JP2024010065A - 二重特異性チェックポイント阻害剤抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】2つの異なるチェックポイント細胞表面受容体に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。【解決手段】PD-1およびCTLA-4、PD-1およびTIM-3、PD-1およびLAG-3、PD-1およびTIGIT、PD-1およびBTLA、CTLA-4およびTIM-3、CTLA-4およびLAG-3、CTLA-4およびTIGIT、CTLA-4およびBTLA、TIM-3およびLAG-3、TIM-3およびTIGIT、TIM-3およびBTLA、LAG-3およびTIGIT、LAG-3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAに結合する抗体などを開示する。【選択図】図1A-E
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関連出願の相互参照
本出願は、2016年6月14日出願の米国仮特許出願第62/350,145号、2016年6月22日出願の同第62/353,511号、および2016年11月10日出願の同第.62/420,500号の優先権を主張するものであり、これらの内容は、それらの全体が本明細書に参照により明示的かつ完全に組み込まれる。
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本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、その全体が本明細書に参照により組み込まれる配列表を含む。2017年6月9日作成のこのASCIIの複製は、067461_5191WO_SL.txtという名前であり、サイズは、32,442,145キロバイトである。
本出願は、2016年6月14日出願の米国仮特許出願第62/350,145号、2016年6月22日出願の同第62/353,511号、および2016年11月10日出願の同第.62/420,500号の優先権を主張するものであり、これらの内容は、それらの全体が本明細書に参照により明示的かつ完全に組み込まれる。
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本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、その全体が本明細書に参照により組み込まれる配列表を含む。2017年6月9日作成のこのASCIIの複製は、067461_5191WO_SL.txtという名前であり、サイズは、32,442,145キロバイトである。
CTLA-4、PD-1(プログラム細胞死1)、TIM-3(T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン3)、LAG-3(リンパ球活性化遺伝子3)、TIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体)などのチェックポイント受容体は、T細胞および他の細胞型の活性化、増殖、および/またはエフェクター活性を阻害する。チェックポイント受容体が、腫瘍細胞に対する内因性T細胞応答を抑制するという仮説に導かれて、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、およびトレメリムマブを含む抗CTLA4および抗PD1抗体の前臨床研究および臨床研究では、確かに、様々な悪性腫瘍を有するごく一部の患者において、チェックポイント遮断により、優れた抗腫瘍応答がもたらされ、内因性T細胞が刺激されて腫瘍細胞が攻撃され、長期の癌の寛解がもたらされることが示された。残念ながら、患者の一部のみがこれらの療法への応答を示し、その応答率は、適応症および他の要因に応じて、通常、10~30%の範囲であり、各単剤療法に関してはそれよりも高いときもある。これらの作用剤の治療的組み合わせ、例えば、イピリムマブにニボルマブを加えた組み合わせは、場合によっては60%近くの、さらにより高い応答率をもたらす。前臨床研究では、抗PD-1抗体および/または抗CTLA-4抗体と、LAG-3、TIM-3、BTLA、およびTIGITを含む、最近になって同定されたチェックポイント受容体の遮断との間の付加的相乗効果が示された。複数のチェックポイント遮断の潜在能力が極めて有望である一方で、そのような作用剤との組み合わせ療法では、重い経済的負担を背負うことが求められる。さらに、組み合わせ療法、例えば、ニボルマブにイピリムマブを加えた療法の自己免疫毒性は、単剤療法と比較して大幅に上昇し、多くの患者を療法の停止へと至らしめる。
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を調査したいくつかの研究(Ahmadzadeh et
al.,Blood114:1537(2009)、Matsuzaki et al.,PNAS 107(17):7875-7880(2010)、Fourcade et al.,Cancer Res.72(4):887-896(2012)、およびGros et al.,J.Clinical Invest.124(5):2246(2014))では、TILは一般的に複数のチェックポイント受容体を発現することが示された。さらに、複数のチェックポイントを発現するTILは、おそらく、実際に最も腫瘍応答性であろう。これとは対象的に、末梢にある非腫瘍応答性T細胞は、単一のチェックポイントを発現する可能性が高い。単一特異性の完全長抗体を用いたチェックポイント遮断は、自己免疫毒性に寄与すると思われる自己抗原応答性の単一発現T細胞に対する腫瘍応答性TILの抑制解除に関して、おそらく、無差別的である。
al.,Blood114:1537(2009)、Matsuzaki et al.,PNAS 107(17):7875-7880(2010)、Fourcade et al.,Cancer Res.72(4):887-896(2012)、およびGros et al.,J.Clinical Invest.124(5):2246(2014))では、TILは一般的に複数のチェックポイント受容体を発現することが示された。さらに、複数のチェックポイントを発現するTILは、おそらく、実際に最も腫瘍応答性であろう。これとは対象的に、末梢にある非腫瘍応答性T細胞は、単一のチェックポイントを発現する可能性が高い。単一特異性の完全長抗体を用いたチェックポイント遮断は、自己免疫毒性に寄与すると思われる自己抗原応答性の単一発現T細胞に対する腫瘍応答性TILの抑制解除に関して、おそらく、無差別的である。
したがって、本発明は、2つの異なるチェックポイント阻害剤タンパク質に結合する二重特異性抗体を対象とするものである。
本発明は、ヒトPD-1、ヒトCTLA-4、ヒトTIM-3、ヒトLAG-3、およびヒトTIGITなどの2つの異なるチェックポイント細胞表面受容体に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。したがって、いくつかの態様では、好適な二重特異性抗体は、PD-1およびCTLA-4、PD-1およびTIM-3、PD-1およびLAG-3、PD-1およびTIGIT、PD-1およびBTLA、CTLA-4およびTIM-3、CTLA-4およびLAG-3、CTLA-4およびTIGIT、CTLA-4およびBTLA、TIM-3およびLAG-3、TIM-3およびTIGIT、TIM-3およびBTLA、LAG-3およびTIGIT、LAG-3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAに結合する。
一態様では、本発明は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)を使用して連結された可変重ドメインおよび可変軽ドメインを有するscFv、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kを含むFcドメイン、ならびに本明細書で概説するチェックポイント受容体に結合するFvを含む第1の単量体(時として「scFv重鎖」と称される「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kを有するFcドメイン、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント受容体に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」または「重鎖」)と、c)軽鎖と、を含む。この特定の実施形態では、好適な単量体Fvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3、LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLAが挙げられる。
本発明の他の態様を、本明細書に提供する。
A.資料の組み込み
1.図および凡例
米国特許出願第62,350,145号、同第62/353,511号、および同第62/420,500号のすべての図およびそれに付随する凡例は、特に本明細書に示されるアミノ酸配列に関して、その全体が本明細書に参照により明示的かつ独立して組み込まれる。
1.図および凡例
米国特許出願第62,350,145号、同第62/353,511号、および同第62/420,500号のすべての図およびそれに付随する凡例は、特に本明細書に示されるアミノ酸配列に関して、その全体が本明細書に参照により明示的かつ独立して組み込まれる。
2.配列
添付の配列表に関して、以下の通り説明する:ABDとして使用するのに好適な抗PD-1配列としては、配列番号6209~11464(PD-1scのFv配列ではあるが、それらの中のFv配列は、Fabの形式になっている場合がある)、配列番号11465~17134(PD-1のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号33003~33072(追加のPD-1のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号33073~35394(追加のPD-1のscFv配列ではあるが、それらの中のFv配列は、Fabの形式になっている場合がある)、および配列番号36127~36146(PD-1の二価の構築物、これらは、scFvまたはFabのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗CTLA-4の配列としては、配列番号21~2918(CTLA-4のscFv配列ではあるが、それらの中のFv配列は、Fabの形式になっている場合がある)、配列番号2919~6208(CTLA-4のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号36739~36818(追加のCTLA-4のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号35395~35416(CTLA-4の片腕構築物、これらは、FabまたはscFvのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗LAG-3の配列としては、配列番号17135~20764(LAG-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号36819~36962(追加のLAG-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号35417~35606(追加のLAG-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号25194~32793(追加のLAG-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号32794~33002(片腕LAG-3の構築物、これらはFabまたはscFvのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗TIM-3の配列としては、配列番号20765~20884(TIM-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号37587~37698(追加のTIM-3のFab、Fv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号36347~36706(二価のTIM-3の構築物、これらは、FabまたはscFvのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗BTLAの配列としては、配列番号20885~21503(BTLAのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号36707~36738(追加のBTLAのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗TIGITの配列としては、配列番号21504~21523(TIGITのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号37435~37586(追加のTIGITのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)が挙げられる。
添付の配列表に関して、以下の通り説明する:ABDとして使用するのに好適な抗PD-1配列としては、配列番号6209~11464(PD-1scのFv配列ではあるが、それらの中のFv配列は、Fabの形式になっている場合がある)、配列番号11465~17134(PD-1のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号33003~33072(追加のPD-1のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号33073~35394(追加のPD-1のscFv配列ではあるが、それらの中のFv配列は、Fabの形式になっている場合がある)、および配列番号36127~36146(PD-1の二価の構築物、これらは、scFvまたはFabのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗CTLA-4の配列としては、配列番号21~2918(CTLA-4のscFv配列ではあるが、それらの中のFv配列は、Fabの形式になっている場合がある)、配列番号2919~6208(CTLA-4のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号36739~36818(追加のCTLA-4のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号35395~35416(CTLA-4の片腕構築物、これらは、FabまたはscFvのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗LAG-3の配列としては、配列番号17135~20764(LAG-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号36819~36962(追加のLAG-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号35417~35606(追加のLAG-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号25194~32793(追加のLAG-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号32794~33002(片腕LAG-3の構築物、これらはFabまたはscFvのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗TIM-3の配列としては、配列番号20765~20884(TIM-3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号37587~37698(追加のTIM-3のFab、Fv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号36347~36706(二価のTIM-3の構築物、これらは、FabまたはscFvのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗BTLAの配列としては、配列番号20885~21503(BTLAのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号36707~36738(追加のBTLAのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗TIGITの配列としては、配列番号21504~21523(TIGITのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号37435~37586(追加のTIGITのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)が挙げられる。
本発明の二重特異性抗体には、配列番号35607~35866および配列番号21524~22620のLAG3とCTLA4との構築物が含まれる。PD-1とCTLA4との構築物には、配列番号36167~36346および配列番号23316~2373
5としてリストに記載されるものが含まれる。PD-1とTIM3との構築物には、配列番号25174~25193としてリストに記載されるものが含まれる。PD-1とLAG3との構築物には、配列番号35867~36126および配列番号23736~25133としてリストに記載されるものが含まれる。PD-1とTIGITとの構築物には、配列番号25134~25173としてリストに記載されるものが含まれる。PD-1とBTLAとの構築物には、配列番号22724~23315および配列番号36147~36166としてリストに記載されるものが含まれる。CTLA4とBTLAとの構築物には、配列番号22624~22723としてリストに記載されるものが含まれる。最後に、XENP23552、XENP22841、XENP22842、XENP22843、XENP22844、XENP22845、XENP22846、XENP22847、XENP22848、XENP22849、XENP22850、XENP22851、XENP22852、XENP22858、XENP22854、XENP22855の名前はすべて、不注意に省かれた「M428L/N434S」の表示をタイトルに含むべきであった。
5としてリストに記載されるものが含まれる。PD-1とTIM3との構築物には、配列番号25174~25193としてリストに記載されるものが含まれる。PD-1とLAG3との構築物には、配列番号35867~36126および配列番号23736~25133としてリストに記載されるものが含まれる。PD-1とTIGITとの構築物には、配列番号25134~25173としてリストに記載されるものが含まれる。PD-1とBTLAとの構築物には、配列番号22724~23315および配列番号36147~36166としてリストに記載されるものが含まれる。CTLA4とBTLAとの構築物には、配列番号22624~22723としてリストに記載されるものが含まれる。最後に、XENP23552、XENP22841、XENP22842、XENP22843、XENP22844、XENP22845、XENP22846、XENP22847、XENP22848、XENP22849、XENP22850、XENP22851、XENP22852、XENP22858、XENP22854、XENP22855の名前はすべて、不注意に省かれた「M428L/N434S」の表示をタイトルに含むべきであった。
B.概要
PD-1などの免疫チェックポイント阻害剤に向けられる治療抗体は、癌治療の限定された状況では、大いに期待できる。癌は、患者が癌性細胞を認識し、排除することができないとみなされ得る。多くの事例において、これらの形質転換(例えば、癌性)細胞は、免疫監視を弱める。制御されていないT細胞活性を防止するために、体内でT細胞の活性化を制限する天然制御機構があり、これは、免疫応答を回避または抑制するために、癌性細胞によって利用され得る。癌を認識および排除するために、免疫エフェクター細胞、特にT細胞の能力を回復させることが、免疫療法の目標である。時折「免疫療法」と称される免疫腫瘍学の分野は、Yervoy、Keytruda、およびOpdivoなどのT細胞チェックポイント阻害抗体のいくつかの最近の承認により、急速に展開している。これらの抗体は一般に、T細胞免疫の負の制御因子を遮断するため、「チェックポイント阻害物質」と称される。一般に、共刺激および共阻害性の両方の様々な免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を調整することができることが理解されている。
PD-1などの免疫チェックポイント阻害剤に向けられる治療抗体は、癌治療の限定された状況では、大いに期待できる。癌は、患者が癌性細胞を認識し、排除することができないとみなされ得る。多くの事例において、これらの形質転換(例えば、癌性)細胞は、免疫監視を弱める。制御されていないT細胞活性を防止するために、体内でT細胞の活性化を制限する天然制御機構があり、これは、免疫応答を回避または抑制するために、癌性細胞によって利用され得る。癌を認識および排除するために、免疫エフェクター細胞、特にT細胞の能力を回復させることが、免疫療法の目標である。時折「免疫療法」と称される免疫腫瘍学の分野は、Yervoy、Keytruda、およびOpdivoなどのT細胞チェックポイント阻害抗体のいくつかの最近の承認により、急速に展開している。これらの抗体は一般に、T細胞免疫の負の制御因子を遮断するため、「チェックポイント阻害物質」と称される。一般に、共刺激および共阻害性の両方の様々な免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を調整することができることが理解されている。
一般に、これらのモノクローナル抗体は、CTLA-4およびPD-1等のチェックポイント阻害タンパク質に結合し、これにより、通常の状況であれば、細胞傷害性T細胞(CTL)の活性化が予防または抑制される。例えば、これらのタンパク質に結合する抗体の使用によりチェックポイントタンパク質を阻害することによって、腫瘍に対するT細胞応答の増加が達成され得る。すなわち、これらの癌チェックポイントタンパク質は、免疫応答を抑制し、例えば、チェックポイントタンパク質に対して抗体を使用して、これらのタンパク質が遮断されたとき、免疫系が活性化され、癌および感染性疾患などの病態の治療をもたらす。
しかしながら、上述のように、TILは一般的に複数のチェックポイント受容体を発現することが研究により明らかになっており、これは、単一のチェックポイント遮断では、完全なT細胞応答を促進するのに十分ではないことを示唆している可能性がある。さらに、複数のチェックポイントを発現するTILは、実際には、最も腫瘍反応性である可能性が高く、したがって、2つ以上のチェックポイント抗原を塞ぐ療法が非常に有用であり得ることを示唆するものである。
したがって、本発明は、2つの抗原を発現する細胞に結合する二重特異性チェックポイント抗体と、T細胞および/またはNK細胞を活性化させて、癌および感染性疾患などの疾患、または免疫活性を高めることによって治療される他の病態を治療する方法と、を提供する。
したがって、本発明は、場合によっては、単一細胞上で2つの異なるチェックポイント阻害剤分子に結合する二重特異性抗体を提供し、有利に1つの治療物質のみの投与を必要とすることにより、毒性の問題および複数の抗体投与の費用を解決することを対象とする。
2つの異なる標的を同時に結合することができる二重特異性抗体は、TIL対末梢T細胞標的の選択性を改善する可能性を提供し、一方で療法の費用も低減する。細胞表面上の2つの標的との抗体の二価相互作用は、場合によっては、一度に1つの標的との一価相互作用に対してより高い結合力をもたらすはずである。このため、通常の二価抗体は、細胞表面上のそれらの標的に高い結合力を有する傾向がある。二重特異性抗体では、両方の標的への同時結合によって得られるより高い結合力を利用して、2つの異なる標的を同時に発現する細胞に対してより高い選択性を創出する可能性がある。
したがって、本発明は、例えば、二重特異性結合を可能にするために、2つ以上のチェックポイント抗原またはリガンドへの結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規構築物を対象とする。したがって、例えば、抗PD1x抗CTLA4(PD1×CTLA4)二重特異性抗体は、PD1+CTLA4+二重陽性TIL対単一陽性PD1のみまたはCTLA4のみT細胞により選択的であると予想される。したがって、二重陽性TIL対単一陽性T細胞の選択的遮断は、組み合わされたチェックポイント遮断の治療指数を改善することが予想される。これは、本明細書に概説されるように、他の可能な組み合わせに関して同様に当てはまる。したがって、本発明の好適な二重特異性抗体は、PD-1およびCTLA-4、PD-1およびTIM-3、PD-1およびLAG-3、PD-1およびTIGIT、PD-1およびBTLA、CTLA-4およびTIM-3、CTLA-4およびLAG-3、CTLA-4およびTIGIT、CTLA-4およびBTLA、TIM-3およびLAG-3、TIM-3およびTIGIT、TIM-3およびBTLA、LAG-3およびTIGIT、LAG-3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAに結合する。一般に、これらの二重特異性抗体は、各対について、「抗PD-1X抗CTLA-4」、または一般に単純化して、または簡単にするために(よって互換的に)、「PD-1XCTLA-4」等と命名されることに留意する。
本発明のヘテロ二量体二重特異性チェックポイント抗体は、様々な種類の癌を治療するのに有用である。当業者に理解されるように、腫瘍抗原に結合する従来のモノクローナル抗体、または例えばCD3および腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体のより新しいクラス(例えば、USSN15/141,350に記載されるような)とは対照的に、チェックポイント抗体は、免疫応答を高めるために使用されるが、一般に、それらの作用において腫瘍特異的ではない。すなわち、本発明の二重特異性チェックポイント抗体は、免疫系の抑制を阻害し、一般にT細胞活性化につながり、これはがん性細胞に対するより大きな免疫応答、したがって、治療につながる。.したがって、そのような抗体は、多種多様な腫瘍型の治療のための有用性を見出すことが予想され得る。例えば、FDAは、腫瘍型ではなく遺伝子特徴に基づいた抗PD-1単一特異性抗体であるKeytruda(登録商標)を最近認可した。
以下で論じるように、T細胞活性化を測定することができる様々な方法がある。NKおよびT細胞に対する二重特異性チェックポイント抗体の機能効果は、次のパラメータ:増殖、サイトカイン放出、および細胞表面マーカーの変化を測定することによって、インビトロで(および以下により完全に記載されるように、場合によっては、インビボで)評価され得る。NK細胞について、細胞増殖の増加、細胞傷害性(CD107a、グランザイム、パーフォリン発現の増加によって測定される標的細胞を殺傷させる能力、または標的細胞殺傷を直接測定することによって)、サイトカイン産生(例えば、IFN-γおよびTNF)、および細胞表面受容体発現(例えば、CD25)は、免疫調節、例えばがん細
胞の増強された殺傷の指標となる。T細胞について、増殖の増加、活性化の細胞表面マーカーの発現の増加(例えば、CD25、CD69、CD137、およびPD1)、細胞傷害性(標的細胞を殺傷する能力)、およびサイトカイン産生(例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-17A)は、免疫調節、例えばがん細胞の増強された殺傷の指標となる。したがって、治療の評価は、次のうちの1つ以上を評価するアッセイを使用して行うことができる:(i)免疫応答の増加、(ii)αβおよび/またはγδT細胞の活性化の増加、(iii)細胞傷害性T細胞活性の増加、(iv)NKおよび/またはNKT細胞活性の増加、(v)αβおよび/またはγδT細胞抑制の軽減、(vi)炎症誘発性サイトカイン分泌の増加、(vii)IL-2分泌の増加、(viii)インターフェロンγ産生の増加、(ix)Th1応答の増加、(x)Th2応答の減少、(xi)制御性T細胞および細胞のうちの少なくとも1つの細胞数および/または活性の減少、(xii)腫瘍免疫浸潤物の増加。
胞の増強された殺傷の指標となる。T細胞について、増殖の増加、活性化の細胞表面マーカーの発現の増加(例えば、CD25、CD69、CD137、およびPD1)、細胞傷害性(標的細胞を殺傷する能力)、およびサイトカイン産生(例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-17A)は、免疫調節、例えばがん細胞の増強された殺傷の指標となる。したがって、治療の評価は、次のうちの1つ以上を評価するアッセイを使用して行うことができる:(i)免疫応答の増加、(ii)αβおよび/またはγδT細胞の活性化の増加、(iii)細胞傷害性T細胞活性の増加、(iv)NKおよび/またはNKT細胞活性の増加、(v)αβおよび/またはγδT細胞抑制の軽減、(vi)炎症誘発性サイトカイン分泌の増加、(vii)IL-2分泌の増加、(viii)インターフェロンγ産生の増加、(ix)Th1応答の増加、(x)Th2応答の減少、(xi)制御性T細胞および細胞のうちの少なくとも1つの細胞数および/または活性の減少、(xii)腫瘍免疫浸潤物の増加。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、(a)炎症誘発性サイトカインの上方制御、(b)T細胞の増殖、拡大、もしくは腫瘍浸潤の増加、(c)T細胞によるインターフェロンγ、TNF-α、および他のサイトカイン産生の増加、(d)IL-2分泌の増加、(e)抗体応答の刺激、(f)癌細胞成長の阻害、(g)抗原特異的T細胞免疫の促進、(h)CD4+および/もしくはCD8+T細胞活性化の促進、(i)T細胞抑制の低減、(j)NK細胞活性化の促進、(k)癌細胞のアポトーシスまたは溶解の促進、ならびに/または(l)癌細胞に対する細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制効果を必要とする対象に、これらのうちの1つ以上を実施するための、二重特異性チェックポイント抗体の使用を提供する。
したがって、本発明は、二重特異性ヘテロ二量体チェックポイント抗体を提供する。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の2つのFcドメイン、例えば、「二量体」に組織化する2つの「単量体」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により完全に論じられる各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は、一般に、いくつかの方法で、チェックポイント抗原を共捕捉することができるヘテロ二量体抗体の創出を対象とし、それぞれの鎖で異なる、定常領域のアミノ酸変異体に依存することで、ヘテロ二量体形成を促進し、かつ/またはホモ二量体に関してヘテロ二量体精製の容易化を可能にする。
したがって、本発明は、二重特異性チェックポイント抗体を提供する。抗体技術における継続問題は、2つ(以上)の異なる抗原に同時に結合し、一般に、そのようにして、異なる抗原を近接させることを可能にし、新しい機能性および新しい治療をもたらす「二重特異性」抗体が、切望されていることである。一般に、これらの抗体は、各重鎖および軽鎖の遺伝子を宿主細胞(一般に、本発明において、本明細書に概説される2つの重鎖単量体および軽鎖の遺伝子)に含めることによって作られる。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体(A-B)、ならびに2つのホモ二量体(A-AおよびB-B)の形成がもたらされる。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ヘテロ二量体抗体を精製してホモ二量体抗体を除去すること、および/またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。
この問題を解決するために、本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる機構がいくつか存在する。加えて、当業者に理解されるように、これらの機構は、高いヘテロ二量体化を確実にするために組み合わせることができる。したがって、ヘテロ二量体抗体の産生につながるアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。以下に論じられるように、ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体(例えば、以下に記載される「ノブアンドホール」または「非対称」変異体、および以下に記載される「電荷対」変異体)、ならびにヘテロ二量体を除去してホモ二量体の精製を可能にする「pI変異体」
を含み得る。
を含み得る。
ヘテロ二量体形成を好み、ホモ二量体形成を好まないように立体および/または静電影響を創出するアミノ酸操作を指す、一般に当該技術分野において「ノブアンドホール」(「KIH」)と呼ばれるか、または本明細書において「非対称」変異体と呼ばれることがある1つの機構を任意選択で使用することもでき、Ridgway et al.,Protein Engineering 9(7):617(1996)、Atwell et al.,J.Mol.Biol.1997 270:26、米国特許第8,216,805号、US2012/0149876に記載されるとおりである(それらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。図において、「ノブアンドホール」アミノ酸置換を含むいくつかの「単量体A-単量体B」の対が同定されている。加えて、Merchant et al.,Nature Biotech.16:677(1998)において記載されるように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、形成をヘテロ二量体化へと非対称にすることができる。本発明において使用されるものは、特に以下に概説されるpI変異体を含む他のヘテロ二量体化変異体と組み合わせて、T366Wと対であるT366S/L368A/Y407V、ならびに架橋ジスルフィドを伴うこの変異体、T366W/S354Cと対であるT366S/L368A/Y407V/Y349Cである。
ヘテロ二量体抗体の生成において有用である追加の機構は、「静電操縦」または「電荷対」と呼ばれることがあり、Gunasekaran et al.,J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)において記載されるとおりである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。これは、本明細書において「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気が、形成をヘテロ二量体化へと非対称にするために使用される。当業者であれば、これらは、pIに対しても効果を有し得、そうすることで、精製に対しても効果を有し得、したがって、場合によっては、pI変異体と考えられ得ることを理解するであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、限定されないが、D221R/P228R/K409Rと対であるD221E/P228E/L368E(例えば、これらは、「単量体が対応するセットである)およびC220R/E224R/P228R/K409Rと対であるC220E/P228E/368Eが含まれ、他は図に示される。
本発明において、いくつかの実施形態では、pI変異体は、単量体のうちの1つまたは両方のpIを変えるために使用され、そうすることで、A-A二量体タンパク質、A-B二量体タンパク質、およびB-B二量体タンパク質の等電点分離を可能にする。
本発明において、ヘテロ二量体タンパク質の精製を容易にすることができるいくつかの基礎的な機構が存在する。すなわち、pI変異体の使用に依存し、その結果、単量体は、それぞれが異なるpIを有し、そうすることで、A-A二量体タンパク質、A-B二量体タンパク質、及びB-B二量体タンパク質の等電点精製を可能にする。あるいは、「三重F」型などのいくつかの足場型は、サイズに基づく分離も可能にする。以下にさらに概説されるように、ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体を上回るようにする「非対称」も可能である。したがって、立体二量体化変異体、およびpI変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において、特に有用である。加えて、以下にさらに概説されるように、三重F型などのscFv(複数可)を利用する足場は、精製目的に向けて、さらなるpIの増大を与える帯電scFvリンカー(正か負のいずれか)を含むことができる。当業者に理解されるように、三重F型によっては、帯電scFvリンカーのみを有し、追加のpI調整無しでも有用であるが、本発明は、帯電scFvリンカー(および本明細書に論じられるFc、FcRn、およびKOの組み合わせ)を有する非対称変異体の使用も提供する
。
。
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてpIを利用する本発明において、アミノ酸変異体は、単量体ポリペプチドのうちの1つまたは両方に導入されてもよい。すなわち、単量体のうちの1つのpI(本明細書において、単に「単量体A」と呼ばれる)が単量体Bを除去するために操作され得るか、または単量体AおよびBの両方が帯電され、単量体AのpIを増加させ、単量体BのpIを減少させることができる。以下に、より完全に概説されるように、単量体のいずれか、または両方のpIの変化は、帯電残基を除去もしくは追加(例えば、中性アミノ酸は、正もしくは負に帯電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである)するか、帯電残基を正もしくは負から反対の電荷へと変化(例えば、アスパラギン酸からリジンへ)させるか、または帯電残基を中性残基へと変化(例えば、リジンからセリンへであり、これにより帯電が消失する)させることによって行うことができる。いくつかのこれらの変異体が、図に示される。加えて、本明細書のヘテロ二量体抗体の創出に使用するための好適なpI変異体は、例えば、著しい免疫原性を導入することなくpIを変化させるように、異なるIgGアイソタイプからpI変異体を移入する、アイソタイプのものであり、米国公開第2014/0288275号の図29(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
したがって、本発明のこの実施形態において、単量体のうちの少なくとも1つにおいて、pIの十分な変化の創出を提供し、その結果、ヘテロ二量体は、ホモ二量体から分離され得る。当業者に理解されるように、そして、以下にさらに論じられるように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、そのpIが増加もしくは減少(wt A-+Bもしくはwt
A--B)のいずれかとなるように操作された変異体領域と、を使用することによって行うことができるか、または一方の領域を増加させ、もう一方の領域を減少させること(A+-B-もしくはA-B+)によって行うことができる。
A--B)のいずれかとなるように操作された変異体領域と、を使用することによって行うことができるか、または一方の領域を増加させ、もう一方の領域を減少させること(A+-B-もしくはA-B+)によって行うことができる。
したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体であり、このアミノ酸変異体は、アミノ酸置換(「pI変異体」または「pI置換」)を単量体のうちの1つまたは両方へ組み込むことによって、「pI二量体」(タンパク質が抗体であるとき、これらは「pI抗体」と呼ばれる)を形成するために、二量体タンパク質の単量体の両方か、もし両方でないなら少なくとも1つの等電点(pI)を変えることに向けられる。本明細書で示されるように、2つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、2つの単量体のpIが、わずか0.1pH単位でも異なれば達成でき、0.2、0.3、0.4、および0.5、またはそれより大きな差異は、すべて本発明において有用である。
当業者に理解されるように、良好な分離を得るために単量体(複数可)のそれぞれまたは両方に含まれるpI変異体の数は、対象のscFvおよびFabの出発pIに依存する部分がある。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」(例えば、より正、もしくはより負)にするかを決定するために、2つの標的抗原のFv配列が計算され、そこから決定がなされる。当該技術分野で知られるように、異なるFvであれば、本発明で活用される異なる出発pIを有する。一般に、本明細書に概説されるように、pIが操作されることにより、それぞれの単量体で、少なくとも約0.1logの総pI差異がもたらされ、本明細書に概説されるように当該総pI差異は、0.2~0.5であることが好ましい。
さらに、当業者に理解され、本明細書に概説されるように、場合によっては(型による)、ヘテロ二量体は、サイズ(例えば分子量)に基づいてホモ二量体から分離することができる。例えば、図1のいくつかの実施形態に示されるように、型によって、異なるサイ
ズのホモ二量体およびヘテロ二量体をもたらす(例えば、栓抜きについて、1つのホモ二量体は「二重scFv」型であり、1つのホモ二量体は標準抗体であり、ヘテロ二量体は1つのFabおよび1つのscFvを有する。
ズのホモ二量体およびヘテロ二量体をもたらす(例えば、栓抜きについて、1つのホモ二量体は「二重scFv」型であり、1つのホモ二量体は標準抗体であり、ヘテロ二量体は1つのFabおよび1つのscFvを有する。
加えて、図1に示されるように、いくつかの抗原が二価で結合されることが可能である(例えば、単一抗原に対して2つの抗原結合部位)ことを認識する。理解されるように、FabおよびscFvの任意の組み合わせを利用して、所望の結果および組み合わせを達成することができる。
pI変異体が、重鎖(複数可)の定常領域(複数可)を使用することによって、ホモ二量体を上回るヘテロ二量体精製を達成するために使用される場合は、抗体を含む多重特異性タンパク質の設計および精製に対する、よりモジュール型の手法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化変異体(非対称ヘテロ二量体化変異体および精製ヘテロ二量体化変異体を含む)は、可変領域に含まれておらず、その結果、個々の抗体は、それぞれ操作されなければならない。加えて、いくつかの実施形態では、pI変異体からもたらされる免疫原性の可能性は、異なるIgGアイソタイプ由来のpI変異体を移入することによって、著しく低減され、その結果、著しい免疫原性を導入することなくpIを変化させる。したがって、解決すべき追加の問題は、ヒト配列含量が高い低pI定常ドメインの解明であり、例えば、何らかの特定位置における非ヒト残基の最小化または回避である。
このpI操作で起こり得る付帯利点は、血清半減期の延長およびFcRn結合の増加でもある。すなわち、USSN13/194,904に記載されるように(参照によりその全体が組み込まれる)、抗体定常ドメイン(抗体およびFc融合体においてみられるものを含む)のpIを下げることは、インビボにおいて、血清での保持が長期化することにつながり得る。血清半減期の増加に向けた、これらのpI変異体によって、精製に向けたpI変化も容易となる。
加えて、ホモ二量体が存在する場合に、排除、最小化、および区別するいずれかの能力が顕著であるため、ヘテロ二量体化変異体のpI変異体が、二重特異性抗体の分析論および品質管理工程に追加の利点をもたらすことに留意されたい。同様に、ヘテロ二量体タンパク質産生の再現性を確実に試験する能力が重要である。
当業者に理解され、以下により完全に論じられるように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、一般に、図1に示されるように、多種多様の立体配置をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」上に1種類の特異性、およびもう一方の「アーム」上に異なる特異性がある「シングルエンド化(single ended)」立体配置を示す。他の図は、分子の「上部」に少なくとも1種類の特異性、および分子の「下部」に1つ以上の異なる特異性がある「二重エンド化(dual ended)」立体配置を示す。したがって、本発明は、第1の抗原および第2の抗原を共捕捉する新規の免疫グロブリン組成物を対象とする。本発明の第1および第2の抗原は、本明細書において、それぞれ、抗原-1および抗原-2(または「チェックポイント-1」および「チェックポイント-2」)と称される。
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、「三重F」または図1Aに示される「栓抜き」足場型である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は、単鎖Fv(以下に定義される「scFv」)を含み、もう一方の重鎖は、「定型的な(regular)」FAb型であって、可変重鎖および軽鎖を含む。この構造は、本明細書で「三重F」型(scFv-FAb-Fc)、または栓抜きにおおよそ視覚的に類似している(図1A参照)ことから「栓抜き」型と呼ばれることがある。2つの鎖は、ヘテロ二量体抗体の形成
を促進する定常領域(例えば、Fcドメインおよび/またはヒンジ領域)において、アミノ酸変異体を使用することによって一緒にまとめられており、以下に、より完全に記載される。
を促進する定常領域(例えば、Fcドメインおよび/またはヒンジ領域)において、アミノ酸変異体を使用することによって一緒にまとめられており、以下に、より完全に記載される。
本「三重F」型には、いくつかの明確に異なる利点が存在する。当該技術分野で知られるように、2つのscFv構築物に依存する抗体類似体は、安定性および凝集の問題を有することが多いが、本発明においては、「定型的な」重鎖および軽鎖の対を追加することによって、こうした問題を軽減することができる。加えて、2つの重鎖および2つの軽鎖に依存する型とは対照的に、重鎖および軽鎖が、不正確に対になる(例えば、重1が、軽2と対になる等)という問題は存在しない。
さらに、本明細書で概説されるように、追加のアミノ酸変異体は、追加の機能性を追加するために、本発明の二重特異性抗体に導入することができる。例えば、Fc領域内のアミノ酸変化は、ADCCまたはCDCの増加を容易にするため(例えば、Fcγ受容体への結合を変える)、ならびにFcRnへの結合を増加し、かつ/または得られる分子の血清半減期を増加させるために(1つの単量体または両方の単量体のいずれかに)付加され得る。本明細書にさらに記載され、当業者に理解されるように、本明細書に概説されるすべての変異体が任意選択かつ独立して他の変異体と組み合わせることができる。
同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは、「Fcγ切断変異体」または「Fcノックアウト(FcKOもしくはKO)変異体である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途に向け、Fcγ受容体(例えば、FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)のうちの1つ以上またはすべてに対するFcドメインの通常の結合を低減または除去して、作用の付加的な機構を回避することが望ましい。すなわち、例えば、一般に、FcγRIIIa結合を切断して、ADCC活性を排除または著しく低減することが望ましい。好適な切断変異体は、図5に示される。
C.命名法
本発明の二重特異性抗体は、いくつかの異なる型でリストに記載される。各ポリペプチドは固有の「XENP」番号を与えられるが、当技術分野で理解されるように、より長い配列がより短い番号を含む場合がある。例えば、所与の配列の栓抜き型のscFv側単量体の重鎖は、第1のXENP番号を有し、一方でscFvドメインは異なるXENP番号を有する。分子によっては3つのポリペプチドを有し、そのため、構成要素と共にXENP番号が名称として使用される。したがって、栓抜き型である分子XENP20717は、一般に、「XENP20717 HC-Fab」、「XENP20717HC-scFv」、および「XENP20717LC」と称される3つの配列、または等価物含むが、当業者は、配列アライメントによりこれらを容易に同定することができるだろう。これらのXENP番号ならびに識別子は、配列表にあり、図で使用されている。加えて、3つの構成要素を含む1つの分子は、複数の配列識別子をもたらす。例えば、Fab単量体のリストは、完全長配列、可変重配列、および可変重配列の3つのCDRを有し、軽鎖は、完全長配列、可変軽配列、および可変軽配列の3つのCDRを有し、scFv-Fcドメインは、完全長配列、scFv配列、可変軽配列、3つの軽CDR、scFvリンカー、可変重配列、および3つの重CDRを有する。scFvドメインを有する本明細書のすべての分子が単一の帯電scFvリンカー(+H)を使用するが、他が使用され得ることに留意する。加えて、特定の可変ドメインの命名法は、「Hx.xx_Ly.yy」の種類の形式を使用し、番号は特定の可変鎖配列に対する固有の識別子である。したがって、XENP22841のFab側の可変ドメインは、「7G8_H3.30_L1.34」であり、これは、可変重ドメインH3.30が軽ドメインL1.34と組み合わされたことを示す。これらの配列がscFvsとして使用される場合、指定「7G8_H3.30_L1.34」は、可変重ドメインH3.30が軽ドメインL1.34と組み合わされ、Nか
