JP2020536502A - 遺伝子操作のためのヌクレアーゼシステム - Google Patents

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    • C12N2310/322—2'-R Modification

Abstract

融合構築物をコードするRNase-H様ドメイン含有組成物が開示されている。がんを処置するためにRNase-H様ドメイン含有組成物を用いる組成物および方法も開示されている。また、さまざまな疾患、状態、およびがんを処置する際の該RNase-H様ドメイン含有組成物の作製方法および使用方法も開示されている。

Description

相互参照
本願は、2017年9月7日に出願された米国特許仮出願第62/555,564号および2018年4月3日に出願された米国特許仮出願第62/652,047号の恩典を主張し、これらの出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
配列表
本願はASCIIフォーマットで電子提出された配列表を含み、この配列表は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。2018年9月7日に作成されたこのASCIIコピーは47533-727＿601＿SL.txtと名付けられており、サイズは1,150,509バイトである。
背景
ゲノム科学が急速な進歩を遂げつつあるなか、効果的なゲノム操作は、ヒト疾患の分子的基礎を理解する上でも、ゲノムに同定可能な改変を持つヒト障害を処置する上でも、大いに有望である。RNA誘導型（RNA-guided）CRISPR/Cas9技術が一気に台頭したのは、ここ数年のことである。現行のCRISPR/Cas9システムを最適化するために、かつ/または効率および特異性が向上したCas9様ヌクレアーゼをより多く同定するために、多大な努力が払われている。
同様に、特異性および効率が改良されたゲノム編集に用いることができる新しいシステムを同定するためにも、多大な努力が費やされている。
参照による組み入れ
本明細書における刊行物、特許、および特許出願はいずれも、個々の刊行物、特許、または特許出願について参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により組み入れられる。本明細書における用語と組み入れられた参照文献における用語との間で矛盾が生じた場合は、本明細書における用語が優先される。
本明細書では、原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とを含むポリペプチド構築物が開示される。場合により、RHDCポリペプチド配列は、中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する。場合により、標的ポリヌクレオチド配列はガイドDNAによって結合される。場合により、RHDCポリペプチド配列は核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合される。場合により、RHDCポリペプチド配列または該核酸巻き戻しポリペプチド配列のうちの少なくとも一方は中温生物に由来する。場合により、RHDCポリペプチド配列は、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する。場合により、RHDCポリペプチド配列は、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、または約30℃で該標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する。場合により、RHDCポリペプチド配列は、37℃で該標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する。場合により、中温生物は原核生物である。場合により、原核生物は、バクテロイデス門（bacteroidetes）、プロテオバクテリア門（proteobacteria）、アシドバクテリア門（acidobacteria）、アクチノバクテリア門（actinobacteria）、ファーミキューテス門（firmicutes）、シアノバクテリア門（cyanobacteria）、スピロヘータ門（spirochaetes）、デイノコックス門（deinococcus）、ベルコミクロビア門（verrucomicrobia）、プランクトミセス門（planctomycetes）、バルネオラ門（balneolaeota）、およびクロロフレクサス門（chloroflexi）からなる群より選択される科に由来する。場合により、RHDCポリペプチド配列は、P-element induced WImpy testis（PIWI）遺伝子、RuvC、Cas、Sir2、Mrr、TIR、PLD、REase、制限エンドヌクレアーゼ、DExD/H、スーパーファミリーIIヘリカーゼ、RRXRR（SEQ ID NO:380）、DUF460、DUF3010、DUF429、DUF1092、COG5558、OrfB＿IS605、ペプチダーゼ＿A17、リボヌクレアーゼH様ドメイン、3'-5'エキソヌクレアーゼドメイン、3'-5'エキソリボヌクレアーゼRv2179c様ドメイン、バクテリオファージμ、トランスポザーゼ、DNA指向性DNAポリメラーゼ、ファミリーB、エキソヌクレアーゼドメイン、エキソヌクレアーゼ、RNase T/DNAポリメラーゼIII、yqgF遺伝子、HEPN、RNase LSドメイン、LsoA触媒ドメイン、KENドメイン、RNaseL、Ire1、RNaseドメイン、RloC、またはPrrCのうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされるポリペプチドに由来する。場合により、RHDCポリペプチド配列は、防御、ストレス応答、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）、アルゴノート、またはDNA修復に関与する遺伝子のうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされるポリペプチドに由来する。場合により、RHDCポリペプチド配列はアルゴノートドメイン配列である。場合により、RHDCポリペプチド配列は、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む。場合により、ポリペプチド構築物は、RHDCポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とに融合された追加の機能的ポリペプチド配列をさらに含む。場合により、核酸巻き戻しポリペプチドは原核生物起源または古細菌起源である。場合により、核酸巻き戻しポリペプチドは、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、Cas、またはそれらの組合せを含む。場合により、Casは触媒不活性（catalytically dead）Casまたは部分不活性（partially dead）Cas（ニッカーゼ）である。場合により、触媒不活性Casは、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、およびCasRXの触媒不活性誘導体からなる群より選択される。場合により、ポリペプチド構築物はATPase配列をさらに含む。場合により、RHDCポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列は、リンカー配列によって融合される。場合により、リンカーは、以下の要素を含むポリペプチドリンカーである:1つのGSGSGS配列もしくは複数コピーのGSGSGS（SEQ ID NO:381）、非荷電アミノ酸、αヘリックスドメイン、またはリガンド誘導性コンフォメーション変化を伴うペプチド。場合により、リンカーはポリペプチドリンカーである。場合により、核酸巻き戻しポリペプチド配列とRHDCポリペプチド配列は同じフレームで発現される。場合により、ポリペプチド構築物はガイドDNAに結合する。場合により、ガイドDNAは、約1塩基対長〜約30塩基対長である。場合により、ガイドDNAは標的ポリヌクレオチド配列に相補的である。場合により、標的ポリヌクレオチド配列は遺伝子配列を含む。場合により、ポリペプチド構築物は、細胞に導入された場合に、遺伝子配列の破壊をもたらす。場合により、破壊は二本鎖切断または一本鎖切断を含む。場合により、RHDCポリペプチド配列は、ファーミキューテス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、RHDCポリペプチド配列は、クロストリジウム（Clostridium）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、クロストリジウム・アルゴノートドメインは、クロストリジウム・ディスポリカム（Clostridium disporicum）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。場合により、RHDCポリペプチド配列は、サーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインは、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。場合により、RHDCポリペプチド配列は、メチロバクター（Methylobacter）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、メチロバクター・アルゴノートドメインは、メチロバクター・ウィッテンバリー（Methylobacter whittenburyi）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。場合により、RHDCポリペプチド配列は、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインは、サーモシネココッカス・エロンゲーツ（Thermosynechococcus elongates）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。
本明細書では、アルゴノートポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列との合成融合体を含むポリペプチド構築物が開示される。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は中温で標的核酸を切断する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列または核酸巻き戻しポリペプチド配列のうちの少なくとも一方は、中温生物に由来する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は約19℃〜40℃で標的核酸を切断する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で標的核酸を切断する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は37℃で標的核酸を切断する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は古細菌アルゴノートポリペプチド配列である。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む。場合により、アルゴノートポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列は、リンカー配列によって融合される。
本明細書では、ポリペプチド構築物を含むエクスビボ細胞が提供される。
本明細書では、ポリペプチド構築物をコードする核酸が提供される。
本明細書では、ポリペプチド構築物を含む組成物が提供される。
本明細書では、細胞をポリペプチド構築物と接触させる工程を含む、ゲノム編集の方法が提供される。
本明細書では、ポリペプチド構築物とその使用説明書とを含むキットが提供される。場合により、キットは容器をさらに含むことができる。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列、核酸巻き戻しポリペプチド配列、および核酸挿入ポリペプチド配列を含むポリペプチド構築物が提供される。場合により、RHDCポリペプチド配列は、中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断することで、切断された核酸を生成する。場合により、標的ポリヌクレオチド配列はガイドDNAによって結合される。場合により、RHDCポリペプチド配列は核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合される。場合により、核酸挿入ポリペプチド配列は切断された核酸に核酸配列を挿入する。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と調節ドメインポリペプチド（RDP）配列とを含むポリペプチド構築物が提供される。場合により、ポリペプチド構築物は核酸巻き戻しドメイン配列をさらに含む。場合により、核酸巻き戻しドメイン配列は、触媒不活性Cas、ヘリカーゼ、またはトポイソメラーゼを含む。場合により、RDP配列は、Rad51ポリペプチド、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、または、生殖細胞修復に関与するドメインである。場合により、RHDCポリペプチド配列は、ファーミキューテス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する。場合により、RHDCポリペプチド配列は、クロストリジウム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する。場合により、クロストリジウム・アルゴノートドメインは、クロストリジウム・ディスポリカムアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。場合により、RHDCポリペプチド配列は、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する。場合により、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインは、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。場合により、RHDCポリペプチドは、メチロバクター・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する。場合により、メチロバクター・アルゴノートドメインは、メチロバクター・ウィッテンバリー・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。場合により、RHDCポリペプチドは、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する。場合により、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインは、サーモシネココッカス・エロンゲーツ・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。
本明細書では、アルゴノートポリペプチド配列、核酸巻き戻しポリペプチド配列および核酸挿入ポリペプチド配列を含むポリペプチド構築物が開示される。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は中温で核酸を切断し、核酸挿入ポリペプチド配列は切断された核酸に核酸配列を挿入する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列または核酸巻き戻しポリペプチド配列のうちの少なくとも一方は、中温生物に由来する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は、19℃〜40℃で核酸を切断する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で核酸を切断する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は37℃で核酸を切断する。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は古細菌アルゴノートポリペプチド配列である。場合により、アルゴノートポリペプチド配列は、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む。場合により、アルゴノートポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列は、リンカーによって接続される。
本明細書では、ポリペプチド構築物を含むエクスビボ細胞が提供される。
本明細書では、ポリペプチド構築物をコードする核酸が提供される。
本明細書では、ポリペプチド構築物を含む組成物が提供される。
本明細書では、細胞をポリペプチド構築物と接触させる工程を含む、ゲノム編集の方法が提供される。
本明細書では、細胞を、（i）RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列、（ii）核酸巻き戻し因子配列、（iii）ガイド核酸、および（iv）調節ドメインポリペプチド（RDP）配列を含む核酸編集システムと接触させる工程を含む、方法が提供される。場合により、接触させる工程は、細胞における核酸の編集をもたらす。場合により、RHDC配列、核酸巻き戻し因子配列、およびRDP配列はタンパク質複合体中に存在する。場合により、タンパク質複合体はガイド核酸と会合して誘導型編集複合体を形成する。場合により、ガイド核酸はガイドDNAである。場合により、ガイド核酸はガイドRNAである。場合により、RHDCドメインはアルゴノートに由来する。場合により、核酸巻き戻し因子配列は、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、Cas、またはそれらの組合せを含む。場合により、Casは触媒不活性Casまたは部分的触媒不活性Casである。場合により、RDP配列は、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、生殖細胞修復ドメイン、DNA修復タンパク質、またはそれらの組合せを含む。場合により、RDP配列は核酸編集の全部または一部を制御する。場合により、ガイド核酸は細胞中の核酸に相補的である。場合により、細胞中の核酸は疾患関連抗原である。場合により、疾患は、心疾患、糖尿病、がん、神経学的疾患、精神疾患、遺伝性疾患、またはそれらの組合せである。場合により、本方法は、RDP配列を用いない対応する核酸編集方法と比較してエネルギー要求量が低く、かつ、予め決められた量のATPを核酸編集システムに供給してATP使用量を編集後の（［ATP］-［ADP］）/［修飾されたDNA］に基づいて算出することでATP使用量の差を算出することによって、エネルギー要求量が求められる。場合により、RDP配列を含む核酸編集システムを用いた場合、エネルギーレベルは、RDP配列を使用しない相当する核酸編集システムと比較して、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、または最大25％低減する。場合により、本方法は、ゲノム編集修復を非相同末端結合よりも相同組換え修復に偏らせる。場合により、本方法は、細胞のゲノムにトランスジーンを導入する工程をさらに含む。場合により、導入する工程は非ウイルス性に行われる。場合により、導入する工程はウイルス性に行われる。場合により、細胞は初代細胞または組換え細胞である。場合により、細胞はヒト細胞である。場合により、核酸編集システムは細胞にエレクトロポレートされる。場合により、本方法は、本方法によって編集された細胞を、それを必要とする対象に導入する工程をさらに含む。場合により、RHDCポリペプチド配列は、ファーミキューテス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、RHDCポリペプチド配列は、クロストリジウム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、クロストリジウム・アルゴノートドメインは、クロストリジウム・ディスポリカムアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。場合により、RHDCポリペプチド配列は、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインは、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。場合により、RHDCポリペプチド配列は、メチロバクター・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、メチロバクター・アルゴノートドメインは、メチロバクター・ウィッテンバリー・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。場合により、RHDCポリペプチド配列は、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインは、サーモシネココッカス・エロンゲーツ・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。
本明細書では、SEQ ID NO:161〜252のいずれか1つに対して少なくとも60％の同一性を含む単離された核酸配列が提供される。場合により、単離された核酸配列は、SEQ ID NO:161〜252のいずれか1つに対して少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％の同一性を含む。
本明細書では、単離された核酸配列を含む細胞が提供される。
本明細書では、単離された核酸配列によってコードされるタンパク質を含む細胞が提供される。場合により、細胞はガイド核酸をさらに含む。場合により、細胞は調節ドメインポリペプチド（RDP）をさらに含む。
本明細書では、SEQ ID NO:20〜38のいずれか1つに対して少なくとも60％の同一性を含む単離されたポリペプチド配列が提供される。場合により、単離されたポリペプチド配列は、SEQ ID NO:20〜38のいずれか1つに対して少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％の同一性をさらに含む。
本明細書では、単離されたポリペプチド配列を含む細胞が提供される。場合により、細胞はガイド核酸をさらに含む。場合により、細胞は調節ドメインポリペプチド（RDP）配列をさらに含む。
本明細書では、細胞の集団をポリペプチド構築物と接触させる工程を含み、接触させる工程の後に、該集団の少なくとも約5％がゲノム破壊を含む、ゲノム編集の方法が提供される。場合により、接触させる工程の後に、集団の少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、または少なくとも約60％がゲノム破壊を含む。
本明細書では、細胞の集団を、ポリペプチド構築物をコードする単離されたポリ核酸と接触させる工程を含み、接触させる工程の後に、該集団の少なくとも約5％がゲノム破壊を含む、ゲノム編集の方法が提供される。場合により、接触させる工程の後に、集団の少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、または少なくとも約60％がゲノム破壊を含む。
本明細書では、（a）ゲノム配列をCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）タンパク質で巻き戻し、それによって、巻き戻されたゲノム配列を生成する工程と、（b）巻き戻されたゲノム配列を中温性RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと接触させることによって、巻き戻されたゲノム配列にゲノム破壊を導入し、それによってゲノムを編集する工程とを含む、ゲノム編集の方法が提供される。場合により、CRISPRタンパク質は、触媒不活性Casまたは部分不活性Cas（ニッカーゼ）である。場合により、触媒不活性Casは、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、およびCasRXの触媒不活性誘導体からなる群より選択される。場合により、CasはdCas9である。場合により、RHDCポリペプチドは、RuvC、HNH、RNase H、PIWI、またはそれらの組合せから選択されるポリペプチドを含む。場合により、本方法は、調節ドメインポリペプチド（RDP）をさらに含む。場合により、RDPは、Rad51、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、または、生殖細胞修復に関与するドメインを含む。場合により、ゲノム配列は、初代細胞中または組換え細胞中に存在する。場合により、ゲノム配列はヒト細胞中に存在する。
本明細書では、本明細書に開示する方法によって編集された細胞を投与する工程を含む、それを必要とする対象において疾患を処置する方法が提供される。場合により、疾患は、心疾患、糖尿病、がん、神経学的疾患、免疫学的疾患、精神疾患、遺伝性疾患、またはそれらの組合せである。場合により、投与する工程の後に、疾患の程度が約10％〜約50％低減する。
本明細書では、本明細書に開示する方法によって編集された細胞を投与する工程を含む、それを必要とする対象において疾患を安定化する方法が提供される。場合により、安定化は、投与する工程の後の対象における疾患のレベルの5％未満の変化を含む。
本明細書では、原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とをコードする、核酸構築物であって、RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、かつRHDCポリペプチド配列が、核酸構築物によってコードされるポリペプチドにおいて、核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されている、核酸構築物が提供される。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とをコードする、核酸構築物であって、該RHDCポリペプチド配列によってコードされるタンパク質が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、RHDCポリペプチド配列が、核酸構築物によってコードされるポリペプチドにおいて核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されており、かつ核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された核酸に核酸配列を挿入する、核酸構築物が提供される。
本明細書では、原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物を含む、細胞であって、RHDCポリペプチド配列が中温で核酸を切断し、ここで、核酸切断活性がガイドDNAによって束縛され、かつRHDCポリペプチド配列が核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている、細胞が提供される。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とを含むポリペプチド構築物を含む、細胞であって、RHDCポリペプチド配列によってコードされるポリペプチドが中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、RHDCポリペプチド配列が核酸巻き戻しポリペプチドに融合されており、かつ核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された核酸に核酸配列を挿入する、細胞が提供される。
本明細書では、原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とをコードする核酸構築物を含む細胞であって、RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、かつRHDCポリペプチド配列が核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されている、細胞が提供される。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とをコードする核酸構築物を含む、細胞であって、RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、RHDCポリペプチド配列が核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されており、核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された核酸に核酸配列を挿入する、細胞が提供される。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチドとを含む原核ポリペプチド構築物が開示される。RHDCポリペプチドは中温で核酸を切断する。核酸切断活性はガイドDNAによって方向付けられ、RHDCポリペプチドは核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物が開示される。RHDCポリペプチドは中温で核酸を切断する。核酸切断活性はガイドDNAによって方向付けられ、RHDCポリペプチドは核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている。
本明細書では、アルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物が開示される。アルゴノートポリペプチドは中温で核酸を切断する。場合により、RHDCポリペプチドまたは核酸巻き戻しポリペプチドのうちの少なくとも一方は中温生物に由来する。場合により、アルゴノートポリペプチドまたは核酸巻き戻しポリペプチドのうちの少なくとも一方は中温生物に由来する。RHDCポリペプチドは、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃〜約39℃で核酸を切断することができる。場合により、RHDCポリペプチドは約19℃〜約40℃で核酸を切断する。場合により、RHDCポリペプチドは37℃で核酸を切断する。場合により、アルゴノートポリペプチドは、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で核酸を切断する。場合により、アルゴノートポリペプチドは37℃で核酸を切断する。場合により、中温生物は原核生物である。原核生物は、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、アシドバクテリア門、アクチノバクテリア門、ファーミキューテス門、シアノバクテリア門、スピロヘータ門、デイノコックス門、ベルコミクロビア門、プランクトミセス門、バルネオラ門、およびクロロフレクサス門からなる群より選択される科に由来しうる。RHDCポリペプチドは古細菌アルゴノートポリペプチドであることができる。アルゴノートポリペプチドは古細菌アルゴノートポリペプチドであることができる。RHDCポリペプチドは、P-element induced WImpy testis（PIWI）遺伝子、RuvC、Cas、Sir2、Mrr、TIR、PLD、REase、制限エンドヌクレアーゼ、DExD/H、スーパーファミリーIIヘリカーゼ、RRXRR（SEQ ID NO:380）、DUF460、DUF3010、DUF429、DUF1092、COG5558、OrfB＿IS605、ペプチダーゼ＿A17、リボヌクレアーゼH様ドメイン、3'-5'エキソヌクレアーゼドメイン、3'-5'エキソリボヌクレアーゼRv2179c様ドメイン、バクテリオファージμ、トランスポザーゼ、DNA指向性DNAポリメラーゼ、ファミリーB、エキソヌクレアーゼドメイン、エキソヌクレアーゼ、RNase T/DNAポリメラーゼIII、yqgF遺伝子、HEPN、RNase LSドメイン、LsoA触媒ドメイン、KENドメイン、RNaseL、Ire1、RNaseドメイン、RloC、またはPrrCのうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされうる。場合により、RHDCポリペプチドは、防御、ストレス応答、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）、アルゴノート、またはDNA修復に関与する遺伝子のうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされる。場合により、RHDCポリペプチドはアルゴノートドメインである。場合により、RHDCポリペプチドは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せをコードする。場合により、アルゴノートポリペプチドは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せをコードする。場合により、RHDCポリペプチドはRNaseをコードする。核酸巻き戻しポリペプチドは原核生物起源または古細菌起源であることができる。場合により、核酸巻き戻しポリペプチドは、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、Cas、またはそれらの組合せをコードする。Casは、触媒不活性Casまたは部分不活性Cas（ニッカーゼ）であることができる。Casは部分的に触媒不活性であることができる。Casは部分不活性であることができる。場合により、触媒不活性Casは、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、およびCasRXからなる群より選択される。場合により、ポリペプチド構築物はATPaseコード配列をさらに含む。場合により、RHDCポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドは、リンカーによって接続される。リンカーは、以下の要素を含むポリペプチドリンカーである:GSGSGS、非荷電アミノ酸、αヘリックスドメイン、およびリガンド誘導性コンフォメーション変化を伴うペプチド。場合により、アルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドはリンカーによって接続される。リンカーはポリペプチドリンカーであることができる。場合により、核酸巻き戻しポリペプチドとRHDCポリペプチドは同じフレームで発現される。場合により、核酸巻き戻しポリペプチドとアルゴノートポリペプチドは同じフレームで発現される。場合により、ポリペプチド構築物によってコードされるタンパク質は、ガイドDNAに結合する。場合により、ポリペプチド構築物はガイド核酸に結合することができる。場合により、ガイドポリ核酸はガイドDNA（gDNA）またはガイドRNA（gRNA）であることができる。ガイドDNAは、約1塩基対長〜約30塩基対長であることができる。ガイドDNAは、標的ポリヌクレオチド配列に相補的であることができる。場合により、標的ポリヌクレオチド配列は遺伝子配列を含む。場合により、ポリペプチド構築物によってコードされるタンパク質は、細胞に導入された場合に、遺伝子配列の破壊をもたらす。破壊は二本鎖切断または一本鎖切断を含みうる。
本明細書では、ポリペプチド構築物を含むエクスビボ細胞が開示される。
本明細書では、細胞をポリペプチド構築物によってコードされるタンパク質と接触させる工程を含むゲノム編集の方法が開示される。
本明細書では、ポリペプチド構築物とその使用説明書とを含むキットが開示される。キットは容器をさらに含むことができる。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物が開示される。RHDCポリペプチドによってコードされるタンパク質は中温で核酸を切断する。核酸切断活性はガイドDNAによって方向付けされうる。RHDCポリペプチドは核酸巻き戻しポリペプチドに融合することができ、ポリペプチド構築物によってコードされるタンパク質はさらに、核酸挿入活性を呈することができる。
本明細書では、アルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物が開示され、アルゴノートポリペプチドによってコードされるタンパク質は中温で核酸を切断し、ポリペプチド構築物によってコードされるタンパク質はさらに核酸挿入活性を呈する。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと調節ドメインポリペプチド（RDP）とを含むポリペプチド構築物が開示される。ポリペプチド構築物は核酸巻き戻しドメインをさらに含むことができる。核酸巻き戻しドメインは、触媒不活性Cas、ヘリカーゼ、またはトポイソメラーゼであることができる。場合により、RDPは、Rad51ポリペプチド、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、または、生殖細胞修復に関与するドメインである。
本明細書では、ポリペプチド構築物を含む細胞が開示される。
本明細書では、ポリペプチド構築物を含む組成物が開示される。
本明細書では、細胞を、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻し因子とガイド核酸と調節ドメインポリペプチド（RDP）とを含む核酸編集システムと接触させる工程を含む、方法が開示される。場合により、RHDC、核酸巻き戻し因子およびRDPは、タンパク質複合体に含まれる。タンパク質複合体はガイド核酸と会合して誘導型編集複合体を形成する。場合により、ガイド核酸は、ガイドDNA、ガイドRNA、またはそれらの組合せである。RHDCドメインはアルゴノートに由来しうる。核酸巻き戻し因子は、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、Cas、またはそれらの組合せを含む。場合により、Casは触媒不活性Casであることができる。Casは部分的に触媒不活性であることができる。RDPは、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、生殖細胞修復ドメイン、DNA修復タンパク質、またはそれらの組合せを含むことができる。場合により、RDPは核酸編集の調整を可能にする。ガイド核酸は、細胞中の遺伝子を含むゲノム配列に相補的であることができる。場合により、遺伝子は疾患に関与するタンパク質をコードする。疾患は、心疾患、糖尿病、がん、神経学的疾患、免疫学的疾患、精神疾患、遺伝性疾患、またはそれらの組合せであることができる。場合により、本明細書に開示する方法は、RDPを使用しない対応する核酸編集システムと比較してエネルギー要求量が低く、かつ、予め決められた量のATPを核酸編集システムに供給してATP使用量を編集後の（［ATP］-［ADP］）/［修飾されたDNA］に基づいて算出することでATP使用量の差を算出することによって、エネルギー要求量が求められる。場合により、本核酸編集システムを用いた場合、エネルギーレベルは、RDPを使用しない相当する核酸編集システムと比較して、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、または最大25％低減されうる。場合により、本方法は、ゲノム編集修復を非相同末端結合よりも相同組換え修復に傾かせる。本明細書では、細胞のゲノムにトランスジーンを導入する工程をさらに含む方法が開示されうる。場合により、トランスジーンを導入する工程は非ウイルス性またはウイルス性に行われる。細胞は初代細胞または組換え細胞であることができる。細胞はヒト細胞または非ヒト細胞であることができる。核酸編集システムは細胞にエレクトロポレートされうる。方法は、核酸編集システムによって編集された細胞を、それを必要とする対象に導入する工程をさらに含むことができる。
本明細書では、SEQ ID NO:161〜252のいずれか1つに対して少なくとも60％の同一性パーセントを含む単離された核酸配列が開示される。単離された核酸配列は、本明細書に開示する配列に対して少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、または最大約100％の同一性を、さらに含むことができる。
本明細書では、単離された核酸配列によってコードされるタンパク質を含む細胞が開示される。細胞はガイド核酸をさらに含むことができる。細胞は、調節ドメインポリペプチド（RDP）によってコードされるタンパク質を、さらに含むことができる。
本明細書では、細胞の集団を、ポリペプチド構築物によってコードされるタンパク質またはポリペプチド構築物と接触させる工程を含み、接触させる工程の後に、該集団の少なくとも約5％がゲノム破壊を含む、ゲノム編集の方法が開示される。場合により、接触させる工程の後に、細胞の集団の少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、または少なくとも約60％が、ゲノム破壊を含む。
本明細書では、ゲノム配列をCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）タンパク質で巻き戻し、それによって巻き戻されたゲノム配列を生成する工程と、巻き戻されたゲノム配列に、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと接触させることによってゲノム破壊を導入し、それによってゲノムを編集する工程とを含む、ゲノム編集の方法が開示される。CRISPRタンパク質は触媒不活性Casまたは部分不活性Cas（ニッカーゼ）であることができる。Casは部分的に触媒不活性であることができる。触媒不活性Casは、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、およびCasRXからなる群より選択することができる。CasはdCas9であることができる。RHDCは、RuvC、HNH、RNase H、PIWI、またはそれらの組合せから選択されるタンパク質を含む。方法は調節ドメインポリペプチド（RDP）をさらに含むことができる。場合により、RDPは、Rad51、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、または、生殖細胞修復に関与するドメインであることができる。細胞は初代細胞または組換え細胞であることができる。細胞はヒト細胞または非ヒト細胞であることができる。
本明細書では、本方法によって編集された細胞を投与する工程を含む、それを必要とする対象において疾患を処置する方法が開示される。疾患は、心疾患、糖尿病、がん、神経学的疾患、免疫学的疾患、精神疾患、遺伝性疾患、またはそれらの組合せであることができる。場合により、疾患のレベルは、投与する工程の後に、約10％〜約50％低減する。
本明細書では、本方法によって編集された細胞を投与する工程を含む、それを必要とする対象において疾患を安定化する方法が開示される。疾患の安定化は、対象における疾患のレベルの5％未満の変化を含むことができる。
一態様において、本開示は、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物であって、RHDCポリペプチドが中温で核酸を切断し、ここで、核酸切断活性がガイドDNAによって方向付けられ、かつRHDCポリペプチドが核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている、ポリペプチド構築物を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、アルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含み、アルゴノートポリペプチドが中温で核酸を切断する、ポリペプチド構築物を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、細胞に、（a）RNase-H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド、（b）核酸巻き戻し因子、および（c）ガイドDNAを導入する工程を含み、ガイドDNAが、細胞中の標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的である配列を含み、核酸巻き戻し因子が標的配列の少なくとも一部分を巻き戻し、かつRHDCポリペプチドが中温で標的配列にゲノム破壊を導入する、ゲノム編集の方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、細胞に、（a）アルゴノートポリペプチド、（b）核酸巻き戻し因子、および（c）ガイドポリ核酸を導入する工程を含み、ガイドポリ核酸が、細胞中の標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的である配列を含み、核酸巻き戻し因子が標的配列の少なくとも一部分を巻き戻し、かつアルゴノートポリペプチドが中温で標的配列にゲノム破壊を導入する、ゲノム編集の方法を提供する。
いくつかの態様において、本方法は、細胞に外因性核酸配列を導入する工程をさらに含む。いくつかの態様において、外因性核酸配列はゲノム破壊部に導入される。いくつかの態様において、外因性核酸配列はランダムなゲノム位置に導入される。いくつかの態様において、外因性核酸配列は、非ウイルス性導入またはウイルス性導入によって導入される。いくつかの態様において、ウイルス性導入は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスを含む。いくつかの態様において、外因性核酸配列の非ウイルス性導入は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム、またはコンジュゲーションを含む。いくつかの態様において、外因性核酸配列はDNAまたはRNAである。いくつかの態様において、外因性核酸配列は一本鎖DNAまたは二本鎖DNAである。いくつかの態様において、外因性核酸配列は二本鎖DNAを含み、二本鎖DNAは、プラスミドDNAまたはミニサークルDNAを含む。いくつかの態様において、外因性核酸配列は外因性受容体をコードする。
いくつかの態様において、本方法は、導入する工程の前に、導入する工程と同時に、または導入する工程の後に細胞を刺激する工程を含む。いくつかの態様において、細胞は、導入する工程の前に刺激される。いくつかの態様において、細胞は、導入する工程の約1時間〜約48時間前に刺激される。いくつかの態様において、刺激は、細胞を、抗CD3抗体、抗CD28抗体、またはインターロイキンのうちの少なくとも1つと接触させる工程を含む。いくつかの態様において、導入する工程は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム、またはコンジュゲーションのうちの少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、導入する工程はエレクトロポレーションを含む。いくつかの態様において、エレクトロポレーションは、アルゴノートポリペプチド、核酸巻き戻し因子、誘導ポリ核酸、またはそれらの組合せを、約1ms〜約30msにわたる約1000V〜約2000Vの電圧で導入する工程を含む。いくつかの態様において、電圧は約1400Vで約10msにわたる。いくつかの態様において、エレクトロポレーションは約1パルス〜約5パルスを含む。いくつかの態様において、エレクトロポレーションは3パルスである。
いくつかの態様において、本方法は、細胞を拡大増殖させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、細胞のうちの1つまたは複数を選択する工程をさらに含む。いくつかの態様において、選択は、磁気分離、サイトメトリー分離、および/または抗生物質のうちの少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、選択は、細胞マーカーまたは外因性受容体を発現する細胞の集団を選択する工程を含む。いくつかの態様において、細胞マーカーは、CD3、CD4、CD8、CCR7、CD45RA、CD62L＋、CD27、CD28、およびIL-7Rαのうちの少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、本方法は密閉系で行われる。いくつかの態様において、本方法は、細胞で本方法を繰り返す工程をさらに含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、少なくとも1つのRHDCポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含む。いくつかの態様において、前記少なくとも1つのRHDCポリペプチドおよび核酸巻き戻しポリペプチドは中温生物に由来する。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、少なくとも1つのアルゴノートポリペプチドおよび核酸巻き戻しポリペプチドを含む。いくつかの態様において、前記少なくとも1つのアルゴノートポリペプチドおよび核酸巻き戻しポリペプチドは中温生物に由来する。
一態様において、本開示は、予め決められた遺伝子のターゲティングに使用するためのエクスビボシステムであって、システムが、RNase-H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻し因子とガイドDNA（gDNA）とを含み、gDNAが、遺伝子または遺伝子に隣接する核酸配列に結合し、かつRHDCポリペプチドが中温で核酸を切断し、核酸切断活性がガイドDNAによって方向付けられる、エクスビボシステムを提供する。
一態様において、本開示は、予め決められた遺伝子のターゲティングに使用するためのエクスビボシステムであって、システムがアルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻し因子とを含み、アルゴノートポリペプチドが中温で核酸を切断する、エクスビボシステムを提供する。
いくつかの態様において、エクスビボシステムは細胞をさらに含む。
いくつかの態様において、予め決められた遺伝子のターゲティングに使用するためのエクスビボシステムは、少なくとも1つのRHDCポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含む。いくつかの態様において、前記少なくとも1つのRHDCポリペプチドおよび核酸巻き戻しポリペプチドは中温生物に由来する。
いくつかの態様において、予め決められた遺伝子のターゲティングに使用するためのエクスビボシステムは、少なくとも1つのアルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含む。いくつかの態様において、前記少なくとも1つのアルゴノートポリペプチドおよび核酸巻き戻しポリペプチドは中温生物に由来する。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは約30℃〜約39℃で核酸を切断する。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは約35℃〜約39℃で核酸を切断する。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは37℃で核酸を切断する。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは5℃〜40℃でヌクレアーゼ活性を呈する。
いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドは約30℃〜約39℃で核酸を切断する。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドは約35℃〜約39℃で核酸を切断する。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドは、37℃で核酸を切断する。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドは、5℃〜40℃でヌクレアーゼ活性を呈する。
いくつかの態様において、中温生物は原核生物である。いくつかの態様において、中温生物は、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、ファーミキューテス門、シアノバクテリア門、スピロヘータ門、デイノコックス門、ベルコミクロビア門、プランクトミセス門、バルネオラ門、およびクロロフレクサス門からなる群より選択される科に由来する。いくつかの態様において、中温生物は、プロテオバクテリア門、アシドバクテリア門、アクチノバクテリア門、およびバクテロイデス門からなる群より選択される科に由来する。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは古細菌アルゴノートポリペプチドである。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドは古細菌アルゴノートポリペプチドである。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは、P-element induced WImpy testis（PIWI）遺伝子、RuvC、Cas、Sir2、Mrr、TIR、PLD、REase、制限エンドヌクレアーゼ、DExD/H、スーパーファミリーIIヘリカーゼ、RRXRR、DUF460、DUF3010、DUF429、DUF1092、COG5558、OrfB＿IS605、ペプチダーゼ＿A17、リボヌクレアーゼH様ドメイン、3'-5'エキソヌクレアーゼドメイン、3'-5'エキソリボヌクレアーゼRv2179c様ドメイン、バクテリオファージμ、トランスポザーゼ、DNA指向性DNAポリメラーゼ、ファミリーB、エキソヌクレアーゼドメイン、エキソヌクレアーゼ、RNase T/DNAポリメラーゼIII、yqgF遺伝子、HEPN、RNase LSドメイン、LsoA触媒ドメイン、KENドメイン、RNaseL、Ire1、RNaseドメイン、RloC、またはPrrCのうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされる。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは、防御、ストレス応答、CRISPRシステム、またはDNA修復に関与する遺伝子のうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされる。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドはアルゴノートドメインを含む。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドはヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドはヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ活性は二本鎖DNA切断活性である。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドはニッカーゼ活性を有する。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドはニッカーゼ活性を有する。いくつかの態様において、ニッカーゼ活性は一本鎖DNA切断活性である。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドはRNAse活性を有する。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドはRNase活性を有する。いくつかの態様において、RNase活性は二本鎖RNA切断活性である。いくつかの態様において、RNase活性はRNA切断活性である。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドはRNase-H活性を有する。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドはRNase-H活性を有する。いくつかの態様において、RNase-H活性はRNA切断活性である。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドはリコンビナーゼ活性を有する。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドはDNA塩基フリッピング活性を有する。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドはトランスポザーゼ活性を有する。
いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドは原核生物起源である。いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドは古細菌起源である。
いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドはヘリカーゼドメインを含む。いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドはトポイソメラーゼドメインを含む。いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドはCasタンパク質ドメインを含む。いくつかの態様において、Casタンパク質ドメインは、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、およびCas9HiFiからなる群より選択される。
いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドは触媒不活性核酸巻き戻しドメインを含む。いくつかの態様において、触媒不活性核酸巻き戻しドメインはdCasドメインである。いくつかの態様において、触媒不活性核酸巻き戻しドメインはdCas9ドメインである。
いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドはATPaseドメインを含む。いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドはATPase活性を有する。いくつかの態様において。
いくつかの態様において、ポリペプチド構築物はATPase活性を持つポリペプチドを含む。いくつかの態様において、エクスビボシステムは機能的ATPaseドメインを含む。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドは、リンカーによって接続される。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドは、リンカーによって接続される。いくつかの態様において、リンカーはポリペプチドリンカーである。
いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドとRHDCポリペプチドは同じフレームで発現される。いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチド配列とアルゴノートポリペプチドは同じフレームで発現される。
いくつかの態様において、ポリペプチド構築物はガイドDNAに結合する。いくつかの態様において、RNase-H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチド構築物とを含むポリペプチド構築物はガイドDNAに結合する。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドおよび核酸巻き戻し因子のうちの少なくとも一方はガイドDNAに結合する。
いくつかの態様において、ポリペプチド構築物はガイド核酸に結合する。いくつかの態様において、アルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物はガイド核酸に結合する。
いくつかの態様において、ガイドポリ核酸はガイドDNA（gDNA）である。いくつかの態様において、ガイドDNAは約1塩基対〜約30塩基対である。いくつかの態様において、ガイドDNAは二次構造を形成する。いくつかの態様において、ガイドDNAは標的ポリヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチド配列は遺伝子配列である。いくつかの態様において、遺伝子配列は疾患関連遺伝子の配列である。
いくつかの態様において、ガイド核酸はガイドRNA（gRNA）である。
いくつかの態様において、ガイドポリ核酸は約1塩基対〜約30塩基対である。いくつかの態様において、ガイドポリ核酸は二次構造を形成する。いくつかの態様において、ガイドポリ核酸は標的ポリヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチド配列は遺伝子配列である。いくつかの態様において、遺伝子配列は疾患関連遺伝子の配列である。いくつかの態様において、ポリペプチド構築物は、細胞に導入された場合に、破壊をもたらす。いくつかの態様において、本エクスビボシステムは、細胞に導入された場合に、破壊をもたらす。
いくつかの態様において、破壊は二本鎖切断または一本鎖切断を含む。いくつかの態様において、細胞は原核細胞である。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、真核細胞は植物細胞である。いくつかの態様において、真核細胞は動物細胞である。いくつかの態様において、動物細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、ヒト細胞は幹細胞である。いくつかの態様において、ヒト細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞はリンパ系細胞である。いくつかの態様において、リンパ系細胞はT細胞、B細胞、NK細胞、幹細胞、またはTILである。いくつかの態様において、細胞は初代細胞である。
いくつかの態様において、ポリペプチド構築物は、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（GMP）に適合する。いくつかの態様において、エクスビボシステムは医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（GMP）に適合する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示するポリペプチド構築物のうちのいずれか1つを含むエクスビボ細胞を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、RNase-H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物を含む、エクスビボ細胞であって、RHDCポリペプチドが中温で核酸を切断し、ここで、核酸切断活性がガイドDNAによって方向付けられ、かつRHDCポリペプチドが核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている、エクスビボ細胞を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、アルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物を含み、アルゴノートポリペプチドが中温で核酸を切断する、エクスビボ細胞を提供する。
いくつかの態様において、エクスビボ細胞は初代細胞である。いくつかの態様において、エクスビボ細胞は組換え細胞である。いくつかの態様において、エクスビボ細胞は原核細胞である。いくつかの態様において、エクスビボ細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、真核細胞は植物細胞である。いくつかの態様において、真核細胞は動物細胞である。いくつかの態様において、動物細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、ヒト細胞は幹細胞である。いくつかの態様において、ヒト細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞はリンパ系細胞である。いくつかの態様において、リンパ系細胞はT細胞、B細胞、NK細胞、幹細胞またはTILである。いくつかの態様において、細胞は初代細胞である。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示するポリペプチド構築物のうちのいずれか1つをコードするポリ核酸を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、RNase-H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物をコードする、ポリ核酸であって、RHDCポリペプチドが中温で核酸を切断し、ここで、核酸切断活性がガイドDNAによって方向付けられ、かつRHDCポリペプチドが核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている、ポリ核酸を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、アルゴノートポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物をコードし、アルゴノートポリペプチドが中温で核酸を切断する、ポリ核酸を提供する。
いくつかの態様において、RHDCポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドは同じリーディングフレームにある。
いくつかの態様において、ポリ核酸は核局在化シグナルをさらに含む。
いくつかの態様において、本開示は、（a）本明細書に開示するポリペプチド構築物のうちのいずれか1つまたは本明細書に開示するエクスビボシステムのうちのいずれか1つと、（b）賦形剤、希釈剤、または担体のうちの少なくとも1つとを含む、薬学的組成物を提供する。
いくつかの態様において、薬学的組成物は単位剤の形態である。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、錠剤、液剤、シロップ剤、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、皮下製剤、吸入可能呼吸器（inhalable respiratory）製剤、坐剤、およびそれらの任意の組合せの形態である。
いくつかの態様において、本開示は、（a）本明細書に開示するポリペプチド構築物のうちのいずれか1つまたは本明細書に開示するエクスビボシステムのうちのいずれか1つと、（b）その使用説明書とを含む、キットを提供する。
いくつかの態様において、キットは容器をさらに含む。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示する方法のいずれか1つで修飾された細胞の集団を投与する工程を含む、それを必要とする対象を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、サイトカイン、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗生物質、または顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）類似体のうちの少なくとも1つを投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、サイトカインはIL-2である。いくつかの態様において、がんは、投与する工程の後に、その必要がある対象において、CTスキャンによる測定で低減する。
いくつかの態様において、本開示は、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻し因子とガイド核酸とを含むエクスビボシステムであって、ガイド核酸が、予め決められた遺伝子または予め決められた遺伝子に隣接する核酸配列に結合し、RHDCポリペプチドが、予め決められた遺伝子に二本鎖切断を導入する能力を有し、核酸巻き戻し因子が、二本鎖切断を導入するためのエネルギー要求量を、RHDCポリペプチド単独で二本鎖切断を導入する場合と比較して低下させ、かつエクスビボシステムが19℃〜40℃の温度範囲において二本鎖切断を導入する、エクスビボシステムを提供する。いくつかの態様において、エクスビボシステムは調節ドメインポリペプチド（RDP）をさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻し因子とガイド核酸と調節ドメインポリペプチド（RDP）とを含むエクスビボシステムであって、ガイド核酸が、予め決められた遺伝子または予め決められた遺伝子に隣接する核酸配列に結合し、RHDCポリペプチドが、予め決められた遺伝子に二本鎖切断を導入する能力を有し、核酸巻き戻し因子が、二本鎖切断を導入するためのエネルギー要求量を、RHDC単独で二本鎖切断を導入する場合と比較して低下させ、かつエクスビボシステムが19℃〜40℃の温度範囲において二本鎖切断を導入する、エクスビボシステムが提供される。いくつかの態様において、核酸巻き戻し因子はポリペプチドである。いくつかの態様において、RHDCポリペプチド、核酸巻き戻し因子およびRDPは、ポリペプチド構築物である。場合により、RDPはRad51ポリペプチドまたはリコンビナーゼである。場合により、ガイド核酸はガイドDNAである。場合により、エクスビボシステムは、予め決められた遺伝子に、該核酸巻き戻し因子を使用しない相当するエクスビボシステムよりも25％、50％、または75％高い効率で、二本鎖切断を導入する。場合により、エクスビボシステムは予め決められた遺伝子に25％、50％、または75％の効率で第1Dループを導入し、該予め決められた核酸配列に25％、50％、または75％の効率で第2Dループを導入する。場合により、RHDCポリペプチドはアルゴノートポリペプチドである。場合により、アルゴノートは、MjAgo、TtAgo、HlaAgo、DmcAgo、MsAgo、TsAgo、およびPfAgoからなる群より選択される。
いくつかの態様において、本明細書では、エクスビボシステムを含む細胞が提供される。
いくつかの態様において、本明細書では、エクスビボシステムを含む組成物が提供される。
いくつかの態様において、本明細書では、RNAse H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと調節ドメインポリペプチド（RDP）とを含むポリペプチド構築物が提供される。場合により、ポリペプチド構築物は核酸巻き戻しドメインをさらに含む。場合により、核酸巻き戻しドメインはdCas9ドメインである。場合により、ポリペプチド構築物は調節ドメインポリペプチド（RDP）をさらに含む。場合により、RDPはRad51ポリペプチドまたはリコンビナーゼである。
本明細書では、ポリペプチド構築物を含む細胞が提供される。
本明細書では、ポリペプチド構築物を含む組成物が提供される。
本明細書では、細胞を核酸編集システムと接触させる工程を含む、核酸編集システムに付随するエネルギー要求量を低減するための方法であって、核酸編集システムがRNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻し因子とガイド核酸と調節ドメインポリペプチド（RDP）とを含み、該核酸編集システムによる核酸編集に要求されるエネルギーが、RDPを使用しない相当する核酸編集システムよりも少ない、方法が提供される。
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドと任意の調節ドメインポリペプチド（RDP）とを含む遺伝子編集集合分子（Assembled Genetic Editing Molecule:AGEM）であって、RHDCポリペプチドが中温で核酸を切断し、ここで、核酸切断活性がガイド核酸によって方向付けられ、かつRHDCポリペプチドが核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている、遺伝子編集集合分子が提供される。場合により、RHDCポリペプチドはアルゴノートポリペプチドである。場合により、アルゴノートは、MjAgo、TtAgo、HlaAgo、DmcAgo、MsAgo、TsAgo、およびPfAgoからなる群より選択される。場合により、RHDCポリペプチドはSEQ ID NO:59〜160からなる群より選択される配列を含む。場合により、RDPはRad51ポリペプチドまたはリコンビナーゼである。場合により、核酸巻き戻しポリペプチドはdCas9ドメインを含む。
本発明の新規な特徴については、添付の特許請求の範囲に具体的に示す。本発明の特徴および利点は、本発明の原理が用いられている例示的態様を示す以下の詳細な説明と添付の図面とを参照することによって、より良く理解されるであろう。
アルゴノートタンパク質の完全ゲノムにおけるPIWIドメインに関する系統樹を表す。この系統樹では、適切なヌクレアーゼドメインまたはヘリカーゼドメインを同定するために使用することができる生物中の考えうるPIWIドメインが同定される。 PIWIドメイン同定に基づくヌクレアーゼ同定のためのマイニング戦略を表す。 PIWIスーパーファミリータンパク質の特徴を表し、これには、C末端がPIWIドメインを含有しうることおよびC末端がヌクレアーゼ間で保存されうることが含まれる。点線は、同じ予測オペロン中に位置する別々の遺伝子を示している。 系統樹を表す。右側は予測構造アラインメント間の相同性である。左から右に向かってタンパク質の位置0から末端である。黒色のボックスは保存されたドメインである。 C末端構造アラインメントを表す。赤色はマッチするαヘリックスであり、青色はβシートである。図5は表示順にそれぞれSEQ ID NO:385〜406を開示している。 近傍にヘリカーゼを持つアルゴノート遺伝子の系統樹を表す。青色はアルゴノート遺伝子が中温生物由来であることを示し、赤色はアルゴノート遺伝子が好熱生物由来であることを示す。 図7A〜7Dはアルゴノートタンパク質の系統樹を表す。青色はアルゴノートタンパク質が中温生物由来であることを示し、赤色はアルゴノートタンパク質が好熱生物由来であることを示す。 図8A〜8Dは系統樹を表す。右側は予測構造アラインメント間の相同性である。左から右に向かってタンパク質の位置0から末端である。黒色のボックスは保存されたドメインである。 機能獲得型遺伝子編集レポーターシステムの概略を表す。 レポーター細胞株HEK293T QMS（CMVS-CuO luc-p2A-GFP、EF1α-cymR）を生成するためにHEK 293Tに組み込まれたレンチウイルスプラスミドのマップである。 SpCas9およびsgCymR発現プラスミドpX459-sgCymR-94のマップである。 RDP-相同組換え修復増強の概略を表す。注:人工ゲノムエディター分子（aGEM）。 図13Aは、アルゴノート（SEQ ID NO:190）の溶解条件1のクーマシーブルー染色ゲルを表す。図13Bは、アルゴノート（SEQ ID NO:190）の溶解条件2のクーマシーブルー染色ゲルを表す。図13Cは、アルゴノート（SEQ ID NO:190）の溶解条件3のクーマシーブルー染色ゲルを表す。図13Dは、アルゴノート（SEQ ID NO:190）の溶解条件4のクーマシーブルー染色ゲルを表す。図13Eは、アルゴノート（SEQ ID NO:190）の溶解条件5のクーマシーブルー染色ゲルを表す。図13Fは、アルゴノート（SEQ ID NO:190）の溶解条件6のクーマシーブルー染色ゲルを表す。 図14Aは、アルゴノート（SEQ ID NO:190）を表25のsgDNA（D1、D2、または非ターゲティングsgDNA（NT））と一緒に異なるNaCl濃度下で用いるssDNA切断（cleavage）アッセイ法のSYBR Gold染色ssDNAゲルを表す。図14Bは、超音波処理アルゴノート（SEQ ID NO:190）を表25のsgDNA（D1、D2またはNT）と一緒に異なるNaCl濃度下で用いるssDNA切断アッセイ法のSYBR Gold染色ssDNAゲルを表す。図14Cは、超音波処理アルゴノート（SEQ ID NO:190）を表25のsgDNA（D1、D2、R1、R2、またはNT）と一緒に250mMのNaCl濃度で用いるssDNA切断アッセイ法のSYBR Gold染色ssDNAゲルを表す。図14Dは、超音波処理アルゴノート（SEQ ID NO:190）を表25のsgDNA（D1、D2、R1、R2、またはNT）と一緒に、95℃の加熱工程を含む異なる処理条件下で用いる、ssDNA切断アッセイ法のSYBR Gold染色ssDNAゲルを表す。 図15AはBSAのタンパク質定量標準曲線を表す。図15BはArgo＃4、Argo＃7、Argo＃8、Argo＃9、およびArgo＃10のタンパク質定量を表す。図15CはArgo＃16、Argo＃17、Argo＃19、Argo＃20、およびArgo＃21のタンパク質定量を表す。図15DはArgo＃23、Argo＃25、Argo＃26、Argo＃27、およびArgo＃29のタンパク質定量を表す。図15EはArgo＃29、Argo＃30、Argo＃41、Argo＃63、および空対照のタンパク質定量を表す。 Argo＃41、＃17、および＃30を用いるssDNA切断アッセイ法の結果を表す。 dsDNA/ssDNA切断アッセイ法の概略を表す。 6808細胞アッセイ法の概略を表す。 はDNAカッティング/ニッキングアッセイ法のためのスプリット蛍光レポーターの考えうる構成の一例を表す。この構成に対するガイドDNA 6819、6821、sg＿02、sg＿03、sg＿01の位置も含まれている。 DNAカッティング/ニッキングアッセイ法のためのスプリット蛍光レポーターの考えうる構成の一例を表す。この構成に対するガイドDNA 6819、6821、sg＿02、sg＿03、sg＿01の位置も含まれている。 DNAカッティング/ニッキングアッセイ法のためのスプリット蛍光レポーターの考えうる構成の一例を表す。この構成に対するガイドDNA 6819、6821、sg＿02、sg＿03、sg＿01の位置も含まれている。 図22AはHEK293T細胞を使って行われた陰性対照実験を表す。図22Bは6808細胞を使って行われた陰性対照実験を表す。図22Cは6808細胞およびCas9を使って行われた陰性対照実験を表す。図22Dは、6808細胞、Cas9、および非ターゲティングガイドRNAを使って行われた陰性対照実験を表す。図22Eは、6808細胞、Cas9、非ターゲティングガイドRNA、および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナーを使って行われた陰性対照実験を表す。図22Fは、6808細胞、Cas9、非ターゲティングガイドRNA、および別の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナーを使って行われた陰性対照実験を表す。図22Gは、6808細胞、Cas9n、および非ターゲティングガイドRNAを使って行われた陰性対照実験を表す。図22Hは、6808細胞、Cas9、非ターゲティングガイドRNA、および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナーを使って行われた陰性対照実験を表す。図22Iは、6808細胞、nCas9、非ターゲティングガイドRNA、および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナーを使って行われた陰性対照実験を表す。図22Jは、6808細胞および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナーを使って行われた陰性対照実験を表す図22Kは6808細胞および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナーを使って行われた陰性対照実験を表す。 6808細胞、Cas9、および94＿リンカーを標的とするガイドRNAを使って行われた陽性対照実験を表す。 、6808細胞、nCas9、および94＿リンカーを標的とするガイドRNAを使って行われた陽性対照実験を表す。 図25Aは、6808細胞、nCas9、94＿リンカーを標的とするガイドRNA、および一本鎖オリゴヌクレオチドドナーを使って行われた陽性対照実験を表す。図25Bは、6808細胞、nCas9、94＿リンカーを標的とするガイドR、NAおよび別の一本鎖オリゴヌクレオチドドナーを使って行われた陽性対照実験を表す。 図26Aは、表22のトランケート型誘導ポリ核酸を用いたssDNA切断アッセイ法のクーマシーブルー染色ゲルを表す。図26Bは、表22のトランケート型誘導ポリ核酸を用いたssDNA切断アッセイ法のSYBR Gold染色ssDNAゲルを表す。D1＊は、D1が5'リン酸化されていないことを表す。 図27Aは、無処理の6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を表す。図27Bは、Cas9n、非ターゲティングガイドRNA、およびssODN＿4ドナーで処理した6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を表す。 nCas9およびsgRNA6821で処理した6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を表す。 nCas9、sgRNA6821、およびssODN＿4ドナーで処理した6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を表す。 Cas9およびsgRNA6825で処理した6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を表す。 Cas9、sgRNA6825、およびssODN＿4ドナーで処理した6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を表す。 図32Aおよび図32Bは、それぞれ38種類および44種類の異なるAgoタンパク質に関するスプリット蛍光6808細胞アッセイ法の結果を表す。 遺伝熱力学の第1法則を表し、本明細書において提供されるAGEMシステム（発熱）と他の遺伝子編集システム（吸熱）とを比較している。 人工ゲノムエディター分子（aGEM）の構造の例示的概略を表す。aGEMは、RNase-H様ドメイン含有タンパク質、核酸巻き戻し因子、および調節ドメイン因子を含有する。 DNAカッティング/ニッキングアッセイ法のためのスプリット蛍光レポーターの考えうる構成の一例を表す。この構成に対するガイドDNA 6825の位置も含まれている。
発明の詳細な説明
以下の説明および実施例により、本発明の態様を詳しく説明する。本発明は本明細書に記載される特定の態様に限定されず、したがってさまざまでありうると理解すべきである。本発明には、本発明の範囲に包含される数多くの変形態様および変更態様があることは、当業者にはわかるであろう。
定義
基準数値およびそれと文法的に等価な物に関して「約」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合には、その値から±10％の値の範囲を包含しうる。例えば「約10」という量は9〜11の量を包含する。基準数値に関して「約」という用語は、その値から±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、または±1％の値の範囲も包含しうる。
「活性化」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、細胞が休止状態から活性状態に遷移するプロセスを指しうる。このプロセスは、抗原への応答、遊走、および/または機能的に活性な状態への表現型変化もしくは遺伝子変化を含みうる。例えば「活性化」という用語はT細胞活性化の段階的プロセスを指しうる。例えばT細胞は、完全な活性化状態になるために、少なくとも2つのシグナルを要求しうる。第1シグナルは抗原-MHC複合体によるTCRのエンゲージメント後に生じうる。また、第2シグナルは共刺激分子のエンゲージメントによって生じうる。インビトロで、抗CD3は第1シグナルを模倣することができ、抗CD28は第2シグナルを模倣することができる。
「隣接」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、基準物のすぐ隣を指しうる。例えば、ヌクレオチド配列との関連において隣接するという用語は、その間にいかなるヌクレオチドも存在しないことを意味しうる。例えばポリヌクレオチドBに隣接するポリヌクレオチドAとは、AとBの間にいかなるヌクレオチドも存在しないABを意味しうる。
「アルゴノート」、「Ago」、およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、誘導ポリ核酸によって、その誘導ポリ核酸に相補的な配列を含む標的核酸を特異的に認識するように誘導されうる、天然のまたは操作されたドメインまたはタンパク質を指しうる。いくつかのAgoドメインまたはAgoタンパク質は、本明細書において「アルゴノートヌクレアーゼ」とも呼ばれ、エンドヌクレアーゼ活性を、例えば標的核酸中の内部ホスホジエステル結合を切断する能力を有する。いくつかのAgoタンパク質は標的核酸を切断しないと考えられる。
「自家」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、同じ存在物に由来することを指しうる。例えば、試料（例えば細胞）を取り出し、処理し、その後、同対象（例えば対象）に戻すことができる。自家プロセスは、ドナーとレシピエントとが異なる対象である同種異系間プロセスとは区別される。
「がん」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、調節されない成長、分化の欠如、局所的組織浸潤、および/または転移をもたらす特有の形質を持つ、つまり正常な制御の喪失を持つ細胞の過剰増殖を指しうる。本発明の方法に関して、がんは、任意のがん、例えば急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢もしくは胸膜のがん、鼻、鼻腔もしくは中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、大腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝がん、肺がん、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網および腸管膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、固形腫瘍、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、ならびに/または膀胱がんのうちのいずれかでありうる。本明細書において使用される場合、「腫瘍」という用語は、細胞または組織の、例えば悪性型または良性型の、異常な成長を指す。
「がんネオ抗原」または「ネオ抗原」または「ネオエピトープ」およびそれらと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、正常な非がん性宿主組織では発現せずかつ/または免疫監視機構に露出されていない抗原を指しうる。例えば、「ネオ抗原」は正常な非変異型宿主ゲノムにはコードされていない場合がある。「ネオ抗原」は、場合によっては、発癌性ウイルスタンパク質であるか、または体細胞変異の結果として生じる異常タンパク質でありうる。例えば、ネオ抗原は、ウイルスタンパク質の活性による細胞機構の破壊によって生じうる。別の例として、場合によっては体細胞変異につながりうる発癌性化合物のばく露を挙げることができる。この体細胞変異は最終的には腫瘍/がんの形成につながりうる。
本明細書において使用される「細胞毒性」という用語は、細胞の正常な状態が、その細胞が死ぬように改変されることを指す。細胞の正常な状態とは、細胞が細胞毒性組成物、細胞毒性因子、および/または細胞毒性条件にばく露される前に示されているまたは存在する状態を指しうる。一般に、正常な状態にある細胞は、ホメオスタシスの状態にある細胞である。細胞の正常な状態の意図しないまたは望ましくない改変は、例えば細胞死（例えばプログラム細胞死）、複製能力の低下、膜の完全性などといった細胞の完全性の低下、代謝活性の低下、発生能の低下、または本願において開示する細胞毒性効果のいずれかの形態で顕在化されうる。細胞毒性は、例えば腫瘍細胞細胞毒性のように、望ましい場合もあるし、例えば健常細胞細胞毒性のように、望ましくない場合もある。
「細胞毒性を低減すること」または「細胞毒性を低減する」という表現は、細胞毒性組成物、細胞毒性因子、および/または細胞毒性条件へのばく露時に起きる細胞の正常な状態の意図しないまたは望ましくない改変の程度または頻度の低減を指す。この表現は、細胞毒性組成物、細胞毒性因子、および/または細胞毒性条件にばく露された個々の細胞における細胞毒性の程度を低減すること、または細胞の集団を細胞毒性組成物、細胞毒性因子、および/もしくは細胞毒性条件にばく露した時に、その集団のうち、細胞毒性を呈する細胞の数を低減することを指しうる。
「操作された」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、核酸の、例えば生物のゲノム内の核酸の、1つまたは複数の改変を指しうる。「操作された」という用語は、遺伝子の改変、付加、および/または欠失を指しうる。操作された細胞とは、遺伝子が付加され、欠失し、かつ/または改変されている細胞も指しうる。
「細胞」または「操作された細胞」という用語およびそれらと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、ヒト起源または非ヒト動物起源の細胞を指しうる。
「チェックポイント遺伝子」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、免疫応答の大きさを調節するように作用する阻害プロセス（例えばフィードバックループ）、例えば有害な応答の無抑制な蔓延を緩和する免疫阻害フィードバックループに関与する任意の遺伝子を指しうる。これらの応答は、感染に対する免疫応答中に生じうる付随的組織損傷から保護する分子シールドおよび/または末梢性自己寛容の維持の一因となることを含みうる。チェックポイント遺伝子の非限定的な例として、拡張されたCD28受容体ファミリーのメンバーおよびそれらのリガンドならびに共阻害経路に関与する遺伝子（例えばCTLA-4およびPD-1）が挙げられる。「チェックポイント遺伝子」という用語は、免疫チェックポイント遺伝子も指しうる。
「CRISPR」、「CRISPRシステム」、または「CRISPRヌクレアーゼシステム」およびそれらと文法的に等価な物は、DNAとヌクレアーゼ機能（例えば2つのヌクレアーゼドメイン）を持つCasタンパク質（例えばCas9）とに結合するRNA分子（例えばガイドRNA）を含みうる。例えばSander,J.D.,et al.「CRISPR-Cas systems for editing,regulating and targeting genomes」Nature Biotechnology,32:347-355（2014）を参照されたい。また、例えばHsu,P.D.,et al.,「Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering」Cell 157（6）:1262-1278（2014）も参照されたい。いくつかの態様において、CRISPRシステムは、ニッカーゼ機能（例えば1つの触媒不活性ヌクレアーゼドメインと1つの触媒活性ヌクレアーゼドメイン）を持つCasタンパク質を含む。Casは部分的に触媒不活性であることができる。
「破壊する」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、例えば欠失、挿入、変異導入、再配列、またはそれらの任意の組合せによって、遺伝子を改変するプロセスを指しうる。例えば遺伝子はノックアウトによって破壊されうる。遺伝子の破壊は、例えば、その遺伝子の発現を部分的または完全に抑制しうる。遺伝子の破壊は、異なる遺伝子、例えば下流遺伝子の活性化を引き起こす場合もある。
「操作された」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、核酸の、例えば生物のゲノム内の核酸の、1つまたは複数の改変を指しうる。「操作された」という用語は、遺伝子の改変、付加および/または欠失を指しうる。操作された細胞とは、遺伝子が付加され、欠失しかつ/または改変されている細胞も指しうる。
「機能」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、意図した目的を達成し、有し、または果たす能力を指しうる。機能的は、正常機能のベースラインから100％までの任意のパーセントを含みうる。例えば機能的は、正常機能の約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、および/または約100％を含みうるまたは含む。場合により、機能的という用語は、正常機能の100％超または約100％超、例えば正常機能の125、150、175、200、250、300％、および/またはそれ以上を意味しうる。
「遺伝子編集」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、1つまたは複数のヌクレオチドが挿入され、置換され、またはゲノムから除去される遺伝子操作を指しうる。遺伝子編集は、ヌクレアーゼ（例えば天然のヌクレアーゼまたは人工的に操作されたヌクレアーゼ）を使って行うことができる。
「医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準」（GMP）およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、FDAに従って安全であるか、有効であるか、または純粋である、製品を指しうる。GMPは「cGMP」と呼ばれる場合もある。この「c」は「現行（current）」を意味する。製品の製造では、GMP製品の規制に適合させるために、最新の技術およびシステムを使用することができる。GMP適合製品は、通例、研究の場ではなく、臨床の場で用いられる。
「変異導入」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドにおける1つまたは複数のヌクレオチドの置換、検出および挿入を包含しうる。例えば、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチド配列において、最大1、最大2、最大3、最大4、最大5、最大6、最大7、最大8、最大9、最大10、最大11、最大12、最大13、最大14、最大15、最大20、最大25、最大30、最大40、最大50個、またはそれ以上のヌクレオチド/アミノ酸を、置換し、欠失させ、かつ/または挿入することができる。変異導入は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を及ぼしうる。変異導入は、ゲノム配列の構造またはコードされているmRNAの構造/安定性にも影響を及ぼしうる。
「非ヒト動物」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、非ヒト哺乳動物を含むヒト以外のあらゆる動物種を包含することができ、これは、ネイティブの動物または遺伝子修飾された非ヒト動物であることができる。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、および「オリゴヌクレオチド」ならびにそれらと文法的に等価な用語は、可換的に使用することができ、線状または環状コンフォメーションの、および一本鎖型または二本鎖型の、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指しうる。本開示に関して、これらの用語は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、長さに関する限定と解釈すべきでない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの類似体、ならびに塩基部分、糖部分および/またはリン酸部分が修飾されているヌクレオチド（例えばホスホロチオエート主鎖）も包含しうる。これらの用語の修飾は、脱メチル化、CpGメチル化の付加、細菌メチル化の除去および/または哺乳動物メチル化の付加も包含しうる。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有しうる。例えばAの類似体はTと塩基対合することができる。
「構築物」という用語は、人工構築物または合成構築物を指しうる。例えばポリペプチド構築物は、例えば1つまたは複数のポリペプチド配列を含む、人工ポリペプチドまたは合成ポリペプチドを指しうる。また、核酸構築物は、例えば1つまたは複数の核酸配列を含む、人工核酸または合成核酸を指しうる。
「同一性パーセント（％）」という用語は、核酸またはアミノ酸配列について、配列の全長またはそのフラグメントにおいて、容易に決定することができる。一般に、2つの異なる配列（例えばヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）の間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「アラインメントされた」配列に関して判定される。「アラインメントされた」配列または「アラインメント」とは、基準配列と比較して欠けているまたは追加されている塩基またはアミノ酸に関して補正が加えられている場合が多い、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。
「末梢血リンパ球」（PBL）という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、血液（例えば末梢血）中を循環するリンパ球を指しうる。末梢血リンパ球は臓器に局在化していないリンパ球を指しうる。末梢血リンパ球は、T細胞、NK細胞、B細胞、またはそれらの任意の組合せを含みうる。
「表現型」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、ある生物の観察可能な特徴または形質の複合物、例えばその形態、発生、生化学的もしくは生理学的性質、フェノロジー、行動、および/または行動の産物を指しうる。文脈によって、「表現型」という用語は、ある集団の観察可能な特徴または形質の複合物を指す場合もある。
「プロトスペーサー」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、ガイドRNAの一部分、例えばガイドRNAのスペーサー配列または操作されたターゲティング部分にハイブリダイズする能力を有する、PAM隣接核酸配列を指しうる。プロトスペーサーは、ガイドRNAによって標的とされる遺伝子、ゲノムまたは染色体のヌクレオチド配列でありうる。ネイティブ状態において、プロトスペーサーはPAM（プロトスペーサー隣接モチーフ）に隣接している。RNA誘導型ヌクレアーゼによる切断部位はプロトスペーサー配列内にある。例えばガイドRNAが特異的プロトスペーサーを標的とする場合、Casタンパク質は、プロトスペーサー配列内に二本鎖切断を生成し、それによってプロトスペーサーを切断する。切断に続いて、プロトスペーサーの破壊が、非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え修復（HDR）によって起こりうる。プロトスペーサーの破壊はプロトスペーサーの欠失をもたらしうる。上記に加えて、または上記に代えて、プロトスペーサーの破壊は、外因性核酸配列のプロトスペーサーへの挿入、または外因性核酸配列によるプロトスペーサーの置き換えをもたらしうる。
「レシピエント」という用語およびそれらと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、ヒトまたは非ヒト動物を指しうる。レシピエントは、それを必要としている場合もある。
「組換え」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、2つのポリ核酸の間で遺伝情報が交換されるプロセスを指しうる。この開示に関して、「相同組換え」または「HR」は、例えば二本鎖切断の修復中などに起こりうるそのような遺伝子交換の特殊な形態を指しうる。このプロセスは、標的分子（例えば二本鎖切断を起こした分子）のテンプレート修復のために、例えばドナー分子を使ったヌクレオチド配列相同性を必要としうる。またこのプロセスは、非交叉遺伝子変換またはショートトラクト遺伝子変換として知られる場合もある。そのような移行は、破壊された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ修正、および/またはドナーが標的の一部となりうる遺伝情報を再合成するために使用されうる合成依存性鎖アニーリング、および/または関連プロセスも伴いうる。そのような特殊なHRは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に組み込まれうるような標的分子の改変をもたらしうる。場合により、「組換えアーム」および「相同性アーム」という用語は、可換的に使用することができる。
「RNase-H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド」という用語およびそれらと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、構造上および/または機能上の特徴を共有しているポリペプチドを指しうる。RHDCをRNase-H様ドメイン含有タンパク質と言う場合もある。一定の態様において、RHDCポリペプチドは、RNase-Hの構造と類似する構造上の特徴、例えば次に挙げるようなβストランドおよびαヘリックスの二次構造を有する:β1-β2-β3-α1-β4-α2-β5-（α3）-α4、ここでα3は任意選択である。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは、RHDCポリペプチドが中温生物に由来しうるという事実から明らかなように、例えば約19℃〜40℃で核酸切断活性を有する。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは例えば約19℃〜40℃で核酸切断活性を有する。いくつかの態様において、「中温生物に由来する」とは、中温生物に見出されるという特徴を指しうる。場合により、中温生物に由来しうる特徴は、α3を任意選択としてβ1-β2-β3-α1-β4-α2-β5-（α3）-α4というドメイン構成を共有しうると共に、中温生物に見出されるRHDCポリペプチドに対して少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の配列同一性も有する。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは核酸切断活性を有するか、核酸切断活性を助ける。
「トランスジーン」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、生物に移入される遺伝子または遺伝物質を指しうる。例えばトランスジーンは、生物に導入される遺伝子を含有するDNAのストレッチまたはセグメントであることができる。トランスジーンが生物に移入されると、その生物はトランスジェニック生物と呼ばれる。トランスジーンは、RNAまたはポリペプチド（例えばタンパク質）を生産するその能力をトランスジェニック生物において保ちうる。トランスジーンは異なる核酸、例えばRNAまたはDNAで構成されうる。トランスジーンは操作されたT細胞受容体をコードすることができる（例えばTCRトランスジーン）。トランスジーンはTCR配列であることができる。トランスジーンは受容体であることができる。トランスジーンは組換えアームを含むことができる。トランスジーンは操作された部位を含むことができる。
「治療効果」は、処置される状態に変化があれば、生じうる。変化は正または負であることができる。例えば「正の効果」は対象における活性化T細胞数の増加に対応しうる。別の一例において、「負の効果」は対象における腫瘍の量またはサイズの減少に対応しうる。少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは100％の改良があれば、処置される状態の「変化」がある。変化は、個体における処置される状態の重症度の改良に基づくか、本発明の組成物が組み合わせて投与される治療組成物による処置の有無に伴う個体の集団における改良された状態の頻度の相違に基づきうる。また、本開示の方法は、「治療的に有効」な細胞量を対象に投与する工程を含みうる。「治療的に有効」という用語は「治療効果を有する」に対応する定義を有すると理解すべきである。
「配列」という用語およびそれと文法的に等価な用語は、本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列を指すことができ、それはDNAまたはRNAであることができ、線状、環状、または分枝状であることができ、一本鎖または二本鎖のいずれかであることができる。配列は変異させることができる。配列は、任意の長さ、例えば2〜1,000,000ヌクレオチド長またはそれ以上（またはそれらの間もしくはそれらを上回る任意の整数）、例えば約100〜約10,000ヌクレオチドまたは約200〜約500ヌクレオチドであることができる。
概要
本開示は、RHDCポリペプチドと核酸巻き戻し因子とを含むシステムを使って標的核酸を修飾するための方法、システム、組成物、およびキットを提供する。本明細書に記載するシステムは、例えばヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、およびATPaseを含むことができる。これらのシステムにより、例えばヒト細胞における遺伝子編集に資する温度における活性の欠如などといった、RHDCタンパク質に付随する技術的課題が克服される。本明細書に記載する方法、システム、組成物、およびキットは、核酸巻き戻し因子と組み合わされたRHDCポリペプチドを提供することによって、この生理学的に適切な遺伝子編集を可能にする。理論に束縛されることは望まないが、この組合せでは、RHDCポリペプチドが露出した領域において切断を行うことができるように、核酸巻き戻し因子が核酸配列を露出させるので、RHDCタンパク質が単独で一本鎖または二本鎖核酸切断を誘導するのを妨げる、RHDCタンパク質が直面するエネルギー障壁が、克服される。いくつかの態様において、RHDCは、例えば中温生物由来のアルゴノートタンパク質である。いくつかの態様において、核酸巻き戻し因子はヘリカーゼまたはトポイソメラーゼである。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドと核酸巻き戻し因子は融合タンパク質として提供される。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドと核酸巻き戻し因子は、それらが融合タンパク質として存在することなく、核酸上に共局在化するように提供される。本開示は、DNA修復のバイオエネルギー効率のための、代用（proxy）としてのバイオインフォマティック共局在も提供する。場合により、生理学的修復はエネルギー効率がよく、自然状態である。いくつかの局面において、二本鎖切断の病的不全はエネルギー効率が悪く、疾患状態である。
遺伝子操作のためのヌクレアーゼシステム
細胞内ゲノム移植は、治療的応用のために細胞および核酸を遺伝子修飾する方法になりうる。本明細書では、交換可能なパーツを含有する遺伝子編集システムが提供されうる。例えば、遺伝子編集システムのあるモジュールは、他のモジュールの機能に影響を及ぼすことなく、置き換えることができる。本明細書において提供されるモジュラー遺伝子編集システムは、遺伝子編集効率の増進（dialing-up）および減退（dialing-down）ならびに/またはある特定ゲノム切断修復方法への傾斜を可能にするように調整可能でありうる。本明細書では、対象（例えば哺乳動物、非哺乳動物、または植物）におけるゲノム配列を破壊するための組成物、構築物、システム、および方法も提供される。また本発明では、関心対象のゲノム座位中の標的配列における欠陥が引き起こす状態の処置または阻害を必要とする対象（例えば哺乳動物またはヒト）または非ヒト対象（例えば哺乳動物）において、関心対象のゲノム座位中の標的配列における欠陥が引き起こす状態を処置または阻害する組成物、構築物、システム、および方法も提供される。場合により、方法は、標的配列の操作によって対象または非ヒト対象を修飾する工程を含むことができ、その場合、状態は、標的配列の操作による処置または阻害に感受性でありうる。
本明細書では、有利な熱力学でゲノム改変を行うRNase-H様ドメイン含有タンパク質を用いてシステムをゲノム編集する方法も開示される。ゲノム改変は発熱性でありうる。ゲノム改変は吸熱性でありうる。場合により、開示のシステムを用いるゲノム改変は、他の遺伝子編集システムよりもエネルギー的に有利でありうる。RNase-H様ドメイン含有タンパク質システムは、生化学的システムによって測定すると、例えば一定量のATPを反応に提供し、ゲノム改変が起こる前、ゲノム改変が起こっている間およびゲノム改変が起こった後に遺伝子編集の量を測定することなどによって測定すると、熱力学的により有利でありうる。場合により、RNase-H様ドメイン含有タンパク質を用いる本開示の編集システムは、RNase-H様ドメイン含有タンパク質を使用しないシステムと比較して、エネルギー要求量を約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、約25％、約40％、約50％、または最大約60％低減することができる。場合により、RNase-H様ドメイン含有タンパク質を用いる本開示の編集システムは、本開示のRNase-H様ドメイン含有タンパク質を使用しないシステムと比較して、RNase-H様ドメイン含有タンパク質に対する免疫応答を約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、約25％、約40％、約50％、または最大約60％低減することができる。場合により、RNase-H様ドメイン含有タンパク質は、免疫応答の誘発を防止するために人体に内在性に存在する細菌から回収することができる。
場合により、破壊または修飾されうるゲノムは、真核生物（ヒトを含む哺乳動物を含む）または非ヒト真核生物または非ヒト動物または非ヒト哺乳動物であることができる生物または対象に由来しうる。場合により、生物または対象は非ヒト動物であることができ、節足動物、例えば昆虫であってもよく、または線虫であってもよい。場合により、生物または対象は植物でありうる。場合により、生物または対象は哺乳動物または非ヒト哺乳動物でありうる。非ヒト哺乳動物は、例えば齧歯類（好ましくはマウスまたはラット）、有蹄類または霊長類であってもよい。いくつかの本発明方法において、生物または対象は微細藻類を含む藻類であるか、または菌類である。場合により、対象はヒトでありうる。ヒト対象は成人対象または小児対象でありうる。小児対象は18歳未満でありうる。成人対象は約18歳または18歳超でありうる。
核酸切断活性を持つタンパク質（例えばヌクレアーゼ）は、核酸中のヌクレオチドの鎖を、より小さな単位へと切断する酵素であることができる。核酸切断活性を持つタンパク質は真核生物または原核生物に由来しうる。核酸切断活性を持つタンパク質は真核生物に由来しうる。核酸切断活性を持つタンパク質は原核生物に由来しうる。場合により、核酸切断活性を持つタンパク質は古細菌に由来しうる。
場合により、核酸切断活性を持つタンパク質はRNase-H様ドメイン含有タンパク質でありうる。場合により、ヌクレアーゼは、RNase-HまたはRNase-H様ドメイン含有タンパク質に類似する二次構造を有するタンパク質でありうる。RNase-Hは、トランスポザーゼ、レトロウイルスインテグラーゼ、ホリデイジャンクションリゾルバー、およびRISCヌクレアーゼであるアルゴノートを含みうるヌクレオチジルトランスフェラーゼスーパーファミリーに属しうる。場合により、RNase-HまたはRNase-H様ドメイン含有タンパク質は、一般的特徴として、2金属イオン触媒作用（two-metal-ion catalysis）を用いうる。ヌクレアーゼでは、2つの金属イオンが非対称的に配位され、求核剤の活性化および遷移状態の安定化に異なる役割を有しうる。場合により、RNase-HまたはRNase-H様ドメイン含有タンパク質は、触媒中心にカルボキシレートトライアド（carboxylate triad）を含有するα/βフォールドを有しうる。場合により、ヌクレアーゼには、空間的に保存された2つのAspが存在しうる。例えばAsp残基はアルゴノート配列の大半に保存されうる。Asp残基はRNase-H様触媒部位の触媒Asp残基と空間的に整列しうる。場合により、ヌクレアーゼは、RNase-H、逆転写酵素、インテグラーゼ、Tn5、アルゴノート、RuvC、Cas、またはそれらの組合せでありうる。場合により、ヌクレアーゼは、RNase-H、逆転写酵素、インテグラーゼ、Tn5、アルゴノート、RuvC、またはCasのいずれか一つと共通するRNase-Hドメインを有しうる酵素でありうる。別の例では、ヌクレアーゼは、構造が、RNase-H、逆転写酵素、インテグラーゼ、Tn5、アルゴノート、RuvC、またはCasのいずれか1つと実質的に類似しうる。実質的に類似する構造は、両側をαヘリックスで囲まれた中央の5ストランド混合βシートを含有するβ-フォールドを含有しうる。場合により、RNase-H構造は、基質結合表面の一部を形成することができる2つのα-ターン-βユニットの間に挿入された追加のヘリックスおよびループも有しうる。場合により、実質的に類似する構造は活性部位を含有する。RNase-HまたはRNase-H様タンパク質の活性部位は一組の高度に保存された3つのカルボキシレートを含有しうる。場合により、ドメインはRuvCであってもよい。場合により、ドメインはPIWIドメインであってもよい。場合により、適切なヌクレアーゼドメインまたはヘリカーゼドメインを同定するために使用することができる生物中の考えうるPIWIドメインは、系統樹によって同定される（図1）。
