈 동화 활성을 촉진 할 수 있는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. rAAV9-amiR-shn3 벡터 또는 rAAV9-amiR-Ctrl 벡터를 3개월령 마우스에 정맥 주사하고 2개월 후, EGFP 발현을 측정하였으며, 대퇴골의 골질량 변화를 확인하였고, 대퇴골 metaphysis 내 소주골의 골 형성률 (BFR), 미네랄 부착률 (MAR) 및 골 표면 당 골세포 표면 비율(Ob.S/BS)을 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10a에 나타낸 바와 같이, rAAV9-amiR-shn3을 투여한 마우스의 대퇴골은 shn3 mRNA 수준이 대조군 대비 50 % 감소한 것을 확인하였다.
도 10b, 도 10c에 나타낸 바와 같이, 대퇴골 및 요추의 골 질량이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.
도 10d, 도 10e에 나타낸 바와 같이, 골 형성률, 미네랄 부착률 및 골 표면 당 조골세포 표면 비율이 증가한 것을 통해, rAAV9-amiR-shn3 처리된 마우스에서 생체 내 조골 세포 활성이 증가한 것을 확인하였다.
이러한 결과는 rAAV9-amiR-shn3의 전신적 전달이 조골 세포 계통 세포에서 shn3 발현을 감소시키고, 조골 세포 활성을 증가시키며, 파골 세포 수 및 생체 내 기능의 변화없이 골량을 증가시킨 것임을 나타낸 것이다. 따라서, rAAV9-amiR-shn3 벡터는 강력한 골 동화 작용제로서 골다공증 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. rAAV9 매개
shn3
사일런싱의 골다공증 모델에 대한 효과
5.1 골다공증 모델에서
shn3
결손의 효과
난소 절제(OVX) 마우스는 에스트로겐 결핍 유발 골다공증에 대한 모델로서 기능한다. shn3의 억제가 골다공증 치료법으로서 뼈 형성을 촉진시키는 효과적인 표적이 될 수 있음을 추가로 확인하기 위해, shn3가 없는 3 개월령 암컷 마우스(Shn3-/-)의 난소를 절제하고, 절제 2달 후 골 질량을 microCT로 측정하였으며, 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 난소 절제가 WT 마우스에서 소주골 질량을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 그러나 sham-Shn3-/-마우스와 OVX-Shn3-/-마우스의 소주골 질량을 비교한 결과, 난소 절제-유도성 골 손실은 shn3 결실에 의해 완전히 예방되는 것을 확인하였다. 따라서, 골다공증에서 골 손실을 예방할 수 있는 표적으로 shn3이 될 수 있음을 다시 한번 확인하였다.
5.2 골다공증 모델에서 rAAV9-amiR-
shn3
치료 효과의 확인
골다공증에서 rAAV9-amiR-shn3의 치료 효과를 시험하기 위해, 3 개월 된 야생형 암컷 마우스에 대해 샴 또는 OVX 수술을 수행하였고, 벡터는 수술 후 6 주에 정맥 주사하였다. 실험 방법을 도식화하여 도 12a에 나타내었고, 벡터 주사 7주 후 실험군 및 대조군의 대퇴골 분석결과를 도 12b 내지 도 12h에 나타내었다.
도 12b 및 도 12c에 나타낸 바와 같이, 벡터 주사 7 주 후, rAAV9-amiR-shn3 처리된 대퇴골은 효율적으로 형질 도입된 것을 확인하였으며, shn3가 대조군 대비 50 % 넉다운된 것을 확인하였다.
도 12d 및 도 12e에 나타낸 바와 같이, amiR-Ctrl 발현 난소 절제 마우스는 샴 마우스에 비해 대퇴골 및 요추에서 소주골 질량이 현저히 감소된 것을 확인하였다.
도 12f 및 도 12g에 나타낸 바와 같이, amiR-Ctrl 발현 OVX 마우스에 비해 rAAV9-amiR-shn3 벡터 처리한 마우스의 대퇴골 골 형성률 (BFR), 미네랄 부착률(MAR)이 증가한 것을 확인하여, 생체 내에서 조골 세포 활성이 향상된 것을 확인하였다.
도 12h에 나타낸 바와 같이, 생체 역학 분석 결과, rAAV9-amiR-shn3 벡터 처리한 마우스는 난소 절제 유도성 골 손실로부터 대퇴골의 강도 및 강성이 상당히 보호된 것을 확인하였다. 이는 shn3에 대한 rAAV9 매개 사일런싱이 골다공증에서 임상적으로 효과를 나타내는 것을 의미한다.
종합하면, 상기 결과는 전신적으로 전달된 rAAV9-amiR-shn3가 골 형성을 촉진하고, 난소 절제-유도성 골다공증 발병 후 뼈의 기계적 특성을 향상 시킨다는 것을 확인한 것이다.
실시예
6. 골 표적
펩타이드
모티프 ((
AspSerSer
)
6
, DSS)에 의한
AAV9의
비 표적(off target) 감소 효과 확인
6.1 DSS 삽입에 의한 골 표적화 개선 검증을 위한 in vitro 실험
위에서 설명 된 바와 같이, rAAV9의 대부분은 골 이외의 말초 조직을 표적화하는바, 전신적으로 전달된다면 rAAV9-amiR-shn3의 특이성이 제한된다. 항-스클레로스틴 항체 (Romosozumab) 및 cathepsin K (Odanacatib)의 소분자 억제제 같은 골다공증에 대한 새로운 약제가 임상 시험에서 심혈관 및 뇌 혈관과 같은 비 표적(off target) 작용이 확인된 바, 골 특이적인 치료 전략이 필요하다. 따라서, 본 발명자들은 rAAV9-매개 유전자 요법의 잠재적 비 골격 조직에 대한 부작용을 피하기 위해, AAV9 캡시드를 변형하여, 형질 도입 대상에서 비 관련 조직을 표적에서 제외하고자 하였다. 골 표적 펩타이드 모티프 ((AspSerSer)6, DSS)는 골 형성 계통 세포가 존재하는 골 형성 표면으로 골 형성능이 있는 siRNA로 캡슐화 된 리포좀을 유도하는데 효과적이다. 따라서, 조골 세포 계통 세포를 표적화하는 rAAV9의 능력을 개선하기 위해, 글루타민 588과 알라닌 589 사이의 루프 IV 도메인에 DSS를 암호화하는 DNA 서열을 삽입하여, AAV9.DSS-588를 제조하였고, VP2의 N- 말단에 DSS를 암호화하는 DNA 서열을 삽입하여, AAV9.DSS-Nter를 제조하였으며, DSS 삽입 위치를 도식화하여 도 13에 나타내었다.
상기 제조한 AAV9.DSS-Nter 또는 AAV9.DSS-Nter 벡터를 COB에 처리하고, 면역 블롯팅 및 형광 현미경에 의해 EGFP 발현을 평가하여 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, rAAV9와 비교하여, rAAV9.DSS-Nter는 낮은 MOI (109 GC / mL)에서 형질도입이 약간 감소한 것을 확인하였으며, rAAV9.DSS-588 처리된 COB에서는 EGFP 발현이 거의 확인되지 않았다. 대조적으로, rAAV9.DSS-588은 트랜스진의 발현이 거의 없었다.
상기 제조한 AAV9.DSS-Nter 또는 AAV9.DSS-Nter 벡터를 COB 및 BM-OCP에 처리하고, fast blue 염색법으로 ALP를 측정하여 측정 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, rAAV9 및 rAAV9.DSS 벡터로 COB 및 BM-OCP를 처리한 결과, 조골 세포 또는 파골 세포 분화 마커가 거의 변하지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 rAAV9의 처리가 벡터 관련 부작용을 초래하지 않는 것을 의미한다.
6.2 DSS 삽입에 의한 골 표적화 개선 검증을 위한 in vivo 실험
AAV9.DSS-Nter 캡시드는 in vitro에서 형질 도입 활성을 유지하므로, 본 발명자들은 in vivo에서 골-표적 활성을 확인하는 시험을 수행하였다. rAAV9-Egfp 또는 rAAV9.DSS-Nter-Egfp 벡터를 2 개월령 마우스에 정맥 주사하고, 벡터의 조직 별 분포를 주사 2주 후 EGFP 발현을 통해 평가하였으며, 평가 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16a에 나타낸 바와 같이, rAAV9.DSS-Nter 처리된 마우스는 rAAV9로 처리된 마우스와 비교하여, EGFP가 심장에서는 거의 발현되지 않았으며, 간에서 55% 적게 발현하였고, 뒷다리에서는 75% 적게 발현된 것을 확인하여, 골 이외의 조직에서 적게 발현하는 것을 확인하였다.
도 16b, 16c, 16d에 나타낸 바와 같이, rAAV9.DSS-Nter 처리군은 심장에서 EGFP가 검출되지 않았으며, 간 및 근육에서 EGFP가 현저히 감소한 것을 확인하였다. 이는 rAAV9.DSS-Nter 처리된 마우스가 골 이외의 조직에서 EGFP를 적게 발현하는 것을 확인한 것을 뒷받침하는 것이다.
도 16e에 나타낸 바와 같이, rAAV9-처리된 마우스의 대퇴골에 비하여, rAAV9.DSS-Nter 처리된 마우스의 대퇴골 뼈 표면의 EGFP-발현 세포의 수가 증가한 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터, 골 표적 펩티드 모티프 (DSS)와 결합한 VP2 캡시드 단백질에 의하여, 비-골격 조직으로의 전달을 감소시켜, rAAV9의 골 친화성을 향상시켰다는 것을 확인하였다.
6.3 DSS 삽입에 의해 골
표적능이
개선된
rAAV9.DSS
-
Nter
-
amiR
-
shn3
의 골다공증
모델에 대한 효과 확인
난소 절제 마우스에 amiR-shn3
트랜스진을 전달하는 AAV9.DSS-Nter 골 친화성 캡시드(rAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3)의 능력을 확인하는 시험을 수행하였다. 3개월 된 암컷 마우스에 샴 또는 난소 절제 수술을 수행하고, rAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3를 수술 6주 후 정맥 주사하였다. 주사 7주 후,
shn3 mRNA를 측정하여 도 17a에 나타내었고, 대퇴골을 분석하여 도 17b 내지 17e에 나타내었다.
도 17a에 나타낸 바와 같이, amiR-Ctrl를 처리한 샴 마우스 또는 amiR-Ctrl를 처리한 난소 절제 마우스의 대퇴골에 비해 amiR-shn3를 처리한 난소 절제 마우스의 대퇴골에서 shn3 mRNA의 발현이 현저하게 감소된 것을 확인하였다.
도 17b 내지 17e에 나타낸 바와 같이, amiR-Ctrl을 처리한 난소 절제 마우스는 amiR-Ctrl을 처리한 샴 마우스에 비해 대퇴골 및 요추의 소주골 질량이 유의하게 감소한 것을 확인하였으나, rAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3 처리한 난소 절제 마우스에서 소주골 질량이 현저히 증가한 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, AAV9.DSS-Nter 골-친화성 캡시드에 의한 amiR-shn3의 전달이 골다공증에서 골 손실을 방지 할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. rAAV9의 파골세포에 대한 도입능 확인
rAAV9의 다른 HSC 계통 세포에 대한 형질 도입능을 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 구체적으로 rAAV9.EGFP를 2 개월령 마우스에 정맥 내 주사하고, IVIS 광학 이미지를 이용한 EGFP 발현 측정에 의해 rAAV9의 조직 분포를 평가 하였다. 마우스의 개별 장기를 영상화한 결과, 심장, 간 및 뒷다리에서 EGFP 발현이 나타났다. 또한, 대퇴골에서 EGFP 발현 세포를 확인한 결과를 도 18에 나타내었으며, EGFP를 발현하는 골수세포의 유세포 분석 결과를 도 19에 나타내었고, EGFP 발현을 통해 형질도입에 효과적인 세포군을 확인한 결과를 도 20에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 대퇴골에서 조골세포 및 카텝신 K 발현 파골 세포를 포함한 대부분의 EGFP 발현 세포는 골간단의 소주골에 위치하는 반면, 소수의 원형 골수 세포 만이 EGFP 발현을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 골수에 존재하는 거핵 세포는 자동 형광을 나타내는 것을 확인하였다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 골수 세포의 유세포 분석으로 CD11b+ 단핵구, 파골세포의 전구세포 (OCP; CD3ε-, B220-, TER119-, CD11b-/lo, Ly6c+) 및 B220+ B 림프구에서 EGFP가 발현되는 것을 확인하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 골수 유래 단핵구 (BMM)의 in vitro 분화 분석은 rAAV9가 RANKL 처리된 예비 파골세포(pre-OC) 및 성숙 파골세포(OC)에 형질 도입하는데 매우 효과적이지만, 골수 유래 단핵구 (BMM), 대식세포 (BMDM) 및 수지상세포(BMDC)는 아닌 것으로 확인하였다. 따라서, rAAV9가 골수에서 다른 HSC 계통 세포보다 예비 및 성숙 파골 세포를 형질 도입하는데 더 효과적인 것을 확인하였다.
