KR102170788B1 - 무당질 항체 생산용 형질전환 마우스 및 이로부터 생산된 무당질 항체의 용도 - Google Patents

무당질 항체 생산용 형질전환 마우스 및 이로부터 생산된 무당질 항체의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102170788B1
KR102170788B1 KR1020190067572A KR20190067572A KR102170788B1 KR 102170788 B1 KR102170788 B1 KR 102170788B1 KR 1020190067572 A KR1020190067572 A KR 1020190067572A KR 20190067572 A KR20190067572 A KR 20190067572A KR 102170788 B1 KR102170788 B1 KR 102170788B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
sugar
seq
antibody
free antibody
Prior art date
Application number
KR1020190067572A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190139163A (ko
Inventor
김용삼
고정헌
이난이
김선희
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Publication of KR20190139163A publication Critical patent/KR20190139163A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102170788B1 publication Critical patent/KR102170788B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/319—Chemical structure of the backbone linked by 2'-5' linkages, i.e. having a free 3'-position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 무당질 항체 생산용 형질전환 마우스 및 이로부터 생산된 무당질 항체의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 형질전환 마우스를 이용하면 다양한 목적 항원에 대한 무당질 항체를 손쉽게 생산할 수 있고, 생산된 무당질 항체로 당단백질 바이오마커를 정밀하게 검출하여 질병 진단의 정밀화를 도모할 수 있다.

Description

무당질 항체 생산용 형질전환 마우스 및 이로부터 생산된 무당질 항체의 용도{Transgenic Mouse for Producing Aglycosylated Antibody and Uses of Aglycosylated Antibody prepared Thereof}
본 발명은 무당질 항체 생산용 형질전환 마우스, 이로부터 생산된 목적 항원에 대한 무당질 항체 및 생산된 무당질 항체로 당단백질 바이오마커를 분석하여 질병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
질병 진단을 위한 마커로 당단백질(glycoprotein), 질병 특이적 항원 등이 이용되고 있다. 예를 들어, 전립선암의 전립선-특이적 항원(prostate-specific antigen, PSA), 대장암의 암태아성 항원(carcinoembryogenic antigen, CEA), 고환암 및 간암 진단을 위한 알파-태아단백질 (alpha-fetoprotein; AFP) 등이 있다. 이러한 마커들은 질병 진행 과정에서 마커의 양적 증가뿐만 아니라 단백질에 결합되어 있는 당쇄 또한 변하는 것으로 알려져 있다.
면역글로불린(immunoglobulin, Ig, 항체)은 질병 진단 분야에서 폭넓게 사용되는 도구이며, IgG 유형 항체가 진단 시장을 가장 크게 점유하고 있다. IgG는 이황화 결합으로 연결된 2개의 중쇄(heavy chain)와 2개의 경쇄(light chain)로 이루어져 있다. IgG는 중쇄의 CH2 불변 도메인(constant domain)에 존재하는 Asn297 자리에 당쇄 수식이 일어난다(N-당질화). N-당질화는 Asn-X(Pro 외)-Ser/Thr 라는 보존된 서열(consensus sequence)에서 일어난다. 당단백질을 표적으로 하는 질병진단 분야에서 IgG의 당쇄는 진단 결과를 교란시키는 중요한 요소이다. 일 예로 렉틴(lectin)은 당단백질 등의 당쇄를 확인하기 위해 사용되나, IgG의 당쇄에까지 교차결합하여 분석 결과를 혼동시킬 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 항체의 당쇄 부분을 제거하려는 노력이 있어왔고, PNGase 절단법, 펩신 절단법, 크로스-링커(cross-linker) 방법 등이 수행되었다. 그러나 이 방법들은 효소 반응과 화학 반응의 효율이 완벽하지 못하며, 처리 후 IgG 회수가 어렵다는 한계를 가지고 있다. 따라서, 항체의 당쇄 문제를 근본적으로 해결할 필요가 요구되고 있다.
본 발명자들은 마우스의 게놈 DNA에서 IgG 유전자를 편집하여 항체의 N-당질화 서열을 무당질화 서열로 변형시켰다. 또한 이렇게 제작된 마우스로부터 항체를 생산하여, 생산된 항체가 무당질항체임을 밝히고 이를 이용하여 ELISA와 CLIA 방법으로 AFP-L3를 정량적으로 분석할 수 있음을 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.
1. 대한민국 공개 특허 제10-2015-0127185호
본 발명의 하나의 목적은 IgG(immunoglobulin G) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 하나 이상의 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; ABE(adenine base editor)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터 또는 상기 재조합 발현벡터로부터 생산된 RNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 무당질 항체(aglycosylated antibody) 생산용 동물모델의 제작용 형질전환 세포주 또는 수정란을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 수정란을 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 무당질 항체 생산용 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 IgG(immunoglobulin G) 유전자가 변형된 무당질 항체 생산용 동물모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물모델에 진단하고자 하는 항원을 투여하는 단계를 포함하는 항원에 대한 무당질 항체의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 무당질 항체의 생산방법으로 생산된 무당질 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 무당질 항체; 및 당단백질 바이오마커를 포함하는 면역진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 IgG(immunoglobulin G) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 하나 이상의 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; ABE(adenine base editor)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터 또는 상기 재조합 발현벡터로부터 생산된 RNA를 제공한다.
본 명세서에서는 아데닌 염기 편집 시스템(adenine base editing system)을 활용하여 세포주 또는 수정란의 IgG 유전자를 특이적으로 변형시키거나, 또는 형질전환 체세포 복제 기법의 적용에 의하여 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 수정란을 이식하는 단계를 포함하는 무당질 항체 생산용 동물모델의 제조방법, 무당질 항체를 생산하는 형질전환 동물을 생산하는 방법, 및 형질전환 동물로부터 생산된 무당질 항체의 용도가 제공된다.
본 발명에서 사용되는 용어, " 아데닌 염기 편집 시스템(adenine base editing system)"은 nickase Cas9- hypothetical deoxyadenosine deaminase 융합단백질(adenine base editor; ABE)과 gRNA(guide RNA) 로 구성되는 단일염기교정 유도 시스템으로써, 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 과 hypothetical deoxyadenosine deaminase 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열 중 아데닌을 DNA의 절단없이 구아닌으로 치환하도록 고안된 게놈 편집 시스템을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "adenine base editor (ABE)"는 adenine base editing 시스템에서 필수적인 단백질 요소로써, nickase-Cas9 hypothetical deoxyadenosine deaminase 융합단백질이며 gRNA와 복합체를 형성하여 단일염기교정을 유도할 수 있다. 상기 ABE 단백질은 2017년 David R. Liu에 의해 개발된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "base editor"는 기존의 CRISPR/Cas9 시스템 대비 게놈 DNA에서 더욱 효율적으로 변형을 매개하는 단백질을 말하여, 구체적으로 'G-C to A-T' 혹은 'A-T to G-C' 전환이 가능한 염기 편집 시스템(base editing system)에 사용된다. 본 발명에서는 그 중에서도, 'A-T to G-C' 전환을 유도하는 adenine base editor를 사용하여 IgG 유전자의 변형을 유도하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "gRNA"는 표적 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 RNA로, gRNA는 Cas9 단백질 혹은 adenine base editor내의 nickase-Cas9 부분과 복합체를 형성할 수 있고, Cas9 단백질 혹은 adenine base editor 단백질을 표적 DNA에 가져올 수 있는 단일 사슬 RNA를 말한다.
본 발명의 재조합 발현벡터 또는 RNA를 이용하여 수정란 또는 세포를 형질전환하면 세포 내에 gRNA 단편을 전달할 수 있고, 전달된 gRNA 단편은 IgG 유전자를 인식할 수 있다. 따라서, 재조합 발현벡터 또는 RNA를 이용하여 수정란 또는 세포를 형질전환하면 세포 내에 gRNA를 전달할 수 있고, 전달된 gRNA는 adenine base editor 또는 Cas9 단백질 복합체가 인식할 수 있는 구조를 형성하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "변형"은 염기서열 중 특정 아미노산을 코딩하는 서열을 다른 아미노산을 코딩하는 서열로 변환하는 것을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "재조합 발현벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점(replication origin), 프로모터 및 전사 종결 서열(terminator) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA)일 수 있으며, 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 또는 BBV 복제원점 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다. 프로모터는 세포, 예컨대, 진핵 세포(예컨대, 식물 세포, 또는 동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스 등의 포유류 세포 등) 등)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter(예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate-early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pL λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 재조합 발현벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예를 들어, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현벡터로부터 생산한 “RNA”는 상기 재조합 발현벡터를 주형으로 시험관 내에서 합성된 mRNA를 말한다
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 IgG는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 IgG일 수 있다.
마우스의 IgG 유전자, 구체적으로 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및/또는 IgG3의 변형에 의하여 무당질 항체가 마우스로부터 생산이 가능하며, IgG1, IgG2b, IgG2c 및 IgG3이 모두 변형되는 것이 바람직하다. 또한, 이와 같이 변형된 IgG 유전자를 마우스의 반복적인 역교배(back cross)에 의하여 고정시킴으로써, 무당질 항체 생산용 마우스 계통의 확립이 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 gRNA는 서열번호 2 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 발현 벡터 또는 RNA가 도입된 무당질 항체(aglycosylated antibody) 생산용 동물모델의 제작용 형질전환 세포주 또는 수정란을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터 또는 RNA가 도입된 형질전환 수정란을 제조하기 위하여, 야생형 C57BL/6 마우스를 교배하여 수정란은 획득하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 핵산 분자를 수정란 또는 배아에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 미세주입법(microinjection) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현 벡터 또는 RNA가 도입된 형질전환 세포주를 제조하기 위하여, 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환 세포주로 사용될 세포의 종류는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있고, 바람직하게는 포유류, 바람직하게는 마우스, 토끼 및 염소 등 항체생산에 사용되는 동물 또는 이들 동물 유래의 체세포 또는 수정란 및 배아 일 수 있고, 가장 바람직하게는 마우스 또는 마우스 유래의 체세포 또는 수정란 및 배아 일 수 있다. 형질전환 세포주로 마우스 유래의 체세포를 사용할 경우, 출생 직후 마우스가 사망하는 문제를 개선할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 수정란을 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 무당질 항체 생산용 동물모델의 제조방법을 제공한다.
상기 무당질 항체 생산용 동물모델의 제조방법은 체세포 핵이식(SCNT; somatic cell nuclear transfer)에 의한 것일 수 있다. "체세포 핵이식"은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 유전자 조작기술로써, 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "핵이식란"은 핵 공여세포가 도입 또는 융합된 난자를 말하며, "융합"은 핵 공여세포와 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마막 또는 핵막일 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다. 상기 형질전환 세포주는 핵 공여 세포로써, 핵 수용체인 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. 난자는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말하며, 바람직하게는 마우스의 난자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 토끼, 염소 또는 마우스(mouse)일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
마우스는 이미 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 이용되고 있으며, 특히 오랫동안 경제 동물로 가치가 인정되어 다른 중/대 동물을 질환모델로 사용할 때보다 윤리적인 문제점을 피해갈 수 있으며, 안정적인 사육 시스템이 구축되어 있어 실험동물 모델 개발시 유지 및 관리가 용이한 장점이 있다. 또한, 토끼 및 염소 등은 이미 항체 생산에 다양하게 활용되고 있어, 본 발명의 무당질 항체 생산에 용이하게 활용될 수 있다. 항체를 생산할 수 있는 닭, 말 등 기타 동물들도 활용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 무당질 항체의 생산은 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 IgG의 변형에 의한 것일 수 있다.
