KR20230127269A - 센스, 억제자 트랜스퍼 rna 조성물 및 관련된 용도와기능 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 적어도 부분적으로 수용체 줄기 및 비동족 삼중 코돈을 포함하는 안티코돈 아암을 포함하는 센스, 억제자 트랜스퍼 RNA(sstRNA), 뿐만 아니라 이의 사용 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2020년 12월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 63/132,932, 2021년 2월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/151,416 및 2021년 2월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/151,436에 대한 우선권을 주장한다. 상기에 언급된 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
DNA 분자는 DNA 중합체를 구성하는 뉴클레오티드 염기의 서열의 형태에서 유전 정보를 수반한다. 단지 4가지 뉴클레오티드 염기가 DNA에서 이용된다: 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민. 이 정보는 3개의 인접한 염기의 코돈의 형태로 메신저 RNA(mRNA)로 전사된 다음 트랜스퍼 RNA(tRNA)와 리보솜에 의해 번역되어 단백질을 형성한다. 4가지 뉴클레오티드 염기가 RNA에서 이용된다: 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실. 유전자 코드는 삼중항 코돈과 특정 아미노산 사이의 관계이다. 64개의 가능한 코돈 삼중항이 유전자 코드를 형성하며, 여기서 3개의 정지("종료" 또는 "넌센스"라고도 함) 코돈은 번역 기구(세포 리보솜)에 신호를 제공하여 특정 코돈에서 단백질 생산을 중단시킨다. 다른 61개의 코돈 삼중항("센스 코돈"이라고도 함)은 20개의 표준 아미노산 중 하나에 해당한다.
DNA는 리보솜에 의해 번역되어 각 아미노산이 하나씩 함께 연결되어 DNA에 의해 구체적으로 제공된 유전 명령에 따라 폴리펩티드를 형성하도록 한다. 트랜스퍼 RNA는 mRNA를 리보솜 상에서 단백질로 번역한다. 각 tRNA는 mRNA 상의 상보적 코돈과 혼성화하는 "안티코돈" 영역을 함유한다. 그 지정된 아미노산을 수반하는 tRNA는 "하전된" tRNA로 지칭된다. tRNA가 61개 아미노산-연관된 tRNA(또는 "센스 tRNA") 중 하나인 경우, 그것은 일반적으로 성장하는 펩티드에 그 아미노산을 부착한다. tRNA의 구조 유전자는 약 72-90 뉴클레오티드 길이이고 클로버잎 구조로 접혀 있다.
놀랍게도 tRNA가 비동족 코돈을 인식하고 폴리펩티드 생산을 위한 대체 아미노산을 수반하도록 조작될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이들 센스, 억제자 tRNA는 단백질 발현 또는 기능 파괴를 유발할 수 있을 뿐만 아니라 세포 생존력을 감소시킬 수 있는 폴리펩티드 및 단백질에서 아미노산을 전환하는데 사용될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 수용체 줄기 및 비동족 코돈에 특이적인 안티코돈을 포함하는 센스, 억제자 트랜스퍼 RNA(sstRNA)가 제공된다.
본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 안티코돈은 임의의 비동족 코돈에 대해 특이적이다. 본 명세서에 제공된 이러한 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 수용체 줄기는 그의 안티코돈에 의해 코딩되는 것과 상이한 임의의 아미노산에 대해 특이적이다.
본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 안티코돈은 류신 코돈에 특이적이다. 본 명세서에 제공된 이러한 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 수용체 줄기는 프롤린에 특이적이고 폴리펩티드 또는 단백질 생산에서 프롤린을 류신으로 대체할 수 있다. 본 명세서에 제공된 이러한 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, sstRNA는 서열번호: 3 및 4에 제시된 서열에 의해 인코딩된다.
본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 안티코돈은 프롤린 코돈에 특이적이다. 본 명세서에 제공된 이러한 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 수용체 줄기는 류신에 특이적이고 폴리펩티드 또는 단백질 생산에서 류신을 프롤린으로 대체할 수 있다. 본 명세서에 제공된 이러한 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, sstRNA는 서열번호: 1, 2 및 5-13에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩된다.
본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 안티코돈은 프롤린 코돈에 특이적이다. 본 명세서에 제공된 이러한 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 수용체 줄기는 이소류신에 특이적이고 폴리펩티드 또는 단백질 생산에서 이소류신을 프롤린으로 대체할 수 있다. 본 명세서에 제공된 이러한 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, sstRNA는 서열번호: 14 및 15에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩된다.
본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 안티코돈은 미스센스 돌연변이를 갖는 코돈에 대해 특이적이다. 본 명세서에 제공된 이러한 sstRNA 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 수용체 줄기는 미스센스 돌연변이를 갖는 코돈에 의해 코딩되는 것보다 대체 아미노산에 대해 특이적이고 폴리펩티드 또는 단백질 생산을 위해 대체 아미노산을 대체할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 150개 또는 300개 미만의 뉴클레오티드의 총 길이를 갖는다. 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA이다. 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나 또는 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나를 인코딩하는 핵산 및 프로모터를 포함하는 발현 카세트가 제공된다. 본 명세서에 제공된 발현 카세트 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 발현 카세트는 종결자를 추가로 포함한다. 본 명세서에 제공된 발현 카세트 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호: 16-26에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드 또는 발현 카세트 중 임의의 하나를 포함하는 벡터가 제공된다. 일 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드 또는 발현 카세트 중 임의의 하나는 cDNA의 형태로 된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나, 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나, 발현 카세트 중 임의의 하나 또는 벡터 중 임의의 하나, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나 중 적어도 2개 또는 적어도 3개, 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나 중 적어도 2개 또는 적어도 3개, 발현 카세트 중 임의의 하나 중 적어도 2개 또는 적어도 3개, 또는 벡터 중 임의의 하나 중 적어도 2개 또는 적어도 3개, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 명세서에 제공된 조성물 또는 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA가 있을 때 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA는 동일한 올리고뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터 또는 조성물에 있다. 본 명세서에 제공된 조성물 또는 방법 중 임의의 하나의 또 다른 실시형태에서, 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA가 있을 때 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA는 적어도 2개 또는 3개의 상이한 올리고뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터 또는 조성물에 있다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나, 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나, 발현 카세트 중 임의의 하나 또는 벡터 중 임의의 하나를 포함하는 세포가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나 중 적어도 2개 또는 적어도 3개, 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나 중 적어도 2개 또는 적어도 3개, 발현 카세트 중 임의의 하나 중 적어도 2개 또는 적어도 3개, 또는 벡터 중 임의의 하나 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 포함하는 세포가 제공된다.
세포를 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 발현 카세트 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 벡터 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 또는 조성물 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개)와 접촉시키는 것을 포함하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 발현 카세트 중 어느 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 벡터 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 또는 조성물 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개)를 전달하는 것을 포함하는, 단백질 발현 또는 기능을 변형 또는 파괴하는 방법이 제공된다. 이러한 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, sstRNA(들), 올리고뉴클레오티드(들), 발현 카세트(들), 벡터(들) 또는 조성물(들)의 양은 세포에서 단백질 발현 또는 기능을 변형하거나 파괴하는데 효과적이다.
또 다른 양태에서, 세포를 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 발현 카세트 중 어느 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 벡터 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 또는 조성물 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개)와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 사멸시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, sstRNA(들), 올리고뉴클레오티드(들), 발현 카세트(들), 벡터(들) 또는 조성물(들)의 양은 세포를 사멸시키는데 효과적이다. 이러한 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 세포는 시험관내이다. 이러한 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 세포는 생체내이다.
또 다른 양태에서, 세포를 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 발현 카세트 중 어느 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 벡터 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 또는 조성물 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개)와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 생존을 감소시키는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 세포를 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 발현 카세트 중 어느 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 벡터 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 또는 조성물 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개)와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 운동성을 감소시키는 방법이 제공된다.
세포를 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 발현 카세트 중 어느 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 벡터 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 또는 조성물 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개)와 접촉시키는 것을 포함하는, 면역 세포를 활성화시키는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 세포는 면역 반응이 활성화되도록 면역 세포 또는 다른 면역 성분과 접촉하거나 접촉될 수 있다.
또 다른 양태에서, 대상체에게 본 명세서에 제공된 sstRNA 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 발현 카세트 중 어느 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 벡터 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개), 또는 조성물 중 임의의 하나(예를 들어, 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개)를 투여하는 것을 포함하는, 과증식성 질환 또는 장애가 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, sstRNA(들), 올리고뉴클레오티드(들), 발현 카세트(들), 벡터(들) 또는 조성물(들)의 양은 과증식성 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적이다. 이러한 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 과증식성 질환 또는 장애는 암이다. 이러한 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 암은 흑색종 또는 유방암, 예컨대 삼중 음성 유방암이다.