실시예 8. rAAV9 매개
RANK
유전자 결실의 효과
8.1
RANK
대립 유전자를 조건부 결실에 따른 마우스 골 변화
파골 세포를 표적으로하는 Cre- 결실 마우스(Rankfl
/fl; ctsk)에서 RANK 대립 유전자를 조건부 결실시켰을 때, 마우스의 뼈에 나타나는 변화를 확인하였으며, 이를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 파골 세포를 표적으로하는 Cre- 결실 마우스(Rankfl/fl; ctsk)에서 RANK 대립 유전자의 조건부 결실은 파골 세포-매개 골 흡수가 결여되어 골화석증(osteopestrosis)을 일으키는 것을 확인하였다.
8.2 rAAV9 매개
RANK
결실의 확인
전신적으로 전달된 rAAV9가 골 재흡수를 억제하기 위해 파골 세포에서 RANK를 표적으로 할 수 있는지 확인하기 위해, Cre 재조합 효소를 발현하는 rAAV9 벡터(rAAV9.Cre)를 생성하여 파골 세포 계통 세포에서 RANK의 결실을 유도하였으며, Cre 유전자와 RANK 유전자의 발현을 측정하여 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 배양된 Rankfl
/fl의 예비 파골세포에서 rAAV9-매개 Cre발현은 RANK를 결실시켰으며, 파골 세포로의 분화를 억제하는데 효과적이었다.
8.3 rAAV9 매개
RANK
결실에 따른 마우스 골 변화
생체 내 파골 세포에서의 rAAV9 매개 Cre 발현을 확인하기 위해, Cre-리포터 RosamT/mG 마우스를 Rankfl
/fl 마우스와 교배시켜 Rankfl
/
fl;RosamT
/
mG 마우스를 제작하였다. rAAV9.Cre를 2 개월령 Rankfl
/fl; RosamT
/
mG 마우스에 정맥 주사하고, 대퇴골에서의 Cre 매개 GFP 발현을 주사 2주 후 형광 현미경으로 확인하여 도 23a에 나타내었고, 주사 2개월 후 마우스 대퇴골을 분석하여 도 23b에 나타내었다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 주사 2개월 후, rAAV9.Cre를 주사한 마우스의 대퇴골은 rAAV9.EGFP를 주사한 마우스의 대퇴골에 비해 소주골 질량 및 피질 두께가 현저히 증가한 것을 확인하였다. 따라서, 전신적으로 전달된 rAAV9.Cre는 Rankfl
/fl; RosamT/mG 마우스에서 파골 세포를 표적으로하며, RANK의 결실을 유도하여 뼈 질량을 증가시키는 것을 확인하였다.
실시예
9 파골세포에 대한
rAAV9
매개 유전자
사일런싱의
골 질량 증대 효과 확인
9.1 rAAV9-매개 유전자 전달 벡터 제작 및 이의 효과 확인
파골 세포-매개 골 흡수를 억제하기 위해, rAAV9-매개 유전자 전달을 사용하여 주요 파골 세포 조절 유전자인 RANK (tnfrsf11a) 및 카텝신 K (ctsk)를 사일런싱시키고 이의 효과를 확인하였다. Small silencing RNA의 가이드 가닥을 miR-33-유도 miRNA 스캐폴드(amiR)에 포함시켜 shRNA 관련 독성을 감소시키고, 유전자 녹다운을 효율을 높였으며, 기존 shRNA에 비해 표적 외 사일런싱(off target silencing)을 10배 이상 감소시켰다. 그 후, RANK와 ctsk를 타겟으로 하는 amiR 카세트(amiR-RANK-1, amiR-RANK-2, amiR-ctsk
-1 및 amiR-ctsk
-
2)를 생성한 다음 AAV9 캡시드로 패키지하였다. amiR 카세트는 형질 도입된 세포를 추적하기 위한 트랜스진 카세트의 EGFP 인트론 영역 내에 삽입하여 벡터를 제조하였다. 배양된 야생형 예비 파골세포(pre-OC)에서 이들 벡터의 녹다운 효율을 RT-PCR을 사용하여 조사하였다. 상기 벡터의 amiR 카세트 삽입 위치를 도식화하여 도 24a에 나타내었으며, 상기 벡터에 의한 녹다운 효율을 도 24b에 나타내었다.
도 24b에 나타낸 바와 같이, amiR-RANK-1 대비 amiR-RANK-2의 RANK 녹다운 효율이 높으며, amiR-ctsk
-2 대비 amiR-ctsk
-1의 ctsk 녹다운 효율이 높은 것을 확인하였다. 따라서, 이하 실시예에서 amiR-RANK-2과 amiR-ctsk
-1을 본 발명의 amiR-RANK 또는 amiR-ctsk로 사용하였다.
9.2 rAAV9.amiR-
RANK
또는 rAAV9.amiR-
ctsk
벡터 투여에 의한 골 변화 확인
마우스에서 RANK 유전자 결실은 파골 세포 생존 및 분화를 약화시켜 파골 세포 자체의 감소를 유발한다. 반면에, 카텝신 K의 소실은 파골 세포의 생존 및 분화를 유지하면서, 파골 세포의 재흡수 활성을 억제한다. 이와 유사하게, rAAV9 매개 RANK 사일런싱은 파골 세포의 분화 및 재흡수 활성 모두를 손상시키는 반면, rAAV9.amiR-ctsk 처리된 세포는 골 재흡수 활성만이 현저하게 감소되는 것을 확인하였으며 이를 도 25a에 나타내었다.
생체 내 골 흡수를 억제하는 amiR-RANK 또는 amiR-ctsk의 효과를 확인하기 위해, amiR-RANK 또는 amiR-ctsk을 운반하는 rAAV9 벡터(rAAV9.amiR-RANK 또는 rAAV9.amiR-ctsk)를 2 개월령 마우스에 정맥 주사하고 2 개월 후, 대퇴골 EGFP 발현을 형광 현미경에 의해 시각화 하여 이를 도 25b에 나타내었다.
rAAV9.amiR-Ctrl 처리된 대퇴골과 비교하여, rAAV9.amiR-RANK 또는 rAAV9.amiR-ctsk 처리된 대퇴골에서 60 % 이하의 RANK 또는 ctsk mRNA 발현 감소 및 소주골 질량의 상대적 증가를 확인하였으며, 이를 도 25c, 도 25d 및 도 25e에 나타내었다.
특히, rAAV9.amiR-RANK 처리된 대퇴골 대비, rAAV9.amiR-ctsk 처리된 대퇴골에서 소주골 부피, 수 및 두께가 더 높게 확인된 바와 같이, rAAV9.amiR-ctsk는 rAAV9.amiR-RANK보다 뼈 발생에 대해 더 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
9.3
rAAV9.amiR
-
RANK
또는
rAAV9.amiR
-
ctsk
벡터 투여에 의한 골 변화 유발 기전의 확인
상기 효과에 대한 기전을 확인하기 위하여, 생체 내 파골 세포 및 조골 세포 활성을 평가하였으며, 상기 벡터 처리된 대퇴골의 골간단에서 조직형태측정(histomophometry)을 실시하였다.
rAAV9.amiR-RANK 처리된 대퇴골에서, TRAP(Tartrate resistant acid phosphatase)-양성 파골 세포의 수와 뼈 표면의 침식은 rAAV9.amiR-Ctrl- 처리된 대퇴골에 비해 현저하게 감소된 것을 확인하였으며, 이를 도 26a 및 도 26b에 나타내었다.
이에 반하여, rAAV9.amiR-ctsk로 처리한 대퇴골의 경우, 뼈 표면의 침식이 현저하게 감소되는 반면, 파골 세포 수는 유의하게 변화하지 않은 것을 확인하였으며, 이를 도 26c 및 도 26d에 나타내었다.
rAAV9.amiR-RANK 처리된 대퇴골과는 달리, rAAV9.amiR-ctsk 처리된 대퇴골에서 골 형성률 (BFR), 미네랄 부착률 (MAR) 및 골 표면 당 골세포 표면 비율 (Ob.S / BS)이 현저히 증가한 것을 확인하였으며, 이를 도 26e, 26f 및 26g에 나타내었다.
상기 결과는 rAAV9.amiR-RANK 처리가 조골 세포 활성에 변화를 유발하지 않고, 파골 세포 분화 및 재흡수 활성에 현저한 감소를 초래한다는 것을 확인한 것이다.
한편, rAAV9.amiR-ctsk 처리는 파골 세포 분화에 영향을 미치지 않으면서, 파골 세포-매개 골 흡수를 약화시키고 조골 세포-매개 골 형성을 촉진시킨다. 대신, 파골 세포에서 ctsk의 유전자 결실을 갖는 마우스와 유사하게, rAAV9.amiR-ctsk 처리된 대퇴골에서 sphingosine kinase 1 (sphk1) 및 Runt 관련 전사 인자 2 (runx2) mRNA의 발현 증가가 확인되었으며, 이를 도 26h에 나타내었다.
SPHK1이 sphingosine을 인산화하여 sphingosine 1 phospate (S1P)를 생성함으로써 골 형성을 촉진한다고 가정하면, 파골 세포에서 ctsk의 rAAV9- 매개 사일런싱은 S1P의 생산 증가를 통해 조골 세포-매개 골 형성을 향상시킬 수 있다. 즉 이러한 결과는 amiR-ctsk는 파골 세포-매개 골 흡수를 억제하고, 조골 세포-매개 골 형성을 동시에 촉진할 수 있으므로, rAAV9-amiR-ctsk 벡터가 rAAV9-amiR-RANK 벡터보다 골다공증 치료에 더 효과적인 것을 확인한 결과이다.
실시예 10. 골조직을 표적으로하는 rAAV9 캡시드의 제조
10.1 골조직을 표적으로하는 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14의 제조
카텝신 K는 표피, 심혈관 및 뇌 혈관 부위를 포함한 다양한 비 골격 조직에서 발현된다. 따라서, 카텝신 K를 약리학적으로 억제하는 방법은 임상적용시 뇌 혈관 등의 표적 외(off target) 위험이 존재한다. 이러한 부작용을 해소하기 위하여, 비 골격 조직에 대한 표적화를 회피하기 위한 캡시드를 제조하였다. 구체적으로, (Asp-Ser-Ser)6 또는 (Asp)14 펩티드 모티프를 AAV9 캡시드 단백질 서브 유닛 VP2의 N-말단에 이식하여 AAV9.DSS-Nter (rAAV9.DSS) 및 AAV9.D14-Nter (rAAV9.D14)를 제조하였으며, AAV9.DSS-Nter (rAAV9.DSS) 및 AAV9.D14-Nter (rAAV9.D14)의 구조를 도 27에 나타내었다.
10.2 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14의 하이드록시아파타이트에 대한 친화도 확인
하이드록시아파타이트 (HA)는 뼈 조직에서 주요 무기 성분이기 때문에, in vitro에서 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14의 HA-결합 친화도를 확인하는 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 28a, 나타내었고, rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14에 의한 형질도입 효율을 확인하여 도 28b에 나타내었다.
