TW200840822A

TW200840822A - Anti-Robo4 antibodies and uses therefor

Info

Publication number: TW200840822A
Application number: TW097104860A
Authority: TW
Inventors: Jr Franklin V Peale; Ryan J Watts; Alexander W Koch; Yan Wu; Scott Stawicki; Richard Carano
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2008-02-12
Publication date: 2008-10-16
Also published as: CA2676766A1; US20080247951A1; IL200012A0; BRPI0806403A2; CN101652389A; EP2468776A3; CR11017A; US20110059112A1; KR20090114443A; WO2008100805A3; CL2008000420A1; US20110059013A1; WO2008100805A2; NZ578701A; ECSP099619A; PE20081760A1; AU2008216495A1; MA31231B1; AR065271A1; EP2468776A2

Description

200840822 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明大體係關於血管生成及内皮細胞增殖及遷移之領域。更特定言之，本發明係關於R〇bo4之調節劑及該等調節劑之用途。本申請案主張2007年2月9曰申請之美國臨時專利申請案第60/889,214號及2007年2月23日申請之美國臨時專利申請案第60/891,475號之權利，為了所有目的，該等案揭示之全文以引用的方式併入本文中。【先前技術】

Roundabout家族受體為分子導向分子，其調節軸突導向、神經元遷移及白細胞趨化性以回應與Slit蛋白之相互作用（Suchting 等人，/· 19:121-123 (2005))。

Roundabout受體分子在其胞外區中含有5個免疫球蛋白及3 個纖維結合蛋白域。Magic Roimdabout(亦即，Robo4或内皮細胞特異性分子4(ESCSM4))在結構上不同於其他 Roundabout家族成員。人類Magic Roundabout(Robo4)包含兩個免疫球蛋白及主要組織相容性複合體域（胺基酸46-11 6 及151-209)、兩個III型纖維結合蛋白域（胺基酸252-335及 347-432)、跨膜區（468-490)及富含脯胺酸區（胺基酸715-772)(參見 Huminiecki 等人，GeTzomia 79(4):547-552 (2002) 及其中圖1)。小鼠及人類Robo4顯示75%核苷酸序列一致性（Huminiecki 等人，見上（2002))。

Robo4表現之分析表明R〇bo4表現受到高度限制，其在 128838.doc 200840822 胎盤及腫瘤（包括腦、膀胱及結腸至肝之轉移）中強烈表現，其中腫瘤表現限於腫瘤維管結構（Huminiecki等人，見上（2002))。此外，雖然Robo4表現與有效血管生成之位點有關，但在神經元組織中未伯測到（Huminiecki，L等人，見上（2002))。作為具有胞外域之膜相關受體，R〇bo4為可用於遞送細胞毒性治療劑以抑制血管生成期間血管内皮細胞增殖之標靶。Robo4亦為可用於遞送可偵測之標記物至增殖血管内皮細胞之標靶。亦已報導靶向Robo4(亦稱為ECSM4)之抗體接合物作為潛在治療化合物（其中該接合物包含細胞毒素）以及作為潛在診斷標記物（其中該接合物包含可偵測之標記）（例如參見WO 2002036771)。抗體-藥物接合物用於局部遞送細胞毒性劑或細胞生長抑制劑（亦即，在癌症治療中殺死或抑制腫瘤細胞之藥物）之用途（Syrigos 及 Epenetos，Anticancer Res. 19:605-614 (1999) ; Niculescu-Duvaz及 Springer，Adv. Drg Del· Rev. 26:151-172 (1997);美國專利第4,975,278號）使得藥物部分革巴向遞送至腫瘤且藥物在細胞内積聚。

已研製或正在研製大量靶向其他分子之抗體-藥物接合物。舉例而言，ZEVALIN®(替坦異貝莫單抗（ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)為抗體-放射性同位素接合物，其由抗在正常及惡性B淋巴細胞之表面上發現之CD20抗原的鼠科IgGlK單株抗體及與硫脲連接子-螯合劑結合之ιηΙη或 90Y放射性同位素組成（Wiseman等人，Jour. NucL 128838.doc 200840822

Med, 27(7):766-77 (2000) ; Wiseman 等人，Blood 99(12):4336-42 (2002) ; Witzig 等人，J. C/k. Omo/· 20(10):2453-63 (2002) ; Witzig 等人，C/h. Onco/. 20(15):3262-69 (2002))。雖然ZEVALIN具有抵抗 B細胞非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin’s Lymphoma，NHL)之活性，但投藥導致大部分患者罹患嚴重及長期之細胞減少症。由與刺抱黴素（calicheamicin)連接之huCD33抗體組成的MYLOTARG™ (吉妥珠單抗奥唑米星（gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)在2000年批准用於藉由注射治療急性骨體白jk病（Drugs of the Future (2000) 25(7):686 ;美國專利第 4,970，198號、第 5,079,233 號、第 5,585,089 號、第 5,606,040 號、第 5,693,762 號、第 5,739，116號、第 5,767,285號、第 5,773,001 號）。由經由二硫連接子SPP與類美登素（maytansinoid)藥物部分DM1連接之huC242抗體組成的卡土珠單抗莫它恩星（Cantuzumab mertansine，Immunogen，Inc.)正處於研製之中以用於治療表現CanAg抗原之癌症，諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌及其他癌症。由與類美登素藥物部分DM1連接之抗前列腺特異性膜抗原（PSMA)單株抗體組成的MLN-2704(Milleimium Pharm·，BZL Biologies，Immunogen Inc·)正處於研製之中以潛在用於治療前列腺腫瘤。相同之類美登素藥物部分DM1 經由非二硫不可分裂連接子SMCC與小鼠鼠科單株抗體 ΤΑ·1 連接（Chari 等人，C ㈣义 52:127-131 (1992))。據報導此接合物比相應二硫連接子接合物效力低200倍。 128838.doc 200840822 阿瑞他汀（auristatin)肽、阿瑞他汀E(AE)及單甲基阿瑞他汀（MMAE)(海兔毒素（dolastatin)之合成類似物）已與以下各物接合：(i)cBR96，對癌瘤上之Lewis Y具特異性之嵌合單株抗體；（ii)cAClO，其對血液學惡性腫瘤上之CD30具特異性（Klussman等人，C/zembirj 15(4):765-773 (2004) ； Doronina^ A 5 Nature Biotech. 21(7):778-784 (2003) ; Francisco等人，5/ood 102(4):1458-1465 (2003); 美國專利公開案第2004/001 8 194號）；（iii)用於治療表現 CD20之癌症及免疫病症之抗CD20抗體，諸如Rituxan®(利妥昔單抗，rituximab)(WO 04/032828) ; (iv)用於治療結腸直腸癌之抗EphB2抗體2H9及抗IL-8(Mao等人，C⑽cer Res. 64(3):781-788 (2004)) ; (v)E-選擇素抗體（Bhaskar 等人，Cancer 63:6387-6394 (2003));及（vi)其他抗 CD3 0抗體（WO 03/043 5 83)。單曱基阿瑞他汀（MMAE)亦已與抗EphB2R之抗體2H9接合，EphB2R為在小鼠與人類之間具有相近同源性的類型1 TM酪胺酸激酶受體，且在結腸直腸癌細胞中過度表現（Mao等人，Ccmcer 64:781-788 (2004) ) 〇據報導在C末端具有苯丙胺酸之阿瑞他汀Ε(ΜΜΑΕ)之變異體單曱基阿瑞他汀MMAF(美國專利第5,767,237號及第 6，124,431號）比ΜΜΑΕ效力低，但在與單株抗體接合時比 ΜΜΑΕ效力高（Senter 等人，Proceedings of the American Association for Cancer Research,第 45 卷，文摘號 623, 2004年3月28日提出）。ΜΜΑΕ之苯丙胺酸變異體阿瑞他汀 128838.doc 200840822 F苯二胺（AFP)經由1F6之C末端經由苯二胺間隔基與抗 CD70 mAb 1F6 連接（Law等人，proceedings 〇fthe 咖 Association for Cancer Research，第 45卷，文摘號625 2004年3月28日提出）。 ’ 此項技術中對治療與血管生成（包括（例如）與癌症有關之視内皮來源之維管結構之生長及增殖而定的異常血管生成）相關之疾病及病症的其他藥物存在需要。此項技術中亦對其他輕向内皮細胞之抗Rob〇4抗體-藥物接合物存在需要，該等接合物用於偵測及目測（例如）由血管過度增生所支持或引起之癌症或眼部病症中以及其中監測血管生長可用於瞭解或治療生理狀態之病症或其他生理狀態中的血管生長及增生。本發明滿足此等及其他需要。【發明内容】本發明提供與Robo4(包括（例如）靈長類動物及/或齧齒動物之Robo4，諸如人類及/或小鼠之尺〇1)〇4))特異性結合之抗體及使用該等抗體之診斷及治療方法。在一些實施例中’抗體為人化抗體或人類抗體。在一些實施例中，抗體係選自由完整抗體、抗體變異體及抗體衍生物、Fab、 Fab’、（Fab，）2及Fv組成之群。在一實施例中，本發明提供種對人類R〇bo4及視情況對鼠科R〇b〇4具有親和力及特異性之抗Robo4抗體’該抗體包含如圖ία、IB、2A及2B 中所繪示之輕鏈及重鏈可變域序列之高變區（HVR)(SEq m NO: 1-8、17-71)、由其組成或基本上由其組成。在另一實施例中，本發明提供一種對人類R〇b〇4及視情況對鼠科 128838.doc -10- 200840822

Robo4具有親和力及特異性之抗R〇bo4抗體，該抗體包含如圖1A、IB、2A、2B、3A、3B、4A及4B中所繪示之輕鏈及重鏈可變域序列之構架區（FR)(SEQ ID NO:9-16、SEQ ID NO:12(其中V經Μ置換）及SEQ ID NO:99-139)、由其組成或基本上由其組成。在另一實施例中，本發明提供一種對人類Robo4及視情況對鼠科Robo4具有親和力及特異性之抗Robo4抗體，該抗體包含如圖1A及1B(SEQ ID NO:72-97)及圖2A及2B(SEQ ID NO:140-165)中所繪示之輕鏈及重 • 鏈可變域序列、由其組成或基本上由其組成。在一實施例中，本發明提供一種抗Robo4抗體，其包含：至少一、二、三、四、五或六個選自由下列各物組成之群之高變區（HVR)序列： (i) 包含序歹丨J A1-A11之HVR-L1，其中A1-A11為 RASQDVSTAVA(SEQ ID ΝΟ:1) (ii) 包含序列B1-B7之HVR-L2，其中B1-B7為 • SASFLYS(SEQ ID NO:2) (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3，其中C1-C9為 QQSYTTPPT(SEQ ID NO:3) (iv) 包含序歹J D1-D10之HVR-H1，其中D1-D10為 GFTINGYYIH(SEQ ID NO:17) (v) 包含序列E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為 GFIYPAGGDTDYADSVKG(SEQ ID NO: 18)； (vi) 包含序列FIF17之HVR-H3，其中F1-F17為 ARLIGNKFGWSSYGMDY(SEQ ID NO:19);及 128838.doc -11- 200840822 (vii) 至少一個變異HVR，其中該變異HVR包含SEQ ID NO: 1、2、3、17、1 8或19中所繪示序列之至少一個胺基酸殘基的插入、缺失或取代。在另一實施例中，本發明提供一種抗Robo4抗體，其包含：至少一、二、三、四、五或六個選自由下列各物組成之群之高變區（HVR)序列： (i) 包含序歹ij A1-A11之HVR-L1，其中A1-A11為 RASQDVSTAVA(SEQ ID ΝΟ:1) (ii) 包含序列B1-B7之HVR-L2，其中B1-B7為 SASFLYS(SEQ ID NO:2) (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中C1-C9為 QQSYTTPPT(SEQ ID NO:3) (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1，其中D1-D10為 GFTISGSW1H(SEQ ID NO:4) (v) 包含序歹U E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為 AVITPAGGYTYYADSVKG(SEQ ID NO:5);及 (vi) 包含序列F1-F16之HVR-H3，其中F1-F16為 SNRYSGQFVPAYAMDY(SEQ ID NO:6)。在一實施例中，本發明之抗體之HVR-L1包含序列SEQ ID ΝΟ:1。在一實施例中，本發明之抗體之HVR-L2包含序列SEQ ID NO:2。在一實施例中，本發明之抗體之HVR-L3 包含序列SEQ ID NO:3。在一實施例中，本發明之抗體之 HVR-H1包含序列SEQ ID NO:4。在一實施例中，本發明之抗體之HVR-H2包含序列SEQ ID NO:5。在一實施例中，本 128838.doc -12- 200840822 發明之抗體之HVR-H3包含序列SEQ ID NO:6。在一實施例中，HVR-L1 包含 RASQSISSYLA(SEQ ID NO:7)或 RASQDGARSLA(SEQ ID NO:39)或 RASQDGAIYLA(SEQ ID NO:40)。在一實施例中，HVR-L2 包含 GASSRAS(SEQ ID NO:8)或 SASFLAS(SEQ ID NO:41)或 SASLES(SEQ ID NO:42)或 SATLAS(SEQ ID NO:43)或 SASFLAS(SEQ ID NO:44)或 SASNLAS(SEQ ID NO:45)或 SASTLAS(SEQ ID NO:46)。在一實施例中，包含此等序列（如本文所述組合）之本發明之抗體為人化抗體或人類抗體。在一態樣中，本發明提供一種包含一、二、三、四、五或六個HVR之抗體，其中各HVR包含選自由下列各物組成之群之序列、由其組成或基本上由其組成：SEQ ID ΝΟ:1、2、3、4、5、6、7及8，且其中 SEQ ID NO]或 7對應於 HVR-L1，SEQ ID N0.2 或 8 對應於 HVR-L2，SEQ ID NO:3 對應於 HVR-L3，SEQ ID NO:4對應於 HVR-H1，SEQ ID NO:5 對應於 HVR-H2，且 SEQ ID NO:6對應於 HVR-H3。在一實施例中，本發明之抗體包含：包含SEQ ID NO:7之 HVR-L1，包含 SEQ ID NO:2 之 HVR-L2，包含 SEQ ID NO:3 之 HVR-L3，包含SEQ ID NO:4 之 HVR-H1，包含SEQ ID NO:5之 HVR-H2及包含 SEQ ID NO:6之 HVR-H3。在另一實施例中，本發明之抗體包含：包含SEQ ID NO: 1之HVR-LI，包含 SEQ ID NO:8之 HVR-L2，包含 SEQ ID NO:3 之 HVR-L3，包含 SEQ ID NO:4 之 HVR-H1，包含 SEQ ID NO:5之HVR-H2及包含 SEQ ID NO:6之HVR-H3。在一實施 128838.doc -13- 200840822 例中’本發明之抗體包含：包含8£(^10>10:1之11¥11-11，包含 SEQ ID NO:2 之 HVR-L2，包含 SEQ ID NO:3 之 HVR-L3，包含 SEQ ID NO:4 之 HVR-H1，包含 SEQ ID NO:5 之 HVR-H2及包含SEQ ID NO:6之HVR-H3。在另一實施例中，本發明之抗體包含：包含SEQ ID ΝΟ:1之HVR-L1，包含 SEQ ID NO:2 之 HVR-L2，包含 SEQ ID NO:20 之 HVR· L3，包含 SEQ ID ΝΟ··17 之 HVR-H1，包含 SEQ ID NO:18 之 HVR-H2 及包含 SEQ ID NO:19 之 HVR-H3。本發明之抗體中變異HVR可在HVR内具有一或多個殘基修飾。在一實施例中，HVR-L1變異體包含其中A1-11在以下位置之任何組合中包含1-6個（1、2、3、4、5或6個）取代之 SEQ ID NO:l : A5(S)、A6(I 或 G)、A7(A)、A8(S、R或 I)、A9(Y或S)及A10(L)。在一實施例中，HVR-L2變異體包含其中B1-7在以下位置之任何組合中包含1-4個（1、2、 3、4、5 或 6 個）取代的 SEQ ID NO:2 : B1(G)、B3(T)、 B4(S、L、N 或 T)、B5(R、E 或 A)、B6(A或 S)及 B7(Y)。在一實施例中，HVR-L3變異體包含其中Cl-9在以下位置之任何組合中包含1-6個（1、2、3、4、5或6個）取代的SEQ ID ΝΟ··3 : C3(Y、P、T、F 或 G)、C4(W、F、R 或 N)、 C5(S、N、A、D、F、Η、V 或 G)、C6(Y、S、A、D、N、 L、I、Μ、Y 或 G)、C7(L、H 或 T)及 C8(L、F、A、M 或 S)。在一實施例中，HVR-H1變異體包含其中Dl-io在以下位置之任何組合中包含1 -9個（1、2、3、4、5、6、7、8或9 個）取代的 SEQ ID NO:4 : D2(Y)、D3(S)、D4(F 或 L)、 128838.doc -14- 200840822 D5(N、Τ、Υ、D 或 Κ)、D6(N 或 S)、D7(Y、N 或 R)、D8(Y 或A)、D9(M、F、L或N)及Dl〇(S、E或Q)。在一實施例中，HVR-H2變異體包含其中El-18在以下位置之任何組合中包含1-10個（1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個）取代的 SEQ ID NO:5 : E1(G或 S)、E2(F、G、I、T或 R)、E4(Y或 S)、E5(G 或 S)、E6(T、Y 或 Μ)、E7(D 或 L)、E8(S)、 E9(D、S、Τ、Η、Κ、A 或 V)、E10(I)及 E11(D、N、A、E 或I)。在一實施例中，HVR-H3變異體包含其中FI-18在以下位置之任何組合中包含1 -17個（1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16 或 17 個）取代的 SEQ ID NO:6 : F2(S)、F3(L、G、D、Μ或 W)、F4(I、G ' V 或 S)、F5(G、Y 或 N)、F6(N、S 或 V)、F7(K、Y、W 或 Μ)、 F8(F、S、P或缺失）、F9(G、A、S、Y或缺失）、F10(W、 R、P、E、G或缺失）、F11(S、W、G、H或缺失）、F12 (S、W、H或缺失）、F13(Y、D、G、V或缺失）、F14(G或缺失）、F15(V 或缺失）、F16(L 或 F)、F17(a)及 F18(V)。繼各位置之後的括號中之字母指示說明性取代（亦即，置換）胺基酸或指示胺基酸缺失。在一實施例中，HVR-L1包含序列 SEQ ID NChl ; HVR-L2 包含 SEQ ID NO:2 ; HVR-L3 包含其中C4、C5、C6及C6分別為R、S、D及Η之SEQ ID NO:3 ; HVR-H1 包含 SEQ ID NO:17 ; HVR-H2 包含 SEQ ID NO:18 ;且 HVR-H3 包含 SEQ ID NO:19 或 HVR-H3 變異體包含SEQ ID NO: 19。在此等抗體之一實施例中，此等抗體進一步包含人類κΐ輕鏈構架一致序列。在一實施例中，輕鏈 128838.doc -15- 200840822 之構架區4(LC-FR4)中位置104(Kabat編號)為V。在一實施例中，LC-FR4之位置104為Μ。

在一實施例中，本發明之抗體包含變異HVR-H1 SEQ ID NO:4，編號為D1-D10，其中1至6個取代係選自以下各取代：D2(Y)、D3(S)、D4(F 或 L)、D5(S、T、Y、D 或 K)、 D6(N 或 S)、D7(S、N 或 R)、D8(W 或 A)、D9(M、F、L 或 N) 及D10(S、E或Q)。在一實施例中，本發明之抗體包含：包含 SEQ ID NO:24、25、26、27 或 28之變異 HVR-H1。在一實施例中，本發明之抗體包含變異HVR-H2 SEQ ID NOJ，編號為E1-E18，其中1至7個取代係選自以下各取代：E1(A 或 S)、E2(V、G、I、T 或 R)、E4(T 或 S)、E5(G 或 S)、E6(T、Y或 M)、E7(D 或 L)、E8(S)、E9(Y、S、T、Η、 K、A或V)、E10(I)及E11(Y、N、A、E或I)。在一實施例中，本發明之抗體包含：包含SEQ ID ΝΟ:29、30、31、32 或33之變異HVR-H2。在一實施例中，本發明之抗體包含：包含SEQ ID ΝΟ:6之變異HVR-H3，編號為F1-F16，其中1 -1 5個取代係選自以下各取代·· F 1 (S、G、D、Μ或W)、 F2(N、G、V 或 S)、F3(R、Υ 或 Ν)、F4(Y、S 或 V)、F5(S、 Y、W 或 Μ)、F6(G、S、P或缺失）、F7(Q、A、S、Y或缺失）、F8(F、R、P、E、G或缺失）、F9(V、W、G、Η或缺失）、F10(P、W、H或缺失）、F11(A、D、G、V或缺失）、 F12(Y或缺失）、F13(A或 V)、F14(L 或 F)及 F15(V)。根據本發明，胺基酸取代可涵蓋給定序列中之胺基酸缺失。在本發明之一實施例中，本發明之抗體包含：包含SEQ ID 128838.doc -16- 200840822 ^0:34、35、36、37或3 8之變異11¥^13。在此等抗體之一實施例中，構架一致序列包含位置71、73及/或78上之取代。在此等抗體之一些實施例中，位置7丨為A , 73為T及/ 或78為A。在此等抗體之一實施例中，此等抗體進一步包含人類亞群III重鏈構架一致序列。在一悲樣中，本發明提供一種抗R〇b〇4抗體，其包含一、二、三、四、五、六個或六個以上圖卜2、3&(seq IDNO:l-8、17-71)中所繪示之HVR序列。

在一實施例中，本發明提供一種人化抗Robo4抗體。本卷月之人化抗Robo4抗體可在其重鏈及/或輕鏈可變域中包含一或多個人類及/或人類一致非高變區（例如，構架）序列°在-些實施例中’—或多個其他修飾存在於人類及/ 或人類-致非高變區序列内。在一實施例中，本發明之抗體之重鏈可變域包含人類—致構架序列，其在—實施例中為亞群III 一致構架序列。在_每 J在Θ知例中，本發明之抗體包含在至少一個胺基酸位置上破像直上、、、工修飾之變異亞群III一致構架序列。舉例而言，在一實施例中 J中變異亞群III一致構架序列可包含在位置71、73及/或 A ^ 5〒之一或多個位置上之取代。在一實施例中，該取代代為u任何組合之R71A、N73丁及/或N78A及/或L/78A。在一眘#加a 馬知例中，本發明之抗體輕鏈可變域包含人類一致構架淼Η 祕操力t 其在一實施例中為亞群κΐ 一致構架序列。在一實斗、夕h T 車里鏈一致構架序列在一或多個位置上經修飾。在一位詈104 s 士、也例中’輕鏈一致序列在位置104上具有胺基酸V。在一每只也例中，輕鏈一致序列在 128838.doc -17· 200840822 根據Kabat編號系統之位置104上經修飾，其中位置104為 Μ。在一態樣中’本發明提供一種包含輕鍵FR序列LC-FR1 (SEQ ID NO:9)、LC-FR2(SEQ ID NO:10)、LC-FR3(SEQ ID NO:ll)及 LC-FR4(SEQ ID NO:12)中 1至 4個序列或全部序列之抗體。在一實施例中，1^邛114(31(5 10!^0:12)為其中位置104為Μ之變異體。在一態樣中，本發明提供一種包含重鏈FR序列HC-FR1 (SEQ ID NO:13)、HC-FR2(SEQ ID NO:14)、HC-FR3(SEQ ID NO:15)及 HC-FR4(SEQ ID NO:16)中 1至4個序列或全部序列之抗體。在一實施例中，本發明提供一種用於宿主個體中之治療劑，該治療劑在該個體體内幾乎不引起抗此治療劑之免疫原性反應。舉例而言，在一實施例中，本發明提供一種人化抗體，與經培養抗人類R〇bo4之鼠科抗體相比’該人化抗體在宿主個體體内以實質上減少之程度引起及/或期望引起人類抗小鼠抗體反應（HAMA)。在另一實例中，本發明提供一種引起及/或期望引起最低或無人類抗小鼠抗體反應（HAMA)的人化抗體。在一實例中，本發明之抗體以臨床可接受之程度或低於臨床可接受之程度引起抗小鼠抗體反應。本發明亦提供在如下文所述之雜化高變位置上包含修飾之抗體。在^一實施例中’本發明之抗體包含在一或多個雜化高變位置上經修飾之變異人類亞群一致構架序列。在一 128838.doc -18- 200840822 實施例中，本發明之抗體包含：包含在位置26_35、 65、95-102及94中之一或多個位置上經修飾之變異人類亞群III致構架序列的重鏈可變域。在一實施例中，本發明之抗體包含：包含在位置24-34、50_56及39-97中之一戋多個位置上經修飾之變異人類κ亞群〗一致構架序列的輕鏈可變域。在一實施例中，本發明之抗體包含人類κ輕鏈之構架序列之至少一部分（或全部）。在一實施例中，本發明之抗體鲁包含人類κ亞群I構架一致序列之至少一部分（或全部）。在一實施例中，本發明之抗體包含圖3 Α及3Β中所示之構架序列。本兔明之抗體可包含任何合適之人類或人類一致重鏈構架序列’其限制條件為抗體展示所需生物學特徵（例如，所需結合親和力）。在一實施例中，本發明之抗體包含人類亞群III重鏈之構架序列之至少一部分（或全部）。在一實施例中，本發明之抗體包含圖4 A及4B中所示之構架序列。在一實施例中，本發明之抗體包含：包含SEQ ID NO:72-137(圖 1A、IB、2A、2B、3A、3B、4A及 4B)中所繪示之構架序列的重鏈及/或輕鏈可變域。在一態樣中，本發明之抗體為一種結合人類Robo4血管内皮細胞標記物之人化抗R〇bo4抗體。舉例而言，在一實施例中，本發明之抗體以小於1〇〇〇 nM、小於500 nM、小於200 nM、小於1〇〇 nM、小於50 nM、小於30 nM、小於 128838.doc -19- 200840822 20 nM、小於1〇11]\4、小於 5 nM、小於 3 nM、小於 1 nM、小於0·1 nM或小於0·01 nM之IC50值結合人類Robo4。抑制配位體與其受體結合之能力的比較可根據此項技術中已知之各種方法（包括如以下實例中所述之方法）來執行。在一態樣中，本發明之抗體為一種與細胞毒素部分接合之抗Robo4抗體（抗11〇13〇4抗體藥物接合物，亦稱為抗 Robo4 ADC)，其中抗Robo4 ADC在表現Robo4之細胞中抑制Rob〇4依賴性細胞增殖。表現Rob〇4之細胞包括（但不限於）内皮細胞，諸如血管内皮細胞。例示性抗Rob〇4 ADC揭示於本文中。在一實施例中，抗R〇bo4抗體為人化抗體。在一實施例中，抗R〇bo4抗體為人類抗體。在一實施例中，抗Robo4抗體來源於噬菌體呈現突變誘發及選擇。在一態樣中，本發明之抗體為一種比未與細胞毒性劑接合之參考抗R〇bo4抗體更佳地抑制Robo4依賴性細胞增殖的抗Robo4抗體ADC。舉例而言，在一實施例中，本發明之抗Robo4 ADC抗體以小於未與細胞毒性劑接合之參考抗 Robo4抗體之IC50值約一半的IC50值抑制細胞增殖。在一實施例中，本發明之ADC抗體之IC50值為非ADC參考抗體之 IC50值的約 0.001、0·01、0.1、0.2、0.3 或 0.4。抑制細胞增殖之能力的比較可根據此項技術中已知之各種方法 (包括如以下實例中所述之方法）來執行。在一實施例中，在約0.01 nM至約100 nM之抗體濃度範圍上測定IC50值。在一實施例中，人化抗體及嵌合抗體均為單價。在一實施例中，人化抗體及嵌合抗體均包含與Fc區連接之單一 128838.doc -20- 200840822

Fab區。在一實施例中，參考嵌合抗體包含與人類Fc區連接之圖7中所繪示之可變域序列（SEQ ID NO: 9及10)。在一實施例中，人類Fc區為IgG之|^區（例如，IgG1、2、3或 4) 〇在一態樣中，本發明之抗體包含Fc區。在一實施例中， Fc區為IgGl、2、3或4。在一實施例中，igG為天然IgG。在一貫施例中，Fc區展示相對於天然igGl、2、3或4之野生型抗體依賴性細胞毒性（ADCC)活性增強之ADCC。在一籲實施例中，1gG為自天然IgG改變之Fc區，使得經改變之fc 區展示相對於天然Fc區增強之ADCC活性。在一態樣中，本發明之抗體為一種與諸如顯像劑之可偵測部分接合的抗R〇b〇4抗體。在一態樣中，本發明之抗體可與任何標記部分接合，該標記部分可經由反應性部分、活化部分或反應性半胱胺酸硫醇基與抗體共價連接（Singh 等人，J㈣/·万沁〜㈣.304:147-15(2002) ; Harlow E.及 • Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ； Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification,第 2版，CRC Press，Boca Raton，FL)。所連接標記可用以：⑴提供可偵測信號；（ii)與第二標記相互作用以修改由第一或第二標記提供之可偵測信號，例如發出FRET(螢光共振能量傳遞）；（iii)穩定與抗原或配位體之相互作用或增強與其之結合親和力；（iv)藉由電荷、疏水性、形狀或其他物理參數影響移動性，例如電泳移動性或 128838.doc -21- 200840822 細胞滲透性；或（V)提供捕捉部分以調節配位體親和力、抗體/抗原結合或離子錯合作用。本發明之標記抗體進一步揭示於本文中。

在一實施例中，可偵測標記為在活體外或活體内可偵測之水性不溶顆粒。在一實施例中，顆粒為磁性或金屬顆粒。金屬顆粒可藉由諸如磁共振成像（MRI)、單個顆粒或單個分子追蹤、免疫細胞化學、暗場照明下之電漿子頻率 (plasmon frequency with dark-field illumination)、微分干涉差（differential interference contrast)及影像增強、全内反射及光熱干涉差（Pic)技術之方法偵測（例如參見 USA 100(20):1 1350-1 1355 (2003) ; Sheetz 等人， 340:284-288 (1989) ; Baschong 等人， 83:409-411 (1985) ； Slot^Geuze, Eur. J. Cell Biol. 38:87-93 (1935) ; Frey 及 Frey，乂 Sirwci· Βζ·ο/· 127:94-100 (1999) ; Hainfeld 及 Powell，J. Cytochem· 48:471-480 (2000)； Schultz# A 5 PNAS USA 97:996-1001 (2000) ; Gelles 等人，331:450-453 (1988);

Sonnichsen^ A j AppL Phys. Lett. 77:2949-2951 (2000)； Boyer等人，Science 297:1160-1163 (2002))。本發明之奈米顆粒劑亦可包括（但不限於）微泡（參見Ellegala等人， Circulation 108:336-341 (2003)，亦稱為聲學活性脂質球 (AAL)(參見 Tartis等人，Med· 32(11):1771- 80 (2006)))、超順磁性劑、脂質體、全氟化碳奈米顆粒乳液（W〇 2005104051)及樹枝狀聚合物（參見Caruthers等人， 128838.doc -22- 200840822

Methods in Molecular Medicine, 124:387-400 (2006)^^» ή1 引用之參考文獻，所有彼等參考文獻均以全文引用的方式併入本文中）。在一態樣中，本發明提供一種包含重鏈可變域之抗體，該重鏈可變域包含圖1Β及2Β中所繪示之HVR-H1、HVR-Η2及/或HVR-H3序列。在一實施例中，可變域包含圖1Β、 2Β、4Α及 4Β 中所繪示之 HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3 及 /或 HC-FR4序歹4。在一實施例中，抗體包含CH1及/或Fc序列。在一實施例中，本發明之抗體包含：包含圖1B、 2B、4A及 4B 中所繪示之 HVR-H1、HVR-H2 及 / 或 HVR-H3 序列及HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及/或HC-FR4序列的重鏈可變域。在一實施例中，本發明之抗體包含：包含圖 IB、2B、4A及 4B 中所繪示之 HVR1-HC、HVR2-HC及 / 或 HVR3-HC序列的重鏈可變域及CH1及/或Fc序列。在一態樣中，本發明提供一種包含輕鏈可變域之抗體’ 該輕鏈可變域包含圖1A或2A中所繪示之HVR1-LC、 HVR2-LC及/或HVR3-LC序歹》J。在一實施例中，可變域包含圖3A及3B中所繪示之FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC及/或 FR4-LC序列。在一實施例中，本發明之抗體包含如之前兩段中所述之輕鏈及重鏈可變域。在一實施例中，抗體為單價且包含Fc 區。在一實施例中，F c區包含至少一個隆凸（隆突）及至少一個空腔（孔穴），其中隆凸及空腔之存在增強在包含隆凸之Fc多肽與包含空腔之Fc多肽之間形成複合物，（例如）如 128838.doc -23· 200840822 WO 2005/063816中所述。在一實施例中，本發明之抗體之 Fc區包含弟一及弟一 fc多肽，其中第一及第二多肽各自包含一或多個關於野生型人類Fc之突變。在一實施例中，空腔犬變為T366S、L368A及/或Y407V。在一實施例中，隆凸突變為T366W。在一實施例中，第一多肽包含圖13中所繪示之Fc序列且第二多肽包含圖14中所繪示之Fc序列。在一實施例中’本發明提供藉由將抗R〇b〇4抗體投與個體（例如，哺乳動物個體，諸如人類）來調節R〇b〇4相關作 ^ 用（例如，R〇b〇4活化、下游分子信號轉導（例如，有絲分裂原/舌化蛋白激酶（MAPK)麟酸化）、細胞增殖、細胞遷移、細胞存活、細胞形態形成及血管生成）中之一或多個方面的方法。在一些實施例中，例如藉由與R〇b〇4胞外域内之序列結合且藉此抑制該結合域與其結合搭配物（諸如，配位體分子）之相互作用，抗R〇b〇4抗體破壞配位體與 Robo4之結合。在其他實施例中，R〇b〇4抗體與不在 _ 配位體結合位點内之序列結合，其中該結合導致與其結合搭配物相互作用之能力受到破壞。在本發明之一實施例中，抗體與R〇b〇4之結合抑制 Robo4相關之内皮細胞增殖。在本發明之尺〇1>〇4抗體之另一實施例中，細胞中抗體與R〇b〇4之結合抑制細胞之增殖、存活、分散、形態形成及/或活動性。在另一實施例中，細胞為内皮細胞，諸如（但不限於）血管内皮細胞。在一實施例中’本發明之R〇b〇4抗體與圖5中所示之 R〇b〇4之至少一部分（SEQ m N〇: 138)或其變異體特異性結 128838.doc -24- 200840822 合。在一實施例中，本發明之抗體在缺乏前導序列（亦即，缺乏圖5中虛下劃線所指示之區域）之全長R〇b〇4胺基酉文序列内特異性結合。在一實施例中，本發明之抗體在圖 5中所示之胞外域序列（由圖5中實下劃線所指示）内特異性結合。在一實施例中，本發明之抗體與由Robo4胞外域之部分或全部所形成之構形抗原決定基特異性結合。在一實施例中’本發明之抗體與具有與圖5中所示序列（Seq id N0.138)至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%序列一致性或相似性的胺基酸序列特異性結合。在一實施例中’本發明之抗體與具有與缺乏前導序列（亦即，缺乏由圖5中虛下劃線所指示之區域）之R〇b〇4全長胺基酸序列之序列至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%序列一致性或相似性的胺基酸序列特異性結合。在一實施例中’本發明之抗體與具有與R〇b〇4胞外域之序列（由圖5中實下劃線所指示之區域）至少5〇%、6〇〇/。、7〇0/。、8〇0/。、 90%、95%、98%序列一致性或相似性的胺基酸序列特異性結合。在一實施例中，本發明之抗體與第一動物物種之R〇b〇4 特異性結合，且不與第二動物物種之R〇b〇4特異性結合。在一實施例中，第一動物物種為人類及/或靈長類動物（例如，食蟹猴（cynomolgus monkey》，且第二動物物種為鼠屬（例如’大鼠）、鼠科動物（例如，小鼠）及/或犬科動物。在一實施例中，第一動物物種為人類。在一實施例中，第一動物物種為靈長類動物，例如食蟹猴。在一實施例中， 128838.doc • 25 - 200840822 第二動物物種為鼠科動物，例如小鼠。在一實施例中，第二動物物種為犬科動物。在一實施例中，本發明之抗體與至少兩種物種之R〇bo4特異性結合。在一實施例中，第一動物物種為人類及/或靈長類動物（例如，食蟹猴），且第二動物物種為鼠科動物（例如，小鼠）。與一種以上物種結合之本發明之抗體在用於治療劑或診斷劑之動物模型化研究中獲得應用。

