KR20110132579A

KR20110132579A - 골재생용 조성물

Info

Publication number: KR20110132579A
Application number: KR1020117023157A
Authority: KR
Inventors: 임채렬; 최경백; 이현열; 현종필
Original assignee: 코오롱생명과학 주식회사
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2011-12-08
Also published as: WO2010114319A3; WO2010114319A9; WO2010114319A2

Abstract

본 발명은 골재생 유도 인자를 도입한 간엽줄기세포 및 히알루론산을 포함하는 골 재생용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 골 재새용 조성물은 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포 및 히알루론산을 포함할 수 있다. 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질은 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)일 수 있다. 상기 줄기세포는 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)일 수 있으며, 자살유전자가 추가로 도입된 것일 수 있다. 상기 히알루론산은 평균 분자량이 50,000 내지 300,000 달톤인 것일 수 있다.

Description

골재생용 조성물{COMPOSITION FOR BONE REGENERATION}

본 발명은 골재생용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

뼈(bone)는 척추동물의 대표적인 특징으로, 생체 내에서는 살아있는 조직 중 하나이다. 상기 뼈는 장기를 보호할 뿐 아니라 몸 전체 각 조직에 필요한 영양분과 노폐물을 운반하는 혈액세포를 생성하는 조혈작용을 하며, 칼슘 및 미네랄(mineral)을 축적하는 등 매우 다양한 역할을 한다.

상기 뼈를 구성하는 세포로는 뼈의 항상성을 유지하는 골세포(osteocyte), 뼈를 형성하는 골모세포(osteoblast), 뼈를 흡수하는 파골세포(osteoclast) 및 뼈의 말단의 관절 기능을 담당하는 연골세포(chondrocyte) 등이 있다. 뼈의 성장기에는 골모세포가 뼈를 활발하게 형성하고, 성장기 이후에는 골 형성과 골 흡수가 반복(remodeling)된다.

상기 골형성과 골 흡수의 균형이 깨뜨려져 어느 한쪽으로 치우친다면 골 질환을 일으키게 되는데, 이는 심각한 증상을 유발하여 심하면 난치성으로 이를 수 있다. 난치성 골 질환에는 골다공증 및 당뇨병에 의해 부러진 뼈가 붙지 않는 불유합(non-union) 골절, 선천적인 골 결함으로 인한 골형성 부전증, 골 기질에 무기질의 침착이 부족하여 생기는 골연화증(Osteomalacia), 그리고 골종양 및 사고로 인한 골결손 등이 있다.

이러한 난치성 골 질환 가운데 가장 흔히 발생하는 질환은 골다공증이다. 상기 골다공증 환자의 경우 낮은 골량(bone mass) 및 골 구조의 미세구성의 퇴화에 의해 골절, 구체적으로 불유합 골절이 자주 유발된다.

골절을 야기하는 낮은 골량(bone mass) 및 골 구조의 미세구성의 퇴화에 의해 특징지어 지는 골다공증은 노인들에게 있어서 가장 일반적인 건강문제이나, 단순히 노화에 의해서만 진행되는 것은 아니다. 상기 골다공증 또는 골다공성 질병은 다양한 요인, 예를 들어 폐경기, 칼슘 결핍 식이, 난소절제(ovariectomization), 글루코르티코이드-유도 골다공증, 갑상성 항진증(hyperthyroidism) 및 면역억제성 유도에 의해 야기될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 골다공증에 의한 골절은 일상적인 생활 가운데서 발생할 수 있는 정도의 충격에도 골절이 쉽게 일어날 위험이 높으며, 골절이 되기 전에는 특별한 증상이 눈에 띄지 않기 때문에 더욱 위험할 뿐만 아니라 사망의 원인이 되기도 한다.

이러한 골다공증은 신체 모든 부위에서 골절을 일으킬 수 있는데, 이 중 척추골절과 고관절(둔부) 골절이 가장 대표적이다. 골다공증으로 인해 한번 골절이 생기면, 반복하여 다시 골절이 일어날 위험이 약 5배 이상 높아진다. 또한, 골다공증에 의한 고관절 골절의 경우 사망위험이 매우 높으며, 일 예로 골다공증 환자의 둔부골절에 의한 첫해 사망률은 대략 25％에 이르는 것으로 보고되고 있다.

상기 나이에 따른 골밀도 감소로 인한 골절, 사고 및 재해에 의한 골조직의 파괴 및 결손, 그리고 선천적인 골형성 부전증에 의한 성장 부진 등 다양한 난치성 골질환에 대한 효과적인 치료 방법이 요구된다.

그러나, 다양한 원인에 의해 유발될 수 있는 골절의 치료는 매우 복잡한 과정에 의하기 때문에, 골절 치유에 관한 치유 메커니즘에 대해서는 거의 밝혀져 있지 않다.

또한, 전통적인 치료방법으로 제안되는 자가골 이식(autografting), 동종골 이식(allografting) 및 인조골 이식(artificial bone grafting)의 경우에도 문제점이 제기되고 있다. 자가골 이식은 골 채취 부위의 감염, 통증 또는 혈종과 같은 합병증의 문제를 갖는다. 동종골 이식은 공여자로부터의 질병 전염 가능성의 문제를 갖고, 골유합 및 골형성 효과가 저조한 단점을 갖는다. 인조골 이식은 근본적인 골 생성이 되지 않아, 뼈 재생시간이 오래 걸리며, 주변의 기존 뼈 조직과의 융합이 잘 되지 않는다는 문제점이 있다.

최근 전통적인 치료방법에 대한 대안으로 제안된 치료방법은 상처 부위에 골유도성 단백질(osteoinductive protein)이 주입된 생분해성 담체를 이식하는 방법이다. 상기 골 재생 또는 골 형성을 유도할 수 있는 단백질인 골유도성 단백질은 생체 내 짧은 활동기간을 갖기 때문에, 치료 효과를 달성하기 위해서 다량의 재조합 단백질의 투여가 요구된다. 따라서, 상기 치료법은 상기 재조합 단백질의 과다한 투여에 의한 부작용 등의 안전성 문제가 제기될 뿐만 아니라, 치료 효과를 보장할 수 없다는 단점이 있다.

정형분야에서는 몇몇 사이토카인이 성형 질환의 치료를 위한 후보 물질로 고려되어 왔으며, 그 중 골 형성 단백질은 골형성의 효과적인 자극제로서 보고되어 있다. 또한, 골 세포의 분열증식(proliferation)을 자극하는 것으로 공지된 성장 인자로는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 형질전환 성장 인자-β 단백질(TGF-β), 인슐린형 성장 인자(IGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)등이 있다.

뼈 생성에는 성장인자에 의한 골유도(osteoinduction), 지지체에 의한 골전도(osteoconduction) 그리고 줄기세포에 의한 골발생(osteogenesis)의 3가지 요소가 관여한다. 이들 3가지 요소가 적절하게 조화를 이룰 때 뼈 생성을 극대화시킬 수 있다.

이 중 골유도와 관련된 골 재생 유도 인자인 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMPs)은 골 형성을 유도한다는 것이 보고되었다. 일 예로, 골형성 단백질의 일종인 BMP-2(Bone Morphogenic Protein-2) 및 BMP-4(Bone Morphogenic Protein-4)는 내연골성 막성 골절 치유에 관여한다는 것이 보고되었다. 또한, BMP-2는 뼈 성장을 촉진하는 단백질일 뿐만 아니라, BMP-2 단백질들이 자연적인 재생 반응에 필수적이라는 것도 보고되었다.

최근 모든 장기로 분화가 가능한 줄기세포 치료에 대한 기대가 고조되고 있다. 그러나, 분화능이 뛰어난 배아줄기세포 이식은 제어가 불가능한 기형종의 발생 또는 유전체 각인(imprinting)을 통한 발달학적 문제라는 부작용이 있고, 윤리적 문제로 말미암아 제약을 받고 있다. 따라서, 최근 성체줄기세포에 대한 관심이 높아지고 있다.

성체줄기세포로는 조혈계 줄기세포(hematopoietic stem cell)가 주목을 받고 있다. 상기 조혈계 줄기세포원인 골수에는 현재까지 두 종류의 줄기세포가 알려져 있다. 첫째가 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)이고, 둘째가 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)이다.

상기 골수의 조혈줄기세포는 매우 드물게 다른 장기의 세포로 분화되는 반면, 간엽줄기세포는 3가지 모든 배엽, 즉 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화가 가능하고 주머니배(balstocyst)에 주입하였을 때 거의 모든 장기 세포로 분화되는 뛰어난 분화능이 보고 되어 있다. 또한, 인간의 골수에서도 이와 비슷한 성상의 줄기세포가 분리되어, 질병 및 손상에 대한 세포 치료영역 분야에 응용할 가능성이 높을 것으로 예상되고 있다.

그러나, 골수는 나이가 듦에 따라 조혈줄기세포 및 간엽줄기세포 구역이 줄어들고, 골수 채취 자체가 고통을 야기한다는 점으로 인하여 실제 적용 유용성에 있어 매우 불리하므로 대안의 필요성이 지속적으로 제기되어 왔다.

제대(umbilical cord)는 태아에 대한 모든 영양공급원이자 노폐물 배설기관이고, 모체의 태반과 태아를 이어주는 줄이며, 제대혈이란 제대 안에 들어있는 혈액을 의미한다.

제대혈은 조혈계줄기세포(hematopoietic stem cell)를 채취하는데 있어 골수를 대신할 가장 적절한 대안으로서 제시되고 있는데, 그 이유는 골수보다 제대혈 줄기세포들이 더욱 원시적이며 세포 채취에 있어 용이하다는 점 때문이다.

자살유전자는 인체에 무해한 전구약물(prodrug)을 세포독성을 지닌 항암물질로 전환시키는 기능이 있는 유전자로서, 예를 들어, 사이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase)는 5-FC(5-fluorocytosine)를 세포독성이 큰 항암제인 5-FU(5-fluorouracil)로 전화시키는 기능이 있으며, 이때 5-FU는 세포 밖으로 분비되어 주변에 인접한 세포를 죽이는 주변인 효과(bystander effect)를 지닌다. 5-FU는 전신 투여시 세포독성이 매우 커서 부작용이 많지만, 자살유전자와 5-FC 라는 전구약물을 이용하면 자살유전자가 있는 근처에서만 5-FU의 농도가 높아지며, 그 결과 5-FU의 항암효과는 암세포주변에서 국소적으로 나타나게 된다고 보고되고 있다(Bourbeau et al., The Journal of Gene Medicine, 6, 1320-1332(2004)).

또한, 세포에 원래 존재하는 티미딘 키나아제(thymidine kinase)는 DNA 합성시 salvage pathway에 이용되는 효소로, HSV-tk는 티미딘(thymidine) 뿐만 아니라 뉴클레오사이드 유사체(nucleoside analogs)이면서 항바이러스제로 쓰이는 acyclovir 또는 GCV도 인산화킬 수 있다. DNA 합성 과정 중 deoxy-guanosine tri-phosphate 대신에 tri-phosphorylated GCV가 들어가면, DNA polymerase에 의한 chain elongation이 중단되어 DNA 합성을 억제함으로써, 세포 살상능이 나타내게 되는데, 이를 이용하여 암세포에 HSVtk유전자와 GCV를 투여하여 암세포를 죽이는 항암요법이 연구되고 있다.

상기 암 치료 전략의 중요한 장점은 HSV-tk 유전자가 투입되지 않은 주위의 암세포도 같이 죽이는 주변인 효과(bystander effect)를 나타낸다는 것으로, 현재 암치료를 위한 유전자요법의 가장 큰 문제점인 모든 암세포에 일일이 유전자를 투입할 수 없다는 결점을 부분적으로 보완할 수 있다는 점에서 중요한 의미를 갖는다.

상기 주변인 효과(bystander effect)는 인산화된 GCV가 인접 세포 사이에 형성된 gap junction을 통해 전달되거나 HSV-tk와 GCV 처리에 의해 죽어가는 암세포의 apoptotic vesicle을 주위 암세포가 endocytosis함으로써 이루어지는 것으로 이해되고 있다.

상기 골절 치료와 관련된 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 골을 효과적으로 재생 또는 형성시킬 수 있도록 골 형성 기능을 갖는 골재생용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 골 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 골 재생용 조성물 및 그 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 골 재생용 조성물은 줄기세포 및 히알루론산을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 골 재생용 조성물을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방, 경감 또는 치료용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 골 질환 치료법을 제공한다.

또한, 본 발명은 자살유전자 및 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질의 결합부위가 존재하고, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질에 의해 전사개시여부가 결정되는 프로모터 및 자살유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 기존 골 질환 치료방법이 갖는 문제점을 해결하기 위한 연구를 거듭한 결과, 골 형성 기능을 갖는 단백질인 BMP-2(Bone Morphogenic Protein-2)를 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포와 평균 분자량이 50,000Da 내지 300,000 Da인 히알루론산을 포함하는 골 재생용 조성물을 골 재생 또는 골 형성이 요구되는 부위에 처리하는 경우에, 다른 종류의 생체적합성 물질이나 다른 분자량의 히알루론산과 함께 처리한 경우에 비하여 현저하게 우수한 골 재생 효과 또는 골 형성 효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 줄기세포를 상기 BMP-2 및 자살유전자가 함께 도입된 줄기세포를 이용하는 경우, 우수한 골 형성 효과를 나타내면서도, 과도한 또는 지속적인 골 형성 기능을 갖는 단백질의 발현으로 인한 부작용을 제거할 수 있다는 것을 확인하였다.

상기 확인된 사실에 의하여, 본 발명자는 본 발명의 골 재생용 조성물을 이용하는 경우, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절 및 골결손을 포함하는 골질환군, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 두개안면 복원, 종양제거로 인한 환절 결함, 골 성장 장애, 불유합 골절 등의 골질환으로 인한 장애, 유전적 골성장의 결함으로 인한 골성장이 필요한 질환 또는 골신장 등의 다양한 골질환의 치료, 경감 및/또는 예방할 수 있다는 것을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서에 있어서, "골전구 세포" 또는 "골 전구 세포"란 골 세포가 될 잠재성을 갖고, 골막 및 골수에 존재하는 세포를 의미한다.

본 명세서에 있어서, "골 성장"이란 용어는 골량에 관한 것으로, 조골세포(osteoblast)의 수 및 크기가 증가하거나 전신 투여 후에 골성 라이닝 골 표면(osteoid lining bone surface)에 증가된 침작을 포함하는 개념이다. 상기 "골량"은 단위 면적 당 골량을 지칭하며, 종종 골 무기물 농도로서 지칭된다.