도 28a에 나타낸 바와 같이, HA 펠렛에서 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14의 게놈 카피(GC)는 야생형 rAAV9에 비해 현저히 증가한 반면, 상층액 내의 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14의 게놈 카피(GC)는 감소한 것을 확인하였다. 이는 AAV9.DSS-Nter 및 AAV9.D14-Nter 캡시드는 HA에 대한 결합 친화도가 우수한 것을 확인하였다.
다만, 도 28b에 나타낸 바와 같이, (Asp-Ser-Ser)6 또는 (Asp)14 펩티드 모티프의 캡시드에 대한 이식이 rAAV9의 형질 도입 효율에는 영향을 미치지 않았다.
10.3 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14의 생체 내 분포 확인
캡시드의 뼈-표적화 활성을 in vivo단계에서 확인하기 위해, 실시예 10.1에서 제조한 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14를 2 개월령 마우스에 정맥 주사하고 2 주 후 IVIS 광학 이미지를 사용하여 EGFP 발현에 의해 벡터 생체 분포를 평가 하였으며 이를 도 29a 및 도 29b에 나타내었고, 형광 현미경을 이용하여 EGFP 발현에 의해 벡터 생체 분포를 평가한 결과를 도 29c에 나타내었다.
도 29a,도 29b 및 도 29c에 나타낸 바와 같이, rAAV9.DSS를 주사한 마우스는 야생형 rAAV9를 주사한 마우스에 비해, 간에서 50 % 이하로 EGFP를 적게 발현하였고, 근육에서도 30 % 이하로 적게 발현하였으며, 심장에서도 거의 발현하지 않는 것을 확인하였다. 그러나, rAAV9.D14를 주사한 마우스에서의 EGFP의 생체 분포는 rAAV9를 주사한 마우스의 생체 분포와 유사하였다. 이는 AAV9.D14 캡시드는 생체 내에서 뼈에 대한 특이성이 약하다는 것을 의미한다. 상기 결과는 rAAV9 또는 rAAV9.D14를 주사한 마우스와 비교할 때, rAAV9.DSS를 주사한 마우스의 심장에서 EGFP가 거의 발현되지 않으며, 간 및 근육에서 EGFP의 발현이 현저히 감소한 것으로 측정된 형광 현미경 데이터와 일치하는 것임을 확인하였다. 특히, 대퇴골에서의 발현은 처리 그룹들 사이에서 비교적 유사하였으며, AAV9.D14가 아닌 AAV9.DSS는 비 골격 조직으로의 형질 도입을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 종합하면, AAV9.D14와 달리, AAV9.DSS는 뼈 조직 이 외의 조직에 대한 표적화를 회피함으로써, rAAV9의 뼈 특이성을 개선시키는 것을 확인하였다.
실시예
11.
rAAV9
매개
ctsk
사일런싱의
폐경기 이후 골다공증 모델에 대한 효과
폐경기 이후 골다공증(타입 1) 및 노인성 골다공증(타입 2)은 심각한 뼈 손실 및 뼈 구조의 악화를 초래하여 골절 위험을 증가시킨다. 폐경기 이후 여성의 골 소실은 에스트로겐 감소의 결과로 파골 세포 활성 증가에 의해 발생한다. 일반적으로 월경주기의 일부로 생성되는 에스트로겐은 주로 파골 세포에 대한 네거티브 조절제로 작용하여 파골 세포 매개성 골 흡수를 억제한다. 노인성 골다공증은 일반적으로 남성과 여성 모두 70 세 이후에 발생하며 골 노화와 칼슘 결핍에 의해 발생한다. 골다공증에서 골-표적화 rAAV9 매개 유전자 사일런싱의 효과를 시험하기 위해, AAV9.DSS와 함께 amiR-ctsk를 패키징하여, AAV9.DSS-amiR-ctsk를 제조하였다.
난소 절제 마우스는 에스트로겐 결핍에 의해 유도되는 폐경기 이후 골다공증 모델로 사용된다. 샴 또는 OVX(난소절제) 수술을 3 개월된 암컷 마우스(C57BL/6J)에 수행하였고, AAV9.DSS-amiR-ctsk 200μl (8 X 1011 GC/마우스)를 수술 6주 후 정맥 주사하였다. 주사 7주 후, 마우스를 희생시켜 분석하였으며, 분석 결과를 도 30에 나타내었다.
도 30b에 나타낸 바와 같이, amiR-ctsk를 발현하는 OVX 마우스 대퇴골에서 ctsk mRNA의 발현이 감소한 것을 확인하였다.
도 30c와 도 30d에 나타낸 바와 같이, amiR-Ctrl 발현 OVX 마우스의 대퇴골은 샴 마우스의 대퇴골에 비해 소주골 질량의 현저한 감소를 보여 주었지만, 소주골의 BV/TV, 두께, 수 및 연결 밀도를 측정한 바와 같이, amiR-ctsk를 발현하는 OVX 마우스의 대퇴골에서는 골소실이 억제되는 것을 확인하였다.
도 30e에 나타낸 바와 같이, amiR-ctsk 발현 OVX 마우스의 대퇴골에서 뼈 표면 침식이 감소되는 것을 확인하였고, 전체 뼈 영역 내 파골 세포의 수는 amiR-Ctrl 발현 OVX 마우스와 비교적 비슷한 것을 확인하였다.
도 30f, 도 30g, 도 30h 및 도 30i에 나타낸 바와 같이, OVX 마우스에서 rAAV9.DSS-amiR-ctsk를 주사하면, sphk1 mRNA의 발현이 증가하며, 골 형성률 (BFR), 미네랄 부착 속도 (MAR) 및 골 표면 당 조골 세포 표면(Ob.S/BS)이 증가하는 것을 확인하였다.
도 30j에 나타낸 바와 같이, 생체 역학 분석(biomechanical testing analysis) 결과, rAAV9.DSS-amiR-ctsk를 처리한 경우, 대퇴골의 강도(strength)와 강성(stiffness)이 OVX로 유발된 뼈 손실로부터 상당히 보호되었으며, 이는 골 표적화 rAAV9 매개 ctsk 사일런싱이 임상적으로 개선된 것임을 나타낸다. 이러한 결과는 골 표적 캡시드에 의한 amiR-ctsk의 전신적인 전달에 의해 골 손실을 방지하고, 파골 세포 매개 뼈 흡수를 억제하여, 에스트로겐 결핍 유발 골다공증 발병시 뼈의 물리적 속성을 향상시킬 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 12.
rAAV9 매개
ctsk
사일런싱의 노인성 골다공증 모델에 대한 효과
노인성 골다공증의 마우스 모델에서 rAAV9.DSS-amiR-ctsk의 효과를 확인하였다. rAAV9.DSS-amiR-ctsk 200μl (8 X 1011 GC/마우스)를 18 개월령 수컷 마우스에 정맥 주사하고 2 개월 후, 모델 마우스를 희생시켜 분석하였다.
도 31a에 나타낸 바와 같이, 대퇴골 및 요추에서의 EGFP 발현을 형광 현미경에 의해 관찰한 결과, EGFP 발현 세포는 주로 대퇴골 및 척추의 소주골 표면에 위치하는 것을 확인하였다.
도 31b, 도 31c, 도 31d, 도 31e 및 도 31f에 나타낸 바와 같이, amiR-ctrl을 주사한 마우스와 비교하여, amiR-ctsk를 주사한 마우스는 ctsk mRNA 발현이 감소하였으며, 소주골의 BV/TV, 두께, 수 및 연결 밀도를 측정한 바와 같이, amiR-ctsk를 주사한 마우스의 대퇴골 및 요추에서는 소주골의 골 질량이 상대적으로 증가된 것을 확인하였다. 척추에 비해 대퇴골에서 EGFP가 높게 발현됨에 따라, rAA9.DSS.amiR-ctsk를 주사한 마우스에서 척추에서보다 대퇴골에서 골 축적이 더 높게 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 amiR-ctsk의 골 표적 전달이 노인성 골다공증의 골 손실로부터 뼈를 보호하는데에도 효과적임을 의미한다. 종합적으로, rAAV9.DSS-amiR-ctsk는 폐경 후 골다공증 및 노인성 골다공증 모두에 효과적인 치료제임을 확인하였다.
실시예 13. rAAV9의 국소 적용을 위한 골 대체제 개발
rAAV9 매개 골 질환 치료제를 골절 및 골 결손 부위에 효과적으로 국소 전달 하기 위해 함께 적용할 골 대체제를 개발하였으며, rAAV9 매개 골질환 치료제와 골 대체제가 적용되는 것을 도식화 하여 도 32에 나타내었다.
rAAV9.DSS 또는 rAAV9.D14과 같은 rAAV9 매개 골 질환 치료제를 국소적 투여시 함께 사용하게 되는 골 대체재로 다른 개체에서 획득한 타가골 (allogenous bone)과 합성골의 한 종류인 Hydroxyapatite (HA, Ca10(PO4)6(OH)2)-based scaffold과 granule를 사용하였다. 합성골의 경우, Inroad bone void filler (small and large particles)을 미국 주재 Osteogene Inc에서 구입하였다. 타가골의 경우, 다른 쥐에서 수확한 후 처리 방식에 따라 Fresh frozen과 Dried frozen으로 구분된다. 본 실시예에서는 경우 실험 모델이 될 마우스를 기본으로 하였다.
13.1 Fresh frozen 방법으로 제조한
타가골
(
Murine
allogenous
bone, fresh frozen method, MAF) 제조방법
3개월 된 Wild type의 수컷 또는 암컷 마우스의 대퇴골 간부(femoral shaft)에서 골을 채취하였다. 대퇴골의 세번째 대퇴돌기(third trochanter) 원위 지점에서 원위 방향으로 4mm 길이를 채취하였다. 채취한 골에서 골막(periosteum)을 모두 제거하였다. 70% 에탄올에 약 30분 정도 멸균(sterilization)하고, 원심분리(centrifuge, 12,000rpm, 2min)와 음파처리(sonication, 30min)를 통해 최대한 채취한 골 내부의 세포를 제거하였다. 에탄올을 제거한 뒤 -70°C 냉동고(freezer)에 최소 7일 이상 보관한다. 타가골을 사용할 때에는 Q-water로 에탄올을 충분히 씻어낸 뒤(wash out)에 사용하였다.
13.2 Dried frozen 방법으로 제조한
타가골
(
Murine
allogenous
bone, dried frozen method, MAD) 제조방법
상기 MAF 제조방법과 같은 멸균과 세포 제거 과정을 거친 후 UV 챔버에서 2시간 탈수화(dry-up)하였다. 탈수화 과정이 추가됨으로써 MAD는 MAF와 비교하여 골 내부에 저장 공간은 증가하게 되고, 반면 기계적 강도(mechanical strength)는 떨어진다. 이후 -70°C 냉동고(freezer)에 최소 7일 이상 보관하였다.
실시예
14. 골 대체제에 대한
rAAV9의
부착/친화력 평가 (
AAV
attachment/affinity test)
골 대체제에 대한 rAAV9의 부착/친화력을 평가하기 위한 실험을 실시하였으며, 실험 과정을 도식화하여 도 33에 나타내었다.
14.1 타가골에 대한 rAAV9의 부착/친화력 평가
냉동고(-70°C) 보관 상태인 타가골을 해동한 후 PBS로 3차례 씻어내었다. 30초 동안 원심분리 (centrifuge, 12,000rpm)한 후에 타가골을 250uL-sized microcentrifuge 튜브에 담은 뒤, 30uL의 rAAV9 (control), rAAV9.DSS 또는 rAAV9.D14 용액을 넣었다. 실온에서 1시간 동안 로테이터(rotator) 위에서 배양(incubation)하고, 4°C에 보관하였다. 사용 직전 30초 동안 원심분리 (centrifuge, 12,000rpm)하여 부착되지 않은 rAAV9을 제거하였다. AAV9의 골에 대한 친화력을 평가하기 위해 rAAV9.DSS-egfp와 rAAV9.D14-egfp, 대조군으로 rAAV9-egfp을 사용하였다. 효과적인 AAV9 농도를 확인하기 위해 3 x 1011 genome copy (GC), 3 x 1010 GC, 3 x 109 GC, 3가지 titer를 사용하였다. 또한, 타가골 대체재는 MAF와 MAD를 이용하였다. AAV-부착된 타가골을 AAV lysis buffer (DNase I + Protease K)에서 파쇄(crushing)하고, 배양(incubation)하여 scDNA-egfp를 분리하였다. SYBR® Green PCR Master Mix (Bio-Rad)를 사용하여 CFX connect RT-PCR detection system (Bio-Rad) 상에서 egfp primers에 대한 Quantitative RT-PCR 분석을 제조사 프로토콜에 따라 시행하였으며, PBS를 negative Ct value로 하여 2^(-ddCt) 값을 결과 수치로 사용하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머 서열을 표 5에 나타내었다 그 결과를 도 34에 나타내었다.