다른 양태에서, sstRNA를 동정하는 방법이 제공된다. 본 명세서에 제공된 동정하는 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, sstRNA는 비동족 코돈에 특이적인 안티코돈을 포함하도록 선택되거나 조작된다. 본 명세서에 제공된 동정하는 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, sstRNA는 그의 안티코돈에 의해 코딩된 아미노산과 상이한 아미노산에 특이적인 수용체 줄기 또는 아암을 갖는 것이다. 본 명세서에 제공된 동정하는 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 방법은 고-처리량 클로닝 및 스크리닝을 포함하거나 추가로 포함한다. 본 명세서에 제공된 동정하는 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 방법은 세포에서 sstRNA를, 예컨대 형질감염에 의해 발현시키고, 단백질 발현 또는 기능 변형 또는 파괴 및/또는 세포사, 사멸, 생존 또는 운동성을 평가하는 것을 포함하거나 추가로 포함한다. 본 명세서에 제공된 동정하는 방법 중 임의의 하나의 일 실시형태에서, 방법은 단백질 발현 또는 기능 변형 또는 파괴 및/또는 세포사, 사멸, 생존 또는 운동성을 초래하는 sstRNA를 선택하는 것을 포함하거나 추가로 포함한다.
도 1은 유전자 코드의 표를 제공한다.
도 2는 T-아암, D-아암, 안티코돈 아암 및 수용체 줄기(또는 아암)를 포함하는 tRNA의 일반적인 4-아암 구조를 나타낸다. 이들 영역은 또한 전체적으로 '루프'로 지칭될 수 있다.
도 3은 GFP 발현과 세포 분열이 빠르게 완화된 SWTX2와 SWTX3의 공동-형질감염으로부터의 결과를 나타낸다.
도 4는 SWTX5 및 SWTX7의 공동-형질감염으로부터의 결과를 나타낸다.
도 5는 GFP 플라스미드 라이브러리 스크린에 대한 플레이트 맵을 나타낸다.
도 6은 24시간에서 플레이트/세포 모니터링으로부터의 결과를 나타낸다.
도 7은 44시간에서 플레이트/세포 모니터링으로부터의 결과를 나타낸다.
도 8은 개별 플라스미드를 발현하는 HEK293-T 세포에서 44시간에서 GFP의 강도를 나타낸다.
도 9는 RPMI-7951 세포(흑색종 세포주)에서 형질감염 30시간 후 GFP 발현(GFP 단독)을 나타낸다.
도 10은 RPMI-7951 세포(흑색종 세포주)에서 형질감염 30시간 후 GFP 발현(GFP + sstRNA 51)을 나타낸다.
도 11은 HEK293T 세포에서 43시간에서 GFP 발현 결과를 나타낸다.
도 12는 SKMEL3 세포(흑색종 세포주)에서 43시간에서 GFP 발현 결과를 나타낸다.
도 13은 RPMI-7951 세포(P14) SWTX +/- tdtomato(1μg/웰)(24시간에서 2:1 Fugene:DNA 비율)로 Fugene 형질감염의 결과를 나타낸다.
도 14는 RPMI-7951 세포(P14) SWTX +/- Nluc WT(1μg/웰)(24시간에서 2:1 Fugene:DNA 비율)로 Fugene 형질감염의 결과를 나타낸다.
도 15는 RPMI-7951 세포(P14) SWTX +/- tdtomato(1μg/웰)(48시간에서 2:1 Fugene:DNA 비율)로 Fugene 형질감염의 결과를 나타낸다.
도 16은 RPMI-7951 세포(P14) SWTX +/- Nluc WT(1μg/웰)(48시간에서 2:1 Fugene:DNA 비율)로 Fugene 형질감염의 결과를 나타낸다.
도 17은 GFP, 51 또는 51 플라스미드의 cDNA와 1:1.5, 1:3 및 1:6 비율에서 리포펙타민 3000 형질감염으로부터의 결과를 나타낸다. GFP 신호가 도시된다.
도 18은 SKMEL 흑색종 라인에서 cDNA에 대한 시약의 비율에 의한 요약인, 리포페타민 3000(LP) 형질감염으로부터의 결과를 나타낸다. 각 플롯은 동일한 조건의 2개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
도 19는 HCC 삼중-음성 유방암 라인으로부터의 결과를 나타낸다.
도 20은 지시된 조건에 대한 Fugene 형질감염된 HEK293 세포를 나타낸다. 스크래치 검정이 48시간에서 수행되었고 GFP 발현 및 세포 밀도에 대해 이미지화되었다. 72시간에서의 이미지는 SWTX2 + SWTX3 조건이 아닌 GFP에서 운동성/생존을 나타낸다.
도 21은 삼중 sstRNA 조합의 결과를 나타낸다. 실험 조건은 다음과 같다: 젤은 바닥까지 150V에서 흐른다; 4℃에서 2시간 동안 250mA에서 발생된 전달; 1XTBST 중 5% 밀크에서 RT에서 30분 동안 차단; 4℃에서 일차 O/N(차단 용액에서 1:2000 Sigma T2949); 1XTBST x3로 세정; 차단 용액(1:10000 항-토끼 IgG)에서 RT에서 이차 1시간; 1XTBST x3으로 세정; ECL 이미징 + "5 샷".
도 2는 T-아암, D-아암, 안티코돈 아암 및 수용체 줄기(또는 아암)를 포함하는 tRNA의 일반적인 4-아암 구조를 나타낸다. 이들 영역은 또한 전체적으로 '루프'로 지칭될 수 있다.
도 3은 GFP 발현과 세포 분열이 빠르게 완화된 SWTX2와 SWTX3의 공동-형질감염으로부터의 결과를 나타낸다.
도 4는 SWTX5 및 SWTX7의 공동-형질감염으로부터의 결과를 나타낸다.
도 5는 GFP 플라스미드 라이브러리 스크린에 대한 플레이트 맵을 나타낸다.
도 6은 24시간에서 플레이트/세포 모니터링으로부터의 결과를 나타낸다.
도 7은 44시간에서 플레이트/세포 모니터링으로부터의 결과를 나타낸다.
도 8은 개별 플라스미드를 발현하는 HEK293-T 세포에서 44시간에서 GFP의 강도를 나타낸다.
도 9는 RPMI-7951 세포(흑색종 세포주)에서 형질감염 30시간 후 GFP 발현(GFP 단독)을 나타낸다.
도 10은 RPMI-7951 세포(흑색종 세포주)에서 형질감염 30시간 후 GFP 발현(GFP + sstRNA 51)을 나타낸다.
도 11은 HEK293T 세포에서 43시간에서 GFP 발현 결과를 나타낸다.
도 12는 SKMEL3 세포(흑색종 세포주)에서 43시간에서 GFP 발현 결과를 나타낸다.
도 13은 RPMI-7951 세포(P14) SWTX +/- tdtomato(1μg/웰)(24시간에서 2:1 Fugene:DNA 비율)로 Fugene 형질감염의 결과를 나타낸다.
도 14는 RPMI-7951 세포(P14) SWTX +/- Nluc WT(1μg/웰)(24시간에서 2:1 Fugene:DNA 비율)로 Fugene 형질감염의 결과를 나타낸다.
도 15는 RPMI-7951 세포(P14) SWTX +/- tdtomato(1μg/웰)(48시간에서 2:1 Fugene:DNA 비율)로 Fugene 형질감염의 결과를 나타낸다.
도 16은 RPMI-7951 세포(P14) SWTX +/- Nluc WT(1μg/웰)(48시간에서 2:1 Fugene:DNA 비율)로 Fugene 형질감염의 결과를 나타낸다.
도 17은 GFP, 51 또는 51 플라스미드의 cDNA와 1:1.5, 1:3 및 1:6 비율에서 리포펙타민 3000 형질감염으로부터의 결과를 나타낸다. GFP 신호가 도시된다.
도 18은 SKMEL 흑색종 라인에서 cDNA에 대한 시약의 비율에 의한 요약인, 리포페타민 3000(LP) 형질감염으로부터의 결과를 나타낸다. 각 플롯은 동일한 조건의 2개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
도 19는 HCC 삼중-음성 유방암 라인으로부터의 결과를 나타낸다.
도 20은 지시된 조건에 대한 Fugene 형질감염된 HEK293 세포를 나타낸다. 스크래치 검정이 48시간에서 수행되었고 GFP 발현 및 세포 밀도에 대해 이미지화되었다. 72시간에서의 이미지는 SWTX2 + SWTX3 조건이 아닌 GFP에서 운동성/생존을 나타낸다.