본 명세서에 있어서, "성숙한 골"이란 골성(osteoid)과 같이 비무기화(non-mineralizing)된 골과는 대조적으로 무기화(mineralizing)된 골을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "골형성적 유효량"이란 성숙한 골의 형성 및 발생에 영향을 미치는 양을 의미한다.

본 명세서에 있어서, 핵산, 단백질, 단백질 단편 또는 이의 유도체와 관련하여 "생물학적 활성"이란 용어는 핵산 또는 아미노산이 야생형 핵산 또는 단백질에 의해 유도되는 공지된 생물학적 기능을 모방하는 능력으로서 정의된다.

본 명세서에 있어서, "개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "환자" 는 인간을 포함하지만 이에 한정되지 않은 동물계의 일원을 포함한다.

본 명세서에 있어서, "치료"란 유리하거나 목적하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법을 의미한다. 본 발명의 목적에 있어서, 유리하거나 목적하는 임상 결과는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화(즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 진전의 연기 또는 지연, 질환 상태의 경감 및 일시적 완화, 및 검출가능하거나 검출불가능한 소실(remission, 부분적이든 전체적이든)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, "치료"란 용어는 또한 치료를 받지 않는 경우에 예상 생존기간에 비해 연장된 생존을 의미할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서, "치료"란 용어는 치료학적 치료 및 예방책 둘 다를 의미하는 것이다. 치료가 필요한 이들은 질병이 예방되어야 할 사람뿐만 아니라, 이미 질병을 앓고 있는 사람을 포함한다. 질환을 "일시적 완화하기"란 용어는 치료하지 않은 상황과의 비교시 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 못한 임상적인 징후가 약해지고/지거나 진행 시간의 경과가 지연되거나 길어짐을 의미한다.

본 명세서에 있어서, 수용체 동물이 조성물의 투여에 내성을 갖는 경우 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능하고", 다르게는 상기 동물에 투여하기에 적합하다. 이 같은 약제는 투여량이 생리학적으로 유효한 경우에 치료학적 유효량으로 투여되는 것을 의미한다. 약제의 존재로 인해 수용체 환자의 생리 현상에서의 검출가능한 변화를 야기하는 경우 약제는 생리학적으로 유의한 것이다.

본 명세서에 있어서, "약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항-박테리아제 및 항-진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

본 명세서에 있어서, 1종 이상의 추가적인 치료제와 "함께" 투여함은 임의의 순서로 동시(공동) 또는 연속 투여하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 있어서, "벡터", "폴리뉴클레오타이드 벡터", "컨스트럭트(construct)" 및 "폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트(poly nucleotide construct)"란 용어는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 벡터는 RNA, DNA, 레트로바이러스성 피복물에 캡슐화(encapsulating)된 RNA, 아데노바이러스 피복물에 캡슐화된 DNA, 기타 바이러스성 또는 바이러스형 형태(예를 들어, 허피스 심플렉스(herpes simplex) 및 아데노 회합 바이러스(AAV))로 패킹(packing)된 DNA, 리포좀(liposome)에 캡슐화된 DNA, 폴리리신과 복합체를 형성한 DNA, 합성 다가 양이온성 분자와 복합체를 형성한 DNA, 분자를 면역학적으로 마스킹(masking)하고/하거나 반감기를 증가시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 화합물과 복합체를 형성한 DNA 또는 비-바이러스성 단백질에 접합된 DNA를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA일 수 있다. 본 명세서에서 있어서, "DNA"란 용어는 염기인 A, T, C 및 G를 포함할 뿐만 아니라, 이들 염기의 유사체 및 변형된 형태, 예를 들어 메틸화 뉴클레오타이드, 전하를 띠지 않은 결합 및 티오에이트(thioate)와 같은 뉴클레오타이드간 변형(internucleotide modification), 당 유사체의 용도, 및 폴리아미드와 같은 변형 및/또는 대체 골격 구조를 포함한다.

본 명세서에 있어서, "프로모터"란 활성은 나타내며, 진핵 세포에서 전사를 조절하는 DNA의 임의의 서열을 의미한다. 상기 프로모터는 진핵 세포 또는 원핵 세포 각각 또는 둘 다에서 활성을 나타낼 수 있다. 상기 프로모터는 구조적으로 발현되거나 유도성일 수 있으며, 외부 자극에 의해 유도될 수 있다. 또한, 전사를 조절하는 "인핸서 원소(enhancer element)"는 DNA 벡터 컨스트럭트에 삽입되어, 흥미있는 유전자의 발현을 향상시키는 본 발명의 컨스트럭트와 함께 사용될 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "숙주 세포"란 용어는 본 발명의 벡터의 수용체였거나 수용체일 수 있는 개개의 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 필수적으로 자연적인 돌연변이 및/또는 변화, 우발적인 돌연변이 및/또는 변화 및 의도적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 (형태학 또는 DNA 총량에 있어서) 초기 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있다. 본 명세서에 있어서, "포유동물 숙주"란 인간을 포함하지만 이에 한정되지 않은 동물계의 일원을 포함한다.

본 발명의 일례는 포유류 유래의 골재생 유도인자, 바람직하게는 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포 및 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 골재생용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 예는 상기 골재생용 조성물을 포함하는 골질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포 및 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 골 재생용 조성물에 관한 것이다.

상기 골재생 유도인자(촉진인자)는 포유류에서 골형성을 유도하는 모든 단백질을 암호화하는 유전자를 의미하며, 바람직하게는, 골 형성 기능(bone generation function)을 갖는 단백질일 수 있다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질이란 골 세포의 분열증식(proliferation)을 자극하는 단백질을 의미하며, 골 형성 기능을 갖는 단백질 또는 골 재생 단백질이라고도 한다. 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자란 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 의미한다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질은 일 예로, 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 형질전환 성장 인자-β 단백질(TGF-β), 인슐린형 성장 인자(IGF), 섬유아세포성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 구체적으로 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF) 및 혈관내피생장인자 (Vascular Endotherial Growth Factor, VEGF)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 골 형성 단백질(BMP)은 골 형성을 개시하기 전에 연골 세포 및 조골세포로의 중배엽형 세포의 분화를 유도하도록 작용하는 단백질이다. 상기 골 형성 단백질은 골절 부위의 주변 또는 이소성 위치(ectopic location)에서 연골형성 및 골형성 세포의 분화를 증진할 수 있다. 또한, 몇몇 골 형성 단백질은 조골세포에서 알칼라인 포스포타제 및 콜라겐의 합성을 유도하거나 조골세포에 직접 작용하여 이들의 성숙을 증진시키는 반면, 동시에 근원성(myogenous) 분화를 억제할 수 있다. 또한, 몇몇 골 형성 단백질은 연골세포로의 전형적인 섬유아세포의 전환을 증진시키고, 비골원성 세포 유형에서 조골세포 표현형의 발현을 유도할 수도 있다.

상기 골 형성 단백질은 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-7, BMP-8, BMP-8b, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12 및 BMP-14로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 BMP-2(예컨데, GenBank Accession No. AAF21646; GenBank Accession No. M22489에 의하여 암호화됨)는 BMP-2A또는 BMP-2-α(114개의 아미노산)일 수 있다. 상기 BMP-3(예컨데, GenBank Accession No. NP_001192; GenBank Accession No. NM 001201에 의하여 암호화됨)는 당단백질이고 오스테오게닌(Osteogenin)과 동일할 수 있다. BMP-2B 또는 BMP-2-β(116개의 아미노산)는 상기 BMP-4(예컨데, GenBank Accession No. ACB21039; GenBank Accession No. EU518936에 의하여 암호화됨)로 재명명되었고, 드로로필라 단백질과 72％ 상동성을 나타낸다. 상기 BMP-7(예컨데, GenBank Accession No. NP_001710; GenBank Accession No. NM_001719에 의하여 암호화됨)은 OP-1(골원성 단백질-1)과 동일하다. 생쥐 및 인간 단백질은 98％의 상동성을 갖는다. 상기 BMP-8(139개의 아미노산)은 BMP-8a로 지칭되기도 하고, OP-2(골원성 단백질-2)와 그 서열이 동일할 수 있다. 상기 BMP-8b(139개의 아미노산) OP-3(골원성 단백질-3)와 그 서열이 동일할 수 있다. 상기 BMP-9(110개의 아미노산)는 또한 GDF-5로서 지칭되기도 한다. 상기 BMP-11(109개의 아미노산)은 소 공급원으로부터 단리되었으며, GDF-11로도 지칭되기도 한다. 상기 BMP-12(104개의 아미노산)는 GDF-7 또는 CDMP-3으로도 지칭되기도 한다. 상기 BMP-14(예컨데, GenBank Accession No. AAH32495; GenBank Accession No. BC032495 에 의하여 암호화됨)는 GDF-5 및 CDMP-1과 동일할 수 있다.

상기 골 형성 단백질(BMP)은 BMP-2, BMP-3 또는 BMP-7일 수 있다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 염기서열 정보로부터 얻어지는 cDNA를 클로닝하거나 합성하여 사용할 수 있으며, 이와 동등하거나 유사한 활성을 나타낼 수 있다면 이들 서열의 일부가 변형, 결실, 치환된 것도 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 줄기세포 및 상기 줄기세포로부터 분화 및/또는 증식된 조골세포를 모두 포함하는 개념이다. 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포 또는 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)일 수 있다.

상기 간엽 줄기세포는 면역거부반응을 최소화하기 위하여, 환자 자신으로부터 채취하거나 혈액은행의 데이터베이스를 이용하여 HLA(human leukocyte antigen) 타입이 일치되는 골수로부터 분리하여 사용할 수 있다.

상기 간엽줄기세포는 인간, 설치류 등을 포함하는 모든 포유동물의 골수, 혈액(peripheral blood), 제대혈(cord blood), 양막, 양수, 지방세포 등으로부터 분리된 것일 수 있으며, 특히 인간의 골수, 제대혈 또는 지방세포로부터 분리된 간엽줄기세포일 수 있고, 이 때 연령은 무관하며, 면역거부반응을 최소화하기 위하여, 환자 자신으로부터 채취하거나 혈액은행의 데이터베이스를 이용하여 HLA(human leukocyte antigen) 타입이 일치되는 골수로부터 분리하여 사용할 수 있다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포, 상기 줄기세포로부터 증식된 줄기세포 및/또는 상기 줄기세포로부터 분화된 줄기세포, 일 예로 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 조골세포는 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 골결손, 큰 충격이나 특별한 원인 없이도 뼈가 쉽게 부러지는 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 두개안면 복원, 환절 결함(예컨데, 종양제거로 인한 환절 결함), 이식체 교정 주위의 골 증가(예컨데, 엉덩이 이식체 교정 주위의 골증가), 골성장 장애, 불유합 골절, 유전적 골성장의 결합 등에 의한 질환 및 골신장으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 세포대체요법과 유전자 치료요법에 유용하며, 우수한 골 형성 및 골 재생 효과를 나타낸다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포는 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된 벡터를 이용하여 상기 줄기세포, 구체적으로 간엽줄기세포를 형질감염시킴으로써 제조될 수 있다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된 벡터는 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 세포 내로 도입하기 위하여 사용되는 운반체 역활을 하는 모든 물질을 의미하며, 일 예로 아데노바이러스 발현 벡터, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스 벡터 또는 플라스미드(plasmid)일 수 있다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된 벡터는 추가로 자살유전자를 포함할 수 있다. 보다 상세하게, 상기 벡터는 골 형성 기능을 갖는 단백질, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질의 결합부위가 존재하고, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질에 의해 전사개시여부가 결정되는 프로모터 및 자살유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터일 수 있다.

상기 유전자 발현 카세트는 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질, 상기 프로모터 및 상기 자살유전자는 전사방향으로 연결되어 구성된 것일 수 있다.

상기 자살유전자는 Herpes simples virus thymidine kinase(HSV-tk) 유전자, Cytosine deaminase(CD) 유전자, Varicella zoster virus thymidine kinase(VZV-tk) 유전자, Escherichia coli nitroreductase(NTR) 유전자, Cytochrome P450 B1(CYP2B1) 유전자, Carboxypeptidase G2(CPG2) 유전자, Escherichia coli gtp(XGPRT) 유전자 및 Escherichia coli Deo(PNP) 유전자로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 자살유전자는 인체에 무해한 전구약물(prodrug)을 세포독성을 지닌 항암물질로 전환시키는 기능이 있는 유전자로서, 일 예로, 항암제 5-FU(5-fluorouracil)의 전구약물인 5-FC (5-fluorocytosine)를 5-FU로 전환시킬 수 있는 사이토신 데아미네이즈(cytosine deaminase, CD)의 유전자와 티미딘(thymidine)뿐만 아니라 뉴클레오시드 아날로그(nucleoside analogs)이면서 항바이러스제제로 쓰이는 acyclovir, GCV도 인산화시키는 능력을 가지고 있는 유전자로서 DNA 합성 과정 중 deoxy-guanosine tri-phosphate 대신에 tri-phosphorylated GCV 가 들어가 DNA polymerase에 의한 chain elongation을 중단시켜 DNA 합성을 억제할 수 있는 티미딘 키나아제(thymidine kinase, TK)의 유전자일 수 있다.

상기 HSV-tk 유전자는 HSV-tk 유전자(GenBank Accesion No. EU814922)이거나 서열번호 2의 서열을 가진 유전자일 수 있고, 상기 CD 유전자는 CD 유전자(GenBank Accesion No. S56903)이거나 서열번호 3의 서열을 가진 유전자일 수 있으며, 상기 VZV-tk 유전자는 VZV-tk 유전자(GenBank Accesion No. M36160)이거나 서열번호 4의 서열을 가진 유전자일 수 있고, 상기 CYP2B1 유전자는 CYP2B1 유전자(GenBank Accesion No. NM_001134844)이거나 서열번호 5의 서열을 가진 유전자일 수 있으며, 상기 XGPRT 유전자는 XGPRT 유전자(GenBank Accesion No. M15035)이거나 서열번호 6의 서열을 가진 유전자일 수 있고, 상기 PNP 유전자는 PNP 유전자(GenBank Accesion No. M60917)이거나 서열번호 7의 서열을 가진 유전자일 수 있다.