らC末端のvh-リンカー-vl配向にあることを示す。重可変ドメインおよび軽可変ドメインの同一の配列を有するが逆の順序であるこの分子は、「7G8_L1.34_H3.30」と命名されるであろう。同様に、異なる構築物は、配列表および図から明らかであるように、重鎖および軽鎖を「うまく組み合わせる」ことができる。
本発明の二重特異性抗体は、いくつかの異なる型でリストに記載される。各ポリペプチドは固有の「XENP」番号を与えられるが、当技術分野で理解されるように、より長い配列がより短い番号を含む場合がある。例えば、所与の配列の栓抜き型のscFv側単量体の重鎖は、第1のXENP番号を有し、一方でscFvドメインは異なるXENP番号を有する。分子によっては3つのポリペプチドを有し、そのため、構成要素と共にXENP番号が名称として使用される。したがって、栓抜き型である分子XENP20717は、一般に、「XENP20717 HC-Fab」、「XENP20717HC-scFv」、および「XENP20717LC」と称される3つの配列、または等価物含むが、当業者は、配列アライメントによりこれらを容易に同定することができるだろう。これらのXENP番号ならびに識別子は、配列表にあり、図で使用されている。加えて、3つの構成要素を含む1つの分子は、複数の配列識別子をもたらす。例えば、Fab単量体のリストは、完全長配列、可変重配列、および可変重配列の3つのCDRを有し、軽鎖は、完全長配列、可変軽配列、および可変軽配列の3つのCDRを有し、scFv-Fcドメインは、完全長配列、scFv配列、可変軽配列、3つの軽CDR、scFvリンカー、可変重配列、および3つの重CDRを有する。scFvドメインを有する本明細書のすべての分子が単一の帯電scFvリンカー(+H)を使用するが、他が使用され得ることに留意する。加えて、特定の可変ドメインの命名法は、「Hx.xx_Ly.yy」の種類の形式を使用し、番号は特定の可変鎖配列に対する固有の識別子である。したがって、XENP22841のFab側の可変ドメインは、「7G8_H3.30_L1.34」であり、これは、可変重ドメインH3.30が軽ドメインL1.34と組み合わされたことを示す。これらの配列がscFvsとして使用される場合、指定「7G8_H3.30_L1.34」は、可変重ドメインH3.30が軽ドメインL1.34と組み合わされ、Nか
らC末端のvh-リンカー-vl配向にあることを示す。重可変ドメインおよび軽可変ドメインの同一の配列を有するが逆の順序であるこの分子は、「7G8_L1.34_H3.30」と命名されるであろう。同様に、異なる構築物は、配列表および図から明らかであるように、重鎖および軽鎖を「うまく組み合わせる」ことができる。
D.定義
本出願をより完全に理解し得るために、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的に等価であるものを包含することを意図する。
本出願をより完全に理解し得るために、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的に等価であるものを包含することを意図する。
本明細書では、「切断」とは、活性の低減または除去を意味する。したがって、例えば、「FcγR結合の切断」は、特定の変異体を含有しないFc領域と比較して、Fc領域アミノ酸変異体が、出発結合の50%未満を有することを意味し、活性を70~80~90~95~98%超喪失していることが好ましく、一般に、活性は、Biacore、SPR、またはBLIアッセイにおいて、検出可能な結合レベルを下回る。FcγR結合の切断において特に使用されるものは、図5に示されるものであり、これらは一般に両単量体に付加される。
本明細書で使用される場合、「ADCC」または「抗体依存性細胞傷害性」とは、細胞が媒介する反応であり、FcγRを発現する非特異的細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こすことを意味する。ADCCは、FcγRIIIaに対する結合と相関しており、FcγRIIIaに対する結合の増加は、ADCC活性の増加につながる。
本明細書で使用される場合、「ADCP」または抗体依存性細胞貪食とは、細胞が媒介する反応であり、FcγRを発現する非特異的貪食細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の貪食を引き起こすことを意味する。
本明細書では、「抗原結合ドメイン」または「ABD」とは、ポリペプチド配列の一部として存在するとき、本明細書で論じられるように、標的抗原に特異的に結合する6つの相補性決定領域(CDR)のセットを意味する。したがって、「チェックポイント抗原結合ドメイン」は、本明細書に概説される標的チェックポイント抗原に結合する。当該技術分野で知られるように、これらのCDRは、一般に、可変重CDR(vhCDRまたはVHCDR)の第1のセット、および可変軽CDR(vlCDRまたはVLCDR)の第2のセットとして存在し、それぞれが、3つのCDR:重鎖のvhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、ならびに軽鎖のvlCDR1、vlCDR2、およびvlCDR3を含む。CDRは、それぞれ、可変重ドメインおよび可変軽ドメインに存在し、一緒にFv領域を形成する。(表1およびCDR番号付けスキームについての上記の関連する考察を参照されたい)。したがって、場合によっては、抗原結合ドメインの6つのCDRは、可変重ドメインおよび可変軽ドメインにより寄与される。「Fab」型において、6つのCDRのセットは、2つの異なるポリペプチド配列である、可変重ドメイン(vhまたはVH;vhCDR1、vhCDR2、およびvhCDR3を含有する)および可変軽ドメイン(vlまたはVL;vlCDR1、vlCDR2、およびvlCDR3を含有する)により寄与され、vhドメインのC末端が重鎖のCH1ドメインのN末端に結合され、vlドメインのC末端が定常軽ドメインのN末端に結合する(したがって、軽鎖を形成する)。scFv型において、vhおよびvlドメインは、本明細書に概説されるように、一般にリンカー(「scFvリンカー」の使用により、単一ポリペプチド配列に共有結合され、これは、(N末端から開始して)vh-リンカー-vlまたはvl-リンカー-vhのいずれかであってよく、前者が一般に好ましい(使用される型(例えば図1から)により、各側に任意選択のドメインリンカーを含む。一般に、scFvドメインのC末端は、第2の単量体のヒンジのN末端に結合される。
本明細書では、「改変」とは、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、および/もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分に対する変更を意味する。例えば、改変は、糖質の変更またはタンパク質に結合されたPEG構造であってよい。本明細書では、「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を意味する。明確化のために、別段の記載が無い限り、アミノ酸改変は、常に、DNAよってコードされるアミノ酸への改変であり、例えば、DNAおよびRNAにおいてコドンを有する20個のアミノ酸である。
本明細書では、「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列における特定位置で、アミノ酸を異なるアミノ酸と置き換えることを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定位置で自然発生しないアミノ酸に対するものであり、生物内において、または何らかの生物において、いずれでも自然発生しない。例えば、置換E272Yは、変異体ポリペプチドを指し、この場合、位置272で、グルタミン酸が、チロシンで置き換えられているFc変異体である。明確化のために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させないように操作されたタンパク質(例えば、CGG(アルギニンをコードする)をCGA(依然としてアルギニンをコードする)に交換して、宿主生物の発現レベルを増加させる)は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にかかわらず、タンパク質が、それが開始した特定の位置で同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の追加を意味する。例えば、-233Eまたは233Eは、位置233の後かつ位置234の前でのグルタミン酸の挿入を指定する。さらに、-233ADEまたはA233ADEは、位置233の後かつ位置234の前でのAlaAspGluの挿入を指定する。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。例えば、E233-またはE233#、E233()またはE233delは、位置233でグルタミン酸の欠失を指定する。加えて、EDA233-またはEDA233#は、位置233から始まる配列GluAspAlaの欠失を指定する。
本明細書で使用される場合、「変異体タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」は、少なくとも1つのアミノ酸改変の理由によって、親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を有するが、それほど多くはなく、変異体タンパク質は、以下に記載されるようなアライメントプログラムを用いて親タンパク質と整列しない。一般に、変異体タンパク質(本明細書で概説される変異体Fcドメインなどは、一般に、BLASTなどの以下に記載されるアライメントプログラムを使用して、親タンパク質に対して少なくとも75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%同一である。
以下に記載されるとおり、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えば、Fc親ポリペプチドは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4由来の重定常ドメインまたはFc領域などのヒト野生型配列であるが、変異体を有するヒト配列は、「親ポリペプチド」として機能することもでき、例えば、米国公開第2006/0134105号のIgG1/2ハイブリッドが含まれ得る。本明細書のタンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列と、少なくとも約80%の同一性、最も好ましくは少なくとも約90%の同一性、より好ましくは少なくとも95~98~99%の同一性を有する。したが
って、本明細書で使用される場合、「抗体変異体」または「変異体抗体」とは、少なくとも1つのアミノ酸改変の理由によって、親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される場合、「IgG変異体」または「変異体IgG」は、少なくとも1つのアミノ酸改変の理由によって、親IgG(同様に、多くの場合、ヒトIgG配列から)とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン変異体」または「変異体免疫グロブリン」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾の理由によって親免疫グロブリン配列とは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される場合、「Fc変異体」または「変異体Fc」は、ヒトIgG1、IgG2、またはIgG4のFcドメインと比較して、Fcドメインにアミノ酸改変を含むタンパク質を意味する。
って、本明細書で使用される場合、「抗体変異体」または「変異体抗体」とは、少なくとも1つのアミノ酸改変の理由によって、親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される場合、「IgG変異体」または「変異体IgG」は、少なくとも1つのアミノ酸改変の理由によって、親IgG(同様に、多くの場合、ヒトIgG配列から)とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン変異体」または「変異体免疫グロブリン」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾の理由によって親免疫グロブリン配列とは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される場合、「Fc変異体」または「変異体Fc」は、ヒトIgG1、IgG2、またはIgG4のFcドメインと比較して、Fcドメインにアミノ酸改変を含むタンパク質を意味する。
本発明のFc変異体は、それを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、N434Sまたは434Sは、親Fcポリペプチドに対して、位置434で置換セリンを有するFc変異体であり、番号付けは、EUインデックスに従うものである。同様に、M428L/N434Sは、親Fcポリペプチドに対して、置換M428L及び置換N434Sを有するFc変異体を定義する。WTアミノ酸の同一性が、特定されていなくてもよく、その場合、先に記載した変異体は、428L/434Sと呼ばれる。置換が提供される規則は任意であることに留意されたい。つまり、例えば、N434S/M428Lは、M428L/N434Sと同一のFc変異体である等である。本発明において論じられ、抗体に関連する位置のすべてで、別段の記載が無い限り、アミノ酸位置の番号付けは、EUインデックスに従うものである。EUインデックスまたはKabatもしくはEU番号付けスキームにあるようなEUインデックスは、EU抗体の番号付けを指す。Kabatらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列保存の程度に基づき、彼らは、個々の一次配列をCDRおよびフレームワークへと分類し、そのリストを作製した(SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5th edition,NIH publication,No.91-3242,E.A.Kabat et al.を参照されたい。参照によって、全体が組み込まれる)。Edelman et al.,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85も参照されたい。参照により全体が組み込まれる。改変は、追加、欠失、または置換であり得る。
本明細書では、「タンパク質」とは、少なくとも2つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドが含まれる。加えて、本発明の抗体を作りあげるポリペプチドは、1つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、PEG化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたはペプチド標識の追加を含んでよい。
本明細書で使用される場合、「残基」とは、タンパク質における位置を意味し、アミノ酸同一性と関連する。例えば、アスパラギン297(Asn297またはN297とも呼ばれる)は、ヒト抗体IgG1における位置297の残基である。
本明細書で使用される場合、「Fab」または「Fab領域」とは、一般に、2つの異なるポリペプチド鎖上にVH、CH1、VL、およびCL免疫グロブリンドメイン(例えば、一方の鎖上にVH-CH1、そしてもう一方の鎖上にVL-CL)を含むポリペプチドを意味する。Fabは、この領域を単独で、または本発明の二重特異性抗体の文脈においてこの領域を指してよい。Fabの文脈において、Fabは、CH1およびCLドメインに加えてFv領域を含む。
本明細書で使用される場合、「Fv」または「Fv断片」または「Fv領域」は、ABDのVLドメインおよびVHドメインを含むポリペプチドを意味する。Fv領域は、Fab(上述のように、一般に、上記に概説される定常領域も含む2つの異なるポリペプチド
)およびscFvの両方として形式化されてよく、ここで、vlおよびvhドメインは組み合わされて(一般に、本明細書で論じられるリンカーで)、scFvを形成する。
)およびscFvの両方として形式化されてよく、ここで、vlおよびvhドメインは組み合わされて(一般に、本明細書で論じられるリンカーで)、scFvを形成する。
本明細書では、「単鎖Fv」または「scFv」とは、scFvまたはscFvドメインを形成するために、一般に本明細書に論じられるscFvリンカーを使用して、可変軽ドメインに共有結合した可変重ドメインを意味する。.scFvドメインは、NからC末端のいずれかの配向(vh-リンカー-vlまたはvl-リンカー-vh)であってよい。配列表および図に示される配列において、vhドメインおよびvlドメインの順序は名称で示され、例えば、H.X_L.Yは、NからC末端がvh-リンカー-vlであることを意味し、L.Y_H.Xはvl-リンカー-vhである。
本明細書で使用される場合、「IgGサブクラス改変」または「アイソタイプ改変」は、1つのIgGアイソタイプの1個のアミノ酸を、異なる、整列されたIgGアイソタイプにおいて、対応するアミノ酸に変換するアミノ酸改変を意味する。例えば、EU位置296に、IgG1は、チロシンを含み、IgG2は、フェニルアラニンを含むため、IgG2におけるF296Y置換は、IgGサブクラス改変であると考えられる。
本明細書で使用される場合、「非自然発生改変」とは、アイソタイプではないアミノ酸改変を意味する。例えば、ヒトIgGのいずれも位置434にセリンを含まないため、IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4(またはそのハイブリッド)における置換434Sは、非自然発生改変であると考えられる。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、DNAおよびRNAによってコードされる自然発生する20個のアミノ酸のうちの1つを意味する。
本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」とは、抗体Fc領域と、Fc受容体またはFcリガンドとの相互作用からもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、限定されないが、ADCC、ADCP、およびCDCが含まれる。
本明細書で使用される場合、「IgG Fcリガンド」とは、IgG抗体のFc領域に結合し、Fc/Fcリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくは、ポリペプチドを意味する。Fcリガンドには、限定されないが、FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、staphylococcalプロテインA、streptococcalプロテインG、およびウイルスFcγRが含まれる。Fcリガンドは、FcγRに相同性のFc受容体のファミリーであるFc受容体相同体(FcRH)(Davis et al.,2002,Immunological Reviews 190:123-136、参照により全体が組み込まれる)も含む。Fcリガンドには、Fcに結合する未発見分子が含まれてよい。特定のIgG Fcリガンドは、FcRnおよびFcガンマ受容体である。本明細書で使用される場合、「Fcリガンド」とは、抗体のFc領域に結合し、Fc/Fcリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
本明細書で使用される場合、「Fcガンマ受容体」、「FcγR」、または「FcガンマR」とは、IgG抗体のFc領域に結合するタンパク質ファミリーの何らかのメンバーを意味し、FcγR遺伝子によってコードされる。ヒトにおいては、このファミリーには、限定されないが、アイソフォームFcγRIa、アイソフォームFcγRIb、およびアイソフォームFcγRIcを含むFcγRI(CD64)、アイソフォームFcγRIIa(アロタイプH131およびアロタイプR131を含む)、アイソフォームFcγRIIb(FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む)、ならびにアイソフォー
ムFcγRIIcを含むFcγRII(CD32)、ならびにアイソフォームFcγRIIIa(アロタイプV158およびアロタイプF158を含む)、およびアイソフォームFcγRIIIb(アロタイプFcγRIIb-NA1およびアロタイプFcγRIIb-NA2を含む)を含むFcγRIII(CD16)(Jefferis et al.,2002,Immunol Lett 82:57-65の全体が、参照によって組み込まれる)、ならびに何らかの未発見のヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはFcγRアロタイプが含まれる。FcγRは、何らかの生物由来であってよく、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルが含まれる。マウスFcγRには、限定されないが、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、およびFcγRIII-2(CD16-2)、ならびに何らかの未発見のマウスFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはFcγRアロタイプが含まれる。
ムFcγRIIcを含むFcγRII(CD32)、ならびにアイソフォームFcγRIIIa(アロタイプV158およびアロタイプF158を含む)、およびアイソフォームFcγRIIIb(アロタイプFcγRIIb-NA1およびアロタイプFcγRIIb-NA2を含む)を含むFcγRIII(CD16)(Jefferis et al.,2002,Immunol Lett 82:57-65の全体が、参照によって組み込まれる)、ならびに何らかの未発見のヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはFcγRアロタイプが含まれる。FcγRは、何らかの生物由来であってよく、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルが含まれる。マウスFcγRには、限定されないが、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、およびFcγRIII-2(CD16-2)、ならびに何らかの未発見のマウスFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはFcγRアロタイプが含まれる。
本明細書で使用される場合、「FcRn」または「新生児型Fc受容体」とは、IgG抗体のFc領域に結合するタンパク質を意味し、少なくとも一部がFcRn遺伝子によってコードされる。FcRnは、何らかの生物由来であってよく、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルが含まれる。当該技術分野で知られるように、機能性FcRnタンパク質は、2つのポリペプチドを含み、重鎖および軽鎖と呼ばれることが多い。軽鎖は、ベータ-2-ミクログロブリンであり、重鎖は、FcRn遺伝子によってコードされる。別段の記載が無い限り、FcRnまたはFcRnタンパク質は、FcRn重鎖のベータ-2-ミクログロブリンとの複合体を指す。FcRn受容体への結合の増加に使用され、場合によっては、血清半減期の増加に使用される様々なFcRn変異体。「FcRn変異体」は、FcRn受容体への結合を増加させるものであり、好適なFcRn変異体は以下に示される。
本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」とは、後に改変されて変異体を生成する出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、自然発生するポリペプチド、または自然発生するポリペプチドの変異体もしくは操作された型であってよい。したがって、本明細書で使用される場合、「親免疫グロブリン」とは、変異体を生成するように改変される未改変免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される場合、「親抗体」とは、変異体抗体を生成するように改変される未改変抗体を意味する。「親抗体」は、以下に概説されるように、既知の市販の組換え産生抗体を含むことに留意されたい。この文脈において、「親Fcドメイン」は、列記される変異体に対してであり、したがって、「変異体ヒトIgG1 Fcドメイン」は、ヒトIgG1の親Fcドメインと比較され、「変異体ヒトIgG4 Fcドメイン」は、親FcドメインヒトIgG4等と比較される。
本明細書で使用される場合、「Fc」または「Fc領域」または「Fcドメイン」とは、IgG分子のCH2-CH3ドメインを含み、場合によっては、ヒンジを含むポリペプチドを意味する。ヒトIgG1のEU番号付けにおいて、CH2-CH3ドメインは、アミノ酸231~447を含み、ヒンジは216~230である。したがって、「Fcドメイン」の定義は、アミノ酸231~447(CH2-CH3)もしくは216~447(ヒンジ-CH2-CH3)の両方、またはその断片を含む。この文脈において、「Fc断片」は、NおよびC末端のいずれか、または両方からのより少ないアミノ酸を含有し得るが、一般にサイズに基づく(例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等)標準的な方法を使用して検出され得るとき、依然として別のFcドメインもしくはFc断片を有する二量体を形成する能力を保持する。ヒトIgG Fcドメインは、本発明において、特定の使用のものであり、ヒトIgG1、IgG2、またはIgG4由来のFcドメインであり得る。
「変異体Fcドメイン」は、親Fcドメインと比較してアミノ酸改変を含有する。した
がって、「変異体ヒトIgG1 Fcドメイン」は、ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、アミノ酸改変(一般に、アミノ酸置換だが、切断変異体の場合、アミノ酸欠失が含まれる)を含有するものである。一般に、変異体Fcドメインは、対応する親ヒトIgG
Fcドメインに対して少なくとも約80、85、90、95、97、98、または99パーセントの同一性を有する(以下に論じられる同一性アルゴリズムを使用し、一実施形態では、デフォルトパラメータを使用して、当該技術分野で知られるBLASTアルゴリズムを利用する)。あるいは、変異体Fcドメインは、親Fcドメインと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸改変を有し得る。加えて、本明細書で論じられるように、本明細書において変異体Fcドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載される既知の技法を使用して測定されるように、依然として別のFcドメインを有する二量体を形成する能力を保持する。
がって、「変異体ヒトIgG1 Fcドメイン」は、ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、アミノ酸改変(一般に、アミノ酸置換だが、切断変異体の場合、アミノ酸欠失が含まれる)を含有するものである。一般に、変異体Fcドメインは、対応する親ヒトIgG
Fcドメインに対して少なくとも約80、85、90、95、97、98、または99パーセントの同一性を有する(以下に論じられる同一性アルゴリズムを使用し、一実施形態では、デフォルトパラメータを使用して、当該技術分野で知られるBLASTアルゴリズムを利用する)。あるいは、変異体Fcドメインは、親Fcドメインと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸改変を有し得る。加えて、本明細書で論じられるように、本明細書において変異体Fcドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載される既知の技法を使用して測定されるように、依然として別のFcドメインを有する二量体を形成する能力を保持する。
本明細書において、「重鎖定常領域」とは、可変重ドメインを除く抗体(またはその断片)のCH1-ヒンジ-CH2-CH3部分を意味し、ヒトIgG1のEU番号付けにおいて、これはアミノ酸118~447である。本明細書では、「重鎖定常領域断片」とは、NおよびC末端のいずれか、または両方からのより少ないアミノ酸を含有するが、依然として別の重鎖定常領域を有する二量体を形成する能力を保持する、重鎖定常領域を意味する。
本明細書で使用される場合、「位置(position)」とは、タンパク質の配列における場所(location)を意味する。位置は、連続して番号付けされるか、または確立された形式に従ってよく、例えば、抗体の番号付けのためのEUインデックスに従ってよい。
本明細書で使用される場合、「標的抗原」とは、所与の抗体の可変領域を含む抗原結合ドメインによって特異的に結合される分子を意味する。以下に論じられるように、本事例において、標的抗原はチェックポイント阻害剤タンパク質である。
本明細書において、本発明のヘテロ二量体抗体の単量体の構成における「鎖性(strandedness)」とは、「適合」するDNAの2つの鎖(strand)と同様に、ヘテロ二量体化変異体が、「適合」してヘテロ二量体を形成する能力を保つように、それぞれの単量体へと取り込まれることを意味する。例えば、いくつかのpI変異体が、単量体Aへと操作される(例えば、pIを高くする)のであれば、「電荷対」である立体変異体も利用することができ、pI変異体を妨害しない。例えば、pIを高くする電荷変異体を、同一「鎖」または同一「単量体」に加えることにより、両機能性が保持される。同様に、以下により完全に概説されるセットの対で起こる「非対称」変異体については、当業者は、pI分離も非対称のpIを使用して最大になるように、どの鎖または単量体を1セットの対に組み込むかを決定するときにpIを考慮する。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、標的抗原を発現している細胞を意味する。
本明細書において、本発明に従う二重特異性抗体を産生する文脈において、「宿主細胞」とは、二重特異性抗体の構成要素をコードする外来核酸を含有し、好適な条件下で二重特異性抗体を発現することができる細胞を意味する。好適な宿主細胞を以下に論じる。
本明細書で使用される場合、「可変領域」または「可変ドメイン」とは、それぞれ、カッパ免疫グロブリン、ラムダ免疫グロブリン、および重鎖免疫グロブリンの遺伝子座を作りあげるVκ遺伝子、Vλ遺伝子、および/またはVH遺伝子のいずれかによって実質的
にコードされる1つ以上のIgドメインを含み、抗原特異性を付与するCDRを含有する免疫グロブリンの領域を意味する。したがって、「可変重ドメイン」は「可変軽ドメイン」と対となり、抗原結合ドメイン(「ABD」)を形成する。加えて、各可変ドメインは、3つの超可変領域(「相補性決定領域」、「CDR」)(可変重ドメインについてvhCDR1、vhCDR2、およびvhCDR3、ならびに可変軽ドメインについてvlCDR1、vlCDR2、およびvlCDR3)と、4つのフレームワーク(FR)領域とを含み、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
にコードされる1つ以上のIgドメインを含み、抗原特異性を付与するCDRを含有する免疫グロブリンの領域を意味する。したがって、「可変重ドメイン」は「可変軽ドメイン」と対となり、抗原結合ドメイン(「ABD」)を形成する。加えて、各可変ドメインは、3つの超可変領域(「相補性決定領域」、「CDR」)(可変重ドメインについてvhCDR1、vhCDR2、およびvhCDR3、ならびに可変軽ドメインについてvlCDR1、vlCDR2、およびvlCDR3)と、4つのフレームワーク(FR)領域とを含み、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
本明細書では、「野生型またはWT」は、自然界にみられるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子変動を含む。WTタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
本発明は、ヒト抗体ドメインに対して配列同一性を有するいくつかの抗体ドメインを提供する。2つの類似する配列(例えば、抗体可変ドメイン)間の配列同一性は、Smith,T.F.&Waterman,M.S.(1981)“Comparison Of
Biosequences,”Adv.Appl.Math.2:482[局地的相同性アルゴリズム]、Needleman,S.B.&Wunsch,CD.(1970)“A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins,”J.Mol.Biol.48:443[相同性アライメントアルゴリズム]、Pearson,W.R.&Lipman,D.J.(1988)“Improved Tools For Biological Sequence Comparison,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444[類似検索法]、またはAltschul,S.F.et al,(1990)“Basic Local Alignment Search
Tool,”J.Mol.Biol.215:403-10(「BLAST」 アルゴリズム)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを参照されたい)などのアルゴリズムにより測定することができる。前述のアルゴリズムのうちのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメータ(ウィンドウの長さ、ギャップペナルティ等)が使用される。一実施形態では、配列同一性は、デフォルトパラメータを使用して、BLASTアルゴリズムを使用して行われる。
Biosequences,”Adv.Appl.Math.2:482[局地的相同性アルゴリズム]、Needleman,S.B.&Wunsch,CD.(1970)“A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins,”J.Mol.Biol.48:443[相同性アライメントアルゴリズム]、Pearson,W.R.&Lipman,D.J.(1988)“Improved Tools For Biological Sequence Comparison,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444[類似検索法]、またはAltschul,S.F.et al,(1990)“Basic Local Alignment Search
Tool,”J.Mol.Biol.215:403-10(「BLAST」 アルゴリズム)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを参照されたい)などのアルゴリズムにより測定することができる。前述のアルゴリズムのうちのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメータ(ウィンドウの長さ、ギャップペナルティ等)が使用される。一実施形態では、配列同一性は、デフォルトパラメータを使用して、BLASTアルゴリズムを使用して行われる。
本発明の抗体は、一般に、単離されているか、または組換え体である。「単離された」が、本明細書に開示される様々なポリペプチドについての説明に使用されるとき、それが発現される細胞または細胞培養から、同定され、分離され、および/または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも1つの精製段階によって調製されることになる。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え体」は、抗体が、外来宿主細胞において組換え核酸技法を使用して生成されることを意味し、それらも単離され得る。
「特異的結合(Specific binding)」、または特定の抗原もしくはエピトープ「に特異的に結合する(specifically bind to)」、または特定の抗原もしくはエピトープ「に向けた特異的(specific for)」は、非特異的相互作用とは、測定可能な程に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない類似構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子との競合によって決定することができる。
特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに
向けて、抗体が、少なくとも約10-4MのKD、少なくとも約10-5MのKD、少なくとも約10-6MのKD、少なくとも約10-7MのKD、少なくとも約10-8MのKD、少なくとも約10-9MのKD、あるいは、少なくとも約10-10MのKD、少なくとも約10-11MのKD、少なくとも約10-12MのKD以上のKDを有することによって示すことができ、KDは、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対して、対照分子が、20倍~、50倍~、100倍~、500倍~、1000倍~、5,000倍~、10,000倍~、またはこれらを上回る倍数のKDを有する。
向けて、抗体が、少なくとも約10-4MのKD、少なくとも約10-5MのKD、少なくとも約10-6MのKD、少なくとも約10-7MのKD、少なくとも約10-8MのKD、少なくとも約10-9MのKD、あるいは、少なくとも約10-10MのKD、少なくとも約10-11MのKD、少なくとも約10-12MのKD以上のKDを有することによって示すことができ、KDは、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対して、対照分子が、20倍~、50倍~、100倍~、500倍~、1000倍~、5,000倍~、10,000倍~、またはこれらを上回る倍数のKDを有する。
また、特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、対照に対して、抗体が、そのエピトープに向けて、少なくとも20倍~、50倍~、100倍~、500倍~、1000倍~、5,000倍~、10,000倍~、またはこれらを上回る倍数の、抗原またはエピトープに向けたKAまたはKaを有することによって示すことができ、KAまたはKaは、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は一般に、Biacore、SPR、またはBLIアッセイを使用して測定される。
E.抗体
本発明は、本明細書で論じられるように、2つの異なるチェックポイント抗原に結合する二重特異性チェックポイント抗体の生成に関する。以下に論じられるように、「抗体」という用語が、一般に使用される。本発明において有用である抗体は、本明細書に記載されるいくつかの型を呈し、伝統的な抗体、ならびに本明細書に記載され、図に示される抗体の誘導体、断片、および模倣体が含まれる。
本発明は、本明細書で論じられるように、2つの異なるチェックポイント抗原に結合する二重特異性チェックポイント抗体の生成に関する。以下に論じられるように、「抗体」という用語が、一般に使用される。本発明において有用である抗体は、本明細書に記載されるいくつかの型を呈し、伝統的な抗体、ならびに本明細書に記載され、図に示される抗体の誘導体、断片、および模倣体が含まれる。
伝統的な抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。それぞれの四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の2つの同一対からなり、それぞれの対が、1つの「軽」鎖(典型的には、約25kDaの分子量を有する)、および1つの「重」鎖(典型的には、約50~70kDaの分子量を有する)を有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類される。本発明は、一般に、IgGクラスに基づいた二重特異性抗体を対象とし、IgGクラスは、いくつかのサブクラスを有し、限定されないが、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4が含まれる。一般に、IgG1、IgG2、およびIgG4がIgG3よりも頻繁に使用される。IgG1は、356(DまたはE)および358(LまたはM)に多型を有する異なるアロタイプを有することに留意されたい。本明細書に示される配列は、356E/358Mアロタイプを使用しているが、他のアロタイプも本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるIgG1 Fcドメインを含む任意の配列は、356E/358Mアロタイプを置き換える356D/358Lを有し得る。
加えて、本明細書の抗体の多くは、位置220にセリンに置き換えられるシステインのうちの少なくとも1つを有し、一般に、これは、本明細書に示される配列の大半に関して「scFv単量体」側にあるが、ジスルフィド形成を低減するために、「Fab単量体」側にあるか、またはその両方にあってもよい。置き換えられたこれらのシステイン(C220S)の一方または両方が本明細書の配列内に具体的に含まれる。
したがって、本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的特性および抗原特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。治療用抗体は、アイソタイプおよび/またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。例えば、参照によって組み込まれる米国公開第2009/0163699号に示されるように、本発明は、ヒトIgG1/G2ハイブリッドの使用。
超可変領域は、軽鎖可変領域における、約アミノ酸残基24~34(LCDR1;「L」は軽鎖を示す)、50~56(LCDR2)、および89~97(LCDR3)、重鎖
可変領域における、およそ約31~35B(HCDR1;「H」は、重鎖を示す)、約50~65(HCDR2)、および約95~102(HCDR3)のアミノ酸残基;Kabat et al.,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)、ならびに/または超可変ループを形成するそれらの残基(例えば、軽鎖可変領域における残基26~32(LCDR1)、50~52(LCDR2)、および91~96(LCDR3)、ならびに重鎖可変領域における26~32(HCDR1)、53~55(HCDR2)、および96~101(HCDR3);Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917、由来のアミノ酸残基を包含することが一般的である。本発明の特定のCDRは、以下に記載される。
可変領域における、およそ約31~35B(HCDR1;「H」は、重鎖を示す)、約50~65(HCDR2)、および約95~102(HCDR3)のアミノ酸残基;Kabat et al.,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)、ならびに/または超可変ループを形成するそれらの残基(例えば、軽鎖可変領域における残基26~32(LCDR1)、50~52(LCDR2)、および91~96(LCDR3)、ならびに重鎖可変領域における26~32(HCDR1)、53~55(HCDR2)、および96~101(HCDR3);Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917、由来のアミノ酸残基を包含することが一般的である。本発明の特定のCDRは、以下に記載される。
当業者に理解されるように、CDRの正確な番号付けおよび配置は、異なる番号付けシステム間で異なり得る。しかしながら、可変重および/または可変軽配列の開示は関連する(固有)CDRの開示を含むことを理解されたい。したがって、各可変重領域の開示は、vhCDR(例えば、vhCDR1、vhCDR2、およびvhCDR3)の開示であり、各可変軽領域の開示は、vlCDR(例えば、vlCDR1、vlCDR2、およびvlCDR3)の開示である。CDR番号付けの有用な比較は、以下のとおりであり、Lafranc et al.,Dev.Comp.Immunol.27(l):55-77(2003):を参照されたい。
表1
表1
本明細書を通して、可変ドメイン(およそ、軽鎖可変領域の残基1~107、および重鎖可変領域の残基1~113)における残基を指すときは、Kabat番号付けシステムが一般に使用され、Fc領域についてはEU番号付けシステムが一般に使用される(例えば、Kabat et al.、上記(1991))。
重鎖のIgドメインの別の型は、ヒンジ領域である。本明細書では、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、抗体の第1の定常ドメインと第二定常ドメインとの間にアミノ酸を含む可動性のポリペプチドを意味する。構造的に、IgG CH1ドメインは、EU位置215で終了し、IgG CH2ドメインは、残基EU位置231から始まる。したがって、IgGについて、抗体ヒンジは、本明細書において、位置216(IgG1においてE216)~230(IgG1においてp230)を含むように定義され、番号付けは、KabatにあるようにEUインデックスに従う。場合によっては、「ヒンジ断片」が使用され、これは、ヒンジドメインのNおよびC末端のいずれか、または両方により少ないアミノ酸を含有する。本明細書に示されるように、pI変異体は、ヒンジ領域においても作製することができる。
軽鎖は、一般に、2つのドメイン、可変軽ドメイン(軽鎖CDRを含み、可変重ドメイ
ンと共にFv領域を形成する)および定常軽鎖領域(CLまたはCκと呼ばれることが多い)を含む。
ンと共にFv領域を形成する)および定常軽鎖領域(CLまたはCκと呼ばれることが多い)を含む。
以下に概説される、追加の置換のための別の関心領域は、Fc領域である。
本発明は、多数の異なるCDRのセットを提供する。この場合、「完全なCDRのセット」は、3つの可変軽CDRおよび3つの可変重CDR、例えば、vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2、およびvhCDR3を含む。これらは、それぞれより大きい可変軽ドメインまたは可変重ドメインの一部であり得る。加えて、より完全に本明細書に概説されるように、可変重ドメインおよび可変軽ドメインは、重鎖および軽鎖が使用される場合(例えば、Fabが使用される場合)別個のポリペプチド鎖上に、またはscFv配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
CDRは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして知られる、抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の分類であり、通常、特定の構造特性、および特定の電荷特性を有する。単一抗原が2つ以上のエピトープを有してよい。
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基(エピトープの免疫優性構成要素とも呼ばれる)、および特異的な抗原結合ペプチドによって、効果的に遮断されるアミノ残基などの、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含んでよい。換言すれば、アミノ酸残基は、特異的な抗原結合ペプチドのフットプリントの範疇である。
エピトープは、立体構造的、または直線的のいずれでもよい。立体構造的エピトープは、空間的に並置されたアミノ酸によって、直線的ポリペプチド鎖の異なるセグメントから産生される。直線的エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接アミノ酸残基によって産生されるものである。立体構造的エピトープおよび非立体構造的エピトープは、前者に対する結合であって、後者に対するものではない結合が、変性溶媒の存在下で消失するという点で区別されてよい。