도 21은 삼중 sstRNA 조합의 결과를 나타낸다. 실험 조건은 다음과 같다: 젤은 바닥까지 150V에서 흐른다; 4℃에서 2시간 동안 250mA에서 발생된 전달; 1XTBST 중 5% 밀크에서 RT에서 30분 동안 차단; 4℃에서 일차 O/N(차단 용액에서 1:2000 Sigma T2949); 1XTBST x3로 세정; 차단 용액(1:10000 항-토끼 IgG)에서 RT에서 이차 1시간; 1XTBST x3으로 세정; ECL 이미징 + "5 샷".
트랜스퍼 RNA는 DNA 및 RNA "블루프린트"의 디코더이고 세포와 조직의 구조를 형성하는 단백질을 만드는 데 도움이 된다. 이들 RNA 분자는 유전자 코드의 체계적인 "리코딩"을 가능하게 할 수 있도록 변형되거나 조작될 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질 생산에서 비동족 아미노산을 전달하는데 사용될 수 있도록 트랜스퍼 RNA(tRNA)에서의 부위-지향된 변화를 기반으로 하는 플랫폼 기술이 본 명세서에 제공된다. 예를 들어, 프롤린 tRNA와 같은 tRNA는 류신 코돈과 같은 비동족 코돈을 인식하고 디코딩하도록 조작될 수 있다. 이 예에서 tRNA는 류신 코돈을 억제하고 폴리펩티드 또는 단백질 생산 동안 이를 프롤린으로 대체하는데 사용될 수 있다. 그러한 표적화된 변화의 생물학적 영향은 폴리펩티드 또는 단백질 생산이 변형되고 감소된 발현 및/또는 기능과 같이 불리하게 영향을 받을 수 있다는 것이다. 예를 들어, 프롤린의 경우 아미노산이 "꼬임"을 촉진하기 때문에 발현된 폴리펩티드 또는 단백질은 일반적으로 형상이 변경되어 단백질 기능을 비활성화할 것이다. 다른 아미노산 치환도 불리한 결과를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 궁극적인 결과는 세포사, 사멸, 생존 또는 운동성일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 tRNA는 세포사, 사멸, 생존 또는 운동성이 이점을 갖는 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 이들 센스, 억제자 tRNA는 또한 단백질 발현 및/또는 기능, 바람직하게는 내인성 단백질의 단백질 발현 및/또는 기능을 변형하거나 방해하는데 사용될 수 있다.
따라서, 대안적 아미노산을 인코딩할 목적으로 비동족 센스 코돈을 억제할 수 있는 센스, 억제자 tRNA가 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "센스, 억제자 트랜스퍼 RNA(sstRNA)"는 그의 안티코돈에 의해 코딩된 아미노산과 상이한 아미노산을 운반, 전달 또는 제공할 수 있는 tRNA를 지칭한다. 바람직하게는, 아미노산은 천연 아미노산이지만 그의 안티코돈에 의해 코딩되는 아미노산과는 상이하다. 즉, sstRNA는 그의 안티코돈에 의해 코딩된 아미노산을 억제하고 그 자리에 다른 아미노산을 대체한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 그의 안티코돈에 의해 코딩된 아미노산은 안티코돈이 특이적인 아미노산이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 수용체 줄기 또는 아암의 아미노산 특이성을 언급할 때 "에 대해 특이적"은 tRNA의 수용체 줄기 또는 아암에 의해 운반, 전달 또는 제공되거나, 될 수 있는 아미노산을 지칭한다.
tRNA의 안티코돈 루프(RNA 메시지에 결합하는 부분)를 변경함에 의해, 단백질 코돈 의미를 전환하는 능력을 가진 신규한 tRNA 서열이 식별되었다. 예를 들어, RNA로 프롤린 코돈을 구조적으로 상이한 아미노산인 류신으로 디코딩할 수 있고; 류신 코돈을 프롤린으로 디코딩할 수 있고; 또는 프롤린 코돈을 이소류신으로 디코딩할 수 있는 tRNA 분자가 생성되었다. 사실상, 앞서 언급한 코돈의 유전적 의미를 교체하는 것이다. 이 기술은 트랜스퍼 RNA 코돈 교환으로 치환( S ubstitution w ith t ransfer RNA codon E x change)의 약어를 기반으로 "SWTX" tRNA라고도 명명된다. 본 명세서에서 제공되는 tRNA는 본 명세서에서 센스, 억제자 tRNA라고도 지칭된다. 이 치료적 접근법은 "코드 전환"을 이용한다. 코돈-선택적 아미노산 변환을 실시함에 의한 코드-전환은 크기, 형상 및/또는 전하에 대한 변화와 같은 단백질 변형에 대한 다중 경로를 허용한다. 이러한 변화 중 임의의 하나 이상이 본 명세서에 제공된 방법 중 임의의 하나에서 원하는 결과일 수 있다. 체계적이고 선택적인 측쇄 변환은 세포 기능을 마비시키고 세포 분열 및/또는 성장 등을 중단시킬 수 있다.
tRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 합성적으로 생성될 수 있다. 또한, 수백 개의 인간 tRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 알려져 있고 일반적으로 유전자은행과 같은 공급원을 통해 당업자에게 이용가능하다. tRNA의 구조는 고도로 보존되어 있고 tRNA는 종에 걸쳐서 기능적일 수 있다. 따라서, 박테리아 또는 다른 진핵생물 tRNA 서열은 또한 발명의 tRNA에 대한 잠재적 공급원이다. 원하는 포유동물 세포에서와 같이 특정 tRNA가 원하는 대로 기능하는지 여부의 결정은 본 명세서에 기재된 바와 같이 또는 본 명세서에 제공된 교시의 이점으로 당업자에게 명백할 것인 다른 실험을 통해 확인될 수 있다.
현재 연구는 tRNA가 tRNA 내의 안티코돈 서열의 분자 편집을 통해 변경될 수 있음을 나타낸다. 이 접근법은 비동족 아미노산으로 치환될 센스 코돈을 재프로그래밍할 수 있게 한다. 본 명세서에서 제공되는 조작된 tRNA는 특정 아미노산에 대한 코돈의 "재-편집"을 가능하게 한다. 이들 tRNA 분자의 작은 크기는 즉시 발현을 할 수 있게 하며, 예를 들어 tRNA + 프로모터는 단지 ~300bp 이하이다. 본 발명의 추가 이점은 전체 시스템이 컴팩트할 수 있기 때문에 손쉬운 발현 및 세포 전달을 제공한다는 것이다. 간략하게, 인간 세포에서와 같은 세포에서 기능적인 tRNA 유전자의 구조적 성분을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있다. 이 올리고뉴클레오티드의 서열은 특정 tRNA가 특정 코돈을 인식하지만 대체 아미노산을 전달하도록 하는 tRNA의 안티코돈 영역에서 이루어진 치환을 갖는 알려진 서열을 기반으로 설계된다.
tRNA는 T-아암, D-아암, 안티코돈 아암, 수용체 줄기 또는 아암을 포함하는 일반적인 4개-아암 구조를 가지고 있다(도 2). T-아암은 "T-줄기"과 "TΨC 루프"로 구성된다. 본 명세서에 제공된 tRNA 중 임의의 하나는 이 4개-아암 구조를 포함할 수 있다. tRNA는 길이가 대략적으로 100개 뉴클레오티드이고 세포 안으로 쉽게 도입될 수 있다.
특정 실시형태에서, tRNA는 발현 카세트에서 인코딩된다. tRNA 인코딩 서열의 내부 프로모터 서열 때문에, tRNA 서열은 별도의 전사 단위에 포함될 필요는 없지만, 그것이 제공될 수는 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에 제공된 바와 같은 tRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 특정 실시형태에서, 발현 카세트는 프로모터를 추가로 함유한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 조절가능한 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 전달되는 tRNA를 인코딩하는 서열의 발현을 유도하기 위한 프로모터는 프로모터에 기능적으로 연결된 핵산의 발현 수준 및 벡터가 사용되는 세포 유형과 같은 공지된 고려사항에 의해 선택된 임의의 원하는 프로모터일 수 있다. 프로모터는 외인성 또는 내인성 프로모터일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "발현 카세트"는 종결 신호에 작동가능하게 연결될 수 있는 관심있는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있는, 적절한 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 관심있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있다. 발현 카세트는 또한 자연적으로 발생하지만 이종 발현에 유용한 재조합 형태로 수득된 것일 수 있다. 발현 카세트에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터 또는 조절가능한 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 발현 카세트는 벡터이거나 벡터에 함유될 수 있다.