場合により、酵素ポリペプチドは、RNA依存性DNaseエディター、RNA依存性RNaseエディター、DNA依存性DNaseエディター、またはDNA依存性RNaseエディターでありうる。RNA依存性DNaseエディターの例としては、例えばCas9とCpf1の2つを挙げることができる。RNA依存性RNaseエディターの一例はCas13である。酵素タンパク質は複数のドメインを含有することができる。例えば酵素ポリペプチドは、DNA-RNA、DNA-DNA、またはRNA-RNAの二重鎖に結合することができるドメインを含有しうる。例えばRuvCはCas9およびCpf1に結合することができ、HNHはCas9に結合することができ、RNase-Hはリボヌクレアーゼに結合することができ、PIWIはAgoに結合することができる。
場合により、RHDCポリペプチドは、P-element induced WImpy testis（PIWI）遺伝子、RuvC、Cas、Sir2、Mrr、TIR、PLD、REase、制限エンドヌクレアーゼ、DExD/H、スーパーファミリーIIヘリカーゼ、RRXRR（SEQ ID NO:380）、DUF460、DUF3010、DUF429、DUF1092、COG5558、OrfB＿IS605、ペプチダーゼA17、リボヌクレアーゼH様ドメイン、3'-5'エキソヌクレアーゼドメイン、3'-5'エキソリボヌクレアーゼRv2179c様ドメイン、バクテリオファージμ、トランスポザーゼ、DNA指向性DNAポリメラーゼ、ファミリーB、エキソヌクレアーゼドメイン、エキソヌクレアーゼ、RNase T/DNAポリメラーゼIII、yqgF遺伝子、HEPN、RNase LSドメイン、LsoA触媒ドメイン、KENドメイン、RNaseL、Ire1、RNaseドメイン、RloCもしくはPrrC、またはそれらの修飾型のうちの少なくとも1つのオペロンに隣接して位置する遺伝子によって発現されうる。本明細書に開示するRHDCポリペプチドは可換的でありうる。例えばRHDCポリペプチドドメインは、CRISPR、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALENまたは制限酵素を含むリストから選択されうる任意のヌクレアーゼドメインであることができる。場合によっては、RHDCドメインが交換された場合に、その交換は、遺伝子編集システムの残りのモジュール（核酸巻き戻し因子またはRDP）の機能に影響を及ぼさないと考えられる。場合によっては、遺伝子編集システムを増進または減退することができる。増進は、RHDCポリペプチドなどのドメインを、より高性能なRHDCポリペプチドと交換することによって行うことができる。増進は、相当する遺伝子編集システムと比較して、二本鎖切断修復を約5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または最大約100％増強することができる。減退は、二本鎖切断の改良された相同組換え修復（HDR）のために、RHDCポリペプチドなどのドメインを、より低性能なRHDCポリペプチドと交換することによって行うことができる。場合により、遺伝子編集システムのモジュールの交換は、二本鎖切断のHDRを可能にすることができる。本明細書に開示する遺伝子編集システムの使用は、相当するまたは代替的な遺伝子編集システムの使用よりも、二本鎖切断の優先的なHDRを可能にすることができる。場合により、HDR修復は、ある細胞集団において、相当する遺伝子編集システムで起こるHDR修復よりも、％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または最大約100％、優先的に起こりうる。
場合により、RHDCまたはその機能的フラグメントは、クロロフレクサス門、プロテオバクテリア門、バクテロイデス門、プランクトミセス門、ファーミキューテス門、シアノバクテリア門、バクテロイデス門、バルネオラ門、バクテロイデス門、ユリアーキオータ門（Euryarchaeota）、クレンアーキオータ門（Crenarchaeota）、ファーミキューテス門、ユリアーキオータ門、アクチノバクテリア門、テルモトガ門（Thermotogae）、デイノコックス門、スピロヘータ門、アシドバクテリア門、それらの修飾型（modified version）、またはそれらの任意の組合せから選択される細菌の門から選択することができる。
場合により、RHDCまたはその機能的フラグメントは、門名クロロフレクサス（綱名:サーモフレキシア（Thermoflexi）、デハロコッコイデス（dehalococcoidia）、アナエロリネア（anaerolinaea）、アーデンティカテナ（ardenticatenia）、カルディリネア（caldilineae）、テドノバクター（ktedonobacteria）、サーモミクロビウム（thermomicrobia）、クロロフレクサス（chloroflexia））、門名プロテオバクテリア（綱名:アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ヒュドロゲノピルス（hydrogenophilalia）、ガンマプロテオバクテリア、アシディチオバシリア（acidithiobacillia）、デルタプロテオバクテリア（Deltaproteobacteria）、イプシロンプロテオバクテリア（epsilonproteobacteria）、オリゴフレクサス（oligoflexia））、門名バクテロイデス（綱名:ロドテルムス（rhodothermia）、バルネオラ（balneolia）、サイトファーガ（cytophagia）、スフィンゴバクテリウム（sphingobacteria）、キチノファーガ（chitinophagia）、バクテロイデス（bacteroidia）、フラボバクテリウム（flavobacteriia））、門名プランクトミセス（綱名:フィシスフェラ（phycisphaerae）、プランクトマイセス（plantomycetacia））、門名ファーミキューテス（綱名:バチルス（bacillales）、クロストリジウム（clostridia）、サーモリソバクター（thermolithobacteria））、門名シアノバクテリア（綱名:クロオコックス（chroococcales）、クロオコッキディオプシス（chroococcidiopsidales）、グレオバクテリア（gleobacterales）、ネンジュモ（nostocales）、オシラトリア（oscillatoriales）、プレウロカプサ（pleurocapsales）、スピルリナ（spirulinales）、シネココックス（synechococcales）、所属不明（incertae sedis））、門名バクテロイデス（綱名:ロドテルムス、バルネオラ、サイトファーガ、スフィンゴバクテリウム、キチノファーガ、バクテロイデス、フラボバクテリウム）、門名バルネオラ（綱名:バルネオ）、門名ユリアーキオータ（綱名:アシデュリプロファンダム（aciduliprofundum）、アルカエオグロブス（archaeoglobi）、ハロバクテリウム（halobacteria）、メタノバクテリウム（methanobacteria）、メタノコッカス（methanococci）、メタノミクロビウム（methanomicrobia）、メタノピルス（methanopyri）、ナノ好塩古細菌（nanohaloarchaea）、サーモコッカス（thermococci）、サーモプラズマ（thermoplasmata））、門名クレンアーキオータ（綱名:エオキタ（eocyta）、エオサイト（eocytes）、クレン古細菌（crenarchaeot garrity and holt））、門名アクチノバクテリア（綱名:ルブロバクター（rubrobacteria）、サーモレオフィラ（thermoleophilia）、コリオバクテリウム（coriobacteriia）、アシディミクロビウム（acidimicrobiia）、ニトリリルプトイア（nitrilliruptoia）、アクチノバクテリア）、門名テルモトガ（綱名:テルモトガ）、デイノコックス門（綱名:デイノコッカス（deinococci））、門名スピロヘータ（綱名:スピロヘータ（spirochaetia））、門名アシドバクテリア（綱名:アシドバクテリア、ブラストカテラ（blastocatellia）、ホロファーガ（holophagae））、それらの修飾型、またはそれらの任意の組合せから選択される細菌の綱から選択することができる。
場合により、RHDCまたはその機能的フラグメントは、デハロコッコイデス・マッカルチ（Dehalococcoides mccartyi）DCMB5、クプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）H1130、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）、メチロバクター・ウィッテンブリイ、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）I1345株、カンジダタス・ブロカディア・シニカ（Candidatus Brocadia sinica）JPN1、クロストリジウム・サルタゴフォルメ（Clostridium sartagoforme）AAU1、カロスリックス（Calothrix）sp. PCC7103、ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）PCC9701、エリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Elizabethkingia meningoseptica）、ロドハロバクター・ハロフィラス（Rhodohalobacter halophilus）、パラバクテロイデス・ゴルドステイニイ（Parabacteroides goldsteinii）CL02T12C30、スフィンゴビウム・クロロフェノリカム（Sphingobium chlorophenolicum）L-1、メタノトリス・フォルミシカス（Methanotorris formicicus）Mc-S-70、ヒメノバクター・サイクロトレランス（Hymenobacter psychrotolerans）DSM 18569、バルカニセタ・モウントノブスキア（Vulcanisaeta moutnovskia）768-28、フラボバクテリウム・ソウレンセ（Flavobacterium seoulense）、リザベトキンギア・アノフェリス（Elizabethkingia anophelis）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）DX-1、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）VE202-12、サーモコッカス・バロフィラス（Thermococcus barophilus）、リゾビウム・ウンディコラ（Rhizobium undicola）ORS 992＝ATCC 700741、アノキシバチルス・ゲネンシス（Anoxybacillus gonensis）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、フラボバクテリウム・ジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）KW、バークホルデリア（Burkholderia）sp. H160、クロオコッキディオプシス・サーマリス（Chroococcidiopsis thermalis）PCC 7203、フィシェレラ・メジャー（Fischerella major）NIES-592、サイクロバクテリウム・マリヌム（Cyclobacterium marinum）DSM 745、フラボバクテリウム（Flavobacterium）sp. Root186、ノカルディア・シエナタ（Nocardia sienata）NBRC 100364、サーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）sp. CDF、メチロバクテリウム・メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）SR1.6/6、ノンラベンス・ウルバニボランス（Nonlabens ulvanivorans）、シネココッカス（Synechococcus）sp. PCC 7003、サイクロセルペンス・ダムポネンシス（Psychroserpens damuponensis）、フラボバクテリウム・ソリ（Flavobacterium soli）DSM 19725、アシネトバクター・ノソコミアリス（Acinetobacter nosocomialis）、メタノカルドコッカス・フェルベンス（Methanocaldococcus fervens）AG86、デハロコッコイデス・マッカルチCBDB1、マリニトーガ・ハイドロゲニトレランス（Marinitoga hydrogenitolerans）DSM 16785、サーマス・ブロキアヌス（Thermus brockianus）、サーマス・スコトダクタス（Thermus scotoductus）SA-01、ロドピレルラ・マイオリカ（Rhodopirellula maiorica）SM1、ヒドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）sp. PBC、デイノコッカス（Deinococcus）sp. YIM 77859、クルチア・マッシリエンシス（Kurthia massiliensis）、サーモコッカス・オンヌリネウス（Thermococcus onnurineus）NA1、プレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）ZT、ヒフォモナス（Hyphomonas）sp. T16B2、ハロピガー・ジェルフィマッシリエンシス（Halopiger djelfimassiliensis）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、ナトリアルバ・アジアティカ（Natrialba asiatica）DSM 12278、ミクロキスティス（Microcystis）sp. T1-4、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、セディミニバクテリウム（Sediminibacterium）sp. C3、フルビイコーラ・タフェンシス（Fluviicola taffensis）DSM 16823、ハロフェラックス（Haloferax）sp. BAB2207、セセムビア・ロナレンシス（Cecembia lonarensis）LW9、レプトリネア・タルジビタリス（Leptolinea tardivitalis）、サーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）BP-1、メソリゾビウム（Mesorhizobium）sp. L2C066B000、セルロファーガ・リティカ（Cellulophaga lytica）DSM 7489、ハロルブラム・コクリイ（Halorubrum kocurii）JCM 14978、パエニバチルス・ボレアリス（Paenibacillus borealis）、クリセオバクテリウム（Chryseobacterium）sp. JM1、バリオボラックス・パラドクサス（Variovorax paradoxus）B4、メチリビウム（Methylibium）sp. YR605、ポルフィロモナス科細菌（Porphyromonadaceae bacterium）COT-184 OH4590、ヒフォモナス（Hyphomonas）sp. T16B2、レプトスピラ・ノグチイ（Leptospira noguchii）、クロストリジウム目細菌（Clostridiales bacterium）NK3B98、ゲオバチルス（Geobacillus）sp. FW23、［クロストリジウム］シトロニエ（［Clostridium］citroniae）WAL-19142、クロストリジウム・ディスポリカム（Clostridium disporicum）、バークホルデリア・ベトナミエンシス（Burkholderia vietnamiensis）、バクテロイデス・フラギリス3397T14株、レプトリングビア（Leptolyngbya）sp. 「ヘンソニイ（hensonii）」、アシドバクテリウム・カプスラタム（Acidobacterium capsulatum）ATCC 51196、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）WAL-14572、ゲオバチルス・カウストフィルス（Geobacillus kaustophilus）GBlys、クロストリジウム・サウディエンセ（Clostridium saudiense）、メチロミクロビウム・ブリアテンセ（Methylomicrobium buryatense）5G、エンテロバクター・コベイ（Enterobacter kobei）、デイノコッカスsp. RLから選択される種から選択することができる。
場合により、RHDCまたはその機能的フラグメントは、以下のうちの少なくとも1つから選択することができる:バルカニセタ・モウントノブスキア、サーモプロテウス・ユゾニエンシス（Thermoproteus uzoniensis）、ピロバキュラム（Pyrobaculum）、モデストバクター・マリヌス（Modestobacter marinus）、アシドボラックス・アベナエ（Acidovorax avenae）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、キサントモナス・カムペストリス（Xanthomonas campestris）、カウロバクター・セグニス（Caulobacter segnis）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、キサントモナス・ベシカトリア（Xanthomonas vesicatoria）、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、パンテア（Pantoea）、クプリアビダス、ゲオバクター・スルフレデュセンス（Geobacter sulfurreducens）、クロロビウム・ファエオバクテロイデス（Chlorobium phaeobacteroides）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Bordetella bronchiseptica）、ウッドショレア・マリチマ（Woodsholea maritima）、ノボスフィンゴビウム・ペンタロマチボランス（Novosphingobium pentaromativorans）、リゾビウム・ファゼオリ（Rhizobium phaseoli）、ポリモルフム・ギルブム（Polymorphum gilvum）、ブラディリゾビウム・エルカニイ（Bradyrhizobium elkanii）、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）、ブラディリゾビウム・オリゴトロフィカム（Bradyrhizobium oligotrophicum）、ゲオバクター・ウラニイレデュセンス（Geobacter uraniireducens）、プランクトミセス・リムノフィルス（Planctomyces limnophilus）、パルブラルキュラ・ベルムデンシス（Parvularcula bermudensis）、アルファプロテオバクテリウム（alpha proteobacterium）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アシネトバクター・ウルシンギイ（Acinetobacter ursingii）、アシネトバクター・ベレジニアエ（Acinetobacter bereziniae）、マリプロフンドゥス・フェッロオクシュダンス（Mariprofundus ferrooxydans）、バークホルデリアsp. H160、チオアルカリビブリオ・チオシアノキシダンス（Thioalkalivibrio thiocyanoxidans）、バリオボラックス・パラドクサス、バークホルデリア・グラミニス（Burkholderia graminis）、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）LB400、バクテロイデス・フラギリス638R、デスルフォバクラ・トルオリカ（Desulfobacula toluolica）Tol2、クロストリジウム・テルミチディス（Clostridium termitidis）、クロストリジウムsp. CAG-264、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、ファーミキューテス門細菌CAG-65、バクテロイデス、バクテロイデス・オバータス（Bacteroidesovatus）、フルビイコーラ・タフェンシスDSM 16823、ジョーステラ・マリナ（Joostella marina）、バクテロイデス・マッシリエンシス（Bacteroides massiliensis）、パラバクテロイデス・ゴルドステイニイ、エムペドバクター・ブレビス（Empedobacter brevis）、バクテロイデス・エガーシー（Bacteroides eggerthii）、バクテロイデス・フルクスサス（Bacteroides fluxus）、アリスティペス・ピュトレディニス（Alistipes putredinis）、パラバクテロイデス・メルダエ（Parabacteroides merdae）、トレポネーマ・ビンセンティ（Treponema vincentii）、ラクノスピラ科細菌3 1 57FAA CT1、ブラキスピラ（Brachyspira）sp. CAG-484、クロストリジウム綱細菌（Clostridiales bacterium）NK3B98、ファーミキューテス門細菌CAG-137、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）sp. 6 1 46AFAA、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）R551-3、オーウェンウィークシア・ホンコンゲネシス（Owenweeksia hongkongensis）DSM、サイクロバクテリウム・マリヌムDSM 745、バクテロイデス・コプロフィルス（Bacteroides coprophilus）、バクテロイデス・インテスティナリス（Bacteroides intestinalis）CAG-564、ベドバクター・サルタンス（Pedobacter saltans）DSM 12145、ハイホマイクロビウム・デニトリフィカンス（Hyphomicrobium denitrificans）1NES1、スフィンゴモナス（Sphingomonas）sp. S17、ロドシュードモナス・パルストリスBisB5、アグロバクテリウム（Agrobacterium）sp. H13-3、エリオラエア・テピディフィラ（Elioraea tepidiphila）、ロダノバクター・デニトリフィカンス（Rhodanobacter denitrificans）、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）CIAT 652、ペラギバクテリウム・ハロトレランス（Pelagibacterium halotolerans）B2、ティストレラ・モビリス（Tistrella mobilis）KA081020-065、スフィンゴモナス・ウイッティチイチ（Sphingomonas wittichii）RW1、アシドバクテリウム・カプスラタムATCC 51196、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）PAl 5、メソリゾビウムsp. STM 4661、シノリゾビウム・フレディ（Sinorhizobium fredii）NGR234、シノリゾビウム・メディカエ（Sinorhizobium medicae）WSM419、メソリゾビウム・メタリデュランス（Mesorhizobium metallidurans）、メタノサルキナ・アセティボランス（Methanosarcina acetivorans）C2A、好塩古細菌DL31、ハロアーキュラ・マリスモルツイ（Haloarcula marismortui）ATCC 43049、ハロルブラム・ラクスプロファンディ（Halorubrum lacusprofundi）ATCC 49239、ハロサルシナ・パリダ（Halosarcina pallida）、ハロルブラム・テベンクイチェンス（Halorubrum tebenquichense）、リゾビウム・ルピネ（Rhizobium lupine）、グラヌリセラ・ツンドリコラ（Granulicella tundricola）MP5ACTX9、メチロミクロビウム・アルブム（Methylomicrobium album）、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）sp. PP1Y、ロドピレルラ・マイオリカ（Rhodopirellula maiorica）、フラボバクテリウム・インディカム（Flavobacterium indicum）GPTSA100-9、プランクトミセス・マリス（Planctomyces maris）、レプトリングビアsp. PCC 7375、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、バクテロイデスsp. 3 1 19、パラバクテロイデス（Parabacteroides）、スフィンゴバクテリウム・スピリティボラム（Sphingobacterium spiritivorum）、フィブレラ・アエスツアリナ（Fibrella aestuarina）BUZ 2、アナエロファガ・サーモハロフィラ（Anaerophaga thermohalophila）、ビブリオ・ツビアシイ（Vibrio tubiashii）、ギルビマリヌス・キネンシス（Gilvimarinus chinensis）、シェワネラ（Shewanella）sp. ANA-3、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、アリシェワネラ・アグリ（Alishewanella agri）、シュードモナス・プレコグロッシキダ（Pseudomonas plecoglossicida）、シュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）、緑膿菌、ノボスフィンゴビウム・ペンタロマチボランス、メチロバクテリウム・メソフィリカム、アゾスピリラム・アマゾネンセ（Azospirillum amazonense）、メチリビウム・ペトロレイフィラム（Methylibium petroleiphilum）PM1、メチロハロビウム・クリメエンシス（Methylohalobius crimeensis）、パルブラルキュラ・ベルムデンシスHTCC2503、オピトゥトゥス科細菌（Opitutaceae bacterium）TAV5、ペドスファエラ・パルブラ（Pedosphaera parvula）、アシドバクテリウム科細菌（Acidobacteriaceae bacterium）TAA166、クプリアビダス・メタリデュランスCH34、クプリアビダス・タイワネンシス（Cupriavidus taiwanensis）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）sp. KMS、モデストバクター・マリヌス、リゾビウム・ファゼオリ、スフィンゴモナスsp. KC8、ブラディリゾビウムsp. YR681、メチロバクテリウム（Methylobacterium）sp. 88A、ノボスフィンゴビウム・ペンタロマチボランス、マリティミバクター・アルカリフィルス（Maritimibacter alkaliphilus）、スフィンゴビウム・ヤノイクヤエ（Sphingobium yanoikuyae）、ベイジェリンキア・インディカ（Beijerinckia indica）亜種インディカ（indica）ATCC 9039、ブルセラ・イノピナタ（Brucella inopinata）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）MAFF303099、アフィピア・ブロメアエ（Afipia broomeae）、アスティカカウリス・ビプロスセシウム（Asticcacaulis biprosthecium）、スフィンゴピクシス・バエクリュンゲンシス（Sphingopyxis baekryungensis）、フォディニクルバタ・セディミニス（Fodinicurvata sediminis）、スルフィトバクター（Sulfitobacter）sp. NAS-14-1、ロドプラム（Rhodovulum）sp. PH10、キサントバクター・オートトロフィカス（Xanthobacter autotrophicus）Py2、スルフォロブス・アイランディカス（Sulfolobus islandicus）M-16-27、カルダナエロバクター・サブテラネウス（Caldanaerobacter subterraneus）、サイトファーガ・ハッチンソニイ（Cytophaga hutchinsonii）ATCC 33406、ソリタレア・カナデンシス（Solitalea canadensis）DSM 3403、バクテロイデスsp. CAG-189、ウィノグラドスキエラ・サイクロトレランス（Winogradskyella psychrotolerans）、セセムビア・ロナレンシス（Cecembia lonarensis）、フラボバクテリウムsp. WG21、スフィンゴビウム・クロロフェノリカムL-1、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）A3-2、メチロバクテリウム・メソフィリカム、パルブラルキュラ・ベルムデンシスHTCC2503、ロドシュードモナス・パルストリスDX-1、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）SI、シントロフォバクター・フマロキシダンス（Syntrophobacter fumaroxidans）MPOB、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、アシネトバクター・ノソコミアリス（Acinetobacter nosocomialis）、ヒドロゲノファーガsp. PBC、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、ゲンマタ・オブスキュリグロブス（Gemmata obscuriglobus）、ザバルジネラ・フォルモサ（Zavarzinella Formosa）、アシドボラックス・エブレウス（Acidovorax ebreus）TPSY、ロドピレルラ・マイオリカ、シアノセイス（Cyanothece）sp. PCC 8801、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ATCC 17025、アシドバクテリウム・カプスラタムATCC 51196、アルカエオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）DSM 4304、カルディテリビブリオ・ニトロレデュセンス（Calditerrivibrio nitroreducens）DSM 19672、マリニミクロビア細菌（Marinimicrobia bacterium）JGI 0000039-D08、セルロファーガ・リティカ（Cellulophaga lytica）DSM 7489、ベルリエラ・バルティカ（Belliella baltica）DSM 15883、サイクロバクテリウム・マリヌムDSM 745、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumanniil）、アシネトバクター・ノソコミアリス、トレポネーマ・メディウム（Treponema medium）、ピレルラ・スタレイ（Pirellula staleyi）DSM 6068、レプトスピラ・インタロガンス（Leptospira interrogans）、ペドバクター・ヘパリヌス（Pedobacter heparinus）DSM 2366、スピロソーマ・リングアレ（Spirosoma linguale）DSM74、レプトスピラ・サンタロサイ（Leptospira santarosai）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）sp. DT3-1、メチロブラム・ミヤコネンセ（Methylovulum miyakonense）、スルフォロブス・コトダイイ（Sulfolobus tokodaii）7株、カンジダツス・ニトロソスファエラ・ガルゲンシス（Candidatus Nitrososphaera gargensis）Ga9-2、スキトネマ・ホフマンニ（Scytonema hofmanni）、シアノセイスsp. PCC 8802、カロスリックスsp. PCC 7103、イネ・ジャポニカグループ（Oryza sativa Japonica Group）、ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Natronobacterium gregoryi）SP2、ハロバクテリウム（Halobacterium）sp. DL1、プロクロロトリックス・ホランディカ（Prochlorothrix hollandica）、ハロピジャー・ザナデュエンシス（Halopiger xanaduensis）SH-6、ハロフェラックス・エロガンス（Haloferax elongans）、ハロフェラックス・デニトリフィカンス（Haloferax denitrificans）、ナトロノルブラム・チベテンス（Natronorubrum tibetense）、ナトリネマ・ペリル
ブラム（Natrinema pellirubrum）DSM 15624、シュードアルテロモナス・ルテオビオラセア（Pseudoalteromonas luteoviolacea）、アロマトレウム・アロマティカム（Aromatoleum aromaticum）EbN1、シネココッカスsp. PCC 7002、シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）PCC 7942、シネココッカスsp. JA-3-3Ab、シアノセイスsp. PCC 7822、スタニエリア・シアノスフェラ（Stanieria cyanosphaera）PCC 7437、サーマス・スコトダクタスSA-01、サーマス（Thermus）sp. CCB US3 UF1、ハロルブラム・ラクスプロファンディATCC 49239、イグニスファエラ・アグレガンス（Ignisphaera aggregans）DSM 17230、アクイフェックス・エオリカス（Aquifex aeolicus）VF5、カマエシフォン・ミヌツス（Chamaesiphon minutus）PCC 6605、オシラトリア・アキュミナタ（Oscillatoria acuminata）PCC 6304、リングビア（Lyngbya）sp. PCC 8106、クロオコッキディオプシス・サーマリスPCC 7203、リブラリア（Rivularia）sp. PCC 7116、アオコ（Microcystis aeruginosa）NIES-843、クリナリウム・エピプサムマム（Crinalium epipsammum）PCC 9333、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrical）PCC 7122、フィシェレラ（Fischerella）sp. JSC-11、カロスリックスsp. PCC 7507、バークホルデリア・アムビファリア（Burkholderia ambifaria）、および/またはチオアルカリビブリオ・チオシアノキシダンス。
場合により、ポリペプチド構築物は、クロストリジウム・ディスポリカム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含むことができる。場合により、ポリペプチド構築物はRHDCポリペプチドを含むことができ、該RHDCポリペプチドは、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸切断活性を呈することができる。場合により、ポリペプチド構築物は、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体由来のドメインを含む。場合により、ポリペプチド構築物はRHDCポリペプチドを含むことができ、該RHDCポリペプチドは、メチロバクター・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、ポリペプチド構築物は、メチロバクター・ウィッテンバリー・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含むメチロバクター・アルゴノートドメインを含む。場合により、ポリペプチド構築物はRHDCポリペプチドを含み、該RHDCポリペプチドは、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する。場合により、ポリペプチド構築物は、サーモシネココッカス・エロンゲーツ・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含むサーモアクチノミセス・アルゴノートドメインを含む。
場合により、本明細書に記載の核酸構築物は、原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとをコードすることができる。場合により、RHDCポリペプチドは中温で核酸を切断する。核酸切断活性はガイドDNAによって方向付けられうる。場合によっては、RHDCポリペプチドを核酸巻き戻しポリペプチドに融合することができる。場合により、本明細書に記載の核酸構築物は、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとをコードすることができる。場合により、RHDCポリペプチドによってコードされるタンパク質は中温で核酸を切断する。場合により、核酸切断活性はガイドDNAによって方向付けられうる。場合によっては、RHDCポリペプチドを核酸巻き戻しポリペプチドに融合することができる。場合により、ポリペプチド構築物によってコードされるタンパク質は、さらに、核酸挿入活性を呈する。場合により、挿入は外因性トランスジーンの挿入であることができる。外因性トランスジーンは、場合により、キメラ抗原受容体またはT細胞受容体などの細胞受容体であることができる。
場合により、RHDCポリペプチドは、ゲノムにおける二次遺伝子への近さに基づいて選ぶことができる。例えば、RHDCポリペプチドは、ssDNAヘリカーゼSF1などのヘリカーゼ遺伝子に隣接するその位置に基づいて選んでもよい。場合により、RHDCポリペプチドは、DNA修復関連遺伝子への近さに基づいて選ぶことができる。場合により、RHDCポリペプチドは、予測されるアラインメント（例えば構造解析）または系統解析に基づいて選ぶことができる（図4〜8D）。例えば、RHDCポリペプチドは、二次遺伝子の遺伝子配列に関して相同性を有するか、保存されていてもよい。場合により、RHDCポリペプチドは、RNase-Hに関して高度に保存されうる。保存とは配列または構造を指しうる。構造的保存は構造上の特徴の有無を指しうる。構造上の特徴はαヘリックスまたはβプリーツシートなどの二次構造の特徴であることができる（図5）。RHDCポリペプチドは、二次構造に基づいてスクリーニングすることまたは選ぶことができる。RHDCポリペプチドはRNase-HI、RNase-HII、RVE/Trasp、アルゴノート、Prp8、RuvC、RuvX、RNase T、またはDNA PolIIIであることができる。RHDCポリペプチドは、RNase-HI、RNase-HII、RVE/Trasp、アルゴノート、Prp8、RuvC、RuvX、RNase T、またはDNA PolIIIのうちの少なくとも1つに類似する二次構造を共有することができる。場合により、ヌクレアーゼは、構造中のRHDCポリペプチドフォールドの存在に基づいて選ばれる。場合により、RHDCポリペプチドは、N末端またはC末端における保存に基づいて選ばれる。例えばC末端はPIWIドメインを含有し、適切なヌクレアーゼ間では保存されうる（図3）。
場合により、ヌクレアーゼは、RNase-Hフォールドの有無によって同定されうる。RNase-Hフォールドは、さまざまなヌクレアーゼの間で共有されうる進化的に最も古いタンパク質フォールドのうちの1つでありうる。場合により、分岐進化の過程において、ヌクレアーゼメンバーの配列は、数多くの置換、挿入、欠失を蓄積し、さまざまなドメインとの融合を起こしている。この分岐により、異なるRNHLタンパク質ファミリー間の配列類似性は、低くなりうる。場合により、配列類似性は検出不可能でありうる。異なるタンパク質におけるRNase-H様ドメインの長さは、触媒コアに数多くの挿入が存在するために、有意に変動しうる。場合により、RNase-HドメインまたはRNase-H様ドメインなどのドメインを共有するヌクレアーゼを同定するために、シーケンシング解析を行うことができる。
場合により、RHDCポリペプチドを、少なくとも1つの追加要素、例えばヘリカーゼに融合することができる。場合により、ヌクレアーゼを、ATPaseに融合することができる。場合により、RHDCポリペプチドを、別のRHDCポリペプチドに融合することができる。場合により、RHDCポリペプチドを、ターゲティングポリ核酸またはターゲティングタンパク質と融合することができる。場合により、RHDCポリペプチドは、RHDCポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとの融合構築物であることができる。場合により、融合タンパク質は中温生物由来のポリペプチドで構成される。中温生物は、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、ファーミキューテス門、シアノバクテリア門、スピロヘータ門、デイノコックス門、ベルコミクロビア門、プランクトミセス門、バルネオラ門、およびクロロフレクサス門からなる群より選択される科に由来しうる。中温生物は、プロテオバクテリア門、アシドバクテリア門、アクチノバクテリア門、およびバクテロイデス門からなる群より選択される科に由来しうる。
場合により、RHDCポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を有しうるポリペプチドでありうる。ヌクレアーゼ活性は、例えばDNAまたはRNAなどの二本鎖ポリ核酸切断活性でありうる。場合により、ヌクレアーゼ活性は一本鎖ポリ核酸切断活性でありうる。場合により、RHDCポリペプチドはニッカーゼ活性を有しうる。ニッカーゼ活性は一本鎖DNAまたはRNA切断活性でありうる。場合により、RHDCポリペプチドはRNase活性を有しうる。場合により、RNase活性は二本鎖RNA切断活性でありうる。場合により、RNase活性はRNA切断活性でありうる。場合により、RHDCタンパク質またはRHDCポリペプチドはRNase-H活性を有しうる。場合により、RNase-H活性はRNA切断活性でありうる。場合により、RHDCポリペプチドはリコンビナーゼ活性を有しうる。RHDCポリペプチドはDNAフリッピング活性も有しうる。場合により、RHDCポリペプチドはトランスポザーゼ活性を有しうる。
融合タンパク質は公知の技術を使って、例えば、融合タンパク質のさまざまな部分のコード配列を核酸レベルで一つに連結することができる組換えDNA技術を使って、合成することができる。次に宿主細胞を使って融合タンパク質を生産することができる。いくつかの態様において、融合タンパク質は、タンパク質の異なるセクションまたはドメインの間（例えば核酸巻き戻しドメインとRHDCポリペプチドとの間）に切断可能なリンカーまたは切断可能でないリンカーを含む。例えばリンカーは、ポリペプチドリンカー、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50アミノ酸長、またはそれ以上のリンカーでありうる。本明細書に言う「融合」された2つのポリペプチド配列は、互いに直接的に隣接している必要はない。融合されたポリペプチド配列は、リンカーによって融合されるか、またはそれらのポリペプチドに融合されている追加の機能的ポリペプチド配列によって融合されうる。
リンカーはGSGSGSリンカー（SEQ ID NO:381）でありうる。場合により、ゲノム編集構築物上には、1、2、3、4、5、6、7、8、もしくは9個から10個までのリンカーが存在しうる。例えば1〜10個のGSGSGSリンカーが存在しうる。リンカーは非荷電アミノ酸または荷電アミノ酸を含むことができる。リンカーはαヘリックスドメインを含みうる。リンカーは化学的架橋剤を含むことができる。場合により、リンカーは、融合されるドメインの機能およびそれらの物理的近さを調節するために、さまざまな長さを有しうる。場合により、リンカーは、リガンド誘導性コンフォメーション変化を伴うペプチドを含むことができる。
いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、アルゴノートタンパク質もしくはアルゴノートポリペプチドまたはその機能ドメインもしくは機能的変異体でありうる。アルゴノートタンパク質は約800〜約1200アミノ酸の比較的大きなタンパク質でありうる。アルゴノートタンパク質もしくはアルゴノートポリペプチドまたはその機能ドメインもしくは機能的変異体は、真核生物起源でありうる。アルゴノートタンパク質もしくはアルゴノートポリペプチドまたはその機能ドメインもしくは機能的変異体は、原核生物起源でありうる。真核生物アルゴノートタンパク質は、AG02などのマウス・アルゴノートタンパク質を含みうる。アルゴノートタンパク質は古細菌生物または細菌生物に由来しうる。アルゴノートタンパク質は中温生物に由来しうる。中温生物は約19℃〜40℃の温度で活性な生物でありうる。いくつかの態様において、中温生物は、約17℃、約18℃、19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃から40℃までの温度で活性でありうる。いくつかの態様において、中温生物は約17℃〜40℃の温度で活性でありうる。いくつかの態様において、中温生物は少なくとも約17℃の温度で活性でありうる。いくつかの態様において、中温生物は高くて40℃の温度で活性でありうる。いくつかの態様において、中温生物は、約17℃〜約19℃、約17℃〜約21℃、約17℃〜約23℃、約17℃〜約25℃、約17℃〜約27℃、約17℃〜約29℃、約17℃〜約31℃、約17℃〜約33℃、約17℃〜約35℃、約17℃〜約37℃、約17℃〜40℃、約19℃〜約21℃、約19℃〜約23℃、約19℃〜約25℃、約19℃〜約27℃、約19℃〜約29℃、約19℃〜約31℃、約19℃〜約33℃、約19℃〜約35℃、約19℃〜約37℃、約19℃〜40℃、約21℃〜約23℃、約21℃〜約25℃、約21℃〜約27℃、約21℃〜約29℃、約21℃〜約31℃、約21℃〜約33℃、約21℃〜約35℃、約21℃〜約37℃、約21℃〜40℃、約23℃〜約25℃、約23℃〜約27℃、約23℃〜約29℃、約23℃〜約31℃、約23℃〜約33℃、約23℃〜約35℃、約23℃〜約37℃、約23℃〜40℃、約25℃〜約27℃、約25℃〜約29℃、約25℃〜約31℃、約25℃〜約33℃、約25℃〜約35℃、約25℃〜約37℃、約25℃〜40℃、約27℃〜約29℃、約27℃〜約31℃、約27℃〜約33℃、約27℃〜約35℃、約27℃〜約37℃、約27℃〜40℃、約29℃〜約31℃、約29℃〜約33℃、約29℃〜約35℃、約29℃〜約37℃、約29℃〜40℃、約31℃〜約33℃、約31℃〜約35℃、約31℃〜約37℃、約31℃〜40℃、約33℃〜約35℃、約33℃〜約37℃、約33℃〜40℃、約35℃〜約37℃、約35℃〜40℃、または約37℃〜40℃の温度で活性でありうる。本明細書に記載する一定の態様において、アルゴノートポリペプチドは、本明細書に記載するアルゴノートタンパク質またはその変異体からの機能ドメインを含みうる。
場合により、RHDCポリペプチドは、約19℃〜約41℃を含む温度範囲において核酸切断活性を呈することができる。場合により、ヌクレアーゼまたはRHDCポリペプチドは中温生物に由来しうる。RHDCポリペプチドは、アルゴノートタンパク質、アルゴノートポリペプチドまたはその機能的部分でありうる。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは、約17℃、約18℃、19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、または最大40℃の温度で核酸切断活性を有する。いくつかの態様において、RHDCポリペプチドは約17℃〜40℃の温度で核酸切断活性を有する。いくつかの態様において、中温生物は少なくとも約17℃の温度で活性でありうる。いくつかの態様において、中温生物は高くて40℃の温度で活性でありうる。いくつかの態様において、中温生物は、約17℃〜約19℃、約17℃〜約21℃、約17℃〜約23℃、約17℃〜約25℃、約17℃〜約27℃、約17℃〜約29℃、約17℃〜約31℃、約17℃〜約33℃、約17℃〜約35℃、約17℃〜約37℃、約17℃〜40℃、約19℃〜約21℃、約19℃〜約23℃、約19℃〜約25℃、約19℃〜約27℃、約19℃〜約29℃、約19℃〜約31℃、約19℃〜約33℃、約19℃〜約35℃、約19℃〜約37℃、約19℃〜40℃、約21℃〜約23℃、約21℃〜約25℃、約21℃〜約27℃、約21℃〜約29℃、約21℃〜約31℃、約21℃〜約33℃、約21℃〜約35℃、約21℃〜約37℃、約21℃〜40℃、約23℃〜約25℃、約23℃〜約27℃、約23℃〜約29℃、約23℃〜約31℃、約23℃〜約33℃、約23℃〜約35℃、約23℃〜約37℃、約23℃〜40℃、約25℃〜約27℃、約25℃〜約29℃、約25℃〜約31℃、約25℃〜約33℃、約25℃〜約35℃、約25℃〜約37℃、約25℃〜40℃、約27℃〜約29℃、約27℃〜約31℃、約27℃〜約33℃、約27℃〜約35℃、約27℃〜約37℃、約27℃〜40℃、約29℃〜約31℃、約29℃〜約33℃、約29℃〜約35℃、約29℃〜約37℃、約29℃〜40℃、約31℃〜約33℃、約31℃〜約35℃、約31℃〜約37℃、約31℃〜40℃、約33℃〜約35℃、約33℃〜約37℃、約33℃〜40℃、約35℃〜約37℃、約35℃〜40℃、または約37℃〜40℃の温度で活性でありうる。
アルゴノートポリペプチドは、ヒト（Homo sapiens）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、イネ・ジャポニカ（oryza sativa japonica）、エントアメーバ・ディスパー（Entamoeba dispar）、ヨツヒメゾウリムシ（paramecium tetraurelia）、キイロショウジョウバエ（drosophila melanogaster）、セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）に由来しうる。アルゴノートポリペプチドは、ヒトAgo2、シロイヌナズナAgo、イネ・ジャポニカAgo、エントアメーバ・ディスパーSAW760 Ago、ヒメゾウリムシd4-2株Ago、キイロショウジョウバエAgo、セノラブディティス・エレガンスAgo、またはヒトAgoでありうる。場合により、RHDCポリペプチドは、アルゴノートタンパク質またはアルゴノート機能ドメインを含みうる。
場合により、アルゴノートポリペプチドまたはその一部分は、天然のアルゴノートポリペプチド（例えば細菌細胞および/または古細菌細胞中に天然に見出されるもの）でありうる。別の例では、アルゴノートポリペプチドは天然のポリペプチドでなくてもよい（例えばアルゴノートポリペプチドは、変異体、キメラ、または融合体でありうる）。場合により、アルゴノートポリペプチドはヌクレアーゼ活性を有しうる。場合により、アルゴノートポリペプチドはヌクレアーゼ活性を有しなくてもよい。
場合により、アルゴノートポリペプチドはI型原核生物アルゴノートでありうる。場合により、I型原核生物アルゴノートはDNA核酸ターゲティング核酸を運びうる。場合により、DNA核酸ターゲティング核酸は、二本鎖DNA（dsDNA）の一方の鎖を標的として、dsDNAのニックまたは切断を生じる。ニックまたは切断は宿主DNA修復をトリガーしうる。場合により、宿主DNA修復は非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え（HDR）でありうる。場合により、dsDNAは、ゲノム、染色体およびプラスミドから選択されうる。I型原核生物アルゴノートは、N-PAZ-MID-PIWIドメイン構造を持ちうる長鎖（long）I型原核生物アルゴノートでありうる。場合により、長鎖I型原核生物アルゴノートは触媒活性PIWIドメインを持つ。長鎖I型原核生物アルゴノートは、アスパラギン酸-グルタミン酸-アスパラギン酸-アスパラギン酸/ヒスチジン（DEDX）によってコードされる触媒テトラッドを持ちうる。触媒テトラッドは1つまたは複数のマグネシウムイオンまたはマンガンイオンに結合することができる。場合により、I型原核生物アルゴノートはDNAガイドの5'リン酸末端を固定する。場合により、DNAガイドはその5'末端にデオキシ-シトシンを有しうる。
いくつかの態様において、原核生物アルゴノートはII型Agoである。II型原核生物アルゴノートはRNA核酸ターゲティング核酸を運びうる。RNA核酸ターゲティング核酸は、二本鎖DNA（dsDNA）の一方の鎖を標的として、宿主DNA修復をトリガーしうるdsDNAのニックまたは切断を生じうる。この宿主DNA修復は非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え（HDR）でありうる。場合により、dsDNAは、ゲノム、染色体、およびプラスミドから選択されうる。II型原核生物アルゴノートは長鎖II型原核生物アルゴノートまたは短鎖（short）II型原核生物アルゴノートでありうる。長鎖II型原核生物アルゴノートはN-PAZ-MID-PIWIドメイン構造を有しうる。短鎖II型原核生物アルゴノートはMIDドメインとPrWIドメインを有しうるが、PAZドメインは有しないと考えられる。場合により、短鎖II型AgoはPAZドメインの類似体を有しうる。場合により、II型Agoは触媒活性PIWIドメインを有しないと考えられる。II型Agoは、アスパラギン酸-グルタミン酸-アスパラギン酸-アスパラギン酸/ヒスチジン（DEDX）によってコードされる触媒テトラッドを欠きうる。場合により、II型原核生物アルゴノートをコードする遺伝子は、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはそれらの組合せをコードする1つまたは複数の遺伝子とクラスターを形成する。ヌクレアーゼは天然型、人口設計型（designed）、またはそのドメインでありうる。場合により、ヌクレアーゼは、Sir2、RE1、およびTIRから選択される。II型AgoはRNAガイドの5'リン酸末端を固定しうる。場合により、RNAガイドはその5'末端にウラシルを有する。場合により、II型原核生物アルゴノートはロドバクター・スフェロイデス・アルゴノートである。場合により、アルゴノート:ガイド分子複合体をプローブとして使用する応用例などでは、核酸を切断するその能力が欠けているアルゴノートヌクレアーゼを使用することが望ましいこともある。場合により、不活性アルゴノートシステムは、ゲノム破壊を行うために二次的ヌクレアーゼを用いうる。そのような場合は、触媒活性を消失または減少させることができるように、触媒ドメイン中のアミノ酸残基のうちの1つまたは複数を置換しまたは欠失させることができる。別の例において、切断のタイミングを制御するために、または非誘導温度では切断が阻害されるべき場合には、切断温度誘導性アルゴノートを使用することが望まれうる。
場合により、アルゴノートポリペプチドは少なくとも1つの活性ドメインを有しうる。例えばアルゴノートの活性ドメインはPIWIドメインでありうる。触媒PIWIドメインに加えて、アルゴノートは、PAZ（PIWI-Argonaute-Zwille）、MID（Middle）、およびNドメインなどの非触媒ドメインを、2つのドメインリンカーL1およびL2と共に含有することができる。MIDドメインは誘導ポリ核酸の5'末端に結合するために用いることができ、Agoタンパク質中に存在することができる。PAZドメインはOBフォールドコアを含有しうる。OBフォールドコアは3'末端からの誘導ポリ核酸の安定化に関与しうる。Nドメインは、ロードされた二本鎖ゲノムの第2のパッセンジャー鎖の解離と標的切断との一因になりうる。場合により、アルゴノートファミリーはPIWIドメインおよびMIDドメインを含有しうる。場合により、アルゴノートファミリーはPAZドメインおよびNドメインを含有しても含有しなくてもよい。