IgG 유전자를 구성하는 염기중 일부의 치환에 의한 IgG의 변형에 의하여, 무당질 항체를 생산하는 동물모델의 제조가 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 변형은 서열번호 2에 해당하는 서열이 서열번호 40의 서열로 치환; 서열번호 3에 해당하는 서열이 서열번호 37의 서열로 치환; 서열번호 4에 해당하는 서열이 서열번호 38의 서열로 치환; 및 서열번호 5에 해당하는 서열이 서열번호 39의 서열로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환에 의하여 발생된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 IgG(immunoglobulin G) 유전자가 변형된 무당질 항체 생산용 동물모델을 제공한다.
본 발명의 무당질 항체 생산용 동물모델에 있어서, 전술한 내용과 중복되는 부분은 전술한 의미와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 변형은 IgG1 중쇄의 아미노산 서열에서 N-S-T 서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; IgG2b 중쇄의 아미노산 서열에서 N-S-T 서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; IgG2c 중쇄의 아미노산 서열에서 N-S-T 서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; 및 IgG3 중쇄의 아미노산 서열에서 N-S-T 서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환에 의하여 발생된 것일 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 변형은 IgG1 중쇄의 아미노산 서열에서 N-S-T 서열 중 아미노산 N이 N외의 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 S가 P로 치환되거나, 또는 T가 S가 아닌 다른 아미노산으로 치환; IgG2b 중쇄의 아미노산 서열에서 N-S-T 서열 중 아미노산 N이 N외의 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 S가 P로 치환되거나, 또는 T가 S가 아닌 다른 아미노산으로 치환; IgG2c 중쇄의 아미노산 서열에서 N-S-T 서열 중 아미노산 N이 N외의 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 S가 P로 치환되거나, 또는 T가 S가 아닌 다른 아미노산으로 치환 ; 및 IgG3 중쇄의 아미노산 서열에서 N-S-T 서열 중 아미노산 N이 N외의 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 S가 P로 치환되거나, 또는 T가 S가 아닌 다른 아미노산으로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환에 의하여 발생된 것일 수 있다.
N-S-T의 D-S-T로의 돌연변이는 D-G-T 또는 G-S-T로의 돌연변이와는 달리 N-글리코실화 아스파라긴 잔기가 면역글로불린 β샌드위치 폴드(fold)의 두 가닥 사이에 노출된 루프에 위치하고 있기 때문에, 대전된 측쇄를 갖더라도, 아스파라긴과 동일한 기하학적 구조를 나타내는 아스파르트산은 글리신(GST)에 비해 잠재적 기하학적인 구조적 불안정성을 피할 수 있으므로 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 N-S-T 서열은 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 IgG 중쇄의 297번 내지 299번 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 변형은 서열번호 2에 해당하는 서열이 서열번호 40의 서열로 치환; 서열번호 3에 해당하는 서열이 서열번호 37의 서열로 치환; 서열번호 4에 해당하는 서열이 서열번호 38의 서열로 치환; 및 서열번호 5에 해당하는 서열이 서열번호 39의 서열로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환에 의하여 발생된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 토끼, 염소 또는 마우스일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 동물모델에 진단하고자 하는 항원을 투여하는 단계를 포함하는 항원에 대한 무당질 항체의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 무당질 항체 생산방법은 항원 투여 후 형질전환 마우스로부터 무당질 항체를 분리 및 정제하는 과정을 포함할 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 당해 기술 분야에 알려진 방법, 컬럼을 이용한 분리 또는 단백질 G 아가로스 비드를 이용한 분리 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 무당질 항체의 생산방법으로 생산된 무당질 항체를 제공한다.
본 발명의 방법으로 생산된 무당질 항체는 항체의 중쇄에 당사슬이 부가되지 않은 항체, 즉, 당질화 반응이 일어나지 않은 항체이므로, 당쇄 부분에 의한 교차결합을 배제할 수 있으므로, 당쇄 연구를 위한 다양한 분자생물학적 분석실험법과 질병의 진단에 사용하기 위한 키트 등에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 무당질 항체; 및 당단백질 바이오마커를 포함하는 면역진단키트를 제공한다.
본 발명의 면역진단키트는, 예를 들어, 면역진단용 스트립을 사용하는 것일 수 있다. 상기 스트립은 생물학적 시료가 흡수되는 샘플 패드(sample pad); 상기 생물학적 시료에 존재하는 검사하고자 하는 질병 항원과 특이적으로 결합하는 무당질 항체를 포함하는 접합 패드(conjugation pad); 검사하고자 하는 질병 항원에 특이적으로 결합하는 무당질 항체가 고정되어 있는 검사선(test line) 및 대조군 항체가 고정되어 있는 대조선(control line)을 포함하는 반응막(test membrane); 및 상기 생물학적 시료와 각각의 항체가 반응한 후 남은 잔량의 시료가 흡수되는 흡수 패드(absorption pad)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 당업계에서 면역진단에 일반적으로 사용되는 시약을 더 포함할 수 있다.
당단백질(glycoprotein)은 2 내지 6 종류의 단당류와 단백질이 공유결합으로 연결된 복합 단백질을 말하며, 생체 내 거의 모든 세포에 존재한다. 세포 외부로부터 오는 신호를 감지, 인식하고, 화학물질을 운반하는 기능을 하며, 각종 염증 및 질병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 당단백질을 분석함으로써, 다양한 질병의 진단이 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "면역진단(immunoassay)"은 특이적으로 반응하는 항원-항체 반응에 기초하여 질병의 감염 여부, 발병 여부, 경과 과정 등을 확인하는 방법을 말하며, 효소면역검정법, 형광면역검정법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 당단백질 바이오마커는 렉틴에 의해 검출될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "렉틴(lectin)"은 특정 당 분자와 특이적으로 결합하는 단백질을 말하며, 분자진단 분야에서는 단백질에 수식된 당사슬의 확인에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 렉틴은 L4-PHA (Phytohemagglutinin-L4), LCA (lens culinaris agglutinin), DSA (Datura stramonium agglutinin), AAL (Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴 (Selectin), Con A(Concanavalin-A), WGA (Wheat germ agglutinin), 자칼린 (Jacalin), SNA (Sambucus Nigra agglutinin), 갈렉틴 (galectin)일 수 있으나,, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 당단백질은 AFP-L3일 수 있으나, 특정 질병에서 특이적으로 진단에 유효성이 있는 바이오마커까지 포함할 수 있다.
간암 환자에서는 AFP-L3 수준이 증가하고, 간경변, 난소암 환자에서는 CA-125(mucin 16, MUC16)의 수준이 상승하는 것으로 알려져 있다. 상기 무당질 항체에는 렉틴이 결합할 수 없으므로, 본 발명의 키트를 사용하여, 생물학적 시료에 포함되어 있는 당단백질의 유무 및 양을 정확하게 측정할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 본 발명의 무당질 항체 생산용 동물모델로부터 생산된 무당질 항체 및 AAL을 사용하여 AFP-L3의 양을 측정함으로써 간암의 신뢰성 있는 진단이 가능함을 구체적으로 확인하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 면역진단키트를 사용하여 당단백질을 분석하는 방법은 당업계에 알려진 단백질 분석 방법을 추가적으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(otA: badioimmunoassay), 방사 면역 확산법, 전기영동, 면역침전 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 형질전환 마우스를 이용하면 다양한 목적 항원에 대한 무당질 항체를 손쉽게 생산할 수 있고, 생산된 무당질 항체로 당단백질 바이오마커를 정밀하게 검출하여 질병 진단의 정밀화를 도모할 수 있다.
도 1은 렉틴은 피분석물이 존재하지 않더라도 포획 항체에 결합될 수 있음을 나타낸 모식도이다.
도 2는 적절한 렉틴 및 무당질 항체를 사용하는 면역분석 플랫폼인 ALIQUAT(Aglycosylated antibody-Lectin coupled Immunoassay for the QUAntification of Tumor marker)을 통한 특정 글리코폼(glycoform) 분석 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 IgG2c, IgG2b, IgG1 및 IgG3에 공통적으로 존재하는 N-S-T 서열을 나타낸 그림이다.
도 4는 ARMS(amplification refractory mutation system) 및 PCR을 사용하여 편집된 돌연변이의 스크리닝 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 아데닌 염기 편집 과정 후에 태어난 9개의 pup의 IgG2c 유전자에 대한 생거 서열 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 6은 아데닌 염기 편집 과정 후에 태어난 9개의 pup의 IgG2b 유전자에 대한 생거 서열 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 아데닌 염기 편집 과정 후에 태어난 9개 pup의 IgG3 유전자에 대한 생거 서열 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 아데닌 염기 편집에 따라 편집된 IgG2c의 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 9는 아데닌 염기 편집에 따라 편집된 IgG2b의 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 10은 아데닌 염기 편집에 따라 편집된 IgG3의 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 11은 IgG2c 및 IgG3에서 pup(# 11)의 생거 서열 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 12는 intermediate founder를 선택하기위한 IgG의 구조 분석 결과를 나타낸 그림이다. (a) 야생형 IgG 단백질 구조는 Asn 잔기에 N- 글리코실화된 N-S-T의 보존된 모티프를 나타낸다. (b) N-글리코실화가 없는 돌연변이 D-S-T 및 G-S-T 항체의 가상 IgG2 구조를 나타내며, G-S-T 모티프는 β-샌드위치 폴드의 구조적 변형을 초래하는 것으로 나타난다.
도 13은 아데닌 염기 편집에 따라 편집된 IgG1의 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 14는 게놈 편집된 마우스와 야생형 마우스에 있어 생산되는 항체가 동일한 프로파일을 보임을 나타낸 그림이다. 또한 IgG2b 및 IgG3 유전자가 녹아웃된 마우스에서, 상응하는 서브클래스(subclass)의 생산에 결함을 나타낸 그림이다.
도 15는 IgG2b 유전자가 녹아웃된 마우스에서, 상응하는 서브클래스(subclass)의 유전자의 결함을 나타낸 그림이다.
도 16은 IgG3 유전자가 녹아웃된 마우스에서, 상응하는 서브클래스의 유전자의 결함을 나타낸 그림이다.
도 17은 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)의 암표지자인 인간 AFP를 모델 항원으로 상기 무당질 항체 생산용 동물에 투여하여 각 면역 단계에서 혈청을 채취하여 hAFP에 대한 direct ELISA 분석을 수행한 결과, 시간이 지남에 따라 증가된 반응성을 나타낸 그래프이다.
도 18은 hAFP에 대해 특히 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 클론을 나타낸 그림이다.
도 19는 1E5, 2A2 및 3A5 클론의 IgG1 서브클래스 및 카파(kappa) 경쇄의 단일클론항체 분비를 나타낸 그림이다.
도 20은 1E5 항체의 중쇄에는 N-글리칸이 없음을 나타낸 그림이다.
도 21은 1E5, 2A2 및 3A5 클론의 무당질화(aglycosylation)를 나타낸 그림이다.
도 22는 틀이동 넌센스 돌연변이를 갖는 FUT8-/- 돌연변이 세포주 클론의 유전자형을 나타낸 그림이다.
도 23은 FUT8-/- HEK293-T 세포에 대한 PhoSL의 결합성이 없음을 나타낸 그림이다.
도 24는 AFP의 다른 glycoform을 정량화하기 위하여 항-hAFP 항체를 사용하여 면역 블롯 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 25는 FUT8-/- 세포에서 AFP-L3는 나타나지 않고, 야생형 세포에서 AFP-L3의 생성비율은 99.5%임을 확인한 질량분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 26은 유효성이 확인된 시판 항체와 비교하여 0-20ng/mL AFP의 범위에서 우수한 선형성을 나타내는 무당질 항체에 대한 표준 곡선 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 27은 L3 양성 AFP 샘플에 대한 AAL 및 무당질 항체를 사용한 렉틴 ELISA 분석에 따른 민감성과 선형성이 우수한 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 28은 FP-L3 표준 분자를 1.0ng/mL 미만의 AFP 수준을 나타내는 정상 혈청에 스파이크한 경우, 0-100ng/mL의 범위에서 양호한 선형성을 갖는 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 29는 무당질 기반 렉틴-ELISA hAFP 테스트와 μ-TAS 분석에 따른 AFP 농도에 대한 %AFP-L3 값을 나타낸 그래프이다.