EGFP 정방향 프라이머 | AGCAAAGACCCCAACGAGAA |
EGFP 역방향 프라이머 | GGCGGCGGTCACGAA |
도 34에 나타낸 바와 같이, rAAV9.D14가 MAD에 부착효과가 없는 것과는 달리 rAAV9.DSS는 MAF, MAD 모두에서 효과적으로 부착하였고, 특히 3 x 1011 GC titer에서 MAD에 가장 높은 골 친화력을 보였다.
14.2 합성골에 대한 rAAV9의 부착/친화력 평가
Osteogene Inc.에서 구입한 인로드 본 보이드 필러(Inroad bone void filler) 5mm x 2.5mm 실린더 형 HA-scaffold 또는 2mm 구형 HA-granule을 96 웰 플레이트에 담은 뒤 150uL 또는 100ul의 rAAV9 (control), rAAV9.DSS 또는 rAAV9.D14 용액을 넣었다. 실온에서 1시간 동안 로테이터(rotator) 위에서 배양(incubation)한 후 4°C에 보관하였다. 사용 직전 30초 동안 원심분리(centrifuge, 12,000rpm)하여 부착되지 않은 rAAV9을 제거하였다. 효과적인 rAAV9 농도를 확인하기 위해 2 x 1011 GC, 2 x 1010 GC, 2가지 titer를 사용하였다. 타가골과 같은 방법으로 scDNA-egfp를 분리한 후 egfp primers에 대한 Quantitative RT-PCR 분석을 시행하였다. PBS를 negative Ct value로 하여 2^(-ddCt) 값을 결과 수치로 사용하여 측정하였으며, 측정결과를 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타낸 바와 같이, 타가골과 달리, rAAV9.DSS와 rAAV9.D14가 모두 2 x 1011 GC titer에서 HA-scaffold, HA-granule에 높은 부착효과를 나타내는 것을 확인하였다. 특히, HA-granule의 경우, rAAV9.DSS보다 rAAV9.D14이 높은 부착효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 15. 골 대체재에 부착된 rAAV9에 의한 형질도입 확인
15.1 HA-scaffold에
부착된 rAAV9에 의한 형질도입 확인
골 대체재에 부착된 rAAV9가 조골세포에 형질도입이 되는지를 확인하기 위해 마우스 COB를 rAAV9가 부착된 합성골에 배양하였다. rAAV9에 부착된 합성골을 만들기 위해, 2 x 1011 GC titer의 rAAV9 (control), rAAV9.DSS와 rAAV9.D14를 HA-scaffold에 1시간 동안 배양하고, 30초간 원심분리 (centrifuge, 12,000rpm)하였다. 조골세포는 생후 5일 된 야생형 마우스 (C57BL/6J)의 칼바리아에서 collagenase type II (50mg/ml, Worthington, LS004176)과 dispase II (100mg/ml, Roche, 10165859001)를 사용하여 COB를 분리한 뒤 α-MEM medium (Gibco, 10% FBS(Gibco), 2mM L-glutamine (Coring), 1% penicillin/streptomycin (Coring), and 1% nonessential amino acids (Coring))에 배양한 후에 액체 질소에서 냉동 보관하였다. 실험하기 2일전에 COB를 녹여 10cm petri-dish에서 배양한 후에, 실험날에 배지를 제거하고, 0.25% 트립신 2mL를 넣고 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 2분간 배양하여 COB를 분리시켰다. 배지(10mL)와 함께 Centrifuge 튜브에 넣고 5분 동안 원심분리 (1500rpm, 4℃)하였다. 상층액을 버리고 다시 배지(10mL)를 넣어 세포 수를 확인하였다. HA-scaffold를 넣은 48 웰 플레이트에 1 x 106 cell/ml와 1uL of Xtreme gene 9 DNA 트랜스펙턴트 시약(transfectant reagent, Roche)를 넣은 후 37℃ 세포 배양 인큐베이터에서 2~3일 동안 배양하였다. 그 후, HA-scaffold를 파쇄(crushing)하고 QIAzol(QIAGEN)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. cDNA는 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)를 사용하여 합성하였다. Quantitative RT-PCR 분석을 통해 조골세포에 형질도입된 egfp
RNA을 측정하였다. 다음으로, 세포 용해물에서 EGFP의 발현을 면역 블롯팅을 이용하여 확인하였다. 면역 블롯팅은 TNT 용해 완충제 (50mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 50mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, and protease inhibitor cocktail (Sigma))를 사용하여 COB를 용해하고, 세포 용해물의 단백질 양을 DC 단백질 분석 (Bio-Rad)으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질을 4-12% SDS-PAGE 겔에 전기영동한 후에, Immunobilon-P membranes (Millipore)으로 옮기고, 항-GFP 항체 (JL-8, 632381, Takara, 1:1000)를 사용하여 면역블롯팅을 시행하였다. 로딩 대조군으로 항-HSP90 항체(675402, Biolegend, 1:1000)를 사용하여 면역 블롯팅을 시행하였다. 마지막으로, 배지를 제거하고 PBS에 담은 후 Evos epifluorescence 현미경(ThermoScientific)을 이용하여 COB에 DSS.rAAV9의 형질도입 정도를 EGFP 발현을 통해 확인하였다. Quantitative RT-PCR 분석 결과를 도 36a에 나타내었으며, 면역 블롯팅 결과를 도 36b에 나타내었고, Evos epifluorescence 현미경 관찰 결과를 도 36c에 나타내었다.
도 36에 나타낸 바와 같이, COB에서 DSS.rAAV9가 rAAV9과 D14.rAAV9에 비해 높은 egfp mRNA와 protein 발현을 보였으며, HA-scaffold 표면에 붙어 있는 COB가 DSS.rAAV9이 형질도입되어 EGFP 단백질을 발현함을 검증하였다.
15.2 HA-granule에
부착된 rAAV9에 의한 형질도입 확인
rAAV9에 부착된 HA-granule에 대한 COB의 형질도입을 알아 보기 위해서, 48 well plate에 넣은 2 x 1011 GC of DSS.rAAV9가 처리된 HA-granule을 1 x 106 cell과 1uL of Xtreme gene 9 DNA transfectant reagent (Roche)과 섞은 후에 37℃ Cell culture incubator에서 2~3일 동안 배양했다. Quantitative RT-PCR 분석을 통해 조골세포에 형질도입된 egfp mRNA을 측정하였으며, 그 결과를 도 37에 나타내었다.
도 37에 나타낸 바와 같이, COB에서 DSS.rAAV9가 rAAV9에 비해 높은 EGFP mRNA 발현을 보였다. 또한, medium을 제거하고 PBS에 담은 후 Evos epifluorescence microscope을 이용하여 HA-granule표면에 붙어 있는 COB의 EGFP 단백질 발현을 확인하여, DSS.rAAV9의 COB 형질도입을 확인하였다.
따라서, DSS를 삽입하지 않은 rAAV9 보다 DSS.rAAV9이 골 대체제 부착 및 친화력이 높으면서 조골세포 형질도입이 우월한 것을 확인하였다.
실시예
16. DSS.
rAAV9.amiR
-
shn3
와
DSS.
rAAV9.amiR
-
SOST
의
골 결손 마우스 모델에 대한 골 형성능 평가
마우스 모델의 대퇴골 골 결손 (mouse model of femoral bone defect)은 손상된 골에서 DSS.rAAV9.amiR-shn3와 DSS.rAAV9.amiR-SOST AAV 매개 유전자 치료제의 골형성 능력을 평가하기 위해 실시하였다. 생후 3개월 마우스를 대상으로 4 x 1011 GC of DSS.rAAV9 (control), DSS.rAAV9.amiR-shn3 또는 DSS.rAAV9.amiR-SOST을 정맥주사로 투여하고, 2주 후에 전신 호흡 마취 (Isoflurane, 1~4%) 하에 수술을 진행하였다. 통증은 수술 1시간 전에 Buprenorphine (0.03 mg/kg)을 피하 주사하여 조절하였다. 수술 대상을 측와위(lateral decubitus) 위치시키고 소독 및 수술 포로 부위의 멸균 환경을 유지하였다. 좌측 대퇴부의 외측부에 1.0cm 크기의 피부 절개를 가하고, 외측 광근(Vastus lateralis)의 외측으로 접근하여 대퇴골을 노출시켰다. 후방의 대퇴신경을 보호하며 1mm-사이즈의 전동 연마기(motorized burr) 이용하여 길이 4 mm, 너비 1 mm, 깊이 0.5 mm의 골 결손을 만들었다. 수술 후 3주에 쥐를 안락사하여 대퇴골을 분리한 후 microCT35 (Scanco Medical Inc)를 이용하여, 11mm-spatial resolution 조건에서 골 형성 능력을 분석하였다. 골 결손 부위를 기준으로 Inveon multimodality 3D visualization program (Siemens Medical Solutions USA, Inc)을 이용하여 시상면 이미지를 재구성하였다. 골 피질에서 관심 영역(ROI)을 수술 시 생성된 골 결손 크기로 설정하고 새로 형성된 골 피질의 크기 비율을 분석하였다. 추가적으로 결손 부위의 골밀도 (bone density)를 microCT35를 이용하여 분석하였다. 조직학적 분석(histological analysis)을 위해 대퇴골을 근육을 포함하여 채취한 뒤 10% 중성 완충 포르말린 에 2일간 고정(fixation)하고, 5% tetrasodium EDTA에 2~4주 동안 탈석회화 (decalcification)하였다. 에탄올로 탈수화 (dehydration) 후 xylene으로 2회 세척(clearing)한 뒤 파라핀에 포매(embedding)한다. 관상면으로 6 mm 두께로 절단(section)하였다. H&E (Hematoxylin and Eosin) 염색을 통하여 골 생성 부위의 조직학적 소견을 확인하였다. 조직계측학적 분석 (Histomorphometric analysis)를 위해 톨루이딘 블루 (Toluidine blue) 염색과 TRAP (Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 시행하고 각각 조골세포와 파골세포의 골표면당 표면 비율을 분석 (Oblast surface/Bone surface, Osteoclast surface/ bone surface)하여 비교하였다. 마우스 모델에 수술을 통해 유도한 골 결손 부위를 도 38에 나타내었다.
실시예
17.
DSS.
rAAV9.amiR
-
shn3
와
DSS.
rAAV9.amiR
-
SOST
의
조골세포 골 형성 향상을 통한 골유합 평가
DSS.rAAV9. amiR-shn3와 DSS.rAAV9. amiR-SOST에 의한 골형성 향상이 골절 치유에 미치는 영향을 확인하기 위해 마우스에 대퇴골 골절 수술을 시행하였다. 생후 3~4개월 마우스를 대상으로 4 x 1011 GC of DSS.rAAV9 (control), DSS.rAAV9.amiR-shn3 또는 DSS.rAAV9.amiR-SOST을 정맥주사로 투여하고, 2주 후에 전신 호흡 마취 (Isoflurane, 1~4%) 하에 수술을 진행하였다. 통증은 수술 1시간 전에 Buprenorphine (0.03mg/kg)을 피하 주사하여 조절하였다. 수술 대상을 측와위(lateral decubitus) 위치시키고 소독 및 수술 포로 술부의 멸균 환경을 유지하였다. 좌측 대퇴부의 외측부에 1.5 cm 크기의 피부 절개를 가하고, 외측 광근(Vastus lateralis)의 외측으로 접근하여 대퇴골을 노출시켰다. 후방부의 대퇴 신경의 손상에 주의하며 대퇴골 간부의 1/2지점을 surgical saw를 이용하여 절제하였다. 23~25G 니들을 원위 대퇴골의 슬개골 고랑에서 시작하여 대퇴골의 대전자부 (greater trochanter) 첨부까지 관통하여 골수정 내 고정 (intramedullary fixation)하였다. 니들의 양쪽 끝은 구부린 후 1mm를 남기고 와이어 커터로 절제하였다. 바이크릴 4/0 봉합사를 이용하여 근막을 봉합하고, 나일론 4/0 봉합사를 이용하여 피부를 봉합하였다.