場合により、アルゴノートポリペプチドは、ヌクレアーゼなどの天然ポリペプチド（例えば細菌細胞および/または古細菌細胞中に天然に見出されるもの）であるか、それを含むことができる。別の例において、アルゴノートポリペプチドは、ヌクレアーゼなどの非天然ポリペプチドであるか、それを含むことができる。非天然ポリペプチドは操作されていてもよい。操作されたアルゴノートポリペプチドは、キメラヌクレアーゼ、その変異型、コンジュゲート型または他の修飾型でありうる。場合により、アルゴノートポリペプチドはSEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:19のうちのいずれか1つによってコードされる配列を含むことができる。場合により、アルゴノートポリペプチドのポリペプチド配列は、SEQ ID NO:20〜SEQ ID NO:38のうちのいずれか1つによってコードされる配列を含むことができる。場合により、ポリペプチドは、SEQ ID NO:39〜SEQ ID NO:57のうちのいずれか1つによってコードされる配列を含むことができる。場合により、構築物は、表16の配列（SEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:67）のうちのいずれか1つによってコードされる配列、その修飾型、その誘導体またはそのトランケーションを含むことができる。場合により、構築物は、表17の配列（SEQ ID NO:68〜SEQ ID NO:160）のうちのいずれか1つによってコードされる配列、その修飾型、その誘導体またはそのトランケーションを含むことができる。場合により、構築物は、表18の配列（SEQ ID NO:161〜SEQ ID NO:252）のうちのいずれか1つによってコードされる配列、その修飾型、その誘導体またはそのトランケーションを含むことができる。場合により、構築物は、表19の配列（SEQ ID NO:253〜SEQ ID NO:344）のうちのいずれか1つによってコードされる配列、その修飾型、その誘導体またはそのトランケーションを含むことができる。
場合により、アルゴノート核酸またはその一部分は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:39〜SEQ ID NO:57のうちのいずれか1つに対して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％から少なくとも約100％までの同一性パーセントを含むことができる。場合により、アルゴノートポリペプチドまたはその一部分は、SEQ ID NO:20〜SEQ ID NO:38のいずれか1つに対して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％から少なくとも約100％までの同一性パーセントを含むことができる。場合により、ポリペプチドまたはその一部分は、SEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:344のいずれか1つに対して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％から少なくとも約100％までの同一性パーセントを含む配列由来であることができる。
（表１）PIWIドメインによって同定された細菌アルゴノート機能ドメイン核酸配列
Figure 2020536502
Figure 2020536502
Figure 2020536502
Figure 2020536502
（表２）PIWIドメインによって同定された表1に開示する配列に対応するアルゴノートドメインポリペプチド酸配列
Figure 2020536502
Figure 2020536502
Figure 2020536502
（表３）表1に開示する配列としてPIWIドメインによって同定された対応するアルゴノート完全ゲノム核酸配列
Figure 2020536502
Figure 2020536502
Figure 2020536502
Figure 2020536502
Figure 2020536502
Figure 2020536502
場合により、ヌクレアーゼは、1つまたは複数のCRISPRシステムまたはその変異体もしくは誘導体に由来しうる。CRISPRシステム由来のヌクレアーゼはCasタンパク質でありうる。
化膿レンサ球菌（S.pyogenes）において、Cas9は、タンパク質中の2つの触媒ドメイン、すなわちDNAの相補鎖を切断するHNHドメインと非相補鎖を切断するRuvC様ドメインとが媒介するプロセスにより、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の約1bp〜約10bp上流に平滑末端二本鎖切断を生成することができる。場合により、二本鎖切断はPAMの約3bp上流にある。参照によりその全体が本明細書に組み入れられるJinke et al.,Science 337,816-821（2012）を参照されたい。Cas9タンパク質は、Makarova et al.,Nature Reviews,Microbiology,Vol.9,June 2011,pp.467-477の補足情報において特定されている以下のシステムを含む多くのII型CRISPRシステムに存在することが公知である:メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）C7、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）YS-314、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032キタサト（Kitasato）、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032ビーレフェルト（Bielefeld）、コリネバクテリウム・グルタミカムR、コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Corynebacterium kroppenstedtii）DSM 44385、マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）ATCC 19977、ノカルジア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）IFM10152、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）PR4、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1、ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）B4 uid36573、アシドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）11B、アルスロバクター・クロロフェノリカス（Arthrobacter chlorophenolicus）A6、クリベラ・フラビダ（Kribbella flavida）DSM 17836 uid43465、サーモモノスポラ・クルバータ（Thermomonospora curvata）DSM 43183、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）Bd1、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）DJO10A、スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（Slackia heliotrinireducens）DSM 20476、パーセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）EX H1、バクテロイデス・フラギリスNCTC 9434、カプノサイトファーガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）DSM 7271、フラボバクテリウム・サイクロフィラム（Flavobacterium psychrophilum）JIP02 86、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ATCC BAA 835、ロセイフレクサス・カステンホルジイ（Roseiflexus castenholzii）DSM 13941、ロセイフレクサス（Roseiflexus）RS1、シネコシスティス（Synechocystis）PCC6803、エルシミクロビウム・ミヌツム（Elusimicrobium minutum）Pei191、培養不能シロアリグループ1細菌ファイロタイプ（uncultured Termite group 1 bacterium phylotype）Rs D17、フィブロバクター・スクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）S85、セレウス菌（Bacillus cereus）ATCC 10987、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）GG、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）UCC118、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）A909、ストレプトコッカス・アガラクチアNEM316、ストレプトコッカス・アガラクチア2603、ストレプトコッカス・ディスガラクチア・エクイシミリス（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）GGS 124、ストレプトコッカス・エクイ・ズーエピデミクス（Streptococcus equi zooepidemicus）MGCS10565、ストレプトコッカス・ガロリチカス（Streptococcus gallolyticus）UCN34 uid46061、ストレプトコッカス・ゴルドニ・チャリス・サブストレインCH1（Streptococcus gordonii Challis subst CH1）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）NN2025 uid46353、ストレプトコッカス・ミュータンス、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）M1 GAS、化膿レンサ球菌MGAS5005、化膿レンサ球菌MGAS2096、化膿レンサ球菌MGAS9429、化膿レンサ球菌MGAS10270、化膿レンサ球菌MGAS6180、化膿レンサ球菌MGAS315、化膿レンサ球菌SSI-1、化膿レンサ球菌MGAS10750、化膿レンサ球菌NZ131、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）CNRZ1066、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMG 18311、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）A3ロッホ・マリー（Loch Maree）、ボツリヌス菌Bエクルンド（Eklund）17B、ボツリヌス菌Ba4 657、ボツリヌス菌Fランゲラン（Langeland）、クロストリジウム・セルロリティカ（Clostridium cellulolyticum）H10、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）ATCC 29328、ユーバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）ATCC 33656、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）163K、マイコプラズマ・ペネトラン（Mycoplasma penetrans）、マイコプラズマ・シノビエ（Mycoplasma synoviae）53、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）DSM 12112、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）BTAi1、ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）X14、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）BisB 18、ロドシュードモナス・パルストリスBis B5、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）DS-1、ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）DFL 12、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）Pal 5 FAPERJ、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスPal 5 JGI、アゾスピリルム（Azospirillum）B510 uid46085、ロドスピリルム・ルブルム（Rhodospirillum rubrum）ATCC 11170、ディアフォロバクター（Diaphorobacter）TPSY uid29975、ベルミネフロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）EF01-2、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitides）053442、ナイセリア・メニンギティディスα14、ナイセリア・メニンギティディスZ2491、デスルフォビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）DSM 2638、カンピロバクター・ジェジュニ・ドイレイ（Campylobacter jejuni doylei）269 97、カンピロバクター・ジェジュニ81116、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）RM2100、ヘリコバクター・ヘパティカス（Helicobacter hepaticus）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）DSM 9187、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）T6c、シューワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）ATCC 700345、レジオネラ・ニューモフィラ・パリス（Legionella pneumophila Paris）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）130Z、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、フランシセラ・ツラレンシス・ノビシダ（Francisella tularensis novicida）U112、フランシセラ・ツラレンシス・ホラルクチカ（Francisella tularensis holarctica）、フランシセラ・ツラレンシスFSC 198、フランシセラ・ツラレンシス・ツラレンシス、フランシセラ・ツラレンシスWY96-3418、およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）ATCC 35405。したがって、本開示の局面は、本開示の遺伝子編集システムと合わせて使用されるII型CRISPRシステム中に存在するCas9タンパク質に向けられる。場合により、Casは、RNase-H様ドメイン含有ペプチド複合体中のモジュールとして使用することができる。
Casタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1またはCsx12としても知られる）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、CasRX、そのホモログまたはその修飾型を挙げることができる。場合により、Casの代替物を用いることができる。例えば、場合により、Cpf1エンドヌクレアーゼを使用することができる。Cpf1は系統学的に細菌アルゴノートおよび古細菌アルゴノートに近い場合がある。例えば、Cpf1は、C末端においてアルゴノートと整列しうる。Cpf1のC末端はPIWIドメインを含みうる。場合により、触媒不活性Casタンパク質（例えばdCas9）も使用しうる。Casは部分的に触媒不活性であることができる。Casタンパク質はDNA切断活性またはRNA切断活性を有しうる。CRISPR酵素は、例えば遺伝子配列内および/または遺伝子配列の相補鎖内の標的配列において、一方または両方の鎖の切断を指示することができる。例えばCRISPR酵素は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列の最初または最後のヌクレオチドから、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、もしくはそれ以上の塩基対内、または約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約50、約100、約200、約500、もしくはそれ以上の塩基対内における、一方または両方の鎖の切断を指示することができる。場合により、Casタンパク質はCas9HiFiなどの高忠実度Casタンパク質でありうる。場合により、Casはニッカーゼなどの部分不活性Casでありうる。
（表４）化膿レンサ球菌Cas9（SpCas9）
Figure 2020536502
場合により、Cas9を用いることができる。Cas9とは、野生型の例示的Cas9ポリペプチド（例えば化膿レンサ球菌からのCas9）に対して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％または少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％の配列同一性および/または配列類似性を持つポリペプチドを指しうる。Cas9とは、野生型の例示的Cas9ポリペプチド（例えば化膿レンサ球菌からのもの）に対して、多くとも50％、多くとも60％、多くとも70％、多くとも80％、多くとも90％、多くとも100％または多くとも約50％、多くとも約60％、多くとも約70％、多くとも約80％、多くとも約90％、多くとも約100％の配列同一性および/または配列類似性を持つポリペプチドを指しうる。Cas9とは、欠失、挿入、置換、変異体、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組合せなどといったアミノ酸変化を含むことができる野生型または修飾型のCas9タンパク質を指しうる。Cas9とは、SEQ ID NO:58に対して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％または少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％の配列同一性および/または配列類似性を持つポリペプチドを指しうる。
表4の化膿レンサ球菌Cas9（SpCas9）はゲノム操作のためのCRISPRエンドヌクレアーゼとして使用することができるが、場合によっては、すべての標的除去部位にとって最善のエンドヌクレアーゼというわけではない。例えばSpCas9のためのPAM配列（5'NGG3'）はヒトゲノム全体にわたって豊富に存在するが、NGG配列は、修飾のための所望の遺伝子を標的とするようには正しく位置していない場合もありうる。場合により、異なるエンドヌクレアーゼを、一定のゲノム標的を標的とするために使用することができる。場合により、非NGG PAM配列を持つ合成SpCas9由来変異体を使用することができる。加えて、さまざまな種から他のCas9オルソログも同定されており、これらの「非SpCas9」は、本発明にも役立ちうるさまざまなPAM配列に結合する。例えばSpCas9のサイズは比較的大きいので（およそ4kbコード配列）、SpCas9 cDNAを運ぶプラスミドは細胞中で効率よく発現できないことになる。逆に、黄色ブドウ球菌Cas9（SaCas9）のコード配列はSpCas9よりおよそ1キロベース短いことから、おそらく細胞において効率よく発現することが可能になる。SpCas9と同様に、SaCas9エンドヌクレアーゼは、インビトロで哺乳動物細胞中の標的遺伝子を、またインビボでマウス中の標的遺伝子を、修飾する能力を有する。
化膿レンサ球菌Cas9に代わるものとしては、哺乳動物細胞において切断活性を呈するCpf1ファミリーのRNA誘導型エンドヌクレアーゼを挙げることができる。Cas9ヌクレアーゼとは異なり、Cpf1媒介DNA切断の結果は、短い3'オーバーハングを伴う二本鎖切断である。Cpf1の付着末端切断（staggered cleavage）パターンにより、遺伝子編集の効率を増加させることができる従来の制限酵素クローニングに似た指向性遺伝子移入の可能性が開かれうる。上述のCas9変異体およびオルソログのように、Cpf1も、CRISPRが標的とすることのできる部位の数を、SpCas9が好むNGG PAM部位を欠くATリッチ領域またはATリッチゲノムへと拡張することができる。場合により、ヌクレアーゼは、ヘリカーゼなどのポリ核酸巻き戻し因子を含む。別の例では、ヌクレアーゼはDNA巻き戻し因子を含有しなくてもよい。ポリ核酸を巻き戻すことができるヌクレアーゼはCasまたはCpf1でありうる。
場合により、ヌクレアーゼはトランスポゾン/トランスポザーゼシステムにおいて機能することができる。転位因子は、安定なゲノム組込みおよび/またはゲノム破壊を媒介する能力を有する天然の非ウイルス遺伝子送達ビヒクルになりうる。トランスポゾン/トランスポザーゼはPiggyBacであることができる。PiggyBacは、トランスポゾンカセットとトランスポザーゼの両方とで構成されうる。PiggyBacシステムトランスポゾンはゲノムの「TTAA」部位を修飾することができる。
真核細胞などの特定細胞における発現のために、ヌクレアーゼをコドン最適化することができる。真核細胞などの特定細胞における発現のために、エンドヌクレアーゼ（例えばアルゴノート）をコードするポリヌクレオチドをコドン最適化することができる。このタイプの最適化は、同じタンパク質をコードしつつも、意図した宿主生物または宿主細胞のコドン選択を模倣するために、外来（例えば組換え）核酸への変異導入を必然的に伴いうる。
トランスポザーゼは対称的にコーディネートされて、役割を交換することで、ピンポン機構による連続的な鎖切断と移行のために、水と3'-OHとを交互に活性化しうる。
いくつかの態様において、RNase-HはA型RNA鎖およびB型DNA鎖を特異的に認識する。
ヌクレアーゼは、標的核酸および/または標的核酸と会合したポリペプチドに結合しかつ/またはそれらを修飾（例えば切断、メチル化、脱メチル化など）することができる。以下にさらに詳しく述べるように、場合により、本ヌクレアーゼは、標的核酸を修飾する酵素活性を有しうる。酵素活性とは、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、DNA修復活性、DNA損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、またはグリコシラーゼ活性を指しうる。別の例では、本ヌクレアーゼは、標的核酸と会合したポリペプチドを修飾する酵素活性を有しうる。
いくつかの態様において、核酸切断活性に加えて、または核酸切断活性の代わりに、本明細書に記載される組成物、ポリペプチド、方法、およびシステムは、「ペースト（pasting）」機能も有しうる。したがって、本組成物、ポリペプチド、方法、およびシステムは、標的核酸を切断することに加えて、または標的核酸を切断する代わりに、標的配列に核酸を挿入するために使用することができる。そのような例示的核酸挿入活性として、インテグラーゼ活性、フリッパーゼ活性、トランスポザーゼ（transponase）活性、およびリコンビナーゼ活性が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。したがって、そのような機能を有する例示的ポリペプチド（核酸挿入ポリペプチド）としては、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、およびフリッパーゼが挙げられる。これらの核酸挿入ポリペプチドは、例えば、本開示のポリペプチドによって切断された部位に核酸配列を挿入することができる。
場合により、アルゴノートヌクレアーゼ、CRISPRヌクレアーゼまたはRNase-H様ヌクレアーゼは核局在化配列（NLS）を含有することができる。核局在化配列はSV40に由来しうる。NLSは、SV40、ヌクレオプラスミン、インポーチンα、C-myc、EGL-13、TUS、BORG、hnRNPA1、Mata2、またはPY-NLSのうちの少なくとも1つに由来しうる。NLSはヌクレアーゼポリペプチドまたはヌクレアーゼ核酸のC末端またはN末端に存在しうる。場合により、ヌクレアーゼは約1〜約10個のNLS配列を含有しうる。ヌクレアーゼは1、2、3、4、5、6、7、8、もしくは9個から10個までのNLS配列を含有することができる。ヌクレアーゼはSV40およびヌクレオプラスミンNLS配列を含有しうる。場合により、NLSはサル空砲形成ウイルス（Simian Vacuolating Virus）40に由来しうる。
巻き戻し因子
場合により、核酸巻き戻し因子を用いうる。核酸巻き戻し因子は、核酸を巻き戻すポリ核酸、タンパク質、薬物またはシステムでありうる。核酸巻き戻し因子はエネルギーであることができる。核酸巻き戻し因子はエネルギーまたは熱を提供することができる。巻き戻しとは（例えばDNAの）二重らせんを巻き戻すこと、ならびに二本鎖核酸を巻き戻してそれを一本鎖核酸に変換すること、またはヒストンからDNAを巻き戻すことを指すことができる。いくつかの態様において、巻き戻し因子はヘリカーゼである。いくつかの態様において、ヘリカーゼは、核酸または核酸タンパク質複合体に結合する酵素である。いくつかの態様において、ヘリカーゼはDNAヘリカーゼである。いくつかの態様において、ヘリカーゼはRNAヘリカーゼである。いくつかの態様において、ヘリカーゼはポリ核酸を任意の位置で巻き戻す。場合により、巻き戻される位置は免疫チェックポイント遺伝子内に見出される。場合により、巻き戻される核酸の位置は疾患に関与する遺伝子をコードする。いくつかの態様において、巻き戻し因子はATPase、ヘリカーゼ、合成関連ヘリカーゼ、またはトポイソメラーゼである。
いくつかの態様において、核酸巻き戻し因子は、二本鎖DNAまたは二本鎖RNAにおけるヌクレオチド塩基間の水素結合を壊すことによって機能する。場合により、（例えば水素結合を壊すことによる）核酸の巻き戻しにはエネルギーが要求される。水素結合を壊すために、核酸巻き戻し因子はATPに蓄えられたエネルギーを使用することができる。いくつかの態様において、核酸巻き戻し因子はATPaseを含む。例えば、核酸巻き戻し活性を持つポリペプチドは、ATPaseを含みうるか、またはATPaseに融合されうる。いくつかの態様では、ATPaseが細胞システムに加えられる。
いくつかの態様において、核酸巻き戻し因子はポリペプチドである。例えば核酸巻き戻しペプチドは、原核生物起源、古細菌起源または真核生物起源であることができる。いくつかの態様において、核酸巻き戻しポリペプチドは、ヘリカーゼドメイン、トポイソメラーゼドメイン、Casタンパク質ドメイン、例えばCas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、CasRX、またはdCasドメイン（例えばdCas9ドメイン）などの触媒不活性核酸巻き戻しドメインからなる群より選択されるCasタンパク質ドメインを含む。
いくつかの態様において、核酸巻き戻し因子は小分子である。例えば小分子核酸巻き戻し因子は、核酸へのインターカレーション、溝結合もしくは共有結合、またはそれらの組合せによって、核酸を巻き戻すことができる。例示的な小分子核酸巻き戻し因子としては、9-アミノアクリジン、キナクリン、クロロキン、アクリフラビン、アムサクリン、（Z）-3-（アクリジン-9-イルアミノ）-2-（5-クロロ-1,3-ベンゾオキサゾール-2-イル）プロパ-2-エナール、四重鎖構造を安定化することができる小分子、クアルフロキシン、キンドリン、キノリン系トリアジン化合物、BRACO-19、アクリジン、ピリドスタチン、およびそれらの誘導体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、ポリ核酸は物理的方法で巻き戻される。物理的方法は、例えば加熱または剪断を含みうる。場合により、核酸巻き戻しのために、DNAまたはRNAなどのポリ核酸を熱にばく露することができる。DNAまたはRNAは約50℃〜約150℃の温度で変性しうる。DNAまたはRNAは、約50℃〜60℃、約60℃〜約70℃、約70℃〜約80℃、約80℃〜約90℃、約90℃〜約100℃、約100℃〜約110℃、約110℃〜約120℃、約120℃〜約130℃、約130℃〜約140℃、約140℃〜約150℃で変性する。
場合により、pH変化によってポリ核酸を変性させることができる。例えば、pHを約25〜約29に上昇させることによってポリ核酸を変性させるために、水酸化ナトリウム（NaOH）を使用することができる。場合により、塩の添加によって、ポリ核酸を変性させることができる。
場合により、巻き戻し因子を用いる本開示の編集システムは、本開示の巻き戻し因子を使用しないシステムと比較して、熱力学的エネルギー要求量を約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、約25％、約40％、約50％、または最大約60％低減することができる。場合により、巻き戻し因子を用いる本開示の編集システムは、本開示の巻き戻し因子を使用しないシステムと比較して、巻き戻し因子に対する免疫応答を約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、約25％、約40％、約50％、または最大約60％低減することができる。場合により、巻き戻し因子は、免疫応答の誘発を防止するために人体に内在性に存在する細菌から回収することができる。
調節ドメインポリペプチド（RDP）
場合により、調節ドメインポリペプチドは核酸編集システムの一部であることができる。RDPは、核酸編集システムの活性の、例えば編集の、レベルを調節することができる。RDPの非限定的な例としては、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、生殖細胞修復ドメインまたはDNA修復タンパク質を挙げることができる。場合により、RDPは、RNase-H様ドメイン含有ポリペプチドを含む領域において、共局在しているDNA修復タンパク質をスクリーニングすることによってマイニングすることができる。
RDPとして使用することができる例示的なリコンビナーゼには、Cre、Hin、Tre、またはFLPリコンビナーゼがある。場合により、相同組換えに関与するリコンビナーゼを使用することができる。例えばRDPは、RadA、Rad51、RecA、Dmc1、またはUvsXであることができる。
エピジェネティックモジュレーターは、DNAメチル化、クロマチンの翻訳後修飾によって直接的に、またはクロマチンの構造を改変することによって、エピゲノムを修飾することができるタンパク質でありうる。
例示的な生殖細胞修復ドメインとしては、例えばATM、ATR、またはDNA-PKなどを挙げることができる。生殖細胞修復ドメインは、ヌクレオチド除去修復（NER）、塩基除去修復（BER）、ミスマッチ修復（MMR）、DNA二本鎖切断修復（DSBR）、および複製後修復（PRR）など、さまざまな機序によってDNA損傷を修復することができる。
RDPは、核酸編集システムの調整可能な構成要素でありうる。例えば、本編集システムでは、特定のアウトカムを達成するために、編集システム中のRDPを取り替えることができる。場合により、RDPは、標的とする細胞もしくは求められる編集効率のレベルに基づいて選択するか、または核酸編集システムのオフターゲット効果を低減するために選択することができる。増進または調整は、ゲノム切断修復のパラメータ（効率、安全性、速度、または正確さ）を、相当する遺伝子編集システムと比較して、約5％、約10％、約15％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、または最大約100％増強することができる。減退または調整は、ゲノム修飾中に異なる効果を達成するために、RDPなどのドメインを交換することによって行うことができる。例えば異なる効果とは、特定のゲノム切断修復、組換え、エピジェネティック調整または高忠実度修復への傾斜でありうる。場合により、RDPは、ゲノム切断へのトランスジーン挿入を増強するために使用しうる。場合により、遺伝子編集システムのモジュールを交換することで、NHEJまたはMMEJとは対照的に、二本鎖切断のHDRを可能にすることができる。本明細書に開示する遺伝子編集システムの使用は、相当するまたは他の遺伝子編集システムの使用よりも、二本鎖切断の優先的なHDRを可能にすることができる。場合により、HDR修復は、ある細胞集団において、該RDPを持たない相当する遺伝子編集システムで起こるHDR修復よりも、約5％、約10％、約15％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、もしくは約95％から最大約100％、優先的に起こる。
場合により、RDPを用いる本開示の編集システムは、本開示のRDPを使用しないシステムと比較して、熱力学的エネルギー要求量を約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、約25％、約40％、約50％、または最大約60％低減することができる。場合により、RDPを用いる本開示の編集システムは、本開示のRDPを使用しないシステムと比較して、RDPに対する免疫応答を約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、約25％、約40％、約50％、または最大約60％低減することができる。場合により、RDPは、免疫応答の誘発を防止するために、人体に内在性に存在する細菌から回収することができる。
誘導ポリ核酸
誘導ポリ核酸は、RHDCポリペプチドがコードするタンパク質を含む遺伝子編集システムを、あるゲノム位置へと方向付けることができる。場合により、誘導ポリ核酸はDNAでありうる。別の例では、誘導ポリ核酸はRNAでありうる。誘導ポリ核酸はDNAとRNAの組合せでありうる。誘導ポリ核酸は一本鎖、二本鎖、またはそれらの組合せでありうる。誘導ポリ核酸は、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30ヌクレオチド、またはそれ以上、または少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約17、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、少なくとも約21、少なくとも約22、少なくとも約23、少なくとも約24、少なくとも約25、少なくとも約30ヌクレオチド長、またはそれ以上でありうる。誘導ポリヌクレオチドは、長くても5、長くても10、長くても15、長くても16、長くても17、長くても18、長くても19、長くても20、長くても21、長くても22、長くても23、長くても24、長くても25、長くても30ヌクレオチド、またはそれ以上、または長くても約5、長くても約10、長くても約15、長くても約16、長くても約17、長くても約18、長くても約19、長くても約20、長くても約21、長くても約22、長くても約23、長くても約24、長くても約25、長くても約30ヌクレオチド、またはそれ以上の長さであることができる。誘導ポリヌクレオチドは、約5、約10、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約30ヌクレオチド、またはそれ以上の長さであることができる。場合により、誘導ポリ核酸は、表22に示すようにトランケートされていてもよい。トランケート型誘導ポリ核酸は最小結合長を決定するために用いることができる。
誘導ポリ核酸は、RHDCポリペプチドと会合して標的核酸の標的部位へのハイブリダイゼーションによってRHDCポリペプチドを標的核酸内の特異的標的配列へと方向付けることができるガイドRNA（すなわち「gRNA」）でありうる。同様に、誘導ポリ核酸は、RHDCポリペプチドと会合して標的核酸の標的部位へのハイブリダイゼーションによってRHDCポリペプチドを標的核酸内の特異的標的配列へと方向付けることができるガイドRNA（すなわち「gDNA」）でありうる。場合により、誘導ポリ核酸は、誘導ポリ核酸と標的核酸との間のミスマッチとハイブリダイズすることができる。誘導ポリ核酸は、少なくとも約1、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約11、少なくとも約12、少なくとも約13、少なくとも約14、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約35個、または最大40個のミスマッチを含むことができる。場合により、誘導ポリ核酸は、リクルートドメインにおける、例えばg6、g7、およびg8における、ミスマッチを許容することができる。場合により、誘導ポリ核酸は安定化ドメイン中にミスマッチを含有することができる。安定化ドメインは誘導分子の3'末端に隣接しうる。例えば、16ヌクレオチド長ガイド分子において、位置g6〜g16、例えばg6、g7、g8、g9、g10、g11、g12、g13、g14、g15、およびg16またはそれらの任意の組合せは、ミスマッチしうる。リクルートドメイン中のミスマッチは、好ましくは位置g6、g7、および/またはg8にミスマッチを有しうる。
本明細書に開示する方法は、少なくとも1つのガイドRNAまたはガイド核酸、例えば少なくとも1つのガイドRNAをコードするDNAを、細胞または胚に導入する工程も含むことができる。ガイドRNAは、RNA誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用することで、エンドヌクレアーゼを特異的標的部位に方向付けることができ、ガイドRNAの5'末端は、その部位において、染色体配列中の特異的プロトスペーサー配列と塩基対合する。
ガイドRNAは、2つのRNA、例えばCRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化crRNA（tracrRNA）を含むことができる。ガイドRNAは、場合によっては、crRNAの一部（例えば機能部分）とtracrRNAとの融合によって形成される単一ガイドRNA（sgRNA）を含みうる。ガイドRNAは、crRNAおよびtracrRNAを含むデュアルRNA（dual RNA）であることもできる。ガイドRNAはcrRNAを含みかつtracrRNAを欠くことができる。さらにまた、crRNAは標的DNAまたはプロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができる。
上述のようにガイドRNAは発現産物でありうる。例えば、ガイドRNAをコードするDNAは、ガイドRNAをコードする配列を含むベクターでありうる。単離されたガイドRNAまたはガイドRNAをコードする配列とプロモーターとを含むプラスミドDNAを細胞または生物にトランスフェクトすることにより、細胞または生物にガイドRNAを移入することができる。ウイルス媒介遺伝子送達を使用するなど別の方法で、細胞または生物にガイドRNAを移入することもできる。
誘導ポリ核酸は単離することができる。例えばガイドRNAは、単離されたRNAの形態で、細胞または生物にトランスフェクトすることができる。ガイドRNAは、任意のインビトロ転写システムを使ったインビトロ転写によって調製することができる。ガイドRNAは、ガイドRNAのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離されたRNAの形態で、細胞に移入することができる。
ガイドRNAは、DNAターゲティングセグメントとタンパク質結合セグメントとを含むことができる。DNAターゲティングセグメント（またはDNAターゲティング配列もしくはスペーサー配列）は、標的DNA内の特異的配列（例えばプロトスペーサー）に相補的でありうるヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメント（またはタンパク質結合配列）は、部位特異的修飾ポリペプチドと、例えばCasタンパク質などのRNA誘導型エンドヌクレアーゼと、相互作用することができる。「セグメント」とは、ある分子のセグメント/セクション/領域、例えばRNAにおけるヌクレオチドの連続するストレッチを意味する。セグメントは複合体の領域/セクションも意味しうるので、セグメントは2つ以上の領域を含みうる。例えば、場合により、DNAターゲティングRNAのタンパク質結合セグメントは1つのRNA分子であり、それゆえにタンパク質結合セグメントは当該RNA分子の一領域を含む。別の例では、DNAターゲティングRNAのタンパク質結合セグメントは、相補性がある領域に沿ってハイブリダイズされる2つの別個の分子を含む。
誘導ポリ核酸は2つの別個のポリ核酸分子を含むかまたは単一のポリ核酸分子を含むことができる。例示的な単一分子誘導ポリ核酸（例えばガイドRNA）は、DNAターゲティングセグメントとタンパク質結合セグメントの両方を含む。
場合により、RHDCポリペプチドまたはその一部分は、誘導ポリ核酸との複合体を形成することができる。誘導ポリ核酸は、標的核酸の配列に相補的でありうるヌクレオチド配列を含むことにより、複合体に標的特異性を与える。場合により、標的核酸は、遺伝子の少なくとも一部分を含むことができる。場合により、標的核酸は、遺伝子のエクソン内にあることができる。別の例では、標的核酸は、遺伝子のイントロン内にあることができる。
誘導ポリ核酸はRHDCポリペプチドとの複合体を形成することで、RHDCポリペプチドに部位特異的活性を与えることができる。言い換えると、RHDCポリペプチドは、誘導ポリ核酸との会合により、一本鎖標的核酸配列、例えば二本鎖核酸の一本鎖領域、染色体配列または染色体外配列、例えばエピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、クロロプラスト配列、ssRNA、ssDNAなどの中にある標的部位に誘導されうる。
場合により、誘導ポリ核酸は、核酸に新しい特徴または強化された特徴（例えば改良された安定性）を与えるために、1つまたは複数の修飾（例えば塩基修飾、主鎖修飾）を含むことができる。誘導ポリ核酸は核酸アフィニティータグを含むことができる。ヌクレオシドは塩基-糖の組合せであることができる。ヌクレオシドの塩基部分は複素環式塩基でありうる。そのような複素環式塩基の最も一般的な2つのクラスはプリン類とピリミジン類でありうる。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸をさらに含むヌクレオシドであることができる。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の2'、3'、または5'ヒドロキシル部分に連結されうる。誘導ポリ核酸を形成させる際に、リン酸基は、隣接ヌクレオシドを互いに共有結合で連結して、線状ポリマー化合物を形成させることができる。加えて、線状化合物は内部ヌクレオチド塩基相補性を有してもよく、したがって完全にまたは部分的に二本鎖の化合物が生成するように、折りたたまれうる。誘導ポリ核酸内で、リン酸基は、一般に、誘導ポリ核酸のヌクレオシド間主鎖を形成するということができる。誘導ポリ核酸の連結部または主鎖は、3'→5'ホスホジエステル連結部であることができる。場合により、誘導ポリ核酸はヌクレオシド類似体を含むことができ、そのヌクレオシド類似体は、天然DNAヌクレオシドおよび天然RNAヌクレオシドであるデオキシシチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、およびチミジンのオキシ類似体またはデオキシ類似体であることができる。誘導ポリ核酸は、デオキシイノシンまたは5-ニトロインドールなどのユニバーサル塩基も含むことができる。誘導ポリ核酸は修飾主鎖および/または修飾ヌクレオシド間連結部も含むことができる。修飾主鎖としては、主鎖中にリン原子を保ちうるもの、および主鎖中にリン原子を有しないものを挙げることができる。リン原子をそこに含有する適切な修飾誘導ポリ核酸主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルその他のアルキルホスホネート、例えば3'-アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、および通常の3'-5'連結部を有するボラノホスフェート、2'-5'連結類似体、および1つまたは複数のヌクレオチド間連結部が3'→3'、5'→5'または2'→2'連結部であって極性が反転しているものを挙げることができる。反転した極性を有する適切な誘導ポリ核酸は、最も3'端のヌクレオチド間連結部にある単一の3'→3'連結部（すなわち、核酸塩基が欠けているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する、単一の反転ヌクレオシド残基）を含むことができる。
場合により、誘導ポリ核酸（例えばガイドRNA）は、5'末端または3'末端に、本質的に一本鎖でありうるテール領域も含むことができる。例えばテール領域は、場合によっては、関心対象の細胞においていかなる染色体配列にも相補的でなく、ガイドポリ核酸の残りの部分にも相補的でない場合がありうる。さらに、テール領域の長さはさまざまであることができる。テール領域は4ヌクレオチド長超または約4ヌクレオチド長超でありうる。例えばテール領域の長さは、5または約5〜60または約60ヌクレオチド長にわたりうる。
場合により、誘導ポリ核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）に隣接するゲノムの一領域に結合することができる。ガイド核酸は、5'末端または3'末端もしくはその近くに、標的核酸中の配列（例えばプロトスペーサー）にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列（例えばスペーサー）を含むことができる。ガイド核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対合）により、配列特異的に標的核酸と相互作用することができる。スペーサー配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の5'側または3'側に位置する標的配列にハイブリダイズすることができる。スペーサー配列の長さは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30ヌクレオチド、もしくはそれ以上、または少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約17、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、少なくとも約21、少なくとも約22、少なくとも約23、少なくとも約24、少なくとも約25、少なくとも約30ヌクレオチド、もしくはそれ以上でありうる。スペーサー配列の長さは、多くとも5、多くとも10、多くとも15、多くとも16、多くとも17、多くとも18、多くとも19、多くとも20、多くとも21、多くとも22、多くとも23、多くとも24、多くとも25、多くとも30ヌクレオチド、もしくはそれ以上、または多くとも約5、多くとも約10、多くとも約15、多くとも約16、多くとも約17、多くとも約18、多くとも約19、多くとも約20、多くとも約21、多くとも約22、多くとも約23、多くとも約24、多くとも約25、多くとも約30ヌクレオチド、もしくはそれ以上でありうる。場合により、誘導ポリ核酸は、PAMに隣接する約1〜約20塩基対の領域に結合することができる。別の例では、誘導ポリ核酸は、PAMから約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、もしくは約80塩基対から85塩基対まで離れて結合することができる。一般に、誘導ポリ核酸結合領域は、1つまたは複数の標的核酸配列を相補するまたは実質的に相補するように設計されうる。場合により、誘導ポリ核酸の結合領域には、複数の配列に結合するようにゆらぎ塩基または縮重塩基を組み入れることができる。場合により、結合領域は安定性を増加させるために改変することができる。例えば、分解に対するRNAの耐性を増加させるために、非天然ヌクレオチドを組み入れることができる。場合により、結合領域における二次構造形成が回避され、または低減するように、結合領域を改変または設計することができる。場合により、G-C含量が最適化されるように結合領域を設計することができる。場合により、G-C含量は、好ましくは、約40％〜約60％（例えば40％、45％、50％、55％、および60％）である。場合により、結合領域は、限定するわけではないがメチル化ヌクレオチドまたはリン酸化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含有することができる。
場合により、誘導ポリ核酸は、二次構造を形成することができる二本鎖二重領域も含むことができる。例えば、誘導ポリ核酸が形成する二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含むことができる。ループおよびステムの長さはさまざまであることができる。例えばループは約3〜約10ヌクレオチド長にわたることができ、ステムは約6〜約20塩基対長にわたることができる。ステムは、1〜約10ヌクレオチドのバルジを1つまたは複数含みうる。第2領域の全長は約16〜約60ヌクレオチド長にわたりうる。例えばループは4ヌクレオチド長であるか約4ヌクレオチド長であることができ、ステムは12塩基対であるか約12塩基対であることができる。場合により、5'ステム-ループ領域は、約15〜約50ヌクレオチド長（例えば約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または約50ヌクレオチド長）であることができる。場合により、5'ステム-ループ領域は約30〜45ヌクレオチド長（例えば約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、または約45ヌクレオチド長）である。場合により、5'ステム-ループ領域は少なくとも約31ヌクレオチド長（例えば少なくとも約少なくとも約31、少なくとも約32、少なくとも約33、少なくとも約34、少なくとも約35、少なくとも約36、少なくとも約37、少なくとも約38、少なくとも約39、少なくとも約40、少なくとも約41、少なくとも約42、少なくとも約43、少なくとも約44、または少なくとも約45ヌクレオチド長）である。場合により、5'ステム-ループ構造は、それぞれが約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、または約10ヌクレオチドであるループまたはバルジを1つまたは複数含有する。場合により、5'ステム-ループ構造は、約10〜30相補塩基対（例えば1 1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30相補塩基対）のステムを含有する。場合により、5'ステム-ループ構造は、タンパク質結合構造または小分子結合構造を含有することができる。場合により、5'ステム-ループ機能（例えば誘導ポリ核酸誘導型ヌクレアーゼとの相互作用またはアセンブリ）は、薬物、成長因子、小分子リガンド、または5'ステム-ループのタンパク質結合構造に結合するタンパク質により、条件的に活性化されうる。場合により、5'ステム-ループ構造は非天然ヌクレオチドを含有しうる。例えば、タンパク質-RNA相互作用、タンパク質DNA相互作用を増強するために、または誘導ポリ核酸の熱安定性もしくは分解に対する耐性を増加させるために、非天然ヌクレオチドを組み入れることができる。
場合により、誘導ポリ核酸は、5'ステム-ループ構造と3'ステム-ループ構造との間に、約10〜約50ヌクレオチド長（例えば約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または約50ヌクレオチド長）でありうる介在配列を有しうる。場合により、介在配列は、線状、構造不定、実質的に線状、または実質的に構造不定になるように、設計される。いくつかの態様において、介在配列は非天然ヌクレオチドを含有しうる。例えば、タンパク質-RNA相互作用を増強するために、またはgRNA:ヌクレアーゼ複合体の活性を増加させるために、非天然ヌクレオチドを組み入れることができる。別の例として、gRNAの熱安定性または分解に対する耐性を増強するために、天然ヌクレオチドを組み入れることができる。場合により、3'ステム-ループ構造は、約3、約4、約5、約6、約7、または約8ヌクレオチドのループと、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、もしくは約25ヌクレオチド、またはそれ以上のステムとを含有しうる。場合により、3'ステム-ループは、gRNAの二次構造および/または三次構造を条件的に安定化することができるタンパク質結合構造、小分子結合構造、ホルモン結合構造、または代謝産物結合構造を含有しうる。いくつかの態様において、3'ステム-ループは非天然ヌクレオチドを含有することができる。例えば、タンパク質-誘導核酸相互作用を増強するために、または誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ複合体の活性を増加させるために、非天然ヌクレオチドを組み入れることができる。別の例として、gRNAまたはgDNAの熱安定性または分解に対する耐性を増強するために、天然ヌクレオチドを組み入れることができる。
場合により、誘導ポリ核酸は、その3'末端に終端構造（termination structure）を含みうる。場合により、誘導ポリ核酸は、安定化または追加の機能性、例えば誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼのアセンブリまたは活性の条件的安定化または条件的調節のために、タンパク質、小分子、ホルモンなどと相互作用することができる追加の3'ヘアピン構造を、例えば終端構造の前に含みうる。場合により、安定性、アセンブリおよび/または発現を増強するために、誘導ポリ核酸を最適化することができる。場合により、誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ複合体の活性を、対照誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ構造または相当する誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ構造（gRNA、CRISPR RNP、非修飾gRNA、または非修飾誘導ポリ核酸）と比較して増強するために、誘導ポリ核酸を最適化することができる。場合により、誘導ポリ核酸は、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または付加によって、発現に関して最適化することができる。場合により、コードテンプレート核酸からの効率のよくない転写をもたらすヌクレオチド配列を欠失させるか、または置換することができる。例えば場合により、誘導ポリ核酸は、RNAポリメラーゼIIIプロモーターに機能的に連結された核酸から転写されうる。場合により、安定性が増加するように、誘導ポリ核酸を修飾することができる。安定性は、誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ相互作用の安定性を最適化し、誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ複合体のアセンブリを最適化し、RNAもしくはDNA不安定化配列要素を除去もしくは改変し、またはRNAもしくはDNA安定化配列要素を付加することによって、増強されうる。いくつかの態様において、誘導ポリ核酸は、誘導ポリ核酸-誘導型ヌクレアーゼと相互作用する結合領域の近位に、またはそれに隣接して、5'ステム-ループ構造を含有しうる。5'ステム-ループ構造の最適化は、誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ複合体の安定性またはアセンブリを増強させうる。場合により、5'ステム-ループ構造は、ステム-ループ構造のステム部分の長さを増加させることによって最適化される。例えば、最適化された誘導ポリ核酸を与えるための転写を増加させるために、5'ステム-ループの最適化を変異導入と組み合わせることができる。例えば、最適化された誘導ポリ核酸を得るために、A-Uフリップと延長されたステムループとを組み合わせることができる。
二本鎖誘導ポリ核酸二重領域は、アルゴノートタンパク質、アルゴノートポリペプチド、またはそれらの機能的部分などといったRNA結合タンパク質またはDNA結合タンパク質と複合体を形成することができるタンパク質結合セグメントを含みうる。