도 30은 열 조건에 대한 무당질 항체의 안정성을 나타낸 그림이다.
도 31은 pH 조건에 대한 무당질 항체의 안정성을 나타낸 그림이다.
도 32는 산화 조건에 대한 무당질 항체의 안정성을 나타낸 그림이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1-1. 동물 준비
동물의 사용 및 관리 절차는 KRIBB의 동물실험윤리위원회(IACUC)에서 검토 및 승인되었다. 접합자(zygote)는 C57BL/6J 마우스에서 얻었고, ICR 암컷 마우스를 대리모(recipient)로 사용하였다. 유전자 편집된 C57BL/6J 마우스는 Balb/c 마우스와 역교배(back-cross)되었다. 모든 동물은 12 시간의 명암주기로 24℃의 항온 및 40%의 습도의 무균 사육장에서 사육되었다.
1-2. ABE(adenine base editor) mRNA 준비
pCMV-ABE7.10(addgene, #102919) 및 xCas9(3.7)-ABE(7.10)(addgene, #108382) 플라스미드 벡터는 Addgene에서 구입하였다. 플라스미드를 AgeI(NEB)로 37℃에서 2시간 동안 분해하여 선형화된 벡터를 PCR 정제 키트(QIAGEN)를 사용하여 정제하였다. 정제된 벡터 1㎍을 mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 mRNA 합성을 위한 주형으로 사용하였다. mRNA는 MEGAclear 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분리하고, 동결튜브 바이알에 소분한 후, 액체질소에 저장하였다. 사용한 ABE의 염기서열은 표 1과 같다.
ABE; 서열번호 1
atgtccgaagtcgagttttcccatgagtactggatgagacacgcattgactctcgcaaagagggcttgggatgaacgcgaggtgcccgtgggggcagtactcgtgcataacaatcgcgtaatcggcgaaggttggaataggccgatcggacgccacgaccccactgcacatgcggaaatcatggcccttcgacagggagggcttgtgatgcagaattatcgacttatcgatgcgacgctgtacgtcacgcttgaaccttgcgtaatgtgcgcgggagctatgattcactcccgcattggacgagttgtattcggtgcccgcgacgccaagacgggtgccgcaggttcactgatggacgtgctgcatcacccaggcatgaaccaccgggtagaaatcacagaaggcatattggcggacgaatgtgcggcgctgttgtccgacttttttcgcatgcggaggcaggagatcaaggcccagaaaaaagcacaatcctctactgactctggtggttcttctggtggttctagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagttctggtggttcttctggtggttcttccgaagtcgagttttcccatgagtactggatgagacacgcattgactctcgcaaagagggctcgagatgaacgcgaggtgcccgtgggggcagtactcgtgctcaacaatcgcgtaatcggcgaaggttggaatagggcaatcggactccacgaccccactgcacatgcggaaatcatggcccttcgacagggagggcttgtgatgcagaattatcgacttatcgatgcgacgctgtacgtcacgtttgaaccttgcgtaatgtgcgcgggagctatgattcactcccgcattggacgagttgtattcggtgttcgcaacgccaagacgggtgccgcaggttcactgatggacgtgctgcattacccaggcatgaaccaccgggtagaaatcacagaaggcatattggcggacgaatgtgcggcgctgttgtgttacttttttcgcatgcccaggcaggtctttaacgcccagaaaaaagcacaatcctctactgactctggtggttcttctggtggttctagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagttctggtggttcttctggtggttctgataaaaagtattctattggtttagccatcggcactaattccgttggatgggctgtcataaccgatgaatacaaagtaccttcaaagaaatttaaggtgttggggaacacagaccgtcattcgattaaaaagaatcttatcggtgccctcctattcgatagtggcgaaacggcagaggcgactcgcctgaaacgaaccgctcggagaaggtatacacgtcgcaagaaccgaatatgttacttacaagaaatttttagcaatgagatggccaaagttgacgattctttctttcaccgtttggaagagtccttccttgtcgaagaggacaagaaacatgaacggcaccccatctttggaaacatagtagatgaggtggcatatcatgaaaagtacccaacgatttatcacctcagaaaaaagctagttgactcaactgataaagcggacctgaggttaatctacttggctcttgcccatatgataaagttccgtgggcactttctcattgagggtgatctaaatccggacaactcggatgtcgacaaactgttcatccagttagtacaaacctataatcagttgtttgaagagaaccctataaatgcaagtggcgtggatgcgaaggctattcttagcgcccgcctctctaaatcccgacggctagaaaacctgatcgcacaattacccggagagaagaaaaatgggttgttcggtaaccttatagcgctctcactaggcctgacaccaaattttaagtcgaacttcgacttagctgaagatgccaaattgcagcttagtaaggacacgtacgatgacgatctcgacaatctactggcacaaattggagatcagtatgcggacttatttttggctgccaaaaaccttagcgatgcaatcctcctatctgacatactgagagttaatactgagattaccaaggcgccgttatccgcttcaatgatcaaaaggtacgatgaacatcaccaagacttgacacttctcaaggccctagtccgtcagcaactgcctgagaaatataaggaaatattctttgatcagtcgaaaaacgggtacgcaggttatattgacggcggagcgagtcaagaggaattctacaagtttatcaaacccatattagagaagatggatgggacggaagagttgcttgtaaaactcaatcgcgaagatctactgcgaaagcagcggactttcgacaacggtagcattccacatcaaatccacttaggcgaattgcatgctatacttagaaggcaggaggatttttatccgttcctcaaagacaatcgtgaaaagattgagaaaatcctaacctttcgcataccttactatgtgggacccctggcccgagggaactctcggttcgcatggatgacaagaaagtccgaagaaacgattactccatggaattttgaggaagttgtcgataaaggtgcgtcagctcaatcgttcatcgagaggatgaccaactttgacaagaatttaccgaacgaaaaagtattgcctaagcacagtttactttacgagtatttcacagtgtacaatgaactcacgaaagttaagtatgtcactgagggcatgcgtaaacccgcctttctaagcggagaacagaagaaagcaatagtagatctgttattcaagaccaaccgcaaagtgacagttaagcaattgaaagaggactactttaagaaaattgaatgcttcgattctgtcgagatctccggggtagaagatcgatttaatgcgtcacttggtacgtatcatgacctcctaaagataattaaagataaggacttcctggataacgaagagaatgaagatatcttagaagatatagtgttgactcttaccctctttgaagatcgggaaatgattgaggaaagactaaaaacatacgctcacctgttcgacgataaggttatgaaacagttaaagaggcgtcgctatacgggctggggacgattgtcgcggaaacttatcaacgggataagagacaagcaaagtggtaaaactattctcgattttctaaagagcgacggcttcgccaataggaactttatgcagctgatccatgatgactctttaaccttcaaagaggatatacaaaaggcacaggtttccggacaaggggactcattgcacgaacatattgcgaatcttgctggttcgccagccatcaaaaagggcatactccagacagtcaaagtagtggatgagctagttaaggtcatgggacgtcacaaaccggaaaacattgtaatcgagatggcacgcgaaaatcaaacgactcagaaggggcaaaaaaacagtcgagagcggatgaagagaatagaagagggtattaaagaactgggcagccagatcttaaaggagcatcctgtggaaaatacccaattgcagaacgagaaactttacctctattacctacaaaatggaagggacatgtatgttgatcaggaactggacataaaccgtttatctgattacgacgtcgatcacattgtaccccaatcctttttgaaggacgattcaatcgacaataaagtgcttacacgctcggataagaaccgagggaaaagtgacaatgttccaagcgaggaagtcgtaaagaaaatgaagaactattggcggcagctcctaaatgcgaaactgataacgcaaagaaagttcgataacttaactaaagctgagaggggtggcttgtctgaacttgacaaggccggatttattaaacgtcagctcgtggaaacccgccaaatcacaaagcatgttgcacagatactagattcccgaatgaatacgaaatacgacgagaacgataagctgattcgggaagtcaaagtaatcactttaaagtcaaaattggtgtcggacttcagaaaggattttcaattctataaagttagggagataaataactaccaccatgcgcacgacgcttatcttaatgccgtcgtagggaccgcactcattaagaaatacccgaagctagaaagtgagtttgtgtatggtgattacaaagtttatgacgtccgtaagatgatcgcgaaaagcgaacaggagataggcaaggctacagccaaatacttcttttattctaacattatgaatttctttaagacggaaatcactctggcaaacggagagatacgcaaacgacctttaattgaaaccaatggggagacaggtgaaatcgtatgggataagggccgggacttcgcgacggtgagaaaagttttgtccatgccccaagtcaacatagtaaagaaaactgaggtgcagaccggagggttttcaaaggaatcgattcttccaaaaaggaatagtgataagctcatcgctcgtaaaaaggactgggacccgaaaaagtacggtggcttcgatagccctacagttgcctattctgtcctagtagtggcaaaagttgagaagggaaaatccaagaaactgaagtcagtcaaagaattattggggataacgattatggagcgctcgtcttttgaaaagaaccccatcgacttccttgaggcgaaaggttacaaggaagtaaaaaaggatctcataattaaactaccaaagtatagtctgtttgagttagaaaatggccgaaaacggatgttggctagcgccggagagcttcaaaaggggaacgaactcgcactaccgtctaaatacgtgaatttcctgtatttagcgtcccattacgagaagttgaaaggttcacctgaagataacgaacagaagcaactttttgttgagcagcacaaacattatctcgacgaaatcatagagcaaatttcggaattcagtaagagagtcatcctagctgatgccaatctggacaaagtattaagcgcatacaacaagcacagggataaacccatacgtgagcaggcggaaaatattatccatttgtttactcttaccaacctcggcgctccagccgcattcaagtattttgacacaacgatagatcgcaaacgatacacttctaccaaggaggtgctagacgcgacactgattcaccaatccatcacgggattatatgaaactcggatagatttgtcacagcttgggggtgactctggtggttctcccaagaagaagaggaaagtctaa
1-3. 미세주입 및 전기천공에 따른 게놈 편집 및 접합체의 이식
PMSG 호르몬(5IU, Merck) 주입 후, 48시간 간격으로 C57BL/6J 암컷 마우스(5 주령)의 복강 내로 hCG 호르몬(5IU)을 주입하였다. 암컷 마우스를 9주령의 C57BL/6J 수컷 마우스와 교배시키고, 1세포 접합자를 암컷 마우스의 난관팽대부(ampulla of oviduct)에서 수득하였다. 난구세포(cumulus cell)는 3mg/ml hyaluronidase(Merck)가 함유된 M2 배지에서 배양하여 제거되었다. 실시예 1-2의 표 1의 염기서열을 갖는 ABE mRNA 3 ug/μl, 와 표적 DNA 결합을 위한 sgRNA(Toolgen, 한국) 3ug/μl을 포함하는 혼합물을 LEICA DMIRB 원격조종기(Leica-microsystems)가 장착된 Femtojet 미량주입기(Eppendorf, 독일)를 사용하여 접합자의 세포질에 미량주입하였다.
명칭 CRISPR 표적 염기서열(5'→3') 서열번호
Ighg1 TCAACAGCACTTTCCGTTC AGT 서열번호 2
Ighg2b TACAACAGTACTATCCGGG TGG 서열번호 3
Ighg2c TACAACAGTACTCTCCGGG TGG 서열번호 4
Ighg3 TACAACAGTACCTTCCGAG TGG 서열번호 5
한편, 게놈 편집을 위하여, sgRNA 500ng/μl 및 실시예 1-2에서 준비한 ABE mRNA 400ng/μl를 opti-MEM(Gibco)에 용해하여 전기천공(electroporation)용 혼합물을 제조하였다. 접합체를 전기천공용 혼합물에 현탁시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 NEPA 21 전기천공기(NEPA GENE)를 사용하여 전기천공하였다.