Faxitron MX-20 cabinet X-ray systems을 이용하여 일반 방사선 사진 (radiography)을 수술 직후와 수술 후 2주, 4주, 6주에 측면 촬영으로 진행하였다. 수술 후 6주에 마우스를 안락사하여 고정된 니들을 제거한 뒤 대퇴부를 채취하고, microCT와 조직학적 평가를 진행하였다. X-ray과 microCT 분석을 통하여 골 유합 여부를 확인하였다. microCT 추가 분석을 통하여 가골 (callus bone)의 총량 (total volume)과 골밀도 (bone density)를 평가하였다. Histology 분석을 위해 대퇴골과 근육을 포함하여 채취한 뒤 10% neutral buffered formalin에 2일간 고정(fixation)하고, 5% tetrasodium EDTA에 2~4주 동안 탈석회화 (decalcification)하였다. 에탄올로 탈수화 (dehydration) 후 자일렌으로 2회 세척(clearing)한 뒤 파라핀에 포매(embedding)하였다. 관상면으로 6mm 두께로 절단 (section)하였다. H&E 염색을 통하여 골 유합 부위의 조직학적 소견을 확인하였다. 조직계측학적 분석 (Histomorphometric analysis)를 위해 톨루이딘 블루 염색과 TRAP 염색을 시행하고 각각 조골세포와 파골세포의 골표면당 표면 비율을 분석 (Oblast surface/Bone surface, Osteoclast surface/ bone surface)하여 비교하였다. 마우스 대퇴골 골절 수술 직후, 2주 후, 6주 후 X-ray 사진을 도 39에 나타내었다.
도 39에 나타낸 바와 같이, 수술 2주 후, 골절 부위 주위로 가골(callus)가 형성된 것을 확인하였으며, 수술 6주 후, 골절 부위가 모두 유합된 것을 확인하였다.
실시예
18. DSS.
rAAV9.amiR
-
shn3
와
DSS.
rAAV9.amiR
-
SOST
가
부착된
골대체제의
조골세포 골형성 향상을 통한 골유합 평가
임계 크기 골 결손 마우스 모델 (mouse model of critical-sized bone defect)은 임상적으로 불유합 (nonunion) 결손에 해당하며, rAAV9.DSS를 부착한 골대체재의 국소 투여에 의한 효과를 확인하기 위해, 상기 모델을 사용하였다. 생후 3개월 된 마우스를 전신 호흡 마취 (Isoflurane, 1~4%) 하에 수술을 진행하였다. 통증은 수술 1시간 전에 Buprenorphine (0.03 mg/kg)을 피하 주사하여 조절하였다. 수술 대상을 측와위(lateral decubitus) 위치시키고 소독 및 수술 포로 부위의 멸균 환경을 유지한다. 좌측 대퇴부의 외측부에 2 cm 크기의 피부 절개를 가하고, 외측 광근(Vastus lateralis)의 외측으로 접근하여 대퇴골을 노출시켰다. 대퇴골의 세번째 대퇴 돌기(Third trochanter)의 원위부 기준으로 근위 1 mm와 원위 3 mm (총 4 mm)에 수술용 펜으로 표시 (marking)한 뒤 수술용 전기 톱(surgical electrical saw)을 이용하여 절단하였다. 원위 측 골수에 23G (1 inch) 니들을 삽입하여 대퇴골 원위부로 관통시켰다. 23G 척추 니들(3.5 inch)의 가이드 핀을 23G 숏 니들에 따라 삽입하였다. 23G 척추 니들을 가이드 핀을 따라 역 방향(retrograde)으로 23G 숏 니들과 반대 방향으로 삽입하였다. 대퇴골 원위 절단부를 통과한 뒤, DSS.rAAV9.amiR-shn3 또는 DSS.rAAV9.amiR-SOST이 부착된 타가골을 이어서 관통하고 끝으로 대퇴골 근위 절단부를 통과시켰다. 니들의 양쪽 끝은 구부린 후 1 mm를 남기고 와이어 커터로 절제하였다. 바이크릴 4/0 봉합사를 이용하여 근막을 봉합하고, 나일론 4/0 봉합사를 이용하여 피부를 봉합하였다.
X-ray을 이용하여 살아있는 마우스에서 수술 직후와 수술 후 4주, 8주, 12주에 측면 촬영으로 진행하였다. 수술 후 12주에 마우스를 안락사 하여 대퇴부를 채취하여 고정된 니들을 제거하고, microCT와 조직학적 분석을 하였다. 일반 방사선 사진과 microCT 분석을 통하여 DSS.rAAV9 (control), DSS.rAAV9.amiR-shn3 또는 DSS.rAAV9.amiR-SOST이 부착된 양쪽 끝의 골유합 여부를 확인하였다. microCT 추가 분석을 통하여 가골 (callus bone)의 총량 (total volume)과 골밀도 (bone density)를 평가하였다. 조직학적 분석을 위해 대퇴골과 근육을 포함하여 채취한 뒤 10% 중성 완충 포르말린에 2일간 고정(fixation)하고, 5% tetrasodium EDTA에 2~4주 동안 탈석회화(decalcification)하였다. 에탄올로 탈수화 (dehydration) 후 자일렌으로 2회 세척(clearing)한 뒤 파라핀에 포매(embedding)하였다. 시상면으로 6 mm 두께로 절단(section)하였다. H&E 염색을 통하여 골 유합 부위의 조직학적 소견을 확인하였다. 조직계측학적 분석 (Histomorphometric analysis)를 위해 톨루이딘 블루 염색과 TRAP 염색을 시행하고 각각 조골세포와 파골세포의 골표면당 표면 비율을 분석 (Oblast surface/Bone surface, Osteoclast surface/bone surface)하여 비교하였다. 임계 크기 골 결손 마우스 모델 (mouse model of critical-sized bone defect)을 도 40에 나타내었다.
실시예 19. 양(sheep) 모델을 대상으로 한 DSS. rAAV9.amiR - shn3 와 DSS.rAAV9.amiR- SOST 가 부착된 골대체제의 조골세포 골형성 향상을 통한 골유합 평가
전임상 단계의 마우스 모델은 사이즈가 작아서 골절의 고정시에 안정적인 고정이 불가능하였기 때문에 니들을 이용한 골수정내 고정을 통해 상대적 고정 (relative fixation)을 시행하였다. 이는 실제 임상에서 사용되는 수술적 기술과 큰 차이가 있으며, 골 치유에 대한 DSS.rAAV9.amiR-shn3와 DSS.rAAV9.amiR-SOST의 정확한 효과를 확인하기 위해서는 안정적 고정 수술이 가능한 큰 동물 모델이 필요하다. 또한, 마우스에는 neutralizing antibody against rAAV9가 없기 때문에 rAAV9 항체가 존재하면서 인간과 비슷한 크기의 양(sheep) 모델이 유전자 치료제 전임상 단계 모델로 선호된다. 양의 대퇴골 간부에서 얻어진 타가골 또는 같은 사이즈의 합성골에 DSS.rAAV9 (control), DSS.rAAV9.amiR-shn3 또는 DSS.rAAV9.amiR-SOST을 부착하였다. 임계 크기 골 결손을 대퇴골에 만든 후 준비된 타가골 혹은 합성골을 골 결손 부위에 충전한 뒤, 잠김나사 금속판 (locking plate)을 이용하여 대퇴골과 이식된 대체골을 고정하였다. X-ray와 peripheral quantitative computed tomography (pQCT)를 이용하여 살아있는 양에서 수술 직후와 수술 후 4주, 8주, 12주에 골유합을 분석하였다. 수술 후 16주 후에 안락사 시키고 X-ray, microCT, histology 분석을 통해 골대체제에서의 조골세포에 의한 골형성과 골유합을 분석하였다.
실시예 20. WNT 신호전달을 제어하는 골 표적화 AAV 유전자 사일런서의 개발
분비된 단백질 SOST인 WNT 길항제는 골다공증을 앓는 환자에서 치료적 중재를 위한 새로운 표적으로서 인식되어 왔다. 유사하게, 세포 내 어댑터 단백질 SHN3은 OB에서 WNT 신호전달을 억제한다. SHN3 또는 SOST를 억제하면 WNT/β-카테닌 신호전달이 향상되고, OB 기능이 증가하며, 골 형성이 촉진되다. 그러나, 이러한 골 동화 활성은 시간이 지남에 따라 쇠퇴하며, 이는 SHN3 및 SOST 경로의 음성 피드백 루프를 시사한 것이다. 따라서, 본 발명자의 데이터에 따르면 이들 유전자의 발현이 골 리모델링 또는 재생 활성에 반응하여 동역학적으로 변경되는 것으로 나타났다.
도 41A에서 알 수 있는 바와 같이, 22월령 마우스에서 노화된 골은 2월령 마우스의 미성숙 골에 비해 Shn3 및 Sost 전사체 수준의 증가를 나타냈다. 마찬가지로, Shn3 및 Sost 발현은 골 골절 치유의 말기 단계(21일째 날)에 현저하게 상향 조절되는 반면, 초기 단계(7일째 날)에서는 어떠한 발현의 변화도 관찰되지 않았다(도 41B 및 도 41C). 초기 단계는 염증성 및 연질 캘러스 단계를 포함하며, 경질 캘러스 형성 및 골 리모델링은 말기 단계에 발생한다. 이들 결과는 골 골절 치유 동안의 골 재생뿐만 아니라 노화에 따른 골 리모델링에서의 WNT 길항제인 SHN3 및 SOST의 잠재적인 관여를 암시한다. 흥미롭게도, Sost의 mRNA 수준은 대조군 벡터를 갖는 AAV9(AAV9.amiR
-
ctrl, 도 41D)와 비교하여 shn3 사일런서(AAV9.amiR-shn3)를 갖는 AAV9로 처리되는 경우에 장골에서 실질적으로 증가하였다. 이러한 효과는 또한 OB-계통 세포(Shn3
prx1 , 도 41E)에서 SHN3이 결여된 마우스에서 나타났다. 그러나, Shn3 발현은 Sost 발현의 AAV9-매개 사일런싱에 의해 영향을 받지 않았다(도 41F). SHN3이 또한 OB에서 SOST 발현을 상향 조절하는 골 형성 단백질(BMP) 신호전달 억제제로서 기능을 하기 때문에 이들 결과는 SOST의 BMP-유도 발현을 향상시킴으로써 OB에서 WNT 신호전달을 제한하는 음성 피드백 기작을 시사한다.