場合により、誘導ポリ核酸は修飾を含むことができる。修飾は化学修飾でありうる。修飾は、5'アデニレート、5'グアノシン三リン酸キャップ、5'N7-メチルグアノシン三リン酸キャップ、5'三リン酸キャップ、3'リン酸、3'チオリン酸、5'リン酸、5'チオリン酸、Cis-Synチミジン二量体、三量体、C12スペーサー、C3スペーサー、C6スペーサー、dスペーサー、PCスペーサー、rスペーサー、スペーサー18、スペーサー9、3'-3'修飾、5'-5'修飾、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンBB、ビオチンTEG、コレステリルTEG、デスチオビオチンTEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-ビオチン、デュアルビオチン、PCビオチン、ソラレンC2、ソラレンC6、TINA、3'DABCYL、ブラックホールクエンチャー（black hole quencher）1、ブラックホールクエンチャー2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、2'デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、2'デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、2'-O-メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ゆらぎ/ユニバーサル塩基、蛍光色素ラベル、2'フルオロRNA、2'O-メチルRNA、メチルリン酸、ホスホジエステルDNA、ホスホジエステルRNA、ホスホチオエートDNA、ホスホロチオエートRNA、UNA、プソイドウリジン-5'-三リン酸、5-メチルシチジン-5'-三リン酸、2-O-メチル3ホスホロチオエート、またはそれらの任意の組合せから選択することができる。修飾はプソイドウリジン修飾でありうる。場合により、修飾は生存能に影響を及ぼしえない。
場合により、修飾は2-O-メチル3ホスホロチオエート付加である。2-O-メチル3ホスホロチオエート付加は1塩基〜150塩基で行うことができる。2-O-メチル3ホスホロチオエート付加は1塩基〜4塩基で行うことができる。2-O-メチル3ホスホロチオエート付加は2塩基で行うことができる。2-O-メチル3ホスホロチオエート付加は4塩基で行うことができる。修飾はトランケーションであることもできる。トランケーションは5塩基トランケーションでありうる。誘導ポリ核酸は、当技術分野において公知の方法によって修飾することができる。場合により、修飾は、限定するわけではないが、例えば以下に挙げる配列要素のうちの1つまたは複数の付加を含みうる:5'キャップ（例えば7-メチルグアニレートキャップ）、3'ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列、安定性制御配列、ヘアピン、細胞内局在配列、検出配列もしくはラベル、または1つもしくは複数のタンパク質のための結合部位。修飾には、限定するわけではないが、蛍光ヌクレオチドおよびメチルかヌクレオチドのうちの1つまたは複数などといった、非天然ヌクレオチドの導入も含まれうる。いくつかの態様において、誘導ポリ核酸は、5'から3'に向かって、（i）約10〜約50ヌクレオチドの結合領域、（ii）4つ未満の連続ウラシルヌクレオチドまたは少なくとも31ヌクレオチド（例えば約31〜約41ヌクレオチド）の長さを含有する5'ヘアピン領域、（iii）3'ヘアピン領域、および（iv）転写終結配列を含有することができ、低分子ガイドRNAは、非修飾の複合体と比較して増大した安定性または活性を有する、誘導ポリ核酸誘導型ヌクレアーゼとの複合体を形成するように構成される。
ガイドRNAまたはガイドDNAは、20ヌクレオチドまたは約20ヌクレオチドの核酸配列を標的とすることができる。標的核酸は20ヌクレオチド未満または約20ヌクレオチド未満であることができる。標的核酸は、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30ヌクレオチド、またはそれ以上、または少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約17、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、少なくとも約21、少なくとも約22、少なくとも約23、少なくとも約24、少なくとも約25、少なくとも約30ヌクレオチド、またはそれ以上であることができる。標的核酸は、多くとも5、多くとも10、多くとも15、多くとも16、多くとも17、多くとも18、多くとも19、多くとも20、多くとも21、多くとも22、多くとも23、多くとも24、多くとも25、多くとも30ヌクレオチド、またはそれ以上、または多くとも約5、多くとも約10、多くとも約15、多くとも約16、多くとも約17、多くとも約18、多くとも約19、多くとも約20、多くとも約21、多くとも約22、多くとも約23、多くとも約24、多くとも約25、多くとも約30ヌクレオチド、またはそれ以上であることができる。標的核酸配列はPAMの第1ヌクレオチドのすぐ5'側の20塩基または約20塩基であることができる。ガイドRNAまたはガイドDNAは、遺伝子またはその一部分を含む核酸配列を標的とすることができる。
ガイドRNAまたはガイドDNAは、遺伝子を含むゲノム配列を標的とすることができる。標的とすることができる遺伝子は疾患に関与しうる。疾患は、がん、心血管病態、生殖器病態、神経学的疾患、免疫学的疾患、臓器病態、変性、眼病態、糖尿病、血管病態、または胃腸病態でありうる。
破壊されうる遺伝子は、遺伝子ファミリーのメンバーでありうる。例えば、破壊されうる遺伝子はがん免疫療法の治療可能性を改良することができる。破壊されうる遺伝子は、ヒト遺伝性疾患に関連する1つまたは複数の症状または合併症を改善することができる。
破壊されうる遺伝子は、TCRのシグナリング、機能的アビディティまたはがんに対する免疫の減弱に関与しうる。場合により、破壊される遺伝子は、TCRが刺激された時に、アップレギュレートされる。遺伝子は、細胞の拡大増殖、機能的アビディティまたはサイトカインの多機能性の阻害に関与しうる。遺伝子は、細胞のサイトカイン生産の負の調節に関与しうる。例えば、遺伝子は、IFN-γおよび/またはTNFなどのエフェクターサイトカインの生産の阻害に関与しうる。遺伝子は、TCR刺激後のIL-2などの補助的サイトカイン（supportive cytokine）の発現の阻害にも関与しうる。
疾患は新形成でありうる。新形成に関連する遺伝子は、PTEN、ATM、ATR、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、AKT、AKT2、AKT3、HIF、HIF1a、HIF3a、Met、HRG、Bcl2、PPARα、PPARγ、WT1（ウィルムス腫瘍）、FGF受容体ファミリーメンバー（5つのメンバー:1、2、3、4、5）、CDKN2a、APC、RB（網膜芽細胞腫）、MEN1、VHL、BRCA1、BRCA2、AR（アンドロゲン受容体）、TSG101、IGF、IGF受容体、Igf1（4つの変異体）、Igf2（3つの変異体）、Igf1受容体、Igf2受容体、Bax、Bcl2、カスパーゼファミリー（9つのメンバー:1、2、3、4、6、7、8、9、12）、Kras、Apcでありうる。疾患は加齢黄斑変性症でありうる。黄斑変性症に関連する遺伝子は、Abcr、Ccl2、Cc2、cp（セルロプラスミン）、Timp3、カテプシンD、Vldlr、Ccr2でありうる。疾患は統合失調症でありうる。統合失調症に関連する遺伝子は、ニューレグリン1（Nrg1）、Erb4（ニューレグリンの受容体）、コンプレキシン1（Cplx1）、Tph1トリプトファンヒドロキシラーゼ、Tph2トリプトファンヒドロキシラーゼ2、ニューレキシン1、GSK3、GSK3a、GSK3bでありうる。障害は、5-HTT（Slc6a4）、COMT、DRD（Drd1a）、SLC6A3、DAOA、DTNBP1、Dao（Dao1）などの遺伝子に関連しうる。疾患はトリヌクレオチドリピート障害でありうる。トリヌクレオチドリピート障害は、HTT（ハンチントン病診断）、SBMA/SMAX1/AR（ケネディー病診断）、FXN/X25（フリードライヒ運動失調症）、ATX3（マシャド・ジョセフ病診断）、ATXN1およびATXN2（脊髄小脳失調症）、DMPK（筋緊張性ジストロフィー）、アトロフィン-1およびAtn1（DRPLA診断）、CBP（Creb-BP広域不安定性（global instability））、VLDLR（アルツハイマー病）、Atxn7、Atxn10などの遺伝子に関連しうる。疾患は脆弱X症候群でありうる。脆弱X症候群に関連する遺伝子はFMR2、FXR1、FXR2、mGLUR5でありうる。疾患は、関連遺伝子がAPH-1（αおよびβ）、プレセニリン（Psen1）、ニカストリン（Ncstn）、PEN-2、Nos1、Parp1、Nat1、Nat2から選択されるセクレターゼ関連疾患でありうる。疾患はプリオン関連障害であることができ、この場合、関連遺伝子はPrpから選択される。疾患はALSであることができ、この場合、関連遺伝子はSOD1、ALS2、STEX、FUS、TARDBP、VEGF（VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c）である。疾患は薬物嗜癖であることができ、この場合、関連遺伝子はPrkce（アルコール）、Drd2、Drd4、ABAT（アルコール）、GRIA2、Grm5、Grin1、Htr1b、Grin2a、Drd3、Pdyn、Gria1（アルコール）である。疾患は自閉症であることができ、この場合、関連遺伝子はMecp2、BZRAP1、MDGA2、Sema5A、ニューレキシン1、脆弱X（FMR2（AFF2）、FXR1、FXR2、Mglur5）から選択される。疾患はアルツハイマー病であることができ、この場合、関連遺伝子は、E1、CHIP、UCH、UBB、Tau、LRP、PICALM、クラスタリン、PS1、SORL1、CR1、Vldlr、Uba1、Uba3、CHIP28（Aqp1、アクアポリン1）、Uchl1、Uchl3、APPから選択される。疾患は炎症であることができ、この場合、関連遺伝子はIL-10、IL-1（IL-1a、IL-1b）、IL-13、IL-17（IL-17a（CTLA8）、IL-17b、IL-17c、IL-17d、IL-17f）、II-23、Cx3cr1、ptpn22、TNFa、NOD2/CARD15（IBDの場合）、IL-6、IL-12（IL-12a、IL-12b）、CTLA4、Cx3cl1から選択される。疾患はパーキンソン病であることができ、この場合、関連遺伝子はx-シヌクレイン、DJ-1、LRRK2、Parkin、PINK1から選択される。疾患は血液障害および凝固障害でありうる:貧血（CDAN1、CDA1、RPS19、DBA、PKLR、PK1、NT5C3、UMPH1、PSN1、RHAG、RH50A、NRAMP2、SPTB、ALAS2、ANH1、ASB、ABCB7、ABC7、ASAT）、裸リンパ球症候群（TAPBP、TPSN、TAP2、ABCB3、PSF2、RING11、MHC2TA、C2TA、RFX5、RFXAP、RFX5）、出血性障害（TBXA2R、P2RX1、P2X1）、H因子およびH因子様1（HF1、CFH、HUS）、第V因子および第VIII因子（MCFD2）、第VII因子欠損症（F7）、第X因子欠損症（F10）、第XI因子欠損症（F11）、第XII因子欠損症（F12、HAF）、第XIIIA因子欠損症（F13A1、F13A）、第XIIIB因子欠損症（F13B）、ファンコニ貧血（FANCA、FACA、FA1、FA、FAA、FAAP95、FAAP90、FLJ34064、FANCB、FANCC、FACC、BRCA2、FANCD1、FANCD2、FANCD、FACD、FAD、FANCE、FACE、FANCF、XRCC9、FANCG、BRIP1、BACH1、FANCJ、PHF9、FANCL、FANCM、KIAA1596）、血球貪食性リンパ組織球症障害（PRF1、HPLH2、UNC13D、MUNC13-4、HPLH3、HLH3、FHL3）、血友病A（F8、F8C、HEMA）、血友病B（F9、HEMB）、出血性障害（PI、ATT、F5）、白血球不全症および白血球障害（ITGB2、CD18、LCAMB、LAD、EIF2B1、EIF2BA、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B5、LVWM、CACH、CLE、EIF2B4）、鎌状赤血球貧血（HBB）、サラセミア（HBA2、HBB、HBD、LCRB、HBA1）。細胞調節不全ならびに腫瘍性疾患および腫瘍性障害:B細胞非ホジキンリンパ腫（BCL7A、BCL7）、白血病（TAL1 TCL5、SCL、TAL2、FLT3、NBS1、NBS、ZNFN1A1、IK1、LYF1、HOXD4、HOX4B、BCR、CML、PHL、ALL、ARNT、KRAS2、RASK2、GMPS、AF10、ARHGEF12、LARG、KIAA0382、CALM、CLTH、CEBPA、CEBP、CHIC2、BTL、FLT3、KIT、PBT、LPP、NPM1、NUP214、D9S46E、CAN、CAIN、RUNX1、CBFA2、AML1、WHSC1L1、NSD3、FLT3、AF1Q、NPM1、NUMA1、ZNF145、PLZF、PML、MYL、STAT5B、AF10、CALM、CLTH、ARL11、ARLTS1、P2RX7、P2X7、BCR、CML、PHL、ALL、GRAF、NF1、VRNF、WSS、NFNS、PTPN11、PTP2C、SHP2、NS1、BCL2、CCND1、PRAD1、BCL1、TCRA、GATA1、GF1、ERYF1、NFE1、ABL1、NQO1、DIA4、NMOR1、NUP214、D9S46E、CAN、CAIN）。疾患は炎症ならびに/または免疫関連疾患および免疫関連障害でありうる:AIDS（KIR3DL1、NKAT3、NKB1、AMB11、KIR3DS1、IFNG、CXCL12、SDF1）、自己免疫性リンパ球増殖症候群（TNFRSF6、APT1、FAS、CD95、ALPS1A）、複合型免疫不全（IL2RG、SCIDX1、SCIDX、IMD4）、HIV-1（CCL5、SCYA5、D17S136E、TCP228）、HIV感受性またはHIV感染（IL10、CSIF、CMKBR2、CCR2、CMKBR5、CCCKR5（CCR5））、免疫不全（CD3E、CD3G、AICDA、AID、HIGM2、TNFRSF5、CD40、UNG、DGU、HIGM4、TNFSF5、CD40LG、HIGM1、IGM、FOXP3、IPEX、AIID、XPID、PIDX、TNFRSF14B、TACI）、炎症（IL-10、IL-1（IL-1a、IL-1b）、IL-13、IL-17（IL-17a（CTLA8）、IL-17b、IL-17c、IL-17d、IL-17f）、II-23、Cx3cr1、ptpn22、TNFa、NOD2/CARD15（IBDの場合）、IL-6、IL-12（IL-12a、IL-12b）、CTLA4、Cx3cl1）、重症複合免疫不全症（SCID）（JAK3、JAKL、DCLRE1C、ARTEMIS、SCIDA、RAG1、RAG2、ADA、PTPRC、CD45、LCA、IL7R、CD3D、T3D、IL2RG、SCIDX1、SCIDX、IMD4）。疾患は代謝病、肝臓病、腎臓病、およびタンパク質病ならびに代謝障害、肝障害、腎障害、およびタンパク質障害でありうる:アミロイドニューロパチー（TTR、PALB）、アミロイドーシス（APOA1、APP、AAA、CVAP、AD1、GSN、FGA、LYZ、TTR、PALB）、肝硬変（KRT18、KRT8、CIRH1A、NAIC、TEX292、KIAA1988）、嚢胞性線維症（CFTR、ABCC7、CF、MRP7）、糖原病（SLC2A2、GLUT2、G6PC、G6PT、G6PT1、GAA、LAMP2、LAMPB、AGL、GDE、GBE1、GYS2、PYGL、PFKM）、肝腺腫 142330（TCF1、HNF1A、MODY3）、早発性肝不全および神経障害（Hepatic failure,early onset,and neurologic disorder）（SCOD1、SCO1）、肝リパーゼ欠損症（LIPC）、肝芽腫、がんおよびがん種（CTNNB1、PDGFRL、PDGRL、PRLTS、AXIN1、AXIN、CTNNB1、TP53、P53、LFS1、IGF2R、MPRI、MET、CASP8、MCH5、髄質嚢胞性腎疾患（UMOD、HNFJ、FJHN、MCKD2、ADMCKD2）、フェニルケトン尿症（PAH、PKU1、QDPR、DHPR、PTS）、多発性嚢胞腎および肝疾患（FCYT、PKHD1、ARPKD、PKD1、PKD2、PKD4、PKDTS、PRKCSH、G19P1、PCLD、SEC63）。疾患は筋/骨格疾患および筋/骨格障害でありうる:ベッカー型筋ジストロフィー（DMD、BMD、MYF6）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD、BMD）、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（LMNA、LMN1、EMD2、FPLD、CMD1A、HGPS、LGMD1B、LMNA、LMN1、EMD2、FPLD、CMD1A）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHMD1A、FSHD1A）、筋ジストロフィー（FKRP、MDC1C、LGMD2I、LAMA2、LAMM、LARGE、KIAA0609、MDC1D、FCMD、TTID、MYOT、CAPN3、CANP3、DYSF、LGMD2B、SGCG、LGMD2C、DMDA1、SCG3、SGCA、ADL、DAG2、LGMD2D、DMDA2、SGCB、LGMD2E、SGCD、SGD、LGMD2F、CMD1L、TCAP、LGMD2G、CMD1N、TRIM32、HT2A、LGMD2H、FKRP、MDC1C、LGMD2I、TTN、CMD1G、TMD、LGMD2J、POMT1、CAV3、LGMD1C、SEPN1、SELN、RSMD1、PLEC1、PLTN、EBS1）、大理石骨病（LRP5、BMND1、LRP7、LR3、OPPG、VBCH2、CLCN7、CLC7、OPTA2、OSTM1、GL、TCIRG1、TIRC7、OC116、OPTB1）、筋萎縮（VAPB、VAPC、ALS8、SMN1、SMA1、SMA2、SMA3、SMA4、BSCL2、SPG17、GARS、SMAD1、CMT2D、HEXB、IGHMBP2、SMUBP2、CATF1、SMARD1）。疾患は神経学的疾患および神経学的障害ならびに神経細胞疾患および神経細胞障害でありうる:ALS（SOD1、ALS2、STEX、FUS、TARDBP、VEGF（VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c））、アルツハイマー病（APP、AAA、CVAP、AD1、APOE、AD2、PSEN2、AD4、STM2、APBB2、FE65L1、NOS3、PLAU、URK、ACE、DCP1、ACE1、MPO、PACIP1、PAXIP1L、PTIP、A2M、BLMH、BMH、PSEN1、AD3）、自閉症（Mecp2、BZRAP1、MDGA2、Sema5A、ニューレキシン1、GLO1、MECP2、RTT、PPMX、MRX16、MRX79、NLGN3、NLGN4、KIAA1260、AUTSX2）、脆弱X症候群（FMR2、FXR1、FXR2、mGLUR5）、ハンチントン病およびハンチントン病様障害（HD、IT15、PRNP、PRIP、JPH3、JP3、HDL2、TBP、SCA17）、パーキンソン病（NR4A2、NURR1、NOT、TINUR、SNCAIP、TBP、SCA17、SNCA、NACP、PARK1、PARK4、DJ1、PARK7、LRRK2、PARK8、PINK1、PARK6、UCHL1、PARK5、SNCA、NACP、PARK1、PARK4、PRKN、PARK2、PDJ、DBH、NDUFV2）、レット症候群（MECP2、RTT、PPMX、MRX16、MRX79、CDKL5、STK9、MECP2、RTT、PPMX、MRX16、MRX79、x-シヌクレイン、DJ-1）、統合失調症（ニューレグリン1（Nrg1）、Erb4（ニューレグリンの受容体）、コンプレキシン1（Cplx1）、Tph1トリプトファンヒドロキシラーゼ、Tph2、トリプトファンヒドロキシラーゼ2、ニューレキシン 1、GSK3、GSK3a、GSK3b、5-HTT（Slc6a4）、COMT、DRD（Drd1a）、SLC6A3、DAOA、DTNBP1、Dao（Dao1））、セクレターゼ関連障害（APH-1（αおよびβ）、プレセニリン（Psen1）、ニカストリン（Ncstn）、PEN-2、Nos1、Parp1、Nat1、Nat2）、トリヌクレオチドリピート障害（HTT（ハンチントン病診断）、SBMA/SMAX1/AR（ケネディー病診断）、FXN/X25（フリードライヒ運動失調症）、ATX3（マシャド・ジョセフ病診断）、ATXN1およびATXN2（脊髄小脳失調症）、DMPK（筋緊張性ジストロフィー）、アトロフィン-1およびAtn1（DRPLA診断）、CBP（Creb-BP-広域不安定性）、VLDLR（アルツハイマー病）、Atxn7、Atxn10）。疾患は眼疾患および/または眼障害でありうる:加齢黄斑変性症（Abcr、Ccl2、Cc2、cp（セルロプラスミン）、Timp3、カテプシンD、Vldlr、Ccr2）、白内障（CRYAA、CRYA1、CRYBB2、CRYB2、PITX3、BFSP2、CP49、CP47、CRYAA、CRYA1、PAX6、AN2、MGDA、CRYBA1、CRYB1、CRYGC、CRYG3、CCL、LIM2、MP19、CRYGD、CRYG4、BFSP2、CP49、CP47、HSF4、CTM、HSF4、CTM、MIP、AQP0、CRYAB、CRYA2、CTPP2、CRYBB1、CRYGD、CRYG4、CRYBB2、CRYB2、CRYGC、CRYG3、CCL、CRYAA、CRYA1、GJA8、CX50、CAE1、GJA3、CX46、CZP3、CAE3、CCM1、CAM、KRIT1）、角膜混濁および角膜ジストロフィー（APOA1、TGFBI、CSD2、CDGG1、CSD、BIGH3、CDG2、TACSTD2、TROP2、M1S1、VSX1、RINX、PPCD、PPD、KTCN、COL8A2、FECD、PPCD2、PIP5K3、CFD）、先天性扁平角膜（KERA、CNA2）、緑内障（MYOC、TIGR、GLC1A、JOAG、GPOA、OPTN、GLC1E、FIP2、HYPL、NRP、CYP1B1、GLC3A、OPA1、NTG、NPG、CYP1B1、GLC3A）、レーバー先天黒内障（CRB1、RP12、CRX、CORD2、CRD、RPGRIP1、LCA6、CORD9、RPE65、RP20、AIPL1、LCA4、GUCY2D、GUC2D、LCA1、CORD6、RDH12、LCA3）、黄斑ジストロフィー（ELOVL4、ADMD、STGD2、STGD3、RDS、RP7、PRPH2、PRPH、AVMD、AOFMD、VMD2）。
場合により、本開示の編集システムで処置されうる疾患は、細胞の状態と関連しうる。例えば細胞のパフォーマンスに関連する遺伝子を本開示の編集システムで破壊することができる:PI3K/AKTシグナリング:PRKCE、ITGAM、ITGA5、IRAK1、PRKAA2、EIF2AK2、PTEN、EIF4E、PRKCZ、GRK6、MAPK1、TSC1、PLK1、AKT2、IKBKB、PIK3CA、CDK8、CDKN1B、NFKB2、BCL2、PIK3CB、PPP2R1A、MAPK8、BCL2L1、MAPK3、TSC2、ITGA1、KRAS、EIF4EBP1、RELA、PRKCD、NOS3、PRKAA1、MAPK9、CDK2、PPP2CA、PIM1、ITGB7、YWHAZ、ILK、TP53、RAF1、IKBKG、RELB、DYRK1A、CDKN1A、ITGB1、MAP2K2、JAK1、AKT1、JAK2、PIK3R1、CHUK、PDPK1、PPP2R5C、CTNNB1、MAP2K1、NFKB1、PAK3、ITGB3、CCND1、GSK3A、FRAP1、SFN、ITGA2、TTK、CSNK1A1、BRAF、GSK3B、AKT3、FOXO1、SGK、HSP90AA1、RPS6KB1。例えば、ERK/MAPKシグナリング:PRKCE、ITGAM、ITGA5、HSPB1、IRAK1、PRKAA2、EIF2AK2、RAC1、RAP1A、TLN1、EIF4E、ELK1、GRK6、MAPK1、RAC2、PLK1、AKT2、PIK3CA、CDK8、CREB1、PRKCI、PTK2、FOS、RPS6KA4、PIK3CB、PPP2R1A、PIK3C3、MAPK8、MAPK3、ITGA1、ETS1、KRAS、MYCN、EIF4EBP1、PPARG、PRKCD、PRKAA1、MAPK9、SRC、CDK2、PPP2CA、PIM1、PIK3C2A、ITGB7、YWHAZ、PPP1CC、KSR1、PXN、RAF1、FYN、DYRK1A、ITGB1、MAP2K2、PAK4、PIK3R1、STAT3、PPP2R5C、MAP2K1、PAK3、ITGB3、ESR1、ITGA2、MYC、TTK、CSNK1A1、CRKL、BRAF、ATF4、PRKCA、SRF、STAT1、SGK。グルココルチコイド受容体シグナリング:RAC1、TAF4B、EP300、SMAD2、TRAF6、PCAF、ELK1、MAPK1、SMAD3、AKT2、IKBKB、NCOR2、UBE2I、PIK3CA、CREB1、FOS、HSPA5、NFKB2、BCL2、MAP3K14、STAT5B、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、BCL2L1、MAPK3、TSC22D3、MAPK10、NRIP1、KRAS、MAPK13、RELA、STAT5A、MAPK9、NOS2A、PBX1、NR3C1、PIK3C2A、CDKN1C、TRAF2、セルピンE1、NCOA3、MAPK14、TNF、RAF1、IKBKG、MAP3K7、CREBBP、CDKN1A、MAP2K2、JAK1、IL8、NCOA2、AKT1、JAK2、PIK3R1、CHUK、STAT3、MAP2K1、NFKB1、TGFBR1、ESR1、SMAD4、CEBPB、JUN、AR、AKT3、CCL2、MMP1、STAT1、IL6、HSP90AA1。軸索ガイダンスシグナリング:PRKCE、ITGAM、ROCK1、ITGA5、CXCR4、ADAM12、IGF1、RAC1、RAP1A、E1F4E、PRKCZ、NRP1、NTRK2、ARHGEF7、SMO、ROCK2、MAPK1、PGF、RAC2、PTPN11、GNAS、AKT2、PIK3CA、ERBB2、PRKCI、PTK2、CFL1、GNAQ、PIK3CB、CXCL12、PIK3C3、WNT11、PRKD1、GNB2L1、ABL1、MAPK3、ITGA1、KRAS、RHOA、PRKCD、PIK3C2A、ITGB7、GLI2、PXN、VASP、RAF1、FYN、ITGB1、MAP2K2、PAK4、ADAM17、AKT1、PIK3R1、GLI1、WNT5A、ADAM10、MAP2K1、PAK3、ITGB3、CDC42、VEGFA、ITGA2、EPHA8、CRKL、RND1、GSK3B、AKT3、PRKCA。エフリン受容体シグナリング:PRKCE、ITGAM、ROCK1、ITGA5、CXCR4、IRAK1、PRKAA2、EIF2AK2、RAC1、RAP1A、GRK6、ROCK2、MAPK1、PGF、RAC2、PTPN11、GNAS、PLK1、AKT2、DOK1、CDK8、CREB1、PTK2、CFL1、GNAQ、MAP3K14、CXCL12、MAPK8、GNB2L1、ABL1、MAPK3、ITGA1、KRAS、RHOA、PRKCD、PRKAA1、MAPK9、SRC、CDK2、PIM1、ITGB7、PXN、RAF1、FYN、DYRK1A、ITGB1、MAP2K2、PAK4、AKT1、JAK2、STAT3、ADAM10、MAP2K1、PAK3、ITGB3、CDC42、VEGFA、ITGA2、EPHA8、TTK、CSNK1A1、CRKL、BRAF、PTPN13、ATF4、AKT3、SGK。アクチン細胞骨格シグナリング:ACTN4、PRKCE、ITGAM、ROCK1、ITGA5、IRAK1、PRKAA2、EIF2AK2、RAC1、INS、ARHGEF7、GRK6、ROCK2、MAPK1、RAC2、PLK1、AKT2、PIK3CA、CDK8、PTK2、CFL1、PIK3CB、MYH9、DIAPH1、PIK3C3、MAPK8、F2R、MAPK3、SLC9A1、ITGA1、KRAS、RHOA、PRKCD、PRKAA1、MAPK9、CDK2、PIM1、PIK3C2A、ITGB7、PPP1CC、PXN、VIL2、RAF1、GSN、DYRK1A、ITGB1、MAP2K2、PAK4、PIP5K1A、PIK3R1、MAP2K1、PAK3、ITGB3、CDC42、APC、ITGA2、TTK、CSNK1A1、CRKL、BRAF、VAV3、SGK。ハンチントン病シグナリング:PRKCE、IGF1、EP300、RCOR1、PRKCZ、HDAC4、TGM2、MAPK1、CAPNS1、AKT2、EGFR、NCOR2、SP1、CAPN2、PIK3CA、HDAC5、CREB1、PRKC1、HSPA5、REST、GNAQ、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、IGF1R、PRKD1、GNB2L1、BCL2L1、CAPN1、MAPK3、CASP8、HDAC2、HDAC7A、PRKCD、HDAC11、MAPK9、HDAC9、PIK3C2A、HDAC3、TP53、CASP9、CREBBP、AKT1、PIK3R1、PDPK1、CASP1、APAF1、FRAP1、CASP2、JUN、BAX、ATF4、AKT3、PRKCA、CLTC、SGK、HDAC6、CASP3。アポトーシスシグナリング:PRKCE、ROCK1、BID、IRAK1、PRKAA2、EIF2AK2、BAK1、BIRC4、GRK6、MAPK1、CAPNS1、PLK1、AKT2、IKBKB、CAPN2、CDK8、FAS、NFKB2、BCL2、MAP3K14、MAPK8、BCL2L1、CAPN1、MAPK3、CASP8、KRAS、RELA、PRKCD、PRKAA1、MAPK9、CDK2、PIM1、TP53、TNF、RAF1、IKBKG、RELB、CASP9、DYRK1A、MAP2K2、CHUK、APAF1、MAP2K1、NFKB1、PAK3、LMNA、CASP2、BIRC2、TTK、CSNK1A1、BRAF、BAX、PRKCA、SGK、CASP3、BIRC3、PARP1。B細胞受容体シグナリング:RAC1、PTEN、LYN、ELK1、MAPK1、RAC2、PTPN11、AKT2、IKBKB、PIK3CA、CREB1、SYK、NFKB2、CAMK2A、MAP3K14、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、BCL2L1、ABL1、MAPK3、ETS1、KRAS、MAPK13、RELA、PTPN6、MAPK9、EGR1、PIK3C2A、BTK、MAPK14、RAF1、IKBKG、RELB、MAP3K7、MAP2K2、AKT1、PIK3R1、CHUK、MAP2K1、NFKB1、CDC42、GSK3A、FRAP1、BCL6、BCL10、JUN、GSK3B、ATF4、AKT3、VAV3、RPS6KB1。白血球血管外漏出シグナリング:ACTN4、CD44、PRKCE、ITGAM、ROCK1、CXCR4、CYBA、RAC1、RAP1A、PRKCZ、ROCK2、RAC2、PTPN11、MMP14、PIK3CA、PRKCI、PTK2、PIK3CB、CXCL12、PIK3C3、MAPK8、PRKD1、ABL1、MAPK10、CYBB、MAPK13、RHOA、PRKCD、MAPK9、SRC、PIK3C2A、BTK、MAPK14、NOX1、PXN、VIL2、VASP、ITGB1、MAP2K2、CTNND1、PIK3R1、CTNNB1、CLDN1、CDC42、F11R、ITK、CRKL、VAV3、CTTN、PRKCA、MMP1、MMP9。インテグリンシグナリング:ACTN4、ITGAM、ROCK1、ITGA5、RAC1、PTEN、RAP1A、TLN1、ARHGEF7、MAPK1、RAC2、CAPNS1、AKT2、CAPN2、PIK3CA、PTK2、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、CAV1、CAPN1、ABL1、MAPK3、ITGA1、KRAS、RHOA、SRC、PIK3C2A、ITGB7、PPP1CC、ILK、PXN、VASP、RAF1、FYN、ITGB1、MAP2K2、PAK4、AKT1、PIK3R1、TNK2、MAP2K1、PAK3、ITGB3、CDC42、RND3、ITGA2、CRKL、BRAF、GSK3B、AKT3。急性期応答シグナリング:IRAK1、SOD2、MYD88、TRAF6、ELK1、MAPK1、PTPN11、AKT2、IKBKB、PIK3CA、FOS、NFKB2、MAP3K14、PIK3CB、MAPK8、RIPK1、MAPK3、IL6ST、KRAS、MAPK13、IL6R、RELA、SOCS1、MAPK9、FTL、NR3C1、TRAF2、セルピンE1、MAPK14、TNF、RAF1、PDK1、IKBKG、RELB、MAP3K7、MAP2K2、AKT1、JAK2、PIK3R1、CHUK、STAT3、MAP2K1、NFKB1、FRAP1、CEBPB、JUN、AKT3、IL1R1、IL6。PTENシグナリング:ITGAM、ITGA5、RAC1、PTEN、PRKCZ、BCL2L11、MAPK1、RAC2、AKT2、EGFR、IKBKB、CBL、PIK3CA、CDKN1B、PTK2、NFKB2、BCL2、PIK3CB、BCL2L1、MAPK3、ITGA1、KRAS、ITGB7、ILK、PDGFRB、INSR、RAF1、IKBKG、CASP9、CDKN1A、ITGB1、MAP2K2、AKT1、PIK3R1、CHUK、PDGFRA、PDPK1、MAP2K1、NFKB1、ITGB3、CDC42、CCND1、GSK3A、ITGA2、GSK3B、AKT3、FOXO1、CASP3、RPS6KB1。p53シグナリング:PTEN、EP300、BBC3、PCAF、FASN、BRCA1、GADD45A、BIRC5、AKT2、PIK3CA、CHEK1、TP53INP1、BCL2、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、THBS1、ATR、BCL2L1、E2F1、PMAIP1、CHEK2、TNFRSF10B、TP73、RB1、HDAC9、CDK2、PIK3C2A、MAPK14、TP53、LRDD、CDKN1A、HIPK2、AKT1、PIK3R1、RRM2B、APAF1、CTNNB1、SIRT1、CCND1、PRKDC、ATM、SFN、CDKN2A、JUN、SNAI2、GSK3B、BAX、AKT3。アリール炭化水素受容体シグナリング:HSPB1、EP300、FASN、TGM2、RXRA、MAPK1、NQO1、NCOR2、SP1、ARNT、CDKN1B、FOS、CHEK1、SMARCA4、NFKB2、MAPK8、ALDH1A1、ATR、E2F1、MAPK3、NRIP1、CHEK2、RELA、TP73、GSTP1、RB1、SRC、CDK2、AHR、NFE2L2、NCOA3、TP53、TNF、CDKN1A、NCOA2、APAF1、NFKB1、CCND1、ATM、ESR1、CDKN2A、MYC、JUN、ESR2、BAX、IL6、CYP1B1、HSP90AA1。異物代謝シグナリング:PRKCE、EP300、PRKCZ、RXRA、MAPK1、NQO1、NCOR2、PIK3CA、ARNT、PRKCI、NFKB2、CAMK2A、PIK3CB、PPP2R1A、PIK3C3、MAPK8、PRKD1、ALDH1A1、MAPK3、NRIP1、KRAS、MAPK13、PRKCD、GSTP1、MAPK9、NOS2A、ABCB1、AHR、PPP2CA、FTL、NFE2L2、PIK3C2A、PPARGC1A、MAPK14、TNF、RAF1、CREBBP、MAP2K2、PIK3R1、PPP2R5C、MAP2K1、NFKB1、KEAP1、PRKCA、EIF2AK3、IL6、CYP1B1、HSP90AA1。SAPK/JNKシグナリング:PRKCE、IRAK1、PRKAA2、EIF2AK2、RAC1、ELK1、GRK6、MAPK1、GADD45A、RAC2、PLK1、AKT2、PIK3CA、FADD、CDK8、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、RIPK1、GNB2L1、IRS1、MAPK3、MAPK10、DAXX、KRAS、PRKCD、PRKAA1、MAPK9、CDK2、PIM1、PIK3C2A、TRAF2、TP53、LCK、MAP3K7、DYRK1A、MAP2K2、PIK3R1、MAP2K1、PAK3、CDC42、JUN、TTK、CSNK1A1、CRKL、BRAF、SGK。PPAr/RXRシグナリング:PRKAA2、EP300、INS、SMAD2、TRAF6、PPARA、FASN、RXRA、MAPK1、SMAD3、GNAS、IKBKB、NCOR2、ABCA1、GNAQ、NFKB2、MAP3K14、STAT5B、MAPK8、IRS1、MAPK3、KRAS、RELA、PRKAA1、PPARGC1A、NCOA3、MAPK14、INSR、RAF1、IKBKG、RELB、MAP3K7、CREBBP、MAP2K2、JAK2、CHUK、MAP2K1、NFKB1、TGFBR1、SMAD4、JUN、IL1R1、PRKCA、IL6、HSP90AA1、ADIPOQ。NF-KBシグナリング:IRAK1、EIF2AK2、EP300、INS、MYD88、PRKCZ:TRAF6、TBK1、AKT2、EGFR、IKBKB、PIK3CA、BTRC、NFKB2、MAP3K14、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、RIPK1、HDAC2、KRAS、RELA、PIK3C2A、TRAF2、TLR4:PDGFRB、TNF、INSR、LCK、IKBKG、RELB、MAP3K7、CREBBP、AKT1、PIK3R1、CHUK、PDGFRA、NFKB1、TLR2、BCL10、GSK3B、AKT3、TNFAIP3、IL1R1。ニューレグリンシグナリング:ERBB4、PRKCE、ITGAM、ITGA5:PTEN、PRKCZ、ELK1、MAPK1、PTPN11、AKT2、EGFR、ERBB2、PRKCI、CDKN1B、STAT5B、PRKD1、MAPK3、ITGA1、KRAS、PRKCD、STAT5A、SRC、ITGB7、RAF1、ITGB1、MAP2K2、ADAM17、AKT1、PIK3R1、PDPK1、MAP2K1、ITGB3、EREG、FRAP1、PSEN1、ITGA2、MYC、NRG1、CRKL、AKT3、PRKCA、HSP90AA1、RPS6KB1。Wntおよびβカテニンシグナリング:CD44、EP300、LRP6、DVL3、CSNK1E、GJA1、SMO、AKT2、PIN1、CDH1、BTRC、GNAQ、MARK2、PPP2R1A、WNT11、SRC、DKK1、PPP2CA、SOX6、SFRP2:ILK、LEF1、SOX9、TP53、MAP3K7、CREBBP、TCF7L2、AKT1、PPP2R5C、WNT5A、LRP5、CTNNB1、TGFBR1、CCND1、GSK3A、DVL1、APC、CDKN2A、MYC、CSNK1A1、GSK3B、AKT3、SOX2。インスリン受容体シグナリング:PTEN、INS、EIF4E、PTPN1、PRKCZ、MAPK1、TSC1、PTPN11、AKT2、CBL、PIK3CA、PRKCI、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、IRS1、MAPK3、TSC2、KRAS、EIF4EBP1、SLC2A4、PIK3C2A、PPP1CC、INSR、RAF1、FYN、MAP2K2、JAK1、AKT1、JAK2、PIK3R1、PDPK1、MAP2K1、GSK3A、FRAP1、CRKL、GSK3B、AKT3、FOXO1、SGK、RPS6KB1。IL-6シグナリング:HSPB1、TRAF6、MAPKAPK2、ELK1、MAPK1、PTPN11、IKBKB、FOS、NFKB2:MAP3K14、MAPK8、MAPK3、MAPK10、IL6ST、KRAS、MAPK13、IL6R、RELA、SOCS1、MAPK9、ABCB1、TRAF2、MAPK14、TNF、RAF1、IKBKG、RELB、MAP3K7、MAP2K2、IL8、JAK2、CHUK、STAT3、MAP2K1、NFKB1、CEBPB、JUN、IL1R1、SRF、IL6。肝胆汁うっ滞:PRKCE、IRAK1、INS、MYD88、PRKCZ、TRAF6、PPARA、RXRA、IKBKB、PRKCI、NFKB2、MAP3K14、MAPK8、PRKD1、MAPK10、RELA、PRKCD、MAPK9、ABCB1、TRAF2、TLR4、TNF、INSR、IKBKG、RELB、MAP3K7、IL8、CHUK、NR1H2、TJP2、NFKB1、ESR1、SREBF1、FGFR4、JUN、IL1R1、PRKCA、IL6。IGF-1シグナリング:IGF1、PRKCZ、ELK1、MAPK1、PTPN11、NEDD4、AKT2、PIK3CA、PRKCI、PTK2、FOS、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、IGF1R、IRS1、MAPK3、IGFBP7、KRAS、PIK3C2A、YWHAZ、PXN、RAF1、CASP9、MAP2K2、AKT1、PIK3R1、PDPK1、MAP2K1、IGFBP2、SFN、JUN、CYR61、AKT3、FOXO1、SRF、CTGF、RPS6KB1。NRF2媒介酸化ストレス応答:PRKCE、EP300、SOD2、PRKCZ、MAPK1、SQSTM1、NQO1、PIK3CA、PRKCI、FOS、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、PRKD1、MAPK3、KRAS、PRKCD、GSTP1、MAPK9、FTL、NFE2L2、PIK3C2A、MAPK14、RAF1、MAP3K7、CREBBP、MAP2K2、AKT1、PIK3R1、MAP2K1、PPIB、JUN、KEAP1、GSK3B、ATF4、PRKCA、EIF2AK3、HSP90AA1。肝線維症/肝星細胞活性化:EDN1、IGF1、KDR、FLT1、SMAD2、FGFR1、MET、PGF、SMAD3、EGFR、FAS、CSF1、NFKB2、BCL2、MYH9、IGF1R、IL6R、RELA、TLR4、PDGFRB、TNF、RELB、IL8、PDGFRA、NFKB1、TGFBR1、SMAD4、
VEGFA、BAX、IL1R1、CCL2、HGF、MMP1、STAT1、IL6、CTGF、MMP9。PPARシグナリング:EP300、INS、TRAF6、PPARA、RXRA、MAPK1、IKBKB、NCOR2、FOS、NFKB2、MAP3K14、STAT5B、MAPK3、NRIP1、KRAS、PPARG、RELA、STAT5A、TRAF2、PPARGC1A、PDGFRB、TNF、INSR、RAF1、IKBKG、RELB、MAP3K7、CREBBP、MAP2K2、CHUK、PDGFRA、MAP2K1、NFKB1、JUN、IL1R1、HSP90AA1。FcεRIシグナリング:PRKCE、RAC1、PRKCZ、LYN、MAPK1、RAC2、PTPN11、AKT2、PIK3CA、SYK、PRKCI、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、PRKD1、MAPK3、MAPK10、KRAS、MAPK13、PRKCD、MAPK9、PIK3C2A、BTK、MAPK14、TNF、RAF1、FYN、MAP2K2、AKT1、PIK3R1、PDPK1、MAP2K1、AKT3、VAV3、PRKCA。Gタンパク質共役受容体シグナリング:PRKCE、RAP1A、RGS16、MAPK1、GNAS、AKT2、IKBKB、PIK3CA、CREB1、GNAQ、NFKB2、CAMK2A、PIK3CB、PIK3C3、MAPK3、KRAS、RELA、SRC、PIK3C2A、RAF1、IKBKG、RELB、FYN、MAP2K2、AKT1、PIK3R1、CHUK、PDPK1、STAT3、MAP2K1、NFKB1、BRAF、ATF4、AKT3、PRKCA。イノシトールリン酸代謝:PRKCE、IRAK1、PRKAA2、EIF2AK2、PTEN、GRK6、MAPK1、PLK1、AKT2、PIK3CA、CDK8、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、MAPK3、PRKCD、PRKAA1、MAPK9、CDK2、PIM1、PIK3C2A、DYRK1A、MAP2K2、PIP5K1A、PIK3R1、MAP2K1、PAK3、ATM、TTK、CSNK1A1、BRAF、SGK。PDGFシグナリング:EIF2AK2、ELK1、ABL2、MAPK1、PIK3CA、FOS、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、CAV1、ABL1、MAPK3、KRAS、SRC、PIK3C2A、PDGFRB、RAF1、MAP2K2、JAK1、JAK2、PIK3R1、PDGFRA、STAT3、SPHK1、MAP2K1、MYC、JUN、CRKL、PRKCA、SRF、STAT1、SPHK2。VEGFシグナリング:ACTN4、ROCK1、KDR、FLT1、ROCK2、MAPK1、PGF、AKT2、PIK3CA、ARNT、PTK2、BCL2、PIK3CB、PIK3C3、BCL2L1、MAPK3、KRAS、HIF1A、NOS3、PIK3C2A、PXN、RAF1、MAP2K2、ELAVL1、AKT1、PIK3R1、MAP2K1、SFN、VEGFA、AKT3、FOXO1、PRKCA。ナチュラルキラー細胞シグナリング:PRKCE、RAC1、PRKCZ、MAPK1、RAC2、PTPN11、KIR2DL3、AKT2、PIK3CA、SYK、PRKCI、PIK3CB、PIK3C3、PRKD1、MAPK3、KRAS、PRKCD、PTPN6、PIK3C2A、LCK、RAF1、FYN、MAP2K2、PAK4、AKT1、PIK3R1、MAP2K1、PAK3、AKT3、VAV3、PRKCA。細胞周期:G1/Sチェックポイント調節:HDAC4、SMAD3、SUV39H1、HDAC5、CDKN1B、BTRC、ATR、ABL1、E2F1、HDAC2、HDAC7A、RB1、HDAC11、HDAC9、CDK2、E2F2、HDAC3、TP53、CDKN1A、CCND1、E2F4、ATM、RBL2、SMAD4、CDKN2A、MYC、NRG1、GSK3B、RBL1、HDAC6。T細胞受容体シグナリング:RAC1、ELK1、MAPK1、IKBKB、CBL、PIK3CA、FOS、NFKB2、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、MAPK3、KRAS、RELA、PIK3C2A、BTK、LCK、RAF1、IKBKG、RELB、FYN、MAP2K2、PIK3R1、CHUK、MAP2K1、NFKB1、ITK、BCL10、JUN、VAV3。デス受容体シグナリング:CRADD、HSPB1、BID、BIRC4、TBK1、IKBKB、FADD、FAS、NFKB2、BCL2、MAP3K14、MAPK8、RIPK1、CASP8、DAXX、TNFRSF10B、RELA、TRAF2、TNF、IKBKG、RELB、CASP9、CHUK、APAF1、NFKB1、CASP2、BIRC2、CASP3、BIRC3。FGFシグナリング:RAC1、FGFR1、MET、MAPKAPK2、MAPK1、PTPN11、AKT2、PIK3CA、CREB1、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、MAPK3、MAPK13、PTPN6、PIK3C2A、MAPK14、RAF1、AKT1、PIK3R1、STAT3、MAP2K1、FGFR4、CRKL、ATF4、AKT3、PRKCA、HGF。GM-CSFシグナリング:LYN、ELK1、MAPK1、PTPN11、AKT2、PIK3CA、CAMK2A、STAT5B、PIK3CB、PIK3C3、GNB2L1、BCL2L1、MAPK3、ETS1、KRAS、RUNX1、PIM1、PIK3C2A、RAF1、MAP2K2、AKT1、JAK2、PIK3R1、STAT3、MAP2K1、CCND1、AKT3、STAT1。筋萎縮性側索硬化症シグナリング:BID、IGF1、RAC1、BIRC4、PGF、CAPNS1、CAPN2、PIK3CA、BCL2、PIK3CB、PIK3C3、BCL2L1、CAPN1、PIK3C2A、TP53、CASP9、PIK3R1、RAB5A、CASP1、APAF1、VEGFA、BIRC2、BAX、AKT3、CASP3、BIRC3。JAK/Statシグナリング:PTPN1、MAPK1、PTPN11、AKT2、PIK3CA、STAT5B、PIK3CB、PIK3C3、MAPK3、KRAS、SOCS1、STAT5A、PTPN6、PIK3C2A、RAF1、CDKN1A、MAP2K2、JAK1、AKT1、JAK2、PIK3R1、STAT3、MAP2K1、FRAP1、AKT3、STAT1。ニコチン酸およびニコチンアミド代謝:PRKCE、IRAK1、PRKAA2、EIF2AK2、GRK6、MAPK1、PLK1、AKT2、CDK8、MAPK8、MAPK3、PRKCD、PRKAA1、PBEF1、MAPK9、CDK2、PIM1、DYRK1A、MAP2K2、MAP2K1、PAK3、NT5E、TTK、CSNK1A1、BRAF、SGK。ケモカインシグナリング:CXCR4、ROCK2、MAPK1、PTK2、FOS、CFL1、GNAQ、CAMK2A、CXCL12、MAPK8、MAPK3、KRAS、MAPK13、RHOA、CCR3、SRC、PPP1CC、MAPK14、NOX1、RAF1、MAP2K2、MAP2K1、JUN、CCL2、PRKCA。IL-2シグナリング:ELK1、MAPK1、PTPN11、AKT2、PIK3CA、SYK、FOS、STAT5B、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、MAPK3、KRAS、SOCS1、STAT5A、PIK3C2A、LCK、RAF1、MAP2K2、JAK1、AKT1、PIK3R1、MAP2K1、JUN、AKT3。シナプス長期抑圧:PRKCE、IGF1、PRKCZ、PRDX6、LYN、MAPK1、GNAS、PRKCI、GNAQ、PPP2R1A、IGF1R、PRKD1、MAPK3、KRAS、GRN、PRKCD、NOS3、NOS2A、PPP2CA、YWHAZ、RAF1、MAP2K2、PPP2R5C、MAP2K1、PRKCA。エストロゲン受容体シグナリング:TAF4B、EP300、CARM1、PCAF、MAPK1、NCOR2、SMARCA4、MAPK3、NRIP1、KRAS、SRC、NR3C1、HDAC3、PPARGC1A、RBM9、NCOA3、RAF1、CREBBP、MAP2K2、NCOA2、MAP2K1、PRKDC、ESR1、ESR2。タンパク質ユビキチン化経路:TRAF6、SMURF1、BIRC4、BRCA1、UCHL1、NEDD4、CBL、UBE2I、BTRC、HSPA5、USP7、USP10、FBXW7、USP9X、STUB1、USP22、B2M、BIRC2、PARK2、USP8、USP1、VHL、HSP90AA1、BIRC3。IL-10シグナリング:TRAF6、CCR1、ELK1、IKBKB、SP1、FOS、NFKB2、MAP3K14、MAPK8、MAPK13、RELA、MAPK14、TNF、IKBKG、RELB、MAP3K7、JAK1、CHUK、STAT3、NFKB1、JUN、IL1R1、IL6。VDR/RXR活性化:PRKCE、EP300、PRKCZ、RXRA、GADD45A、HES1、NCOR2、SP1、PRKCI、CDKN1B、PRKD1、PRKCD、RUNX2、KLF4、YY1、NCOA3、CDKN1A、NCOA2、SPP1、LRP5、CEBPB、FOXO1、PRKCA。TGF-βシグナリング:EP300、SMAD2、SMURF1、MAPK1、SMAD3、SMAD1、FOS、MAPK8、MAPK3、KRAS、MAPK9、RUNX2、SERPINE1、RAF1、MAP3K7、CREBBP、MAP2K2、MAP2K1、TGFBR1、SMAD4、JUN、SMAD5。Toll様受容体シグナリング:IRAK1、EIF2AK2、MYD88、TRAF6、PPARA、ELK1、IKBKB、FOS、NFKB2、MAP3K14、MAPK8、MAPK13、RELA、TLR4、MAPK14、IKBKG、RELB、MAP3K7、CHUK、NFKB1、TLR2、JUN。p38 MAPKシグナリング:HSPB1、IRAK1、TRAF6、MAPKAPK2、ELK1、FADD、FAS、CREB1、DDIT3、RPS6KA4、DAXX、MAPK13、TRAF2、MAPK14、TNF、MAP3K7、TGFBR1、MYC、ATF4、IL1R1、SRF、STAT1。ニューロトロフィン/TRKシグナリング:NTRK2、MAPK1、PTPN11、PIK3CA、CREB1、FOS、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、MAPK3、KRAS、PIK3C2A、RAF1、MAP2K2、AKT1、PIK3R1、PDPK1、MAP2K1、CDC42、JUN、ATF4。FXR/RXR活性化:INS、PPARA、FASN、RXRA、AKT2、SDC1、MAPK8、APOB、MAPK10、PPARG、MTTP、MAPK9、PPARGC1A、TNF、CREBBP、AKT1、SREBF1、FGFR4、AKT3、FOXO1。シナプス長期増強:PRKCE、RAP1A、EP300、PRKCZ、MAPK1、CREB1、PRKCI、GNAQ、CAMK2A、PRKD1、MAPK3、KRAS、PRKCD、PPP1CC、RAF1、CREBBP、MAP2K2、MAP2K1、ATF4、PRKCA。カルシウムシグナリング:RAP1A、EP300、HDAC4、MAPK1、HDAC5、CREB1、CAMK2A、MYH9、MAPK3、HDAC2、HDAC7A、HDAC11、HDAC9、HDAC3、CREBBP、CALR、CAMKK2、ATF4、HDAC6。EGFシグナリング:ELK1、MAPK1、EGFR、PIK3CA、FOS、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、MAPK3、PIK3C2A、RAF1、JAK1、PIK3R1、STAT3、MAP2K1、JUN、PRKCA、SRF、STAT1。心血管系における低酸素シグナリング:EDN1、PTEN、EP300、NQO1、UBE2I、CREB1、ARNT、HIF1A、SLC2A4、NOS3、TP53、LDHA、AKT1、ATM、VEGFA、JUN、ATF4、VHL、HSP90AA1。RXR機能LXR/RXR活性化のLPS/IL-1媒介阻害:IRAK1、MYD88、TRAF6、PPARA、RXRA、ABCA1、MAPK8、ALDH1A1、GSTP1、MAPK9、ABCB1、TRAF2、TLR4、TNF、MAP3K7、NR1H2、SREBF1、JUN、IL1R1 FASN、RXRA、NCOR2、ABCA1、NFKB2、IRF3、RELA、NOS2A、TLR4、TNF、RELB、LDLR、NR1H2、NFKB1、SREBF1、IL1R1、CCL2、IL6、MMP9。アミロイドプロセシング:PRKCE、CSNK1E、MAPK1、CAPNS1、AKT2、CAPN2、CAPN1、MAPK3、MAPK13、MAPT、MAPK14、AKT1、PSEN1、CSNK1A1、GSK3B、AKT3、APP。IL-4シグナリング:AKT2、PIK3CA、PIK3CB、PIK3C3、IRS1、KRAS、SOCS1、PTPN6、NR3C1、PIK3C2A、JAK1、AKT1、JAK2、PIK3R1、FRAP1、AKT3、RPS6KB1。細胞周期:G2/M DNA損傷チェックポイント調節:EP300、PCAF、BRCA1、GADD45A、PLK1、BTRC、CHEK1、ATR、CHEK2、YWHAZ、TP53、CDKN1A、PRKDC、ATM、SFN、CDKN2A。心血管系における一酸化窒素シグナリング:KDR、FLT1、PGF、AKT2、PIK3CA、PIK3CB、PIK3C3、CAV1、PRKCD、NOS3、PIK3C2A、AKT1、PIK3R1、VEGFA、AKT3、HSP90AA1。プリン代謝:NME2、SMARCA4、MYH9、RRM2、ADAR、EIF2AK4、PKM2、ENTPD1、RAD51、RRM2B、TJP2、RAD51C、NT5E、POLD1、NME1。cAMP媒介シグナリング:RAP1A、MAPK1、GNAS、CREB1、CAMK2A、MAPK3、SRC、RAF1、MAP2K2、STAT3、MAP2K1、BRAF、ATF4。ミトコンドリア機能障害Notchシグナリング:SOD2、MAPK8、CASP8、MAPK10、MAPK9、CASP9、PARK7、PSEN1、PARK2、APP、CASP3 HES1、JAG1、NUMB、NOTCH4、ADAM17、NOTCH2、PSEN1、NOTCH3、NOTCH1、DLL4。小胞体ストレス経路:HSPA5、MAPK8、XBP1、TRAF2、ATF6、CASP9、ATF4、EIF2AK3、CASP3。ピリミジン代謝:NME2、AICDA、RRM2、EIF2AK4、ENTPD1、RRM2B、NT5E、POLD1、NME1。パーキンソン病シグナリング:UCHL1、MAPK8、MAPK13、MAPK14、CASP9、PARK7、PARK2、CASP3。心臓およびβアドレナリン作動性シグナリング:GNAS、GNAQ、PPP2R1A、GNB2L1、PPP2CA、PPP1CC、PPP2R5C。解糖/糖新生:HK2、GCK、GPI、ALDH1A1、PKM2、LDHA、HK1。インターフェロンシグナリング:IRF1、SOCS1、JAK1、JAK2、IFITM1、STAT1、IFIT3。ソニックヘッジホッグシグナリング:ARRB2、SMO、GLI2、DYRK1A、GLI1、GSK3B、DYRKIB。グリセロリン脂質代謝:PLD1、GRN、GPAM、YWHAZ、SPHK1、SPHK2。リン脂質分解:PRDX6、PLD1、GRN、YWHAZ、SPHK1、SPHK2。トリプトファン代謝:SIAH2、PRMT5、NEDD4、ALDH1A1、CYP1B1、SIAH1。リジン分解:SUV39H1、EHMT2、NSD1、SETD7、PPP2R5C。ヌクレオチド除去修復経路:ERCC5、ERCC4、XPA、XPC、ERCC1。デンプンおよびスクロース代謝:UCHL1、HK2、GCK、GPI、HK1。アミノ糖代謝:NQO1、HK2、GCK、HK1。アラキドン酸代謝:PRDX6、GRN、YWHAZ、CYP1B1。概日リズムシグナリング:CSNK1E、CREB1、ATF4、NR1D1。凝固システム:BDKRB1、F2R、SERPINE1、F3。ドーパミン受容体シグナリング:PPP2R1A、PPP2CA、PPP1CC、PPP2R5C。グルタチオン代謝:IDH2、GSTP1、ANPEP、IDH1。グリセロ脂質代謝:ALDH1A1、GPAM、SPHK1、SPHK2。リノール酸代謝:PRDX6、GRN、YWHAZ、CYP1B1。メチオニン代謝:DNMT1、DNMT3B、AHCY、DNMT3A。ピルビン酸代謝:GLO1、ALDH1A1、PKM2、LDHA。アルギニンおよびプロリン代謝:ALDH1A1、NOS3、NOS2A。エイコサノイドシグナリング:PRDX6、GRN、YWHAZ。フルクトースおよびマンノース代謝:HK2、GCK、HK1。ガラクトース代謝:HK2、GCK、HK1。スチルベン、クマリンおよびリグニン生合成:PRDX6、PRDX1、TYR。抗原提示経路:CALR、B2M。ステロイドの生合成:NQO1、DHCR7。ブタン酸代謝:ALDH1A1、NLGN1。クエン酸サイクル:IDH2、IDH1。脂肪酸代謝:ALDH1A1、CYP1B1。グリセロリン脂質代謝:PRDX6、CHKA。ヒスチジン代謝:PRMT5、ALDH1A1。イノシトール代謝:ERO1L、APEX1。シトクロムp450による生体異物の代謝:GSTP1、CYP1B1。メタン代謝:PRDX6、PRDX1。フェニルアラニン代謝:PRDX6、PRDX1。プロパン酸代謝:ALDH1A1、LDHA。セレノアミノ酸代謝:PRMT5、AHCY。スフィンゴリピド代謝:SPHK1、SPHK2。アミノホスホン酸代謝:PRMT5。アンドロゲンおよびエストロゲン代謝:PRMT5。アスコルビン酸およびアルダル酸代謝:ALDH1A1。胆汁酸生合成:ALDH1A1。システイン代謝:LDHA。脂肪酸生合成:FASN。グルタミン酸受容体シグナリング:GNB2L1。NRF2媒介酸化ストレス応答:PRDX1。ペントースリン酸経路:GPI。ペントースおよびグルクロン酸相互変換:UCHL1。レチノール代謝:ALDH1A1。リボフラビン代謝:TYR。チロシン代謝:PRMT5、TYR。ユビキノン生合成:PRMT5。バリン、ロイシンおよびイソロイシン分解:ALDH1A1。グリシン、セリンおよびスレオニン代謝:CHKA。リジン分解:ALDH1A1。痛み/味覚:TRPM5、TRPA1。痛み:TRPM7、TRPC5、TRPC6、TRPC1、Cnr1、cnr2、Grk2、
