KR20130045824A

KR20130045824A - 변이 ｃｔｌａ4 유전자 이입 ｔ 세포 및 이를 포함하는 항암 면역치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130045824A
Application number: KR1020120119603A
Authority: KR
Inventors: 최경호; 신재훈
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2011-10-26
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2013-05-06
Also published as: US9688740B2; KR101471647B1; JP2014532642A; US20140242049A1; JP6074435B2

Abstract

본 발명은 항암 T-세포 요법(T-cell therapy)을 위한 형질전환된 T-세포 및 이를 포함하는 항암 치료용 조성물에 대한 것으로,
구체적으로는 상기 형질전환된 T-세포는 T-세포 표면 면역관용(immune tolerance) 유도 수용체인 CTLA4 또는 PD1의 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 제거하고, 이에 T-세포 활성화 표면 단백질인 CD28의 세포내 활성화 전달 도메인을 결합시킨 CTLA4-CD28 키메라(chimera) 단백질 또는 PD1-CD28 키메라 단백질을 코딩하는 유전자가 이입된 것을 특징으로 한다.
상기 CTLA4-CD28 키메라 단백질 또는 PD1-CD28 키메라 단백질을 코딩하는 유전자가 이입된 T-세포는 암 세포의 면역관용 유도로 인한 치료효과 저해 문제를 해결할 수 있을 뿐 아니라, 오히려 CD28의 신호 전달을 활성화시켜 T-세포의 활성화를 유도함으로써 함암 효과를 극대화시킬 수 있다는 장점이 있다.
또한 암세포에 특이적인 T-세포에서만 CTLA4 또는 PD1의 활성을 억제함으로써, 기존 항-CTLA4 항체 등 비특이적 CTLA4 또는 PD1 길항제(antagonist)를 이용할 경우 발생하는 전신적 T-세포 활성화로 인한 자가면역질환 발병 등의 부작용을 최소화할 수 있다.

Description

변이 ＣＴＬＡ4 유전자 이입 Ｔ 세포 및 이를 포함하는 항암 면역치료용 조성물{Mutant CTLA4 gene modified T-cell and composition for anticancer immunotherapy comprising thereof}

본 발명은 항암 T-세포 요법(T-cell therapy)을 위한 유전자 변형된 T-세포 및 이를 포함하는 항암 치료용 조성물에 관한 것이다.

암의 치료에 있어 가장 일차적이고 효과적인 방법은 외과적 절제술이다. 그러나 외과적 절제만으로는 잔존 암(residual tumor)나 전이성 병소(metastatic foci)의 제거가 쉽지 않으므로 그동안 화학 요법(chemotherapy), 방사선 요법(radiation therapy) 등 여러 치료방법이 외과적 절제술과 병행되어 왔다. 그러나 이러한 다양한 치료법의 발전에도 불구하고 다발성 전이(multiple metastasis)나 외과적 절제 후 보이는 생화학적 재발(biochemical recurrence)의 효과적인 치료는 아직 어려운 실정이며 현재 의학계가 해결해야 할 큰 숙제로 남아있다.

이러한 여러 장기의 종양 병소(tumor foci)나 가시적으로 확인이 불가능한 미세 병소(micro-foci)의 치료를 위한 좋은 대안으로 체내의 면역계를 이용한 면역요법이 최근 각광받고 있으며, Robert Schreiber 등에 의해 임파구결핍 생쥐나 강력한 효과 사이토카인(effector cytokine)인 인터페론(IFN)-γ 낙아웃(Knockout) 생쥐 등에서 암의 발생 빈도가 현저하게 증가함이 관찰됨으로써 암 발생이 면역계, 특히 임파구에 의해 억제되고 있다는 개념이 신빙성을 얻고 있고(Nature, 2001, vol410;1107-1111), 특히 암환자의 체내에 암-관련 항원(tumor-associated antigen)을 인지할 수 있는 특이적인 항체 또는 T-세포가 존재한다는 보고가 잇따르고 있음은 항암 면역요법의 적용 가능성이 매우 높음을 입증하는 것이다.

최근 들어 면역요법 중에 가장 각광받고 있는 치료법으로는 수지상세포, 자연살해세포(Natural Killer Cell : NK세포), T-세포 등 면역세포를 환자에게 직접 주입하는 세포치료법을 들 수 있다. 그 중에서도 T-세포 치료법은 가시적인 성과를 올리고 있는데, T-세포 치료법은 환자 체내의 암 항원 특이 T세포를 분리하여 체외(in vitro) 세포 배양을 통해 대량 증식하여 다시 환자의 혈액으로 돌려줌으로써 암세포를 공격하도록 한다는 기본적인 개념을 가지고 있다(Nat. Rev. Immunol , vol 6 , pp 383). 즉, 소수의 암 특이 T-세포를 체외 배양을 통해 그 수를 증폭시켜 치료에 이용한다는 것이다.

특히 T 림프구(T lymphocyte)가 가지는 항원 특이성과 조직침투력은 여러 곳에 산재해 있는 암 초점을 한꺼번에 효과적으로 제거할 수 있는 것으로 기대를 모으고 이는데, T-세포는 스스로 혈관외유출(extravasation)을 통해 직접 조직에 침투하여 특이적으로 항원을 발현하는 세포를 살해할 수 있으므로 여러 전이조직에 각각 침투하여 암세포를 제거할 수 있는 장점을 가지고 있어, 최근 이들 항암 T-세포를 이용한 세포치료법 개발이 활발해지고 있는 상황이다.

T-세포를 이용한 세포치료는 미국 국립보건원(NIH)의 Steve Rosenberg 박사를 주축으로 지난 20~30년간 LAK(lymphokine-activated killer), TIL(tumor-infiltrating lymphocyte)등의 이름으로 시도되어 왔으나, 그 유효성은 제한적으로만 입증되어 왔다. 하지만, 최근 T-세포 주입 전에 환자의 림프구(lymphocyte)를 미리 고갈(depletion)시키는 시도를 통하여 전이성 흑색종(metastatic melanoma) 환자에서 완전 회복(complete remission)를 포함하여 50%의 반응율(response rate)을 보고함으로써 선택적 T-세포 전달요법(adoptive T cell transfer therapy)에 중요한 돌파구를 열었다고 평가되고 있다(Science. 2002;298(5594):850-4, J. Clin. Oncol. 2005;23(10):2346-57). T-세포 주입 전 림프구 고갈(lymphocyte depletion)은 다음에 주입될 T-세포가 증식할 여지(space)를 만들어 주는 한편, T-세포 활성화의 제한요소인 조절 T-세포(regulatory T cell)을 제거해 주는 효과가 있을 것으로 추정되고 있다. 이러한 반응률은 현재까지 시도된 면역치료법 사상 가장 높은 반응률로써 그 발전 가능성에 대한 매우 고무적인 예측을 불러일으키고 있다.

암 항원 특이적 T-세포 요법의 성공에 힘입어, 최근 T-세포 요법의 경향은 분리한 T-세포에 유전자 조작을 가함으로써 그 성질 및 효능을 향상시킨 후 다시 환자에게 주입하는 유전자 조작 T-세포 요법(genetically engineered T cell therapy)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 유전자 조작 T-세포 요법은 환자로부터 분리된 암항원 특이적 T세포를 증식시킨 후, 특정 유전자 발현용 레트로바이러스(retrovirus)를 이용하여 T-세포를 형질전환(transduction)시켜 환자에게 재주입하는 개념이며, 이러한 개념은 실험실 수준을 벗어나 이미 많은 예에서 임상시험이 진행되고 있다.

그러나, 이러한 암 특이 T-세포를 이용한 암 치료요법을 통해 암세포를 효과적으로 제거하기 위해서 반드시 넘어야 할 장애요인으로 암세포가 가지는 면역저항성 혹은 면역억제력이 존재한다. 면역계의 종양 억제능에도 불구하고 정상생쥐에서나 면역능을 유지하고 있는 정상인에서 암이 발생한다는 것은 암세포가 면역계에 저항할 수 있는 면역저항성 또는 면역회피성을 보유하게 된다는 것을 의미한다.

암세포의 면역저항성이 생기는 원인은 아직 명확하게 밝혀지지는 않았으며, 여러 가설이 제시되고 있지만, 암세포가 항암 임파구에 대한 관용(tolerance)을 유도한다는 설이 유력하다. 즉, 인체 내에는 실제 암세포를 인지하고 파괴시킬 수 있는 T-임파구가 존재하지만 암세포 혹은 암세포주위의 미세 환경(microenvironment)이 이들 항암 T-세포를 불활성화 시킨다는 것이다.

실제로 흑색종 환자의 혈액에서 채취한 암항원 특이 T-세포는 암 항원인 Melan-A 펩타이드로 자극하면 IFN-γ를 분비하는 반면, 암 조직이나 암 조직 림프절에서 채취한 암 항원특이 T-세포는 암 항원으로 자극해도 IFN-γ를 분비하지 못하는 비활성화상태에 있다는 보고가 있다. 이는 암 환자의 말초혈액에는 암 세포를 인지하여 반응할 수 있는 T-세포가 존재하지만 이들 T-세포가 암 조직에 가게 되면 국소적으로 비활성화, 즉 관용(tolerance)에 빠지게 됨을 의미한다.