エピトープは、固有の空間的立体構造において、典型的には少なくとも3個のアミノ酸を含み、より一般的には、少なくとも5または8~10個のアミノ酸を含む。同一エピトープを認識する抗体は、1つの抗体が、標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する能力を示す単純な免疫アッセイにおいて検証することができ、例えば、「ビニング(binning)」である。以下に概説されるように、本発明は、本明細書において列挙される抗原結合ドメインおよび抗体を含むだけでなく、列挙される抗原結合ドメインによって結合されるエピトープと結合について競合するものも含む。
したがって、本発明は、異なる抗体ドメインを提供する。本明細書に記載され、当該技術分野で知られるように、本発明のヘテロ二量体抗体は、鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、そのドメインはまた、重複し得る。これらのドメインには、限定されないが、Fcドメイン、CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン(CH1-ヒンジ-FcドメインまたはCH1-ヒンジ-CH2-CH3)、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、軽定常ドメイン、FAbドメイン、およびscFvドメインが含まれる。
したがって、「Fcドメイン」は、-CH2-CH3ドメイン、および任意選択でヒンジドメイン(-H-CH2-CH3)を含む。本明細書の実施形態では、scFvがFcドメインに結合されるとき、それは、Fcドメインのヒンジのすべてまたは一部に結合さ
れるscFv構築物のC末端であり、例えば、それは一般に、ヒンジの開始である配列EPKSに結合される。重鎖は、可変重ドメインおよび定常ドメインを含み、CH2-CH3を含むCH1-任意選択のヒンジ-Fcドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽定常ドメインを含む。scFvは、可変重鎖、scFvリンカー、および可変軽ドメインを含む。本明細書に概説される構築物および配列の大半において、可変重鎖のC末端は、scFvリンカーのN末端に結合され、そのC末端は、可変軽鎖のN末端に結合される(N-vh-リンカー-vl-C)が、それは交換することができる(N-vl-リンカー-vh-C)。
れるscFv構築物のC末端であり、例えば、それは一般に、ヒンジの開始である配列EPKSに結合される。重鎖は、可変重ドメインおよび定常ドメインを含み、CH2-CH3を含むCH1-任意選択のヒンジ-Fcドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽定常ドメインを含む。scFvは、可変重鎖、scFvリンカー、および可変軽ドメインを含む。本明細書に概説される構築物および配列の大半において、可変重鎖のC末端は、scFvリンカーのN末端に結合され、そのC末端は、可変軽鎖のN末端に結合される(N-vh-リンカー-vl-C)が、それは交換することができる(N-vl-リンカー-vh-C)。
本発明のいくつかの実施形態は、自然に発生しないが、一般に、scFvリンカーによって一緒に連結される可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含む少なくとも1つのscFvドメインを含む。本明細書で概説されるように、scFvドメインは、一般に、vh-scFvリンカー-vlのようにNからC末端に配向されるが、これは、scFvドメインのいずれか(またはFabからのvhおよびvl配列を使用して構築されるもの)に関して逆にすることができ、一端または両端の任意選択のリンカーは型(一般に図1を参照されたい)に依存する。
本明細書に示されるように、使用され得るいくつかの好適なリンカー(ドメインリンカーまたはscFvリンカーのいずれかとして使用するための)があり、それらのリンカーは、組換え技術によって生成される伝統的なペプチド結合を含む、列記されるドメインを共有結合するために使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主に含み得る:Gly、Ser、Ala、またはThr。リンカーペプチドは、2つの分子を連結するために適切な長さを有するべきであり、そのようにして、それらは、お互いに対して正しい立体構造をとり、その結果、それらは、所望の活性を保持する。一実施形態では、リンカーは、長さが、アミノ酸で約1~50個、好ましくは、長さが、アミノ酸で約1~30個である。一実施形態では、長さが、アミノ酸で1~20個であるリンカーを、いくつかの実施形態において有用である約5~約10個のアミノ酸と共に使用してよい。有用なリンカーには、グリシン-セリン重合体(例えば、(GS)n、(GSGGS)n(配列番号37756)、(GGGGS)n(配列番号37757)、および(GGGS)n(配列番号37758)を含み、ここで、nは、少なくとも1(かつ一般に3~4)である整数である)、グリシン-アラニン重合体、アラニン-セリン重合体、および他の可動性リンカーが含まれる。あるいは、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールの共重合体を含む様々な非タンパク質性の重合体が、リンカーとして有用であり得る。
他のリンカー配列は、CL/CH1ドメインのすべての残基ではないが、CL/CH1ドメインの何らかの長さの何らかの配列を含んでよく、例えば、CL/CH1ドメインの最初の5~12個のアミノ酸残基を含んでよい。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖由来であり得、例えば、CκまたはCλである。リンカーは、何らかのアイソタイプの免疫グロブリン重鎖由来であり得、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε、およびCμが含まれる。リンカー配列は、Ig様タンパク質(例えば、TCR、FcR、KIR)、ヒンジ領域由来の配列、および他のタンパク質由来の他の天然の配列などの他のタンパク質に由来してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に一緒に概説されるあらゆる2つのドメインを連結させるために使用される「ドメインリンカー」である。例えば、図1Fにおいて、FabのCH1ドメインのC末端をscFvのN末端に結合させるドメインリンカーが存在してよく、別の任意選択のドメインリンカーが、scFvのC末端をCH2ドメインに結合させる(しかし、多くの実施形態では、ヒンジがこのドメインリンカーとして使用される)。いずれの好適なリンカーが使用され得るが、多くの実施形態は、ドメインリンカーとして、グリシン-セリン重合体を利用し、これには、例えば、(GS)n、(GSGGS)n(配列番号37756)、(GGGGS)n(配列番号37757)、および(GGGS)n(配列番号37758)(ここで、nは、少なくとも1(かつ一般に3~4~5)である整数である)、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするのに十分な長さおよび柔軟性を有する、2つのドメインの組換え結合を可能にするあらゆるペプチド配列を含む。場合によっては、および以下に概説されるように「鎖性」に注目すると、scFvリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、帯電ドメインリンカーが使用され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書で論じられるように、vhおよびvlドメインを共有結合させるために使用されるscFvリンカーである。多くの場合では、scFvリンカーは、帯電scFvリンカーであり、そのいくつかは、
図7に示される。したがって、本発明は、第1の単量体と第2の単量体との間でpIにおける分離を容易にするために帯電scFvリンカーをさらに提供する。すなわち、帯電scFvリンカーを組み込むことによって、正であっても、負であっても(あるいは異なる単量体上でscFvを使用する足場の場合は両方)、これは、帯電リンカーを含む単量体が、Fcドメインをさらに変更することなくpIを変えることを可能にする。これらの帯電リンカーは、標準リンカーを含有するあらゆるscFvに置換され得る。かさねて、当業者に理解されるように、帯電scFvリンカーは、pIにおける所望の変更に従って、正しい「鎖」または単量体上に使用される。例えば、本明細書で論じられるように、三重F型のヘテロ二量体抗体を作製するために、所望の抗原結合ドメインのそれぞれについてのFv領域の最初のpIが計算され、1つがscFvを作製するために選択され、pIによって、正または負のリンカーいずれかが選択される。
帯電ドメインリンカーはまた、本発明の単量体のpI分離を増加するためにも使用することができ、したがって、
図7に含まれるものは、リンカーが利用される本明細書のいずれの実施形態においても使用され得る。
具体的には、図1に示される型は、通常「ヘテロ二量体抗体」と呼ばれる抗体であり、タンパク質が、ヘテロ二量体Fcドメインに自己組織化される少なくとも2つの関連Fc配列、および少なくとも2つのFv領域(FabとしてまたはscFvとしてにかかわらず)を有することを意味する。
キメラ抗体およびヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および/または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」であるか、または特定の生殖系列配列「に由来する」重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含むか、またはそれからなり得る。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、またはヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列に最も近い(すなわち、最大の同一性%)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択する(本明細書に概説される方法を使用する)ことによってそのように同定され得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、または特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生する体細胞変異または部位指向変異の意図的な導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を含有し得る。しか
しながら、ヒト化抗体は典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも90%同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較したとき、ヒト配列に由来するものとして抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。ある特定の場合では、ヒト化抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも95、96、97、98、または99%同一であるか、またはさらには少なくとも96%、97%、98%、もしくは99%同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と10~20個以上のアミノ酸差異を示さない(本明細書の任意の非対称、pI、および切断変異体の導入前、すなわち、本発明の変異体の導入前の変異体の数は、一般に少ない)。ある特定の場合では、ヒト化抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と5個以上、またはさらには4、3、2、もしくは1個以上のアミノ酸差異を示さない(同様に、本明細書の任意の非対称、pI、および切断変異体の導入前、すなわち、本発明の変異体の導入前の変異体の数は、一般に少ない)。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および/または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」であるか、または特定の生殖系列配列「に由来する」重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含むか、またはそれからなり得る。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、またはヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列に最も近い(すなわち、最大の同一性%)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択する(本明細書に概説される方法を使用する)ことによってそのように同定され得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、または特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生する体細胞変異または部位指向変異の意図的な導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を含有し得る。しか
しながら、ヒト化抗体は典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも90%同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較したとき、ヒト配列に由来するものとして抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。ある特定の場合では、ヒト化抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも95、96、97、98、または99%同一であるか、またはさらには少なくとも96%、97%、98%、もしくは99%同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と10~20個以上のアミノ酸差異を示さない(本明細書の任意の非対称、pI、および切断変異体の導入前、すなわち、本発明の変異体の導入前の変異体の数は、一般に少ない)。ある特定の場合では、ヒト化抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と5個以上、またはさらには4、3、2、もしくは1個以上のアミノ酸差異を示さない(同様に、本明細書の任意の非対称、pI、および切断変異体の導入前、すなわち、本発明の変異体の導入前の変異体の数は、一般に少ない)。
一実施形態では、親抗体は、親和性が成熟しており、当該技術分野で知られるとおりである。構造に基づく方法が、ヒト化および親和性の成熟に用いられてよく、例えば、USSN11/004,590において説明されるとおりである。抗体可変領域のヒト化および/または親和性成熟のために、選択に基づく方法が用いられてよく、限定されないが、Wu et al.,1999,J.Mol.Biol.294:151-162、Baca et al.,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684、Rosok et al.,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618、Rader et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915、Krauss et
al.,2003,Protein Engineering 16(10):753-759において説明される方法が含まれ、これらはすべて、参照により全体が組み込まれる。他のヒト化方法は、CDRの一部のみの移植を伴うものでよく、限定されないが、USSN09/810,510、Tan et al.,2002,J.Immunol.169:1119-1125、De Pascalis et al.,2002,J.Immunol.169:3076-3084において説明される方法が含まれ、これらはすべて、参照により全体が組み込まれる。
al.,2003,Protein Engineering 16(10):753-759において説明される方法が含まれ、これらはすべて、参照により全体が組み込まれる。他のヒト化方法は、CDRの一部のみの移植を伴うものでよく、限定されないが、USSN09/810,510、Tan et al.,2002,J.Immunol.169:1119-1125、De Pascalis et al.,2002,J.Immunol.169:3076-3084において説明される方法が含まれ、これらはすべて、参照により全体が組み込まれる。
IV.ヘテロ二量体抗体
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己組織化してヘテロ二量体Fcドメインおよびヘテロ二量体抗体を形成する、2つの異なる重鎖変異体Fc配列の使用に依存するヘテロ二量体チェックポイント抗体を提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己組織化してヘテロ二量体Fcドメインおよびヘテロ二量体抗体を形成する、2つの異なる重鎖変異体Fc配列の使用に依存するヘテロ二量体チェックポイント抗体を提供する。
したがって、本発明は、例えば、二重特異性結合を可能にするために、2つ以上のチェックポイント抗原またはリガンドへの結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規構築物を対象とする。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の2つのFcドメイン、例えば、「二量体」に組織化する2つの「単量体」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により完全に論じられる各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は、一般に、いくつかの方法で、抗原を共捕捉することができるヘテロ二量体チェックポイント抗体の創出を対象とし、それぞれの鎖で異なる、定常領域のアミノ酸変異体に依存することで、ヘテロ二量体形成を促進し、かつ/またはホモ二量体に関してテロ二量体精製の容易化を可能にする。
したがって、本発明は、二重特異性抗体を提供する。抗体技術における継続問題は、2つの異なる抗原に同時に結合し、一般に、そのようにして、異なる抗原を近接させること
を可能にし、新しい機能性および新しい治療をもたらす「二重特異性」抗体が、切望されていることである。一般に、これらの抗体は、重鎖および軽鎖それぞれの遺伝子を宿主細胞に含めることによって作られる。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体(A-B)、ならびに2つのホモ二量体(A-A及びB-B(軽鎖ヘテロ二量体の問題を含まない))の形成がもたらされる。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ヘテロ二量体抗体を精製してホモ二量体抗体を除去すること、および/またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。
を可能にし、新しい機能性および新しい治療をもたらす「二重特異性」抗体が、切望されていることである。一般に、これらの抗体は、重鎖および軽鎖それぞれの遺伝子を宿主細胞に含めることによって作られる。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体(A-B)、ならびに2つのホモ二量体(A-A及びB-B(軽鎖ヘテロ二量体の問題を含まない))の形成がもたらされる。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ヘテロ二量体抗体を精製してホモ二量体抗体を除去すること、および/またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。
本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる機構がいくつか存在する。加えて、当業者に理解されるように、これらの機構は、高いヘテロ二量体化を確実にするために組み合わせることができる。したがって、ヘテロ二量体の産生につながるアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。以下に論じられるように、ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体(例えば、以下に記載される「ノブアンドホール」または「非対称」変異体、および以下に記載される「電荷対」変異体)、ならびにヘテロ二量体を除去してホモ二量体の精製を可能にする「pI変異体」を含み得る。これにより、参照によりその全体が組み込まれ、特に「ヘテロ二量体化変異体」の議論について以下のようにWO2014/145806において一般に記載されるように、ヘテロ二量体化の有用な機構には、「ノブアンドホール」(「KIH」、時に本明細書では「非対称」変異体として(WO2014/145806の議論参照)、WO2014/145806に記載される「静電操縦」または「電荷対」、WO2014/145806に記載されるpI変異体、ならびにWO2014/145806および以下に概説される一般的な追加のFc変異体が含まれる。
本発明には、ヘテロ二量体抗体の精製を容易にすることができるいくつかの基礎的な機構が存在する。すなわち、pI変異体の使用に依存し、その結果、単量体は、それぞれが異なるpIを有し、そうすることで、A-A二量体タンパク質、A-B二量体タンパク質、及びB-B二量体タンパク質の等電点精製を可能にするものである。あるいは、「三重F」型などのいくつかの足場型は、サイズに基づく分離も可能にする。以下にさらに概説されるように、ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体を上回るようにする「非対称」も可能である。したがって、立体二量体化変異体、およびpI変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において、特に有用である。
一般に、本発明において特に有用な実施形態は、非対称変異体を含む変異体のセットに依存し、この変異体は、2つの単量体間でpI差異を増加させるpI変異体と共に、ホモ二量体化形成より優先してヘテロ二量体化形成を促し、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体の精製を容易にする。
加えて、以下により完全に概説されるように、ヘテロ二量体抗体の型に応じて、pI変異体は、単量体の定常および/またはFcドメイン内のいずれかに含有され得るか、あるいはドメインリンカーまたはscFvリンカーのいずれかである帯電リンカーが使用され得る。すなわち、三重F型などのscFv(複数可)を利用する足場は、精製目的に向けて、さらなるpIの増大を与える帯電scFvリンカー(正か負のいずれか)を含むことができる。当業者に理解されるように、三重F型によっては、帯電scFvリンカーのみを有し、追加のpI調整無しでも有用であるが、本発明は、単量体のうちの1つまたは両方にあるpI変異体、および/または帯電ドメインリンカーも提供する。加えて、代替機能性のために操作する追加のアミノ酸はまた、Fc、FcRn、およびKO変異体などのpI変化を与え得る。
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてpIを利用する本発明において、アミノ酸変異体は、単量体ポリペプチドのうちの1つまたは両方に導入され
てもよい。すなわち、単量体のうちの1つのpI(本明細書において、単に「単量体A」と呼ばれる)が単量体Bを除去するために操作され得るか、または単量体AおよびBの変化の両方が帯電され、単量体AのpIを増加させ、単量体BのpIを減少させることができる。論じられるように、単量体のいずれか、または両方のpIの変化は、帯電残基を除去もしくは追加(例えば、中性アミノ酸は、正もしくは負に帯電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである)するか、帯電残基を正もしくは負から反対の電荷へと変化(例えば、アスパラギン酸からリジンへ)させるか、または帯電残基を中性残基へと変化(例えば、リジンからセリンへであり、これにより帯電が消失する)させることによって行うことができる。いくつかのこれらの変異体が、図に示される。
てもよい。すなわち、単量体のうちの1つのpI(本明細書において、単に「単量体A」と呼ばれる)が単量体Bを除去するために操作され得るか、または単量体AおよびBの変化の両方が帯電され、単量体AのpIを増加させ、単量体BのpIを減少させることができる。論じられるように、単量体のいずれか、または両方のpIの変化は、帯電残基を除去もしくは追加(例えば、中性アミノ酸は、正もしくは負に帯電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである)するか、帯電残基を正もしくは負から反対の電荷へと変化(例えば、アスパラギン酸からリジンへ)させるか、または帯電残基を中性残基へと変化(例えば、リジンからセリンへであり、これにより帯電が消失する)させることによって行うことができる。いくつかのこれらの変異体が、図に示される。
したがって、本発明のこの実施形態は、単量体のうちの少なくとも1つにおいて、pIの十分な変化の創出を提供し、その結果、ヘテロ二量体は、ホモ二量体から分離され得る。当業者に理解されるように、そして、以下にさらに論じられるように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、そのpIが増加もしくは減少(wt A-+Bもしくはwt A--B)のいずれかとなるように操作された変異体領域と、を使用することによって行うことができるか、または一方の領域を増加させ、もう一方の領域を減少させること(A+-B-もしくはA-B+)によって行うことができる。
したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体であり、このアミノ酸変異体は、アミノ酸置換(「pI変異体」または「pI置換」)を単量体のうちの1つまたは両方へ組み込むことによって、「pI抗体」を形成するために、二量体タンパク質の単量体の両方か、もし両方でないなら少なくとも1つの等電点(pI)を変えることに向けられる。本明細書で示されるように、2つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、2つの単量体のpIが、わずか0.1pH単位でも異なれば達成でき、0.2、0.3、0.4、および0.5、またはそれより大きな差異は、すべて本発明において有用である。
当業者に理解されるように、良好な分離を得るために単量体(複数可)のそれぞれまたは両方に含まれるpI変異体の数は、構成要素の出発pI、例えば、三重F型で、対象のscFvおよびFabの出発pIに依存する部分がある。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」(例えば、より正、もしくはより負)にするかを決定するために、2つの標的抗原のFv配列が計算され、そこから決定がなされる。当該技術分野で知られるように、異なるFvであれば、本発明で活用される異なる出発pIを有する。一般に、本明細書に概説されるように、pIが操作されることにより、それぞれの単量体で、少なくとも約0.1logの総pI差異がもたらされ、本明細書に概説されるように当該総pI差異は、0.2~0.5であることが好ましい。
さらに、当業者に理解され、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体は、サイズに基づいてホモ二量体から分離することができる。例えば図1に示されるように、型のいくつかは、サイズに基づくヘテロ二量体及びホモ二量体の分離を可能にする。
A.ヘテロ二量体化変異体
本発明は、ヘテロ二量体タンパク質を提供し、これには、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体形成および/または精製を可能にするためにヘテロ二量体変異体を利用する様々な型のヘテロ二量体抗体を含む。
本発明は、ヘテロ二量体タンパク質を提供し、これには、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体形成および/または精製を可能にするためにヘテロ二量体変異体を利用する様々な型のヘテロ二量体抗体を含む。
いくつかの好適なヘテロ二量体化非対称変異体のセットの対がある。これらの変異体は、「セット」の「対」で起こる。すなわち、対の一方のセットは、第1の単量体に組み込
まれ、対のもう一方のセットは、第2の単量体に組み込まれる。これらのセットは、一方の単量体上の残基ともう一方の単量体上の残基との間の1対1の対応を有する「ノブインホール」変異体として必ずしも機能せず、すなわち、これらの対のセットは、ヘテロ二量体形成を促し、ホモ二量体形成を防止する2つの単量体の間で境界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体のパーセンテージが、予想された50%よりもむしろ90%を超えることを可能にする(25%のホモ二量体A/A:50%のヘテロ二量体A/B:25%のホモ二量体B/B)ことに留意されたい。
まれ、対のもう一方のセットは、第2の単量体に組み込まれる。これらのセットは、一方の単量体上の残基ともう一方の単量体上の残基との間の1対1の対応を有する「ノブインホール」変異体として必ずしも機能せず、すなわち、これらの対のセットは、ヘテロ二量体形成を促し、ホモ二量体形成を防止する2つの単量体の間で境界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体のパーセンテージが、予想された50%よりもむしろ90%を超えることを可能にする(25%のホモ二量体A/A:50%のヘテロ二量体A/B:25%のホモ二量体B/B)ことに留意されたい。
B.立体変異体
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の追加によって容易になる場合がある。すなわち、それぞれの重鎖におけるアミノ酸を変化させることによって、同一Fcアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりも、異なる重鎖が、会合してヘテロ二量体構造を形成する可能性が高くなる。好適な立体変異体は、図に含まれる。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の追加によって容易になる場合がある。すなわち、それぞれの重鎖におけるアミノ酸を変化させることによって、同一Fcアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりも、異なる重鎖が、会合してヘテロ二量体構造を形成する可能性が高くなる。好適な立体変異体は、図に含まれる。
ヘテロ二量体形成を促し、ホモ二量体形成を防止するように立体的影響を創出するアミノ酸操作を指す、当該技術分野で一般に「ノブアンドホール」と呼ばれる1つの機構も任意選択で使用され得る。これは、USSN61/596,846、Ridgway et
al.,Protein Engineering 9(7):617(1996);Atwell et al.,J.Mol.Biol.1997 270:26、米国特許第8,216,805号(それらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるように、「ノブアンドホール」と呼ばれる場合がある。「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「単量体A-単量体B」の対が図において同定されている。加えて、Merchant et al.,Nature Biotech.16:677(1998)に記載されるように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、ヘテロ二量体化へと形成を非対称にすることができる。
al.,Protein Engineering 9(7):617(1996);Atwell et al.,J.Mol.Biol.1997 270:26、米国特許第8,216,805号(それらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるように、「ノブアンドホール」と呼ばれる場合がある。「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「単量体A-単量体B」の対が図において同定されている。加えて、Merchant et al.,Nature Biotech.16:677(1998)に記載されるように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、ヘテロ二量体化へと形成を非対称にすることができる。
ヘテロ二量体の生成に有用である追加の機構は、「静電操縦」と呼ばれることがあり、Gunasekaran et al.,J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるとおりである。これは、本明細書で「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気が、ヘテロ二量体化へと形成を非対称とするために使用される。当業者であれば、これらは、pIに対しても効果を有し得、そうすることで、精製に対しても影響を有し得、したがって、場合によっては、pI変異体であり得るとも考えられることを理解するであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、限定されないが、D221R/P228R/K409Rと対であるD221E/P228E/L368E(例えば、これらは、「単量体が対応するセットである)およびC220R/E224R/P228R/K409Rと対であるC220E/P228E/368Eが含まれる。
追加の単量体A変異体および単量体B変異体を、本明細書に概説されるpI変異体、またはUS2012/0149876の図37に示される他のこの当該特許文献の図および説明文ならびに配列番号は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される立体変異体を、何らかのpI変異体(またはFc変異体、FcRn変異体等の他の変異体)と共に1つまたは両方の単量体へ、任意選択かつ独立して、組み込むことができ、本発明のタンパク質を独立かつ任意選択で含むか、またはこのタンパク質から除外することができる。
好適な非対称変異体のリストは図3にみられ、図8は、多くの実施形態における特定の
有用性のいくつかの対を示す。多くの実施形態において特に使用されるものは、限定されないが、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、およびT366S/L368A/Y407V:T366W(任意選択で架橋ジスルフィド、T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)を含む、セットの対である。命名法の点から、上記のように、対「S364K/E357Q:L368D/K370S」は、単量体のうちの一方が二重変異体セットS364K/E357Qを有し、もう一方が二重変異体セットL368D/K370Sを有することを意味し、これらの対の「鎖性」は出発pIに依存する。
有用性のいくつかの対を示す。多くの実施形態において特に使用されるものは、限定されないが、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、およびT366S/L368A/Y407V:T366W(任意選択で架橋ジスルフィド、T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)を含む、セットの対である。命名法の点から、上記のように、対「S364K/E357Q:L368D/K370S」は、単量体のうちの一方が二重変異体セットS364K/E357Qを有し、もう一方が二重変異体セットL368D/K370Sを有することを意味し、これらの対の「鎖性」は出発pIに依存する。
C.ヘテロ二量体のpI(等電点)変異体
一般に、当業者に理解されるように、pI変異体には2つの一般的なカテゴリー:タンパク質のpIを増加させるもの(塩基性の変化)、およびタンパク質のpIを減少させるもの(酸性の変化)が存在する。本明細書に記載されるように、これらの変異体のすべての組み合わせを行うことができる、つまり、一方の単量体が、野生型、または野生型と顕著に異なるpIを示さない変異体であり得、もう一方は、より塩基性、またはより酸性であり得る。あるいは、それぞれの単量体を、1つはより塩基性へ、1つはより酸性へと変化させる。
一般に、当業者に理解されるように、pI変異体には2つの一般的なカテゴリー:タンパク質のpIを増加させるもの(塩基性の変化)、およびタンパク質のpIを減少させるもの(酸性の変化)が存在する。本明細書に記載されるように、これらの変異体のすべての組み合わせを行うことができる、つまり、一方の単量体が、野生型、または野生型と顕著に異なるpIを示さない変異体であり得、もう一方は、より塩基性、またはより酸性であり得る。あるいは、それぞれの単量体を、1つはより塩基性へ、1つはより酸性へと変化させる。
pI変異体の好ましい組み合わせは図4に示される。本明細書に概説され、図に示されるように、これらの変化は、IgG1に対して示されるが、すべてのアイソタイプおよびアイソタイプハイブリッドを、このように変えることができる。重鎖定常ドメインが、IgG2~4由来である場合は、R133EおよびR133Qも使用することができる。
一実施形態では、例えば、図1A、E、F、G、H、およびI型では、pI変異体の好ましい組み合わせは、208D/295E/384D/418E/421D変異体(ヒトIgG1に対しての場合、N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)を含む1つの単量体と、正の帯電scFvリンカー((GKPGS)4を含む)(配列番号37755)を含む第2の単量体(正のscFv側)とを有する。しかしながら、当業者に理解されるように、第1のモノマーは、位置208を含むCH1ドメインを含む。したがって、CH1ドメインを含まない構築物において(例えば、ドメインのうちの1つにCH1ドメインを利用しない抗体のため、例えば、図1B、C、またはDに示されるものなどの二重scFv型または「片腕」型において)、好ましい負のpI変異体Fcセットは、295E/384D/418E/421D変異体(ヒトIgG1に対しての場合、Q295E/N384D/Q418E/N421D)を含む。
したがって、いくつかの実施形態では、一方の単量体は図4からの置換のセットを有し、もう一方の単量体は帯電リンカー(型が指示するように、その単量体がscFvまたは帯電ドメインリンカーを含むため、帯電scFvリンカーの形態のいずれかで、これは図7に示されるものから選択され得る)を有する。
1.アイソタイプ変異体
加えて、本発明の多くの実施形態が、1つのIgGアイソタイプから別のものへの、特定位置でのpIアミノ酸の「取り込み」に依存しており、したがって、変異体へ導入される不要な免疫原性の可能性を低下または除去している。これらのいくつかは、米国公開第2014/0370013号の図21に示され、参照により本明細書に組み込まれる。すなわち、IgG1は、高いエフェクター機能を含む様々な理由で、治療用抗体のための共通のアイソタイプである。しかしながら、IgG1の重定常領域は、IgG2のそれと比較して、より高いpIを有している(8.10対7.31)。特定位置で、IgG2残基
を、IgG1骨格に導入することによって、得られる単量体のpIは低下(または増加)し、付加的に血清半減期の長期化を示す。例えば、IgG1は、位置137にグリシン(pI5.97)を有し、IgG2は、グルタミン酸(pI3.22)を有している。つまり、グルタミン酸の取り込みは、得られるタンパク質のpIに影響を与えることになる。以下に記載されるように、いくつかのアミノ酸置換は、一般に、変異体抗体のpIに顕著な影響を与えることが必要とされている。しかしながら、以下に論じられるように、IgG2分子における変化でさえ、血清半減期の増加を可能にすることに留意されるべきである。
加えて、本発明の多くの実施形態が、1つのIgGアイソタイプから別のものへの、特定位置でのpIアミノ酸の「取り込み」に依存しており、したがって、変異体へ導入される不要な免疫原性の可能性を低下または除去している。これらのいくつかは、米国公開第2014/0370013号の図21に示され、参照により本明細書に組み込まれる。すなわち、IgG1は、高いエフェクター機能を含む様々な理由で、治療用抗体のための共通のアイソタイプである。しかしながら、IgG1の重定常領域は、IgG2のそれと比較して、より高いpIを有している(8.10対7.31)。特定位置で、IgG2残基
を、IgG1骨格に導入することによって、得られる単量体のpIは低下(または増加)し、付加的に血清半減期の長期化を示す。例えば、IgG1は、位置137にグリシン(pI5.97)を有し、IgG2は、グルタミン酸(pI3.22)を有している。つまり、グルタミン酸の取り込みは、得られるタンパク質のpIに影響を与えることになる。以下に記載されるように、いくつかのアミノ酸置換は、一般に、変異体抗体のpIに顕著な影響を与えることが必要とされている。しかしながら、以下に論じられるように、IgG2分子における変化でさえ、血清半減期の増加を可能にすることに留意されるべきである。
以下にさらに記載されるように、他の実施形態では、得られるタンパク質の全体の電荷状態を低下(例えば、より高いpIアミノ酸を、より低いpIアミノ酸へと変化させることによって)させるか、または安定に向けた構造の適応を可能にする等のいずれかのために、非アイソタイプアミノ酸変化がなされる。
加えて、重定常ドメインおよび軽定常ドメインの両方のpI操作によって、ヘテロ二量体のそれぞれの単量体において、顕著な変化をみることができる。本明細書で論じられるように、2つの単量体のpIを少なくとも0.5異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法によっての分離が可能になる。
D.pIの計算
それぞれの単量体のpIは、変異体重鎖定常ドメインおよび融合相手を含む、可変重鎖定常領域および総単量体のpIに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態では、米国公開第2014/0370013号の図19中のチャートを使用して、変異体重鎖定常ドメインに基づいて、pIの変化が計算される。本明細書で論じられるように、どの単量体を操作するかは、一般に、Fvおよび足場領域の固有pIによって決定される。あるいは、それぞれの単量体のpIを、比較することができる。
それぞれの単量体のpIは、変異体重鎖定常ドメインおよび融合相手を含む、可変重鎖定常領域および総単量体のpIに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態では、米国公開第2014/0370013号の図19中のチャートを使用して、変異体重鎖定常ドメインに基づいて、pIの変化が計算される。本明細書で論じられるように、どの単量体を操作するかは、一般に、Fvおよび足場領域の固有pIによって決定される。あるいは、それぞれの単量体のpIを、比較することができる。
E.より良好なFcRnインビボ結合も付与するpI変異体
pI変異体が、単量体のpIを減少させる場合、インビボでの血清における保持の改善という利点が追加され得る。
pI変異体が、単量体のpIを減少させる場合、インビボでの血清における保持の改善という利点が追加され得る。
未だ試験中であるが、Fc領域は、インビボにおいてより長い半減期を有すると考えられ、これは、エンドソームにおける、pH6でのFcRnに対する結合が、Fcを隔離するためである(Ghetie and Ward,1997 Immunol Today.18(12):592-598の全体が参照により組み込まれる)。その後、エンドソームの区画は、細胞表面へとFcを再循環させる。区画が、より高いpHである約7.4の細胞外空間へと一旦開くと、Fcの放出が誘導され、血液へ戻る。マウスにおいて、Dall’Acquaらは、pH6およびpH7.4でのFcRn結合が増加したFc変異型(Fc mutant)が、実際は、血清濃度を低下させ、野生型Fcと同一の半減期を有することを示した(Dall’Acqua et al.2002,J.Immunol.169:5171-5180の全体が参照により組み込まれる)。pH7.4でのFcRnに向けたFcの親和性の増加は、Fcが放出されて血流へ戻ることを妨げると考えられる。それ故に、インビボにおけるFcの半減期を増加させるであろうFc変異は、より高いpHでのFcの放出を、可能なままにしつつ、より低いpHでFcRn結合を理想的に増加させる。アミノ酸であるヒスチジンは、6.0~7.4のpH範囲において、その電荷状態が変化する。したがって、His残基が、Fc/FcRn複合体において、重要な位置を占めるという発見は、驚くべきことではない。
最近、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体が、より長い血清半減期も有し得
ることが示唆された(Igawa et al.,2010 PEDS.23(5):385-392の全体が参照により組み込まれる)。しかしながら、この機構の理解は、依然として不十分である。その上、可変領域は、抗体毎に異なる。本明細書に記載されるように、pIが低下し、半減期が延長している定常領域変異体は、抗体の薬物動態特性の改善に対する、よりモジュール型の手法を提供する。
ることが示唆された(Igawa et al.,2010 PEDS.23(5):385-392の全体が参照により組み込まれる)。しかしながら、この機構の理解は、依然として不十分である。その上、可変領域は、抗体毎に異なる。本明細書に記載されるように、pIが低下し、半減期が延長している定常領域変異体は、抗体の薬物動態特性の改善に対する、よりモジュール型の手法を提供する。
F.追加の機能性のための追加のFc変異体
pIアミノ酸変異体に加えて、様々な理由から実施することのできる、いくつかの有用なFcアミノ酸改変が存在し、限定されないが、1つ以上のFcγR受容体に対する結合の変更、FcRn受容体に対する結合の変更等が含まれる。
pIアミノ酸変異体に加えて、様々な理由から実施することのできる、いくつかの有用なFcアミノ酸改変が存在し、限定されないが、1つ以上のFcγR受容体に対する結合の変更、FcRn受容体に対する結合の変更等が含まれる。
したがって、本発明のタンパク質は、アミノ酸改変を含むことができ、これには、pI変異体および立体変異体を含む、本明細書に概説されるヘテロ二量体化変異体が含まれる。変異体の各セットは、任意の特定のヘテロ二量体タンパク質を独立かつ任意選択で含むか、またはこのタンパク質から除外することができる。
G.FcγR変異体
したがって、FcγR受容体のうちの1つ以上への結合を変えるために行うことができる有用なFc置換がいくつか存在する。結合の増加、および結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、FcγRIIIaに対する結合の増加は、ADCC(抗体依存性細胞傷害。これは、細胞が媒介する反応であって、FcγRを発現している、非特異性である細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こす反応である)の増加をもたらすことが知られている。同様に、FcγRIIb(抑制性受容体)に対する結合の減少も、状況によっては、有益であり得る。本発明において有用であるアミノ酸置換には、USSN11/124,620(特に図41)、USSN11/174,287、USSN11/396,495、USSN11/538,406においてリストに記載されるものが含まれ、これらはすべて、参照により全体が明確に本明細書に組み込まれ、特に、そこで開示される変異体に向けて組み込まれる。有用な特定の変異体には、限定されないが、236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V、および299Tが含まれる。
したがって、FcγR受容体のうちの1つ以上への結合を変えるために行うことができる有用なFc置換がいくつか存在する。結合の増加、および結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、FcγRIIIaに対する結合の増加は、ADCC(抗体依存性細胞傷害。これは、細胞が媒介する反応であって、FcγRを発現している、非特異性である細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こす反応である)の増加をもたらすことが知られている。同様に、FcγRIIb(抑制性受容体)に対する結合の減少も、状況によっては、有益であり得る。本発明において有用であるアミノ酸置換には、USSN11/124,620(特に図41)、USSN11/174,287、USSN11/396,495、USSN11/538,406においてリストに記載されるものが含まれ、これらはすべて、参照により全体が明確に本明細書に組み込まれ、特に、そこで開示される変異体に向けて組み込まれる。有用な特定の変異体には、限定されないが、236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V、および299Tが含まれる。
加えて、FcRn受容体に対する結合増加、および血清半減期の増加において有用な追加のFc置換が存在し、参照により全体が組み込まれるUSSN12/341,769において具体的に開示されるとおりであって、限定されないが、434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I、またはV/434S、436V/428L、および259I/308F/428Lが含まれる。
H.切断変異体
同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは、「Fcγ切断変異体」または「Fcノックアウト(FcKOもしくはKO)」変異体である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途に向け、Fcγ受容体(例えば、FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)のうちの1つ以上またはすべてに対するFcドメインの通常の結合を低減または除去して、作用の付加的な機構を回避することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、特に、Fcドメインのうちの1つが1つ以上のFcγ受容体切断変異体を含むように、FcγRIIIa結合を切断して、ADCC活性を排除するか、またはADCCを大幅に低減することが望ましい二重特異性チェックポイント抗体の使用において、これらの切断変異体は、図5に示され、それぞれは、G236R/L328R
、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、およびE233P/L234V/L235A/G236delからなる群から選択される切断変異体を利用する好ましい態様と共に独立かつ任意選択で含むか、または除外することができる。本明細書において参照される切断変異体が、一般に、FcRn結合ではなくFcγR結合を切断することに留意されたい。
同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは、「Fcγ切断変異体」または「Fcノックアウト(FcKOもしくはKO)」変異体である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途に向け、Fcγ受容体(例えば、FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)のうちの1つ以上またはすべてに対するFcドメインの通常の結合を低減または除去して、作用の付加的な機構を回避することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、特に、Fcドメインのうちの1つが1つ以上のFcγ受容体切断変異体を含むように、FcγRIIIa結合を切断して、ADCC活性を排除するか、またはADCCを大幅に低減することが望ましい二重特異性チェックポイント抗体の使用において、これらの切断変異体は、図5に示され、それぞれは、G236R/L328R
、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、およびE233P/L234V/L235A/G236delからなる群から選択される切断変異体を利用する好ましい態様と共に独立かつ任意選択で含むか、または除外することができる。本明細書において参照される切断変異体が、一般に、FcRn結合ではなくFcγR結合を切断することに留意されたい。
当該技術分野で知られるように、ヒトIgG1のFcドメインは、Fcγ受容体への結合が最高であり、したがって、ヘテロ二量体抗体の骨格における定常ドメイン(またはFcドメイン)がIgG1である場合、切断変異体が使用され得る。あるいは、またはIgG1バックグラウンドにおける切断変異体に加えて、グリコシル化位置297における変異(一般に、AまたはSに)は、例えば、FcγRIIIaへの結合を顕著に切断することができる。ヒトIgG2およびIgG4は、Fcγ受容体への自然に低減された結合を有し、したがって、これらの骨格は、切断変異体と共に、または切断変異体を伴わずに使用することができる。
I.ヘテロ二量体およびFc変異体の組み合わせ
当業者に理解されるように、「鎖性」または「単量体区分(monomer partition)」が保持される限り、列記されるヘテロ二量体化変異体(非対称および/またはpI変異体を含む)はすべて、任意選択かつ独立して、何らかの方法で組み合わせることができる。加えて、これらの変異体はすべて、ヘテロ二量体化型のいずれかに組み入れることができる。
当業者に理解されるように、「鎖性」または「単量体区分(monomer partition)」が保持される限り、列記されるヘテロ二量体化変異体(非対称および/またはpI変異体を含む)はすべて、任意選択かつ独立して、何らかの方法で組み合わせることができる。加えて、これらの変異体はすべて、ヘテロ二量体化型のいずれかに組み入れることができる。
pI変異体の場合、特に有用な実施形態は、図に示されているが、精製の容易化のために2つの単量体間のpI差異を変える基礎的な規則に従って、他の組み合わせを生成することができる。
加えて、ヘテロ二量体化変異体、非対称、およびpIのうちのいずれかはまた、一般的に本明細書に概説されるように、Fc切断変異体、Fc変異体、FcRn変異体と独立かつ任意選択で組み合わせられる。
V.本発明の有用な型
当業者に理解され、以下により完全に論じられるように、本発明の二重特異性ヘテロ二量体抗体は、一般に、図1に示されるように、多種多様の立体配置をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」上に1種類の特異性、およびもう一方の「アーム」上に異なる特異性がある「シングルエンド化(single ended)」立体配置を示す。他の図は、分子の「上部」に少なくとも1種類の特異性、および分子の「下部」に1つ以上の異なる特異性がある「二重エンド化(dual ended)」立体配置を示す。したがって、本発明は、異なる第1の抗原および第2の抗原を共捕捉する新規の免疫グロブリン組成物を対象とする。
当業者に理解され、以下により完全に論じられるように、本発明の二重特異性ヘテロ二量体抗体は、一般に、図1に示されるように、多種多様の立体配置をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」上に1種類の特異性、およびもう一方の「アーム」上に異なる特異性がある「シングルエンド化(single ended)」立体配置を示す。他の図は、分子の「上部」に少なくとも1種類の特異性、および分子の「下部」に1つ以上の異なる特異性がある「二重エンド化(dual ended)」立体配置を示す。したがって、本発明は、異なる第1の抗原および第2の抗原を共捕捉する新規の免疫グロブリン組成物を対象とする。
当業者に理解されるように、本発明のヘテロ二量体型は、異なる結合価を有し、かつ二重特異性であってよい。すなわち、本発明のヘテロ二量体抗体は、二価かつ二重特異性であってよく、一方のチェックポイント標的が、1つのABDによって結合され、もう一方のチェックポイント標的が、第2のABDによって結合される。ヘテロ二量体抗体はまた、三価かつ二重特異性であってよく、第1の抗原が、2つのABDによって結合され、第2の抗原が、第2のABDによって結合される。
A.栓抜き型
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、「三重F」または図1Aに示される「栓抜き」足場型である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は、単鎖Fv(以下に定義される「scFv」)を含有し、もう一方の重鎖は、「定型的な」Fab型であって、可変重鎖および軽鎖を含む。この構造は、本明細書で「三重F」型(scFv-Fab-Fc)、または栓抜きにおおよそ視覚的に類似している(図1A参照)ことから「栓抜き」型と呼ばれることがある。2つの鎖は、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域(例えば、Fcドメイン、CH1ドメイン、および/またはヒンジ領域)において、アミノ酸変異体を使用することによって一緒にまとめられており、以下に、より完全に説明される。
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、「三重F」または図1Aに示される「栓抜き」足場型である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は、単鎖Fv(以下に定義される「scFv」)を含有し、もう一方の重鎖は、「定型的な」Fab型であって、可変重鎖および軽鎖を含む。この構造は、本明細書で「三重F」型(scFv-Fab-Fc)、または栓抜きにおおよそ視覚的に類似している(図1A参照)ことから「栓抜き」型と呼ばれることがある。2つの鎖は、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域(例えば、Fcドメイン、CH1ドメイン、および/またはヒンジ領域)において、アミノ酸変異体を使用することによって一緒にまとめられており、以下に、より完全に説明される。
本「三重F」型には、いくつかの明確に異なる利点が存在する。当該技術分野で知られるように、2つのscFv構築物に依存する抗体類似体は、安定性および凝集の問題を有することが多いが、本発明においては、「定型的な」重鎖および軽鎖の対を追加することによって、こうした問題を軽減することができる。加えて、2つの重鎖および2つの軽鎖に依存する型とは対照的に、重鎖および軽鎖が、不正確に対になる(例えば、重1が、軽2と対になる等)という問題は存在しない。
本明細書に概説される実施形態の多くは、一般に、scFvを含む第1の単量体を含む栓抜き型に依存し、このscFvは、scFvリンカー(全ての場合ではないが、多くの場合において帯電している)を使用して共有結合される可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含み、scFvは、通常ドメインリンカー(本明細書に概説されるように、非帯電であるか、または帯電されているかのいずれかであってよいを介して、第1のFcドメインのN末端に共有結合され、また外因性または内因性(例えば、ネイティブヒンジドメインすべてまたはその一部)であり得る。栓抜き型の第2の単量体は重鎖であり、組成物は、軽鎖をさらに含む。
加えて、栓抜き型のFcドメインは、一般に、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)、任意選択で帯電scFvリンカー(図7に示されるものを含む)を含み、重鎖はpI変異体を含む(図4に示されるものを含む)。
いくつかの実施形態では、栓抜き型は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに本明細書で概説するチェックポイント受容体に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント受容体に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この特定の実施形態では、好適な単量体Fvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1お
よびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3、LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLAが挙げられる。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、PD-1に結合するABD 1G6_L1.194_H1.279を含むscFv側を有し、特に有用である。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、CTLA-4に結合する[CTLA-4]_H3.23_L0.129 ABDを含むscFv側を有し、特に有用である。
よびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3、LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLAが挙げられる。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、PD-1に結合するABD 1G6_L1.194_H1.279を含むscFv側を有し、特に有用である。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、CTLA-4に結合する[CTLA-4]_H3.23_L0.129 ABDを含むscFv側を有し、特に有用である。
いくつかの実施形態、特に栓抜き型における特定の使用ものは、CTLA-4 X PD-1、LAG-3 X PD-1、BTLAXPD-1、TIM-3XPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
これらの組み合わせのABD配列は、配列リストに開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、栓抜き型は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この特定の実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、PD-1に結合するABD 1G6_L1.194_H1.279を含むscFv側を有し、特に有用である。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、CTLA-4に結合する[CTLA-4]_H3.23 L0.129 ABDを含むscFv側を有し、特に有用である。
いくつかの実施形態、特に栓抜き型における特定の使用ものは、CTLA-4 X PD-1、LAG-3 X PD-1、BTLAXPD-1、TIM-3XPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
具体的には、図37は、本発明に使用され得るFv配列を欠くいくつかの栓抜き「骨格」配列を示す。すなわち、scFv部分およびFab部分のFv配列は、PD-1およびCTLA-4、PD-1およびTIM-3、PD-1およびLAG-3、PD-1およびTIGIT、PD-1およびBTLA、CTLA-4およびTIM-3、CTLA-4およびLAG-3、CTLA-4およびTIGIT、CTLA-4およびBTLA、TIM-3およびLAG-3、TIM-3およびTIGIT、TIM-3およびBTLA、LAG-3およびTIGIT、LAG-3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAのいずれの組み合わせから使用され得る。配列は、本明細書において配列表および/または図9~13に開示されるもののうちのいずれかであり得る。
図37の栓抜き骨格1について、本発明における特定のFvの使用の組み合わせとしては、PD-1およびCTLA-4、PD-1およびTIM-3、PD-1およびLAG-3、PD-1およびTIGIT、PD-1およびBTLA、CTLA-4およびTIM-3、CTLA-4およびLAG-3、CTLA-4およびTIGIT、CTLA-4およびBTLA、TIM-3およびLAG-3、TIM-3およびTIGIT、TIM-3およびBTLA、LAG-3およびTIGIT、LAG-3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAが挙げられる。配列は、本明細書において配列表および/または図9~13に開示されるもののうちのいずれかであり得る。
図37の栓抜き骨格1について、本発明における特定のFvの使用の組み合わせとしては、CTLA-4(Fab)XPD-1(scFv)、PD-1(Fab)XCTLA-4(scFv)、LAG-3(Fab)XPD-1(scFv)、BTLA(Fab)XPD-1(scFv)、およびLAG-3(Fab)XCTLA-4(scFv)が挙げられる。
図37の栓抜き骨格1(任意選択で428L/434S変異体を含む)について、ヒトPD-1に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1、ならびに配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146のリストに記載されるものが挙げられる。
図37の栓抜き骨格1(任意選択で428L/434S変異体を含む)について、ヒトCTLA-4に結合する特定のABDとしては、限定されないが、[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4
_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
図37の栓抜き骨格1(任意選択で428L/434S変異体を含む)について、ヒトLAG-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
図37の栓抜き骨格1(任意選択で428L/434S変異体を含む)について、ヒトBTLAに結合する特定のABDとしては、限定されないが、9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1および9C6_H1.11_L1、ならびに配列番号20885~21503および配列番号36707~36738のリストに記載されるものが挙げられる。
図37の栓抜き骨格1(任意選択で428L/434S変異体を含む)について、ヒトTIM-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0、ならびに配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706のリストに記載されるものが挙げられる。
具体的な栓抜きの実施形態を以下に概説する。
B.mAb-Fv型
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Hに示されるmAb-Fv型である。この実施形態では、型は、一方の単量体に対する「余分な」可変重ドメインのC末端結合、およびもう一方の単量体に対する「余分な」可変軽ドメインのC末端結合の使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、1つのチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、異なるチェックポイント標的に結合する。
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Hに示されるmAb-Fv型である。この実施形態では、型は、一方の単量体に対する「余分な」可変重ドメインのC末端結合、およびもう一方の単量体に対する「余分な」可変軽ドメインのC末端結合の使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、1つのチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、異なるチェックポイント標的に結合する。
この実施形態では、第1の単量体は、第1の可変重ドメインおよび第1の定常重ドメインを含む第1の重鎖を含み、この第1の定常重ドメインは、ドメインリンカーを使用して第1のFcドメインのC末端に共有結合される第1の可変軽ドメインを有する第1のFcドメインを含む(vh1-CH1-ヒンジ-CH2-CH3-[任意選択のリンカー]-vl2)。第2の単量体は、第2のFcドメインを含む第2の定常重ドメインの第2の可変重ドメインと、ドメインリンカーを使用して第2のFcドメインのC末端に共有結合される第3の可変重ドメインとを含む(vh1-CH1-ヒンジ-CH2-CH3-[任意選択のリンカー]-vh2。2つのC末端に結合された可変ドメインは、scFvを作りあげる。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、2つの同一Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
これらの組み合わせのABD配列は、配列表に開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
加えて、mAb-Fv型のFcドメインは、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)、任意選択で帯電scFvリンカー(図7に示されるものを含む)を含み、重鎖はpI変異体を含む(図4に示されるものを含む)。
いくつかの実施形態では、mAb-Fv型は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1
の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、(Fab-scFvの順)CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、(Fab-scFvの順)CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
いくつかの実施形態では、mAb-Fv型は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、(Fab-scFvの順)CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)に類似するmAb-Fv配列について、ヒトPD-1に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1、ならびに配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)に類似するmAb-Fv配列について、ヒトCTLA-4に結合する特定のABDとしては、限定されないが、[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA
-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)に類似するmAb-scFv配列について、ヒトLAG-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)に類似するmAb-Fv配列について、ヒトBTLAに結合する特定のABDとしては、限定されないが、9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、および9C6_H1.11_L1、ならびに配列番号20885~21503および配列番号36707~36738のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)に類似するmAb-Fv配列について、ヒトTIM-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0、ならびに配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706のリストに記載されるものが挙げられる。
C.mAb-scFv
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Iに示されるmAb-scFv型である。この実施形態では、型は、単量体のうちの1つに対するscFvのC末端結合の使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、1つのチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、異なるチェックポイント標的に結合する。
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Iに示されるmAb-scFv型である。この実施形態では、型は、単量体のうちの1つに対するscFvのC末端結合の使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、1つのチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、異なるチェックポイント標的に結合する。
この実施形態では、第1の単量体は第1の重鎖を含み(可変重ドメインおよび定常ドメインを含む)、C末端共有結合されるscFvは、いずれかの配向(vh1-CH1-ヒンジ-CH2-CH3-[任意選択のリンカー]-vh2-scFvリンカー-vl2またはvh1-CH1-ヒンジ-CH2-CH3-[任意選択のリンカー]-vl2-scFvリンカー-vh2)で、scFv可変軽ドメイン、scFvリンカー、およびscFv可変重ドメインを含む。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む
共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、標的抗原のうちの1つに結合する2つの同一Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、標的抗原のうちの1つに結合する2つの同一Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
これらの組み合わせのABD配列は、配列表に開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
加えて、mAb-scFv型のFcドメインは、一般に、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)、任意選択で帯電scFvリンカー(図7に示されるものを含む)を含み、重鎖はpI変異体を含む(図4に示されるものを含む)。
いくつかの実施形態では、mAb-scFv型は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、(Fab-scFvの順)CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
いくつかの実施形態では、mAb-scFv型は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあ
げる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。mAb-scFv型において、本発明における特定のFvの使用の組み合わせとしては、CTLA-4(Fab)XPD-1(scFv)、PD-1(Fab)XCTLA-4(scFv)、LAG-3(Fab)XPD-1(scFv)、BTLA(Fab)XPD-1(scFv)、およびLAG-3(Fab)XCTLA-4(scFv)が挙げられる。
げる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。mAb-scFv型において、本発明における特定のFvの使用の組み合わせとしては、CTLA-4(Fab)XPD-1(scFv)、PD-1(Fab)XCTLA-4(scFv)、LAG-3(Fab)XPD-1(scFv)、BTLA(Fab)XPD-1(scFv)、およびLAG-3(Fab)XCTLA-4(scFv)が挙げられる。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)において、ヒトPD-1に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1、ならびに配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)において、ヒトCTLA-4に結合する特定のABDとしては、限定されないが、[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)において、ヒトLAG-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、2A11_H0
L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)において、ヒトBTLAに結合する特定のABDとしては、限定されないが、9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、および9C6_H1.11_L1、ならびに配列番号20885~21503および配列番号36707~36738のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)において、ヒトTIM-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0、ならびに配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706のリストに記載されるものが挙げられる。
D.中心scFv
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Fに示される中心scFv型である。この実施形態では、型は、挿入scFvドメインの使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、一方のチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、もう一方のチェックポイント標的に結合する。scFvドメインは、単量体のうちの1つのFcドメインとCH1-Fv領域との間に挿入され、したがって、第3の抗原結合ドメインを提供する。
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Fに示される中心scFv型である。この実施形態では、型は、挿入scFvドメインの使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、一方のチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、もう一方のチェックポイント標的に結合する。scFvドメインは、単量体のうちの1つのFcドメインとCH1-Fv領域との間に挿入され、したがって、第3の抗原結合ドメインを提供する。
この実施形態では、1つの単量体は、第1の可変重ドメイン、CH1ドメイン(および任意選択のヒンジ)、およびFcドメインを含む第1の重鎖を含み、scFvは、scFv可変軽ドメイン、scFvリンカー、およびscFv可変重ドメインを含む。scFvは、任意選択のドメインリンカーを使用して、重定常ドメインのCH1ドメインのC末端と第1のFc ドメインのN末端との間で共有結合される(vh1-CH1-[任意選択のリンカー]-vh2-scFvリンカー-vl2-[ヒンジを含む任意選択のリンカー]-CH2-CH3、またはscFvのための反対の配向、vh1-CH1-[任意選択のリンカー]-vl2-scFvリンカー-vh2-[ヒンジを含む任意選択のリンカー]-CH2-CH3)。他の単量体は標準的なFab側である。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、チェックポイント阻害剤に結合する2つの同一Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD
-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
これらの組み合わせのABD配列は、配列表に開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
加えて、中心scFv型のFcドメインは、一般に、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)、任意選択で帯電scFvリンカー(図7に示されるものを含む)を含み、重鎖はpI変異体を含む(図4に示されるものを含む)。
いくつかの実施形態では、中心scFv型は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4を含む。
いくつかの実施形態では、中心scFv型は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに第1の可変軽ドメイン
と一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4を含む。
と一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4を含む。
図37の栓抜き骨格1に類似する/栓抜き骨格を利用する中心scFv配列(任意選択でM428L/N434Sを含む)ついて、本発明における特定のFvの使用の組み合わせとしては、CTLA-4(Fab)XPD-1(scFv)、PD-1(Fab)XCTLA-4(scFv)、LAG-3(Fab)XPD-1(scFv)、BTLA(Fab)XPD-1(scFv)、およびLAG-3(Fab)XCTLA-4(scFv)が挙げられる。
図37の栓抜き骨格1に類似する/栓抜き骨格を利用する中心scFv配列(任意選択でM428L/N434Sを含む)ついて、ヒトPD-1に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1、ならびに配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146のリストに記載されるものが挙げられる。
図37の栓抜き骨格1に類似する/栓抜き骨格を利用する中心scFv配列(任意選択でM428L/N434Sを含む)ついて、ヒトCTLA-4に結合する特定のABDとしては、限定されないが、[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
図37の栓抜き骨格1に類似する/栓抜き骨格を利用する中心scFv配列(任意選択でM428L/N434Sを含む)ついて、ヒトLAG-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
図37の栓抜き骨格1に類似する/栓抜き骨格を利用する中心scFv配列(任意選択でM428L/N434Sを含む)ついて、ヒトBTLAに結合する特定のABDとしては、限定されないが、9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、および9C6_H1.11_L1、ならびに配列番号20885~21503および配列番号36707~36738のリストに記載されるものが挙げられる。
図37の栓抜き骨格1に類似する/栓抜き骨格を利用する中心scFv配列(任意選択でM428L/N434Sを含む)ついて、ヒトTIM-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0、ならびに配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706のリストに記載されるものが挙げられる。
E.中心Fv型
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Gに示される中心Fv型である。この実施形態では、型は、挿入scFvドメインの使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、一方のチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、もう一方のチェックポイント標的に結合する。scFvドメインは、単量体のFcドメインとCH1-Fv領域との間に挿入され、したがって、第3の抗原結合ドメインを提供し、各単量体は、scFvの構成要素を含有する(例えば、一方の単量体は、可変重ドメインを含み、もう一方は、可変軽ドメインを含む)。
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Gに示される中心Fv型である。この実施形態では、型は、挿入scFvドメインの使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、一方のチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、もう一方のチェックポイント標的に結合する。scFvドメインは、単量体のFcドメインとCH1-Fv領域との間に挿入され、したがって、第3の抗原結合ドメインを提供し、各単量体は、scFvの構成要素を含有する(例えば、一方の単量体は、可変重ドメインを含み、もう一方は、可変軽ドメインを含む)。
この実施形態では、一方の単量体は、第1の可変重ドメイン、CH1ドメイン、およびFcドメイン、ならびに追加の可変軽ドメインを含む第1の重鎖を含む。軽ドメインは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのCH1ドメインのC末端と第1のFcドメインのN末端との間で共有結合される(vh1-CH1-[任意選択のリンカー]-vl2-ヒンジ-CH2-CH3)。もう一方の単量体は、第1の可変重ドメイン、CH1ドメイン、およびFcドメイン、ならびに追加の可変重ドメインを含む第1の重鎖を含む(vh1-CH1-[任意選択のリンカー]-vh2-ヒンジ-CH2-CH3)。軽ドメインは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのCH1ドメインのC末端と第1のFcドメインのN末端との間で共有結合される。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、TTAに結合する2つの
同一Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
同一Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
これらの組み合わせのABD配列は、配列表に開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
中心scFv型において、本発明における特定のFvの使用の組み合わせとしては、CTLA-4(Fab)XPD-1(scFv)、PD-1(Fab)XCTLA-4(scFv)、LAG-3(Fab)XPD-1(scFv)、BTLA(Fab)XPD-1(scFv)、およびLAG-3(Fab)XCTLA-4(scFv)が挙げられる。
中心scFv型において、ヒトPD-1に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1、ならびに配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146のリストに記載されるものが挙げられる。
中心scFv型において、ヒトCTLA-4に結合する特定のABDとしては、限定されないが、[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4
]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
中心scFv型において、ヒトLAG-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
中心scFv型において、ヒトBTLAに結合する特定のABDとしては、限定されないが、9C6_H0L0;9C6 H1.1_L1および9C6_H1.11_L1、ならびに配列番号20885~21503および配列番号36707~36738のリストに記載されるものが挙げられる。
中心scFv型において、ヒトTIM-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0、ならびに配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706のリストに記載されるものが挙げられる。
F.片腕中心scFv
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Cに示される片腕中心scFv型である。この実施形態では、一方の単量体は、Fcドメインのみを含み、もう一方の単量体は、挿入scFvドメインを使用し、したがって、第2の抗原結合ドメインを形成する。この型では、Fab部分のいずれかが1つのチェックポイント標的に結合し、scFvは別のチェックポイント標的に結合する。scFvドメインは、単量体のうちの1つのFcドメインとCH1-Fv領域との間に挿入される。
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Cに示される片腕中心scFv型である。この実施形態では、一方の単量体は、Fcドメインのみを含み、もう一方の単量体は、挿入scFvドメインを使用し、したがって、第2の抗原結合ドメインを形成する。この型では、Fab部分のいずれかが1つのチェックポイント標的に結合し、scFvは別のチェックポイント標的に結合する。scFvドメインは、単量体のうちの1つのFcドメインとCH1-Fv領域との間に挿入される。
この実施形態では、1つの単量体は、scFv可変軽ドメイン、scFvリンカー、およびscFv可変重ドメインを含むscFvを有する第1の可変重ドメイン、CH1ドメイン、およびFcドメインを含む第1の重鎖を含む。scFvは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのCH1ドメインのC末端と第1のFcドメインのN末端との間で共有結合される。第2の単量体は、Fcドメインを含む。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体など
が含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
が含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
これらの組み合わせのABD配列は、配列表に開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
加えて、片腕中心scFv型のFcドメインは、一般に、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)、任意選択で帯電scFvリンカー(図7に示されるものを含む)を含み、重鎖はpI変異体を含む(図4に示されるものを含む)。
いくつかの実施形態では、片腕中心scFv型は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4を含む。
いくつかの実施形態では、片腕中心scFv型は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236d
el/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4を含む。
el/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4を含む。
片腕中心scFv型において、ヒトPD-1に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1、ならびに配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146のリストに記載されるものが挙げられる。
片腕中心scFv型において、ヒトCTLA-4に結合する特定のABDとしては、限定されないが、[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
片腕中心scFv型において、ヒトLAG-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18
_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
片腕中心scFv型において、ヒトBTLAに結合する特定のABDとしては、限定されないが、9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、および9C6_H1.11_L1、ならびに配列番号20885~21503および配列番号36707~36738のリストに記載されるものが挙げられる。
片腕中心scFv型において、ヒトTIM-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0、ならびに配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706のリストに記載されるものが挙げられる。
G.片腕scFv-mAb
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Dに示される片腕scFv-mAb型である。この実施形態では、一方の単量体はFcドメインのみを含み、もう一方の単量体は、一般にリンカー:vh-scFvリンカー-vl-[任意選択のドメインリンカー]-CH1-ヒンジ-CH2-CH3または(逆の配向において)vl-scFvリンカー-vh-[任意選択のドメインリンカー]-CH1-ヒンジ-CH2-CH3の使用により、重鎖のN末端で結合されるscFvドメインを使用する。この型では、Fab部分のいずれかが1つのチェックポイント標的に結合し、scFvは別のチェックポイント標的に結合する。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Dに示される片腕scFv-mAb型である。この実施形態では、一方の単量体はFcドメインのみを含み、もう一方の単量体は、一般にリンカー:vh-scFvリンカー-vl-[任意選択のドメインリンカー]-CH1-ヒンジ-CH2-CH3または(逆の配向において)vl-scFvリンカー-vh-[任意選択のドメインリンカー]-CH1-ヒンジ-CH2-CH3の使用により、重鎖のN末端で結合されるscFvドメインを使用する。この型では、Fab部分のいずれかが1つのチェックポイント標的に結合し、scFvは別のチェックポイント標的に結合する。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
これらの組み合わせのABD配列は、配列表に開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
加えて、のFcドメインは、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K
、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)、任意選択で帯電scFvリンカー(図7に示されるものを含む)を含み、重鎖はpI変異体を含む(図4に示されるものを含む)。
、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)、任意選択で帯電scFvリンカー(図7に示されるものを含む)を含み、重鎖はpI変異体を含む(図4に示されるものを含む)。
いくつかの実施形態では、片腕scFv-mAb型は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4を含む。
いくつかの実施形態では、片腕scFv-mAb型は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4を含む。
片腕scFv-mAb型において、ヒトPD-1に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1、ならびに配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146のリストに記載されるものが挙げられる。
片腕scFv-mAb型において、ヒトCTLA-4に結合する特定のABDとしては、限定されないが、[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0
、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
片腕scFv-mAb型において、ヒトLAG-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
片腕scFv-mAb型において、ヒトBTLAに結合する特定のABDとしては、限定されないが、9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、および9C6_H1.11_L1、ならびに配列番号20885~21503および配列番号36707~36738のリストに記載されるものが挙げられる。
片腕scFv-mAb型において、ヒトTIM-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1D10_H0L0;1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12 L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0、ならびに配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706のリストに記載されるものが挙げられる。
H.scFv-mAb型
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Eに示されるmAb-scFv型である。この実施形態では、型は、単量体のうちの1つに対するscFvのN末端結合の使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、1つのチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、異なるチェックポイント標的に結合する。
本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、図1Eに示されるmAb-scFv型である。この実施形態では、型は、単量体のうちの1つに対するscFvのN末端結合の使用に依存し、したがって、第3の抗原結合ドメインを形成し、2つの単量体のFab部分は、1つのチェックポイント標的に結合し、「余分な」scFvドメインは、異なるチェックポイント標的に結合する。
この実施形態では、第1の単量体は第1の重鎖を含み(可変重ドメインおよび定常ドメインを含む)、N末端共有結合されるscFvは、いずれかの配向((vh1-scFvリンカー-vl1-[任意選択のドメインリンカー]-vh2-CH1-ヒンジ-CH2-CH3)または(逆の配向でscFvで)((vl1-scFvリンカー-vh1-[任意選択のドメインリンカー]-vh2-CH1-hinge-CH2-CH3))で、scFv可変軽ドメイン、scFvリンカー、およびscFv可変重ドメインを含む。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、標的抗原のうちの1つに結合する2つの同一Fabを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、pI変異体、切断変異体、追加のFc変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なFvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD-1およびCTLA-4、CTLA-4およびPD-1、PD-1およびTIM-3、TIM-3およびPD-1、PD-1およびLAG-3、LAG-3XPD1、PD-1およびTIGIT、TIGITおよびPD-1、PD-1およびBTLA、BTLAおよびPD-1、CTLA-4およびTIM-3、TIM-3およびCTLA-4、CTLA-4およびLAG-3、LAG-3およびCTLA-4、CTLA-4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA-4、CTLA-4およびBTLA、BTLAおよびCTLA-4、TIM-3およびLAG-3、LAG-3およびTIM-3、TIM-3およびTIGIT、TIGITおよびTIM-3、TIM-3およびBTLA、BTLAおよびTIM-3が挙げられる。LAG-3およびTIGIT、TIGITおよびLAG-3、LAG-3およびBTLA、BTLAおよびLAG-3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLA。
これらの組み合わせのABD配列は、配列表に開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
加えて、scFv-mAb型のFcドメインは、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)、任意選択で帯電scFvリンカー(図7に示されるものを含む)を含み、重鎖はpI変異体を含む(図4に示されるものを含む)。
いくつかの実施形態では、mAb-scFv型は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234
V/L235A/G236del/S267K、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、(Fab-scFvの順)CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
V/L235A/G236del/S267K、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、(Fab-scFvの順)CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
いくつかの実施形態では、mAb-scFv型は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、(Fab-scFvの順)CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
図38のmAb-scFv型骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)について、ヒトPD-1に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1、ならびに配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv型骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)について、ヒトCTLA-4に結合する特定のABDとしては、限定されないが、[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[C
TLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
TLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74、ならびに配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv型骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)について、ヒトLAG-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1、ならびに配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv型骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)について、ヒトBTLAに結合する特定のABDとしては、限定されないが、9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、および9C6_H1.11_L1、ならびに配列番号20885~21503および配列番号36707~36738のリストに記載されるものが挙げられる。
図38のmAb-scFv型骨格1(任意選択でM428L/N434Sを含む)について、ヒトTIM-3に結合する特定のABDとしては、限定されないが、1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0 1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0、ならびに配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706のリストに記載されるものが挙げられる。
I.二重scFv型
本発明はまた、当該技術分野で知られ、図1Bに示される二重scFv型も提供する。この実施形態では、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、2つのscFv-Fc単量体(両方とも(vh-scFvリンカー-vl-[任意選択のドメインリンカー]-CH2-CH3)型または(vl-scFvリンカー-vh-[任意選択のドメインリンカー]-CH2-CH3)型のいずれかで、または一方の単量体が一方の配向、そしてもう一方が他方の配向で構成される。
本発明はまた、当該技術分野で知られ、図1Bに示される二重scFv型も提供する。この実施形態では、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、2つのscFv-Fc単量体(両方とも(vh-scFvリンカー-vl-[任意選択のドメインリンカー]-CH2-CH3)型または(vl-scFvリンカー-vh-[任意選択のドメインリンカー]-CH2-CH3)型のいずれかで、または一方の単量体が一方の配向、そしてもう一方が他方の配向で構成される。
この場合、全てのABDはscFv型であり、PD-1およびCTLA-4、PD-1およびTIM-3、PD-1およびLAG-3、PD-1およびTIGIT、PD-1お
よびBTLA、CTLA-4およびTIM-3、CTLA-4およびLAG-3、CTLA-4およびTIGIT、CTLA-4およびBTLA、TIM-3およびLAG-3、TIM-3およびTIGIT、TIM-3およびBTLA、LAG-3およびTIGIT、LAG-3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAのいずれの組み合わせが有用である。これらの組み合わせのABD配列は、配列表に開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
よびBTLA、CTLA-4およびTIM-3、CTLA-4およびLAG-3、CTLA-4およびTIGIT、CTLA-4およびBTLA、TIM-3およびLAG-3、TIM-3およびTIGIT、TIM-3およびBTLA、LAG-3およびTIGIT、LAG-3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAのいずれの組み合わせが有用である。これらの組み合わせのABD配列は、配列表に開示されるか、または図9~13に示されるとおりであり、図39および図40に示される任意の組み合わせであり得る。
加えて、二重scFv型のFcドメインは、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)、任意選択で帯電scFvリンカー(図7に示されるものを含む)を含み、重鎖はpI変異体を含む(図4に示されるものを含む)。
いくつかの実施形態では、二重scFv型は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、(Fab-scFvの順)CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
いくつかの実施形態では、二重scFv型は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、a)非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに軽鎖の第1の可変軽ドメインと一緒になって、第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重ドメインを含む第1の単量体と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに第1の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第1のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる第1の可変重ドメイン、および第2の可変重鎖と一緒になって、第2のチェックポイント阻害剤に結合するFv(ABD)を形成する第2の可変軽鎖を含む第2の単量体と、c)第1の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、(Fab-scFvの順)CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、およびLAG-3XCTLA-4である。
J.非ヘテロ二量体二重特異性抗体
当業者に理解されるように、本明細書に概説されるFv配列は、単一特異性抗体(例えば、「従来のモノクローナル抗体」)または非ヘテロ二量体二重特異性型の両方で使用することもできる。
当業者に理解されるように、本明細書に概説されるFv配列は、単一特異性抗体(例えば、「従来のモノクローナル抗体」)または非ヘテロ二量体二重特異性型の両方で使用することもできる。
好適な非ヘテロ二量体二重特異性型は、当該技術分野で知られており、一般にSpiess et al.,Molecular Immunology(67):95-106(2015)およびKontermann,mAbs 4:2,182-197(2012)(それらの両方が参照により、特に、その中の型に対する図、凡例、および引用に関して明確的に組み込まれる)に示されるいくつかの異なる型を含む。
K.単一特異性モノクローナル抗体
当業者に理解されるように、本明細書に概説される新規Fv配列は、単一特異性抗体(例えば、「従来のモノクローナル抗体」)または非ヘテロ二量体二重特異性型の両方で使用することもできる。したがって、本発明は、一般に、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4定常領域を有する、6つのCDR、ならびに/または図のvh配列およびvl配列を含むモノクローナル(単一特異性)抗体を提供し、IgG1、IgG2、およびIgG4(S228Pアミノ酸置換を含むIgG4定常領域を含む)がいくつかの実施形態において特に有用である。すなわち、「H_L」指定を有する本明細書の任意の配列は、ヒトIgG1抗体の定常領域に連結され得る。
当業者に理解されるように、本明細書に概説される新規Fv配列は、単一特異性抗体(例えば、「従来のモノクローナル抗体」)または非ヘテロ二量体二重特異性型の両方で使用することもできる。したがって、本発明は、一般に、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4定常領域を有する、6つのCDR、ならびに/または図のvh配列およびvl配列を含むモノクローナル(単一特異性)抗体を提供し、IgG1、IgG2、およびIgG4(S228Pアミノ酸置換を含むIgG4定常領域を含む)がいくつかの実施形態において特に有用である。すなわち、「H_L」指定を有する本明細書の任意の配列は、ヒトIgG1抗体の定常領域に連結され得る。
VI.抗原を標的とする抗原結合ドメイン
本発明の二重特異性抗体は、一般に図1に示されるように、二価の二重特異性型、または三価の二重特異性型のいずれかで、2つの異なる標的チェックポイント抗原(「標的対」)に結合する2つの異なる抗原結合ドメイン(ABD)を有する。好適な標的チェックポイント抗原としては、ヒト(および時としてcyno)PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、およびBTLAが含まれ、それらの配列は図2に示される。したがって、好適な二重特異性抗体は、PD-1およびCTLA-4、PD-1およびTIM-3、PD-1およびLAG-3、PD-1およびTIGIT、PD-1およびBTLA、CTLA-4およびTIM-3、CTLA-4およびLAG-3、CTLA-4およびTIGIT、CTLA-4およびBTLA、TIM-3およびLAG-3、TIM-3およびTIGIT、TIM-3およびBTLA、LAG-3およびTIGIT、LAG-3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAに結合する。一般に、これらの二重特異性抗体は、各対について、「抗PD-1X抗CTLA-4」、または一般に単純化して、または簡単にするために(よって互換的に)、「PD-1XCTLA-4」等と命名されることに留意する。本明細書において指定されない限り、名称における抗原リストの順序は、構造を付与しないことに留意されたい。すなわち、PD-1XCTLA-4栓抜き抗体はPD-1またはCTLA-4に結合するscFvを有し得るが、場合によっては、順序は示されるように構造を指定する。
本発明の二重特異性抗体は、一般に図1に示されるように、二価の二重特異性型、または三価の二重特異性型のいずれかで、2つの異なる標的チェックポイント抗原(「標的対」)に結合する2つの異なる抗原結合ドメイン(ABD)を有する。好適な標的チェックポイント抗原としては、ヒト(および時としてcyno)PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、およびBTLAが含まれ、それらの配列は図2に示される。したがって、好適な二重特異性抗体は、PD-1およびCTLA-4、PD-1およびTIM-3、PD-1およびLAG-3、PD-1およびTIGIT、PD-1およびBTLA、CTLA-4およびTIM-3、CTLA-4およびLAG-3、CTLA-4およびTIGIT、CTLA-4およびBTLA、TIM-3およびLAG-3、TIM-3およびTIGIT、TIM-3およびBTLA、LAG-3およびTIGIT、LAG-3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAに結合する。一般に、これらの二重特異性抗体は、各対について、「抗PD-1X抗CTLA-4」、または一般に単純化して、または簡単にするために(よって互換的に)、「PD-1XCTLA-4」等と命名されることに留意する。本明細書において指定されない限り、名称における抗原リストの順序は、構造を付与しないことに留意されたい。すなわち、PD-1XCTLA-4栓抜き抗体はPD-1またはCTLA-4に結合するscFvを有し得るが、場合によっては、順序は示されるように構造を指定する。
本明細書でより完全に概説されるように、ABDのこれらの組み合わせは、以下に概説されるように、様々な型であってよく、一般に、一方のABDがFab型であり、もう一方がscFv型である組み合わせである。本明細書で論じられ、図1に示されるように、いくつかの型は、単一のFabおよび単一のscFv(図1A、C、およびD)を使用し、いくつかの型は、2つのFabおよび単一のscFv(図1E、F、G、H、およびI)を使用する。
A.抗原結合ドメイン
本明細書で論じられるように、本発明の二重特異性チェックポイントヘテロ二量体抗体
は、2つの抗原結合ドメイン(ABD)を含み、それらのそれぞれが異なるチェックポイントタンパク質に結合する。本明細書で概説されるように、これらのヘテロ二量体抗体は、二重特異性および二価(各抗原が、例えば図1Aに示される型で、単一のABDによって結合される)であるか、または二重特異性および三価(例えば図1Fに示されるように、一方の抗原が単一のABDによって結合され、もう一方が2つのABDによって結合される)であり得る。
本明細書で論じられるように、本発明の二重特異性チェックポイントヘテロ二量体抗体
は、2つの抗原結合ドメイン(ABD)を含み、それらのそれぞれが異なるチェックポイントタンパク質に結合する。本明細書で概説されるように、これらのヘテロ二量体抗体は、二重特異性および二価(各抗原が、例えば図1Aに示される型で、単一のABDによって結合される)であるか、または二重特異性および三価(例えば図1Fに示されるように、一方の抗原が単一のABDによって結合され、もう一方が2つのABDによって結合される)であり得る。
加えて、一般に、ABDのうちの1つは、vh-scFvリンカー-vlまたはvl-scFvリンカー-vhのNからC末端の配向で、本明細書に概説されるscFvを含む。型により、他のABDの一方または両方は、一般にFabであり、一方のタンパク質鎖(一般に、重鎖の構成要素として)上にvhドメインを含み、そして別のタンパク質鎖(一般に、軽鎖の構成要素として)上にvlを含む。
本発明は、以下に概説されるように、いくつかの異なるチェックポイントタンパク質に結合するいくつかのABDを提供する。当業者に理解されるように、6つのCDRまたはvhおよびvlドメインの任意のセットは、scFv型またはFab型であり得、これは、次いで、重定常ドメインおよび軽定常ドメインに付加され、ここで、重定常ドメインは変異体を含む(CH1ドメインならびにFcドメイン内に含まれる)。配列表に含まれるscFv配列は特定の帯電リンカーを利用するが、本明細書で概説されるように、非帯電または他の帯電リンカーを使用することができ、図7に示されるものを含む。
加えて、上述のように、CDRの識別配列表で使用される番号付けはKabatであるが、異なる番号付けを使用することができ、表1に示されるように、CDRのアミノ酸配列が変化する。
本明細書のリストに記載される可変重ドメインおよび可変軽ドメインの全てについて、さらなる変異体が作製され得る。本明細書で概説されるように、いくつかの実施形態では、6つのCDRのセットは、フレームワーク(CDRを除く)が米国特許第7,657,380号の図1(図および凡例は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)のリストに記載されるものから選択されるヒト生殖系列配列に対して少なくとも80、85、または90%の同一性を保持する限り、0、1、2、3、4、または5つのアミノ酸改変(アミノ酸置換が特に有用である)、ならびに可変重ドメインおよび可変軽ドメインのフレームワーク領域に変化を有することができる。したがって、例えば、本明細書に記載される同一のCDRは、フレームワーク領域が米国特許第7,657,380号の図1のリストに記載されるものから選択されるヒト生殖系列配列に対して少なくとも80、85、または90%の同一性を保持する限り、ヒト生殖系列配列からの異なるフレームワーク配列と組み合わせることができる。あるいは、CDRは、アミノ酸改変(例えば、CDRのセットにおいて1、2、3、4、または5つのアミノ酸改変(すなわち、6つのCDRのセットにおける総変化数が6未満のアミノ酸改変である限り、CDRを改変することができ、CDRの任意の組み合わせが変化する。例えば、vlCDR1において1つの変化、vhCDR2において2つの変化、vhCDR3において変化なしなどであってよい)を有し、またフレームワーク領域が米国特許第7,657,380号の図1のリストに記載されるものから選択されるヒト生殖系列配列に対して少なくとも80、85、または90%の同一性を保持する限り、フレームワーク領域の変化を有することができる。
B.PD-1抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはPD-1に結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146に
示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、図9に示され、識別子1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1を有する、配列表のそれらの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはPD-1に結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146に
示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、図9に示され、識別子1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1を有する、配列表のそれらの配列を含む。
当業者に理解されるように、好適な抗PD-1ABDは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表1に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146のvhおよびvl配列内の他のアライメントを使用して同定されるCDRとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される6つのCDRのセットを含み得る。好適なABDはまた、scFvまたはFabとして使用される、これらの配列および図に示されるvhおよびvl配列全体も含み得る。Fv対PD-1を含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、PD-1に結合するのはscFv単量体である。本明細書で論じられるように、PD-1が抗原のうちの1つであるときの標的対の他方は、CTLA-4(好適な配列は、配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、TIM-3(好適な配列は、配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、LAG-3(好適な配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、BTLA(好適な配列は、配列番号20885~21503および配列番号36707~36738(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、およびTIGIT(好適な配列は、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))から選択される。
ヒトPD-1に結合する特に有用なABDには、限定されないが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1が含まれる。
ABD対PD-1を形成する配列表に開示される親CDRセットに加えて、本発明は変異体CDRセットを提供する。一実施形態では、6つのCDRのセットは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(biolayer interferometry:バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親CDRから1、2、3、4、または5つのアミノ酸変化を有することができる。
ABD対PD-1を形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体vhおよびvl ドメインを提供する。一実施形態では、変異体vhおよびvlドメインはそれぞれ、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つで測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親vhおよびvlドメインから1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸変化を有することができる。別の実施形態では、変異体vhおよびvlは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Oct
etアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親vhまたはvlに対して少なくとも90、95、97、98、または99%同一である。
etアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親vhまたはvlに対して少なくとも90、95、97、98、または99%同一である。
具体的な好ましい実施形態としては、図37の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、scFv型の1G6_L1.194_H1.279抗PD-1 Fvが挙げられる。
具体的な好ましい実施形態としては、図38のmAb-scFv型骨格のいずれかの中に含まれる、scFv型の1G6_L1.194_H1.279抗PD-1 Fvが挙げられる。
C.CTLA-4抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはCTLA-4に結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、図10に示され、識別子[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、0[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74を有する、配列表のそれらの配列も含む。
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはCTLA-4に結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、図10に示され、識別子[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、0[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74を有する、配列表のそれらの配列も含む。
当業者に理解されるように、好適な抗CTLA-4ABDは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表1に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416のvhおよびvl配列内の他のアライメントを使用して同定されるCDRとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される6つのCDRのセットを含み得る。好適なABDはまた、scFvまたはFabとして使用される、これらの配列および図に示されるvhおよびvl配列全体も含み得る。Fv対CTLA-4を含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、CTLA-4に結合するのはscFv単量体である。本明細書で論じられるように、CTLA-4が抗原のうちの1つであるときの標的対の他方は、PD-1(好適な配列は、配列番号6209~1
1464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、TIM-3(好適な配列は、配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、LAG-3(好適な配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、BTLA(好適な配列は、配列番号20885~21503および配列番号36707~36738(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、およびTIGIT(好適な配列は、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))から選択される。
1464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、TIM-3(好適な配列は、配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、LAG-3(好適な配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、BTLA(好適な配列は、配列番号20885~21503および配列番号36707~36738(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、およびTIGIT(好適な配列は、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))から選択される。
ABD対CTLA-4を形成する配列表に開示される親CDRセットに加えて、本発明は変異体CDRセットを提供する。一実施形態では、6つのCDRのセットは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(biolayer interferometry:バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親CDRから1、2、3、4、または5つのアミノ酸変化を有することができる。
ABD対CTLA-4を形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体vhおよびvlドメインを提供する。一実施形態では、変異体vhおよびvlドメインはそれぞれ、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親vhおよびvlドメインから1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸変化を有することができる。別の実施形態では、変異体vhおよびvlは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親vhまたはvlに対して少なくとも90、95、97、98、または99%同一である。
具体的な好ましい実施形態としては、図37の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、Fab型の[CTLA-4]_H3_L0.22抗CTLA-4 Fvが挙げられる。
具体的な好ましい実施形態としては、図37の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、scFv型の[CTLA-4]_H3_L0.22抗CTLA-4 Fvが挙げられる。
具体的な好ましい実施形態としては、図38のmAb-scFv型骨格のいずれかの中に含まれる、scFv型の[CTLA-4]_H3_L0.22抗CTLA-4 Fvが挙げられる。
具体的な好ましい実施形態としては、図38のmAb-scFv型骨格のいずれかの中に含まれる、Fab型の[CTLA-4]_H3_L0.22抗CTLA-4 Fvが挙げられる。
D.TIM-3抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはTIM-3に結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、識別子1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0を有する、配列表のそれらの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはTIM-3に結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、識別子1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0を有する、配列表のそれらの配列を含む。
当業者に理解されるように、好適な抗TIM-3ABDは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表1に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706のvhおよびvl配列内の他のアライメントを使用して同定されるCDRとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される6つのCDRのセットを含み得る。好適なABDはまた、scFvまたはFabとして使用される、これらの配列および図に示されるvhおよびvl配列全体も含み得る。Fv対TIM-3を含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、TIM-3に結合するのはFab単量体である。本明細書で論じられるように、TIM-3が抗原のうちの1つであるときの標的対の他方は、PD-1(好適な配列は、配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、CTLA-4(好適な配列は、配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、LAG-3(好適な配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、BTLA(好適な配列は、配列番号20885~21503および配列番号36707~36738(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、およびTIGIT(好適な配列は、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))から選択される。
ABD対TIM-3を形成する配列表に開示される親CDRセットに加えて、本発明は変異体CDRセットを提供する。一実施形態では、6つのCDRのセットは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(biolayer interferometry:バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親CDRから1、2、3、4、または5つのアミノ酸変化を有することができる。
ABD対TIM-3を形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体vhおよびvlドメインを提供する。一実施形態では、変異体vhおよびvlドメインはそれぞれ、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つで測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親vhおよびvlドメインから1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸変化を有す
ることができる。別の実施形態では、変異体vhおよびvlは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親vhまたはvlに対して少なくとも90、95、97、98、または99%同一である。
ることができる。別の実施形態では、変異体vhおよびvlは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親vhまたはvlに対して少なくとも90、95、97、98、または99%同一である。
LAG-3抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはLAG-3に結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、図11に示され、識別子2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28 L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1を有する、配列表のそれらの配列も含む。
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはLAG-3に結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、図11に示され、識別子2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28 L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1を有する、配列表のそれらの配列も含む。
当業者に理解されるように、好適な抗LAG-3ABDは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表1に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002のvhおよびvl配列内の他のアライメントを使用して同定されるCDRとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される6つのCDRのセットを含み得る。好適なABDはまた、scFvまたはFabとして使用される、これらの配列および図に示されるvhおよびvl配列全体も含み得る。Fv対LAG-3を含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、LAG-3に結合するのはFab単量体である。本明細書で論じられるように、LAG-3が抗原のうちの1つであるときの標的対の他方は、PD-1(好適な配列は、配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、CTLA-4(好適な配列は、配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、TIM-3(好適な配列は、配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、BTLA(好適な配列は、配列番号20885~21503および配列番号36707~36738(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、およびTIGIT(好適な配列は、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))から選択される。
ABD対LAG-3を形成する配列表に開示される親CDRセットに加えて、本発明は
変異体CDRセットを提供する。一実施形態では、6つのCDRのセットは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(biolayer interferometry:バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親CDRから1、2、3、4、または5つのアミノ酸変化を有することができる。
変異体CDRセットを提供する。一実施形態では、6つのCDRのセットは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(biolayer interferometry:バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親CDRから1、2、3、4、または5つのアミノ酸変化を有することができる。
ABD対LAG-3を形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体vhおよびvlドメインを提供する。一実施形態では、変異体vhおよびvlドメインはそれぞれ、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親vhおよびvlドメインから1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸変化を有することができる。別の実施形態では、変異体vhおよびvlは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親vhまたはvlに対して少なくとも90、95、97、98、または99%同一である。
具体的な好ましい実施形態としては、図37の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、Fab型の7G8_H3.30_L1.34抗LAG-3 Fvが挙げられる。
具体的な好ましい実施形態としては、図37の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、scFv型の7G8_H3.30_L1.34抗LAG-3 Fvが挙げられる。
E.BTLA抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはBTLAに結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号20885~21503および配列番号36707~36738に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、図12に示され、識別子9C6_H0L0;9C6_H1.1_L1および9C6_H1.11_L1を有する、配列表のそれらの配列も含む。
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはBTLAに結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号20885~21503および配列番号36707~36738に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のABD配列は、図12に示され、識別子9C6_H0L0;9C6_H1.1_L1および9C6_H1.11_L1を有する、配列表のそれらの配列も含む。
当業者に理解されるように、好適な抗BTLA ABDは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表1に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、vhおよびvl配列の配列番号20885~21503および配列番号36707~36738の内の他のアライメントを使用して同定されるCDRとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される6つのCDRのセットを含み得る。好適なABDはまた、scFvまたはFabとして使用される、これらの配列および図に示されるvhおよびvl配列全体も含み得る。Fv対BTLAを含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、BTLAに結合するのはFab単量体である。本明細書で論じられるように、LAG-3が抗原のうちの1つであるときの標的対の他方は、PD-1(好適な配列は、配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、CTLA-4(好適な配列は、配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、TIM-3(好適な配列は、配
列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、LAG-3(好適な配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、およびTIGIT(好適な配列は、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))から選択される。
列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、LAG-3(好適な配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、およびTIGIT(好適な配列は、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))から選択される。
ABD対BTLAを形成する配列表に開示される親CDRセットに加えて、本発明は変異体CDRセットを提供する。一実施形態では、6つのCDRのセットは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(biolayer interferometry:バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つで測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親CDRから1、2、3、4、または5つのアミノ酸変化を有することができる。
ABD対BTLAを形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体vhおよびvlドメインを提供する。一実施形態では、変異体vhおよびvlドメインはそれぞれ、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、親vhおよびvlドメインから1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸変化を有することができる。別の実施形態では、変異体vhおよびvlは、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つによって測定されるとき(多くの実施形態において後者が得に有用である)、ABDが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親vhまたはvlに対して少なくとも90、95、97、98、または99%同一である。
具体的な好ましい実施形態としては、図37の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、Fab型の9C6_H1.1_L1抗LAG-3 Fvが挙げられる。
具体的な好ましい実施形態としては、図37の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、scFv型の7G8_H3.30_L1.34抗LAG-3 Fvが挙げられる。
F.TIGIT抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはTIGITに結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586に示される。