Trpa1、Pomc、Cgrp、Crf、Pka、Era、Nr2b、TRPM5、Prkaca、Prkacb、Prkar1a、Prkar2a。ミトコンドリア機能:AIF、CytC、SMAC（Diablo）、Aifm-1、Aifm-2。発生神経学:BMP-4、コーディン（Chrd）、ノギン（Nog）、WNT（Wnt2、Wnt2b、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt7b、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt16）、β-カテニン、Dkk-1、Frizzled関連タンパク質、Otx-2、Gbx2、FGF-8、リーリン、Dab1、unc-86（Pou4flまたはBrn3a）、Numb、Reln。
場合により、編集システムは免疫細胞のパフォーマンスを改良するために使用することができる。がん抑制または腫瘍抑制に関与する遺伝子の例としては、例えば、ATM（毛細血管拡張性運動失調症変異）、ATR（毛細血管拡張性運動失調症およびRad3関連）、EGFR（上皮成長因子受容体）、ERBB2（v-erb-b2赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ2）、ERBB3（v-erb-b2赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ3）、ERBB4（v-erb-b2赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ4）、Notch1、Notch2、Notch3またはNotch4を挙げることができる。セクレターゼ障害に関連する遺伝子およびタンパク質を破壊または導入することもでき、これには、PSENEN（プレセニリンエンハンサー2ホモログ（C.エレガンス））、CTSB（カテプシンB）、PSEN1（プレセニリン1）、APP（アミロイドβ（A4）前駆体タンパク質）、APH1B（前咽頭欠損1ホモログB（C.エレガンス））、PSEN2（プレセニリン2（アルツハイマー病4））またはBACE1（β部位APP切断酵素1）が含まれうる。本願内の遺伝子の遺伝子ホモログ（例えば遺伝子の任意の哺乳動物型）は包含されると考えられる。例えば標的とすることができる遺伝子として、CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、HPRT、CCR5、AAVS部位（例えばAAVS1、AAVS2など）、PPP1R12C、TRAC、TCRBまたはCISHを、さらに挙げることができる。それゆえに（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％または約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、もしくは約100％の同一性を呈する上述の遺伝子のいずれか一つを破壊することができると考えられる。また（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）50％、55％、60％、65％,70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％または約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、もしくは約100％の同一性を呈する上述の遺伝子のいずれかを破壊することができると考えられる。当技術分野ではいくつかの遺伝子ホモログが公知であるが、場合によっては、ホモログは未知である。しかし、哺乳動物間の相同遺伝子は、NCBI BLASTなどの公的に利用可能なデータベースを使って核酸（DNAまたはRNA）配列またはタンパク質配列を比較することによって見出すことができる。本明細書では、上述の遺伝子のいずれか1つの非ヒト遺伝子等価物も開示されうる。上述の遺伝子のいずれかの非ヒト等価物は、本明細書に開示する遺伝子編集システムで破壊することができる。
ガイドRNAはRNA分子として細胞または胚に導入することができる。例えばRNA分子は、インビトロで転写することができ、かつ/または化学合成することができる。次にガイドRNAをRNA分子として細胞または胚に導入することができる。ガイドRNAは、非RNA核酸分子、例えばDNA分子の形で、細胞または胚に導入することもできる。例えば、ガイドRNAをコードするDNAは、関心対象の細胞または胚におけるガイドRNAの発現のために、プロモーター制御配列に機能的に連結することができる。RNAコード配列は、RNAポリメラーゼIII（Pol III）によって認識されるプロモーター配列に機能的に連結することができる。
ガイドRNAまたはガイドDNAをコードする核酸は線状であることができる。ガイドRNAまたはガイドDNAをコードする核酸は環状であることもできる。誘導ポリ核酸をコードする核酸はベクターの一部であることもできる。ベクターの例の一部として、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工/ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクターを挙げることができる。例えばRNA誘導型エンドヌクレアーゼをコードするDNAはプラスミドベクター中に存在する。適切なプラスミドベクターの他の非限定的な例として、pUC、pBR322、pET、pBluescript、およびそれらの変異体が挙げられる。さらにベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能マーカー配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含むことができる。
誘導ポリ核酸、タンパク質、または誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ複合体を導入するための適切な方法は、当技術分野において公知であり、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、またはPEI、PEG、DEAE、ナノ粒子もしくはリポソーム媒介形質転換などがある。他の適切なトランスフェクション方法として、直接マイクロインジェクションが挙げられる。場合により、誘導ポリ核酸およびヌクレアーゼは別々に導入され、誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ複合体が細胞内で形成される。別の例では、誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ複合体を形成させてから、細胞に導入することができる。場合により、それぞれ異なるゲノム標的に方向付けられた複数の弁別的に標識された誘導ポリ核酸:ヌクレアーゼ複合体を形成させてから、それらを細胞に導入する。核酸誘導型ヌクレアーゼとガイドポリ核酸との両方が細胞に導入される場合、それぞれが別々の分子（例えば融合タンパク質コード配列を含有する1つのベクターとガイドポリ核酸コード配列を含有する第2のベクター）の一部であるか、または両方が同じ分子（例えば融合タンパク質と誘導ポリ核酸の両方のコード（および調節）配列を含有する1つのベクター）の一部であることができる。場合により、ヌクレアーゼは、誘導ポリ核酸との複合体を予め形成させておくことができる。複合体はリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体でありうる。
場合により、操作された誘導ポリ核酸の特異性を判定するために、GUIDE-Seq解析を行うことができる。CRISPRシステムヌクレアーゼによるオフターゲット切断のGUIDE-Seqプロファイリングの一般的機序およびプロトコールは、Tsai,S.et al.,「GUIDE-Seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR system nucleases」Nature,33:187-197（2015）に記載されている。
誘導ポリ核酸は任意の機能的濃度で導入することができる。例えば10マイクログラムの誘導ポリ核酸を細胞に導入することができる。別の例では、0.5マイクログラム〜100マイクログラムの誘導ポリ核酸を導入することができる。0.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100マイクログラムのgRNAを導入することができる。
誘導ポリ核酸の配列は、その標的核酸の配列に100％相補的でなくても、特異的にハイブリダイズ可能またはハイブリダイズ可能である。さらにまた、誘導ポリ核酸は、介在セグメントまたは隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、1つまたは複数のセグメントにハイブリダイズしうる（例えばループ構造またはヘアピン構造）。例えば、ポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズすることになる標的核酸配列内の標的領域に対して、60％もしくはそれ以上、65％もしくはそれ以上、70％もしくはそれ以上、75％もしくはそれ以上、80％もしくはそれ以上、85％もしくはそれ以上、90％もしくはそれ以上、95％もしくはそれ以上、98％もしくはそれ以上、99％もしくはそれ以上、99.5％、または100％の配列相補性を含むことができる。例えば、アンチセンス化合物の20ヌクレオチド中18ヌクレオチドが標的領域に相補的であり、それゆえに特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス核酸は、90パーセントの相補性に相当すると考えられる。この例では、残りの非相同ヌクレオチドはクラスターを形成するか、残りの非相同ヌクレオチドの間に相補的ヌクレオチドが散在することができ、残りの非相同ヌクレオチドが互いにまたは相補的ヌクレオチドに連続している必要はない。核酸内の核酸配列の特定ストレッチ間の相補性パーセントは、任意の好都合な方法を使って決定することができる。例示的方法として、BLAST（basic local alignment search tool）プログラムおよびPowerBLASTプログラム（Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410、Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649-656）、またはSmithとWatermanのアルゴリズム（Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489）を使用するGapプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,ウィスコンシン州マディソンユニバーシティ・リサーチ・パーク）をデフォルト設定で使用する方法が挙げられる。
誘導ポリ核酸は遺伝子またはその位置部分を標的とすることができる。場合により、修飾された細胞は、1つまたは複数の抑制、破壊またはノックアウトされた遺伝子と、1つまたは複数のトランスジーン、例えば受容体とを含むことができる。
本明細書において記載する方法および組成物は哺乳動物の遺伝子を標的とするために使用することができる。標的とすることができる遺伝子は、任意の器官または組織からの遺伝子であることができる。標的とすることができる遺伝子は、限定するわけではないが、皮膚、眼、心臓、肝臓、肺、腎臓、生殖器官、脳などからの遺伝子であることができる。標的とすることができる遺伝子は、いくつかの状態および疾患からの遺伝子であることもできる。
場合により、破壊は、破壊された遺伝子またはその一部分のゲノム転写産物のコピー数の低減をもたらしうる。例えば、破壊することができる標的遺伝子は、破壊されていない細胞における同じ標的遺伝子と比較して、低減した転写産物量を有することができる。破壊は、145コピー/μL、140コピー/μL、135コピー/μL、130コピー/μL、125コピー/μL、120コピー/μL、115コピー/μL、110コピー/μL、105コピー/μL、100コピー/μL、95コピー/μL、190コピー/μL、185コピー/μL、80コピー/μL、75コピー/μL、70コピー/μL、65コピー/μL、60コピー/μL、55コピー/μL、50コピー/μL、45コピー/μL、40コピー/μL、35コピー/μL、30コピー/μL、25コピー/μL、20コピー/μL、15コピー/μL、10コピー/μL、5コピー/μL、1コピー/μL、または0.05コピー/μLを下回る破壊結果をもたらしうる。場合により、破壊は100コピー/μLを下回ってもたらしうる。
任意の方法を使って細胞中の1つまたは複数の遺伝子をノックアウトまたは破壊することができる。例えば、1つまたは複数の遺伝子のノックアウトは、細胞のゲノムからの1つまたは複数の遺伝子を欠失させることを含みうる。ノックアウトは、細胞からある遺伝子配列の全部または一部を除去することも含みうる。ノックアウトは細胞のゲノム中の遺伝子の全部または一部を1つまたは複数のヌクレオチドで置き換えることを含みうるとも考えられる。1つまたは複数の遺伝子のノックアウトは、1つまたは複数の遺伝子にある配列を挿入し、それによってその1つまたは複数の遺伝子の発現を破壊することも含みうる。例えば、配列の挿入は1つまたは複数の遺伝子の途中に停止コドンを生じさせうる。配列の挿入が1つまたは複数の遺伝子のオープンリーディングフレームをシフトさせる場合もある。
動物または細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、またはそれ以上の、疾患と関連するタンパク質をコードする破壊されたゲノム配列と、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、またはそれ以上の、疾患と関連するタンパク質をコードするゲノムに組み込まれた配列とを含みうる。
細胞への送達
RHDCおよび核酸巻き戻し因子、それらをコードするポリヌクレオチド、および/または任意のトランスジーンポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載のポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適切な手段によって標的細胞に送達することができる。
適切な細胞として、真核生物および原核生物の細胞および/または細胞株を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。適切な細胞はヒト初代細胞でありうる。
集団倍加数がごくわずかであり、それゆえに、連続腫瘍原性細胞株または人工的に不死化された細胞株と比較して、それらが由来する組織の主たる機能的構成要素および特徴をより良く表現している初代細胞を、生きている組織（すなわち生検材料）から直接採取して、インビトロでの成長のために樹立させることができる。
初代細胞は、器官、脈管構造、バフィーコート、全血、アフェレーシス、血漿、骨髄、腫瘍、細胞バンク、凍結保存バンク、または血液試料など、さまざまな供給源から取得することができる。初代細胞は幹細胞でありうる。Ranse-H様ドメインを含むゲノム編集システムで編集することができる適切な細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、神経系細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（B、NKおよびT）、マクロファージ、単球、単核球、心筋細胞、他の筋細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、膵島細胞、血液細胞、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、臍帯静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、線維芽細胞、肝臓星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞、クッパー細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、および上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、アストロサイト、赤血球、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、メモリー細胞、T細胞、B細胞、形質細胞、筋細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、管周囲細胞、セルトリ細胞、ルテイン細胞、子宮頚管細胞、子宮内膜細胞、乳房細胞、濾胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角質化上皮細胞、角質化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞（dopamiergic cell）、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ドーパミン作動性細胞、胚性幹細胞、線維芽細胞および胎児線維芽細胞であることができる。さらに、1つまたは複数の細胞は、限定するわけではないが、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵F細胞（例えばPP細胞）、または膵臓ε細胞などの、膵島細胞および/または膵島細胞クラスターなどでありうる。一例として、1つまたは複数の細胞は膵α細胞でありうる。別の一例として、1つまたは複数の細胞は膵β細胞でありうる。
ヒト初代細胞は免疫細胞でありうる。免疫細胞はT細胞、B細胞、NK細胞、および/またはTILでありうる。そのような細胞またはそのような細胞から生成する細胞株の非限定的な例としては、COS、CHO（例えばCHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV）、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NSO、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293（例えばHEK293-F、HEK293-H、HEK293-T）、およびperC6細胞ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Spodopterafugiperda）（Sf）などの昆虫細胞またはサッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）、およびシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）などの真菌細胞が挙げられる。場合により、細胞株はCHO-K1、MDCK、またはHEK293細胞株でありうる。場合により、適切な初代細胞として、末梢血単核球（PBMC）、末梢血リンパ球（PBL）、および他の血液細胞サブセット、例えば限定するわけではないが、T細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーT細胞、単球前駆細胞、造血幹細胞、または非多能性幹細胞が挙げられる。場合により、細胞は、任意のT細胞、例えば腫瘍浸潤細胞（TIL）、例えばCD3＋T細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、または他の任意のタイプのT細胞を含む、任意の免疫細胞でありうる。T細胞としてメモリーT細胞、メモリー幹T細胞またはエフェクターT細胞も挙げることができる。T細胞は、全血からT細胞を選択するなど、バルク集団から選択することもできる。T細胞をバルク集団から拡大増殖させることもできる。T細胞は特定の集団および表現型に傾かせることもできる。例えばT細胞は表現型的にCD45RO（-）、CCR7（＋）、CD45RA（＋）、CD62L（＋）、CD27（＋）、CD28（＋）、および/またはIL-7Rα（＋）を含むように傾かせることができる。CD45RO（-）、CCR7（＋）、CD45RA（＋）、CD62L（＋）、CD27（＋）、CD28（＋）、および/またはIL-7Rα（＋）を含むリストから選択される1つまたは複数のマーカーを含む適切な細胞を選択することができる。適切な細胞として、例えば胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞も挙げられる。適切な細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞、および/またはマウス細胞など、多くの初代細胞を含みうる。適切な細胞は前駆細胞でありうる。適切な細胞は処置される対象（例えば対象）に由来しうる。適切な細胞はヒトドナーに由来しうる。適切な細胞は、CD45RO（-）、CCR7（＋）、CD45RA（＋）、CD62L＋（L-セレクチン）、CD27＋、CD28＋、およびIL-7Rα＋で構成される幹メモリーTSCM細胞でありうる。幹メモリー細胞はCD95、IL-2Rβ、CXCR3、およびLFA-1も発現することができ、幹メモリー細胞に特徴的な機能的属性を数多く示す。適切な細胞はL-セレクチンおよびCCR7を含むセントラルメモリーTCM細胞でありうる。セントラルメモリー細胞は例えばIL-2を分泌しうるが、IFNγやIL-4は分泌しない。適切な細胞は、L-セレクチンまたはCCR7を含むエフェクターメモリーTEM細胞であることもでき、例えばIFNγおよびIL-4などのエフェクターサイトカインを生産しうる。
場合により、修飾細胞は、CD45RO（-）、CCR7（＋）、CD45RA（＋）、CD62L＋（L-セレクチン）、CD27＋、CD28＋およびIL-7Rα＋で構成される幹メモリーTSCM細胞でありうる。幹メモリー細胞はCD95、IL-2Rβ、CXCR3およびLFA-1も発現することができ、幹メモリー細胞に特徴的な機能的属性を数多く示す。操作された細胞、例えばRHDCポリペプチド修飾細胞は、L-セレクチンおよびCCR7を含むセントラルメモリーTCM細胞であることもでき、ここでセントラルメモリー細胞は、例えばIL-2を分泌しうるが、IFNγやIL-4は分泌しない。操作された細胞は、L-セレクチンまたはCCR7を含むエフェクターメモリーTEM細胞であることもでき、例えばIFNγおよびIL-4などのエフェクターサイトカインを生産しうる。場合により、細胞の集団は対象に導入することができる。例えば、細胞の集団はT細胞とNK細胞の組合せでありうる。別の例では、集団はナイーブ細胞とエフェクター細胞の組合せでありうる。
ヒト初代細胞などの適切な細胞を獲得する方法は、細胞を選択する工程を含みうる。場合により、細胞は、その細胞のために選択されうるマーカーを含みうる。例えばそのようなマーカーはGFP、耐性遺伝子、細胞表面マーカー、内在性タグを含むことができる。細胞は内在性マーカーを使って選択することができる。適切な細胞は任意の技術を使って選択することができる。そのような技術はフローサイトメトリーおよび/または磁気カラムを含むことができる。選択された細胞は次に対象に注入することができる。選択された細胞を多数に拡大増殖させることもできる。選択された細胞を注入前に拡大増殖させることができる。
場合により、適切な細胞は組換え細胞でありうる。組換え細胞は不死化細胞株でありうる。細胞株はCHO-K1細胞、HEK293細胞、Caco2細胞、U2-OS細胞、NIH 3T3細胞、NSO細胞、SP2細胞、CHO-S細胞、DG44細胞、K-562細胞、U-937細胞、MRC5細胞、IMR90細胞、Jurkat細胞、HepG2細胞、HeLa細胞、HT-1080細胞、HCT-1 16細胞、Hu-h7細胞、Huvec細胞、Molt 4細胞であることができる。これらの細胞株はいずれも、関心対象の遺伝子またはタンパク質を生産し、発現させ、定量し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するために、本明細書に記載の方法によって修飾することができる。これらのモデルは、研究および生産、ならびに非限定的な例として化学、バイオ燃料、治療薬および作物栽培学などといったさまざまな分野において、関心対象の生物学的に活性な分子をスクリーニングするために使用することもできる。
本明細書に記載のゲノム編集システムは、ベクターを使って、例えば前記タンパク質のうちの1つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを使って、送達することができる。場合により、本明細書に記載のシステムは、ウイルスベクターなしで送達することができる。場合により、本明細書に記載のシステムは、例えばシステムが1キロベースより大きい場合に、ウイルスベクターなしで、細胞の生存に影響を及ぼすことなく送達することができる。ポリヌクレオチドをコードするトランスジーンも同様に送達することができる。限定するわけではないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどといった、任意のベクターシステムを使用することができる。さらにまた、これらのベクターはいずれも、1つまたは複数の転写因子、ヌクレアーゼおよび/またはトランスジーンを含むことができる。したがって、1つまたは複数のCRISPR、TALEN、トランスポゾン系、ZFN、メガヌクレアーゼもしくはMega-TAL分子、および/またはトランスジーンが細胞に導入される場合、CRISPR、TALEN、トランスポゾン系、ZFN、メガヌクレアーゼもしくはMega-TAL分子、および/またはトランスジーンは、同じベクターで、または異なるベクターで、運ぶことができる。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、1つまたは複数のCRISPR、TALEN、トランスポゾン系、ZFN、メガヌクレアーゼもしくはMega-TAL分子、および/またはトランスジーンをコードする配列を含むことができる。
従来のウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法は、操作されたCRISPR、TALEN、トランスポゾン系、ZFN、メガヌクレアーゼもしくはMega-TAL分子、および/またはトランスジーンをコードする核酸を細胞（例えば哺乳動物細胞）および標的組織に導入するために使用することができる。そのような方法は、CRISPR、TALEN、トランスポゾン系、ZFN、メガヌクレアーゼもしくはMega-TAL分子、および/またはトランスジーンをコードする核酸をインビトロで細胞に投与するためにも使用することができる。いくつかの例において、CRISPR、TALEN、トランスポゾン系、ZFN、メガヌクレアーゼもしくはMega-TAL分子、および/またはトランスジーンをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ免疫治療用途のために投与することができる。非ウイルスベクター送達システムとしては、DNAプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルとの複合体を形成した核酸を挙げることができる。ウイルスベクター送達システムとしては、細胞への送達後に、エピソームゲノムを有するか、組み込まれたゲノムを有する、DNAウイルスおよびRNAウイルスを挙げることができる。
核酸の非ウイルス性送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、金ナノ粒子送達、マイクロインジェクション、バイオリスティック法、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、または脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、mRNA、人工ビリオン、および作用物質増強DNA取り込みが挙げられる。例えばSonitron 2000システム（Rich-Mar）などを用いるソノポレーションも核酸の送達に使用することができる。さらなる例示的核酸送達システムとしては、AMAXA（登録商標）Biosystems（ドイツ、ケルン）、Life Technologies（メリーランド州フレデリック）、MAXCYTE,Inc.（メリーランド州ロックビル）、BTX Molecular Delivery Systems（マサチューセッツ州ホリストン）、およびCopernicus Therapeutics Inc.（例えば米国特許第6,008,336号）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクション試薬は市販されている（例えばTRANSFECTAM（登録商標）およびLIPOFECTIN（登録商標））。送達は細胞（例えばエクスビボ投与）または標的組織（例えばインビボ投与）への送達であることができる。さらなる送達方法として、送達される核酸のEnGeneIC送達ビヒクル（EDV）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらのEDVは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がEDVに対する特異性を有する二重特異性抗体を使って、標的組織に特異的に送達される。この抗体はEDVを標的細胞表面に導き、EDVは次にエンドサイトーシスによって細胞中に運ばれる。
操作されたCRISPR、TALEN、トランスポゾン系、ZFN、メガヌクレアーゼもしくはMega-TAL分子、トランスポゾン、および/またはトランスジーンをコードする核酸を含有するウイルスベクターおよび非ウルスベクターを含むベクターを、インビボでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のDNAまたはmRNAを投与することができる。投与は、限定するわけではないが注射、注入、外用適用、およびエレクトロポレーションなど、分子を血液細胞または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のいずれかによる。特定の組成物の投与には2つ以上の経路を使用することができる。薬学的に許容される担体は、一つには、投与される特定の組成物によって、またその組成物を投与するために使用される特定の方法によって決まる。
場合により、外因性トランスジーンをコードするベクターは、細胞ヌクレアーゼにシャトルされうる。例えばベクターは核局在化配列（NLS）を含有しうる。NLSはサル空砲形成ウイルス40に由来しうる。ベクターはタンパク質またはタンパク質複合体によってもシャトルされうる。場合により、ミニサークルベクターをシャトルするための手段として、Cas9を使用することができる。Casは1つまたは複数のNLSを含むことができる。場合により、ベクターは、エレクトロポレーションに先だって、予めCasタンパク質との複合体を形成させることができる。シャトリングのために使用することができるCasタンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Cas9（dCas9）タンパク質でありうる。シャトリングのために使用することができるCasタンパク質は、ヌクレアーゼコンピテントCas9でありうる。場合により、Casタンパク質は、予めガイドRNAおよび外因性トランスジーンをコードするベクターまたはプラスミドと混合しておくことができる。
ベクターは、個々の対象への投与によって、典型的には後述するように、全身性投与（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または外用適用によって、インビボ送達することができる。あるいは、ベクターをエクスビボの細胞、例えば個々の対象から外植された細胞（例えばリンパ球、T細胞、骨髄吸引物、組織生検）に送達した後、それらの細胞を、通常はベクターが組み込まれている細胞の選択後に、対象に再移植することもできる。選択前または選択後に細胞を拡大増殖させることができる。
細胞には、外因性トランスジーンおよびRNase-H様ドメイン含有タンパク質を含む編集システムをコードする変異型またはキメラ型アデノ随伴ウイルスベクターを、トランスフェクトすることができる。AAVベクター濃度は0.5ナノグラム〜50マイクログラムでありうる。場合により、エレクトロポレーションによって細胞に導入されうる核酸（例えばssDNA、dsDNA、RNA）の量は、トランスフェクション効率および/または細胞生存率を最適化するために変化させることができる。場合により、約100ピコグラム未満の核酸を各細胞試料に加えることができる（例えば1つまたは複数の細胞がエレクトロポレートされる）。場合により、少なくとも約100ピコグラム、少なくとも約200ピコグラム、少なくとも約300ピコグラム、少なくとも約400ピコグラム、少なくとも約500ピコグラム、少なくとも約600ピコグラム、少なくとも約700ピコグラム、少なくとも約800ピコグラム、少なくとも約900ピコグラム、少なくとも約1マイクログラム、少なくとも約1.5マイクログラム、少なくとも約2マイクログラム、少なくとも約2.5マイクログラム、少なくとも約3マイクログラム、少なくとも約3.5マイクログラム、少なくとも約4マイクログラム、少なくとも約4.5マイクログラム、少なくとも約5マイクログラム、少なくとも約5.5マイクログラム、少なくとも約6マイクログラム、少なくとも約6.5マイクログラム、少なくとも約7マイクログラム、少なくとも約7.5マイクログラム、少なくとも約8マイクログラム、少なくとも約8.5マイクログラム、少なくとも約9マイクログラム、少なくとも約9.5マイクログラム、少なくとも約10マイクログラム、少なくとも約11マイクログラム、少なくとも約12マイクログラム、少なくとも約13マイクログラム、少なくとも約14マイクログラム、少なくとも約15マイクログラム、少なくとも約20マイクログラム、少なくとも約25マイクログラム、少なくとも約30マイクログラム、少なくとも約35マイクログラム、少なくとも約40マイクログラム、少なくとも約45マイクログラム、または少なくとも約50マイクログラムの核酸を、各細胞試料に加えることができる（例えば1つまたは複数の細胞がエレクトロポレートされる）。例えば、1マイクログラムのdsDNAを、エレクトロポレーションのために、各細胞試料に加えることができる。場合により、最適なトランスフェクション効率および/または細胞生存率に要求される核酸（例えばdsDNA）の量は、細胞タイプに特異的でありうる。場合により、各試料に使用される核酸（例えばdsDNA）の量は、トランスフェクション効率および/または細胞生存率に直接対応しうる。
本明細書に記載する核酸送達プラットフォームのいずれか、例えばヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションによる、細胞のトランスフェクション効率は、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、もしくは99.9％超または約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約99.5％、約99.9％、もしくは約99.9％超でありうる。
本明細書に記載するベクター、プラスミド、およびゲノム編集システムは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技法、高速DNA被覆ペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合などといった任意の適切な方法によって送達することができる。本発明の任意の態様を構築するために使用される方法は、核酸操作の技能を持つ人々には公知であり、これには、遺伝子工学、組換え工学、および合成技法などがある。例えばSambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NYを参照されたい。Neon（登録商標）トランスフェクションシステム（ThermoFisher Scientific）またはAMAXA（登録商標）Nucleofector（AMAXA（登録商標）Biosystems）などを用いるエレクトロポレーションも、細胞への核酸の送達に使用することができる。トランスフェクション効率および/または細胞生存率を最適化するために、エレクトロポレーションパラメータを調節することができる。エレクトロポレーションデバイスは、指数関数的減衰、時定数（time constant）、および矩形波など、複数の電気波形パルス設定を有しうる。どの細胞タイプも、適用されるパルスパラメータ（例えば電圧、キャパシタンスおよび抵抗）に依存する特有の至適電界強度（E）を有する。至適電界強度の適用は、膜電位の誘導によって電気的易透化を引き起こし、それにより、核酸は細胞膜を通過することが可能になる。場合により、トランスフェクション効率および/または細胞生存率を最適化するために、エレクトロポレーションパルス電圧、エレクトロポレーションパルス幅、パルスの数、細胞密度、およびチップタイプを調節することができる。
場合により、トランスフェクション効率および/または細胞生存率を最適化するために、エレクトロポレーションパルス電圧を変更することができる。場合により、エレクトロポレーション電圧は約500ボルト未満でありうる。場合により、エレクトロポレーション電圧は、少なくとも約500ボルト、少なくとも約600ボルト、少なくとも約700ボルト、少なくとも約800ボルト、少なくとも約900ボルト、少なくとも約1000ボルト、少なくとも約1100ボルト、少なくとも約1200ボルト、少なくとも約1300ボルト、少なくとも約1400ボルト、少なくとも約1500ボルト、少なくとも約1600ボルト、少なくとも約1700ボルト、少なくとも約1800ボルト、少なくとも約1900ボルト、少なくとも約2000ボルト、少なくとも約2100ボルト、少なくとも約2200ボルト、少なくとも約2300ボルト、少なくとも約2400ボルト、少なくとも約2500ボルト、少なくとも約2600ボルト、少なくとも約2700ボルト、少なくとも約2800ボルト、少なくとも約2900ボルト、または少なくとも約3000ボルトでありうる。場合により、最適なトランスフェクション効率および/または細胞生存率に要求されるエレクトロポレーションパルス電圧は、細胞タイプに特異的でありうる。例えば、マクロファージ細胞の場合、1900ボルトのエレクトロポレーション電圧が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。別の一例では、Jurkat細胞またはT細胞などの初代ヒト細胞の場合、約1350ボルトのエレクトロポレーション電圧が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。場合により、所与の細胞タイプに対して、ある範囲のエレクトロポレーション電圧が最適でありうる。例えばヒト578T細胞の場合、約1000ボルト〜約1300ボルトのエレクトロポレーション電圧が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。
場合により、トランスフェクション効率および/または細胞生存率を最適化するために、エレクトロポレーションパルス幅を変更することができる。場合により、エレクトロポレーションパルス幅は約5ミリ秒未満でありうる。場合により、エレクトロポレーション幅は、少なくとも約5ミリ秒、少なくとも約6ミリ秒、少なくとも約7ミリ秒、少なくとも約8ミリ秒、少なくとも約9ミリ秒、少なくとも約10ミリ秒、少なくとも約11ミリ秒、少なくとも約12ミリ秒、少なくとも約13ミリ秒、少なくとも約14ミリ秒、少なくとも約15ミリ秒、少なくとも約16ミリ秒、少なくとも約17ミリ秒、少なくとも約18ミリ秒、少なくとも約19ミリ秒、少なくとも約20ミリ秒、少なくとも約21ミリ秒、少なくとも約22ミリ秒、少なくとも約23ミリ秒、少なくとも約24ミリ秒、少なくとも約25ミリ秒、少なくとも約26ミリ秒、少なくとも約27ミリ秒、少なくとも約28ミリ秒、少なくとも約29ミリ秒、少なくとも約30ミリ秒、少なくとも約31ミリ秒、少なくとも約32ミリ秒、少なくとも約33ミリ秒、少なくとも約34ミリ秒、少なくとも約35ミリ秒、少なくとも約36ミリ秒、少なくとも約37ミリ秒、少なくとも約38ミリ秒、少なくとも約39ミリ秒、少なくとも約40ミリ秒、少なくとも約41ミリ秒、少なくとも約42ミリ秒、少なくとも約43ミリ秒、少なくとも約44ミリ秒、少なくとも約45ミリ秒、少なくとも約46ミリ秒、少なくとも約47ミリ秒、少なくとも約48ミリ秒、少なくとも約49ミリ秒、または少なくとも約50ミリ秒でありうる。場合により、最適なトランスフェクション効率および/または細胞生存率に要求されるエレクトロポレーションパルス幅は、細胞タイプに特異的でありうる。例えば、マクロファージ細胞の場合、30ミリ秒のエレクトロポレーションパルス幅が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。別の一例では、Jurkat細胞の場合、約10ミリ秒のエレクトロポレーション幅が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。場合により、所与の細胞タイプに対して、ある範囲のエレクトロポレーション幅が最適でありうる。例えば、ヒト578T細胞の場合、約20ミリ秒〜約30ミリ秒のエレクトロポレーション幅が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。
場合により、トランスフェクション効率および/または細胞生存率を最適化するために、エレクトロポレーションパルスの数を変更することができる。場合により、エレクトロポレーションは単一パルスを含むことができる。場合により、エレクトロポレーションは、2パルス以上を含むことができる。場合により、エレクトロポレーションは、2パルス、3パルス、4パルス、5パルス、6パルス、7パルス、8パルス、9パルスもしくは10パルス、またはそれ以上を含むことができる。場合により、最適なトランスフェクション効率および/または細胞生存率に要求されるエレクトロポレーションパルスの数は、細胞タイプに特異的でありうる。例えば、マクロファージ細胞の場合、単一パルスによるエレクトロポレーション電圧が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。別の一例では、初代細胞の場合、3パルスによるエレクトロポレーションが最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。場合により、所与の細胞タイプに対して、ある範囲のエレクトロポレーション幅が最適でありうる。例えば、ヒト細胞の場合、約1〜約3パルスによるエレクトロポレーションが最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。
場合により、トランスフェクション効率および/または細胞生存率を最適化するために、エレクトロポレーションのための出発細胞密度を変更することができる。場合により、エレクトロポレーションのための出発細胞密度は約1×105細胞を下回りうる。場合により、エレクトロポレーションのための出発細胞密度は、少なくとも約1×105細胞、少なくとも約2×105細胞、少なくとも約3×105細胞、少なくとも約4×105細胞、少なくとも約5×105細胞、少なくとも約6×105細胞、少なくとも約7×105細胞、少なくとも約8×105細胞、少なくとも約9×105細胞、少なくとも約1×106細胞、少なくとも約1.5×106細胞、少なくとも約2×106細胞、少なくとも約2.5×106細胞、少なくとも約3×106細胞、少なくとも約3.5×106細胞、少なくとも約4×106細胞、少なくとも約4.5×106細胞、少なくとも約5×106細胞、少なくとも約5.5×106細胞、少なくとも約6×106細胞、少なくとも約6.5×106細胞、少なくとも約7×106細胞、少なくとも約7.5×106細胞、少なくとも約8×106細胞、少なくとも約8.5×106細胞、少なくとも約9×106細胞、少なくとも約9.5×106細胞、少なくとも約1×107細胞、少なくとも約1.2×107細胞、少なくとも約1.4×107細胞、少なくとも約1.6×107細胞、少なくとも約1.8×107細胞、少なくとも約2×107細胞、少なくとも約2.2×107細胞、少なくとも約2.4×107細胞、少なくとも約2.6×107細胞、少なくとも約2.8×107細胞、少なくとも約3×107細胞、少なくとも約3.2×107細胞、少なくとも約3.4×107細胞、少なくとも約3.6×107細胞、少なくとも約3.8×107細胞、少なくとも約4×107細胞、少なくとも約4.2×107細胞、少なくとも約4.4×107細胞、少なくとも約4.6×107細胞、少なくとも約4.8×107細胞、または少なくとも約5×107細胞でありうる。場合により、最適なトランスフェクション効率および/または細胞生存率に要求されるエレクトロポレーションのための出発細胞密度は、細胞タイプに特異的でありうる。例えば、マクロファージ細胞の場合、エレクトロポレーションのための出発細胞密度は1.5×106細胞が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。別の一例では、ヒト細胞の場合、エレクトロポレーションのための出発細胞密度は5×106細胞が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。場合により、所与の細胞タイプに対して、エレクトロポレーションのための出発細胞密度は、ある範囲で最適でありうる。例えば、T細胞などのヒト細胞の場合、エレクトロポレーションのための出発細胞密度は、5.6×106〜5×107細胞が最適でありうる（例えば最も高い生存率および/またはトランスフェクション効率を与えうる）。
場合により、誘導ポリ核酸とヌクレアーゼは複合体として細胞に導入することができる。複合体はリボ核酸タンパク質複合体（RNP）でありうる。RNP複合体の導入はタイミングを調節することができる。場合により、細胞は、誘導ポリ核酸およびヌクレアーゼの導入に先だって、他の細胞と、細胞周期のG1期、S期、および/またはM期で同期させることができる。場合により、RNP複合体は、HDR、MMEJ、またはNHEJが増強されうるように、ある細胞期において送達することができる。場合により、RNP複合体は相同組換え修復を容易にしうる。
非相同末端結合（NHEJ）および相同組換え修復（HDR）はさまざまな方法を使って定量化することができる。
場合により、NHEJ、HDR、または両者の組合せのパーセンテージは、遺伝子編集分子、例えば誘導ポリ核酸およびRNase H様ドメイン含有ポリペプチドを、プロモーターレスGFPをコードするドナーDNAテンプレートと共に細胞に同時送達することによって決定することができる。約72時間後に、総細胞数（NTotal）、GFP陽性細胞数（NGFP＋）、およびGFP陰性細胞数（NGFP-）を定量化するために、フローサイトメトリーを行うことができる。GFP陰性細胞の中で、次世代シーケンシングを行って、変異導入がない細胞（NGFP- 0）および変異導入がある細胞（NGFP- 1）を同定することができる。HDR効率はNGFP＋/NTotal×100％として算出することができ、NHEJ効率はNGFP- 1/NTotal×100％として算出されることになる。
場合により、DNA編集システムの活性は、レポータータンパク質を発現する細胞またはレポーター遺伝子を含有する細胞を使ってアッセイすることができる。例えば、レポータータンパク質を、停止コドン、フレームシフト変異導入、スペーサー、リンカー、または転写ターミネーターなどの障害を含有するように操作し、次にDNA編集システムを使ってその障害を除去し、その結果生じる機能的レポータータンパク質を検出することができる。場合により、障害は、レポータータンパク質の機能性を回復するには特異的配列修飾が要求されるように、設計することができる。別の例では、レポータータンパク質の機能生の回復には1塩基または2塩基のフレームシフトをもたらす任意の挿入または欠失で十分でありうるように、障害を設計することができる。レポータータンパク質の例としては、比色分析用酵素、代謝酵素、蛍光タンパク質、抗生物質耐性と関連する酵素および輸送体、ならびに発光酵素が挙げられる。そのようなレポータータンパク質の例として、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、およびウミシイタケ（renilla）が挙げられる。異なるレポータータンパク質には異なる検出方法を使用しうる。例えばレポータータンパク質は、細胞生存率、細胞成長、蛍光、発光または検出可能な産物の発現に影響を及ぼしうる。場合により、レポータータンパク質は、比色アッセイ法を使って検出しうる。場合により、レポータータンパク質は蛍光タンパク質であり、DNA編集は、処理された細胞の蛍光の程度または少なくともしきいレベルの蛍光を持つ処理された細胞の数を測定することによってアッセイされうる。場合により、レポーター遺伝子の転写レベルを評価しうる。別の例では、レポーター遺伝子をシーケンシングによって評価しうる。場合により、DNA編集を測定するためのアッセイ法は、スプリット蛍光タンパク質システム、例えば独力で会合して機能的GFPシグナルを形成することができるGFPタンパク質の2つのフラグメント（G1〜10およびG11）がフレームシフトリンカーを使って連結されている自己相補性スプリットGFP1〜10/11システムなどを使用しうる。フレームシフトリンカー内での挿入または欠失は、G11フラグメントのフレームを回復させることができ、その結果、2つのフラグメントは機能的GFPシグナルを形成することが可能になる。そのようなアッセイ法の一例を実施例12ならびに図18〜25および図27〜32に示す。図32Aおよび図32Bに見られるように、Ago51およびAgo89はどちらも、約1.2％の、GFP蛍光を示す細胞をもたらした。これは、Agoなしの対照条件に見られるレベル（0.6％）より2倍高いレベルであり、ベースラインで見られるレベルの2倍のレベルでDNA編集が成功したことを示している。場合により、本明細書に記載するAgoタンパク質は、少なくとも約1％、少なくとも約1.1％、少なくとも約1.2％、少なくとも約1.3％、少なくとも約1.4％、少なくとも約1.5％、少なくとも約1.6％、少なくとも約1.7％、少なくとも約1.8％、少なくとも約1.9％、少なくとも約2％、少なくとも約2.5％、少なくとも約3％、少なくとも約4％、少なくとも約5％、少なくとも約6％、少なくとも約7％、少なくとも約8％、少なくとも約9％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の、回復したレポータータンパク質活性を呈する細胞をもたらしうる。場合により、本明細書に記載するAgoタンパク質は、少なくとも約1％〜99％、少なくとも約1％〜10％、少なくとも約1％〜5％、少なくとも約1％〜2％、少なくとも約5％〜50％、少なくとも約10％〜80％、少なくとも約10％〜50％、少なくとも約30％〜70％、または少なくとも約50％〜80％の、回復したレポータータンパク質活性を呈する細胞をもたらしうる。場合により、本明細書に記載するAgoタンパク質は、ベースラインと比較して、回復したレポーター活性を持つ細胞のパーセンテージに、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍の増加をもたらしうる。場合により、本明細書に記載するAgoタンパク質は、ベースラインと比較して、回復したレポーター活性を持つ細胞のパーセンテージに、少なくとも約1.2倍〜10倍、少なくとも約1.5倍〜10倍、少なくとも約2倍〜10倍、少なくとも約2倍〜5倍、少なくとも約2倍〜20倍、少なくとも約3倍〜5倍、少なくとも約4倍〜10倍、少なくとも約5倍〜20倍、少なくとも約10倍〜100倍、少なくとも約10倍〜50倍、または少なくとも約1.2倍〜100倍の増加をもたらしうる。
NHEJまたはMMEJよりもHDRを用いるゲノム切断修復の発生率は、RNase-H様ドメインを含むゲノム編集システムと接触させた細胞のうちの20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、もしくは99.9％超、または約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約99.5％、約99.9％、もしくは約99.9％超でありうる。HDRまたはMMEJよりもNHEJを用いるゲノム切断修復の発生率は、RNase-H様ドメインを含むゲノム編集システムと接触させた細胞のうちの20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、もしくは99.9％超、または約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約99.5％、約99.9％、もしくは約99.9％超でありうる。HDRまたはNHEJよりもMMEJを用いるゲノム切断修復の発生率は、RNase-H様ドメインを含むゲノム編集システムと接触させた細胞のうちの20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、もしくは99.9％超、または約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約99.5％、約99.9％、もしくは約99.9％超でありうる。
TCRなどの外因性ポリ核酸の組込みは、任意の技法を使って測定することができる。例えば組込みは、フローサイトメトリー、サーベイヤーヌクレアーゼアッセイ法、分解によるインデルのトラッキング（tracking of indels by decomposition：TIDE）、ジャンクションPCRまたはそれらの任意の組合せによって、測定することができる。別の例では、トランスジーン組込みをPCRによって測定することができる。操作された細胞に対してTIDE解析を行うこともできる。エクスビボ細胞トランスフェクションは、診断法、研究または遺伝子治療（例えば宿主生物へのトランスフェクト細胞の再注入によるもの）にも使用することができる。場合により、細胞は対象生物から単離され、核酸（例えば遺伝子またはcDNA）をトランスフェクトされ、対象生物（例えば対象）に再注入によって戻される。
対象において治療的に有効であるために必要となりうるRHDCポリペプチド含有修飾細胞の量は、細胞の生存率および細胞が遺伝子修飾された効率（例えばトランスジーンが1つまたは複数の細胞に組み込まれた効率）に依存して変動しうる。場合により、遺伝子修飾後の細胞の生存率とトランスジーンの組込み効率との積（例えばかけ算）は、対象への投与に用いることができる細胞の治療アリコート（therapeutic aliquot）に対応しうる。場合により、遺伝子修飾後の細胞の生存率の増加は、投与が対象において治療的に有効であるために必要となる細胞の量の減少に対応しうる。場合により、トランスジーンが1つまたは複数の細胞に組み込まれた効率の増加は、投与が対象において治療的に有効であるために必要となる細胞の量の減少に対応しうる。場合により、治療的に有効であるために必要となる細胞の量の決定は、経時的な細胞生存率の変化に対応する関数を決定する工程を含みうる。場合により、治療的に有効であるために必要となる細胞の量の決定は、時間依存的変量（例えば細胞培養時間、エレクトロポレーション時間、細胞刺激時間）に関して、トランスジーンが1つまたは複数の細胞に組み込まれうる効率の変化に対応する関数を決定する工程を含みうる。