미량주입 및 전기천공 후, 5% CO2 보충된 37℃의 배양기에서 접합자를 KSOM+AA 배지(Millipore)에서 2세포 단계까지 배양한 후, 생존 가능한 세포를 위임신(pseudo-pregnant) 대리모 마우스의 난관에 이식하였다.
1-4. 유전형 분석
게놈 DNA를 분리하기 위하여 1주령의 pup에서 발가락을 절단하였다.
프라이머 프라이머 염기서열
(5'→3')		 PCR 산물 크기(bp) 서열번호
Control A G
Ighg 1_ARMS_outer_F TCCCAGAAGTATCATCTGTC 321 203 147 서열번호 6
Ighg 1_ABE+G-ARMS F_14+G GGAGGAGCAGATCAG 서열번호 7
Ighg 1_ABE-A-ARMS R_15 AACGGAAAGTGCTGT 서열번호 8
Ighg 1_ARMS_outer_R CTTTGGTTTTGGAGATGGTT 서열번호 9
Ighg 2b_ARMS_outer F CTAACCTCGAGGGTGG 476 209 296 서열번호 10
Ighg 2b_ABE+G-ARMS R_14+G ATAGAGAGGATTACG 서열번호 11
Ighg 2b_ABE-A-ARMS R 15 CCGGATAGTACTGTT 서열번호 12
Ighg 2b_ARMS_outer_R GGCGGCAAGATGTATAC 서열번호 13
Ighg 2c_ARMS_outer F CATGCGCAGGTAAGTC 403 330 102 서열번호 14
Ighg 2c_ABE+G-ARMS F _14+G ATAGAGAGGATTACG 서열번호 15
Ighg 2c_ABE-A-ARMS R_15 CCGGAGAGTACTGTT 서열번호 16
Ighg 2c_ARMS_outer_R TGTTGTTGACCTTGCATTTG 서열번호 17
Ighg 3_ARMS_outer_F CTGGTAACATCTTGGGTGGA 506 212 323 서열번호 18
Ighg 3_ABE+G-ARMS F_14+G GTGAAGCTCAGTACG 서열번호 19
Ighg 3_ABE-A-R_15 TCGGAAGGTACTGTT 서열번호 20
Ighg 3_ARMS_outer_R TTCTTCTTGGACATTTGTT 서열번호 21
단일염기교정 확인을 위하여, H-Taq(Biofact)를 사용한 ARMS(amplification refractory mutation system)에 의해 유전자형(genotyping)의 사전 선별을 표 3의 프라이머를 사용하여 수행하고, 표적 부위에서 구아닌 밴드만을 갖는 샘플을 생거 시퀀싱 분석하였다. 최종 돌연변이는 표적 유전자좌를 Pfu 및 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다(표 4). PCR 산물의 생거 시퀀싱 분석 방법으로 확인하였다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
IgG subclass_Ighg1 forward GCAGCACCAAGGTGGACAAG 서열번호 22
reverse GTGCTGGGTGTGGCAGTGTA 서열번호 23
IgG subclass_Ighg2b forward CTCCTAACTCCGAGGGTGGA 서열번호 24
reverse GAGATGGTTCTTCCGATGGG 서열번호 25
IgG subclass_Ighg2c forward ACCATCCGTCTTCATCTTCC 서열번호 26
reverse TGTTGTTGACCTTGCATTTG 서열번호 27
IgG subclass_Ighg3 forward CTGGTAACATCTTGGGTGGA 서열번호 28
reverse TGAGATGGTTCTCTCGATGG 서열번호 29
Fut8_Exon 9 forward ACCAGTGTCAATGCGAGCAT 서열번호 30
reverse TTTCAAGGGCCAGGAAGACT 서열번호 31
Fut8_Exon 11 forward GTGAAAGGTGGGAGGAGGGT 서열번호 32
reverse TCCAGATGATTCTCATGCATGCT 서열번호 33
1-5. 하이브리도마 세포 제작
TiterMax Gold 보조제(Merck) 100㎕에 인간 AFP(Mybiosource) 50㎍을 용해시켜 항원성 용액(antigenic solution)을 제조하고, 게놈 편집된 마우스(6주령)의 발바닥에 1주 간격으로 4회 주입하였다. 최종 주입 후, 슬와 림프절(popliteal lymph node)을 해부하여 B 세포를 수득한 후, 기존의 방법에 따라 FO 골수종(myeloma) 세포와 융합시켰다. 단일 융합 세포를 배양 접시에 넣고, 20% FBS, 1xHAT(100uM hypoxanthine, 0.4uM aminopterin 및 16uM thymidine)(Merck), 1x항생제-항균 용액(100units/ml 페니실린, 100ug/ml streptomycin sulfate 및 0.25μg/ml amphotericin B) (Welgene, Korea)를 첨가한 채 2주 동안 배양하였다. hAFP에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 indirect ELISA 검사를 사용하여 선별하였다. 인간 AFP 용액은 1μg/ml의 농도로 hAFP를 PBS에 용해시켜 제조하였다. 96-웰 플레이트(Thermo Fisher scientific)의 표면을 코팅하기 위해 항원 용액(100㎕)을 사용하였다. 블로킹 후, 배양 배지를 100배 희석하고 코팅된 플레이트의 웰에 첨가한 후 인큐베이션하였다. TBS-Tween20(0.02 %)으로 3회 세척한 후, HRP(Cell Signaling Technology, 희석 비율: 1:2000)가 컨쥬게이트된 항-마우스 2차 항체를 처리하고, TMB-ultra solution(Thermo Fisher Scientific)을 처리하였다. 0.2N H2SO4 100㎕를 첨가하여 화학 반응을 정지시킨 후, VERSA max 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 무당질(aglycosylated) 단일클론항체를 생산하기 위하여, 양성 클론을 무혈청배지(Gibco)에서 배양하였다.
1-6. 단일클론항체의 생산
실시예 1-5에서 제조한 하이브리도마 세포를 5% CO2가 보충된 챔버에서 72시간 동안 100RPM으로 교반하면서 무혈청배지(Gibco)에서 배양하였다. 조건 배지(conditioned media)를 수득하고, 13,000g에서 30분간 원심분리하여 세포 파편을 제거하였고, 잔여 파편들을 0.22㎛ 주사기 필터(Millipore)로 여과하여 제거하였다. FPLC 시스템(AKTA 정수기, GE healthcare Life Sciences)을 사용한 HiTrapTM Protein G HPcolumn(GE healthcare Life Sciences)으로 여과액을 정제하였다. PBS(phosphate-buffered saline) 버퍼로 평형을 맞춘 칼럼에 1ml/min의 유속으로 여과액을 통과시키고, 결합 단백질을 3㎖/min의 유속에서 50mM 글리신-HCl(pH 2.5)로 용출시켰다. 용출된 분획을 1M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화시킨 후, 단백질 안정화 칵테일 용액(Thermo Fisher Scientific)과 혼합하고, -20℃에서 보관하였다.
1-7. FUT8 녹아웃 세포 제작
혼성화된 올리고뉴클레오티드 쌍을 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)(Addgene plasmid #48139) 벡터에 클로닝함으로써 FUT8 표적화 가이드 RNA 구조물(표 5)을 생성하였다.
명칭 CRISPR 표적 염기서열(5'→3') 서열번호
Fut8-e9-sgRNA#1 TACTACCTCAGTCAGACAGA 서열번호 34
Fut8-e9-sgRNA#2 AACCAGTTCTGTCAGATCTT 서열번호 35
Fut8-e11-sgRNA#1 CACCCAGCGAACACTCATCT 서열번호 36
구체적으로, 10ug의 벡터를 50units의 BbsI로 1시간 동안 절단하고, 절단된 벡터를 겔 추출 키트(Solgent)를 사용하여 추출한 후, gRNA 쌍(10pmol)을 선형화된 벡터에 클로닝하였다. 표적 서열은 생거 시퀀싱 분석 방법으로 확인하였다. 벡터 구조물(10μg)을 사용하여 전압 1300V, 펄스 폭 10ms 및 펄스 수 3의 전기천공기(electroporator)(Neon, Invitrogen)를 사용하여 HEK293-T 세포(8×105 세포)를 형질전환하였다. 각 웰에 단일 세포를 분주하여 클론을 형성하였으며, 각 클론에 대해 생거 시퀀싱 분석 방법으로 유전자형 분석을 수행하여 FUT8-/- 클론을 선별하였다.
1-8. μ-Tas 분석
자동 분석기(automatic analyzer)(mTAS Wako i30, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)에서 마이크로 칩 모세관 전기영동(microchip capillary electrophoresis) 및 액상 결합 분석(liquid-phase binding assay)을 수행하여 잔류 혈청 검체에서 알파태아단백(alpha-fetoprotein)인 AFP-L3을 측정하였다. AFP에 대해 0.3 내지 2000ng/mL 범위에서 측정하였으며, AFP 농도가 0.3ng/ml를 초과하는 혈청에서 AFP-L3 농도를 계산하였다. 시료의 AFP 농도가 2,000ng/mL 이상인 경우 시료를 제조사의 지침에 따라 기존 결과를 기준으로 수동으로 희석하였다. 모든 검사는 부산대학교 양산 병원에서 수행되었으며, 검사 전 피험체에 대한 어떠한 정보도 제공되지 않았다.
1-9. 면역형광분석
편집된 HEK293-T 세포(2×104)를 DEME 배지의 18mm×18mm 커버글라스 상에서 1일 동안 성장시켰다. 세포를 BD cytofix/cytoperm 용액(BD bioscience)으로 12시간 동안 고정하였다. 그 후, 세포를 2시간 동안 실온에서 9ng/ul PhoSL-alexa488의 존재하에 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 1.5㎍/ml DAPI를 함유하는 Vectashield 봉입제(mounting medium)(VECTOR Laboratories)로 커버글라스를 덮었다. Zeiss LSM510 Meta 현미경(Carl Zeiss MicroImaging)으로 형광을 모니터링하였다.
1-10. 샌드위치 렉틴-ELISA
완충액(pH 7.4) 0.1M 중탄산나트륨(sodium-bicarbonate)에 용해된 항-hAFP 마우스 단일클론항체(#ab54745, Abcam) 또는 항-hAFP 무당질 항체 0.5μg으로 ELISA 웰 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 TBS-0.1% Tween 20으로 2회 세척하고 무단백 블로킹 완충액(Thermo Fisher Scientific) 또는 0.5% 폴리비닐알콜 + 0.1% Tween 20을 사용하여 실온에서 1시간 동안 블록킹하였다. 각각의 웰에 임상 시료 또는 배양 배지(100μl)를 분주하였다. 각각의 웰을 RIPA 버퍼(25mM Tris-HCl 7.6, 150mM NaCl, 1% NP40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)로 5회 이상 세척하고, 다시 TBS-0.1% Tween 20으로 반복하였다. 1 : 2,000으로 희석된 항-hAFP 토끼 다클론항체(# ab8201, Abcam) 또는 1 : 1,000으로 희석된 비오틴-표지된 AAL(aleuria aurantia lectin)(# B-1395, VECTOR Laboratories) 중 하나를 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 충분히 세척한 후, 각각 HRP와 컨쥬케이트된 항 토끼 제2항체(Cell Signaling) 또는 스트렙타비딘을 1 : 2,000로 희석하고, 실온에서 1시간 동안 처리하였다. TBS-0.1% Tween 20으로 간단히 세척한 후, TMP 기질 용액(Thermo fisher Scientific) 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 2N 황산으로 반응을 정지시킨 후, 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.