이는 역으로 말하면, 암 세포에 의한 T-세포 관용을 제거하게 되면 암세포가 T-세포에 의해 효과적으로 제거될 수 있음을 의미한다. 따라서 암세포에 대한 면역학적 관용을 깨서 항암 임파구를 활성화시키는 것이 항암 면역요법의 중요한 선결과제라고 할 수 있다.

이러한 암 세포에 의한 T-세포 관용을 제거하기 위한 다양한 연구가 진행되어 왔다. 특히 암 세포에 의한 T-세포 관용에 관여하는 수용체 또는 단백질 등을 규명하고, 이의 기능(function)을 제거 또는 억제하거나, 수용체에 대한 길항제(antagonist) 또는 항체(antibody) 등을 이용하여 치료효과를 높이기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

대표적으로 T-세포 관용에 관여하는 것으로 알려진 수용체는 CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein 4, 또는 T-Lymphocyte Antigen 4)로서, CD152라고도 불린다. CTLA4는 면역글로불린(immunoglobulin)의 슈퍼패밀리(superfamily)의 일종으로, T-세포의 표면에 발현되며, T-세포에 저해신호(inhibitory signal)를 전달한다. CTLA4 단백질의 T-세포 비활성화를 통한 관용유도현상은 CTLA4 낙아웃 마우스(knockout mice)에서 심각한 임파구증식성 질환(lymphoproliferative disease) 및 자가면역질환이 관찰됨으로써 확인되었다.

CTLA4는 T-세포 보조자극인자(costimulatory protein)인 CD28과 유사한 서열을 가지며, 항원제시세포(antigen-presenting cells)의 B7이라고도 불리는 CD80 및 CD86에 대해 CD28과 경쟁적으로 결합하는데, B7과 결합할 경우 CTLA4는 저해신호를, CD28은 자극신호(stimulatory signal)를 전달한다. 즉, B7과 CTLA4이 결합하면 T-세포의 활성화(activation)를 저해하며, B7과 CD28이 결합하면 T-세포의 활성화를 유도하는 것이다.

T-세포 관용에 관여하는 또 다른 단백질은 PD1이다. PD1은 T-세포 표면에 발현되며, PD-L1과 결합하여 T-세포의 활성화를 저해하는 것으로 알려져 있다. PD-L1은 CD28와 유사한 구조를 가진 패밀리 멤버(family member)로서, 주로 T-세포, B-세포, 마크로파지(macrophage), 수지상 세포(dendritic cell) 등의 면역세포 표면에 발현되며, 심장 혈관내피세포 등 일부 비림프성(non-lymphoid) 세포에서도 발현되는 것으로 알려져 있다.

PD1 낙아웃 마우스(knockout mouse)에서 자연적으로 자가면역질환이 생기고, PD1 자극에 의해 T-세포 내부에 음성 신호(negative signal)가 전달되는 등, PD-L1과 PD1의 상호작용을 통한 T-세포 활성 억제현상은 면역관용현상에서 매우 중요한 것으로 알려져 있다.

그런데 최근, 많은 종류의 암 조직에서 PD-L1의 발현이 증가되어 있는 것이 관찰되었으며(Nat. Med., 2002 Aug;8(8):793-800), PD-L1에 대한 저해 항체(blocking antibody)를 처리하면 항암 면역이 증가되었다는 보고가 있는 등(Proc. Natl. Acad. Sci., 17;99(19):12293-7), PD-L1이 암세포 표면에서 면역억제작용을 하고 있다는 증거들이 속속 보고되고 있다.

따라서, CTLA4나 PD1과 같이 T-세포 면역관용 반응에 관여하는 수용체나 단백질의 활성을 억제하면 항암 효과를 거둘 수 있을 것이라는 기대에 따라, CTLA4나 PD1에 대한 항체 등 이의 활성을 억제하는 전략의 T-세포 면역요법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히, BMS(Bristol-Myers Squibb) 등이 개발한 항-CTLA4 항체인 이필리무맵(Ipilimumab)은 항암 면역관용을 억제하여, 전이성 흑색종(metastatic melanoma)에 대한 항종양 효과를 보임이 임상적으로 입증되어, 2011년 FDA 허가를 취득하여 현재 시판 중에 있으며, BMS 등은 완전 인간형 항-PD1 항체에 대한 임상시험도 진행 중에 있는 것으로 알려져 있다.

하지만, 항-CTLA4 항체나 항-PD1 항체를 사용할 경우, CTLA4 또는 PD1의 전신적 억제(systemic inhibition)로 인해 항암 T-세포 뿐 아니라, 자가항원에 대한 T-세포 관용도 파괴함으로써, 전신적인 자가면역질환이라는 치명적인 부작용을 초래하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 암 항원 특이적 T-세포 요법의 실질적인 임상 적용을 위해서 항암 T-세포에 대해서만 선택적으로 CTLA4 또는 PD1 등의 T-세포 관용 신호전달체계를 저해할 수 있는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 CTLA4의 세포내부 억제신호 전달도메인(intracellular inhibitory signaling domain)이 제거된 CTLA4 돌연변이체(mutant)인 CTLA4 유인 수용체(CTLA decoy receptor)를 발현하도록 항암 T-세포를 유전자 조작하여, T-세포 고유의 CTLA4(endogenous CLTA4) 기능을 경쟁적으로 억제함으로써 항암 T-세포의 활성을 증가시키려 하였다. 실제 이렇게 유전자 조작된 항암 T-세포의 경우, CTLA4 유인 수용체가 리간드인 B7과 결합하더라도 세포 내부로 억제신호가 전달되지 않으므로 암세포에 의한 T-세포 관용 문제는 어느 정도 해결할 수 있지만, 여전히 T-세포의 활성화를 유도하는 CD28과 리간드인 B7의 결합을 경쟁적으로 억제(competitive inhibition)함으로써 결과적으로 T-세포의 활성화가 오히려 저해된다는 문제점이 발견되었다.

이에, 본 발명자들은 상기 CTLA4의 세포내부 억제신호 전달 도메인을 제거하고, 그 자리에 CD28 단백질의 세포내부 활성화신호 전달 도메인(intracellular stimulatory signaling domain)을 융합시킨 CTLA4-CD28 키메라 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 항암 T-세포(도 1 참조)를 고안하여, CTLA4에 리간드가 결합될 경우, CTLA4-CD28 키메라 단백질에 포함된 CD28의 세포내부 활성화신호 전달 도메인의 작용에 의해 CTLA4와 리간드의 결합으로 인한 T-세포 활성 억제신호를 활성화신호(stimulatory signal)로 바꾸는 효과를 가져오게 되므로, 암 세포에 의한 T-세포 관용을 극복할 수 있을 뿐 아니라, T-세포의 활성화를 통해 항암 능력이 향상되는 효과를 가져옴으로써 항암 효능이 크게 향상되며, 또한 전신적인 CTLA4 활성 억제로 인한 자가면역질환 발병 등의 부작용을 회피할 수 있어 이상적인 T-세포 면역요법에 이용가능하다는 점을 확인하였고, 또한, CTLA4와 마찬가지로 T-세포 관용에 관여하는 것으로 알려진 PD1의 세포내 도메인을 제거하고, 이에 CTLA4-CD28 키메라 단백질과 유사하게 PD1-CD28 키메라 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 T-세포 역시 T세포 활성화를 증가시켜 이상적인 T-세포 면역요범에 이용가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

미국등록특허 8026224: Tumor cells with increase immunogenecity and uses thereof, 등록일자: 2011년9월27일, 출원인: Dana-Farber Cancer Institute, Inc. 미국등록특허 7744875: Surrogate therepeutic endpoint for anti-CTLA4 base immunotherapy of disease, 등록일자: 2010년6월29일, 출원인: Medarex, Inc. 미국등록특허 7700556: Method of treatment using CTLA4 mutant molecules, 등록일자: 2010년4월20일, 출원인: Britsol-Myers Squibb Co.

"Structural analysis of CTLA-4 function in vivo" Masteller E. L. et al, J Immunol. 2000 May 15;164(10):5319-27. "Short cytoplasmic SDYMNM segment of CD28 is sufficient to convert CTLA-4 to a positive signaling receptor" Yin L. et al., J Leukoc Biol. 2003 Jan;73(1):178-82.

본 발명의 목적은 T-세포 면역 관용 수용체의 세포 내 신호전달 도메인을 제거하고, T-세포 활성화 표면 단백질 CD28의 세포 내 신호전달 도메인을 융합시킨 융합단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 바이러스 또는 비바이러스성 담체(carrier)로 형질전환(transduction)된 암 항원 특이적 형질전환된 T-세포 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 T-세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, T-세포 표면에 CTLA4 또는 PD1의 세포내부 억제신호 전달 도메인를 제거하고, 그 자리에 CD28 단백질의 세포내부 활성화신호 전달 도메인이 융합된 융합단백질인 CTLA4-CD28 키메라 단백질 또는 PD1-CD28 키메라 단백질, 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 바이러스 또는 비바이러스성 담체(carrier)로 형질전환(transduction)된 암 항원 특이적 형질전환된 T-세포 및 이의 제조방법을 제공한다.