상기 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질의 결합부위가 존재하고, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질에 의해 전사개시여부가 결정되는 프로모터는 일 예로 오스테오칼신(Osteocalcin) 단백질의 프로모터, 오스테오폰틴(Osteopontin)의 프로모터, 오스테오넥틴(Osteonecin)의 프로모터, 알카라인 포스파타제(Alkaline Phosphatase)의 프로모터 및 타입 I 콜라겐의 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 오스테오칼신(Osteocalcin, OC) 단백질은 Bone Gla protein (BGP)일 수 있고, 상기 오스테오칼신 단백질 유전자는 OC(예컨데, GenBank Accession No. X53698)일 수 있으며, 상기 오스테오칼신(Osteocalcin) 단백질의 프로모터는 GenBank Accession No. AY147065인 것일 수 있으며, 상기 오스테오폰틴(Osteopontin, OP) 단백질은 Bone Sialoportein(BSP)일 수 있고, 상기 오스테오폰틴 단백질 유전자는 OP(예컨데, GenBank Accession No. X13694)일 수 있으며, 상기 오스테오넥틴(Osteonecin, ON, SPARC) 단백질 유전자는 ON(예컨데, GenBank Accession No. J03040)일 수 있고, 상기 오스테오넥틴 단백질의 프로모터는 예컨데, GenBank Accession No. U65081의 서열을 갖는 프로모터일 수 있으며, 상기 알카라인 포스파타제 유전자는 OC(예컨데, GenBank Accession AB011406)일 수 있으며, 상기 알카라인 포스파타제의 프로모터는 예컨데, GenBank Accession No. AB035417의 서열을 갖는 프로모터일 수 있고, 상기 타입 I 콜라겐(COL1A1) 단백질 유전자는 OC(예컨데, GenBank Accession No. NM_000088)일 수 있다.

일 예로, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포는 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자를 아데노바이러스 벡터에 삽입하여 제작한 발현벡터를 형질도입시킨 포장세포(packaging cell)를 배양한 후, 여과하여 얻은 아데노바이러스 용액을 이용하여 간엽 줄기세포를 감염시킴으로써 제조할 수 있다.

다른 예로, 상기 줄기세포는 상기 자살유전자 및 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자를 아데노바이러스 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 상기 벡터를 포장(packaging) 세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후, 여과하여 아데노바이러스 용액을 얻고, 이를 이용하여 간엽 줄기세포를 감염시키는 방법으로 제조할 수 있다.

상기 줄기세포는 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 자살유전자가 도입된 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 자살유전자를 발현할 수 있고, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질에 의해 상기 자살유전자의 발현 여부가 조절되는 줄기세포일 수 있다.

상기 골 재생용 조성물이 젤 상태인 경우, 상기 골 재생용 조성물에서 치료 효과를 나타내기 위해 필수적인 성분인 상기 줄기세포의 생체 내 이식을 용이하게 하고, 생체 내 이식 후 위치의 고정이 용이한 장점이 있다. 반면, 용액 상태의 조성물은 유동성이 크고 흐르는 성질로 인하여, 생체 내 이식 후 위치의 고정이 곤란하고 원하는 위치에서의 충분한 골재생 효과를 거두기 힘든 단점이 있다. 따라서, 상기 골 재생용 조성물을 젤 상태인 것이 바람직하다.

이러한 측면에서, 본 발명은 유효성분으로 히알루론산을 포함한다. 상기 히알루론산은 아미노산과 우론산으로 이루어진 뮤코다당류 중 하나로, 본 명세서에서 히알루론산은 히알루론산 및 변성 히알루론산을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포 및 히알루론산을 포함하는 골 재생용 조성물은 상기 히알루론산을 포함함으로써 상온 및 체온 범위를 포함하는 4℃ 내지 50℃, 바람직하게는 20℃ 내지 40℃에서 젤 상태일 수 있다. 상기 골재생용 조성물이 젤 상태인 경우 생체 내 이식에 있어서의 용이성을 도모할 수 있고, 이식 후 위치가 거의 고정되어 원하는 위치에서의 충분한 골재생 효과를 얻을 수 있다.

본 발명자들은 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포를 포함하는 조성물이 4℃ 내지 50℃에서 젤 상태를 유지하기 위하여, 조성물의 점도를 조절할 수 있는 천연 생체 고분자 및 합성 생체적합성 고분자에 대한 연구를 수행하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 상기 조성물의 점도를 조절할 수 있는 물질에 대한 연구를 위하여, 골 질환 치료에 임상적으로 사용가능한 고분자를 대상으로 실험을 수행하던 중, 히알루론산을 사용하는 경우 가장 바람직한 효과가 있음을 확인하였다. 반면에, 임상에서 사용허가를 얻은 하이드로겔(hydrogel)인 Puramatrix(3DM 사, 일본)와 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포를 함께 사용한 경우에는 골재생 효과가 거의 없는 것으로 확인되었다. 상기 Puramatrix는 1％(w/v)의 합성 펩타이드와 99％ 물로 구성된 합성 펩타이드 하이드로겔로, 상기 합성 펩타이드는 16개의 아미노산(can-RADARADARADARADA-CNH2)으로 구성된 합성 펩타이드이다.

상기 히알루론산이 포함된 골 재생용 조성물은 젤 상태를 유지할 수 있기 때문에 이식에 있어서의 용이성을 도모할 수 있고, 이식 후 일주일 이상을 젤 상태를 유지할 수 있을 뿐만 아니라 이식 후 위치가 거의 고정될 수 있다. 따라서, 상기 히알루론산은 줄기세포에 도입된 유전자의 안정적 발현 및 전달 효과와 줄기세포의 생존성 증가에 이바지함으로써, 골재생 효과를 배가 시킬 수 있고, 장기적이고 지속적인 치료 효과를 발휘할 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명자들은 추가로 상기 히알루론산의 분자량 및 함량에 따른 골 재생 효과를 확인한 결과, 평균 분자량이 110,000 달톤(Da)인 히알루론산을 전체 조성물을 기준으로 0.5％(w/v) 첨가하는 경우에 골 재생 효과가 가장 우수한 것으로 확인하였다.

따라서, 상기 히알루론산은 평균 분자량이 10,000 내지 2,000,000 달톤, 바람직하게는 50,000 내지 300,000 달톤, 더욱 바람직하게는 80,000 내지 200,000 달톤인 것일 수 있다. 또한, 상기 히알루론산의 함량은 전체 조성물을 기준으로 0.01 내지 3％(w/v), 바람직하게는 0.05 내지 2％(w/v), 더욱 바람직하게는 0.25 내지 1％(w/v)일 수 있다.

상기 조건으로 히알루론산을 포함하는 상기 골 재생용 조성물은 4℃ 내지 50℃에서 젤상태를 가질 수 있을 뿐만 아니라, 세포 증식율이 우수하고, 골 재생 효과가 현저하게 우수할 수 있다

상기 골 재생용 조성물은 골 질환의 정도에 따라 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 스캐폴딩 골격(지지체) 또는 스캐폴더, 매트릭스 또는 생체 접착제 등의 보조 역할을 하는 것으로, 상기 골 재생용 조성물 이식 후, 상기 골 재생용 조성물에 포함된 줄기세포를 이식된 위치에 더욱 오래 고정될 수 있게 하기 위해 첨가되는 물질일 수 있다.

상기 지지체는 지지체의 목적으로 사용되는 모든 생체적합성 물질일 수 있으며, 예컨대, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 베타-트리칼슘포스페이트(β-tricalcium phosphate, β-TCP), 또는 이들의 복합체 등의 골성분 대체제나 폴리포스파진(polyphosphazine), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 및 PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid)) 등으로 이루어진 중합체 또는 공중합체 등의 합성 생체적합성 고분자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 첨가제는 상기 형질도입된 줄기세포와 함께 생체 내 이식될 수 있다. 상기 골 재생용 조성물에 포함되는 상기 첨가제의 함량은 특별한 제한이 없고, 목적하는 역할에 따라서 절절하게 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량 기준으로 50 내지 95 중량％일 수 있다.

본 발명은 상기 골 재생용 조성물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 골질환은 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 골결손, 큰 충격이나 특별한 원이 없이도 뼈가 쉽게 부러지는 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 두개안면(craniofacial) 복원, 환절 결함(예컨대, 종양제거로 인한 환절 결함), 이식체 교정 주위의 골 증가(예컨대 엉덩이 이식체 교정 주위의 골증가), 골성장 장애, 골 종양, 불유합골절 및 유전적 골성장의 결함 상기 결함에 의한 질환, 및 골신장 등을 포함하는 "골 결함" 또는 "결함된 골"에 의해 발병되는 질병으로, 골 형성 또는 골 재생에 의해 치료 가능한 모든 질병을 포함한다.

상기 "골 결함" 또는 "결함된 골"이란 용어에 사용된 상기 결함은 상처 또는 질환에 의해 야기되는 이 같은 질병을 비롯한 골절, 단절, 및/또는 골의 퇴화를 포함할 수 있고, 척주의 척추의 결함 및 척추 사이의 디스크 구역의 추가적인 퇴화를 추가적으로 포함할 수 있는 것일 수 있다.

상기 골 질환은 구체적으로 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 골결손, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 환절 결함, 이식체 교정 주위의 골 증가, 골성장 장애, 골 종양, 불유합골절 및 유전적 골성장의 결함으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 골다공증은 재흡수가 골 형성 단계를 좌우하여, 영향을 받은 골의 중량 지지력을 감소시키도록 골 형성, 골 재흡수 또는 둘 다에서의 불균형을 일으키는 골량의 손실에 의해 야기되는 골격의 구조적인 퇴화를 의미한다.

건강한 성인에서, 골이 형성되고 재흡수되는 속도는 골격 골의 재생을 유지하도록 엄격하게 조정된다. 그러나, 골다공증 질환을 갖는 개체에서는, 이들 골 리모델링(remodeling) 주기의 불균형이 진행되어, 골량이 손실되고, 골격의 연속성에서의 미세 구조의 결함이 형성된다. 상기 골 리모델링 주기에서의 혼란에 의해 생성된 골격 결함이 축적되면, 최종적으로 골격의 구조적 보존이 심각하게 손상되어, 골절 가능한 시점에까지 이르게 된다. 이 같은 불균형은 대부분의 개인에게서는 나이가 들어가면서 점진적으로 나타나고 (노인성 골다공증), 폐경 이후의 여성에서 급진적으로 발생할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 측면에서 상기 골 재생용 조성물을 이용하여, 골격 골량을 감소시키는 질환, 특히 상기 골 리모델링에서의 불균형을 야기하는 질환에 감염된 개개에서의 골 골절을 겪고 있는 환자의 골을 생성하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다른 측면에서 상기 골 재생용 조성물을 포함하고, 대사성 골 질환을 비롯한 골 질병을 겪고 있는 아이들의 골절을 치료, 경감 및/또는 예방하기 위해 골 성장을 증진시키는 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 소아 대사성 골 질환의 치료, 경감 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다른 측면에서 상기 골 재생용 조성물을 포함하고, 폐경 이후의 여성, 노인 및 투석을 받고 있는 환자를 비롯한, 골량이 감소할 위험이 있는 개인에서 골절된 골을 치료, 경감 및/또는 예방하기 위한 조성물 또는 상기 조성물을 이용하여 상기 골절될 골을 치료, 경감 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다른 측면에서 상기 골 재생용 조성물을 이용하여 골 골절을 치료하는 단계를 포함하는, 구조적으로 손상된 골의 미세 구조에서 결함을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 골형성을 자극하여 선택적으로는 장기간에 걸쳐 골량을 증가시키는 것을 목적으로 하며, 특히 골격의 구조적인 퇴화로부터 기인된 새로운 골절의 발생을 감소시키는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 다른 측면에서 골절 또는 파골 부위에 또는 이들 주변에 상기 골 재생용 조성물을 투여함으로서 척추동물, 예를 들어 포유동물에서 골 이식편을 강화하는 방법에 관한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 골 재생용 조성물 및/또는 상기 골 질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물의 투여 방식에는 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 골질환 부위 주입이나 골질환 부위 수술 시 점적에 의할 수 있다.

본 발명에 따른 골 재생용 조성물 및/또는 상기 골 질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물은 상기 줄기세포 및 히알루론산을 포함하는 것을 특징으로 하며, 국부 투여용으로 제형화될 수 있다. 본 발명에서, 상기 골 재생용 조성물 및/또는 상기 골 질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물은 일반적으로 투여 방식 및 투여 형태의 특징에 따라 충진제, 증점제, 결합제, 습윤제, 분산제, 표면 활성제, 부식성 중합체 및 윤활제를 포함할 수 있는 부형제의 희석제와 같은 담체와 조합될 수 있다.

상기 골 재생용 조성물 및/또는 상기 골 질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 비경구 조성물을 제제화하는 것이 유리하다.

상기 제형화된 형태 중 일 예인 주사용으로 적합한 약학 형태는 멸균 증류수(즉, 가용성 수용액) 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제제용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 약학 형태는 멸균되어야 하고, 용이하게 주사할 수 있는 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 상기 담체는 일 예로 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리프로필렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 또는 식물성 오일을 비롯한 용매 또는 분산 매체일 수 있다.

본 발명에 따른 골 재생용 조성물 및/또는 골 질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물의 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태, 질환 종류 및 증세에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 충분한 골재생 및/또는 골질환 예방, 경감 또는 치료 효과를 얻기 위하여, 본 발명에 따른 골재생용 조성물 및/또는 골질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물의 투여량은 0.05 내지 2mL로 할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 예는 줄기세포를 조골세포(osteoblast)로 분화(transdifferentiation)시키는 방법 및 골 재생용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 예는 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질의 결합부위가 존재하고, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질에 의해 전사개시여부가 결정되는 프로모터 및 자살유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 예는 상기 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 발현 벡터에 관한 것이다.