1-11. 안정성 테스트
탈글리코실화된(deglycosylated) 항체는 50℃에서 15분 동안 Rapid PNGase F 비-환원형 버퍼에서 PNGase-F(NEB) 100units과 시판중인 항-hAFP 항체(# MIA1305, Thermo fisher Scientific) 10μg을 인큐베이션하여 준비되었다. 시간 의존적 및 온도 의존적 단백질 안정성은 PBS 완충액에서 글리코실화, 탈글리코실화 또는 무당질 항체를 4℃또는 37℃에서 최대 14일 동안 인큐베이션하여 측정하였다. 인큐베이션된 항체를 4-20% Mini-Protein TGXTM 겔(BioRad)에서 전기영동시키고 쿠마시 블루 염색에 의해 시각화하였다. 단백질 안정성은 pH 3.0, 7.0 또는 10.0으로 조정된 0.1M 인산염 버퍼에서 항체를 0-14일 동안 인큐베이션하여 모니터링하였다. 또한, 각 항체를 0-3% H2O2를 함유한 PBS 버퍼에서 5시간 동안 37℃ 배양기로 인큐베이션하였다. 항체의 온전성(integrity)은 상기 기재된 ELISA 분석에 의해 측정되었다.
1-12. 통계분석
인델(indel) 효율에 대한 통계적 테스트는 two-tailed Student's t-test를 사용하여 Sigma Plot에서 수행되었었으며, p value < 0.05는 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2. 게놈 편집에 의한 무당질 항체 생산 마우스 확립
면역글로블린 G(IgG)는 N-연결된 당단백질로, 일반적인 당단백질과 마찬가지로 글리칸 구조에 이질성(heterogeneity)을 나타낸다. 이와 같은 특성 때문에, 렉틴을 포함한 글리칸 특이적 프로브를 사용하여 질병 특이적 글리콜-바이오 마커를 측정하는데 있어서, ELISA 또는 CLIA와 같은 일상적으로 사용되는 면역측정법(immunoassay)의 사용이 제한되었다. 한편, 렉틴은 피분석물이 존재하지 않더라도 포획 항체에 결합될 수 있고(도 1), 글리칸 구조는 예측하기 어렵고, batch-to-batch 변형이 용이하므로, 통제할 수 없는 상당한 공시험값(blank value)을 생성한다. 이와 같은 문제는 적절한 렉틴 및 무당질 항체를 사용하는 면역분석 플랫폼인 ALIQUAT(Aglycosylated antibody-Lectin coupled Immunoassay for the QUAntification of Tumor marker)을 통한 특정 글리코폼(glycoform) 분석에 의하여 해결될 수 있다(도 2). 따라서, 본 실시예에서는 게놈 편집에 의하여 무당질 항체를 생산하는 마우스를 확립하였다.
2-1. 마우스 접합체의 게놈 편집 확인
HDR 효율성을 향상시키기 위해 여러 가지 접근 방법이 개발되었지만, 이와 같은 방법들은 여전히 비상동 말단 연결(Non-homologous end joining, NHEJ) 기반의 녹아웃(knock-out) 효율에 비해 상당히 낮다. 최근, 이중가닥 DNA의 절단 없이, 시토신 또는 아데닌 염기 기반 편집에 의해 높은 효율로 각각 'C-G to T-A' 또는 'A-T to G-C' 전환이 가능한 염기 편집 시스템(base editing system)이 개발되었다. C57BL/6의 IgG 유전자의 서열 분석 결과, 염기 편집 창(도 3) 내에서 IgG2b, IgG2c 및 IgG3가 N-글리코실화 아스파라긴 코딩 서열(AAC)에 편집 가능한 아데닌을 공유하는 것으로 나타났다. 하나 또는 둘 모두의 아데닌을 구아닌으로 전환시키면, 비-아스파라긴 코딩 서열이 생성되어 IgG에서 N-글리칸이 사라진다.
따라서, 무당질 항체 생산 마우스를 확립하기 위하여, 실시예 1-3에 따라, C57BL/6 마우스 유래 접합체에 IgG2b, IgG2c 및 IgG3를 표적으로하는 가이드 RNA 및 ABE7.10 mRNA를 동시에 주입하여 해당 유전자의 변형을 유도하였다. 그 후, 실시예 1-4에 따라, 유전자형 분석을 수행하였다. 유전자형 분석은 ARMS(amplification refractory mutation system)에 의해 태어난 pup(n=24)에서 수행되었으며, 프라이머는 도 4 에서 화살표로 표시된 바와 같이, A에서 G로 전환될 때 다른 크기의 추가 PCR 생성물을 생성하도록 설계되었다(도 4).
분석 결과, 모든 IgG 유전자에 대해 고효율의 A에서 G 로의 전환이 관찰되었다. 전환율(적어도 하나의 유전자좌의 전환)은 IgG2c가 79.1%(19/24), IgG2b가 87.5%(21/24), IgG3가 62.5%(15/24)인 것으로 확인되었다. 유전자형 선별 결과를 비교한 결과, 3개의 유전자에서 동시 전환을 나타내는 것으로 보이는 15마리의 pup을 확인하였으며, 그 중 9마리에 대해 개별적으로 생거 서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 키메라 돌연변이가 포함된 경우, 9마리의 모든 pup에서 IgG2c(도 5), IgG2b(도 6) 및 IgG3(도 7)의 세 유전자좌에 돌연변이가 발생한 것으로 확인되었다.
2-2. IgG2b, IgG2c 및 IgG3 유전자 편집된 intermediate founder 마우스 확립
실시예 2-1에서 선별한 9마리의 pup 중, IgG1 유전자좌에서 게놈 편집을 수행하는데 사용하기 위하여, 다른 pup 대비 IgG2c(도 8), IgG2b(도 9) 및 IgG3(도 10) 유전자에서 이대립인자성(biallelic) "A to G" 전환율이 높은 pup(#11)을 선택하였다. 이 pup은 IgG2b에서 동형접합 돌연변이(homozygous mutation)를 보였으며 IgG2c와 IgG3에서 키메라 돌연변이를 보였다(도 11).
구분 편집된 표적 염기서열(5'→3') 서열번호
IgG2b TAC G ACAGTACT C TCCGGGTGG 서열번호 37
IgG2c TAC G ACAGTACTCTCCGGGTGG 서열번호 38
IgG3 TAC G ACAGTACCTTCCGAGTGG 서열번호 39
게놈 편집된 pup과 야생형 C57BL/6 마우스의 교배하여 생긴 pup을 이형접합 돌연변이 pup과 수회 반복 교배 및 번식시켜 돌연변이 아미노산 모티프인 D-S-T, D-G-T, G-S-T 및 G-G-T 중 하나를 갖도록 고정하였다. D-S-T 돌연변이는 N-글리코실화 아스파라긴 잔기가 면역글로불린 β샌드위치 폴드(fold)의 두 가닥 사이에 노출된 루프에 위치하고 있기 때문에, 대전된 측쇄를 갖더라도, 아스파라긴과 동일한 기하학 구조를 나타내는 아스파르트산은 글리신(GST)에 비해 잠재적 기하학적 구조의 불안정성을 피할 수 있으므로, intermediate founder로써, D-S-T 돌연변이를 선택하였다. D-G-T 또는 G-S-T와 같은 두 가지 돌연변이의 도입은 구조물의 변형을 최소화하기 위해 배재하였다(도 12). intermediate founder를 사육하고, IgG1 유전자 편집을 위해 사용하였다.
2-3. IgG1, IgG2b, IgG2c 및 IgG3 유전자 편집된 founder 마우스 확립
IgG1의 표적 부위는 canonical(NGG)을 포함하지 않지만, 표적의 두 가닥 모두 NG PAM 서열만을 포함한다. 따라서, 가능한 인접 사이트를 표적으로하여 공여 DNA를 사용하여 HDR 매개 유전자 편집을 수행하였으나, IgG1 유전자가 편집된 pup을 생성할 수 없었다. 따라서, IgG1의 유전자 편집을 위하여, NG 서열에 대한 유전자 표적화 활성을 나타내는 실시예 1-2의 xCas9-ABE를 사용하여 실시예 1-3에 따라 IgG1 유전자를 편집하였다.
그 결과, 2개의 pup에서 heterogeneic 전환이 나타났으며, 하나의 대립유전자가 세린을 암호화하는 서열(TCA G CAGCACTTTCCGTTCAGT; IgG1; 서열번호 40)로 전환되었다(도 13). 편집된 pup을 homozygous IgG1이 될 때까지 수 회 반복 교배 및 번식시켰다. 모든 돌연변이는 생식선 전이(germ-line transmission)가 이루어졌고, IgG1, IgG2b, IgG2c 및 IgG3에서 누적된 무당질 돌연변이를 갖는 founder가 성공적으로 확립되었다. 4개의 대립유전자에서의 돌연변이는 생거 시퀀싱에 의해 다시 확인되었다. 구체적인 게놈 편집에 대한 절차는 표 7과 같다.
Subclass 방법 Effector protein Effector
/gRNA		 Amino acid modification 접합자 수 Pups born Mutants
(monoallelic
/biallelic)
수집 주입 이식
IgG1 Adenine base editing xCas9-ABE7.10 mRNA/RNA NST→SST 211 196 32 10 7/0
IgG2b ABE7.10 NST→DST 405 317 112 24 10/11
IgG2c 12/7
IgG3 5/10
실시예 3. 게놈 편집된 마우스에서 인간 AFP에 대해 생성된 무당질 단일클론항체의 생산 확인
3-1. 면역글로불린의 모든 서브클래스 생산 능력 확인
면역글로불린 G(IgG)의 N-글리코실화는 마우스, 토끼 및 인간을 포함하는 고등 진핵 생물 사이에서 고도로 보존되어있다. IgG N-글리코실화가 안정성을 부여하거나 면역 반응 조절에 관여한다는 보고가 있지만, 진화론적 압력으로 인하여 고등 생물체가 IgG의 N-글리코실화를 채택하게 된 것인지는 명확하지 않다.
따라서, 결함이 있는 IgG가 생산되는지 확인하기 위하여, 실시예 2에서 확립된 게놈 편집된 마우스 유래 IgG에 대해 면역글로불린 아이소타이핑(isotyping) 키트를 사용하여 IgG 프로파일링을 수행하였다.
그 결과, 게놈 편집된 마우스는 야생형 마우스와 동일한 프로파일을 보이는 것으로 확인되었다(도 14). 반면, IgG2b(도 15) 및 IgG3(도 16) 유전자가 녹아웃된 마우스는 상응하는 서브클래스(subclass)의 생산에 결함을 보이는 것으로 확인되었다.
이와 같은 결과를 통하여, 게놈 편집된 마우스는 면역글로불린의 모든 서브클래스를 생산할 수 있는 능력을 보유하고 있는 것으로 확인되었다.
3-2. 무당질 항체 생산 확인
게놈 편집된 마우스로부터 생산되는 항체가 무당질 항체인지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)에서 가장 특징적인 종양 표지자 중 하나인 인간 AFP를 모델 항원으로 사용하였다. 동일한 양의 보조제로 유화한 인간 AFP를 6주령의 게놈 편집된 마우스(n=5)의 뒷발에 1주 간격으로 5회 주사하고, 각 면역 단계에서 혈청을 채취하여 hAFP에 대한 direct ELISA 분석을 수행하였다.
그 결과, 시간이 지남에 따라 증가된 반응성을 나타내는 것으로 확인되어(도 17), 면역화가 진행된 것으로 확인되었다.
면역화 후, 쥐에서 슬와림프절 세포를 채취하여 실시예 1-5에 따라 FO 골수종(myeloma) 세포와 융합시키고, HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 함유 플레이트 상에 하이브리도마 세포의 콜로니를 형성시켜 666개의 하이브리도마 클론을 얻었다.