아울러 본 발명은 본 발명의 형질전환된 T-세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 키메라 유전자가 이입된 T-세포는 암 세포의 면역관용으로 인한 치료효과 저해 문제를 해결할 수 있을 뿐 아니라, 오히려 CD28의 신호 전달을 활성화시킴으로써 T-세포의 활성화를 유도함으로써 항암효과를 극대화시킬 수 있다는 장점이 있으며,

또한 암세포에서만 특이적으로 CTLA4 또는 PD1의 활성을 억제함으로써, 기존 항-CTLA4 항체 등 비특이적 CTLA4 또는 PD1 길항제(antagonist)를 이용할 경우 발생하는 전신적 T-세포 활성화로 인한 자가면역질환 발병 등의 부작용을 최소화할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 키메라 유전자가 이입된 T-세포를 포함하는 항암 치료용 약학 조성물은 기존의 방법에 비해 현저하게 우수한 암 치료 효능을 갖는 T-세포 면역요법에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 CTLA4-CD28 키메라 단백질을 발현하는 암 항원 특이적 T-세포의 암 치료 원리를 나타내는 도이다:
CTdc:CLLA4 유인 수용체; 및
CTC28:CTLA4-CD28 키메라 단백질.
(이하 다른 도면의 설명에서도 동일함.)
도 2는 CTLA4-CD28의 발현을 위한 유전자 구조체 및 플라스미드 개열지도를 나타내는 도이다.
(a) pMIG-w 레트로바이러스성 벡터의 개열지도(restriction map); 및
(b) CTLA4-CD28의 레트로바이러스성 유전자 구조체의 구조.
CTLA4 EC: CTLA4의 세포외 도메인;
TM: 막횡단 도메인;
CD28 CP: CD28의 세포내 도메인; 및
EV: CTLA4-CD28이 포함되지 않은 빈 레트로바이러스성 벡터(empty vector).
(이하 다른 도면의 설명에서도 동일함.)
도 3은 CLTA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T-세포의 세포 분열 능력 및 IFN-γ 분비능력을 나타내는 도이다.
(a) 아무런 유전자 조작을 하지 않은 경우의 루시퍼라제 활성;
(b) CTdc 또는 CTC28로 형질전환한 경우의 루시퍼라제 활성;
(c) CTdc 또는 CTC28로 형질전환한 경우의 T-세포 분열 능력; 및
(d) CTdc 또는 CTC28로 형질전환한 경우의 IFN-γ 분비능력.
도 4는 CLTA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 CD8 T-세포의 IFN-γ의 분비능력, 암 세포 살상능력 및 종양치료 효과를 나타내는 도이다.
(a) CTC28로 형질전환한 경우의 IFN-γ 분비능력;
(b) CTC28로 형질전환한 경우의 암 세포 살상능력; 및
(c) CTC28로 형질전환한 경우의 종양치료 효과.
도 5는 CLTA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T 세포의 세포배양시 항원 반응성을 나타내는 도이다.
(a) CD4 OT-II 세포를 이용한 경우의 IL-2 분비능력;
(b) CD4 OT-II 세포를 이용한 경우의 IFN-γ 분비능력;
(c) CD8 OT-I 세포를 이용한 경우의 IL-2 분비능력; 및
(d) CD8 OT-I 세포를 이용한 경우의 IFN-γ 분비능력.
도 6은 유전자조작 CD4 및 CD8 T-세포 병합치료 모델을 나타내는 도이다.
도 7은 E.G7 종양에 대한 OT-II T-세포 단독투여의 효과를 나타내는 도이다.
도 8은 E.G7 종양에 대한 OT-I T세포와 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 OT-II T-세포의 병합투여의 효과를 나타내는 도이다.
(▲ : 아무런 처리도 하지 않은 경우, △ : OT-1만을 사용한 경우, ● : OT-1 + OT-II, □ : OT-1 + OT-II CTC28)
(a) OT-1 T-세포 : OT-II T-세포 비율 = 2 : 0.5;
(b) OT-1 T-세포 : OT-II T-세포 비율 = 2 : 1; 및
(c) OT-1 T-세포 : OT-II T-세포 비율 = 2 : 2 .
도 9는 OT-II 및 OT-I T-세포의 동시 형질전환에 의한 종양치료 효과를 나타내는 도이다.
(▲ : 아무런 처리도 하지 않은 경우, ■ : OT-1 + OT-II, ● : OT-1 + OT-II CTC28, □ : OT-1 CTC28 + OT-II CTC28)
도 10은 유전자조작 CD4 및 CD8 T-세포 병합요법의 항 흑색종(melanoma) 효과를 나타내는 도이다.
(▲ : 아무런 처리도 하지 않은 경우, ○ : Pmel-1 EV, ■ : Pmel-1 EV + CD4 EV, □ : Pmel-1 CTC28 + CD4 CTC28)
(a) 종양부피의 변화를 나타내는 도면; 및
(b) 생존율 변화를 나타내는 도면
도 11은 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T-세포의 Akt 인산화를 나타내는 도이다.
도 12는 CTLA4-CD28 발현을 위한 유전자 구조체들을 이용 형질전환한 T-세포를 유세포 분류기를 사용해서 분석한 결과 나타내는 도이다.
도 13은 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T-세포의 각 수용체를 자극하였을 때, IFN-γ의 분비 능력을 나타내는 도이다.
도 14는 E.G7 종양에 대한 OT-I T-세포 단독투여의 효과를 나타내는 도이다.
도 15는 E.G7 종양을 가진 마우스에 형질전환된 OT-I 및 OT-II T-세포를 투여한 후, 마우스 비장(spleen)내의 이들 T-세포의 수 및 항원 반응성을 나타내는 도이다.
(a) 형질전환된 OT-I 및 OT-II T-세포의 세포배양시 항원 반응성을 유세포 분류기를 사용해서 분석한 결과;
(b) 형질전환된 OT-II T-세포의 마우스 체내 증식도를 유세포 분류기를 사용해서 계산한 결과; 및
(c) 형질전환된 OT-I T-세포의 세포배양시 항원 반응 후 IFN-γ의 분비 능력.
도 16은 나타내는 유전자조작 CD4 및 CD8 T-세포 병합요법의 항 흑색종(melanoma) 효과중 혈액 내 유전자 조작 T-세포의 증식도를 나타내는 도이다.
(a) 혈액 세포중 CD4 T-세포의 비율을 유세포 분류기를 사용해서 분석한 결과;
(b) 혈액 세포중 Pmel-1 T-세포의 비율을 유세포 분류기를 사용해서 분석한 결과;
(c) 혈액 내 CD4 T-세포의 수를 유세포 분류기를 사용해서 계산한 결과( ● : CD4 EV, □ : CD4 CTC28); 및
(d) 혈액 내 Pmel-1 T-세포의 수를 유세포 분류기를 사용해서 계산한 결과( ● : Pmel-1 EV, □ : Pmel-1 CTC28).
도 17은 유전자조작 CD4 및 CD8 T-세포 병합요법의 항 흑색종(melanoma)에 대한 효과를 나타내는 도이다.
(▲ : 아무런 처리도 하지 않은 경우, ■ : Pmel-1 EV + CD4 EV, ◆ : Pmel-1 EV + CD4 CTC28, □ : Pmel-1 CTC28 + CD4 CTC28)
도 18은 유전자조작 CD4 및 CD8 T-세포 병합요법의 항 흑색종(melanoma)에 대한 IL-2의 효과를 나타내는 도이다.
(▲ : 아무런 처리도 하지 않은 경우, ■ : CTC28 + 대조군 IgG 항체, ◇ : CTC28 + 항-IL-2 항체, □ : CTC28 + 대조군 IgG 항체)

이하, 본 발명의 용어를 상세히 설명한다.

본 발명에서 용어 “세포외 도메인(extracellular domain)”은 세포 외부로 돌출되어 리간드 등과 결합할 수 있는 도메인를 의미하며,

“막횡단 도메인(transmembrane domain)”은 CTLA4, CD28 등에 있어서, 세포막에 위치하는 도메인를 의미하며,

“세포내 도메인(intracellular domain)”은 세포 내부에 위치하며 세포외 도메인과 리간드가 결합되어 전달되는 신호를 세포내로 전달하는 도메인을 의미한다.

상기 세포내 도메인은 신호의 성격에 따라 저해신호 전달 도메인(inhibitory signaling domain) 또는 활성신호 전달 도메인(activation signaling domain)으로 구분될 수 있다.

본 발명에서 용어, “항암” 이란 “예방” 및 “치료”를 포함하며, 여기서 "예방"이란 본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 암 항원 특이적 T-세포를 포함하는 조성물 투여에 의해 암이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 암 항원 특이적 T-세포를 포함하는 조성물 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 T-세포 표면 면역 관용 유도 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 제거하고, T-세포 활성화 표면 단백질 CD28의 세포 내 신호전달 도메인을 융합시킨 융합단백질을 제공한다.

상기 T-세포 표면 관용 유도 수용체와 T-세포 활성화 표면 단백질인 CD28은 T-세포 표면 관용 유도 수용체 또는 CD28의 막횡단 도메인에 의해 융합되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 T-세포 표면 관용 유도 수용체는 CTLA4(Cytotoxic T lymphocyteassociated antigen4) 또는 PD1인 것이 바람직하다.

상기 융합단백질은 CTLA4의 세포외 도메인-CTLA4의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인 또는 CTLA4의 세포 외 도메인-CD28의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인으로 구성된 것이 바람직 하나 이에 한정되지 않는다.

상기 융합단백질은 PD1의 세포외 도메인-PD1의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인 또는 PD-1의 세포 외 도메인-CD28의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인으로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 CTLA4는 인간 유래 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 마우스 유래 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다.

상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 내지 161 번까지의 아미노산 서열이 세포외 도메인, 즉 B7 등의 리간드와 결합하는 부위이며, 162 내지 189번까지의 아미노산 서열은 막횡단 도메인, 190번 내지 223번까지의 아미노산 서열은 세포내 도메인을 나타낸다.

상기 CD28은 인간 유래 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 마우스 유래 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다.

상기 서열번호 3의 아미노산 서열에서 1 내지 152 번까지의 아미노산 서열이 세포외 도메인, 즉 B7 등의 리간드와 결합하는 부위이며, 153 내지 178번까지의 아미노산 서열은 막횡단 도메인, 179번 내지 220번까지의 아미노산 서열은 세포내 도메인을 나타내며, 서열번호 4의 아미노산 서열에서 1 내지 150 번까지의 아미노산 서열이 세포외 도메인, 즉 B7 등의 리간드와 결합하는 부위이며, 151 내지 176번까지의 아미노산 서열은 막횡단 도메인, 177번 내지 218번까지의 아미노산 서열은 세포내 도메인을 나타낸다.

또한, CLTA4-CD28 키메라 단백질에 CTLA4의 막횡단 도메인이 이용될 경우, CTLA4의 세포내 저해 신호가 전달되지 않는 범위 내에서 CTLA4의 세포외 도메인과 막횡단 도메인에 부가적으로 CTLA4 세포내 도메인의 일부 서열이 더 포함되는 경우, 또는 CD28의 세포내 도메인에 CD28 막횡단 도메인의 일부 서열이 더 포함되는 경우도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것이라는 점은 통상의 기술자에게 자명한 것이며,

CTLA4-CD28 키메라 단백질에 CD28의 막횡단 도메인이 이용될 경우, CTLA4와 리간드의 결합에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 CD28의 세포외 도메인 일부가 CD28의 세포내 도메인과 막횡단 도메인에 더 포함되는 경우, 또는 CTLA4의 세포외 도메인에 CTLA4 막횡단 도메인의 일부 서열이 더 포함되는 경우도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것이라는 점 역시 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

본 발명에서 제공되는 CTLA4-CD28 키메라 단백질의 한 예는 서열번호 5 내지 서열번호 7 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가진다.

상기 CTLA4의 세포 외 도메인-CTLA4의 막횡단 도메인-CD28의 세포내 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 CTLA4의 세포 외 도메인-CD28의 세포막 도메인-CD28의 세포내 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 PD1의 세포외 도메인-PD1의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인 또는 PD-1의 세포 외 도메인-CD28의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

상기 CTLA4의 세포 도메인-CTLA4의 막횡단 도메인은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열인 것이 바람직하고, CD28 세포 내 도메인은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 또는 비바이러스성 담체(non-viral carrier)를 제공한다.

상기 바이러스 또는 비바이러스성 담체는 동물세포, 특히 T-세포 등을 감염에 의해 형질전환(transduction)시킬 수 있는 것이라면 제한 없이 사용가능하다.

상기 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)가 바람직하며, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스가 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 비바이러스성 담체는 트랜스포손 시스템(transposon system)을 이용하는 것(Hackett 등, US 6,489,458) 등이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 사용될 수 있는 비바이러스성 담체 중에서 본 발명에 목적에 부합되는 어떠한 것이라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 또는 비바이러스성 담체를 이용하여 형질전환된 T-세포를 제공한다.

상기 T-세포는 암 항원 특이적 T-세포 또는 키메릭 항원 수용체인 CAR(Chimeric Antigen Receptor) 유전자가 형질전환된 T-세포이며, 암 항원 특이적 CD4 T-세포(Helper T-cell, 보조 T-세포) 또는 CD8 T-세포(cytotoxic T-cell, 세포독성 T-세포)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 키메릭 항원 수용체란 T-세포 활성화 단백질(CD3-zeta chain, CD28, 41BBL, Ox40, ICOS, high-affinity receptor for IgE (FcεRI) 및 기타 T-세포 활성화 단백질)의 세포막 혹은 세포내 신호전달부위를 암 항원 특이적 항체의 항원결합부위(single chain Fv fragment)와 융합시킨 단백질을 통칭한다.

상기 암 항원에 특이적인 T-세포는 환자의 암조직으로부터 분리한 T-세포(tumor infiltrating lymphocyte)를 체외 배양한 것, 암 항원을 특이적으로 인지하는 수용체, 즉 암 항원 특이적 T-세포 수용체(T-cell receptor(TCR)) 유전자를 클로닝(cloning)한 후, 레트로바이러스(retrovirus) 등의 바이러스성 벡터(viral vector)를 이용하여 환자말초혈액으로부터 분리한 전체 T-세포에 형질전환(transduction) 하여 수득한 T-세포 (TCR 유전자 변형 T-세포, TCR gene-modified T cell)(Science. 2006 ;314(5796):126-9), TCR(T-cell receptor)의 세포외 도메인(extracellular domain)을 암 항원 특이적 항체로 대체시킨 키메릭 항원 수용체인 CAR(Chimeric Antigen Receptor)(J. Clin. Invest. 117:1466-1476 (2007))으로 형질전환시킨 CAR-형질전환 T-세포(CAR-transduced T-cell)(Blood. 2010; 116(7):1035-1044) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것이 아니다.

본 발명에서 암 항원 특이적 T-세포가 특이적으로 인식할 수 있는 항원은 MUC1, CD19, HER2, EGFR, CD20, CEA, PSMA, GD2, 폴레이트 수용체(Folate receptor), IL-13Rα2, Lewis-Y 항원(antigen), NY-ESO-1, MART-1, gp100, 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제-연관 단백질(tyrosinase-related proteins), MAGE, WT-1 등이 예시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 다른 암에서 특이적으로 발현되는 항원들도 본 발명의 목적에 부합되는 한, 본 발명에 따른 T-세포 면역요법에 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

본 발명은 CTLA4의 세포내부 억제신호 전달도메인를 제거하고, 그 자리에 CD28 단백질의 세포내부 활성화신호 전달 도메인을 융합시킨 CTLA4-CD28 키메라 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 항암 T-세포(도 1 참조)를 고안하여, CTLA4에 리간드가 결합될 경우, CTLA4-CD28 키메라 단백질에 포함된 CD28의 세포내부 활성화신호 전달 도메인의 작용에 의해 CTLA4와 리간드의 결합으로 인한 T-세포 활성 억제신호를 활성화신호(stimulatory signal)로 바꾸는 효과를 가져오게 되므로, 암 세포에 의한 T-세포 관용을 극복할 수 있을 뿐 아니라, T-세포의 활성화를 통해 항암 능력이 향상되는 효과를 극대화시킬 수 있다는 장점이 있으며, 또한 암세포에서만 특이적으로 CTLA4 또는 PD1의 활성을 억제함으로써, 기존 항-CTLA4 항체 등 비특이적 CTLA4 또는 PD1 길항제(antagonist)를 이용할 경우 발생하는 전신적 T-세포 활성화로 인한 자가면역질환 발병 등의 부작용을 최소화할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 형질전환된 T-세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 암치료용 약학적 조성물에는 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 유전자로 형질전환된 암 항원 특이적 CD4 T-세포 또는 CD8 T-세포를 포함하는 것이 바람직하고, CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 유전자로 형질전환된 암 항원 특이적 CD4 T-세포 및 CD8 T-세포를 모두 포함하는 것이 보다 바람직하다.

상기 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 포함한다. 바람직하게 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 췌장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경세포아종, 흑색종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 또는 신경교종 등을 포함하며, 더욱 바람직하게는, 대장암, 난소암, 위암, 췌장암, 유방암 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 항암 조성물은 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 암 항원 특이적 T-세포를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 암을 치료하고 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여, 또는 암의 성장을 억제하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 마우스 및 세포준비

Pmel-1, OT-I, B6와 Thy1.1⁺ 콘제닉(congenic) B6 마우스는 잭슨 연구소(Jackson Lab.)에서 입수하였다. RAG1^-/- 배경(background)을 지닌 OT - II 마우스는 타코닉(Taconic)에서 입수하였다. 형질 전환 마우스 모두는 B6 배경을 가진다. 마우스는 국립 암센터 내의 특정 병원체가 없는 시설에서 사육되었으며, 국립 센터의 실험동물 관리 및 사용 위원회의 지침을 준수하였다.

E.G7 림프종 세포 및 B16-F10 (B16) 흑색종 세포 (ATCC No. CRL-2113 및 CRL-6475)는 B6 마우스에서 유래했다. 피닉스 에코(Pheonix Eco) 및 피닉스(Pheonix) GP 세포주는 Garry Nolan 박사(스탠포드 대학)의 허가 하에 ATCC로부터 입수하였다 (ATCC No. SD3444 및 SD3514).

CD8 T-세포 또는 CD4⁺CD25^- T-세포는 항-CD8 마이크로 비즈(microbeads)를 사용하여 포지티브 선별(positive selection)하거나, CD4+CD25- 조절 T-세포 분리 키트(밀터니 바이오텍, Myltenyi Biotec)를 사용하여 네커티브 선별(negative selection) 하였다.

< 실시예 2> 플라스미드 제작

CTLA4-CD28 키메라 제작을 위해 마우스 유래 CTLA4의 세포외 도메인과 막횡단 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 9)과 마우스 CD28의 세포내 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 10)은 마우스 CTLA4 및 CD28 cDNA를 포함하는 플라스미드로부터 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction : PCR)에 의해 증폭하여 수득하였다.

증폭된 두 단편은 블런트 엔드 라이게이션(blunt end ligation)에 의해 결합되어 클로닝 벡터(cloning vector)로 클로닝되었다.

이어 CTLA4-CD28 키메라 유전자의 cDNA는 미국 국립 쥬이쉬 의학연구센터(National Jewish Medical and Research Center)의 Yosef Refaeli 박사로부터 입수한 pMIG-w 레트로바이러스성 벡터(도 2(a) 참조)에 클로닝 되었다.

CTLA4 유인 수용체는 서열번호 9에 따른 CTLA4의 세포외 및 막횡단 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 이용하여 PCR로 증폭한 후, pMIG-w 레트로바이러스성 벡터에 클로닝 하였다(도 2(b) 참조).

< 실시예 3> 루시퍼라제 분석 및 웨스턴 블랏( Western blot )

주르캇(Jurkat) T-세포 (1×10⁷)는 레트로 바이러스 발현 플라스미드, RE/AP 루시페라제 플라스미드(캘리포니아 대학의 Arthur Weiss 교수 제공) 및 표준화를 위한 pRL-TK 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 플라스미드(Promega 사)와 혼합하였다.

이후, 250 V 및 950 μF 조건에서 바이오 래드(Bio-Rad Laboratories)의 진펄서(Gene Pulser)를 이용하여 0.4-cm-gap에서 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환시켰다.

형질전환 후, 자극(stimulation) 전에 24시간 방치하였으며, 이후 자극을 위해, 항-마우스 IgG(5 μg/ml)와 항-햄스터 IgG 항체 (5 μg/ml)로 코팅되어 하룻밤(overnight) 방치된 96-웰 플레이트(well plate)를 세척한 후, 항-CD3 항체 (1 μg/ml) 단독, 또는 정상 햄스터 IgG나 햄스터 항-CLTA4 항체 (9H10, 2 μg/ml)로 코팅한 후, 실온에서 2시간 방치하였다.

이후, 1×10⁵ 세포를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 6 시간 배양한 후, 용해(lysis) 시켰다. 몇 가지 실험을 위해서는 수용성 항-CD28 항체가 플레이트에 결합된 항- CTLA4 항체 대신에 배지에 직접 첨가되었다.

루시페라제 활성은 듀얼-루시퍼라제 보고 분석 시스템(Dual-luciferase reporter assay system)을 이용하여, 루미노미터(luminometer, 프로메가 사, Promega)를 이용하여 측정하였다. 초파리 루시퍼라제의 활성은 레닐라 루시퍼라제 활성을 이용하여 표준화(normalization)하였다.

웨스턴 블롯 분석을 위해, 루시페라제 플라스미드를 제외하고 레트로 바이러스 플라스미드만을 사용하여 상기 프로토콜에 따라 주르캇 T-세포를 형질전환 하였다.

형질전환된 세포의 자극을 위해, 형질전환된 세포는 마우스 항-인간 CD28 항체 또는 일반 햄스터 IgG 또는 햄스터 항-마우스 CTLA4 항체 (2 μg/ml의) 중 하나를 이용하여 얼음 위에서 10분간 처리하였으며, 이어서 염소 항-마우스 IgG 또는 항-햄스터 IgG (5 μg/ml)와 10 분간 빙상에서 가교(crosslinking)시켰다.

그 후, 세포를 30 분간 37℃의 수조에 넣고, 얼음을 이용하여 냉각된 PBS를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 세포 용해물(cell lysates)은 SDS-PAGE 분석에 이용되고, 니트로 셀룰로오스 막(밀리포어)에 옮겨져서, 항-인산 Akt(anti-phospho-Akt) 또는 항-Akt 항체(셀 시그널링사, Cell Signaling)를 이용하여 검출되었다. HRP-표지 2차 항체 (잭슨 면역연구 랩, Jackson Immunoresearch Laboratories)는 1차 항체를 검출하는데 이용되었으며, 블랏(blots)은 피어스사의 슈퍼시그널 웨스트 피코(SuperSignal West Pico)를 이용하여 화학 발광 반응에 의해 시각화했다.

< 실시예 4> 레트로 바이러스 제작 및 형질전환

리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (인비트로젠사, Invitrogen)을 이용하여 레트로바이러스성 플라스미드(retroviral plasmid)와 VSV-G cDNA를 코딩하는 플라스미드인 pMD.G를 피닉스(Phoenix) GP 세포주에 형질전환(transfection)시켰다. 48 시간 후 VSV-G 가형식(pseudotyped) 레트로 바이러스를 포함하는 상등액을 회수하였다. 피닉스 에코(Phoenix Eco) 세포주는 레트로바이러스를 포함하는 상청액을 이용하여 밤새 형질전환 시켰다.

3~5일 경과 후 GFP 양성 피닉스 에코 세포주는 에코트로픽(ecotropic) 레트로 바이러스를 생산하기 위한 안정적 생산주 제작을 위해서 세포 선별기(cell sorter) (FACS Aria, 비디 바이오사이언스 사, BD Biosciences)를 이용하여 분리되었다. 에코트로픽 레트로바이러스를 포함하는 상등액은 회수된 후, 원심분리 필터기(centrifugal filter device) (Amicon Ulra-15, 컷오프 값 100 kDa, 밀리포어사, Millipore)를 이용하여 10배 농축되었다. 레트로바이러스를 이용한 T-세포의 형질전환을 위해 정상 또는 형질전환된 마우스 유래의 비장세포를 플레이트에 결합된 항-CD3ε (5 μg/ml, 145 - 2C11) 및 항-CD28 (2 μg/ml, 37.51) 항체 또는 항원성 펩티드(antigenic peptides)를 이용하여 자극하였다.

자극 후 24시간 되는 시점에, T-세포는 농축된 레트로바이러스를 이용하여 2500 rpm에서 90분간 원심분리하여 형질전환(스핀 감염, spin infection)시켰다. 이 과정은 같은 날 한 번 더 반복되었다. 스핀 감염을 수행하는 동안, 6 μg/ml의 폴리브렌(polybrene, 시그마사, Sigma)이 배양 상등액에 첨가되거나, 형질전환 효율을 높이기 위해 레트로넥틴(Retronectin)-코팅된 플레이트((15 μg/ml, 타카라사, Takara)에서 상기 과정이 수행되었다. 자극 후 48시간 되는 시점에, 형질전환된 T-세포는 30 unit/ml의 마우스 IL-2(인비트로젠사, Invitrogen)를 포함하는 신선한 배지(fresh medium)로 옮겨져서 부석 전에 48~72 시간 동안 방치되었다.

< 실시예 5> 사이토카인 ELISA , 세포 증식 및 세포 독성 분석(P- JAM 테스트)

세포 선별(cell-sorting)에 의해 분리된 GFP-양성 세포(2×10⁴/well)는 48 시간 동안 조사된 비장세포(irradiated splenocytes) (2×10⁵/well)의 존재 하에 다양한 농도의 항- CD3 항체 또는 항원 펩티드를 이용하여 자극되었다.

상청액(supernatant) 내의 사이토카인은 BD 바이오사이언스(BD Biosciences)의 ELISA 세트(ELISA Sets)를 이용하여 측정하였다.

세포 증식(cell proliferation) 측정을 위해 48 시간 동안 자극된 세포를 ³H-티미딘(Thymidine)을 이용하여 펄스(pulse)하여, 추가적으로 24시간 동안 자극하였다. 세포는 세포 하베스터를 이용하여 수거되어으며, 방사능활성(radioactivity)은 왈랏 트리룩스 1450 신틸레이션 카운터(Wallac Trilux 1450 scintillation counter)를 이용하여 측정되었다.

세포 독성 분석을 위해 형질전환된 Pmel-1 T-세포를 48 시간 조사 비장 세포의 존재하에 1 μM의 hgp100 펩티드를 이용하여 자극한 후, 다양한 활성화된 T-세포를 B16 세포(1×10⁴)와 함께 배양한 20시간 동안 공동 배양(co-culture)한 후, PBS로 세척하였다. 남은 B16 세포는 세포의 회수 및 방사능활성 측정 전에 6 시간 동안 ³H-티미딘(Thymidine)을 이용하여 펄스(pulse)하였다.

< 실시예 6> T-세포를 이용한 형질전환( Adoptive T- cell transfer )

B6 마우스에 0 일째 E.G7 세포 (1~2×10⁶) 또는 B16 세포 (1×10⁵)를 피하 주사했다. 레트로바이러스로 형질전환된 T-세포는 7일째에 마우스로 이입되었다. B16 흑색종 모델의 경우 T-세포가 이입되는 날에, 마우스를 골수 비형성 전신 조사(nonmyeloablative total body irradiation, TBI) (4 Gy)하여 림프구 고갈(lymphodepletion) 시켰다.

종양의 성장은 캘리퍼(caliper)를 사용하여 3~4일 간격으로 측정하였으며, 대략적인 크기(㎟)는 다음과 같이 계산되었다 : 길이 (mm) × 폭 (mm) × π.

종양의 크기가 500 ㎟를 초과하면 마우스를 안락사시켰다. 형질전환된 T-세포의 세포내 사이토카인 염색을 위해, 세포외(ex vivo)에서 활성화된 T-세포가 고정 및 관통(fixed and permeabilized) (BD cytofix/cytoperm 키트)된 후, PE-표지된 항-마우스 IL-2 또는 IFN-γ로 염색되었다.

<실험예 1> CTLA4 - CD28 키메라 단백질의 T-세포 활성화 효과

마우스 유래 CTLA4(서열번호 2 참조)의 세포내부 억제신호 전달 도메인(intracellular inhibitory signaling domain)가 제거된 CTLA4 돌연변이체(mutant)인 CTLA4 유인 수용체(CTLA decoy receptor) 및 CTLA4-CD28 키메라 단백질(서열번호 6 참조)을 발현하는 레트로바이러스성 유전자 구조체(retroviral construct)를 도 2(b)에 개시된 바와 같이 제작하였다.

도 2에서 EV는 아무 것도 삽입되지 않은 레트로바이러스 벡터인 pMIG-w를 의미하며, CTLA4-CD28 키메라(CTC28) 유전자와 CTLA4 유인 수용체(CTdc)의 cDNA는 pMIG-w의 IRES-GFP(녹색 형광 단백질) 카세트(cassette) 앞에 삽입되었다.

주르캇(Jurkat) T-세포를 CLTA4 유인 수용체 또는 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 포함하지 않는 빈 플라스미드와, CD28 반응부위(CD28 response element)를 함유하는 RE/AP 루시페라제 플라스미드로 형질전환시킨 후, 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극한 경우, 이전의 보고와 같이 항-CD3 항체 단독으로 자극한 경우에 비해 루시퍼라제 활성이 크게 증가함을 확인할 수 있었다(도 3(a) 참조). 이는 내생적(endogenous) CD28에 의한 신호전달이 잘 일어나고 있음을 입증해 주는 것이다.

유사하게 주르캇(Jurkat) T-세포를 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 포함하는 플라스미드와 RE/AP 루시페라제 플라스미드로 형질전환시킨 후, 항-CD3 및 항-CTLA4 항체로 자극한 경우, 역시 항-CD3 항체 단독으로 자극한 경우에 비해 루시퍼라제 활성이 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, CTLA4 유인체 수용체 유전자를 포함하는 경우에는 루시퍼라제 활성이 거의 증가하지 않음을 확인할 수 있었다(도 3(b) 참조).

또한, CTLA4 유인 유전자가 형질전환된 주르캇(Jurkat) 세포주에서는 Akt 인산화가 증가하지 않은 반면에, CTLA4-CD28 키메라를 주르캇 세포주에 형질전환한 후, 항-CTLA4항체로 자극을 한 경우, Akt 인산화는 증가함을 확인할 수 있었다(도 11 참조).

이는 CTLA4-CD28 키메라 단백질을 이용할 경우, CTLA4의 세포외 도메인에 리간드가 결합하더라도 실제로 세포내로는 CD28에 의한 활성화 신호가 전달되고 있음을 입증하는 것이다.

이러한 점은 T-세포 활성화 결과로도 입증되는데, 도 2(b)와 같이 GFP를 리포터로 사용하여 형질전환된 T-세포의 활성화를 측정한 결과, CTLA4 유인 유전자로 형질전환된 T-세포는 아무 처리도 하지 않은 경우에 비해서 떨어지는 분열능과 IFN-γ 분비능을 보이는 반면, CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T-세포는 정상적인 분열능과 훨씬 증가된 IFN-γ 분비능을 보이는 것으로 확인되었다(도 3(c) 및 도3(d) 참조).

또한, 비장 세포에 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 포함하지 않는 빈 플라스미드와, CD28 반응부위(CD28 response element)를 함유하는 GFP리포터 유전자를 갖는 플라스미드로 형질전환시킨 후, 항-CD28 및 항-CTLA4 항체로 염색하고, GFP 양성세포를 유세포 분류기를 이용해서 분석한 결과, CTLA4-CD28 키메라 발현 수준은 내생적 CTLA4 발현수준보다 더 높았다는 것을 확인하였다(도 12 참조).

또한, 상기와 같은 형질전환된 비장 T-세포에 항-CD3, 항-CD28 및 항-CTLA4 항체로 자극했을 때, CTLA4-CD28의 과발현은 항-CTLA4 항체의 IFN-γ 억제능을 감소시키는 것을 확인하였다.(도 13 참조).

이러한 점을 종합해보면, CTLA4-CD28 키메라 단백질은 리간드가 CTLA4의 세포외 도메인에 결합할 경우, 저해 신호(inhibitory signal)를 전달하지 않을 뿐 아니라, CTLA4-CD28 키메라 단백질의 CD28 세포내 도메인에 의한 활성화 신호(stimulatory signal)를 세포내로 전달함으로써 T-세포 활성화가 현저하게 증가하는 것으로 확인되었다.

<실험예 2> CTLA4 - CD28 키메라 유전자로 형질전환된 CD8 T-세포의 항암 능력

종양 항원 특이적인 T-세포의 CTLA4-CD28 키메라 유전자의 발현으로, T-세포의 항종양 활성이 강화될 수 있는지 확인하기 위하여, Pmel-1이라고 불리는 흑색종 항원 특이적(antigen-specific) TCR 형질전환 마우스로부터 유래된 CD8 T-세포(Pmel-1 T-세포)를 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 포함하는 레트로바이러스를 이용하여 형질전환시켰다. Pmel-1 T-세포는 동계(syngenic) B16 흑색종 세포 표면에 발현되는 종양 항원인 gp100을 특이적으로 인식한다.

그 결과, 형질전환된 Pmel-1 T-세포는 컨트롤에 비해서 높은 IFN-γ 분비능을 보이는 것으로 나타났지만(도 4(a) 참조), B16 세포에 대한 in-vitro 상에서의 세포용해활성(cytolytic activity)은 그다지 큰 향상을 보이지 않는 것으로 나타났다(도 4(b) 참조). 또한, CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 Pmel-1 T-세포는 림프구 고갈된 B16 종양-함유 마우스에 이입한 경우, 고용량의 IL-2와 병용 처리한 경우에도 큰 항 종양 효과의 향상을 보이지 않음을 확인할 수 있었다(도 4(c) 참조). 결론적으로, 실험예 1과는 다르게 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 Pmel-1 T-세포는 그 기능에 있어서 큰 향상을 나타내지는 않았다.

< 실험예 3> CTLA4 - CD28 키메라 유전자를 이용한 형질전환에 의한 항원 특이적 T-세포의 항원 반응성 변화

실험예 1과 실험예 2의 차이는 실험예 1의 경우는 정상 마우스로부터 분리된 T-세포는 CD4 및 CD8 T-세포가 혼합된 것인 반면, Pmel-1 T-세포는 CD8 T-세포만이 존재한다는 점이다. 따라서, CTLA4-CD28 키메라 유전자의 형질전환에 의해 CD4 및 CD8 T-세포의 종양 항원 특이적 반응(response)이 상이하게 조절되는지 확인할 필요가 있다.

동일한 항원에 대한 CD4 및 CD8 T-세포의 반응을 확인하기 위하여, 오발부민(ovalbumin : OVA)을 특이적으로 인식하는 TCR을 T-세포에서만 발현하도록 제작된 항-OVA TCR 형질전환 마우스를 도입하였다. 특히, CD4 및 CD8 T-세포의 반응을 나누어 볼 수 있도록 CD4 항-OVA TCR 형질전환 마우스(OT-II) 및 CD8 항-OVA TCR 형질전환 마우스(OT-I)로부터 각각 OVA 특이적 CD4 및 CD8 세포를 분리하여 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환시킨 후, OVA 항원에 의한 T-세포 활성화를 IL2 및 IFN-γ의 분비능을 통해 확인하였다.

OT-I 및 OT-II T-세포(OT-I 및 OT-II 유래의 T-세포)를 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 포함하는 레트로바이러스로 형질전환시킨 후, 사이토카인의 생산능력을 측정하기 위해 항원제시세포(antigen presenting cell : APC) 존재 하에 OVA로 자극하였다. 본 발명에서 OT-1 CTC28 또는 OT-II CTC28은 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 OT-1 T-세포 또는 OT-II T-세포를 의미한다.

그 결과, CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용한 형질전환에 의해 OT-I(도 5(d) 참조) 및 OT-II T-세포(도 5(b) 참조) 모두 IFN-γ의 생산능력이 향상되었음을 확인할 수 있었다.

또한 IL-2의 생산능력은 OT-II T-세포의 경우는 IL-2 생산을 컨트롤과 비교하여 10~20 배 가량 크게 증가했지만(도 5(a) 참조), OT-I T-세포의 경우는 약간의 상승만이 확인되었다(도 5(c) 참조). 즉, CD4 T-세포 반응은 특히 IL-2 생산능력의 측면에서 CD8 T-세포에 비해 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용한 형질전환에 의한 영향이 큰 것으로 확인되었다.

< 실험예 4> CTLA4 - CD28 키메라 유전자의 CD4 및 CD8 T-세포로의 동시 형질전환에 의한 T-세포의 항종양 효과

CD4 T-세포가 CD8 T-세포의 항 종양 효과에 필요하다는 점은 잘 알려져 있다. 따라서 종양 항원에 대한 강화된 CD4의 반응은 종양 항원 특이적 CD8 T-세포의 항 종양 효과를 배가할 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명자들은 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 CD4 T-세포가 CD8 T-세포의 항암 효능을 증가시킬 수 있는지를 실험예 3에 따른 OT-I 및 OT-II T-세포를 이용하여 시험하였다. 이를 위해 OVA를 모델 종양 항원으로, OVA cDNA로 형질전환된 동계(syngenic) EL4 림프종 세포주(E.G7)를 종양 모델로 선정하였다(도 6 참조).

CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 OT-II T-세포를 E.G7를 포함하는 마우스에 이입한 결과, 별다른 종양 치료효과를 나타내지 않음을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

하지만, OT-I T-세포와 조합할 경우, 그 효과는 달라지는 것을 확인할 수 있었는데, OT-I T-세포 단독으로 사용한 경우에도 다소 효과는 보였지만, CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 OT-II T-세포와 병용할 경우 항 종양 효과가 급격하게 증가되는 것으로 나타났으며, 그 증가 정도는 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 OT-II T-세포의 농도에 비례하는 것으로 나타났다(도 8 (a) 내지 도 8(c), 도 14 참조).

특히 OT-I T-세포와 형질전환된 OT-II T-세포가 2:2로 사용된 경우에는 15일 경과 후에 종양이 완전히 사라지는 것으로 나타났으며, 2:1로 사용된 경우에는 15일 경과 후에 종양이 거의 없어졌지만, 다시 종양 부피가 다소 증가하는 것으로 확인되었다.

상기 실험에서 종양 크기는 그룹마다 적어도 5 마리의 마우스의 종양 크기의 평균을 기록하였으며(^* : p = 0.0391, ^** : p = 0.0078, ^*** : p = 0.0078, 윌콕슨 부합-페어 테스트, Wilcoxon matched pair test), 도 7 및 도 8에서 제시된 결과는 적어도 2 개의 독립적인 실험 결과를 나타낸다.

CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용한 형질전환이 CD4 T-세포보다는 덜 효과적이기는 하지만 CD8 T-세포의 항원반응성 역시 증가시킴을 상기 실험예를 통해 확인할 수 있었으므로, CD4 및 CD8 T-세포를 동시에 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환 시킴으로써 항 종양 효과를 극대화할 수 있는가를 확인하기 위하여, OT-II T-세포와 OT-I T-세포 모두를 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환시킨 후, E.G7 종양을 가진 마우스(도 6 참조)에 주사하였을 때, OT-II에만 형질전환시킨 경우에 비해, 훨씬 강력한 항 종양효과를 보임을 확인할 수 있었다(도 9 참조).

상기 실험에서 종양 크기는 그룹마다 적어도 5 마리의 마우스의 종양 크기의 평균을 기록하였으며(^* : p = 0.0029, 윌콕슨 부합-페어 테스트, Wilcoxon matched pair test), 도 9에서 제시된 결과는 적어도 3 개의 독립적인 실험 결과를 나타낸다.

E.G7 종양을 가진 마우스에서 유전자 형질 전환된 T-세포의 활성을 실험하기 위해서, 유전자 형질 전환된 OT-I 및 OT-II T-세포를 주입한 마우스로부터 비장 세포(splenocytes)를 분리했고, 오발부민(ovalbumin;OVA) 펩티드를 가지고 생체 외에서 상기 T-세포들을 자극했다. 새포 내 사이토카인 염색(intracellular cytokine staining)에 의해서 분석했을 때 유전자 형질 전환된 OT-II T-세포는 대조군 OT-II T-세포들보다 IL-2 및 IFN-γ 생산 세포들이 훨씬 높은 비율이었다(도 15(a) 참조). 게다가, 유전자 형질 전환된 OT-II T-세포의 전체 수는 대조군 OT-II T-세포와 비교해서 증가되었다(도 15(b) 참조). OT-I T-세포와 함께, 비장에서 형질 전환된 OT-I T-세포의 비율은 새포 내 사이토카인 염색 분석에 필요한 값(0.1%이상)보다 너무 낮았다. 그 결과, 본 발명은 전체 CD8 T-세포를 분리한 후, 동일한 수의 유전자 형질전환된 OT-I 및 빈 벡터로 형질전환된 OT-I T-세포를 시험관 내(in vitro)에서 오발부민 펩티드 및 항원제시세포(APCs)와 함께 배양하여 자극했다. 그리고 본 발명은 ELISA에 의해서 IFN-γ 분비를 측정했다. 또다시, 유전자 형질 전환된 OT-I T-세포는 빈 벡터로 형질 전환된 OT-I T-세포보다 많은 양의 IFN-γ 생산했다(도 15(c) 참조). 그래서 유전자 형질 전환된 OT-I 및 OT-II T-세포는 종양을 가진 마우스에 투여된 이후에도 그 증가된 활성을 유지함을 알 수 있었다.

< 실험예 5> 흑색종 모델에서의 CTLA4 - CD28 키메라 유전자로 형질전환된 종양 항원 특이적 T-세포의 항종양효과

실험예 4에서의 모델은 OVA라는 인위적인 종양 항원에 대해서 항종양 효과를 시험한 것이므로, CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 CD4 및 CD8 T 세포를 이용하여 실제 종양항원을 함유하는 모델에서의 항 종양 효과를 시험하는 것이 필요하다.

B16 흑색종은 적합한 모델 종양의 하나인데, 이는 Pmel-1 CD8 T-세포가 특이적으로 인식할 수 있는 내재적(endogeneous) gp100 항원을 가지고 있기 때문이다.

하지만, B16 종양은 좋지 않은 면역원성(immnugenecity)을 가지고 있으며, T-세포 면역요법에 저항성을 가지고 있다고 알려져 있으며, 본 발명에서의 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 Pmel-1 T-세포를 사용한 경우에도 항 종양 효과의 향상은 크지 않았지만(실험예 2 참조), 다클론 CD4 T-세포의 첨가를 통해 Pmel-1 T-세포를 이용한 T-세포 면역요법이 효과가 있을 수 있다는 보고가 있다.

본 실험에서는 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 Pmel-1 T-세포와 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 다클론 CD4 T-세포를 함께 사용할 경우 항 종양 효과가 증가될 수 있는지를 시험하였다.

B6 마우스에 B16 흑색종 세포를 피하주사하고 7일 후, 5 Gy의 전신 방사선조사를 통해 림프구 고갈(lymphocyte depletion)과정을 거친 후, 형질전환 마우스(transgenic mice)로부터 분리한 흑색종 특이적 CD8 T-세포인 Pmel-1 T-세포를 정맥주사하고 종양의 부피 감소 정도를 관찰하였다.

또한, CD4 T-세포와의 병합치료를 위하여서는 B6 마우스로부터 분리한 다클론 CD4 T세포(조절 T-세포가 제거된 CD4⁺CD25^- 집단)를 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환시켜, Pmel-1 T-세포와 병행 치료에 이용하였다.

그 결과, CD4 T-세포 및 Pmel-1 T-세포 모두를 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환시키고, B16 종양을 함유하는 B6 마우스에 정맥주사할 경우, 형질전환되지 않은 CD4 T-세포 및 Pmel-1 T-세포를 사용할 경우에 비해 훨씬 강력한 항종양 효과를 보인다는 점을 종양 크기 및 생존율 측정을 통해 확인하였다(도 10(a) 및 도 10(b) 참조). 또한 이러한 항종양 효과는 말초혈액내의 CD4 T-세포 및 Pmel-1 T-세포의 비율 및 절대수의 증가와 밀접하게 관련되어 있음을 확인하였다(도 16 (a) 내지 (d) 참조). CTLA4-CD28 키메라의 CD4 T-세포의 증식효과는 CD8 T-세포에서 보다 크게 나타났다(8.6배 vs 3.7배;도 16(c) 내지 (d) 참조). 본 발명에서 CD4 T-세포 단독의 유전자 형질전환이 Pmel-1 T세포의 항암 효과를 증가시킬 수 있는지를 점검했다. 기대했던 것과 같이, 유전자 형질 전환된 CD4 T-세포는 종양의 증식을 크게 억제했다. Pmel-1 T-세포의 추가적인 유전자 형질 전환은 종양의 성장을 더욱 억제했다(도 17 참조). 따라서, CD4 및 CD8 T-세포 모두를 형질전환하는 것이 항종양효과를 극대화 시킬수 있음을 알 수 있었다. 마지막으로, CTLA4-CD28 형질 전환이 CD4 T-세포에서 IL-2 분비를 유의적으로 증가되었기 때문에(도 5(a) 참조), 본 발명은 생체 내에서 유전자 형질 전환된 T-세포의 치료 효과에 IL-2가 필요한지 의문을 가졌다. 예상대로, 생체 내 항-IL-2 중화 항체 처리에 의해, 유전자 형질 전환의 치료 효과가 거의 없어짐이 확인되었다(도 18 참조). 결론적으로, 이러한 결과들은, 이미 크게 성장하였고(pre-established), 면역원성이 약한 종양을 CTLA4-CD28 유전자 형질 전환된 CD4 및 CD8 T-세포를 이용한 선택적 세포치료(adoptive transfer therapy)에 의해서 효과적으로 억제할 수 있고, 이 치료효과에 IL-2가 중요하게 기여함을 보여주었다.

본 발명에서 Pmel-1 EV는 형질전환되지 않은 Pmel-1 T-세포, CD4 EV는 형질전환되지 않은 CD4, Pmel-1 CTC28은 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 Pmel-1 T-세포를 의미하며, CD4 CTC28는 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 CD4 T-세포를 의미한다.

결론적으로, CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 T-세포를 이용한 T-세포 면역요법은 CD4 및 CD8 T-세포의 병합요법에서 항종양 효과의 큰 증가를 유발하였으며, 이는 CTLA4 수용체를 통한 T-세포 면역관용을 회피함으로써 항암 T-세포 면역요법의 효능이 크게 증가될 수 있음을 증명한 것이다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Mutant CTLA4 gene modified T-cell and composition for anticancer immunotherapy comprising thereof <130> 12p-10-37 <150> KR10-2011-0109729 <151> 2011-10-26 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220 <210> 2 <211> 223 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro 1 5 10 15 Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His 50 55 60 Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln 65 70 75 80 Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly 85 90 95 Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met 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110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 180 185 190 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 195 200 205 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 210 215 220 <210> 4 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gln 1 5 10 15 Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Leu Leu Val Val 20 25 30 Asp Ser Asn Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu 35 40 45 Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val 50 55 60 Glu Val Cys Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gln Pro Gln Phe Arg 65 70 75 80 Ser Asn Ala Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn 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Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Val Arg Ser 180 185 190 Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg 195 200 205 Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg 210 215 220 Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 225 230 <210> 6 <211> 231 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro 1 5 10 15 Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His 50 55 60 Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln 65 70 75 80 Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly 85 90 95 Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Thr Asn Ser 180 185 190 Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg 195 200 205 Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg 210 215 220 Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 225 230 <210> 7 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln 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215 220 Ala Ala Tyr Arg Ser 225 <210> 8 <211> 241 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp 20 25 30 Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met 50 55 60 Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala 65 70 75 80 Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln 85 90 95 Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp 100 105 110 Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val 130 135 140 Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala 165 170 175 Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val 180 185 190 Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu 195 200 205 Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg 210 215 220 Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg 225 230 235 240 Pro <210> 9 <211> 567 <212> DNA <213> murine <400> 9 atggcttgtc ttggactccg gaggtacaaa gctcaactgc agctgccttc taggacttgg 60 ccttttgtag ccctgctcac tcttcttttc atcccagtct tctctgaagc catacaggtg 120 acccaacctt cagtggtgtt ggctagcagc catggtgtcg ccagctttcc atgtgaatat 180 tcaccatcac acaacactga tgaggtccgg gtgactgtgc tgcggcagac aaatgaccaa 240 atgactgagg tctgtgccac gacattcaca gagaagaata cagtgggctt cctagattac 300 cccttctgca gtggtacctt taatgaaagc agagtgaacc tcaccatcca aggactgaga 360 gctgttgaca cgggactgta cctctgcaag gtggaactca tgtacccacc gccatacttt 420 gtgggcatgg gcaacgggac gcagatttat gtcattgatc cagaaccatg cccggattct 480 gacttcctcc tttggatcct tgtcgcagtt agcttggggt tgttttttta cagtttcctg 540 gtcactgctg tttctttgag caagatg 567 <210> 10 <211> 129 <212> DNA <213> murine <400> 10 acaaatagta gaaggaacag actccttcaa agtgactaca tgaacatgac tccccggagg 60 cctgggctca ctcgaaagcc ttaccagccc tacgcccctg ccagagactt tgcagcgtac 120 cgcccctga 129

Claims

T-세포 표면 면역 관용 유도 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 제거하고, T-세포 활성화 표면 단백질 CD28의 세포 내 신호전달 도메인을 융합시킨 융합단백질.
제 1항에 있어서, T-세포 표면 면역 관용 유도 수용체와 T-세포 활성화 표면 단백질 CD28 융합단백질은 T-세포 표면 관용 유도 수용체 또는 CD28의 막횡단 도메인에 의해 융합되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 1항에 있어서, T-세포 표면 관용 유도 수용체는 CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein 4, T-Lymphocyte Antigen 4) 또는 PD1인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 1항에 있어서, 융합단백질은 CTLA4의 세포외 도메인-CTLA4의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인 또는 CTLA4의 세포 외 도메인-CD28의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인으로 구성된 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 1항에 있어서, 융합단백질은 PD1의 세포외 도메인-PD1의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인 또는 PD-1의 세포 외 도메인-CD28의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인으로 구성된 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 3항에 있어서, CTLA4는 인간 유래 서열번호 1 또는 마우스 유래 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 1항에 있어서, CD28은 인간 유래 서열번호 3 또는 마우스 유래 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 6항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 세포외 도메인은 1 내지 161번째까지 아미노산 서열이고, 세포막 도메인은 162 내지 189번째까지의 아미노산 서열이고, 세포 내 도메인은 190 내지 223번까지의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 7항에 있어서, 세포외 도메인은 서열번호 3의 1 내지 152번째까지 아미노산 서열이거나, 서열번호 4의 1 내지 150번째까지 아미노산 서열이고, 세포막 도메인은 서열번호 3의 153 내지 178번째가지의 아미노산 서열이거나,서열번호 4의 151 내지 176번째까지 아미노산 서열이고, 세포 내 도메인은 서열번호 3의 179 내지 220번까지의 아미노산 서열이거나 서열번호 4의 177 내지 218번째까지 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제4항에 있어서, CTLA4의 세포 외 도메인-CTLA4의 막횡단 도메인-CD28의 세포내 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제4항에 있어서, CTLA4의 세포 외 도메인-CD28의 세포막 도메인-CD28의 세포내 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 5항에 있어서, PD1의 세포외 도메인-PD1의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인 또는 PD-1의 세포 외 도메인-CD28의 막횡단 도메인-CD28의 세포 내 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 1항 내지 제 12항의 어느 한 항에 따른 융합단백질을 코딩하는 유전자.
제 13항에 있어서, CTLA4의 세포 도메인-CTLA4의 막횡단 도메인은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 융합단백질을 코딩하는 유전자.
제 13항에 있어서, CD28 세포 내 도메인은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 융합단백질을 코딩하는 유전자.
제 13항의 유전자를 포함하는 바이러스 또는 비바이러스성 담체.
제 16항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이러스 또는 비바이러스성 담체.
제 16항의 바이러스 또는 비바이러스성 담체를 이용하여 형질전환(transduction)된 T-세포.
제 18항에 있어서, 상기 T-세포는 암 항원 특이적 CD4 T-세포, CD8 T-세포 또는 CD4 T-세포 및 CD8 T-세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 T-세포.
제18항에 있어서, 상기 T-세포는 암 항원 특이적 T-세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 T-세포.
제 20항에 있어서, 상기 암 항원 특이적 T-세포는 환자의 암 조직으로부터 분리한 T-세포, 암 항원 특이적으로 인지하는 수용체 유전자로 형질전환된 T-세포 및 CAR(Chimeric Antigen Receptor)유전자로 형질전환된 T-세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 T-세포.
제 20항에 있어서, 암 항원은 MUC1, CD19, HER2, EGFR, CD20, CEA, PSMA, GD2, 폴레이트 수용체(Folate receptor), IL-13Rα2, Lewis-Y 항원(antigen), NY-ESO-1, MART-1, gp100, 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제-연관 단백질(tyrosinase-related proteins), MAGE 및 WT-1 로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환된 T-세포.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 T-세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
제 23항에 있어서, 상기 형질전환된 T-세포는 암 항원 특이적 CD4 T-세포, CD8 T-세포 또는 CD4 T-세포 및 CD8 T-세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
제 16항의 바이러스 또는 비바이러스성 담체를 이용하여 T-세포를 형질 전환 시키는 단계를 포함하는 제 18항의 형질 전환된 T-세포의 제조 방법.