상기 줄기세포의 분화 방법은 골재생 유도인자, 바람직하게는 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 발현 벡터를 줄기세포로 형질 감염시켜 상기 줄기세포를 조골세포(osteoblast)로 분화(transdifferentiation)시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 골 재생용 조성물 제조 방법은 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된 벡터 또는 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자에 의해 발현된 단백질에 의해 전사개시여부가 결정되는 프로모터 및 자살유전자가 전사방향으로 연결되어 구성된 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 상기 벡터를 이용하여 줄기세포에 골 형성 기능을 하는 단백질을 암호화하는 유전자를 도입시키는 단계; 및 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 히알루론산과 혼합하여 젤상태의 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질은 골형성 단백질((Bone Morphogenetic Protein, BMP), 바람직하게는 포유류 유래의 골형성 단백질일 수 있다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자는 상기 골 형성 단백질은 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-7, BMP-8, BMP-8b, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12 및 BMP-14로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자는 BMP-2 유전자, BMP-3 유전자, BMP-4 유전자, BMP-7 유전자 및 BMP-14 유전자로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 BMP-2 유전자는 서열번호 1의 서열을 가진 유전자일 수 있다

상기 줄기세포는 간엽줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 도입된 유전자, 구체적으로 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자의 발현에 의한 골 형성 기능을 갖는 단백질에 의해서 조골세포로 분화될 수 있다.

상기 자살유전자는 HSV-tk 유전자, CD 유전자, VZV-tk 유전자, NTR 유전자, CYP2B1 유전자, CPG2 유전자, XGPRT 유전자 및 PNP 유전자로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질의 결합부위가 존재하고, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자에 의해 발현된 단백질에 의해 전사개시여부가 결정되는 프로모터는 일 예로 오스테오칼신(Osteocalcin) 단백질의 프로모터, 오스테오폰틴(Osteopontin)의 프로모터, 오스테오넥틴(Osteonecin)의 프로모터, 알카라인 포스파타제(Alkaline Phosphatase)의 프로모터 및 타입 I 콜라겐의 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 유전자 발현 카세트는 상기 골 형성 단백질, 상기 프로모터 및 상기 자살유전자는 전사방향으로 연결되어 구성된 것일 수 있다.

상기 발현벡터를 제작하는 방법 또는 상기 유전자를 도입하는 방법은 아데노바이러스를 이용하는 방법, 아데노-연관 바이러스를 이용하는 방법, 레트로바이러스를 이용하는 방법, 플라스미드를 이용하는 방법, 일 예로 DNA-칼슘 침전법 또는 일렉트로포레이션법(electroporation)법, 리포좀을 이용하는 방법 및/또는 폴리아민 계열을 사용하는 방법 등 당 분야에서 공지된 유전자의 세포 내 도입기술 방법일 수 있다.

상기 유전자를 도입하는 방법은 줄기세포의 특성을 고려하면 아데노바이러스를 이용하는 방법이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 줄기세포에 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자의 도입은 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자를 아데노바이러스 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하고, 이를 이용하여 줄기세포를 형질감염시키는 방법으로 수행할 수 있다.

일 예로, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자 또는 상기 자살유전자 및 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자를 아데노바이러스 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 상기 벡터를 포장(packaging) 세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후, 여과하여 아데노바이러스 용액을 얻고, 이를 이용하여 간엽줄기세포를 감염시킴으로써 간엽줄기세포에 상기 자살유전자 또는 상기 자살유전자 및 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자를 도입함으로써 상기 줄기세포를 제조할 수 있다.

상기 방법에 의하는 경우, 간엽줄기세포 내의 골재생 유도 인자, 예컨대 골 형성 기능을 갖는 단백질의 농도를 현저하게 높일 수 있으며, 이로 인하여 생체 주입 시 우수한 골재생 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 이식 전에 적절한 조건에서 저장될 수 있으며, 예컨대, 줄기세포는 액체 질소 중의 10％ DMSO에 냉동 저장될 수 있으며, 저장 조건 및 방법은 당해 기술분야에 통상적으로 알려진 바에 따를 수 있다.

본 발명의 골 형성용 조성물은 줄기세포를 우수한 효율로 조골세포로 분화시킬 수 있고, 생체 내 이식이 용이하며, 이식된 장소에 거의 고정되어 원하는 위치에서 충분한 골재생 효과를 얻을 수 있으므로, 현저하게 우수한 골 형성 효과를 얻을 수 있으므로, 골다공증성 골절, 골연화증, 골형성 부전증 및 골성장 장애와 같은 골 질환을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 자살유전자를 발현을 통하여 체내에서 치료부위를 제외한 다른 부위로 이동된 줄기세포에 의한 부작용이나 과도한 골 형성 기능을 갖는 단백질의 발현에 의한 부작용 등을 제어할 수 있으므로, 기존 골 질환 치료용 조성물에 비하여 부작용의 치료란 현저하게 상승된 효과를 가지고 있다.

본 발명의 골 형성용 조성물은 골 질환에 대한 세포 대체 요법이나 유전자 치료요법에 이용되거나, 신약개발에 있어 약물효과 검증 또는 각종 연구를 위한 재료로 폭 넓게 이용될 수 있다.

도 1은 제대혈로부터 분리하여 시험관 내(in vitro)에서 배양한 간엽줄기세포(패세지(passage) 6)의 형태를 광학현미경상에서 촬영한 사진이다.
도 2는 제대혈 유래의 간엽줄기세포(패세지(passage) 6)의 면역 표현형 발현 양상을 확인한 그래프이다.
도 3은 골형성 단백질인 BMP-2를 발현하는 아데노바이러스 벡터의 개열지도이다.
도 4은 녹색 형광 단백질인 GFP를 발현하는 아데노바이러스를 50 M.O.I와 500 M.O.I로 간엽줄기세포에 형질 도입시킨 후 도입된 간엽줄기세포에서 발현되는 녹색 형광 단백질을 형광현미경상에서 촬영한 사진이다.
도 5는 6주된 스프라그-다울리(Sprague-Dawley)계 흰쥐 암컷으로부터 골다공증을 유도하여 20주 동안 골 미네랄 밀도(BMD)를 측정한 그래프이다. 상기 그래프에서 OVX는 난소를 절제한(ovariectomized) 실험군을 의미하고, Ca free는 칼슘이 포함되지 않은 사료를 먹인 실험군을 의미하며, Low Ca는 사료에 칼슘이 낮은 농도로 포함된 사료를 먹인 실험군을 의미한다. 상기 그래프에서 가로축은 사육기간을 나타내고, 세로축은 골 미네랄 밀도를 의미한다.
도 6은 6주된 스프라그-다울리(Sprague-Dawley)계 흰쥐 암컷으로부터 골다공증을 유도하여 20주 동안 골 혈액 내 칼슘 농도를 측정한 그래프이다. 상기 그래프에서 OVX는 난소를 절제한(ovariectomized) 실험군을 의미하고, Ca free는 칼슘이 포함되지 않은 사료를 먹인 실험군을 의미하며, Low Ca는 사료에 칼슘이 낮은 농도로 포함된 사료를 먹인 실험군을 의미한다. 상기 그래프에서 가로축은 사육기간을 나타내고, 세로축은 혈중 칼슘 농도를 의미한다.
도 7는 래빗의 경골에서 골결손을 유도한 결함부위를 방사선으로 촬영한 사진이다.
도 8은 누드 마우스의 두개골에서 골결손을 유도한 결함부위의 조직을 촬영한 사진이다.
도 9는 본 발명의 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포(MSC/BMP2) 및 2％(w/v)의 히알루론산이 포함된 골 재생용 조성물을 상온에서 10도의 각으로 유지된 뼈 부위에 적용한 후 10분 동안 유지한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 골다공증성 골절 실험동물의 골절부위에 PBS를 주사한 후, 7일, 21일, 35일, 49일, 63일, 77일 및 91일 뒤 방사선를 통해 골의 재생을 관찰한 사진이다.
도 11은 골다공증성 골절 실험동물의 골절부위에 본 발명의 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포(MSC/BMP2) 및 히알루론산이 포함된 골 재생용 조성물을 주사한 후, 7일, 21일, 35일, 49일, 63일, 77일 및 91일 뒤 방사선를 통해 골의 재생을 관찰한 사진이다.
도 12는 두개골 결함 부위에 본 발명의 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포(MSC/BMP2)와 히알루론산이 포함된 골 재생용 조성물, 히알루론산 용액, 간엽줄기세포 배양액 및 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포(MSC/BMP2)와 퓨라메트릭스가 포함된 골 재생용 조성물을 처리한 후, 6주가 경과된 시점에 상기 두개골 결함 부위를 다시 촬영한 사진이다.
도 13은 두개골 결함 부위에 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포(MSC/BMP2) 및 분자량이 상이한 히알루론산이 포함된 골 재생용 조성물을 처리한 후, 6주가 경과된 시점에 상기 두개골 결함 부위를 다시 촬영한 사진이다.
도 14는 두개골 결함 부위에 본 발명의 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포(MSC/BMP2) 및 함량이 상이한 히알루론산이 포함된 골 재생용 조성물을 처리한 후, 6주가 경과된 시점에 상기 두개골 결함 부위를 다시 촬영한 사진이다.
도 15는 재생된 골 조직을 검사한 것을 나타낸 것이다. 세포를 주사한 후 28일, 91일 뒤 재생된 골 조직의 파라핀 절단부분을 제조하고, 마송 삼색(Masson's trichrome)을 이용한 염색(MT 염색) 및 헤마톡실린 및 에오신을 이용한 염색(H＆E 염색)으로 염색한 결과를 촬영한 사진이다. 상기 도 15의 A 및 B는 MT 염색 결과이고, 도 15의 C 및 D는 H＆E 염색 결과이며, 상기 A 및 C는 28일이 경과한 시점에 촬영한 사진이고, 상기 B 및 D는 91일이 경과한 시점에 촬영한 사진이다. 상기 도 15의 역삼각형 모양의 화살표는 최초 골절부위를 나타낸다.
도 16는 재생된 골 조직의 파라핀 절단부분을 제조하고, 오스테오칼신(osteocalin)에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학염색법으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다. 상기 도 16의 A 및 C는 A 및 C는 이차 항체(2" ab)만으로 반응시킨 후, 촬영한 사진이고, 도 16의 B 및 D 는 오스테오칼신에 대한 항체 및 이차 항체로 반응시킨 후, 촬영한 사진이며, 상기 A 및 B는 28일이 경과한 시점에 촬영한 사진이고, 상기 C 및 D는 91일이 경과한 시점에 촬영한 사진이다. 상기 도 16의 역삼각형 모양의 화살표는 최초 골절부위를 나타낸다.
도 17은 이소성 골 형성 유도 실험동물 모델에 본 발명의 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포와 히알루론산이 포함된 골 재생용 조성물, 히알루론산 용액 및 히알루론산 및 간엽줄기세포 배양액이 포함된 용액으로 처리한 지지체를 삽입한 후, 4주가 경과된 시점에 상기 지지체가 삽입된 부위의 골 조직 파라핀 절단부분을 헤마톡실린 및 에오신을 이용한 염색(H＆E 염색)으로 염색한 결과를 촬영한 사진이다.

발명의 실시를 위한 형태

이하, 실시예에서 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 예들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 간엽줄기세포의 분리, 배양 및 계대 배양

간엽줄기세포의 분리, 배양 및 계대 배양은 제대혈 혹은 골수에서 생산된 것을 사용하였다.

실시예 1-1. 간엽줄기세포의 분리

공여자로부터 동의를 얻어 수득한 제대혈 수득물을 피콜-하이팩 농도구배(Ficoll-Hypaque gradient, 밀도 1.077g/cm³, Sigma 사)로 원심분리하여 단핵구 세포를 수득한 다음, 기본 배양배지(10％ FBS(Gibco 사)가 첨가된 최소 배지 α-MEM (Gibco 사)로 수 차례 세척 후 기본 배양배지에 4X10⁶세포/cm²의 농도로 접종하여 현탁하였다. 이를 37℃의 온도 조건 및 5％ CO₂를 포함하는 습윤한 대기 조건에서 일주일에 두 번씩 배지를 교환해가며 7일 내지 14일 동안 배양하였다. 상기 배양 후 섬유아세포와 유사한 부착력있는 세포가 관찰되었다. 이를 0.25％ 트립신(invitrogen 사)으로 처리하여 세포를 떼어내어 모은 후, 상기 기본 배양배지가 첨가된 최소 배지 α-MEM 배지에 5X10⁴세포/cm²의 농도로 분주하여 계대배양을 반복함으로써 세포수를 증가시켰다.

실시예 1-2. 간엽줄기세포의 배양 및 계대배양

상기 실시예 1-1에서 분리한 간엽줄기세포를 CO₂배양기를 이용하여 37℃를 유지하면서 간엽줄기세포 배지89％(α-MEM(Thermo사) + 1X 안티바이오틱-안티마이코틱(antibiotic-antimycotic, Gibco사) + 10％ FBS(Hyclone사))에서 배양하였다. 2일 간격으로 배지를 교체하면서 세포를 배양하여, 배양용기에 약 80％정도 세포가 차게 되면 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)를 이용하여 세포를 떨어뜨린 후, 상기 배지를 첨가하여 1:20으로 희석한 다음 새로운 배지에서 계대 배양하였다. 세포 중 일부는 10％ DMSO(Sigma사)가 첨가된 배지를 이용하여 동결 보관하였다. 도 1은 인간 골수로부터 분리된 간엽줄기세포(패세지(passage) 6)를 시험관 내에서 3일간 배양한 후 광학현미경상에서 촬영한 사진이고, 도 2는 이들 간엽줄기세포의 면역 표현형 발현 양상을 관찰한 결과이다.

실시예 1-3. 간엽줄기세포의 다분화능 확인

상기 실시예 1-1에서 분리하고, 상기 실시예 1-2에서 배양한 간엽줄기세포의 지방세포, 연골세포 및 뼈세포로의 분화능을 다음과 같이 확인하였다.

1) 지방세포로의 분화

상기 간엽 줄기세포를 상기 간엽 줄기세포 배지를 이용하여 배양용기의 약 80 ％ 정도 세포가 차게 배양한 후, 지방세포 분화유도배지(1 μM 덱사메타손(dexamethasone, Sigma사), 0.5 mM 메틸-이소부틸잔틴(Sigma사), 인슐린(10 ㎍/㎖, Gibco사), 100 nM 인도메타신(indomethacin, Sigma사) 및 10 ％ FBS(Gibco사)를 함유하는 DMEM 배지)에서 48시간 배양하였다. 상기 배양 후, 지방세포 유지배지(10 ㎍/㎖ 인슐린 및 10％ FBS를 함유하는 DMEM 배지)에서 1주일 간 배양하고, 오일 레드 O(oil red O)를 이용하여 염색하였다. 상기 염색에 의해 확인한 결과, 오일 레드 O에 의해 붉게 염색된 지방방울이 세포 내에 생성되는 것을 확인하여, 상기 간엽 줄기세포가 지방세포로 분화되었음을 확인하였다.