그 결과, 하이브리도마 클론 중, 13.9% 클론(93개)에서 hAFP에 높은 반응성을 나타내는 항체가 분비되는 것으로 확인되었다(도 18).
3-3. 단일클론항체 생산성이 우수한 하이브리도마 클론 선별
항-hAFP 항체는 인간혈청알부민(human serum albumin, HAS)에 존재하는 에피토프에 대해 교차 반응을 나타낼 수 있으므로, HAS에 대한 반응성을 확인하여 반응성 클론을 제외하였다. 또한, 시간이 지남에 따라 항체 생산이 감소한 클론은 제외하고, 항체 생산이 지속되는 클론을 선별하여, 1E5, 2A2 및 3A5로 지정된 3개의 클론을 선별하였다. 3개의 클론은 모두 IgG1 서브클래스 및 카파(kappa) 경쇄의 단일클론항체를 분비하는 것으로 확인되었다(도 19). 또한, MS 분석을 통하여, 새롭게 형성된 돌연변이 영역에 O-linked 글리코실화와 같은 번역 후 변형(post-translational modification)은 존재하지 않는 것으로 확인되었다.
3-4. 선별된 하이브리도마 클론에서 생산된 항체의 무당화 확인
생성된 항체가 완전히 무당화된 것을 확인하기 위하여, Concanavalin A(Con-A)를 사용한 렉틴 블롯 분석 및 항-마우스 IgG 항체를 사용한 면역 블롯 분석을 수행하였다.
그 결과, 화살표로 표시된 Con-A에 반응하는 상업적으로 구입한 항체와 달리, 항체(1E5)의 중쇄에는 N-글리칸이 없는 것으로 확인되었다(도 20). IgG는 CH2 영역 밖에도 N-글리칸의 전달이 가능하지만, 실시예 3-3에서 확립된 세 개의 클론은 N-글리코실화의 흔적을 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 21).
실시예 4. 렉틴 결합 ELISA 분석에 따른 무당화 항체의 타당성 검사
4-1. L3-null AFP 표준을 만들기 위한 FUT8 - /- 돌연변이 클론 제작
HEK293-T 세포는 GDP-푸코오스(fucose)에서 core N-글리칸으로의 푸코오스 전이를 촉매하는 FUT8(alpha-(1,6)-fucosyltransferase)를 발현한다. FUT8 유전자에는 3가지 스플라이싱 변이가 존재하고, 촉매 활성과 관련이 있고, 모든 변이형이 공유하는 엑손 9 및 11은 글리코실트랜스퍼라아제(glycosyltransferase) 패밀리 23에 속한다.
ALIQUAT(Aglycosylated antibody-Lectin coupled Immunoassay for the QUAntification of Tumor marker) 시스템을 확립하기 위하여, 실시예 1-10에 따라 무당화 항체의 생산 가능성을 샌드위치 ELISA 플랫폼에서 테스트하기에 앞서, AFP-L3이 결핍된 hAFP 표준을 얻는 것이 중요하므로, L3-null AFP 표준을 만들기 위하여, 실시예 1-7에 따라 CRISPR-Cas9으로 엑손 9 및 11을 각각 표적화하였다.
그 결과, 틀이동 넌센스 돌연변이를 나타내는 FUT8-/- 돌연변이 클론을 얻었다(도 22).
4-2. FUT8 -/- 세포의 AFP-L3을 생성 여부 확인
FUT8 유전자 제거에 의한 기능적 손실을 조사하기 위하여, core-fucosylated N-glycan에 특이적인 결합성을 나타내는 것으로 알려진 PhoSL(mushroom Pholiota squarrosa) 유래 렉틴을 사용하여 실시예 1-9에 따라 렉틴 결합 테스트를 수행하였다. 면역 형광(immunofluorescence) 분석 수행 결과, FUT8-/- HEK293-T 세포는 PhoSL 결합성이 없는 것으로 확인되었다(도 23).
한편, hAFP는 야생형 및 FUT8-/- HEK293-T 세포 모두에서 과발현되었고, 렉틴 친화도 전기영동을 위하여 조건 배지를 수득하였다. AFP-L3과 AFP-L1이 다른 이동성을 나타내도록 Lens culinaris agglutinin이 포함된 아가로오스 젤에서 단백질의 전기영동을 수행하였다. 항-hAFP 항체를 사용하여 면역 블롯 분석하여 AFP의 다른 glycoform을 시각화하였다(도 24). AFP-L3는 야생형 HEK293-T 세포로부터 얻은 AFP glycoform의 대부분을 차지하는 반면, FUT8-/- 세포는 AFP-L3을 생성하지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 질량분석 결과, FUT8-/- 세포에서 AFP-L3는 나타나지 않는 것으로 확인되었고, 야생형 세포에서 AFP-L3의 생성비율은 99.5%인 것으로 확인되었으며(도 25), μ-Tas 분석에서도 유사한 결과를 확인하였다(86.8 %).
4-3. ALIQUAT 시스템에 있어서, 무당질 항체의 타당성 확인
canonical sandwich ELISA 및 AAL을 사용하는 lectin-coupled ELISA 분석에 의해 표준 곡선을 작성하였다.
구체적으로, canonical sandwich ELISA의 경우, 무당질 항체(1E5) 또는 상업적 항체를 포획(capture) 항체로 사용하였다. 검출(detection) 항체 쌍은 상업적으로 이용 가능한 항체 중, 포획 항체와 메칭되는 항체를 선택하였다. 표준 곡선 분석 결과, 유효성이 확인된 시판 항체와 비교하여 민감도는 낮지만, 무당질 항체는 0-20ng/mL AFP의 범위에서 우수한 선형성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 26).
무당질 항체의 타당성은 AAL 렉틴을 사용한 AFP-L3 테스트에 의해 증명되었다(도 27). 상업적 항체를 사용한 렉틴 ELISA는 상당한 공시험값(blank value)을 나타내었고, L3 양성 AFP의 증가된 농도는 높은 표준 오차(standard error)를 갖는 광학 밀도의 선형 증가를 반영하지 않았다. 이 패턴은 L3 양성 및 음성 AFP 샘플 모두에서 유사하게 관찰되었다. 그러나 무당질 항체를 사용한 렉틴 ELISA 분석은 L3 양성 AFP 샘플에 대한 선형성이 우수한 표준 곡선을 만들었다. 0-1,000ng/mL의 범위에서 어떠한 간섭도 관찰되지 않았으며, 특정 글리코폼(glycoform)의 정량화를 위한 분석 플렛폼의 제공에 있어서, 렉틴과 무당질 항체의 조합적 사용에 따른 분석의 타당성을 확인하였다.
실시예 5. 무당질 기반 렉틴-ELISA hAFP 테스트의 μ-TAS 분석 대체 가능성 확인
μ-TAS는 LCA가 내장된 모세관에서 AFP-L3의 이동을 전기영동으로 분석하는 체외 진단용 면역 분석기이다. 분석기의 고감도 및 견고성과 AFP-L3 측정의 임상적 유용성 때문에, μ-TAS는 HCC 진행의 위험성 평가를 위한 시험관 내 검사의 FDA 승인을 받았다. 분석적 타당성과 임상적 유용성에도 불구하고 μ-TAS 분석은 임상적 용도에 몇 가지 한계가 있다. 일반적으로 고비용을 요하는 분석이므로, 암 검진을 위한 일상적인 임상적 사용이 제한된다. 또한, μ-TAS는 AFP-L3의 용도로 개발되었으며, 다른 글리코폼 분석에 사용하기 어렵다.
반면, ALIQUAT 방법은 다양한 질병 특이적 형태의 검출을 위한 범용적이고 보편적인 플랫폼을 제공할 수 있다. 다만, ALIQUAT 플랫폼은 글리코폼 특이적 프로브 및 무당질 항체가 이용 가능한 경우에만 다른 질병 특이적 글리코폼의 테스트에 용이하게 적용될 수 있다. 종양 특이적 바이오마커에 대한 특이성을 가진 다양한 렉틴이 이미 이용 가능하므로, 본 발명의 게놈 편집된 마우스로부터 용이하게 생산될 수 있는 무당질 항체가 ALIQUAT 방법에 적용될 수 있는지 확인하기 위하여, 무당질 항체(1E5)가 마그네틱 비드에 컨쥬게이션되어 혈청에서 hAFP를 탐지하고 푸코실화된(fucosylated) 형태가 AAL로 추적되는 화학발광 면역분석(chemiluminescent immunoassay, CLIA) 플랫폼에 임상 샘플을 적용하여 분석의 타당성 여부를 확인하였다.
구체적으로, AFP-L3 표준 분자를 1.0ng/mL 미만의 AFP 수준을 나타내는 정상 혈청에 스파이크하였다. 표준 곡선은 0-100ng/mL의 범위에서 양호한 선형성을 보였다(도 28). 그 다음, 정상적인 지원자와 hepatitis, cirrhosis 및 hepatocellular carcinoma 환자에서 혈청(n=19)을 채취하였다. 100ng/mL보다 높은 AFP 수준을 나타내는 혈청에 대해서는 농도가 표준 곡선 범위 내에 있도록 희석하였다. 각각의 혈청을 균등 부피로 나누고, ALIQUAT 방법 및 실시예 1-8에 따른 μ-TAS 분석을 통해 측정하였다.
측정된 값을 X 축에 대해서는 AFP 수준으로, Y 축에 대해서는 %AFP-L3로 플롯하고, 두 플랫폼에서 얻은 각 값을 비교한 결과, 비교 분석은 p value > 0.05를 나타내어, 두 검사가 실질적으로 동일한 결과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 29).
실시예 6. 무당질 항체의 보존된 단백질의 안정성
단백질 글리코실화는 단백질 기능, 단백질-단백질 상호 작용, 세포-숙주 인식 등 다양한 효과를 나타낸다. 또한, 단백질 글리칸은 in vivo 및 in vitro에서 단백질 안정성을 부여하는 것으로 알려져 있다(Bowden 2012). 따라서, 무당질화에 의하여 항체가 저장 및 시험 중에 단백질 안정성을 상실하는지 여부를 실시예 1-11에 따라 확인하였다.
구체적으로, 다양한 조건에서 항체의 안정성을 조사하고자 시판되는 글리코실화된 항체와 PNGase-F 처리에 의해 생성된 탈글리코실화(deglycosylate)된 형태의 항체를 대조군으로 비교하였다.
6-1. 단백질의 열 안정성 확인
PBS 버퍼에서 다양한 형태의 항체를 14일 동안 4℃ 및 37℃의 조건으로 처리하였다. 탈글리코실화 항체는 화살표로 나타낸 바와 같이 2개의 상이한 분해 단편(degradation fragment)을 나타내는 것으로 확인되었다(도 30). 처리 초기에 단편이 관찰되었기 때문에, 단편 중 분자량이 약 35kDa인 단편은 PNGase-F 처리에 의하여 발생한 것으로 확인되었다. 단편 중, 분자량이 약 50kDa인 단편은 37℃에서 시간에 따라 증가한 것으로 확인하였다. 그러나 본래의 글리코실화된 형태는 조사된 조건 하에서 어떠한 분해 생성물도 나타내지 않았다. 유사하게, 우리는 겔상에서 무당질 항체에 대한 분해 산물의 흔적을 검출할 수 없었다.
이와 같은 결과를 통하여, 글리칸 자체의 부재보다는 탈글리코실화 반응 조건에 의해 단백질의 안정성의 더욱 손실되는 것을 확인하였다.
6-2. 단백질의 pH 안정성 확인
항체는 다양한 반응 조건 또는 정제 과정에서 pH의 변화에 노출될 수 있다. 따라서, 다양한 pH 조건에서 다양한 글리코폼 항체의 안정성을 조사하였다.