いくつかの実施形態では、ABDのうちの1つはTIGITに結合する。好適な6つのCDRのセットならびに/またはvhおよびvlドメイン、ならびにscFv配列は、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586に示される。
当業者に理解されるように、好適な抗TIGIT ABDは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表1に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号21504~21523および配列番号37435~37586のvhおよびvl配列内の他のアライメントを使用して同定されるCDRとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される6つのCDRのセットを含み得る。好適なABDはまた、scFvまたはFabとして使用される、これらの配列および図に示されるvhおよびvl配列全体も含み得る。Fv対TIGITを含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、TIGITに結合するのはFab単量体である。本明細書で論じられるように、L
AG-3が抗原のうちの1つであるときの標的対の他方は、PD-1(好適な配列は、配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、CTLA-4(好適な配列は、配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、TIM-3(好適な配列は、配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、LAG-3(好適な配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、およびBTLA(好適な配列は、配列番号20885~21503および配列番号36707~36738(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))から選択される。
AG-3が抗原のうちの1つであるときの標的対の他方は、PD-1(好適な配列は、配列番号6209~11464、配列番号11465~17134、配列番号33003~33072、配列番号33073~35394、および配列番号36127~36146(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、CTLA-4(好適な配列は、配列番号21~2918、配列番号2919~6208、配列番号36739~36818、および配列番号35395~35416(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、TIM-3(好適な配列は、配列番号20765~20884、配列番号37587~37698、および配列番号36347~36706(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、LAG-3(好適な配列は、配列番号17135~20764、配列番号36819~36962、配列番号35417~35606、配列番号25194~32793、および配列番号32794~33002(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))、およびBTLA(好適な配列は、配列番号20885~21503および配列番号36707~36738(scFv配列、CDR配列セット、またはvhおよびvl配列であり得る))から選択される。
G.具体的な二重特異性実施形態
本発明は、以下に概説されるように、いくつかの特定の二重特異性抗体を提供する。
本発明は、以下に概説されるように、いくつかの特定の二重特異性抗体を提供する。
1.LAG-3XCTLA-4
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトLAG-3に結合する第1のABDと、ヒトCTLA-4に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがLAG-3側であり、CLTA-4側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトLAG-3に結合する第1のABDと、ヒトCTLA-4に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがLAG-3側であり、CLTA-4側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
一実施形態では、LAG-3XCTLA-4二重特異性抗体は、図1Aの栓抜き型であり、CTLA-4 ABDはscFvである。別の実施形態では、LAG-3XCTLA-4二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、LAG-3 ABDはFab構成要素である。別の実施形態では、LAG-3XCTLA-4二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、CTLA-4 ABDはscFvである。
LAG-3XCTLA-4二重特異性抗体(栓抜き型または中心scFv型のいずれか)は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、2つの単量体のFcドメインは、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)を含み、Fab側を含む単量体(例えば、重鎖定常ドメイン)は、pI変異体(図4に示されるものを含む)を含む。
いくつかの実施形態では、LAG-3XCTLA-4二重特異性抗体は、非対称変異体を有するFcドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、LAG-3XCTLA-4抗体は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列
が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびCTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129を利用するが、配列表中のCTLA-4またはLAG-3 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびCTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129を利用するが、配列表中のCTLA-4またはLAG-3 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
いくつかの実施形態では、LAG-3XCTLA-4抗体は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびCTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129を利用するが、配列表中のCTLA-4またはLAG-3 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
さらなる実施形態は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびCTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129を有する、図37からの骨格のうちのいずれかを含む。
さらなる実施形態は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびCTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129を有する、図38からの骨格のうちのいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、LAG-3XCLTA-4二重特異性抗体について、LAG-3 Fab側のFvは、識別子2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122;2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。CTLA-4 scFv側のFvは、識別子[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[
CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、0[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、0[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
いくつかの実施形態では、LAG-3XCTLA-4二重特異性抗体は、配列番号35607~35866および配列番号21524~22620のリストに記載されるそれらの構築物から選択される。
いくつかの実施形態では、LAG-3XCTLA-4二重特異性抗体は、XENP20206、XENP21582、XENP21584、XENP21588、XENP22123、XENP22124、XENP22125、XENP22604、XENP22672、XENP22847、XENP22847、XENP22841、およびXENP22849から選択される。
2.BTLAXPD-1
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトBTLAに結合する第1のABDと、ヒトPD-1に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがBTLA側であり、PD-1側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトBTLAに結合する第1のABDと、ヒトPD-1に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがBTLA側であり、PD-1側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
一実施形態では、BTLAXPD-1二重特異性抗体は、図1Aの栓抜き型であり、PD-1 ABDはscFvである。別の実施形態では、BTLAXPD-1二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、BTLA ABDはFab構成要素である。別の実施形態では、BTLAXPD-1二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、PD-1 ABDはscFvである。
BTLAXPD-1二重特異性抗体(栓抜き型または中心scFv型のいずれか)は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、2つの単量体のFcドメインは、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)を含み、Fab側を含む単量体(例えば、重鎖定常ドメイン)は、pI
変異体(図4に示されるものを含む)を含む。
変異体(図4に示されるものを含む)を含む。
いくつかの実施形態では、BTLAXPD-1二重特異性抗体は、非対称変異体を有するFcドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、BTLAXPD-1抗体は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、BTLA Fab 9C6_H1.1_L1およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のBTLAまたはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
いくつかの実施形態では、BTLAXPD-1抗体は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、BTLA Fab 9C6_H1.1_L1およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のBTLAまたはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
さらなる実施形態は、BTLA Fab 9C6_H1.1_L1およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を有する、図37からの骨格のうちのいずれかを含む。
さらなる実施形態は、BTLA Fab 9C6_H1.1_L1およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を有する、図38からの骨格のうちのいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、BTLAXPD-1二重特異性抗体について、BTLA F
ab側のFvは、識別子9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、9C6_H1.11_L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。PD-1 scFv側のFvは、識別子1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
ab側のFvは、識別子9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、9C6_H1.11_L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。PD-1 scFv側のFvは、識別子1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
いくつかの実施形態では、BTLAXPD-1二重特異性抗体は、配列番号22724~23315および配列番号36147~36166としてリストに記載されるものを含む構築物から選択される。
いくつかの実施形態では、BTLAXPD-1二重特異性抗体は、XENP20895、XENP21220、XENP21221、およびXENP22858から選択される。
3.CTLA-4XPD-1
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトCTLA-4に結合する第1のABDと、ヒトPD-1に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがCTLA-4側であり、PD-1側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトCTLA-4に結合する第1のABDと、ヒトPD-1に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがCTLA-4側であり、PD-1側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
一実施形態では、CTLA-4XPD-1二重特異性抗体は、図1Aの栓抜き型であり、PD-1 ABDはscFvである。別の実施形態では、CTLA-4XPD-1二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、CTLA-4 ABDはFab構成要素である。別の実施形態では、CTLA-4XPD-1二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、PD-1 ABDはscFvである。
CTLA-4XPD-1二重特異性抗体(栓抜き型または中心scFv型のいずれか)は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、2つの単量体のFcドメインは、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)を含み、Fab側を含む単量体(例えば、重鎖定常ドメイン)は、pI変異体(図4に示されるものを含む)を含む。
いくつかの実施形態では、CTLA-4XPD-1二重特異性抗体は、非対称変異体を有するFcドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、CTLA-4XPD-1抗体は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/
S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、CTLA-4 Fab[CTLA-4]_H3_L0.22およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のCTLA-4またはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、CTLA-4 Fab[CTLA-4]_H3_L0.22およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のCTLA-4またはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
いくつかの実施形態では、CTLA-4XPD-1抗体は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、CTLA-4 Fab[CTLA-4]_H3_L0.22およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のCTLA-4またはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
さらなる実施形態は、CTLA-4 Fab[CTLA-4]_H3_L0.22およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を有する、図37からの骨格のうちのいずれかを含む。
さらなる実施形態は、CTLA-4 Fab[CTLA-4]_H3_L0.22およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を有する、図38からの骨格のうちのいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、CTLA-4XPD-1二重特異性抗体について、CTLA-4 Fab側のFvは、識別子[CTLA-4]_H0.25_L0、[CTLA-4]_H0.26_L0、[CTLA-4]_H0.27_L0、[CTLA-4]_H0.29_L0、[CTLA-4]_H0.38_L0、[CTLA-4]_H0.39_L0、0[CTLA-4]_H0.40_L0、[CTLA-4]_H0.70_L0、[CTLA-4]_H0_L0.22、[CTLA-4]_H2_L0、[CTLA-4]_H3.21_L0.124、[CTLA-4]_H3.21_L0.129、[CTLA-4]_H3.21_L0.132、[CTLA-4]_H3.23_L0.124、[CTLA-4]_H3.23_L0.129、[CTLA-4]_H3.23_L0.132、[CTLA-4]_H3.25_L0.124、[CTLA-4]_H3.25_L0.129、[CTLA-4]_H3.25_L0.132、[CTLA-4]_H3.4_L0.118、[CTLA-4]_H3.4_L0.119、[CTLA-4]_H3.4_L0.12、[CTLA-4]_H3.4_L0.121、[CTLA-4]_H3.4_L0.122、[CTLA-4]_H3.4_L0.123、[CTLA-4]_H3.4_L0.124、[CTLA-4]_H3.4_L0.125、[CTLA-4]_H3.4_L0.126、[CTLA-4]_H3.4_L0.127、[CTLA-4]_H3.4_L0.128、[CTLA-4]_H3.4_L0.129、[CTLA-4]_H3.4_L0.130、[CTLA-4]_H3.4_L0.131、[CTLA-4]_H3.4_L0.132、[CTLA-4]_H3.5_L
2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74を有する識別子を有する、配列表のそれらの配列から選択される。PD-1 scFv側のFvは、識別子1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
2.1、[CTLA-4]_H3.5_L2.2、[CTLA-4]_H3.5_L2.3、[CTLA-4]_H3_L0、[CTLA-4]_H3_L0.22、[CTLA-4]_H3_L0.44、[CTLA-4]_H3_L0.67、および[CTLA-4]_H3_L0.74を有する識別子を有する、配列表のそれらの配列から選択される。PD-1 scFv側のFvは、識別子1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
いくつかの実施形態では、CTLA-4XPD-1二重特異性抗体は、配列番号36167~36346および配列番号23316~23735としてリストに記載されるものから選択される。
いくつかの実施形態では、CTLA-4XPD-1二重特異性抗体は、XENP19738、XENP19739、XENP19741、XENP20053、XENP20066、XENP20130、XENP20146、XENP20717、およびXENP22836から選択される。
4.LAG-3XPD-1
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトLAG-3に結合する第1のABDと、ヒトPD-1に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがLAG-3側であり、PD-1側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトLAG-3に結合する第1のABDと、ヒトPD-1に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがLAG-3側であり、PD-1側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
一実施形態では、LAG-3XPD-1二重特異性抗体は、図1Aの栓抜き型であり、PD-1 ABDはscFvである。別の実施形態では、LAG-3XPD-1二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、LAG-3 ABDはFab構成要素である。別の実施形態では、LAG-3XPD-1二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、PD-1 ABDはscFvである。
LAG-3XPD-1二重特異性抗体(栓抜き型または中心scFv型のいずれか)は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、2つの単量体のFcドメインは、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)を含み、Fab側を含む単量体(例えば、重鎖定常ドメイン)は、pI変異体(図4に示されるものを含む)を含む。
いくつかの実施形態では、LAG-3XPD-1二重特異性抗体は、非対称変異体を有するFcドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、LAG-3XPD-1抗体は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/
L235A/G236del/S267K、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のLAG-3またはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
L235A/G236del/S267K、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のLAG-3またはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
いくつかの実施形態では、LAG-3XPD-1抗体は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のLAG-3またはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
さらなる実施形態は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を有する、図37からの骨格のうちのいずれかを含む。
さらなる実施形態は、LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を有する、図38からの骨格のうちのいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、LAG-3XPD-1二重特異性抗体について、LAG-3
Fab側のFvは、識別子2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122;2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。PD-1 scFv側のFvは、識別子1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
Fab側のFvは、識別子2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122;2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A11_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。PD-1 scFv側のFvは、識別子1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
いくつかの実施形態では、LAG-3XPD-1二重特異性抗体は、配列番号35867~36126および配列番号23736~25133としてリストに記載されるものを含む構築物から選択される。
いくつかの実施形態では、LAG-3XPD-1二重特異性抗体は、XENP20206、XENP21582、XENP21584、XENP21588、XENP22123、XENP22124、XENP22125、XENP22604、XENP22672、XENP22847、XENP22847、およびXENP22849から選択される。
5.TIGITXPD-1
いくつかの実施形態では、TIGITXPD-1二重特異性抗体は、配列番号25134~25173のリストに記載されるそれらの構築物から選択される。
いくつかの実施形態では、TIGITXPD-1二重特異性抗体は、配列番号25134~25173のリストに記載されるそれらの構築物から選択される。
6.TIM-3XPD-1
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトTIM-3に結合する第1のABDと、ヒトPD-1に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがTIM-3側であり、PD-1側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトTIM-3に結合する第1のABDと、ヒトPD-1に結合する第2のABDとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図1に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、FabがTIM-3側であり、PD-1側がscFv側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
一実施形態では、TIM-3XPD-1二重特異性抗体は、図1Aの栓抜き型であり、PD-1 ABDはscFvである。別の実施形態では、TIM-3XPD-1二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、TIM-3 ABDはFab構成要素である。別の実施形態では、TIM-3XPD-1二重特異性抗体は、図1Fの中心scFv型であり、PD-1 ABDはscFvである。
TIM-3XPD-1二重特異性抗体(栓抜き型または中心scFv型のいずれか)は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、2つの単量体のFcドメインは、非対称変異体(例えば、図3および図8に示されるアミノ酸置換のセット)、任意選択で切断変異体(図5に示されるものを含む)を含み、Fab側を含む単量体(例えば、重鎖定常ドメイン)は、pI変異体(図4に示されるものを含む)を含む。
いくつかの実施形態では、TIM-3XPD-1二重特異性抗体は、非対称変異体を有するFcドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W、およびT366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、TIM-3XPD-1抗体は、非対称変異体、pI変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418
E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のTIM-3またはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を利用するが、配列表中のTIM-3またはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
いくつかの実施形態では、TIM-3XPD-1抗体は、非対称変異体、pI変異体、切断変異体、およびFcRn変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するFvを含む第1の単量体(「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn変異体M428L/N434S、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント阻害剤に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」)と、c)軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、PD-1 scFv 1G6 L1.194 H1.279を利用するが、配列表中のTIM-3またはPD-1 Fvのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
さらなる実施形態は、TIM-3 Fab側およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を有する、図37からの骨格のうちのいずれかを含む。
さらなる実施形態は、TIM-3 Fab側およびPD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279を有する、図38からの骨格のうちのいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、TIM-3 Fab側XPD-1二重特異性抗体について、TIM-3 Fab側Fab側のFvは、識別子1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0、7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0を有する、配列表のそれらの配列から選択される。PD-1 scFv側のFvは、識別子1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
加えて、本発明の抗体は、本明細書に概説される抗原結合ドメインと同じエピトープ、または本明細書に概説される抗原結合ドメインとの結合について競合するエピトープのいずれかに結合するものを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性チェックポイント抗体は、本明細書に概説されるABDのうちの1つと、本明細書に概要されるABDのうちの1つと結合について競合する第2のABDとを含有し得る。いくつかの実施形態では、両ABDは、本明細書に概説される対応するABDと結合について競合する。結合競合は一般に、Biacore、表面プラズモン共鳴(SPR)、および/またはBLI(バイオレイヤー干渉、例えば、Octetアッセイ)アッセイのうちの少なくとも1つを使用して決定され、多くの実施形態において、後者が特に有用である。
VII.有用な実施形態
一実施形態では、本発明において有用な非対称変異体およびpI変異体の特定の組み合
わせは、T366S/L368A/Y407V:T366W(任意選択で架橋ジスルフィド、T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cを含む)であり、一方の単量体は、Q295E/N384D/Q418E/N481Dを含み、もう一方の単量体は、正の帯電scFvリンカー(型がscFvドメインを含む場合)を含む。当該技術分野で理解されるように、「ノブインホール」変異体は、pIを変化させず、したがって、いずれの単量体で使用することができる。
一実施形態では、本発明において有用な非対称変異体およびpI変異体の特定の組み合
わせは、T366S/L368A/Y407V:T366W(任意選択で架橋ジスルフィド、T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354Cを含む)であり、一方の単量体は、Q295E/N384D/Q418E/N481Dを含み、もう一方の単量体は、正の帯電scFvリンカー(型がscFvドメインを含む場合)を含む。当該技術分野で理解されるように、「ノブインホール」変異体は、pIを変化させず、したがって、いずれの単量体で使用することができる。
VIII.本発明の核酸
本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸(または「単一特異性」抗体の場合、それらをコードする核酸も)組成物をさらに提供する。
本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸(または「単一特異性」抗体の場合、それらをコードする核酸も)組成物をさらに提供する。
当業者に理解されるように、核酸組成物は、ヘテロ二量体タンパク質の型および足場に依存する。したがって、例えば、型が3つのアミノ酸配列を必要とする場合、例えば、二重scFv型を除いて、図1に示される全ての型に関して、3つの核酸配列が発現のための1つ以上の発現ベクターに組み込まれ得る。同様に、いくつかの型(例えば、図1に開示されるものなどの二重scFv型)2つの核酸のみが必要とされ、同様に、それらは、1つまたは2つの発現ベクターに加えられ得る。
当該技術分野で知られるように、本発明の構成要素をコードする核酸は、当該技術分野で知られる、および本発明のヘテロ二量体抗体を産生するために使用される宿主細胞によって、発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は、任意の数の制御要素(プロモーター、複製の起源、選択可能なマーカー、リボソーム結合部位、誘導物質など)に操作可能に連結される。発現ベクターは、外部染色体または統合ベクターであってもよい。
本発明の核酸および/または発現ベクターは、その後、哺乳類、細菌、酵母菌、昆虫、および/または真菌細胞を含む当該技術分野でよく知られる任意の数の異なる型の宿主細胞に変換され、哺乳細胞(例えば、CHO細胞)は、多くの実施形態において有用である。
いくつかの実施形態では、型に応じて適用可能であるように、各単量体をコードする核酸および軽鎖をコードする任意選択の核酸は、一般に、異なるまたは同一のプロモーター制御下で、単一の発現ベクター内でそれぞれ含有される。本発明の特定使用の実施形態では、これらの2つまたは3つの核酸のそれぞれは、異なる発現ベクター上に含有される。本明細書および62/025,931(参照により本明細書に組み込まれる)で示されるように、異なるベクターの比は、ヘテロ二量体形成を誘起するために使用され得る。すなわち、驚くべきことに、タンパク質が、1:1:2の比で第1の単量体:第2の単量体:軽鎖(ヘテロ二量体抗体を含む3つのポリペプチドを有する本明細書の実施形態の多くの場合)を含むが、これらは、最良の結果をもたらす比ではない。
本発明のヘテロ二量体抗体は、当該技術分野においてよく知られている発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦産生されると、イオン交換クロマトグラフィー段階を含む伝統的な抗体精製段階がなされる。本明細書で論じられるように、2つの単量体のpIを少なくとも0.5異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法によっての分離が可能になる。すなわち、各モノマーの等電点(pI)を変えるpI置換を含むことにより、各単量体が異なるpIを有し、ヘテロ二量体も明確なpIを有し、したがって、「三重F」ヘテロ二量体の等電精製(例えば、アニオン交換カラム、カチオン交換カラム)を容易にする。これらの置換は、何らかの混入している二重scFv-Fcホモ二量体およびmAbホモ二量体の、精製(例えば、IEFゲル、cIEF、および分析IEXカラム)後の判定および監視においても役に立つ。
IX.ヘテロ二量体チェックポイント抗体の生物学的および生化学的機能性
一般に、本発明の二重特異性チェックポイント抗体本はがんを有する患者に投与され、有効性は本明細書に記載されるいくつかの方法で評価される。したがって、がん負荷、腫瘍のサイズ、および転移の存在またはその程度の評価等の、有効性の標準的なアッセイが実行され得る一方で、免疫腫瘍学的治療は免疫状態評価に基づいて評価することもできる。これは、インビトロおよびインビボアッセイの両方を含む、いくつかの方法で行うことができる。例えば、腫瘍量、サイズ、侵襲性、LN関与、転移等の「従来の」測定と共に、免疫状態の変化の評価(例えば、ipi治療後のICOS+CD4+T細胞の存在)が行われてもよい。したがって、CD4+T細胞活性化もしくは増殖、CD8+T(CTL)細胞活性化もしくは増殖、CD8+T細胞媒介細胞傷害活性、ならびに/またはCTL媒介細胞枯渇、NK細胞活性、およびNK媒介細胞枯渇に対するチェックポイントの阻害効果、Treg細胞分化および増殖、ならびにTregもしくは骨髄由来抑制因子細胞(MDSC)媒介免疫抑制もしくは免疫寛容に対するチェックポイントの増大効果、ならびに/または免疫細胞により産生された炎症誘発性サイトカイン、例えば、T細胞もしくは他の免疫細胞によるIL-2、IFN-γ、もしくはTNF-α産生に対するチェックポイントの効果のうちのいずれか、またはすべてが評価され得る。
一般に、本発明の二重特異性チェックポイント抗体本はがんを有する患者に投与され、有効性は本明細書に記載されるいくつかの方法で評価される。したがって、がん負荷、腫瘍のサイズ、および転移の存在またはその程度の評価等の、有効性の標準的なアッセイが実行され得る一方で、免疫腫瘍学的治療は免疫状態評価に基づいて評価することもできる。これは、インビトロおよびインビボアッセイの両方を含む、いくつかの方法で行うことができる。例えば、腫瘍量、サイズ、侵襲性、LN関与、転移等の「従来の」測定と共に、免疫状態の変化の評価(例えば、ipi治療後のICOS+CD4+T細胞の存在)が行われてもよい。したがって、CD4+T細胞活性化もしくは増殖、CD8+T(CTL)細胞活性化もしくは増殖、CD8+T細胞媒介細胞傷害活性、ならびに/またはCTL媒介細胞枯渇、NK細胞活性、およびNK媒介細胞枯渇に対するチェックポイントの阻害効果、Treg細胞分化および増殖、ならびにTregもしくは骨髄由来抑制因子細胞(MDSC)媒介免疫抑制もしくは免疫寛容に対するチェックポイントの増大効果、ならびに/または免疫細胞により産生された炎症誘発性サイトカイン、例えば、T細胞もしくは他の免疫細胞によるIL-2、IFN-γ、もしくはTNF-α産生に対するチェックポイントの効果のうちのいずれか、またはすべてが評価され得る。
いくつかの実施形態では、治療の評価は、例えば、CFSE希釈法、免疫エフェクター細胞のKi67細胞内染色、および3H-チミジン組み込み法を用いて、免疫細胞増殖を評価することによって行われる。
いくつかの実施形態では、治療の評価は、CD25、CD69、CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40のうちの1つ以上を含む活性化関連マーカーの遺伝子発現の増加、またはそのタンパク質レベルの増加、およびCD107Aの表面発現によって測定された細胞脱顆粒を評価することによって行われる。
一般に、当該技術分野で知られる遺伝子発現アッセイが行われる。
一般に、当該技術分野で知られるタンパク質発現測定も同様に行われる。
いくつかの実施形態では、治療の評価は、酵素活性(プロテアーゼ活性を含む)、細胞膜透過性、細胞接着、ATP産生、共酵素産生、およびヌクレオチド取り込み活性などの多くの細胞パラメータを推定することにより、標的細胞の生存率を検出することによって測定される細胞傷害活性を評価することによって行われる。これらのアッセイの具体的な例としては、限定されないが、トリパンブルーまたはPI染色、51Crまたは35S放出法、LDH活性、MTTおよび/またはWSTアッセイ、カルセイン-AMアッセイ、発光に基づくアッセイ、およびその他が挙げられる。
いくつかの実施形態では、治療の評価は、よく知られた技法を使用して、限定されないが、IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13を含むサイトカインを使用して、培養上清においていずれの細胞内で測定する、サイトカイン産生によって測定されたT細胞活性を評価することによって行われる。
したがって、治療の評価は、次のうちの1つ以上を評価するアッセイを使用して行うことができる:(i)免疫応答の増加、(ii)αβおよび/またはγδT細胞の活性化の増加、(iii)細胞傷害性T細胞活性の増加、(iv)NKおよび/またはNKT細胞活性の増加、(v)αβおよび/またはγδT細胞抑制の軽減、(vi)炎症誘発性サイトカイン分泌の増加、(vii)IL-2分泌の増加、(viii)インターフェロン
産生の増加、(ix)Th1応答の増加、(x)Th2応答の減少、(xi)制御性T細
胞(Tregのうちの少なくとも1つの細胞数および/または活性の減少もしくは排除。
産生の増加、(ix)Th1応答の増加、(x)Th2応答の減少、(xi)制御性T細
胞(Tregのうちの少なくとも1つの細胞数および/または活性の減少もしくは排除。
有効性を測定するためのアッセイ
いくつかの実施形態では、T細胞活性化は、当該技術分野で知られる混合リンパ球反応(MLR)アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
いくつかの実施形態では、T細胞活性化は、当該技術分野で知られる混合リンパ球反応(MLR)アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、異なる因子のリン酸化または脱リン酸化によって測定されるように、または他の翻訳後修飾を測定することによって、免疫応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばCD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび/またはγδT細胞の活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、がん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばCD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化によって例えば測定される、細胞傷害性T細胞活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、がん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えばCD107aのような活性化マーカーの発現の変化によって例えば測定される、NKおよび/またはNKT細胞活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばCD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび/またはγδT細胞抑制の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ELISAにより、またはLuminexにより、またはMultiplexビーズに基づく方法により、または細胞内染色およびFACS分析により、またはAlispot等により測定される、炎症誘発性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ELISAにより、またはLuminexにより、またはMultiplexビーズに基づく方法により、または細胞内染色およびFACS分析により、またはAlispot等により測定される、IL-2分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ELISAにより、またはLuminexにより、またはMultiplexビーズに基づく方法により、または細胞
内染色およびFACS分析により、またはAlispot等により測定される、インターフェロン
産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
内染色およびFACS分析により、またはAlispot等により測定される、インターフェロン
産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Th1応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Th2応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはIHCによって測定される、制御性T細胞(Treg)のうちの少なくとも1つの細胞数および/または活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはIHCによって測定される、M2マクロファージ細胞数の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、M2マクロファージ腫瘍形成誘発活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはIHCによって測定される、N2好中球増加における増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、N2好中球腫瘍形成誘発活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばCD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、T細胞活性化阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、がん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばCD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化によって例えば測定される、CTL活性化阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、活性化マーカーの発現の変化
によって測定される、αβおよび/またはγδT細胞消耗の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
によって測定される、αβおよび/またはγδT細胞消耗の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばCD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび/またはγδT細胞応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばCD45RA、CCR7等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、抗原特異的メモリー応答刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、MTT、Cr放出、カルシンAMなどの細胞傷害性アッセイにより、または例えば、CFSE希釈またはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって例えば測定される、がん細胞のアポトーシスまたは溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、MTT、Cr放出、カルシンAMなどの細胞傷害性アッセイにより、または例えば、CFSE希釈またはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって例えば測定される、がん細胞に対する細胞傷害性効果または細胞増殖抑制性効果の刺激における増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、MTT、Cr放出、カルシンAMなどの細胞傷害性アッセイにより、または例えば、CFSE希釈またはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって例えば測定される、がん細胞の直接殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Th17活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、MTT、Cr放出、カルシンAMについてなどの細胞傷害性アッセイにより、または例えば、CFSE希釈またはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって例えば測定される、補体依存性細胞傷害および/または抗体依存性細胞傷害の誘導における増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
一実施形態では、T細胞活性化は、例えば、がん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、CD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化によって例えば測定される。T細胞について、増殖、活性化の細胞表面マーカー(例えば、CD25、CD69
、CD137、PD1)、細胞傷害(標的細胞を殺傷する能力)、およびサイトカイン産生(例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)の増加は、がん細胞の強化された殺傷と一致する免疫調節の指標となるだろう。
、CD137、PD1)、細胞傷害(標的細胞を殺傷する能力)、およびサイトカイン産生(例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)の増加は、がん細胞の強化された殺傷と一致する免疫調節の指標となるだろう。
一実施形態では、NK細胞活性化は、例えば、例えばがん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えばCD107a等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。NK細胞について、増殖、細胞傷害性(標的細胞を殺傷する能力、CD107a、グランザイム、およびパーフォリン発現の増加)、サイトカイン産生(例えば、IFNγおよびTNF)、および細胞表面受容体発現(例えばCD25)の増加は、がん細胞の強化された殺傷と一致する免疫調節の指標となるだろう。
一実施形態では、γδT細胞の活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
一実施形態では、Th1細胞の活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
適切な活性または応答の増加(または上に概説されるように、必要に応じて減少)は、参照試料または対照試料のいずれか、例えば本発明の抗体を含有しない試験試料のシグナルに対する10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または98~99%パーセントの増加である。同様に、参照または対照試料と比較して、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、または5倍の増加は有効性を示す。
X.治療
一旦作製されると、本発明の組成物は、がんを治療することによる、一般に、本発明の二重特異性チェックポイント抗体の結合と共に、T細胞活性の抑制を阻害することによる(例えば、T細胞はもはや抑制されない)いくつかの腫瘍学用途に有用である。
一旦作製されると、本発明の組成物は、がんを治療することによる、一般に、本発明の二重特異性チェックポイント抗体の結合と共に、T細胞活性の抑制を阻害することによる(例えば、T細胞はもはや抑制されない)いくつかの腫瘍学用途に有用である。
したがって、本発明のヘテロ二量体組成物は、これらの癌の治療に有用である。
XI.併用療法
いくつかの実施形態では、二重特異性チェックポイントが抗PD-1抗原結合ドメインを含まない場合、二重特異性抗体は、ペンブロリズマブ(Keytruda(登録商標))またはニボルマブ(Opdivo(登録商標))などの別個の抗PD-1抗体と共投与することができる。共投与は、当業者に理解されるように同時にまたは順次行うことができる。
いくつかの実施形態では、二重特異性チェックポイントが抗PD-1抗原結合ドメインを含まない場合、二重特異性抗体は、ペンブロリズマブ(Keytruda(登録商標))またはニボルマブ(Opdivo(登録商標))などの別個の抗PD-1抗体と共投与することができる。共投与は、当業者に理解されるように同時にまたは順次行うことができる。
すなわち、本明細書に開示されるCTLA-4XLAG-3二重特異性チェックポイント抗体、または配列表の抗LAG-3配列および抗CTLA-4配列を組み込むもののうちのいずれかなど、および特に、XENP22602、XENP22675、XENP22841、またはXENP22843は、抗PD-1抗体と共投与することができる。
同様に、本明細書に開示されるBTLAXCTLA-4二重特異性チェックポイント、または配列表の抗BTLA配列および抗CTLA-4配列を組み込むもののうちのいずれかなどは、抗PD-1抗体と共投与することができる。
配列表の抗TIM-3配列および抗CTLA-4配列を組み込むもののうちのいずれかなどのCTLA-4XTIM-3二重特異性チェックポイント抗体は、抗PD-1抗体と
共投与することができる。
共投与することができる。
配列表の抗CTLA-4および抗TIGIT配列を組み込むもののうちのいずれかなどのCTLA-4およびTIGIT二重特異性チェックポイント抗体は、抗PD-1抗体と共投与することができる。
配列表の抗TIM-3配列および抗LAG-3配列を組み込むもののうちのいずれかなどのTIM-3およびLAG-3二重特異性チェックポイント抗体は、抗PD-1抗体と共投与することができる。
配列表の抗TIM-3配列および抗TIGIT配列を組み込むもののうちのいずれかなどのTIM-3およびTIGIT二重特異性チェックポイント抗体は、抗PD-1抗体と共投与することができる。
配列表の抗TIM-3および抗BTLA配列を組み込むもののうちのいずれかなどのTIM-3およびBTLA二重特異性チェックポイント抗体は、抗PD-1抗体と共投与することができる。
配列表の抗LAG-3配列および抗TIGIT配列を組み込むもののうちのいずれかなどのLAG-3およびTIGIT二重特異性チェックポイント抗体は、抗PD-1抗体と共投与することができる。
配列表の抗LAG-3配列および抗BTLA配列を組み込むもののうちのいずれかなどのLAG-3およびBTLA二重特異性チェックポイント抗体は、抗PD-1抗体と共投与することができる。
配列表の抗TIGIT配列および抗BTLA配列を組み込むもののうちのいずれかなどのTIGITおよびBTLA二重特異性チェックポイント抗体は、抗PD-1抗体と共投与することができる。
XII.インビボ投与用の抗体組成物
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度を有し、任意選択で、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤(一般にRemington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.[1980]に概説される)と共に抗体を混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において、貯蔵向けに調製される。許容可能な担体、緩衝剤、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾールなど)、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の糖質、EDTAなどのキレート物質、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体(例えば、Zn-タンパク質複合体)、ならびに/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオ
ン性界面活性剤が含まれる。
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度を有し、任意選択で、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤(一般にRemington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.[1980]に概説される)と共に抗体を混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において、貯蔵向けに調製される。許容可能な担体、緩衝剤、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾールなど)、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の糖質、EDTAなどのキレート物質、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体(例えば、Zn-タンパク質複合体)、ならびに/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオ
ン性界面活性剤が含まれる。
投与様式
本発明の抗体および化学療法剤は、ボーラスとしての静脈投与、または一定期間にわたる継続注入による静脈投与などの既知の方法に従って、対象に投与される。
本発明の抗体および化学療法剤は、ボーラスとしての静脈投与、または一定期間にわたる継続注入による静脈投与などの既知の方法に従って、対象に投与される。
治療様式
本発明の方法において、療法は、疾患または状態に関する有益な治療応答を提供するために使用される。「有益な治療応答」は、疾患もしくは状態における改善、および/または疾患もしくは状態と関連する症状における改善を意図する。例えば、有益な治療応答は、疾患における下記の改善のうちの1つ以上を指す:(1)新生物細胞数の減少、(2)新生物細胞死の増加、(3)新生物細胞の生存阻害、(5)腫瘍成長の阻害(すなわち、ある程度の緩徐、好ましくは停止)、(6)患者生存率の増加、および(7)疾患または状態と関連する1つ以上の症状のいくらかの緩和。
本発明の方法において、療法は、疾患または状態に関する有益な治療応答を提供するために使用される。「有益な治療応答」は、疾患もしくは状態における改善、および/または疾患もしくは状態と関連する症状における改善を意図する。例えば、有益な治療応答は、疾患における下記の改善のうちの1つ以上を指す:(1)新生物細胞数の減少、(2)新生物細胞死の増加、(3)新生物細胞の生存阻害、(5)腫瘍成長の阻害(すなわち、ある程度の緩徐、好ましくは停止)、(6)患者生存率の増加、および(7)疾患または状態と関連する1つ以上の症状のいくらかの緩和。
何らかの所与の疾患または状態における有益な治療応答は、疾患または状態に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像法(MRI)スキャン、x-線画像法、コンピュータ断層撮影(CT)スキャン、骨スキャン画像法、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺(BMA)および循環における腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検試料採取などのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態学(すなわち、全体的な腫瘍量、腫瘍サイズなど)における変化で評価することができる。
これらの有益な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状において、改善の有利な効果を経験し得る。
本発明による治療は、使用する薬剤の「治療有効量」を含む。「治療有効量」は、必要な投与量および期間で、所望の治療結果を達成するために有効である量を指す。
治療有効量は、個々の疾患の状況、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個々における、薬剤の所望応答を引き出す能力に応じて変化してよい。治療有効量は、抗体または抗体部分の治療上有利な効果が、何らかの毒性作用または有害作用を凌ぐ量でもある。
腫瘍治療に向けた「治療有効量」は、疾患の進行を安定化させるその能力によって測定されてもよい。がんを阻害する化合物の能力を、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してよい。
あるいは、組成物のこの性質は、当業者に知られるインビトロアッセイによって、化合物が、細胞の成長を抑制する能力、またはアポトーシスを誘導する能力を試験することによって評価されてもよい。治療用化合物の治療有効量によって、対象の腫瘍サイズが減少されるか、またはそうでなければ、対象の症状が回復し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および特定の組成物、または選択される投与経路などの要因に基づいてそのような量を決定できるであろう。
投与レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与するか、いくつかに分割された用量を長時間にわたって投与するか、または治療状況の要件が示すように、比例的に用量を減少または増加してよい。非経口組成物を、投与の容易化、および投与量の均一性のために、投与量単位形態に製剤化してよい。本明細書で使用される投与量単位形態は、治療される対象の単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療
効果をもたらすために計算された既定の量の活性化合物を含有する。
効果をもたらすために計算された既定の量の活性化合物を含有する。
本発明の投与量単位形態のための規格は、(a)活性化合物特有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに(b)そのような活性化合物を、個々の感受性の治療向けに配合する技術分野での固有の制限、によって決定されると共に、直接的にそれらに応じて、決定される。
本発明において使用される二重特異性抗体に向けた、効率的な投与量および投与レジメンは、治療される疾患または状態に依存し、当業者によって決定されてよい。
本発明に使用される二重特異性抗体の治療有効量の例示的な非限定的な範囲は、約0.1~100mg/kgである。
すべての引用文献は、参照によりそれらの全体が明確に本明細書に組み込まれる。
例示目的に向けて、本発明の特定の実施形態を上に説明したが、当業者は、添付の特許請求の範囲において説明される本発明から逸脱することなく、多くの詳細の変更が行われ得ることを理解するであろう。
本発明を示すために、実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を何らかの特定の応用、または実施理論に限定しようと意図するものではない。本発明において論じられる定常領域の位置のすべてに関して、番号付けは、Kabat(Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,United States Public Health Service,National Institutes
of Health,Bethesda。参照によって、全体が組み込まれる)にあるように、EUインデックスに従う。抗体技術分野の当業者であれば、この慣習が、免疫グロブリン配列の特定領域における、非連続的な番号付けからなっており、免疫グロブリンファミリーにおける保存位置への標準化された参照が可能になっていることを理解するであろう。したがって、EUインデックスによって定義される、何らかの所与の免疫グロブリンの位置は、その連続配列に必ずしも対応していないことになる。
of Health,Bethesda。参照によって、全体が組み込まれる)にあるように、EUインデックスに従う。抗体技術分野の当業者であれば、この慣習が、免疫グロブリン配列の特定領域における、非連続的な番号付けからなっており、免疫グロブリンファミリーにおける保存位置への標準化された参照が可能になっていることを理解するであろう。したがって、EUインデックスによって定義される、何らかの所与の免疫グロブリンの位置は、その連続配列に必ずしも対応していないことになる。
一般的かつ特定の科学技法は、米国公開第2015/0307629号、同第2014/0288275号、およびWO2014/145806に概説され、これらはすべて、参照により全体が明確に組み込まれ、特に、それらに概説される技術に関して組み込まれる。
A.実施例1:複数のがんの種類からのTILは免疫チェックポイント受容体を共発現する。
PD-1、CTLA-4、LAG-3、およびBTLA間の潜在的な関連性を調査するために、The Cancer Genome Atlas project(TCGA)のRNA配列決定データを分析のために使用した。V2 RSEMデータは、FireBrowse(http://firebrowse.org/)からダウンロードされた。カスタムルーチンでRを用いて分析を実施した。PD-1とCTLA-4発現との間の相関を、計算されたR2値(図1:ピアソン相関係数の2乗)と共に図66に示す。図66はさらに、PD-1とLAG-3発現、PD-1とBTLA発現、およびLAG-3とCTLA-4発現との間の相関を示す。
PD-1、CTLA-4、LAG-3、およびBTLA間の潜在的な関連性を調査するために、The Cancer Genome Atlas project(TCGA)のRNA配列決定データを分析のために使用した。V2 RSEMデータは、FireBrowse(http://firebrowse.org/)からダウンロードされた。カスタムルーチンでRを用いて分析を実施した。PD-1とCTLA-4発現との間の相関を、計算されたR2値(図1:ピアソン相関係数の2乗)と共に図66に示す。図66はさらに、PD-1とLAG-3発現、PD-1とBTLA発現、およびLAG-3とCTLA-4発現との間の相関を示す。
図44は、PD-1およびCTLA-4が、膀胱癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、黒色腫
、卵巣癌、および肺癌を含むがんにおいて共発現されたことを示し、PD-1およびCTLA-4、PD-1およびLAG-3、PD-1およびBTLA、ならびにLAG-3およびCTLA-4のセットが、膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、および黒色腫の癌を含むがんにおいて共発現されたことを示す。
、卵巣癌、および肺癌を含むがんにおいて共発現されたことを示し、PD-1およびCTLA-4、PD-1およびLAG-3、PD-1およびBTLA、ならびにLAG-3およびCTLA-4のセットが、膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、および黒色腫の癌を含むがんにおいて共発現されたことを示す。
B.実施例2:二重特異性免疫チェックポイント抗体は、単一特異性免疫チェックポイント抗体より優れている
二重チェックポイント遮断の効果を示すために、プロトタイプの免疫チェックポイント抗体(例えば、ニボルマブおよびイピリムマブ)およびプロトタイプ抗体に基づく二重特異性免疫チェックポイント抗体を産生した。別段の記載がない限り、本明細書において、二重特異性体は、最初にFab可変領域、そして次にscFv可変領域を使用して命名される。プロトタイプ抗体のアミノ酸配列は配列表のリストに記載される。重鎖および軽鎖をコードするDNAを、遺伝子合成によって生成し(Blue Heron Biotechnology,Bothell,Wash)、標準的な分子生物学技法を使用して、二価または二重特異性定常領域を含有する発現ベクターpTT5にサブクローニングし、HEK293E細胞において一時的にトランスフェクトした。抗体を、プロテインAクロマトグラフィー(および二重特異性抗体についてはカチオン交換クロマトグラフィー)により精製した。サイズ排除クロマトグラフィー、分析カチオン交換クロマトグラフィー、およびキャピラリー等電点電気泳動により純度を評価した。
二重チェックポイント遮断の効果を示すために、プロトタイプの免疫チェックポイント抗体(例えば、ニボルマブおよびイピリムマブ)およびプロトタイプ抗体に基づく二重特異性免疫チェックポイント抗体を産生した。別段の記載がない限り、本明細書において、二重特異性体は、最初にFab可変領域、そして次にscFv可変領域を使用して命名される。プロトタイプ抗体のアミノ酸配列は配列表のリストに記載される。重鎖および軽鎖をコードするDNAを、遺伝子合成によって生成し(Blue Heron Biotechnology,Bothell,Wash)、標準的な分子生物学技法を使用して、二価または二重特異性定常領域を含有する発現ベクターpTT5にサブクローニングし、HEK293E細胞において一時的にトランスフェクトした。抗体を、プロテインAクロマトグラフィー(および二重特異性抗体についてはカチオン交換クロマトグラフィー)により精製した。サイズ排除クロマトグラフィー、分析カチオン交換クロマトグラフィー、およびキャピラリー等電点電気泳動により純度を評価した。
1.二重陽性細胞は、二重特異性免疫チェックポイント抗体によって選択的に占有される。
単一免疫チェックポイント受容体を発現する非腫瘍反応性T細胞に対する、複数の免疫チェックポイント受容体を発現する腫瘍反応性TILの選択的標的(実施例1に示されるように)は、周辺毒性を回避しながら抗腫瘍活性を増強することができる(図42に示されるように)。
単一免疫チェックポイント受容体を発現する非腫瘍反応性T細胞に対する、複数の免疫チェックポイント受容体を発現する腫瘍反応性TILの選択的標的(実施例1に示されるように)は、周辺毒性を回避しながら抗腫瘍活性を増強することができる(図42に示されるように)。
SEB刺激PBMCアッセイを使用して、二重特異性免疫チェックポイント抗体のT細胞への結合を調査した。SEB刺激PBMCアッセイは、Tヘルパー(TH)細胞増殖をアッセイし、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の集団を生成するためのインビトロ方法である。PBMCがstaphylococcalエンテロトキシンB(SEB)で刺激される場合、TH細胞集団は拡大し、続いてCTL集団が拡大する。PBMCを、100ng/mLのSEBで3日間刺激し、次いで、4℃で30分間、プロトタイプの抗LAG-3x抗PD-1二重特異性抗体および陰性対照(Numax、二価)で処理した。処理後、細胞を、4℃で30分間、APC標識片腕抗LAG-3抗体、FITC標識片腕抗PD-1抗体、およびBV605標識抗CD3抗体と共にインキュベートした。CD3+T細胞の散布図を図67に示す。データは、PD-1およびLAG-3の両方を発現する二重陽性細胞が、二重特異性免疫チェックポイント抗体が複数のチェックポイント受容体を発現するT細胞を選択的に標的とすることを示す抗LAG-3x抗PD-1二重特異性体によって選択的に占有されることを示す。
2.抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性体は混合リンパ球反応においてIL-2応答を増強する
プロトタイプ免疫チェックポイント抗体XENP16432(ニボルマブ)およびXENP16433(イピリムマブ)、ニボルマブおよびイピリムマブに基づく二重特異性免疫チェックポイント抗体XENP16004、ならびに片腕(単一特異性、一価)組み合わせ対照を、混合リンパ球反応(混合白血球反応またはMLRとしても知られる)において試験した。MLRは、Tヘルパー(TH)細胞増殖をアッセイし、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の集団を生成するための別のインビトロ方法である。同種(異なるMHCハ
プロタイプ)リンパ球が一緒に培養される場合、TH細胞集団は拡大し、続いてCTL集団が拡大する。インターロイキン-2(IL-2)分泌を使用して、T細胞の活性化を監視した。
プロトタイプ免疫チェックポイント抗体XENP16432(ニボルマブ)およびXENP16433(イピリムマブ)、ニボルマブおよびイピリムマブに基づく二重特異性免疫チェックポイント抗体XENP16004、ならびに片腕(単一特異性、一価)組み合わせ対照を、混合リンパ球反応(混合白血球反応またはMLRとしても知られる)において試験した。MLRは、Tヘルパー(TH)細胞増殖をアッセイし、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の集団を生成するための別のインビトロ方法である。同種(異なるMHCハ
プロタイプ)リンパ球が一緒に培養される場合、TH細胞集団は拡大し、続いてCTL集団が拡大する。インターロイキン-2(IL-2)分泌を使用して、T細胞の活性化を監視した。
Ficoll-Paque(商標)Plus密度勾配を使用して、ヒトPBMCの異なるセットを、異なる匿名の健常なボランティア(HemaCare,VanNuys,CA)の白血球アフェレーシスから精製した。2人のドナー由来のPBMCを混合し、次いで、20μg/mLの示される試験物品で処理した。上清を収集し、IL-2 ELISAを使用してIL-2の濃度を測定し、示されるデータはいくつかの抗CTLA-4 Fabスクリーニングの結果を示す。これは、FabおよびscFvの実施形態のXENPコード、vhおよびvl操作されたドメインの指定、Octetにより測定される、ヒトおよびcynoCTLA-4に対するKD結合定数、ならびにscFvおよびFabのTmを示す。加えて、少なくとも1つのヒトVHまたはVL生殖系列と正確に一致した配列9量体の数は、FabおよびscFvの両方の可変領域のヒト性の尺度として示される。
図25A。各カラムについて、各データ点は異なるドナー-ドナーの組み合わせの別個の反応である。
データは、プロトタイプ抗PD-1x抗CTLA-4二重特異性抗体がニボルマブおよびイピリムマブ単独よりも大幅にIL-2応答を増大することを示す。特に、片腕の組み合わせ(二重特異性体のそれぞれの一価のアームに別個に付加される)は、抗PD-1x抗CTLA-4二重特異性体よりも劣り、二重陽性PD-1+CTLA-4+細胞に対して二重特異性体がより強く結合することを示唆し、これは抗LAG-3x抗PD-1二重特異性抗体に関して図67に示される所見と一致する。
3.追加の二重特異性免疫チェックポイント抗体は、混合リンパ球反応においてIL-2応答を増強する
追加の免疫チェックポイント受容体に向けられる追加のプロトタイプ免疫チェックポイント抗体および二重特異性免疫チェックポイント抗体を、上述のMLRアッセイにおいて試験した。20のドナーが1つレシピエントドナーを標的とし、別のセットの20のドナーが別の1つのレシピエントドナーを標的とする、合計40のMLR反応の2セットのMLRを創出した。反応物を、20μg/mLの示される試験物品と共に6日間インキュベートした。抗PD-1二価(XENP16432)での治療に対する示される試験物品での治療後のIL-2およびIFNγ(ELISAによってアッセイされる)の倍数増加を示すデータを図32に示す。データは、追加の二重特異性免疫チェックポイント抗体も活性化T細胞においてニボルマブ単独よりも優れていたことを示す。
追加の免疫チェックポイント受容体に向けられる追加のプロトタイプ免疫チェックポイント抗体および二重特異性免疫チェックポイント抗体を、上述のMLRアッセイにおいて試験した。20のドナーが1つレシピエントドナーを標的とし、別のセットの20のドナーが別の1つのレシピエントドナーを標的とする、合計40のMLR反応の2セットのMLRを創出した。反応物を、20μg/mLの示される試験物品と共に6日間インキュベートした。抗PD-1二価(XENP16432)での治療に対する示される試験物品での治療後のIL-2およびIFNγ(ELISAによってアッセイされる)の倍数増加を示すデータを図32に示す。データは、追加の二重特異性免疫チェックポイント抗体も活性化T細胞においてニボルマブ単独よりも優れていたことを示す。
4.三重免疫チェックポイント遮断-抗PD-1二価および抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性抗体は、SEB刺激PBMCアッセイにおけるIL-2応答の増強において相乗的である
図43に示される抗PD-1二価および抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性体などによる三重免疫チェックポイント遮断がT細胞活性化の増強において追加の利益を提供するであろうと仮定された。仮説を試験するために、プロトタイプ免疫チェックポイント抗体XENP16432(ニボルマブ)、25F7およびイピリムマブに基づくプロトタイプ二重特異性抗LAG-3x抗CTLA-4免疫チェックポイント抗体XENP16430、ならびにXENP16432およびXENP16430の組み合わせを、SEB刺激PBMCアッセイにおいて試験した。
図43に示される抗PD-1二価および抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性体などによる三重免疫チェックポイント遮断がT細胞活性化の増強において追加の利益を提供するであろうと仮定された。仮説を試験するために、プロトタイプ免疫チェックポイント抗体XENP16432(ニボルマブ)、25F7およびイピリムマブに基づくプロトタイプ二重特異性抗LAG-3x抗CTLA-4免疫チェックポイント抗体XENP16430、ならびにXENP16432およびXENP16430の組み合わせを、SEB刺激PBMCアッセイにおいて試験した。
複数のドナー由来のヒトPBMCを、20μg/mLの示される試験物品と共に、72時間、10ng /mLのSEBで刺激した。処理後、細胞上清を、ELISAによって
、IL-2についてアッセイした。Numax二価に対するIL-2の倍数増加についてのデータが図33に示される。各点は、技術的一重項において表されるドナーを示す。
、IL-2についてアッセイした。Numax二価に対するIL-2の倍数増加についてのデータが図33に示される。各点は、技術的一重項において表されるドナーを示す。
データは、抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性チェックポイント抗体(XENP16430)単独が、対照(Numax二価)に対してIL-2応答を増強したが、増強はニボルマブ(XENP16432)単独よりも低いことを示す。しかしながら、ニボルマブと組み合わせた抗CTLA-4x抗LAG-3二重特異性体は、どちらかの単独よりも著しく高いIL-2応答をもたらす。
5.チェックポイント受容体/リガンド相互作用の遮断はT細胞活性化に必要である
バイオレイヤー干渉(BLI)に基づく方法Octetを使用して、プロトタイプ抗BTLA抗体4A7、E8D9、および8D5を、そのリガンドHVEMとのBTLA相互作用を遮断するそれらの能力についてスクリーニングした。Octetの実験段階には、一般に以下が含まれた:固定化(リガンドまたは試験物品をバイオセンサ上に捕捉する)、会合(リガンドまたは試験物品コーティングしたバイオセンサを、対応する試験物品またはリガンドの連続希釈を含有するウェルに浸漬する)、および試験物品の一価親和性を決定するための解離(バイオセンサを、緩衝剤を含有するウェルに戻す)。緩衝液のみを含有する参照ウェルも、データ処理中のバックグラウンド補正の方法に含まれた。500nMの各抗BTLA抗体および100nMのBTLA-Fcを、1時間にわたってインキュベートした。抗Penta-His(HIS1K)バイオセンサを使用して、HVEM-Fc-Hisを捕捉し、次いで、抗体/BTLA混合物に浸漬して、残留BTLA/HVEM結合を測定した。図35Bに示されるように、8D5は、BTLA/HVEM相互作用を遮断しなかったが、4A7およびE8D9は、BTLA/HVEM相互作用を遮断した。
バイオレイヤー干渉(BLI)に基づく方法Octetを使用して、プロトタイプ抗BTLA抗体4A7、E8D9、および8D5を、そのリガンドHVEMとのBTLA相互作用を遮断するそれらの能力についてスクリーニングした。Octetの実験段階には、一般に以下が含まれた:固定化(リガンドまたは試験物品をバイオセンサ上に捕捉する)、会合(リガンドまたは試験物品コーティングしたバイオセンサを、対応する試験物品またはリガンドの連続希釈を含有するウェルに浸漬する)、および試験物品の一価親和性を決定するための解離(バイオセンサを、緩衝剤を含有するウェルに戻す)。緩衝液のみを含有する参照ウェルも、データ処理中のバックグラウンド補正の方法に含まれた。500nMの各抗BTLA抗体および100nMのBTLA-Fcを、1時間にわたってインキュベートした。抗Penta-His(HIS1K)バイオセンサを使用して、HVEM-Fc-Hisを捕捉し、次いで、抗体/BTLA混合物に浸漬して、残留BTLA/HVEM結合を測定した。図35Bに示されるように、8D5は、BTLA/HVEM相互作用を遮断しなかったが、4A7およびE8D9は、BTLA/HVEM相互作用を遮断した。
プロトタイプ抗BTLA抗体、およびプロトタイプ抗体に基づく抗BTLA Fabアームを有する抗BTLAx抗PD-1二重特異性抗体を、SEB刺激PBMCアッセイにおいて試験した。具体的には、ヒトPBMCを、20μg/mLの示される試験物品と共に20ng/mLのSEBで72時間刺激した。処理後、細胞上清を、ELISAによって、IL-2についてアッセイした。Numax二価に対するIL-2の倍数増加についてのデータを、図35Aに示す(各点は、一重項で試験した個々のPBMCドナーを表す)。データは、非遮断8D5抗BTLA Fabアームを有する二重特異性抗体がニボルマブよりも著しく少ないIL-2を誘導したことを示し、BTLA/HVEM相互作用の遮断がT細胞活性化の増強に必要であることを示す。
6.二重特異性免疫チェックポイント抗体はヒトPBMC移植NSGマウスにおける生着および疾患活性を増強する
二重特異性チェックポイント抗体を、NSG(NOD-SCID-ガンマ)免疫不全マウスにおいて実施された移植片対宿主病(GVHD)モデルにおいて評価した。NSGマウスにヒトPBMCを注入したとき、ヒトPBMCはマウス細胞に対して自己免疫応答を発達させた。ヒトPBMCを注入されたNSGマウスの処置後の免疫チェックポイント阻害剤での処置は移植されたT細胞を抑制解除(de-repress)し、生着を増強する。
二重特異性チェックポイント抗体を、NSG(NOD-SCID-ガンマ)免疫不全マウスにおいて実施された移植片対宿主病(GVHD)モデルにおいて評価した。NSGマウスにヒトPBMCを注入したとき、ヒトPBMCはマウス細胞に対して自己免疫応答を発達させた。ヒトPBMCを注入されたNSGマウスの処置後の免疫チェックポイント阻害剤での処置は移植されたT細胞を抑制解除(de-repress)し、生着を増強する。
1000万個のヒトPBMCを、0日目にIV-OSPを介してNSGマウスに移植し、その後1日目に示される試験物品(5mg/kgまたは示されるとおり)を投薬した。CD45+事象を14日目に測定した(図34)。GVHDは直接測定されたが、CD45+細胞レベルの増加は体重の減少と相関する(ニボルマブ(抗PD-1モノクローナル抗体、Opdivo(登録商標)として販売されている)単独、イピリムマブ単独(抗CTLA-4モノクローナル抗体、Yervoy(登録商標)として販売されている)、ニ
ボルマブおよびイピリムマブアームに基づくプロトタイプ抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性体、および「片腕」組み合わせ対照.によるIL-2放出の増強を見る混合リンパ球反応を示す。
ボルマブおよびイピリムマブアームに基づくプロトタイプ抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性体、および「片腕」組み合わせ対照.によるIL-2放出の増強を見る混合リンパ球反応を示す。
図26B)、および疾患を予測する。
データは、本発明の二重特異性チェックポイント抗体が、対照(PBS+PBMC)と比較して、ヒトPBMC移植NSGマウスにおけるCD45+細胞の増殖を増強することを示す。さらに、ニボルマブ(XENP16432)単独で見られるよりも、本発明の抗体を使用する方が増強が大きい。さらに、ニボルマブと組み合わせた抗CTLA-4x抗LAG-3二重特異性体(XENP16430)は、実施例2Dのデータと一致する最高の生着レベルをもたらした。
C.実施例3:ハイブリドーマ
1.ハイブリドーマ生成
本発明の二重特異性免疫チェックポイント抗体のPD-1、LAG-3、およびBTLA標的アームを開発するために、標準的な方法またはRapid Prime方法のいずれかによる、ImmunoPreciseのハイブリドーマ技術により、モノクローナル抗体を最初に生成した。
1.ハイブリドーマ生成
本発明の二重特異性免疫チェックポイント抗体のPD-1、LAG-3、およびBTLA標的アームを開発するために、標準的な方法またはRapid Prime方法のいずれかによる、ImmunoPreciseのハイブリドーマ技術により、モノクローナル抗体を最初に生成した。
標準的な方法に関して、抗原(複数可)を3匹のBALB/cマウスに注入した。ハイブリドーマ生成のために屠殺する7~10日前に、免疫化マウスは抗原ブーストを受けた。抗体力価は、ELISAによって抗原で評価され、最良の応答マウスが融合のために選ばれる。最後の抗原ブーストは融合の4日前に与えられる。マウスからのリンパ球をプールし、精製し、次いで、SP2/0骨髄腫細胞と融合した。融合した細胞を、10~12日間、HAT選択的単一段階クローニング媒体上で成長させ、この時点でハイブリドーマはスクリーニングに適した状態であった。
Rapid Prime方法に関して、抗原(複数可)を3匹のBALB/cマウスに注入した。19日後、マウスからのリンパ球をプールし、精製し、次いで、SP2/0骨髄腫細胞と融合した。融合した細胞を、10~12日間、HAT選択的単一段階クローニング媒体上で成長させ、この時点でハイブリドーマはスクリーニングに適した状態であった。
抗PD-1ハイブリドーマの生成に関して、標準的な方法およびRapid Prime方法が使用され、使用された抗原(複数可)は、ヒトPD-1のマウスFc融合体(huPD-1-mFc)、cyno PD-1のマウスFc融合体(cynoPD-1-mFc)、Hisタグ付きヒトPD-1(hiPD-1-His)、Hisタグ付きcyno PD-1(cynoPD-1-His)、またはこれらの混合物であった。
抗BTLAハイブリドーマの生成に関して、標準的な方法およびRapid Prime方法が使用され、使用された抗原は、ヒトBTLAのマウスFc融合体(huBTLA-mFc)、cyno BTLAのマウスFc融合体(cynoBTLA-mFc)、Hisタグ付きヒトBTLA(huBTLA-His)、またはhuBTLA-mFcおよびcynoBTLA-mFcの混合物であった。
抗LAG-3ハイブリドーマの生成に関して、Rapid Prime方法が使用され、使用された抗原は、ヒトLAG-3のマウスFc融合体(huLAG-3-mFc)、cyno LAG-3のマウスFc融合体(cynoLAG-3-mFc)、Hisタグ付きヒトLAG-3(hiLAG-3-His)、huLAG-3-mFcおよびcyn
oLAG-3-mFcの混合物、または混合物huLAG-3-HisおよびcynoLAG-3-Hisであった。
oLAG-3-mFcの混合物、または混合物huLAG-3-HisおよびcynoLAG-3-Hisであった。
抗TIM-3ハイブリドーマの生成に関して、標準的な方法およびRapid Prime方法が使用され、使用された抗原(複数可)は、ヒトTIM-3のマウスFc融合体(huTIM-3-mFc)、cyno TIM-3のマウスFc融合体(cynoTIM-3-mFc)、Hisタグ付きヒトTIM-3(hiTIM-3-His)、Hisタグ付きcyno TIM-3(cynoTIM-3-His)、またはこれらの混合物であった。
2.抗PD-1ハイブリドーマクローンのスクリーニング
上述のように生成された抗PD-1ハイブリドーマクローンは、Octetを使用して2回のスクリーニングを受けた。1回目に関して、抗マウスFc(AMC)バイオセンサを使用してクローンを捕捉し、500nMの二価ヒトおよびcyno PD-1-Fc-Hisに浸漬した。2回目に関して、ヒトおよびcyno PD-1の両方に対して陽性であった、1回目で同定されたクローンを、AMCバイオセンサ上に捕捉し、500nM一価ヒトおよびcyno PD-1-Hisに浸漬した。
例示的な抗PD-1抗体の配列は、配列表にある。
上述のように生成された抗PD-1ハイブリドーマクローンは、Octetを使用して2回のスクリーニングを受けた。1回目に関して、抗マウスFc(AMC)バイオセンサを使用してクローンを捕捉し、500nMの二価ヒトおよびcyno PD-1-Fc-Hisに浸漬した。2回目に関して、ヒトおよびcyno PD-1の両方に対して陽性であった、1回目で同定されたクローンを、AMCバイオセンサ上に捕捉し、500nM一価ヒトおよびcyno PD-1-Hisに浸漬した。
例示的な抗PD-1抗体の配列は、配列表にある。
3.抗BTLAハイブリドーマクローンのスクリーニング
上述のように生成された抗BTLAハイブリドーマクローンは、Octetを使用して2回のスクリーニングを受けた。1回目に関して、AMCバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、複数濃度のヒトおよびcyno BTLA-Hisに浸漬してKDを決定した。2回目に関して、遮断アッセイを使用して、BTLA/HVEM相互作用を遮断したクローンを同定した。抗Penta-His(HIS1K)バイオセンサを使用してHVEM-Fc-Hisを捕捉し、25nMのBTLA-Fcのみ、またはハイブリドーマ試料の25nM BTLA-Fc+1:1希釈に浸漬して、残留BTLA/HVEM結合を測定した。例示的な抗BTLA抗体の配列は、配列表にある。
上述のように生成された抗BTLAハイブリドーマクローンは、Octetを使用して2回のスクリーニングを受けた。1回目に関して、AMCバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、複数濃度のヒトおよびcyno BTLA-Hisに浸漬してKDを決定した。2回目に関して、遮断アッセイを使用して、BTLA/HVEM相互作用を遮断したクローンを同定した。抗Penta-His(HIS1K)バイオセンサを使用してHVEM-Fc-Hisを捕捉し、25nMのBTLA-Fcのみ、またはハイブリドーマ試料の25nM BTLA-Fc+1:1希釈に浸漬して、残留BTLA/HVEM結合を測定した。例示的な抗BTLA抗体の配列は、配列表にある。
4.抗LAG-3ハイブリドーマクローンのスクリーニング
抗親和性を有するクローン、MHC-IIを内因的に発現するRamos細胞に結合するLAG-3結合を遮断するクローン、および25F7mAbと異なるエピトープに結合するクローンを同定するために、上述のように生成された抗LAG-3ハイブリドーマクローンは、数回のスクリーニングを受けた。
抗親和性を有するクローン、MHC-IIを内因的に発現するRamos細胞に結合するLAG-3結合を遮断するクローン、および25F7mAbと異なるエピトープに結合するクローンを同定するために、上述のように生成された抗LAG-3ハイブリドーマクローンは、数回のスクリーニングを受けた。
Octetを使用して親和性を決定した。AMCバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、単一濃度のヒトLAG-3-Fcおよびcyno LAG-3-Fcに浸漬した。LAG-3/MHC-II相互作用を遮断するクローンを同定するために、10μL中1μgのヒトLAG-3-hIgを、室温で20分間、50μLのハイブリドーマ上清(2倍希釈、10%FBSを含むRPMI培地において8回)と混合した。40μLのDaudiまたはRamos細胞(内因的にMHC-IIを発現する)を添加し、4℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、抗ヒトFc-Alexa647二次抗体と共に30分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、FACSによりAlexa647について分析した。データを図62に示す。25F7 mAbとは異なるエピトープに結合するクローンを同定するために、AMCバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、100nMヒトLAG-3-hFcまたは500nM 25F7を含む100nM LAG-3-hFcに浸漬して、残留結合を測定した。例示的な抗LAG-3抗体の配列は、配列表にある。
5.抗TIM-3ハイブリドーマクローンのスクリーニング
上述のように生成された抗TIM-3ハイブリドーマクローンは、2回のスクリーニングを受けた。1回目は、IgG試料およびIgMクローンのためのスクリーニングに分割された。IgGクローンに関して、AMCバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、複数濃度のヒトおよびcyno TIM-3-Hisに浸漬した。IgMクローンに関して、AR2Gを使用して抗IgM mAbをバイオセンサ上に結合し、バイオセンサは、複数濃度のヒトおよびcyno TIM-3-Hisに浸漬された。IgM試料のいずれもベースラインよりも高い結合シンガルをもたらさなかった。1回目のスクリーニングの後、ヒトおよびcyno TIM-3の両方に結合したIgGクローンを、二価のヒトおよびcyno TIM-3-Fcの二価型で再スクリーニングした。例示的な抗TIM-3抗体の配列は、配列表にある。
上述のように生成された抗TIM-3ハイブリドーマクローンは、2回のスクリーニングを受けた。1回目は、IgG試料およびIgMクローンのためのスクリーニングに分割された。IgGクローンに関して、AMCバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、複数濃度のヒトおよびcyno TIM-3-Hisに浸漬した。IgMクローンに関して、AR2Gを使用して抗IgM mAbをバイオセンサ上に結合し、バイオセンサは、複数濃度のヒトおよびcyno TIM-3-Hisに浸漬された。IgM試料のいずれもベースラインよりも高い結合シンガルをもたらさなかった。1回目のスクリーニングの後、ヒトおよびcyno TIM-3の両方に結合したIgGクローンを、二価のヒトおよびcyno TIM-3-Fcの二価型で再スクリーニングした。例示的な抗TIM-3抗体の配列は、配列表にある。
クローンのうちのいくつかをキメラ化し、SEB刺激PBMCアッセイにおいてT細胞結合について評価した。ヒトPBMCを、100ng/mLのSEBで3日間刺激した。刺激後、細胞を、示される試験物品で、4℃で30分間処理した。CD3細胞に対する結合は、抗ヒトFc二次抗体を用いて検出され、図21に示された。
6.ハイブリドーマ由来の構成要素抗体ドメインは、チェックポイント受容体/リガンド相互作用を遮断する
実施例2Eに示されるように、チェックポイント受容体/リガンド相互作用の遮断はT細胞活性化に必要である。ハイブリドーマに由来するドメインを含む例示的な抗体の遮断能力を、に示されるように、細胞結合アッセイまたはOctetのいずれかを使用して調査し、本明細書に提供される対象抗体の構成要素抗体ドメインがチェックポイント受容体/リガンド相互作用を遮断することができることを示すグラフである。特に、1G6抗PD-1 scFvアームを含む二重特異性抗体は、PD-1/PD-L1およびPD-1/PD-L2相互作用を遮断することが可能であり、7G8抗LAG-3片腕は、LAG-3/MHC II相互作用を遮断することが可能であり、例示的な抗PD-1 Fabアームを含む二重特異性抗体は、CTLA-4/CD80およびCTLA-4/CD86相互作用を遮断することが可能であり、9C6抗BTLA Fabアームを含む二重特異性抗体は、BTLA/HVEM相互作用を遮断することが可能である。
実施例2Eに示されるように、チェックポイント受容体/リガンド相互作用の遮断はT細胞活性化に必要である。ハイブリドーマに由来するドメインを含む例示的な抗体の遮断能力を、に示されるように、細胞結合アッセイまたはOctetのいずれかを使用して調査し、本明細書に提供される対象抗体の構成要素抗体ドメインがチェックポイント受容体/リガンド相互作用を遮断することができることを示すグラフである。特に、1G6抗PD-1 scFvアームを含む二重特異性抗体は、PD-1/PD-L1およびPD-1/PD-L2相互作用を遮断することが可能であり、7G8抗LAG-3片腕は、LAG-3/MHC II相互作用を遮断することが可能であり、例示的な抗PD-1 Fabアームを含む二重特異性抗体は、CTLA-4/CD80およびCTLA-4/CD86相互作用を遮断することが可能であり、9C6抗BTLA Fabアームを含む二重特異性抗体は、BTLA/HVEM相互作用を遮断することが可能である。