2) 연골세포로의 분화

상기 간엽 줄기세포를 상기 간엽 줄기세포 배지를 이용하여 배양용기의 약 80 ％ 정도 세포가 차게 배양한 후, 트립신으로 세포를 분리해 냈다. 상기 원심분리하여 수득한 2 x 10⁵ 세포에 0.5 ㎖의 무혈청 연골세포 분화 유도배지(50㎖ 고-글루코스 DMEM(Gibco사), 0.5 ㎖ 100x ITS(0.5 ㎎/㎖ 소 췌장 유래 인슐린, 0.5 ㎎/㎖ 인간 트랜스페린, 0.5 ㎍/㎖ 소듐 셀레네이트; Sigma사), 50 ㎕ 리놀레산-알부민 (Sigma사), 100 nM 덱사메타손(Sigma사) 및 10 ng/㎖ TGF-β1(Sigma사))를 가한 후 배양하였다. 상기 연골세포 분화 유도배지를 3일 간격으로 교체하면서 3주간 배양한 후, 4 ％ 파라포름알데히드 용액으로 고정하고, 박절기(microtome)로 절편을 만든 다음 알시안 블루(alcian blue) 염색을 실시하였다. 상기 염색을 실시한 결과, 알시안 블루 염색액에 연골세포 밖의 연골기질성분이 파랗게 염색되는 사실과 연골소강(lacuna) 내에 연골세포가 존재하는 것으로부터 간엽 줄기세포가 연골세포로 분화되었음을 확인할 수 있다.

3) 뼈세포로의 분화

간엽 줄기세포를 간엽 줄기세포 배지를 이용하여 배양용기에 배양용기의 약 80 ％ 정도 세포가 차게 배양한 후, 뼈세포 분화유도배지(10 mM β-글리세롤 포스페이트(Sigma사), 0.2 mM 아스코르베이트-2-포스페이트(Sigma사), 10 nM 덱사메타손(Sigma사) 및 10 ％ FBS(Gibco사)를 함유하는 DMEM 배지)에서, 3일 간격으로 배지를 교체하면서 2주간 배양하였다. 배양 후, 세포를 4 ％ 파라포름알데히드 용액으로 고정하고 폰 코사(von Kossa) 및 알칼라인 포스파타제 염색을 실시하였다. 상기 실시한 결과, 세포 내 알칼라인 포스파타제 활성의 증가 및 폰 코사 염색으로 확인되는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 형태의 칼슘이 세포 외부에 축적되는 사실로부터 중간엽 줄기세포가 뼈세포로 분화되었음을 확인할 수 있다.

실시예 2: 아데노바이러스 벡터 제작

실시예 2-1. BMP-2 유전자의 클로닝 및 BMP-2 발현 아데노바이러스 제작

인간 BMP-2 유전자(bone morphogenetic protein 2; 서열번호 1)를 인간 태아 뇌 cDNA(TissueGene Inc., 미국) 및 2개의 프라이머를 사용하는 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 클로닝하였다. 5' 프라이머는 5'-TCCCAGCGTGAAAAGAGAGACTGC-3'(서열변호: 8)이고, 3' 프라이머는 5'-TTTTGCTGTACTAGCGACACCCACAACC-3'(서열번호: 9)이었다.

GC 풍부 PCR 시스템(Roche)을 이용한 PCR이후, CRII-TOPO 벡터에의 클로닝은 TOPO TA 클로닝 키트(invitrogen)를 이용하여 수행되었다. 클로닝된 벡터의 염기서열 분석을 통하여 BMP-2 유전자가 벡터 내에 포함되어 있음을 확인하고, 제한효소를 사용하여 BMP-2유전자만을 잘라 내었다. 잘라낸 BMP-2 유전자와 상기 제한효소로 절단한 recombinant pAd벡터(포항공대, 한국)에 T4 DNA 리가제(Roche 사)를 이용하여 결합시킨 후, 대장균 DH5α(Stratagene, USA)에 형질전환시켜 최종적으로 recombinant pAd벡터에 BMP-2 유전자가 삽입된 recombinant pAD/BMP2벡터를 제작하였다.

또한, 아데노바이러스 시스템에서 BMP-2의 효율적인 발현을 확인하기 아데노바이러스 벡터 제조과정에 골형성 단백질 유전자 대신 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 삽입하여 GFP 아데노바이러스 벡터를 제작하였다. 상기 골형성 단백질(BMP2)이 삽입된 아데노바이러스 벡터의 개열 지도를 도 3에 나타내었다.

상기 벡터 recombinant pAD/BMP2 또는 GFP 아데노바이러스 벡터를 칼슘 포스페이트 침전법(Jordan, Nucleic Acid Research, 24, 596-601(1996))으로 아데노바이러스 포장(packaging) 세포주인 QBI-293A(Qbiogene사) 세포에 형질도입한 후, 배양기에 넣고 37℃의 온도 조건 및 5％ CO₂를 포함하는 습윤한 대기 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 동안 배양한 후, 배양액만을 얻고, 상기 배양액을 0.45 ㎛ 여과막으로 여과하여 BMP-2 아데노바이러스 용액 또는 GFP 아데노바이러스 용액을 얻었다. 상기 아데노바이러스 용액들은 분주하여 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

실시예 2-2. CD 유전자의 클로닝과 BMP-2 및 CD 발현 아데노바이러스 제작

대장균(Escherichia coli) K-12 MG1655(ATCC 700926, 한국생명공학연구원)로부터 DNA를 분리한 후, 프라이머 CD-F(5'-GAATTCAGGCTAGCAATGTCTCGAATAACGCTTTACAAA C-3'; 서열번호: 10) 및 CD-R(5'-GGATTCTCTAGCTGGCAGACAGCCGC-3'; 서열번호: 11)을 이용하여, 94℃ 5분; 94℃ 30, 60℃ 40초, 72℃ 1분, 27사이클; 72℃ 7분의 조건으로 PCR을 수행하였다.

상기 PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터 클로닝 키트(Promega사)를 이용하여 클로닝한 후, X-gal IPTG를 이용하여 청백색 콜로니(blue-white colony) 선별을 통해 CD유전자가 들어간 pGEM-CD벡터를 제작하였다. 제작된 pGEM-CD벡터는 서열번호: 12의 서열(5'-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3')을 갖는 프라이머 및 서열번호: 13의 서열(5'-ACCGGGAAACACCTATTGTG-3')을 갖는 프라이머를 이용하여 서열분석한 결과, 자살유전자인 CD를 포함하는 것을 확인하였다.

상기 pGEM-CD 플라스미드와 pcDNA3.1(Clontech사)을 각각 EcoRI(BM사) 및 NotI(BM사) 제한효소로 자르고, 플라스미드 pGEM-CD로부터 분리된 CD 유전자와 절단된 플라스미드 pcDNA3.1를 T4 DNA 연결효소(ligase, BM사)로 연결한 후 이를 이용하여 컴피턴트(competent) 세포인 대장균 DH5α를 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 앰피실린이 포함된 LB 플레이트에서 배양, 선별하여 플라스미드 pcDNA3.1-CD를 얻었다.

상기 플라스미드를 BamH I(BM사) 제한효소로 자르고, 상기 실시예 2-1에서 제조한 BMP2가 삽입된 아데노바이러스를 생산할 수 있는 아데노바이러스 벡터인 recombinant pAD/BMP2(Qbiogene사)를 BglII로 자른 후, T4 DNA 연결효소로 연결하여 벡터 recombinant pAD/BMP2-CD를 제작하였다. 벡터 recombinant pAD/BMP2-CD를 서열분석한 결과, 서열번호 3의 서열을 갖는 자살유전자인 CD(gi:298594)와 일치하는 서열을 포함하는 것을 확인하였다.

상기 벡터 recombinant pAD/BMP2-CD를 칼슘 포스페이트 침전법(Jordan, Nucleic Acid Research, 24, 596-601(1996))으로 아데노바이러스 포장(packaging) 세포주인 QBI-293A(Qbiogene사) 세포에 형질도입한 후, 배양기에 넣고 37℃의 온도 조건 및 5％ CO₂를 포함하는 습윤한 대기 조건에서 배양하였다. 48시간 동안 배양한 후, 배양액만을 얻고, 상기 배양액을 0.45 ㎛ 여과막으로 여과하여 아데노바이러스 용액을 얻었다. 상기 아데노바이러스 용액들은 분주하여 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

실시예 3: 간엽줄기세포로 외래 유전자의 도입

실시예 3-1. 간엽 줄기세포로 BMP-2의 도입

상기 실시예 1-1에서 분리하고, 상기 실시예 1-2에서 배양한 간엽줄기세포(MSC)를 100 mm 배양용기에 70％ 정도 차도록 배양한 후, 상기 실시예 2-1에서 얻은 BMP2 아데노바이러스 용액 또는 또는 2X10¹⁰pfu/ml의 역가를 갖는 GFP 아데노바이러스 용액을 5ml 인컴플리트 배지(99％ α-MEM(Thermo사) 및 1X 안티바이오틱-안티마이코틱(antibiotic-antimycotic, Gibco사))에 50 M.O.I(Multiplicity of infection) 및 500 M.O.I이 되도록 희석하여 첨가하였다. 상기 recombinant pAD/BMP2 벡터 아데노바이러스 용액 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 아데노바이러스 용액을 첨가하고 2시간 동안 세포에 처리한 후, 5ml의 배양 배지(89％ α-MEM(Thermo사), 1X 안티바이오틱-안티마이코틱(antibiotic-antimycotic, Gibco사) 및 10％ FBS(Hyclone사))를 첨가하였다.

상기 형질감염 여부를 확인하기 위하여, GFP의 발현 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 GFP 아데노바이러스 용액을 50 M.O.I와 500 M.O.I로 1X10⁶세포의 간엽줄기세포에 형질감염 시킨 후, 상기 형질감염된 간엽줄기세포를 48시간 배양하였다. 상기 배양 후, 배양배지 내에 간엽줄기세포에서 발현된 GFP를 형광현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 GFP 아데노바이러스 용액의 농도가 높을수록 강한 형광이 확인되어, 상기 형질감염된 간엽줄기세포는 GFP를 정상적으로 발현할 수 있는 것이 확인되었다.

또한, 상기 BMP2의 형질감염 여부를 확인하기 위하여, BMP의 발현 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 BMP2 아데노바이러스 용액을 500 M.O.I의 농도로 1X10⁶세포의 간엽줄기세포에 형질감염 시킨 후, 상기 형질감염된 간엽줄기세포를 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 배양배지 내에 간엽줄기세포에서 발현된 BMP2 양을 효소매개면역반응분석법(ELISA)으로 측정하였다. 상기 측정된 BMP2양은 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 BMP2 아데노바이러스 용액을 이용하여 형질전환시킨 간엽줄기세포의 배양액에서 충분한 양의 BMP2가 검출되어, 상기 형질감염된 간엽줄기세포는 BMP2를 정상적으로 발현할 수 있는 것이 확인되었다.

실시예 3-2. 간엽 줄기세포로 BMP-2 및 CD의 도입

상기 실시예 1-1에서 분리하고, 상기 실시예 1-2에서 배양한 간엽줄기세포(MSC)를 100 mm 배양용기에 70％ 정도 차도록 배양한 후, 상기 실시예 2-2에서 얻은 recombinant pAD/BMP2-CD 아데노바이러스 용액을 5ml 인컴플리트 배지(99％ α-MEM(Thermo사) 및 1X 안티바이오틱-안티마이코틱(antibiotic-antimycotic, Gibco사))에 50 M.O.I 되도록 희석하여 첨가하였다. 상기 recombinant pAD/BMP2-CD 아데노바이러스 용액을 첨가하고 2시간 동안 세포에 처리한 후, 5ml의 배양 배지(89％ α-MEM(Thermo사), 1X 안티바이오틱-안티마이코틱(antibiotic-antimycotic, Gibco사) 및 10％ FBS(Hyclone사))를 첨가하였다. 상기 배양 배지를 첨가한 후, 이틀 동안 CO₂ 배양기 (CO₂water Jacketed Incubator, ThermoForma ScientificTM)에서 배양하여 BMP2와 CD 자살유전자를 발현할 수 있는 세포주 MSC/BMP2-CD를 제작하였다.

실시예 4: CD가 도입된 간엽줄기세포의 효과 확인

실시예 4-1. MSC/BMP2-CD에서 전구약물에 의한 세포 독성 평가

6-웰 플레이트에 웰 당 5,000 개의 상기 실시예 3-2에서 제조된 MSC/BMP2-CD를 넣고 배양한 후, 다음날부터 5-FU의 전구 약물인 5-FC(Sigma사)를 0 내지 10,000 μM 농도로 2일 마다 배지를 교환하면서 2주간 처리한 후 MTT 분석을 수행하였다. 상기 MTT분석을 수행한 결과, 5-FC의 농도가 증가함에 따라 세포의 사멸률이 증가함이 확인되었다.

실시예 4-2. CD 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포에서 주변인 효과의 확인

6-웰 플레이트에 웰 당 10,000 개의 상기 실시예 1-1에서 분리하고, 상기 실시예 1-2에서 배양한 간엽줄기세포(MSC) 또는 상기 실시예 3-2에서 제조된 MSC/BMP2-CD를 넣고 C6/LacZ 신경교종 세포를 3,000개를 가한 후, 24시간 동안 배양하였다. 다음날부터 상기 5-FC를 0 내지 1,000 Mm의 농도로 2일 마다 배지를 교환하면서 2주간 처리한 후, X-gal 염색과 베타-갈락토시데이즈 분석을 수행하였다.

상기 수행 결과에 의하면, 1000 μM 5-FC로 처리한 결과, MSC/CD 세포가 함께 들어 있는 웰에서 C6/LacZ 세포가 사멸한 것이 확인되었다. 또한, MSC 세포와 C6/LacZ 세포가 함께 들어 있는 웰(MSC)에서는 5-FC의 농도가 증가하더라도 베타-갈락토시데이즈의 활성이 거의 변하지 않는 반면에, MSC/BMP2-CD 세포와 C6/LacZ 세포가 함께 들어 있는 웰(MSC/CD)에서는 5-FC의 농도가 증가함에 따라 베타-갈락토시데이즈의 활성이 감소하므로 C6/LacZ 세포의 사멸율이 증가함이 확인되었다. 또한, MSC/BMP2-CD세포와 C6/LacZ 세포가 함께 들어 있는 웰(MSC/CD)에서 5-FC의 농도 증가에 따라 세포의 사멸률이 높아짐이 확인되었다. 상기한 결과로부터, CD가 도입된 간엽줄기세포에서만 주변인 효과가 나타남을 확인할 수 있었다.