이들 인자 둘 모두의 동시 억제에 의해 WNT 신호전달 및 골 증가가 추가로 증가한다는 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 Shn3 및 Sost를 표적화하는 2중 사일런서를 갖는 골 표적화 AAV9 벡터를 조작하였다(도 41G). 본 발명자의 이전 연구에 따르면 rAAV9는 골 내층 세포, 골내막 OB 및 골세포를 비롯한 OB-계통 세포의 형질 도입에 매우 효과적인 혈청형인 것으로 확인되었다. AAV9 캡시드의 골-특이적 굴성은 골-귀소 펩티드 모티프(AspSerSer)6을 AAV9-VP2 캡시드 단백질(AAV9.DSS-Nter) 상에 이식함으로써 추가로 개선되었다. 높은 수준의 AAV-전달된 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)가 RNA 간섭 기구를 방해함으로써 세포 독성을 유도하거나, 유의한 비표적 사일런싱(off-target silencing)을 나타나다는 것을 고려하면, 본 발명자들은 마우스 miR-33 유래 miRNA 스캐폴드(인공 miRNA, amiR)를 이용하여 소형 사일런싱 RNA의 가이드 가닥을 포매하였으며, 이는 통상적인 shRNA 구조체와 비교하여 비표적 사일런싱을 10배 감소시키면서 벡터 유전체 온전성을 증가시키고, shRNA-관련 독성을 제한하며, 효율적인 유전자 녹다운(gene knockdown)을 가능케 하였다. 먼저, 본 발명자들은 2개의 마우스 Sost 표적화 서열(amiR
-
sost1, amiR
-
sost2) 또는 대조군(amiR-ctrl)을 함유하는 amiR 카세트를 제작하였다. 이러한 설계에서, amiR은 CB 프로모터와 egfp 수용체 유전자 사이에 인트론성으로 삽입되었으며(도 42A), 이는 양으로 형질 도입된 조직에 대한 시각적 추적을 가능케 하며, 이어서 amiR 카세트는 AAV9.DSS-Nter 캡시드 내에 패지킹되었다. 예상된 바와 같이, GFP 단백질은 AAV9.DSS.egfp의 정맥 내(i.v.) 주사 후 2개월에 피질 골에 포매된 골세포에서 높게 발현되었다(도 42B). 2월령 야생형 마우스에 정맥 주사하는 경우, amiR-ctrl-처리 마우스와 비교하여 amiR-sost1 또는 amiR-sost2를 갖는 rAAV9로 처리하면 경골에서 Sost
mRNA 수준이 각각 약 25% 또는 약 55% 감소하였다(도 42C). 이는, 조직 부피 대비 보다 높은 지주골 부피(Tra. BV/TV), 개수(Tra. N) 및 두께(Tra. Th)(도 S1D)로 나타나 있는 바와 같이, AAV-처리 대퇴골의 지주 골량의 증가에 상응한다(도 42D). 이하, 도 41에서 amiR
-
sost
-2는 amiR-sost로서 지칭된다. 동일한 miRNA 또는 shRNA를 병치하면 종종 헝클어진 구조의 형성으로 인해 AAV 벡터 유전체에서 불완전한 전사가 야기되는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 마우스 Shn3 표적화 서열을 마우스 miR-33 유래 miRNA 스캐폴드(amR)에서 유래하는 스텝-루프 부위 내의 5개의 상이한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 인간 miR-33 유래 miRNA 스캐폴드(hs-amR) 내에 클로닝하였다(도 41H). 면역 블로팅 분석에 따르면 hs-
amiR
-
shn3의 과발현은 HEK293 세포에서 Flag-태깅된 SHN3 단백질의 녹다운용으로 효과적인 것으로 증명되었다(도 43A). 2월령 야생형 마우스에 정맥 내 주사하는 경우, Shn3 mRNA 수준의 약 40% 감소가 amiR
-
shn3 또는 hs-
amiR
-
shn3을 갖는 AAV9.DSS로 처리된 경골에서 관찰되었으며(도 41I), AAV-처리 대퇴골의 지주 골량의 상응하는 증가가 동반되었다(도 41J). 이들 결과에 따르면 AAV9.DSS.hs-
amiR
-
shn3은 Shn3 발현을 사일런싱하고 골 증가를 증가시키는데 있어서 AAV9.DSS.amiR
-
shn3만큼 강력한 것으로 증명되었다. 최종적으로, SHN3 및 SOST를 표적화하는 2중 사일런서를 갖는 AAV 벡터 유전체(amiR
-
sost
/
shn3)는 egfp 수용체를 amiR
-
sost를 암호화하는 AAV 벡터 유전체 내의 hs-
amiR
-
shn3으로 교체함으로써 생성되었다(AAV9.DSS.amiR
-
sost
/
shn3, 도 41G).
시험관 내에서 WNT/β-카테닌 신호전달에 미치는 AAV9.DSS.amiR
-
sost
/
shn3의 시너지 효과를 시험하기 위해, Ocy454 골세포 세포주는 Shn3 또는 Sost를 표적화하는 단일 또는 2중 사일런서를 갖는 AAV 벡터로 형질 도입하였다. AAV의 사일런싱 효능은 면역 블로팅(도 41K) 및 정량적 PCR 분석(도 43B)을 이용하여 SOST-발현 Ocy454 세포주 및 SHN3-과발현 C3H10T1/2 MSC-유사 세포주에서 검사하였으며, 이는 SOST 또는 SHN3의 단백질 및 mRNA 수준이 amiR
-
sost
/
shn3의 AAV-매개 발현 이후에 실질적으로 감소하였다는 것을 증명한 것이다. Shn3 또는 Sost 발현의 단일 녹다운으로 인해 Wnt3a-처리 Ocy454 세포에서 β-카테닌-반응성 루시페라아제 활성(탑-플래시(Top-flash) Luc)의 약한 증가가 초래하였지만, 루시페라아제 활성은 Shn3 및 Sost의 발현이 둘 모두에서 사일런싱되는 경우에 현저하게 증가하였다(도 41L). 유사하게, β-카테닌 표적 유전자인 Axin2 및 Lef1의 발현은 amiR
-
sost 또는 amiR
-shn3을 발현하는 Ocy454 세포에서 약간 증가하였으며, 이 발현은 amiR
-
sost
/
shn3의 존재 하에 추가로 상향 조절되었다(도 41M). 따라서, Shn3 및/또는 Sost 사일런서를 갖는 골 표적화 AAV 벡터는WNT/β-카테닌 신호전달의 미세 조정자로서 기능을 할 가능성이 있다.
실시예
21.
WNT
-조절
AAV
유전자
사일런서의
마우스에서 시너지성 골 형성 촉진
생체 내에서 골 동화 활성을 향상시키는 WNT-조절 유전자 사일런서의 능력을 검사하기 위해, 단일 투여량의 AAV 벡터를 3월령 마우스에 정맥 내 주사하고, 4주 후에 정량적 PCR 분석에 의해 녹다운 효율 및 WNT 신호전달을 평가하였다.
amiR - sost / shn3-발현 경골이 Shn3의 약 60% 녹다운 및 Sost 발현의 약 40% 녹다운을 나타냈지만, Shn3 또는 Sost mRNA 수준에서의 유사한 감소가 또한 단일 녹다운이 나타난 경골에서 관찰되었다(도 44A). AAV-처리 Ocy454 세포에서 알 수 있는 바와 같이, Shn3 또는 Sost를 표적화하는 단일 사일런서를 이용한 처리에 의해 약한 유도와 비교하여 amiR
-
sost
/
shn3-발현 경골에서는 Axin2 및 Lef1의 시너지성 유도는 관찰되었다(도 44B). 이는 AAV-처리 대퇴골의 지주 골량 및 피질 골 두께의 증가에 상응하는 것이다(도 44C 및 도 44D). 이들 결과는 골격에서의 Shn3 및/또는 Sost 발현의 AAV-매개 사일런싱이 생체 내에서 WNT/β-카테닌 신호전달 및 골 증가를 향상시키는데 효과적임을 시사한다.
실시예
22.
WNT
-조절
AAV
유전자
사일런서의
골다공증에서 골 소실 반전
폐경 후 및 노인성 골다공증은 골 소실 및 골 구조의 저하를 초래하여, 골절 위험성을 증가시킨다. 폐경 후 여성에서의 골 소실은 에스트로겐 감쇠(estrogen withdrawal)의 결과로서 파골세포 활성 향상에 의해 야기된다. 월경 주기의 일부로서 정상적으로 생성되는 에스트로겐은 주로 음성 조절자로서 파골세포에 작용하여, 파골세포-매개 골 재흡수를 예방한다. 반면, 노인성 골다공증은 전형적으로 남성 및 여성 둘 모두의 경우에 70세 이후에 발병하며, 이는 골 노쇠 및 칼슘 결핍의 결과이다. 난소 적출(OVX)된 마우스를 이용하여 폐경 후 골다공증에서 본 발명자의 NT-조절 유전자 사일런서의 치료 효과를 시험하였다. 3월령 암컷 마우스에 대해 모의 대조군 또는 OVX 수술을 실시하였으며, amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3, amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3을 갖는 AAV9.DSS를 단일 투여량으로 수술 후 6주째에 정맥 내 주사하였다(도 45A). 주사 후 8주째에, Shn3 및/또는 Sost
mRNA의 감수된 수준을 AAV-처리 OVX 경골에서 입증하였다(도 45B). amiR
-
ctrl-발현 OVX 마우스가 모의 마우스 대비 지주 골량에서 유의한 감소를 나타냈지만, 이러한 골 소실은 각각 Sost 및 Shn3 발현의 단일 녹다운에 의해 부분적으로 및 거의 완전히 반전되었다. AAV9.DSS.amiR-sost/shn3으로 처리하는 경우, OVX 대퇴골에서의 지주 골량은 추가로 증가하였으며, 심지어 모의 대퇴에서보다 높았으며, 이는 보다 높은 지주골 BV/TV 및 결합 밀도로 나타나 있다(도 45C 및 도 45D). 이들 결과에 따르면 Shn3 발현의 단일 녹다운은 Sost 녹다운보다 에스트로겐 결핍-유도 골 소실을 반전시키는데 더 효과적이며, 이러한 효과는 Shn3 및 Sost 발현의 2중 녹다운에 의해 추가로 향상되는 것으로 나타났다. 마찬가지로, OVX 마우스에서 rAAV9.DSS-amiR
-
shn3을 이용한 처리는 골 형성율(BFR) 및 무기질 침착율(MAR)을 향상시키는 반면, amiR
-sost-발현 OVX 마우스에서는 BFR만이 약간 증가하였다(도 45E 및 도 45F). 놀랍게도, amiR
-
sost
/
shn3-발현 OVX 대퇴골에서는 BFR 및 MAR의 증가가 거의 관찰되지 않았다(도 45E 및 도 45F). 지주골 두께에서의 실질적인 증가(도 46A)와 동반하여, 이들 결과는 처리 후 4주에 걸쳐 OB-매개 골 형성이 쇠퇴한 이후에 OC-매개 골 재흡수의 감소는 amiR
-
sost-발현 OVX 마우스에서 골 증가에 관여할 수 있다는 것을 시사한다.
이어, 본 발명자들은 노인성 골다공증의 마우스 모델에서 본 발명자의 AAV 벡터의 치료 효과를 시험하였다. 20월령 수컷 마우스에는 amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3, amiR-sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3을 갖는 단일 투여량의 AAV9.DSS를 정맥 내 주사하였으며, 2개월 후에 AAV-처리 경골에서 Shn3 및/또는 Sost mRNA의 감소된 수준을 입증하였다(도 45G). OVX 마우스와는 달리, miR
-
shn3-발현 및 amiR
-
sost-발현 대퇴골 둘 모두는 amiR
-
ctrl-발현 대퇴골과 비교하여 지주 골량에서의 유의한 증가를 나타냈다. 골 증가는 amiR
-
sost
/
shn3-발현 대퇴골에서 추가로 증가하였으며, 이는 보다 높은 지주골 BV/TV, 개수 및 두께에 의해 증명된 것이다(도 45H 및 도 45I). 특히, AAV-처리 요추에서의 지주 골량의 유사한 증가가 또한 관찰되었다(도 45J). 따라서, 이들 결과에 따르면 폐경 후 골다공증에서 알 수 있는 바와 같이 Shn3 및 Sost 발현의 2중 녹다운은 Shn3 및 Sost 발현의 단일 녹다운보다 노인성 골다공증에서의 골 소실을 반전시키는데 보다 효과적인 것으로 증명된다. 종합하면, 골 표적화 AAV 벡터를 이용하는 WNT-조절 유전자 사일런서는 폐경 후 골다공증 및 노인성 골다공증 둘 모두에 대한 유망한 치료제일 수 있다.
실시예
23.