本明細書に記載するとおり、AAVなどのウイルス粒子は、外因性TCRなどの関心対象の遺伝子またはトランスジーンを含むウイルスベクターを、エクスビボまたはインビボの細胞に送達するために使用することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示する変異型またはキメラ型アデノ随伴ウイルスベクターは、pfu（プラーク形成単位）として測定されうる。場合により、本開示の組成物および方法の組換えウイルスまたは変異型もしくはキメラ型アデノ随伴ウイルスベクターのpfuは、約108〜約5×1010pfuでありうる。場合により、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×108、少なくとも約2×108、少なくとも約3×108、少なくとも約4×108、少なくとも約5×108、少なくとも約6×108、少なくとも約7×108、少なくとも約8×108、少なくとも約9×108、少なくとも約1×109、少なくとも約2×109、少なくとも約3×109、少なくとも約4×109、少なくとも約5×109、少なくとも約6×109、少なくとも約7×109、少なくとも約8×109、少なくとも約9×109、少なくとも約1×1010、少なくとも約2×1010、少なくとも約3×1010、少なくとも約4×1010、および少なくとも約5×1010pfuである。場合により、本開示の組換えウイルスは、多くとも約1×108、多くとも約2×108、多くとも約3×108、多くとも約4×108、多くとも約5×108、多くとも約6×108、多くとも約7×108、多くとも約8×108、多くとも約9×108、多くとも約1×109、多くとも約2×109、多くとも約3×109、多くとも約4×109、多くとも約5×109、多くとも約6×109、多くとも約7×109、多くとも約8×109、多くとも約9×109、多くとも約1×1010、多くとも約2×1010、多くとも約3×1010、多くとも約4×1010、および多くとも約5×1010pfuである。いくつかの局面において、本開示の変異型またはキメラ型アデノ随伴ウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定されうる。場合により、本開示の組換えウイルスは、1×1010〜3×1012ベクターゲノム、もしくは1×109〜3×1013ベクターゲノム、もしくは1×108〜3×1014ベクターゲノム、もしくは少なくとも約1×101、少なくとも約1×102、少なくとも約1×103、少なくとも約1×104、少なくとも約1×105、少なくとも約1×106、少なくとも約1×107、少なくとも約1×108、少なくとも約1×109、少なくとも約1×1010、少なくとも約1×1011、少なくとも約1×1012、少なくとも約1×1013、少なくとも約1×1014、少なくとも約1×1015、少なくとも約1×1016、少なくとも約1×1017、および少なくとも約1×1018ベクターゲノムであるか、または1×108〜3×1014ベクターゲノムであるか、または多くとも約1×101、多くとも約1×102、多くとも約1×103、多くとも約1×104、多くとも約1×105、多くとも約1×106、多くとも約1×107、多くとも約1×108、多くとも約1×109、多くとも約1×1010、多くとも約1×1011、多くとも約1×1012、多くとも約1×1013、多くとも約1×1014、多くとも約1×1015、多くとも約1×1016、多くとも約1×1017、および多くとも約1×1018ベクターゲノムである。
場合により、本開示の変異型またはキメラ型アデノ随伴ウイルスベクターは、感染多重度（MOI）を使って測定することができる。場合により、MOIは、核酸が送達されうる細胞に対するベクターまたはウイルスゲノムの比または倍数を指しうる。場合により、MOIは1×106GC/mLでありうる。場合により、MOIは1×105GC/mL〜1×107GC/mLでありうる。場合により、MOIは1×104GC/mL〜1×108GC/mLでありうる。場合により、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×101GC/mL、少なくとも約1×102GC/mL、少なくとも約1×103GC/mL、少なくとも約1×104GC/mL、少なくとも約1×105GC/mL、少なくとも約1×106GC/mL、少なくとも約1×107GC/mL、少なくとも約1×108GC/mL、少なくとも約1×109GC/mL、少なくとも約1×1010GC/mL、少なくとも約1×1011GC/mL、少なくとも約1×1012GC/mL、少なくとも約1×1013GC/mL、少なくとも約1×1014GC/mL、少なくとも約1×1015GC/mL、少なくとも約1×1016GC/mL、少なくとも約1×1017GC/mL、および少なくとも約1×1018GC/mL MOIである。場合により、本開示の変異型またはキメラ型アデノ随伴ウイルスは、約1×108GC/mL〜約3×1014GC/mL MOIであるか、または多くとも約1×101GC/mL、多くとも約1×102GC/mL、多くとも約1×103GC/mL、多くとも約1×104GC/mL、多くとも約1×105GC/mL、多くとも約1×106GC/mL、多くとも約1×107GC/mL、多くとも約1×108GC/mL、多くとも約1×109GC/mL、多くとも約1×1010GC/mL、多くとも約1×1011GC/mL、多くとも約1×1012GC/mL、多くとも約1×1013GC/mL、多くとも約1×1014GC/mL、多くとも約1×1015GC/mL、多くとも約1×1016GC/mL、多くとも約1×1017GC/mL、および多くとも約1×1018GC/mL MOIである。
いくつかの局面において、非ウイルスベクターまたは非ウイルス核酸は、変異型もしくはキメラ型アデノ随伴ウイルスベクターを使用せずに送達することができ、核酸の量に従って測定することができる。一般に、本開示の組成物および方法では、任意の適切な量の核酸を使用することができる。場合により、核酸は、少なくとも約1pg、少なくとも約10pg、少なくとも約100pg、少なくとも約1pg、少なくとも約10pg、少なくとも約100pg、少なくとも約200pg、少なくとも約300pg、少なくとも約400pg、少なくとも約500pg、少なくとも約600pg、少なくとも約700pg、少なくとも約800pg、少なくとも約900pg、少なくとも約1μg、少なくとも約10μg、少なくとも約100μg、少なくとも約200μg、少なくとも約300μg、少なくとも約400μg、少なくとも約500μg、少なくとも約600μg、少なくとも約700μg、少なくとも約800μg、少なくとも約900μg、少なくとも約1ng、少なくとも約10ng、少なくとも約100ng、少なくとも約200ng、少なくとも約300ng、少なくとも約400ng、少なくとも約500ng、少なくとも約600ng、少なくとも約700ng、少なくとも約800ng、少なくとも約900ng、少なくとも約1mg、少なくとも約10mg、少なくとも約100mg、少なくとも約200mg、少なくとも約300mg、少なくとも約400mg、少なくとも約500mg、少なくとも約600mg、少なくとも約700mg、少なくとも約800mg、少なくとも約900mg、少なくとも約1g、少なくとも約2g、少なくとも約3g、少なくとも約4g、または少なくとも約5gでありうる。場合により、核酸は、多くとも約1pg、多くとも約10pg、多くとも約100pg、多くとも約1pg、多くとも約10pg、多くとも約100pg、多くとも約200pg、多くとも約300pg、多くとも約400pg、多くとも約500pg、多くとも約600pg、多くとも約700pg、多くとも約800pg、多くとも約900pg、多くとも約1μg、多くとも約10μg、多くとも約100μg、多くとも約200μg、多くとも約300μg、多くとも約400μg、多くとも約500μg、多くとも約600μg、多くとも約700μg、多くとも約800μg、多くとも約900μg、多くとも約1ng、多くとも約10ng、多くとも約100ng、多くとも約200ng、多くとも約300ng、多くとも約400ng、多くとも約500ng、多くとも約600ng、多くとも約700ng、多くとも約800ng、多くとも約900ng、多くとも約1mg、多くとも約10mg、多くとも約100mg、多くとも約200mg、多くとも約300mg、多くとも約400mg、多くとも約500mg、多くとも約600mg、多くとも約700mg、多くとも約800mg、多くとも約900mg、多くとも約1g、多くとも約2g、多くとも約3g、多くとも約4g、または多くとも約5gでありうる。
移植前、移植後、および/または移植中の細胞（例えば操作された細胞または操作された初代細胞）は、機能的であることができる。例えば移植された細胞は、移植後、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも6、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100日、または少なくとも約1、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約11、少なくとも約12、少なくとも約13、少なくとも約14、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約17、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、少なくとも約21、少なくとも約22、少なくとも約23、少なくとも約24、少なくとも約25、少なくとも約6、少なくとも約27、少なくとも約28、少なくとも約29、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、または少なくとも約100日にわたって機能的でありうる。移植された細胞は、移植後、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、または少なくとも12ヶ月、または少なくとも約1、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約11、または少なくとも約12ヶ月にわたって機能的でありうる。移植された細胞は、移植後、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、または少なくとも30年、または少なくとも約1、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、または少なくとも約30年にわたって機能的でありうる。場合により、移植された細胞はレシピエントの寿命まで機能的でありうる。
さらに、移植された細胞は、意図されたその通常動作の100％の機能を果たしうる。また、移植された細胞は、意図されたその通常動作の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％の機能を果たしうる。
移植された細胞は、意図された通常動作の100％を超える機能も果たしうる。例えば、移植された細胞は、意図されたその通常動作の110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000％、またはそれ以上の機能を果たしうる。
本発明の細胞と共に1つまたは複数のサイトカインを導入することができる。サイトカインは、細胞毒性Tリンパ球（養子移入された腫瘍特異的細胞毒性Tリンパ球を含む）をブーストして腫瘍微小環境内で拡大増殖させるために用いることができる。場合により、本明細書に記載の細胞の拡大増殖を助長するために、IL-2を使用することができる。IL-15などのサイトカインも使用することができる。IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、またはそれらの任意の組合せなど、免疫治療の分野における他の関連サイトカインも用いることができる。
場合により、IL-2は、細胞注入の24時間以内に開始して、約4日まで（最大12回）続けて投与することができる。場合により、IL-2は、最初の投与後に、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40日までにわたって投与しうる。IL-2は8時間ごとに投与することができる。場合により、IL-2を、最初の投与後、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間ごとに投与することができる。場合により、毒性が検出された場合には、IL-2の投与を停止することができる。場合により、対象がアルデスロイキンによりグレード3またはグレード4の毒性に達した場合には、下痢、悪心、嘔吐、低血圧、皮膚異常、食欲不振、粘膜炎、嚥下障害、または全身症状および検査値変化などのアルデスロイキンに一般的な可逆的グレード3毒性を除いて、投与を遅らせることまたは停止することができる。場合により、これらの毒性を対症療法により24時間以内に容易に反転させることができる場合には、追加の投与を行うことができる。加えて、投与は処置医の裁量で保持または停止することができる。
薬学的組成物および製剤
全体を通して記載される組成物は、医薬に製剤化して、がんなどの疾患と診断された、それを必要とするヒトまたは哺乳動物を処置するために使用することができる。これらの医薬は、ヒトまたは哺乳動物に、1つまたは複数のT細胞（例えば操作されたT細胞）ならびに1つまたは複数の化学療法剤または化学療法化合物と、共投与することができる。本願は、修飾ポリヌクレオチドを含む材料および方法ならびにヒト遺伝性疾患に関連する1つまたは複数の症状または合併症を改善するためにそのようなポリヌクレオチドを使用する方法も提供する。
化学療法剤は、がんの処置に有用な化学化合物でありうる。本開示のT細胞と組み合わせて使用することができるがん化学療法剤としては、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。これには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびNavelbine（商標）（ビノレルビン、5'-ノルアンヒドロブラスチン）などがある。さらに別の例では、がん化学療法剤として、カンプトテシンなどのトポイソメラーゼI阻害剤が挙げられる。本明細書において使用される場合、「カンプトテシン化合物」としては、Camptosar（商標）（イリノテカンHCL）、Hycamtin（商標）（トポテカンHCL）ならびにカンプトテシンおよびその類似体から誘導される他の化合物が挙げられる。本明細書に開示する方法および組成物において使用することができるがん化学療法剤の別のカテゴリーは、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、テニポシド、およびミトポドジドでありうる。本開示は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化する、アルキル化剤として公知の他のがん化学療法剤を、さらに包含する。これには、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン（chlomaphazin）、およびダカルバジンなどがあるが、それらに限定されるわけではない。本開示は化学療法剤としての代謝拮抗物質を包含する。これらのタイプの作用物質の例としては、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプライム（azathioprime）、およびプロカルバジンが挙げられる。本明細書に開示する方法および組成物において使用することができるがん化学療法剤の追加のカテゴリーに、抗生物質がある。例としては、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシン（mytomycin）C、およびダウノマイシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。これらの化合物についてはリポソーム製剤が数多く市販されている。本開示は、限定するわけではないが、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イホスファミド、およびミトキサントロンなどといった、他のがん化学療法剤をさらに包含する。
患者には、それらのために生成されうる数の細胞を注入しうる。場合により、患者に注入される細胞は、すべてが操作された細胞であるわけではない。場合により、対象には、導入することができる細胞の全集団中、あるパーセンテージの、操作された細胞を与えうる。例えば、患者に導入されうる細胞の少なくとも90％が操作された細胞でありうる。別の例では、患者に導入される細胞の少なくとも40％が操作された細胞でありうる。例えば患者には、任意の数の操作された細胞を、導入される全集団の10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％与えうる。
本明細書に開示する細胞は、細胞毒性/抗新生物剤および抗血管新生剤などといった他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。細胞毒性/抗新生物剤はがん細胞を攻撃して殺す作用物質と定義することができる。
抗血管新生剤も使用することができる。本開示の方法および組成物において使用するための適切な抗血管新生剤として、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含む抗VEGF抗体、抗VEGFアプタマー、ならびに抗VEGFアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。他の血管新生阻害剤として、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1（αおよびβを含む）、インターロイキン12、レチノイン酸、ならびに組織メタロプロテイナーゼ阻害物質-1および-2（TIMP-1および-2）が挙げられる。抗血管新生活性を持つトポイソメラーゼII阻害剤であるラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含む小分子も使用することができる。
場合により、例えば組成物、製剤、および処置方法において、投与される組成物または製剤の単位投薬量は、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100mgでありうる。場合により、投与される組成物または製剤の総量は、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、または100gでありうる。
場合により、本発明は、細胞を含む薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、単独でまたは薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と一緒に、任意の経路で投与することができ、そのような投与は1回または複数回実行することができる。より具体的には、薬学的組成物は、錠剤、カプセル剤、口中錠、トローチ剤、ハンドキャンディ（hand candy）、散剤、噴霧剤、水性懸濁剤、注射用溶液剤、エリキシル剤、シロップ剤などの形態で、種々の薬学的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。そのような担体として、固形の希釈剤または充填材、滅菌水性媒体および種々の非毒性有機溶媒などが挙げられる。さらにまた、そのような薬学的経口製剤には、適宜、甘味または風味を付与する目的に一般に使用されるタイプの種々の作用物質を使って、甘味および/または風味を付与することができる。
場合により、担体は、水、食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油など、希釈剤、薬学的に許容される担体（例えばリン酸緩衝食塩水）、薬学的に許容される賦形剤、抗原性を増強するためのアジュバント、免疫刺激化合物もしくは免疫刺激分子および/または当技術分野において公知の他の化合物でありうる。本明細書におけるアジュバントは、抗原が吸着される無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液、または抗原溶液が油中に乳化される油中水型エマルション（MF-59、フロイド不完全アジュバント）、場合によっては、抗原性をさらに増強するために死滅させたマイコバクテリアを含めたもの（フロイント完全アジュバント）（抗原の分解を阻害し、かつ/またはマクロファージの流入を引き起こす）を含有しうる。アジュバントとして、サイトカインなどの免疫刺激分子、共刺激分子、および例えばCpGオリゴヌクレオチドなどの免疫刺激DNAまたはRNA分子も挙げられる。当業者は、そのような投与調合物を、容易に確認することができる。投薬量は、1つまたは複数の薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を、さらに含有しうる。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質、ゲルまたはゲル化材、着香剤、着色剤、マイクロスフェア、ポリマー、懸濁剤などといった補助物質も、ここに存在しうる。加えて、1つまたは複数の他の通常の薬学的成分、例えば保存剤、保水剤、懸濁化剤、界面活性剤、酸化防止剤、凝固防止剤、充填剤、キレート剤、コーティング剤、化学安定化材なども、とりわけ剤形が再構成可能な形態である場合には、存在しうる。適切な例示的成分として、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート80、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミンおよびそれらの組合せが挙げられる。薬学的に許容される賦形剤の詳細な議論は、参照により本明細書に組み入れられるRemington's pharmaceutical sciences（Mack Pub.Co.,N.J.1991）に見ることができる。
細胞は、本明細書に記載するように、ヒトから抽出することができる。細胞は、エクスビボで遺伝子改変して、相応に使用することができる。これらの細胞は細胞ベースの治療に使用することができる。これらの細胞はレシピエント（例えばヒト）における疾患を処置するために使用することができる。例えばこれらの細胞はがんを処置するために使用することができる。
本明細書には、操作された細胞を含む1つまたは複数の細胞（器官および/または組織を含む）をレシピエントに移植する工程を含む、レシピエントにおける疾患（例えばがん）を処置する方法が記載される。がんを処置するために、細胞内ゲノム移植によって調製された細胞を使用することができる。
本明細書には、1つまたは複数のアルゴノート修飾細胞（器官および/または組織を含む）をレシピエントに移植する工程を含む、レシピエントにおける疾患（例えばがん）を処置する方法が記載される。一般に、本明細書に記載する修飾細胞は、CD3 TCR複合体関連シグナルを刺激することができる作用物質とT細胞表面上の共刺激分子を刺激することができるリガンドとが取り付けられた表面との接触によって、拡大増殖させることができる。具体的には、細胞集団は、例えば表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗CD2抗体との接触によって、またはプロテインキナーゼC活性化因子（例えばブリオスタチン）と、場合によってはカルシウムイオノフォアと一緒に、接触させることによって、インビトロで刺激することができる。修飾細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用することができる。例えば、細胞の集団を、T細胞の増殖を刺激することができる条件下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。場合により、細胞を刺激するために、4-1BBを使用することができる。例えば細胞を4-1BBおよびIL-21または別のサイトカインで刺激することができる。場合により、5×1010細胞が対象に投与される。別の例では、5×1011細胞が対象に投与される。
いくつかの態様において、約5×1010細胞が対象に投与される。いくつかの態様において、約5×1010細胞は、対象に投与される細胞のメジアン量を表す。いくつかの態様において、対象における治療応答に影響を及ぼすには、約5×1010細胞が必要である。いくつかの態様において、少なくとも約少なくとも約1×107細胞、少なくとも約2×107細胞、少なくとも約3×107細胞、少なくとも約4×107細胞、少なくとも約5×107細胞、少なくとも約6×107細胞、少なくとも約6×107細胞、少なくとも約8×107細胞、少なくとも約9×107細胞、少なくとも約1×108細胞、少なくとも約2×108細胞、少なくとも約3×108細胞、少なくとも約4×108細胞、少なくとも約5×108細胞、少なくとも約6×108細胞、少なくとも約6×108細胞、少なくとも約8×108細胞、少なくとも約9×108細胞、少なくとも約1×109細胞、少なくとも約2×109細胞、少なくとも約3×109細胞、少なくとも約4×109細胞、少なくとも約5×109細胞、少なくとも約6×109細胞、少なくとも約6×109細胞、少なくとも約8×109細胞、少なくとも約9×109細胞、少なくとも約1×1010細胞、少なくとも約2×1010細胞、少なくとも約3×1010細胞、少なくとも約4×1010細胞、少なくとも約5×1010細胞、少なくとも約6×1010細胞、少なくとも約6×1010細胞、少なくとも約8×1010細胞、少なくとも約9×1010細胞、少なくとも約1×1011細胞、少なくとも約2×1011細胞、少なくとも約3×1011細胞、少なくとも約4×1011細胞、少なくとも約5×1011細胞、少なくとも約6×1011細胞、少なくとも約6×1011細胞、少なくとも約8×1011細胞、少なくとも約9×1011細胞、または少なくとも約1×1012細胞。例えば、約5×1010細胞を対象に投与することができる。別の一例では、3×106細胞から出発し、細胞を約5×1010細胞まで拡大増殖させて、対象に投与することができる。場合により、細胞を治療に十分な数まで拡大増殖させる。例えば、5×107細胞は、迅速な拡大増殖を起こして、治療的使用に十分な数を生じうる。場合により、治療的使用に十分な数は5×1010でありうる。治療的使用には任意の数の細胞を注入することができる。例えば対象には、両端を含む1×106〜5×1012の数の細胞を注入しうる。対象には、それらのために生成されうる数の細胞を注入することができる。場合により、対象に注入される細胞は、すべてが操作された細胞であるわけではない。例えば対象に注入される細胞の少なくとも90％が操作された細胞でありうる。別の例では、対象に注入される細胞の少なくとも40％が操作された細胞でありうる。
いくつかの態様において、本開示の方法は、対象における治療応答に影響を及ぼすのに必要な修飾細胞の量を、算出しかつ/または対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、治療応答に影響を及ぼすのに必要な操作された細胞の量の算出は、細胞の生存率および/またはトランスジーンが細胞のゲノムに組み込まれた効率を含む。いくつかの態様において、対象における治療応答に影響を及ぼすために、対象に投与することができる修飾細胞は生存可能でありうる。いくつかの態様において、対象における治療応答に影響を達成するために、細胞の少なくとも約95％、少なくとも約90％、少なくとも約85％、少なくとも約80％、少なくとも約75％、少なくとも約70％、少なくとも約65％、少なくとも約60％、少なくとも約55％、少なくとも約50％、少なくとも約45％、少なくとも約40％、少なくとも約35％、少なくとも約30％、少なくとも約25％、少なくとも約20％、少なくとも約15％、少なくとも約10％は生存細胞である。いくつかの態様において、対象における治療応答に影響を及ぼすために、対象に投与されるRHDCポリペプチド修飾細胞は、1つまたは複数のトランスジーンが細胞のゲノムにうまく組み込まれている細胞でありうる。いくつかの態様において、対象における治療応答を達成するために、細胞の少なくとも約95％、少なくとも約90％、少なくとも約85％、少なくとも約80％、少なくとも約75％、少なくとも約70％、少なくとも約65％、少なくとも約60％、少なくとも約55％、少なくとも約50％、少なくとも約45％、少なくとも約40％、少なくとも約35％、少なくとも約30％、少なくとも約25％、少なくとも約20％、少なくとも約15％、少なくとも約10％は、1つまたは複数のトランスジーンが細胞のゲノムにうまく組み込まれている。
本明細書に開示する方法は、限定するわけではないが、がん、心血管疾患、肺疾患、肝疾患、皮膚疾患、または神経学的疾患を含む疾患を、その処置または防止を必要とする対象にRNase-H様ドメイン含有ペプチド修飾細胞を投与することによって処置または防止するために使用することができる。
移植は任意のタイプの移植によることができる。部位としては、肝被膜下腔、脾被膜下腔、腎被膜下腔、網、胃または腸の粘膜下組織、小腸の血管セグメント、静脈嚢、精巣、脳、脾臓、または角膜を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。例えば移植は被膜下移植であることができる。移植は筋肉内移植であることもできる。移植は門脈内移植であることができる。
移植はヒトからの1つまたは複数の細胞の移植であることができる。例えば、前記1つまたは複数の細胞は器官からの細胞であることができ、器官は、脳、心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、腺、鼻、口、口唇、脾臓、歯肉、歯、舌、唾液腺、扁桃、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靱帯、腎上体、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、またはリンパ管でありうる。前記1つまたは複数の細胞は、脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、眼、小腸または膵臓からの細胞であることもできる。前記1つまたは複数の細胞は膵臓、腎臓、眼、肝臓、小腸、肺、または心臓からの細胞であることができる。前記1つまたは複数の細胞は膵臓からの細胞であることができる。前記1つまたは複数の細胞は膵島細胞、例えば膵β細胞であることができる。前記1つまたは複数の細胞は、末梢血単核球（PBMC）、リンパ球、単球、またはマクロファージなど、任意の血液細胞であることができる。前記1つまたは複数の細胞は、リンパ球、B細胞、またはT細胞など、任意の免疫細胞であることができる。
本明細書に開示する方法は、1つまたは複数の細胞（例えば自家細胞または同種異系細胞）を移植する工程を含み、前記1つまたは複数の細胞は任意のタイプの細胞であることができる。例えば、前記1つまたは複数の細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、神経系細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（BおよびT）、マクロファージ、単球、単核球、心筋細胞、他の筋細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、膵島細胞、血液細胞、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、臍帯静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞、クッパー細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、および上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、アストロサイト、赤血球、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、メモリー細胞、T細胞、B細胞、形質細胞、筋細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、管周囲細胞、セルトリ細胞、ルテイン細胞、子宮頚管細胞、子宮内膜細胞、乳房細胞、濾胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角質化上皮細胞、角質化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞（dopamiergic cell）、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ドーパミン作動性細胞、胚性幹細胞、線維芽細胞および胎児線維芽細胞であることができる。さらに、1つまたは複数の細胞は、限定するわけではないが、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵F細胞（例えばPP細胞）、または膵臓ε細胞などの、膵島細胞および/または膵島細胞クラスターなどでありうる。一例として、1つまたは複数の細胞は膵α細胞でありうる。別の一例として、1つまたは複数の細胞は膵β細胞でありうる。
ドナーは、限定するわけではないが胎児、新生児、若年および成人など、任意の発生段階にあることができる。例えばドナーT細胞はヒト成人から単離されうる。ドナーヒトT細胞は、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1歳未満でありうる。例えばT細胞は6歳未満のヒトから単離されうる。T細胞は3歳未満のヒトから単離することもできる。ドナーは10歳超であることができる。
キット
本明細書では組成物を含むキットが開示されうる。本明細書において開示されるのは、がん、病原体感染、免疫障害または同種異系移植の処置または防止のためのキットであることもできる。一態様において、キットは、単位剤形中に有効量のヌクレアーゼ修飾細胞の組成物を含有する治療組成物または予防組成物を含みうる。いくつかの態様において、キットは、操作されたT細胞の治療組成物を含有しうる滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、小袋、ブリスターパック、または当技術分野において公知の他の適切な容器形態であることができる。そのような容器は、プラスチック製、ガラス製、積層紙製、金属箔製、または医薬を保持するのに適した他の材料製であることができる。場合により、RHDCポリペプチド修飾細胞は、がん、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植を有するまたはそれらを発生するリスクがある対象への細胞の投与に関する説明書と一緒に提供することができる。説明書は一般に、がん、病原体感染、免疫障害または同種異系移植の処置または防止のための組成物の使用に関する情報を含みうる。場合により、キットは約1×104細胞〜約1×1012細胞を含みうる。場合により、キットは、少なくとも約1×105細胞、少なくとも約1×106細胞、少なくとも約1×107細胞、少なくとも約4×107細胞、少なくとも約5×107細胞、少なくとも約6×107細胞、少なくとも約6×107細胞、少なくとも約8×107細胞、少なくとも約9×107細胞、少なくとも約1×108細胞、少なくとも約2×108細胞、少なくとも約3×108細胞、少なくとも約4×108細胞、少なくとも約5×108細胞、少なくとも約6×108細胞、少なくとも約6×108細胞、少なくとも約8×108細胞、少なくとも約9×108細胞、少なくとも約1×109細胞、少なくとも約2×109細胞、少なくとも約3×109細胞、少なくとも約4×109細胞、少なくとも約5×109細胞、少なくとも約6×109細胞、少なくとも約6×109細胞、少なくとも約8×109細胞、少なくとも約9×109細胞、少なくとも約1×1010細胞、少なくとも約2×1010細胞、少なくとも約3×1010細胞、少なくとも約4×1010細胞、少なくとも約5×1010細胞、少なくとも約6×1010細胞、少なくとも約6×1010細胞、少なくとも約8×1010細胞、少なくとも約9×1010細胞、少なくとも約1×1011細胞、少なくとも約2×1011細胞、少なくとも約3×1011細胞、少なくとも約4×1011細胞、少なくとも約5×1011細胞、少なくとも約6×1011細胞、少なくとも約6×1011細胞、少なくとも約8×1011細胞、少なくとも約9×1011細胞、または少なくとも約1×1012細胞を含みうる。例えばキットには約5×1010細胞が含まれうる。別の一例では、キットは3×106細胞を含み、それらの細胞を約5×1010細胞まで拡大増殖させて、対象に投与することができる。
場合により、キットは同種異系細胞を含みうる。場合により、キットは、ゲノム修飾を含みうる細胞を含むことができる。場合により、キットは「既製の（off-the-shelf）」細胞を含みうる。場合により、キットは、臨床的使用のために拡大増殖させることができる細胞を含みうる。場合により、キットは、研究目的のための内容物を含有しうる。
場合により、説明書は、以下の少なくとも1つを含む:治療剤の説明、新形成、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植またはそれらの症状の処置または防止のための投薬スケジュールおよび投与、注意、警告、禁忌、過量情報、有害反応、動物薬理学、臨床研究、および/または参照文献。説明書は、容器（容器が存在する場合）の上に直接印刷されるか、容器に貼付されるラベルとして印刷されるか、容器に入れてまたは容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カード、またはフォルダーとして印刷されうる。場合により、説明書は、化学療法剤を投与した少なくとも約1、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約11、少なくとも約12、少なくとも約13、少なくとも約14、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約17、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、少なくとも約21、少なくとも約22、少なくとも約23、少なくとも約24、少なくとも約25、少なくとも約26、少なくとも約27、少なくとも約28、少なくとも約29、少なくとも約30日後、または最大2日、最大3日、最大4日、最大5日、最大6日、もしくは最大7日後に、ヌクレアーゼ修飾細胞を投与するための手順を提供する。場合により、説明書は、操作された細胞を、化学療法剤を投与した少なくとも24時間後に投与するための手順を提供する。ヌクレアーゼ修飾細胞は静脈内注射用に製剤化することができる。ヌクレアーゼ修飾細胞は注入用に製剤化することができる。場合により、キットは、小児投薬量の製品を含有することができる。
本明細書に記載する方法、組成物、またはキットのさらなる用途には、以下の1つまたは複数が含まれうる:ゲノム編集、転写調節またはエピジェネティック調節、ゲノムイメージング、コピー数解析、生細胞の解析、高度に反復するゲノム配列またはゲノム構造の検出、複雑なゲノム配列またはゲノム構造の検出、遺伝子重複または遺伝子再配列の検出、高感度FISHラベリング、標的核酸の巻き戻し、ゲノムの欠失、重複および再配列に関係する疾患および遺伝障害の大規模診断、ハイスループットイメージングおよび/またはハイスループット診断のための複数の特有のgRNAまたはgDNAによるRNAオリゴチップの使用、標的の多色分別検出、原因または起源が不明な疾患の同定または診断、および細胞（例えば生細胞）、組織または生物の4次元（例えばタイムラプス）または5次元（例えば多色タイムラプス）イメージング。
実施例1:ヌクレアーゼマイニング
パイプライン1
NCBI RefSeqデータベースを使用し、TBlastNを使って、さまざまなPIWI配列のWIPI位置を検索した。解析した配列はWIPI 1ヒット±10kbを有した。関連ヒットについてGeneMarSを使ってアミノ酸配列を予測した。関連ヒットを、タンパク質ファミリー、二次構造および隣接領域の機能エンリッチメントにグループ分けした。タンパク質ファミリーヒットはCDDデータベースに対して解析した。二次構造を解析した。機能エンリッチメント解析では、防御、ストレス応答、Casシステム、DNA修復、または毒素防御に関与するドメインについて、隣接領域を精査した（図2）。
パイプライン2
NCBI RefSeqデータベースを使用し、TBlastNを使って、さまざまなPIWI配列のWIPI位置を検索した。解析した配列はWIPI 1ヒット±10kbを有した。関連ヒットについてGeneMarSを使ってアミノ酸配列を予測した。関連ヒットは、ORF中のアミノ酸を使用し、RPS-BLASTを使って、CDDデータベースに対して解析した。候補アルゴノート配列が同定された。
結果
アルゴノートは、配列決定された真核生物ゲノムの約65％にコードされ、5つの真核生物スーパーグループのうちの少なくとも4つに分散していた。対照的に、代表的PIWIドメイン配列をクエリとして使用するRefSeqデータベース（2013年11月）のposition-specific iterative basic local alignment search tool（PSI-BLAST）検索により、Agoタンパク質は、利用可能な古細菌ゲノムおよび細菌ゲノムのうちのそれぞれ約32％および約9％に、そして37のうち17の原核生物門に、コードされていることが示される。大半の原核生物防御遺伝子42と同様に、pAgoはパッチ状の分布を示し、任意の細菌門または古細菌門において多くとも70％を占める。
（表１０）ヌクレアーゼ起源一覧
Figure 2020536502
（表１１）分類学的分布
Figure 2020536502
（表１２）分類学的分布
Figure 2020536502
実施例2:適切なヌクレアーゼの同定
適切なヌクレアーゼは、個々のゲノム配列からのRNase-Hタンパク質への、またはメタゲノミクスからの遺伝子アセンブリへの、二次構造アラインメントによって同定される。RNase-H1、RNase-HII、RVE/Transp、アルゴノート、Prp8、RuvC、RuvC、RuvX、RNaseT、およびDNAPoIIIをアラインメントしたところ、アラインメント結果から、これらのタンパク質は二次構造相同性を共有していることが明らかになった。構造アラインメントにより、ヌクレアーゼドメインの存在が確認される。
実施例3:RNase-H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド構築物
RNase-H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド（例えばアルゴノートタンパク質）は、PCR技法、分子クローニングまたは組換えDNA技法を用いて、核酸巻き戻しポリペプチド（例えばヘリカーゼドメイン）に、設計されたまたはスクリーニングされたペプチドリンカー配列を介して融合される。結果として生じる融合ポリペプチドを単離し、精製する。
実施例4:合成ヘリカーゼ-アルゴノート融合構築物
触媒不活性Cas9（例えばdCas9）は、単一ガイドRNA（sgRNA）によって標的配列に誘導される。ゲノム破壊を達成するために、dCas9は、単独で使用するか（この場合は立体障害によって転写を抑制する）、ヘリカーゼとして使用することができる。dCas9は、RHDCポリペプチドまたはその機能的部分に融合された場合に、2段階ゲノム編集システムを可能にする。このシステムでは、dCas9が、まず標的配列に方向付けられ、その標的配列内の標的部位において二重らせんを巻き戻し、第2段階ではRHDCが巻き戻された標的配列でのゲノム切断を遂行する。
実施例5:RNase-H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド構築物を使ったゲノム操作
T細胞のNeonトランスフェクション
Neonトランスフェクションシステム（10uLキット、Invitrogen、Life Technologies）を使って、無刺激T細胞または刺激T細胞をエレクトロポレートする。細胞を計数し、10uLのT緩衝液に2×105細胞の密度で再懸濁する。1ugのアルゴノート-ヘリカーゼ構築物またはmRNAと標的遺伝子（例えば免疫チェックポイント遺伝子）を標的とする1ugのgRNA）プラスミドまたはmRNAとを細胞混合物に加える。細胞を1400V、10ms、3パルスでエレクトロポレートする。トランスフェクション後に、細胞を、48ウェルプレート中の培養培地200uLにプレーティングする。
フローサイトメトリー
エレクトロポレートされたT細胞を、破壊された標的遺伝子の発現について、トランスフェクションの24〜48時間後にフローサイトメトリーで分析する。細胞を、0.5％FBSを含む冷1×PBSで洗浄することによって調製し、APC抗ヒトCD3ε（eBiosciences、サンディエゴ）およびFixable Viability Dye eFlour 780（eBiosciences、サンディエゴ）で染色する。表示の特異性を持つ以下のmAbおよび試薬を適切なアイソタイプコントロールと共に使用する。BD Biosciences製:APCコンジュゲート抗CD3（555335）、FITC-抗CD8（555366）、PE-抗CD8（555635）、PE-抗CD28（561793）、PE-抗CD107a（555801）およびPE-抗β-2ミクログロブリン（551337）、FITC-抗HLA-I（555552）、APC-抗CD137（550890）。Biolegend製:APC-抗PD1（114102）、APC-抗PDL1（329702）、FITC-抗CD45RO（304204）、APC-抗CD62L（304814）。Beckman Coulter製:PE-抗Vb13.1（IM2021U）。データは、CellQuestバージョン3.3（BD Biosciences）を使ってFACS Accuri（BD Biosciences）で取得し、FCS Expressバージョン3.00（De Novo Software）またはFlowJoバージョン7.6.1（Tree Star,Inc.）で解析する。
T7E1アッセイ法、TIDE、およびPCRフラグメントのシーケンシングを使ったアレル修飾頻度の測定
T細胞における標的遺伝子のゲノム破壊のレベルはT7E1ヌクレアーゼアッセイ法（NEB）によって決定される。標的破壊率はデンシトメトリーによって定量化される。PCR産物をTOPOクローニングベクター（Invitrogen）にライゲートしてから、大腸菌（E.coli）に形質転換する。単一クローンを拾い、インデルおよび挿入を算出するために配列決定する。サンガーシーケンシングによってPD1破壊を確認する。標的座位の増幅に使用されるPCRプライマーは以下のとおりである。
Figure 2020536502
TIDE（Tracking of Indels by Decomposition）を使ってアレル修飾頻度を解析するために、精製PCR産物を、両PCRプライマーを使ってサンガーシーケンシングに供し、各配列クロマトグラムをオンラインTIDEソフトウェアで解析する。解析はCas9モックトランスフェクト試料からの基準配列を使って行う。パラメータは、10ヌクレオチドのデフォルト最大インデルサイズに設定し、分解ウインドウは、高品質トレースで可能な限り最大のウインドウをカバーするように設定する。1.5％の検出感度未満のTIDE解析はすべて0％に設定する。
ELISAアッセイ法
標的細胞を洗浄し、R10培地に1×106細胞/mLで再懸濁する。次に、100μLの各標的細胞タイプを3つ一組にして96ウェル丸底プレート（Corning）に加える。エフェクターT細胞を洗浄し、R10培地に1×106細胞/mLで再懸濁した後、100μLのT細胞を表示のウェルにおいて標的細胞と組み合わせる。プレートを37℃で18〜24時間インキュベートする。インキュベーション後に、上清を回収し、ELISA（eBioscience）に供する。
IFNγ ELISpot
RNase-H様ドメイン含有（RHDC）融合構築物で編集されたT細胞を、照射された同種異系PBMCと共に、1ウェルあたり2×104細胞の濃度でELISpotプレート（R＆D Systems）にプレーティングする。別の実験は、同種異系PBMCと照射された編集済みT細胞との共培養によって行う。細胞を1:1の刺激細胞（stimulator）対応答細胞（responder）比で18時間インキュベートした。実験は製造者の説明書に従って行う。スポットは、スキャニングと分析にELISpotプレートリーダーを使って、自動的に定量化される。
実施例6:タンパク質レベルでのゲノム破壊の検出
遺伝子レベルで観察されたノックダウン頻度がタンパク質の喪失と相関するかどうかを判定するために、ノックアウト後の標的タンパク質の発現を評価する。末梢血（PB）T細胞およびTILを、エレクトロポレーションの14日後に、プレートに結合した抗CD3と可溶性抗CD28抗体とを使って再刺激し、クーマシーブルー染色ゲルによって標的遺伝子の喪失を評価した。
実施例7:RHDC遺伝子カッティングアッセイ法
遺伝子編集レポーターシステム:
RHDC遺伝子カッティングアッセイ法は高感度の機能獲得型哺乳動物遺伝子編集レポーターシステムである（図9）。一過性プラスミドDNA（図10）を、24ウェルプレートのウェルにおいて、HEK293T QMS細胞にトランスフェクトした。すべてのプラスミドを、大腸菌stellar細胞から、エンドトキシンフリーDNA調製キットを使って調製した。要約すると、5×104細胞を、6ウェルプレートの1ウェルあたり0.5mlの完全DMEM成長培地にプレーティングした。細胞培養を、トランスフェクション前に、およそ24〜36時間にわたって37℃でインキュベートした。トランスフェクション前に細胞は約60〜70％コンフルエントであった。
A:トランスフェクションの直前にTransIT-LT1試薬:DNA複合体を作製した（表１３）
（表１３）TransIT-LT1試薬:DNA複合体レシピ
Figure 2020536502
試薬:DNA複合体は、TransIT-LT1試薬を室温に温め、使用前に穏やかにボルテックスすることによって生成した。50μLのOpti-MEM I血清低減培地を滅菌1.5mlチューブに入れた。1μgのプラスミドDNAを加えた後、ピペッティングすることで十分に混合した。1.5μLのTransIT-LT1試薬をDNA混合物に加え、静かにピペッティングした。最後に30分間のインキュベーションを行った。
B:複合体を完全成長培地中の細胞に分配した
TransIT-LT1試薬:DNA複合体をウェルの異なるエリアに滴下した。プレートを静かに前後左右に揺動することで、TransIT-LT1試薬:DNA複合体を均等に分配した。その混合物を37℃でインキュベートした。必要に応じて細胞を継代した。
C:トランスフェクト細胞のフローサイトメトリー分析
0.25％トリプシンを用いてトランスフェクト細胞をトリプシン処理した。細胞を500gで5分間遠沈し、5％FBSおよび0.5m EDTAを含むDPBSに再懸濁し、5ml FACSチューブのトップフィルターに通した。Beckman CytoFlexフローサイトメーターを使って、3日目、6日目および10日目に、細胞を分析した。
HEK293TにおけるRHDC遺伝子編集
一過性プラスミドDNA（図10）を、24ウェルプレートのウェルにおいて、HEK293T QMS細胞にトランスフェクトした。すべてのプラスミドを、大腸菌stellar細胞から、エンドトキシンフリーDNA調製キットを使って調製した。要約すると、5×104細胞を、6ウェルプレートの1ウェルあたり0.5mlの完全DMEM成長培地にプレーティングした。細胞培養を、トランスフェクション前に、およそ24〜36時間にわたって37℃でインキュベートした。トランスフェクション前に細胞は約60〜70％コンフルエントであった。
A:トランスフェクションの直前に遺伝子カッティング混合物を生成した
（表１４）HEK293Tアッセイ法におけるアルゴノート遺伝子編集のためのレシピ
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B:複合体を完全成長培地中の細胞に分配した
混合物をウェルの異なるエリアに滴下した。プレートを静かに前後左右に揺動することで、混合物を均等に分配した。混合物を37℃でインキュベートした。必要に応じて細胞を継代した。
C:トランスフェクト細胞のフローサイトメトリー分析
0.25％トリプシンを用いてトランスフェクト細胞をトリプシン処理した。細胞を500gで5分間遠沈し、5％FBSおよび0.5m EDTAを含むDPBSに再懸濁し、5ml FACSチューブのトップフィルターに通した。Beckman CytoFlexフローサイトメーターを使って、3日目、6日目および10日目に、細胞を分析した。
（表１５）遺伝子カッティングアッセイ法の比較
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実施例8:遺伝子編集集合分子のゲノム熱力学的算出
遺伝子編集集合分子（AGEM）のゲノム編集システムのエネルギーの測定は、ATP、ADPの量および修飾されたDNAのパーセンテージを考慮することによって算出することができる。
AGEMはRNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドと任意選択の調節ドメインポリペプチド（RDP）とを含むモジュラーシステムである（図34）。一定量のATPを反応に提供することにより、生化学的システムにおいて、遺伝子熱力学的反応のエネルギーコストを測定することができる。反応の最後に、適正に修飾されたDNAの量ならびに反応中に残っているATPおよびADPの量の定量化を、（［ATP］-［ADP］）/［修飾されたDNA］を算出することによって分析することができる（図33）。この式は、編集反応につきどのくらいの多くのエネルギーが消費されるかを見積ることができる。編集システムのモジュールは交換することができるので、編集イベントあたりの正確なエネルギーコストは相違すると考えられる。例えばRHDCは、核酸巻き戻し因子またはRDPの機能に影響を及ぼすことなく、任意のヌクレアーゼドメイン（CRISPRシステム、アルゴノートシステム、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALEN、または任意の制限酵素システムからのもの）に交換することができる。
ゲノム編集分子のゲノム熱力学的反応の測定値は、誘導ポリ核酸（gDNAまたはgRNA）に対する完全マッチ配列を含有する100bp長のdsDNAを反応に投入することによって決定することができる。1uMの遺伝子編集分子を加え、比が遺伝子エディター:標的DNA＝1:1になるように、1uMのガイドDNAまたはガイドRNAを加える。10:1（10uM）のATPを反応に補足する。反応は1時間行われる。反応の最後に、停止バッファーを反応に加える（例えばMOPS）。比色アッセイ法（OD＝570nm）または蛍光アッセイ法（Ex/Em＝535/587nm）によって容易に定量化することができる生成物を生じるグリセロールのリン酸化に基づく標準的ATPアッセイ法によって、ATPの残存量を測定する。修飾された標的DNAの量は、非完全マッチDNA（編集されたDNA）を認識し切断するT7エンドヌクレアーゼIアッセイ法と、それに続くポリアクリルアミドゲル電気泳動によって定量化される。遺伝子編集分子によって消費された総エネルギーは（［ATP］-［ATP］残り）/［編集されたDNA］によって算出される。
実施例9:アルゴノートと共局在するヘリカーゼおよびそれらの最適化された核酸配列
表16に記載する配列は、公知の制限酵素認識部位、潜在的遺伝子発現調節部位、転写または翻訳を封じ込めると予測される配列、10bpを上回る反復配列がいずれも除去されるように最適化されている。この最適化はタンパク質ペプチド配列を変化させず、純粋に、同じアミノ酸をコードするためにヌクレオチドの異なるトリプレットを使用するコドン使用の縮重に基づいている。
（表１６）最適化されたAgoヘリカーゼのヌクレオチド配列
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（表１７）サル空砲形成ウイルス40由来の2×核局在化配列（NLS）を含有するアルゴノートヌクレオチド配列