실시예 5; 골다공증성 골절 래트, 골결손 래빗 및 골결손 마우스 모델

실시예 5-1. 암컷 흰쥐(rat)로부터 골다공증 유도

6주된 스프라그-다울리(Sprague-Dawley)계 암컷 래트(오리엔트 바이오㈜, 대한민국)를 이용하여 하기의 방법으로 골다공증을 유도하였다.

먼저, 럼푼(lumpun, 3.5mg/kg 체중)과 케타민 하이드로클로라이드 (ketamin hydrochloride, 20mg/kg 체중)을 복강에 주입하여 흰쥐를 마취시킨 후, 복강 부위의 털을 깎은 다음 포비돈요오드(betadine)로 소독하고, 복강을 절개하여 양쪽 난소를 제거하였다. 양쪽 난소가 제거된 흰쥐를 칼슘과 인이 제거된 AIN-76a 사료(피드랩㈜, 대한민국)을 이용하여 계속적으로 사육하였다. 골다공증을 유도한 후 2주 간격으로 20주까지 BMD(bone mineral density)와 혈액으로부터 칼슘 농도를 측정하여 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.

실시예 5-2. 골다공증이 유도된 흰쥐에서 골절 유도

상기 실시예 5-1에서 양쪽 난소를 제거한 흰쥐를 칼슘과 인이 제거된 AIN-76a 사료로 사육하였다. 상기 칼슘과 인이 제거된 AIN-76a 사료로 사육한지 5주가 경과한 후 골절을 유도하였다.

먼저, 럼푼(lumpun, 3.5mg/kg 체중)과 케타민 하이드로클로라이드 (ketamin hydrochloride, 20mg/kg 체중)을 복강에 주입하여 상기 칼슘과 인이 제거된 AIN-76a 사료로 사육한 암컷 흰쥐를 마취시킨 후, 오른쪽 경골 부위의 털을 깎은 다음 포비돈요오드(betadine)로 소독하였다. 상기 소독한 오른쪽 경골 부위를 절개한 후, 골절 유도 기계를 이용하여 상기 오른쪽 경골의 골절을 유도하였다. 상기 경골의 골절이 유도된 흰쥐는BMP-2 유전자가 도입된 간엽줄기세포 및 히알루론산을 포함하는 골 재생용 조성물의 효과를 확인하기 위한 생체 내 실험에 사용하였다.

실시예 5-3. 토끼(rabbit)에서 골결손 유도

중량이 3.0 내지 3.5kg인 뉴질랜드 흰색 토끼(현대바이오, 대한민국)을 연구용으로 선별하여 골결손을 유도하였다.

먼저, 럼푼(lumpun, 3.5mg/kg 체중)과 케타민 하이드로클로라이드 (ketamin hydrochloride, 20mg/kg 체중)을 근육으로 주입하여 흰색 토끼를 마취시킨 후, 경골 부위의 털을 깎은 다음 절개할 부위를 포비돈요오드(betadine)로 소독하였다. 상기 소독한 경골 부위를 절개하여, 경골을 노출시킨 후, 정형술 외과 기기를 사용하여 상기 경골부위에 결함(넓이 0.5cm및 높이 1.5cm)을 만들었다. 상기 결함부위를 방사선(X-ray)으로 촬영한 결과를 도 7에 나타내었다.

실시예 5-4. 누드 마우스 두개골에서 골결손 유도

6주된 발비시(BALB/c/nu)계 누드 마우스 수컷(성균관대 실험동물센터, 대한민국)을 이용하여 다음과 같은 두개골결손을 유도하였다.

먼저, 럼푼(lumpun, 3.5mg/kg 체중)과 케타민 하이드로클로라이드 (ketamin hydrochloride, 20mg/kg 체중)을 복강에 주입하여 누드 마우스를 마취시킨 후, 마우스가 움직이지 못하도록 틀(stereotaxic frame)에 귀와 입을 고정시켰다. 절개할 부위를 포비돈요오드(betadine)로 소독하고, 정수리 부분 1cm정도를 수직으로 절개하여 두개골(skull)을 노출시켰다. 상기 노출된 두개골에 트레판 버(Trephan Burr)를 사용하여 결함(지름 4mm)을 만들었다. 상기 두개골에 결함이 생긴 마우스를 안락사 시킨 후 결함부위의 조직을 채취하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

실시예 5-5. 흰쥐 두개골에서 골결손 유도

6주된 스프라그-다울리(Sprague-Dawley)계 수컷 흰쥐(서울대학교 실험동물센터, 대한민국)을 이용하여 다음과 같은 두개골결손을 유도하였다.

먼저, 럼푼(lumpun, 3.5mg/kg 체중)과 케타민 하이드로클로라이드 (ketamin hydrochloride, 20mg/kg 체중)을 복강에 주입하여 흰쥐를 마취시킨 후, 휜쥐가 움직이지 못하도록 틀(stereotaxic frame)에 귀와 입을 고정시켰다. 절개할 부위를 포비돈요오드(betadine)로 소독하고, 정수리 부분 2cm정도를 수직으로 절개하여 두개골(skull)을 노출시켰다. 상기 노출된 두개골에 트레판 버(Trephan Burr)를 사용하여 결함(지름 8mm)을 만들었다. 상기 두개골이 결손된 흰쥐는BMP-2 유전자가 도입된 간엽줄기세포 및 히알루론산을 포함하는 골 재생용 조성물의 효과를 확인하기 위한 생체 내 실험에 사용하였다.

실시예 5-6. 이소성 골 형성 유도

6주된 발비시(BALB/c/nu)계 누드 마우스 수컷(인하대 실험동물센터, 대한민국)을 이용하여 다음과 같이 이소성 골 형성을 유도하였다.

먼저, 럼푼(lumpun, 3.5mg/kg 체중)과 케타민 하이드로클로라이드 (ketamin hydrochloride, 20mg/kg 체중)을 복강에 주입하여 누드 마우스를 마취시킨 후, 누드 마우스 등쪽 절개할 부위를 포비돈요오드(betadine)로 소독하였다. 상기 소독한 등쪽 부분 1cm정도를 절개하였다. 상기 등쪽 부분의 피부가 절개된 마우스는 BMP-2 유전자가 도입된 간엽줄기세포 및 히알루론산을 포함하는 골 재생용 조성물의 효과를 확인하기 위한 생체 내 실험에 사용하였다.

실시예 6: BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포의 생체내( in vivo )에서 골 재생 유도의 확인

실시예 6-1. 골 재생용 조성물의 제조

상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 50 ㎕당 1 x 10⁵내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석하였다. 본 발명의 젤 타입의 골 재생용 조성물을 제조하기 위하여, 상기 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포 희석액에 히알루론산 또는 퓨라메트릭스(Puramatrix)를 첨가하였다. 상기 간엽줄기세포 희석액에 히알루론산 또는 퓨라메트릭스(Puramatrix)를 첨가하여 제조된 골 재생용 조성물은 단독 또는 지지체와 함께 실험동물에 생체이식되었다.

상기 히알루론산은 세포의 안정화와 성장을 위하여 첨가되었고, 이 때 사용된 히알루론산은 평균분자량(중량평균 분자량)이 50,000 Da(코오롱생명과학㈜ 제조)인 것, 평균분자량이 110,000 Da(코오롱생명과학㈜ 제조 lot 번호PFL-1612E 사용)인 것, 평균분자량이 300,000 Da(코오롱생명과학㈜ 제조)인 것 및 평균분자량이 1,220,000 Da(코오롱생명과학㈜ 제조 lot 번호P-0307DE 사용)인 것을 사용하였다. 상기 히알루론산은 3차 증류수에 각각 0.1％(w/v), 1％(w/v), 2％(w/v), 4％(w/v) 및 6％(w/v)의 농도로 첨가한 히알루론산 용액 형태로 제조하여 사용하였다. 상기 히알루론산의 투여량은 전체 골 재생용 조성물 전체 부피를 기준으로 첨가된 히알루론산의 함량 단위로 표시하였고, 상기 히알루론산의 투여량은 0.05 ％(w/v), 0.5％(w/v), 1％(w/v), 2％(w/v), 3％(w/v), 4％(w/v) 및 5 ％(w/v)의 함량으로 사용하였다.

또한, 상기 퓨라메트릭스는 임상으로 사용가능한 하이드로겔(hydrogel)로, 구체적으로 세포의 인테그린(integrin) 결합 부위(binding site)의 서열인 RGD(arginine-glycine-aspartate)와 유사한 서열인 RAD(arginine-alanine-aspartate)가 반복되는 서열을 갖는 16개의 아미노산(can-RADARADARADARADA-CNH2)으로 구성된 합성 펩타이드 1％(w/v)와 99％ 물로 구성된 하이드로겔(3DM inc, 일본)이다. 상기 퓨라메트릭스의 투여량은 전체 골 재생용 조성물을 기준으로 0.5％(w/v) 사용하였다.

실시예 6-2. 조성물의 성상 확인

상기 골 재생용 조성물에 대하여 히알루론산의 첨가는 4℃ 내지 50℃에서 젤 상태를 유지하기 위함이다. 따라서, 상기 골 재생용 조성물에 첨가될 수 있는 히알루론산의 종류를 확인하기 위하여, 상기 히알루론상의 종류 및 첨가량에 따른 골 재생용 조성물의 점도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 골 재생용 조성물의 제조는 상기 실시예 6-1에서 준비된 각 농도의 히알루론산 용액과 상기 실시예 6-1에서 50㎕당 1 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하도록 PBS로 희석한 간엽줄기세포 희석액을 동량으로 혼합하여 제조하였다.

상기 점도의 측정은 Brookfield DV-II+Pro (LV) Viscometer를 이용하여 상온의 온도조건 및 12rpm 회전속도조건에서 64번 spindle로 확인하였다. 하기 표 2에서 'ND'란 점도 값이 측정되지 않은 경우, 즉 해당 점도가 측정범위 보다 높은 것을 의미한다.

상기 표 2에서 확인된 바와 같이, 평균 분자량이 110,000 Da 의 히알루론산을 이용한 경우, 상기 히알루론산의 함량이 0.5％(w/v) 내지 2％(w/v)인 경우 상기 조성물이 젤 상태를 유지하는 것으로 확인되었고, 상기 결과의 해석 상 0.05％(w/v) 내지 3％(w/v)의 범위에서도 젤 상태를 유지할 수 있을 것으로 예상되었다. 그러나, 평균분자량 1,220,000 Da 인 경우에는 히알루론산의 함량이 0.5％(w/v) 이상인 경우에 상기 조성물의 점성이 너무 높아 젤 상태를 유지하지 못하거나, 젤 상태를 유지하는 경우에도 너무 높은 점성으로 인하여 상기 조성물의 생체 내 투여가 용이하지 아니할 것으로 판단되었다.

따라서, 상기 조성물에 사용되기 위한 최적의 히알루론산을 확인하기 위한 이후의 실험에서는 상기 평균 분자량이 50,000 Da, 110,000 Da 및 300,000 Da 인 것을 사용하였다.

또한, 상기 표 2에서 바람직한 것으로 확인된 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 2％(w/v) 포함하고 있는 상기 조성물을 상온에서 10도의 각으로 유지된 뼈 부위에 적용한 후, 10분 동안 상기 조성물이 이식된 위치에서 고정될 수 있는지 여부를 확인하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다

상기 도 9에 나타난 바와 같이, 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 2％(w/v) 포함하고 있는 상기 조성물은 상온에서 10분이 경과한 후에도 최초 이식된 뼈 부위에 고정되고 흘러내리지 않음이 확인되었다. 상기 결과로부터, 상기 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 사용하는 경우 이식의 용이성이란 목적과 이식 후 위치의 고정이란 두 가지 목적을 모두 달성할 수 있다는 것이 확인되었다.

실시예 6-3. 히알루론산 최적 조건의 확인

상기 실시예 6-1에서 제조한 골 재생용 조성물에 사용될 히알루론산의 종류(평균 분자량) 및 함량을 특정하기 위하여, 상기 실시예 6-2의 결과를 기초로, 평균 분자량이 50,000 Da, 110,000 Da 및 300,000 Da인 히알루론산에 대한 실험을 수행하였다.

우선, 상기 히알루론산을 각각 1％(w/v)의 함량으로 포함하는 상기 골 재생용 조성물을 지지체와 함께 상온에서 20분 동안 방치한 후, 2일 및 7일 동안 배양하였다. 상기 지지체는 지름 1 내지 3 mm의 미립 입자(granule) 타입의 베타-트리칼슘포스페이트(β-ricalcium phosphate, β-TCP, 경원메디칼㈜, 대한민국)을 사용하다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 10㎕당 1 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석한 희석액 10 ㎕ 및 상기 실시예 6-1의 히알루론산 용액 10㎕를 혼합한 후, 상기 지지체 0.03g과 혼합하여 상온에서 20분 동안 방치하여, 지지체에 세포가 부착되도록 하였다. 상기 20분간 방치 후, 배양 배지((89％ α-MEM(Thermo사), 1X 안티바이오틱-안티마이코틱(antibiotic-antimycotic, Gibco사) 및 10％ FBS(Hyclone사))를 2일 간격으로 교환하여 주면서, CO₂ 배양기(ThermoForma Scientific^TM)를 이용하여, 37℃의 온도 조건 및 5％ CO₂를 포함하는 습윤한 대기에서 7일 동안 배양하였다. 상기 배양기간 동안 2일 및 7일이 경과한 시점에, MTT 시약을 이용하여 발색한 후, 전자현미경으로 세포수를 측정하였다.

상기 측정된 결과는 히알루론산을 첨가하지 않고 상온에서 20분 방치하였을 때 측정된 실험군의 세포 수를 기준으로 하여 세포 증식율을 계산하였고, 계산 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 세포 증식율을 측정한 결과, 무첨가 군에 비하여 히알루론산 첨가군이 현저하게 우수한 효과를 가질 수 있음이 확인되었고, 상기 히알루론산 첨가군에서는 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 사용하는 경우에 세포 증식이 현저하게 높은 증식율을 나타내는 것으로 확인되었다.