"작동가능하게-연결된"은 서열 중 하나의 기능이 또 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 조절 DNA 서열이 코딩 DNA의 발현에 영향을 미치도록(즉, 코딩 서열 또는 기능성 RNA가 프로모터의 전사 제어하에 있도록) 2개의 서열이 위치되어 지는 경우, 조절 DNA 서열은 RNA 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 "작동가능하게 연결"되거나 "연관"되었다고 한다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 지칭하고 전장 단백질 및 그의 단편을 포함한다. 따라서, "단백질" 및 "폴리펩티드"는 종종 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 방법은 핵산을 세포로 전달하는 방법을 제공한다. 세포에 대한 투여는 단순히 세포에 접촉시키는 것을 포함하는 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 세포와의 접촉은 원하는 시간 동안 이루어질 수 있다. 세포는 인간뿐만 아니라 영장류, 말, 양, 염소, 돼지 및 개와 같은 다른 대형(비-설치류) 포유동물의 임의의 원하는 세포를 포함할 수 있다. 본 명세서에 제공된 대상체 중 임의의 하나는 인간 또는 다른 포유동물일 수 있다. 용어 "포유동물"은 인간, 마우스, 랫트, 기니피그, 원숭이, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 및 양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
대상체로의 전달 및 도입을 위한 적합한 방법이 또한 제공되거나 또는 달리는 당업계에서 이해된다. 일 실시형태에서, 약학적 조성물은 관심있는 핵산의 치료적으로 유효한 양, 즉 단백질 발현 또는 기능을 방해하여 세포사, 사멸, 생존 또는 운동성을 초래하거나 또는 문제의 질환 상태의 증상을 감소 또는 개선하기에 충분한 양 또는 원하는 이점을 부여하기에 충분한 양을 생산하기에 충분한 유전 물질을 포함할 것이다.
tRNA는 유효량으로 전달될 수 있고, 내인성 tRNA 합성효소와 같은 tRNA 합성효소와 함께 세포 안으로 전달될 수 있다. tRNA 합성효소는 본 발명에 따라 tRNA가 도입되는 세포에 존재하는 경우 세포에 "내인성"인 것으로 간주된다. 당업자에게 자명한 바와 같이, tRNA 합성효소는 관련 유형의 세포에서 자연적으로 발견되는지 또는 문제의 특정 세포가 조작되었는지 달리는 그것을 함유하거나 발현하도록 사람의 손에 의해 조작되었는지 여부에 관계없이 이들 목적을 위해 내인성인 것으로 간주될 수 있다.
약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 것이다. 그러한 부형제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 약학적 제제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 소르비톨, Tween80 및 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염이 이에 포함될 수 있다. 부가적으로, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제에 대한 철저한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)에서 이용 가능하다.
본 명세서의 교시의 관점에서 당업자에게 명백한 바와 같이, 제공된 tRNA의 유효량은 경험적으로 결정될 수 있다. 투여는 치료 과정 전반에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 1회 용량으로 수행될 수 있다. 가장 효과적인 투여의 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 요법의 조성, 표적 세포 및 치료되는 대상체 등에 따라 달라질 수 있다. 단일 및 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다.
물, 수성 식염수, 인공 CSF 또는 기타 공지된 물질을 포함하는 비히클이 본 발명과 함께 이용될 수 있다. 제형을 제조하기 위해, 정제된 조성물이 단리될 수 있다. 그런 다음 조성물을 적절한 농도로 조정되고 사용을 위해 포장될 수 있다.
용어 "핵산"은 당, 인산염 및 퓨린 또는 피리미딘인 염기를 함유하는 단량체(뉴클레오티드)로 구성된 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 알려진 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다.
"핵산 단편"은 주어진 핵산 분자의 일부이다. 용어 폴리뉴클레오티드 서열의 "실질적 동일성"은 폴리뉴클레오티드가 표준 매개변수를 사용하여 기술된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하는 기준 서열과 비교하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 또는 79%, 또는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%, 또는 심지어 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다.
외인성 유전 물질(예를 들어, sstRNA 또는 SWTX tRNA를 인코딩하는 것)은 형질감염과 같은 유전자 전달 방법에 의해 생체내에서 세포 안으로 도입될 수 있다. 다양한 발현 벡터(즉, 표적 세포 안으로의 외인성 유전 물질의 전달을 촉진하기 위한 비히클)는 당업자에게 공지되어 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "세포의 형질감염"은 혼입에 의한 신규한 유전 물질의 세포에 의한 획득을 지칭한다. 따라서, 형질감염은 물리적 또는 화학적 방법을 사용하여 세포 안으로 핵산의 삽입을 지칭한다. 여러 형질감염 기술이 당업자에게 공지되어 있거나 달리는 본 명세서에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "외인성 유전 물질"은 세포에서 자연적으로 발견되지 않거나; 또는 세포에서 자연적으로 발견되는 경우, 세포에 의해 생물학적으로 중요한 수준으로 전사되거나 발현되지 않는, 천연 또는 합성인 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, "외인성 유전 물질"은, 예를 들어 tRNA로 전사될 수 있는 비-천연 발생 핵산을 포함한다.
전형적으로, 외인성 유전 물질은 새로운 유전자의 전사를 제어하기 위한 프로모터와 함께 이종 유전자를 포함할 수 있다. 프로모터는 특징적으로 전사를 개시하는데 필요한 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 선택적으로, 외인성 유전 물질은 원하는 유전자 전사 활성을 얻기 위해 필요한 추가 서열(즉, 인핸서)을 더 포함할 수 있다. 외인성 유전 물질은 프로모터와 코딩 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩 서열의 전사를 허용하도록 프로모터 바로 하류에서 세포 게놈 안으로 도입될 수 있다.
적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 이종 핵산에 부가하여, 발현 벡터는 발현 벡터로 형질감염된 세포의 선택을 용이하게 하기 위한 선택 유전자, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포는 2개 이상의 발현 벡터, tRNA를 인코딩하는 유전자(들)를 함유하는 적어도 하나의 벡터, 선택 유전자를 함유하는 다른 벡터로 형질감염될 수 있다. 적합한 프로모터, 인핸서, 선택 유전자 및/또는 신호 서열(아래에 기술됨)의 선택은 과도한 실험 없이 당업계의 통상인의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
본 명세서에 제공된 실시형태 중 임의의 하나의 실시형태에서, sstRNA(들)는 cDNA의 형태이고 그 자체로 세포에 전달되거나 접촉될 수 있다.
본 명세서에 제공된 실시형태 중 임의의 하나의 실시형태에서, sstRNA(들)는 원하는 아미노산으로 하전되거나 하전되지 않으며, 그 자체로 세포에 전달되거나 접촉될 수 있다.
일 실시형태에서 본 발명은 발명의 sstRNA 또는 SWTX tRNA의 투여를 통해 과증식성 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것과 같이 본 명세서에 제공된 방법 또는 용도 중 임의의 하나를 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "과증식성 질환 또는 장애"는 급속한 분열, 실질적인 과증식 등에 의해 비정상적으로 높은 세포의 증식률이 있는 임의의 질환 또는 장애를 지칭한다. 본 개시내용의 특정 실시형태는 포유동물과 같은 대상체에서 과증식성 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 포유동물은 인간이다.
본 개시내용의 특정 실시형태는 포유동물 예컨대 인간과 같은 대상체에서 과증식성 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것과 같이 본 명세서에 제공된 방법 또는 용도 중 임의의 하나에 유용한 약제를 제조하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 sstRNA, 올리고뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터 또는 조성물의 용도를 제공한다. 특정 실시형태에서, 요법은 종양, 암 및 신생물 조직을 포함한 과증식성 질환 또는 장애를 비-신생물성 또는 비-악성 과증식성 장애와 함께 치료/관리하기 위한 잠재적인 용도를 갖는다. 특정 실시형태에서, 과증식성 질환 또는 장애는 암 예컨대 흑색종 또는 삼중 음성 유방암과 같은 유방암이다. 암은 또한 폐암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암/자궁암, 방광암 또는 간암일 수 있다.
암은 내성 암인 것일 수 있다. "내성 암"은 치료를 받았지만 치료에도 불구하고 진행된 암이다. 일 실시형태에서 내성 암은 화학요법, 방사선 및/또는 표적화된 요법과 같은 하나 초과의 치료에도 불구하고 암이 진행되는 "범-내성 암"이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 sstRNA, 올리고뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 벡터를 함유하는 세포를 제공한다. 세포는 인간과 같은 포유동물일 수 있다. 일 양태에 따르면, 세포 발현 시스템이 제공된다. 발현 시스템은 본 명세서에 제공된 바와 같은 세포 및 발현 카세트를 포함한다. 발현 카세트는 플라스미드, 바이러스 벡터 및 이종 유전 물질을 세포에 전달하기 위한 기타 비히클을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
세포 발현 시스템은 생체내에서 형성될 수 있다. 또 다른 양태에 따르면, 대상체를 생체내에서 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 sstRNA, 올리고뉴클레오티드, 발현 카세트, 엑터 또는 조성물을 대상체에게 생체내에 도입하는 것을 포함한다. 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 대상체에게 증상을 완화시키거나 일부 이점을 제공할 수 있는 치료적 처리 및 조치 둘 모두를 지칭하며, 여기서 대상체는 암의 성장, 발달 또는 확산과 같은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 늦추는(약화시키는) 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 바람직한 임상 결과는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화 및 감지가능하든 감지가능하지 않든 (부분적이든 전체적이든) 경감을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존에 비해 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 이들은 이미 병태, 질환 또는 장애가 있는 이들을 포함한다.
어구 "치료적으로 유효한 양"은 (i) 특정 질환, 병태 또는 장애를 치료하고, (ii) 특정 질환, 병태, 또는 장애의 하나 이상의 증상을 약화, 개선 또는 제거하고, 또는 (iii) 본 명세서에 기술된 특정 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개시를 예방하거나 지연시키는 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. 암의 경우에, 치료적으로 유효한 양의 약물이 암 세포의 수를 감소시키고; 종양 크기를 감소시키고; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제하고(즉, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중단시키고); 종양 전이를 억제하고(즉, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중단시키고); 종양 성장을 어느 정도 억제하고; 및/또는 암과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 기존 암 세포의 성장을 방지하고/하거나 사멸하는 정도까지, 그것은 세포증식억제 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우, 효능은 예를 들어 질환 진행까지의 시간(TTP)을 평가하고/하거나 반응률(RR)을 결정함에 의해 측정될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서 생리학적 병태를 지칭하거나 기술한다. "종양"은 하나 이상의 암 세포를 포함한다. 암의 예는 암종, 악성종양 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 흑색종 또는 삼중 음성 유방암과 같은 유방암을 포함한다.
발명의 작용제는 과증식성 질환 또는 장애(예를 들어, 암)와 연관된 적어도 하나의 증상을 감소시키도록 투여될 수 있다. 투여된 양은 선택된 조성물, 특정 질환, 포유동물의 체중, 신체 상태 및 연령을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자는 동물 모델 또는 그 분야에 공지된 다른 테스트 시스템을 이용하는 임상의에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 sstRNA, 올리고뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터 또는 조성물의 투여는 예를 들어 수령체의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료인지 여부 및 숙련된 실무자에게 공지된 다른 요인에 의존하여 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 발명의 작용제의 투여는 미리선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 일련의 간격을 둔 용량일 수 있다.
발명의 sstRNA, 올리고뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터 또는 조성물을 갖는 하나 이상의 적합한 단위 투여량 형태가 제형화될 수 있고 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 발명의 작용제가 투여를 위해 제조될 때, 이들은 약학적 제형 또는 단위 투여량 형태를 형성하기 위해 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합될 수 있다. 이러한 제형에서 총 활성 성분은 제형의 0.1 내지 99.9중량%를 포함한다. "약학적으로 허용가능한"은 제형의 다른 성분과 상용성이고 그 수령체에게 유해하지 않은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 염이다. 발명의 작용제를 함유하는 약학적 제형은 잘 알려져 있고 쉽게 이용가능한 성분을 사용하여 당업계에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 발명의 작용제는 또한 투여에 적합한 용액으로 제형화될 수 있다. 발명의 작용제의 약학적 제형은 또한 수성 또는 무수 용액 또는 분산액의 형태, 또는 대안적으로 에멀젼 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있다.
따라서, 작용제는 투여용으로 제형화될 수 있고, 앰플, 사전-충진된 주사기, 소용량 주입 용기 또는 보존제가 첨가된 다중-용량 용기에 단위 용량 형태로 제공될 수 있다. 활성 성분은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 무균, 발열원 없는 물 내에 있을 수 있다. 각 투여량 형태의 개별 용량에 함유된 활성 성분 또는 성분들의 단위 함량은 복수의 투여량 단위의 투여에 의해 필요한 유효량에 도달할 수 있기 때문에 그 자체로 특정 적응증 또는 질환을 치료하기 위한 유효량을 구성할 필요는 없다는 것이 인지될 것이다. 더욱이, 유효량은 개별적으로 또는 일련의 투여에서 투여량 형태에서의 용량 미만을 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 약학적 제형은 선택적 성분으로서 당업계에 잘 알려진 유형의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 가용화제 또는 유화제, 및 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형에 유용한 담체 및/또는 희석제의 특정 비-제한적 예는 물 및 생리학적으로 허용가능한 완충 식염수 용액 예컨대 인산염 완충 식염수 pH 7.0-8.0 및 물을 포함한다.
본 명세서에 제공된 임의의 조성물은 형질감염 또는 형질도입과 같은 유전적 전달 방법으로 세포와 접촉, 세포 안으로 투여 또는 도입되도록 위치될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 임의의 조성물은 유전자 전달 비히클과 함께 또는 그 안에 포함될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 당업계에 공지된 임의의 전달 비히클일 수 있고 수령체 및/또는 지질 매개된 형질감염에 의해 촉진되는 네이키드 핵산뿐만 아니라 임의의 다수의 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 진핵 벡터, 원핵 벡터(예컨대 예를 들어 박테리아 벡터) 및 비제한적으로 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터(인간 및 돼지를 비롯한 기타), 헤르페스 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, SV40 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터 및 유사형의 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "레트로바이러스"는 그 복제 주기 동안 역전사효소를 활용하는 RNA 바이러스와 관련하여 사용된다. 시스터나바이러스 A, 온코바이러스 A, 온코바이러스 B, 온코바이러스 C, 온코바이러스 D, 렌티바이러스 및 스푸마바이러스를 포함하여 패밀리 레트로바이러스과 내에 포함된 여러 속이 있다. 레트로바이러스는 광범위한 종을 감염시키고 수평 및 수직 둘 모두로 전파될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "렌티바이러스"는 천천히 발병하는 질환을 일으키는 레트로바이러스의 군(또는 속)을 지칭한다. 이 군에 포함된 바이러스는 인간 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 병인인 HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형 및 HIV 2형 포함); 양에서 뇌염(비스나) 또는 폐렴(매디)을 야기하는 비스나-매디, 염소에서 면역 결핍, 관절염 및 뇌병증을 야기하는 염소 관절염-뇌염 바이러스; 자가면역 용혈성 빈혈 및 말에서 뇌병증을 야기하는 말 전염성 빈혈 바이러스; 고양이에서 면역 결핍을 야기하는 고양잇과의 면역결핍 바이러스(FIV); 소에서 림프절병증, 림프구증가증 및 가능하게는 중추 신경계 감염을 야기하는 소과의 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 인간-이하 영장류에서 면역 결핍 및 뇌병증을 야기하는 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다. 이들 바이러스에 의해 야기된 질환은 긴 인큐베이션 기간 및 연장된 과정을 특징으로 한다. 일반적으로, 바이러스는 잠복하여 단핵구와 대식세포를 감염시키고 여기에서 이들은 다른 세포로 퍼진다. HIV, FIV 및 SIV는 또한 T 림프구(즉, T-세포)를 쉽게 감염시킨다.
일 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. "AAV" 벡터는 아데노-연관된 바이러스를 지칭하고 자연적으로 발생하는 야생형 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭는데 사용될 수 있다. 이 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고 모든 하위유형, 혈청형 및 유사형, 및 자연적으로 발생하는 및 재조합 두 형태 모두를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "혈청형"은 정의된 항혈청과의 캡시드 단백질 반응성에 기반하여 다른 AAV에 의해 동정되고 이로부터 구별되는 AAV를 지칭하며, 예를 들어 영장류 AAV의 8가지 알려진 혈청형, AAV-1 내지 AAV-9 및 AAVrh10이 있다. 예를 들어, 혈청형 AAV2는 AAV2의 캡 유전자로부터 인코딩된 캡시드 단백질 및 동일한 AAV2 혈청형으로부터의 5' 및 3' ITR 서열을 함유하는 게놈을 함유하는 AAV를 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, rAAV1은 동일한 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 5'-3' ITR 둘 모두를 갖는 AAV를 지칭하기 위해 사용될 수 있거나, 이는 하나의 혈청형으로부터 캡시드 단백질 및 상이한 AAV 혈청형으로부터 5'-3' ITR, 예를 들어, AAV 혈청형 2로부터 캡시드 및 AAV 혈청형 5로부터 ITR을 갖는 AAV를 지칭할 수 있다. 본 명세서에 예시된 각각의 예에 대해, 벡터 디자인 및 생산의 설명은 캡시드 및 5'-3' ITR 서열의 혈청형을 기술한다. 약어 "rAAV"는 재조합 AAV 벡터(또는 "rAAV 벡터")라고도 하는 재조합 아데노-연관된 바이러스를 지칭한다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질(바람직하게는 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의함) 및 캡슐화된 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포로 전달되어 지는 이식유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이것은 전형적으로 "rAAV"로 지칭된다.
일 실시형태에서, AAV 발현 벡터는 전사의 방향으로 작동가능하게 연결된 구성요소로서 적어도 전사 개시 영역, 관심있는 DNA 및 전사 종결 영역을 포함하는 제어 요소를 제공하기 위해 공지된 기술을 사용하여 구축된다. 제어 요소는 포유동물 세포에서 기능하도록 선택된다. 작동가능하게 연결된 구성요소를 함유하는 얻어진 작제물은 기능적 AAV ITR 서열과 측접(5' 및 3')된다.
"아데노-연관된 바이러스 반전된 말단 반복" 또는 "AAV ITR"은 시스에서 DNA 복제의 기원 및 바이러스에 대한 패키징 신호로서 함께 기능하는 AAV 게놈의 각 말단에서 발견되는 해당 분야에서 인식되는 영역을 의미한다. AAV ITR은 AAV rep 코딩 영역과 함께 포유동물 세포 게놈 안으로 2개의 측접하는 ITR 사이에 개재된 뉴클레오티드 서열로부터 효율적인 절제 및 구조와 이의 통합을 제공한다.
AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "AAV ITR"은 묘사된 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요는 없지만, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 부가적으로, AAV ITR은 제한 없이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등을 포함하는 여러 AAV 혈청형 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 더욱이, AAV 벡터에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 측접하는 5' 및 3' ITR은 이들이 의도한 대로 기능하는 한, 즉 숙주 세포 게놈 또는 벡터에서 관심있는 서열의 절제 및 구조를 허용하고 AAV Rep 유전자 산물이 세포에 존재할 때 수령체 세포 게놈 안으로 이종 서열의 통합을 허용하도록 기능하는 한, 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형 또는 단리물에서 유래될 필요는 없다.
일 실시형태에서, AAV ITR은 제한 없이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등을 포함하는 임의의 여러 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 더욱이, AAV 발현 벡터에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 측접하는 5' 및 3' ITR은 이들이 의도한 대로 기능하는 한, 즉 숙주 세포 게놈 또는 벡터에서 관심있는 서열의 절제 및 구조를 허용하고 AAV Rep 유전자 산물이 세포에 존재할 때 수령체 세포 게놈 안으로 DNA 분자의 통합을 허용하도록 기능하는 한, 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형 또는 단리물에서 유래될 필요는 없다.
일 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV2로부터 유래될 수 있다. AAV 벡터에 사용하기에 적합한 DNA 분자는 크기가 약 5킬로베이스(kb) 미만, 약 4.5kb 미만, 약 4kb 미만, 약 3.5kb 미만, 약 3kb 미만, 약 2.5kb 미만일 것이고 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약화된 바이러스"라는 의도된 대상체에서 그의 병원성이 실질적으로 감소되도록 변형된 임의의 바이러스(예를 들어, 약화된 렌티바이러스)를 지칭한다. 바이러스는 임상적 관점에서 비병원성이 되는 지점, 즉 바이러스에 노출된 대상체가 대조군 대상체에 비해 통계적으로 유의하게 증가된 병리 수준을 나타내지 않는 지점까지 약화될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"은 바이러스 또는 벡터 핵산을 바이러스 캡시드 또는 입자 안으로 삽입하는데 필요하거나 적어도 용이하게 하는 바이러스 게놈 또는 벡터 내에 위치한 서열을 지칭한다. 용어 "패키징 신호"는 기능적 패키징 신호로 전사되는 벡터 서열을 지칭하기 위해 편의상 사용되기도 한다. 패키징 벡터와 이식유전자 벡터 사이의 차이점은 패키징 벡터에서 주요 패키징 신호가 비활성화되고 이식유전자 벡터에서는 주요 패키징 신호가 기능적이라는 것일 수 있다. 이상적으로는, 일부 실시형태에서, 패키징 벡터에서 모든 패키징 신호는 비활성화될 것이고, 이식유전자 벡터에서는 모든 패키징 신호가 기능적일 것이다. 그러나, 바이러스 역가를 최대화하거나 동종 재조합을 억제하는 것과 같은 상쇄하는 고려사항은 그러한 작제물을 덜 바람직하게 만들 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 조성물은 세포와 접촉되거나 나노입자와 같은 입자 내에서 대상체에게 전달 또는 투여될 수 있다. 나노입자와 같은 입자는 지질-기반 나노입자(또한 본 명세서에서 지질 나노입자, 즉 그 구조를 구성하는 대부분의 물질이 지질인 나노입자라고도 함), 바이러스-유사 입자(즉, 주로 바이러스 구조 단백질로 구성되지만 감염성이 없거나 감염성이 낮은 입자) 및/또는 나노물질의 조합을 가진 입자일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 입자는 구형, 직육면체형, 피라미드형, 장방형, 원통형, 도넛형 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 상이한 형상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 나노입자와 같은 입자는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자와 같은 입자는 리포솜을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자와 같은 입자는 지질 이중층을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자와 같은 입자는 지질 단층을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자와 같은 입자는 미셀을 포함할 수 있다.
발명은 이제 다음 비-제한적 실시예에 의해 예시된다.
실시예
실시예 1
안티코돈 루프가 비동족 삼중항 DNA 코돈에 특이적이도록 변형된 트랜스퍼 RNA 분자가 생성되었다. 이들 SWTX(tRNA eXchange로 치환) tRNA는 인간 유전자 코드 내의 센스 코돈(본 명세서에서는 센스 억제자 tRNA(sstRNA)라고도 함)을 억제할 수 있다.
간략하게, 단일-플라스미드 설계를 사용하여 코돈-스와핑된 tRNA 및 GFP 리포터를 발현했다. tRNA 카세트는 업스트림 리더 서열에 이어서 다운스트림 종결자를 함유한다. HEK 293 세포를 다음과 같이 역형질감염시켰다. 세포는 해동 후 적어도 3일 동안 매일 배양액에서 계대되었고 70% 컨플루언시로 성장되었다. 플라스미드 cDNA를 형질감염 시약과 혼합하고 96-웰에 첨가한 후 HEK293 세포를 10K/180ul 밀도로 첨가했다. 세포를 그 다음 24시간 및 48시간 시점에서 GFP 발현에 대해 영상화하였다.
결과
대체 아미노산을 전달할 수 있는 SWTX tRNA 또는 sstRNA가 생성되었다. 예를 들어 SWTX2 및 SWTS3는 프롤린 삼중항 코돈을 디코딩하여 프롤린(CCA) 코돈에 류신을 배치한다(소문자는 안티코돈 삼중항을 나타냄). 즉, 류신 tRNA는 프롤린(CCA) 코돈에서 류신을 인코딩하도록 리코딩되어 생성되었다.
SWTX2:
ACCAGAATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtggGATCCAATGGATTCATATCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTTCTGGTA (서열번호:1)
SWTX3:
ACCGGGATGGCTGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtggGATCCAATGGACAGGTGTCCGCGTGGGTTCGAGCCCCACTCCCGGTA (서열번호:2)
이들 작제물의 공동-형질감염은 GFP 발현 및 세포 분열을 빠르게 완화했다(도 3). 일시적인 형질감염에 의한 SWTX2 또는 SWTX3 tRNA 작제물의 공동-발현은 결과적으로 신속하고 유해한 생물학적 활성을 나타내는 GFP의 세포 생산을 손상시킨다. SWTX5 또는 SWTX7 tRNA 작제물의 공동-발현 결과도 표시된다(도 4).
실시예 2
상기 기술된 바와 같이, 그리고 얻어진 GFP 강도(SWTX51 및 52는 올-인-원 플라스미드 설계를 가짐)와 관련하여 플라스미드에서 발현될 때 스크리닝된 일부에 대해 생성된 tRNA 작제물의 추가 예(도 5 - 8)는 다음과 같다:
Pro -> Leu AAG(Leu 억제 및 Pro로 변환)
SWTX 11:
GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATGATTCTCGCTTaagGTGCGAGAGGtCCCGGGTTCAAATCCCGGACGAGCCC (서열번호:3)
SWTX 13:
GGCTCGTTGGTCTAGTGGTATGATTCTCGCTTaagGTGCGAGAGGtCCCGGGTTCAAATCCCGGACGAGCCC (서열번호:4)
Leu - > Pro AGG (Pro 억제 및 Leu로 변환)
SWTX 31:
GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTaggGTTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACTTCTGACA (서열번호:5)
SWTX 32:
GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTaggGTTCTGGTCTCCGTATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACTTCTGACA (서열번호:6)
SWTX 33:
GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTaggGTTCTGGTCTCCGCATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACTTCTGACA (서열번호:7)
SWTX 34:
ACCAGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTaggGATCCAATGGACATATGTCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTCCTGGTA (서열번호:8)
SWTX 35:
ACCGGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTaggGATCCAATGGGCTGGTGCCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTCTCGGTA (서열번호:9)
SWTX 36:
ACCAGAATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTaggGATCCAATGGATTCATATCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTTCTGGTA (서열번호:10)
Leu - > Pro TGG (Pro 억제 및 Leu로 변환)
SWTX 50:
ACCAGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtggGATCCAATGGACATATGTCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTCCTGGTA (서열번호:11)
SWTX 51:
ACCGGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtggGATCCAATGGGCTGGTGCCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTCTCGGTA (서열번호:12)
SWTX 52:
ACCAGAATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtggGATCCAATGGATTCATATCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTTCTGGTA (서열번호:13)
Ile - > Pro AGG (Pro 억제 및 Ile로 변환)
SWTX 55:
GGCCGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGGTGCTaggAACGCCAAGGtCGCGGGTTCGATCCCCGTACTGGCCA (서열번호:14)
SWTX 57:
GGCCGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGGTGCTaggAACGCCAAGGtCGCGGGTTCGAACCCCGTACGGGCCA (서열번호:15)
사용된 플라스미드 서열은 다음과 같다:
SWTX 31
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTaggGTTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACTTCTGACAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:16)
SWTX 32
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTaggGTTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACTTCTGACAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATC (서열번호:17)
SWTX 33
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTaggGTTCTGGTCTCCGTATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACTTCTGACAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:18)
SWTX 34
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTaggGTTCTGGTCTCCGCATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACTTCTGACAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:19)
SWTX 35
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCACCAGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTaggGATCCAATGGACATATGTCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTCCTGGTAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:20)
SWTX 36
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCACCGGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTaggGATCCAATGGGCTGGTGCCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTCTCGGTAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:21)
SWTX 50
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtggGTTCTGGTCTCCGCATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACTTCTGACAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:22)
SWTX 51
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCACCAGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtggGATCCAATGGACATATGTCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTCCTGGTAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:23)
SWTX 52
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCACCGGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtggGATCCAATGGGCTGGTGCCCGCGTGGGTTCGAACCCCACTCTCGGTAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:24)
SWTX 55
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGGCCGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGGCGCTaagAACGCCAAGGtCGCGGGTTCGATCCCCGTACGGGCCAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:25)
SWTX 57
G0619 pFBAAVmcsCMVeGFPSV40pA
CTCGAGCAGATACACTGTCTTTGACACGTTGATGGATTAAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGGCTGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGGTGCTaagAACGCCAAGGtCGCGGGTTCGATCCCCGTACTGGCCAGTCCTTTTTTTGTGCTACGGCGATTCTTGGAGAGCCAGCTGCGATCGCTAGGATCC (서열번호:26)
실시예 3
다수의 생성된 sstRNA는 또한 다음 세포주에서 형질감염되었다(WT GFP 또는 GFP + SWTX 51 또는 SWTX 52 작제물, SWTX51 및 52는 올-인-원 플라스미드 설계를 가짐)(위와 유사한 HEK293T, 도 8 및 11).
SK-MEL-3: 악성 흑색종, 피부; 전이 부위에서 유래: 림프절. 이 세포주에 대한 기본 배지는 ATCC-제형화된 McCoy's 5a 배지 변형된, 카탈로그 번호 30-2007이었다. 완전한 성장 배지를 만들기 위해 다음 성분을 기본 배지에 첨가했다: 최종 농도 15%까지 태아 소 혈청. 역형질감염을 수행하였다.
RPMI-7951: 악성 흑색종, 피부; 전이 부위에서 유래: 림프절. 이 세포주에 대한 기본 배지는 ATCC-제형화된 이글스 최소 필수 배지(MEM), 카탈로그 번호 30-2003이었다. 완전한 성장 배지를 만들기 위해 다음 성분을 기본 배지에 첨가했다: 최종 농도 10%까지 태아 소 혈청. FUGENE을 형질감염 시약으로 사용하였다.
결과는 SWTX 51 및 SWTX 52가 흑색종 라인에서 단백질 생산을 손상시킨다는 것을 나타낸다(도 9, 10 및 12).
실시예 4
GFP 발현에 대한 tRNA 카세트 프로모터 간섭의 가능성을 평가하기 위해 양 tRNA가 GFP 리포터와 동일한 플라스미드 페이로드(즉, "시스" 형태)에 있는 SWTX 51 및 52 tRNA의 "올인원" 설계가 사용되었다. SWTX 51 및 52 tRNA는 리포터와 분리된 그 자체 플라스미드((SWTX 2 및 SWTX3라고 함)에서 공동-발현되었다. 이것은 "트랜스" 형태이다. SWTX 2 및 SWTX 활성은 tdtomato(적색 형광 단백질) 및 나노루시퍼라제 발현에 대해 흑색종 세포주를 사용하여 평가되었다. SWTX 2 및 SWTX3은 tdtomato뿐만 아니라 nanoluc를 성공적으로 녹아웃하였다(도 13 및 14, 24시간 결과, 및 도 15, 48시간 결과 및 16, 24시간 및 48시간 결과).
실시예 5
tRNA가 리포펙타민 및 역형질감염에 의해 전달되었을 때 RPMI-7951 흑색종 세포에서 GFP의 tRNA 매개된 녹-다운이 관찰되었다. SWTX 51 및 SWTX 52는 SKMEL 흑색종 세포주에서 리포터 단백질 기능/발현을 손상시켰다. 결과는 SK Mel 3 흑색종 세포주 및 HCC 삼중 음성 세포주에 나타나 있다(도 17-19). SK Mel의 경우, RPMI-7951 및 HEK 비교가 맨 위에는 WT GFP와, 이어서 SWTX 51 및 SWTX 52로 도시되어 있다.
실시예 6
두 작제물: SWTX 2 및 SWTX3의 조합, SWTX 51 및 52의 "tRNA 단독" 버전이 사용되었다. 데이터는 숙주 리보솜을 동시적으로 공격하는 2개의 tRNA가 단일 작제물보다 더 강력할 수 있음을 시사한다. 48시간까지(도 20) 세포사는 SWTX 2+3 조건에서 관찰되지만 GFP 단독에서는 관찰되지 않는다. 48시간에 스크래치 검정을 수행하여 제거된 영역으로 다시 이동하는 세포의 능력을 측정했다. 72시간 후, GFP 세포는 건강하고 형광을 유지하고 스크래치에 의해 만들어진 제거를 대부분 다시 채웠다. SWTX2+3 세포에는 광범위한 세포사가 있고 운동성이 없고 GFP 발현이 거의 없다.
실시예 7
HEK 세포와 내인성 대사 단백질인 mTOR의 sstRNA 발현의 삼중 조합을 사용하여, 대사의 조절인자를 조사했다. 이 단백질은 류신 또는 이소류신으로 돌연변이될 수 있는 90개 초과의 프롤린 코돈을 갖는다. 도 21의 왼쪽에 있는 파란색 얼룩은 모두 단백질이고, 같은 도면에서 오른쪽은 다양한 조건 및 시점에서 mTOR에 대한 웨스턴이다.
다수의 SWTX tRNA의 조합이 테스트되었으며 SWTX 2/3/57의 삼중 조합이 72시간에서 가장 큰 영향을 미쳤다(적색 별표). 레인이 단백질로 충진되어 있어도 mTOR의 수준은 유의하게 영향을 받는다. 효과는 리보솜에 영향을 주기 위해 일반적으로 사용되는 시클로헥사미드보다 훨씬 더 두드러진다.
전술한 명세서 및 실시예는 본 발명을 완전히 개시하고 가능하게 하지만, 본 명세서에 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 참조로 포함된다. 전술한 명세서에서 본 발명은 이의 특정 실시형태와 관련하여 기술되었고 많은 세부사항이 설명의 목적으로 제시되었지만, 발명이 추가적인 실시형태에 민감하고 본 명세서에 기술된 특정 세부사항이 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고 상당히 변경될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
발명을 기술하는 맥락에서 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 지시대상의 사용은 본 명세서에서 달리 나타내거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포괄하는" 및 "함유하는"은 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만 이에 제한되지 않음"을 의미)로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위의 인용은 단지 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서 역할을 하기 위한 것이고, 각각의 별개의 값은 본 명세서에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 및 모든 실시예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이고 달리 청구되지 않는 한 발명의 범주를 제한하지 않는다. 명세서에서 어떤 언어도 임의의 청구되지 않은 요소를 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
발명을 수행하기 위해 발명자들에게 알려진 최선의 양식을 포함하는 본 발명의 실시형태들이 본 명세서에 기술된다. 이들 실시형태의 변형은 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있다. 발명자들은 숙련된 기술자가 이러한 변형을 적절하게 이용할 것을 기대하고, 발명자는 발명이 본 명세서에 구체적으로 기술된 것과 달리 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 해당 법률이 허용하는 바에 따라 본 명세서에 첨부된 청구범위에 인용된 대상 물질의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본 명세서에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 상기-기술된 요소들의 모든 가능한 변형의 임의의 조합이 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> UNIVERSITY OF IOWA RESEARCH FOUNDATION
<120> SENSE, SUPPRESSOR TRANSFER RNA COMPOSITIONS AND RELATED USES AND
FUNCTIONS
<130> 17023.246WO1
<140> PCT/US2021/065508
<141> 2021-12-29
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<151> 2021-02-19
<150> 63/151,416
<151> 2021-02-19
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<151> 2020-12-31
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
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accagaatgg ccgagtggtt aaggcgttgg acttgggatc caatggattc atatccgcgt 60
gggttcgaac cccacttctg gta 83
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accgggatgg ctgagtggtt aaggcgttgg acttgggatc caatggacag gtgtccgcgt 60
gggttcgagc cccactcccg gta 83
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ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc ttaaggtgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cc 72
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ggctcgttgg tctagtggta tgattctcgc ttaaggtgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
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gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactagggtt ctggtctcca atggaggcgt 60
gggttcgaat cccacttctg aca 83
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gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactagggtt ctggtctccg tatggaggcg 60
tgggttcgaa tcccacttct gaca 84
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gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactagggtt ctggtctccg catggaggcg 60
tgggttcgaa tcccacttct gaca 84
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accaggatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actagggatc caatggacat atgtccgcgt 60
gggttcgaac cccactcctg gta 83
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accgggatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actagggatc caatgggctg gtgcccgcgt 60
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accgggatgg ccgagtggtt aaggcgttgg acttgggatc caatgggctg gtgcccgcgt 60
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accagaatgg ccgagtggtt aaggcgttgg acttgggatc caatggattc atatccgcgt 60
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ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgg tgctaggaac gccaaggtcg cgggttcgat 60
ccccgtactg gcca 74
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ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgg tgctaggaac gccaaggtcg cgggttcgaa 60
ccccgtacgg gcca 74
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ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcgtcagg atggccgagt ggtctaaggc 120
gccagactag ggttctggtc tccaatggag gcgtgggttc gaatcccact tctgacagtc 180
ctttttttgt gctacggcga ttcttggaga gccagctgcg atcgctagga tcc 233
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ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcgtcagg atggccgagt ggtctaaggc 120
gccagactag ggttctggtc tccaatggag gcgtgggttc gaatcccact tctgacagtc 180
ctttttttgt gctacggcga ttcttggaga gccagctgcg atcgctagga tc 232
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ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcgtcagg atggccgagt ggtctaaggc 120
gccagactag ggttctggtc tccgtatgga ggcgtgggtt cgaatcccac ttctgacagt 180
cctttttttg tgctacggcg attcttggag agccagctgc gatcgctagg atcc 234
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ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcgtcagg atggccgagt ggtctaaggc 120
gccagactag ggttctggtc tccgcatgga ggcgtgggtt cgaatcccac ttctgacagt 180
cctttttttg tgctacggcg attcttggag agccagctgc gatcgctagg atcc 234
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ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcaccagg atggccgagt ggttaaggcg 120
ttggactagg gatccaatgg acatatgtcc gcgtgggttc gaaccccact cctggtagtc 180
ctttttttgt gctacggcga ttcttggaga gccagctgcg atcgctagga tcc 233
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ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcaccggg atggccgagt ggttaaggcg 120
ttggactagg gatccaatgg gctggtgccc gcgtgggttc gaaccccact ctcggtagtc 180
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ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcgtcagg atggccgagt ggtctaaggc 120
gccagacttg ggttctggtc tccgcatgga ggcgtgggtt cgaatcccac ttctgacagt 180
cctttttttg tgctacggcg attcttggag agccagctgc gatcgctagg atcc 234
<210> 23
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<213> Artificial Sequence
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ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcaccagg atggccgagt ggttaaggcg 120
ttggacttgg gatccaatgg acatatgtcc gcgtgggttc gaaccccact cctggtagtc 180
ctttttttgt gctacggcga ttcttggaga gccagctgcg atcgctagga tcc 233
<210> 24
<211> 233
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ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcaccggg atggccgagt ggttaaggcg 120
ttggacttgg gatccaatgg gctggtgccc gcgtgggttc gaaccccact ctcggtagtc 180
ctttttttgt gctacggcga ttcttggaga gccagctgcg atcgctagga tcc 233
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 25
ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcggccgg ttagctcagt tggttagagc 120
gtggcgctaa gaacgccaag gtcgcgggtt cgatccccgt acgggccagt cctttttttg 180
tgctacggcg attcttggag agccagctgc gatcgctagg atcc 224
<210> 26
<211> 224
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 26
ctcgagcaga tacactgtct ttgacacgtt gatggattaa gcgctccggt ttttctgtgc 60
tgaacctcag gggacgccga cacacgtaca cgtcggctgg ttagctcagt tggttagagc 120
gtggtgctaa gaacgccaag gtcgcgggtt cgatccccgt actggccagt cctttttttg 180
tgctacggcg attcttggag agccagctgc gatcgctagg atcc 224
<210> 27
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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oligonucleotide"
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(17)
<223> Dihydrouridine
<220>
<221> modified_base
<222> (39)..(39)
<223> Pseudouridine
<220>
<221> modified_base
<222> (55)..(55)
<223> Pseudouridine
<400> 27
gcggauuuag cucagnnggg agagcgccag acugaayanc uggagguccu gugtncgauc 60
cacagaauuc gcacca 76
Claims (34)
- 수용체 줄기 및 비동족 코돈에 특이적인 안티코돈을 포함하는 센스, 억제자 트랜스퍼 RNA(sstRNA).
- 제1항에 있어서, 상기 안티코돈은 류신 코돈에 특이적인, sstRNA.
- 제2항에 있어서, 상기 수용체 줄기는 프롤린에 특이적인, sstRNA.
- 제3항에 있어서, 상기 sstRNA는 서열번호: 3 및 4에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩되는, sstRNA.
- 제1항에 있어서, 상기 안티코돈은 프롤린 코돈에 특이적인, sstRNA.
- 제5항에 있어서, 상기 수용체 줄기는 류신에 특이적인, sstRNA.
- 제6항에 있어서, 상기 sstRNA는 서열번호: 1, 2 및 5-13에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩되는, sstRNA.
- 제5항에 있어서, 상기 수용체 줄기는 이소류신에 특이적인, sstRNA.
- 제8항에 있어서, 상기 sstRNA는 서열번호: 14 및 15에 제시된 서열에 의해 인코딩되는, sstRNA.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드.
- 제10항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 150개 미만의 뉴클레오티드 또는 300개 미만의 뉴클레오티드의 총 길이를 갖는, 올리고뉴클레오티드.
- 제11항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 cDNA와 같은 DNA인, 올리고뉴클레오티드.
- 제11항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 RNA인, 올리고뉴클레오티드.
- 프로모터 및 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA, 또는 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트.
- 제14항에 있어서, 종결자를 추가로 포함하는, 발현 카세트.
- 서열번호: 16-26에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호: 16-26에 제시된 적어도 2개 또는 3개의 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
- 제17항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터인, 벡터.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 또는 제17항 또는 제18항의 벡터, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
- 제19항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 나노입자와 같은 입자인, 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 입자는 리포솜 또는 지질 나노입자인, 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제17항 또는 제18항의 벡터, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포.
- 단백질 발현 또는 기능을 변형하거나 파괴하는 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제17항 또는 제18항의 벡터, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 세포에서 단백질 발현 또는 기능을 파괴하기 위한 효과적인 양으로 세포 내로 전달하는 것을 포함하는, 방법.
- 세포를 사멸하는 방법으로서, 세포를 사멸시키는데 유효한 양인, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제17항 또는 제18항의 벡터, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 세포 생존을 감소시키는 방법으로서, 세포의 생존을 감소시키는데 유효한 양인, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제17항 또는 제18항의 벡터, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 세포 운동성을 감소시키는 방법으로서, 세포의 운동성을 감소시키기에 효과적인 양인, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제17항 또는 제18항의 벡터, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 면역 세포를 활성화시키는 방법으로서, 면역 세포를 활성화시키기에 효과적인 양인, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제17항 또는 제18항의 벡터, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 시험관내인, 방법.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 생체내인, 방법.
- 과증식성 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 과증식성 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 양인, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 sstRNA, 선택적으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제17항 또는 제18항의 벡터, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 과증식성 질환 또는 장애는 암인, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 암은 흑색종 또는 삼중 음성 유방암과 같은 유방암인, 방법.
- 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA가 있을 때, 상기 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA는 동일한 올리고뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터 또는 조성물에 있는, 방법.
- 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA가 있을 때, 상기 적어도 2개 또는 3개의 sstRNA는 적어도 2개 또는 3개의 상이한 올리고뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터 또는 조성물에 있는, 방법.
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