WNT
-조절
AAV
유전자
사일런서는
단피질
골 결함(
uni
-cortical bone defect)에서 골 재생 촉진
PTH 및 항-스클레로스틴 항체와 같은 동화제가 골 재생을 향상시킬 수 있고, 골 치유 과정에서 초기에 캘러스 부피를 증가시킬 수 있다는 증거가 존재한다. WNT-조절 AAV 유전자 사일런서에 의한 초기 치유 과정에서의 골 재생 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 2월령 마우스의 대퇴골에 대해 단피질 골 결함 수술을 실시하였다. 이러한 수술은 골 상처 부위에서의 기계적 불안정성을 제거하도록 설계되었는데, 이는 캘러스 부피를 측정하는 주요 인자이다. amiR
-
ctrl, amiR
-
shn3, amiR-sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3을 갖는 단일 투여량의 AAV9.DSS를 수술 2주 전에 주사하였다(도 47A). 본 발명자들은 1 ㎜ 크기의 전동 연마기(motorized burr)를 이용하여 대퇴골의 골간 상에 3 ㎜ 길이의 단피질 결함을 형성하여, 기타 피질 골을 동일한 골 결함 수준으로 보존하였다(도 47B). 수술 2주 후에 마우스를 안락사 시키고, 평가하였다. 골 동결절편(bone cryosection)의 형광 현미경검사에 의해 골 결함 주변에서 egfp 발현을 검출하였으며, 이는 유전자 사일런서가 결함 병소에서 골 재생에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다(도 47C). Shn3 및/또는 Sost의 전사체 감소는 AAV 유전자 사일런서에 의해 형질 도입된 경공에서 입증되었다(도 47D). 본 발명자들이 골 결함 내에서 새로운 골 형성 부피를 측정하는 경우, amiR
-ctrl에 비해 유의하게 높은 골 부피가 rAAV9.DSS
-
amiR
-
shn3, amiR
-
sost 또는 amiR
-sost/shn3으로 처리된 대퇴골에서 관찰되었다(도 47E). 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에 의한 조직학적 절편에 따르면 골 결함 영역이 망상골로 채워지는 것으로 나타났으며, 이는 대조군(amiR
-
ctrl)에서보다 amiR
-
shn3, amiR
-
sost 또는 amiR
-sost/shn3 발현 대퇴골에서 보다 큰 면적을 나타냈다(도 47F). 조직형태학적 분석에 따르면 유전자 사일런서-처리 마우스에서의 골 형성 증가는 골아세포 개수의 증가에 기인하는 반면, 파골세포 개수의 감소는 또한 rAAV9.DSS
-
amiR
-
sost
/
shn3
처리 측면에서 기여할 수 있는 것으로 확인되었다(도 47G 및 도 47H). 이들 결과에 따르면 골 표적화 AAV 벡터를 이용하는 WNT-조절 유전자 사일런서는 골 치유 과정에서 초기에 골아세포-매개 골 재생을 촉진할 수 있으며, 이는 rAAV9.DSS
-
amiR
-sost/shn3의 처리 시에 항-재흡수 효과에 의해 용이하게 되는 것으로 증명되었다.
실시예
24.
WNT
-조절
AAV
유전자
사일런서의
골 골절 치유 촉진
골 리모델링, 즉 골 형성 골아세포와 골 재흡수 파골세포 사이의 일련의 작용에 의해 조절되는 연속적인 골 치환은 골 골절 유합을 달성하고 생체 역학적 특성을 회복하는데 필요하다. 본 발명자들은 WNT-조절 AAV 유전자 사일런서가 골 치유에서 초기에 골 재생을 향상시킨다는 것을 확인하였다. 그러나, 골절 치유에서 항-스클레로스틴 항체를 이용한 WNT 조절에 관한 몇몇 연구에 따르면 WNT 조절이 골 리모델링에 악영향을 미치며, 골 골절 유합을 방해하는 것으로 주장하였다.
골 골절 유합에 미치는 WNT-조절 AAV 유전자 사일런서의 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 3월령 마우스에서 대퇴부 골절제술 및 고정을 실시하였다. 대부분의 골절이 동시에 치유될 수 있다는 것을 고려하면, 본 발명자들은 25G 바늘을 이용한 수질 내 반고형 고정을 실시하였으며, 이는 C57BL/6J 마우스를 이용한 예비 시험에서 수술 후 6주에 평균 26.9%의 유합율(26마리 중 7마리)을 나타냈다. amiR
-ctrl, amiR
-
shn3, amiR
-
sost 또는 amiR
-
sost
/
shn3을 갖는 단일 투여량의 rAAV9.DSS는 정맥 내 제공되었다(도 48A). 주사 2주 후, 좌측 대퇴골의 중앙을 진동 톱으로 절단하고, 25G 바늘을 이용하여 수질 내에 고정하여, 원위 대퇴골의 슬개골 홈에서 대퇴골의 보다 큰 전자(trochanter)까지 관통하였다.
골 동결절편의 형광 현미경검사에 의해 수술 후 1주 내지 4주에 골절 부위 주변에서 egfp 발현을 모니터링하였으며, 이는 AAV-형질 도입된 세포가 골절 치유 과정에 구성적으로 영향을 미쳤다는 것을 시사한다(도 49A, 도 48B). 정량적 PCR에 의해 AAV-처리 경골에서 shn3 및/또는 sost mRNA 수준의 억제가 증명되었다(도 49B). β-카테닌 표적 유전자인 Axin2 및 Lef1의 발현 수준은 rAAV9.DSS
-
amiR
-sost/shn3를 이용한 처리에서 현저하게 증가하는 반면, Axin2 발현의 약간 증가는 amiR
-
shn3 또는 amiR
-
sost로 처리된 경골에서 나타났으며, 이는 WNT 신호전달 경로의 상이한 향상 정도를 시사한다(도 49C, 도 48C). 따라서, 대측성 측면 대퇴골에 대한 미세 전산화 단층촬영(μCT) 분석에 따르면 Tra. BV/TV, Tra. N 및 Tra. Th는 amiR-sost/shn3 발현 대퇴골에서 보다 높은 것으로 나타났다(도 49D, 도 48D). 골절 치유 동안에 캘러스 형성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 살아있는 마우스에서 골절 후 2주째 날에 단순 방사선촬영을 수행하고, 안락사 이후에 골절 후 6주째 날에 μCT를 분석하였다. 초기 캘러스 형성이 2주째 날에 방사선촬영 사진에 AAV9.DSS
-
amiR
-shn3, amiR
-
sost 및 amiR
-
sost
/
shn3을 증가시키는 경향이 있을 지라도, amiR
-
shn3에서의 캘러스 크기만이 골절 후 6주째 날에 μCT 분석에서 유의한 증가를 나타냈다(도 49E 내지 도 49G). 본 발명자들은 AAV 유전자 사일런서에 의한 WNT 조절이 초기 캘러스 형성에 영향을 미칠 수 있지만, 후기 캘러스 부피에는 영향을 미치지 않음을 추측하였으며, 이는 유전자 사일런서의 골 형성 활성에 의존할 가능성이 없지만, 골절 부위에서의 불안정한 상태의 정도 및 기간과 같은 기타 인자에 의존할 가능성이 있다. 최종적으로, 골 골절 유합율은 amiR
-
ctrl에서보다 amiR
-
shn3 및 amiR-sost 발현 대퇴골에서 증가하는 반면, 놀랍게도 이는 amiR
-sost/shn3 발현 대퇴골에서 개선되지 않았다(도 49H). H&E 염색에 의한 조직학적 섹션에 따르면 rAAV9.DSS-amiR
-
shn3 및 amiR
-
sost에서 망상골에 의한 골절의 양 말단 사이의 연결이 나타났으며, 이는 활성 골 리모델링을 시사한다(도 49I). 조직형태학적 분석에 따르면 대조군에 비해 3개의 유전자 사일런서 모두에서 골 표면 당 골아세포 표면(Ob.S/B.S)의 증가가 나타났다. 그러나, 골 표면 당 골아세포 표면(Ob.S/B.S)은 rAAV9.DSS-amiR-sost/shn3에서만 감소하였다(도 49J). 종합하면, 파골세포 활성의 감소는 골 리모델링에 악영향을 미칠 수 있으며, rAAV9.DSS-amiR
-
sost
/
shn3에서 골 골절 유합의 악화로 이어질 수 있는 것으로 추론된다. 반면, rAAV9.DSS-amiR
-
shn3 또는 amiR
-
sost는 파골세포-매개 골 재흡수의 방해 없이 골아세포-매개 골 형성을 활성화시키며, 그 결과 골 골절 유합의 겉보기 향상이 이루어진다.
실시예
25.
임계 크기 골 결함에 대한 골 동화 인간 골격
오르가노이드의
개발
임계 크기의 골격 결함(critical-sized skeletal defects, CSD)의 치유는, CSD가 골 이식편의 삽입과 같은 중재 없이 치유될 수 없기 때문에 정형 외과적 관리에서 가장 어려운 문제점들 중 하나로 남아 있다. 우수한 골전도, 골유도 및 골발생 활성을 갖는 자가 골 이식편(autogenous bone graft)이 최적 표준 처리(gold standard treatment)일지라도, 자가 골의 수확은 도너 부위 이환율 및 양에 의해 제한된다. 따라서, 동종 골 이식편(allogenous bone graft)은 자가 이식편 수확에 내재된 이들 문제를 피하기 위해 개발되었다. 그러나, 이들은 또한 제한된 고유의 골형성 잠재성을 나타내며, 이때 동종 이식편 골절로 인해 흔히 지속적인 불유합이 초래한다. 동종 이식편 결과를 개선하기 위해, 주위 골격 조직과의 통합을 촉진하면서 골 형성을 향상시키기 위한 새로운 부가 방법의 개발이 요구된다. 하나의 잠재적인 접근법은 OB-접종된 동종 이식편(골격 오르가노이드)을 CSD 상처 부위에 이식하는 것이며, 이때 본 발명자의 WNT-조절 유전자 사일런서는 OB 기능의 증가로 인해 동종 이식편의 골 재생을 촉진할 수 있다. 본 발명자의 AAV 벡터를 동종 골 물질에 부착하기 위해, OC-부유 골 형성 표면(Asp-Ser-Ser)6 또는 OC-부유 골 재흡수 표면(Asp)14에 귀소하는 펩티드 모티프를 AAV9 캡시드 단백질의 VP2 하위단위의 N-말단 상에 이식함으로써 골 표적화 AAV9 캡시드를 이용하였다. rAAV9, rAAV9.DSS-Nter(rAAV9.DSS) 또는 rAAV9.D14-Nter(rAAV9.D14) 벡터를 탈세포화된 동종 골 또는 하이드록시아파타이트(HA) 기반 스캐폴드와 함께 인큐베이션하였으며(도 51A), AAV의 유전체 복제수(GC)를 측정함으로써 이들의 결합 친화도를 평가하였다. 탈세포화된 골 및 HA-스캐폴드에서는 어떠한 rAAV9의 GC도 검출되지 않았지만, rAAV9.DSS의 GC는 rAAV9.D14의 GC에 비해 현저하게 증가하였으며(도 50A 및 도 51B), 이는 AAV9.DSS-Nter 캡시드가 주요 유기 성분인 HA를 통한 동종 골에 대한 시험관 내 결합 친화도를 향상킬 수 있는다는 것을 증명한 것이다. 흥미로운 것은, 이러한 펩티드 모티프의 캡시드 이식이 시험관 내의 마우스 및 인간 골수 유래 간질 세포(BMSC, 도 50B) 및 생체 외의 인간 골 조직(도 50C)에서 rAAV9의 형질 도입 효율에 영향을 미치지 않았다. 이어, rAAV9.DSS 또는 rAAV9.D14가 부착된 HA-스캐폴드를 마우스 BMSC와 함께 인큐베이션하고, EGFP 발현에 의해 이들의 형질 도입 효율을 평가하였으며(도 50D), 이는 rAAV9.DSS가 rAAV9.D14보다 BMSC 형질 도입에 보다 효과적임을 증명한 것이다(도 50E). 마찬가지로, rAAV9.DSS-부착 HA-스캐폴드는 또한 인간 BMSC를 형질 도입할 수 있었으며(도 50F), 이는 rAAV9.DSS-부착 HA-스캐폴드가 인간 골격 오르가노이드를 개발하기 위해 인간 BMSC 배양을 위한 최적의 환경을 제공할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
SHN3은 인간 골 조직(도 50G) 및 BMSC(도 50I)에서 고도로 발현되는 대형(2,000 초과의 아미노산)의 세포 내 어댑터 단백질이며, OB에서 WNT 신호전달의 억제제로서 기능을 한다. SHN3-결핍 마우스가 OB 활성 증가로 인해 골량의 점진적인 증가를 나타냄에 따라, SHN3의 과발현에 의해 인간 BMSC에서 OB 분화가 유사하게 제거되는 반면(도 50H), OB 분화는 SHN3 발현의 shRNA-매개 녹다운에 의해 현저하게 증가하였다(도 50I). 따라서, 본 발명자들은 인간 miR-33 유래 miRNA 스캐폴드(hs-amR) 기반 카세트를 조작하여 인간 SHN3 mRNA의 발현을 사일런싱하였다(도 50J)
실시예
26. 골-부착된
WNT
조절
AAV
유전자
사일런서의
임계 크기 골격 결손의 치유 촉진
본 발명자들은 amiR
-
shn3 또는 amiR
-
sost를 갖는 rAAV9.DSS로 WNT 조절은 골 치유를 향상시키고 골절 유합을 개선시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 향상된 골 치유 용량이 주로 추가로 제기된 골격 부상을 관리하는데 필요하다는 것을 고려하면, 본 발명자들은 C57BL
/6J 마우스를 이용하여 임계 크기의 골격 결손을 설계하였다. 이 실험을 위해, 본 발명자들은 이전 연구로부터 참조된, AAV 유전자 사일런서의 국소화된 투여를 설정하였다. 몇몇 연구에 따르면 타가 골(allogenous bone, AB)에 AAV 벡터의 생체 외 부착에 의한 임계 크기의 골격 결손에서 국소 유전자 전달이 시도되었다. 또한, 본 발명자들은 골 결함 부위를 채우기 위해 타가 골(allogenous bone, AB)를 사용하므로 본 발명자들은 실온에서 30분 동안 DSS.rAAV9(1.0E + 13 GC/㎖)를 함유하는 30 ㎕의 멸균 PBS에서 타가 골(allogenous bone, AB)를 인큐베이션함으로써 타가골-부착 WNT 조절 AAV 유전자 사일런서를 생산하였다(도 51A, 도 53A). 본 발명자들은 이들 골-부착된 유전자 사일런서가 원위의 비표적(off target)을 감소시키면서 임계 크기의 골격 결손에서 골 치유를 향상시킬 수 있다는 것을 가정하였다.