상기 실시예 6-2의 표 2의 결과 및 상기 표 3의 결과를 바탕으로 히알루론산 최적 첨가 함량에 대한 실험을 수행하였다.

상기 표 3의 결과에서 가장 바람직한 것으로 확인된 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 전체 골 재생용 조성물 전체 부피를 기준으로 0.05 ％(w/v), 0.5％(w/v), 1％(w/v) 및 3％(w/v)의 함량으로 포함하는 골 재생용 조성물을 이용하여 상기와 같은 방법으로 지지체와 함께 세포 증식율을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 세포 증식율을 측정한 결과, 무첨가 군에 비하여 히알루론산 첨가군이 현저하게 우수한 효과를 가질 수 있음이 확인되었고, 상기 히알루론산 첨가군에서는 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 0.5％(w/v) 사용하는 것이 가장 높은 증식율을 나타내는 것으로 확인되었다. 상기 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 0.05％(w/v) 사용하는 경우에는 세포 증식율의 관점에서는 우수한 효과를 나타냈으나, 실시예 6-2에서 확인된 바와 같이 상기 조성물의 점도가 낮은 문제점이 지적되었고, 상기 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 3％(w/v) 사용하는 경우에는 세포 증식율이 낮은 문제가 지적되었다.

실시예 6-4. 간엽줄기세포의 생체이식(transplantation)

실시예 5-1에 의해 준비된 골다공증이 유도된 흰쥐(rat)의 오른쪽 경골에 대하여 골절 유도 기계를 이용하여 실시예 5-2의 방법으로 골절을 유도하였다. 골절을 유도한 후, 절개된 피부를 봉합하고 2일 후에 씨-암(C-arm)장비를 이용하여 골절부위를 확인하면서 상기 실시예 6-3에서 효과가 가장 우수한 것으로 확인된 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산이 0.5％(w/v) 포함된 히알루론산 용액 50 ㎕ 및 상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 50㎕당 1 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석한 희석액 50 ㎕를 포함하는 상기 골 재생용 조성물 100 ㎕을 골절부위에 주사하였다. 대조군으로 PBS를 동일한 양으로 주사하였다. 상기 골 재생용 조성물과 PBS를 주사한 실험동물은 2주 간격으로 방사선으로 통해 골절부위를 관찰하였으며, 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

상기 도 10 및 도 11에서 확인된 바와 같이, BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포(MSC/BMP2) 및 히알루론산이 포함된 본 발명의 골 재생용 조성물을 주사한 경우, 현저하게 우수한 골 재생 효과가 확인되어, 본 발명의 골 재생용 조성물은 세포치료용으로 효과적임을 확인할 수 있다.

실시예 6-5. 실험동물을 이용한 골 재생 효과 확인

상기 실시예 6-3에서 세포 증식율에 관한 실험으로 효과를 확인한 히알루론산에 대해 골 재생 효과와 관련된 실험을 상기 실시예 5-5에서 제작된 흰쥐 두개골 결손 모델을 이용하여 수행하였다.

우선, 상기 실시예 5-5의 방법으로 두개골 결함을 만든 실험동물의 결함 부위에 상기 실시예 6-3에서 세포 증식율에 관한 실험으로 효과를 확인한 히알루론산의 평균 분자량 및 함량을 달리한 히알루론산과 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포(MSC/BMP2) 희석액를 포함하는 상기 골 재생용 조성물을 떨어트리는 방식(drop)으로 처리한 후, 절개된 피부를 봉합하였다. 비교군으로 상기 실시예 6-1의 퓨라메트릭스 용액을 사용하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 6-1에서 제작된 상기 실시예 6-3에서 효과가 가장 우수한 것으로 확인된 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산이 0.5％(w/v) 포함된 히알루론산 용액 10 ㎕ 및 상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 10㎕당 1 x 10⁵내지 5 x 10⁵세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석한 희석액 10 ㎕를 포함하는 상기 골 재생용 조성물 20 ㎕를 결함부위에 처리(drop)하고, 10분 동안 방치한 후, 절개된 피부를 봉합하였다.

본 발명의 골 재생용 조성물의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험동물에 상기 본 발명의 골 재생용 조성물 대신 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산이 0.5％(w/v) 포함된 히알루론산 용액 20 ㎕, 상기 실시예 1-2에서 계대 배양한 20㎕당 1 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하는 간엽줄기세포 배양액 20 ㎕ 및 상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 10㎕당 1 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석한 희석액 10 ㎕와 상기 퓨라메트릭스가 0.5％(w/v) 포함된 퓨라메트릭스 용액 10 ㎕이 포함된 조성물 20 ㎕를 상기와 같은 방법으로 처리하였다.

상기 처리하고 6주가 경과한 후, 상기 각각의 실험동물의 봉합된 결손 부위의 피부를 다시 절개하여, 상기 결손 부위를 관찰하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 히알루론산을 단독으로 처리한 경우에는 거의 골 재생 효과가 없는 것으로 확인되었다. 또한, 히알루론산과 간엽줄기세포를 처리한 경우에 미세한 골 재생 효과가 확인되었다. 상기한 결과로부터 히알루론산 자체 또는 간엽줄기세포와 히알루론산을 함께 처리하는 것만으로는 골 재생 효과가 뛰어나지 않아, 치료 효과를 기대할 수 없는 것으로 평가되었다. 한편, BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포와 퓨라메트릭스를 동일한 함량으로 사용한 경우에도 그 치료 효과가 미비하여, BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포를 포함한 조성물을 단순히 젤 상태로 제조하는 것만으로는 골 재생 효과를 거둘 수 없는 것으로 확인되었다.

상기 결과와 비교하여, 본 발명의 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포와 히알루론산을 함께 사용한 조성물의 경우에는 골 결손 부위인 8mm의 두개골 결함 부위 전부가 다시 재생될 정도로 상기 결과와 비교하여 현저하게 우수한 골 재생 효과가 확인되었다. 상기 결과로부터, 실험동물을 이용한 생체내(in vivo)에서도 본 발명의 골 재생용 조성물의 골 재생과 관련된 현저하게 우수한 효과가 확인되어, 본 발명의 골 재생용 조성물은 세포치료용으로 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.

또한, 히알루론산의 평균 분자량에 따른 생체내(in vivo) 실험에서 골 재생 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 6-1에서 제작된 평균 분자량이 50,000 Da, 110,000 Da 및 300,000 Da인 히알루론산이 0.5％(w/v) 포함된 히알루론산 용액 10 ㎕ 및 상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 10㎕당 1 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석한 희석액 10 ㎕ 포함하는 상기 골 재생용 조성물 20 ㎕을 상기와 같은 방법으로 결함부위에 처리(drop)하고, 10분 동안 방치한 후, 절개된 피부를 봉합하였다.

상기 처리하고 6주가 경과한 후, 상기 각각의 실험동물의 봉합된 결손 부위의 피부를 다시 절개하여, 상기 결손 부위를 관찰하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

상기 도 13에 나타낸 바와 같이, BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포를 단독으로 처리한 경우에 비하여, 히알루론산을 함께 처리한 경우에는 골 재생 효과가 우수한 것으로 확인되었다.

구체적으로, 평균 분자량이 50,000 Da인 히알루론산을 사용한 경우에는 실시예 6-3에서 확인한 시험관(in vitro) 실험에서의 세포 배양 결과가 유사한 평균 분자량이 300,000 Da인 히알루론산을 사용한 경우에 비하여 골 재생 효과가 낮게 나타났으며, 이러한 결과로부터 상기 히알루론산의 최적 범위와 관련하여, 세포 배양 결과와 함께 전제 조성물의 점도도 골 재생 효과에 영향을 미칠 것으로 예상되었다.

또한, 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 사용한 조성물의 경우에는 실시예 6-3에서 확인한 시험관(in vitro) 실험에서의 세포 배양 결과에서도 우수한 것으로 확인되었고, 실험동물을 이용한 생체내(in vivo) 실험에서도 전체 골 결손 부위의 50％ 이하 정도만 골 재생이 된 평균 분자량이 다른 히알루론산과 비교하여, 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산을 사용한 조성물의 경우 골 결손 부위인 8mm의 두개골 결함 부위 전부가 재생될 정도로 현저하게 우수한 골 재생 효과가 확인되었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 골 재생용 조성물의 히알루론산의 최적 분자량은 평균 분자량이 110,000 Da인 것으로 확인되었다.

또한, 히알루론산의 함량에 따른 생체내(in vivo)에서 골 재생 효과를 확인하기 위하여, 상기에서 최적 조건으로 확인된 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산이 0.05％(w/v), 0.5％(w/v) 및 1％(w/v) 포함된 히알루론산 용액 10 ㎕ 및 상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 10㎕당 1 x 10⁵내지 5 x 10⁵세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석한 희석액 10 ㎕를 포함하는 상기 골 재생용 조성물 20 ㎕를 상기와 같은 방법으로 결함부위에 처리(drop)하고, 10분 동안 방치한 후, 절개된 피부를 봉합하였다.

상기 처리하고 6주가 경과한 후, 상기 각각의 실험동물의 봉합된 결손 부위의 피부를 다시 절개하여, 상기 결손 부위를 관찰하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.

상기 도 14에 나타낸 바와 같이, BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포를 단독으로 처리한 경우에 비하여, 히알루론산을 함께 처리한 경우에는 골 재생 효과가 우수한 것으로 확인되었다.

또한, 상기 히알루론산은 0.05％ 포함된 경우 또는 1％ 포함된 경우에도 골 재생 효과가 우수한 것으로 확인되었고, 상기 히알루론산이 0.05％ 포함된 경우에는 실시예 6-3에서 확인한 시험관(in vitro) 실험에서의 세포 배양 결과가 유사한 상기 히알루론산이 1％ 포함된 경우에 비하여 골 재생 효과가 낮게 나타났으며, 이러한 결과로부터 상기 히알루론산의 최적 범위와 관련하여, 세포 배양 결과와 함께 전제 조성물의 점도도 골 재생 효과에 영향을 미칠 것으로 예상되었다.

또한, 상기 히알루론산은 0.5％ 포함된 조성물의 경우에는 실시예 6-3에서 확인한 시험관(in vitro) 실험에서의 세포 배양 결과에서도 우수한 것으로 확인되었고, 실험동물을 이용한 생체내(in vivo) 실험에서도 전체 골 결손 부위의 50％ 이하 정도만 골 재생이 된 다른 함량으로 히알루론산을 포함하는 조성물과 비교하여, 상기 히알루론산은 0.5％ 포함된 조성물의 경우 골 결손 부위인 8mm의 두개골 결함 부위 전부가 거의 재생될 정도로 현저하게 우수한 골 재생 효과가 확인되었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 골 재생용 조성물의 히알루론산의 최적 함량은 전체 조성물의 부피를 기준으로 0.5％(w/v)인 것으로 확인되었다.

실시예 6-6. 지지체(scaffold)와 이식용 간엽줄기세포의 혼합 및 생체 이식

상기 실시예 6-1에서 제조된 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포(MSC/BMP2) 희석액 및 상기 실시예 6-1에서 제조된 히알루론산이 포함된 골 재생용 조성물이 골결손부위에서 보다 효과적으로 골 재생을 할 수 있도록, 상기 골 재생용 조성물과 함께 지지체(scaffold)를 사용하였다. 상기 지지체는 지름 1 내지 3 mm의 미립 입자(granule) 타입의 베타-트리칼슘포스페이트(β-tricalcium phosphate, β-TCP, 경원메디칼㈜, 대한민국)를 사용하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 200㎕당 1 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석한 희석액 200 ㎕ 및 상기 실시예 6-1의 히알루론산 용액 200㎕를 혼합한 본 발명의 조성물 200 ㎕ 과 상기 지지체 1g를 혼합하고, 상온에서 20분 동안 방치하여 상기 지지체에 상기 간엽줄기세포가 부착되도록 하였다.

상기 간엽줄기세포를 부착시킨 지지체의 생체 내 이식은 실시예 5-3에 따라 준비하였다. 먼저 럼푼(lumpun, 3.5mg/kg 체중)과 케타민 하이드로클로라이드(ketamin hydrochloride, 20mg/kg 체중)을 근육으로 주입하여 토끼를 마취시킨 후, 경골 부위의 털을 깎은 다음 절개할 부위를 포비돈요오드(betadine)로 소독하였다. 상기 소독한 경골 부위를 절개하여, 경골을 노출시킨 후, 정형술 외과 기기를 사용하여 상기 경골부위에 결함(넓이 0.5cm및 높이 1.5cm)을 만들었다. 상기 결함부위에 간엽줄기세포를 부착시킨 지지체 1g을 삽입한 후 절개된 피부를 봉합하였다.

상기 봉합 후, 6주가 경과한 시점에서 상기 지지체가 삽입된 부위에 접합하여 있고, 골 재생 효과가 있음이 확인되었다. 상기 결과로부터 상기 베타-트리칼슘포스페이트으로 제조된 지지체를 사용할 수 있음이 확인되었다.

실시예 6-7. 조직절편 제작

상기 방사선으로 통해 골절부위를 관찰하여 골 재생 효과가 뛰어난 것을 확인한 실시예 6-4의 실험동물(rat)의 골 조직의 변화를 통하여 골 재생 효과를 확인하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 6-4의 실험동물을 골 재생용 조성물을 생체이식 후 28일 및 91일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후, 오른쪽 경골을 10％ 포르말린용액에 2일 동안 고정시키고 7％ 질산에 4일 동안 탈회를 시켰다. 상기 탈회된 경골을 파라핀 블록으로 만들고, 상기 블록을 3㎛ 두께로 잘라 절편을 제조하였다. 상기 절편을 마송 삼색(Masson's trichrome)을 이용한 염색(MT 염색) 및 헤마톡실린 및 에오신을 이용한 염색(H＆E 염색)으로 염색한 후, 전자현민경을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

상기 도 15에 나타낸 바와 같이, 28일이 경과된 시점에 비하여, 91일이 경과된 시점에 희생시킨 실험동물의 경골 조직의 결손 부위의 골 재생 정도가 더욱 뛰어나며, 91일이 경과된 시점에서는 정상 상태의 골 상태와 유사한 정도를 나타내는 것이 확인되었다. 상기 골다공증 환자의 골 결손과 관련된 실험동물을 통하여 확인한 결과로부터, 본 발명의 골 재생용 조성물이 골다공증에 의한 골 결손에 대해 유효하고도 현저한 치료 효과를 가짐이 확인되었다.