구체적으로, 37℃에서 14일 동안 pH 3.0, 7.0 및 10.0의 버퍼에서 인큐베이션한 항체를 hAFP 측정에서 검출 항체로 사용하였다. 테스트의 광학 밀도 값을 측정하여 단백질의 결합력을 평가하였다. 그 결과, 글리코실화 및 무당질 항체는 유사한 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 31). 두 종류의 항체 모두 중성(pH 7.0) 조건에서 14일 동안 높은 안정성을 나타내었고 염기성 (pH 10.0) 조건에서 높은 저항성을 나타낸 반면, pH 3.0에서는 시간에 따라 안정성이 감소하였다. 대조적으로, 탈글리코실화된 형태는 중성 pH에서도 온전성(integrity)에서 상당한 손실을 보였다. pH 7.0에서 14일간 항온 배양한 항체 중 약 50%의 항체가 결합력을 상실하였으며 pH 10.0에서 배양한 경우 손실이 더 두드러졌다. 특히, 탈글리코실화된 형태는 pH 3.0에서 4일 동안 배양할 경우 결합력이 완전히 손실되는 것으로 확인되었다.
6-3. 산화 조건에 대한 단백질의 안정성 확인
산화 조건 하에서 항체의 온전성에 대해 조사한 결과, 글리코실화 및 무당질 항체 모두 이러한 조건에 대한 저항성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이는 탈글리코실화된 형태의 물리적 특성과 상당히 대조적이었다(도 32). 무당질 항체는 3.0% H2O2를 함유하는 PBS 완충액에서 1시간 동안 항온 처리한 경우, 10% 미만의 온전성 손실을 나타냈다. 그러나, 탈글리코실화된 항체는 이러한 조건 하에서 약 50%의 결합활성(avidity) 손실이 확인되었다. 이와 같은 결과를 통하여, 글리코실화된 면역글로불린 G 대비 무당질 항체의 안정성이 낮아지지 않는 것으로 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Transgenic Mouse for Producing Aglycosylated Antibody and Uses of Aglycosylated Antibody prepared Thereof <130> PN180123-P1 <160> 40 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABE <400> 1 atgtccgaag tcgagttttc ccatgagtac tggatgagac acgcattgac tctcgcaaag 60 agggcttggg atgaacgcga ggtgcccgtg ggggcagtac tcgtgcataa caatcgcgta 120 atcggcgaag gttggaatag gccgatcgga cgccacgacc ccactgcaca tgcggaaatc 180 atggcccttc gacagggagg gcttgtgatg cagaattatc gacttatcga tgcgacgctg 240 tacgtcacgc ttgaaccttg cgtaatgtgc gcgggagcta tgattcactc ccgcattgga 300 cgagttgtat tcggtgcccg cgacgccaag acgggtgccg caggttcact gatggacgtg 360 ctgcatcacc caggcatgaa ccaccgggta gaaatcacag aaggcatatt ggcggacgaa 420 tgtgcggcgc tgttgtccga cttttttcgc atgcggaggc aggagatcaa ggcccagaaa 480 aaagcacaat cctctactga ctctggtggt tcttctggtg gttctagcgg cagcgagact 540 cccgggacct cagagtccgc cacacccgaa agttctggtg gttcttctgg tggttcttcc 600 gaagtcgagt tttcccatga gtactggatg agacacgcat tgactctcgc aaagagggct 660 cgagatgaac gcgaggtgcc cgtgggggca gtactcgtgc tcaacaatcg cgtaatcggc 720 gaaggttgga atagggcaat cggactccac gaccccactg cacatgcgga aatcatggcc 780 cttcgacagg gagggcttgt gatgcagaat tatcgactta tcgatgcgac gctgtacgtc 840 acgtttgaac cttgcgtaat gtgcgcggga gctatgattc actcccgcat tggacgagtt 900 gtattcggtg ttcgcaacgc caagacgggt gccgcaggtt cactgatgga cgtgctgcat 960 tacccaggca tgaaccaccg ggtagaaatc acagaaggca tattggcgga cgaatgtgcg 1020 gcgctgttgt gttacttttt tcgcatgccc aggcaggtct ttaacgccca gaaaaaagca 1080 caatcctcta ctgactctgg tggttcttct ggtggttcta gcggcagcga gactcccggg 1140 acctcagagt ccgccacacc cgaaagttct ggtggttctt ctggtggttc tgataaaaag 1200 tattctattg gtttagccat cggcactaat tccgttggat gggctgtcat aaccgatgaa 1260 tacaaagtac cttcaaagaa atttaaggtg ttggggaaca cagaccgtca ttcgattaaa 1320 aagaatctta tcggtgccct cctattcgat agtggcgaaa cggcagaggc gactcgcctg 1380 aaacgaaccg ctcggagaag gtatacacgt cgcaagaacc gaatatgtta cttacaagaa 1440 atttttagca atgagatggc caaagttgac gattctttct ttcaccgttt ggaagagtcc 1500 ttccttgtcg aagaggacaa gaaacatgaa cggcacccca tctttggaaa catagtagat 1560 gaggtggcat atcatgaaaa gtacccaacg atttatcacc tcagaaaaaa gctagttgac 1620 tcaactgata aagcggacct gaggttaatc tacttggctc ttgcccatat gataaagttc 1680 cgtgggcact ttctcattga gggtgatcta aatccggaca actcggatgt cgacaaactg 1740 ttcatccagt tagtacaaac ctataatcag ttgtttgaag agaaccctat aaatgcaagt 1800 ggcgtggatg cgaaggctat tcttagcgcc cgcctctcta aatcccgacg gctagaaaac 1860 ctgatcgcac aattacccgg agagaagaaa aatgggttgt tcggtaacct tatagcgctc 1920 tcactaggcc tgacaccaaa ttttaagtcg aacttcgact tagctgaaga tgccaaattg 1980 cagcttagta aggacacgta cgatgacgat ctcgacaatc tactggcaca aattggagat 2040 cagtatgcgg acttattttt ggctgccaaa aaccttagcg atgcaatcct cctatctgac 2100 atactgagag ttaatactga gattaccaag gcgccgttat ccgcttcaat gatcaaaagg 2160 tacgatgaac atcaccaaga cttgacactt ctcaaggccc tagtccgtca gcaactgcct 2220 gagaaatata aggaaatatt ctttgatcag tcgaaaaacg ggtacgcagg ttatattgac 2280 ggcggagcga gtcaagagga attctacaag tttatcaaac ccatattaga gaagatggat 2340 gggacggaag agttgcttgt aaaactcaat cgcgaagatc tactgcgaaa gcagcggact 2400 ttcgacaacg gtagcattcc acatcaaatc cacttaggcg aattgcatgc tatacttaga 2460 aggcaggagg atttttatcc gttcctcaaa gacaatcgtg aaaagattga gaaaatccta 2520 acctttcgca taccttacta tgtgggaccc ctggcccgag ggaactctcg gttcgcatgg 2580 atgacaagaa agtccgaaga aacgattact ccatggaatt ttgaggaagt tgtcgataaa 2640 ggtgcgtcag ctcaatcgtt catcgagagg atgaccaact ttgacaagaa tttaccgaac 2700 gaaaaagtat tgcctaagca cagtttactt tacgagtatt tcacagtgta caatgaactc 2760 acgaaagtta agtatgtcac tgagggcatg cgtaaacccg cctttctaag cggagaacag 2820 aagaaagcaa tagtagatct gttattcaag accaaccgca aagtgacagt taagcaattg 2880 aaagaggact actttaagaa aattgaatgc ttcgattctg tcgagatctc cggggtagaa 2940 gatcgattta atgcgtcact tggtacgtat catgacctcc taaagataat taaagataag 3000 gacttcctgg ataacgaaga gaatgaagat atcttagaag atatagtgtt gactcttacc 3060 ctctttgaag atcgggaaat gattgaggaa agactaaaaa catacgctca cctgttcgac 3120 gataaggtta tgaaacagtt aaagaggcgt cgctatacgg gctggggacg attgtcgcgg 3180 aaacttatca acgggataag agacaagcaa agtggtaaaa ctattctcga ttttctaaag 3240 agcgacggct tcgccaatag gaactttatg cagctgatcc atgatgactc tttaaccttc 3300 aaagaggata tacaaaaggc acaggtttcc ggacaagggg actcattgca cgaacatatt 3360 gcgaatcttg ctggttcgcc agccatcaaa aagggcatac tccagacagt caaagtagtg 3420 gatgagctag ttaaggtcat gggacgtcac aaaccggaaa acattgtaat cgagatggca 3480 cgcgaaaatc aaacgactca gaaggggcaa aaaaacagtc gagagcggat gaagagaata 3540 gaagagggta ttaaagaact gggcagccag atcttaaagg agcatcctgt ggaaaatacc 3600 caattgcaga acgagaaact ttacctctat tacctacaaa atggaaggga catgtatgtt 3660 gatcaggaac tggacataaa ccgtttatct gattacgacg tcgatcacat tgtaccccaa 3720 tcctttttga aggacgattc aatcgacaat aaagtgctta cacgctcgga taagaaccga 3780 gggaaaagtg acaatgttcc aagcgaggaa gtcgtaaaga aaatgaagaa ctattggcgg 3840 cagctcctaa atgcgaaact gataacgcaa agaaagttcg ataacttaac taaagctgag 3900 aggggtggct tgtctgaact tgacaaggcc ggatttatta aacgtcagct cgtggaaacc 3960 cgccaaatca caaagcatgt tgcacagata ctagattccc gaatgaatac gaaatacgac 4020 gagaacgata agctgattcg ggaagtcaaa gtaatcactt taaagtcaaa attggtgtcg 4080 gacttcagaa aggattttca attctataaa gttagggaga taaataacta ccaccatgcg 4140 cacgacgctt atcttaatgc cgtcgtaggg accgcactca ttaagaaata cccgaagcta 4200 gaaagtgagt ttgtgtatgg tgattacaaa gtttatgacg tccgtaagat gatcgcgaaa 4260 agcgaacagg agataggcaa ggctacagcc aaatacttct tttattctaa cattatgaat 4320 ttctttaaga cggaaatcac tctggcaaac ggagagatac gcaaacgacc tttaattgaa 4380 accaatgggg agacaggtga aatcgtatgg gataagggcc gggacttcgc gacggtgaga 4440 aaagttttgt ccatgcccca agtcaacata gtaaagaaaa ctgaggtgca gaccggaggg 4500 ttttcaaagg aatcgattct tccaaaaagg aatagtgata agctcatcgc tcgtaaaaag 4560 gactgggacc cgaaaaagta cggtggcttc gatagcccta cagttgccta ttctgtccta 4620 gtagtggcaa aagttgagaa gggaaaatcc aagaaactga agtcagtcaa agaattattg 4680 gggataacga ttatggagcg ctcgtctttt gaaaagaacc ccatcgactt ccttgaggcg 4740 aaaggttaca aggaagtaaa aaaggatctc ataattaaac taccaaagta tagtctgttt 4800 gagttagaaa atggccgaaa acggatgttg gctagcgccg gagagcttca aaaggggaac 4860 gaactcgcac taccgtctaa atacgtgaat ttcctgtatt tagcgtccca ttacgagaag 4920 ttgaaaggtt cacctgaaga taacgaacag aagcaacttt ttgttgagca gcacaaacat 4980 tatctcgacg aaatcataga gcaaatttcg gaattcagta agagagtcat cctagctgat 5040 gccaatctgg acaaagtatt aagcgcatac aacaagcaca gggataaacc catacgtgag 5100 caggcggaaa atattatcca tttgtttact cttaccaacc tcggcgctcc agccgcattc 5160 aagtattttg acacaacgat agatcgcaaa cgatacactt ctaccaagga ggtgctagac 5220 gcgacactga ttcaccaatc catcacggga ttatatgaaa ctcggataga tttgtcacag 5280 cttgggggtg actctggtgg ttctcccaag aagaagagga aagtctaa 5328 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg1 <400> 2 tcaacagcac tttccgttca gt 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg2b <400> 3 tacaacagta ctatccgggt gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg2c <400> 4 tacaacagta ctctccgggt gg 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg3 <400> 5 tacaacagta ccttccgagt gg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 1_ARMS_outer_F <400> 6 tcccagaagt atcatctgtc 20 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 1_ABE+G-ARMS F_14+G <400> 7 ggaggagcag atcag 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 1_ABE-A-ARMS R_15 <400> 8 aacggaaagt gctgt 15 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 1_ARMS_outer_R <400> 9 ctttggtttt ggagatggtt 20 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 2b_ARMS_outer F <400> 10 ctaacctcga gggtgg 16 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 2b_ABE+G-ARMS R_14+G <400> 11 atagagagga ttacg 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 2b_ABE-A-ARMS R 15 <400> 12 ccggatagta ctgtt 15 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 2b_ARMS_outer_R <400> 13 ggcggcaaga tgtatac 17 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 2c_ARMS_outer F <400> 14 catgcgcagg taagtc 16 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 2c_ABE+G-ARMS F _14+G <400> 15 atagagagga ttacg 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 2c_ABE-A-ARMS R_15 <400> 16 ccggagagta ctgtt 15 