図68。
PD-1を外因的に発現するHEK293TをXENP20717と共にインキュベートすることにより、用量依存様式でPD-L1およびPD-L2のPD-1への結合が防止された。LAG-3をXENP22606と共にインキュベートすることにより、MHC-IIを外因的に発現するDaudi細胞へのその結合が防止された。CTLA-4をXENP20066と共にインキュベートすることにより、CD80およびCD86への残留結合が阻害された。BTLAをXENP20895と共にインキュベートすることにより、HVEMへの残留結合が阻害された。
D.実施例4:親和性および安定性の最適化
1.抗PD-1 mAb 1G6および2E9
実施例3で生成された抗PD-1ハイブリドーマクローン1G6および2E9は、二重特異性免疫チェックポイント阻害剤で使用するためのscFvまたはFabとの関連において最適な親和性および安定性を有するように操作された。クローンは、ストリング含有量最適化(string content optimization)を使用して最初にヒト化された(例えば、米国.特許第7,657,380号、2010年2月2日発行を参照されたい)。重鎖および軽鎖をコードするDNAを、遺伝子合成(Blue Heron Biotechnology,Bothell,Wash.)によって生成し、標準分子生物学的技法を使用して発現ベクターpTT5にサブクローニングした。scF
vのC末端は、ポリヒスチジンタグを含んだ。Fv変異体のライブラリは、完全長二価Fab-Hisおよび/またはscFv-His型で、標準的な変異誘発(QuikChange,Straagene,Cedar Creek,Tx)によって構築された。標準的なプロテインAクロマトグラフィーにより二価mAbを精製し、Ni-NTAクロマトグラフィーによりFab-HisおよびscFv-Hisを精製した。本発明の例示的な1G6および2E9二価抗体、Fab、ならびにscFvの配列は、配列表のリストに記載されている(しかしながら、ポリヒスチジンタグはFabおよびscFvsに関して除去された)。初期スクリーニング後、組み合わせは対象の変異体で構成され、これらは親和性および安定性について発現、精製、および再検査された。
1.抗PD-1 mAb 1G6および2E9
実施例3で生成された抗PD-1ハイブリドーマクローン1G6および2E9は、二重特異性免疫チェックポイント阻害剤で使用するためのscFvまたはFabとの関連において最適な親和性および安定性を有するように操作された。クローンは、ストリング含有量最適化(string content optimization)を使用して最初にヒト化された(例えば、米国.特許第7,657,380号、2010年2月2日発行を参照されたい)。重鎖および軽鎖をコードするDNAを、遺伝子合成(Blue Heron Biotechnology,Bothell,Wash.)によって生成し、標準分子生物学的技法を使用して発現ベクターpTT5にサブクローニングした。scF
vのC末端は、ポリヒスチジンタグを含んだ。Fv変異体のライブラリは、完全長二価Fab-Hisおよび/またはscFv-His型で、標準的な変異誘発(QuikChange,Straagene,Cedar Creek,Tx)によって構築された。標準的なプロテインAクロマトグラフィーにより二価mAbを精製し、Ni-NTAクロマトグラフィーによりFab-HisおよびscFv-Hisを精製した。本発明の例示的な1G6および2E9二価抗体、Fab、ならびにscFvの配列は、配列表のリストに記載されている(しかしながら、ポリヒスチジンタグはFabおよびscFvsに関して除去された)。初期スクリーニング後、組み合わせは対象の変異体で構成され、これらは親和性および安定性について発現、精製、および再検査された。
二価抗体の親和性スクリーニングをOctetを使用して実施した。
抗ヒトFc(AHC)バイオセンサを使用して試験物品を捕捉し、KD決定のために複数濃度のPD-1-Hisに浸漬した。scFv-Hisの安定性を、示差走査蛍光定量法(DSF)を使用して評価した。DSF実験をBio-Rad CFX ConnectリアルタイムPCR検出システムを使用して実施した。タンパク質をSYPRO Orange蛍光色素と混合し、PBS中0.2mg/mLに希釈した。SYPRO Orangeの最終濃度は10Xであった。25℃での10分間の初期インキュベーション期間後、タンパク質を1℃/分の加熱速度を使用して、25℃から95℃に加熱した。30秒毎に蛍光測定を行った。融解温度(Tm)は、装置のソフトウェアを使用して計算した。親和性および安定性の結果を図23に示す。
抗ヒトFc(AHC)バイオセンサを使用して試験物品を捕捉し、KD決定のために複数濃度のPD-1-Hisに浸漬した。scFv-Hisの安定性を、示差走査蛍光定量法(DSF)を使用して評価した。DSF実験をBio-Rad CFX ConnectリアルタイムPCR検出システムを使用して実施した。タンパク質をSYPRO Orange蛍光色素と混合し、PBS中0.2mg/mLに希釈した。SYPRO Orangeの最終濃度は10Xであった。25℃での10分間の初期インキュベーション期間後、タンパク質を1℃/分の加熱速度を使用して、25℃から95℃に加熱した。30秒毎に蛍光測定を行った。融解温度(Tm)は、装置のソフトウェアを使用して計算した。親和性および安定性の結果を図23に示す。
2.抗CTLA-4 mAb
抗CTLA-4抗体の親可変領域を、様々な二重特異性体の構成要素として使用するために操作した。改善された特性を有する変異体の同定を試みるために、2つのアプローチを取った:(1)単一、二重、および三重アミノ酸置換を、QuikChange(Stratagene,Cedar Creek,Tx)変異誘発を介して行う、および(2)代替ヒト生殖系列(IGHV3-7、IGHV3-13、IGHV3-21、IGHV3-64、IGKV3D-20、IGKV3-15)と交換されたそれらのフレームワークを有する再移植された配列がDNA合成およびサブクローニングによって構築された。変異体FabおよびscFvを設計し、発現させ、精製した。ヒトおよびcyno CTLA-4に対する親和性を、Octetを使用して、Fabについて測定した。AHCバイオセンサを使用して、ヒトまたはcyno CTLA-4のFc融合体を捕捉し、KD決定のために複数濃度のFab試験物品に浸漬した。DSFを使用して、FabおよびscFvの両方について熱安定性を測定した。加えて、少なくとも1つのヒトVHまたはVL生殖系列と正確に一致した配列9量体の数は、FabおよびscFvの両方の可変領域のヒト性の尺度として計数された(例えば、米国特許第7,657,380号、2010年2月2日発行を参照されたい)。初期スクリーニング後、組み合わせは対象の変異体で構成され、これらは親和性および安定性について発現、精製、および再検査された。結果を図24に要約する。いくつかの変異体は、ヒトおよびcyno CTLA-4の両方に関して類似の親和性を保持しながら、親可変領域に対して増加した熱安定性を有した。加えて、ヒト生殖系列一致配列9量体の数によって測定される配列ヒト性の増加がいくつかの変異体に関して同定された。好ましい変異体としては、H0.25_L0、H0.26_L0、H0.27_L0、H0.29_L0、H0.38_L0、H0.39_L0、H0.40_L0、H0.70_L0、H0_L0.22、H2_L0、H3_L0、H3_L0.22、H3_L0.67、H3_L0.74、H3_L0.44、H3.4_L0.118、H3.4_L0.119、H3.4_L0.120、H3.4_L0.121、H3.4_L0.122、H3.4_L0.123、H3.4_L0.124、H3.4_L0.125、H3.4_L0.126、H3.4_L0.127、H3.4_L0.128、H3.4_L0.129、H3.4_L0.130、H3.4_L0.131、H3.4_L0.132、H3.5_L2.1、H3.5_L2.2、H3.5_
L2.3、H3.21_L0.124、H3.21_L0.129、H3.21_L0.132、H3.23_L0.124、H3.23_L0.129、H3.23_L0.132、H3.25_L0.124、H3.25_L0.129、およびH3.25_L0.132が含まれる。
抗CTLA-4抗体の親可変領域を、様々な二重特異性体の構成要素として使用するために操作した。改善された特性を有する変異体の同定を試みるために、2つのアプローチを取った:(1)単一、二重、および三重アミノ酸置換を、QuikChange(Stratagene,Cedar Creek,Tx)変異誘発を介して行う、および(2)代替ヒト生殖系列(IGHV3-7、IGHV3-13、IGHV3-21、IGHV3-64、IGKV3D-20、IGKV3-15)と交換されたそれらのフレームワークを有する再移植された配列がDNA合成およびサブクローニングによって構築された。変異体FabおよびscFvを設計し、発現させ、精製した。ヒトおよびcyno CTLA-4に対する親和性を、Octetを使用して、Fabについて測定した。AHCバイオセンサを使用して、ヒトまたはcyno CTLA-4のFc融合体を捕捉し、KD決定のために複数濃度のFab試験物品に浸漬した。DSFを使用して、FabおよびscFvの両方について熱安定性を測定した。加えて、少なくとも1つのヒトVHまたはVL生殖系列と正確に一致した配列9量体の数は、FabおよびscFvの両方の可変領域のヒト性の尺度として計数された(例えば、米国特許第7,657,380号、2010年2月2日発行を参照されたい)。初期スクリーニング後、組み合わせは対象の変異体で構成され、これらは親和性および安定性について発現、精製、および再検査された。結果を図24に要約する。いくつかの変異体は、ヒトおよびcyno CTLA-4の両方に関して類似の親和性を保持しながら、親可変領域に対して増加した熱安定性を有した。加えて、ヒト生殖系列一致配列9量体の数によって測定される配列ヒト性の増加がいくつかの変異体に関して同定された。好ましい変異体としては、H0.25_L0、H0.26_L0、H0.27_L0、H0.29_L0、H0.38_L0、H0.39_L0、H0.40_L0、H0.70_L0、H0_L0.22、H2_L0、H3_L0、H3_L0.22、H3_L0.67、H3_L0.74、H3_L0.44、H3.4_L0.118、H3.4_L0.119、H3.4_L0.120、H3.4_L0.121、H3.4_L0.122、H3.4_L0.123、H3.4_L0.124、H3.4_L0.125、H3.4_L0.126、H3.4_L0.127、H3.4_L0.128、H3.4_L0.129、H3.4_L0.130、H3.4_L0.131、H3.4_L0.132、H3.5_L2.1、H3.5_L2.2、H3.5_
L2.3、H3.21_L0.124、H3.21_L0.129、H3.21_L0.132、H3.23_L0.124、H3.23_L0.129、H3.23_L0.132、H3.25_L0.124、H3.25_L0.129、およびH3.25_L0.132が含まれる。
3.抗BTLA mAb 9C6
実施例3で生成された抗BTLAハイブリドーマクローン9C6は、一般に実施例4Aで上述されるように、二価抗体型で最適な親和性および安定性を有するようにヒト化および操作された。本発明の例示的な抗BTLA二価抗体の配列は、配列表のリストに記載される。
実施例3で生成された抗BTLAハイブリドーマクローン9C6は、一般に実施例4Aで上述されるように、二価抗体型で最適な親和性および安定性を有するようにヒト化および操作された。本発明の例示的な抗BTLA二価抗体の配列は、配列表のリストに記載される。
変異体二価抗体の親和性スクリーニングをOctetを使用して実施した。AHCバイオセンサを使用して試験物品を捕捉し、KD決定のために、複数濃度のBTLA-Hisを含むウェルに浸漬した(抗BTLAx抗PD-1キメラ二重特異性体がSEB刺激PBMCからのIFNγ分泌を促進することを示すAおよびBにおいて示される。PBMCを、示される試験物品と共に10ng/mLのSEBで3日間刺激した。細胞上清を収集し、示される分析物についてMSDでアッセイした。A:20μg/mLの試験物品;B 5μg/mLの試験物品。
図52)。
4.抗LAG-3 mAb 7G8および2A11
実施例3で生成された抗LAG-3ハイブリドーマクローン7G8および2A11は、一般に実施例4Aに上述されるように、二重特異性免疫チェックポイント阻害剤で使用するためのFabとの関連において最適な親和性および安定性を有するようにヒト化され、操作された。本発明の例示的な抗LAG-3二価抗体の配列は、配列表のリストに記載される。
実施例3で生成された抗LAG-3ハイブリドーマクローン7G8および2A11は、一般に実施例4Aに上述されるように、二重特異性免疫チェックポイント阻害剤で使用するためのFabとの関連において最適な親和性および安定性を有するようにヒト化され、操作された。本発明の例示的な抗LAG-3二価抗体の配列は、配列表のリストに記載される。
変異体抗LAG-3 Fabの親和性および安定性は、一般に実施例4Aで上述されるように決定された。AMCバイオセンサを使用して、ヒトLAG-3のマウスFc融合体を捕捉し、KD決定のために複数濃度の試験物品を含有するウェルに浸漬した。結果は、2A11変異体については図53に示され、7G8変異体については図54に示される。
例示的な変異体2A11および7G8抗LAG-3二価抗体を、MHC-IIを内因的に発現するDaudi細胞へのLAG-3結合を遮断するそれらの能力についてさらにスクリーニングした。1μgのLAG-3-mFcを、室温で30分間、示される濃度のmAbと混合した。次いで、Daudi細胞を添加し、4℃で30分間インキュベートした。LAG-3-mFc結合を、抗マウスFc二次抗体で検出した。データを図63に示す。
5.抗TIM-3 mAb
実施例3で生成された抗TIM-3ハイブリドーマクローンは、一般に実施例4Aで上述されるように、二価抗体型で最適な親和性および安定性を有するようにヒト化および操作された。本発明の例示的な抗TIM-3二価抗体の配列は、配列表のリストに記載される。
実施例3で生成された抗TIM-3ハイブリドーマクローンは、一般に実施例4Aで上述されるように、二価抗体型で最適な親和性および安定性を有するようにヒト化および操作された。本発明の例示的な抗TIM-3二価抗体の配列は、配列表のリストに記載される。
変異体二価抗体の親和性スクリーニングをOctetを使用して実施した。AHCバイオセンサを使用して試験物品を捕捉し、KD決定のために複数濃度のTIM-3-Hisを含有するウェルに浸漬した(図22に示される)。
最適化した変異体を、SEB刺激PBMCアッセイにおいてT細胞結合についても試験した。ヒトPBMCを、100ng/mLのSEBで72時間刺激した。刺激後、細胞を示される試験物品で処理した。3H3_H1_L2.1(XENP21189)のCD3+細胞に対する結合は、抗ヒトFc二次抗体を用いて検出され、図21に示された。7B11_HJ1_L1.1(XENP21196)のCD3+細胞に対する結合は、抗ヒトIgG-APC二次抗体を用いて検出され、図21に示された。
6.変異体抗LAG-3x抗CTLA-4 Fab-scFv二重特異性抗体の親和性スクリーニング
実施例4Dに記載される最適化した抗LAG-3二価抗体に由来する抗LAG-3 Fabを含む二重特異性抗体、および実施例4Bに記載される例示的な抗CTLA-4scFvを、一般に上述のように、Octetを使用して親和性についてスクリーニングした。具体的には、AMCまたはHIS1Kバイオセンサを使用して、ヒトLAG-3のマウスFc融合体またはヒトLAG-3のHis-Aviタグ付きTEV-Fc融合体を捕捉し、試験物品を含有するウェルに浸漬してKDを決定した。結果を図55に示す。
実施例4Dに記載される最適化した抗LAG-3二価抗体に由来する抗LAG-3 Fabを含む二重特異性抗体、および実施例4Bに記載される例示的な抗CTLA-4scFvを、一般に上述のように、Octetを使用して親和性についてスクリーニングした。具体的には、AMCまたはHIS1Kバイオセンサを使用して、ヒトLAG-3のマウスFc融合体またはヒトLAG-3のHis-Aviタグ付きTEV-Fc融合体を捕捉し、試験物品を含有するウェルに浸漬してKDを決定した。結果を図55に示す。
7.変異体抗LAG-3x抗PD-1 Fab-scFv二重特異性抗体の親和性スクリーニング。
実施例4Dに記載される最適化した抗LAG-3二価抗体に由来する抗LAG-3 Fabを含む二重特異性抗体、および実施例4Aに記載される例示的な抗PD-1scFvを、一般に上述のように、Octetを使用して親和性についてスクリーニングした。具体的には、AMCまたはHIS1Kバイオセンサを使用して、ヒトLAG-3のマウスFc融合体またはヒトLAG-3のHis-Aviタグ付きTEV-Fc融合体を捕捉し、試験物品を含有するウェルに浸漬してKDを決定した。結果を図61に示す。
E.実施例5:親和性および安定性最適化アームを有する二重特異性免疫チェックポイント抗体のインビトロ評価
1.抗PD-1x抗CTLA-4二重特異性抗体
a.二重特異性抗PD-1×抗CTLA-4二重特異性抗体はPD-L1およびPD-L2とのPD-1相互作用を遮断する
PD-1を発現するHEK293T細胞を、XENP20717(抗PD-1×抗CTLA-4)、および片腕抗PD-1、および抗CTLA-4対照(それぞれ、XENP20111およびXENP20059)と共に、4℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、PD-L1-mFcまたはPD-L2-mFcを添加し、4℃で30分間さらにインキュベートした。PD-L1-mFcおよびPD-L2-mFcを、抗マウスIgG二次抗体で検出した。
E.実施例5:親和性および安定性最適化アームを有する二重特異性免疫チェックポイント抗体のインビトロ評価
1.抗PD-1x抗CTLA-4二重特異性抗体
a.二重特異性抗PD-1×抗CTLA-4二重特異性抗体はPD-L1およびPD-L2とのPD-1相互作用を遮断する
PD-1を発現するHEK293T細胞を、XENP20717(抗PD-1×抗CTLA-4)、および片腕抗PD-1、および抗CTLA-4対照(それぞれ、XENP20111およびXENP20059)と共に、4℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、PD-L1-mFcまたはPD-L2-mFcを添加し、4℃で30分間さらにインキュベートした。PD-L1-mFcおよびPD-L2-mFcを、抗マウスIgG二次抗体で検出した。
図45は、XENP20717が用量依存様式でPD-1のリガンドPD-L1およびPD-L2への結合を遮断することができたことを示す。XENP20111もPD-1のリガンドPD-L1およびPD-L2への結合を遮断することができ、一方でXENP20559はそのリガンドへのPD-1結合を遮断しなかった。
b.CD3+細胞上の二重特異性抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性抗体のT細胞結合
ヒトPBMCを、500ng/mLのSEBで3日間刺激し、培養培地で2回洗浄し、次いで500ng/mLのSEBでさらに24時間再刺激した。次いで、PBMCを、4℃で30分間、XENP20717(抗CTLA-4x抗PD-1)で処理した。処理後、PBMCを洗浄し、抗CD3-FITC(UCHT1)mAbを有するCD3+細胞上の抗ヒトFc-(Fab断片特異的)-APC二次抗体(Jackson Labs)と共にインキュベートした。次いで、PBMCを2回洗浄し、フローサイトメトリーにより
分析した。図45は、7つの固有のPBMCドナーの平均MFIを示し、CD3+T細胞上のXENP20717の結合を示し、結合が用量依存性様式であることを示す。
ヒトPBMCを、500ng/mLのSEBで3日間刺激し、培養培地で2回洗浄し、次いで500ng/mLのSEBでさらに24時間再刺激した。次いで、PBMCを、4℃で30分間、XENP20717(抗CTLA-4x抗PD-1)で処理した。処理後、PBMCを洗浄し、抗CD3-FITC(UCHT1)mAbを有するCD3+細胞上の抗ヒトFc-(Fab断片特異的)-APC二次抗体(Jackson Labs)と共にインキュベートした。次いで、PBMCを2回洗浄し、フローサイトメトリーにより
分析した。図45は、7つの固有のPBMCドナーの平均MFIを示し、CD3+T細胞上のXENP20717の結合を示し、結合が用量依存性様式であることを示す。
c.T細胞活性化に対する変異体抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性体の評価
変異体抗CTLA-4 Fabアームを有する抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性抗体を、MLRアッセイにおいて試験した。混合PBMCを、等モルPD-1結合濃度の、69.5nMの二価抗体(例えば、ニボルマブ)または139nMの二重特異性抗体(例えば、XENP16004)で処理した。示されるデータはいくつかの抗CTLA-4
Fabスクリーニングの結果を示す。これは、FabおよびscFvの実施形態のXENPコード、vhおよびvl操作されたドメインの指定、Octetにより測定される、ヒトおよびcynoCTLA-4に対するKD結合定数、ならびにscFvおよびFabのTmを示す。加えて、少なくとも1つのヒトVHまたはVL生殖系列と正確に一致した配列9量体の数は、FabおよびscFvの両方の可変領域のヒト性の尺度として示される。
変異体抗CTLA-4 Fabアームを有する抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性抗体を、MLRアッセイにおいて試験した。混合PBMCを、等モルPD-1結合濃度の、69.5nMの二価抗体(例えば、ニボルマブ)または139nMの二重特異性抗体(例えば、XENP16004)で処理した。示されるデータはいくつかの抗CTLA-4
Fabスクリーニングの結果を示す。これは、FabおよびscFvの実施形態のXENPコード、vhおよびvl操作されたドメインの指定、Octetにより測定される、ヒトおよびcynoCTLA-4に対するKD結合定数、ならびにscFvおよびFabのTmを示す。加えて、少なくとも1つのヒトVHまたはVL生殖系列と正確に一致した配列9量体の数は、FabおよびscFvの両方の可変領域のヒト性の尺度として示される。
図25Bは、いくつかの二重特異性抗体がニボルマブ単独よりも優れたIL-2誘導を可能にすることを示す。
SEB刺激PBMCアッセイにおいて、PBMCを500ng/mLのSEBで2日間処理した。次いで、細胞を洗浄し、20μg/mLのXENP16432(ニボルマブ)またはXENP20717および500ng/mLのSEBで処理した。上清を、T細胞活性化の指標としてIL-2についてアッセイした。図69に示されるデータは、抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性体がニボルマブ単独よりも顕著に多いIL-2放出を誘導することを示す。
別の研究において、XENP16432、XENP20717、および片腕組み合わせ対照を、SEB刺激PBMCアッセイにおいて試験した。PBMCを、500ng/mLのSEBで2日間刺激した。次いで、細胞をPBSで1回洗浄し、次いで20μg/mLの試験物品および500ng/mLのSEBを含む培養培地を添加した。上清を24時間後に収集し、IL-2についてアッセイした。SEB刺激なしの対照実験において、PBMCを示される試験物品で3日間処理した後、上清をIL-2についてアッセイした。Il-2濃度の倍数変化は図45A~Cに示される。図45Bに示されるように、XENP20717は、ニボルマブよりも顕著に多くIL-2分泌を増強した。データは、XENP20717が抗PD-1二価単独、ならびに片腕抗PD-1および片腕抗CTLA-4の組み合わせの両方よりも強くT細胞を活性化し、複数の免疫チェックポイント受容体を発現するT細胞を選択的に活性化する利点を示す。特に、および実施例2Bに記載される所見と一貫して、二重特異性体XENP20717は、XENP20717に由来する片腕抗体の組み合わせよりも大幅にIL-2分泌を増強した。
抗CTLA-4 scFvアームおよび変異体2E9抗PD-1 Fabアームを有するCTLA-4およびPD-1を標的とする追加の二重特異性抗体および対照試験物品を、SEB刺激PBMCアッセイにおいて試験した。ヒトPBMCを、100ng/mLのSEBで2日間刺激した。細胞を洗浄し、20μg/mLの示される試験物品と組み合わせて100ng/mLのSEBで再刺激した。処理24時間後に上清をIL-2およびIFNγについてアッセイした(図19AおよびBにそれぞれ示される)。
2.抗LAG-3x抗PD-1二重特異性チェックポイント抗体のインビトロ評価
a.T細胞活性化に対する変異体抗LAG-3x抗PD-1二重特異性体の評価
SEB刺激PBMCアッセイにおいて、PBMCを500ng/mLのSEBで2日間処理した。次いで、細胞を洗浄し、20μg/mLのXENP16432(ニボルマブ)
またはXENP22604および500ng/mLのSEBで処理した。上清を、T細胞活性化の指標としてIL-2についてアッセイした(図69に示される)。
a.T細胞活性化に対する変異体抗LAG-3x抗PD-1二重特異性体の評価
SEB刺激PBMCアッセイにおいて、PBMCを500ng/mLのSEBで2日間処理した。次いで、細胞を洗浄し、20μg/mLのXENP16432(ニボルマブ)
またはXENP22604および500ng/mLのSEBで処理した。上清を、T細胞活性化の指標としてIL-2についてアッセイした(図69に示される)。
最適化2A11抗LAG-3 Fabアームを有する追加の抗LAG-3x抗PD-1二重特異性抗体(実施例4に記載されるように生成された変異体mAbに由来する)も、SEB刺激PBMCアッセイにおいてT細胞活性化について評価した。複数のドナー由来のヒトPBMCを、500ng/mLのSEBで2日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で2回洗浄し、10μg/mLの示される試験物品と組み合わせて500ng/mLのSEBで刺激した。処理の24時間後、細胞上清を、IL-2およびIFNγについてアッセイした。Numax二価に対するIL-2およびIFNγの倍数増加についてのデータが図64に示される。各点は、技術的一重項において表されるドナーを示す。
データは、いくつかの抗LAG-3x抗PD-1二重特異性抗体がニボルマブ単独または抗LAG-3二価単独よりも強くT細胞を活性化することを示す。
3.抗BTLAx抗PD-1二重特異性チェックポイント抗体のインビトロ評価
a.CD3+細胞上の二重特異性抗BTLAx抗PD-1二重特異性抗体のT細胞結合
最適化抗BTLA Fabアームを有する抗BTLAx抗PD-1二重特異性抗体(実施例4に記載されるように生成された変異体mAbに由来する)も、T細胞上の結合について評価した。ヒトPBMCを100ng/mLのSEBで3日間刺激し、その後、PBMCを、4℃で30分間、示される試験物品で処理した。次いで、PBMCを、抗ヒトFc二次抗体と共に4℃で30分間インキュベートした。図47は、CD3+細胞上の示される試験物品の結合を示す。
a.CD3+細胞上の二重特異性抗BTLAx抗PD-1二重特異性抗体のT細胞結合
最適化抗BTLA Fabアームを有する抗BTLAx抗PD-1二重特異性抗体(実施例4に記載されるように生成された変異体mAbに由来する)も、T細胞上の結合について評価した。ヒトPBMCを100ng/mLのSEBで3日間刺激し、その後、PBMCを、4℃で30分間、示される試験物品で処理した。次いで、PBMCを、抗ヒトFc二次抗体と共に4℃で30分間インキュベートした。図47は、CD3+細胞上の示される試験物品の結合を示す。
データは、本発明の抗PD-1x抗BTLA二重特異性チェックポイント抗体(例えば、XENP20895、XENP21220、およびXENP21221)が片腕対照(例えば、XENP21446およびXENP16011)と比較してより強くT細胞に結合することを示す。これは、ヒトT細胞への結合が一般に、各アームが異なる抗原に一価的に結合する二重特異性抗体で、片腕対照などの一価の単一特異性抗体よりも良好であることを示す。
b.T細胞活性化に対する変異体抗BTLAx抗PD-1二重特異性体の評価
プロトタイプ抗BTLA(例えば、4C7、8D5、およびE8D9)および9C6 Fabアームを有する抗BTLAx抗PD-1二重特異性抗体を、SEB刺激PBMCアッセイにおいてT細胞活性化について評価した。複数のドナー由来のヒトPBMCを、5μg/mLまたは20μg/mLの示される試験物品と共に、72時間、10ng/mLのSEBで刺激した。処置後、細胞上清を、それぞれ、図1Jおよび1Kに示される、ELISAによってIL-2およびIFNγについてアッセイした。データは、9C6ハイブリドーマ由来アームを含む二重特異性抗体が、抗PD-1二価単独が増強するよりも大きいだけでなく、プロトタイプ抗BTLA Fabアームを有する二重特異性体が増強するよりも大きくT細胞活性化を増強したことを示す。
プロトタイプ抗BTLA(例えば、4C7、8D5、およびE8D9)および9C6 Fabアームを有する抗BTLAx抗PD-1二重特異性抗体を、SEB刺激PBMCアッセイにおいてT細胞活性化について評価した。複数のドナー由来のヒトPBMCを、5μg/mLまたは20μg/mLの示される試験物品と共に、72時間、10ng/mLのSEBで刺激した。処置後、細胞上清を、それぞれ、図1Jおよび1Kに示される、ELISAによってIL-2およびIFNγについてアッセイした。データは、9C6ハイブリドーマ由来アームを含む二重特異性抗体が、抗PD-1二価単独が増強するよりも大きいだけでなく、プロトタイプ抗BTLA Fabアームを有する二重特異性体が増強するよりも大きくT細胞活性化を増強したことを示す。
例示的な抗BTLAx抗PD-1 XENP-21220およびXENP16432(ニボルマブ)を、SEB刺激PBMCアッセイにおいて評価した。PBMCを、500ng/mLのSEBで2日間処理した。次いで、細胞を洗浄し、20μg/mLのXENP16432またはXENP21220および500ng/mLのSEBで処理した。上清を、T細胞活性化の指標としてIL-2についてアッセイした(図69に示される)。
変異体9C6抗BTLA Fabアームおよび片腕変異体9C6抗体(単独で、および
片腕抗PD-1抗体との組み合わせで)を有する追加の抗BTLAx抗PD-1二重特異性体を、上述のように、SEB刺激PBMCアッセイにおいてT細胞活性化について評価した。PBSでの処理に対するIL-2およびIFNγ分泌の倍数増加についてのデータが図1Lに示される。
片腕抗PD-1抗体との組み合わせで)を有する追加の抗BTLAx抗PD-1二重特異性体を、上述のように、SEB刺激PBMCアッセイにおいてT細胞活性化について評価した。PBSでの処理に対するIL-2およびIFNγ分泌の倍数増加についてのデータが図1Lに示される。
4.抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性チェックポイント抗体のインビトロ評価
a.CD3+細胞上の二重特異性抗BTLAx抗PD-1二重特異性抗体のT細胞結合
抗LAG-3 Fabアームおよび片腕変異体抗LAG-3抗体を有する抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性体を、T細胞で結合について評価した。ヒトPBMCを100ng/mLのSEBで3日間刺激し、その後、PBMCを、4℃で30分間、示される試験物品で処理した。処理後、PBMCを、抗CD3-FITCおよび抗ヒトFc-APC抗体と共に4℃で30分間インキュベートした。次いで、PBMCを2回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。図56は、CD3+T細胞上の示される試験物品の結合を示す。
a.CD3+細胞上の二重特異性抗BTLAx抗PD-1二重特異性抗体のT細胞結合
抗LAG-3 Fabアームおよび片腕変異体抗LAG-3抗体を有する抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性体を、T細胞で結合について評価した。ヒトPBMCを100ng/mLのSEBで3日間刺激し、その後、PBMCを、4℃で30分間、示される試験物品で処理した。処理後、PBMCを、抗CD3-FITCおよび抗ヒトFc-APC抗体と共に4℃で30分間インキュベートした。次いで、PBMCを2回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。図56は、CD3+T細胞上の示される試験物品の結合を示す。
データは、本発明のいくつかの抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性チェックポイント抗体(例えば、XENP22505およびXENP21896)が片腕対照(例えば、XENP22516)と比較してより強くT細胞に結合することを示す。これは、ヒトT細胞への結合が、各アームが異なる抗原に一価的に結合する二重特異性抗体で、片腕対照などの一価の単一特異性抗体よりも良好であり得ることを示す。
b.抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性抗体によるT細胞活性化
抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性抗体を、MLRおよびSEB刺激PBMCアッセイにおいて、T細胞活性化について評価した。
抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性抗体を、MLRおよびSEB刺激PBMCアッセイにおいて、T細胞活性化について評価した。
40のMLR反応を、20μg/mLの示される試験物品の存在下で行い、細胞上清を、IL-2およびIFNγについて、処理の6日後にアッセイした。図59は、抗RSV二価(XENP15074)に対するIL-2およびIFNγにおける倍数誘導を示す。
SEB刺激PBMCアッセイにおいて、PBMCを500ng/mLのSEBで2日間処理した。次いで、細胞を洗浄し、20μg/mLのXENP16432(ニボルマブ)、XENP22602、またはXENP16432およびXENP22602の組み合わせ、ならびに500ng/mLのSEBで処理した。上清を、T細胞活性化の指標としてIL-2についてアッセイした(図69に示される)。
別のSEB刺激PBMCアッセイにおいて、追加の抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性体を評価した。複数のドナー由来のヒトPBMCを、500ng/mLのSEBで2日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で2回洗浄し、20μg/mLの示される試験物品と組み合わせて500ng/mLのSEBで刺激した。処理の24時間後、細胞上清を、IL-2およびIFNγについてアッセイした。Numax二価に対するIL-2およびIFNγの倍数増加についてのデータが図57および図58および図60に示される。各点は、技術的一重項において表されるドナーを示す。
データは、抗PD-1二価および抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性体の組み合わせがT細胞活性化において相乗的効果をもたらすことを示す実施例2Dと一致する。さらに、データは、7G8に基づく抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性抗体がPBMCで2A11に基づく抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性抗体よりも選択的な機能を呈することを示す。
F.実施例6:二重特異性免疫チェックポイント抗体のインビボ評価
1.抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性体はヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着および疾患活性を増強する
いくつかのGVHD研究において、本発明の例示的な抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性抗体は、ヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着および疾患活性を増強することが示された。
1.抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性体はヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着および疾患活性を増強する
いくつかのGVHD研究において、本発明の例示的な抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性抗体は、ヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着および疾患活性を増強することが示された。
第1の研究において、0日目に、IV-OSPを介して1000万個のヒトPBMCをNSGマウスに移植した。1日目に、マウスにXENP16432(2.89mg/kg)、XENP20053(2mg/kg)、ならびにXENP16432およびXENP16433(2.89+2.92mg/kg)の組み合わせを投薬した。CD45+細胞計数を14日目に測定した(図70に示される)。
変異体抗CTLA-4 Fabおよび抗PD-1 scFvアームを有する追加の抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性体を評価した。1000万個のヒトPBMCを、0日目にIV-OSPを介してNSGマウスに移植し、その後1日目に示される試験物品(5mg/kgまたは示されるとおり)を投薬した。CD45+細胞計数を14日目に測定した(図1QA、図1RA、および図1S)。IFNγレベルもGVHDの追加の指標として測定され、CD45+細胞レベルに対してプロットされた(変異体CTLA-4 Fabアームおよび変異体抗PD-1 scFvアームを有する抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性抗体、ならびにニボルマブ単独、イピリムマブ単独、ならびに対照としてニボルマブおよびイピリムマブアームに基づくプロトタイプ抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性体によるIL-2放出の増強を見る混合リンパ球反応を示す。
図27および図30)。
データは、本発明の抗PD-1x抗CTLA-4二重特異性チェックポイント抗体が、対照(PBS+PBMC)と比較して、ヒトPBMC移植NSGマウスにおけるCD45+細胞の増殖を増強することを示す。さらに、ニボルマブ(XENP16432)単独で見られるよりも、本発明の抗体を使用する方が増強が大きい。図31は、研究160314(図26に提示される)と160331(図29に提示される)との間のCD45+細胞増殖に対する試験物品効果の比較を示す。両方の研究は、ニボルマブ単独よりも抗PD-1x抗CTLA-4二重特異性チェックポイント抗体.が優れていることを一貫して示す。
別の研究において、Xtend Fcを有する抗CTLA-4x抗PD-1二重特異性抗体を評価した。PBMC移植マウスに示される濃度で示される試験物品を投薬し、CD45+、CD4+、およびCD8+事象を14日目に測定した(図20に示される)。
2.抗BTLAx抗PD-1二重特異性体はヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着および疾患活性を増強する
第1の研究において、0日目に、IV-OSPを介して1000万個のヒトPBMCをNSGマウスに移植した。1日目に、マウスにXENP16432(2.89mg/kg)およびXENP20895(5mg/kg)を投薬した。CD45+細胞計数を14日目に測定した(図70に示される)。
第1の研究において、0日目に、IV-OSPを介して1000万個のヒトPBMCをNSGマウスに移植した。1日目に、マウスにXENP16432(2.89mg/kg)およびXENP20895(5mg/kg)を投薬した。CD45+細胞計数を14日目に測定した(図70に示される)。
抗BTLAx抗PD-1二重特異性体XENP20895を第2のGVHD研究で評価した。1000万個のヒトPBMCを、0日目にIV-OSPを介してNSGマウスに移植し、その後1日目に示される試験物品(示される濃度で)を投薬した。CD45+細胞計数およびIFNγを、10、14、および22日目に測定した(それぞれ、図51に示
される)。
される)。
3.抗LAG-3x抗PD-1二重特異性体はヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着および疾患活性を増強する
GVHDにおいて、0日目に、IV-OSPを介して1000万個のヒトPBMCをNSGマウスに移植した。1日目に、マウスにXENP16432(2.89mg/kg)およびXENP22672(5mg/kg)を投薬した。CD45+細胞計数を14日目に測定した(図70に示される)。
GVHDにおいて、0日目に、IV-OSPを介して1000万個のヒトPBMCをNSGマウスに移植した。1日目に、マウスにXENP16432(2.89mg/kg)およびXENP22672(5mg/kg)を投薬した。CD45+細胞計数を14日目に測定した(図70に示される)。
実施例6Aに記載される第2の研究において、別の例示的な抗LAG-3x抗PD-1(XENP22847)も評価された(図20C)。
4.抗LAG-3x抗CTLA-4二重特異性体はヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着および疾患活性を増強する
GVHDにおいて、0日目に、IV-OSPを介して1000万個のヒトPBMCをNSGマウスに移植した。1日目に、マウスにXENP16432(2.89mg/kg)、XENP22675(5mg/kg)、ならびにXENP16432およびXENP22675(5+5mg/kg)の組み合わせを投薬した。CD45+細胞計数を14日目に測定した(図70に示される)。
GVHDにおいて、0日目に、IV-OSPを介して1000万個のヒトPBMCをNSGマウスに移植した。1日目に、マウスにXENP16432(2.89mg/kg)、XENP22675(5mg/kg)、ならびにXENP16432およびXENP22675(5+5mg/kg)の組み合わせを投薬した。CD45+細胞計数を14日目に測定した(図70に示される)。
データは、XENP22675がニボルマブ単独での投薬を上回って生着および疾患活性を強化することを示す。特に、ニボルマブと組み合わせたXENP22675は、相乗的に作用して生着をさらに増強する。
G.実施例7:抗PD-1x抗CTLA-4二重特異性抗体はKG1 A-lucがん細胞およびヒトPBMCを移植されたNSGマウスにおいて抗腫瘍活性を呈する
0日目に、NOD SCIDガンマ(NSG)マウスに、KG1A-lucがん細胞を移植した。21日目に、ヒトPBMCをマウスに腹腔内移植した。PBMC生着後、腹腔内注入により示される試験物品を毎週投薬した(対照マウスにはPBSを投薬した)。インビボ撮像システム(IVIS(登録商標)Lumina III)を使用して、各マウスの総フラックスを測定することにより腫瘍成長を監視し、データは図71に示される(最初の投薬後の日数)。
0日目に、NOD SCIDガンマ(NSG)マウスに、KG1A-lucがん細胞を移植した。21日目に、ヒトPBMCをマウスに腹腔内移植した。PBMC生着後、腹腔内注入により示される試験物品を毎週投薬した(対照マウスにはPBSを投薬した)。インビボ撮像システム(IVIS(登録商標)Lumina III)を使用して、各マウスの総フラックスを測定することにより腫瘍成長を監視し、データは図71に示される(最初の投薬後の日数)。
XIII.参照による組み込み
USSN62/420,500からの「抗CTLA-4」(請求項セットA1~A30)、「抗PD-1」(請求項セットB1~B30)、「抗LAG-3」(請求項セットC1~C28)、「抗TIM-3」(請求項セットD1~D28)、「抗TIGIT」(請求項セットE1~E28)、「抗BTLA」(請求項セットF1~F28)、「骨格+Fv」(請求項セットY1~Y5)、および「特定の分子」(請求項セットX1~X16)の請求項セットは、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
USSN62/420,500からの「抗CTLA-4」(請求項セットA1~A30)、「抗PD-1」(請求項セットB1~B30)、「抗LAG-3」(請求項セットC1~C28)、「抗TIM-3」(請求項セットD1~D28)、「抗TIGIT」(請求項セットE1~E28)、「抗BTLA」(請求項セットF1~F28)、「骨格+Fv」(請求項セットY1~Y5)、および「特定の分子」(請求項セットX1~X16)の請求項セットは、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
Claims (9)
- a)第1の重鎖であって、
i)第1の変異Fcドメインと、
ii)第1の抗原に結合する単鎖Fv領域(scFv)であって、前記scFv領域は、第1の可変重ドメイン(heavy domain)、第1の可変軽ドメイン(light domain)、および帯電scFvリンカーを含み、前記帯電scFvリンカーは、前記第1の可変重ドメインと前記可変軽ドメインを共有結合している、単鎖Fv領域と、を含む、第1の重鎖と、
b)VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3単量体を含む第2の重鎖であって、VHは、第2の可変重ドメインであり、CH2-CH3は、第2の変異Fcドメインである、第2の重鎖と、
c)第2の可変軽ドメインおよび軽定常ドメインを含む、軽鎖と、を含み、
前記第2の変異Fcドメインは、アミノ酸置換N208D/Q295E/N384D/Q418E/N241Dを含み、前記第1および第2の変異Fcドメインは各々、アミノ酸置換E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kを含み、前記第1の変異Fcドメインは、アミノ酸置換S364K/E357Qを含み、第2の変異Fcドメインは、アミノ酸置換L368D/K370Sを含み、前記第1の可変重ドメインおよび第1の可変軽ドメインは、配列番号11376および配列番号11377、配列番号22970および配列番号22971、配列番号11394および配列番号11395、配列番号11367および配列番号11368、ならびに配列番号11412および配列番号11413を含む組から選択され、番号付けは、KabatのEUインデックスによる、ヘテロ二量体抗体。 - 前記第2の重鎖の前記CH1-ヒンジ-CH2-CH3構成要素が、配列番号37725を有し、前記第1の変異Fcドメインが、配列番号37726を有し、前記定常軽ドメインが、配列番号37727を有する、請求項1に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第2の可変重ドメインおよび前記第2の可変軽ドメインが、ヒトCTLA-4、ヒトLAG-3、ヒトTIM-3、およびヒトTIGITの群由来のヒトチェックポイント受容体に結合する抗原結合ドメインを形成している、請求項1または2に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第1の可変重ドメインが、配列番号11394を有し、第1の可変軽ドメインが、配列番号11395を有する、請求項1、2、または3に記載のヘテロ二量体抗体。
- 前記第1の重鎖が、配列番号23581を有し、前記第2の重鎖が、配列番号23576を有し、前記軽鎖が、配列番号23591を有する、請求項1、2、3、または4に記載のヘテロ二量体抗体。
- a)請求項1~5に記載の第1の重鎖をコードする第1の核酸と、
b)請求項1~5に記載の第2の重鎖をコードする第2の核酸と、
c)請求項1~5に記載の軽鎖をコードする第3の核酸と、をそれぞれ含む、核酸組成物。 - a)請求項6に記載の第1の核酸を含む、第1の発現ベクターと、
b)請求項6に記載の第2の核酸を含む、第2の発現ベクターと、
c)請求項6に記載の第3の核酸を含む、第3の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。 - 請求項7に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
- 請求項1~5に記載のヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現する条件下で、請求項8に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、を含む、方法。
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