실시예 6-8. 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)

상기 방사선으로 통해 골절부위를 관찰하여 골 재생 효과가 뛰어난 것을 확인한 실시예 6-4의 실험동물(rat)의 골 조직의 변화를 면역조직화학염색법을 이용하여 확인하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 6-7에서 제작된 조직절편이 붙어있는 슬라이드를 1 x PBS로 2 분간 세척하였다. 상기 세척한 조직절편에 대해 비특이적 반응을 줄이기 위해 3％ H₂O₂를 처리하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 상기 반응 후, 일차 항체인 1:200으로 희석한 오스테오칼신(Osteocalcin) 항체(Biogenex사)를 상기 조직절편에 처리하고, 상온의 습한 챔버(moist chamber)에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 일차 항체를 반응시킨 후, 1 x PBS로 2분씩 3회 세척하고, 상기 오스테오칼신 일차 항체를 검출하기 위하여 biotine-표지된 래트 면역글로뷸린-G(IgG)에 대한 이차 항체(Histostain-plus kit, Zymed사)를 처리한 후, 상온의 습한 챔버(moist chamber)에서 20분 동안 반응시켰다. 상기 이차 항체를 반응시킨 후, 1 x PBS로 2분씩 3회 세척하였으며, 상기 이차 항체를 검출하기 위해 HRP-표지된 스트랩타비딘(streptavidin)을 처리한 후, 상온의 습한 챔버(moist chamber)에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 RP-표지된 스트랩타비딘과 반응시킨 후, 1 x PBS로 2분씩 3회 세척하고, HRP효소에 대한 기질을 처리하였다.

상기 방법으로 면역조직화학염색을 수행한 골 재생용 조성물을 생체이식 후 28일 및 91일이 경과된 시점에서 희생시킨 실험동물의 조직절편에서 상기 인간 오스테오칼신(Osteocalcin) 항체에 의해 염색된 골 형성 단백질인 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 확인하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

상기 도 16에 나타낸 바와 같이, 28일이 경과된 시점에 비하여, 91일이 경과된 시점에 희생시킨 실험동물의 경골 조직의 결손 부위의 골 재생 정도가 더욱 뛰어나며, 91일이 경과된 시점에서는 정상 상태의 골 상태와 유사한 정도를 나타내는 것이 확인되었다. 또한, 이차 항체만을 처리한 대조군과 달리, 오스테오칼신 일차 항체 및 이차 항체를 모두 처리한 경우에 현저하게 염색이 잘 되는 것으로 확인되어, 상기 결손 부위에 처리된 BMP-2가 도입된 이식용 간엽줄기세포(MSC/BMP2)가 골 형성 단백질인 BMP-2 발현에 의해 기능적으로 성숙한 골세포로 분화하였음이 확인되었다.

실시예 6-9. 이소성 골 형성 유도된 실험동물에 대한 지지체의 생체 이식

상기 골 재생용 조성물이 골결손부위에서 보다 효과적으로 골 재생을 할 수 있도록, 상기 실시예 6-1의 상기 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포가 부착된 지지체(scaffold)를 상기 실시예 5-6의 이소성 골 형성이 유도된 실험동물에 이식하였다. 상기 지지체는 실시예 6-6의 베타-트리칼슘포스페이트(β-tricalcium phosphate, β-TCP, 경원메디칼㈜, 대한민국)를 사용하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 6-1의 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산이 1％(w/v) 포함된 용액 10 ㎕ 및 상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 10㎕당 1 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석한 희석액 10 ㎕를 혼합하여 제조한 본 발명의 골 재생용 조성물에 상기 지지체 0.03g을 첨가한 후, 상온에서 20분 동안하여 상기 지지체에 세포가 부착되도록 하였다. 본 발명의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 6-1의 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산이 1％(w/v) 포함된 용액 20㎕ 및 상기 실시예 6-1의 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산이 1％(w/v) 포함된 용액 10㎕와 상기 실시예 3-1에서 제조한 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포를 0.25％ 트립신-EDTA(Gibco사)로 떼어낸 후 10㎕ 당 1 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 세포를 포함하도록 PBS(Sigma사)로 희석한 희석액 10 ㎕에 각각 상기 지지체 0.03g을 첨가하고, 상기 조건으로 배양한 지지체를 제조하였다.

상기 간엽줄기세포를 부착시킨 지지체의 생체 내 이식은 실시예 5-6에 따라 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 5-6의 6주된 발비시(BALB/c/nu)계 누드 마우스 수컷(인하대 실험동물센터, 대한민국)을 마취시킨 후, 상기 누드 마우스 등쪽 절개할 부위를 포비돈요오드(betadine)로 소독하였다. 상기 소독한 등쪽 부분 1cm정도를 절개하였다. 상기 등쪽 부분의 피부가 절개된 마우스에 상기 간엽줄기세포를 부착시킨 지지체 0.03g 및 본 발명의 효과를 확인하기 위해 제조된 상기 2종의 지지체 0.03g을 각각 삽인한 후, 절개된 피부를 봉합하였다.

상기 지지체를 삽입한 후, 4주가 경과된 시점에서 상기 실험동물들을 희생시킨 후, 상기 실시예 6-7과 같이 골 조직의 변화를 통하여 골 재생 효과를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실험동물을 상기 각각의 지지체를 삽입한 후 28일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후, 오른쪽 경골을 10％ 포르말린용액에 2일 동안 고정시키고 7％ 질산에 4일 동안 탈회를 시켰다. 상기 탈회된 경골을 파라핀 블록으로 만들고, 상기 블록을 3㎛ 두께로 잘라 절편을 제조하였다. 상기 절편을 헤마톡실린 및 에오신을 이용한 염색(H＆E 염색)으로 염색한 후, 전자현민경을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.

상기 도 17에 나타낸 바와 같이, 히알루론산 용액으로 처리한 지지체를 삽입한 실험동물에서는 골 재생 효과가 없는 것으로 확인되었다. 또한, 히알루론산과 간엽줄기세포 혼합액으로 처리한 경우에도 거의 골 재생 효과가 없는 것으로 확인되었다. 상기한 결과로부터 히알루론산 자체 또는 간엽줄기세포와 히알루론산을 함께 처리하는 것만으로는 골 재생 효과가 뛰어나지 않아, 치료 효과를 기대할 수 없는 것으로 평가되었다.

상기 히알루론산 용액으로 처리한 지지체 또는 히알루론산과 간엽줄기세포 혼합액으로 처리한 지지체와 달리, 상기 BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포와 상기 평균 분자량이 110,000 Da인 히알루론산이 포함된 본 발명의 골 재생용 조성물로 처리한 지지체를 삽입한 경우에는 충분한 골 조직이 형성된 것이 확인되었다. 상기 이소성 골 형성이 유도된 실험동물을 통하여 확인한 상기 결과로부터, 본 발명의 골 재생용 조성물은 현저한 골 재생 효과가 있으며, 상기 골 재생용 조성물로 처리하여, BMP-2를 발현하는 간엽줄기세포가 부착된 지지체를 삽입하는 경우 효과적인 골 재생이 가능할 것으로 예상되었다.

상기 실시예를 통해 골 형성 기능을 갖는 단백질 유전자가 도입된 줄기세포 및 히알루론산이 포함된 본 발명의 골 재생용 조성물은 불유합 골절, 골 결함 및 골 손실 모델에서 효과적인 골 재생 효과가 있음이 확인되었고, 상기 확인된 사실에 의하여 본 발명의 골 재생용 조성물은 골 질환을 치료하기 위한 세포대체요법과 유전자 치료요법을 포함한 다양한 치료법에 이용될 수 있을 것으로 예상되었다.

산업상 이용가능성

본 발명의 골 형성용 조성물은 골 질환을 치료하기 위한 목적으로 세포 대체요법이나 유전자 치료요법을 포함한 다양한 치료방법에서 이용될 수 있고, 신약개발에 있어 약물효과 검증 또는 각종 연구를 위한 재료로 폭 넓게 이용될 수 있다.

서열목록 Free Text

본 명세서에 첨부된 서열목록의 서열번호 1은 본 발명의 골 형성 기능을 갖는 단백질의 일 예인 BMP-2의 서열이고, 서열번호 2 내지 서열번호 7에 기재된 서열은 자살유전자의 서열이며, 서열번호 8 내지 서열번호 13에 기재된 서열은 본 발명의 벡터를 제조하기 위해 사용된 프라이머의 서열이다.

<110> KOLON LIFE SCIENCE <120> A COMPOSTION FOR REGENERATING BONE <130> PCT20100006 <150> KR2009-0027388 <151> 2009-03-31 <150> KR2009-0062355 <151> 2009-07-09 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1191 <212> DNA <213> BMP2 <400> 1 atggtggccg ggacccgctg tcttctagcg ttgctgcttc cccaggtcct cctgggcggc 60 gcggctggcc tcgttccgga gctgggccgc aggaagttcg cggcggcgtc gtcgggccgc 120 ccctcatccc agccctctga cgaggtcctg agcgagttcg agttgcggct gctcagcatg 180 ttcggcctga aacagagacc cacccccagc agggacgccg tggtgccccc ctacatgcta 240 gacctgtatc gcaggcactc aggtcagccg ggctcacccg ccccagacca ccggttggag 300 agggcagcca gccgagccaa cactgtgcgc agcttccacc atgaagaatc tttggaagaa 360 ctaccagaaa cgagtgggaa aacaacccgg agattcttct ttaatttaag ttctatcccc 420 acggaggagt ttatcacctc agcagagctt caggttttcc gagaacagat gcaagatgct 480 ttaggaaaca atagcagttt ccatcaccga attaatattt atgaaatcat aaaacctgca 540 acagccaact cgaaattccc cgtgaccaga cttttggaca ccaggttggt gaatcagaat 600 gcaagcaggt gggaaagttt tgatgtcacc cccgctgtga tgcggtggac 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ctggcgggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480 ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgc ccgcgcgata ccttatgggc 540 agcatgaccc cccaggccgt gccggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600 acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660 cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720 ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780 cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840 cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900 aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960 cccatgcacg tccttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020 ctgcaactta cctccgggat gatccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080 atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg 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gtggataccg gtggtactgc ggttgcgatt 300 cgtgaaatgt atccaaaagc gcactttgtc accatcttcg caaaaccggc tggtcgtccg 360 ctgggtgatg actatgttgt tgatatcccg caagatacct ggattgaaca gccgtgggat 420 atgggcgtcg tattcgtccc gccaatctcc ggtcgctaa 459 <210> 7 <211> 720 <212> DNA <213> PNP <400> 7 atggctaccc cacacattaa tgcagaaatg ggcgatttcg ctgacgtagt tttgatgcca 60 ggcgacccgc tgcgtgcgaa gtatattgct gaaactttcc ttgaagatgc ccgtgaagtg 120 aacaacgttc gcggtatgct gggcttcacc ggtacttaca aaggccgcaa aatttccgta 180 atgggtcacg gtatgggtat cccgtcctgc tccatctaca ccaaagaact gatcaccgat 240 ttcggcgtga agaaaattat ccgcgtgggt tcctgtggcg cagttctgcc gcacgtaaaa 300 ctgcgcgacg tcgttatcgg tatgggtgcc tgcaccgatt ccaaagttaa ccgcatccgt 360 tttaaagacc atgactttgc cgctatcgct gacttcgaca tggtgcgtaa cgcagtagat 420 gcagctaaag cactgggtat tgatgctcgc gtgggtaacc tgttctccgc tgacctgttc 480 tactctccgg acggcgaaat gttcgacgtg atggaaaaat acggcattct cggcgtggaa 540 atggaagcgg ctggtatcta cggcgtcgct gcagaatttg gcgcgaaagc cctgaccatc 600 tgcaccgtat ctgaccacat ccgcactcac gagcagacca ctgccgctga gcgtcagact 660 accttcaacg acatgatcaa aatcgcactg gaatccgttc tgctgggcga taaagagtaa 720 720 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2-F <400> 8 tcccagcgtg aaaagagaga ctgc 24 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2-R <400> 9 ttttgctgta ctagcgacac ccacaacc 28 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD-F <400> 10 gaattcaggc tagcaatgtc tcgaataacg ctttacaaa 39 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD-R <400> 11 ggattctcta gctggcagac agccgc 26 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analysis F <400> 12 catacgattt aggtgacact atag 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analysis R <400> 13 accgggaaac acctattgtg 20

Claims

골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포 및 히알루론산을 포함하는 골 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 골 형성 기능을 갖는 단백질은 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)이고, 상기 줄기세포는 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)인 골 재생용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 골형성 단백질은 BMP-2(GenBank Accession No. AAF21646), BMP-3(GenBank Accession No. NP_001192), 및 BMP-7 (GenBank Accession No. NP_001710)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 골 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 및 자살유전자가 도입된 줄기세포인 골 재생용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 자살유전자는 HSV-tk 유전자, CD 유전자, VZV-tk 유전자, CYP2B1 유전자, XGPRT 유전자 및 PNP 유전자로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 골 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산은 평균 분자량이 50,000 내지 300,000 달톤인 골 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산의 함량은 총 조성물을 기준으로 0.01 내지 3％(w/v)인 골 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 골 재생용 조성물은 4℃ 내지 50℃에서 젤 상태인 것을 특징으로 하는 골 재생용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 골 재생용 조성물을 포함하는 골질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 골질환은 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 골결손, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 환절 결함, 이식체 교정 주위의 골 증가, 골성장 장애, 골 종양, 불유합골절 및 유전적 골성장의 결함으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 골질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물.
골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된 벡터를 제조하는 단계;
상기 벡터를 이용하여 간엽줄기세포에 골 형성 기능을 하는 단백질을 암호화하는 유전자를 도입시키는 단계; 및
상기 간엽줄기세포 또는 상기 간엽줄기세포로부터 분화된 세포를 히알루론산과 혼합하여 젤상태의 조성물을 제조하는 단계
를 포함하는 골 재생용 조성물의 제조방법.
골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자에 의해 발현된 단백질에 의해 전사개시여부가 결정되는 프로모터 및 자살유전자가 전사방향으로 연결되어 구성된 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
상기 벡터를 이용하여 간엽줄기세포에 상기 유전자 발현 카세트를 도입시키는 단계; 및
상기 간엽줄기세포 또는 상기 간엽줄기세포로부터 분화된 세포를 히알루론산과 혼합하여 젤상태의 조성물을 제조하는 단계
를 포함하는 골 재생용 조성물의 제조 방법.