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場合により、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、1つまたは複数のドメインを含みうる。ポリペプチド構築物のドメインは、任意の順序で配置することができる。場合により、ポリペプチド構築物のドメイン構成は、（ArgoN）;（ArgoL1）;PAZ;ArgoL2;ArgoMid;Piwiの構成をとる。場合により、ポリペプチド構築物のドメイン構成は、SIR2;（ArgoN）;（ArgoL1）;ArgoL2;ArgoMid;Piwiの構成をとる。場合により、ポリペプチド構築物のドメイン構成は、（ArgoN）;（ArgoL1）;（ArgoL2）;ArgoMid;Piwiの構成をとる。場合により、ポリペプチド構築物はDEDXドメインを含有する。場合により、ポリペプチド構築物はDEDXドメインを欠く。場合により、ポリペプチド構築物は天然ヘリカーゼに隣接する。場合により、ポリペプチド構築物は、SEQ ID NO:190の配列、その修飾型、その一部分、またはその機能的フラグメントを含む。場合により、ポリペプチド構築物は、表18に示すもの（SEQ ID NO:161〜SEQ ID NO:252）のように、遺伝子的に類似する、系統的に類似する、または機能的に類似するアルゴノート配列またはヘリカーゼ配列を含む。場合により、ポリペプチド構築物は、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:215、またはSEQ ID NO:249と約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％から100％まで同一である配列を含む。
（表１８）アルゴノートおよびヘリカーゼのDNA配列
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（表１９）2つの核局在化配列と1つのクローニング配列とを含有するアルゴノート核酸配列
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実施例10:RHDCの発現と精製
Argo＃をコードするコドン最適化合成遺伝子をpETM-30発現ベクターにクローニングした。サブクローニングされたArgoプラスミドを、大腸菌（Escherichia coli）BL21（DE3）（New England Biolabs）に、製造者の説明書に従って形質転換した。株を、50μg/mlカナマイシン（Carl Roth）を含有するLB培地（Carl Roth）中、細菌振とうインキュベーターにおいて、37℃および150rpmで培養した。終夜インキュベーション後に、その前培養を使って、0.05の出発OD600nmで発現培養（150ml）に接種した。培養を、37℃および150rpmで、0.6〜0.8のOD600nmに到達するまでインキュベートした。AGOタンパク質発現を1mMのイソプロピル-b-D-チオガラクトシド（IPTG）（Sigma Aldrich）を加えることによって誘導した。細菌振とう機中、30℃および150rpmで、発現を6時間続けた。5000×g、4℃で10分間の遠心分離によって細胞を回収した。ペレットを凍結し、-80℃で保存した。凍結細胞を4℃で解凍し、1mMフェニルメタンスルホニル（Carl Roth）および5mMβ-メルカプトエタノール（Sigma Aldrich）を補足した25mLの緩衝液I（50mM Tris/HCl pH7.5、0.5M塩化ナトリウム、5％グリセロール）に再懸濁した。再懸濁した細胞を、Branson Digital Sonifier（Model 102C、3mmチップ）による超音波処理で破壊した。超音波処理:工程1:振幅25％、5秒オン、2秒オフを2分間、2回繰り返し、各サイクル後に3分間の休止；工程2:振幅35％、5秒オン、2秒オフを30秒間。超音波処理中は、溶解したペレットを氷上に保った。溶解物を15000×g、4℃で15分間遠心分離した後、上清をHis-Tagアフィニティークロマトグラフィー精製に使用した。Ni-NTAアガロース（Qiagen）を、5mMβ-メルカプトエタノールを補足した10CV（カラム体積）の緩衝液I中で平衡化し、遠心分離（50×gで5分間）後に、緩衝液Iを使って1:1の比で希釈した。清澄化した溶解物を、ロータリーホイール上で、350μlの希釈Ni-NTAアガロース懸濁液と共にインキュベートした（4℃で30分）。遠心分離（50×gで5分間）後に、Ni-NTAアガロースビーズを、空のBio-Spinクロマトグラフィーカラム（Biorad）に移した。5mMβ-メルカプトエタノールを補足した60CV（カラム体積）の緩衝液Iでカラムを洗浄した。5mMβ-メルカプトエタノールを補足した緩衝液Iを使用し、イミダゾール濃度を次第に増やして（溶出フラクション（EF）1:25mM-11CV、EF2:50mM-11CV、EF3:75mM-11CV、EF4:125mM-2.5CV、EF5:250mM-2.5CV、EF6:250mM-2.5 CV、EF 7:250mM-2.5CV）、Hisタグ付きAGOタンパク質を徐々に溶出させた。
Argoタンパク質および空対照（タンパク質調製物の不純物に関する発現ベクターのみの対照）を精製し、SDS-ポリアクリルアミドゲルで泳動し、クーマシーブルーで1時間染色した後、水/酢酸/メタノールを含有する溶液で脱染色した。Image Jを使ってタンパク質を定量化した（図15A、図15B、図15C、図15D、および図15E）。
Argo＃41に対して最初に用いた超音波処理プロトコールが機能的であったかどうかを判定するために、他のArgo配列Argo＃17およびArgo＃30をArgo＃41と共に試験することで、超音波処理条件が他のArgoにも当てはまるかどうかを確かめた。本明細書において使用される場合、Argo配列は、可換的に、AGO＃またはArgo＃ということもできる。Argo＃の配列は例えば表18に見出すことができる。対照切断アッセイ法は2.5uLの各調製物で行った。AGO＃17およびAGO＃41はssDNA切断を示したので、使用したタンパク質調製物の、BSA標準を使ったImage Jによる濃度は、Argo＃41:0,58μg/反応、Argo＃17:0,15μg/反応、およびArgo＃30:0,53μg/反応と評価された。これに基づき0,3μgタンパク質/反応を用いた（図16）。
（表２０）Argoタンパク質定量化
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（表２１）溶解条件
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実施例11:アルゴノート活性アッセイ法
活性アッセイ法のために、Argoタンパク質を含有する溶出フラクション（EF5）を、5mMβ-メルカプトエタノールおよび250mMイミダゾールを含有する緩衝液Iで、30μg/mLの最終タンパク質濃度まで希釈した。合計10μlのタンパク質試料を、18.5μlの反応緩衝液中の0,25μM sgDNAまたはsgRNAと混合した（Agoプレローディング工程:0,3μgタンパク質、0,25μM sgDNA/sgRNA、20mM Tris/HCl、5mM MnCl2、250mM NaCl、83,3mMイミダゾール、1.6mMβ-メルカプトエタノール、1.6％グリセロール）。反応を37℃で15分間インキュベートした。プレインキュベーション後に、ssDNA（0,25μM）またはdsDNA（100ng）テンプレート（1μl）を加え、37℃で1時間インキュベートした。
AGOタンパク質調製物:DNase Iまたは超音波処理溶解（溶解条件6）
溶出フラクション4（EF4）:125mMイミダゾール
溶出フラクション5（EF5）:250mMイミダゾール
sgDNA（表２５）:
D1...ターゲティングsgDNA
D2...ターゲティングsgDNA
NT...非ターゲティングsgDNA
テンプレート:90nt ssDNA（表２４）
D1について予想される切断産物:66bp、24bp
D2について予想される切断産物:69bp、21bp
最終緩衝液濃度
MnCl2:5mM
Tris/HCl、pH8:15mM
NaCl:表示のとおり
イミダゾール:32,25mM（EF4）、62,5mM（EF5）
インキュベーション時間:
プレインキュベーション（AGO＋sgDNA）:37℃で15分
インキュベーション:37℃で1時間
ssDNA切断アッセイ反応を失活させるために、試料を、95℃で10分間、TBE尿素試料緩衝液（Biorad）と共に1:1の比でインキュベートした。ssDNA切断産物を15％TBE尿素ゲル（Invitrogen）上で分離した。ゲルをSYBR gold核酸ゲル染色剤（Invitrogen）と共に15分間インキュベートし、UVsolo TSイメージングシステム（Biometra、Analytik Jena）を使って視覚化した。プロテイナーゼK溶液（20μg/反応）（Qiagen）を使って、dsDNA切断アッセイ反応を、室温で20分間、失活させた。試料を、臭化エチジウムを含有する1％アガロースゲルで分離する前に、6×ローディング色素（New England Biolabs）と混合した。マーカーとして、1kb Generulerマーカー（アガロースゲル）または自家製ssDNAマーカー（尿素ゲル）を使用した（図14A、図14B、および図14C）。
熱に起因する核酸巻き戻しによるssDNA切断が高温で起こるかどうかを判定するために、切断アッセイ法の実行前に、Argo調製物を95℃に30分間加熱した（図14D）。未消化のプラスミドを対照として使用することで、タンパク質の安定性が高いTによる影響を受けるかどうかを確認した（図18）。これらのssDNA切断アッセイ法に基づいて、dsDNA切断アッセイ法を現在評価し、最適化しているところである。
トランケート型ガイドポリ核酸を用いてアルゴノートカッティング効率を判定するために、5mMβ-メルカプトエタノールおよび250mMイミダゾールを含有する緩衝液Iで、Argoタンパク質を含有する溶出フラクション（EF5）を、30μg/mLの最終タンパク質濃度まで希釈した。合計10μlのタンパク質試料を、30μlの反応緩衝液中の0,08μM sgDNAまたはsgRNAと混合した（タンパク質、トランケート型sgDNA/sgRNA（表２２）、Tris/HCl、MnCl2、NaCl、イミダゾール、β-メルカプトエタノールおよびグリセロール）。反応を37℃で15分間インキュベートした。プレインキュベーション後に、ssDNA（0,8μM）テンプレート（1μl）を加え、37℃で1時間インキュベートした（図26Aおよび図26B）。
（表２２）トランケート型sgDNA
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（表２３）dsDNA切断アッセイ法
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（表２４）ssDNA切断アッセイ法
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（表２５）sgDNA/sgRNA
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実施例12:哺乳動物細胞DNAカッティングアッセイ法
生細胞におけるタンパク質局在の視覚化におけるタンパク質タグ付きツールとして、スプリット蛍光タンパク質（FP）システムを使用した。このアッセイ法では、さまざまなタンパク質/構築物のDNAカッティング活性を評価するために、スプリット蛍光タンパク質システムを使用する。アッセイ法の概要を図18に示す。簡単に述べると、非相同末端結合によって修復されうるフレームシフトを蛍光タンパク質内に持つ細胞株を構築した。この場合、修復された細胞は蛍光を呈する。自己補完的スプリットGFP1〜10/11システムでは、2つのフラグメント（G1〜10およびG11）が独力で会合することで、機能的GFPシグナルを形成しうる。Fengらの研究（2017）により、G1〜10とG11の間に96bpリンカーを挿入しても、GFPシグナルの蛍光にはごくわずかな影響しかないことが示された。そこで本発明者らは、GFPシグナルが消えるように、リンカーの2bpを欠失させることで、リンカーとGFP11フラグメントとをフレームシフトさせた。DNAカッティングには94bpリンカー内でさまざまな標的部位を選択しうる。リンカーがカッティングまたはニッキングされると、非相同末端結合修復による挿入もしくは欠失または相同組換え修復による挿入もしくは欠失によって、リンカーとGFP11とはインフレームになることができ、GFPシグナルを検出することができる。使用したGFP1〜10/11システムの配列は、以前に報告されたsfGFPから遺伝子工学で改変された（Cabantous,S.,Terwilliger,T.C.,Waldo,G.S.（2005）Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragment of green fluorescent protein.Nat Biotechnol.23,102-7）。
この構築物を使って、安定な哺乳動物細胞株6808を作製した。SFFVプロモーターを使ってレポータータンパク質発現を制御し、94＿リンカーが挿入されているGFP1〜10/11システムの発現を表すために、mCherryを発現マーカーとして使用した。レンチウイルスの生成のために、HEK293T細胞に、pHR構築物、pCMV-dR8.91およびpMD2.Gを、それぞれ9:8:1の比で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後にウイルス上清を収集し、0.45μmフィルターに通し、Lenti-X Concentrator（Clontech）を使って、4℃で終夜インキュベートすることにより、10倍濃縮した。
HEK293T細胞を上述の構成を発現するレンチウイルスで形質導入することにより、6808レポーター細胞株を生成した。この構成の例を図19〜21および図35にも示す。単一細胞を、蛍光活性化細胞選別法（FACS）により、BD FACS Aria2を使って、mCherryマーカー発現について選別することで、形質転換細胞を同定した。
94＿リンカーを標的とするCas9システムを使って、6808レポーター細胞株を検証した。6808細胞を1ウェルあたり12ウェルプレート中1ウェルあたり1×105個の密度で播種した。カッティングおよびニッキング実験の一過性トランスフェクションのために、播種の1日後に、合計1.5μgのプラスミド（sgRNAおよびCas9またはCas9nは同じプラスミド上にある）を、TransITLT1トランスフェクション試薬（Mirus）をプラスミド1.5μgに対してトランスフェクション試薬6μLの比で使って、細胞にトランスフェクトした。GFP発現を分析するためにトランスフェクションの72時間後にトランスフェクト細胞を収集した。GFP発現を分析するために、0.05％トリプシンEDTA（Life Technologies）を使って細胞を解離し、BD LSRIIでのフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーデータはFlowJoを使って解析した。各試料につき10,000個の生存細胞を解析した。選択された配列を表26に記載する。
非形質転換HEK293T細胞（図22A）と、さらにプラスミドなし、Cas9のみ、Cas9および非ターゲティングガイドRNA、Cas9と非ターゲティングガイドRNAおよび二本鎖切断をまたぐ一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナー（ssODN＿3またはssODN＿4）、または非ターゲティングガイドRNAおよび一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナー（ssODN＿3およびssODN＿4）を伴うもしくは伴わないCas9ニッカーゼ（nCas9）にばく露した6808細胞（図22B〜K）とを使って、一連の対照実験を行った。処理された細胞を、蛍光活性化細胞選別法により、105のGFP蛍光カットオフで分析した。図22A〜Kに見られるように、対照実験では蛍光細胞の率が極めて低く、すべての例で0.1％を大きく下回っていた。図23は、Cas9および94＿リンカーを標的とするガイドRNA（図19のsgRNA6819）を使った実験の結果を示しており、この処理の結果として、17.2％の細胞が蛍光を獲得した。図24は、Cas9ニッカーゼおよび94＿リンカーを標的とするガイドRNA（図20に示すsgRNA6821）を使った実験の結果を示しており、この例では、8.23％の細胞が蛍光を獲得した。蛍光細胞の数は、6806細胞をCas9ニッカーゼ、94＿リンカーを標的とするガイドRNAおよびssODN＿3ドナーまたはssODN＿4ドナーで処理することによって、さらに増加させることができる。これらの処理の結果、それぞれ46.3％（図25A）および54.2％（図25B）の細胞が蛍光性になった。
異なる処理条件において起きるDNA修復の形式を分析するために、GFP陽性細胞からDNAを収集し、配列決定した。複数コピーのレポーターフラグメントが細胞に組み込まれているので、GFP陽性細胞のNHEJパーセンテージおよびHDRパーセンテージをMiSeqによって解析した。
GFP発現を分析するためにトランスフェクションの72時間後にトランスフェクト細胞を収集した。BD FACS Aria2を使って蛍光活性化細胞選別法（FACS）でGFP陽性集団細胞をバルク選別した。各試料のGFP陽性細胞100万個を収集することで全DNAを調製した（DNeasy Blood＆Tissueキット、QIAGEN）。アンプリコンは300bpに固定され、sgRNAが標的とする部位は配列決定によって効率よくカバーされうる領域にあった。PCR増幅は、KAPA HiFi PCRキット（KAPABIOSYSTEMS）で、マニュアルに従って行った。PCR条件、95℃5分、98℃,20秒、64℃,20秒、72℃20秒、23サイクル、72℃,5分。PCR産物を正しいアンプリコンについてゲル電気泳動でチェックした。次に各試料につき10PCRをプールし、75bpペアエンドMiseqシーケンシングランを行った。
図27Aは、無処理の6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を示しており、わずか0.5％のリードが非相同末端結合修復と合致する修飾を示し、一方、99.5％のリードは非修飾DNAを示した。図27Bは、nCas9、非ターゲティングガイドRNAおよびssODN＿4で処理された6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を示しており、わずか0.3％のリードが非相同末端結合修復と合致する修飾を示し、一方、99.7％のリードは非修飾DNAを示した。図28は、nCas9およびsgRNA6821で処理された6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を示している。興味深いことに、2.1％のリードは非相同末端結合修復と合致する修飾を示し、一方、97.9％のリードは非修飾DNAを示した。図29は、nCas9、sgRNA6821およびssODN＿4ドナーで処理された6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を示しており、35.8％のリードは相同組換え修復と合致する修飾を示し、0.6％のリードは非相同末端結合修復と合致する修飾を示し、0.7％のリードは混合相同組換え修復および非相同末端結合修復と合致する修飾を示し、62.8％のリードは非修飾DNAを示した。図30は、Cas9およびsgRNA6825で処理された6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を示しており、95.7％のリードは非相同末端結合修復と合致する修飾を示し、4.3％のリードは非修飾DNAを示した。図31は、Cas9、sgRNA6825、およびssODN＿4ドナーで処理された6808細胞について行われたシーケンシング反応の結果を示しており、10.9％のリードは相同組換え修復と合致する修飾を示し、82％のリードは非相同末端結合修復と合致する修飾を示し、0.9％のリードは混合相同組換え修復および非相同末端結合修復と合致する修飾を示し、わずか10.9％のリードが非修飾DNAを示した。
6808細胞アッセイ法を使って、本明細書に記載のさまざまなAgoのDNA編集活性を評価した。レポーター細胞株293T 6808を、5％FBSを含む1mlのDMEM培地と共に、12ウェルプレートに1ウェルあたり100Kで播種した。表27のレシピリストを使用したトランスフェクションの前に、細胞を24時間成長させた。トランスフェクションの72時間後に、上述のように、細胞をプレートからトリプシン処理し、70uMセルストレーナーで濾過し、FACSで分析した。図32Aおよび図32Bにアッセイ法の結果を示す。図32Aおよび図32Bに示すように、一部のAgoタンパク質は、陰性対照と比較して有意に高い、GFP陽性細胞のパーセンテージをもたらした。
（表２６）6808細胞アッセイ法で使用した配列
Figure 2020536502
（表２７）Agoタンパク質による6808細胞アッセイ法のためのレシピ
Figure 2020536502
（表２８）ssDNA切断アッセイ法において用いた発現ベクター
Figure 2020536502
Figure 2020536502

Claims (143)

  1. 原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とを含む、ポリペプチド構築物であって、
    該RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、かつ該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されている、該ポリペプチド構築物。
  2. 前記RHDCポリペプチド配列または前記核酸巻き戻しポリペプチド配列のうちの少なくとも一方が中温生物に由来する、請求項1に記載のポリペプチド構築物。
  3. 前記RHDCポリペプチド配列が、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、請求項1に記載のポリペプチド構築物。
  4. 前記RHDCポリペプチド配列が、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、または約30℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、請求項1に記載のポリペプチド構築物。
  5. 前記RHDCポリペプチド配列が、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、請求項1に記載のポリペプチド構築物。
  6. 前記中温生物が原核生物である、請求項2〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  7. 前記原核生物が、バクテロイデス門（bacteroidetes）、プロテオバクテリア門（proteobacteria）、アシドバクテリア門（acidobacteria）、アクチノバクテリア門（actinobacteria）、ファーミキューテス門（firmicutes）、シアノバクテリア門（cyanobacteria）、スピロヘータ門（spirochaetes）、デイノコックス門（deinococcus）、ベルコミクロビア門（verrucomicrobia）、プランクトミセス門（planctomycetes）、バルネオラ門（balneolaeota）、およびクロロフレクサス門（chloroflexi）からなる群より選択される科に由来する、請求項6に記載のポリペプチド構築物。
  8. 前記RHDCポリペプチド配列が、P-element induced WImpy testis（PIWI）遺伝子、RuvC、Cas、Sir2、Mrr、TIR、PLD、REase、制限エンドヌクレアーゼ、DExD/H、スーパーファミリーIIヘリカーゼ、RRXRR、DUF460、DUF3010、DUF429、DUF1092、COG5558、OrfB＿IS605、ペプチダーゼ＿A17、リボヌクレアーゼH様ドメイン、3'-5'エキソヌクレアーゼドメイン、3'-5'エキソリボヌクレアーゼRv2179c様ドメイン、バクテリオファージμ、トランスポザーゼ、DNA指向性DNAポリメラーゼ、ファミリーB、エキソヌクレアーゼドメイン、エキソヌクレアーゼ、RNase T/DNAポリメラーゼIII、yqgF遺伝子、HEPN、RNase LSドメイン、LsoA触媒ドメイン、KENドメイン、RNaseL、Ire1、RNaseドメイン、RloC、またはPrrCのうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされるポリペプチドに由来する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  9. 前記RHDCポリペプチド配列が、防御、ストレス応答、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）、アルゴノート、またはDNA修復に関与する遺伝子のうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされるポリペプチドに由来する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  10. 前記RHDCポリペプチド配列がアルゴノートドメイン配列である、請求項9に記載のポリペプチド構築物。
  11. 前記RHDCポリペプチド配列が、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  12. 前記RHDCポリペプチド配列と前記核酸巻き戻しポリペプチド配列とに融合された追加の機能的ポリペプチド配列をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  13. 前記核酸巻き戻しポリペプチドが原核生物起源または古細菌起源である、請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  14. 前記核酸巻き戻しポリペプチドが、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、Cas、またはそれらの組合せを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  15. 前記Casが触媒不活性（catalytically dead）Casまたは部分不活性（partially dead）Cas（ニッカーゼ）である、請求項14に記載のポリペプチド構築物。
  16. 前記触媒不活性Casが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、およびCasRXの触媒不活性誘導体からなる群より選択される、請求項15に記載のポリペプチド構築物。
  17. ATPase配列をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  18. 前記RHDCポリペプチド配列と前記核酸巻き戻しポリペプチド配列とがリンカー配列によって融合されている、請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  19. 前記リンカーがポリペプチドリンカーであり、該ポリペプチドリンカーが、1つのGSGSGS配列もしくは複数コピーのGSGSGS、非荷電アミノ酸、αヘリックスドメイン、または、リガンド誘導性コンフォメーション変化を伴うペプチドを含む、請求項18に記載のポリペプチド構築物。
  20. 前記リンカーがポリペプチドリンカーである、請求項19に記載のポリペプチド構築物。
  21. 前記核酸巻き戻しポリペプチド配列と前記RHDCポリペプチド配列が同じフレームで発現される、請求項1〜20のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  22. 前記ガイドDNAに結合する、請求項1〜21のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  23. 前記ガイドDNAが約1塩基対長〜約30塩基対長である、請求項1〜22のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  24. 前記ガイドDNAが前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的である、請求項1〜23のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  25. 前記標的ポリヌクレオチド配列が遺伝子配列を含む、請求項24に記載のポリペプチド構築物。
  26. 細胞に導入された場合に前記遺伝子配列中の破壊をもたらす、請求項1〜25のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  27. 前記破壊が二本鎖切断または一本鎖切断を含む、請求項26に記載のポリペプチド構築物。
  28. 前記RHDCポリペプチド配列が、ファーミキューテス（firmicutes）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、請求項1〜27のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  29. 前記RHDCポリペプチド配列が、クロストリジウム（Clostridium）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、請求項1〜27のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  30. 前記クロストリジウム・アルゴノートドメインが、クロストリジウム・ディスポリカム（Clostridium disporicum）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項29に記載のポリペプチド構築物。
  31. 前記RHDCポリペプチド配列が、サーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、請求項1〜27のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  32. 前記サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインが、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項31に記載のポリペプチド構築物。
  33. 前記RHDCポリペプチド配列が、メチロバクター（Methylobacter）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、請求項1〜27のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  34. 前記メチロバクター・アルゴノートドメインが、メチロバクター・ウィッテンバリー（Methylobacter whittenburyi）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項33に記載のポリペプチド構築物。
  35. 前記RHDCポリペプチド配列が、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、請求項1〜27のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  36. 前記サーモシネココッカス・アルゴノートドメインが、サーモシネココッカス・エロンゲーツ（Thermosynechococcus elongates）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項35に記載のポリペプチド構築物。
  37. アルゴノートポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列との合成融合体を含み、該アルゴノートポリペプチド配列が中温で標的核酸を切断する、ポリペプチド構築物。
  38. 前記アルゴノートポリペプチド配列または前記核酸巻き戻しポリペプチド配列のうちの少なくとも一方が中温生物に由来する、請求項37に記載のポリペプチド構築物。
  39. 前記アルゴノートポリペプチド配列が約19℃〜40℃で前記標的核酸を切断する、請求項37または請求項38に記載のポリペプチド構築物。
  40. 前記アルゴノートポリペプチド配列が、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で前記標的核酸を切断する、請求項39に記載のポリペプチド構築物。
  41. 前記アルゴノートポリペプチド配列が37℃で前記標的核酸を切断する、請求項40に記載のポリペプチド構築物。
  42. 前記アルゴノートポリペプチド配列が古細菌アルゴノートポリペプチド配列である、請求項37〜41のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  43. 前記アルゴノートポリペプチド配列が、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む、請求項37〜41のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  44. 前記アルゴノートポリペプチド配列と前記核酸巻き戻しポリペプチド配列とがリンカー配列によって融合されている、請求項37〜43のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  45. 請求項1〜44のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物を含む、エクスビボ細胞。
  46. 請求項1〜44のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードする、核酸。
  47. 請求項1〜44のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物を含む、組成物。
  48. 細胞を請求項1〜44のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物と接触させる工程を含む、ゲノム編集の方法。
  49. （a）請求項1〜44のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物と、
    （b）その使用説明書と
    を含む、キット。
  50. 容器をさらに含む、請求項49に記載のキット。
  51. RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とを含む、ポリペプチド構築物であって、
    該RHDCポリペプチド配列が、中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断して、切断された核酸を生成し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されており、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が該切断された核酸に核酸配列を挿入する、該ポリペプチド構築物。
  52. RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と調節ドメインポリペプチド（RDP）配列とを含む、ポリペプチド構築物。
  53. 核酸巻き戻しドメイン配列をさらに含む、請求項51または52に記載のポリペプチド構築物。
  54. 前記核酸巻き戻しドメイン配列が、触媒不活性Cas、ヘリカーゼ、またはトポイソメラーゼを含む、請求項53に記載のポリペプチド構築物。
  55. 前記RDP配列が、Rad51ポリペプチド、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、または、生殖細胞修復に関与するドメインである、請求項52〜54のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  56. 前記RHDCポリペプチド配列が、ファーミキューテス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、請求項51〜55のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  57. 前記RHDCポリペプチド配列が、クロストリジウム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、請求項51〜54のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  58. 前記クロストリジウム・アルゴノートドメインが、クロストリジウム・ディスポリカム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項57に記載のポリペプチド構築物。
  59. 前記RHDCポリペプチド配列が、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、請求項51〜54のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  60. 前記サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインが、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項59に記載のポリペプチド構築物。
  61. 前記RHDCポリペプチドが、メチロバクター・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、請求項51〜54のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  62. 前記メチロバクター・アルゴノートドメインが、メチロバクター・ウィッテンバリー・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項61に記載のポリペプチド構築物。
  63. 前記RHDCポリペプチドが、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、請求項51〜54のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  64. 前記サーモシネココッカス・アルゴノートドメインが、サーモシネココッカス・エロンゲーツ・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項63に記載のポリペプチド構築物。
  65. アルゴノートポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とを含む、ポリペプチド構築物であって、
    該アルゴノートポリペプチド配列が中温で核酸を切断し、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された該核酸に核酸配列を挿入する、該ポリペプチド構築物。
  66. 前記アルゴノートポリペプチド配列または前記核酸巻き戻しポリペプチド配列のうちの少なくとも一方が中温生物に由来する、請求項65に記載のポリペプチド構築物。
  67. 前記アルゴノートポリペプチド配列が19℃〜40℃で核酸を切断する、請求項65または66に記載のポリペプチド構築物。
  68. 前記アルゴノートポリペプチド配列が、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で核酸を切断する、請求項67に記載のポリペプチド構築物。
  69. 前記アルゴノートポリペプチド配列が37℃で核酸を切断する、請求項68に記載のポリペプチド構築物。
  70. 前記アルゴノートポリペプチド配列が古細菌アルゴノートポリペプチド配列である、請求項65〜69のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  71. 前記アルゴノートポリペプチド配列が、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む、請求項65〜70のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  72. 前記アルゴノートポリペプチド配列と前記核酸巻き戻しポリペプチド配列とがリンカーによって接続されている、請求項65〜71のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
  73. 請求項51〜72のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物を含む、エクスビボ細胞。
  74. 請求項51〜72のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードする、核酸。
  75. 請求項51〜72のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物を含む、組成物。
  76. 細胞を請求項51〜72のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物と接触させる工程を含む、ゲノム編集の方法。
  77. 細胞を、
    i.RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列、
    ii.核酸巻き戻し因子配列、
    iii.ガイド核酸、および
    iv.調節ドメインポリペプチド（RDP）配列
    を含む核酸編集システムと接触させる工程を含み、該接触させる工程が該細胞における核酸の編集をもたらす、方法。
  78. 前記RHDC配列、前記核酸巻き戻し因子配列、および前記RDP配列がタンパク質複合体中に存在する、請求項77に記載の方法。
  79. 前記タンパク質複合体が、前記ガイド核酸と会合して誘導型編集複合体を形成する、請求項78に記載の方法。
  80. 前記ガイド核酸がガイドDNAである、請求項77〜79のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記ガイド核酸がガイドRNAである、請求項77〜79のいずれか一項に記載の方法。
  82. RHDCドメインがアルゴノートに由来する、請求項77〜81のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記核酸巻き戻し因子配列が、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、Cas、またはそれらの組合せを含む、請求項77〜82のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記Casが触媒不活性Casまたは部分的触媒不活性Casである、請求項83に記載の方法。
  85. 前記RDP配列が、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、生殖細胞修復ドメイン、DNA修復タンパク質、またはそれらの組合せを含む、請求項77〜84のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記RDP配列が前記核酸編集の全部または一部を制御する、請求項77〜85のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記ガイド核酸が前記細胞中の核酸に相補的である、請求項77〜86のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記細胞中の核酸が疾患関連抗原をコードする、請求項87に記載の方法。
  89. 前記疾患が、心疾患、糖尿病、がん、神経学的疾患、精神疾患、遺伝性疾患、またはそれらの組合せである、請求項88に記載の方法。
  90. 前記RDP配列を使用しない対応する核酸編集方法と比較してエネルギー要求量が低く、かつ、
    予め決められた量のATPを前記核酸編集システムに供給してATP使用量を編集後の（［ATP］-［ADP］）/［修飾されたDNA］に基づいて算出することでATP使用量の差を算出することによって、該エネルギー要求量が求められる、
    請求項77〜89のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記RDP配列を含む前記核酸編集システムを用いた場合に、エネルギーレベルが、該RDP配列を使用しない相当する核酸編集システムと比較して約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、または最大25％低減する、請求項77〜90のいずれか一項に記載の方法。
  92. ゲノム編集修復を非相同末端結合よりも相同組換え修復に偏らせる、請求項77〜91のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記細胞のゲノムにトランスジーンを導入する工程をさらに含む、請求項77〜92のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記導入する工程が非ウイルス性に行われる、請求項93に記載の方法。
  95. 前記導入する工程がウイルス性に行われる、請求項93に記載の方法。
  96. 前記細胞が初代細胞または組換え細胞である、請求項77〜95のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記細胞がヒト細胞である、請求項77〜96のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記核酸編集システムが前記細胞にエレクトロポレートされる、請求項77〜97のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記方法によって編集された細胞を、それを必要とする対象に導入する工程をさらに含む、請求項77〜98のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記RHDCポリペプチド配列が、ファーミキューテス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、請求項77〜99のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記RHDCポリペプチド配列が、クロストリジウム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記核酸を切断する、請求項77〜99のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記クロストリジウム・アルゴノートドメインが、クロストリジウム・ディスポリカム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項101に記載の方法。
  103. 前記RHDCポリペプチド配列が、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記核酸を切断する、請求項77〜99のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインが、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項103に記載の方法。
  105. 前記RHDCポリペプチド配列が、メチロバクター・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記核酸を切断する、請求項77〜99のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記メチロバクター・アルゴノートドメインが、メチロバクター・ウィッテンバリー・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項105に記載の方法。
  107. 前記RHDCポリペプチド配列が、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記核酸を切断する、請求項77〜99のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記サーモシネココッカス・アルゴノートドメインが、サーモシネココッカス・エロンゲーツ・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、請求項107に記載の方法。
  109. SEQ ID NO:161〜252のいずれか1つに対して少なくとも60％の同一性を含む、単離された核酸配列。
  110. SEQ ID NO:161〜252のいずれか1つに対して少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％の同一性をさらに含む、請求項109に記載の単離された核酸配列。
  111. 請求項109または110に記載の単離された核酸配列を含む、細胞。
  112. 請求項108または109に記載の単離された核酸配列によってコードされるタンパク質を含む、細胞。
  113. ガイド核酸をさらに含む、請求項111または請求項112に記載の細胞。
  114. 調節ドメインポリペプチド（RDP）をさらに含む、請求項111または112に記載の細胞。
  115. SEQ ID NO:20〜38のいずれか1つに対して少なくとも60％の同一性を含む、単離されたポリペプチド配列。
  116. SEQ ID NO:20〜38のいずれか1つに対して少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％の同一性をさらに含む、請求項114に記載の単離されたポリペプチド配列。
  117. 請求項115または116に記載の単離されたポリペプチド配列を含む、細胞。
  118. ガイド核酸をさらに含む、請求項117に記載の細胞。
  119. 調節ドメインポリペプチド（RDP）配列をさらに含む、請求項117または118に記載の細胞。
  120. 細胞の集団を、請求項1〜44または請求項51〜72のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物と接触させる工程を含み、該接触させる工程の後に該集団の少なくとも約5％がゲノム破壊を含む、ゲノム編集の方法。
  121. 前記接触させる工程の後に、前記集団の少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、または少なくとも約60％が前記ゲノム破壊を含む、請求項120に記載の方法。
  122. 細胞の集団を、請求項1〜44または請求項51〜72のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードする単離されたポリ核酸と接触させる工程を含み、該接触させる工程の後に、該集団の少なくとも約5％がゲノム破壊を含む、ゲノム編集の方法。
  123. 前記接触させる工程の後に、前記集団の少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、または少なくとも約60％が前記ゲノム破壊を含む、請求項122に記載の方法。
  124. a.ゲノム配列をCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）タンパク質で巻き戻し、それによって、巻き戻されたゲノム配列を生成する工程と、
    b.該巻き戻されたゲノム配列を中温性RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと接触させることによって該巻き戻されたゲノム配列にゲノム破壊を導入し、それによってゲノムを編集する工程と
    を含む、ゲノム編集の方法。
  125. 前記CRISPRタンパク質が触媒不活性Casまたは部分不活性Cas（ニッカーゼ）である、請求項124に記載の方法。
  126. 前記触媒不活性Casが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、およびCasRXの触媒不活性誘導体からなる群より選択される、請求項125に記載の方法。
  127. 前記CasがdCas9である、請求項124〜126のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記RHDCポリペプチドが、RuvC、HNH、RNase H、PIWI、またはそれらの組合せから選択されるポリペプチドを含む、請求項124〜127のいずれか一項に記載の方法。
  129. 調節ドメインポリペプチド（RDP）をさらに含む、請求項124〜128のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記RDPが、Rad51、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、または、生殖細胞修復に関与するドメインを含む、請求項129に記載の方法。
  131. 前記ゲノム配列が初代細胞中または組換え細胞中に存在する、請求項124〜130のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記ゲノム配列がヒト細胞中に存在する、請求項124〜131のいずれか一項に記載の方法。
  133. 請求項48、76、77、120、122、または124のいずれか一項に記載の方法によって編集された細胞を投与する工程を含む、それを必要とする対象において疾患を処置する方法。
  134. 前記疾患が、心疾患、糖尿病、がん、神経学的疾患、免疫学的疾患、精神疾患、遺伝性疾患、またはそれらの組合せである、請求項133に記載の方法。
  135. 前記投与する工程の後に前記疾患の程度が約10％〜約50％低減する、請求項133または134に記載の方法。
  136. 請求項48、76、77、120、122、または124のいずれか一項に記載の方法によって編集された細胞を投与する工程を含む、それを必要とする対象において疾患を安定化する方法。
  137. 前記安定化が、前記投与する工程の後の前記対象における疾患のレベルの5％未満の変化を含む、請求項136に記載の方法。
  138. 原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とをコードする、核酸構築物であって、
    該RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、かつ該RHDCポリペプチド配列が、該核酸構築物によってコードされるポリペプチドにおいて該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されている、該核酸構築物。
  139. RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とをコードする、核酸構築物であって、
    該RHDCポリペプチド配列によってコードされるタンパク質が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、該RHDCポリペプチド配列が、該核酸構築物によってコードされるポリペプチドにおいて該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されており、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された該核酸に核酸配列を挿入する、該核酸構築物。
  140. 原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物を含む、細胞であって、
    RHDCポリペプチド配列が中温で核酸を切断し、ここで、核酸切断活性がガイドDNAによって束縛され、かつ該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている、該細胞。
  141. RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とを含むポリペプチド構築物を含む、細胞であって、
    該RHDCポリペプチド配列によってコードされるポリペプチドが中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチドに融合されており、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された該核酸に核酸配列を挿入する、該細胞。
  142. 原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とをコードする核酸構築物を含む、細胞であって、
    RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、かつ該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されている、該細胞。
  143. RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とをコードする核酸構築物を含む、細胞であって、
    該RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されており、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された該核酸に核酸配列を挿入する、該細胞。
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