AAV를 타가 골(allogenous bone, AB)에 부착하기 전에, 본 발명자들은, 골 표적화 펩티드 모티프가 AAV의 타가골-결합 친화도를 향상시킬 것임을 가정하여, rAAV9.DSS, rAAV9.D14((Asp)14), 및 rAAV9로 시험관 내 타가골-결합 친화도를 시험하였다. AAV9.DSS의 유전제 복제수(GC)는 rAAV9.D14의 것에 비해 현저하게 증가하여, rAAV9보다 더 높은 GC를 나타냈다. 마찬가지로, 하이드록시아파타이트(HA)-결합 친화도의 시험관 내 시험은 rAAV9보다 rAAV9.DSS 및 rAAV9.D14에서 상당히 증가된 GC 수준을 나타냈다(도 50A). 이들 결과에 따르면 rAAV9.DSS가 타가골(allogenous bone, AB)에 대해 더 나은 친화성을 가지며, AAV는 타가골(allogenous bone, AB) 내의 HA 조성물에 부착한다는 것이 입증되었다. 본 발명자들은 또한 시험관 내 골-부착된 AAV의 형질 도입 시험을 검사하였고, egfp 발현은 마우스 BMSC와 함께 인큐베이션한 후 HA-부착된 AAV 상에서 직접 형광 현미경검사 및 동결절편 후 형광 현미경검사에 의해 검출하였다. AAV9.DSS 및 AAV9.D14에서 증가된 egfp 발현을 또한 면역블로팅 및 정량적 PCR에 의해 확인하였다(도 50D, 도 51B).
생체 내 타가골-부착 AAV의 비표적(off target) 분포를 시험하기 위해, 본 발명자들은 3월령 마우스의 임계 크기의 대퇴부 골 결함 안으로 rAAV9.DSS-egfp가 부착된 타가골(allogenous bone, AB)를 이식하였다. PBS에서 인큐베이션된 타가골(allogenous bone, AB)은 음성 대조군에 대해 사용되는 반면, rAAV9-
egfp는 양성 대조군으로 AB(비처리됨) 이식 2주 전에 정맥 내 주사하였다. 수술 후 2주째 날, 원위 기관에서 egfp 발현은 타가골-부착 rAAV9.DSS-
egfp
처리된 마우스에서 골 동결절편의 IVIS-100 광학 영상 및 형광 현미경검사에 의해 모니터링되지 않은 반면, rAAV9-
egfp의 전신 주사는 간 및 심장에서 더 높은 egfp 발현을 나타냈다(도 52A, 도 53B). 반면, egfp 발현은 골 동결절편의 형광 현미경검사에 의해 골-부착된 rAAV9.DSS로 처리된 이식된 골에서 검출되었으며, 이는 골-부착된 AAV가 골 결함 치유 동안 동원된 세포를 형질 도입하고 표적 유전자 발현을 조절할 수 있다는 것을 시사한다(도 52C).
다음으로, 임계 크기의 골격 결손에서 골-부착된 WNT 조절 AAV 유전자 사일런서의 골 치유 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 3월령 마우스에서 골-부착된 rAAV9.DSS-amiR-ctrl, amiR
-
shn3 또는 amiR
-
sost로 타가골 이식을 수행하고, 총 골 브릿징 비율(bone bridging ratio)을 비교하였다. 자가 골 이식편(autogenous bone graft)은 또한 양성 대조군으로서 비교되었다. 총 브릿징 백분율은 비록 이들이 자가 골 이식편의 것들보다는 낮았지만 amiR-ctrl보다 amiR
-
shn3
, 및 amiR
-
sost 처리된 대퇴골에서 증가되었다(도 52D, 도 52F). H&E 염색으로 조직학적 섹션은 골-부착된 rAAV9.DSS-amiR
-
shn3, amiR
-
sost, 및 자가 골 이식편에서 숙주 골(HB)과 이식편 골(GB) 사이를 연결하는 망상골을 나타냈다(도 52E). 골-부착된 유전자 사일런서에서 총 브릿징의 백분율(거의 60%)은 유전자 사일런서의 전신 주사의 것들에 유사하였다(도 52G, 도 52H, 도 53C). 종합하면, 이들 결과는 골-부착된 WNT 조절 AAV 유전자 사일런서가 원위 기관에 대한 비표적 분포를 감소시키면서 임계 크기의 골격 결손에서 골 치유를 개선할 수 있다는 증거를 제공한다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> AAVAA Therapeutics, Inc.
<120> Pharmaceutical composition for preventing or treating bone
disease, comprising AAV9, and use thereof
<130> OP200301JP
<160> 24
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amiR-ctrl
<400> 1
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgttactgt aggatcgaga gggatgttct ggcaatacct gtccctctcc 180
ttactacagt aacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 2
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amiRNA-33-shn3
<400> 2
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgtacaaac tacttgagag caggtgttct ggcaatacct gcctgctctg 180
taatagtttg tacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 3
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amiR-33-sost
<400> 3
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgtgacctc tgtggcatca ttcctgttct ggcaatacct gggaatgatc 180
gcgcagaggt cacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 4
<211> 269
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amiR-33-RANK-1
<400> 4
agggctctgc gtttgctcca ggtagtccgc tgctcccttg ggcctgggcc cactgacagc 60
cctggtgcct ctggccggct gcacacctcc tggcgggcag ctgtgaatgg tccacatttc 120
agggactgtt ctggcaatac ctggtccctg atttatggac cattcacgga ggcctgccct 180
gactgcccac ggtgccgtgg ccaaagagga tctaagggca ccgctgaggg cctacctaac 240
catcgtgggg aataaggaca gtgtcaccc 269
<210> 5
<211> 265
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amiR-33-RANK-2
<400> 5
agggctctgc gtttgctcca ggtagtccgc tgctcccttg ggcctgggcc cactgacagc 60
cctggtgcct ctggccggct gcacacctcc tggcgggcag ctgtgacaaa ttagctgtca 120
gcgctgttct ggcaatacct ggcgctgact gcaaatttgt cacggaggcc tgccctgact 180
gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc 240
gtggggaata aggacagtgt caccc 265
<210> 6
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amiR-33-ctsk-1
<400> 6
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgtttcatc atagtacaca cctctgttct ggcaatacct ggaggtgtga 180
tccatgatga aacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 7
<211> 285
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amiR-33-ctsk-2
<400> 7
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgttactgt aggatcgaga gggatgttct ggcaatacct gtccctctcc 180
ttactacagt aacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taagg 285
<210> 8
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAVCap1
<400> 8
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435 440 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705 710 715 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725 730 735
<210> 9
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV Cap2
<400> 9
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435 440 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500 505 510
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Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165 170 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180 185 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210 215 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245 250 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp
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Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
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355 360 365
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370 375 380
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Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr
405 410 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420 425 430
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435 440 445
Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln Gln Leu Leu
450 455 460
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465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485 490 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500 505 510
Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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<210> 21
<211> 737
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV Caprh43
<400> 21
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1 5 10 15
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20 25 30
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85 90 95
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195 200 205
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405 410 415
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485 490 495
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV2/2-66
<400> 22
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1 5 10 15
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165 170 175
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Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Asn Ser Asp Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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580 585 590
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595 600 605
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<211> 735
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV2/2-84
<400> 23
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Gln Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
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145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
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260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
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435 440 445
Asn Ala Pro Ser Gly Thr Thr Thr Met Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
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465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ala Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Asp Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
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515 520 525
Asp Glu Glu Lys Tyr Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Asp Ser Gly Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545 550 555 560
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565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Ser Gly Asn Thr Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Thr Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 24
<211> 735
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV2/2-125
<400> 24
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Ala Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Ala Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Thr Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Arg Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ala Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Asp Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Tyr Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Asp Ser Gly Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Arg Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Ser Gly Asn Thr Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Ser Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
Claims (11)
- miRNA-RANK, miRNA-ctsk, miRNA-shn3 , miRNA-SOST(sclerostin) 또는 miRNA-SOST/shn3을 담지하는 AAV9(Adeno-associated virus serotype 9)을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 AAV9의 캡시드는 골 표적 단백질 모티프(bone-targeting peptide motifs)가 삽입된 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 골 표적 단백질 모티프는 DSS((AspSerSer)6) 또는 D14(Asp14)인 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 DSS는 AAV9 캡시드 펩타이드의 VP2 펩타이드의 N 말단에 삽입되는 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- AAV9의 캡시드에 골 표적 단백질 모티프(bone-targeting peptide motifs)가 삽입된 AAV9을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 골 표적 단백질 모티프는 DSS((AspSerSer)6) 또는 D14(Asp14)인 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 DSS는 AAV9 캡시드 펩타이드의 VP2 펩타이드의 N 말단에 삽입되는 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 임계 크기-골 결함, 파제트병, 신부전 환자의 신성골이영양증, 골절, 골 결손, 불유합, 류마티스성 골질환, 양성 또는 악성 종양에 의한 골 결손 및 치주질환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함하는 골 대체제.
- 제9항의 골 대체제는 타가골 또는 합성골인, 골 대체제.
- 제10항에 있어서, 상기 합성골은 수산화인회석(Hydroxyapatite)으로 제조되는 것인, 골 대체제.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200046120 | 2020-04-16 | ||
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KR1020210050081A KR20210131236A (ko) | 2020-04-16 | 2021-04-16 | Aav9을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그의 이용 |
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2021
- 2021-04-16 KR KR1020210050081A patent/KR20210131236A/ko not_active Application Discontinuation
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