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 2c_ARMS_outer_R <400> 17 tgttgttgac cttgcatttg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 3_ARMS_outer_F <400> 18 ctggtaacat cttgggtgga 20 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 3_ABE+G-ARMS F_14+G <400> 19 gtgaagctca gtacg 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 3_ABE-A-R_15 <400> 20 tcggaaggta ctgtt 15 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ighg 3_ARMS_outer_R <400> 21 ttcttcttgg acatttgtt 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG subclass_Ighg1_F <400> 22 gcagcaccaa ggtggacaag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG subclass_Ighg1_R <400> 23 gtgctgggtg tggcagtgta 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG subclass_Ighg2b_F <400> 24 ctcctaactc cgagggtgga 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG subclass_Ighg2b_R <400> 25 gagatggttc ttccgatggg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG subclass_Ighg2c_F <400> 26 accatccgtc ttcatcttcc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG subclass_Ighg2c_R <400> 27 tgttgttgac cttgcatttg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG subclass_Ighg3_F <400> 28 ctggtaacat cttgggtgga 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG subclass_Ighg3_R <400> 29 tgagatggtt ctctcgatgg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut8_Exon 9_F <400> 30 accagtgtca atgcgagcat 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut8_Exon 9_R <400> 31 tttcaagggc caggaagact 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut8_Exon 11_F <400> 32 gtgaaaggtg ggaggagggt 20 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut8_Exon 11_R <400> 33 tccagatgat tctcatgcat gct 23 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut8-e9-sgRNA#1 <400> 34 tactacctca gtcagacaga 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut8-e9-sgRNA#2 <400> 35 aaccagttct gtcagatctt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut8-e11-sgRNA#1 <400> 36 cacccagcga acactcatct 20 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG2b <400> 37 tacgacagta ctctccgggt gg 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG2c <400> 38 tacgacagta ctctccgggt gg 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG3 <400> 39 tacgacagta ccttccgagt gg 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 <400> 40 tcagcagcac tttccgttca gt 22

Claims (19)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. IgG(immunoglobulin G) 유전자가 변형된 무당질 항체 생산용 인간을 제외한 동물모델에 있어서,
    상기 변형은
    IgG1 중쇄의 297번 내지 299번 아미노산 서열을 암호화하는 영역을 포함하는 염기 중, 서열번호 2에 해당하는 서열이 서열번호 40의 서열로 치환;
    IgG2b 중쇄의 297번 내지 299번 아미노산 서열을 암호화하는 영역을 포함하는 염기 중, 서열번호 3에 해당하는 서열이 서열번호 37의 서열로 치환;
    IgG2c 중쇄의 297번 내지 299번 아미노산 서열을 암호화하는 영역을 포함하는 염기 중, 서열번호 4에 해당하는 서열이 서열번호 38의 서열로 치환; 및
    IgG3 중쇄의 297번 내지 299번 아미노산 서열을 암호화하는 영역을 포함하는 염기 중, 서열번호 5에 해당하는 서열이 서열번호 39의 서열로 치환
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환에 의하여 발생된 것인 동물모델.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 동물은 토끼, 염소 또는 마우스인 것인 동물모델.
  14. 제 9 항의 동물모델에 진단하고자 하는 항원을 투여하는 단계를 포함하는 항원에 대한 무당질 항체의 생산방법.
  15. 제 14 항의 무당질 항체의 생산방법으로 생산된 무당질 항체.
  16. 제 15 항의 무당질 항체; 및
    당단백질을 검출할 수 있는 마커
    를 포함하는 면역진단키트.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 마커는 렉틴인 것인 면역진단키트.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 렉틴은 상기 당단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 렉틴인 것인 면역진단키트.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 당단백질은 AFP-L3인 것인 면역진단키트.
KR1020190067572A 2018-06-07 2019-06-07 무당질 항체 생산용 형질전환 마우스 및 이로부터 생산된 무당질 항체의 용도 KR102170788B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180065394 2018-06-07
KR20180065394 2018-06-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190139163A KR20190139163A (ko) 2019-12-17
KR102170788B1 true KR102170788B1 (ko) 2020-10-28

Family

ID=68770889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190067572A KR102170788B1 (ko) 2018-06-07 2019-06-07 무당질 항체 생산용 형질전환 마우스 및 이로부터 생산된 무당질 항체의 용도

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210127649A1 (ko)
EP (1) EP3804512A4 (ko)
JP (1) JP7268059B2 (ko)
KR (1) KR102170788B1 (ko)
CN (1) CN112512310B (ko)
AU (1) AU2019283621B2 (ko)
WO (1) WO2019235895A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113061605B (zh) * 2020-07-13 2022-11-29 中山大学 一种岩藻糖转移酶8(fut8)功能缺失细胞株的构建方法及其应用
CN114934053B (zh) * 2022-06-30 2024-02-06 澳斯康生物(南通)股份有限公司 岩藻糖基转移酶8缺陷型cho细胞系及其制备方法和应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
US6080910A (en) * 1997-02-20 2000-06-27 Case Western Reserve University Transgenic knockout animals lacking IgG3
EP3263702A1 (en) * 2000-10-06 2018-01-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
CN101022828B (zh) * 2004-02-10 2014-12-10 科罗拉多大学评议会 B因子、补体旁路的抑制及与此相关的方法
US20080019905A9 (en) * 2005-02-18 2008-01-24 Strome Scott E Method of using an anti-CD137 antibody as an agent for radioimmunotherapy or radioimmunodetection
WO2008079713A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Macrogenics Inc. Methods for the treatment of lada and other adult-onset autoimmune diabetes using immunosuppressive monoclonal antibodies with reduced toxicity
US8409641B2 (en) * 2007-12-03 2013-04-02 Syngenta Participations Ag Engineering enzymatically susceptible phytases
US8815237B2 (en) * 2007-12-05 2014-08-26 Massachusetts Institute Of Technology Aglycosylated immunoglobulin mutants
US20110229460A1 (en) * 2008-05-01 2011-09-22 Gtc Biotherapeutics, Inc. anti-cd137 antibody as an agent in the treatment of inflammatory conditions
WO2011007797A1 (ja) * 2009-07-14 2011-01-20 独立行政法人産業技術総合研究所 糖タンパク質の測定方法、肝疾患の検査方法、糖タンパク質定量用試薬および肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質
WO2011116387A1 (en) * 2010-03-19 2011-09-22 Tetragenetics, Inc. Production of aglycosylated monoclonal antibodies in ciliates
EP2797629A4 (en) 2011-12-28 2015-09-30 Novelmed Therapeutics Inc AGLYCOSYLATED HUMAN ANTIBODY AND FUSION PROTEIN AND USES THEREOF
US9580486B2 (en) 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
CN106455512A (zh) * 2014-04-28 2017-02-22 美国陶氏益农公司 单倍体玉米转化
US9790490B2 (en) * 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
KR101863653B1 (ko) * 2016-06-02 2018-06-05 전남대학교 산학협력단 락토페린 발현용 넉-인 벡터 및 이를 이용한 넉인 방법
KR101883886B1 (ko) * 2016-10-27 2018-08-01 국민대학교 산학협력단 암 치료용 무당화 항체 Fc 영역

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomed Sci Letters, vol. 25, pp.372-380(2019.12.31.)
Current opinion in biotechnology, 제30권, 페이지 128-139(2014.07.16. 공개)
Drug discovery today, 제21권, 제5호, 페이지 740-765(2016.05. 공개)
Frontiers in immunology, 제8권, 논문번호 1554(2017.11.13. 공개)
Molecular biotechnology, 제53권, 제3호, 페이지 326-335(2012.03.17. 공개)
Nature Biotechnology, vol.37, pp.430-435(2019년4월 공개)*
Nature, 제551권, 제7681호, 페이지 464-471(2017.11.23. 공개)
이난이의 충북대학교 대학원 석사학위 논문, 논문제목 : RISPR/Cas9 시스템 기반 무당질항체 생산용 마우스 제작을 위한 마우스 유래 세포주 NIH-3T3 세포에서의 Ighg 유전자 교정 연구(2017.02.29. 공개)*

Also Published As

Publication number Publication date
CN112512310B (zh) 2022-12-16
US20210127649A1 (en) 2021-05-06
WO2019235895A1 (ko) 2019-12-12
JP7268059B2 (ja) 2023-05-02
AU2019283621A1 (en) 2021-01-21
AU2019283621B2 (en) 2023-03-30
JP2021526379A (ja) 2021-10-07
KR20190139163A (ko) 2019-12-17
CN112512310A (zh) 2021-03-16
EP3804512A1 (en) 2021-04-14
EP3804512A4 (en) 2022-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105861548B (zh) Adam6小鼠
CA1334177C (en) Production of chimeric antibodies by homologous recombination
RU2694728C2 (ru) Антитела со встроенным в легкие цепи гистидином и генетически модифицированные отличные от человека животные для их получения
US20150250151A1 (en) Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
JP2006507839A (ja) 乳中に安定して産生される改変抗体およびその製造方法
WO2020169022A1 (en) Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus
KR102170788B1 (ko) 무당질 항체 생산용 형질전환 마우스 및 이로부터 생산된 무당질 항체의 용도
CN107660212A (zh) 抗‑cd303单克隆抗体
US8629317B2 (en) Non-human transgenic mammal for the constant region of the class a human immunoglobulin heavy chain and applications thereof
WO2021244522A1 (en) Genetically modified non-human animals with common light chain immunoglobulin locus
US20230060376A1 (en) B cell receptor modification in b cells
KR102192846B1 (ko) 효능이 개선된 인간 cd20 특이적 단일클론항체를 생산하는 형질전환 조류 및 이의 제조방법
JP5158816B2 (ja) キメラ抗体の一段階作製方法
EP3476942A1 (en) Long germline dh genes and long hcdr3 antibodies
Lee et al. Aglycosylated antibody-producing mice for aglycosylated antibody-lectin coupled immunoassay for the quantification of tumor markers (ALIQUAT)
ES2557811T3 (es) Ratones transgénicos del gen cgamma de las inmunoglobulinas humanas de clase G
US20240032515A1 (en) Method for producing bird producing human immunoglobulin fc and target protein
WO2023179620A1 (en) Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin and mhc loci
CN114213542B (zh) Cps-i抗体及其用途
JP2012519001A (ja) Ｃεへの免疫グロブリン重鎖クラススイッチングが増強された高ＩｇＥ動物モデル
KR20230150779A (ko) 중쇄-단독 항체

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant