JP2021511776A

JP2021511776A - 細胞リプログラミングのための方法および組成物

Info

Publication number: JP2021511776A
Application number: JP2019545707A
Authority: JP
Inventors: チャン，カン; ホウ，ルイ; リ，ゲン
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2021-05-13
Also published as: US20220033792A1; EP3534911A4; CN110139654A; CA3042691A1; BR112019009116A2; US20180119122A1; AU2017355481A1; WO2018085644A1; EP3534911A1; CN108018314A; HK1254984A1

Abstract

眼の細胞中の視細胞特異的核内受容体および神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質をコードするものなど、遺伝子の発現を妨げることによって、網膜色素変性、黄斑変性、および他の網膜の疾病を処置するための方法および医薬組成物が本明細書に開示される。これらの方法および組成物は核酸ベースの治療法を使用する。【選択図】図４

Description

相互参照
本出願は、２０１６年１１月３日出願の米国仮特許出願第６２／４１７，１９４号、及び２０１７年３月３０日出願の米国仮特許出願第６２／４７９，１６７号の利益を主張するものであり、それらは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。２０１７年１０月３１日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、４９６９７−７１３−ＳＥＱ．ｔｘｔと題され、４．３１バイトの大きさである。

本開示の背景技術
遺伝子治療、すなわち、疾病を治療するために患者の細胞への核酸の送達は、様々な成功と共に、数十年間熟考され、試験されてきた。治療される疾病は、一般に末期疾患（例えば癌、白血病）および極めて衰弱性の疾患（例えば、重症複合免疫不全症）である。

遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡに細胞を接触させることを含む、第１の細胞型から第２の細胞型へと細胞をリプログラミングする方法であって、ここで、遺伝子が、細胞の細胞型特異的機能に寄与するタンパク質と；標的部位で遺伝子鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼとをコードし、ここで、鎖を切断することは、細胞がもはや細胞型特異的機能を実行することができないように遺伝子の発現を修飾し、それによって、第２の細胞型へ細胞リプログラミングする、方法が本明細書に開示される。遺伝子は突然変異を含み得る。第１の細胞型は突然変異に対して感受性があり得、ここで、第２の細胞型は突然変異に対して耐性がある細胞型である。突然変異は、第１の細胞型中にのみ有害な影響を引き起こし得る。有害な影響は、老衰、アポトーシス、分化の欠如、および異常な細胞増殖から選択され得る。遺伝子は転写因子をコードし得る。第１の細胞型および第２の細胞型は、密接に関連する高分化の成熟細胞型であってもよい。リプログラミングはインビボで起こり得る。リプログラミングはインビトロまたはエクスビボで起こり得る。細胞は、膵臓、心臓、脳、眼、腸、結腸、筋肉、神経系、前立腺、または乳房の細胞であり得る。細胞は分裂終了細胞であってもよい。細胞は眼の中の細胞であってもよい。細胞は網膜細胞であってもよい。網膜細胞は桿体であってもよい。細胞型特異的機能は、夜間視力または色覚であり得る。遺伝子は、ＮＲＬ、ＮＲ２Ｅ３、ＧＮＡＴ１、ＲＯＲベータ、ＯＴＸ２、ＣＲＸ、およびＴＨＲＢから選択され得る。遺伝子は、ＮＲＬおよびＮＲ２Ｅ３から選択され得る。第１の細胞型は桿体であってもよく、第２の細胞型は錐状体であってもよい。錐状体は被験体内で明視が可能であり得る。第１の細胞型は桿体であってもよく、第２の細胞型は多能性細胞であってもよい。第１の細胞型は桿体であってもよく、第２の細胞型は多能性の網膜前駆細胞であってもよい。細胞は癌細胞であり得る。機能は、異常な細胞増殖、転移、および腫瘍血管新生から選ばれてもよい。第１の細胞型は結腸癌細胞であり得、第２の細胞型は良性の腸または結腸の細胞であり得る。遺伝子は、ＡＰＣ、ＭＹＨ１、ＭＹＨ２、ＭＹＨ３、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＥＰＣＡＭ、ＰＯＬＥ１、ＰＯＬＤ１、ＮＴＨＬ１、ＢＭＰＲ１Ａ、ＳＭＡＤ４、ＰＴＥＮ、およびＳＴＫ１１から選択され得る。第１の細胞型は悪性のＢ細胞であり得、第２の細胞型は良性のマクロファージであり得る。遺伝子は、Ｃ−ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、およびＣＤ１９から選択され得る。細胞はニューロンであってもよい。細胞は介在ニューロンであってもよい。介在ニューロンは水平細胞であってもよい。第１の細胞型は、アミロイドベータ、タウタンパク質、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのタンパク質を産生することができ、第２の細胞型はタンパク質を産生しないか、または第１の細胞型より少ないタンパク質を産生する。第１の細胞型はニューロンであり得、第２の細胞型はグリア細胞であり得る。遺伝子は、ＡＰＰおよびＭＡＰＴから選択され得る。第１の細胞型はαシヌクレインを産生する。第１の細胞型はグリア細胞であり得、第２の細胞型はドーパミン産出ニューロンであり得る。遺伝子は、ＳＮＣＡ、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、およびＰＩＮＫ１から選択され得る。遺伝子はαシヌクレイン（ＳＮＣＡ）であり得る。第２の細胞型は、ドーパミン作動性ニューロンおよびドーパミン作用性前駆細胞から選択され得る。第１の細胞型は、非ドーパミン作動性ニューロンまたはグリア細胞であってもよい。

必要とする被験体の疾病を、リプログラミング細胞を用いて治療する方法であって、ここでリプログラミングされた細胞は、遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡに細胞を接触させることによって産生され、ここで、遺伝子が、細胞の細胞型特異的特徴に寄与するタンパク質と；標的部位で遺伝子鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼとをコードし、ここで、鎖を切断することは細胞がもはや細胞型特異的機能を実行することができないように遺伝子の発現を修飾し、それによって、第２の細胞型へ細胞リプログラミングする、方法が本明細書にさらに開示される。リプログラミングされた細胞は、被験体にとって自己由来であり得る。疾病は網膜変性を含み得る。疾病は、黄斑変性、網膜色素変性、および緑内障から選択され得る。疾病は網膜色素変性であってもよい。疾病は癌であり得る。癌は結腸癌または乳癌であり得る。疾病は、神経変性の疾患であり得る。疾病は、パーキンソン病およびアルツハイマー病から選択され得る。

疾病を治療する方法であって、該方法は：第１のタイプの細胞中の遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡであって、ここで、遺伝子が第１のタイプの細胞の第１の機能に寄与するタンパク質をコードする、第１のガイドＲＮＡと；標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼであって、ここで、遺伝子の鎖を切断することは、第１のタイプの細胞が第１のタイプの細胞から第２のタイプの細胞へ切り替えられるように遺伝子の発現を修飾し、結果としてもたらされる第２のタイプの細胞における存在または増加は疾病を改善する、Ｃａｓヌクレアーゼとを、必要とする被験体に投与する工程を含む方法が本明細書に開示される。遺伝子の発現を修飾することは、第１のタイプの細胞の遺伝子の発現を少なくとも約９０％減少させることを含み得る。遺伝子の発現を修飾することは、遺伝子を編集することを含み得、ここで、編集することは、遺伝子からのタンパク質を産出しないか、または遺伝子からの非機能的タンパク質を産出する結果となる。疾病は眼の疾病であり得、第１のタイプの細胞は第１のタイプの眼細胞であり得、第２のタイプの細胞は第２のタイプの眼細胞であり得る。機能は、第１のタイプの眼細胞中で行なわれ得るが、第２のタイプの眼細胞中では行われない。第２のタイプの眼細胞は第２の機能を行なうことができ、ここで、第２の機能は第１のタイプの眼細胞によって行われ得ない。第１のタイプの眼細胞は桿体であり得、第２のタイプの眼細胞は錐状体であり得る。眼の疾病は、網膜変性、網膜色素変性、または黄斑変性であってもよい。遺伝子は、ＮＲ２Ｅ３およびＮＲＬから選択され得る。方法は、桿体を錐状体に、または桿体を多能性の網膜前駆細胞にリプログラミングすることを含み得る。眼の疾病は緑内障であり得、第２のタイプの眼細胞は網膜神経節細胞であり得る。第１の細胞型はミュラーグリア細胞であってもよい。遺伝子はＡＴＯＨ７であってもよい。遺伝子は、ＢＲＮ−３タンパク質（それぞれＢＲＮ３Ａ、ＢＲＮ３Ｂ、ＢＲＮ３Ｃ）をコードするＰＯＵ４Ｆ遺伝子（ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ２、またはＰＯＵ４Ｆ３）であり得る。遺伝子は、ＩＳＬ１とも呼ばれるＩｓｌｅｔ１であり得る。遺伝子は、ｐ１６をコードするＣＤＫＮ２Ａであり得る。遺伝子はＳｉｘ６であり得る。方法は、ベクター、リポソーム、およびリボ核タンパクから選択される送達ビヒクルにおいて、ＣａｓヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを投与することを含み得る。方法は、細胞を第２のガイドＲＮＡと接触させることを含み得る。方法は、第２のガイドＲＮＡを投与することを含み得る。方法は、新規スプライス部位を遺伝子に導入することを含み得る。新規スプライス部位の導入は、結果としてエクソンまたはその一部を遺伝子のコード配列から取り除く。エクソンは、遺伝子中に突然変異を含み得る。突然変異は、第１の細胞型中にのみ有害な影響を引き起こし得る。有害な影響は、老衰、アポトーシス、分化の欠如、および異常な細胞増殖から選択され得る。遺伝子は転写因子をコードし得る。第１のタイプの細胞は突然変異に対して感受性があり得、第２のタイプの細胞は突然変異に対して耐性があり得る。方法は、遺伝子に新規エクソンを導入することを含み得る。方法は、遺伝子に少なくとも１つのヌクレオチドを導入することを含み得る。方法は、遺伝子に新規エクソンを導入することを含み得る。

ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、第１のガイドＲＮＡ、および第２のガイドＲＮＡを含むシステムであって、ここで、第１のガイドＲＮＡは、遺伝子の少なくとも第１の領域の第１の部位５’のＣａｓ９切断を標的化し、第２のガイドＲＮＡは、遺伝子の第１の領域の第２の部位３’のＣａｓ９切断を標的化し、それによって、遺伝子の領域を切除するシステムが本明細書にさらに開示される。第１のガイドＲＮＡは少なくとも第１のエクソンの第１の部位５’のＣａｓ９切断を標的化することができ、第２のガイドＲＮＡは、少なくとも第１のエクソンの第２の部位３’のＣａｓ９切断を標的化し、それによって、少なくとも第１のエクソンを切除する。システムは、ドナーポリヌクレオチドを含むことができ、ここで、ドナーポリヌクレオチドは第１の部位および第２の部位の間に挿入され得る。ドナーポリヌクレオチドは、ドナーエクソンの５’末端および３’末端にスプライス部位を含むドナーエクソンを含んでもよい。ドナーポリヌクレオチドは野生型配列を含み得る。遺伝子は、ＮＲＬおよびＮＲ２Ｅ３から選択され得る。第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質をＳＥＱＩＤＮＯ．：１−４のいずれか１つを含む配列に標的化し得る。

ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、第１のガイドＲＮＡ、および第２のガイドＲＮＡを含むキットであって、ここで、第１のガイドＲＮＡは、遺伝子の少なくとも第１の領域の第１の部位５’のＣａｓ９切断を標的化し、第２のガイドＲＮＡは、遺伝子の第１の領域の第２の部位３’のＣａｓ９切断を標的化し、それによって、遺伝子の領域を切除する、キットが本明細書にさらに開示される。第１のガイドＲＮＡは少なくとも第１のエクソンの第１の部位５’のＣａｓ９切断を標的化することができ、第２のガイドＲＮＡは、少なくとも第１のエクソンの第２の部位３’のＣａｓ９切断を標的化することができ、それによって、少なくとも第１のエクソンを切除する。キットは、ドナーポリヌクレオチドを含むことができ、ここで、ドナー核酸が第１の部位および第２の部位の間に挿入され得る。ドナーポリヌクレオチドは、ドナーエクソンの５’末端および３’末端にスプライス部位を含むドナーエクソンを含んでもよい。ドナーポリヌクレオチドは野生型配列を含み得る。遺伝子は、ＮＲＬおよびＮＲ２Ｅ３から選択され得る。第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質をＳＥＱＩＤＮＯ．：１−４のいずれか１つを含む配列に標的化し得る。

以下を含む被験体の眼の疾病を治療するための医薬組成物が本明細書にさらに開示される：ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと；ＮＲＬ遺伝子およびＮＲ２Ｅ３遺伝子から選択される遺伝子の一部に相補的な、少なくとも１つのガイドＲＮＡ。ポリヌクレオチドはＣａｓタンパク質をコードすることができ、少なくとも１つのガイドＲＮＡが少なくとも１つのウイルスベクター中に存在する。Ｃａｓタンパク質または少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドがリポソーム中に存在する。少なくとも１つのガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＳＥＱＩＤＮＯ．：１−４のいずれか１つを含む配列に標的化することができる。医薬組成物は、点眼剤を用いて投与するための液体として製剤され得る。医薬組成物は、硝子体内投与のための液体として製剤され得る。

細胞中の遺伝子を編集する方法であって、該方法は；細胞を、遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと；ドナー核酸と、に接触させる工程を含む方法が本明細書に開示される。ドナー核酸は、非相同末端結合を介して遺伝子に挿入され得る。細胞は分裂終了細胞であってもよい。遺伝子はＭｅｒｔｋ遺伝子であってもよい。細胞は、被験体の眼の網膜中の細胞であり得る。

被験体の網膜変性を治療する方法であって、該方法は：被験体の網膜を、遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと；非相同末端結合を介して遺伝子に挿入されるドナー核酸と、に接触させる工程を含む方法が本明細書にさらに開示される。網膜変性は網膜色素変性であり得る。遺伝子はＭｅｒｔｋ遺伝子であってもよい。

被験体のβサラセミアを治療する方法であって、該方法は：被験体の造血幹細胞／前駆細胞を、ヘモグロビン遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；標的部位でヘモグロビン遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと；非相同末端結合を介して遺伝子に挿入されるドナー核酸と、に接触させる工程を含む方法が本明細書に開示される。ドナー核酸は、ＣＤ４１／４２突然変異を含むヘモグロビン遺伝子の一部を置き換えることができる。

被験体の癌を治療する方法であって、該方法は：被験体のＴ細胞を、免疫チェックポイント阻害剤をコードする遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと、に接触させる工程を含む方法が本明細書に開示される。方法は、Ｔ細胞をドナー核酸と接触させることを含み得、ここで、ドナー核酸は非相同末端結合を介して遺伝子に挿入される。遺伝子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）をコードするＰＤＣＤ１であり得る。癌は転移性癌であり得る。癌は、転移性卵巣癌、転移性黒色腫、転移性肺非小細胞癌、または転移性腎細胞癌であり得る。

被験体の癌を治療する方法であって、該方法は：被験体の癌細胞を、免疫チェックポイント阻害剤リガンドをコードする遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと、に接触させる工程を含む方法が本明細書にさらに開示される。遺伝子は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）をコードする、ＰＤＣＤ１ＬＧ１としても知られるＣＤ２７４であってもよい。遺伝子は、ＰＤＣＤ１ＬＧ２またはプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）であってもよい。方法は、腫瘍細胞をドナー核酸と接触させることを含み得、ここで、ドナー核酸は非相同末端結合を介して遺伝子に挿入される。癌は転移性癌であり得る。癌は、転移性卵巣癌、転移性黒色腫、転移性肺非小細胞癌、または転移性腎細胞癌であり得る。

本開示の様々な態様が、添付の請求項において特に明記されている。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が用いられている例証的な実施形態と添付の図面を説明する以下の詳細な記載を参照することによって得られる：
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、すなわち、ＮＲＬ遺伝子を標的化するための２つのガイドＲＮＡをコードする上部のベクター、ＮＲ２Ｅ３遺伝子を標的化するための２つのガイドＲＮＡをコードする中央のベクター、およびＣａｓ９をコードする底部のベクターを示す。２つのガイドＲＮＡ（左から６番目のレーン）を用いてＮＲＬ遺伝子を標的化することは、Ｔ７Ｅ１アッセイ中で１つのガイドＲＮＡ（左から５番目のレーン）を用いてＮＲＬ遺伝子を標的化するよりもさらに効率的であることを示す。２つのガイドＲＮＡ（左から６番目のレーン）を用いてＮＲ２Ｅ３遺伝子を標的化することは、Ｔ７Ｅ１アッセイ中で１つのガイドＲＮＡ（左から５番目のレーン）を用いてＮＲＬ遺伝子を標的化するよりもさらに効率的であることを示す。網膜色素変性（ＲＰ）を処置するための、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡのウイルス媒介性送達の投与および評価の代表的な概略図を示す。Ｃａｓ９およびＮｒｌガイドＲＮＡ（上のパネル）を産生するウイルス対、対照ウイルス（下の行）を用いて処置されたマウスの網膜における核の染色（ＤＡＰＩ）、錐体細胞（ｍＣＡＲ）、およびウイルス発現（ｍＣｈｅｒｒｙ）を示す。錐体細胞（ｍＣＡＲ）の染色の拡大図（図３Ａに関する）を示す。錐体細胞（Ｍオプシン）の染色の拡大図（図３Ａに関連する）を示す。Ｃａｓ９およびＮｒｌガイドＲＮＡを産生するウイルスを用いて処置されたマウスＶＳ対照ウイルスを用いて処置されたマウスの網膜の下方の外顆粒層（ＯＮＬ）における、ｍＣＡＲ−陽性細胞の定量化を示す。Ｃａｓ９およびＮｒｌガイドＲＮＡ産生するウイルスを用いて処置されたマウスＶＳ対照ウイルスを用いて処置されたマウスの網膜における、ｍＣＡＲ−陽性細胞の定量化を示し、以前存在していた錐状体プラス新しくリプログラミングされた錐状体を含むｍＣＡＲ−陽性錐状体をすべてカウントする。野生型マウス、すなわちＣａｓ９およびＮｒｌガイドＲＮＡまたはＮＲ２Ｅ３ガイドＲＮＡのいずれかを生産するウイルスを用いて処置されたＲＰを有するマウス対対照ウイルスを用いで処置されたＲＰを有するマウスにおける外顆粒層（ＯＮＬ）厚さの定量化を示す。対照ウイルス（下パネル）を用いて処置された類似のマウスに対して、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ（上パネル）でＲＰを処置されたマウスにおける、網膜電図検査（ＥＲＧ）によって改善された視力を示す。未注入のマウス、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ注入されたマウス、およびＡＡＶ−Ｃａｓ９プラスＡＡＶ−ｇＲＮＡを注入されたマウスにおける明順応ＥＲＧｂ波振幅の定量化を示す。ＣＤ４１／４２に特異的ｇＲＮＡ選択についてのルシフェラーゼアッセイを示す。Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＣａｓ９ＲＮＰ媒介ＨＢＢ編集（左）、Ｃａｓ９ＲＮＰ−２を使用する様々なｓｓＯＤＮのスクリーン（右）の比較を示す。ｓｓＯＤＮ（１１１／３７）を使用するＨＤＲ媒介編集の液滴デジタルＰＣＲ解析を示す。野生型およびＲＣＳラットの両方におけるＭｅｒｔｋ遺伝子の概略図を示す。五角形、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ標的配列。五角形、Ｃａｓ９切断部位内の黒い線。Ｍｅｒｔｋ遺伝子修正ＡＡＶベクターの概略図を示す。周囲のイントロンを含むエクソン２はＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的配列間にはさまれ、ＨＩＴＩによってＭｅｒｔｋのイントロン１内に組み込む。ＡＡＶは血清型８でパッケージされた。黒色の半矢印は、正確なノックインを検証するためのＰＣＲプライマー対を示す。ＲＣＳラットにおけるＭｅｒｔｋ遺伝子修正についての実験計画の概略図を示す。ＡＡＶ−Ｃａｓ９およびＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＩＴＩまたはＡＡＶＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＤＲのいずれかは、３週間目で網膜下注入によってＲＣＳラットに局所的に送達され、７−８週間目で分析された。ＰＣＲによってＡＡＶ−Ｃａｓ９およびＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＩＴＩ注入された眼における正確な遺伝子ノックインの検証を示す。ＲＴ−ＰＣＲによるＡＡＶ注入眼における相対的なＭｅｒｔｋｍＲＮＡ発現を示す。すべての棒グラフについての動物の数：ＲＣＳラットｎ＝８、正常なラットｎ＝８、ＡＡＶ−Ｃａｓ９＋ＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＩＴＩ処置群ｎ＝６、およびＡＡＶ−Ｃａｓ９＋ＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＤＲ処置ｎ＝３。ＡＡＶ注入眼における視細胞の救助を示す網膜の形態学を示す。非常に薄いＯＮＬだけを有した未処理のおよびＡＡＶ−ＨＤＲ処置ＲＣＳ眼と比較して、視細胞外顆粒層（ＯＮＬ）の保存の増加が観察された（ブラケット参照）。スケールバー、２０μｍ。改善された桿体および錐状体の混合反応（左、波形；右、定量化バー）を示し、ＡＡＶ−Ｃａｓ９およびＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＩＴＩ注入された眼における改善されたｂ波値を実証する。すべての棒グラフについての動物の数：ＲＣＳラットｎ＝８、正常なラットｎ＝８、ＡＡＶ−Ｃａｓ９＋ＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＩＴＩ処置群ｎ＝８、およびＡＡＶ−Ｃａｓ９＋ＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＤＲ処置ｎ＝６。ＡＡＶ−Ｃａｓ９およびＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＩＴＩ注入眼における改善した１０Ｈｚのフリッカー錐状体応答を示す。すべての棒グラフについての動物の数：ＲＣＳラットｎ＝８、正常なラットｎ＝８、ＡＡＶ−Ｃａｓ９＋ＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＩＴＩ処置群ｎ＝８、およびＡＡＶ−Ｃａｓ９＋ＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＤＲ処置ｎ＝６。＊Ｐ〈０．０５、スチューデントのｔ検定。Ｍｅｒｔｋ遺伝子への機能的エクソン２のＣａｓ９媒介修復の概略図を示す。ｓｐｌｉｔＣａｓ９Ｎｒｌゲノム編集のためのＡＡＶベクター構築の概略図を示す。Ｎｒｌノックダウンおよび抑制についての標的配列を列挙する。ＰＡＭ配列が強調される。マウスの胚線維芽細胞中のＮｒｌｇＲＮＡのＴ７Ｅ１アッセイを示す。図は、出現順に、ＳＥＱＩＤＮＯ１−２および１８−１９をそれぞれ示す。ｓｐｌｉｔＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９Ｎｒｌ遺伝子抑制についてのＡＡＶ構築の概略図を示す。図１２Ａ−Ｅは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を用いて処置された正常なマウス網膜における細胞の免疫蛍光分析を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンあるいは抑制ストラテジーによって媒介された野生型マウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。ロドプシン、緑；ＤＡＰＩ、青。図１２Ａ−Ｅは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を用いて処置された正常なマウス網膜における細胞の免疫蛍光分析を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンあるいは抑制ストラテジーによって媒介された野生型マウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。ロドプシン、緑；ＤＡＰＩ、青。野生型マウスにおけるＮＲＬの編集または抑制のための実験計画を示す。マウスはＰ７で処置され、Ｐ３０で分析された。図１２Ａ−Ｅは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を用いて処置された正常なマウス網膜における細胞の免疫蛍光分析を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンあるいは抑制ストラテジーによって媒介された野生型マウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。ロドプシン、緑；ＤＡＰＩ、青。ｍＣＡＲ^＋細胞（赤に染色された）の分析を示す。図１２Ａ−Ｅは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を用いて処置された正常なマウス網膜における細胞の免疫蛍光分析を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンあるいは抑制ストラテジーによって媒介された野生型マウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。ロドプシン、緑；ＤＡＰＩ、青。Ｍオプシン^＋細胞（赤に染色された）の分析を示す。図１２Ａ−Ｅは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を用いて処置された正常なマウス網膜における細胞の免疫蛍光分析を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンあるいは抑制ストラテジーによって媒介された野生型マウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。ロドプシン、緑；ＤＡＰＩ、青。ｍＣＡＲ^＋およびＭオプシン^＋細胞の合計の定量化を示す。結果は平均値の±標準誤差として示される。（＊ｐ、０．０５、スチューデントのｔ検定）。図１２Ａ−Ｅは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を用いて処置された正常なマウス網膜における細胞の免疫蛍光分析を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンあるいは抑制ストラテジーによって媒介された野生型マウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。ロドプシン、緑；ＤＡＰＩ、青。処置された野生型の網膜における桿体および錐状体に特異性なマーカーのＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す。各群からのＲＮＡは、網膜組織全体から抽出された。結果は平均値の±標準誤差として示される。（＊ｐ、０．０５、スチューデントのｔ検定）。図１２Ｆ−Ｈは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンおよび抑圧ストラテジーによって媒介されたＮＲＬ−ＧＦＰマウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。図１２Ｆ−Ｈは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンおよび抑圧ストラテジーによって媒介されたＮＲＬ−ＧＦＰマウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。ＮＲＬ−ＧＦＰマウスにおけるＮＲＬの編集または抑制のための実験計画を示す。マウスはＰ７で処置され、Ｐ３０で分析された。図１２Ｆ−Ｈは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンおよび抑圧ストラテジーによって媒介されたＮＲＬ−ＧＦＰマウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。Ｐ７で処置され、Ｐ３０で採取されたマウスからのｍＣＡＲ＋細胞の免疫蛍光分析を示す。ロドプシン、緑；ｍＣＡＲ、赤；ＤＡＰＩ、青。図１２Ｆ−Ｈは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックダウンおよび抑圧ストラテジーによって媒介されたＮＲＬ−ＧＦＰマウスにおける、桿体への錐体細胞リプログラミングを示す。ｍＣＡＲ＋細胞の定量化を示す。結果は平均値の±標準誤差として示される。（＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。ＮｒｌｇＲＮＡｓ／分裂Ｃａｓ９を用いて処置された野生型の網膜におけるｍＣＡＲ＋細胞の解剖的位置を示す。矢印は、下方のＯＮＬおよびより高いＩＮＬで異所的に位置するｍＣＡＲ＋細胞を示す。ＡＡＶ−Ｎｒｌ−ｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−Ｎｒｌ−ｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＫＲＡＢｄＣａｓ９を用いて処置された野生型マウスにおける、カルビンディン^＋およびｍＣＡＲ^＋細胞の免疫蛍光分析の分析を示す。ロドプシン、緑；ｍＣＡＲ、赤；ＤＡＰＩ、青。矢印はカルビンディン^＋細胞／ｍＣＡＲ^＋細胞を示す。図１３Ａ−Ｇは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用する網膜の変性マウスにおける網膜機能を救助するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックダウンまたは抑制ストラテジーを示す。図１３Ａ−Ｇは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用する網膜の変性マウスにおける網膜機能を救助するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックダウンまたは抑制ストラテジーを示す。ＮＲＬｒｄ１０マウスの編集または発現のための実験計画を示す。マウスはＰ７で処置され、Ｐ６０で分析された。桿体変性は約Ｐ１８で始まり、その後、数日後に錐状体変性が起こる。桿体および最小の錐状体活性はＰ６０では検出されない。図１３Ａ−Ｇは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用する網膜の変性マウスにおける網膜機能を救助するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックダウンまたは抑制ストラテジーを示す。注入されたおよび未注入のｒｄ１０マウスにおけるｂ波振幅の定量化（ｎ＝３、結果は平均値の±標準誤差として示される。＊ｐ〈０．０５、対のスチューデントのｔ検定）、および注入されたまたは未注入のｒｄ１０マウスの視力（ｎ＝３、結果が平均値の±標準誤差として示される。＊ｐ〈０．０５、スチューデントのｔ検定）を示す。図１３Ａ−Ｇは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用する網膜の変性マウスにおける網膜機能を救助するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックダウンまたは抑制ストラテジーを示す。ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を注入された眼における改善された錐状体応答を示す代表的なＥＲＧ波記録を示す。図１３Ａ−Ｇは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用する網膜の変性マウスにおける網膜機能を救助するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックダウンまたは抑制ストラテジーを示す。処置された網膜におけるｍＣＡＲ^＋細胞の免疫蛍光分析を示す。ロドプシン、緑；ｍＣＡＲ、赤；ＤＡＰＩ、青。図１３Ａ−Ｇは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用する網膜の変性マウスにおける網膜機能を救助するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックダウンまたは抑制ストラテジーを示す。処置された網膜におけるｍＣＡＲ^＋細胞（平均値の±標準誤差。＊ｐ〈０．０５、スチューデントのｔ検定）およびＯＮＬの厚さ（平均値の±標準誤差。＊ｐ〈０．０５）の定量化を示す。図１３Ａ−Ｇは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用する網膜の変性マウスにおける網膜機能を救助するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックダウンまたは抑制ストラテジーを示す。処置された網膜におけるＭオプシン^＋細胞の免疫蛍光分析を示す。ロドプシン、緑；Ｍオプシン、赤；ＤＡＰＩ、青。図１３Ａ−Ｇは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用する網膜の変性マウスにおける網膜機能を救助するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックダウンまたは抑制ストラテジーを示す。処置された網膜におけるＭオプシン^＋細胞の定量化を示す。結果は平均値の±標準誤差として示される。（＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。図１４Ａ−Ｃは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用して、生後３ヶ月の網膜変性マウスにおける網膜機能をリブートするＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ノックダウンおよび抑制ストラテジーを示す。マウスはＰ９０で処置され、Ｐ１３０で分析された。Ｒｄ１０マウスにおいて、Ｐ９０で桿体または錐状体活性は検出されない。図１４Ａ−Ｃは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用して、生後３ヶ月の網膜変性マウスにおける網膜機能をリブートするＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ノックダウンおよび抑制ストラテジーを示す。マウスはＰ９０で処置され、Ｐ１３０で分析された。Ｒｄ１０マウスにおいて、Ｐ９０で桿体または錐状体活性は検出されない。Ｒｄ１０マウスにおけるＮＲＬの編集または抑制のための実験計画を示す。図１４Ａ−Ｃは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用して、生後３ヶ月の網膜変性マウスにおける網膜機能をリブートするＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ノックダウンおよび抑制ストラテジーを示す。マウスはＰ９０で処置され、Ｐ１３０で分析された。Ｒｄ１０マウスにおいて、Ｐ９０で桿体または錐状体活性は検出されない。処置された網膜におけるｍＣＡＲ^＋細胞の免疫蛍光分析を示す。ロドプシン、緑；ｍＣＡＲ、赤；ＤＡＰＩ、青。図１４Ａ−Ｃは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用して、生後３ヶ月の網膜変性マウスにおける網膜機能をリブートするＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ノックダウンおよび抑制ストラテジーを示す。マウスはＰ９０で処置され、Ｐ１３０で分析された。Ｒｄ１０マウスにおいて、Ｐ９０で桿体または錐状体活性は検出されない。ｒｄ１０処置された網膜におけるｍＣＡＲ^＋細胞（＊ｐ〈０．０５、スチューデントのｔ検定）、ＯＮＬの厚さ（＊ｐ〈０．０５）、ｂ波振幅（ｎ＝３、＊ｐ〈０．０５、対のスチューデントのｔ検定）、および視力（ｎ＝３、＊ｐ〈０．０５、スチューデントのｔ検定）の定量化を示す。ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を用いて処置された成体の網膜変性マウスにおけるカルビンディン^＋およびオプシン^＋細胞の免疫蛍光分析を示し、網膜変性マウスにおける水平細胞への錐体細胞のリプログラミングを実証する。Ｒｄ１０マウスは３ヶ月で処置され、その６週間後に採取された（Ｐ１３０）。カルビンディン、赤；オプシン、緑；ＤＡＰＩ、青。矢印は、カルビンディン^＋細胞／Ｏｐｓｉｎ^＋細胞を示す。図１５Ａ−Ｃは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用して、生後３ヶ月のＦｖＢ網膜変性マウスにおける網膜機能をリブートするＣＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９ノックダウンおよび抑制ストラテジーを示す。マウスはＰ９０で処置され、Ｐ１３０で分析された。図１５Ａ−Ｃは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用して、生後３ヶ月のＦｖＢ網膜変性マウスにおける網膜機能をリブートするＣＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９ノックダウンおよび抑制ストラテジーを示す。マウスはＰ９０で処置され、Ｐ１３０で分析された。ＦｖＢマウスにおけるＮＲＬの編集または抑制のための実験計画を示す。図１５Ａ−Ｃは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用して、生後３ヶ月のＦｖＢ網膜変性マウスにおける網膜機能をリブートするＣＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９ノックダウンおよび抑制ストラテジーを示す。マウスはＰ９０で処置され、Ｐ１３０で分析された。処置された網膜におけるｍＣＡＲ^＋細胞の免疫蛍光分析を示す。ロドプシン、緑；ｍＣＡＲ、赤；ＤＡＰＩ、青。図１５Ａ−Ｃは、ＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９またはＡＡＶ−ＮｒｌｇＲＮＡｓ／ｓｐｌｉｔＣａｓ９を使用して、生後３ヶ月のＦｖＢ網膜変性マウスにおける網膜機能をリブートするＣＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９ノックダウンおよび抑制ストラテジーを示す。マウスはＰ９０で処置され、Ｐ１３０で分析された。ｒｄ１０処置された網膜におけるｍＣＡＲ^＋細胞（＊ｐ〈０．０５、スチューデントのｔ検定）、ＯＮＬの厚さ（＊ｐ〈０．０５）、ｂ波振幅（ｎ＝３、＊ｐ〈０．０５、対のスチューデントのｔ検定）、および視力（ｎ＝３、＊ｐ〈０．０５、スチューデントのｔ検定）の定量化を示す。結果は平均値の±標準誤差として示される。

遺伝子治療は、多くの人間の疾患の処置において大きな見込みを示す。しかし、現在の技術の１つの主要な欠点は、それがせいぜい特定の突然変異または単一遺伝子のみにしか向けられないことであり、それは遺伝子治療を広い患者集団に適用することを難しくする。同様に、内因性または自己由来の幹細胞を使用する組織の修復および再生は、再生医療における重点な目標を表わす。しかし、このアプローチは、出発細胞が正常な遺伝的構造および機能を所有するという要件によって妨害され、それは多くの場合は、自己由来の細胞が、遺伝子治療が克服することを目標とする遺伝子の突然変異を抱えるため実現可能でない。突然変異に対して感受性がある細胞型を同じ突然変異に対して耐性がある機能的に関連する細胞型に切り替え、それによって組織および機能を保存する細胞リプログラミングを用いて、上記の課題克服するための方法が本明細書で提供される。このアプローチは、以下の前提に基づく；１）突然変異が通常その有害な影響を特定の細胞型のみにおいて引き起こし、２）転写の因子の組み合わせは、細胞内運命の決定を可能にし、および３）、膵臓、心臓、および神経細胞などの緊密に関連する高分化の成熟細胞型の間のインビボでの直接転換を可能にする発生的柔軟性がある。さらに、発達的に関連する転写因子の適切な組み合わせによって、遠縁細胞をインビボで直接変換することができる。

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート−Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）に基づく、相同性非依存的標的組み込み（ＨＩＴＩ）ストラテジーを利用する方法が本明細書で提供される。これらの方法は、分裂細胞および非分裂細胞の両方において効率的な標的ノックインを提供する。これらの方法は、インビトロおよびインビボで実施され得る。これらの方法は、生後の哺乳動物の分裂終了細胞（例えば脳）における正確な導入遺伝子挿入を提供する。

網膜色素変性症ＲＰは、眼の最も一般的な変性疾患の１つであり、世界中の１００万以上の患者に影響を及ぼしている。それは、２００を超える遺伝子中の多数の突然変異によって引き起こされ得る。ＲＰは、一次的な桿体視細胞死および変性、その後の二次的な錐状体死で特徴づけられ得る。桿体決定因子ＮＲＬの急性遺伝子ノックアウトは、成体の桿体を錐状体のような細胞にリプログラミングし、桿体視細胞におけるＲＰ特異的遺伝子中の突然変異の影響に対して耐性にし、従って二次的な錐状体欠損を防ぐ。ＮＲＬは、桿体と錐状体との間のマスタースイッチ遺伝子として機能し、重要な下流の転写因子ＮＲ２Ｅ３を活性化する。ＮＲＬおよびＮＲ２Ｅ３は、桿体特異的遺伝子転写ネットワークを活性化し、桿体分化および運命を制御するために協調して機能する。ＮＲＬまたはＮＲ２Ｅ２のいずれかにおける機能の欠損は、桿体を錐体細胞の運命にリプログラミングする。このシステムは、突然変異に対して感受性であるものから、突然変異に対して耐性があるものへと、細胞をリプログラミングされる治療法が開発され得るという概念実証の機会を提供する。

突然変異に対して感受性がある（例えば、細胞を有する被験体に対して機能不全または有害）細胞型において突然変異を抱える遺伝子の標的不活性化を含む、疾病の処置のための方法が本明細書で提供される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の送達（例えば、実施例１２を参照）を使用した、網膜におけるＮＲＬまたはＮＲ２Ｅ３の標的不活性化によるインビボでの桿体から錐状体へのリプログラミングを用いた、ＲＰおよび他の網膜の疾病を処置するための方法を含む、これらの方法の実施例が本明細書で提供される。実施例は、結果としての網膜の視細胞予約および視覚機能救助を伴う桿体視細胞運命の不活性化によって、桿体から錐体の特定細胞運命がリプログラミングされ得ること実証する。これらの結果は、遺伝子および突然変異に依存せず、かつ遺伝子病治療に幅広い意味を持ち得る新しい処置のアプローチを指す。

治療プラットフォーム
被験体の第１の細胞型の細胞に、第１の細胞型中の遺伝子の発現を修飾する本明細書に開示される治療剤を投与することを含む、被験体の遺伝子疾病を処置する方法が本明細書で提供され、ここで、遺伝子が第１の細胞型に特異的な機能を有するタンパク質をコードする。遺伝子の発現を修飾することは、第１の細胞型から第２の細胞型への細胞のリプログラミングを結果としてもたらし得る。非限定的な例として、遺伝子疾病は網膜色素変性であり得、遺伝子はＮＲＬおよびＮＲ２Ｅ３から選択され得、および治療剤は、遺伝子を標的化するガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼをコードするウイルスであり得る。方法は、桿体視細胞（本明細書において「桿体」とも呼ばれる）などの、網膜細胞に治療剤を投与することを含み得る。方法は、桿体を錐状体にリプログラミングし、網膜変性を救助して網膜機能を回復させることを結果としてもたらし得る。したがって、第１の細胞型は桿体であり得、第２の細胞型は錐状体である（例えば実施例１３を参照）。桿体から錐状体へのリプログラミングは、桿体の数および結果としての夜盲症を伴う機能の欠損につながり得るが、被験体は夜盲症に耐えることをいとわないかもしれない。

第１の細胞型から第２の細胞型へと細胞をリプログラミングする方法であって、該方法は、遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡに細胞を接触させる工程を含み、ここで、遺伝子が細胞の細胞型特異的機能に寄与するタンパク質と；標的部位で遺伝子鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼとをコードし、ここで、鎖を切断することは、細胞がもはや細胞型特異的機能を実行することができないように遺伝子の発現を修飾し、それによって、第２の細胞型へ細胞リプログラミングする、方法が本明細書に開示される。

本明細書使用されるように、用語「リプログラミング」は、第１の細胞型から第２の細胞型に細胞を切り替えるために、細胞内の少なくとも１つの遺伝子を変化させることを指す。第１の細胞型は、第２の細胞型よりも分化した型であり得るか、またはその逆であり得る。第１の細胞型は、第２の細胞型と機能的に関係し得る。例えば、第１の細胞型および第２の細胞型は、視力と関連する機能を提供し得る。さらに、非限定的な例として、第１の細胞型および第２の細胞型は、脳活動、神経活動、筋活動、免疫活動、感覚活動、心臓血管活動、細胞増殖、細胞老化、および細胞アポトーシスと関連する機能を提供し得る。遺伝的に遺伝子を変化させることは、遺伝子を発現抑制し、それによって、遺伝子によりコードされたタンパク質の産生を阻害することを含み得る。遺伝子を発現抑制することは、非機能的なタンパク質を産生するために、遺伝子にナンセンス変異を導入することを含み得る。ナンセンス変異は、人工のスプライスバリアントを作成するために遺伝子編集を用いて導入されることができ、ここで、人工のスプライスバリアントは少なくとも１つのエクソンまたはその一部を欠いている。

本明細書で使用されるように、用語「細胞型の特異的機能」は、細胞型に特異的な機能を指す。場合によっては、機能は単一細胞型のみに特異的である。例えば、細胞型特異的機能は明視であり得、単一細胞型は錐状体視細胞である。場合によっては、機能は細胞の部分集合に特異的である。例えば、細胞型特異的機能は一般に視力であり得、細胞の部分集合は、桿体、錐状体、および感光性の網膜の神経節細胞などの視細胞であり得る。

用語「第１の細胞型」および「第２の細胞型」は、本明細書のすぐ近くで使用されている文脈において、ある細胞型を他の細胞型と識別するためだけに使用される。本明細書に開示される方法または組成物が、本出願の他の段落に対する本出願のある段落のそれらの順序によって、決して制限されるべきではない。

本明細書に開示される第１の細胞型は、突然変異に対して感受性があり得る。「突然変異に対して感受性である」とは、その細胞内の遺伝子における突然変異がその細胞に機能効果をもたらすことを意味する。本明細書に開示される第２の細胞型は、突然変異に対して耐性があり得る。「突然変異に対して耐性がある」とは、その細胞内の遺伝子における突然変異は、その細胞にいかなる機能効果ももたらさないか、または、その細胞内の遺伝子における突然変異は、容認可能かつ細胞存在する被験体に対して有害ではない機能効果、あるいは細胞が存在する被験体にほとんどまたは全く重要ではない機能効果をもたらすことを意味する。例えば、突然変異に耐性がある細胞型は、遺伝子を発現しないか、または無視できる量の遺伝子を発現する細胞型であり得る。突然変異に耐性がある細胞型は、遺伝子を発現する細胞型であり得るが、その細胞型内の遺伝子の機能的役割は、突然変異によって影響を受けない。突然変異に対して感受性がある細胞型は細胞型の特異的機能を果たし、ここで、細胞型の特異的機能は、突然変異を抱え得る遺伝子の発現によって調整されるか制御される。突然変異が遺伝子内に生じる場合、細胞型の特異的機能は失われるか変更される。本明細書に開示される方法は遺伝子編集を含み、第１の細胞型（突然変異に対して感受性がある）を第２の細胞型（突然変異に対して耐性がある）にリプログラミングすることを結果としてもたらす。

網膜変性を処置する方法が本明細書で提供される。網膜変性は、網膜色素変性、黄斑変性、および緑内障などの、多くの疾患を包含する。方法は、網膜細胞を本明細書に開示される遺伝子の標的部位にハイブリタイズするガイドＲＮＡに接触させることを含む、網膜細胞を桿体視細胞型から錐状体視細胞型にリプログラミングする工程を含み得、ここで、遺伝子が細胞の夜間視力または色覚機能に寄与するタンパク質と；標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼとをコードし、ここで、鎖を切断することは、網膜細胞がもはや夜間視力または色覚機能を実行することができないように遺伝子の発現を修飾し、それによって、網膜細胞を錐状体視細胞型にリプログラミングする。錐状体視細胞型は、被験体に明視を提供することができ得る。遺伝子は、ＮＲＬ、ＮＲ２Ｅ３、ＧＮＡＴ１、ＲＯＲベータ、ＯＴＸ２、ＣＲＸ、およびＴＨＲＢから選択され得る。遺伝子はＮＲＬであり得る。遺伝子はＮＲ２Ｅ３であり得る。

網膜変性を処置する方法が本明細書で提供される。網膜変性は、網膜色素変性、黄斑変性、および緑内障などの、多くの疾患を包含する。方法は、網膜細胞を第１の細胞型から第２の細胞型にリプログラミングすることを含み得る。第１の細胞型は桿体であり得る。第１の細胞型は、桿体または錐状体以外の細胞であってもよい。第１の細胞型はニューロンであり得る。第１の細胞型は介在ニューロンであり得る。第１の細胞型は、ニューロンの幹細胞またはニューロンの前駆細胞（ニューロン細胞に分化する能力を有する多能性細胞または多能性細胞）であってもよい。介在ニューロンまたは桿体以外の細胞などの細胞を使用する利点は、これらの方法が完全に桿体および錐状体の受容体の両方を失った末期ＲＰ患者へ視界を提供するために使用され得るということである。第２の細胞型は錐状体であり得る。第２の細胞型は中間細胞であり得る。本明細書で記載されるように、中間細胞は、リプログラミング（例えば、ＣａｓヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡまたはＲＮＡｉを用いて処置される）を受ける細胞であり得る。中間細胞は、遺伝子発現が下方制御されている桿体細胞であり得る。桿体細胞遺伝子発現の下方制御は、桿体に特異的な突然変異の影響を減少させ得る。本明細書で使用されるように、「桿体に特異的な突然変異」は一般に、桿体細胞機能および表現型に影響を与える遺伝子内の突然変異を指す。言いかえれば、桿体細胞は、桿体細胞突然変異に対して感受性があり得る。そのような細胞は、正常な構造および機能を維持するための組織構造用支持材を提供し得る。これらの細胞はさらに、内因性の錐体細胞の成長および生存の維持に重要な栄養因子を分泌し得る。

方法は、網膜細胞を本明細書に開示される遺伝子の標的部位にハイブリタイズするガイドＲＮＡに接触させることを含む、多能性細胞を桿体視細胞型から錐状体視細胞型にリプログラミングする工程を含み得、ここで、遺伝子が細胞の夜間視力または色覚機能に寄与するタンパク質と；標的部位で遺伝子鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼとをコードし、ここで、鎖を切断することは、網膜細胞がもはや夜間視力または色覚機能を実行することができないように遺伝子の発現を修飾し、それによって、網膜細胞を多能性細胞型にリプログラミングする。多能性細胞型は、多能性の網膜の前駆細胞であり得、網膜内に配置されたおよび／または網膜の環境刺激を受けた時に、桿体または錐状体に発展する可能性がある細胞を意味する。多能性細胞型は、錐状体と桿体との中間である細胞型であってもよい。錐状体と桿体との中間である細胞型は、網膜の神経節多能性細胞であり得る。正常な網膜の発展過程において、網膜の神経節多能性細胞は錐状体または桿体に分化する。遺伝子は、ＮＲＬ、ＮＲ２Ｅ３、ＧＮＡＴ１、ＲＯＲベータ、ＯＴＸ２、ＣＲＸ、およびＴＨＲＢから選択され得る。遺伝子はＮＲＬであり得る。遺伝子はＮＲ２Ｅ３であり得る。

癌を処置する方法が本明細書で提供される。非限定的な例として、癌は、結腸癌、Ｂ細胞リンパ腫、膠芽腫、網膜芽細胞腫、および乳癌を含み得る。方法は、癌細胞を本明細書に開示される遺伝子の標的部位にハイブリタイズするガイドＲＮＡに接触させることを含む、癌細胞を悪性の細胞型から良性の細胞型にリプログラミングする工程を含み得、ここで、遺伝子が、細胞の増殖に寄与するタンパク質と；標的部位で遺伝子鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼとをコードし、ここで、鎖を切断することは、癌細胞がもはや異常な増殖を実行することができないように遺伝子の発現を修飾し、それによって、癌細胞を良性の細胞型にリプログラミングする。非限定的な例として、第１の細胞型は結腸癌細胞であり得、第２の細胞型は良性の腸細胞または良性の結腸細胞であり得、ならびに遺伝子は、ＡＰＣ、ＭＹＨ１、ＭＹＨ２、ＭＹＨ３、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＥＰＣＡＭ、ＰＯＬＥ１、ＰＯＬＤ１、ＮＴＨＬ１、ＢＭＰＲ１Ａ、ＳＭＡＤ４、ＰＴＥＮ、およびＳＴＫ１１から選択され得る。さらに、非限定的な例として、第１の細胞型は悪性のＢ細胞であり得、第２の細胞型は良性のマクロファージであり得、および遺伝子は、ＰＵ．１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、またはＣＤ７８であり得る。第１の細胞型は悪性のＢ細胞であり得、第２の細胞型は良性のマクロファージであり得、および遺伝子は、Ｃ−ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＲＥＢＢＰ、またはＥＰ３００であり得る。第２の細胞型は、第１の細胞型よりも高い、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４８０、Ｃｄ１１ｃまたはＬｙ６ｇのＲＮＡ／タンパク質レベルを発現することができる。さらに、非限定的な例として、第１の細胞型はエストロゲン受容体陽性および／またはＨｅｒ２陽性乳癌細胞であり得、第２の細胞型はエストロゲン受容体陰性および／またはエストロゲン受容体陰性乳癌細胞であり得、ならびに遺伝子は、エストロゲン受容体遺伝子、Ｈｅｒ２遺伝子、およびそれらの組み合わせから選択され得る。

本明細書に開示される癌を処置する方法は、癌細胞が転移する能力を失うように遺伝子を修飾することを含み得る。方法は、癌細胞が腫瘍の血管新生を促進する能力を失うように、遺伝子を修飾することを含み得る。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
ＲＮＡ干渉を介して細胞内の遺伝子の発現を阻害することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する方法が本明細書で提供される。遺伝子を阻害することは、第１の細胞型から第２の細胞型に細胞を変換することを結果としてもたらし得る。第１の細胞型または細胞型は、本明細書に開示される任意の細胞型であってもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、自然発生のＤＮａｓｅ酵素による消化またはデグラデーションに対する耐性を提供する修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾とは、その合成中に固体相ホスホラミダイト方法を使用した、アンチセンスオリゴヌクレオチドの燐酸ジエステルバックボーンの修飾である。これは、ＤＮａｓｅのほとんどの形態をアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して効果的に無効にする。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２つ方法で最も効率的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを促進または増強する送達システムを含む。いくつかの実施形態では、送達システムは、ヒト細胞によって容易に取り込まれるリポソームまたは脂質の容器を含む。いくつかの実施形態では、送達システムは、オリゴヌクレオチドなどの大きな分子を細胞膜を介して容易に転移させることを可能にする、ｔａｔタンパク質によって媒介されるシステムである。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。これらのＲＮＡの鎖は、対象の遺伝子によって産生されたｍＲＮＡを標的化することによって遺伝子を発現抑制する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、コンピューターソフトウェアを介して特別設計され得、設計テンプレートを使用して商業的に製造され得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、細菌プラスミド、細菌ＤＮＡの環状鎖、またはウイルスベクターを保有するウイルスを使用して送達される。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチは、ＮＲ２Ｅ３遺伝子によってコードされたＲＮＡを標的化する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＲＬ遺伝子によってコードされＲＮＡを標的化する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オプシンタンパク質によってコードされＲＮＡを標的化する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ロドプシン遺伝子によってコードされＲＮＡを標的化する。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが約１８のヌクレオチドから約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは長さが１８のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは長さが１９のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは長さが２０のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは長さが２１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは長さが２２のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは長さが２３のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは長さが２４のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは長さが２５のヌクレオチドである。

遺伝子編集
細胞内の遺伝子を編集する遺伝子のための方法が本明細書で提供され、ここで、遺伝子を編集することは、第１の細胞型から第２の細胞型に細胞を変換することを結果としてもたらす。非限定的な例として、方法は、網膜の疾病を処置するために使用され得る。細胞が本明細書でさらに提供され、ここで、本明細書に開示される方法によって細胞内の遺伝子が修飾される。非限定的な例として、細胞は、網膜細胞とも呼ばれる網膜の細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および細胞は、網膜の疾病を処置するために、細胞内の標的遺伝子を修飾するためのゲノム編集を利用する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼシステムを利用する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼシステムは部位特異的ヌクレアーゼを含む。適切なヌクレアーゼとしては、限定されないが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼ；Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）；ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合タンパク質；レコンビナーゼ；フリッパーゼ；トランスポゼース；アルゴノートタンパク質；任意のそれらの誘導体：任意のそれらの変異体；および、任意のそれらの断片、が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される部位特異的ヌクレアーゼは、部位特異的な標的配列を切断することなく制限することができ、それによって転写を遮断し、標的遺伝子発現を減少させる触媒作用がないヌクレアーゼ（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙｄｅａｄｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を産生するために修飾することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および細胞は、核酸ガイドヌクレアーゼシステムを利用する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および細胞は、核酸分子を修飾するために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質システムを利用する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣａｓヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、および修復鋳型を含む。ガイドＲＮＡは標的配列にＣａｓヌクレアーゼを向け、Ｃａｓヌクレアーゼは標的配列を切断するか、ニックを入れ、それによって切断部位を作成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して修復された二本鎖切断（ＤＳＢ）を産生する。しかし、いくつかの実施形態では、媒介されないか方向付けられないＮＨＥＪ媒介ＤＳＢ修復は、望ましくない結果に結びつく読み取り枠の破壊を結果としてもたらす。これらの問題を回避するために、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、切断部位に挿入される修復鋳型の使用を含み、最終編集遺伝子配列の制御を可能にする。修復鋳型の使用は、相同組換え修復（ＨＤＲ）と呼ばれることもある。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および細胞は、相同性非依存標的組み込み（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔａｒｇｅｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）（ＨＩＴＩ）を利用する。ＨＩＴＩは、インビトロで分裂細胞および非分裂細胞の両方における効率的な標的ノックインを可能にし得、さらに重要なことには、生後の哺乳動物の分裂終了細胞（例えば、脳）へのインビボでの正確な導入遺伝子挿入を可能にし得る。

いくつかの実施形態では、修復鋳型は標的遺伝子に対応する野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、修復鋳型は、切断部位に送達される所望の配列を含む。いくつかの実施形態では、所望の配列は野生型配列ではない。いくつかの実施形態では、所望の配列は、標的遺伝子の発現／活性を修正するか変更するための１つ以上の編集されたヌクレオチドを除いて、標的配列と同一である。例えば、一塩基多型を含む標的配列と比較して、所望の配列は単一のヌクレオチドの相違を含み得、ここで、単一のヌクレオチドの相違は、標的遺伝子に対する野生型の発現／活性または変更された発現／活性を回復させる一塩基多型のヌクレオチドの置換である。

任意の適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、本明細書に開示される方法および組成物のために使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、様々な命名システムを使用して言及され得る。例示的な命名システムは、Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．ｅｔａｌ， “ＡｎｕｐｄａｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ，” ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１５）１３：７２２−７３６ａｎｄＳｈｍａｋｏｖ，Ｓ．ｅｔａｌ， “ＤｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＤｉｖｅｒｓｅＣｌａｓｓ２ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ，” ＭｏｌＣｅｌｌ（２０１５）６０：１−１３において、提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型のシステム、または任意の他の適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。本明細書で使用されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス１、クラス２、または任意の他の適切に分類されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。クラス１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、効果的に調整するために、複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用することができる。クラス１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、Ｉ型（例えば、Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦ、ＩＵ）、ＩＩＩ型（例えば、ＩＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ）、およびＩＶ型（例えば、ＩＶ、ＩＶＡ、ＩＶＢ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ型を含み得る。クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、効果的に調整するために、単一の大きなＣａｓタンパク質を使用することができる。例えば、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型（例えば、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ）、およびＶ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ型を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは互いに相補的であり得、および／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座標的を容易にするためにトランスの機能単位を貸すことができる。

Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶＩ型のＣａｓタンパク質であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のドメインを含み得る。ドメインの非限定的な例としては、ガイド核酸認識および／または結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはリボヌクレアーゼドメイン、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、および二量化ドメインが挙げられる。ガイド核酸認識および／または結合ドメインは、ガイド核酸と相互作用し得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断を防ぐために触媒能力を欠くかもしれない。Ｃａｓタンパク質は、他のタンパク質またはポリペプチドに融合されるキメラＣａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、例えば、様々なＣａｓタンパク質からのドメインを含む、様々なＣａｓタンパク質のキメラであり得る。

Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、ｃ２ｃ３、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌまたはＣｓｘｌ２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓｌＯ、ＣａｓｌＯｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕｌ９６６、ならびにそれらの相同体または修飾バージョンが挙げられる。

Ｃａｓタンパク質は任意の適切な生物由来であり得る。非限定的な例は、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、レンサ球菌属、黄色ブドウ球菌、カルジオプシス・ダッソンビエイ、ストレプトミセスプリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、チルス・セレニティレドセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エキシグオバクテリウムシビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバシラス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス、マイクロシーラ・マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａｍａｒｉｎａ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓｓｐ．）、クロコスファエラ・ワトソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅｓｐ．）、ミクロキスティス・エルギノーサ、緑膿菌、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、アセトハロビウム・アラバチクム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニフェクス・デゲンジイ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシルプトル・ベスシ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒｂｅｃｓｃｉｉ）、カンジダタス・デスルフォルディス（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＤｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシレ、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａ）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシディチオバチルス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマチウム・ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワトソニー（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクテル・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガタム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノデュラリア・スプミゲナ、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｓｐ．）、リングビア属、ミクロコレス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オスキラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｓｐ．）、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ）、アカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓｍａｒｉｎａ）、レプトトリキア・シャヒイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｓｈａｈｉｉ）、およびフランシセラ・ノビシダ菌を含む。いくつかの態様では、生物は化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅ）である。いくつかの態様では、生物は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。いくつかの態様では、生物はサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。

Ｃａｓタンパク質としては、限定されないが、ベイロネラ異型、フソバクテリウム・ヌクレアトゥム、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒａｌｏｃｉｓ）、ソロバクテリウム・ムーレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｏｏｒｅｉ）、コプロコッカス・カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓｃａｔｕｓ）、トレポネーマ・デンティコラ、ペプトニフィラス・デュアデ二（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｉｔｓｕｏｋａｉ）、ミュータンス連鎖球菌、リステリア・イノキュア、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、アシダミノコッカス腸、オルセネラ・ウリ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａｕｌｉ）、エノコッカス・キタハラエ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓｋｉｔａｈａｒａｅ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、クトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ガッセリ、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａ）、マイコプラズマ・モバイル、マイコプラズマ・ガリセプティクム、マイコプラズマ・オビニューモニエ、マイコプラズマ・カニス、マイコプラズマ・シノヴィエ、ユーバクテリウム・レクタレ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ユーバクテリウム・ドリカム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種・トルケンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓｓｕｂｓｐ．Ｔｏｒｑｕｅｎｓ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、ルミノコッカス・アルブス、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アシドサーマス・セルロリィティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビフィオバクテリアム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｅｎｔｉｕｍ）、コリネバクテリア・ジフテリア、エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｍｉｎｕｔｕｍ）、ニトラティフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、スピロケータ・グローバス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａｇｌｏｂｕｓ）、フィブロバクター・サクシノゲネス亜種・サクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓｓｕｂｓｐ．Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）、カプノシトファガ・オクラチエ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｏｃｈｒａｃｅａ）、ロドシュードモナス・パルストリス、プレボテーラ・ミカンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍｉｃａｎｓ）、プレボテラ・ルミニコラ、フラボバクテリウム・カラムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ロードスピリラム属赤核、カンジダツス・プニセイスピリルム・マリナム（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍｍａｒｉｎｕｍ）、ベルミネフロバクター・エイセニアエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒｅｉｓｅｎｉａｅ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｙｚｙｇｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒｓｈｉｂａｅ）、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ウォリネラ・サクシノゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ亜種・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉｓｕｂｓｐ．Ｊｅｊｕｎｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、アシドボラクス・エブレウス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘｅｂｒｅｕｓ）、ウェルシュ菌、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・インテスチナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、髄膜炎菌、パスツレラ‐ムルトシダ亜種・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａｓｕｂｓｐ．Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、スッテリラ・ワドスウォルテンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、プロテオバクテリア、レジュネラ・ニューモフィラ、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ウォリネラ・サクシノゲネス菌、およびフランシセラ・ノビシダ菌を含む様々なバクテリアの種に由来し得る。用語「由来」は、この場合、バクテリアの種の自然発生の変種の大部分から、または有意な相同性を維持するためにバクテリアの種の自然発生の変種から修飾されていると定義される。大部分は、少なくとも１０連続ヌクレオチド、少なくとも２０連続ヌクレオチド、少なくとも３０連続ヌクレオチド、少なくとも４０連続ヌクレオチド、少なくとも５０連続ヌクレオチド、少なくとも６０連続ヌクレオチド、少なくとも７０連続ヌクレオチド、少なくとも８０連続ヌクレオチド、少なくとも９０連続ヌクレオチド、または少なくとも１００連続ヌクレオチドであり得る。有意な相同性は、少なくとも５０％相同、少なくとも６０％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも９０％相同、または少なくとも９５％相同であり得る。由来する種は、自然発生の変種の活動を保持しながら修飾され得る。

いくつかの実施形態では、方法によって利用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムおよび本明細書に記載される細胞は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、核酸分子を修飾するための修復鋳型を含む。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９および２つの非コードの小型ＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ））が、配列特異的な様式で、核酸分子を標的化し分解するために協調して作用する、細菌化膿連鎖球菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）において記載されている（Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．， “ＡＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＤｕａｌ−ＲＮＡ−ＧｕｉｄｅｄＤＮＡＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎＡｄａｐｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉａｌＩｍｍｕｎｉｔｙ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７（６０９６）：８１６−８２１（Ａｕｇｕｓｔ２０１２，ｅｐｕｂＪｕｎ．２８，２０１２）参照）。いくつかの実施形態では、２つの非コードの小型ＲＮＡは、単一の核酸分子を作成するために接続され、ガイドＲＮＡと呼ばれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および細胞は、ガイド核酸を使用する。ガイド核酸は、別の核酸にハイブリタイズできる核酸を指す。ガイド核酸はＲＮＡであり得る。ガイド核酸はＤＮＡであり得る。ＤＮＡであるガイド核酸は、ガイドＲＮＡより安定し得る。ガイド核酸は、部位特異的な核酸の配列に結合するようにプログラムされ得る。標的化される核酸または標的核酸は、ヌクレオチドを含み得る。ガイド核酸はヌクレオチドを含み得る。標的核酸の一部は、ガイド核酸の一部と相補的であり得る。ガイド核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含むことができ、「シングルガイド核酸」（つまり、「シングルガイド核酸」）と呼ばれ得る。ガイド核酸は、２つのポリヌクレオチド鎖を含むことができ、「ダブルガイド核酸」（つまり、「ダブルガイド核酸」）と呼ばれ得る。別段の特定がない限り、用語「ガイド核酸」は包括的であり、シングルガイド核酸およびダブルガイド核酸の両方を指す。

ガイド核酸は、「ガイドセグメント」または「ガイド配列」と呼ばれ得るセグメントを含むことができる。ガイド核酸は、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」と呼ばれ得るセグメントを含み得る。

ガイド核酸は、新しいまたは強化された機能（例えば、改善された安定性）を有する核酸を提供するために、１以上の修飾（例えば、塩基修飾、骨格修飾）を含み得る。ガイド核酸は核酸アフィニティータグを含み得る。ガイド核酸はヌクレオシドを含み得る。ヌクレオシドは塩基−糖組み合わせであり得る。ヌクレオシドの塩基部分は複素環の塩基であり得る。そのような複素環の塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されるリン酸基をさらに含むヌクレオシドであり得る。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについて、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に結合し得る。ガイドする核酸を形成する際に、リン酸基は、直線ポリマー化合物を形成するために、隣接したヌクレオシドを互いに共有結合的に関連することができる。次いで、この直線ポリマー化合物のそれぞれの末端は、環状化合物を形成するためにさらに連結され得るが；一般的には線状化合物が適切である。さらに、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有することができ、したがって、完全にまたは部分的に、二本鎖の化合物を産生するように折り畳むことができる。ガイド核酸内で、リン酸基は、ガイド核酸のヌクレオシド間骨格を形成すると一般的に言及される。ガイド核酸の連鎖または骨格は、３’から５’までのリン酸ジエステル連鎖であり得る。

ガイド核酸は、修飾された骨格および／または修飾されたヌクレオシド間連鎖を含み得る。修飾された骨格は、骨格中のリン原子を保持するもの、および骨格にリン原子を有しないものを含み得る。

適切な修飾されたガイド核酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル（ａｍｉｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒｓ）、メチルおよび３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩、キラルのホスホン酸塩、ホスフィナート、３’−アミノホスホルアミダートを含むホスホルアミダート、およびアミノアルキルホスホラミダート（ａｍｉｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ）などの他のアルキルホスホン酸塩、ホスホロジアミデート、チオノホスホラミダート（ｔｈｉｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ）、チオノアルキルホスホネート（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、チオノアルキルホスホトリエステル（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒｓ）、セレノリン酸、ならびに、正常な３’−５’結合、２’−５’結合類似体、および１つ以上のヌクレオチド間結合が、３’から３’まで、５’から５’まで、または２’から２’までの結合である反転極性を有するものを有するボラノリン酸、を含み得るリン原子を含むことができる。反転極性を有する適切なガイド核酸は、最も３’側のヌクレオチド間の結合において、単一の３’から３’までの結合を含むことができる（つまり、核酸塩基を欠いているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する単一の反転したヌクレオシド残基）。様々な塩（例えば、塩化カリウムまたは塩化ナトリウム）、混合塩、および遊離酸形態も含まれ得る。

ガイド核酸は、１以上のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（つまり、メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩの骨格）、−ＣＨ２−ＯＮ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで、天然リン酸ジエステルヌクレオチド間の結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−）として表わされる）を含み得る。

ガイド核酸は、モルホリノ骨格構造を含み得る。例えば、ガイド核酸は、リボース環の代わりに６員のモルホリノ環を含み得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、ホスホロジアミデートまたは他の非リン酸ジエステルヌクレオシド間結合は、リン酸ジエステル結合を置き換える。

ガイド核酸は、短連鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは１以上の短連鎖ヘテロ原子のまたは複素環のヌクレオシド間結合を形成される、ポリヌクレオチド骨格を含み得る。これらは、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分からの一部分で形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホンの骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）の骨格；メチレンホルムアセチル（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチルの骨格；リボアセチル（ｒｉｂｏａｃｅｔｙｌ）骨格；骨格を含むアルケン；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノの骨格；スルホン酸およびスルホンアミドの骨格；アミド骨格；および、混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の成分部分を有する他のものを含み得る。

ガイド核酸は核酸模倣物を含み得る。用語「模倣物」は、ポリヌクレオチドを含むことが意図され、フラノース環のみまたはフラノース環とヌクレオチド間結合との両方が非フラノース基で置き換えられ、フラノース環のみの置換もまた糖代替物と呼ばれ得る。複素環の塩基部分または修飾された複素環の塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持され得る。そのような核酸１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖骨格は、骨格を含むアミド、特に、アミノエチルグリシン（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）骨格で置き換えられ得る。ヌクレオチドは保持されることができ、骨格のアミド部分のアザ窒素原子（ａｚａｎｉｔｒｏｇｅｎａｔｏｍｓ）に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物中の骨格は、ＰＮＡに骨格を含むアミドを与える２つ以上の結合したアミノエチルグリシン単位を含み得る。複素環の塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合され得る。

ガイド核酸は、モルホリノ環に結合した複素環の塩基を有する結合モルホリノ単位（つまり、モルホリノ核酸）を含み得る。結合基ｃは、モルホリノ核酸中のモルホリノ単量体単位を結合し得る。非イオンのモルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞タンパク質とのそれほど望ましくない相互作用を有する。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、ガイド核酸の非イオンの模倣物であり得る。モルホリノクラス内の様々な化合物は、様々な結合基を使用して連結され得る。ポリヌクレオチド模倣物のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称され得る。核酸分子中に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環で置き換えられ得る。ＣｅＮＡＤＭＴ保護ホスホラミダイト単量体が、ホスホラミダイト化学（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｃｈｅｍｉｓｔｒ）を用いたオリゴマー化合物合成のために、調整され、使用され得る。ＣｅＮＡ単量体の核酸鎖の中への取り込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡ雑種の安定性を増大させることができる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、類似の安定性を有する核酸補体を用いて天然の複合体を形成できる。さらなる修正は、２’−ヒドロキシル基が環の４’糖炭素原子に結合されるロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得、それによって、２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成して、二環の糖部分を形成する。結合は、メチレン（ＣＨ２−）、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋する基であり得、ここでｎは１または２である。ＬＮＡおよびＬＮＡの類似体は、相補的な核酸（Ｔｍ＝＋３から＋１０°Ｃ）との非常に高い二本鎖の熱安定性、３’−エキソヌクレアーゼデグラデーションに対する安定性、および良好な溶解性特性を示すことができる。

ガイド核酸は１つ以上の置換された糖部分を含み得る。適切なポリヌクレオチドは、：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、またはＮ−アルキニル；あるいは、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択された糖置換基を含むことができ、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１からＣ１０アルキル、あるいはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２が特に適しており、このときｎおよびｍが１から約１０である。糖置換基は以下から選択され得る：Ｃ１−Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）、ヘテロシクロアルカリル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏａｌｋａｒｙｌ）、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレータ、ガイド核酸の薬物動態特性を改善するための基、またはガイド核酸の薬力学的特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基。適切な修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる、または２’−ＭＯＥ、つまり、アルコキシアルコキシ基）を含み得る。さらに適切な修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（つまり、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、２’−ＤＭＡＯＥとして知られる）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとして知られる）、つまり、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含み得る。

他の適切な糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ＝ＣＨ２）、およびフルオロ（Ｆ）を含み得る。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあってもよい。適切な２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。類似の修飾は、オリゴマー化合物上の他の位置、特に、３’末端のヌクレオシド上のまたは２’−５’結合ヌクレオチド中の糖の３’位置、および５’末端のヌクレオチドの５’位置においてもなされ得る。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有してもよい。

ガイド核酸は、さらに核酸塩基（しばしば単に「塩基」と称す）の修飾または置換を含み得る。本明細書で使用されるように、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基（例えば、アデニン（Ａ）およびグアニン（ｇ））、ならびにピリミジン塩基（例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ、）およびウラシル（Ｕ））を含み得る。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシ（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ））、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換されたアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換されたウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆアデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニン（ｄｅａｚａｇｕａｎｉｎｅ）、および７−デアザアデノシン（ｄｅａｚａａｄｅｎｉｎｅ）、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデノシンなどの、他の合成および然の核酸塩基を含み得る。修飾された核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）べンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）べンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４―（ｂ）（１，４）べンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧクランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ｐピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン（ピリドインドールシチジン（Ｈピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）などの、三環のピリミジンを含み得る。

複素環の塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えられるものを含み得る。核酸塩基は、ポリヌクレオチド化合物の結合親和性を増加させるのに有用であり得る。これらは、５−置換されたピリミジン、６−アザピリミジン（ａｚａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ）、および２−アミノプロピルアデニン、５−プロピルウラシル、および５−プロピルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、なたびにＯ−６置換されたプリンを含み得る。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６−１．２°Ｃ増加させることができ、適切な塩基置換であり得る（例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合）。

ガイド核酸の修飾は、ガイド核酸の活性、細胞の分布、または細胞の取り込みを増強することができる、ガイド核酸の１つ以上の部分または抱合体に化学的に結合することを含み得る。これらの部分または抱合体は、一次または二次のヒドロキシル基などの官能基に共有結合した抱合基（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｇｒｏｕｐｓ）を含み得る。抱合基としては、限定されないが、インターカレータ、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強することができる基が挙げられる。抱合基としては、限定されないが、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が挙げられる。薬力学的特性を増強する基は、取り込みを改善し、分解に対する体制を増強し、および／または標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションを強くする基を含む。薬物動態特性を増強することができる基は、核酸の取り込み、分布、物質代謝、または排出を改善する基を含む。抱合体部分としては、限定されないが、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分またはオクタデシルアミン、あるいはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステリン部分コレステロール部分のような脂質部分が挙げられる。

修飾は、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（つまり、細胞透過性ペプチド，（ＣＰＰ））を含み得る。ＰＴＤは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、または小胞膜を通過するのを容易にするポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機あるいは無機の化合物を指し得る。ＰＴＤは、小さな極性分子から大きな高分子および／またはナノ粒子の範囲であり得る別の分子に結合され得、ならびに、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、または細胞質ゾルから細胞小器官内へと分子が薄膜を通過することを容易にし得る。ＰＴＤは、ポリペプチドのアミノ末端に共有され得る。ＰＴＤは、ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合され得る。ＰＴＤは、核酸に共有結合され得る。例示的なＰＴＤは、限定されないが、最小のペプチド・タンパク質形質導入ドメイン；細胞（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０−５０のアルギニン）への直接入力に十分な数のアルギニンを含むポリアルギニン配列、ＶＰ２２ドメイン、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン、トランケートされたヒトカルシトニン・ペプチド、ポリリシン、およびトランスポータン、３アルギニン残基から５０のアルギニン残基のアルギニン・ホモポリマーが挙げられ得る。ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）であってもよい。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介してマッチングポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されるポリカチオン性のＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含むことができ、正味の電荷をほぼ０にまで減少させ、それによって細胞への接着および取り込みを阻害する。リンカーが切断されると、ポリアニオンが放出され得、ポリアルギニンおよびその固有の接着性を局所的に暴露し、したがって薄膜を通過するためにＡＣＰＰを「活性化する」。

本開示は、関連ポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を、標的核酸内の特異的標的配列内に向けることができるガイド核酸を提供する。ガイド核酸はヌクレオチドを含み得る。ガイド核酸はＲＮＡであり得る。ガイド核酸はＤＮＡであり得る。ガイド核酸はシングルガイド核酸を含み得る。ガイド核酸は、スペーサー伸長および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長を含み得る。スペーサー伸長および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、さらなる機能性（例えば、安定性）をガイド核酸に寄付する要素を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は選択自由である。ガイド核酸はスペーサー配列を含み得る。スペーサー配列は、標的核酸配列にハイブリタイズする配列を含み得る。スペーサー配列はガイド核酸の可変部分であり得る。スペーサー配列の配列は、標的核酸配列にハイブリダイズするように操作され得る。ＣＲＩＳＰＲ反復（つまり、例示的な実施形態では最小のＣＲＩＳＰＲ反復と称される）は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（つまり、この例示的な実施形態では最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列と称される）にハイブリタイズすることができるヌクレオチドを含み得る。最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、相互作用することができ、相互作用する分子は塩基対の二本鎖の構造を含む。ともに、最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドへの結合を促進することができる。最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ヘアピン構造を形成するために、単一のガイドコネクタを介して一緒に結合され得る。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、プロトスペーサーの隣接モチーフ認識配列を含み得る。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部と同一または類似し得る。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１以上のヘアピンを含み得る。

いくつかの実施形態では、ガイド核酸はシングルガイド核酸を含み得る。ガイド核酸はスペーサー配列を含み得る。スペーサー配列は、標的核酸配列にハイブリタイズできる配列を含み得る。スペーサー配列はガイド核酸の可変部分であり得る。スペーサー配列は第１の二本鎖の５’であり得る。第１の二本鎖は、最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間のハイブリダイゼーションの領域を含み得る。第１の二本鎖は、バルジによって中断され得る。バルジは不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジは、ガイド核酸への部位特異的ポリペプチドの動員を容易にし得る。第１の基部はバルジに続いてもよい。第１の基部は、最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を結合するリンカー配列を含み得る。第１の二本鎖の３’末端における最後の対のヌクレオチドは、第２のリンカー配列に接続され得る。第２のリンカーはＰ−ドメインを含み得る。第２のリンカーは、第１の二本鎖を中央のｔｒａｃｒＲＮＡに結合し得る。いくつかの実施形態では、中央のｔｒａｃｒＲＮＡは、１以上のヘアピン領域を含む。例えば、中央のｔｒａｃｒＲＮＡは、第２の基部および第３の基部を含み得る。

いくつかの実施形態では、ガイド核酸はダブルガイド核酸構造を含み得る。シングルガイド核酸構造にと同様に、ダブルガイド核酸構造は、スペーサー伸長、スペーサー、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長を含んでもよい。しかし、ダブルガイド核酸は、単一のガイドコネクタを含まなくてもよい。代わりに、最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、ＣＲＩＳＰＲ反復の一部と類似または同一であり得る３’ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含み得る。同様に、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部類似または同一であり得る５’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み得る。ダブルガイドＲＮＡは、最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列によって一緒にハイブリタイズすることができる。

いくつかの実施形態では、第１のセグメント（つまり、ガイドセグメント）はスペーサー伸長およびスペーサーを含み得る。ガイド核酸は、上記のガイドセグメントを介して、結合ポリペプチドを標的核酸内の特異的ヌクレオチド配列に誘導することができる。

いくつかの実施形態では、第２のセグメント（つまり、タンパク質結合セグメント）は最小のＣＲＩＳＰＲ反復、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含み得る。ガイド核酸のタンパク結合セグメントは、部位特異的ポリペプチドと相互作用することができる。ガイド核酸のタンパク結合セグメントは、互いにハイブリタイズすることができるヌクレオチドの２つの伸張を含むことができる。タンパク結合セグメントのヌクレオチドは、二重鎖の核酸二本鎖を形成するためにハイブリタイズすることができる。二重鎖の核酸二本鎖はＲＮＡであり得る。二重鎖の核酸二本鎖はＤＮＡであり得る。

いくつかの例では、ガイド核酸はスペーサー伸長、スペーサー、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、単一のガイドコネクタ、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長を５’〜３’の順序で含み得る。いくつかの実施例では、ガイド核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ、単一のガイドコネクタ、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、スペーサー、およびスペーサー伸長を、任意の順序で含み得る。

ガイド核酸および部位特異的ポリペプチドは複合体を形成することができる。ガイド核酸は、標的核酸の配列にハイブリタイズするヌクレオチド配列を含むことによって、複合体に標的特異性を提供することができる。言いかえれば、部位特異的ポリペプチドは、ガイド核酸の少なくともタンパク結合セグメントとのその関連のおかげで核酸配列に誘導され得る。ガイド核酸は、Ｃａｓ９タンパク質の活性を向けることができる。ガイド核酸は、酵素的に不活性のＣａｓ９タンパク質の活性を向けることができる。

開示の方法は、遺伝子組換えされた細胞を提供し得る。遺伝子組換えされた細胞は、外因性のガイド核酸および／またはガイド核酸をコードするヌクレオチド配列を含む外因性の核酸を含み得る。

スペーサー伸長配列

スペーサー伸長配列は安定性を提供し得、および／またはガイド核酸の修飾のための位置を提供することができる。スペーサー伸長配列は、約１のヌクレオチドから約４００のヌクレオチドの長さを有し得る。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７０００のヌクレオチドを超える長さを有する。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００以上のヌクレオチド未満の長さを有する。スペーサー伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さであり得る。スペーサー伸長配列は、１０から３０のヌクレオチドの長さであり得る。スペーサー伸長配列は、３０から７０のヌクレオチドの長さであり得る。

スペーサー伸長配列は、部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含み得る。部分は、核酸標的ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。部分は、転写ターミネーターセグメント（つまり、転写終結配列）であり得る。ガイド核酸の部分は、約１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）から約２０ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ、約３０ｎｔから約４０ｎｔ、約４０ｎｔから約５０ｎｔ、約５０ｎｔから約６０ｎｔ、約６０ｎｔから約７０ｎｔ、約７０ｎｔから約８０ｎｔ、約８０ｎｔから約９０ｎｔ、または約９０ｎｔから約１００ｎｔ、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔ、約１５ｎｔから約５０ｎｔ、約１５ｎｔから約４０ｎｔ、約１５ｎｔから約３０ｎｔ、または約１５ｎｔから約２５ｎｔの全長を有し得る。部分は、真核細胞の中で機能するものであり得る。ある場合には、部分は原核細胞の中で機能するものであり得る。部分は、真核細胞および原核細胞の両方の中で機能するものであり得る。

適切な部分の非限定的な例は：５’キャップ（例えば７−メチルグアニル酸（ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｙｌａｔｅ）キャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体によって、調節された安定性および／または調節されたアクセシビリティーを可能にするために）、ｄｓＲＮＡ二本鎖（つまり、ヘアピン）を形成する配列、細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的化する配列、トラッキング（例えば、蛍光分子への直接結合、それは蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）を提供する修飾または配列、タンパク質のための結合部位（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン・アセチルトランスフェラーゼ、ヒストン・デアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡ上で機能するタンパク質）を提供する修飾または配列、改善した、減少した、および／または制御可能な安定性を提供する修飾または配列、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。スペーサー伸長配列は、プライマー結合部位、分子指標（例えば、バーコード配列）を含み得る。スペーサー伸長配列は、核酸アフィニティータグを含み得る。

スペーサー

ガイド核酸のガイドセグメントは、標的核酸内で配列にハイブリタイズすることができるヌクレオチド配列（例えば、スペーサー）を含み得る。ガイド核酸のスペーサーは、配列特異的な様式でハイブリダイゼーション（つまり、塩基対形成）を介して標的核酸と相互作用することができる。そのように、スペーサーのヌクレオチド配列は変化し得、ガイド核酸および標的核酸が相互作用する標的核酸内の位置を決定することができる。

スペーサー配列は、スペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に位置する標的核酸にハイブリタイズすることができる。様々な生物は様々なＰＡＭ配列を含み得る。例えば、化膿性連鎖球菌において、ＰＡＭは配列５’−ＸＲＲ−３’を含む標的核酸中の配列であり得、ここで、ＲはＡまたはＧのいずれかであり得、Ｘは任意のヌクレオチドであり、およびＸはスペーサー配列によって目標化された標的核酸配列の３’の直ぐそばにある。

標的核酸配列は２０のヌクレオチドであり得る。標的核酸は、２０より少ないヌクレオチドであり得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３の、２４、２５、３０、またはそれより多いヌクレオチドであり得る。標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれより多いヌクレオチドであり得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドの５’直ぐそばの２０塩基であり得る。例えば、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＲＲ−３’を含む配列では、標的核酸はＮに相当する配列であり得、ここでＮは任意のヌクレオチドである。

標的核酸にハイブリタイズすることができるスペーサーのガイド配列は、少なくとも約６ｎｔの長さを有し得る。例えば、標的核酸をハイブリタイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔまたは少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔから約８０ｎｔ、約６ｎｔから約５０ｎｔ、約６ｎｔから約４５ｎｔ、約６ｎｔから約４０ｎｔ、約６ｎｔから約３５ｎｔ、約６ｎｔから約３０ｎｔ、約６ｎｔから約２５ｎｔ、約６ｎｔから約２０ｎｔ、約６ｎｔから約１９ｎｔ、約１０ｎｔから約５０ｎｔ、約１０ｎｔから約４５ｎｔ，約１０ｎｔから約４０ｎｔ、約１０ｎｔから約３５ｎｔ、約１０ｎｔから約３０ｎｔ、約１０ｎｔから約２５ｎｔ、約１０ｎｔから約２０ｎｔ、約１０ｎｔから約１９ｎｔ，約１９ｎｔから約２５ｎｔ、約１９ｎｔから約３０ｎｔ、約１９ｎｔから約３５ｎｔ、約１９ｎｔから約４０ｎｔ、約１９ｎｔから約４５ｎｔ、約１９ｎｔから約５０ｎｔ、約１９ｎｔから約６０ｎｔ、約２０ｎｔから約２５ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ，約２０ｎｔから約３５ｎｔ、約２０ｎｔから約４０ｎｔ、約２０ｎｔから約４５ｎｔ、約２０ｎｔから約５０ｎｔ、または約２０ｎｔから約６０ｎｔの長さを有し得る。ある場合には、標的核酸にハイブリタイズすることができるスペーサー配列は、２０ヌクレオチド長であってもよい。標的核酸にハイブリタイズすることができるスペーサーは、１９ヌクレオチド長であり得る。

スペーサー配列と標的核酸との間の相補率（ｐｅｒｃｅｎｔｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％であり得る。スペーサー配列と標的核酸との間の相補率は、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、最大で約９５％、最大で約９７％、最大で約９８％、最大で約９９％、または１００％であり得る場合によっては、スペーサー配列と標的核酸との間の相補率が、標的核酸の相補鎖の標的配列の６つの近接する５’末端ヌクレオチドにわたって１００％であってもよい。場合によっては、スペーサー配列と標的核酸との間の相補率は、約２０の近接するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。場合によっては、スペーサー配列と標的核酸との間の相補率が、標的核酸の相補鎖の標的配列の１４つの近接する５’末端ヌクレオチドにわたって１００％であり得、および残部にわたって０％まで低くてもよい。そのような場合、スペーサー配列は１４ヌクレオチド長であると考えられ得る。場合によっては、スペーサー配列と標的核酸との間の相補率が、標的核酸の相補鎖の標的配列の６つの近接する５’末端ヌクレオチドにわたって１００％であり得、および残部にわたって０％まで低くてもよい。そのような場合、スペーサー配列は６ヌクレオチド長であると考えられ得る。標的核酸は、ｃｒＲＮＡのシード領域に対して、約５０％６０％７０％、８０％、９０％、または１００％を超えて相補的であり得る。標的核酸は、ｃｒＲＮＡのシード領域に対して、約５０％６０％７０％、８０％、９０％、または１００％未満で相補的であり得る。

ガイド核酸のスペーサーセグメントは、標的核酸内の任意の所望の配列にハイブリダイズするために、（例えば、遺伝子操作によって）修飾され得る。例えば、スペーサーは、癌、細胞増殖、ＤＮＡ複写、ＤＮＡ修復、ＨＬＡ遺伝子、細胞表面タンパク質、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子、がん抑制遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子、長い非コードのＲＮＡ遺伝子、転写因子、グロビン、ウイルス蛋白、ミトコンドリア遺伝子などに関連する標的核酸内の配列に、ハイブリダイズするように操作され得る（例えば、設計されるかプログラムされる）。

スペーサー配列は、コンピュータプログラム（例えば、機械可読コード）を使用して同定され得る。コンピュータプログラムは、予測融解温度、二次構造形成、および予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、染色質アクセシビリティー、％ＧＣ、ゲノム出現頻度、メチル化ステータス、ＳＮＰの存在などのような変数を使用することができる。

最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列

最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、参照ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来のｃｒＲＮＡ）と、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性配列であり得る。最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、参照ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来のｃｒＲＮＡ）と、最大で約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性配列であり得る。最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリタイズすることができるヌクレオチドを含み得る。最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、塩基対の組織、二本鎖の構造を形成することができる。ともに、最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドへの結合を容易にすることができる。最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列の一部は、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリタイズすることができる。最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列の一部は、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的であり得る。最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列の一部は、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、最大で約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的であり得る。

最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約６つのヌクレオチドから約１００のヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）から約５０ｎｔ、約６ｎｔから約４０ｎｔ、約６ｎｔから約３０ｎｔ、約６ｎｔから約２５ｎｔ、約６ｎｔから約２０ｎｔ、約６ｎｔから約１５ｎｔ、約８ｎｔから約４０ｎｔ、約８ｎｔから約３０ｎｔ、約８ｎｔから約２５ｎｔ、約８ｎｔから約２０ｎｔまたは約８ｎｔから約１５ｎｔ、約１５ｎｔから約１００ｎｔ、約１５ｎｔから約８０ｎｔ、約１５ｎｔから約５０ｎｔ、約１５ｎｔから約４０ｎｔ、約１５ｎｔから約３０ｎｔ、または約１５ｎｔから約２５ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ１２のヌクレオチドの長さを有し得る。

最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、一続きの少なくとも６つ、７つ、または８つの近接するヌクレオチドにわたって、参照最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型ｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一であり得る。最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、一続きの少なくとも６つ、７つ、または８つの近接するヌクレオチドにわたって、参照最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型ｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列は、一続きの少なくとも６つ、７つ、または８つの隣接するヌクレオチドにわたって、参照最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列に、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。

最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列

最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に、少なくとも３０約％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有する配列であり得る。最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に、最大で３０約％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有する配列であり得る。最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリタイズすることができるヌクレオチドを含み得る。最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、塩基対の組織、二本鎖の構造を形成することができる。ともに、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、部位特異的ポリペプチドへの結合を容易にすることができる。最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部は、最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリタイズすることができる。最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部は、最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して、最大で約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的であり得る。

最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６つのヌクレオチドから約１００のヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）から約５０ｎｔ、約６ｎｔから約４０ｎｔ、約６ｎｔから約３０ｎｔ、約６ｎｔから約２５ｎｔ、約６ｎｔから約２０ｎｔ、約６ｎｔから約１５ｎｔ、約８ｎｔから約４０ｎｔ、約８ｎｔから約３０ｎｔ、約８ｎｔから約２５ｎｔ、約８ｎｔから約２０ｎｔまたは約８ｎｔから約１５ｎｔ、約１５ｎｔから約１００ｎｔ、約１５ｎｔから約８０ｎｔ、約１５ｎｔから約５０ｎｔ、約１５ｎｔから約４０ｎｔ、約１５ｎｔから約３０ｎｔ、または約１５ｎｔから約２５ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４のヌクレオチドの長さを有し得る。

最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一続きの少なくとも６つ、７つ、または８つの近接するヌクレオチドにわたって、参照最小のｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％同一であり得る。最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一続きの少なくとも６つ、７つ、または８つの近接するヌクレオチドにわたって、参照最小のｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一続きの少なくとも６つ、７つ、または８つの隣接するヌクレオチドにわたって、参照最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列に、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。

最小のＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小のｔｒａｃｒＲＮＡの間の二本鎖は、二重螺旋を含み得る。二本鎖の第１の鎖の第１の塩基はグアニンであり得る。二本鎖の第１の鎖の第１の塩基はアデニンであり得る。最小のＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小のｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二本鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチドを含み得る。最小のＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小のｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二本鎖は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチドを含み得る。

二本鎖はミスマッチを含み得る。二本鎖は、少なくとも約１、２、３、４、または５、あるいはミスマッチを含み得る。二本鎖は、最大で約１、２、３、４、または５、あるいはミスマッチを含み得る。いくつかの例では、二本鎖は２未満のミスマッチを含む。

バルジ

バルジは、最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列で構成される二本鎖内のヌクレオチドの不対の領域を指し得る。バルジは、部位特異的ポリペプチドへの結合において重要であり得る。バルジは、二本鎖の片側において、不対の５’−ＸＸＸＹ−３’を含み得、ここで、Ｘが任意のプリンであり、Ｙが反対の鎖上でヌクレオチドとゆらぎ対、および二本鎖の別の側において不対のヌクレオチド領域を形成することができるヌクレオチドであり得る。

例えば、バルジは、バルジの最小のＣＲＩＳＰＲ反復鎖上で不対のプリン（例えば、アデニン）を含み得る。いくつかの実施形態では、バルジは、バルジの最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖不対の５’−ＡＡＧＹ−３つ’を含むことができ、ここで、Ｙが、最小のＣＲＩＳＰＲ反復鎖上でヌクレオチドとゆらぎ対形成を形成するヌクレオチドであり得る。

二本鎖の第１の側上のバルジ（例えば、最小のＣＲＩＳＰＲ反復側）は、少なくとも１、２、３、４、または５以上の不対のヌクレオチドを含むことができる。二本鎖の第１の側上のバルジ（例えば、最小のＣＲＩＳＰＲ反復側）は、最大で１、２、３、４、または５以上の不対のヌクレオチドを含むことができる。二本鎖の第１の側上のバルジ（例えば、最小のＣＲＩＳＰＲ反復側）は、１つの不対のヌクレオチドを含み得る。

二本鎖の第２の側上のバルジ（例えば、二本鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列側面）は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の不対のヌクレオチドを含み得る。二本鎖の第２の側上のバルジ（例えば、二本鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列側面）は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の不対のヌクレオチドを含み得る。二本鎖の第２の側上のバルジ（例えば、二本鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列側面）は、４つの不対のヌクレオチドを含み得る。

二本鎖の各鎖上の不対のヌクレオチドの様々な数の領域は、ともに対になり得る。例えば、バルジは、第１の鎖からの５つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖からの１つの不対のヌクレオチドを含み得る。バルジは、第１の鎖からの４つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖からの１つの不対のヌクレオチドを含み得る。バルジは、第１の鎖からの３つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖からの１つの不対のヌクレオチドを含み得る。バルジは、第１の鎖からの２つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖からの１つの不対のヌクレオチドを含み得る。バルジは、第１の鎖からの１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖からの１つの不対のヌクレオチドを含み得る。バルジは、第１の鎖からの１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖からの２つの不対のヌクレオチドを含み得る。バルジは、第１の鎖からの１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖からの３つの不対のヌクレオチドを含み得る。バルジは、第１の鎖からの１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖からの４つの不対のヌクレオチドを含み得る。バルジは、第１の鎖からの１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖からの５つの不対のヌクレオチドを含み得る。

いくつかの例では、バルジは少なくとも１つのゆらぎ対形成を含み得る。いくつかの例では、バルジは最大で１つのゆらぎ対形成を含み得る。バルジ配列は、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含み得る。バルジ配列は、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含み得る。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含み得る。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含み得る。バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含み得る。

Ｐ−ドメイン（Ｐ−ＤＯＭＡＩＮ）

Ｐ−ドメインは、標的核酸中のプロトスペーサーの隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識することができるガイド核酸の領域を指し得る。Ｐ−ドメインは、標的核酸中のＰＡＭにハイブリタイズすることができる。そのように、Ｐ−ドメインは、ＰＡＭに相補的な配列を含むことができる。Ｐ−ドメインは、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して３’に位置することができる。Ｐ−ドメインは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（つまり、中央のｔｒａｃｒＲＮＡの配列）内に位置することができる。

最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の二本鎖において、ｐは、最後の対のヌクレオチドの少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以上のヌクレオチド３’から始まる。Ｐ−ドメインは、最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の二本鎖において、最後の対のヌクレオチドの最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチド３’から始まる。

Ｐ−ドメインは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以上の連続するヌクレオチドを含み得る。Ｐ−ドメインは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以上の連続するヌクレオチドを含み得る。

いくつかの例では、Ｐ−ドメインは、ＣＣジヌクレオチド（つまり、２つの連続するシトシンヌクレオチド）を含み得る。ＣＣジヌクレオチドは、ＰＡＭのＧＧジヌクレオチドと相互作用することができ、ここで、ＰＡＭは５’−ＸＧＧ−３’配列を含む。

Ｐ−ドメインは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（つまり、中央のｔｒａｃｒＲＮＡの配列）中に位置するヌクレオチド配列であり得る。Ｐ−ドメインは、二本鎖のヌクレオチド（例えば、ともにハイブリタイズされたヘアピン中のヌクレオチド）を含み得る。例えば、Ｐ−ドメインは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（つまり、中央のｔｒａｃｒＲＮＡ配列）ヘアピンの二本鎖中でＧＧジヌクレオチドにハイブリタイズされるＣＣジヌクレオチドを含むことができる。Ｐ−ドメインの活性（例えば、標的核酸を標的化するガイド核酸の能力）は、Ｐ−ＤＯＭＡＩＮのハイブリダイゼーション状態によって調節され得る。例えば、Ｐ−ドメインがハイブリタイズされる場合、ガイド核酸はその標的を認識することができない。Ｐ−ドメインがハイブリタイズされない場合、ガイド核酸はその標的を認識することができる。

Ｐ−ドメインは、部位特異的ポリペプチド内のＰ−ドメイン相互作用領域と相互作用することができる。Ｐ−ドメインは、部位特異的ポリペプチド中のアルギニンに富んだ塩基性パッチと相互作用することができる。Ｐ−ドメイン相互作用領域は、ＰＡＭ配列と相互作用することができる。Ｐ−ドメインはステムループを含み得る。Ｐ−ドメインはバルジを含み得る。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）との、少なくとも３０約％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有する配列であり得る。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）との、最大で３０約％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有する配列であり得る。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）から約５０ｎｔ、約６ｎｔから約４０ｎｔ、約６ｎｔから約３０ｎｔ約６ｎｔから約２５ｎｔ、約６ｎｔから約２０ｎｔ、約６ｎｔから約１５ｎｔ、約８ｎｔから約４０ｎｔ、約８ｎｔから約３０ｎｔ、約８ｎｔから約２５ｎｔ、約８ｎｔから約２０ｎｔまたは約８ｎｔから約１５ｎｔ、約１５ｎｔから約１００ｎｔ、約１５ｎｔから約８０ｎｔ、約１５ｎｔから約５０ｎｔ、約１５ｎｔから約４０ｎｔ、約１５ｎｔから約３０ｎｔ、または約１５ｎｔから約２５ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４のヌクレオチドの長さを有し得る。

３’ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一続きの少なくとも６つ、７つ、または８つの近接するヌクレオチドにわたって、参照３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一続きの少なくとも６つ、７つ、または８つの近接するヌクレオチドにわたって、参照３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つを超える二本鎖の領域（例えば、ヘアピン、ハイブリタイズされた領域）を含み得る。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二本鎖の領域を含み得る。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、中央のｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれ得る。中央のｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、ステムループ構造を含むことができる。言いかえれば、中央のｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、第２または第３のステムと異なるヘアピンを含むことができる。中央のｔｒａｃｒＲＮＡ（つまり、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ）中のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０以上のヌクレオチドを含むことができる。中央のｔｒａｃｒＲＮＡ（つまり、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ）中のステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチドを含むことができる。ステムループ構造は、官能性部分を含み得る。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、およびエクソンを含むことができる。ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、または５以上の官能性部分を含み得る。ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、または５以上の官能性部分を含み得る。

中央のｔｒａｃｒＲＮＡの配列のヘアピンは、Ｐ−ドメインを含み得る。Ｐ−ドメインは、ヘアピン中の二本鎖領域を含み得る。

ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列

ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、安定性を提供し得、および／またはガイド核酸の修飾のための位置を提供し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１つのヌクレオチドから約４００のヌクレオチドの長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、またはそれ以上の長さのヌクレオチドを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０のヌクレオチドから約５０００以上のヌクレオチドの長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００を超えるヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００未満の長さのヌクレオチドを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００未満のヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０から３０のヌクレオチドの長さであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０から７０のヌクレオチドの長さであり得る。

ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含み得る。部分は、核酸標的ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。部分は、転写ターミネーターセグメント（つまり、転写終結配列）であり得る。ガイド核酸の部分は、約１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド，約１０ヌクレオチド（ｎｔ）から約２０ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ、約３０ｎｔから約４０ｎｔ、約４０ｎｔから約５０ｎｔ、約５０ｎｔから約６０ｎｔ、約６０ｎｔから約７０ｎｔ、約７０ｎｔから約８０ｎｔ、約８０ｎｔから約９０ｎｔ、または約９０ｎｔから約１００ｎｔ、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔ、約１５ｎｔから約５０ｎｔ、約１５ｎｔから約４０ｎｔ、約１５ｎｔから約３０ｎｔ、または約１５ｎｔから約２５ｎｔの長さを有し得る。部分は、真核細胞の中で機能するものであり得る。ある場合には、部分は原核細胞の中で機能するものであり得る。部分は、真核細胞および原核細胞の両方の中で機能するものであり得る。

適切なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部分の非限定的な例は：３’ポリ−アデニル化されたテイル、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体によって、調節された安定性および／または調節されたアクセシビリティーを可能にするために）、ｄｓＲＮＡ二本鎖（つまり、ヘアピン）を形成する配列、細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的化する配列、トラッキング（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）を提供する修飾または配列、タンパク質のための結合部位（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストン・アセチルトランスフェラーゼ、ヒストン・デアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡ上で機能するタンパク質）を提供する修飾または配列、修飾または配列、改善した、減少した、および／または制御可能な安定性を提供する修飾または配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合部位、分子指標（例えば、バーコード配列）を含み得る。開示のいくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１以上のアフィニティータグを含み得る。

シングルガイド核酸

ガイド核酸はシングルガイド核酸であり得る。シングルガイド核酸はＲＮＡであり得る。シングルガイド核酸は、シングルガイドコネクタ配列と呼ばれ得る、最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間のリンカーを含み得る。

シングルガイド核酸のシングルガイドコネクタは、約３つのヌクレオチドから約１００のヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約９０ｎｔ、約３ｎｔから約８０ｎｔ、約３ｎｔから約７０ｎｔ、約３ｎｔから約６０ｎｔ、約３ｎｔから約５０ｎｔ、約３ｎｔから約４０ｎｔ、約３ｎｔから約３０ｎｔ、約３ｎｔから約２０ｎｔ、または約３ｎｔから約１０ｎｔの長さを有し得る。例えば、リンカーは、約３ｎｔから約５ｎｔ、約５ｎｔから約１０ｎｔ、約１０ｎｔから約１５ｎｔ、約１５ｎｔから約２０ｎｔ、約２０ｎｔから約２５ｎｔ、約２５ｎｔから約３０ｎｔ、約３０ｎｔから約３５ｎｔ、約３５ｎｔから約４０ｎｔ、約４０ｎｔから約５０ｎｔ、約５０ｎｔから約６０ｎｔ、約６０ｎｔから約７０ｎｔ、約７０ｎｔから約８０ｎｔ、約８０ｎｔから約９０ｎｔ、または約９０ｎｔから約１００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、シングルガイド核酸のリンカーは、４から４０の間のヌクレオチドである。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００年、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００か、または７０００以上のヌクレオチドの長さを有し得る。リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００年、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００か、または７０００以上のヌクレオチドの長さを有し得る。

リンカー配列は、官能性部分を含み得る。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、およびエクソンを含むことができる。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、または５以上の官能性部分を含んでもよい。リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、または５以上の官能性部分を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、シングルガイドコネクタは、最小のＣＲＩＳＰＲ反復の３’末端を最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の５’末端に接続させることができる。あるいは、シングルガイドコネクタは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の３’末端を最小のＣＲＩＳＰＲ反復の５’末端に接続させることができる。言い換えると、シングルガイド核酸は、３’タンパク質結合セグメントに結合された５’ＤＮＡ結合セグメントを含み得る。シングルガイド核酸は、３’ＤＮＡ結合セグメントに結合された５’タンパク質結合セグメントを含み得る。

ガイド核酸は、１０−５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列と；１２−３０ヌクレオチド長のスペーサー配列であって、ここで、スペーサーは標的核酸に少なくとも５０％相補的である、スペーサー配列と；６つ、７つ、または８つの近接するするヌクレオチドにわたって、原核生物（例えば、化膿性連鎖球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を有する最小のＣＲＩＳＰＲ反復であって、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は５−３０のヌクレオチドの長さを有する、最小のＣＲＩＳＰＲ反復と；６つ、７つ、または８つの近接するするヌクレオチドにわたって、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を有する最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列であって、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は５−３０のヌクレオチドの長さを有する、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列と；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを結合し、３−５０００のヌクレオチドの長さを含むリンカー配列と；６つ、７つ、または８つの近接するするヌクレオチドにわたって、原核生物（例えば、化膿性連鎖球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を含む３’ｔｒａｃｒＲＮＡであって、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは１０−２０のヌクレオチドの長さを含み、かつ二本鎖の領域を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡと；および／または、１０−５０００のヌクレオチドの長さ、または任意のそれらの組み合わせを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長、を含み得る。このガイド核酸はシングルガイド核酸と呼ばれ得る。

ガイド核酸は、１０−５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列と；１２−３０ヌクレオチド長のスペーサー配列であって、ここで、スペーサーは標的核酸に少なくとも５０％相補的である、スペーサー配列と；１）６つの近接するヌクレオチドにわたって、原核生物（例えば、化膿性連鎖球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を有する最小のＣＲＩＳＰＲ反復であって、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は５−３０のヌクレオチドの長さを有する最小のＣＲＩＳＰＲ反復、２）６つの近接するヌクレオチドにわたって、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を有する最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列であって、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は５−３０のヌクレオチドの長さを有する最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ならびに、３）バルジであって、ここで、二本鎖の最小のＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および二本鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジ、を含む二本鎖と；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを結合し、３−５０００のヌクレオチドの長さを含むリンカー配列と；６つの近接するするヌクレオチドにわたって、原核生物（例えば、化膿性連鎖球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を含む３’ｔｒａｃｒＲＮＡであって、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは１０−２０のヌクレオチドの長さを含み、かつ二本鎖の領域を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡと；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖の１−５ヌクレオチド下流から始まるＰ−ドメインであって、ここで、Ｐ−ドメインは１−１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリタイズすることができる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、および３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置するＰ−ドメインと；および／または、１０−５０００のヌクレオチドの長さ、あるいは任意のそれらの組み合わせを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長と、を含み得る。

ダブルガイド核酸

ガイド核酸はダブルガイド核酸であり得る。ダブルガイド核酸はＲＮＡであり得る。ダブルガイド核酸は、２つの別々の核酸分子（つまり、ポリヌクレオチド）を含むことができる。ダブルガイド核酸の２つの核酸分子の各々は、タンパク結合セグメントの二重鎖の二本鎖を形成するために２つの核酸分子の相補的なヌクレオチドをハイブリダイズするように、互いにハイブリタイズすることができる一続きのヌクレオチドを含み得る。特段指定されない限り、用語「ガイド核酸」は、単一分子ガイド核酸および二重分子ガイド核酸の両方を指すことを含み得る。

ダブルガイド核酸は、１）１０−５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含む第１の核酸分子；１２−３０ヌクレオチド長のスペーサー配列であって、ここで、スペーサーは標的核酸に少なくとも５０％相補的である、スペーサー配列；および、６つの近接するするヌクレオチドにわたって、原核生物（例えば、化膿性連鎖球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を含む最小のＣＲＩＳＰＲ反復であって、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は５−３０のヌクレオチドの長さを有する、最小のＣＲＩＳＰＲ反復；ならびに、および、２）６つの近接するヌクレオチドにわたって、原核生物（例えば、化膿性連鎖球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を含む最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むことができるダブルガイド核酸の第２の核酸分子であって、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５−３０のヌクレオチドの長さを有する、ダブルガイド核酸の第２の核酸分子；６つの近接するするヌクレオチドにわたって、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を含む３’ｔｒａｃｒＲＮＡであって、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは１０−２０のヌクレオチドの長さを含み、かつ二本鎖の領域を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ；および／または、１０−５０００のヌクレオチドの長さ、あるいは任意のそれらの組み合わせを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長、を含み得る。

いくつかの実施形態では、ダブルガイド核酸は、１）１０−５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含む第１の核酸分子と；１２−３０ヌクレオチド長のスペーサー配列であって、ここで、スペーサーは標的核酸に少なくとも５０％相補的である、スペーサー配列と；６つの近接するするヌクレオチドにわたって、原核生物（例えば、化膿性連鎖球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を含む最小のＣＲＩＳＰＲ反復であって、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は５−３０のヌクレオチドの長さとバルジの少なくとも３つの不対のヌクレオチドとを有する、最小のＣＲＩＳＰＲ反復と；および、２）６つの近接するヌクレオチドにわたって、原核生物（例えば、化膿性連鎖球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を含む最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むことができるダブルガイド核酸の第２の核酸分子であって、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５−３０のヌクレオチドの長さとバルジの少なくとも１つの不対のヌクレオチドとを有し、ここで、バルジの１つの不対のヌクレオチドは、最小のＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対のヌクレオチドと同じバルジ中に位置する、ダブルガイド核酸の第２の核酸分子と；６つの近接するするヌクレオチドにわたって、原核生物（例えば、化膿性連鎖球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに少なくとも６０％の同一性を含む３’ｔｒａｃｒＲＮＡであって、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは１０−２０のヌクレオチドの長さを含み、かつ二本鎖の領域を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡと；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖の１−５ヌクレオチド下流から始まるＰ−ドメインであって、ここで、Ｐ−ドメインは、１−１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリタイズすることができる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、および３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置するＰ−ドメイン；および／または、１０−５０００のヌクレオチドの長さ、あるいは任意のそれらの組み合わせと、を含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長、を含み得る。

ガイド核酸および部位特異的ポリペプチドの複合体

ガイド核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、核酸ガイドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９）と相互作用することができ、それによって、複合体を形成する。ガイド核酸は、標的核酸に部位特異的ポリペプチドを誘導することができる。

いくつかの実施形態では、複合体（例えば、部位特異的ポリペプチドおよびガイド核酸を含む）が、部位特異的ポリペプチドの切断部位の外部に結合することができるように、ガイド核酸が操作され得る。この場合は、標的核酸は複合体と相互作用しなくてもよく、標的核酸は切除され得る（例えば、複合体を含まない）。

いくつかの実施形態では、複合体が部位特異的ポリペプチドの切断部位の内部に結合することができるように、ガイド核酸が操作され得る。この場合は、標的核酸は複合体と相互作用することができ、標的核酸は結合され得る（例えば、複合体に結合される）。

本開示の任意のガイド核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、エフェクタータンパク質、多重遺伝標的化剤（ａｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｇｅｎｅｔｉｃｔａｒｇｅｔｉｎｇａｇｅｎｔ）、ドナーポリヌクレオチド、縦列融合タンパク質、レポーター要素、対象の遺伝要素、スプリットシステム、および／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸の成分あるいはタンパク質性分子は、組み換え型、精製型および／または単離型であり得る。

いくつかの実施形態では、方法は、核酸分子中の突然変異を修飾するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、置換、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、突然変異は一塩基多型である。

ある場合では、標的配列は、１０から３０の間のヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、標的配列は、１５から３０の間のヌクレオチドの長さである。ある場合には、標的配列は、約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９ｎまたは３０のヌクレオチドの長さである。ある場合には、標的配列は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２のヌクレオチドの長さである。

いくつかの例では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣａｓ９酵素またはその変異体を利用する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および細胞は、Ｃａｓ９酵素またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを利用する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、２つの活性切断部位（二重螺旋の各鎖に１つずつ）を有する二本鎖のヌクレアーゼである。いくつかの例では、Ｃａｓ９酵素またはその変異体は、二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９酵素は野生型Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９酵素は、野生型Ｃａｓ９酵素または化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９酵素の自然発生の変異体または突然変異体である。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を維持している間、変異体は野生型Ｃａｓ９酵素に部分的に相同である酵素であり得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を維持している間、変異体は、野生型Ｃａｓ９酵素の一部のみを含む酵素であり得る。いくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓ９酵素は化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓ９酵素は、ＧｅｎＢａｎｋＩＤＡＫＰ８１６０６．１を与えられたアミノ酸配列よって表わされる。いくつかの実施形態では、変異体は、ＧｅｎＢａｎｋＩＤＡＫＰ８１６０６．１を与えられたアミノ酸配列に少なくとも約９５％相同である。いくつかの実施形態では、変異体は、ＧｅｎＢａｎｋＩＤＡＫＰ８１６０６．１を与えられたアミノ酸配列に少なくとも約９０％相同である。いくつかの実施形態では、変異体は、ＧｅｎＢａｎｋＩＤＡＫＰ８１６０６．１を与えられたアミノ酸配列に少なくとも約８０％相同である。いくつかの実施形態では、変異体は、ＧｅｎＢａｎｋＩＤＡＫＰ８１６０６．１を与えられたアミノ酸配列に少なくとも約７０％相同である。いくつかの例では、Ｃａｓ９酵素は、本明細書に記載される細胞中の最適な発現および／または活性のために野生型のＣａｓ９酵素から修飾される、最適化されたＣａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９酵素は修飾されたＣａｓ９酵素であり、ここで、修飾されたＣａｓ９酵素は、本明細書で記載されるようなＣａｓ９酵素またはその変異体、およびさらなるアミノ酸配列を含む。さらなるアミノ酸配列は、非限定的な例として、Ｃａｓ９酵素またはその変異体に、さらなる活性、安定性、または識別タグ／バーコードを供給することができる。

二本鎖切断を生成するために、自然発生の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９酵素はＤＮＡを切断する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣａｓ９酵素はＣａｓ９ニッカーゼとして機能し、ここで、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的配列に切れ目を入れるために修飾されているＣａｓ９酵素であり、一本鎖切断を作成する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、標的配列において千鳥状パターンで各ＤＮＡ鎖を切断するために、標的配列を標的化する１つを超えるガイドＲＮＡと共にＣａｓ９ニッカーゼの使用を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼと共に２つのガイドＲＮＡを使用することは、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの標的特異性を増大することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡの使用は、ゲノム欠失の生成を結果としてもたらし得る。いくつかの実施形態では、ゲノム欠失は、約５つのヌクレオチドから約５０，０００のヌクレオチドの欠失である。いくつかの実施形態では、ゲノム欠失は、約５つのヌクレオチドから約１，０００のヌクレオチドの欠失である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数のガイドＲＮＡを使用することを含む。いくつかの実施形態では、複数のガイドＲＮＡは、単一遺伝子を標的化する。いくつかの実施形態では、複数のガイドＲＮＡは、複数の遺伝子を標的化する。

いくつかの例では、標的配列のためのガイドＲＮＡの特異性は、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い。いくつかの例では、ガイドＲＮＡは、約２０％、１５％、１０％、５％、３％、１％、またはそれより少ないオフターゲットの結合率を有する。

いくつかの実施形態では、標的配列にハイブリタイズするガイドＲＮＡの特異性は、標的配列に対して、約９５％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の配列相補性を有する。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼを神経網膜ロイシンジッパー（ＮＲＬ）タンパク質をコードする遺伝子に標的化する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＮＲＬコーディング遺伝子の標的配列にハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１−２から選択される。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１−２から選択される配列に少なくとも９０％相同である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１−２から選択される配列に少なくとも約８０％相同である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１−２から選択される配列に少なくとも約８５％相同である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１−２から選択される配列に少なくとも約９０％相同である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１−２から選択される配列に少なくとも約９５％相同である。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼを核内受容体サブファミリー２基Ｅ員、３つの（ＮＲ２Ｅ３）タンパク質をコードする遺伝子に標的化する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＮＲ２Ｅ３コーディング遺伝子の標的配列にハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３−４から選択される。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３−４から選択される配列に少なくとも９０％相同である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３−４から選択される配列に少なくとも約８０％相同である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３−４から選択される配列に少なくとも約８５％相同である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３−４から選択される配列に少なくとも約９０％相同である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３−４から選択される配列に少なくとも約９５％相同である。

ＤＮＡガイドヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および細胞は、核酸ガイドヌクレアーゼシステムを利用する。いくつかの実施形態、本明細書に開示される方法および細胞は、ＤＮＡガイドヌクレアーゼシステムを使用する。いくつかの実施形態、本明細書に開示される方法および細胞は、アルゴノートシステムを使用する。

アルゴノートタンパク質は、標的核酸に結合することができるポリペプチドであり得る。アルゴノートタンパク質はヌクレアーゼであり得る。アルゴノートタンパク質は、真核生物、原核生物、または古細菌のアルゴノートタンパク質であり得る。アルゴノートタンパク質は、原核生物のアルゴノートタンパク質（ｐアルゴノート）であり得る。ｐアルゴノートは、古細菌に由来し得る。ｐアルゴノートは、細菌に由来し得る。細菌は好熱性細菌および中温菌から選ばれ得る。バクテリアまたは古細菌は、超好熱性細菌（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クロストリジウム・バルトレティイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ）、イグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）、ハロゲオメトリカム・ボリンケンセ（Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍｂｏｒｉｎｑｕｅｎｓｅ）、ハロラブラム・ラクスプロフンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、アロマトレウム・アロマチカム（Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、サーマス属好熱性、シネココッカス、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、およびサーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｇａｔｕｓ）、またはそれらの任意の組み合わせから選択され得る。細菌は好熱性細菌であり得る。細菌は、超好熱性細菌であり得る。好熱性細菌はサーマス属好熱性（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔアルゴノート）であり得る。アルゴノートはシネココッカス細菌由来であり得る。アルゴノートはシネココッカス・エロンガタス由来であり得る。ｐアルゴノートは、野生型のｐアルゴノートの変異体ｐアルゴノートであり得る。

いくつかの実施形態では、本開示のアルゴノートは、Ｉ型の原核生物アルゴノート（ｐＡｇｏ）である。いくつかの実施形態では、Ｉ型の原核生物アルゴノートは、ＤＮＡ核酸標的核酸を保有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの核酸標的核酸は、ｄｓＤＮＡのニックまたは切断を生成するために、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の１つの鎖を標的化する。いくつかの実施形態、ニックまたは切断は、宿主ＤＮＡ修復を引き起こす。いくつかの実施形態では、宿主ＤＮＡ修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同方向組換え（ＨＤＲ）（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｄｉｒｅｃｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）である。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡは、ゲノム、染色体、およびプラスミドから選択される。いくつかの実施形態では、Ｉ型の原核生物アルゴノートは、長いＩ型の原核生物アルゴノートである。いくつかの実施形態では、長いＩ型の原核生物アルゴノートは、Ｎ−ＰＡＺ−ＭＩＤ−ＰＩＷＩドメイン構造を所有する。いくつかの実施形態では、長いＩ型の原核生物アルゴノートは、触媒活性ＰＩＷＩドメインを所有する。いくつかの実施形態では、長いＩ型の原核生物アルゴノートは、アスパラギン酸塩−グルタメート−アスパラギン酸塩−アスパラギン酸塩／ヒスチジン（ＤＥＤＸ）によってコードされる触媒四分子を所有する。いくつかの実施形態、触媒四分子は、１以上のＭｇ^＋イオンを結合する。いくつかの実施形態では、触媒四分子は、Ｍｇ^＋イオンを結合しない。いくつかの実施形態、触媒四分子は、１以上のＭｎ^＋イオンを結合する。いくつかの実施形態では、触媒活性ＰＩＷＩドメインは、中程度の温度で最適に活発であり得る。いくつかの実施形態では、中程度の温度は、約４５°Ｃから約２５°Ｃである。いくつかの実施形態では、中温は約３７℃である。いくつかの実施形態では、Ｉ型の原核生物アルゴノートは、ＤＮＡガイドの５′リン酸塩末端を固定する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡガイドは、その５′末端でデオキシシトシンを有する。いくつかの実施形態では、Ｉ型の原核生物アルゴノートは、サーマス・サーモフィルス・アゴ（ＴｔＡｇｏ）である。いくつかの実施形態では、Ｉ型の原核生物アルゴノートは、シネココッカス・エロンガタス・アゴ（ＳｅＡｇｏ）である。

いくつかの実施形態では、原核生物アルゴノートは、ＩＩ型ｐＡｇｏである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型の原核生物アルゴノートは、ＲＮＡ核酸標的核酸を保有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの核酸標的核酸は、ｄｓＤＮＡのニックまたは切断を生成するために、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の１つの鎖を標的化する。いくつかの実施形態、ニックまたは切断は、宿主ＤＮＡ修復を引き起こす。いくつかの実施形態では、宿主ＤＮＡ修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同方向組換えｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｄｉｒｅｃｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＨＤＲ）である。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡは、ゲノム、染色体、およびプラスミドから選択される。いくつかの実施形態では、ＩＩ型の原核生物アルゴノートは、長いＩＩ型の原核生物アルゴノートおよび短いＩＩ型の原核生物アルゴノートから選択される。いくつかの実施形態では、長いＩＩ型の原核生物アルゴノートは、Ｎ−ＰＡＺ−ＭＩＤ−ＰＩＷＩドメイン構造を有する。いくつかの実施形態では、長いＩＩ型の原核生物アルゴノートは、Ｎ−ＰＡＺ−ＭＩＤ−ＰＩＷＩドメイン構造を有しない。いくつかの実施形態では、短いＩＩ型の原核生物アルゴノートは、ＭＩＤおよびＰＩＷＩのドメインを有するが、ＰＡＺドメインは有しない。いくつかの実施形態では、短いＩＩ型のｐＡｇｏは、ＰＡＺドメインの類似体を有する。いくつかの実施形態では、ＩＩ型のｐＡｇｏは、触媒活性ＰＩＷＩドメインを有しない。いくつかの実施形態では、ＩＩ型のｐＡｇｏは、アスパラギン酸塩−グルタメート−アスパラギン酸塩−アスパラギン酸塩／ヒスチジン（ＤＥＤＸ）によってコードされる触媒四分子を欠いている。いくつかの実施形態では、ＩＩ型の原核生物アルゴノートをコードする遺伝子は、ヌクレアーゼをコードする１以上の遺伝子、ヘリカーゼ、またはそれらの組み合わせを用いてクラスター化される。ヌクレアーゼまたはヘリカーゼは、天然のもの、設計されたもの、またはそれらのドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｓｉｒ２、ＲＥ１、およびＴＩＲから選択される。いくつかの実施形態では、ＩＩ型のｐＡｇｏは、ＲＮＡガイドの５’リン酸塩末端を固定する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、その５’末端でウラシルを有する。いくつかの実施形態では、ＩＩ型に原核生物アルゴノートは、ロドバクター・スフェロイデス・アルゴノート（ＲｓＡｇｏ）である。

いくつかの実施形態では、１対のｐＡｇｏは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ核酸標的核酸を保有することができる。Ｉ型ｐＡｇｏは、ＲＮＡ核酸標的核酸を保有することができ、各々が二本鎖ＤＮＡの１つの鎖を標的化して、二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖の切断を生成する。いくつかの実施形態では、対のｐＡｇｏは２つのＩ型のｐＡｇｏを含む。いくつかの実施形態では、対のｐＡｇｏは２つのＩＩ型のｐＡｇｏを含む。いくつかの実施形態では、対のｐＡｇｏはＩ型のｐＡｇｏおよびＩＩ型のｐＡｇｏを含む。

アルゴノートタンパク質は、誘導核酸によって標的核酸配列に目標化することができる。

誘導核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。誘導核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ雑種であり得る。誘導核酸は、化学的に修飾されたヌクレオチドを含むことができる。

誘導核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖と標的ポリヌクレオチドをハイブリタイズすることができる。

誘導核酸は５’修飾を有することができる。５’修飾は、リン酸化、メチル化、ヒドロキシメチル化、アセチル化、ユビキチン化、またはスモイル化であり得る。５’修飾はリン酸化であり得る。

誘導核酸は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドあるいは塩基対の長さであり得る。いくつかの例では、誘導核酸は、１０ヌクレオチドまたは塩基対の長さ未満でもよい。いくつかの例では、誘導核酸は、５０ヌクレオチドまたは塩基対の長さを超えてもよい。

誘導核酸は、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であり得る。ｇＤＮＡは、５’リン酸化末端を有すことができる。ｇＤＮＡは、一本鎖または二本鎖でありえる。ｇＤＮＡは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドあるいは塩基対の長さであり得る。いくつかの例では、ｇＤＮＡは、１０ヌクレオチドの長さ未満でもよい。いくつかの例では、ｇＤＮＡは、５０ヌクレオチドの長さを超えてもよい。

多重化
多重ゲノム工学のための方法、組成物、システム、および／またはキットが本明細書に開示される。開示のいくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはガイド核酸を含むことができ、それによって、複合体を形成する。複合体は、標的核酸と接触させることができる。標的核酸は、複合体によって切断および／または修飾され得る。本開示の方法、組成物、システム、および／またはキットは、複数の標的核酸を迅速に、効率的に、および／または同時に修飾するのに有用であり得る。方法は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）、ガイド核酸、および部位特異的ポリペプチドと本明細書で記載されるようなガイド核酸との複合体のいずれかを使用して実施され得る。

本開示の部位特異的ヌクレアーゼは、任意の組み合わせで組み合わせることができる。例えば、複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、同じ標的の異なる標的配列または異なるセグメントを標的化するために使用され得る。別の例では、Ｃａｓ９およびアルゴノートは、同じ標的の異なる標的または異なるセクションを標的化とするために、組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、複数の異なる配列を同時に標的化するために、複数の異なるガイド核酸と共に使用され得る。

核酸（例えば、ガイド核酸）は、非天然の配列（例えば、部分、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）と融合され得、それによって、核酸モジュールを形成する。核酸モジュール（例えば、非天然の配列に融合された核酸を含む）は、縦一列になって結合され得、それによって、多重遺伝標的化剤（例えば、ポリモジュール（ｐｏｌｙｍｏｄｕｌｅ）、例えば、アレイ）を形成する。多重遺伝標的化剤はＲＮＡを含むことができる。多重遺伝標的化剤は、１以上のエンドリボヌクレアーゼに接触させられ得る。エンドリボヌクレアーゼは非天然の配列に結合することができる。結合エンドリボヌクレアーゼは、非天然の配列によって定義された規定の位置で、多重遺伝標的化剤の核酸モジュールを切断することができる。切断は、個々の核酸モジュールを処理する（例えば、遊離する）ことができる。いくつかの実施形態では、処理された核酸モジュールは、非天然の配列のすべてまたは一部を含むか、あるいは全く含まない。処理された核酸モジュールは、部位特異的ポリペプチドによって結合され得、それによって、複合体を形成する。複合体は、標的核酸に標的化され得る。標的核酸は、複合体によって切断および／または修飾され得る。

多重遺伝標的化剤は、複数の標的核酸を同時に、および／または化学量論量で修飾するのに使用され得る。多重遺伝標的化剤は、縦一列で本明細書に記載されるような任意の核酸標的核酸であり得る。多重遺伝標的化剤は、１以上の核酸モジュールを含む連続的な核酸分子を指し得る。核酸モジュールは、核酸および非天然の配列（例えば、部分、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含むことができる。核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ、またはｌｉｎｃＲＮＡ）、内因性ｓｉＲＮＡ（ｅｎｄｏ−ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性低分子干渉ＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、反復関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ＳｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはそれらの任意の組み合わせなどの、ノンコーディングＲＮＡであり得る。核酸は、コーディングＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。核酸は、任意のタイプのＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、核酸は核酸標的核酸であり得る。

非天然の配列は、核酸モジュールの３’末端に位置し得る。非天然の配列は、核酸モジュールの５’末端に位置し得る。非天然の配列は、核酸モジュールの３’末端および５’末端の両方に位置してもよい。非天然の配列は、エンドリボヌクレアーゼに結合する配列を含むことができる（例えば、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）。非天然の配列は、エンドリボヌクレアーゼによって、配列特異的に認識される配列であり得る（例えば、リボヌクレアーゼＴ１は不対のＧ塩基を切断し、リボヌクレアーゼＴ２はＡｓの３’末端を切断し、リボヌクレアーゼＵ２は不対のＡ塩基の３’末端を切断する）。非天然の配列は、エンドリボヌクレアーゼによって構造的に認識される配列であり得る（例えば、ヘアピン構造、一本鎖−二本鎖接合、例えば、ドローシャはヘアピン内の一本鎖−二本鎖接合を認識する）。非天然の配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムエンドリボヌクレアーゼ（例えば、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、および／またはＣａｓ６タンパク質）に結合することができる配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、非天然の配列はエンドリボヌクレアーゼ結合配列を含み、核酸モジュールは同じエンドリボヌクレアーゼによって結合され得る。核酸モジュールは、同じエンドリボヌクレアーゼ結合配列を含まなくてもよい。核酸モジュールは、配列を結合する様々なエンドリボヌクレアーゼを含むかもしれない。異なるエンドリボヌクレアーゼ結合配列は、同じエンドリボヌクレアーゼによって結合され得る。いくつかの実施形態では、核酸モジュールは、異なるエンドリボヌクレアーゼによって結合され得る。

部分はリボザイムを含み得る。リボザイムはそれ自体を切断することができ、それによって、多重遺伝標的化剤の各モジュールを遊離する。適切なリボザイムは、ペプチジルトランスフェラーゼ２３ＳｒＲＮＡ、ＲｎａｓｅＰ、グループＩイントロン、グループＩＩイントロン、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム（Ｌｅａｄｚｙｍｅ）、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、ＨＤＶリボザイム、ＣＰＥＢ３リボザイム、ＶＳリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ＣｏＴＣリボザイム、合成リボザイムを含み得る。

多重遺伝標的化剤の核酸モジュールの核酸は同一であり得る。核酸モジュールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０以上のヌクレオチドが異なり得る。例えば、様々な核酸モジュールは、核酸モジュールのスペーサー領域が異なってもよく、それによって、核酸モジュールを異なる標的核酸に標的化する。いくつかの例では、様々な核酸モジュールは、核酸モジュールのスペーサー領域が異なってもよいが、同じ標的核酸を標的化する。核酸モジュールは、同じ標的核酸を目標化することができる。核酸モジュールは、１以上の標的核酸を目標化することができる。

核酸モジュールは、核酸モジュールの適切な翻訳または増幅を可能にする制御配列を含むことができる。例えば、核酸モジュールは、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、エンハンサーエレメント、転写終結要素、リボソーム結合部位、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、５’キャップ配列、３’ポリ・アデニル化配列、ＲＮＡ安定要素などを含むことができる。

設計されたガイド核酸および／または核酸ガイドヌクレアーゼをコードする核酸
本開示は、本開示のガイド核酸をコードするヌクレオチド配列、本開示の核酸ガイドヌクレアーゼ、エフェクタータンパク質、ドナーポリヌクレオチド、多重遺伝標的化剤、タンデム融合ポリペプチド（ａｔａｎｄｅｍｆｕｓｉｏｎｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄ）、レポーター要素、対象の遺伝要素、スプリットシステムの成分、および／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質の分子を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示のガイド核酸をコードするヌクレオチド配列、本開示の核酸ガイドヌクレアーゼ、エフェクタータンパク質、ドナーポリヌクレオチド、多重遺伝標的化剤、タンデム融合ポリペプチド、レポーター要素、対象の遺伝要素、スプリットシステムの成分、および／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質の分子は、ベクター（例えば、組み換え発現ベクター）を含み得る。

いくつかの実施形態では、組み換え発現ベクターは、ウイルス構築物（例えば、組み換えアデノ随伴ウイルス構成物）、組み換えアデノウイルス構築物、組み換えレンチウイルス構築物、組み換えレトロウイルス構築物などであり得る。

適切な発現ベクターとしては、限定されないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスに基づくウイルスベクター）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびニワトリ肉腫ウイルス、ハーヴェイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性の肉腫ウイルス、ならびに乳癌ウイルスなどのレトロウイルス由来のベクター）、植物ベクター（例えば、Ｔ‐ＤＮＡベクトル）などが挙げられる。例として、以下のベクターが真核生物の宿主細胞に提供され得る：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（ファルマシア）。宿主細胞に適合する限り、他のベクターが使用されてもよい。

いくつかの例では、ベクターは直線化されたベクターであり得る。直線化されたベクターは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはアルゴノート）および／またはガイド核酸を含んでもよい。直線化されたベクターは、環状プラスミドでなくてもよい。直線化されたベクターは、二本鎖切断を含むことができる。直線化されたベクターは、蛍光タンパク質（例えば、オレンジの蛍光タンパク質（ＯＦＰ））をコードする配列を含むことができる。直線化されたベクターは、抗原（例えば、ＣＤ４）をコードする配列を含むことができる。直線化されたベクターは、設計された核酸標的核酸の一部をコードするベクターの領域において、直線化（例えば、切断）され得る。例えば、直線化されたベクターは、設計された核酸標的核酸の５′領域において、直線化（例えば、切断）され得る。直線化されたベクターは、設計された核酸標的核酸の３′領域において、直線化（例えば、切断）され得る。いくつかの例では、直線化されたベクターまたは閉高次コイルのベクターは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはアルゴノート）をコードする配列、ヌクレアーゼ（例えば、ＣＭＶプロモーター）をコードする配列のプロモーター駆動発現、マーカーをコードする配列、アフィニティータグをコードする配列、ガイド核酸の一部をコードする配列、ガイド核酸の一部をコードする配列のプロモーター駆動発現、そして選択可能なマーカー（例えば、アンピシリン）をコードする配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

ベクターは、転写および／または翻訳制御要素を含むことができる。利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成的または誘導的プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多くの適切な転写および翻訳制御要素のいずれかが発現ベクターにおいて使用され得る。

いくつかの実施形態では、本開示のガイド核酸をコードするヌクレオチド配列、本開示の核酸ガイドヌクレアーゼ、エフェクタータンパク質、ドナーポリヌクレオチド、多重遺伝標的化剤、タンデム融合ポリペプチド、レポーター要素、対象の遺伝要素、スプリットシステムの成分、および／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質の分子は、プロモーターなどの制御要素（例えば、翻訳制御要素）に動作可能に結合され得る。転写制御要素は、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）、および／または原核細胞（例えば、細菌あるいは古細菌細胞）において機能的であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の設計されたガイド核酸をコードするヌクレオチド配列、本開示の核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはアルゴノート）、エフェクタータンパク質、ドナーポリヌクレオチド、多重遺伝標的化剤、タンデム融合ポリペプチド、レポーター要素、対象の遺伝要素、スプリットシステムの成分、および／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質の分子は、複数の制御要素に動作可能に結合され得る。複数の管理要素への動作可能な結合は、本開示のガイド核酸をコードするヌクレオチド配列、本開示の核酸ガイドヌクレアーゼ、エフェクタータンパク質、ドナーポリヌクレオチド、レポーター要素、対象の遺伝要素、スプリットシステム成分および／または原核生物あるいは真核細胞のいずれかにおいて本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質の分子の発現を可能にし得る。

適切な真核生物のプロモーター（つまり、真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）即時型、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期のＳＶ４０、レトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）、およびヒト延長因子１プロモーター（ＥＦ１）、チキンベータ活性プロモーター（ＣＡＧ）に融合したサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）エンハンサー、マウスの幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセレートキナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを含むハイブリッド構築物由来のものが挙げられ得る。プロモーターは菌類プロモーターであり得る。プロモーターは植物プロモーターであり得る。植物プロモーターのデータベースが発見され得る（例えば、ＰｌａｎｔＰｒｏｍ）。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターをさらに含むことができる。発現ベクターは、発現を増幅するのに適切な配列をさらに含むことができる。発現ベクターはまた、アルゴノートに融合される非天然のタグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、赤血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含むことができ、結果として融合タンパク質をもたらす。

いくつかの実施形態では、本開示の設計されたガイド核酸をコードするヌクレオチド配列または配列、本開示の核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはアルゴノート）、エフェクタータンパク質、ドナーポリヌクレオチド、多重遺伝標的化剤、タンデム融合ポリペプチド、レポーター要素、対象の遺伝要素、スプリットシステムの成分、および／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質の分子は、誘導的プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン制御プロモーター、ステロイド制御プロモーター、金属制御プロモーター、エストロゲン受容体制御プロモーターなど）に動作可能に結合され得る。いくつかの実施形態では、本開示のガイド核酸をコードするヌクレオチド配列、本開示の核酸ガイドヌクレアーゼ、エフェクタータンパク質、ドナーポリヌクレオチド、多重遺伝標的化剤、タンデム融合ポリペプチド、レポーター要素、対象の遺伝要素、スプリットシステムの成分、および／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質の分子は、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）に動作可能に接続され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、空間的に制限されたおよび／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）に動作可能に結合され得る。

本開示の設計されたガイド核酸をコードするヌクレオチド配列または配列は、本開示の核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはアルゴノート）、エフェクタータンパク質、ドナーポリヌクレオチド、多重遺伝標的化剤、タンデム融合ポリペプチド、レポーター要素、対象の遺伝要素、スプリットシステムの成分、および／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質の分子は、細胞への送達のために、生体コンパートメント中またはその表面上でパッケージされ得る。生体コンパートメントはとしては、限定されないが、ウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス）、ナノスフェアー、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、またミセルが挙げられ得る。

細胞への本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、抱合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃工学、リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロ・インジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって起こり得る。

コドン最適化
本明細書に開示される核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはアルゴノート）をコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。このタイプの最適化は、同じタンパク質をコードしながら意図する宿主生物または細胞のコドン選択を模倣するために、外来性由来の（例えば、組み換え体）ＤＮＡの突然変異を必要とすることもある。したがって、コドンは変更され得るが、コードされたタンパク質は変更されないままである。例えば、もし意図した標的細胞がヒト細胞ならば、人間のコドン最適化ポリヌクレオチドＣａｓ９が適切なＣａｓ９を産生するために使用され得る。別の非限定的な例として、もし意図した宿主細胞がマウス細胞ならば、Ｃａｓ９をコードするマウスのコドン最適化ポリヌクレオチドは、適切なＣａｓ９であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、対象の多くの宿主細胞のために最適化されたコドンであり得る。アルゴノートがコードするポリヌクレオチドは、対象の多くの宿主細胞のために最適化されたコドンであり得る。宿主細胞は、任意の生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、コナミドリムシナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｇａｄｉｔａｎ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、ヤツマタモク（ＳａｒｇａｓｓｕｍｐａｔｅｎｓＣ．Ａｇａｒｄｈ）など、菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊髄動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生動物、爬虫類、鳥、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、豚、雌牛、ヤギ、ヒツジ、げっ歯動物、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞など、であってもよい。コドン最適化は必要でなくてもよい。いくつかの例では、コドン最適化が好ましい場合がある。

送達
本開示の部位特異的ヌクレアーゼは、細胞内に内因的にまたは組み換えで発現されるかもしれない。部位特異的なヌクレアーゼは、染色体上で、染色体外に、またはプラスミド、合成染色体、あるいは人工染色体上でコードされ得る。さらにまたはあるいは、１つの部位特異的ヌクレアーゼは、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡとしての細胞に提供あるいは送達され得る。そのような例では、ポリペプチドまたはｍＲＮＡは、細胞透過性のペプチド、ナノ粒子、ウイルス粒子、ウイルスのデリバリーシステム、または他の非ウイルスのデリバリーシステムの使用を介するなど、当技術分野において既知の標準メカニズムを介して送達され得る。

さらにまたはあるいは、本明細書に開示されるガイド核酸は、細胞内の遺伝子またはエピゾームのＤＮＡによって提供され得る。ガイド核酸は、細胞内のＲＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写され得る。ガイド核酸は、対応する部位特異的なヌクレアーゼを発現する細胞に提供または送達され得る。さらにまたはあるいは、ガイド核酸は、部位特異的ヌクレアーゼと同時にまたは順次に提供あるいは送達され得る。ガイド核酸は、当技術分野において知られている標準ＤＮＡまたはＲＮＡの生成技術を使用して、化学的に合成されるか、あるいは集合されるか、そうでなければ生成され得る。さらにまたはあるいは、ガイド核酸は、ゲノムＤＮＡ、エピゾームＤＮＡ分子、単離された核酸分子、あるいは任意の他の核酸分子のソースから切断されるか、遊離されるか、そうでなければ得られ得る。

小分子阻害剤
いくつかの実施形態において、治療薬は小分子阻害剤である。小分子阻害剤は、ポリヌクレオチドを含まなくてもよい。小分子阻害剤は、ペプチドを含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、小分子阻害剤は、ｐｌ６ａの発現に関連するタンパク質または構造に直接結合して、それらの機能を破壊する。一般的に、小分子阻害剤は、細胞膜を容易に通過し、その細胞取り込みを助けるためにさらなる修飾を必要としなくてもよい。

遺伝子標的
明細書に開示される遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム本を用いて編集する方法が本明細書で提供される。本明細書に開示される遺伝子から発現されたＲＮＡを、アンチセンスオリゴヌクレオチドに接触させる方法は本明細書でさらに提供され、それによって、遺伝子によってコードされたタンパク質の産生を変更させる。本明細書に開示される遺伝子を編集するか、または本明細書に開示される遺伝子の発現を修飾する方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子の編集することまたは遺伝子の発現を修飾することは、遺伝子の発現を減少させること、遺伝子の産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）の発現を減少させること、遺伝子の産物の活性を低下させること、あるいはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子は核内受容体をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子はロイシンジッパータンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子はオプシンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子はＧ結合、タンパク質受容体をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子は腫瘍抑制因子の遺伝子である。いくつかの実施形態では、遺伝子は、細胞老化を促進するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子は、細胞アポトーシスを促進するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子は、細胞分化を促進するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子は、細胞増殖を阻害するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子は、細胞生存を阻害するタンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、遺伝子は、本明細書で提供される配列識別子（ＳＥＱＩＤＮＯ）を有する配列によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、本明細書で提供される配列識別子（ＳＥＱＩＤＮＯ）に相同性を有するか、または相同である配列によって特徴付けられる。参照配列と比較してアミノ酸配列または核酸配列を記載するために本明細書で使用される際の用語「相同する」、「相同性」、または「パーセント相同性」は、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８，１９９０，ｍｏｄｉｆｉｅｄａｓｉｎＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって記載される式を用いて決定され得る。こうした式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）．のｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムに組み入れられる。配列のパーセント相同性は、この出願の出願日の時点で、ＢＬＡＳＴの最新バージョンを使用して決定され得る。

本明細書に開示される遺伝子のいずれか１つは、人間の遺伝子であり得る。遺伝子は、血液細胞によって発現されたタンパク質をコードすることができる。遺伝子はヘモグロビンをコードすることができる。遺伝子は、人間の被検者の眼の細胞上で発現されたタンパク質をコードすることができる。非限定的な例としては、遺伝子は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）をコードすることができる。ＧＰＣＲは、オプシンタンパク質（例えば、ロドプシン）コードする遺伝子または形質導入（例えば、ＧＮＡＴ１）から選ばれ得る。さらに、非限定的な例として、遺伝子は、ロイシンジッパータンパク質をコードすることができる。遺伝子は、神経網膜特異的ロイシンジッパー遺伝子（Ｎｒｌ）遺伝子であり得る。遺伝子は、Ｎｒｌタンパク質をコードすることができる。遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ．：１またはＳＥＱＩＤＮＯ．：２の少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含むことができる。さらに、非限定的な例として、遺伝子は、核内受容体をコードすることができる。遺伝子は、視細胞特異的核内受容体（ＰＮＲ）遺伝子であり得る。遺伝子は、ＰＮＲタンパク質をコードすることができる。ＰＮＲもまた、ＮＲ２Ｅ３（核内受容体サブファミリー２、Ｅ基、３員）と呼ばれる。遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ．：３またはＳＥＱＩＤＮＯ．：４の少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含むことができる。遺伝子はＭｅｒｔｋ遺伝子であり得る。遺伝子は、網膜芽細胞腫遺伝子、ａｔｈｏｎａｌ７遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子を含む他の眼の遺伝子であり得る。

本明細書に開示される細胞中の本明細書に開示される遺伝子の修飾を含む方法が本明細書で提供される。遺伝子は、非眼遺伝子（ｎｏｎ−ｏｃｕｌａｒｇｅｎｅ）でなくてもよく、細胞は非眼細胞であり得る。非限定的な例として、遺伝子は、ＵＭＯＤ、ＴＭＥＭ１７４、ＳＬＣ２２Ａ８、ＳＬＣ１２Ａ１、ＳＬＣ３４Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１２、ＳＬＣ２２Ａ２、ＭＣＣＤ１、ＡＱＰ２、ＳＬＣ７Ａ１３、ＫＣＮＪ１、ＳＬＣ２２Ａ６、またはＰａｘ３であり得、細胞は腎臓細胞であり得る。非限定的な例として、遺伝子は、ＰＮＬＩＰＲＰ１、ＳＹＣＮ、ＰＲＳＳ１、ＣＴＲＢ２、ＣＥＬＡ２Ａ、ＣＴＲＢ１、ＣＥＬＡ３Ａ、ＣＥＬＡ３Ｂ、ＣＴＲＣ、ＣＰＡ１、ＰＮＬＩＰ、またはＣＰＢ１であり得、細胞は膵臓細胞であり得る。非限定的な例として、遺伝子は、ＧＦＡＰ、ＯＰＡＬＩＮ、ＯＬＩＧ２、ＧＲＩＮ１、ＯＭＧ、ＳＬＣ１７Ａ７、Ｃ１ｏｒｆ６１、ＣＲＥＧ２、ＮＥＵＲＯＤ６、ＺＤＨＨＣ２２、ＶＳＴＭ２Ｂ、またはＰＭＰ２であり得、細胞は脳細胞であり得る。非限定的な例として、遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤をコードすることができ、細胞はＴ細胞であり得る。非限定的な例として、遺伝子は、ＰＤ−１をコードすることができ、細胞はＴ細胞であり得る。遺伝子は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２をコードすることができ、細胞は腫瘍細胞であり得る。

細胞
本明細書に開示される細胞によって発現された核酸分子を修飾する方法が本明細書で提供される。本明細書に開示される細胞によって発現された核酸分子の発現および／または活性を修飾する方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、方法は核酸分子またはその発現／活性を修飾することを含み、ここで、核酸分子はインビボで細胞中に存在する。いくつかの実施形態では、方法は核酸分子またはその発現／活性を修飾することを含み、ここで、核酸分子はインビトロで細胞中に存在する。いくつかの実施形態では、方法は核酸分子またはその発現／活性を修飾することを含み、ここで、核酸分子はエクスビボで細胞中に存在する。いくつかの実施形態では、方法は核酸分子またはその発現／活性を修飾することを含み、ここで、核酸分子はインサイチュで細胞中に存在する。

いくつかの実施形態では、細胞は網膜細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は視細胞である。いくつかの実施形態では、視細胞は桿体である。いくつかの実施形態では、視細胞は錐状体である。いくつかの実施形態では、視細胞は感光性の網膜の神経節細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は視神経細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は神経節細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はアマクリン細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は網膜の神経節細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は、処置される対象から単離されている。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍帯血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は血球である。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は造血性多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は上皮細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は腸の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は分化多能性の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは神経細胞に由来した。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは眼の細胞に由来した。いくつかの実施形態では、細胞は、網膜の神経節細胞またはその多能性前駆細胞に分化したｉＰＳＣであった。

医薬組成物および投与の形態
遺伝子発現およびタンパク質活性阻害する本明細書に記載される治療剤を含む、網膜の変性疾病の処置のための医薬組成物が本明細書に開示される。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、それ眼に投与するための製剤である。いくつかの実施形態では、眼に投与するための製剤は、それを眼への投与に適切なものにする増粘剤、界面活性剤、湿潤剤、基剤原料、担体、賦形剤または塩を含む。いくつかの実施形態では、眼への投与のための製剤は、それを眼への投与に適切なものにするｐＨ、塩、または浸透圧を有する。眼への投与のための製剤のこれらの態様が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は眼科用薬剤である。医薬組成物は、医薬組成物と眼との接触時間を延長するための増粘剤を含み得る。いくつかの実施形態では、増粘剤は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、粘剤はろ過され滅菌される。

本明細書に開示される医薬組成物は、眼用の薬学的に許容可能な担体、薬学的に許容可能な賦形剤、または薬学的に許容可能な塩を含み得る。眼用の薬学的に許容可能な担体、薬学的に許容可能な賦形剤、および薬学的に許容可能な塩の非限定的な例は、ヒアルロナン、ホウ酸、塩化カルシウム、過ホウ酸ナトリウム、ホスホン酸、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ならびに塩化ナトリウムを含む。

本明細書に開示される医薬組成物は、涙の分泌物と等張であるべきである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、０．５−２％ＮａＣｌの張度を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は等張性ビヒクルを含む。非限定的な例として、等張性ビヒクルはホウ酸または一塩基リン酸ナトリウムを含み得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３〜約８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３〜約７のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約４〜約７のｐＨを有する。投与された時、このｐＨ範囲外の医薬組成物は、眼を刺激するか、または眼の中に微粒子を形成する可能性がある。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、界面活性剤または湿潤剤を含む。本明細書に開示される医薬組成物中の使用された界面活性剤の非限定的な例は、塩化ベンザルコニウム、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、およびジオクチルソジウムスルホサクシネート（ｄｉｏｃｔｙｌｓｏｄｉｕｍｓｕｌｐｈｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、医薬組成物を保持する容器が開けられた後に微生物汚染を防ぐ防腐剤を含む。いくつかの実施形態では、防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀、クロルヘキシジン酢酸塩、および硝酸フェニル水銀から選択される。

いくつかの実施形態では、医薬組成物（例えば、ローション剤または軟膏剤）は基剤原料を含む。基剤原料は、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂、硫酸亜鉛、パラフィン、およびワックス、または脂肪物質から選択され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物はローション剤である。いくつかの実施形態では、ローション剤は、使用直前に再構成される粉体または凍結乾燥した産物として、被験体（あるいは、ローション剤を投与する被験体）に提供される。

眼に医薬組成物を直接投与することは、眼以外の位置における、治療剤のいかなる望ましくないオフターゲット効果を回避することができる。例えば、医薬組成物を静脈内にあるいは全身的に投与することは、眼の細胞以外の細胞中の遺伝子発現を阻害する結果となり得、ここで、遺伝子を阻害することは有害作用を有し得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｓｈＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ポリヌクレオチドをコードするヌクレアーゼ）のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドベクターを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドベクターは発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、医薬組成物はウイルスを含み、ここで、ウイルスは、ベクターおよび／または核酸分子を被験体の細胞に送達する。いくつかの実施形態では、ウイルスはレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスはレンチウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、血清型１、２、５、７、８、および９から選ばれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ血清型２である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ血清型８である。

ＡＡＶは、免疫系の最小の刺激および非分裂性網膜細胞において何年にもわたって発現を提供するその能力のために、本明細書に開示される方法に特に有用であり得る。ＡＡＶは、網膜内の多数の細胞型を形質導入が可能であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶの硝子体内投与（例えば、眼の硝子体液に注入される）を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶの網膜下投与（例えば、網膜下に注入される）を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、ＡＡＶベクター中に外因的に調節可能なプロモーターシステムを含む。非限定的な例として、外因的に調節可能なプロモーターシステムはテトラサイクリン誘導性発現系であり得る。

本明細書に開示される医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、賦形剤、またはビヒクルをさらに含み得る。本医薬組成物で使用される薬学的に許容可能な塩、賦形剤、またはビヒクルは、担体、賦形剤、希釈剤、抗酸化剤、保存剤、着色剤、調味料およびと稀釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、等張化剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗菌剤、および界面活性剤を含んでいる。

中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、典型的に適切な担体であり得る。医薬組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムなどの、塩を形成する対イオン；および／または、ツイーン、プルロニック、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン界面活性剤を含むこともある。さらに、一例として、適切な等張促進剤は、アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは、ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトールなどを含んでいる。適切な保存剤は、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸などを含んでいる。過酸化水素は保存剤としても使用されることがある。適切な共溶媒は、グリセリン、プロピレングリコール、およびＰＥＧを含んでいる。適切な錯化剤は、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシ−プロピル−ベータ−シクロデキストリンを含んでいる。適切な界面活性剤または湿潤剤は、ソルビタンエステル、ポリソルベート８０のようなポリソルベート、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポールなどを含んでいる。緩衝剤は、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、またはトリス−ＨＣｌのような従来の緩衝剤であり得る。緩衝酢酸溶液は、約ｐＨ４−５．５であり得、Ｔｒｉｓバッファーは、約ｐＨ７−８．５であり得る。さらなる医薬品は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９０で説明されている。

組成物は、液体形態あるいは凍結乾燥または冷凍乾燥された形態であり得、１つ以上の結乾燥防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）、賦形剤、界面活性剤、高分子量の構造的（ｓｔｒｕｃｔｕａｌ）添加剤及び／又は増量剤を含み得る（例えば、米国特許第６，６８５，９４０号、第６，５６６，３２９号、および第６，３７２，７１６号を参照）。１つの実施形態では、スクロース、ラクトース、またはトレハロースのような非還元糖であるリオプロテクタントが含まれている。一般に含まれるリオプロテクタントの量は、再構成時に、高張性またはわずかに低張性の製剤も適切ではあるが、結果として生じる製剤が等張性になるような量である。加えて、リオプロテクタントの量は、凍結乾燥時のタンパク質の許容しがたい量の分解および／または凝集を防ぐのに十分でなければならない。あらかじめ凍結乾燥された製剤中の砂糖（例えばスクロース、ラクトース、トレハロース）の典型的なリオプロテクタント濃度は、約１０ｍＭから約４００ｍＭまでである。別の実施形態では、界面活性剤は、例えば非イオン界面活性剤、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）のようなイオン性界面活性剤；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；ポリ（エチレングリコール）フェニルエーテル（例えば、トリトン）；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、またはセチル−ベタイン；ラウラミドプロピル、コカミドプロピル、リノールアミドプロピル−、ミリストアミドプロピル−、パルミドロプロピル、またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウラミドプロピル）；ミリストアミドプロピル、パルミドプロピル、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウム、またはオフェイルメチルタウリン二ナトリウムメチル；および、ＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（ＭｏｎａＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、およびエチレンとプロピレングリコール（例えば、プルロニック、ＰＦ６８など）のコポリマーが含まれる。あらかじめ凍結乾燥された製剤中に存在し得る典型的な量の界面活性剤は、約０．００１−０．５％である。高分子量の構造的な添加剤（例えば、充填剤、結合剤）は、例えば、アラビアゴム、アルブミン、アルギン酸、リン酸カルシウム（二塩基）、セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、デキストラン、デキストリン、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）、スクロース、チロース、α化デンプン、硫酸カルシウム、アミロース、グリシン、ベントナイト、マルトース、ソルビトール、エチルセルロース、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ピロ亜硫酸二ナトリウム、ポリビニルアルコール、ゼラチン、グルコース、グアーガム、液状グルコース、圧縮可能な砂糖、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、マルトデキストリン、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリル酸、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、トラガント微結晶性セルロース、デンプン、およびゼインを含み得る。高分子量の構造的な添加剤の典型的な濃度は、０．１重量％−１０重量％までである。他の実施形態では、増量剤（例えばマンニトール、グリシン）が含まれることがある。

組成物は、非経口投与に適し得る。典型的な組成物は、熟練の作業員に利用可能な任意の経路、例えば、関節内、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、または損傷内の経路による動物への注射または注入に適している。非経口製剤は、典型的に、随意に薬学的に許容可能な防腐剤を含有している、無菌の、パイロジェンを含まない、等張性水溶液である。

非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルである。水性担体は水、アルコール／水溶液、塩性媒体および緩衝媒体を含むエマルジョンまたは懸濁液を含んでいる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは固定油を含んでいる。静脈内のビヒクルは、流体と栄養素の補給物、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補充薬を含んでいる。保存剤および他の添加剤は、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在することがある。一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈＥｄ．，ＭａｃｋＥｄｓ．，１９８０．を参照。

本明細書に記載される組成物は、生成物の局所濃度を提供する様式での送達の制御または持続（例えば、ボーラス、デポ効果）及び／又は特定の局所環境での安定性または半減期の増加のために製剤され得る。組成物は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物、および生分解性マトリックス、注射用ミクロスフェア、マイクロカプセル粒子、マイクロカプセル、生体内分解性粒子状ビーズ（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｂｅａｄｓ）、リポソームなどの薬剤を用いた、本明細書に開示されるポリペプチド、核酸、またはベクターの製剤、ならびに、その後蓄積注射として送達され得る活性剤の制御または持続した放出を提供する埋め込み可能な送達デバイスを含み得る。上記のような持続されたまたは制御された送達手段を製剤化するための技術が知られており、医薬品の制御放出および送達のために様々なポリマーが開発および使用されている。こうしたポリマーは、典型的には生分解性かつ生体適合性である。生理活性タンパク質薬剤の捕捉に伴う軽度（ｍｉｌｄ）および水性の条件が原因で薬物のデポ効果を提供するために、エナンチオマーのポリマーまたはポリペプチド断片の錯体生成によって形成されたものを含むポリマーヒドロゲル、および温度またはｐＨ感受特性を有するヒドロゲルが望ましいかもしれない。例えば、ＷＯ９３／１５７２２の医薬組成物の送達のための制御放出多孔性ポリマー微粒子の記載を参照。

この目的に適切な材料は、ポリラクチド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号を参照）、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８Ａ）などのポリ−（α−ヒドロキシカルボン酸）のポリマー、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共重合体（Ｓｉｄｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート（Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１），ａｎｄＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸のポリマーを含む。他の生分解性ポリマーはポリ（ラクトン）、ポリ（アセタール）、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（オルトカーボネート）を含んでいる。持続放出組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該技術分野に既知の幾つかの方法のいずれかによって調製され得る（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−９２（１９８５）を参照）。担体そのものまたはその分解産物は標的組織内では無毒でなければならず、疾病をさらに悪化させてはならない。これは、標的の障害の動物モデルにおいて、またはそのようなモデルが利用不可能である場合に、正常動物において、日常的なスクリーニングによって測定され得る。

筋肉内、皮下、腫瘍周囲、又は静脈内の注入に適切な製剤は、生理的に許容可能な無菌の水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、及び無菌の注入可能な溶液又は分散液への再構成のための無菌の粉末剤を含み得る。適切な水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、クレモフォールなど）、その適切な混合物、植物油（オリーブオイルなど）、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって、維持される。皮下注射に適した製剤は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分配剤（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇａｇｅｎｔ）などの随意の添加剤も含む。

静脈注射のために、活性薬剤は、水溶液中で、好ましくはハンク溶液、リンガー溶液、又は生理食塩水のバッファーなどの生理的に互換性をもつ緩衝液中で、随意に製剤される場合もある。

非経口注入は、ボーラス注入又は持続注入を随意に含む。注射のための製剤は、随意に、ユニット剤形、例えば、アンプルまたは複数回用量の容器において、加えられた防腐剤とともに提供される。本明細書に記載される医薬組成物は、油性または水溶性のビヒクル中の滅菌した懸濁液、水溶液、またはエマルジョンとして、非経口注射に適切な形態であり得、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤などの、調合剤を含有し得る。非経口投与のための医薬製剤は、水溶性形態の活性薬剤の水溶液を含む。加えて、懸濁液は、適切な油性の注入懸濁液として随意に調製される。

あるいはまたはさらに、組成物は、埋め込みを介して、膜、スポンジ、または本明細書に開示される治療剤が吸収された又はカプセル化された他の適切な物質の患部へと局所に投与され得る。埋め込みデバイス（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｄｅｖｉｃｅ）が使用される場合、デバイスは任意の適切な組織または臓器へと埋め込まれ得、本明細書に開示される治療剤、核酸、またはベクターの送達は、ボーラスを介して、または連続投与を介して、あるいは持続注入を使用するカテーテルを介して、デバイスに直接通され得る。

本明細書に開示される治療剤を含む特定の製剤は、経口で投与され得る。この方法で投与される製剤は、錠剤やカプセル剤のような固体の剤形を調剤する際に通例使用される担体とともに、または担体を用いずに製剤化されることもある。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大限にされ、前全身性分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小限にされるときの胃腸管中の時点で製剤の活性部分を放出するように設計され得る。追加の薬剤は選択的な結合剤の吸収を促すために含まれることがある。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤、崩壊剤、および結合剤も利用され得る。

適切な及び／又は好ましい医薬製剤は、意図した投与経路、送達様式、および所望の投与量に応じて、本開示および製剤技術の存在する一般知識を考慮して決定され得る。投与の方法にかかわらず、有効量は患者の体重、体表面積、または臓器のサイズによって計算されることがある。

本明細書に記載される製剤の各々に伴う処置に適切な投与量を決定するための計算のさらなる精査が、当該技術分野で慣例的になされ、これは、当該技術分野で慣例的に行われた作業の範囲内にある。適切な投与量は適切な用量反応データを使用して確認されてもよい。

「薬学的に許容可能な」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって認可された又は認可可能であること、あるいは米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）またはヒトを含む動物における使用のための他の一般に承認された薬局方にリストされていることを指し得る。

「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的に許容可能である及び親化合物の所望の薬理学的活性を有する化合物の塩を指し得る。

「薬学的に許容可能な賦形剤、担体、またはアジュバント」は、本開示の少なくとも１つの抗体とともに被験体に投与され得る、およびその薬理学的活性を破壊せず、治療上の量の化合物を送達するのに十分な用量で投与されるときに無毒である、賦形剤、担体またはアジュバントを指し得る。

「薬学的に許容可能なビヒクル」は、本開示の少なくとも１つの抗体とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体を指し得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、注射投与のために製剤される。いくつかの実施形態では、方法は医薬組成物を注入することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、眼内注射を介して、液体形態の医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、眼周囲注射を介して、液体形態の医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、硝子体内注射を介して、液体形態の医薬組成物を投与することを含む。一方、投与のこれらの様式が被験体にとって魅力的ではないかもしれないが（例えば、硝子体内注射）、それらは、眼の障壁の貫通性において最も有効であり得、ならびに治療剤は、利便性および低価格を提供する目薬と比較して、涙または瞬によって流される可能性が最も低い。

いくつかの実施形態では、医薬製剤を全身的に投与する方法含む。いくつかの実施形態では、治療剤はポリヌクレオチドベクターであり、ここで、ポリヌクレオチドベクターは、ガイドＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＣａｓをコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドベクターは、細胞特異的な様式で核酸分子のベクターの発現を駆動させるための条件付きのプロモーターを含む。非限定的な例として、条件付きのプロモーターは、網膜の神経節細胞においてのみ発現を駆動することができるか、網膜の神経節細胞中で機能効果を有するレベルでのみ発現を駆動することができる。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非注射投与のために製剤される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は局所的投与のために製剤される。非限定的な例として、核酸分子は、眼に滴下するのに適切な食塩水または緩衝液に懸濁され得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、点眼薬、ゲル、ローション剤、軟膏剤、懸濁液、またはエマルジョンとして製剤され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、眼内インサートなどの固形剤で製剤される。例えば、眼内インサートは、ある期間にわたって医薬組成物を放出し、持続放出性製剤を有効に運ぶコンタクトレンズと同様に形成され得るか成型され得る。ゲルまたは軟膏剤は、眼瞼の下または眼瞼内に、あるいは眼の隅に塗布することができる。

いくつかの実施形態では、方法は、寝る直前、または被験体が閉眼を維持し得る期間の直前に医薬組成物を投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、被験者に彼らの眼を閉じたままにするよう指示すること、あるいは、医薬組成物の投与後、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、または少なくとも８時間にわたって閉眼を維持するためにカバー（例えば、包帯、テープ、パッチ）を与えるすることを含む。方法は、医薬組成物の投与後、１分から８時間にわたって閉眼を維持するよう被験者に指示することを含む。方法は、医薬組成物の投与後、１分から２時間にわたって閉眼を維持するよう被験者に指示することを含む。方法は、医薬組成物の投与後、１分から３０分間にわたって閉眼を維持するよう被験者に指示することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、緑内障を処置するために、被験体に医薬組成物を一度だけ投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、緑内障を処置するするために、医薬組成物の第１回目および第２回目の投与を含む。第１の回目および第２回目は、１時間から１２時間の期間隔てられ得る。第１の回目および第２回目は、１日から１週間の期間で隔てられ得る。第１の回目および第２回目は、１週間から１か月の期間で隔てられ得る。いくつかの実施形態では、方法は、毎日、毎週、毎月、または毎年、被験体に薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、最初に積極的治療を含み得、維持療法へと減らされる。非限定的な例として、方法は、医薬組成物を最初に注入し、その後、目薬の形態で投与された医薬組成物で処置を維持することを含み得る。非限定的な例として、方法は、最初に、約１週から約２０週間にわたって医薬組成物を毎週注射投与し、その後、２〜１２ヶ月毎に注射投与または局所投与によって医薬組成物を投与することを含み得る。

いくつかの実施形態では、治療剤は小分子阻害剤であり、医薬組成物は経口投与のために製剤される。

キット／システム
Ｃａｓヌクレアーゼ、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡをコードするＣａｓヌクレアーゼまたはポリヌクレオチドを含む、キットならびにシステムが本明細書で提供される。Ｃａｓヌクレアーゼおよび第１／第２のガイドＲＮＡは、本明細書に開示されるもののいずれか１つであり得る。第１のガイドＲＮＡは、遺伝子の少なくとも第１の領域の第１の部位５’のＣａｓ９切断を標的化することができ、および第２のガイドＲＮＡは遺伝子の第１の領域の第２の部位３’のＣａｓ９切断を標的化することができ、それによって遺伝子の領域を切除し、今後、切除される領域（ｅｘｃｉｓｅｄｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる。領域はエクソンを含み得る。領域はエクソンの一部を含み得る。領域は、エクソンの約１％から約１００％を含み得る。領域は、エクソンの約２％から約１００％を含み得る。領域は、エクソンの約５％から約１００％を含み得る。領域は、エクソンの約５％から約９９％を含み得る。領域は、エクソンの約１％から約９０％を含み得る。領域は、エクソンの約５％から約９０％を含み得る。領域は、エクソンの約１０％から約１００％を含み得る。領域は、エクソンの約１０％から約９０％を含み得る。領域は、エクソンの約１５％から約１００％を含み得る。領域は、エクソンの約１５％から約８５％を含み得る。領域は、エクソンの約２０％から約８０％を含み得る。領域は、エクソンから本質的になり得る。領域は、１つを超えるエクソンを含み得る。領域は、イントロンまたはその一部を含み得る。エクソンまたはイントロンの部分は、少なくとも約１ヌクレオチドであり得る。エクソンまたはイントロンの部分は、少なくとも約５ヌクレオチドであり得る。エクソンまたはイントロンの部分は、少なくとも約１０ヌクレオチドであり得る。

本明細書に開示されるドナーポリヌクレオチドを含むキットおよびシステムが本明細書で提供される。ドナーポリヌクレオチドは、第１の部位と第２の部位の間に挿入されることに適合する末端を含み得る。ドナーポリヌクレオチドは、ドナーエクソンの５’末端および３’末端にスプライス部位を含むドナーエクソンであり得る。ドナーポリヌクレオチドは、ドナーエクソンの５’末端および３’末端にスプライス部位を含むドナーエクソンを含んでもよい。スプライス部位は遺伝子の読み取り枠におけるエクソンの包含を可能にし、したがって、スプライス部位は、対象の細胞中でドナーエクソンが転写されたことを確実にする。ドナーポリヌクレオチドは、野生型配列を含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に少なくとも約９９％相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に少なくとも約９５％相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に少なくとも約９０％相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に少なくとも約８５％相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に少なくとも約８０％相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、ドナーポリヌクレオチドが野生型配列を含むことを除いて、切除される領域と同一であり得、ここで、切除される領域は突然変異を含む。いくつかの例では、ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域と類似していない。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約９０％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約８０％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約７０％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約６０％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約５０％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約４０％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約３０％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約２０％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約１０％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約８％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約５％未満の相同であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、切除される領域に約２％未満の相同であり得る。

ＮＲＬおよびＮＲ２Ｅ３から選択される遺伝子中の配列を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む、眼の疾病を処理するためのキットおよびシステムが本明細書で提供される。第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質をＳＥＱＩＤＮＯ：１−４のいずれか１つを含む配列に標的化することができる。第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質をＳＥＱＩＤＮＯ：１−４のいずれか１つに少なくとも９０％相同である配列に標的化することができる。

特定の用語
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、請求される主題が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。前述の一般的な記載と以下の例が典型的かつ説明的なものに過ぎず、任意の本願の主題を限定するものではないことが理解されよう。本出願では、単数の使用は、特別に別記しない限り、複数を含む。明細書および添付の請求項内で用いられる通り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明確に他のことを定めていない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「または」の使用は特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、限定的なものではない。

本明細書で使用されるように、範囲および量は、特定の値または範囲の「約（ａｂｏｕｔ）」として表わされ得る。「約」は正確な量も含んでいる。例えば、「約５μＬ」は、「約５μＬ」およびさらに「５μＬ」を意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差内にあると予想される量を含んでいる。用語「約」は、提供された値より１０％少ない値から１０％多い値までを含む。例えば、「約５０％」は、「４５％から５５％の間」を意味する。さらに、例として「約３０」は、「２７から３３の間」を意味する。

本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のみにあり、記載される主題を限定すると解釈されるものではない。

本明細書で使用されるように、用語「個体」、「被験体」、および「患者」は任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は非ヒトである。

用語「統計的に有意な」または「有意な」は、統計的有意性を指し、一般に２つの標準偏差（２ＳＤ）、正常以下、またはより低いマーカーの濃度を意味する。用語は、違いがあるという統計的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真実の場合に、帰無仮説を棄却する決定を下す可能性として定義される。その決定は、ｐ値を使用して、しばしば下される。０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると考えられる。

本明細書で使用されるように、用語「処置する」および「処置」は、疾患の少なくとも１つの症状を軽減し、または疾患を改善し、例えば、有益なまたは所望の臨床結果を被験体にもたらすように、被験体に有効量の組成物を投与することを指す。本発明の目的について、有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されないが、検知可能であろうと検出不可能であろうと、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患状態の安定（例えば、悪化しない）、疾患の進行を遅らせるかまたは遅くすること、病状の改善または緩和、および寛解（一部または全て）が挙げられる。あるいは、疾患の進行が減少されるか停止される場合、処置は「有効」である。処置を必要とする人々は、既に疾患または症状であると診断された人々と同様に、疾患または症状に寄与する遺伝的感受性または他の因子によって疾患または疾病を発症する可能性がある人々を含み、例えば、非限定的な例として、被験体の体重、食事、および健康は、真性糖尿病を発症する可能性がある被験体に寄与し得る因子である。処置を必要とする人々はまた、内科的または外科的な注意、ケア、あるいは管理を必要とする被験体を含む。

さらなる精査なしに、当業者が、前述の説明に基づいて、本発明をその十分な程度にまで利用することができると考えられる。以下の実施例は、例示目的のみであり、方法がどうであれ、開示の残りを限定するものではない。

本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示的目的のみのためであり、本明細書に提供される特許請求の範囲を限定することを意図しない。当業者に示唆された様々な修正または変更は、本出願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲内に含まれるべきである。

＜実施例１＞
インビトロでの２つのガイドＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９標的化
ＲＰを処置して視覚機能を保存するためのＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９に基づいた細胞のリプログラミングストラテジーをテストするために、２つのＡＡＶベクターが使用され、１つはＣａｓ９を表現し、もう１つはＮＲＬまたはＮＲ２Ｅ３遺伝子を標的化するｇＲＮＡを保有する（図１Ａを参照）。二重のｇＲＮＡ発現ベクターを構築するために、ｐＡＡＶ−Ｕ６ｇＲＮＡ−ＥＦ１ａｍＣｈｅｒｒｙが使用された。両方の２０ｂｐｇＲＮＡ配列は、それぞれベクターにサブクローンされた（ｓｕｂ−ｃｌｏｎｅｄ）。この試験で使用されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列（下線で示される２０ｂｐ標的および３ｂｐＰＡＭ配列）が以下に示される：ＮＲＬノックダウンのためのＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）、およびＧＴＡＴＧＧＴＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＣＧＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）、ＮＲ２Ｅ３ノックダウンのためのＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴＧＣＧＡＴＧＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）、ならびにＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴＧＣＧＡＴＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ．４）。評価された同じ遺伝子中の２つのｇＲＮＡｓによって２つの部位を同時に標的化することによる標的化および不活性化の効率を、一重のｇＲＮＡの標的化および不活性化の効率に対して評価した。マウスの繊維芽細胞における遺伝子ノックダウン効率を、ミスマッチした二本鎖ＤＮＡ鋳型を切断するＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイを使用して試験した。２−ｇＲＮＡシステムのノックダウン効率は、１つのガイドＲＮＡシステムによるものより、非常に高い編集効率を有した（図１Ｂおよび１Ｃを参照）。従って、二重標的化ノックアウト戦略は、続くすべてのインビボの実験に採用された。

＜実施例２＞
インビボでの２つのガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９標的化
Ｃａｓ９をコードするＡＡＶおよびＮＲＬ遺伝子を標的化する２つのガイドＲＮＡは、Ｐ０で網膜下注入によってＷＴマウスに送達された（生後７日）。簡潔に言えば、麻酔をかけたマウスの眼が拡大され、解剖顕微鏡を用いた直接の視覚化の下で、ガラスマイクロピペット（内部径５０−７５μｍ）およびポンプマイクロインジェクション装置（ＰｉｃｏｓｐｒｉｔｚｅｒＩＩＩ；ＰａｒｋｅｒＨａｎｎｉｆｉｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、小切開を介して１μｌＡＡＶ混合物を網膜下腔に注入した。成功した注射は、網膜下の小さな液体泡の生成により注目された。出血などの網膜損傷を示すいかなるマウスも、試験には含まれていなかった。Ｐ３０マウスが組織学のために屠殺された。網膜を凍結区分し、かつ抗マウス錐状体アレスチン（ｍＣＡＲ）抗体および抗媒体波長オプシン（Ｍオプシン）抗体を含む錐状体マーカーについて染色した。さらにｍＣｈｅｒｒｙを、ＡＡＶベクターによって、形質導入エリアおよび細胞を標識するためのマーカーとして画像化した。結果は、ＡＡＶ８−Ｃａｓ９＋ＡＡＶ８−ＮＲＬｇＲＮＡ１−ｍＣｈｅｒｒｙがいかなる表現型を導入することができなかったことを示し、単一のｇＲＮＡ１がゲノム配列崩壊を効率的に導入することができなかったことを示唆するインビトロのＴ７Ｅ１アッセイと一致して、運命切り替え表現型がインビトロの２つのｇＲＮＡを用いて観察された。対照網膜では、錐状体核がＯＮＬの頂上層に存在し、桿体核がＯＮＬの残りの部分を満たす（図３Ａを参照）。ＡＡＶ８−Ｃａｓ９＋ＡＡＶ８−ＮＲＬｇＲＮＡ２＋３−ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入された網膜が観察され、下方の外顆粒層（ＯＮＬ）中に多くのｍＣＡＲ＋細胞があった（図３Ｂを参照）。下方のＯＮＬ層のｍＣＡ余分なＲ^＋細胞は、正常な桿体外節を有する（図３Ｂを参照）。下方のＯＮＬ層の余分なｍＣＡＲ＋細胞を、左の未注入の対照網膜において観察した。定量化は、ＡＡＶ８−Ｃａｓ９＋ＡＡＶ８−ＮＲＬｇＲＮＡ２＋３−ｍＣｈｅｒｒｙ注入群において、下方のＯＮＬ層の余分なｍＣＡＲ＋細胞の有意な増加があったことを示す（図３Ｄ）。Ｍオプシン抗体で染色することもまた、これらの細胞が別の錐状体特異的遺伝子、Ｏｐｎ１ｍｗ（図３Ｃ）を発現することを示し、錐状体のような遺伝子発現プログラムの実現可能性を示唆する。

＜実施例３＞
ＮＲＬまたはＮＲ２Ｅ３を標的化するＡＡＶコーディングＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた、網膜色素変性症（ＲＰ）モデルマウスの網膜下注入
変性した桿体から錐状体への部分転換が網膜変性を救助するおよび網膜の機能を修復するのに十分であるという仮説を検証するために、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９をＲＤ１０マウスの網膜下腔にＰ０で注入した。ＲＤ１０マウスは、急速な桿体視細胞変性を患うヒトにおける常染色体劣性ＲＰのモデルである。ＲＤ１０マウスは、桿体ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）遺伝子の自然突然変異を保有し、Ｐ１８あたりで始まる急速な桿体変性につながる。桿体変性は、生後６０日で錐状体変性と同時に完了する。視細胞変性は網膜発達とオーバーラップせず、光反応が生後約１ヶ月間記録することができ、ＲＤ１０マウスは、ｒｄ１突然変異体などの他のＲＤモデルよりも、典型的なヒトＲＰを非常によく模倣する。

分析は生後７−８週間の間で行なわれた。網膜の生理機能に対するこのＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９処置の効果を測定するために、網膜電図検査（ＥＲＧ）応答を試験して、桿体（暗順応、暗所視のＥＲＧが行ったが、データはまだ分析しない）および錐状体（明順応）の電気活性を測定した。ＥＲＧ試験を、注入（Ｐ５０）後６週目に行った。ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９で処置されたすべての眼は、有意に改善された明所視のｂ波値を示し、増強された錐状体機能（図５Ｂを参照）を示唆した。これらの結果は、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９処置が視細胞変性を救助したことを実証し、網膜の視覚機能を保存する。

ＤＮＡ分析は、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９注入眼における正確なノックダウンを明らかにした（図を２Ｃ参照）。さらに、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９注入は、未注入の対照のそれと比べて、ＯＮＬ厚さの有意に改善された保存をもたらした（図を４Ｃ参照）。ＯＮＬ中にたった１−２（まばらに分配された）の視細胞核を有する未処置の眼とは異なり、ＯＮＬの３−５層が存在し、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９処置が視細胞変性を防いだことを示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を、桿体および錐状体の視細胞遺伝子の相対的な発現レベルを測定するために使用した（図を５Ｃ参照）。これらの分析は、錐状体特異的遺伝子の増加した発現を示した。

顕著に、ＯＮＬの厚さの有意な増加を処置された眼において観察した。興味深いことには、ＯＮＬ中の多くの細胞が桿体マーカーも錐状体マーカーもどちらも発現せず、それらが中間細胞運命にリプログラミングされた可能性があることを示唆する。観察された救助効果の１つの追加的または代替的な説明は、これらの中間細胞が桿体特異的遺伝子を下方制御し、それによって、桿体特異的遺伝子の突然変異によって引き起こされた死／変性に対してそれらを耐性にする。これらの中間細胞は、正常な組織構造的一体性および内因性錐状体生存に不可欠な分泌された栄養因子を維持することができる。したがって、視覚機能増加は、部分的には、桿体の錐状体運命へのリプログラミングではなく、既存の錐状体における救助結果によるものである可能性がある。

＜実施例４＞
βサラセミアを処置のためのＣａｓ媒介相同組換え修復（Ｃａｓ−ＭｅｄｉａｔｅｄＨｏｍｏｌｏｇｙＤｉｒｅｃｔｅｄＲｅｐａｉｒ）を用いた、ヘモグロビン遺伝子突然変異の標的化
βサラセミアは、ヘモグロビン（Ｈｂ）の産生を減少させる血液疾患である。Ｈｂコーディング遺伝子中のＣＤ４１／４２（ＴＣＴＴ）として知られる突然変異は、この障害と関連する。この遺伝子の修復は、この障害を有する被験者に治療効果があり得る。

患者由来の造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）において、同種および異種のＣＤ４１／４２突然変異の両方を特異的に標的化するために、突然変異部位に位置する２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列を選択した。その後、一本鎖アニーリング原理（ＳＳＡ）に基づくルシフェラーゼアッセイを使用して、特異性および効率を試験した。ＳＳＡは、二本鎖ブレッド（ａｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｄ）が、同じ方角に向けられた２つの反復配列間で作られる時に始められるプロセスである。野生型およびＣＤ４１／４２突然変異配列を２つの部分的に繰り返されるルシフェラーゼ発現カセットの間に置くことによって、特異的な切断がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって媒介される時にルシフェラーゼ発現が活性化される。ｇＲＮＡ−１およびｇＲＮＡ−２の両方は相当な特異性を示し、ｇＲＮＡ−２はより高い効率（図６Ａ）を含んでいた。さらなるＨＳＰＣ編集のためにｇＲＮＡ−２を選択した。次に、様々なＣａｓ９フォーマットおよび一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮｓ）の編集効率を試験した。ＨＤＲ特異的ＰＣＲおよびドロップレットデジタルＰＣＲの両方によって、ＨＤＲ媒介編集を評価した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよび２つのＣａｓ９ＲＮＰのうち、Ｃａｓ９ＲＮＰ−２は最も高いＨＤＲ効率を示した（図６Ｂ、左）。７つの非対称ｓｓＯＤＮｓを、Ｃａｓ９ＲＮＰ−２を使用して設計およびスクリーニングし、その中でｓｓＯＤＮ−１１１／３７が最も高いＨＳＰＣ編集効率を記録した（図６Ｂ、左および６Ｃ）。

プラスミド
ｇＲＮＡ発現ベクターを構築するために、ｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ、４２２３０）を使用した。前述のように、２つの突然変異特異的標的配列を別々にベクターにサブクローンした。この試験で使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列（下線で示される２０ｂｐ標的および３ｂｐＰＡＭ配列）が以下に示される：ｇＲＮＡ−１：ＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：６）；ｇＲＮＡ−２：ＧＧＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：７）。Ｃａｓ９のインビトロ転写用のプラスミドを購入した。

ルシフェラーゼアッセイ
特突然変異異的ｇＲＮＡを選択するために、野生型およびＣＤ４１／４２変異配列を合成し、それぞれｐＧＬ４−ＳＳＡにクローニングした。ｐＸ３３０−ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９、ｐＧＬ４−ＳＳＡ−ＨＢＢ、およびｐＧＬ４−ｈＲｌｕｃを２９３Ｔ細胞に同時導入した。デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼアッセイを行った。

インビトロ転写
ｇＲＮＡ−２のインビトロ転写のための鋳型を、プライマーを使用して増幅した：ｇＲＮＡ−２−Ｆ：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＧＴＣＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：８）およびｇＲＮＡ−Ｆ：ＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：９）；プラスミドＭＬＭ３６３９を直線化し、そしてＣａｓ９インビトロ転写に使用した。ｇＲＮＡおよびＣａｓ９をインビトロで転写し、精製し、ＨＳＰＣ電気穿孔に使用した。

Ｃａｓ９ＲＮＰの集合体
２０μｌの細胞懸濁液（１００，０００の細胞）をＣａｓ９ＲＮＰで電気穿孔するために、Ｃａｓ９緩衝液に１．２のモル過剰のｇＲＮＡを加えることによって５μｌｇＲＮＡ溶液を調製した。１００ｐｍｏｌＣａｓ９を含んでいる別の５μｌの溶液をｇＲＮＡ溶液に徐々に加え、標的細胞と混合する前に〉１０分間、室温でインキュベートした。

患者由来のＣＤ３４＋ＨＳＰＣの単離および培養
ＣＤ４１／４２突然変異を有する患者からの凍結保存した動員末梢血ＰＢＭＣをＨＳＰＣ単離および培養に使用した。

患者由来のＣＤ３４＋ＨＳＰＣＨＢＢにおける編集
患者由来のＨＳＰＣを編集するために、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９ＲＮＰを用いた電気穿孔の２日前に、ＨＳＰＣを前述のように単離および培養した。１００，０００のＨＳＰＣをペレット化し、２０μｌＬｏｎｚａＰ３溶液中で再懸濁し、１０ｕｌＣａｓ９ＲＮＰ、１ｕｌ１００ｕＭｓｓＯＤＮ鋳型、または同じモルのＣａｓ９ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、および１ｕｌ１００ｕＭｓｓＯＤＮ鋳型で混合した。この混合物を電気穿孔し、遺伝子型を同定し、赤血球分化に使用した。

編集された細胞の遺伝子型同定
ＨＤＲ特異的フォワードプライマーおよび一般的なリバースプライマー、ＨＤＲ−Ｆを用いて、ＨＤＲ特異的ＰＣＲを行った：ＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＣＧＡＡＴＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：１０）；Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｒ：ＴＣＡＴＴＣＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：１１）。ＢｓｔＢＩ（ＮＥＢ、Ｒ０５１９）制限消化もまた、ＨＤＲ媒介編集を評価するために使用した：ＣＤ４１／４２突然変異の周辺領域を最初に増幅し、次にＨＤＲ編集のための突然変異のためにＢｓｔＢＩで消化した。ＣＤ４１／４２突然変異のＨＤＲ媒介編集を、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ、ＱＸ２００、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）ＨＢＢ−Ｆによって評価した：ＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：１２）；ＨＢＢ−Ｒ：ＡＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：１３）；プローブドナー：６−ＦＡＭ／ＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＣＧＡＡＴＣＣＴＴＴＧ／ＢＨＱ１（ＳＥＱＩＤＮＯ．：１４）；プローブ突然変異：ＨＥＸ／ＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＧＴＣＣ／ＢＨＱ１（ＳＥＱＩＤＮＯ．：１５）。

フローサイトメトリー
単離および電気穿孔の後のＨＳＰＣを、純度および系譜についてＬＳＲ細胞アナライザー（ＢＤ生物科学）で分析した。

標的化ディープシーケンシング
ＣＲＩＳＰＲＤｅｓｉｇｎＴｏｏｌを用いて、上位１２の予測されたオフターゲット部位を探索した。オンターゲットおよび潜在的オフ標的の領域をＨＳＰＣＤＮＡを用いて増幅し、ライブラリ構築に使用した。ゲノム領域を増幅するプライマーは以下に列挙される：ＨＢＢ−Ｆ：ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：１６）；ＨＢＢ−Ｒ：ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ．：１７）。第１の工程からの次のＰＣＲアンプリコンを、Ａｍｐｕｒｅｂｅａｄｓ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、その後、サンプル特異的バーコードに結合するために２回目のＰＣＲを受けさせた。ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑを用いた対の両端シーケンシング（ｐａｉｒ−ｅｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のために、精製されたＰＣＲ産物を等しい比率でプールした。生の読み取りは、マウス参照ゲノムｍｍ９にマップされた。前述のように、高品質な読み取り（スコア〉３０）を、挿入および欠失（インデル）イベント、ならびに最尤推定値（ＭＬＥ）計算について分析した。インデルの次世代シーケンシング分析は、大きいサイズの欠失および挿入イベントを検知することができないため、上記のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９標的化効率および活性は過小評価される。

＜実施例５＞
インビボでの網膜変性のための相同性非依存標的組み込み（ＨＩＴＩ）遺伝子組み換え治療
英国王立外科学院（ＲＣＳ）ラットは、ヒトにおける失明の一般的な原因である網膜色素変性と呼ばれる遺伝性網膜変性の広く使われている動物モデルである。イントロン１からエクソン２の１．９ｋｂの欠失を抱えるＭｅｒｔｋ遺伝子中の同型接合体の突然変異は、結果として生ずるＲＰＥおよびオーバーレイ視細胞変性および失明を伴う、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の不完全な食細胞機能を結果としてもたらす（図７Ａ）。ＲＣＳラットの網膜変性を、網膜電図検査（ＥＲＧ）を介する形態学および視覚機能試験によって評価することができる。視細胞外顆粒層（ＯＮＬ）変性における形態学的変化は、生後１６日（Ｐ１６）の早い段階でＲＣＳラットに現れる。眼におけるＭｅｒｔｋ遺伝子の網膜機能を回復するために、ＨＩＴＩ（ＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＩＴＩ）を介して、Ｍｅｒｔｋのエクソン２の機能的コピーをイントロン１に挿入することができるＡＡＶベクターを生成した。比較のために、ＨＤＲＡＡＶベクターもまた、欠失した１．９のｂｐ領域（ＡＡＶ−ｒＭｅｒｔｋ−ＨＤＲ）を修復するために生成した（図７Ｂ）。ＡＡＶを生後３週間でラットの眼に注入し、７−８週間目で分析した（図７Ｃ）。ＤＮＡ分析から、ＡＡＶ注入眼における正確なＤＮＡノックインを検出した（図７Ｄおよび図８）。未処置の対照およびＨＤＲ−ＡＡＶ対照と比較して、ＨＩＴＩ−ＡＡＶ注入は、ＭｅｒｔｋｍＲＮＡ発現レベルにおける有意な増加、およびＯＮＬ厚さのより良好な保存をもたらした（図７Ｅ＆７Ｆ）。Ｈ＆Ｅの染色によって、注入された眼における視細胞ＯＮＬの増加を確認した。これに対して、未処置眼およびＨＤＲ−ＡＡＶ処置眼は、ＯＮＬ中にわずか１−２のまたはまばらに分布した視細胞本を有した。さらにＭＥＲＴＫタンパク質発現は、ＨＩＴＩ−ＡＡＶ中で観察されたが、ＨＤＲ−ＡＡＶ注入眼では観察されなかった（図７Ｇ）。網膜の生理機能における処置の効果を決定するために、ＥＲＧ応答は、注射後４週間（Ｐ５０）で試験し、桿体機能および錐状体機能の電気活性（１０Ｈｚのフリッカー）を測定した。簡潔に言えば、深麻酔したマウスの眼は、１％局所的トロピカミドで拡大した。１つのアクティブレンズ電極を各角膜上に配置し、皮下に配置された基底針電極（ｇｒｏｕｎｄｎｅｅｄｌｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を底部に、および基準電極を頭の皮下に、ほぼ眼の間に配置した。Ｇａｎｚｆｅｌｄボウル中のキセノンランプを用いて光シミュレーションを送達し、およびＤｉａｇｎｏｓｙｓのソフトウェアを用いて結果を処理した。公表されるように、明順応ＥＲＧを行った：３０ｃｄ／ｍ^２の背景光での１０分間の光適応に続いて、錐状体応答が１０ｃｄ／ｍ^２の低背景光を伴う３４ｃｄ／ｍ^２の閃光によって誘発され、シグナルは５０スイープから平均された。ＨＩＴＩ−ＡＡＶで処置されたすべての眼は、有意に改善されたＥＲＧｂ波応答を示した（図７Ｈ）。同様に、錐状体応答を測定する１０Ｈｚのフリッカー値は有意に改善され、未処置の眼のそれよりも４倍以上高かった（図７Ｉ）。これらの結果は、ＡＡＶ−ＨＩＴＩ処置がＲＣＳラットモデルにおいて網膜の視覚機能を救助し保存することができることを実証する。

＜実施例６＞
結腸癌細胞を標的化する、ＡＡＶエンコーディングＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた腹腔内注入
Ｃａｓ９をエンコーディングする１つ以上のウイルスおよび突然変異駆動結腸癌を保有する遺伝子を標的化する２つのガイドＲＮＡを、結腸癌を患う被験体に腹腔内注入する。遺伝子はＡＰＣである。あるいは、遺伝子は、ＭＹＨ１、ＭＹＨ２、ＭＹＨ３、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＥＰＣＡＭ、ＰＯＬＥ１、ＰＯＬＤ１、ＮＴＨＬ１、ＢＭＰＲ１Ａ、ＳＭＡＤ４、ＰＴＥＮ、またはＳＴＫ１１である。大腸生検が４週間後に得られ、それをウイルスで処置される前の被験体から得られた大腸生検と比較した。処置後に得られた生検サンプル中の結腸癌細胞の数は、処置前に得られた生検サンプルのものと比べて、より少なく、およびより多くの小腸細胞が存在した。結腸癌細胞が良性の小腸細胞にリプログラミングされたことが結論付けられる。

＜実施例７＞
リンパ腫細胞を標的化するＡＡＶコーディングＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた静脈内注入
Ｃａｓ９をコーディングする１つ以上のウイルスおよび突然変異駆動Ｂ細胞リンパ腫を保有する遺伝子を標的化する２つのガイドＲＮＡを、Ｂ細胞リンパ腫を有する被験体に静脈内注入する。遺伝子はＣ−ＭＹＣである。あるいは、遺伝子は、ＣＣＮＤ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、またはＣＤ１９である。血液サンプルが４週間後に得られ、それをウイルスで処置される前の被験体から得られた血液サンプルと比較した。処置後に得られた血液サンプル中のＢ細胞の数は、処置前に得られた血液サンプルのものと比べて、より少なく、およびより多くのマクロファージが存在した。Ｂ細胞リンパ腫細胞が良性のマクロファージにリプログラミングされたことが結論付けられる。

＜実施例８＞
免疫療法のための、Ｔ細胞を標的化するＡＡＶコーディングＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた静脈内注入
Ｃａｓ９をコードする１つ以上のウイルスならびに遺伝子をコードするＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤を標的化する２つのガイドＲＮＡを、転移性黒色腫を有する患者に静脈内注入した。あるいは、患者は、転移性卵巣癌、転移性腎細胞癌、または非小細胞肺癌などの別の癌を患っている。Ｔ細胞の数および応答が最大限化するように、Ｔ細胞はウイルスに感染させて遺伝子をコードするＰＤ−１を不活性化する。ＰＤ−Ｌ１を発現する患者の癌細胞も感染させ、さらにＰＤ−Ｌ１も同様に不活性化し、Ｔ細胞活性化およびサイトカイン産生のＰＤ−Ｌ１阻害を減少させ、それは通常、癌細胞に免疫逃避をもたらす。

＜実施例９＞
ＳｐｌｉｔＣａｓ９送達プラットフォーム
インビボの桿体を錐状体へのリプログラミングをもたらすための網膜中のＮＲＬのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介標的化不活性化を、以下のように実施した。アデノ随伴ウイルスを、それらの穏やかな免疫応答、長期的な導入遺伝子発現、および好ましい安全プロフィールにより、遺伝子導入のために選択した。それらの制限されたパッケージ容量を克服するために、ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９システムを使用した。化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を、スプリットインテイン（ｓｐｌｉｔ−ｉｎｔｅｉｎｓ）を使用して、２成分へ分割した。各ＳｐＣａｓ９部分をその対応するスプリットインテイン部分に融合した。同時発現に際して、完全なＳｐＣａｓ９タンパク質を再構成した。このように２つのＡＡＶベクターを利用することによって（図９を参照）、各ベクターの残存するパッケージ容量は、単一または二重のｇＲＮＡの送達を介する多重の標的化、またはインサイチュ治療のための、ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−媒介標的化インビボの遺伝子抑圧を含むゲノム工学機能の広範囲に適応した。

＜実施例１０＞
１つまたは２つのｇＲＮＡを用いた二重ベクター送達の有効性
二重のＡＡＶのベクターアプローチを、ＮＲＬを標的化するＣａｓ９およびｇＲＮＡの送達のために評価した。ＮＲＬを標的化する１つまたは２つのｇＲＮＡを用いた構築を、同じ遺伝子について２つのｇＲＮＡによって２つの部位を標的化する場合に、１つのｇＲＮＡによって標的化するよりさらに高い標的化効率を有するか否かを決定するために設計した。標的配列は図１０Ａに示され、ＰＡＭ配列は下線で示される。さらに、ＡＡＶにおいて反復配列を回避し、それによって、ベクター安定性およびウイルス力価を妥協するために、各ｇＲＮＡを独立して駆動するためのヒトのＵ６プロモーターおよびマウスＵ６プロモーターを使用した。さらなる非相同性ｔｒａｃｒＲＮＡを使用した。標準的なＴ７エンドヌクレアーゼ１を使用して、マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）中の遺伝子編集率を定量化した。ｓｐｌｉｔＣａｓ９−Ｎｒｌベクターを用いてＭＥＦを同時導入し、ゲノムＤＮＡ（図１０Ｂ）を用いてＴ７Ｅ１アッセイを実行した。矢印は、ゲノム編集によって引き起こされたヘテロニ本鎖ＤＮＡに特異的なＴ７Ｅ１酵素によって産生された切断されたＤＮＡを示す。突然変異頻度を、全バンド強度に対する切断バンド強度（ｃｕｔｂａｎｄｓｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の割合から計算した。遺伝子ターゲティング効率を、一重のｇＲＮＡ方法よりも二重のｇＲＮＡの標的ストラテジーによって改善した。

＜実施例１１＞
二重ベクターシステムにおけるＫＲＡＢ転写抑制因子の封入
転写干渉は、ＫＲＡＢ転写抑制因子の使用を介してもたらされた。実施例１０に記載される二重のＡＡＶのベクターシステムを元にして、ＫＲＡＢ抑制因子ドメインをＣａｓ９タンパク質配列（図１１）のＮ末端に融合させることによって、ＫＲＡＢ転写抑制因子をｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９システムに組み入れた。これは、痕のない潜在的に可逆的な遺伝子治療のためのアプローチを作成し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性の不活性化により、突然変異誘発の危険を最小化した。

＜実施例１２＞
野生型マウスおよびＮＲＬ−ＧＦＰマウスにおける桿体から錐状体への細胞リプログラミング
ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９またはＡＡＶ−ｇＲＮＡ／ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９標的化ＮＲＬを、生後７日（ｐ７）の野生型マウスの網膜下腔に注入し、Ｐ３０で組織学のために屠殺した（図１２Ａ）。ＡＡＶ２カプシドおよびチロシン突然変異体Ｙ４４４Ｆの両方を、形質導入効率について評価した。Ｙ４４４Ｆ突然変異体ベクターは、ＡＡ２よりも増強された網膜の形質導入を示し、続く研究において使用された。網膜を瞬間冷凍し、区分し、および錐体アレスチン（ｍＣＡＲ）および中波長オプシン（Ｍオプシン）を含む錐状体マーカーについて染色した。染色されたセクションに示されるように、および細胞アッセイ（図１２Ｂ−Ｄ）で、リプログラミングされた光受容体表現型がＣａｓ９−ｇＲＮＡｓと共に見られた。野生型対照と比較して、錐状体特異的発現がＯＮＬの中で視覚化される。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、リプログラミングされた網膜および対照中の桿体遺伝子または錐状体遺伝子の相対的な発現レベルを測定した。錐状体特異的遺伝子の上方制御を伴う桿体特異的伝子の下方制御があった（図１２Ｅ）。

トランスジェニックＮＲＬ−ＧＦＰマウス（ここで、桿体視細胞はすべて標識化される）に、ＡＡＶ−ＮＲＬｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を記載されるように網膜下に注入した（図１２Ｆ）。ｍＣＡＲ陽性細胞の数の有意な増加およびＮｒｌ−ＧＦＰ^＋桿体視細胞における付随する減少が見られた（図１２Ｇおよび１２Ｈ）。野生型の網膜中の水平細胞（ＨＣ）を連想させる、多くの形態学的に錐状体のような細胞が内顆粒層の内部面に見られた（図１２Ｉ）。さらに、これらの細胞は、錐状体マーカー、ｍ−ＣＡＲ、およびＨＣマーカー、カルビンディンの両方で発現したことが検出され（図１２Ｊ）、水平細胞も錐状体のような細胞リプログラミングを受ける可能性を維持することを示す。桿体が錐状体のような細胞へリプログラミングされたことが結論付けられる。

＜実施例１３＞
ｒｄ１０マウス中のＮＲＬ、つまり常染色体劣性ＲＰのためのモデルを目標化した。これらのｒｄ１０マウスは、桿体ホスホジエステラーゼ遺伝子の自然突然変異を保有し、約Ｐ１８で始まる急速な桿体変性を示す。Ｐ６０までには、桿体はもはや目に見えず、付随的な錐体視細胞変性を伴う。桿体から錐状体への転換が、網膜変性を回復に向かわせ、視覚機能を救助するのに十分であるかどうかを評価するために、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９またはＡＡＶ−ｇＲＮＡ／ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９を、ｒｄ１０マウスにＰ７で注入した。錐状体の生理機能および視力におけるそのような処置の効果を、網膜電図検査（ＥＲＧ）応答および視覚運動性眼振（ＯＫＮ）を計測することによって決定し、注入後６週目（Ｐ６０）の錐体視細胞活性（明所視応答（ｐｈｏｔｏｐｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅ））およびの視力を定量化した（図１３Ａ）。簡潔に言えば、試験動物が置かれたプラットフォームを囲む４つのコンピュータモニターを有する仮想現実チャンバーを作成することによって、ＯＫＮを測定した。動物を試験条件に順応させた後、垂直の正弦波格子で覆われた仮想シリンダをモニターに投影した。仮想の線条シリンダを、コントラストの最高レベル（１００％、黒０、白２５５、２５０ｃｄ／ｍ^２より上から照らされる）で設定し、線条の数は１つのスクリーン当たり４から始めた（２黒および２白）。試験は、１分の時計方向回転で１３の速度で始まり、その後、１分の反時計方向回転が続いた。動物の上に位置したビデオカメラは、不偏の観察者が頭部動作を追跡し、記録することを可能にした。データを、サイクル／度（ｃ／ｄ）によって測定し、平均の±標準偏差として表し、ｔ検定統計分析を用いて比較した。Ｐ値〈０．０５は、統計的に有意であると考えられた。明所視のｂ波値および視力における有意な改善によって示されるように、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９またはＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９で処置された眼はすべて、錐状体機能および視覚機能を改善した（図１３Ｂ−Ｃ）。さらに、ｍＣＡＲ陽性細胞およびＭオプシン陽性細胞の数は、ＡＡＶ−ＮＲＬｇＲＮＡｓ／Ｃａｓ９またはＫＲＡＢ−ｄＣＡＳ９−処置ｒｄ１０網膜の組織学的分析において観察され（図１３Ｄ−Ｇ）、視覚機能における改善の発見と一致した。未処置の眼がまばらに分布した視細胞核のみをＯＮＬ中に有する一方、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９またはＡＡＶ−ｇＲＮＡ／ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９処置眼は３−５層のＯＮＬを有し、これは、処置が視細胞変性を防ぎ、ＯＮＬを保存したこと防いだことを示した（図１３Ｄ）。

＜実施例１４＞
後期／末期の疾患における錐状体のような細胞の産生
ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９またはＡＡＶ−ｇＲＮＡ／ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９を、生存可能な視細胞および記録不可能なＥＲＧが存在しないｒｄ１０マウスにＰ６０で網膜下注入した（図１４Ａ）。錐状体ｍＣＡＲ陽性細胞の数の付随する増加と共に、明所視のｂ波値および視力における有意な改善によって示されるように、ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９またはＡＡＶ−ｇＲＮＡ／ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９で処置された眼はすべて、錐状体機能および視覚機能を改善した（図１４Ｂ−Ｃ）。新生仔および成体のｒｄ１０マウスのＡＡＶ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９またはＡＡＶ−ｇＲＮＡ／ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９で処置されたすべての眼において、錐状体オプシン^＋細胞の大部分における共局在したカルビンディン発現を観察した（図１４Ｄ）。桿体および錐状体の視細胞が実質的に変性させられるか失われる後期／末期でのＲＰ遺伝子治療に、介在ニューロンから錐状体へのリプログラミングを適用できることが結論付けられる。

＜実施例１５＞
３ヶ月齢ＦｖＢ網膜変性マウスの網膜の機能の回復
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）のＢサブユニットをコードするＰｄｅ６ｂｒｄ１のための同型接合体の突然変異を有するＦＶＢ／Ｎマウスは、ｐ３５までの桿体視細胞の急速な初期損失および続く錐状体視細胞の損失によって特徴付けられる、遺伝的常染色体劣性の網膜変性を示す。そのようなマウスに、Ｐ６０でＡＡＶ−ｇＲＮＡ／ＫＲＡＢ−ｄＣＡＳ９で網膜下注入した（図１５Ａ）。先の実施例のように、組織学的分析を行った。ＡＡＶ−ｇＲＮＡ／ＫＲＡＢ−ｄＣＡＳ９−処置網膜は、有意に改善した明所視のｂ波値および視力を有するｍＣＡＲ^＋細胞の発生を示し、改善された視覚機能（図１５Ｂ−Ｃ）を示した。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９媒介細胞のリプログラミングは、遺伝子および突然変異非依存的な治療であることが結論付けられる。

Claims

細胞を第１の細胞型から第２の細胞型にリプログラミングする方法であって、該方法は：
細胞を、
ａ）遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡであって、ここで、遺伝子は細胞の細胞型特異的機能に寄与するタンパク質をコードする、第１のガイドＲＮＡ遺伝子と；
ｂ）標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと、に接触させる工程を含み、
ここで、遺伝子の鎖を切断することは、細胞がもはや細胞型特異的機能を実行することができないように遺伝子の発現を修飾し、それによって、第２の細胞型に細胞をリプログラミングする、方法。
遺伝子は突然変異を含む、請求項１に記載の方法。
第１の細胞型は突然変異に対して感受性があり、第２の細胞型は突然変異に対して耐性がある細胞型である、請求項２に記載の方法。
突然変異は、第１の細胞型中のみに有害な影響を引き起こす、請求項２に記載の方法。
有害な影響は、老衰、アポトーシス、分化の欠如、および異常な細胞増殖から選択される、請求項４に記載の方法。
遺伝子は転写因子をコードする、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
第１の細胞型および第２の細胞型は、密接に関連する高分化の成熟細胞型である、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
リプログラミングはインビボで起こる、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
リプログラミングはインビトロまたはエクスビボで起こる、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
細胞は、膵臓、心臓、脳、眼、腸、結腸、筋肉、神経系、前立腺、または乳房の細胞である、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
細胞は分裂終了細胞である、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
細胞は眼の中の細胞である、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
細胞は網膜細胞である、請求項１２に記載の方法。
網膜細胞は桿体である、請求項１３に記載の方法。
細胞型特異的機能は夜間視力または色覚である、請求項１４に記載の方法。
遺伝子は、ＮＲＬ、ＮＲ２Ｅ３、ＧＮＡＴ１、ＲＯＲベータ、ＯＴＸ２、ＣＲＸ、およびＴＨＲＢから選択される、請求項１２に記載の方法。
遺伝子はＮＲＬおよびＮＲ２Ｅ３から選択される、請求項１２に記載の方法。
第１の細胞型は桿体である、請求項１２に記載の方法。
第１の細胞型は介在ニューロンである、請求項１２に記載の方法。
第２の細胞型は錐状体である、請求項１２に記載の方法。
第２の細胞型は中間細胞である、請求項１２に記載の方法。
第１の細胞型は桿体であり、第２の細胞型は錐状体である、請求項１２に記載の方法。
錐状体は被験体において明視が可能である、請求項２２に記載の方法。
第１の細胞型は桿体であり、第２の細胞型は多能性細胞である、請求項１２に記載の方法。
第１の細胞型は桿体であり、第２の細胞型は多能性の網膜前駆細胞である、請求項１２に記載の方法。
細胞は癌細胞である、請求項１に記載の方法。
細胞型特異的機能は、異常な細胞増殖、転移、および腫瘍血管新生から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
第１の細胞型は結腸癌細胞であり、第２の細胞型は良性の腸または結腸の細胞である、請求項２６に記載の方法。
遺伝子は、ＡＰＣ、ＭＹＨ１、ＭＹＨ２、ＭＹＨ３、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＥＰＣＡＭ、ＰＯＬＥ１、ＰＯＬＤ１、ＮＴＨＬ１、ＢＭＰＲ１Ａ、ＳＭＡＤ４、ＰＴＥＮ、およびＳＴＫ１１から選択される、請求項２８に記載の方法。
第１の細胞型は悪性のＢ細胞であり、第２の細胞型は良性のマクロファージである、請求項２６に記載の方法。
遺伝子は、Ｃ−ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、およびＣＤ１９から選択される、請求項３０に記載の方法。
細胞はニューロンである、請求項１に記載の方法。
第１の細胞型は、アミロイドベータ、タウタンパク質、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのタンパク質を産生し、第２の細胞型はタンパク質を産生しないか、または第１の細胞型が産生するよりも少ないタンパク質を産生する、請求項３２に記載の方法。
第１の細胞型はニューロンであり、第２の細胞型はグリア細胞である、請求項３３に記載の方法。
遺伝子はＡＰＰおよびＭＡＰＴから選択される、請求項３３に記載の方法。
第１の細胞型はαシヌクレインを産生する、請求項３２に記載の方法。
第１の細胞型はグリア細胞であり、第２の細胞型はドーパミン産出ニューロンである、請求項３６に記載の方法。
遺伝子は、ＳＮＣＡ、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、およびＰＩＮＫ１から選択される、請求項３６に記載の方法。
遺伝子はαシヌクレイン（ＳＮＣＡ）である、請求項３６に記載の方法。
第２の細胞型は、ドーパミン作動性ニューロンおよびドーパミン作用性前駆細胞から選択される、請求項３６に記載の方法。
第１の細胞型は、非ドーパミン作動性ニューロンまたはグリア細胞である、請求項３５に記載の方法。
リプログラミングされた細胞を用いて、必要とする被験体の疾病を処置する方法であって、ここで、リプログラミングされた細胞は請求項１に記載の方法によって産生される、方法。
リプログラミングされた細胞は、被験体にとって自己由来である請求項４２に記載の方法。
疾病は網膜変性を含む、請求項４２に記載の方法。
疾病は、黄斑変性、網膜色素変性、および緑内障から選択される、請求項４４に記載の方法。
疾病は網膜色素変性である、請求項４４に記載の方法。
疾病は癌である、請求項４２に記載の方法。
癌は結腸癌または乳癌である、請求項４７に記載の方法。
疾病は神経変性の疾病である、請求項４２に記載の方法。
疾病は、パーキンソン病およびアルツハイマー病から選択される、請求項４９に記載の方法。
疾病を処置する方法であって、該方法は：
ａ）第１のタイプの細胞中の遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡであって、ここで、遺伝子が第１のタイプの細胞の第１の機能に寄与するタンパク質をコードする、第１のガイドＲＮＡと；
ｂ）標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと、を必要とする被験体に投与する工程を含み、
ここで、遺伝子の鎖を切断することは、第１のタイプの細胞は第１のタイプの細胞から第２のタイプの細胞へ切り替えられるように遺伝子の発現を修飾し、ここで、結果としてもたらされる第２のタイプの細胞における存在または増加は疾病を改善する、方法。
遺伝子の発現を修飾することは、第１のタイプの細胞中の遺伝子の発現を少なくとも約９０％減少させることを含む、請求項５１に記載の方法。
遺伝子の発現を修飾することは遺伝子を編集することを含み、ここで、編集することは、遺伝子からタンパク質を産出しないか、または遺伝子から非機能的タンパク質を産出する結果となる、請求項５１に記載の方法。
疾病は眼の疾病であり、および第１のタイプの細胞は第１のタイプの眼細胞であり、第２のタイプの細胞は第２のタイプの眼細胞である、請求項５１−５３のいずれか１つに記載の方法。
機能は第１のタイプの眼細胞中で行なわれ、第２のタイプの眼細胞中では行われない、請求項５４に記載の方法。
第２のタイプの眼細胞は第２の機能を行ない、ここで、第２の機能は第１のタイプの眼細胞によって行われない、請求項５４に記載の方法。
第１のタイプの眼細胞は桿体であり、第２のタイプの眼細胞は錐状体である、請求項５４に記載の方法。
眼の疾病は、網膜変性、網膜色素変性、または黄斑変性である、請求項５４に記載の方法。
遺伝子はＮＲ２Ｅ３およびＮＲＬから選択される、請求項５７に記載の方法。
桿体を錐状体に、または桿体を多能性の網膜前駆細胞にリプログラミングする工程を含む、請求項５９に記載の方法。
眼の疾病は緑内障であり、第２のタイプ眼細胞は網膜神経節細胞である、請求項５４に記載の方法。
第１の細胞型はミュラーグリア細胞である、請求項６１に記載の方法。
遺伝子はＡＴＯＨ７、ＰＯＵ４Ｆ遺伝子、またはＩｓｌｅｔ１である、請求項６２に記載の方法。
遺伝子はＣＤＫＮ２ＡおよびＳｉｘ６から選択される、請求項５８に記載の方法。
ベクター、リポソーム、およびリボ核タンパクから選択される送達ビヒクルにおいて、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびガイドＲＮＡを投与する工程を含む、請求項５１に記載の方法。
細胞を第２のガイドＲＮＡと接触させる工程を含む、請求項５１に記載の方法。
第２のガイドＲＮＡを投与する工程を含む、請求項５１に記載の方法。
遺伝子中の新規スプライス部位を導入する工程を含む、請求項６６または６７に記載の方法。
新規スプライス部位は、結果としてエクソンまたはその一部を遺伝子のコード配列から取り除く、請求項６８に記載の方法。
エクソンは遺伝子中に突然変異を含む、請求項６９に記載の方法。
突然変異は、第１の細胞型中のみに有害な影響を引き起こす、請求項７０に記載の方法。
有害な影響は、老衰、アポトーシス、分化の欠如、および異常な細胞増殖から選択される、請求項７１に記載の方法。
遺伝子は転写因子をコードする、請求項６８に記載の方法。
第１のタイプの細胞は突然変異に対して感受性があり、第２のタイプの細胞は突然変異に対して耐性がある、請求項６８に記載の方法。
新規エクソンを遺伝子に導入する工程を含む、請求項６９に記載の方法。
少なくとも１つのヌクレオチドを遺伝子に導入する工程を含む、請求項５１−７５のいずれか１つに記載の方法。
新規エクソンを遺伝子に導入する工程を含む、請求項７６に記載の方法。
ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、第１のガイドＲＮＡ、および第２のガイドＲＮＡを含むシステムであって、ここで、第１のガイドＲＮＡは、遺伝子の少なくとも第１の領域の第１の部位５’のＣａｓ９切断を標的化し、第２のガイドＲＮＡは、遺伝子の第１の領域の第２の部位３’のＣａｓ９切断を標的化し、それによって、遺伝子の領域を切除する、システム。
第１のガイドＲＮＡは少なくとも第１のエクソンの第１の部位５’のＣａｓ９切断を標的化し、第２のガイドＲＮＡは、少なくとも第１のエクソンの第２の部位３’のＣａｓ９切断を標的化し、それによって、少なくとも第１のエクソンを切除する、請求項７８に記載のシステム。
第１の部位および第２の部位の間に挿入され得るドナーポリヌクレオチドを含む、請求項７９に記載のシステム。
ドナーポリヌクレオチドは、ドナーエクソンの５’末端および３’末端にスプライス部位を含むドナーエクソンである、請求項８０に記載のシステム。
ドナーポリヌクレオチドは野生型配列を含む、請求項８０に記載のシステム。
遺伝子はＮＲＬおよびＮＲ２Ｅ３から選択される、請求項７８に記載のシステム。
第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質をＳＥＱＩＤＮＯ．１−４のいずれか１つを含む配列に標的化する、請求項８３に記載のシステム。
ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、第１のガイドＲＮＡ、および第２のガイドＲＮＡを含むキットであって、ここで、第１のガイドＲＮＡは、遺伝子の少なくとも第１の領域の第１の部位５’のＣａｓ９切断を標的化し、第２のガイドＲＮＡは、遺伝子の第１の領域の第２の部位３’のＣａｓ９切断を標的化し、それによって、遺伝子の領域を切除する、キット。
第１のガイドＲＮＡは少なくとも第１のエクソンの第１の部位５’のＣａｓ９切断を標的化し、第２のガイドＲＮＡは少なくとも第１のエクソンの第２の部位３’のＣａｓ９切断を標的化し、それによって、少なくとも第１のエクソンを切除する、請求項８５に記載のキット。
ドナーポリヌクレオチドを含み、ここで、ドナー核酸が第１の部位および第２の部位の間に挿入される、請求項８６に記載のキット。
ドナーポリヌクレオチドは、ドナーエクソンの５’末端および３’末端にスプライス部位を含むドナーエクソンである、請求項８７に記載のキット。
ドナーポリヌクレオチドは野生型配列を含む、請求項８７に記載のキット。
遺伝子はＮＲＬおよびＮＲ２Ｅ３から選択される、請求項８５に記載のキット。
第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質をＳＥＱＩＤＮＯ．１−４のいずれか１つを含む配列に標的化する、請求項８５に記載のキット。
被験体の眼の疾病を処置するための医薬組成物であって、該医薬組成物は：
ａ）ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと；
ｂ）ＮＲＬ遺伝子およびＮＲ２Ｅ３遺伝子から選択される遺伝子の一部に相補的な、少なくとも１つのガイドＲＮＡと、を含む、医薬組成物。
Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのガイドＲＮＡが少なくとも１つのウイルスベクター中に存在する、請求項９２に記載の医薬組成物。
Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは少なくとも１つのガイドＲＮＡがリポソーム中に存在する、請求項９３に記載の医薬組成物。
少なくとも１つのガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＳＥＱＩＤＮＯ．１−４のいずれか１つを含む配列に標的化する、請求項９２に記載の医薬組成物。
医薬組成物は、点眼剤を用いて投与するための液体として製剤される、請求項９２に記載の医薬組成物。
医薬組成物は、硝子体内投与のための液体として製剤される、請求項９２に記載の医薬組成物。
細胞中の遺伝子を編集する方法であって、該方法は：
細胞を、
ａ）遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；
ｂ）標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと；
ｃ）ドナー核酸と、に接触させる工程を含む、方法。
ドナー核酸は、非相同末端結合を介して遺伝子に挿入される、請求項９８に記載の方法。
細胞は分裂終了細胞である、請求項９８に記載の方法。
遺伝子はＭｅｒｔｋ遺伝子である、請求項９８に記載の方法。
細胞は被験体の眼の網膜中の細胞である、請求項９８に記載の方法。
被験体の網膜変性を処置する方法であって、該方法は：
被験体の網膜を、
ａ）遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；
ｂ）標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと；
ｃ）非相同末端結合を介して遺伝子に挿入されるドナー核酸と、に接触させる工程を含む、方法。
網膜変性は網膜色素変性である、請求項１０３に記載の方法。
遺伝子はＭｅｒｔｋ遺伝子である、請求項１０３に記載の方法。
被験体のβサラセミアを処置する方法であって、該方法は：
被験体の造血幹細胞／前駆細胞を、
ａ）ヘモグロビン遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；
ｂ）標的部位でヘモグロビン遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと；
ｃ）非相同末端結合を介して遺伝子に挿入されるドナー核酸と、に接触させる工程を含む、方法。
ドナー核酸は、ＣＤ４１／４２突然変異を含むヘモグロビン遺伝子の一部を置き換える、請求項１０６に記載の方法。
被験体の癌を処置する方法であって、該方法は：
被験体のＴ細胞を、
ａ）免疫チェックポイント阻害剤をコードする遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；
ｂ）標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと、に接触させる工程を含む、方法。
Ｔ細胞をドナー核酸と接触させる工程を含み、ここで、ドナー核酸は非相同末端結合を介して遺伝子に挿入される、請求項１０８に記載の方法。
遺伝子はＰＤ−１をコードする、請求項１０８に記載の方法。
被験体の癌を処置する方法であって、該方法は：
被験体の癌細胞を、
ａ）免疫チェックポイント阻害剤リガンドをコードする遺伝子の標的部位にハイブリタイズする第１のガイドＲＮＡと；
ｂ）標的部位で遺伝子の鎖を切断するＣａｓヌクレアーゼと、に接触させる工程を含む、方法。
遺伝子はＰＤ−Ｌ１あるいはＰＤ−Ｌ２をコードする、請求項１１１に記載の方法。
腫瘍細胞をドナー核酸と接触させる工程を含み、ここで、ドナー核酸は非相同末端結合を介して遺伝子に挿入される、請求項１１１または１１２に記載の方法。
癌は転移性癌である、請求項１１１−１１３のいずれか１つに記載の方法。
癌は、転移性卵巣癌、転移性黒色腫、転移性非小細胞肺癌、または転移性腎細胞癌である、請求項１１４に記載の方法。細胞のリプログラミングのための方法および組成物