在恶樣中，本發明提供一種偵測哺乳動物企清中 R〇bo4之方法，其中血清中R〇b〇4濃度比正常R〇b〇4含量高表明哺乳動物中存在血管生成。根據本發明之方法，使可偵測或經標記可偵測之本發明之抗以〇1)〇4抗體與來自測試哺乳動物（包括（但不限於）人類）之血清樣品接觸。抗R〇b〇4 抗體直接經由可偵測標記偵測或間接藉由（例如）與經標記可偵測或可偵測之二次抗體接觸來偵測。測試哺乳動物中抗R〇b〇4之血清濃度（含量）比來自正常哺乳動物之抗R〇b〇4 血清濃度高表明測試哺乳動物中之血管生成。正常哺乳動物係指已知其未經歷血管生成之哺乳動物或未經歷血管生成之哺乳動物群體。在一實施例中，測試及正常哺乳動物或哺乳動物群體為相同物種，包括（但不限於）人類。已在患有晚期非小細胞肺癌之人類患者中偵測到R〇b〇4蛋白之血清含量（Gorn等人，Lung Cancer 49:71-76 (2005))。血、、主抗Robo4含量可用於診斷及預測與癌症有關之血管生成。' 在一態樣中，本發明提供包含一或多種本發明之抗體及載劑之組合物。在一實施例中，載劑為醫藥學: 128838.doc -26- 200840822 載劑。在悲樣中’本發明提供編碼本發明之R〇bo4抗體之核酸、包含核酸之載體及包含核酸及/或載體之宿主細胞（例如大腸桿菌（五.或中國倉鼠卵巢（CHO)細胞），包含本發明之核酸或載體之細胞。載體可為任何類型，例如重組載體’諸如表現載體。可使用多種宿主細胞中之任一者。在一實施例中，宿主細胞為原核細胞，例如大腸桿菌。在一貝施例中，宿主細胞為真核細胞，例如哺乳動物細胞， Φ 諸如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞。在一態樣中，本發明提供用於製造抗R〇b〇4之方法。舉例而言，本發明提供一種製造尺〇]3〇4抗體之方法，該方法包含在合適宿主細胞中表現編碼該抗體（或其片段）之本發明之重組載體及回收該抗體。在一態樣中，本發明提供一種包含容器及含於容器内之組合物的製造物件，其中該組合物包含一或多種本發明之鲁抗Rob〇4抗體。在一實施例中，組合物包含本發明之核酸。在一實施例中，包含抗體之組合物進一步包含載劑，在一些實施例中载劑為醫藥學上可接受之載劑。在一實施例中，本發明之製造物件進一步包含用於將組合物（例如’抗體）投與個體之說明。在一悲樣中，本發明提供一種套組，該套組包含：包含組合物之第一容器，該組合物包含一或多種本發明之1 R〇b〇4抗體；及包含緩衝劑之第二容器。在一實施例中^ 緩衝劑為醫藥學上可接受之緩衝劑。在一實施例中，包人 128838.doc -27- 200840822 抗體之組合物進一步包含載劑，在一些實施例中載劑為醫藥學上可接受之載劑。在一實施例中，套組進一步包含用於將組合物（例如，抗體）投與個體之說明。在一態樣中’本發明提供本發明之R〇b〇4抗體的用途，其係用於製備供治療及/或預防性治療諸如以下疾病之疾病用之藥劑：癌症、腫瘤、細胞增殖病症、免疫（諸如，自體免疫）病症及/或血管生成相關病症。在一態樣中，本發明提供本發明之核酸的用途，其係用於製備供治療及/或預防性治療諸如以下疾病之疾病用之藥劑：癌症、腫瘤、細胞增殖病症、免疫（諸如，自體免疫）病症及/或血管生成相關病症。在一態樣中’本發明提供本發明之表現載體的用途，其係用於製備供治療及/或預防性治療諸如以下疾病之疾病用之藥劑：癌症、腫瘤、細胞增殖病症、免疫（諸如，自體免疫）病症及/或血管生成相關病症。在一恶樣中’本發明提供本發明之宿主細胞的用途，其係用於製備供治療及/或預防性治療諸如以下疾病之疾病用之藥劑：癌症、腫瘤、細胞增殖病症、免疫病症（例如自體免疫病症，諸如類風濕性關節炎）及/或血管生成相關病症。在一態樣中，本發明提供本發明之製造物件的用途，其係用於製備供治療及/或預防性治療諸如以下疾病之疾病用之藥劑：癌症、腫瘤、細胞增殖病症、免疫病症（例如自體免疫病症，諸如類風濕性關節炎）及/或血管生成相關 128838.doc -28- 200840822 病症。在一態樣中’本發明提供本發明之套組的用途，其係用於製備供治療及/或預防性治療諸如以下疾病之疾病用之藥劑：癌症、腫瘤、細胞增殖病症、免疫（諸如，自體免疫）病症及/或血管生成相關病症。本發明提供可用於調節與R〇b〇4信號轉導軸之調節異常有關的疾病病況之方法及組合物。信號轉導路狎及多種生物及生理功能，包括（例如）細胞增殖及血管生成。因此，在一態樣中，本發明提供一種包含將本發明之抗體投與個體之方法。在一態樣中，本發明提供一種抑制R〇b〇4活化之細胞增殖之方法，該方法包含使細胞或組織與有效量之本發明之抗體接觸’藉此抑制與R〇b〇4活化有關之細胞增殖。在一悲樣中，本發明提供一種治療個體中與R〇b〇4活化之调節異常有關的病理病狀之方法，該方法包含將有效量之本發明之抗體投與該個體，藉此治療該病狀。在一態樣中，本發明提供一種抑制表現R〇b〇4t細胞生長之方法，該方法包含使該細胞與本發明之抗體或本發明之抗體藥物接合物接觸，藉此使得該細胞之生長受到抑制。在一態樣中，本發明提供一種治療患有包含表現化心〇4 ^細胞的癌性腫瘤之哺乳動物之方法，該方法包含將有效里之本發明之抗體或有效量之本發明之抗體藥物接合物投與該喝乳動物，藉此有效治療該哺乳動物。 128838.doc -29- 200840822 在一態樣中，本發明提供一種用於治療或預防與增加之 R〇b〇4表現或活性有關的細胞增殖病症之方法，該方法包含將有效篁之本發明之抗體或有效量之抗體藥物接合物投與需要該治療之個體，藉此有效治療或預防該細胞增殖病症。在一實施例中，該增殖病症為與異常或不需之内皮細胞增殖有關的病理病狀，諸如包括（但不限於）以下病症之病症中的異常或不需之血管細胞增殖··癌症、血管生成及與實體腫瘤及轉移有關之病症（例如，藉由經歷病症之組 # 織内内皮細胞增殖而擴大之病症）、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新生血管性疾病（諸如增生性視網膜病，例如糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼）、移植角膜、、且、我及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎及牛皮癬。在另恶樣中，本發明提供一種治療哺乳動物中腫瘤之 0 八中"亥腫瘤之生長係至少部分地視内皮細胞（包括 (但:限於）灰管内皮細胞）中表現之RGbG4之生長強化作用而定°亥方法包含使該細胞與有效量之本發明之抗體或有效量之本發明之抗體藥物接合物接觸，藉此抑制（例如）盥該腫瘤有關之企管生成中内皮細胞之生長且藉此有效治療該腫瘤。 μ 本發明之又另—實施例提供藉由使細胞或組織與有效量之本文所述之抗Robo4抗體接觸來調節血管生成之方法。在-些實施例中，抗體進一步包含細胞毒性劑。在一些實 I28838.doc -30- 200840822 施例中，血管生成得以抑制。 ._ A y |市j 在一些實施例中，血管生成得以增強。在一些實施例中，& # 斑&生成與選自以下病症之病症有關··癌症、動脈粥Μ涵仏 θ _ 为像硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼内靳注喂門新生血官性疾病、增生性視網膜病、糖尿病性視網膜症、# J胰病、年齡相關之黃斑變性 (AMD)、新生血管性青光眼、狡# & . y , 移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎、牛㈣及其心。在__ 些實施例中，血管生成與癌症有關。在一些實施例中，癌

法進一步包含使細胞與選自以下各劑之藥劑接觸：抗贅生性劑、化學治療劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑及其組合。在一些實施例中，藥劑為抗vegf抗體。在二只施例中，該方法進一步包含使細胞與選自以下各知]第—、第二或苐四藥劑接觸·抗贅生性劑、化學治療劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑及其組合。症係選自由以下癌症組成之群：包括骨肉瘤及a管肉瘤之肉瘤、鱗狀細胞癌、肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌之胃癌…胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌（liver _cer)、膀胱癌、泌尿道癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌（hepatic carcinoma)、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤及B細胞淋巴瘤、腦癌、頭頸癌及相關轉移及^ 組合。在一些實施例中，細胞或組織在哺乳動物體内。： -些實施例中’哺乳動物為人類。在_些實施例中，該方 128838.doc -31 - 200840822 第三或第四藥劑為抗VEGF抗

在本發明之方W關之細胞及/或組織。在—實施例中，結腸直腸癌、肺癌乾向广細胞為在腫瘤(包括(例如)乳癌、癌）、結腸癌、姨腺/ 癌（例如，甲狀腺之乳頭狀統癌、骨肉瘤、腎/ t桌癌、子宮頸癌、中樞神經系狀細胞癌、里辛二：、肝細胞癌、膀胱癌、胃㉟、頭頸鱗、 " 生成中内皮細胞增殖所支持的任何癌症)内增殖之内皮細胞或血管内皮細胞。在一實施例中，

在一些實施例中體。病里病狀係與異常或不需之内皮細胞增殖有關。在一些實知例中，本發明之抗_。4抗體或抗體藥物接合物之標乾包t ··包括（但不限於）以下病症之病症中的異常或不需之 …吕、、、田胞增殖·癌症（包括（例如）實體腫瘤及轉移）、動脈、弓樣硬化aa狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新生血管性疾病（諸如增生性視網膜病，例如糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼）、移植肖膜組織及其他組織之免疫排斥反應、類風難關節炎、牛皮癖及與血管生成有關之病症（包括（例如）藉由經歷病症之組織内内皮細胞增殖而擴大之病症）。本發明之方法可進一步包含其他治療步驟。舉例而言，在一實施例中，方法進一步包含其中將標靶細胞及/或組織（例如，癌細胞）曝露於放射治療或化學治療劑之步驟。 128838.doc •32- 200840822 在本發明之方法之一實施例中’標靶細胞(例如，腫瘤 Λ或視為膜之内皮細胞)為其中如與相同組織來源之正常組織中内皮細胞相比Robo4表現增加之細胞。在一實施例中，本發明之方法引起標乾細胞死亡。舉例而言，與本發月之抗Robo4抗體接觸（包括與本發明之抗體藥物接合物接觸）導致細胞毒素部分吸收，藉此引起細胞死亡。或者，與接合細胞毒性化合物之本發明之抗尺吡以抗體接觸可導致細胞毒性化合物内在化，藉此導致細胞死亡。在另一替代性實施例中，諸如藉由有關技術中熟知之成像技術，與接合可偵測部分之本發明之抗R〇b〇4抗體接觸使（例如）組織（例如，腫瘤組織或視網膜）之維管結構之内皮細胞被4貞測。本發明之另一實施例提供藉由將本文所述之抗R〇b〇4抗體投與鳴乳動物而在活體内成像之方法。在一些實施例中’哺乳動物為人類。在一些實施例中，哺乳動物疑似患有選自以下疾病或病症之疾病或病症：癌症、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新生血管性疾病、增生性視網膜病、糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎、牛皮癬及其組合0 本發明之另一實施例提供藉由使細胞與本文所述之抗 R〇bo4抗體接觸來偵測表現R〇b〇4之細胞的方法。在一些實施例中’細胞為血管内皮細胞。在一些實施例中，細胞 128838.doc -33- 200840822

在哺乳動物體内。在一此眚力& A 二η苑例中，哺乳動物疑似患有自以下疾病或病症之疾病澎· 、届次病症·癌症、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管 _ g屑忮性炎症、眼内新生血管性疾病、增生性視網膜病、联媽糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青 $注月光眼、移植角膜組織

之免疫排斥反應、類風濕性關節炎、牛皮癖及其組合。在 -些實施例中，哺乳動物疑似患㈣自以下癌症m 鱗狀細胞癌、肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌之胃癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、印巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤及B細胞淋巴瘤、腦癌、頭頸癌及相關轉移及其組合。【實施方式】 I.引言本發明提供結合Rob〇4或其部分之組合物、包含該等組合物之套組及製造物件及使用該等組合物之方法，包括 (例如）用於調節配位體與R〇bo4受體結合之方法及用於調節與配位體與R〇bo4受體結合有關之生物/生理活性的方法。本發明係部分基於多種結合R〇bo4受體（可用作治療及診斷（例如，活體内、活體外或離體成像）標乾之受體）之抗 Robo4抗體之確認。本發明之抗R〇bo4抗體可便利地用作治療劑及診斷劑，以用於靶向與異常或不需之内皮細胞增 128838.doc -34- 200840822 殖有關的病理病狀，諸如包括（但不限於）以下病症之病症中的異常或不需之血管細胞增殖：癌症、調節異常血管生成及與經歷病症之組織内内皮細胞增殖有關（例如，藉由其擴大）之病症、實體腫瘤及轉移、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新生金管性疾病（諸如增生性視網膜病，例如糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼）、移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎及牛 • ㈣。本發明之抗R〇b〇4抗體可單獨使用或與其他藥劑（包括杬贅生性組合物、化學治療劑、細胞毒性劑、生長抑制劑）組合使用。在一些實施例中，本發明提供用於確認及/ 或使用靶向R0b04之抗體以阻斷R〇b〇4功能、遞送細胞毒性劑至表現R〇b〇4之細胞（例如，細胞表面上）及/或遞送顯像劑至表現Rob〇4之細胞的細胞表面上之方法。舉例而吕，在一些實施例中，經標記可偵測之抗R〇b〇4抗體可便 φ 。用作供其中增加之血管形成有害之疾病病況（例如，癌症及黃斑變性）或用於其中内皮細胞增殖、血管細胞增或血嘗生成為需要條件之生理病狀（諸如，例如傷口癒合中）用的顯像劑。 II·定義除非另外說明，否則如本文所用之以下術語具有以下指定至其之含義。如本文所用之術語"R〇b〇4"或"Magic Roundab〇m”、"内皮細胞特異性分子4”或”ECSM4 ”係指包含圖5中所示胺基 128838.doc -35- 200840822 酸序列、其變異體或本發明之抗體特異性結合之子序列 (包括（例如）Robo4之胞外域或其任何子序列）的任何天然或變異（無論天然抑或合成）Robo4多肽。術語"野生型Robo4n 一般係指包含天然存在之Robo4蛋白之胺基酸序列的多肽。術語’’野生型Robo4序列”一般係指在天然存在之R〇bo4 中發現之胺基酸序列。本發明之R〇bo4多肽為哺乳動物 Robo4多肽，諸如（但不限於）人類、馬、牛、豬、犬科動物、描科動物、齧齒動物之R〇bo4。"Robo4”、"Magic Roundabout”、”内皮細胞特異性分子4Π或nECSM4n亦係指核酸及多肽多晶型變異體、等位基因、突變體及種間同源物，其：（1)較佳在至少約 25、50、100、200、500、1〇〇〇或更多胺基酸之區域上胺基酸序列與藉由Robo4核酸編碼之胺基酸序列（對於人類R〇bo4多肽序列，例如參見圖5及7 及SEQ ID NO:138及171 ;對於鼠科Robo4多肽序列，例如參見SEQ ID NO: 172)具有超過約60%胺基酸序列一致性、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、較佳 91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或更大胺基酸序列一致性，（2)與抗體結合’例如經培養以抗包含R〇b〇4 蛋白之胺基酸序列之免疫原的多株抗體及/或單株抗體，及其經保守修飾之變異體；（3)在嚴格雜交條件下特異性雜交對應於編碼R〇bo4蛋白之核酸序列的反義鏈，及其經保守修飾之變異體；（4)較佳在至少約25、50、100、200、 500、1〇〇〇或更多核苷酸之區域上核酸序列與R〇b〇4核酸 (例如，編碼圖5及7中所述之多肽&SEq id NO: 138、171 128838.doc -36- 200840822 或172之核酸）具有超過約95%、較佳超過約96%、97%、 98%、99%或更高核苷酸序列一致性。較佳在至少約25、 50 、 100 、 150 、 200 、 250 、 300 、 350 、 400 、 450或500 、 600、700、800、900或1000或更多核苷酸之區域上， Robo4核酸較佳與編碼SEQ ID NO:138、171或172之核酸序列具有超過 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%—致性。術語"抗R〇b〇4抗體"或”與R〇bo4結合之抗體π係指能夠以足夠親和力結合Robo4使得抗體可用作把向Robo4時之診斷劑及/或治療劑的抗體。較佳地’如（例如）藉由放射免疫檢定（rIA)所量測，抗Robo4抗體與不相干#Robo4蛋白結合之程度小於抗體與R〇bo4結合之約1 〇%。在某些實施例中，與Robo4結合之抗體具有2 μΜ、200 nM、50 nM、幻nM或切·1 nM之解離常數（Kd)。在某些實施例中，抗 Rob〇4抗體與在來自不同物種之間保守的之抗原決定基結合。在其他實施例中，抗R〇b〇4抗體與在來自不同物種之Rob〇4間不保守的R〇b〇4之抗原決定基結合。本文中術語”抗體，，以最廣泛之意義使用且特定涵蓋單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整抗體形成之多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）及抗體片段，只要該等抗體片段展示所需生物料料。，，經分離”之抗體為已自其天然環境之組份中鑑別及分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染組份為干擾抗體之研究、診斷或治療用途的物質且可包括酶、激素、及其他 128838.doc -37- 200840822 蛋白性或非蛋白性溶質。在一些實施例中，抗體經純化（^) 至如藉由（例如）勞立（Lowry)方法測定有超過％重量％之抗體，且在一些實施例中至超過99重量％ ; (2)至藉由使用 (例如）旋杯式序列分析儀足以獲得至少15個N末端殘基或内部胺基酸序列的程度，或（3)使用（例如）考馬斯藍 (Coomassie blue)或銀染在還原或非還原條件下藉由sds_ PAGE至均質。經分離之抗體包括重組細胞内原位抗體，此係因為抗體天然環境之至少—種組份將不存在。然而， • 經分離之抗體通常將藉由至少一個純化步驟製備。 "天然抗體，，通常為由兩個相同輕（L)鏈及兩個相同重（h) 鏈組成之約150,000道爾頓（Dalt〇n)之異四聚體醣蛋白。各輕鏈藉由一共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數目在不同免疫球蛋白同型之重鏈間有所不同。各重鍵及輕鍵亦具 2規則間隔之鏈内二硫橋。各重鏈在一末端具有繼大量恒定或之後的可茭域(vH)。各輕鏈在一末端具有可變域(V。 φ 且在〃另末端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一怪^域對準，且輕鏈之可變域與重鏈之可變域對準。咸信特疋胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成界面0 抗體之可&區”或"可冑域„係指抗體之重鍵或輕鍵之胺基末端域。重鏈之可變域可稱為"vh"。輕鍵之可變域可稱為”VL’’。此等域一般為抗體之最可變部分且含有抗原位點。術語”可變"係指可變域之某些部分在抗體間序列廣泛不 128838.doc -38 - 200840822 同且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性的事實。然而，可變性在整個抗體可變域中並非均勻分布。在輕鍵及重鏈可變域中均集中三個稱為高變區（HVR)之區 ^又°可變域之更高度保守之部分稱為構架區（FR)。天然重鍵及輕鏈之可變域各自包含四個藉由形成環連接之三個 HVR連接的1"11區，其大部分採用β片狀構型，且在某些狀況下形成β片狀結構之部分。各鏈中HVR與FR區緊密保持在一起’且與來自另一鏈之HVR一起促成抗體之抗原結合位.、、、占之形成（參見 Kabat 專人 ’ iSegwewces < jProie/似〇/ /mm㈣〇/〇gz.ca/ /价⑽，，第 5 版，Nati〇nal institute 〇f

Health，Bethesda，MD (1991))。雖然恆定域不直接涉及抗體與抗原之結合，但其展示各種效應功能，諸如抗體依賴性細胞毒性中抗體之參與。來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）之”輕鏈，，可基於其丨互疋域之胺基酸序列歸於兩種明顯不同類型中之一者，稱為κ及λ。視其重鏈之恆定域之胺基酸序列而定，抗體（免疫球蛋白）可歸於不同類別。存在五個主要類別之免疫球蛋白： IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等免疫球蛋白中之若干者可進一步分成亞類（同型），例如IgG】、igG2、lgG3、 IgG#、IgA〗& IgA?。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恒定域分別稱為α、δ、ε ' γ及μ。不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維構型為吾人所熟知且一般描述於（例如）Abhas 等 k，Cellular and Mol, Immunology，第 4 版 128838.doc -39- 200840822 (W，B· Saimders，Co·，2000)中。抗體可為由抗體與一或多個其他蛋白或肽共價或非共價締合而形成之較大融合分子之部分。本文中術語”全長抗體"、"完整抗體”及”完全抗體”可交替使用以指4於其實質上完整形式之抗體而非如下所定義之抗體片段。該等術語尤其係指具有含有以區之重鏈之抗體。為達成本文中之目的，”裸露抗體，，為未與細胞毒素部分或放射性標記接合之抗體。 ”抗體片段”包含完整抗體之—部分，較佳包含其抗原結合區。抗體片段之實例包括！^、Fab，、吵^及^片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；&由抗體片段形成之多特異性抗體。抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同抗原結合片段，稱為："Fab”片段，其各具有單個抗原結合位點；及殘餘”Fc” 片段，其名稱反映其易於結晶之能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原組合位點且仍能夠與抗原交聯之·片 "Fv"為含有完全抗原結合位點之最小抗體片段。在一實施例中，雙鏈Fv種類由_重鏈可變域與_輕鏈可變域以緊密非共價締合之二聚體組成。在單鏈Μ·)種類中，— 重鏈可變域與-輕鏈可變域可藉由可撓性肽連接子共價連接，使得輕鏈及重鏈可以類似於雙鏈Fv種類中之二聚體处構的"二聚體”結構締合。正是在此構型中，各可變域之； 128838.doc -40- 200840822 個HVR相互作用以界定VH-VL二聚體之表面上的抗原結合位點。六個HVR共同給予抗體抗原結合特異性。然而，甚至單個可變域（或Fv之一半，其僅包含三個對抗原具特異性之H VR)亦具有識別且結合抗原之能力，但親和力比整個結合位點低。

Fab片段含有重鏈可變域及輕鏈可變域且亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域（CH1)。Fab·片段不同於Fab片段，在於在重鏈CH1域之魏基末端添加包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的數個殘基。Fab’-SH為本文中用於其中恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之FaW的名稱。F(ab，）2抗體片段最初以在其間具有鉸鏈半胱胺酸之 Fab·片段對產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。，，單鏈Fv，，4nscFv’，抗體片段包含抗體之VH及VL域’其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，scFv#肽進一步包含在VH與VL域之間的多肽連接子，該多肽連接子使 scFv能夠形成抗原結合所需之結構。關於scFv之綜述’例如參見 Pluckthiin，The Pharmacology of Monoclonal 如说。山·α，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編’（外1^11^61·-

Verlag，New York，1994)，第 269-3 15 頁。術語”雙功能抗體，，係指具有兩個抗原結合位點之抗體片段，該等片段包含與同一多肽鏈（VH-VL)中輕鏈可變域 (VL)連接之重鏈可變域（VH)。藉由使用過短而無法使同一鏈上兩個域之間配對的連接子，該等域被迫與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體可為二價 128838.doc -41 - 200840822

或雙特異性。雙功能抗體更完全地描述於（例如）EP 404,097 ; WO 1993/01161 ; Hudson等人，施忒 9:129- 134 (2003);及 Hollinger等人，p见^ 9〇: 64体6448 (1993)中。三功能抗體及四功能抗體亦描述於^^心的等 A ^ Nat. Med. 9:129-134 (2003)t ° 如本文所用之術語”單株抗體"係指自一群實質上同類之抗體獲得之抗體’亦即包含此群體之個別抗體除可以微量存在之可能突變（例如，天然存在之突變）外均相同。因 ❿此’修飾语’’單株”表明抗體並非為離散抗體之混合物的特徵。在某些實施例中，該單株抗體通常包括包含結合標靶之多肽序列之抗體，其中藉由包括自複數個多肽序列選擇單個標靶結合多肽序列的方法來獲得該標靶結合多肽序列。舉例而言，選擇方法可為自複數個純系（諸如，融合瘤純系池、噬菌體純系或重組DNA純系）選擇獨特純系。應瞭解所選標靶結合序列可進一步經改變（例如）以改良對鲁才丁乾之親和力、使;j：示革巴結合序列人化、改良其在細胞培養物中之產生、減少其在活體内之免疫原性、產生多特異性杬體等，且包含經改變之標靶結合序列的抗體亦為本發明單株抗體與通常包括針對不同決定子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗 T針對抗原上之單個決定子。除其特異性外，單株抗體製 ^ :、、、有利的此係因為其通常未受到其他免疫球蛋白污染。仏飾浯單株”表明如自實質上同類群體之抗體獲得之抗 128838.doc -42- 200840822 體的特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本發明待使用之單株抗體可藉由多種技術製成，該等技術包括（例如）融合瘤方法（例如Kohler及 Milstein，iVaiwre，256:495-97 (1975) ; Hongo 等人，

Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995) ; Harlow 等人，

Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2 版，1988) ; Hammerling 等人， Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 5 63-681 (Elsevier，N.Y.，1981))、重組DNA方法（例如參見美國專利第4,816,567號）、噬菌體呈現技術（例如參見Clackson等 k、Nature, 3 52: 624-628 (1991) ; Marks 等人，J· Mo/. Biol. 222: 581-597 (1992) ； Sidhu 等人，J· Mol· Biol· 338(2): 299-310 (2004) ; Lee 等人，丄 Mol· Biol· 340(5): 1073-1093 (2004) ； Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004) ； ALee^ A » J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004))及用於在具有部分或全部人類免疫球蛋白基因座或編碼人類免疫球蛋白序列之基因的動物中產生人類或類人抗體的技術（例如參見WO 1998/24893 ; WO 1996/34096 ;

WO 1996/33735 ; WO 1991/10741 ; Jakobovits等人，PAUS USA 90: 2551 (1993) ； Jakobovitsf A > Nature 362: 255-25 8 (1993) ; Bruggemann 等人，Year in Immunol· 7:33 (1993);美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第 5,569,825 號、第 5,625，126 號、第 5,633,425 號及第 5，661，0 1 6 號；Marks 等人，10: 779-783 128838.doc -43- 200840822 (1992) ; Lonberg 等人，368: 856-859 (1994); Morrison，TVwwe 368: 812_8ΐ3 (1994) ; Fishwild等人，

Nature Biotechnol 14: 845-851 (1996) ； Neuberger, Nature Bioiec/mo/· 14: 826 (1996);及 Lonberg及 Huszar，/价 Rev. ImmunoL 1 3 : 65-93 (1995)) ° 本文中單株抗體特定包括”嵌合"抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體中相應序列一致或同源，而鏈之剩餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體中相應序列一致或同源，以及該等抗體之片段，只要其展示所需生物活性即可（美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，户见^ 81:6851-6855 (1984))。嵌合抗體包括 PRIMATIZED ② 抗體其中技*體之抗原結合區來源於藉由（例如）用相關抗原使獼猴免疫所產生之抗體。人化”形式之非人類（例如，鼠科）抗體為含有來源於非人類免疫球备白夕备vl、皮而丨ΛΑ由人丨上.

非人類 [度上，置換之人類免疫球蛋白（接受者抗體）。在某些情況下，人

128838.doc 大乳、兔或具有所需特異 I類動物）之高變區的殘基人類殘基置換。施體抗體中發現體效能。一般而個且通常兩個可 -44- 200840822 變域，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等高變環且全部或實質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之彼等FR。人化抗體視情況將亦包含免疫球蛋白恆定區（Fc)(通常為人類免疫球蛋白之免疫球蛋白恆定區）之至少一部分。進一步詳情參見jones等人，^321:522- 525 (1986) ; Riechmann 等人，332:323-329 (1988);及 Presta，Cwrr· 〇ρ· Βζ·〇/. 2:593-596 (1992)。亦參見以下綜述文章及其中引用之參考文獻： Vaswani 及 Hamilton，d狀· Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998) ； Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995) ; Hurle 及 Gross，Cwrr. Op. 5:428-433 (1994) 〇 •’人類抗體"為具有對應於藉由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用如本文揭示之用於製備人類抗體之技術中之任一者來製備的抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術（包括噬菌體呈現文庫）來產生。Hoogenboom及 Winter，/· Mo/· 5/〇/·，227:381 (1991) ; Marks等人，/· Mo/·价〇/·，222:581 (1991)。亦可用於製備人類單株抗體之方法描述於c〇le等人，

Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，第 77 頁（1985)，Boerner 等人，J. /所， 147(1):86-95 (1991)中。亦參見van Dijk 及 van de Winkel，Cwrr· Op/” P/mrmaeW·，5: 368-74 (2001)。人類抗體可藉由將抗原投 128838.doc -45- 200840822 與經修飾以回應抗原挑釁而產生該等抗體但其内源基因座已無用之轉殖基因動物（例如，經免疫之異種小鼠）來製備 (關於XENOMOUSETM技術，例如參見美國專利第 6,075,1 81號及第6,1 50,584號）。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生人類抗體，亦例如參見Li等人，尸见4夕 103:3557-3562 (2006)。 ”抗原”為抗體可選擇性結合之預定抗原（例如，R〇b〇4序列）。標革巴抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半 _ 抗原或其他天然存在或合成之化合物。較佳地，標輕抗原為多肽。用於達成本文之目的之"受體人類構架"為包含來源於人類免疫球蛋白構架或來源於人類一致構架之VL或VH構架之胺基酸序列的構架。”來源於”人類免疫球蛋白構架或人類一致構架之受體人類構架可包含其相同胺基酸序列，或可含有預先存在之胺基酸序列變化。在一些實施例中，預 _ 先存在之胺基酸變化的數目為1 0個或更少、9個或更少、8 個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少或2個或更少。在預先存在之胺基酸變化存在於VH中之情況下，較佳為彼等變化僅存在於位置7丨η、 73Η及78Η中之三個、兩個或一個位置上；舉例而言，彼荨位置上之胺基酸殘基可為71Α、73Τ及/或78Α。在一實施例中’ VL受體人類構架之序列與vl人類免疫球蛋白構架序列或人類一致構架序列一致。在預先存在之胺基酸變化存在於VH中之情況下，較佳為彼等變化僅在位置7丨η、 128838.doc -46- 200840822 73H及78H中之三個、兩個或一個位置上；舉例而言，彼等位置上之胺基酸殘基可為71A、73T及/或78A。在一實施例中，VL受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類一致構架序列一致。 11人類一致構架”為在選擇人類免疫球蛋白VL或VH構架序列時代表最常存在之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人中之亞群。在一實施例中，對於VL，亞群為如Kabat等人中之亞群κΐ。在一實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人中之亞群III。 ” VH亞群III一致構架"包含自Kabat等人之可變重鏈亞群 III中的胺基酸序列獲得之一致序列。在一實施例中，VH 亞群III 一致構架胺基酸序列包含以下各序列之至少一部分或全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID N0:128)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:129)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:131)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)。在另一實施例中， VH亞群III一致構架胺基酸序列包含以下各序列之至少一部分或全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID N0:128)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:129)-H2-RFTISADTSKNTAYLQMNSLRLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:137)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16) 〇 nVL亞群I一致框架"包含自Kabat等人之可變輕鏈κ亞群I 中的胺基酸序列獲得之一致序列。在一實施例中，VH亞 128838.doc -47- 200840822 群i 一致構架胺基酸序列包含以下各序列之至少一部分或全部： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID N0:9)-L1-WY QQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO: 10)-L2-GVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:99)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID N0:100)。 ”未經修飾之人類構架’’為具有與受體人類構架相同之胺基酸序列的人類構架，例如受體人類構架中缺乏人類至非人類胺基酸之取代。術語π高變區”、"HVR”或’’HV”在本文中使用時係指序列高變及/或形成結構確定之環的抗體可變域之區域。一般而言，抗體包含六個高變區；三個在VH(H1、Η2、Η3)中且三個在VL(L1、L2、L3)中。本文中使用且涵蓋許多關於高變區之描繪。Kabat互補判定區（CDR)係基於序列可變性之HVR且為最常用者（Kabat等人，Segwewca <9/ /mm⑽o/ogz’ca/ /πίπαί，第 5版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991)) 0 另外，Chothia指出結構環之位置（Chothia及Lesk，J· Mol 196:901-917 (1987))。AbM高變區表示Kabat CDR與 Chothia結構環之間的折衷，且為Oxford Molecular之AbM 抗體模型化軟體所用。n接觸"高變區係基於可得之複雜晶體結構的分析。以下指明來自此等高變區中之每一者的殘基。 128838.doc -48- 200840822 環 Kabat AbM Chothia 接觸 L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B(Kabat編號） H1 H31-H3 5 H26-H35 H26-H32 H30_H35(Chothia編號） H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 描繪抗體之高變區的胺基酸位置/邊界可視上下文及此項技術已知之各種定義（如下所述）而變。可變域内之一些位置可視作雜化高變位置，此係因為在一組標準下可認為此等位置在高變區之内而在一不同組之標準下認為此等位置在高變區之外。此等位置中之一或多者亦可在擴展高變區中發現。在一實施例中，此等雜化高變位置包括重鏈可變域中位置 26-30、2635、33-35B、47-49、49-65、57-65、95-102、93、94及102中之一或多者。在一實施例中，此等雜化高變位置包括輕鏈可變域中位置24-29、24-34、35-36、46-49、50-56、89-97、56 及 97 中之一或多如本文所用，輕鍵之HVR可交替地稱為HVR-L1、HVR-L2 或 HVR-L3 或 HVR1-LC、HVR2-LC 或 HVR3-LC 或表明提及輕鏈HVR之其他類似名稱。如本文所用，重鏈之HVR可 128838.doc -49- 200840822 交替地稱為 HVR-Hl、HVR-H2 或 HVR-H3 或 HVRl-HC、 HVR2-HC或HVR3-HC或表明提及重鏈HVR之其他類似名稱。高變區可包含如下”擴展高變區’，：VL中之24-36或24- 34(Ll) 、 46—56 或 50-56(L2) 及 89-97(L3) ，及 VH 中之26· 35(H1)、50_65 或 49-65(H2)及 93-102、94-102 或 95- 1〇2(Η3)。可變域殘基係根據Kabat等人（見上）關於該等定義中之每一者來編號。為達成本發明之目的，"經改變之高變區”為其中包含一或多個（例如，1至約16個）胺基酸取代之高變區。為達成本文之目的，”未經修飾之高變區”為具有與來源於非人類抗體之胺基酸序列相同之胺基酸序列的高變區，亦即其中缺乏一或多個胺基酸取代之高變區。 ’’構架’’或1’FR’’殘基為除如本文所定義之高變區殘基以外之彼等可變域殘基。如本文所用，LC_fr1_4或fri_4-LC 或類似名稱可交替使用且係指輕鏈之構架區。如本文所用，HC-FR1-4或FR1-4-HC或類似名稱可交替使用且係指重鏈之構架區。親和力成熟’’抗體為其一或多個CDR具有一或多處改變之抗體，與不具有彼等改變之親本抗體相比，該等改變使抗體對抗原之親和力得以改良。較佳親和力成熟抗體將對標靶抗原具有奈莫耳濃度或甚至皮莫耳濃度（pic〇m〇lar)之親和力。藉由此項技術中已知之程序產生親和力成熟抗體。Marks等人，ΐ〇:779·783 (1992)描述由 128838.doc -50· 200840822 VH及VL域改組引起之親和力成熟。CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發係由以下文獻描述·· Barbas等人，尸见45 91:3809-3813 (1994) ; Schier 等人，Ge㈣ 169:147-155 (1995) ； Yeltonf A ^ J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)； Jackson 等人，J. /mm麗ο/. 154(7):3310-9 (1995);及

Hawkins等人，《/. Mo/· 5/6>厂 226:889-896 (1992) ° n阻斷”抗體或”拮抗劑"抗體為抑制或降低所結合之抗原之生物活性的抗體。舉例而言，阻斷抗體或拮抗劑抗 ⑩ Robo4抗體藉由結合Robo4而實質上或完全抑制血管生成。術語”如Kabat中可變域殘基編號”或"如Kabat中胺基酸位置編號"及其變體係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD· (1991)中用於編製抗體之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有使對應於可變域之 FR或CDR縮短或插入其中的更少或其他胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘基52後插入之單個胺基酸 (根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82後插入之殘基（例如，根據Kabat之殘基82a、82b及82c等）。藉由在同源區將抗體序列與”標準"Kabat編號之序列對準’可確定給定抗體之殘基的Kabat編號。如本文所用之短語”實質上類似π或”實質上相同’’表示兩個數值（一般一數值與本發明之抗體有關’且另一數值與 128838.doc -51 - 200840822 參考/比較抗體有關）之間有足夠高的類似程度，使得熟習此項技術者認為兩個值之間的差異在藉由該等值（例如， Kd值）所量測之生物學特徵的背景下幾乎不具有生物及/或統計顯著性。該兩個值之間的差異較佳小於約5〇%、較佳小於約40%、較佳小於約3〇%、較佳小於約2〇%、較佳小於約10%，其隨參考/比較抗體之值而變。 ”結合親和力”一般係指分子（例如，抗體）之單一結合位點與其結合搭配物（例如，抗原）之間的總計非共價相互作 • 之強度。除非另外指#，否則如本文所用之"結合親和力”係指反映結合對成員（例如，抗體與抗原）之間ι:ι相互作用的固有結合親和力。分子χ對其搭配物γ之親和力一般可藉由解離常數（Kd)來表示。可藉由此項技術中已知之常見方法（包括本文所述之彼等方法）來量測親和力。低親和力抗體一般緩慢結合抗原且傾向於易於解離，而高親和力抗體一般較快結合抗原且傾向於較久地保持結合。多種 # 量測結合親和力之方法在此項技術中已知，該等方法中之任-者可用於達成纟發明之㈣。特$說明性實施例描述於下文中。在一實施例中’ ”Kd"、"KD"或"^值"係藉由放射性標記之抗原結合檢定（RIA)來量測，該檢定係使用相關抗體之 Fab形式及其抗原如藉由量測Fab對抗原之溶液結合親和力的以下檢定所述來執行：藉由在滴定系列之未標記抗原存在下使Fab與最低濃度之（m〗）標記之抗原達成平衡，接著用經抗Fab抗體塗佈之培養盤捕捉結合抗原等人 128838.doc -52- 200840822 (1999)/·淑W 293:865-881)。為確定檢定之條件，將微量滴定盤（Dynex^5 μ§/ηι1κ5〇 mM碳酸鈉（pH 96)中之捕捉抗Fab抗體（Cappel Labs)塗佈隔夜，且接著用pBs中 2%(w/v)牛血清白蛋白在室溫（約23。〇下阻斷，歷時二至^小時。在非吸附劑培養盤（Nunc#—26962〇)中，將1〇〇 PM*% PM [1251]-抗原與連續稀釋之相關Fab (例如，如pRSta等人，C⑽ cer 及以· 57:4593-4599 (1997)中所述iFab_12Ui 合。接著將相關Fab培育隔夜；然而，培育可持續較長時段（例如，65小時）以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉培養盤中以在室溫下培育（例如，i小時）。接著移除溶液且將培養盤用PBS中〇1% Tween@ 2〇洗滌8次。當培養盤已乾燥時，添加每孔B0…之閃燦體（Micr〇Scint_2〇 ;

Packard)且在Topcount γ計數儀（Packard)上對培養盤計數，歷時ίο分鐘。選擇產生小於或等於20%最大結合之各Fab 濃度以用於競爭性結合檢定。根據另一實施例，藉由使用表面電漿共振檢定使用BIAc〇reTM-2〇〇()或BIAc〇reTM_ 3000(BIAcore，Inc” Piscataway，NJ)在 25〇c下以在約 1〇個反應單位（RU)下的固定抗原〇Μ5晶片量測Kd或Kd值。簡言之，根據廠商說明，將羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片 (CM5, BIAcore lnc·)用乙基-二甲胺基丙基）_碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)及iV-羥基琥珀醯亞胺（Nhs)活化。將抗原用10 mM乙酸鈉（pH 4.8)稀釋至5 pg/ml(約〇·2 μΜ)，接著以5微升/分鐘之流動速率注射以達成約i 〇個反應單位之偶合蛋白。注射抗原之後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反 128838.doc -53- 200840822 在25°C下以約25 μΐ/min之流動速率將兩倍連續稀釋之

Fab(0,78 nM 至 500 nM)注射於具有〇·〇5% Tween 20® (PBST)之PBS中。使用簡單一對一朗繆耳（Langmuir)結合核型（BIAcore汗估軟體（BIA core Evaluation S oft ware)版本 3 ·2)藉由同時擬合締合及解離感應圖（sens〇rgrani)來計算締合速率（kQn)及解離速率（kQff)。平衡解離常數（Kd)計算為比率 koff/kon。例如參見 Chen等人，293:865-881 (1999)。若藉由以上表面電漿共振檢定締合速率超過1〇6 Μ」S·1，則可藉由使用在25。〇下量測在如光譜儀（諸如，裝配截概之分光光度計（Aviv Instruments)或具有檟;拌比色管之 8000 系列 SLM-Aminco™分光光度計（Therm〇Spectr〇nic)) 中所量測的增加濃度之抗原存在下pBS(pH 7·2)中2〇抗原抗體（Fab形式）之螢光發射強度（激發=295 ；發射 = 340 nm，16 nm帶通）增加或減少的螢光淬滅技術來測定締合速率。如本文所用之短語，，實質上減少"或"實質上不同”表示兩個數值（一般一數值與本發明之抗體有關，且另一數值與參考/比較抗體有關）之間有足夠高的差異程度，使得熟習此項技術者認為兩個值之間的差異在藉由該等值（例如，Kd值，HAMA反應）所量測之生物學特徵的背景下具有統計顯著性。該兩個值之間的差異較佳大於、勺較L大於約2 〇 %、較佳大於約3 0 %、較佳大於約40%、較佳大於約5〇%，其隨參考/比較抗體之值而變〇 128838.doc 54- 200840822 關於肽或多肽序列之"百分比（％)胺基酸序列一致性"定義為在將序列及引入缺口（若需要）對準以實現最大百分比之序列一致性而不考慮任何保守取代作為序列一致性之部分後，候選序列中與特定肽或多肽序列中胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比。為達成测定百分比胺基酸序列一致性之目的之對準可以在此項技術技能之内的多種方式來實現，該等方法例如使用公開可得之電腦軟體，諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign(DNASTAR™)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測對準之適當參數，包括實現所比較之序列之全長上最大對準所需的任何演算法。然而，為達成本文之目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2產生％胺基酸序列一致性之值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech，Inc·創作且所示原始碼已與使用說明書一起申請於 U.S· Copyright Office，Washington D.C.，20559，其中其寄存於 U.S. Copyright Registration 第 TXU510087號。ALIGN-2程式經由 Genentech，Inc· (South San Francisco，California)公開可得。ALIGN-2程式應經編譯以用於UNIX操作系統，較佳為數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設置且並不改變。在ALIGN-2用於胺基酸序列比較之情況下，給定胺基酸序列A對、與或相對給定胺基酸序列B2 %胺基酸序列一致性（或者其可表述為具有或包含對、與或相對給定胺基酸序列B之一定％胺基酸序列一致性的給定胺基酸序列A)計算如下： 128838.doc -55- 200840822 10〇χ 分數 χ/γ， /、中X為由於程式對準A及b而藉由序列對準程式 ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基數目，且其中丫為6中胺基酸殘基總數。應瞭解在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不等的情況下，A對3之％胺基酸序列一致性將不等於B對八之％胺基酸序列一致性。除非另外特定說明，否則本文所用之所有％胺基酸序列一致性之值均如之前數段中所述使用ALIGN_2電腦程式獲 • 得。又如本文所用之術語，，載體"欲指能夠輸送其所連接之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為”質體，，，其係指其他 DNA區段可接合之環狀雙鏈DNA環。另一類型之載體為噬菌體載體。另一類型之載體為病毒載體，其中其他1)1^八區段可接合至病毒基因組。某些載體能夠在其引入之宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游 φ 離型哺乳動物載體）。其他載體（例如，非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞後整合至宿主細胞基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接之基因的表現。該等載體在本文中稱為，，重組表現載體"(或簡稱為”重組載體，，）。一般而言，重技術中應用之表現載體常處於質體形式。在本說明書中， π質體π及載體π可交替使用，此係因為質體為最常使用之載體形式。如本文可交替使用之”聚核苷酸”或"核酸”係指任何長度 128838.doc -56- 200840822 之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧 h糖核苦酸、核糖核苦酸、經修飾之核皆酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中的任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則對核苷酸結構之修飾可在聚合物組裝之前或之後進行。核苦酸序列可被非核Μ組份中斷。可在合成後進_步修_聚核苦酸，諸如藉由與標記接合來修飾。其他類型之修飾包括 (例如)”帽？”、—或多㈣天然存在之核苷酸經類似物之取代、核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵之修飾（例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等）及具有帶電鍵之修飾（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）、含有側位部分之修飾（諸如蛋白，例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L·離胺酸等）、具有嵌入劑之修飾（例如， °丫咬、補骨脂素等）、含有螯合劑之修飾（例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等）、含有烷化劑之修飾、具有經修飾之鍵的修飾（例如，α_變旋異構核酸等），以及未_ 修飾形式之聚核苷酸。此外，通常存在於糖中之任何羥基可（例如）經膦酸酯基、麟酸酯基置換，經標準保護基保護或經:活化以製備與其他核苷酸之其他鍵或可與固體戋半固體支撐物接合。5,及3,末端ΟΗ可經磷酸化或經胺或具有1 至20個碳原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生至標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之類似形式之核糖或脫氧核糖，包括（例如甲美、 128838.doc -57- 200840822 2’-0-烯丙基、2’-氟-或2，-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、心變旋異構糖、差向異構糖（諸如，阿拉伯糖、木糖或來蘇糖派南醣、吱喃醣、景天庚酮糖（sedoheptulose)、非環形類似物及脫鹼基核苷類似物，諸如甲基核苷）。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括（但不限於）其中磷酸酯經p(〇)S("硫代酯"）、 P(S)S("一硫代酯"）、（〇)NR2(” 酸胺酸酯"）、p(〇)R、 ρ(ο)οκ、CO或CH2("甲縮醛”）置換之實施例，其中尺或&，籲各自獨立為Η或經取代或未經取代之視情況含有醚卜〇_)鍵的烷基（1-20 C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。聚核苷酸中並非所有鍵均需相同。之前描述適用於本文提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。如本文所用之，，寡核苷酸”一般係指一般單鏈之一般為合成之短聚核苷酸，其長度一般（但未必）小於約2⑽個核苷酸。術語”寡核苷酸”及"聚核苷酸”並不互相排斥。以上對 I 聚核苷酸之描述同等及完全適用於寡核苷酸。病症或"疾病”為將受益於用本發明之物質/分子或方法治療之任何病狀。其包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物傾向於罹患所論及之病症的彼等病理病狀。本文中欲治療之病症之非限制性實例包括惡性及良性腫瘤；非白血病及淋巴惡性腫瘤；神經元、神經膠質、星細胞、下丘腦及其他腺體、巨噬細胞、上皮、基質及囊胚腔病症；及炎症、免疫及其他血管生成相關病症。術語"細胞增殖病症Η及"增生病症"係指與某種程度之異 128838.doc -58- 200840822 常細胞增殖相關之病症。在癌二在-實施例中，細胞增殖病症為血:了有癌變珂細胞及組織與癌性細胞二。⑹本文中所提及之術語”癌症”、”癌性”、'細胞增 :丙症增生病症π及，，腫瘤"並不互相排斥。

/Γ、癌症及癌性’’係指或描述通常特徵為不受調節之細胞增殖的哺乳動物體内之生理病狀。癌症之實例包括 '但不限於)：癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。 /等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、肺癌（包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺之腺癌及肺之鱗狀細胞癌）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（包括胃腸癌）、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌及各種類型之頭頸癌以及Β細胞淋巴瘤（包括低度/濾泡非霍奇金氏淋巴瘤（NHL);小淋巴細胞（SL)NHL ;中度/ 濾泡NHL ;中度彌漫性NHL ;高度免疫母細胞NHL ;高度淋巴母細胞NHL ;高度小非分裂細胞NHL ;腫塊性病變 NHL ;套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症（Waldenstrom’s Macroglobulinemia));慢性淋巴細胞白血病（CLL);急性淋巴母細胞白血病（ALL);毛細胞白血病；慢性骨趙母細胞白如病；及移植後淋巴組織增生性病症（PTLD)以及與母斑細胞病、水腫（諸如，與腦 128838.doc •59- 200840822 腫瘤有關之水腫）及梅格斯氏症候群（Meigs’ syndrome)有關之異常血管增生。術語’’抗贅生性組合物”或”抗癌組合物”或”抗癌劑”係指適用於治療癌症之組合物，其包含至少一種活性治療劑 (例如”抗癌劑"）。治療劑（抗癌劑）之實例包括（但不限於）例如化學治療劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、放射療法中所用之藥劑、抗血管生成劑、細胞凋亡劑、抗微管蛋白劑及其他治療癌症之藥劑，例如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體（EGFR)拮抗劑（例如，酪胺酸激酶抑制劑）、HER1/EGFR抑制劑（例如，埃羅替尼（erlotinib， TarcevaTM))、血小板衍生生長因子抑制劑（例如， GleevecTM(伊馬替尼曱石黃酸鹽，Imatinib Mesylate))、 COX-2抑制劑（例如，賽利克西（celecoxib))、干擾素、細胞激素、與以下標靶 ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、 BlyS、APRIL、BCMA、VEGF 或 VEGF 受體中之一或多者結合之拮抗劑（例如，中和抗體）、TRAIL/Apo2及其他生物活性藥劑及有機化學藥劑等。其組合亦包括在本發明内。 "血管生成因子或血管生成劑’’為刺激血管發育之生長因子，例如促進血管生成、内皮細胞生長、血管穩定及/或血管發生等之生長因子。舉例而言，血管生成因子包括 (但不限於）例如VEGF及VEGF家族之成員、P1GF、PDGF 家族、纖維母細胞生長因子家族（FGF)、TIE配位體（血管生成素）、Ephrin、Del-Ι、纖維母細胞生長因子（酸性 (aFGF)及驗性（bFGF))、卵泡抑素、顆粒細胞群落刺激因 128838.doc -60- 200840822 子（G-CSF)、肝細胞生長因子（HGF)/散射因子（SF)、介白素-8(IL-8)、痩素、中期因子（Midkine)、胎盤生長因子、 jk小板衍生内皮細胞生長因子（PD-ECGF)、血小板衍生生長因子（尤其PDGF-BB或PDGFR-β)、多效生長因子 (Pleiotrophin，PTN)、顆粒蛋白前體、增殖蛋白、轉化生長因子-a(TGF-a)、轉化生長因子-p(TGF-P)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、血管内皮生長因子（VEGF)/血管通透因子 (VPF)等。亦包括加速傷口癒合之因子，諸如生長激素、類胰島素生長因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生長因子 (EGF)、CTGF及其家族成員以及TGF-a及TGF-β。例如參見 Klagsbrun 及 D’Amore，53:217-39 (1991) ; Streit及 Detmar，Owogew，22:3172-3179 (2003); Ferrara 及 Alitalo， Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999) ; Tonini等人，22:6549-6556 (2003)(例如表1列出已知之血管生成因子）；&Sato，hi.J.Cm 0_/·，8:200-206 (2003)。如本文所用之術語nVEGF"係指165胺基酸人類血管内皮細胞生長因子及相關121、189及206胺基酸人類金管内皮細胞生長因子（如Leung等人，5^>加6，246:1306 (1989)及 Houck等人，Mo/. ，5:1806 (1991)所述）以及其天然存在之等位基因及加工形式。術語"VEGF”亦係指來自非人類物種（諸如，小鼠、大鼠或靈長類動物）之VEGF。有時來自特定物種之VEGF藉由諸如針對人類VEGF之 hVEGF、針對鼠科VEGF之mVEGF等術語來指示。術語 128838.doc -61 - 200840822 ftVEGF"亦用以指包含165胺基酸人類血管内皮細胞生長因子之胺基酸8至1 09或1至1 〇9的多肽之截短形式。在本申請案中對任何該等形式之VEGF的提及可（例如）藉由 nVEGF(8-109)n、nVEGF(K109)，’或”VEGFl65”來指示。”截短π之天然VEGF的胺基酸位置係如天然VEGF序列中所指示來編號。舉例而言，截短之天然VEGF中胺基酸位置 17(甲硫胺酸）亦為天然VEGF中位置17(甲硫胺酸）。截短之天然VEGF對KDR及Fit-1受體具有與天然veGF相當之結合親和力。根據一較佳實施例，VEGF為人類VEGF。 ’’VEGF拮抗劑”係指能夠中和、阻斷、抑制、中止、減少或干擾VEGF活性之分子，包括其與VEGF或一或多種 VEGF受體或編碼其之核酸結合。較佳地，VEGF拮抗劑結合VEGF或VEGF受體。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結合片段、結合VEGF及VEGF受體且阻斷配位體-受體相互作用之多肽（例如，免疫黏附素、肽體 (peptibody))、抗VEGF受體抗體及VEGF受體拮抗劑，諸如 VEGFR酪胺酸激酶之小分子抑制劑、與VEGF及在嚴格條件下雜合至編碼VEGF或VEGF受體之核酸序列之核酸結合的適體（例如，RNAi)。根據一較佳實施例，VEGF拮抗劑與VEGF結合且在活體外抑制VEGF誘發之内皮細胞增殖。根據一較佳實施例，VEGF拮抗劑以比與非VEgf或非 VEGF受體結合之親和力大的親和力與VEGF或VEGF受體結合。根據一較佳實施例，VEGI^^抗劑以1 μΜ與1 pM之間的Kd與VEGF或VEGF受體結合。根據另一較佳實施例， 128838.doc -62- 200840822 VEGF拮抗劑在500 nM與1 pM之間與VEGF或VEGF受體結合。根據一較佳實施例，VEGF拮抗劑係選自由下列各物組成之群：諸如抗體之多肽、肽體、免疫黏附素、小分子或適體。在一較佳實施例中，抗體為諸如AVASTIN®抗體之抗VEGF抗體或諸如抗VEGFR2或抗VEGFR3抗體之抗VEGF 受體抗體。VEGF拮抗劑之其他實例包括：VEGF-Trap、慕卡根（Mucagen)、PTK787、SU11248、AG-013736、Bay 439006(索拉非尼，sorafenib)、ZD-6474、CP632、CP-547632、AZD-2171、CDP-171、SU-14813、CHIR-258、 AEE-788、SB786034、BAY579352、CDP-791、EG-3306、 GW-786034、RWJ-417975/CT6758及 KRN-633。 ’，抗VEGF抗體”為以足夠親和力及特異性與VEGF結合之抗體。較佳地，本發明之抗VEGF抗體可用作靶向及干擾涉及VEGF活性之疾病或病狀的治療劑。抗VEGF抗體通常並不與諸如VEGF-B或VEGF-C之其他VEGF同源物結合，亦不與諸如P1GF、PDGF或bFGF之其他生長因子結合。較佳抗VEGF抗體為結合與藉由融合瘤ATCC HB 10709產生之單株抗VEGF抗體A4.6.1結合的抗原決定基相同之抗原決定基的單株抗體。更佳地，抗VEGF抗體為根據Presta等人，（1997) Cancer Res. 57:4593-4599所產生之重組人化抗 VEGF單株抗體，包括（但不限於）稱為貝伐單抗 (bevacizumab，BV ; Avastin®)之抗體。根據另一實施例，可使用之抗VEGF抗體包括（但不限於）WO 2005/0123 59中 128838.doc -63- 200840822 揭示之抗體。根據一實施例，抗VEGF抗體包含WO 2005/0123 59之圖24、25、26、27及29中揭示之任一抗體的可變重鏈區及可變輕鏈區（例如，G6、G6-23、G6-3 1、 G6-23.1、G6-23.2、B20、B20-4 及 B20.4.1)。在另一較佳實施例中，稱為籣尼單抗（ranibizximab)之抗VEGF抗體為針對諸如糖尿病性神經病及AMD之眼部疾病而投與之 VEGF拮抗劑。抗VEGF抗體"貝伐單抗（BV)’’（亦稱為"duiMAb VEGF”或 ’’Avastin®’’）為一種根據 Presta 等人（1997) Cancer Res. 57:4593-4599所產生之重組人化抗VEGF單株抗體。其包含突變人類IgGl構架區及來自阻斷人類VEGF與其受體結合之鼠科抗hVEGF單株抗體A.4.6.1的抗原結合互補判定區。貝伐單抗約93%之胺基酸序列（包括大部分構架區）係來源於人類IgGl，且約7%之序列係來源於鼠科抗體A4.6.1。貝伐單抗具有約149,000道爾頓之分子質量且.經糖基化。其他抗VEGF抗體包括美國專利第6884879號及WO 2005/044853中所述之抗體。抗VEGF抗體蘭尼單抗或LUCENTIS®抗體或rhuFab V2為人化親和力成熟之抗人類VEGF Fab片段。蘭尼單抗係藉由標準重組技術方法在大腸桿菌co//)表現載體及細菌酸酵中產生。蘭尼單抗未經糖基化且具有約48,000道爾頓之分子質量。參見W0 98/45331及US20030190317。血管生成之調節異常可導致異常血管生成，亦即新血管之過量或不適當生長（例如，自醫學觀點而言，血管生成 128838.doc -64- 200840822 之位置、時間選擇或開始非所需）處於疾病病況引起疾病=況時。當存在促使疾病病況惡化或引起疾病病 :之新血官，長時，過量、不適當或不受控制之血管生成毛生新血S可餵養患病組織，破壞正常組織，且症之狀況下新血管可使腫瘤細胞溜入循環且留在其他哭官中 (腫瘤轉移）。涉及異常血管生成之錢錢包括❹生！ =及贅生性病狀，包括（例如）癌症（尤其血Μ實體_ ㈣腫瘤)(包括結腸癌、乳癌、肺癌(尤其小細胞肺癌）或财列腺癌）、非所要或異常肥大、關節炎、類風渴性關節炎_、炎性腸病或削（克羅恩、氏症（Cr〇hn，s 一)及潰癌性結腸炎)、牛皮癣、牛皮癖斑、結節病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑、糖尿病性及其他增生性視網膜病（包括早產兒視網膜病）、晶狀體後纖維組織増生新生血官性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥反應、視網膜/脈絡膜新血管生成、虹膜前表面新血管生成（虹膜紅變）、眼部新生血管性疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形（AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生（包括格雷弗氏病（Grave，s disease))、慢性炎症、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺動脈尚壓、惡性肺部積液、腦水腫（例如，與急性中風/封閉式頭部損傷/創傷相關聯）、滑液炎、骨化性肌炎、肥厚性骨形成、骨關節炎（0A)、難治性腹水、多囊性印巢疾病、子宮内膜異位、第三間隔流體疾病（胰腺炎、間隔症候群、 128838.doc -65- 200840822 燒傷、腸病）、子宮纖維瘤、早產、慢性炎症(諸如，励）、腎同種異體移植排斥反應、炎性腸病、^病症候群、非所要或異常組織大量生長（非癌）、血友病性關節病 '肥厚性瘢痕、毛髮生長抑制、奥韋二氏症候群(0sler_ Weber syndrome)、化膿性肉芽腫晶狀體後纖維組織增生、硬皮病、顆粒性結膜炎、血管黏著、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液f1 &少1 胸腔積液。積夜U如’與心包炎相關之彼疾幻及如本文所用之”治療”孫扣告# % h w , >、，、彳日*试改交所治療之個體或細胞之自然過程的臨床干預，且可為預防或在臨床病理學過程中執行。、理想的治療效果包括預防疾病發作或復發、緩和症狀、減少疾病之任何直接直接或間接病理性後果、預防病灶 ☆、降低疾錢展㈣、改善或減緩疾病錢以及症狀 =解或預後改良。在—些實施例中，本發明之抗體用於延緩疾病或病症之發展。量:有=有效於達成所要治療或預防結果所需之劑 #二=月之物P分子、促效劑或拮抗劑之”治療有效量"可根據堵如以下之因素而變：個體之疾病病況、年及體重以及物暂/八2 力、刀、足效劑或拮抗劑在個體中引起所二應'之…治療有致量亦為治療有益作用超過物質/ 二子、促效劑或枯抗劑之任何毒性或有害作㈣礼動物（aka患者）體内疾病或病症之量。在癌症之狀 128838.doc -66- 200840822 況下’藥物之治療有 J藏夕癌細胞的數目· 尺寸或重量；抑制(亦的數目，減小腫瘤癌細胞浸潤至外周g官、、&度上減慢且較佳停止）為g ，抑制（亦即，在某種且較佳停止）腫瘤轉移./甘隹杲種％度上減忮 —、产甘括。在某種程度上抑制腫瘤生長；及/ 或在某種程度上減輕鱼京風転與癌症有關之症狀中狀。在藥物可阻止生長次夕個症 u —a 長及/或设死存在之癌細胞的程度上，樂物可抑制細胞生長玍長及/或具有細胞毒性。在一實旆例中，治療有效量為抑、 I利玍長之置。在另一實施例中，治療有效量為延長患者存活期〜里在另一實施例中，治療有效量為改良患者之無進展存活之量。 "預防有效量"係指有效於達成所要預防結果所需之劑量及時段之量。通常但並非必需，由於預防劑量係在疾病之前或早期階段用於個體’所以預防有效量小於治療有效量0 如本文所用之術語”細胞毒性劑”係指抑制或阻礙細胞功能且/或導致細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素（例如，At211、I131、1!25、Y90、Rel86、Re!88、

Sm153、Bi212、P32及Lu之放射性同位素）；化學治療劑，例如甲胺喋呤（methotrexate)、阿黴素（adriamicin)、長春花生物鹼（vinca alkaloid)(長春新鹼（vincristine)、長春驗 (vinblastine)、依託泊苷（etoposide))、多柔比星（d〇x〇ru_ bicin)、美法侖（melphalan)、絲裂黴素c(mit〇mycin C)、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、柔紅徽素（daunorubicin)或其他欲入劑；酶及其片段，諸如核分解酶；抗生素及毒素，諸 128838.doc -67- 200840822 如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素（包括其片段及/或變異體）；及以下所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑描述於下文中。殺腫瘤劑導致腫瘤細胞之破壞。

”化學治療劑”為可用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烧基化劑，諸如σ塞替旅（thiotepa)及 CYTOXAN®環填酸胺（cyclosphosphamide);石黃酸烧基醋類，諸如白消胺（busulfan)、英丙舒凡（improsulfan)及旅泊舒凡（piposulfan);氮丙σ定類，諸如苯并多巴（benzodopa)、卡巴酉昆（carboquone)、麥曲多巴（meturedopa)及尤利多巴 (uredopa);伸乙基亞胺類及曱基三聚氰胺類，包括六甲蜜胺（altretamine)、三伸乙基三聚氰胺 (tr i e thy lenemel amine) 、三伸乙基碟 Si 胺 (triethylenephosphoramide)、三伸乙基硫代填醯胺 (triethiylenethiophosphoramide)及三經甲基三聚氰胺 (trimethylolomelamine)；乙醢生（acetogenin)類（尤其布拉他辛（bullatacin)及布拉他辛酮（bullatacinone)) ; δ-9-四氫大麻酴（曲大麻紛（dronabinol)，MARINOL®) ; β-拉帕酉昆 (beta-lapachone);拉帕醇（lapachol);秋水仙驗 (colchicine);樺木酸（b etui ini c acid)；喜樹驗 (camptothecin)(包括合成類似物拓撲替康 (topotecan)(HYCAMTIN®) 、 CPT_11(伊立替康 (irinotecan)，CAMPTOSAR®)、乙酸喜樹驗、斯可波萊辛 (scopolectin)及9-胺基喜樹驗）；苔蘚抑素（bryostatin);卡 128838.doc -68- 200840822

利他汀（callystatin) ； CC-1065(包括其阿多來新 (adozelesin) > 卡折來新（carzelesin)及比折來新（bizelesin) 合成類似物）；鬼臼毒素（podophyllotoxin);足葉草酸 (podophyllinic acid);替尼泊甙（teniposide);念珠藻環肽 (cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);海兔毒素；多卡黴素（duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189及 CB1-TM1);艾權塞洛素（eleutherobin);潘卡替他汀 (pancratistatin);沙科地辛（sarcodictyin);海綿素 (spongistatin);氮芥劑（nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥（chlornaphazine)、膽填醯胺 (cholophosphamide)、雌莫司汀（estramustine)、異環石粦醯胺（ifosfamide)、氮芥（mechlorethamine)、氧化氮芥鹽酸鹽 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新恩比興（novembichin)、苯芥膽甾醇（phenesterine)、潑尼莫司汀 (prednimustine)、曲碟胺（trofosfamide)、尿口密 σ定氮芥 (uracil mustard);亞硝基脲類（nitrosurea)，諸如卡莫司汀 (carmustine)、氯脲菌素（chlorozotocin)、福莫司、;丁 (fotemustine)、洛莫司汀（lomustine)、尼莫司汀（nimustine) 及拉努司汀（ranimnustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素（例如，刺孢黴素（calicheamicin)，尤其刺孢黴素γΐΐ及刺孢黴素 ω II)(例如參見 Agnew，C/zem /W/· £/7^7·， 33:183-186 (1994));達内黴素（dynemicin)，包括達内黴素 A ;埃斯培拉黴素（esperamicin);以及新製癌菌素發色團 (neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白稀二快類抗生 I28838.doc -69- 200840822

素發色團，阿克萊諾黴素（aclacinomysin)、放線菌素 (actinomycin)、奥瑟黴素（authramycin)、偶氮絲胺酸 (azaserine)、博萊黴素（bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin)、卡洛比星（carabicin)、洋紅黴素 (carminomycin)、嗜癌菌素（carzinophilin)、色黴素 (chromomycinis)、放線菌素 D(dactinomycin)、柔紅黴素、地托比星（detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基（oxo)-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®多柔比星（doxorubicin)(包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及脫氧多柔比星）、表柔比星（epirubicin)、依索比星 (esorubicin)、伊達比星（idarubicin)、麻西羅黴素 (marcellomycin)、絲裂黴素（諸如絲裂黴素C)、黴紛酸 (mycophenolic acid)、諾拉徽素（nogalamycin)、橄欖黴素 (olivomycin)、培洛黴素（peplomycin)、博替羅黴素 (potflromycin)、嗓 σ令黴素（puromycin)、奎拉黴素 (quelamycin)、羅多比星（rodorubicin)、鏈黑黴素 (streptonigrin)、鏈佐星（streptozocin)、殺結核菌素（tuber-cidin)、烏苯美司（ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)、佐柔比星（zorubicin);抗代謝物，諸如甲胺嗓呤及5 -氟尿1^密σ定 (5-FU);葉酸類似物，諸如迪諾特寧（denopterin)、甲胺蝶呤、蝶羅呤（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate);嗓呤.類似物，諸如氟達拉賓（fludarabine)、6-疏嘌呤、硫咪嘌呤 (thiamiprine)、硫鳥嗓呤（thioguanine) ; σ密咬類似物，諸如安西他濱（ancitabine)、阿紮胞普（azacitidine)、6-氮尿苦 -70- 128838.doc 200840822

(6-azauridine)、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苦 (cytarabine)、雙脫氧尿皆（dideoxyuridine)、去氧氟尿普 (doxifluridine)、依諾他濱（enocitabine)、氣尿苦（floxuri-dine);雄激素，諸如卡普睾酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧（mepitiostane)、睾内酷（testolactone);抗腎上腺劑，諸如胺魯米特（aminoglutethimide)、米托坦（mito-tane)、曲洛司坦（1：1^1〇81&116);葉酸補充劑，諸如亞葉酸 (frolinic acid);醋葡酸内酉旨（aceglatone);酸石舞ϋ胺糖苦 (aldophosphamide glycoside) ; ^ ^ ^ Si 1¾ St. (aminolevu-linic acid);乙炔尿σ密咬(eniluracil);安定（amsacrine); 貝曲布辛（bestrabucil);比生群（bisantrene);伊達曲仙 (edatraxate);德弗法明（defofamine);秋水仙胺（demecol-cine);地0Y 酿（diaziquone);伊弗尼辛（elfornithine);依利醋鈹（elliptinium acetate);艾普塞隆（epothilone);依託格魯（etoglucid);石肖酸鎵；經基脲；蘑益多糖（lentinan);洛尼達寧（lonidainine);類美登素（maytansinoids)，諸如美登素（maytansine)及安絲菌素（ansamitocin);米托脈腙 (mitoguazone)；米托蒽酉昆（mitoxantrone);莫 π比丹莫 (mopidanmol);尼曲伊寧（nitraerine);噴司他丁（pento-statin);蛋胺氮芥（phenamet) ; °比柔比星（pirarubicin);洛索蒽覼（losoxantrone) ; 2-乙基醯肼；丙卡巴肼（procarbazine); PSK ㊣多醣複合物（JHS Natural Products， Eugene， OR);雷佐生（razoxane);根瘤菌素（rhizoxin);西佐喃 128838.doc -71 - 200840822

(sizofiran);鍺螺胺（spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸 (tenuazonic acid)；三亞胺酉昆（triaziquone) ; 2,2f，2M-三氯三乙胺；單端孢黴稀（trichothecene)(尤其T-2毒素、費羅菌素 A(verracurin Α)、漆斑菌素A(roridin Α)及蛇形菌素 (anguidine));烏拉坦（urethan);長春地辛 (vindesine)(ELDISINE® 、FILDESIN®)；達卡巴嗪 (dacarbazine);甘露莫司汀（mannomustine);二漠甘露醇 (mitobronitol);二漠衛矛醇（mitolactol);派泊溴烧 (pipobroman); 瓜西托辛（gacytosine); 阿拉伯糖普 (arabinoside)(”Ara-C");嗔替娘；紫杉醇類（taxoids)，例如 TAXOL® 太平洋紫杉醇（paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton，N.J·)、ABRAXANETM不含聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor)、太平洋紫杉醇之白蛋白工程化奈米顆粒調酉己物（American Pharmaceutical Partners， Schaumberg, Illinois)及 TAXOTERE⑧多西他賽 (doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；氣萊布辛（chloranbucil);吉西他賓（gemcitabine)(GEMZAR®) ; 6-硫鳥嘌呤；魏嘌吟；甲胺嗓呤；鉑類似物，諸如順鉑 (cisplatin)及卡銘（carboplatin);長春驗（VELBAN®);翻；依託泊苦（etoposide)(VP-16);異環填醯胺（ifosfamide);米托蒽酉昆（mitoxantrone);長春新驗（ONCOVIN®);奥沙利始 (oxaliplatin)；甲酸四氫葉酸（leucovovin);長春瑞賓 (vinorelbine)(NAVELBINE®);諾凡特龍（novantrone);依達曲沙（edatrexate);道諾黴素（daunomycin);胺嗓呤 128838.doc -72- 200840822 (aminopterin);伊班膦酸鹽（ibandronate);拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氟曱基鳥胺酸（DMFO);類視色素，諸如視黃酸；卡西他賓（capecitabine)(XELODA®);上述任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及上述兩種或兩種以上之組合，諸如CHOP(環磷醯胺、多柔比星、長春新驗及潑尼龍（prednisolone)之組合療法的縮寫）及 FOLFOX(奥沙利鉑（ELOXATINtm)與5-FU及甲醯四氫葉酸組合之治療方案的縮寫）。其他化學治療劑包括可用作抗體藥物接合物之細胞毒性劑，諸如類美登素（例如，DM1) 及阿瑞他汀（例如，MMAE及MMAF)。 π化學治療劑”亦包括"抗激素劑”，其用於調節、降低、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素的作用且其常為全身性或整體治療之形式。其可為激素本身。實例包括抗雌激素劑及選擇性雌激素受體調節劑（SERM)，包括（例如）他莫昔芬（tamoxifen)(包括 NOLVADEX® 他莫昔芬）、EVISTA® 雷諾昔芬（raloxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)、4-經基他莫昔芬、曲沃昔芬（trioxifene)、克沃昔芬（keoxifene)、 LY117018、奥那司酮（onapri stone)及 FARES TON® 托瑞米芬（toremifene);抗孕酮劑；雌激素受體下調劑（ERD);用於抑制或關閉卵巢之藥劑，例如，黃體生成激素釋放激素 (LHRH)促效劑，諸如LUPRON®及ELIGARD®乙酸亮丙瑞林（leuprolide acetate)、乙酸戈舍瑞林（goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林（buserelin acetate)及曲皮瑞林（tripterelin); 其他抗雄激素劑，諸如氟他胺（flutamide)、尼魯胺 128838.doc -73- 200840822 (nilutamide)及比卡魯胺（bicalutamide);及抑制調節腎上腺中之雌激素產生之芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如4(5)-咪 17坐、胺魯米特（aminoglutethimide)、MEGASE®乙酸甲地孕酮（megestrol acetate) 、 AROMASIN® 依西美坦 (exemestane)、福美絲坦（formestanie)、法屈嗤 (fadrozole)、RIVISOR®伏羅嗤（vorozole)、FEMARA® 來曲口坐（letrozole)及 ARIMIDEX® 安美達錠（anastrozole)。此外，化學治療劑之此定義包括雙膦酸鹽，諸如氣屈膦酸鹽 (clodronate)(例如，BONEFOS® 或 OSTAC®)、 DIDROCAL® 依替膦酸鹽（etidronate) 、NE-58095 、 ZOMETA⑧唾來膦酸（zoledronic acid)/吐來膦酸鹽 (zoledronate)、FOSAMAX⑧阿佘膦酸鹽（alendronate)、 AREDIA® 帕米膦酸鹽（pamidronate)、SKELID® 替魯膦酸鹽（tiludronate)或 ACTONEL® 利塞膦酸鹽（risedronate);以及曲沙他濱（troxacitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞哺淀類似物）；反義寡核苷酸，尤其抑制涉及於異常細胞增殖之信號轉導路徑中之基因表現的彼等者，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體（EGF-R);疫苗，諸如 THERATOPE⑧疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN® 疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗及 VAXID®疫苗； LURTOTECAN㊣拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH ;拉帕替尼二甲苯石黃酸鹽（lapatinib ditosylate)(ErbB-2與EGFR之雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為 GW572016);及上述物質中之任一者的醫藥學上可接受之 128838.doc -74- 200840822 鹽、酸或衍生物。

”生長抑制劑"在用於本文時係指活體外或活體内抑制細胞（諸如，表現R〇bo4之細胞）生長及/或增殖之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯著降低在§期表現R〇b〇4之細胞百分比的抑制劑。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進程（處於S期外之位置）之抑制劑，諸如誘發G1停滯及 Μ期停滯之抑制劑。傳統“期阻斷劑包括長春花類（長春新鹼及長春鹼）、紫杉烷（taxane)，及π型拓撲異構酶抑制劑’諸如多柔比星、纟柔比星、柔紅黴素、依託泊苷及博萊黴素。彼等阻滯G1之藥劑亦外溢至s期停滞，例如dna 烷基化劑，諸如他莫昔芬、潑尼松、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶及ara_c。其他資訊可見於^ 跑^of Cancer，Mendelsohn 及 Israel 編，第 i 章，標題 ”Cell cycle regulation，〇nc〇genes， _ 她neOPlastie drugs，，，Murakami 等人（wb

Ph=delphia，1995)，尤其第13頁。紫杉烷（太平洋紫杉醇及夕烯糸杉醇）均為源自紫杉之抗癌藥物。源自歐洲紫杉之 f 烯紫杉醇（TAXOTERE®，Rhone_P〇ulenc R〇rer)為太平洋紫杉醇（TAXOL®，Bristol-Myers Squibb)之半合成類、物太平/羊紫杉醇及多稀紫杉醇促進由微管蛋白二聚體組裝微管且藉由防止解聚合來穩定微管，藉此導致細胞中有絲分裂之抑制。木比生”為蒽環徽I沉生京。多柔比星之化學全名為 (8S，）-l〇-[(3-胺基-2,3,6-三去氧_α心來蘇糖基_六派喃糖 128838.doc -75- 200840822 基）氧基卜^^-回氫-^⑴王經基^侦基乙醯基卜甲氧基-5,12-幷四苯二酮。 III.抗Robo4抗體在一怨樣中，本發明提供與尺〇13〇4結合之抗體。在一實鉍例中，抗Robo4抗體為單株抗體。在一實施例中，抗 R〇b〇4抗體為抗體片段，例如Fab、Fab，-SH、Fv、scFv或 (Fab h片段。在一實施例中，抗R〇b〇4抗體為嵌合抗體、人化杬體或人類抗體。在一實施例中，抗R〇b〇4抗體經純化。在本發明之另一態樣中，提供編碼抗Robo4抗體之聚核苦酸。在某些實施例中，提供包含編碼抗Robo4抗體之聚核夂的載體。在某些實施例中，提供包含該等載體之宿主細胞。在本發明之另-態樣中，提供包含抗Robo4抗體或編碼抗R〇b〇4抗體之聚核苷酸的組合物。在某些實施例中、、且σ物為用於治療包括以下疾病及病症之疾病及病症的西藥為配物·例如癌症、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新生血管性疾病、增生1±視、網膜病、糖尿病性視網膜病、年齡相目之黃斑變性 (AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎、牛皮癣及其組合。本。文提供且在以下實例中描述來源於噬菌體文庫之例示欧單株抗體°彼等抗體稱為YW71.6、YW71.1、 YW71’22、YW71.89、YW79.1、YW79.8及 YW79.11。彼等抗體、、工親和力成熟以產生YW71.22.S1.2、YW71.22S1.8、 128838.doc -76- 200840822 YW71.22S1.16 、 YW71.22S1.23 、 YW71.22S1.24 、 YW71.22S1.27 、 YW71.22S1.31 、 YW71.22S1.38 、 YW71.22SL77 、 YW71.22.S2.21 、 YW71.22.S2.79 、 YW71.22.H1.2 、 YW71.22.H1.9 、 YW71.22.H1.46 、 YW71.22，H1,77、YW71_22.H1.91 及 YW71.22.H2.31。抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域的序列闡述於圖1及2中。本發明之抗體可包含任何合適之人類或人類一致輕鏈構架序列，其限制條件為該抗體展示所需之生物學特徵（例 φ 如，所需結合親和力）。在一實施例中，本文中人類一致構架係來自或來源於 VH亞群111(參見圖4A及4B)及/或VLk亞群1(參見圖3A及3B) 一致構架序列。因此，VH受體人類構架可包含以下構架序列中之一、二、三或全部四者： FR1，其包含 evqlvesggglvqpggslrlscaas(seq ID NO:13)， • FR2，其包含WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:14)， FR3，其包含 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:15)， FR4，其包含 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)。在其他實施例中，VH—致構架包括：人類VH亞群I 一致構架1-4減去Kabat CDR(SEQ ID ΝΟ··111、112、113、16);

人類VH亞群I 一致構架1-4減去擴展高變區（SEQ ID 128838.doc -77- 200840822 NO:114、115、113、16或 SEQ ID NO:114、115、116、16 或 SEQ ID NO:114、115、117、16); 人類VH亞群II 一致構架1-4減去Rabat CDR(SEQ ID NO:118、119、120、16); 人類VH亞群II一致構架1-4減去擴展高變區（SEq id NO:121、122、120、16或 SEQ ID NO:121、122、123、16 或 SEQ ID NO: 121、122、124、16); 人類VH亞群III 一致構架1-4減去Kabat CDR(SEQ ID • NO:125、126、127、16);

人類VH亞群III 一致構架1-4減去擴展高變區（seQ ID NO:128、129、127、16或 SEQ ID NO:128、129、130、16 或 SEQ ID NO: 128、129、131、16); 人類 VH受體 1構架 1-4減去 Kabat CDR(SEQ ID NO:132、 126、133、16)；

人類VH受體1構架1-4減去擴展高變區（SEQ ID NO:128、129、133、16 或 SEQ ID NO:128、129、134、 ^ 16)；人類 VH受體 2構架 1-4減去 Kabat CDR(SEQ ID NO: 132、 126、135、16);或

人類VH受體2構架1-4減去擴展高變區（SEQ ID NO:128、126、13 5、16 或 SEQ ID NO:128、126、136、16 或 SEQ ID NO:128、126、137、16) 〇在一實施例中，VH受體人類構架區4(H-FR4)包含 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:45)。 12883B.doc -78 - 200840822 VL受體人類構架可包含以下構架序列中之一、二、三或四者： FR1，其包含 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:9)， FR2，其包含 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:10)，

FR3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 11) ^

FR4 ，其包含 FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:173)或 FGQGTKMEIKR(SEQ ID NO:139)。在其他實施例中，VL—致構架包括：人類 VLk 亞群 I 一致構架 1-4(SEQ ID NCh9、10、99、 100)；人類 VLk亞群 I一致構架 1-4(SEQ ID NO:9、101、99、 100)；人類 VLk 亞群 II 一致構架 1-4(SEQ ID NO:102、103、 104 、 100)；人類 VLk 亞群 III 一致構架 1-4(SEQ ID NO:105、106、 107、100)；或人類 VLk 亞群 IV— 致構架 1-4(SEQ ID NO:108、109、 110 、 100)。雖然受體序列可與無論選自人類免疫球蛋白抑或選自人類一致構架之人類構架序列一致，但本發明涵蓋受體序列可包含相對於人類免疫球蛋白序列或人類一致構架序列預先存在之胺基酸取代。此等預先存在之取代較佳為最少； 128838.doc -79- 200840822 通常相對於人類免疫球蛋白序列或一致構架序列僅四個、三個、兩個或一個胺基酸不同。將非人類抗體之高變區殘基併入¥1^及/或VH受體人類構木中。舉例而言，可併入對應KKabat CDR殘基、ch〇thia 回k %殘基、Abm殘基及/或接觸殘基之殘基。視情況，併入如下之擴展高變區殘基：24-34(Ll)、50-56(L2)及89- 97(L3)、26-35(Η1)、50-65 或 49-65(H2)及 93-102、94-102 或 95-1〇2(Η3)。雖然本文中討論高變區殘基之”併入”，但應瞭解此可以多種方式實現，例如可藉由使編碼小鼠可變域序列之核酸突變以使其構架殘基轉變為受體人類構架殘基，或藉由使編碼人類可變域序列之核酸突變以使高變域殘基轉變為非人類殘基，或藉由合成編碼所需序列之核酸等來產生編碼所需胺基酸序列之核酸。在本文之實例中，藉由使編碼人類受體序列之核酸進行 Kunkel突變誘發，對於各高變區使用單獨募核苷酸，從而產生移植尚變區之變異體。Kunkel等人，Mei/^办五 154:367-382 (1987)。使用常規技術可將適當變化引入構架及/或高變區内以修正及重建合適之高變區-抗原相互作用。 A·抗體片段本發明涵蓋抗體片段。抗體片段可藉由傳統方式（諸如’酶促消化）或藉由重組技術來產生。在某些情形下，使用抗體片段甚至比使用整個抗體具有優勢。片段之較/ 128838.doc -80 - 200840822 尺寸允許快速清除且可導致對實體腫瘤之接近的改良。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，（2003) #加· MW. 9:129-134 ° 已研發出多種用於產生抗體片段之技術。傳統上，經由蛋白水解消化完整抗體來獲得該等片段（例如參見等尺 ’ Journal of Biochemical and Biophysical 24:107-117(1992);及 Brennan 等人，Sc/eMce， 229:81 (1985))。然而，目前可藉由重組宿主細胞直接產生 ⑩ 該等片段。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可表現於大腸桿菌中且由大腸桿菌分泌，由此允許容易地產生大量該等片段。抗體片段可自上文所討論之抗體噬菌體文庫中分離。或者，Fab’-SH片段可自大腸桿菌中直接回收且經化學偶合以形成F(ab，）2片段（Carter等人，价10:163-167 (1992))。根據另一方法，F(ab，）2片段可自重組宿主細胞培養物中直接分離。在美國專利第5,869,046號中描述具 φ 有增加之活體内半衰期之包含補救受體結合抗原決定基殘基的Fab及F(ab，）2片段。其他用於產生抗體片段之技術對於一習此項技術者而言將為顯而易見的。在某些實施例中’抗體為單鏈Fv片段（scFv)。參見WO 93/16185 ;美國專利弟5,571，894號及第5,587,458號。Fv及scFv為具有完整組合位點之缺乏恆定區的僅有種類；因此，其可適於在活體内使用期間的減少之非特異性結合。可建構scFv融合蛋白以在scFv之胺基或羧基末端處產生效應蛋白之融合。參見办心e咖客，，見上。抗體片段 128838.doc -81 - 200840822 亦可為（例如）如美國專利第5,641，870號中所述之'線性抗體”。該等線性抗體可為單特異性或雙特異性抗體。 B·人化抗體本發明涵蓋人化抗體。用於使非人類抗體人化之各種方法在此項技術中係已知的。舉例而言，人化抗體可具有一或多個自非人類來源引入其中的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常被稱為”輸入”殘基，其通常係取自”輸入" 可變域。人化基本上可遵循winter及合作者之方法（J〇nes

等人（1986)為仏re 321:522-525 ; Riechmann 等人（1988) Nature 332:323_327 ; Verhoeyen 等人（1988) 239:1534-1536)，藉由用高變區序列取代人類抗體之相應序列來進行。因此，該等”人化”抗體為嵌合抗體（美國專利第4,816,5 67號），其中實質上小於完整人類可變域者已由來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人化抗體通常為其中某些高變區殘基及可能某些FR殘基經來自齧齒動物抗體之類似位點之殘基取代的人類抗體。待用於製備人化抗體之人類輕鏈及重鏈可變域的選擇對降低抗原性而言可為重要的。根據所謂，，最適"方法，針對整個已知之人類可變域序列文庫篩檢齧齒動物抗體之可變域序列。接著將與齧齒動物之序列最接近之人類序列視為人化抗體之人類構架。例如參見Sims等人（Μ%) 7 /麵膽l ·，Chothia 等人（1987) j 偏咖 196侧。另-方法使用來源於具有輕鏈或重鏈之特定亞群之所有人類抗體的-致序列之特定構架。同一構架可用 128838.doc -82 - 200840822 於若干不同人化抗體。例如參見Carter等人（1992)尸见 89:4285 ; Presta等人(1993) J. /mmwno/·，1 5 1:2623 〇此外一般需要抗體被人化，同時保留對抗原之高親和力及其他有利生物學性質。為實現此目標，根據一方法，藉由使用親本序列及人化序列之三維模型來分析親本序列及各種概念性人化產物的方法製備人化抗體。三維免疫球蛋白模型普遍可得且為熟習此項技術者所熟悉。可獲得繪示且呈現所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。此等呈現之檢驗允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中之可能作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合之能力的殘基。以此方式，可對FR殘基進行選擇，且使FR殘基自接受者序列與輸入序列加以組合，以便實現所需抗體特徵，諸如對標靶抗原增加之親和力。一般而言，高變區殘基直接且大部分實質上涉及對抗原結合之影響。在一些實施例中，本發明提供經人化以使得HAMA反應減少或消除之抗體。HAMA反應之減少或消除為合適治療劑之臨床研發的重要方面。例如參見Khaxzaeli等人，J. Natl. Ca/icer (1988)， 80:937 ; Jaffers 等人，

Transplantation (1986)， 41:572 ; Shawler 等人，J· (1985)，135:1530 ; Sears等人，J.召/<9厂 jRespo/ue Mod· (1984)，3:138 ; Miller等人，(1983)，62:988 ; Hakimi等人 ’ J. /mm關〇/· (1991)，147:1352 ; Reichmann等 A 5 Nature (1988)， 332:323 ; Junghans 等人，Cancer Res. 128838.doc • 83 - 200840822 (1990)，50:1495。可使用此項技術中已知之常規方法進一步獲得此等抗體之變異體，其中一些方法在下文中進一步描述。 7 舉例而言，來自如本文所述之抗體之胺基酸序列可充當使構架及/或高變序列多樣化之起始（親本）序列。起始高變序列所連接之所選構架序列在本文中稱為受體人類構架^ 雖然受體人類構架可來自或來源於人類免疫球蛋白（其及/或VH區），但較佳為受體人類構架係來自或來源於人類一致構架序列，此係因為已證明該等構架在人類患者中具有最低或不具有免疫原性。在受體來源於人類免疫球蛋白之情況下，視情況可藉由將供體構架序列與人類構架序列集中之多種人類構架序列對準來選擇人類構架序列，此係基於其與供體構架序列之同源性而選擇，且選擇最具同源性之構架序列作為受體。 C·人類抗體本叙明之人類抗體可藉由將選自人類來源之嗟菌體呈現文庫的Fv純系可變域序列與如上所述之已知人類恆定域序列組合來建構。或者，本發明之人類單株抗體可藉由融合瘤方法衣付。已例如精由Kozbor ·/· 133: 3001 (1984)，Brodeur 等人，⑽办如⑽ d 却，第 51-63 頁（Marcel Dekker，

Inc·，New York，1987);及 Boerner 等人，J. ， 147·· 86 (1991)描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜合骨髓瘤細胞株。 128838.doc -84- 200840822 現有可能產生在免疫後能夠在缺乏内源免疫球蛋白產生之情況下產生人類抗體之完整譜系的轉殖基因動物（例如小鼠）。舉例而言，已描述在嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈連接區（JH)基因的純合子缺失導致内源抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此等生殖系突變小鼠中將會在抗原挑釁後導致人類抗體之產生。例如參見 Jakobovits 等人，尸AMS 90: 2551 (1993) ; Jakobovits 等人，362: 255 (1993); • Bruggermann 等人，Fear /mm關〇厂，7: 3 3 (1993) 〇基因改組亦可用於自非人類（例如，齧齒動物）抗體獲得人類抗體，其中人類抗體具有與初始非人類抗體相似之親和力及特異性。根據此方法（亦稱為”抗原決定基印記 (epitope imprinting)”)，用人類V域基因譜系置換藉由如本文所述之噬菌體呈現技術獲得的非人類抗體片段之重鏈可變區或輕鏈可變區，從而產生非人類鏈/人類鏈scFv或Fab φ 肷合體群體。用抗原進行選擇導致非人類鏈/人類鏈嵌合 scFv或Fab之分離，其中人類鏈使在移除原代噬菌體呈現純系中之相應非人類鏈後受損的抗原結合位點恢復，亦即抗原決定基決定（印記）對人類鏈搭配物之選擇。當重複該過程以置換剩餘非人類鏈時，獲得人類抗體（參見1993年4 月1日公開之PCT WO 93/06213)。與傳統上藉由CDR移植來使非人類抗體人化不同，此技術提供不具有非人類來源之FR或CDR殘基的完全人類抗體。 D·抗體變異艘 128838.doc -85- 200840822 在些實施例中，涵蓋本文所述之抗體的胺基酸序列修牛例而δ ’可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物子性質。可藉由將適當變化引入編碼抗體之核苷酸序歹〗中或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括（例如）抗體之胺基酸序列内殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入與取代之任何組合以達成最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵。可在製備序列時將胺基酸變化引入個體之抗體胺基酸序列中。種適用於鑑別對於突變誘發而言較佳之位置的抗體之某些殘基或區域的方法稱為"丙胺酸掃描突變誘發，，，如藉由 Cunningham 及 Wells (1989) 244:1081-1085 所述。此處，鑑別殘基或標靶殘基群（例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lyS及glu)且以中性或帶負電胺基酸（例如，丙胺酸或聚丙胺酸）將其置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點處或針對取代位點引入另外或其他變異體來改進彼等對取代展現功能敏感性之胺基酸位置。因此，雖然預先確定用於引入胺基酸序列變化之位點，但突變自身之性質無需預先確定。舉例而言，為分析在給定位點處突變之效能，在標靶密碼子或區域處進行 ala掃描或隨機突變誘發，且篩檢所表現之免疫球蛋白之所需活性。胺基酸序列插入包括··胺基及/或羧基末端融合，其長度在自一個殘基至含有一百個或更多殘基的多肽之範圍内 128838.doc -86 - 200840822 變化；以及單個或多個胺基酸殘基之序列内插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括使抗體之N或C末端融合至酶（例如’對於ADEPT而言）或多肽，其增加抗體之血清半衰期。在某些實施例中，本發明之抗體經改變以增加或減少抗體糖基化之程度。多肽之糖基化作用通常為N-連接型或〇_ 連接型。N-連接型係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺酸殘基之侧鏈。三肽序列天冬醯胺酸絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸（其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸）為用於將碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此’此等三肽序列中任一者在多肽中之存在產生潛在糖基化位點。〇-連接型糖基化作用係指糖N_乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者連接至羥胺基酸，最常見為絲月女fee或蘇胺酸’但5 -經基脯胺酸或5 -經基離胺酸亦可使用。糖基化位點至抗體之添加或缺失係便利地藉由改變胺基酸序列從而產生或移除上述三肽序列中之一或多者來達成 (對於N-連接型糖基化位點）。改變亦可藉由一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基至初始抗體序列之添加、缺失或取代來進行（對於Ο-連接型糖基化位點）。可在抗體包含Fc區之情況下改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分枝雙天線寡醣’其一般藉由N鍵與Fc區之CH2域之Asn297連接。例 128838.doc -87 - 200840822 如參見Wright等人（1997) 7757Έ(^ί 15:26-32。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、Ν -乙醯基葡糖胺 (GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及與雙天線寡醣結構之 ”莖”中的GlcNAc連接之海藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良性質之抗體變異體。舉例而言，提供具有缺乏與抗體Fc區（直接或間接）連接之海藻糖之碳水化合物結構的抗體。此等變異體可具有改良之A D C C功能。例如參見美國專利公開案第U S 2003/0157108號（Presta，L·);第 US 2004/0093621 號（Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。與”去海藻糖基化"或π海藻糖缺乏π 之抗體變異體有關之公開案的實例包括：US 2003/0157108 ; WO 2000/61739 ； WO 2001/29246 ； US 2003/01 15614 ； US 2002/0164328 ； US 2004/0093621 ； US 2004/0132140 ； US 2004/0110704 ； US 2004/0110282 ； US 2004/0109865 ； WO 2003/085119 ； WO 2003/084570 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； WO 2005/053742 ； WO 2002/031140 ； Okazaki等人，《/. Mol· Biol. 336:1239-1249 (2004)； Yamane-Ohnuki ^ A ' Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。倉包夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括蛋白海藻糖基化缺乏之1^〇13(]110細胞（以|>]<^等人，^47^7^5/<^/^所. Biophys. 249:5 3 3 -545 ( 1 986);美國專利申請案第 US 2003/0157108 A1 號，Presta，L;及WO 2004/056312 A1， Adams等人，尤其實例11);及剔除細胞株，諸如α-1，6·海 128838.doc -88 - 200840822 藻糖基轉移酶基因、F 、剔除C Η Ο細胞（例如參見 Yamane-Ohnuki 等人，B/oied 87: 614 (2004)；

Kanda, Υ·等人，oeng·，94(4): 680-688 (2006);及 WO 2003/085107)。進一步提供具有對分募醣之抗體變異體，例如其中與抗體之Fc區連接之雙天線募醣藉由GlcNAc對分。該等抗體變異體可具有減少之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變異體之實例描述於（例如）WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人）；美國專利第 6,602,684 號（Umana 等人）；及118 2005/0123 546(!；11^仙等人）中。亦提供在與？〇區連接之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。該等抗體變異體可具有改良之CDC功能。該等抗體變異體描述於（例如）WO 1997/30087(Patel等人）；WO 1998/58964 (Raju，S·);及 WO 1999/22764(Raju，S·)中。在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個進一步改良ADCC之胺基酸取代的Fc區，例如在Fc區之位置298、 333及/或334(殘基之Eu編號）上的取代。該等取代可與上述變化中之任一者組合存在。

在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些但並非全部效應功能之抗體變異體，此使得該抗體變異體成為其中抗體在活體内之半衰期係重要而某些效應功能（諸如，補體及 ADCC)係無需或有害的許多應用之所需候選者。在某些實施例中，量測抗體之Fc活性以確保僅保持所需性質。可進行活體外及/或活體内細胞毒性檢定以證實CDC及/或ADCC 128838.doc -89- 200840822 活性之減少/耗損。舉例而言，可進行Fc受體（FcR)結合檢定以確保抗體缺乏FcYR結合能力（因此，可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞 (NK細胞）僅表現FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、FcyRII 及FcyRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet， Annu.及ev· /mm關〇/. 9:457-92 (1991)第 464 頁上之表 3 中0 評估相關分子之ADCC活性的活體外檢定之非限制實例描述於美國專利第5,500,362號（例如參見Hellstrom，I·等人， PAMS ί/Μ 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom，I等人，PAMS USA 82:1499-1502 (1985)；第 5,821，337 號（參見

Bruggemann，M.等人，/· Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)) 中。或者，可使用非放射性檢定方法（例如參見用於流式細胞儀之ACTITM非放射性細胞毒性檢定（CellTechnology， Inc. Mountain View，CA)及 CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢定（Promega，Madison，WI))。用於該等檢定之有用效應細胞包括外周企液單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC)及天然殺傷（NK)細胞。或者或另外，可在活體内，例如在動物模型（諸如Clynes等人，尸USA 95:652-656 (1998)中所揭示者）中評估相關分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合檢定以證實抗體不能結合Clq且因此缺乏CDC活性。為評估補體活化，可執行CDC檢定（例士口參見 Gazzano-Santoro 等人，义 Immunol· Methods 202:163 (1996) ; Cragg，M.S·等人，101:1045-1052 (2003);及 Cragg，M.S.及 M.J. Glennie，5/ood 103:2738- 128838.doc -90- 200840822 2743 (2004))。FcRn結合及活體内清除率/半衰期測定亦可使用此項技術中已知之方法來執行（例如參見Petkova，S.B. 等人，//??’/· /mm關〇/. 18(12):1759-1769 (2006)) 〇提供具有一或多個胺基酸取代之其他抗體變異體。雖然用於取代性突變誘發之相關位點包括高變區，但亦涵蓋FR 改變。保守取代顯示於表1中"較佳取代”之標題下。更多實質性變化（名為”例示性取代”)提供於表1中，或如下文關於胺基酸類別進一步描述。可將胺基酸取代引入相關抗體中且例如針對所需活性來篩檢產物，該等活性諸如改良之抗原結合、減少之免疫原性、改良之ADCC或CDC等。表1

初始殘基例示性取代較佳取代 Ala(A) Val ； Leu ； lie Val Arg(R) Lys ; Gin ; Asn Lys Asn(N) Gin ； His ； Asp ； Lys ； Arg Gin Asp(D) Glu ； Asn Glu Cys(C) Ser ； Ala Ser Gln(Q) Asn ； Glu Asn Glu(E) Asp ; Gin Asp Gly(G) Ala Ala His(H) Asn ; Gin ; Lys ; Arg Arg Ile(I) Leu ； Val ； Met ； Ala ； Phe ;正白胺酸 Leu Leu(L) 正白胺酸；lie ; Val ; Met ； Ala ； Phe lie Lys(K) Arg ； Gin ； Asn Arg 128838.doc -91 - 200840822

Met(M) Leu ； Phe ； He Leu Phe(F) Trp ； Leu ； Val ； He ； Ala ； Tyr Tyr Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val ； Ser Ser Trp(W) Tyr ； Phe Tyr Tyr(Y) Trp ； Phe ； Thr ； Ser Phe Val(V) lie ; Leu ; Met ; Phe ; Ala ;正白胺酸 Leu 對抗體生物學性質之修飾可藉由選擇影響（a)取代區之多肽主鏈結構（例如，呈片狀或螺旋構形）、（b)標靶位點處分子之電荷或疏水性或（c)側鏈堆積的取代來達成。可將胺基酸根據其側鏈性質之類似性來分類（A. L. Lehninger， Biochemistry，第 2版，第 73-75 頁，Worth Publishers，New York (1975))：

(1) 非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、 Phe(F)、Trp(W)、Met(M) (2) 不帶電之極性：Gly(G)、Sei*(S)、Thr(T)、Cys(C)、 Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q) (3) 酸性：Asp(D)、Glu(E) (4) 鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H) 或者，基於常見側鏈性質，可將天然存在之殘基分成以下各組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; 128838.doc -92· 200840822 (2) 中性親水性：CyS、Ser、Thr、Asn、Gin ; (3) 酸性：Asp、Glu ; (4) 鹼性：His、Lys、Arg ; (5) 衫響鍵取向之殘基：Gly、Pro ; (6) 芳族·· Trp、Tyr、Phe。非保守取代將會使此等種類中之一者之成員換成另一種類。該等經取代之殘基亦可引入保守取代位點或引入剩餘 (非保守）位點。一種類型之取代性變異體包含取代親本抗體（例如，人化或人類抗體）之一或多個高變區殘基。一般而言，為進一步研發而選擇之所得變異體相對於產生其之親本抗體而 a將具有經修改（例如，經改良）之生物學性質。一例示性取代丨生麦異體為親和力成熟抗體，其可使用基於嗟菌體呈現之親和力成熟技術來便利地產生。簡言之，使若干高變區位點（例如，6-7個位點）突變以在各位點產生所有可能之土 Ssl取代如此產生之抗體係作為融合至封裝於各絲狀噬菌體粒内之至少部分噬菌體鞘蛋白（例如，之基因 ΙΠ產物）而自絲狀噬菌體粒呈現。接著針對其生物活性（例如，結合親和力）篩檢噬菌體呈現之變異體。為鑑別適於修飾之候選高變區位點，可進行掃描突變誘發（例如，丙胺酸掃描）以鑑別顯著促成抗原結合之高變區殘基。或者或另外，分析抗原-抗體複合物之晶體結構可為有益的，以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。根據此項技術中已知之技術，包括本文詳細說明之彼等技術，此等接觸殘基及相 128838.doc -93- 200840822 鄰殘基為用於取代之候選者。―旦產生此等變異體，則使一系列變異體經受使用此項技術中已知之技術（包括本文料之彼等技術）進行之篩檢且可選擇在一或多個相關檢定中具有優良性質之抗體以用於進一步研發。猎由此項技術中已知之多種方法製備編碼抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子。此等方法包括（但不限於）自天然來源（在天然存在之胺基酸序列變異體之狀況下）分離或藉由使早期製備之抗體變異體或抗體之非變異型式發生寡核苷酸介導（或定點）之突變誘發、pCR突變誘發及盒式突變誘發而製備。可能需要在本發明之抗體之Fc區引入一或多個胺基酸修飾，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置（包括鉸鏈半胱胺酸之位置）處包含胺基酸修飾 (例如，取代）之人類Fc區序列（例如，人類IgG1、IgG2、 IgG3 或 IgG4 Fc 區）。根據此描述及此項技術之教示，涵蓋在一些實施例中，如與野生型對應抗體相比，例如在Fc區中，本發明之抗體可包含一或多個改變。但此等抗體仍將保持如與其野生型對應物相比實質上相同之治療效用所需的特徵。舉例而 3 ’據認為可在F c區中進行會導致改變（亦即，改良或減少）C1 q結合及/或補體依賴性細胞毒性（CDC)的某些改變， (例如）如W099/51642中所述。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan 及 Winter，322··738_40 (1988); 美國專利第5,648,2 60號；美國專利第5,6 24,82 1號；及 128838.doc -94- 200840822 WO 94/29351。WO 00/42072(Presta)及 WO 2004/056312 (Lowman)描述具有改良或減少之與fcr之結合的抗體變異體。此等專利公開案之内容以引用的方式明確併入本文中。亦參見Shields等人，丄价〇/. 9(2): 6591-6604 (2001)。具有增加之半衰期及改良之與新生pc受體 (FcRn)(其負責將母體IgG傳遞至胎兒）（Guyer等人，J. 1 17:587 (1976)及 Kim等人，J· /mm⑽24:249 (1994))之結合的抗體描述於1182005/0014934八1(出1^〇11等人）中。此等抗體包含其中具有一或多個取代之1^區，該 (等）取代改良Fc區與FcRn之結合。具有經改變之Fc區胺基酸序列及增加或減少之C1 q結合能力的多肽變異體描述於美國專利第6，194,551B1號、W099/51642中。彼等專利公開案之内容以引用的方式明確併入本文中。亦參見

Idusogie等人，J· /所所彻0/· 164: 4178-4184 (2000)。在另一態樣中，本發明提供在包含Fc區之Fc多肽之界面處包含修飾的抗體，其中該等修飾有助於及/或促進異二聚作用。此等修飾包含將隆凸引入第一 Fc多肽且將空腔引入弟一 Fc多肽’其中該隆凸係安置於該空腔中以便促進第一 Fc多肽與第二FC多肽之複合。產生具有此等修飾之抗體之方法在此項技術中為已知的，（例如）如美國專利第 5,731，168號中所述。在又另一態樣中，可能需要產生半胱胺酸工程化抗體，例如’’thioMAb”及，，thioFab，，，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在 128838.doc -95- 200840822 於抗體之可接近位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此安置於抗體之可接近位點處且可用以將抗體與其他部分（諸如，藥物部分或連接子-藥物部分）接合’如本文進一步描述。在某些實施例中，以下殘基中之任何一或多者可經半胱胺酸取代··輕鏈之V2〇5(Kabat編號），重鏈之A118(EU編號）；及重鏈fc區之S4〇〇(EU編號）。在一較佳實施例中，重鏈之All 8(EU編號）係經半胱胺酸取代。下文進一步詳細描述半胱胺酸工程化之 thioMab及 thioFab。 E·抗艘衍生物本發明之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且易得之其他非蛋白性部分。較佳地，適於將抗體衍生化之部分為水溶性聚合物。水溶性聚合物之隸制性實例包括 (但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、叛甲基纖料、葡聚糖 '聚乙烯醇、聚乙烯。比㈣酮、聚—π

-乳戊％、聚-1，3,6·三料、乙烯/順丁婦二酸酐共聚物、聚胺基酸（均聚物或無規共聚物）及葡聚糖或聚（正乙稀料聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙稀/氧化乙稀丘 :物、：乙氧基化多元醇(例如，甘油)、聚乙稀醇及其：合物。聚乙二醇丙醛可因其在有優勢。聚合物可具有任何製造中具鏈。與抗體連接之聚合物的數目二且：=或無支上之聚合物，則其可為相同或不同分+ 個以衍生化之聚合物之數目及/或類 ’“言，用於土於包括（但不限於）待 128838.doc •96- 200840822 改良抗體之特疋性質或功能、⑨體衍生物是否將用於所界疋條件下之療法等考慮因素來確定。在另一實施例中，提供可藉由曝露於輻射而選擇性加熱之抗體與非蛋白性部分的接合物。在一實施例中，非蛋白性部分為奈米碳管（Kam等人，尸见^ 1〇2: 1ΐ6〇〇_ιΐ6〇5 (2005))。輻射可為任何波長，且包括（但不限於）不傷害普通巧胞仁將非蛋白性部分加熱至殺死鄰近抗體-非蛋白性部分之細胞之溫度的波長。 IV·製備抗體之方法 Α·產生噬菌體衍生之抗體本發明之抗體可藉由如Lee等人，j· M〇1. Bi〇1. (2〇〇4)， 340(5):1073-93中揭示之噬菌體（粒）呈現技術來製備。噬菌體（粒）呈現允許產生大的蛋白變異體文庫，該等蛋白變異體可針對以高親和力與標靶分子結合之彼等序列而快速分類。編碼變異體多肽之核酸一般融合至編碼病毒鞘蛋白 (諸如，基因III蛋白或基因VIII蛋白）之核酸序列。已發展其中編碼蛋白或多肽之核酸序列融合至編碼一部分基因出蛋白之核酸序列的單價噬菌粒呈現系統。（Bass，s

Pr价㈣，8:309 (1990) ; Lowman 及 Wells，施咖U

Compamon ίο Mei/20心 h 五似少_/〇《;；，3:205 (1991))。在單價噬菌粒呈現系統中，基因融合以低程度表現且亦表現野生型基因III蛋白以便保留顆粒之傳染性。產生肽文庫且篩檢彼等文庫之方法已在許多專利中揭示（例如美國專利第 5,723,286號、美國專利第5,432,〇18號、美國專利第 128838.doc -97- 200840822 5’580’717 5虎、美_ #利帛5,427,908號及美目專利第 5,498,530號）。已用許多方式，包括藉由插入隨機DNA序列改變單個基因或藉由選殖相關基因家族來製備抗體或抗原結合多肽之文庫。用於使用噬菌體（粒）呈現來呈現抗體或抗原結合片 I又之方法已描述於美國專利第5,75〇,373號、第5,733,743 號、第 5,837,242號、第 5,969，1〇8號、帛 6，172，197號、第 5,580,717號及第5,658,727號中。接著針對具有所需特徵之 _ 抗體或抗原結合蛋白的表現來篩檢文庫。將所選胺基酸取代至模板核酸中之方法在此項技術中已完全建立，其中一些方法在本文中予以描述。舉例而言，可使用Kunkel方法來取代高變區殘基。例如參見等人，154:367-382 (1987)。寡核苷酸之序列包括一或多個經設計以用於待改變之高變區殘基之密碼子組。密碼子組為一組不同核普酸三聯體 • 序列’其用以編碼所需變異體胺基酸。可使用符號代表密碼子組以表示特定核苷酸或核苷酸之等莫耳混合物，如以下根據IUB碼所示。 IUB碼 G鳥嘌呤 A腺嘌呤 T胸腺嘧啶 C胞嘧啶 R(A 或 G) 128838.doc -98 - 200840822 Y(C 或 τ) Μ(Α 或 C) K(G或 Τ) S(C或 G) W(A 或 Τ) Η(Α或C或Τ) B(C或G或Τ) V(A或C或G) D(A 或 G 或 T)H N(A或C或G或Τ) 舉例而言，在密碼子組DVK中，D可為核苷酸a或G或 Τ，V可為A或G或C ;且κ可為G或T。此密碼子組可提供i 8 個不同密碼子且可編碼胺基酸Ala、τrp、Tyr、LyS、Thr、

Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly及 Cys。寡核苷酸或引子組可使用標準方法來合成。可例如藉由固相合成來合成含有代表由密碼子組所提供之核苷酸三聯體之所有可能組合且將編碼所需胺基酸組的序列之一組募核苷酸。在某些位置具有所選核苷酸"簡幷，，之寡核苷酸的合成在此項技術中熟知。具有某些密碼子組之該等核苦酸組可使用商業核酸合成儀（可購自（例如

Biosyw’ Foster City，CA)來合成或可購得（例如，購自 Life Technologies，RockvilJe，助）。因此，所合成之且有特定密碼子組之-組寡料酸通f將包括複數個具有: 序列之寡核苦酸’差異係由整個序列内密碼子組建立。如 128838.doc -99- 200840822 根據本ι明所使用 < 养核苦酸具有允許雜合至可變域核酸模板之序列且亦可包括限制酶位點以達成選殖之目的。在方法中，編碼變異體胺基酸之核酸序列可藉由寡核苷酸介導之突變誘發而產生。此技術在此項技術中熟知，如Zoller專人，#此/以七•心及以述簡σ之，編碼變異體胺基酸之核酸序列係藉由將編碼所需密碼子組之寡核苷酸組雜合至DNA模板而產生，其中杈板為單鏈形式之含有可變區核酸模板序列的質體。雜合修後，使用DNA聚合酶來合成模板之整個第二互補鍵，因此其將併入寡核苷酸引子且將含有如由寡核苷酸組所提供之密碼子組。一般而言，使用長度為至少25個核苷酸之寡核苷酸。最仫养核苷酸應具有12至1 5個核苷酸，該等核苷酸在編碼突變之核苷酸每一側上與模板完全互補。藉此確保募核苷酸適當雜合至單鏈DNA模板分子。使用此項技術中已知之技 φ 術（諸如，Crea等人，户兄t/以，75:5765 (1978)所述之技術）易於合成募核苷酸。藉由來源於噬菌體M13載體（市售M13mpl8及M13mpl9 載體為合適的）之彼等載體或如viera等人，五Rymo/·，153··3 (1987)所述之含有單鏈噬菌體複製起點之彼等載體來產生DNA模板。因此，待突變之Βνα可插入此等載體中之一者中以產生單鏈模板。單鏈模板之產生描述於以上Sambrook等人之4·21-4·41部分中。為改變天然DNA序列，在合適之雜合條件下將寡核苦酸 128838.doc -100· 200840822 雜合至單鏈模板。接著添加DNA聚合酶（通常為T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I之Klenow片段）以使用寡核苷酸作為合成引子來合成模板之互補鏈。因此形成異型雙鏈分子，使得DNA中之一鏈編碼基因1之突變形式，且另一鏈（起始模板）編碼基因1之天然未改變序列。接著將此異型雙鏈分子轉型至合適宿主細胞中，通常為諸如大腸桿菌JM101之原核生物。在細胞生長後，將其塗於瓊脂糖盤上且使用經 32-磷酸鹽放射性標記之寡核苷酸引子來篩檢以鑑別含有突變DNA之菌落。之前數段所述之方法可經修改以產生其中質體之兩鏈均含有突變之同質雙鏈分子。修改如下：將單鏈寡核苷酸黏接至如上所述之單鏈模板。將三個脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖腺皆（deoxyriboadenosine，dATP)、脫氧核糖鳥苦 (deoxyribo guano sine 9 dGTP)及脫氧核糖胸苷 (deoxyribothymidine，dTT)之混合物與經修飾之石荒脫氧核糖胞 p密咬（thiodeoxyribocytosine，稱為dCTP-(aS)，其可自 Amer sham獲得）組合。將此混合物添加至模板-寡核苷酸複合物中。在將DNA聚合酶添加至此混合物中後，產生除突變鹼基外與模板一致之DNA鏈。此外，DNA之此新鏈將含有dCTP-(aS)而非dCTP，dCTP-(aS)用以保護DNA之此新鏈免於限制性核酸内切酶消化。在雙鏈異型雙鏈體之模板鏈經適當限制酶切口後，可經由含有待誘發突變之位點的區域將模板鏈用ΕχοΙΙΙ核酸酶或另一適當核酸酶消化。接著停止反應以留下僅部分單鏈之分子。接著在所有四個脫氧 128838.doc -101 - 200840822

核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate)、ATP 及DNA連接酶存在下使用DNA聚合酶形成完全雙鏈£^八同質雙鏈體。接著可將此同質雙鏈分子轉換至合適宿主細胞中。如先前所指示，募核苷酸組之序列具有足夠長度以雜合至模板核酸且亦可（但未必）含有限制性位點。藉由來源於嗟菌體M13載體之彼等載體或如viera等人，施汍心zymo/·，153:3 (1987)所述之含有單鏈噬菌體複製起點之籲載體來產生DNA模板。因此，待突變之DNA必須插入此等載體中之一者中以產生單鏈模板。單鏈模板之產生描述於同上之Sambrook等人之4.21-4.41部分中。根據另一方法，可藉由提供上游及下游募核苷酸組來產生文庫，各組具有複數個具有不同序列之寡核苷酸，不同序列係由寡核苷酸序列内所提供之密碼子組建立。上游及下游寡核苷酸組以及可變域模板核酸序列可用於聚合酶鏈馨式反應以產生PCR產物之”文庫”。PCR產物可稱為"核酸盒，，，此係因為使用已建立之分子生物學技術可將其與其他相關或不相關核酸序列（例如，病毒鞘蛋白及二聚化域）融合。 PCR引子之序列包括一或多個經設計以用於高變區中溶劑可接近且高度多樣化之位置的密碼子組。如上所述，密碼子組為一組不同核苷酸三聯體序列，其用以編碼所需變異體胺基酸。使用標準重組技術可將符合所需標準之如經由適當筛檢/ 選擇步驟所選擇之抗體選擇物（selectant)分離且選殖。 128838.doc -102- 200840822 在一態樣中，藉由保持特定位置之胺基酸恆定且變化其他位置之胺基酸來改變HVR-H1、HVR_H2、HVR-H3序列。在一悲樣中，本發明提供一種包含以下序列中之至少一者、至少兩者或全部三者之抗體： (Ο 包含序列SEQ ID ΝΟ:1之HVR-L1序列； (η)包含序列SEQIDNO:2之HVR-L2序列； (ni)包含序列SEQIDNO:3之HVR-L3序列。胺基酸序列SEQ ID NO: 1、2及3係如圖1A(分別為位置 24-34、50-56 及 89-97)及 2A(分別為位置 24-34、50-56 及 89- 97)中所指示，關於個別HVR(亦即，L1、LwL3)編號，編號與如下所述之Kabat編號系統一致。在一態樣中，本發明提供一種包含以下序列中之至少一者、至少兩者或全部三者之抗體： ⑴ 包含序列SEQ ID NO:4之HVR-H1序列； (η)包含序列SEQ ID ΝΟ:5之HVR-H2序列； (in)包含序列SEQIDNO:6之HVR-H3序列。胺基酸序列SEQ ID NO:4、5及6係如圖1B(分別為位置 26-3 5、49-65 及 93-102)及 2B(分別為位置 26-35、49-65 及 93-102)中所指示，關於個別HVR(亦即，HI、H2或H3)來編號’編號與如下所述之1^讣以編號系統一致。在一態樣中，本發明提供包含如圖〗八及2A所繪示之輕鏈HVR序列的抗體。在一態樣中，本發明提供包含如圖⑶及2B所繪示之重 128838.doc 200840822 鏈HVR序列的抗體。本發明之抗體之一些實施例包含如以下SEQ ID NO:98中所繪示之人化4D5抗體（huMAb4D5-8)(HERCEPTIN⑧抗 HER2 抗體，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA， USA)(亦於美國專利第6,407,213號及Lee等人，J· Mol. Biol· (2004)，340(5): 1073-93中提及）之輕鏈可變域。 1 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Are Ala Ser • Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser

Phe Leu Tvr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His

Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val

Glu lie Lys 107 (SEQ ID NO: 98)(HVR殘基加下劃線）在一實施例中，在位置30、66及9 1(分別如以上以粗體/ ^ 斜體指示之Asn、Arg及His)中之一或多個位置上修飾 huMAb4D5-8輕鏈可變域序歹4。在一實施例中，經修飾之 huMAb4D5-8序歹丨J包含位置30上之Ser、位置66上之Gly及/ 或位置91上之Ser。因此，在一實施例中，本發明之抗體包含：包含以下SEQ ID NO: 167中所繪示之序列的輕鏈可變域：， 1 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 128838.doc -104- 200840822

Gin Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser

Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu

Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser

Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val

Glu lie Lys 107 (SEQ ID NO:167)(HVR殘基加下劃線）關於huMAb4D5-8之取代殘基在上文以粗體/斜體指示。本發明之抗體可包含任何合適之構架可變域序列，其限制條件為相對於本文所揭示之本發明抗體，與R〇bo4之結合活性實質上保留（諸如）至少1%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%或更大結合活性。舉例而言，在一些實施例中，本發明之抗體包含人類亞群III重鏈構架一致序列。在此等抗體之一實施例中，構架一致序列包含位置71、73及/或78上之取代。在此等抗體之一些實施例中，位置71為A，73為T及/或78為A。在一實施例中，此等抗體包含huMAb4D5-8(HERCEPTIN®，Genentech， Inc.，South San Francisco，CA，USA)(亦於美國專利第 6,407,213 號及第 5,821，337 號及 Lee 等人，《/. Mol. Biol. 340(5):1073-93 (2004)中提及）之重鏈可變域構架序列。在一實施例中，此等抗體進一步包含人類κΐ輕鏈構架一致序列。在一實施例中，此等抗體包含如美國專利第6,407,213 號及第5,821，337號中所述之huMAb4D5-8之輕鏈HVR序 128838.doc -105· 200840822 列。在一實施例中，此等抗體包含huMAb4D5-8(SEQ ID NO: 98 或 167)(HERCEPTIN ⑧抗 HER2 抗體，Genentech，Inc·， South San Francisco，CA，USA)(亦於美國專利第 6,407,213 號及第 5,821，337號及 Lee等人，J. Mo/.价〇/. 340(5):1073-93 (2004)中提及）之輕鏈可變域序列。

在一實施例中，本發明之抗體可包含如下所提供之 huMAb4D5-8輕鏈及重鏈之構架區序列（SEQ ID NO:9、 10、168、12(輕鏈）及 SEQ ID NO:13、14、15、16(重鏈））。上標/粗體之數字指示根據Kabat之胺基酸位置。 huMAb4D5-8輕鏈之構架序列 LC-FR1 JAsp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys23 (SEQ ID NO:9) LC-FR2 35Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr49 (SEQ ID NO:10) LC-FR3 57Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys88 (SEQ ID NO:168) LC-FR4 98Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys107 (SEQ ID NO:12) huMAb4D5_8重鏈之構架序列 HC-FR1 JGlu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser25 (SEQ ID NO:13) HC-FR2 36Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val48 (SEQ ID NO:14) HC-FR3 66Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn82a Ser82b Leu82c Arg83 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys92 128838.doc -106- 200840822 (SEQ ID NO:15) HC-FR4 103Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser113 (SEQ ID NO:16) 在一實施例中，本發明之抗體可包含如下所提供之 huMAb4D5-8輕鏈及重鏈之修飾/變異構架區序列（SEQ ID NO:9、10、11、12(輕鏈）及 SEQ ID NO:13、14、15、 16(重鏈））。上標/粗體之數字指示根據Kabat之胺基酸位置。在位置66(加下劃線）上修飾之huMAb4I>5-8輕鏈之構架序列 LC-FR1 LC-FR2 LC-FR3 LC-FR4

!Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr

Cys23 (SEQ ID NO:9) 35Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr49 (SEQ ID NO:10) 57Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu

Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys88 (SEQ ID NO:ll) 98Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys107 (SEQ ID NO:12) 在位置71、73及78(加下劃線）上修飾之huMAb4D5-8重鏈之構架序列 HC-FR1 ^lu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser2s (SEQ ID NO:13) HC-FR2 36Irp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val48 (SEQ ID NO: 14) HC-FR3 66Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

Leu Gin Met Asn82a Ser82b Leu82c Arg83 Ala Glu Asp Thr Ala 128838.doc -107- 200840822

Val lyr lyr Cys92 (SEQ ID NO: 15)

HC-FR4 103Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser113 (SEQ ID NO: 16) 在一實施例中，使本發明之抗體親和力成熟以獲得所需之標靶結合親和力。在一實例中，本發明之親和力成熟抗體包含在如下輕鏈之胺基酸位置上的取代。在一實施例中，變異HVR-L1 Al-ll(Kabat位置24-34)為在以下位置之任何組合中具有1、2、3、4或5個取代之RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:l) : A6(G)、A7(A)、A8(R 或 I)、A9(S 或 Y)及 φ A10(L)。在一實施例中，變異HVR-L2 Bl-B7(Kabat位置 50-56)為在以下位置之任何組合中具有1、2、3、4或5個取代之 SASFLYS(SEQ ID NO:2) : B3(T)、B4(L、N 或 T)、 B5(E或A)、B6(A或S)及B7(Y或缺失）。在一實施例中，變異HVR-L3 Cl-9(Kabat位置89-97)為在以下位置之任何組合中具有1、2、3、4、5或6個取代之(5(^丫丁丁？？丁（8£(^10 NO:3) : C3(P、T、F 或 G)、C4(F、R或 N)、C5(A、S、D、 F、Η、N、V 或 G)、C6(A、D、N、L、I、Μ、Y 或 G)、 ’ C7(L、Η或 Τ)及 C8(A、Μ、F 或 S)。在一實施例中，本發明之親和力成熟抗體的抗體包含在如下重鏈之胺基酸位置上的取代。在一實施例中，變異 11¥11-111〇1-〇10(^^5&1位置26-3 5)為在以下位置之任何組合中具有1、2、3、4或5個取代之GFTINGYYIH(SEQ ID NO:17) : D3(S)、D4(L)、D5(Y、D 或 K)、D9(F、L 或 N)及 D10(E 或 Q)。在一實施例中，變異 HVR-H2 El-E18(Kabat 位置49-65)為在以下位置之任何組合中具有1、2、3、4或5 128838.doc -108- 200840822 個取代之 GFIYPAGGDTDYADSVKG(SEQ ID NO:18)： E2(R)、E5(S)、E7(L)、E9(H、K、A 或 V)及 E11(A、E 或 I)。在一實施例中，HVR-H3Fl-F18(Kabat位置 93-102)為 ARLIGNKFGWSSYG*MDY(SEQ ID ΝΟ··19)，其中胺基酸序列中之表明位置F15(Kabat位置100)上之缺失。在一實施例中，本發明之親和力成熟抗體包含圖2 A中所繪示之1、2或3個HVR(L1、L2及/或L3)。在一實施例中，本發明之親和力成熟抗體包含圖2B中所繪示之1、2或3個 HVR(H1、H2及/或H3)。在一實施例中，本發明之親和力成熟抗體包含選自圖2 A及2B中所繪示之HVR之1、2、3、 4、5或所有6個HVR。在一實施例中，本發明之親和力成熟抗體包含圖2 A中所繪示之序列中之任一者的輕鏈可變區序列。在一實施例中，本發明之親和力成熟抗體包含圖2B中所繪示之序列中之任一者的重鏈可變區序列。在一實施例中，本發明之親和力成熟抗體包含圖2 A中所示之輕鏈可變區序列（包含構架序列及HVR序列）及圖2B中所示之相應抗體的重鏈可變區序列（包含構架序列及HVR 序列）。在一態樣中，本發明提供一種與以上提及之抗體中之任一者競爭與Robo4之結合的抗體。在一態樣中，本發明提供一種結合與以上提及之抗體中之任一者所結合之Robo4 上抗原決定基相同的抗原決定基之抗體。 B·基於融合瘤之方法 128838.doc -109- 200840822 本發明之早株抗體亦可使用由Kohler等人，iVaii/re, 256:495 (1 975)首先描述且關於人類-人類融合瘤在（例如)Hongo 等人，Hybridoma, 14 (3)： 253-260 (1 995)， Harlow# A ^ Antibodies: A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2版，1 988)； Hammerling等人，Antibodies and T-Cell

563-681 (Elsevier，Ν·Υ·，1981)及 Ni，Zz·㈣daz· 26(4):265-268 (2006)中進一步描述之融合瘤方法來製備。其他方法包括（例如）美國專利第7，189,826號中關於自融合瘤細胞株產生單株人類天然IgM抗體所述之方法。人類融合瘤技術（Tr i 〇 m a技術）描述於Vo 11 m e r s及 Bran die in, Histology and His topathology ^ 20(3):927-937

(2005)及 Vollmers及 Brandlein，Mei/zoA ㈣d 山M

Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)中。其他融合瘤技術例如參見us 2006/258841 ; US 2006/1 83 887(完全人類抗體）；US 2006/059575; US 2005/287149 ; US 2005/100546 ; US 2005/026229 ;及美國專利第7,078,492號及第7，153,507號。 C·載體、宿主細胞及重組方法抗體亦可使用重組方法產生。為重組產生抗R〇b〇4抗體’將編碼抗體之核酸分離且插入可複製載體中以供進一步選殖（DNA擴增）或供表現用。編碼抗體之DNA可易於分離且使用習知程序（例如，藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針）定序。多種 128838.doc -110- 200840822 载體均可用。載體組份—般包括(但不限於)以下各物中之 -或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。 " 1·信號序列組份本發明之抗體不僅可直接重組產生，而且亦可作為與異原夕肽之融口夕肽產生，該異源多肽較佳為信號序列或在成熟蛋白或多肽之N末端具有特定分裂位點之其他多狀。力選擇之異源信號序列較佳為經宿主細胞識別且加工（亦 • #，、由信號肽酶分裂）之信號序列。對於並未識別且加工天J抗體4泷序列之原核宿主細胞而言，信號序列經（例如）¾自由下列各物組成之群之原核信號序列取代：鹼性填酸酶^黴素酶咖細⑴㈣…㈣或熱穩定性腸毒打前導序列。對於酵母分泌而言，天然信號序列可經（例如）酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列（包括酵母 (心及刻魯維拉菌（尺/—⑽因子前導 • 序列）或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌（C. 似）葡糖澱粉酶前導序列或WO 90/13646中所述之信號序列取代。在哺礼動物細胞表現中，哺乳動物信號序列以及病毒 /刀泌則導序列（例如，單純性疱疹gD信號序列）係可用的。 2·複製起點表現及選殖载體均含有使載體能夠在一或多個所選宿主、、、田胞中複‘的核酸序列。一般而言，在選殖載體中，此序列為使載體能夠獨立於宿主染色體DN a而複製之序列且包括複製起點或自主複製序列。熟知多種細菌、酵母及病毒 128838.doc -111 - 200840822 之該等序列。來自質體冲们^之複製起點適於大部分革蘭氏陰性細囷（Gram-negative bacteria)，2μ質體起點、高於酵母，且各種病毒起點（SV4〇、多瘤病毒、腺病毒、或BPV)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。一般而言，哺礼動物表現載體無需複製起點組份（僅因SV4〇起點含有早期啟動子，故通常可僅使用該起點）。 3·選擇基因組份表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選擇標記籲⑯。典型選擇基因編碼具有下列作用之蛋白··⑷賦予對抗生素或其他毒素（例如，胺苄西林（ampicilHn)、新黴素 (neomycin)、甲胺喋呤或四環素…加巧…以））之抗性；（匕）補充呂養缺型不^，或⑷供應自複合培養基不可得之關鍵營養物，例如對芽孢桿菌（5以川〇而言編碼D—丙胺酸消旋酶之基因。選擇方案之-實例利用藥物來阻滯宿主細胞之生長。經籲-源基口成功轉型之彼等細胞產生賦予藥物抗性之蛋白且口此在I歷造擇方案之後存活。此顯性選擇之實例使用藥物新儒i[素、徵般酿〃微物酉夂（mycophenolic acid)及濕黴素 (hygromycin) ° 哺乳動物細胞之合適可、登禮^ i心口週可選擇標記物的另一實例為可實現鑑別能夠吸收編碼抗濟 ’机體之核酸之細胞的彼等者，諸如 DHFR、麩醯胺酸合成_

风崎（GS)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I 及-II(較佳為靈長類動你么鹿、物金屬&蛋白基因）、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。 128838.doc -112- 200840822 舉例而言，藉由在含有曱胺喋呤（Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑）之培養基中培養轉型物來鑑別經DHFR基因轉型之細胞。在此等條件下，DHFR基因與任何其他共轉型之核酸一起得以擴增。可使用缺乏内源DHFR活性之中國倉鼠卵巢（CHO)細胞株（例如，ATCCCRL-9096)。或者，藉由在含有L-甲硫胺酸磺基肟（Msx)(GS之抑制劑）之培養基中培養轉型物來鑑別經GS基因轉型之細胞。在此等條件下，GS基因與任何其他共轉型之核酸一起得以擴增。GS選擇/擴增系統可與上述DHFR選擇/擴增系統組合使用。或者，可藉由在含有作為可選擇標記物（諸如胺基糖苷抗生素，例如康黴素（kanamycin)、新黴素或G4 1 8)之選擇劑的培養基中進行細胞增殖來選擇經編碼相關抗體之DN A 序列、野生型DHFR基因及另一可選擇標記物（諸如，胺基糖苷3’-磷酸轉移酶（ΑΡΗ))轉型或共轉型之宿主細胞（尤其含有内源DHFR之野生型宿主）。參見美國專利第4,965,199 號。

用於酵母之合適選擇基因為存在於酵母質體YRp7中之 irpl 基因（Stinchcomb 等人，，282:39 (1979))。irpl 基因為缺乏在色胺酸中生長之能力的酵母突變株（例如， ATCC第44076號或PEP4-1)提供選擇標記物。Jones， Geneiics，85 :12 (1977)。接著酵母宿主細胞基因組中irp 1 損害之存在為偵測藉由在缺乏色胺酸之情況下生長的轉型作用提供有效環境。類似地，缺乏之酵母菌株（ATCC 128838.doc -113 - 200840822 20,622或3 8,626)由已知之帶有Zez/2基因之質體補充。此外，來源於1·6 μιη圓形質體pKD1之載體可用於刻魯維拉菌酵母之轉型。或者，已針對乳酸刻克魯維酵母（见化以⑷報導用於大規模產生重組小牛凝乳酶之表現系統。

Van den Berg, 8:135 (1990)。亦已揭示用於藉由刻魯維拉菌之工業菌株分泌成熟重組人類血清白蛋白的穩定多副本表現載體。Fleer等人，扪〇/：rec/m〇/〇a， 9:968-975 (1991)。 4·啟動子組份表現及選殖載體一般含有為宿主生物體所識別且可操作地連接至編碼抗體之核酸之啟動子。適用於原核宿主之啟動子包括一d啟動子、β-内醯胺酶及乳糖啟動子系統、驗性鱗酸酶啟動子、色胺酸（trp)啟動子系統及雜合啟動子，諸如tac啟動子。然而，其他已知之細菌啟動子為合適的。用於細菌系統之啟動子亦含有可操作地連接至編碼抗體之 DNA的 Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因均具有定位於轉錄起始位點上游約25至30個驗基處之AT富集區。在許多基因轉錄起始處上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大部分真核基因之3’末端處為A ATA A A序列，其可為用於將聚腺苴_酸尾（poly A tail)添加至編碼序列之:T末端的信號。所有此等序列均適於插入真核表現載體中。用於酵母宿主之合適啟動子序列之實例包括3 -碟酸甘油 128838.doc -114- 200840822 酸激酶或其他糖解酶（諸如，稀醇化酶、甘油醛磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖_6_ 鱗酸異構酶、3-磷酸甘油酸變旋酶、丙酮酸激酶、鱗酸丙糖異構酶、填酸葡糖異構酶及葡萄糖激酶）之啟動子。其他酵母啟動子（其為具有由生長條件控制之轉錄的其他優勢之誘導性啟動子）為醇脫氫酶2、異細胞色素 C(iS〇Cytochr〇me C)、酸性磷酸酶、與氮代謝有關之降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及負責麥芽糖及半馨乳糖利用之酶的啟動子區。用於酵母表現之合適載體及啟動子進一步描述於EP 73,657中。酵母增強子亦有利地與酵母啟動子一起使用。抗體自哺乳動物宿主細胞中載體之轉錄可（例如）由自病毒（諸如，多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（諸如，腺病毒 2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨化病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒、猿病|4〇(SV4〇))之基因組或自異鲁源哺乳動物啟動子（例如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子）、自熱休克啟動子獲得之啟動子所控制，其限制條件為此等啟動子與宿主細胞系統相容。 SV40病毒之早期及晚期啟動子係作為亦含有sv4〇病毒複製起點之SV40限制性片段而便利地獲得。人類細胞巨化病毒之即刻早期啟動子係作為HindIII e限制性片段而便利地獲仔。在哺乳動物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體來表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修改描述於美國專利第4,6〇1，978號中。關於人類卜干 128838.doc -115- 200840822 擾素cDNA在小鼠細胞中在來自單純性癌瘡病毒之胸苦激酶啟動子控制下之表現，亦參見Reyes等人，⑽^ 297:598·6()1⑽2)。或者，勞斯肉瘤病毒長末端重複序列 (Rous Sarcoma Virus long terminal repea〇可用作啟動子。 5·增強子元件組份由同級真核細胞轉錄編碼本發明之抗體的DNA通常係藉由將增強子序列插入載體中來增強。目前已知許多增強子序列來自哺乳動物基因（血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素）。然而，通常將使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括在複製起點之晚期側的SV4〇增強子（bp 100-270)、細胞巨化病毒早期啟動子增強子、複製起點之晚期侧的多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。關於活化真核啟動子之增強元件，亦參見Yani'Wa仏m 297:17_ 18 (1982)。雖然可將增強子在編碼抗體之序列之位置5，或 3’處剪接至載體中，但較佳定位於啟動子之5,位點。 6·轉錄終止組份用於真核宿主細胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞生物體之有核細胞）之表現載體亦含有終止轉錄且穩定mRNA所必需之序列。該等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5,且偶爾自3,之未經轉譯區獲得。此等區含有在編碼抗體之mRNA之未經轉譯部分中轉錄為聚腺嘌呤化片段的核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組份為牛生長激素聚腺嘌呤化區。參見WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。 128838.doc -116- 200840822 7·宿主細胞之選擇及轉型適用於在本文之載體中選殖或表現DNA之宿主細胞為上述之原核生物、酵母或高級真核生物細胞。達成此目的之合適原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或格蘭氏陽性 (Gram-P〇sitive)生物體，例如腸内菌科，諸如埃希氏菌 (仏(例如，大腸桿菌）、腸桿菌、歐文菌（五〜/—)、克雷伯氏菌☆心）、變形菌 (Prwe、沙門氏菌（以/則加…奴例如，鼠傷寒沙門菌 _ Μ⑽以卿η’麵））、沙雷氏菌如)（例如，黏

質沙雷菌mwmca似））及志贺菌（iS72/ge//a)，以及芽孢桿菌（諸如，枯草芽孢桿菌（反川⑷及益生芽孢桿 fe (反(例如’ 1989年4月12曰公開之DD 266,710中揭示之益生芽孢桿菌41p))、假單胞菌㈣s)(諸如，綠膿桿菌（p此广叹以似“））及鏈黴菌。一種較佳大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌 _ 294(ATCC 31，446)，但諸如大腸桿菌B、大腸桿菌Xl776 (ATCC 31，537)及大腸桿菌 W311〇(ATCC 27,325)之其他菌株係合適的。此等實例為說明性而非限制性的。尤其當糖基化及Fc效應功能不需要時，諸如當治療抗體與自身顯示腫瘤細胞破壞效力之細胞毒性劑（例如，毒素）接合時，可在細菌中產生全長抗體、抗體融合蛋白及抗體片段。全長抗體在循環中具有更大半衰期。在大腸桿菌中產生更快且更具成本效率。關於細菌中抗體片段及多肽之表現，例如參見 U.S· 5,648,237(Carter 等人）、u.s. 128838.doc -117- 200840822 5,789，199(Joly 等人）、U.S· 5,840,523(Simmons 等人），其描述用於使表現及分泌最佳化的轉譯起始區（TIR)及信號序列。亦參見 Charlton，Afei/zo心价〇/〇幻/，第 248

卷（B.K.C· Lo編，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第 245-254頁，其描述大腸桿菌中抗體片段之表現。表現後，可將抗體自可溶部分中之大腸桿菌細胞漿狀物中分離且可經由（例如）蛋白A或G管柱（視同型而定）純化。最終純化可類似於用於純化在（例如）CHO細胞中表現之抗體的方法來進行。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為編碼抗體之載體的合適選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中，釀酒酵母cerevzWae)或常見麵包酵母（baker’s yeast)為最常用。然而，大量其他種類、物種及菌株在本文中通常為可用且有用的，諸如粟酒裂殖酵母 ;刻魯維拉菌宿主，諸如乳酸刻克魯維酵母、脆壁刻魯維酵母（见介叹/…）(ATCC 12,424)、保加利亞刻魯維酵母（^. bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏刻魯維酵母（尺.wickeramii)(ATCC 24?178)^ 刻魯雄酵母菌（见wa/出)(ATCC 56,500)、果蠅刻魯維酵母 (K, drosophilarum)(ATCC 3 6,906)、耐熱刻魯維酵母（[ i/zermoio/era似)及馬克斯刻魯維酵母（见;耶氏酵母（3；arr0wia)(EP 402,226);甲醇酵母(Pichia pastoris)(EF 183，070);念珠菌（C⑽心心）；裏氏木黴 (Trichoderma reesia)(EF 244,234);粗链脈孢菌 128838.doc -118- 200840822 crraua);許旺酵母’ 諸如西方許旺酵母<9eczWe"i(2//*5);及絲狀真囷’ 諸如脈孢菌、青徽菌（PewzW///wm)、彎頸徽菌及曲徽菌宿主，諸如構巢麯徽 (A mW⑽5)及黑麯黴（儿。關於討論酵母及絲狀真菌用於產生治療蛋白之用途的綜述，例如參見Gerngross， TVa，· jBhiecr/z. 22:1409-1414 (2004)。可選擇其中糖基化路徑已”人化’’從而導致產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體的某些真菌及酵母菌株。例如參見Li等人，5/οί%/ζ· 24:210-215 (2006)(其描述曱醇酵母中糖基化路徑之人化）；及Gerngross等人，見上。用於表現糖基化抗體之合適宿主細胞亦來源於多細胞生物體（無脊椎動物及脊椎動物）。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別來自諸如草地黏蟲（办〇而〆 /rz^z>er心）（毛蟲）、埃及伊蚊（dMa aegxp")(蚊子）、白紋伊蚊（deda a/Z><9；7iciz^)(蚊子）、黑腹果蠅（Drc^op/n7a (果繩）及家蠶少X morz·)之宿主的大量桿狀病毒株及變異體及相應允許之昆蟲宿主細胞。多種用於轉染之病毒株公開可得，例如苜蓿丫紋夜蛾（Autographa ca/(/bmka)NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且該等病毒根據本發明可用作本文中之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、浮萍（浮萍科，Lemnac⑽e)、紫苜蓿（截形苜蓿，从之 128838.doc -119- 200840822 植物細胞培養物亦可用作宿主。例如參見美國專利第 5,959，177號、第 6,040,498號、第 6,420,548號、第 7，125,978 號及第6,417,429號（其描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之 PLANTIBODIEStm 技術）。

脊椎動物細胞可用作宿主且脊椎動物細胞在培養物（組織培養物）中之繁殖已成為一種常規程序。適用之哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株 (COS-7，ATCC CRL 1651)、人類胚胎腎細胞株（293細胞或經次選殖以在懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人，义 Gen Fko/. 36:59 (1977))、幼倉鼠腎細胞（BHK， ATCC CCL 10)、小鼠支持細胞（sertoli cell)(TM4，Mather，別〇/· 忒 23:243-251 (1980))、猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587)、人類子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2)、犬科動物腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34)、水牛鼠肝細胞@111^3八， ATCC CRL 1442)、人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75)、人類肝細胞（Hep G2，HB 8065)、小鼠乳房腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI 細胞（Mather 等人，Annals 见 7； Jcai 5W. 3 83:44-68 (1982))、MRC 5 細胞、FS4細胞及人類肝細胞瘤細胞株（Hep G2)。其他有用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，包括DHFR_ CHO 細胞（Urlaub等人，77:4216 (1980))及骨髓瘤細胞株（諸如NS0及Sp2/0)。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，例如參見Yazaki及Wu，Mei/zo心ζ·π 128838.doc -120- 200840822

Mo/eew/ar Bfo/ogy，第 248卷（B.K.C. Lo編，Humana Press， Totowa，NJ，2003)，第 255-268 頁。宿主細胞經上述用於產生抗體之表現或選殖載體轉型，且將其培養於適當時經改質之習知營養培養基中以誘導啟動子、選擇轉型物或擴增編碼所需序列之基因。 8·培養宿主細胞用以產生本發明之抗體之宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham’s FlO(Sigma)、最低必需培養基（MEM， ⑩ Slgma)、RpMI-1640(Sigma)及杜氏改良伊格爾培養基 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)，Sigma)之市售培養基適於培養該等宿主細胞。此外，描述於Ham等人 ’ Md·心ζ· 58:44 (1979)，Barnes等人，』⑽/·出 102:255 (1980)，美國專利第 4,767,704 號；第 4,657,866 號；第 4,927,762號；第 4,560,655 號；或第 5，122,469號； WO 90/03430 ; WO 87/00195 ;或美國專利 Re. 30,985 中之 φ 培養基中之任一者可用作宿主細胞之培養基。此等培養基中之任一者均可在必要時補充激素及/或其他生長因子（諸如，胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（諸如，氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽）、缓衝液（諸如，HEPES)、核苷酸 (諸如，腺苷及胸苷）、抗生素（諸如，GENTAMYCIN™藥 t )、微量元素（定義為通常以在微莫耳濃度範圍内之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可包括熟習此項技術者所已知之適合濃度的任何其他必需補充劑。培養條件（諸如，溫度、pH值及其類似條件）為先前 128838.doc -121 - 200840822 所選擇之宿主細胞之表現所用言將顯而易見。 9·抗體之純化之條件，且對一般技術者而菖使用重組技術時，可在并將直吉技八、、V、" 在周貝間隙中細胞内產生抗體或、/、 '至培養基中。若抗體在細胞内產生，則作為第一步，例如藉由離心或超廣 … 愿术移除俏主細胞或溶胞片段之微粒碎片。Caner等人乃奴

Bio/Technol〇gy 1〇： 163-167

(19 9 2)描述用於分離被分泌至大腸㈣之周質間隙的抗體 ί程序。簡言之，在乙酸鈉（PH3,5)、EDTA及苯甲基確醢乱（PMSF)之存在τ經⑽_使細㈣狀物融解。細胞碎片可藉由離心來移除。在抗體被分泌至培養基中之情況下，一般首先使用市售蛋白濃縮過遽器（例如，細⑽或

MiUiP〇re Pe出晴超遽單元）來濃縮來自該等表現系統之上清液。在先前步驟中之任一者中可包括諸如ρ_之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。自細胞製備之抗體組合物可使用（例如）羥磷灰石層析法、疏水性相互作用層析法、凝膠電泳法、透析及親和性層析法來純化，其中親和性層析法為通常較佳純化步驟中之者。蛋白A作為親和配位體之適宜性係視存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域的種類及同型而定。蛋白a可用於純化基於人類γΐ、γ2或γ4重鏈之抗體（Lindmark等人，〜_邮/· 62:1_13 (1983))。對所有小鼠同型及人類丫3推薦蛋白 g(Guss等人，五5:15671575 (1986))。雖 128838.doc -122- 200840822 然親和配位體所連接之基質最常見為瓊脂糖，但可用其他基質。與用瓊脂糖可達成之流動速率及處理時間相比，機械穩定性基質（諸如，可控孔玻璃或聚（苯乙烯二乙烯基）苯）允許更快之流動速率及更短之處理時間。在抗體包含 CH3 域之情況下，Bakerb〇nd ΑΒχτΜ 樹脂（J T Baker，

Phillipsburg，NJ)可用於純化。視待回收之抗體而定，亦可利用其他用於蛋白純化之技術，諸如離子交換管柱上分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽上層析、關於陰離子或陽離子交換樹脂（諸如，聚天冬胺酸管柱）上肝素 SEPHAROSEtm層析的層析、層析聚焦、sDs_p編及硫酸銨沈澱。在任何初步純化步驟後，可使包含相關抗體及污染物之此口物、、工又使用pH值在約2·5-4·5之間的溶離緩衝液較佳在較低鹽濃度（例如，約（Μ)·25 Μ鹽）下進行之低婦疏水性相互作用層析法。 -般而言’用於製備供研究、測試及臨床用之抗體的各種方法在此項技術中已良好建立，與上述方法一致，及/ 或由熟習此項技術者認為對於相關特^抗體㈣ V.免疫接合物本电明亦提供免疫接合物（可互替稱為,，抗體·藥物接或"ADC”)’其包含與-或多種細胞毒性劑(諸如，化學、、. 療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如，、細菌、直菌二物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放即，放射性接合物）)接合之本發明之抗_抗體中之^ I28838.doc -123 - 200840822 一者。本文中亦涵蓋抗體與一或多種小分子毒素（諸如，刺孢黴素、類美登素、單端孢黴烯及CC 1065及具有毒素活性之此等毒素之衍生物）之接合物。在某些實施例中，免疫接合物包含抗Robo4抗體及化學治療劑或其他毒素。可用於產生免疫接合物之化學治療劑描述於本文（例如，上文）中。酶活性毒素及其片段亦可使用且描述於本文中。在某些實施例中，免疫接合物包含抗Robo4抗體及一或多種包括（但不限於）以下各物之小分子毒素：小分子藥物，諸如刺孢黴素、類美登素、海兔毒素、阿瑞他汀、單端孢黴烯及CC1065，及具有細胞毒素活性之此等藥物之衍生物。該等免疫接合物之實例在下文中進一步詳細討論。 A.例示性免疫接合物本發明之免疫接合物（或π抗體-藥物接合物n(’’ADC”））可為以下式I，其中抗Robo4抗體經由可選連接子（L)與一或多種藥物部分（D)接合（亦即，共價連接）。

Ab-(L-D)pSl 因此，抗Robo4抗體可直接或經由連接子與藥物接合。在式I中，p為每一抗體之藥物部分的平均數，其可在（例如）每一抗體約1至約20個藥物部分之範圍内，且在某些實施例中，在每一抗體1至約8個藥物部分之範圍内。例示性連接子例示性連接子及藥物部分揭示於本文及美國專利公開案第 20050238649 A1號、第 20050276812 A1 號及第 20070092940 A1 128838.doc -124 - 200840822 號中。連接子可包含一或多種連接子組份。例示性連接子組份包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基（”MC”）、順丁烯二醯亞胺基丙醯基（"MP”）、纈胺酸_瓜胺酸（”vai-cit”或"vc")、丙胺酸-苯丙胺酸（"ala-phe”）、對胺基苯甲氧基羰基 (’’PAB”）、4-(2-吡啶基硫基）戊酸N-琥珀醯亞胺酯（"spp”）、 4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷―丨-甲酸N-琥珀醯亞胺酯C’SMCC”）及（4-碘-乙醯基）胺基苯曱酸N_琥珀醯亞胺酯 C’SIAB”）、3-(2-吡啶基二硫基）丙酸N_琥珀醯亞胺酯 (SPDP)(例如參見 Carlsson等人，173，723-737 (1978))、4-(2-啦啶基二硫基）丁酸N_琥珀醯亞胺酯 (SPDB)(例如參見美國專利4,563,304)、4_甲基冰[2-(5-硝基-°比。定基）-二硫基]戊酸N-玻珀醯亞胺酯（§ΜΝΡ)及聚乙二醇衍生物、曱氧基_聚氧化乙烯（mPE〇)。各種連接子組份在此項技術係已知的，其中某些描述於下文中。連接子可為"可分裂連接子”，其有助於藥物在細胞中之 φ 釋放。舉例而言，可使用酸不穩定性連接子（例如，腙）、蛋白酶敏感性（例如，肽酶敏感性）連接子、光不穩定性連接子、一曱基連接子或含二硫化物之連接子（Chari等人 Cancer Researeh 52·127]31 (1992)·，美國專利第 5,2〇8,〇2〇號）。在一些實施例中，連接子組份可包含將抗體與另一連接子組份或與藥物部分連接之"擔架單元”（stretcher unit)。例不性擔架單元顯示於下文中（其中波形線表明與抗體、另一連接子組份或藥物部分共價連接之位點）： 128838.doc -125- 200840822

在一些實施例中，連接子組份可包含胺基酸單元。在一個此實施例中，胺基酸單元允許連接子藉由蛋白酶分裂，藉此有助於在暴露於細胞内蛋白酶（諸如，溶酶體酶）之後使藥物自免疫接合物釋放。例如參見Doronina等人（2003) Nat· Biotechnol· 21:778-784。例示性胺基酸單元包括（但不限於）二肽、三肽、四肽及五肽。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸（vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸（af或ala-phe); 苯丙胺酸-離胺酸（fk或phe-lys);或N-曱基-纈胺酸-瓜胺酸 (Me-val-cit)。例示性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸 (gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸（gly-gly-gly)。胺基 128838.doc -126- 200840822 酸單兀可包含天然存在之胺基酸殘基，以及微量胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸單元可 i"又汁且使其對藉由特定酶（例如，腫瘤相關之蛋白酶、、、、織蛋白i#B、C及D或纖溶酶蛋白酶）進行酶促分裂之選擇性最佳化。 ' 在一些實施例中，連接子組份可包含直接或藉助於擔架單π及/或胺基酸單元將抗體與藥物部分連接之”間隔，，單元間隔單元可為”自我犧牲型"或"非自我犧牲型”。”非自 •，犧牲型，’間隔單元為其中在ADC酶促（例如，蛋白水解）分裂後部分或全部間隔單元保持與藥物部分結合的間隔單兀。非自我犧牲型間隔單元之實例包括（但不限於）甘胺酸間隔單7L及甘胺酸-甘胺酸間隔單元。亦涵蓋容易受到序歹J特異丨生S#促分裂之肽間隔劑的其他組合。舉例而言，藉由腫瘤細胞相關蛋白酶對含有甘胺酸_甘胺酸間隔單元之 ADC進行酶促分裂會引起甘胺酸_甘胺酸_藥物部分自adc _ 之剩餘部分釋放。在一個此實施例中，甘胺酸-甘胺酸_藥物部分接著在腫瘤細胞中經受單獨水解步驟，因此將甘胺酸-甘胺酸間隔單元自藥物部分分裂。，自我犧牲型”間隔單元允許在無單獨水解步驟之情況下釋放藥物部分。在某些實施例中，連接子之間隔單元包含對胺基苄基單元。在一個此實施例中，對胺基苄醇經由醯胺鍵與胺基酸單元連接，且在苄醇與細胞毒性劑之間形成胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯或碳酸酯。例如參見 Ham瞧等人（2005) Εχ_ 〇咖 η” (2〇〇5) 128838.doc -127- 200840822 15:1087-1103。在一實施例中，間隔單元為對胺基苄氧羰基（PAB)。在某些實施例中，對胺基苄基單元之伸苯基部分經Qm取代，其中Q為-Cl_C8烷基、_〇_(Ci_c8烷基）、—齒基、-硝基或_氰基；且m為在0-4之範圍内的整數。自我犧牲型間隔單元之實例進一步包括（但不限於）芳族化合物，亦即電子上類似於對胺基苄醇之芳族化合物（例如參見us 2005/0256030 A1)，諸如2-胺基咪唑-5·甲醇衍生物（Hay等人（1999) Bioorg. Med. Chem· Lett· 9:2237)及鄰胺基节基縮 _ 醛或對胺基苄基縮醛。可使用在醯胺鍵水解後進行環化之間隔劑’諸如經取代及未經取代之4_胺基丁醯胺 (Rodrigues等人，Chemistry Biology，1995，2，223);經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2·2·2]環系統（Storm等人，j

Amei*· Chem· Soc·，1972, 94，5815);及 2·胺基苯基丙醯胺 (Amsberry等人，J· Org. Chem·，1990，55，5867)。在甘胺酸之a位置上經取代之含胺藥物的消除（Kingsbury等人，j. _ Med· Chem·，1984, 27，1447)亦為適用於ADC中之自我犧牲型間隔劑的實例。在一實施例中’間隔單元為如下繪示之支鍵雙（經甲基）苯乙烯（BHMS)單元，其可用於併入且釋放多種藥物。 128· I28838.doc 200840822

Ab ~^Aa

Qm 一 Ww-NH

〇II CH2(〇C)n—D乂？ CH2(OC)n—D

酶促分裂 v 2種藥物其中Q為-C〗-C8烷基、-CKCi-Cs烷基）、-鹵素、-硝基或-氰基；m為在0-4之範圍内的整數；η為0或1 ;且p在1至約 20之範圍内。連接子可包含以上連接子組份中之任何一或多者。在某些實施例中，連接子如以下ADC式II中之方括弧中所示：

Ab-([Aa-Ww-Yy]-D)p 式II，其中A為擔架單元，且a為0至1之整數；W為胺基酸單元且w為0至12之整數；Y為間隔單元且y為0、1或2 ;且Ab、 D及p如上文針對式I所定義。該等連接子之例示性實施例描述於US 20050238649 A1中，其以引用的方式明確併入本文中。在式II之ADC背景下，例示性連接子組份及其組合顯示於下文： 128838.doc -129- 200840822 b A Ab

Val-Cit 或 VC、

MC-val-cit、

Ab

o 0^0 ΟΛ

D MC-val-cit-PAB o 可藉此項技術中已知之方法（諸如us 2005-023 8649 A1 中所述之彼等方法）合成連接子組份（包括擔架單元、間隔單元及胺基酸單元)。 C·例示性藥物部分 1·美登素及類美登素在些實施例中，免疫接合物包含與一或多個類美登素 /刀子接合之本發明之抗體。類美登素為有絲分裂抑制劑，其藉由扣卩制微管蛋白聚合而起作用。美登素最先係自東非灌木齒葉盖AP . 爪六企木（east African shrub Maytenus serrata)分離 128838.doc -130- 200840822 (美國專利第3,896，111號）。後來，發現某些微生物亦產生類美登素’諸如美登醇（maytansinol)及C-3美登醇酯（美國專利第4,15 1，〇42號）。合成美登醇及其衍生物及類似物揭示於（例如）美國專利第4，137,230號、第4,248,870號、第 4,256,746 號、第 4,260,608 號、第 4,265,814 號、第 4,294,757 號、第 4,307,016 號、第 4,308,268 號、第 4,308,269 號、第 4,309,428 號、第 4,313,946 號、第 4,315,929 號、第 4,317,821 號、第 4,322,348 號、第 • 4,331，598 號、第 4,361，650 號、第 4,364,866 號、第 4,424,219 號、第 4,450,254 號、第 4,362,663 號及第 4,371，533號’該等專利之揭示内容以引用的方式明確併入本文中。美登素化合物藉由抑制微管蛋白（micr〇tubuHn proton， tubulin)聚合來抑制有絲分裂期間微管形成，從而抑制細胞增殖（Remillard 等人（1975) Science 189:1〇〇2-1005 ;us φ 52〇8〇2〇)。雖然美登素及類美登素具有高度細胞毒性，但主要因其對腫瘤之不良選擇性而導致其具有嚴重全身性副作用，因而其在癌症療法中之臨床用途受到極大限制。美登素之臨床試驗已因對中樞神經系統及胃腸系統之嚴重不利影響而停止（Issel等人，（1978) Can 丁咖她⑽ 5:199-207) 〇 * 類美登素藥物部分為抗體_藥物接合物中有吸引力之藥物部分，此係因為其：⑴相對易於藉由潑酵或化學改質或酸酵產物之衍生化來製備，⑻易於用適於經由非二硫連 I28838.doc -131- 200840822 接子與抗體接合之官能基衍生化，（iii)在血漿中穩定，及 (iv)有效對抗多種腫瘤細胞株。 ▲適用作類美登素藥物部分之美纟素化合物在此項技術中熟知且可根據已知方法自天然來源分離或使用基因工程技術產生（參見Yu等人（2002) PNAS 99:7968_7973)。美登醇及美登醇類似物亦可根據已知方法合成製備。類美登素藥物部分之例示性實施例包括：如下文所揭示2DM1、DM3 及 DM4 〇如其他藥物部分般，本發明之化合物涵蓋類美登素藥物部分之所有立體異構體，亦即在D之對掌性碳上以與s構型之任何組合。在一實施例中，類美登素藥物部分（D)具有以下立體化學：

類美登素藥物部分之例示性實施例包括：DM1，（CR2)m =CH2CH2 ; DM3，（CR2)m=CH2CH2CH(CH3);及 DM4， (CH2)m=CH2CH2C(CH3)2，其具有以下結構： I28838.doc -132 - 200840822

ch3 ch3o

試圖改良標靶抗體之治療指數，將美登素及類美登素與 128838.doc -133- 200840822 特異性結合腫瘤細胞抗原之抗體接合。含有類美登素之免疫接合物及其治療用途揭示於（例如）美國專利第5,2〇8,〇2〇號、第5,416,064號及歐洲專利Ep 〇 425 235 B1中，該等專利之揭示内容以引用的方式明確併入本文中。等人， P題㈣93:8618_8623 (1996)描述包含與針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242連接之類美登素（指定gDM1)的免疫接合物。發現此接合物對所培養之結腸癌細胞具有高度細胞毒性，且其在活體内腫瘤生長檢定中顯示抗腫瘤活性。Chari等人，Cfl麟r細己㈣六52:127_131 (1992)描述免疫接合物，其中類美登素經由二硫連接子與結合人類結腸癌細胞株上之抗原之鼠科動物抗體A7接合，或與結合 HER-2/π⑼致癌基因之另一鼠科動物單株抗體tai接合。在活體外測試ΤΑ·1-類美登素接合物對人類乳癌細胞株SK_ BR-3(其每個細胞表現3)(1〇5個^^化_2表面抗原）之細胞毒 f生蕖物接0物達成與游離類美登素藥物類似之細胞毒性程度，此程度可藉由增加每個抗體分子之類美登素分子之數目來增加。A7-類美登素接合物在小鼠中顯示低全身性細胞毒性。 :抗體-類美登素接合物係藉由使抗體與類美登素分子化學連接而不顯著降低抗體或類美登素分子之生物活性來製備。每個抗體分子接合平均3_4個類美登素分子已顯示出立曰強對私靶細胞之細胞毒性的功效而對抗體之功能或溶解欧並無不利影響，但預期甚至一分子毒素/抗體即可增強、田肊毋性，優於使用裸露抗體。類美登素在此項技術中係 128838.doc -134- 200840822 =°的’且可藉由已知技術合成或自天然來源分離。合適 ’、員：登素揭示於(例如)美國專利第MW號及上文提 :他專利及非專利公開案中。較佳類美登素為美登醇及在美登醇分+ $ 方矢衣或其他位置上經改質之美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。此項技術中已知多種用於製造抗體·類美登素接合物之土團匕括（例如）美國專利第5,2〇8,〇2〇號或歐洲專利 0 425 235 B1 及 Charii λ 。

寺人，Cancer Research 52:127-131 (1992)中所揭示之彼等遠寺運接基團。連接基團包括如以上指出之專利中所揭示之二炉其 ,^ 一爪基、石爪醚基、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、肽醢χ ^ 肽酶不％定性基團或酯酶不穩定性基團，二硫基及硫_基較佳。抗體與類美登素之接合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑來製得，該等蛋白偶合劑諸如义號㈣亞胺基冬㈣咬基一 ^基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基_4_(N_順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烧小甲酸醋、亞胺基硫雜環戊糾τ)、醯亞㈣之雙官能料物（諸如，己二醯亞胺酸二甲醋鹽酉夂鹽），舌性自曰(諸如’辛二酸二琥珀醯亞胺酯）、醛類(諸如戊—酸）又-宜氮基化合物（諸如，雙侦疊氣基苯甲醯基）己二胺）、雙-重氮鹽衍生物（諸如，雙_(對重氮苯甲酿基）-乙二胺）、二異氰酸輯（諸如，甲苯2,6_二異氛酸㈤及雙活性氟化合物（諸如’ M•二氟_2,4·二硝基苯）。尤其較佳之偶合冑包括N-琥抬醯亞胺基·3_(2♦定基二硫基）丙酸 S|(SPDP)(Carlsson#A > 173:723-737 [1978]) 128838.doc -135- 200840822 及N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基）戊酸酯（SPP)以提供二硫鍵。視連接類型而定，可使連接子在各個位置上與類美登素分子連接。舉例而言，可使用習知偶合技術藉由與經基反應而形成酯鍵。反應可發生在具有羥基之C-3位置、經羥曱基改質之C-14位置、經羥基改質之C-15位置及具有羥基之C-20位置上。在一較佳實施例中，鍵在美登醇或美登醇類似物之C-3位置上形成。 • 2.阿瑞他汀、海兔毒素在一些實施例中，免疫接合物包含與海兔毒素或海兔毒素肽類似物或衍生物（例如，阿瑞他汀）接合之抗體（美國專利第5635483號、第5780588號）。已顯示海兔毒素及阿瑞他汀干擾微管動力學、GTP水解以及核及細胞分裂（Woyke 等人(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45( 12):3580-3584)且具有抗癌（美國專利第5663 149號）及抗真菌活性（Pettit 等人（1998) Antimicrob. Agents Chemother· • 42:2961-2965)。可經由肽藥物部分之N(胺基）末端或C(羧基）末端使海兔毒素或阿瑞他汀藥物部分與抗體連接（WO 02/088172)。例示性阿瑞他汀實施例包括N末端連接之單曱基阿瑞他汀藥物部分DE及DF，其揭示於Senter等人，Proceedings of the American Association for Cancer Research,第 45 卷，文摘號623中，2004年3月28日提出，該參考文獻之揭示内容以全文引用的方式明確併入本文中。 128838.doc -136- 200840822

Dp，

其中DA Df之波形線表明與抗體或抗體·連接子共價連接位點，且在各位置上獨立地： R係選自基； R3係選自H、Cl-C8烷基、c3_c^ 芸其、Γ O h甘/ 方基、CrC8院基- 方基、CVC8烷基-(C3-C8碳環） (C3-C8 雜環）；

肽藥物部分可選自以下式〇£及D

、R18 R4係選自h、Ci-C8貌基、C3_C8碳環、芳夷芳基、C〗-C8烧基_(c3_c8碳環）、c3_c 土 8烧基- (c3-c8雜環）； 8”級及<^-(：8烷基- R5係選自Η及甲基；或心5共同形成碳環且具

Rb係獨立地選自H、Cl-c8烷基及。R)n_’其中 4、5及 6 ; r6係選自烷基； R7係選自h、Ci-c8烷基、c3_Cs碜環 3、4、5及6 . 8碳環且η係選自2、方基、Ci-Cg烧基_ 128838.doc -137- 200840822 芳基、（VC8烧基-(c3_c8碳環）、c3_c8雜環及Ci_c8烷基-(C3-C8雜環）； R8各自獨立地選自H、〇H、Cl_C8烧基、C3_C8碳環及〇_ (CVC8 烷基）； R9係選自Η及CVC8烷基； R係選自芳基或C3-C8雜環； Z為Ο、S、NH或NR12，其中r!2為Ci_C8燒基； R係選自Η、Ci-C2〇烷基、芳基、C3-C8雜環、_(Rl3〇)m· • R14或-(R13〇)m-CH(R15)2 ; m為1-1000範圍内之一個整數； R13為C2-C8烷基； R14為Η或CVC8烷基； R之每一次出現獨立地為H、c〇〇h、 N(R16)2、-(CH2)n-S03H或-(CH2)n-S〇3-Cl-c8烷基； R16之每一次出現獨立地為H、Ci_C8烷基或_(CH2)n_ COOH ； R18係選自-c(R8)2-c(RV芳基、_c(r8)2_c(r8)2_(C3-C^ 環）及-C(R8)2_C(R8)2_(C3-C8 碳環）； n為G至6範圍内之一個整數。在一個實施例中，R3、…及尺7獨立地為異丙基或第二丁基，R5為-H或甲基。在一個例示性實施例中，R3及R4各自為異丙基，R5為-H，R7為第二丁基。在又另-個實施例中，RW各自為甲基，r9H 在再另-個實施例中，R8之每—次出現為_〇cH3。 128838.doc •138- 200840822 在一個例示性實施例中，3 4 j中R&R各自為異丙基，R2及R6 各自為曱基，R5為么给 R為弟二丁基，R8之每一次出現為-OCH3，R9為-H。在一個實施例中，2為或_nh·。在一個實施例中，玟ίο為芳其。 R1()為-苯基。當Z為-Ο-時，R"為-H、甲基在一個例示性實施例中在一個例示性實施例中或第三丁基。

在一個實施例中，當7么n 士 ^ 1C 田乙為日寸，R11為β0ίΙ(Ι115)2，其中 R15為-(CH2)n-N(R16)2，βΐ6 也 ρ ^ ^ ^ ^ ’ R 為_<^(：8烷基或-(CH2)n-COOH。在另個貝施例中，當冗為_NH時，Rll為_ch(r15)2，其中 R15為-(CH2)n-S03H。式de之一個例示性阿瑞他汀實施例為mmae，其中波形線表示共彳貝連接於抗體-藥物接合物之連接子（L):

式DF之例示性阿瑞他汀實施例為Mmaf，其中波形線表明與抗體-藥物接合物之連接子（L)之共價連接（參見us 2005/0238649及 Doronina等人 λ (2〇〇6)⑽c〇_gaie 17:114-124)：

MMAF 〇 128838.doc -139- 200840822 其他藥物部分包括以下MMAF衍生物，其中波形線表明與抗體-藥物接合物之連接子（L)之共價連接：

128838.doc -140- 200840822

在一態樣中，包括（但不限於）如上所示之三乙二醇酯 (TEG)的親水基團可在R11處與藥物部分連接。不受任何特定理論束缚，親水基團有助於藥物部分内在化且不凝聚。包含阿瑞他汀/海兔毒素或其衍生物之式I之ADC的例示性實施例描述於US 2005-0238649 A1及Doronina等人 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124中，其以引用的方 128838.doc -141 - 200840822 式明確併入本文中。包含MMAE或MMAF及各種連接子組份之式I之AD C的例示性實施例具有以下結構及縮寫（其中 ”Ab”為抗體；P為1至約8 ’ nVal-Cit”為顯胺酸-瓜胺酸二肽；且"S"為硫原子）：

包含MMAF及各種連接子組份之式I之ADC的例示性實施例進一步包括 Ab-MC-PAB-MMAF及 Ab-PAB-MMAF。有趣地^ ’顯示包含藉由不可蛋白水解分裂之連接子與抗體連接 128838.doc -142· 200840822 之MM AF的免疫接合物具有與包含藉由可蛋白水解分裂之連接子與抗體連接之MMAF的免疫接合物相當之活性。參見 Doronina等人（2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124。在該等情況下，咸信藥物釋放受細胞中抗體降解作用影響。同前。通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。此等肽鍵可（例如）根據肽化學領域中熟知之液相合成方法（參見E. Schr5der及K. # Ltibke，"The Peptides"，第 1 卷，第 76-136 頁，1965, Academic Press)來製備。可根據以下文獻中之方法製備阿瑞他汀/海兔毒素藥物部分：US 2005-0238649 A1 ;美國專利第5635483號；美國專利第5780588號；Pettit等人（1989) J. Am. Chem. Soc. 1 11:5463-5465 ； Pettit# A (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277 ; Pettit，G.R·等人， Synthesis, 1996，719-725 ; Pettit 等人（1996) J. Chem· Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863 ;及 Doronina (2003) Nat.

Biotechnol· 21(7):778-784。詳言之，式DF之阿瑞他汀/海兔毒素藥物部分（諸如， MMAF 及其衍生物）可使用 US 2005-0238649 A1 及 Doronina 等人（2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124 中所述之方法來製備。式DE之阿瑞他汀/海兔毒素藥物部分（諸如， MMAE及其衍生物）可使用Doronina等人（2003) Nat. Biotech. 21:778_784中所述之方法來製備。藥物-連接子部分 MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF 及 MC-vc- 128838.doc -143 - 200840822 PAB-MMAE 可藉由（例如）如 Doronina 等人（2003) Nat. Biotech· 21:778-784及美國專利公開案第 20050238649 A1 號中所述之常規方法便利地合成，且接著與相關抗體接合。 3.刺孢擻素另一相關免疫接合物包含與一或多個刺抱黴素分子接合之抗體。抗生素之刺孢黴素家族能夠以亞皮莫耳濃度產生雙鏈DNA斷裂。關於刺孢黴素家族之接合物的製備，參見美國專利 5,712,374、5,714,586、5,739，116、5,767,285、 5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(所有均頒予 American Cyanamid Company)。可使用之刺孢黴素結構類似物包括（但不限於）γ!1、（X21、（X31、N-乙醯基-γ〗1、PSAG及 e^Hinman 等人，Cancer Research 53:3336-3342 (1993)， Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928 (1998)及先前所提及之頒予American Cyanamid之美國專利）。抗體可接合之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸劑（antifolate)。刺孢黴素及QFA均具有細胞内作用位點且不易於穿過質膜。因此，此等藥劑經由抗體介導之内在化而被細胞攝入，從而極大地增強了其細胞毒性作用。 4.其他細胞毒性劑可與本發明之抗體接合之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素（streptozoticin)、長春新驗及5-氟尿ϋ密唆、美國專利5,053,394、5,770,710中所述之共同稱為LL-E33288複合物的藥劑家族，以及埃斯波黴素（esperamicin)(美國專利 I28838.doc •144- 200840822 5,877,296) ° 可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌）、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素（modeccin)A鏈、α-帚麴菌素（alpha-sarcin)、桐油樹蛋白 protein)、康乃馨蛋白、洋商陸蛋白amer/ca仙 protein，PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻楓樹蛋白（curcin)、巴豆毒素、鼠尾草抑制劑、天堂果蛋白、有 • 絲分裂素、侷限麴菌素（restrictocin)、紛黴素 (phenomycin)、伊諾黴素（enomycin)及黴菌毒素 (tricothecene)。例如參見 1993年 10月 28 日公開之WO 93/21232。本發明另外涵蓋一種在抗體與具有核分解活性之化合物 (例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNase)之間形成之免疫接合物。為選擇性地破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用於產生放射性接合之抗體。實例包括 ^ At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm15' Bi212、P32、

Pb212及Lii之放射性同位素。可以已知方式將放射性標記或其他標記併入接合物中。舉例而言，可用生物學方法合成肽，或可藉由使用合適胺基酸前驅物（例如，包含以氟-19代替氫）進行化學胺基酸合成來合成肽。諸如Tc99n^I123、Re186、Re188及In111之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連接。IODOGEN 方法（Fraker 等人（1978) Biochem· 128838.doc •145- 200840822 价叩却爻及以· 80: 49-57)可用於併入埃·123 〇 "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy11 (Chatal， CRC Press 1989)詳細描述了其他方法。本發明之抗R〇bo4抗體可與奈米顆粒劑接合，而奈米顆粒劑又可與細胞毒素部分接合。合適之奈米顆粒劑包括 (但不限於）微泡（參見 Ellegala 等人，C/rciz/ai/ow 108:336-341 (2003)，亦稱為聲學活性脂質球（AAL)(參見Tartis等人，Med.別〇/· 32(11):1771-80 (2006)))、超順磁性劑、脂質體、全氟化碳奈米顆粒乳液 (W02005014051)及樹枝狀聚合物（參見Caruthers等人， Methods in Molecular Medicine, 124:387-400 (2006)>S. ψ 引用之文獻，所有彼等參考文獻均以全文引用的方式併入本文中）。抗體與細胞毒性劑之接合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑來製得，該等蛋白偶合劑諸如Ν-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯（SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基曱基）環己烷-1-曱酸酯、亞胺基硫雜環戊烷 (IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如，己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如，辛二酸二琥珀醯亞胺酯）、醛類 (諸如，戊二醛）、雙-疊氮基化合物（諸如，雙-(對疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙-重氮鹽衍生物（諸如，雙-(對重氮苯曱醯基）-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如，甲苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如，1，5-二氟-2,4-二硝基苯）。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，/SWwce 128838.doc •146- 200840822 238:1098 (1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苄基-3-曱基二伸乙基三胺五乙酸（MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體接合之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。連接子可為有助於細胞中細胞毒性藥物釋放之”可分裂連接子”。舉例而言，可使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子（Chari 等人，Ccmcer TiaearcTz 52:127-131 (1992);美國專利第5,208,020號）。本發明之化合物明確涵蓋（但不限於）用以下市售（例如購自 Pierce Biotechnology，Inc·，Rockford，IL·，U.S.A)之交聯試劑製備的 ADC : BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、 SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯砜）苯甲酸酯）。參見第 467-498 頁，2003-2004 Applications Handbook and Catalog 〇 5.藥物負載藥物負載由Ρ表示且為式I、la、la’或II之分子中每一抗體之藥物部分平均數目。藥物負載可在每一抗體1至20個藥物部分（D)之範圍内。式I之ADC包括與1至20個範圍内之藥物部分接合的抗體群。自接合反應製備ADC中每一抗體之藥物部分平均數目可藉由諸如質譜分析、ELISA檢定及HPLC之習知方式來表徵。亦可測定根據p之ADC數量分 128838.doc -147- 200840822 布。在一此捲、nr 1 / /、中P為一特定值之同類ADC與具有二：二物負載之ADC的分離、純化及表徵可藉由諸如逆相 HPLC或電泳之方法來實現。

對於一些抗體-藥物接合物，P可受抗體上連接位點數目 (制舉例而吕，如以上例示性實施例中，在連接為半胱胺酸硫醇之情況下’抗體可具有僅—個或若干個半脱胺酸硫醇基或可具有僅—個或若干個可經由其將連接子連接 2足夠反應性硫醇基。在某些實施例中，例如之較高藥物負载可引起某些抗體_藥物接合物之聚集、不可溶性、毒性或損失細胞滲透性。在某些實施财，本發明之 ADC之藥物負載在i至約8、約2至約6、約3至約5、約3至、、、勺4約3.1至約3.9、約3.2至約3 ·8、約3.2至約3.7、約3.2 至約3·6、約3·3至約3.8或約3.3至約3.7之範圍内。實際上，已顯示對於某些ADC，每一抗體之藥物部分最適比率可小於8且可為約2至約5。參見us 2〇〇5_〇238649 αι(以全文引用的方式併入本文中在某些實施例中，在接合反應期間，少於理論最大值之藥物部分與抗體接合。如以下所討論，抗體可含有（例如）不14某物·連接子中間物或連接子試劑反應的離胺酸殘基。一般而言，抗體不含有許多可與藥物部分連接之游離及反應性半胱胺酸硫醇基；實際上抗體中大部分半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋形式存在。在某些實施例中，抗體可在部分或全部還原條件下被諸如二硫蘇糖醇（DTT)或三幾基乙基膦（TCEP)之還原劑還原以產生反應性半胱胺酸硫醇 128838.doc -148- 200840822 基。在某些實施例中’抗體經受變性核基團，諸如離胺酸或半胱胺酸。h展不反應性親 ADC之負载（藥物/抗體比率）可以不同方式控制例如藉下方法來控制：⑴限制藥物·連接子中間物或連料試劑相對於抗體之莫耳過量；⑼限制接合反應時間或溫度，㈣對於半胱胺酸硫醇修飾，部分或限制還原條件； Μ藉由重組技術來卫程化抗體之胺基酸序列，

胺酸殘基之數目及位置經修飾以控制連接子_藥物連接之數目及/或位置（諸如，如本文及W〇2〇〇6/〇344叫以全文引用的方式併入本文中）中所揭示而製備之如。黯或如oFab)。在本發明之-實施射，本發明之抗體之胺基酸殘基經半胱胺酸殘基取代。在—實施例中，抗體之重鍵 F c區之位置！！ 8上的胺基酸為半胱胺酸或經半脱胺酸殘基取代（其中118係指根據EU編號計數的抗體之以區之胺基酸位置，參見Kabat，Ε. Α·等人，㈣咖㈣〇f pr〇teins打

Immunological Interest (U.S. Dept, of Health and Hum Serv·，Bethesda (1991))。在一實施例中，重鏈以區之位置 11 8(EU編號）上的半胱胺酸殘基與藥物部分或可偵測標記 (諸如本文所揭示之藥物部分或可偵測標記）共價連接。在圖6A中，以粗體子及下劃線顯示之重鏈區之丙胺酸為半胱胺酸經取代以產生thioMAb之位置。應瞭解在一個以上親核基團與藥物-連接子中間物或連接子试劑接著與藥物部分試劑反應之情況下，則所得產物為具有一或多種與抗體連接之藥物部分分布之ADC化合物 128838.doc -149 - 200840822 的混合物。每一抗體之藥物平均數目可藉由對抗體具特異性且對藥物具特異性之雙重ELISA抗體檢定而自混合物計算得到。混合物中個別ADC分子可藉由質譜分析來鑑別且藉由HPLC(例如，疏水性相互作用層析法）分離（例如參見 Hamblett，K.J.等人，"Effect of drug loading on the pharmacology，pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD 30 antibody-drug conjugate，"文摘號 624， American

Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting， 2004 年 3 月 27-31 日，Proceedings of the AACR，第 45 卷， 2004年 3 月；Alley，S.C·等人，"Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates，” 文摘號 627,

American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting，2004年 3 月 27-3 1 日，Proceedings of the AACR，第 45卷，2004年3月）。在某些實施例中，具有單一負載值之同類ADC可藉由電泳或層析法而自接合混合物分離。 D·抗艎-藥物接合物之代謝物在本文所述之ADC化合物之活體内代謝產物具新穎性且在先前技術上並非顯而易見之程度上，該等產物亦在本發明之範疇内。該等產物可（例如）由所投化合物之氧化、還原、水解、醯胺化、酯化、酶促分裂及其類似作用產生。因此，本發明包括新穎且並不顯而易見之化合物，其係藉由包含使本發明之化合物與哺乳動物接觸歷時足以產生其代謝產物之時段的方法而產生。通常藉由製備放射性標記（例如，14C或3H)ADC，將其以 128838.doc -150- 200840822 可偵測d里（例如，大於約0·5 mg/kg)非經腸投與諸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴之動物或投與人，歷時足以使代謝發生之時間（通常約30秒至3〇小時）且將其轉變產物自尿、血液或其他生物樣品分離來鑑別代謝產物。此等產物易於分 •此係因為其經標記（其他產物係藉由使用能夠結合代謝物中殘存抗原決定基之抗體來分離）。代謝物結構係以習知方式（例如藉由MS、分析）來測定。一般而言，代謝物之分析係以與熟習此項技術者熟知之習知藥 • 4勿代謝研究相同之方法進行。只要轉變產物未在活體内另外么現，其即可用於本發明之ADC化合物之治療性給藥的诊斷檢定中。 VI·製備免疫接合物之方法在本發明之抗體藥物接合物（ADC)中，抗體（Ab)經由連接子（L)與一或多個藥物部分（D)接合，例如每一抗體約1至約20個藥物部分。式j、Ia、Ia，或H2ADC可藉由若干途徑 φ 使用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑來製備，包括：（1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成Ab-L，接著與藥物部分D反應；及（2)使藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L ’接著與抗體之親核基團反應。用於經由後一途径製備式I之ADC的例示性方法描述於美國專利公開案第 2005023 8649 A1號中，其以引用的方式明確併入本文中。抗體上之親核基團包括（但不限於）：（i)N末端胺基，側鏈胺基，例如離胺酸，（iii)侧鏈硫醇基，例如半胱胺 128838.doc -151 - 200840822 酸’及（iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺基、硫醇基及經基為親核基團且能夠與包括以下各物之連接子部分及連接子試劑上之親電基團反應以與其形成共價鍵：⑴ 活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸鹽及酸鹵化物； (11)烧基及苄基鹵化物，諸如鹵代乙醯胺；（1丨丨）醛類、酮類、羧基及順丁烯二醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈間二硫化物，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇）或二羰基乙基膦（TCEp)之還原劑進行處理，使得抗

體完全或部分還原，從而使抗體對與連接子試劑接合具反應性。因此，理論上各半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫醇親核物。可經由修飾離胺酸殘基（例如藉由使離胺酸殘基與2-亞胺基硫雜環戊烷（Traut試劑）反應）而使胺轉化為硫醇從而將其他親核基團引入抗體中。可藉由引入一、二、三、四個或四個以上半胱胺酸殘基（例如，藉由製備 b 3或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體）將反應性硫醇基團引入抗體中。亦可藉由在抗體上之親電基團（諸如，醛羰基或酮羰基）與連接子試劑㈣物上之親核基團之間進行反應來產生本發明之抗體’物接合物。連接子試劑上之有用親核基團包括 (但不限於)醯肼、將、胺基、肼、硫半卡⑽。semicarba_e)、竣酸肼及芳基醯肼。在__實施例中，抗體經修飾以引入能夠與=子試劑或藥物上之親核取代基反應的親電部分。 $細例中’y糖基化抗體之糖可經（例如）過璜酸鹽氧七劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的 128838.doc -152- 200840822 醛基或酮基。所得亞胺希夫鹼（Schiff base)基團可形成穩定的鍵，或可經（例如）硼氫化物試劑還原以形成穩定的胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可在抗體中產生可與藥物上之合適基團反應的羰基（酸羰基及酮羰基）(Hermanson， Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗體可與偏過碘酸鈉反應，從而產生醛以代替第一胺基酸（Geoghegan及Stroh，（1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852)。此醛可與藥物部分或連接子親核試劑反應。藥物部分上之親核基團包括（但不限於）胺基、硫醇基、羥基、醯肼基、肟基、肼基、硫半卡基團、羧酸肼基團及芳基醯肼基團，該等基團能夠與包括以下各物之連接子部分及連接子試劑上之親電基團反應以與其形成共價鍵：⑴ 活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸鹽及酸鹵化物； (ii)烷基及苄基li化物，諸如i代乙醯胺；（iii)醛類、酮類、羧基及順丁烯二醯亞胺基。本發明之化合物明確涵蓋（但不限於）用以下市售（例如購自 PiercS Biotechnology，Inc.，Rockford，IL·，U.S.A ;參見第 467-498 頁，2003-2004 Applications Handbook and Catalog)之交聯試劑製備的ADC : BMPS、EMCS、 GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、 SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺 128838.doc -153- 200840822 酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB(琥珀醯亞胺基_(4_乙烯颯）苯甲酸酯）^ 包含抗體及細胞毒性劑之免疫接合物亦可使用多種雙官能蛋白偶合劑來製#，該等蛋白偶合劑諸如&號㈣亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯（spDp)、琥珀醯亞胺基-心 (N-順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷甲酸醋（smcc)、亞胺基硫雜環戊烷（IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如，己二醯亞胺酸二曱酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如，辛二酸二琥珀醯亞胺酯）、醛類（諸如，戊二醛）、雙_疊氮基化合物（諸如，雙-(對疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙_重氮鹽衍生物（諸如，雙-(對重氮苯甲醯基）-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如，甲苯2,6·二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如，I〗-二氟‘ 二硝基苯）。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vhetta等人，Science 238:1098 (1987)中所述來製備。碳14標記之^ 異硫氰基苄基-3·甲基二伸乙基三胺五乙酸（MU3TpA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體接合之例示性螯合劑。參見 WO94/11026。或者，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白可（例如）藉由重組技術或狀合成製得。重組DNA分子可包含編碼彼此相鄰或由編碼連接子肽之區域隔開（其不會破壞所需接合物特徵）之接合物之抗體及細胞毒素部分的區域。本發明之化合物包括半胱胺酸工程化抗體，其中親本抗體之一或多個胺基酸經游離半胱胺酸胺基酸置換。半胱胺酸工程化抗體包含一或多個硫醇反應性值在〇 6至1〇之範 128838.doc -154- 200840822 圍内的游離半胱胺酸胺基酸。游離半胱胺酸胺基酸為已工程化至親本抗體中且並非二硫橋之部分的半胱胺酸殘基。在一態樣中，半胱胺酸工程化抗體係由一種包含以下步驟之方法來製備： (a) 親本抗體之一或多個胺基酸殘基經半胱胺酸置換；及 (b) 藉由使半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性試劑反應來測定半胱胺酸工程化抗體之硫醇反應性。半胱胺酸工程化抗體可具有比親本抗體大的對硫醇反應性試劑之反應性。游離半胱胺酸胺基酸殘基可位於重鏈或輕鏈中，或恆定域或可變域中。抗體片段（例如Fab)亦可經一或多個半胱胺酸胺基酸置換抗體片段之胺基酸而工程化，以形成半胱胺酸工程化抗體片段。本發明之另一態樣提供一種製備（製造）半胱胺酸工程化抗體之方法，其包含： (a) 將一或多個半胱胺酸胺基酸引入親本抗體中以產生半胱胺酸工程化抗體；及 (b) 測定半胱胺酸工程化抗體對硫醇反應性試劑之硫醇反應性；其中半胱胺酸工程化抗體具有比親本抗體大的對硫醇反應性試劑之反應性。製備半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（a)可包含·· (i) 使編碼半胱胺酸工程化抗體之核酸序列誘發突變； 128838.doc -155- 200840822 (ii) 表現半胱胺酸工程化抗體；及 (iii) 分離且純化半胱胺酸工程化抗體。製備半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（b)可包含在選自嗟菌體或噬菌粒之病毒顆粒上表現半胱胺酸工程化抗體。製備半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（b)亦可包含·· (0 使半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性親和試劑反應以產生親和標記之半胱胺酸工程化抗體；及 _ (Η)量測親和標記之半胱胺酸工程化抗體與捕捉介質之結合。本發明之另一態樣為一種使用高度反應性之不成對半胱胺酸胺基酸針對硫醇反應性來篩檢半胱胺酸工程化抗體之方法，其包含： (a) 將一或多個半胱胺酸胺基酸引入親本抗體中以產生半胱胺酸工程化抗體； φ (b)使半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性親和試劑反應以產生親和標記之半胱胺酸工程化抗體；及 (c) 量測親和標記之半胱胺酸工程化抗體與捕捉介質之結合；及 (d) 測定半胱胺酸工程化抗體對硫醇反應性試劑之硫醇反應性。篩檢半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（a)可包含： (i)使編碼半胱胺酸工程化抗體之核酸序列誘發突變； & 128838.doc -156- 200840822 (h) 表現半胱胺酸工程化抗體；及 (iii)分離且純化半胱胺酸工程化抗體。師檢半脱胺酸工程化抗體之方法之步驟（b)可包含在選自噬菌體或噬菌粒之病毒顆粒上表現半胱胺酸工程化抗篩檢半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（b)亦可包含： (i) 使半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性親和試劑反應以產生親和標記之半胱胺酸工程化抗體；及 (U)量測親和標記之半胱胺酸工程化抗體與捕捉介質之結合。半胱胺酸工程化抗體可用於治療癌症且包括對細胞表面及跨膜受體及腫瘤相關抗原（TAA)具特異性之抗體。該等抗體可以裸露抗體（未與藥物或標記部分接合）形式或以式 I、la、IV或II之抗體藥物接合物（ADC)之形式使用。用於製備及篩檢半胱胺酸工程化抗體之方法的實施例包括親本抗體為諸如hu4D5Fabv8之抗體片段之情況。親本抗體亦可為包含白蛋白結合肽序列（ΑΒρ)之融合蛋白。本發明之半胱胺酸工程化抗體可位點特異性及有效地與硫醇反應性試劑偶合。硫醇反應性試劑可為多功能連接子试劑、捕捉標記試劑、螢光團試劑或藥物-連接子中間物。半脱胺酸工程化抗體可經可偵測標記來標記，固定於固相支撐物上及/或與藥物部分接合。本發明之另一態樣為一種包含半胱胺酸工程化抗體（Ab) 128838.doc -157- 200840822 及藥物部分（D)之抗體-藥物接合物化合物，其中半胱胺酸工程化抗體經由一或多個游離半胱胺酸胺基酸藉由連接子部分（L)與D連接；化合物具有式la :

Ab(LD)p la，其中p為1、2、3或4;且其中半胱胺酸工程化抗體係藉由包含將親本抗體之一或多個胺基酸殘基用一或多個游離半胱胺酸胺基酸置換之方法來製備。藥物部分包括（但不限於）類美登素、阿瑞他汀、海兔毒素、單端孢黴烯、 CC1 065、刺孢黴素及其他烯二炔抗生素、紫杉烷、蒽環黴素及其立體異構體、電子等排體、類似物或衍生物。例示性藥物部分包括DM1、MMAE及MMAF。例示性抗體-藥物接合物闡述於美國專利公開案第20070092940 A1號中。式la之抗體-藥物接合物可進一步包含白蛋白結合肽 (ABP)序列；此組合物具有式la’ ： ABPAb(LD)p la，，本發明之抗體包含藉由以下各者教示之具有ABP序列之融合蛋白：（i)Dennis 等人（2002) J Biol Chem. 277:35035-35043，表 III 及 IV，第 35038 頁；（ii)US 20040001827， [0076] SEQ ID NO: 9-22;及（iii)WO 01/45746，第 12-13 頁’ SEQ ID NO: zl-zl4，且所有文獻均以引用的方式併入本文中。 VII·半胱胺酸工程化抗體（ThioMAb及ThioFab) 本發明之化合物包括半胱胺酸工程化抗體，其中野生型或親本抗體之一或多個胺基酸係經半胱胺酸胺基酸置換。 128838.doc -158- 200840822 任何形式之抗體均可如此工程化，亦即突變。舉例而言，親本Fab抗體片段可經工程化以形成半胱胺酸工程化Fat>，在本文中稱為"ThioFabn。類似地，親本單株抗體可經工程化以形成”ThioMab”。應注意在ThioFab中單一位點突變產生單個工程化半胱胺酸殘基，而在ThioMab中由於IgG抗體之二聚性質，所以單一位點突變產生兩個工程化半胱胺酸殘基。評估具有經置換（”工程化”）之半胱胺酸（Cys)殘基之突變體的新引入之工程化半胱胺酸硫醇基之反應性。硫醇反應性值為在0至1 · 〇之範圍内的相對數值項且可針對任何半胱胺酸工程化抗體來量測。本發明之半胱胺酸工程化抗體的硫醇反應性值在〇·6至1·0、0.7至1.0或0.8至1.0之範圍内。本發明之設計、選擇及製備方法使半胱胺酸工程化抗體能夠與親電官能基反應。此等方法進一步使諸如抗體-藥物接合物（ADC)化合物之抗體接合物化合物的藥物分子在才曰疋、设计、選擇位點處。抗體表面上之反應性半胱胺酸殘基允許經由諸如順丁烯二醯亞胺或鹵乙醯基之硫醇反應基團而特異性接合藥物部分。Cys殘基之硫醇官能基對順丁烯二酸亞胺基之親核反應性比蛋白中任何其他胺基酸官能基（諸如’離胺酸殘基之胺基或N末端胺基）高約1〇〇〇倍。雖然碘乙醯基及順丁烯二醯亞胺試劑中硫醇特定官能基可與胺基反應，但需要較高pH值（>9.0)及較長反應時間 (Garman，1997，Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach，Academic Press，London) o 128838.doc -159- 200840822 本’S明之半胱胺酸工程化抗體較佳保留其野生型、親本抗體對應物之抗原結合能力。因此，半胱胺酸工程化抗體能夠與抗原結合，輕、辑么k A丄人乂铨為特異性結合。該等抗原包括（例如）腫瘤相關抗原（TAA)、細胞表面受體蛋白及其他細胞表面分子、跨膜蛋白、信號轉導蛋白、細胞存活調節因子、細胞增殖調節因子、與組織發育或分化有關(例如，已知或懷疑功能上促進組織發育或分化）之分子、淋巴因子、細胞激素、細胞週期調節所涉及之分子、血管發生所涉及之刀子及與血官生成有關（例如，已知或懷疑功能上促進血官生成）之分子。腫瘤相關抗原可為群集分化因子（亦即’ CD蛋白）。半胱胺酸工程化抗體能夠結合之抗原可為以上提及之類別巾之_者的子集成員，其巾該類別之其他子集包含具有不同特徵（相對於相關抗原）之其他分子/抗原。親本抗體亦可為具有本文所揭示之HVR序列中之任何一一四、五或六者的人類或人化抗R〇b〇4抗體或 Fab。本發明之半胱胺酸工程化抗體可位點特異性及有效地與硫醇反應性試劑偶合。硫醇反應性試劑可為多官能連接子試劑、捕捉（亦即，親和）標記試劑（例如，生物素連接子試劑）、偵測標記（例如，螢光團試劑）、固相固定試劑 (例如，SEPHAROSEtm、聚苯乙烯或玻璃）或藥物連接子中間物。硫醇反應性試劑之一實例為N-乙基順丁烯二醯亞胺 (NEM)。在一例示性實施例中，Thi〇Fab與生物素連接子試劑之反應提供生物素標記之Thi〇Fab，藉由該生物素樣記 128838.doc -160- 200840822 之ThioFab可偵測及量測工程化半胱胺酸殘基之存在及反應性。ThioFab與多官能連接子試劑之反應提供具有官能化連接子之ThioFab，其可進一步與藥物部分試劑或其他標記反應。ThioFab與藥物-連接子中間物之反應提供 ThioFab藥物接合物。該方法可應用於其中反應基團為（例如）順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺、吡啶基二硫化物或其他硫醇反應性接合搭配物之其他硫醇反應劑的接合（Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes， Inc· ; Brinkley， 1992,

Bioconjugate Chem. 3:2; Garman，1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjiigate Techniques (1996) Academic Press， San Diego，第40-55頁，第643-671頁）。搭配物可為細胞毒性劑（例如毒素，諸如多柔比星或百日咳毒素（pertussis toxin))、螢光團（諸如螢光染料，如螢光素或若丹明 (rhodamine))、顯像或放射冶療金屬之螯合劑、肽基或非肽基標記或偵測標籤或清除改質劑（諸如，聚乙二醇之各種異構體、與第三組份結合之肽或另一碳水化合物或親脂劑）。例示性抗體片段上鑑別之位點主要處於所有種類抗體上充分保守之抗體的恆定域。此等位點應廣泛適用於其他抗體，無需進一步對特定抗體結構進行結構設計或認識，且 128838.doc -161 - 200840822 不干擾抗體可變域固有之抗原結合性質。 PHESELECTOR檢定（用於選擇反應性硫醇之噬菌體 ELISA ’揭示於w〇 2〇〇6/〇34488(以全文引用的方式併入本文中）中）允許以ELISA噬菌體格式偵測抗體中反應性半脱胺酸基團。將相關蛋白（例如，抗體）塗佈於孔表面上接著用噬菌體粒培育且接著用吸光率偵測HRp標記之二次抗體的方法詳述於WO 2006/034488中。可以快速、穩固及高產置方式篩檢在噬菌體上呈現之突變蛋白。使用相同方法可自抗體或其他蛋白之隨機蛋白_噬菌體文庫產生半胱胺酸工程化抗體文庫且使其經受結合選擇以鑑別游離Cys併入之適當反應性位點。此技術包括使噬菌體上呈現之半胱胺酸突變蛋白與亦具硫醇反應性之親和試劑或報導體基團 (reporter group)反應。可用於治療癌症之半胱胺酸工程化抗體包括（但不限於）抗細胞表面受體及腫瘤相關抗原（TAA)之抗體。該等抗體可以裸露抗體（未與藥物或標記部分接合）形式或以式工、 la、la’或II之抗體-藥物接合物（ADC)之形式使用。腫瘤相關抗原在此項技術中已知且可使用此項技術中熟知之方法及資訊來製備以用於產生抗體。試圖發現用於癌症診斷及療法之有效細胞標靶’研究人員已尋求鑑別跨膜或其他腫瘤相關多肽，如與在一或多個正常非癌多狀在一或多個特定類型之癌細胞表面上特異現= 如與同癌症不相關之非内皮細胞相比，該等多狀在血管生成細胞（諸如，血管内皮細胞）表面上特異性表現。如與非 128838.doc -162- 200840822 癌、田胞或非血官生成細胞表面上相比，該等腫瘤相關多肽通常在癌細胞或血管生成細胞之表面上更？表1該等腫瘤相關細胞表面抗原多肽之鑑別已產生特異絲向癌細胞或血管生成細胞之能力以、經由基於抗冑之療&而進行破壞。在又另一實施例中，抗體可與"受體"（諸如，抗生蛋白 1菌素）接合以用於腫瘤預靶向，其中將抗體_受體接合物投與患者，接著使用清除劑自循環中移除未結合之接合物且接著將與細胞毒性劑（例如，放射性核苷酸）接合之，，配位體π (例如，親和素（avidin))投與。 VIII·使用抗R〇|)〇4抗趙治療之方法 /函盍本明之抗R〇b〇4抗體（包括（例如）裸露抗尺〇1)〇4抗體及ADC)可用以治療（例如）以腫瘤或血管生成相關抗原 (諸如，Robo4)之過度表現為特徵的各種疾病或病症。過度增生性病症之例示性病狀包括與異常或不需之血管細胞增殖相關之病理病狀，諸如在包括（但不限於）以下病症之病症中異常或不需之血管細胞增殖··癌症、血管生成及與實體腫瘤及轉移有關之病症（例如藉由經歷病症之組織内内皮細胞增殖而擴大之病症）、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新生血管性疾病 (諸如增生性視網膜病，例如糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼）、移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎及牛皮癣0 128838.doc 163 - 200840822 在動物模型及基於細胞檢定中鑑別之抗R〇b〇4抗體及 ADC化合物可進一步在患有腫瘤之高級靈長類動物及人類臨床試驗中予以測試。人類臨床試驗可經設計以測試本發明之抗R〇b〇4單株抗體或免疫接合物在經歷以下病症之患者中的功效：細胞增殖病症，包括（但不限於）與異常或不需之内皮細胞增殖有關的病理病狀，諸如包括（但不限於）以下病症之病症中的異常或不需之血管細胞增殖：癌症、血官生成及與實體腫瘤及轉移有關之病症（例如，藉由經歷病症之組織内内皮細胞增殖而擴大之病症）、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新生金官性疾病（諸如增生性視網膜病，例如糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼）、移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關筇炎及牛皮癬。臨床試驗可經設計以評估抗R〇b〇4抗體與已知之治療方案（諸如，包含已知之化學治療劑及/或細胞毒性劑的輻射及/或化學療法）組合之功效。癌症可包含表現R〇b〇4之細胞，以便使本發明之抗 R〇bo4抗體能夠與癌組織内表現R〇b〇4之内皮細胞結合。為確定癌症中之R〇b〇4表現，可利用各種診斷/預後檢定。在一實施例中，R〇bo4過度表現可藉由IHC來分析。可使來自腫瘤活組織檢查之石蠟包埋組織切片經受IHC檢定且相對於著色度及檢查腫瘤細胞之比例給予尺〇七〇4蛋白著色強度標準。在一實施例中，R〇b〇4過度表現可藉由活體内或活體外偵測經可偵測標記物標記的與活體内表現R〇b〇4 128838.doc -164- 200840822 之細胞接觸之抗R〇b〇4抗體來分析。可偵測標記物包括（但不限於）放射性同位素、螢光化合物、金屬及/或磁性奈米顆粒、微泡、螯合配位體及如本文所揭示之其他可偵測標記物。為達成預防或治療疾病之目的，抗R〇b〇4抗體之適當劑量將視如上文所定義之待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、分子係出於預防抑或治療之目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。將分子合適地在某一時刻或經一系列治療投與患者。視疾病之類型及嚴重程度而定，無論（例如）藉由一或多次獨立投藥抑或藉由連續輸液，約1 pg/kg至15 mg/kg (例如，〇1_20 mg/kg)之分子為投與患者之初始候選劑量。 /、i之母日劑里可在約j叫/&§至〗〇〇 mg/kg或更高劑量之範圍内’此視上文所提及之因素而定。待投與患者之Adc 之例示知彳里在母公斤患者體重約H mg至約1 〇之範圍内。對於經數天或更長時間之重複投藥而言，視病狀而定，持績治療直至對疾病症狀之所需抑制發生。例示性給藥方案包含投與約4 mg/kg之初始負荷劑量（1〇ading d〇se)，接著投與約2 mg/kg之抗R〇b〇4抗體之每週維持劑量。其他給藥方木可為適用的。在又另一實施例中，劑量範圍為275_ mg/m。此療法之進程易於藉由習知技術及檢定監測。 A·抗R〇b〇4抗體之投藥 128838.doc -165- 200840822 本發明之抗Robo4抗體（及辅助治療劑）可藉由適於待治療之病狀之任何途徑投與，包括非經腸、皮下、腹膜内、肺内及鼻内投與’且必要時對於局部治療而言可疾病部位内（imralesional)投與。抗R〇b〇4抗體通常將非經腸（亦即輸液）、皮下、肌肉内、靜脈内、皮内、勒内、硬膜外、動脈内及腹膜内投與。此外，抗體適合藉由尤其用降低劑量之抗體脈衝輸液來投與。可藉由任何合適之途徑給藥，例

如藉由注射，諸如靜脈内或皮下注射，此部分係視投藥係短暫抑或慢性而定。 μ μ 為治療癌症或其中發生血管生成之任何疾病，抗_ 抗體或抗體-藥物接合物係經由靜脈内輸液投盥。經由輸液投與之劑量在每次給藥約i 至約1〇，_〆之範圍内，-般為每週一次給藥，總共歷經_、二、三或四次給藥。或者，劑量範圍為約！ μ§/πι2至約1〇〇〇約 1 pg/m2至約 800 ug/m2、的】 7 2 ^ 約1 至約 000 jLtg/m2、約 1 Mg/m2至約 400 、的 2 約 10 M/m 至約 500 pg/m2、約 10 μ〆至約300 _2、約10 _2至約200 或約 1〆至約2〇0 ―2。劑量可每天投與-次，每週投與一次，每週投與多次但少於各於母天次，母月投與多次但少於每天—次，每月投與多次但少於每週—次，每月投與— 次或間歇性投與以減輕戋缥 Α ^和疾病症狀。投藥可以所揭示之時間間隔中之任一者抟綠古有符，直至所治療之疾病或病症之症狀減輕、緩和或消除（你丨‘ (例如，如腫瘤縮減，淋巴瘤、白血病之症狀減輕或消除，左店& # —丄在原^腫瘤未收縮之情況下轉移性 128838.doc • 166 - 200840822 擴散受到抑制（亦即，1 1 ”、、進展存活），眼部新血管生成受到卩H ~ I日7F h投藥可在實現症狀緩解或減輕後繼續，其中該症狀緩解或減輕藉由該繼續投藥而延長。本毛明亦提供一種治療癌症及/或癌症轉移及/或以血管内皮細胞增殖為特徵之眼部病症时法，纟包含將治療有效里之先岫實施例中之任一者中的抗Robo4抗體投與罹患此病症之患者，該抗體未與細胞毒素分子或可偵測分子接合。杬體通常將以約i pg/m2至約1〇〇〇 mg/m2之劑量範圍投與。或者，劑量範圍為約i μ§/ιη2至約8〇〇 pg/y、約 1 Mg/m2 至約 600 pg/m2、約！ pg/m2 至約 4〇() μ§/ιη2、約 10 pg/m2至約 500 pg/m2、約 1〇 μ§/ιη2至約 3〇〇 yg/m2、約 10 pg/m2至約 200 pg/m2或約 1 pg/rn2至約 200 pg/m2。本發明亦提供一種治療癌症及/或癌症轉移及/或以血管内皮細胞增殖為特徵之眼部病症的方法，其包含將治療有效量之先前實施例中之任一者中的抗R〇b〇4抗體投與罹患此病症之患者，該抗體與細胞毒素分子或可偵測分子接合。抗體通常將以約1 pg/m2至約1〇〇〇 mg/m2之劑量範圍投與。或者，劑量範圍為約1 iug/m2至約800 pg/m2、約 1 pg/m2 至約 600 pg/m2、約 1 pg/m2 至約 400 pg/m2、約 10 pg/m2至約 500 pg/m2、約 10 pg/m2至約 300 pg/m2、約 10 jig/m2至約 200 pg/m2或約 1 pg/m2至約 200 μ§/ηι2。 Β ·醫樂調配物在一態樣中，本發明進一步提供包含至少一種本發明之抗Robo4抗體及/或至少，種其免疫接合物及/或至少—種 128838.doc -167- 200840822 本發明之抗R〇bo4抗體-藥物接合物的醫藥調配物。在_此實施例中，醫藥調配物包含1)抗R〇b〇4抗體及/或抗見〇1)〇4 抗體-藥物接合物及/或其免疫接合物，及2)醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥調配物包含丨）抗R〇b〇4 抗體及/或其免疫接合物，且視情況包含2)至少一種其他户療劑。藉由將具有所需純度之抗體或抗體-藥物接合物與可選之生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合

(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第 16版，〇s〇i A 編（1 980))以水溶液、床乾或其他乾燥調配物之形式來製備包含本發明之抗體或免疫接合物或本發明之抗體_藥物接合物之醫藥調配物以供儲存。在所採用之劑量及濃度下，可接受之載劑、賦形劑或穩定劑對接受者係無毒的，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及曱硫胺酸；防腐劑（諸如氣化十八烧基一甲基 > 基銨；氣化六經季銨；氯化笨甲煙銨；苄索氯銨（benzethonium chloride));苯紛、丁醇或节醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯曱酸甲酯或對羥基苯曱酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；夂戊醇；及間甲酚；低分子量（小於約10個殘基）多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他反水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 128838.doc 200840822 EDTA ;冑，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽平衡離子，諸如鈉；金屬錯合物（例如，Zn_蛋白錯合物）；及/或非離子界面活性劑，諸如tweentm、 PLUronICSTM或聚乙二醇（PEG)。用於活體内投藥之醫藥調配物一般為無菌的。此易於藉由用除菌過渡膜過渡來實現。亦可將活性成份包埋於（例如）藉由凝聚技術或藉由界面聚合而製備之微膠囊（例如，分別為羥甲基纖維素或明膠 ^ 微膠囊及聚（甲基丙烯酸曱酯）微膠囊）中，包埋於膠狀藥物遞送系統（例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊）中或包埋於巨乳液中。該等技術揭示於

Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 16版，〇s〇i，八編 (1980) 〇用於活體内投藥之調配物必須無菌。此易於藉由用除菌過濾膜過濾來實現。 _ 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有本發明之抗體或免疫接合物之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如，聚（2_ 每乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚交酯（美國專利第 3’773,919 5虎）、L -麵胺酸與γ-乙基-L -麵胺酸g旨之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物（諸如，LUPRON DEPOT™)(由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林（leuprolide acetate)組成之可注射微球體）及聚_ 128838.doc -169- 200840822 ()3 $工基丁酸。雖然聚合物（諸如，乙烯_乙酸乙婦酯及乳文乙醇g文）使为子能夠釋放歷時1⑽天，但某些水凝膠釋放蛋白歷時較短時間。當經囊封之抗體或免疫接合物保持在體内長時間時，由於暴露於37°C下之水分，故其可能變性或聚集，導致生物活性之損失及免疫原性可能之改變。視所涉及之機制而定’可設計合理策略以求穩^。舉例而吕，若發現聚集機制為經由硫基_二硫化物互換之分子間 S-S鍵形成，則穩定化可藉由改質巯基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用合適添加劑且研製特定聚合物基質組合物來達成。如為所治療之特定適應症所需，本文之調配物亦可含有一種以上活性化合物，較佳為具有不會彼此不利地影響之互補活性的活性化合物。該等分子以有效達成所欲目的之量適當組合存在。 C·組合療法本發明之抗Robo4抗體可與至少一種具有抗癌性質之其他化合物組合於醫藥組合調配物中，或以組合療法組合於給藥方案中。醫藥組合調配物或給藥方案之至少一種其他化合物對抗Robo4抗體組合物較佳具有互補活性，以使其不會彼此不利地影響。該至少一種其他化合物可為化學治療劑、細胞毒性劑、細胞激素、生長抑制劑、抗激素劑及其組合。該等分子以有效達成所欲目的之量適當組合存在。含有本發明之抗 R〇b〇4抗體之醫藥組合物亦可包含治療有效量之化學治療 128838.doc -170· 200840822 劑，諸如微管蛋白形成抑制劑、拓撲異構酶抑制劑或DNA 結合劑。在一態樣中，第一化合物為本發明之抗R〇b〇4 ADC且該至少一種其他化合物為除抗Robo4抗體（裸露抗體或ADC) 外之治療抗體。在一實施例中，該至少一種其他化合物為結合癌細胞表面標記物之抗體。在一實施例中，該至少一種其他化合物為抗HER2抗體曲妥珠單抗（trastuzumab)(例如，Herceptin®，Genentech, Inc., South San Francisco, CA)。在一實施例中，該至少一種其他化合物為抗HER2抗體帕妥珠單抗（pertuzumab)(OmnitargTM，Genentech，Inc·， South San Francisco, CA，參見 US6949245)。在一實施例中，該至少一種其他化合物為抗VEGF抗體（例如 AVASTIN®，Genentech，Inc·)。在一實施例中，該至少一種其他化合物為抗體（裸露抗體或ADC)，且其他抗體為第二、第三、第四、第五、第六抗體或更多抗體使得該第二、第三、第四、第五、第六或更多抗體之組合（裸露或以ADC形式）有效治療表現Robo4之組織中的細胞增殖疾病。其他治療方案可與根據本發明所鑑別之抗癌劑之投與組合，包括（但不限於）放射療法及/或骨髓及外周血液移植及 /或細胞毒性劑、化學治療劑或生長抑制劑。在該等實施例中之一者中，化學治療劑為諸如環磷醯胺、羥基柔紅黴素、阿黴素、多柔比星、長春新鹼（ONCOVINtm)、潑尼龍、CHOP、CVP或COP或免疫治療劑（諸如，抗PSCA、抗 128838.doc • 171 - 200840822 ER2(例如’ HERCEpTl_、〇讀撤g顶）或抗v膨（例如，AVASTIN®))之藥劑或藥劑組合。組合療法可以同時或 =方案投與。當依序投與時，組合可以兩次或更多次投樂來投與:組合投藥包括使用單獨調配物或單一醫藥調配物共同投藥及以任—次序連續投藥，其中較佳存在兩種 (或全部）活性劑同時發揮其生物活性的時段。 ^ Λ把例中’用抗R°b。4抗體治療包含本文所鑑別之

抗癌d 14或多種化學治療劑或生長抑制劑組合投與，包括不同化學治療劑之混合液共同投與。化學治療劑包括紫㈣（諸如’太平洋紫杉醇及多稀紫杉醇）及/或蒽環徽素抗生素:該等化H療劑之製備及給藥時程可根據廠商說明或如熟習此項技術者憑經驗確定來使用。該等化學療法之製備及給藥時程亦描述於，，Chem〇therapy "，㈣2) 編，M.C. Perry，Williams & Wilkins，BaiUm〇re，遍。以上共同投與之藥射之任—者的合適劑量為彼等目前所用量且可由於新鑑狀藥劑及其他化學治療劑或治療之組合作用（協同作用）而降低。組合療法可提供"協同作用"且證明具"增效"，亦即活性成份一起使用時所實現之作用大於由單獨使用該等化合物所引起之作用的總和。當活性成份：（1)共同調配且以組合之單位劑量調配物同時投與或遞送；(2)藉由以單獨調配物交替或並行遞送；（3)藉由一些其他方案時可實現増效作用。當以交替療法遞送時，增效作用可在（例如）藉由在單獨注射器中進行不同注射來依序投與或遞送化合物時實 128838.doc -172- 200840822 現。一般而言，在交替療法期間，依序（亦即依次）投與有 _之各活性成份，而在組合療法中，一起投與有效劑量之兩種或兩種以上活性成份。為達成預防或治療疾病之目的，本發明之抗體之適當劑量（單獨使用或與諸如化學治療劑之其他藥劑組合使用時）將視待治療之疾錢型、抗體類型、錢之嚴重程度及病矛王、抗體係出於預防抑或治療之目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。將抗體合適地在某一時刻或經一系列治療投與患者。視疾病之類型及嚴重程度而定，無論（例如）藉由一或多次獨立投藥抑或藉由連續輸液，約！ pg/kgSb mg/kg(例如，0.1-10 mg/kg)之抗體為投與患者之初始候選劑量。一典型之每日劑量可在約i ^^/4至1〇〇 mg/kg或更高劑量之範圍内，此視上文所提及之因素而定。對於經數天或更長時間之重複投藥而言，視病狀而定，持續治療直至對疾病症狀之所需抑制發生。一例示性抗體劑量在約〇〇5㈤以“ 至約10 mg/kg之範圍内。因此，可將約〇 5 mg/kg、 2_0 mg/kg、4·0 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合）中之一戍多種劑量投與患者。該等劑量可間歇性投與，例如每週或每三週投與（例如，以使患者接受約兩次至約二十次抗體給藥，例如約六次抗體給藥）。最初可投與較高負荷劑量’接著可投與一或多種較低劑量。一例示性給藥方案包含投與約4 mg/kg之初始負荷劑量，接著投與約2 ^^/^之每週維持抗體劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此 128838.doc -173- 200840822 療法之進程易於藉由習知技術及檢定監測。 IX·標記抗體及其用途本發明亦提供經標記之抗Rob〇4抗體。標記抗體可適用於診斷檢定，例如活體外、離體或活體内檢定，以债測特定細胞或組織中R〇b〇4之表現（例如使血管生成、新血管生成及/或腫瘤維管結構顯像）。在一些實施例中，標記抗體用於活體内顯像檢定。本發明之抗R〇b〇4抗體可與可共價連接抗體之任何標記部分接合。在一些實施例中，本發明之抗Robo4抗體（包括（例如）半胱胺酸工程化抗R〇b〇4抗體）經由抗體上之反應基團（諸如，反應性離胺酸或半胱胺酸殘基）與抗體共價連接。經由反應性半胱胺酸硫醇基之共 "ί貝連接揭示於 Singh 等人，304:147-15

(2002) ; Harlow Ε·及 Lane，D. (1999) Using Antibodies: A

Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ； Lundblad R.L. (1991) Chemical

Reagents for Protein Modification，第 2 版，CRC Press， Boca Raton，FL 中。所連接標記可用以：（i)提供可偵測信號；（ii)與第二標記相互作用以修改由第一或第二標記提供之可偵測信號，例如發出FRET(螢光共振能量傳遞）；（iii)穩定與抗原或配位體之相互作用或增強與其之結合親和力；(iv)藉由電荷、疏水性、形狀或其他物理參數影響移動性，例如電泳移動性或細胞滲透性；或&)提供捕捉部分以調節配位體親和力、抗體/抗原結合或離子錯合作用。 128838.doc -174- 200840822 對於診斷應用，抗體通常經可偵測部分標記。可利用一般可为成以下類別之大量標記： (a) 在一些實施例中，抗Rob〇4抗體經放射性同位素 (放射性核素，radionuclide)標記，諸如3H、nC、14C、 18F、19F、32p、35S、64Cii、68Ga、86γ、99Tc、111][n、123i、 I、 1、1311、133Xe、177Lu、211At 或 213Bi。放射性同位素標記之抗R〇b〇4抗體可用於表現R〇b〇4之細胞之受體標輕顯像中（例如用於本發明之診斷用途，諸如腫瘤内皮細 _ 胞、腫瘤維管結構、血管生成及新血管生成之活體内顯像）。 (b) 在一些實施例中，使用价尸μ Immunology，第 1 卷及第 2 卷，Coligen 等人編，WUey_ Interscience，New York，NY，Pubs. (1991)中所述之技術，將抗Robo4抗體用配位體試劑標記，該等配位體試劑與放射性同位素金屬結合、螯合或以其他方式錯合，其中試劑 _ 對抗體之工程化半胱胺酸硫醇具反應性。可與金屬離子錯合之螯合配位體包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA及 TETA(Macr〇cyclics，Dalias，τχ)。諸如 dotA-順丁烯二醯亞胺（4-順丁烯二醯亞胺丁醯胺基苄基_D〇TA)之螯合連接子试劑可藉由根據Axworthy等人（2000)尸則^ 97(4)·· 1 802-1807之程序使胺基苄基-D〇TA與經氯曱酸異丙酯（Aldrich)活化之4-順丁烯二醯亞胺丁酸（Fluka)反應來製備。使DOTA-順丁烯二醯亞胺試劑與半胱胺酸工程化抗體之游離半胱胺酸胺基酸反應且在抗體上提供金屬錯合配位 128838.doc -175- 200840822 體（Lewis 等人，价C/zem. 9:72-86 (1998))。諸如 DOTA-NHS(1，4,7，10-四氮雜環十二烷-l，4,7，l〇-四乙酸單 (N-羥基琥珀醯亞胺酯））之螯合連接子標記試劑可購得 (Macrocyclics，Dallas, TX)。放射性核素可經由與本發明之抗體·藥物接合物錯合來把向（Wu等人， 23(9):1137-1146(2005))。藉由偵測且量化腫瘤組織中逐漸積累之抗體，用放射性核素標記之抗體進行受體標靶顯像可提供增加之標革巴表現的標記（Albert等人，B/oorg. Med. C/iem. Zeii· 8:1207-1210(1998))。經接合之放射-金屬可在溶酶體降解之後保持在細胞内。

適合作為用於顯像實驗之抗體標記的金屬-螯合錯合物揭示於以下文獻中：US 5342606 ; US 5428155 ; US 53 16757 ； US 5480990 ； US 5462725 ； US 5428139 ； US

5385893 ； US 5739294 ； US 5750660 ； US 5834456 ； Hnatowich 等人（1983) J. Immunol· Methods 65:147-157 ； Meares等人，Χπα/·价oc/zem. 142:68-78 (1984) ; Mirzadeh 等人，价oconj’wgaie C/zem. 1:59-65 (1990) ; Meares等人， J. Cancer, Suppl. 10:21 -26 (1990) ; Izard 等人，

Ckm· 3:346-350 (1992) ; Nikula等人，iVwc/· Med· 5/(9/· 22:387-90 (1995) ; Camera 等人，iVwc/. Med· 5ζ·ο/· 20:955-62 (1993) ; Kukis 等人，J. MW· 39:2105-2110 (1998) ; Verel等人，J. Nucl. Med. 44:1663-1670 (2003) ; Camera 等人，J. Med· 21:640-646 (1994) ; Ruegg等人，50:4221-4226 (1990); 128838.doc -176- 200840822

Verel 等人，j. Med 44:1663-1670 (2003) ; Lee 等人 ’ Ca/?cer 及以.61:4474-4482 (2001) ; Mitchell等人，/· Med· 44:1105-1112 (2003) ; Kobayashi 等人，仏oc<97y.wgaie C/zem. 10:103-111 (1999) ; Miederer等人，J. A^c/. Med. 45:129-137 (2004) ; DeNardo 等人，C/z.m.ca/ CaMer 4:2483-90 (1998) ; Blend等人，

Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363 (2003)； Nikula^A ^ J. NucL Med. 40:166-76 (1999) ； Kobayashi# 人，·/. NucL Med. 39:829-36 (1998) ; Mardirossian等人， TVwc/. Md. 5b/· 20:65-74 (1993) ; Roselli等人，C⑽cer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, )A:209-20 (1999) o (c) 在一些實施例中，將抗Robo4抗體用諸如以下各物之螢光標記來標記：稀土金屬螯合物（銪螯合物），螢光素類型，包括FITC、5-羧基螢光素、6-羧基螢光素；若丹明類型，包括TAMRA ; 丹磺醯（dansyl); 麗絲胺 (Lissamine);花青（cyanine);藻紅素（phycoerythrin);得克薩斯紅（Texas Red);及其類似物。舉例而言，可使用同上之Cwrrewi Proioeo/s M 幻/中所揭示之技術使螢光標記與抗體接合。螢光染料及螢光標記試劑包括可自 Invitrogen/Molecular Probes(Eugene， OR)及 Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL)購得之螢光染料及螢光標記試劑。 (d) 在一些實施例中，將抗Robo4抗體用可得或已揭示 (美國專利第4,275，149號）之各種酶-受質標記來標記。酶一 128838.doc -177- 200840822 般催化發色受質之化學改變，此可使用多種技術來量測。舉例而言，酶可催化受質變色，此可藉由分光光度法量測。或者，酶可改變受質之螢光或化學發光。用於量化螢光改變之技術在上文描述。化學發光受質藉由化學反應而電子激發且接著可發出可（例如使用化學發光分析儀）量測之光或貢獻能量至螢光受體。酶標記之實例包括螢光素酶 (例如，螢光蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；美國專利第 4,737,456號）、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化酶（諸如，辣根過氧化物酶（HRP))、鹼性磷酸酶（AP)、-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣類氧化酶（例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）、雜環氧化酶（諸如，尿酸酶及黃嘌呤氧化酶）、乳過氧化物酶、微過氧化物酶及其類似物。用於使酶與抗體接合之技術描述於O’Sullivan等人（1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", Methods in Enzym. (J. Langone^H. Van Vunakis^), Academic Press, New York, 73 :147-166 中。酶-受質組合之實例包括（例如）： (i) 辣根過氧化物酶（HRP)與過氧化氫酶作為受質，其中過氧化氫酶氧化染料前驅體（例如，鄰苯二胺（OPD)或 3,3ί，5,5f-四甲基聯苯胺鹽酸鹽（TMB)); (ii) 鹼性磷酸酶（AP)與對硝基苯磷酸鹽作為發色受質；及 128838.doc -178- 200840822 (ϋ〇半乳糖苷酶（_D-Gal)與發色受質（例如，對硝基苯基半乳糖苷酶)或螢光受質4_甲基傘形酮-^^半乳糖苷酶（4-methylumbemferyl-D-galactosidase)。大量其他酶受質組合對熟習此項技術者而言可用。關於一般綜述，參見 US 4275149及 US 43 18980。才示&己可與抗R〇b〇4抗體（包括（例如）半胱胺酸工程化抗 R〇bo4抗體）間接接合。舉例而言，抗R〇b〇4抗體可與生物素接合且以上所提及之標記之三大類中之任一者可與親和素或抗生蛋白鏈菌素接合，反之亦然。生物素選擇性地與抗生蛋白鏈菌素結合，且因此標記可以此間接方式與抗 R〇bo4抗體接合。或者，為實現標記與抗尺扑〇4抗體之間接接合，使抗R〇bo4抗體與小的半抗原（例如，地高辛 (digoxin))接合且使以上提及之不同類型標記中之一者與抗半抗原多肽變異體（例如，抗地高辛抗體）接合。因此，可實現標記與抗R〇bo4抗體之間接接合（Hermanson，G. (1996), Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego) 〇本發明之抗Robo4抗體可用於任何已知之檢定方法中，諸如ELISA、競爭性結合檢定、直接及間接夾心式檢定及免疫沈殿檢定（Zola，(1987) Monoclonal Antibodies: A Μ⑽wa/第 147-158 頁，CRC Press，Inc·)。本發明之經標記之抗R〇bo4抗體可偵測細胞-表面受體且可用於定位、目測及量化内皮細胞（例如，腫瘤内皮細胞）、血管生成位點、新血管生成位點及/或腫瘤維管結 128838.doc -179- 200840822 構。經標記可偵測之抗體之另一用途係一種基於珠粒之免疫捕捉方法，其包含使珠粒與螢光標記抗體接合且在配位體結合後偵測螢光信號。類似結合偵測方法利用表面電漿共振（SPR)效應以量測及偵測抗體·抗原相互作用。本發明之經標記可偵測之抗Rob〇4抗體可用於任何已知之檢定方法中，諸如ELISA、競爭性結合檢定、直接及間接夾心式才双疋及免疫沈殿檢定（Zola，（1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques，第 147-158 頁，CRC Press，

Inc.) 〇諸如螢光染料及化學發光染料之偵測標記（Briggs等人， «/· CTzem· Soe·，Perkin-Trans· 1:1051-1058 (1997))提供可偵測之信號且一般可應用於標記抗體，其較佳具有以下性貝·（i)標3己抗體應產生具有低背景值之極高信號以便少量抗體在無細胞及基於細胞之檢定中均可敏感地被彳貞測到；及Ο)標記抗體應具光穩定性以便螢光信號可被觀測到、監測及記錄，而無顯著光致漂白^對於涉及標記抗體與膜或細胞表面（尤其活細胞）之細胞表面結合的應用，標記較佳（iii)具有優良水溶性以達成有效接合物濃度及偵測靈敏度，且（iv)對活細胞無毒性以免破壞細胞之正常代謝過程或引起過早細胞死亡。細胞螢光強度之直接量化及螢光標記事件（例如，肽_染料接合物之細胞表面結合）之計數可在使採用活細胞或珠粒之非放射性檢定（Miraglia，"Homogeneous cell· and bead-based assays for high thr〇ughput screening 128838.doc -180- 200840822 fluorometric microvolume assay technology(1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204)自動混合及讀取之系統 (FMAT㊣ 8100 UTS糸統 ’ Applied Biosystems，Foster City,

Calif·)上進行。標記抗體之用途亦包括細胞表面受體結合檢定、免疫捕捉檢定、螢光連接免疫吸附劑檢定 (FLISA)、卡斯蛋白酶（caspase)分裂（zheng，nCaspase-3

controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivol\ (1998) PNAS USA 95:618-23 ;美國專利第6,372,907號）、細胞〉周亡（Vermes， J· /mm㈣ο/· Mei/zo办 184:39-51 (1995))及細胞毒性檢定0 螢光微量檢定技術可用於鑑別藉由靶向細胞表面之分子之上調或下調（Swartzman，」如/.价271:143-51(1999)) 〇本發明之經標記之半胱胺酸工程化抗體可藉由生物醫學及分子顯像之各種方法及技術用作顯像生物標記及探針，該等方法及技術諸如：（i)MRI(磁共振成像）；（ii)X光電腦斷層攝影；（iii)SPECT(單光子發射電腦斷層攝影）；（iv) PET(正電子發身子斷層攝影），Chen等人（2004) Bio conjugate Chem· 15:41-49; (v)生物發光；（Vi)螢光；及（vii)超音波。免疫閃爍攝影術為一種顯像程序，其中將經放射性物質標記之抗體投與動物或人類患者且拍攝在抗體所定位之體内部位處（例如，包括腫瘤維管結構之腫瘤或其轉移）之照片（US 6528624)。可客觀地量測顯像生物標記且作為正常生物過程、病理性過程或對治療干預之藥理學反應的指示而評估。生物標記可具有若千類型：類型0為疾病之自 128838.doc -181 - 200840822 然病史標記且與已知之臨床指數（例如，類風濕性關節炎中滑液炎之MRI評估）縱向相關；類型！標記根據作用機制捕捉干預效應，即使此機制可能並不與臨床結果有關亦如此；類型II標記充當替代終點，其中生物標記之變化或來自其之信號預測臨床益處以”證實”標靶反應，諸如藉由平面X光、MRI或CT在類風濕性關節炎中量測骨侵蝕。因此，顯像生物標記可提供關於（i)標靶蛋白之表現、治療劑與標靶蛋白之接合（亦即選擇性）及（iii)清除率及半衰 _ 期藥物動力學資料的藥效（pD)治療資訊。活體内顯像生物標記相對於基於實驗室之生物標記的優勢包括：非侵襲性治療、可計量之全身評估、重複給藥及評估（亦即多個時間點）及自臨床前（小動物）至臨床（人類）結果之潛在可轉移效應。對於某些應用，生物顯像代替或最小化臨床前研究中動物實驗之數目。肽標記法為吾人所熟知。參見Haugland，2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes， Inc. ； Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2 ； Garman, (1997) Non-

Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London ； Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2 ； Glazeic 專尺{\9Ί5、Chemical Modification of Proteins· Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular (T· S· Work 及 E. Work 編）American Elsevier Publishing Co·，New York ; Lundblad，R, L.及 Noyes，C. M· 128838.doc -182- 200840822 (1984) Chemical Reagents for Protein Modification,第 I卷及第 II卷，CRC Press，New York; Pfleiderer，G. (1985) ffChemical Modification of Proteins11, Modern Methods in Proie，·/? C/zewbiry，H. Tschesche 編，Walter DeGryter， Berlin and New York ;及 Wong (1991) C/zem/sirjK o/iVoieh

Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton， Fla. ; De Leon-Rodriguez 等人（2004) Chem. Eur. J. 10:1149-1 155 ; Lewis 等人（2001) Bioconjugate Chern· 春 12:320-324 ; Li 等人（2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115 ; Mier 等人（2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237。經兩部分足夠接近之螢光報導體及淬滅劑標記的肽及蛋白進行螢光共振能量傳遞法（FRET)。報導體之群通常為螢光染料，其由某一波長之光激發且將能量傳遞至受體或淬滅劑之群，伴隨適當斯托克位移（Stokes shift)以在最大亮度時發射。螢光染料包括具有擴展芳香性之分子，諸如螢光素及若丹明及其衍生物。螢光報導體可部分或顯著地藉 ^ 由完整肽中淬滅劑部分淬滅。在藉由肽酶或蛋白酶使肽分裂之後，可量測到可偵測之螢光增加（Knight，C. (1995) ”Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes’’，Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34) ° 本發明之抗Robo4標記抗體亦可用作親和純化劑。在此過程中，使用此項技術中熟知之方法將標記抗體固定於諸如Sephadex樹脂或濾紙之固相上。使經固定之抗體與含有待純化之抗原之樣品接觸，且此後用合適之溶劑洗滌支撐 128838.doc -183 - 200840822 物，其將實質上移除樣品中除待純化之抗原（其與經固定之抗體結合）外的全部物質。最後，用另一合適之溶劑（諸如甘胺酸緩衝液，pH 5.0)洗滌支撐物，其將使抗原自抗體釋放。標記試劑通常帶有反應官能基，其可⑴與半胱胺酸工程化抗體之半胱胺酸硫醇直接反應以形成標記抗體；（π)與連接子試劑反應以形成連接子-標記中間物，或（iii)與連接子抗體反應以形成標記抗體。標記試劑之反應官能基包括·順丁細一亞胺、鹵乙酿基、峨乙酿胺、號j自酿亞胺酯（例如，NHS，N-羥基琥珀醯亞胺）、異硫氰酸酯、磺醯氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯酯及胺基磷酸酯，但亦可使用其他官能基。例示性反應官能基為可偵測標記（例如，生物素或螢光染料）之羧基取代基的N-羥基琥珀醯亞胺酯（NHS)。該標記之NHS酯可經預先形成、分離、純化及/或表徵，或其可原位形成且與抗體之親核基團反應。通常，標記之羧基形式藉由與以下各物之某些組合反應來活化以產生標記之Nhs 酯：碳化二亞胺試劑，例如二環己基碳化二亞胺、二異丙基碳化二亞胺；或錁試劑，例如TSTU(四氟硼酸〇-(N-琥珀醯亞胺基）-N，N，N’，N，-四曱錁）、HBTU(六氟磷酸（〇-苯并三嗤-1-基）-N，N，N’，N，-四甲錁）或HATU(六氟磷酸〇-(7-氮雜苯并三唑_1_基）-N，N，Nf，NL四甲錁）；活化劑，諸如1-羥基苯并三唑（HOBt)及N-羥基琥珀醯亞胺。在一些狀況下，標記及抗體可藉由標記之原位活化及與抗體之反應來偶合以一 128838.doc -184- 200840822 步形成標記-抗體接合物。其他活化及偶合劑包括TBTU(六氟磷酸2-(1Η-苯并三唑-1-基）-1，1，3,3-四甲錁）、TFFH(2-氟-六氟磷酸Ν，Ν’，Ν”，：ΝΤ·四曱錁）、PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-參-N-吡咯啶基-鱗）、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氫-喹啉）、DCC(二環己基碳化二亞胺）、 DIPCDI(二異丙基碳化二亞胺）、MSNT(l-(均三甲苯-2-磺酿基）-3 -硝基-1Η -1，2，4 -三嗤）及芳基績酿基鹵化物，例如三異丙基苯績酸氯。 Φ 本發明之經標記可偵測之抗體可藉由與磁性顆粒或奈米顆粒或金屬顆粒或奈米顆粒連接（包括共價接合）而偵測。金屬顆粒可藉由諸如磁共振成像（MRI)、單個顆粒或單個分子追蹤、免疫細胞化學、暗場照明下之電漿子頻率、微分干涉差及影像增強、全内反射及光熱干涉差（PIC)技術之方法偵測（例如參見尸AM夕USA 100(20):1 1350-1 1355 (2003) ; Sheetz 等人，仏〜340:284-288 (1989);

Baschong等人，//bioc/zem/siry 83:409-411 (1985) ; Slot及 • Geuze，Ewr. Ο// 5ζ·ο/· 38:87-93 (1935) ; Frey及 Frey /· Struct·价〇/. 127:94-100 (1999) ; Hainfeld 及 Powell，J.

Histochem. Cytochem. 48:471-480 (2000) ; Schultz 等人， PNAS USA 97:996-1001 (2000) ; Gelles 等人，iVa⑼re 331:450-453 (1988) ; Sonnichsen 等人，Ze"· 77:2949-295 1 (2000) i Boyer, D.等人，Science 297:1 160-1 163 (2002))。本發明之抗Robo4抗體可包含奈米顆粒劑，其包括（但不限於）微泡（參見Ellegala等人，C/rcwMWow 128838.doc -185- 200840822 108:336-341 (2003)，亦稱為聲學活性脂質球（AAL)(參見

Tartis 等人，Ultrasound Med. Biol. 32(11): 1771-80 (2006)))、超順磁性劑、脂質體、全氟化碳奈米顆粒乳液 (WO 2005104051)及樹枝狀聚合物（參見Caruthers等人， Methods in Molecular Medicine, 124:387-400 (2006)及其中引用之參考文獻，所有彼等參考文獻均以全文引用的方式併入本文中）。

當經標記之抗R〇bo4抗體用於偵測（例如，在閃爍攝影術研究中）時，標記可包含放射性原子（例如，At2〗】、、 I125、Y9G、ReU6、Rel88、^153、則212、p32、外 2i2及 ^ 之放射性同位素）或用於核磁共振（NMR)成像（亦稱為磁共振成像，mri)之旋轉標記，諸如Tc99m、1231、lllln、mi、 %、巾、％、、、17〇、23他、311>或13^亂、猛、鐵或鐵氧化物（例如’超順磁氧化鐵顆粒（spiL)4超小順磁氧化鐵顆粒（USPIL))或其他NMR可觀測之試劑。 X·製造物件在本發日m態樣中’提供—種含有可用於治療、預防=/或診斷上述病症之物質的製造物件。該製造物件包 3令益及在备益上或與容器相聯之標記或包裝插頁。合適之容器包括（例如）瓶子、小瓶、注射器等。容器可由諸如 :璃或塑料之各種材料形成。容器存放組合物自身或與另 -有效治療、預防及/或診斷病狀之組合物組合的組合物 :::有無菌入孔(例如，I器可為具有可藉由皮下注射，十刺牙之塞子的靜脈内溶液袋或小瓶)。組合物中至少一 128838.doc 200840822 種活性劑為本發明之抗體。標記或包裝插頁表明組合物用於治療所選病狀，諸如癌症。此外，製造物件可包含：(a) 其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及（b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑。本發明之此實施例中之製造物件可進一步包含包裝插頁，該包裝插頁表明第一及第二抗體組合物可用於治療特定病狀，例如癌症。或者或另外，製造物件可進一步包含第二（或第三）容器，該容器包含醫藥學上 • 可接受之緩衝劑，諸如抑菌性注射用水（BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液（Ringer’s solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者立場需要之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾、器、針及注射器。以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解在給出以上所提供之一般描述下可實施各種其他實施例。實例根據 Kabat(Kabat 等人，Sequences of proteins of immunological interest, 第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991))對抗體胺基酸序列内之胺基酸殘基編號。使用單字母胺基酸縮寫。使用IUB碼表示DNA之簡幷（N=A/C/G/T，D=A/G/T， V=A/C/G，B = C/G/T，H=A/C/T，K=G/T，M=A/C， R=A/G，S = G/C，W=A/T，Y=C/T)。實例1 :來源於編碼起始抗體之高變區之噬菌體的抗體使用 HERCEPTIN® 抗 HER2 抗體 rhuMAB 4D5-8 128838.doc •187- 200840822 (Genentech，Inc.)之VL及VH域的核酸序列作為HVR突變誘發及針對與圖5B中所示之人類Robo4 His標籤抗原或人類 Rob4-Fc融合蛋白結合之噬菌體選擇的起始序列。抗體4D5 為人化抗體，其對稱為HeT-2(erbB2)之癌症相關抗原具特異性。抗體包括具有一致構架區之可變域；少數位置在增加人化抗體親和力之過程期間回復至小鼠序列。人化抗體 4D5之序列及晶體結構已描述於美國專利第6,054,297號， Carter等人，尸见89:4285 (1992)中，晶體結構顯示於 J· Mol. 229:969 (1993)及線上 www/ncbi/nih/gov/ structure/mmdb(MMDB#s-990-992)中。HERCEPTIN⑧ VL 及VH域分別包含一致人類κΐ VL域及人類亞群III 一致VH域之變異體。變異VH域具有3個自人類一致之變化：R71A、 N73T及 L78A。用於此項工作之噬菌粒為具有2個在phoA啟動子控制下之開放閱讀框架的單價Fab-g3呈現載體（pV0350-2B)，基本上如 Lee等人，J· Mol. Biol· (2004)，340(5):1073-93 中所述。第一開放閱讀框架由與受體輕鏈之VL及CH1域融合之 stll信號序列組成，且第二開放閱讀框架由與受體重鏈之 VH及CH1域後接截短之次噬菌體鞘蛋白P3融合的stll信號序列組成。參見Lee等人，J. Mol. Biol· (2004)， 340(5):1073-93 ° 實例2 :由重鏈HVR之突變誘發所產生之抗艎由 huMAb 抗體，Genentech，

Inc.)重鏈之HVR-H1、H2及H3產生突變誘發且針對人類 128838.doc -188- 200840822

Robo4-His標籤抗原融合蛋白選擇來產生Fab純系YW71.6、 YW71.1、YW71.22及 YW71.89。在 HVR-H1 中，Kabat位置 26(G)、27(F)、28(T)、29(1)、34(1)及 35(H)保持恆定，且改變位置30-33上之胺基酸。在HVR-H2中，Kabat位置 51(1)、52a(P)、55(G)、57(T)、59(Y)、60(A)、61(D)、 62(S)、63(V)、64(Κ)及65(G)保持恆定，且改變位置49、 50、52、53、54、56及58。在11¥11-113中，1^5&1位置 93(A)及102(Υ)保持恆定，且改變位置94-100、l〇〇a_h及 101。YW71.22之輕鏈為經修飾之huMAb 4D5-8序列（在位置30、66及91上修飾產生SEQ ID NO: 168，包含SEQ ID ΝΟ:1、2及3分別作為HVR-L1、L2及L3)，彼等HVR在噬菌體選擇期間不改變。藉由使用標準突變誘發技術使所選擇之胺基酸位置產生突變誘發，從而將序列多樣性引入各高變區。噬奢邀文肩之產在37°C下，將針對各高變區而設計之隨機化募核苷酸池分別在六個含有660 ng募核苷酸、 50 mM Tris pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM ATP、20 mM DTT及5 U聚核苷酸激酶之20 μΐ反應物中磷酸化1 h。接著將六個磷酸化募核苷酸池與20 pg Kunkel模板在50 mM Tris pH 7.5、10 MgCl2中組合，最終體積為500 μΐ，使得寡核苷酸對模板之比率為3。將混合物在9 0 °C下黏接 4 min，在50°C下黏接5 min且接著在冰上冷卻。使用修改方案用卩1八()1；1(：〖顶？〇11純化套組（(^&8011套組281〇6)將未黏接之過量募核苷酸移除以防止經黏接之DNA過度變性。 128838.doc -189- 200840822 將150 μΐ PB添加至500 μΐ經黏接之混合物中，且將混合物在2個二氧化矽管柱之間分離。在用750 μΐ ΡΕ洗滌各管柱且進行額外旋轉以乾燥管柱之後，用110 μΐ 10 mM Tds、 1 mM EDTA(pH 8)溶離各管柱。接著藉由在室溫下添加 1 μΐ 100 mM ATP、10 μΐ 25 mM dNTP(dATP、dCTP、 dGTP及 dTTP各 25 mM)、15 μΐ 100 mM DTT、25 μΐ 10X TM緩衝劑（0.5 M Tris pH 7.5, 0.1 M MgCl2)、2400 U T4連接酶及3 0 U T 7聚合酶來填充經黏接及淨化之模板 (220 μΐ)，歷時3 h。在Tds-乙酸鹽-EDTA/瓊脂糖凝膠上分析經填充之產物 (Sidhu 等人，Methods in Enzymology 328:333-363 (2000))。通常可見三條帶··底部條帶為正確填充且接合之產物，中部條帶為經填充但未接合之產物，且頂部條帶為鏈替代之產物。頂部條帶係由T7聚合酶之固有副活性（side activity)產生且難以避免（Lechner 等人，J. C/zem. 258:11 174-11 184 (1983));然而，此條帶比底部條帶少30 倍有效轉變，且通常對文庫有很少貢獻。中部條帶係歸因於最終接合反應缺乏5’磷酸鹽；此條帶有效轉變且主要產生野生型序列。接著將經填充之產物純化且電穿孔至SS320細胞中且在 M13/K07輔助噬菌體存在下繁殖，如Sidhu等人，iWW/zoA in Enzymology 328:333-363 (2000)戶斤述。文庫大小在 l-2x 109獨立純系之範圍内。將來自初始文庫之隨機純系定序以評估文庫品質。 128838.doc -190 - 200840822 蜜磨禮選擇-人類Rob 〇 4-Fc及Rob 〇 4-His標籤蛋白用作選擇抗原。將人類R〇b〇4-Fc及Robo4-His以於PBS中10 pg/ml 塗佈於MaxiSorp微量滴定盤（Nunc)上且在4°c下培育隔伙Q對於第一輪選擇，使用12個標靶孔。使用噬菌體阻斷緩衝液（1% BSA”05% Tween® 20, PBS)在室溫下將孔阻斷 1小時。嗟菌體文庫為來自冷凍甘油儲備液之peg沈澱，將其再懸浮於噬菌體阻斷緩衝液中且在室溫下培育i小時。接著將噬菌體文庫添加至在室溫下培育隔夜之經阻斷之抗原培養盤。結合隔夜後，藉由用洗滌緩衝液（pBS， 05% TWeen®20)洗滌將未結合或非特異性結合之噬菌體自抗原培養盤移除。藉由用5〇 rnM HC1、0·5 M KC1培育孔 30 min來溶離所結合之噬菌體。使用Blue細胞及 ]^13/1^07辅助噬菌體將噬菌體擴增且在3()。(：：下在2¥1、 50 pg/ml 卡本西林（carbanecillin)、50 pg/ml 卡那黴素 (kanamycin)、10 pg/mi四環素中生長36小時。接著使用經修改之PEG沈殿方案（Clackson及Lowman 2004)回收經擴增之fe體。將自標乾塗佈孔溶離之嗟菌體力價與自非標輕塗佈孔回收之嗟菌體力價相比以評估富集。伴隨標靶孔之數目減少至4(第2輪）及2(第3輪及第4輪），完成四輪噬菌體選擇。酪蛋白阻斷緩衝液（Pierce)用作抗原培養盤及第2輪及第4輪嗟菌體之阻斷試劑。第2輪至第4輪選擇使用3-4小時嗟菌體-抗原結合時間且增加洗滌嚴格性。選擇四個嗟菌體純系：YW71.6、YW7.1、YW71.22及 YW71.89。確定輕鏈域及重鏈域之序列且其顯示於圖1A& 1B中。R〇b〇4結 128838.doc -191 - 200840822 合特徵如下文所揭示來確定。實例3 :藉由使HVRH1、H2、H3及U變異而產生之抗體由 huMAb 4D5-8(HERCEPTIN®抗HER2抗體，Genentech， Inc.)重鏈可變域及huMAb 4D5_8修飾之輕鏈可變域之11¥11-111、112、113及1^(8丑(5 10 1^0:168)之突變誘發來產生純系 YW79.1、YW79.8 及 YW79.11。在 HVR-H1 中，Kabat位置 26(G)、28(T)、29(F)、30(S)、31(S)及 35(S)保持恆定，且改變位置27、32-34上之胺基酸。在HVR-H2中，Kabat位 φ 置 49(S)、51(1)、55(G)、57(T)、59(Y)、60(A)、61(D)、 62(S)、63(V)、64(Κ)及65(G)保持恆定，且改變位置50、 52、52a、53、54、56 及 58。在 HVR-H3 中，Kabat位置 93(A)、94(R)、100f-g(缺失）保持恆定，且改變位置95-100、100a-e、100h 及 102。在 HVR-L3 中，Kabat 位置 89(Q)、90(Q)、95(P)及97(T)保持恆定，且改變位置91-94 及96。HVR-L1之序列保持恆定為RASQSISSYLA(SEQ ID NO:7)且HVR-L2之序列保持恆定為GASSRAS(SEQ ID NO:8)。藉由使用標準突變誘發技術使所選擇之胺基酸位置產生突變誘發，從而將序列多樣性引入各高變區。選擇抗Robo4抗體純系YW79.1、YW79.8及YW79.11且將其定序。輕鏈可變區及重鏈可變區之序列顯示於圖1A及1B 中〇實例4 :可溶性R〇bo4及抗Robo4抗體之純化此實例描述可用於純化Robo4抗原及本發明之抗Robo4 抗體之方法。Robo4抗原經純化為與組胺酸標籤融合之可 128838.doc -192- 200840822 溶性Rob〇4胞外域，如圖5B所示。

Robo4抗原純化將人類Robo4構築體（胺基酸Ml至胺基酸L461及胺基酸 Ml至胺基酸Y231)作為與人類igGl之Fc部分之融合或與C 末端組胺酸標籤之融合選殖至真核生物表現載體PRK5 中。將鼠科R〇bo4(Ml至H232)僅作為與C末端組胺酸標籤之融合選殖至pRK5中。所有蛋白均藉由CHO細胞之瞬時轉染產生。對於Fc融合蛋白使用蛋白-A SepharoseTM(GE Healthcare)或對於組胺酸標籤融合使用NiNTA Superflow™(Qiagen)，藉由親和性層析法將蛋白純化至純度>90%。必要時添加離子交換層析步驟（Q-或SP-Sepharose™, GE Healthcare)及/或尺寸排除層析步驟 (SuperdexTM 75，GE Healthcare)。使用埃德曼降解法 (Edman degradation method)藉由N末端定序來確認蛋白一致性，藉由BCA檢定且藉由OD 280吸收量測法來測定濃度，且藉由尺寸排除層析法及SDS-PAGE評估純度。抗體純化全長Robo4抗體係在CHO細胞中瞬時表現且藉由使用蛋白-A Sepharose™(GE Healthcare)進行親和性層析法、接著使用SP-SepharoseTM(GE Healthcare)進行離子交換層析法純化至純度>95%。必要時，添加其他尺寸排除層析步驟 (Superdex™ 200，GE Healthcare)。根據廠商說明（Pierce Chemical Co.)藉由BCA檢定且藉由OD 280吸收量測法來測定抗體濃度，且藉由尺寸排除層析法及SDS-PAGE評估純 I28838.doc -193- 200840822 度。對於所有抗體純化，如藉由雷射光散射所測定之聚集體含量低於5%，如藉由蛋白A ELISA所測定之蛋白A含量低於50 ppm，且如藉由LAL(鱟屬阿米巴細胞溶解產物， Limulus Amoebocyte Lysate)發色内毒素檢定所測定之内毒素含量低於0.5 EU/mg。實例5: 之滅和力泌澈為改良抗R〇bo4抗體YW71.22之親和力，在YW71.22背景下產生三個噬菌體呈現文庫，各文庫靶向多個發生軟隨機突變誘發之HVR，如 Lee等人，J. Mol. Biol. (2004) 中所述。為避免自潛在高模板背景再選擇 YW71.22，在產生各文庫之前將終止密碼子引入待突變之 HVR。使用溶液分類法來增強基於親和力之噬菌體選擇方法之效率。藉由控制生物素標記之標革巴濃度，降低噬菌體捕捉時間至較低背景且添加未經生物素標記之標靶以消除具有較快脫離速率之純系，可熟練選擇高度親和力純系。 Lee等人，J. Mol· Biol· (2004)，340(5):1073-93。自第一輪選擇，觀測到富集（標靶依賴性噬菌體捕捉），表明對人類 Rob〇4具有相當高親和力之大量純系存在於各文庫中。在隨後輪次中增加選擇嚴格性。五輪選擇後，分析來自各文庫之純系。在革巴向六個HVR中之每一者的文庫中觀測到新序列（圖2A及2B)。所選純系經噬菌體ELISA篩檢且接著表現為IgG蛋白且使用Biacore™結合分析表徵其親和力。使用固體/溶液分類法將親和力成熟純系之噬菌體文庫分類。藉由將500 μΐ於PBS中之3.6 mg/ml人類Robo4-His及 128838.doc -194- 200840822 10 μΐ 1 Μ填酸钾（pH 8)與 20 μΐ 4 mM 磺酸基-NHS-LC-生物素（Pierce)混合，對人類Rob〇4_His進行生物素標記。對於第一輪選擇’將生物素標記之R〇b〇4-His以於PBS中10 pg/ml塗佈於MaxiSorp微量滴定盤（Nunc)上且在4°C下培育隔夜。對於第一輪選擇，使用16個標靶孔。使用SuperBl〇ck (Pierce)在室溫下將孔阻斷丨小時。在室溫下將成熟噬菌體文庫在SuperBlock緩衝液中稀釋且培育1小時。接著將嗟囷體文庫添加至經阻斷之抗原培養盤中，在室溫下培育2 小時。結合後，藉由用洗滌緩衝液（PBS，05% Tween(g)2〇) 洗條’將未結合及非特異性結合之噬菌體自抗原培養盤移除。藉由用50 mM HC1、0·5 M KC1培育孔30 min來溶離結合之噬菌體。使用XL-l Blue細胞及M13/K07輔助噬菌體將ϋ數菌體擴增且在30°C下在2YT、50 pg/ml卡本西林、 5 0 pg/ml卡那黴素、1〇 pg/mi四環素中生長％小時。接著使用經修改之PEG沈殿方案（Clackson及Lowman 2004)回收經擴增之嗟菌體。將自標革巴塗佈孔溶離之嗟菌體力價與自非標靶塗佈孔回收之噬菌體力價相比以評估富集。對於第 2輪至弟5輪選擇’實施溶液分類方案。在下，將微量滴定孔用PBS中10 pg/ml中和素（neutravidin)塗佈隔夜且接著使用SuperBlock(Pierce)阻斷1小時。將所回收之嗟菌體文庫懸浮在SuperBlock中且將其與5〇 nM生物素標記之 Robo4-His混合，歷時1小時。在中和素塗佈之孔上捕捉與生物素標記之Robo4-His結合之噬菌體，歷時3〇 min，且用洗滌緩衝液滌除未結合之噬菌體。使用5〇 mM HC1、 128838.doc -195 - 200840822 500 mM KC1將噬菌體溶離，歷時3〇 min，中和且在xu blue細胞（Stratagene)中在 κ〇7輔助噬菌體（New Engiand

Biolabs)存在下繁殖。隨後數輪分類類似執行，但有以下例外·在第2輪中最終生物素標記之R〇b〇4_His濃度為 50 nM，在第3輪中最終生物素標記之R〇b〇4_His濃度為 2 5 nM，在第4輪中最終生物素標記iR〇b〇4_His濃度為 5 nM，且在第5輪中最終生物素標記之R〇b〇4_His濃度為 0·5 nM，其中在中和素上進行捕捉之前將5〇。河未經生物 _ 素標記之Robo4-His添加至此混合物，歷時i小時。選擇與人類R〇b〇4-His結合之若干親和力成熟純系且將其定序。藉由純系YW71.22之親和力成熟獲得之抗體純系的可麦區序列顯示於圖2A(輕鏈可變區）及圖2B(重鏈可變區）中。實例6 ··所選抗R〇b〇4抗艘純系之表徵嗑苈邀五1/5^4-執行噬菌體競爭性結合檢定以測定噬菌體 Φ 呈現之Fab對R〇b〇4之近似結合親和力（測定為噬菌體 IC5〇)。該等檢定如下執行。簡言之，使用如上所述之經修改之PEG沈殿方案自各純系產生經純化之嗤菌體上清液。將經純化之噬菌體上清液在噬菌體阻斷緩衝液中連續稀釋，接著在塗有R〇b〇4-mS(l pg/ml)之培養盤上培育15分鐘。將培養盤用洗滌緩衝液洗滌且用辣根過氧化物酶/抗 M13抗體接合物（在pBS緩衝液中以 1:5000稀釋MAmαsham Pharmacia Biotech)培育30分鐘。將培養盤洗滌，以四甲基聯苯胺（TMB)受質（Kirkegaard 及 Perry Laboratories)發展且 128838.doc -196- 200840822 用0.1N H2S04中止。在450 nm下以分光光度法量測吸光率以測定飽和時產生約50%信號之噬菌體濃度，將固定亞飽和濃度之噬菌體在含有350 nM Robo4至5 nM Robo4之兩倍連續稀釋之R〇bo4-His蛋白的噬菌體阻斷緩衝液中稀釋。將混合物在室溫下於輕輕振盪下培育1小時，轉移至塗有 Robo4-His(l pg/ml)之培養盤，且將培養盤培育20分鐘。如上洗滌及處理培養盤。結合親和力評估為IC5G值（定義為阻斷50%噬菌體與固定抗原結合之抗原濃度）。7個純系之 IC5〇結果顯示於表2中。表2 抗Robo4噬菌體競爭概述

純系噬菌體對人類R〇bo4之IC50 YW71.6 15 nM YW71.22 5nM YW71.1 15nM YW71.89 20 nM YW79.1 15nM YW79.11 <5nM YW79.8 <5nM

產兰及瘸和力廣/定-為表現用於親和力量測之Fab蛋白，將終止密碼子引入噬菌體呈現載體中重鏈與g3之間。將純系轉型至大腸桿菌34B8細胞中且在30°C下於AP5培養基中生長（Presta 等人，Cancer 及以.57: 4593-4599 (1997))。藉由離心收集細胞，將細胞懸浮在10 mM Tds、 128838.doc -197- 200840822 1 mM EDTA(pH 8)中且使用微射流機使其斷開。將Fab用蛋白G親和性層析法純化。藉由表面電漿共振使用BIAcoreTM 2000系統（BIAcore， Piscataway，NJ)執行親和力測定。將R〇bo4-His固定（約 1000反應單位（RU))於CM5晶片上且注射PBST中不同濃度之Fab(4 nm至5 00 nM)。進行各注射後，使用100 mM HC1 再產生晶片。藉由表面電漿共振量測法使用BIACORE® 3000系統 (Biacore，Inc·，Piscataway，NJ)測定三個來源於嗟菌體之抗 Robo4抗體對可溶性R〇b〇4胞夕卜域（ECD)之結合親和力。所測試之抗體包括YW71.6、YW71.22及YW79.8。簡言之，根據廠商說明，將羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片（CM5, Biacore Inc.)用iV-乙基二甲胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)及羥基琥珀醯亞胺（NHS)活化。將此等活化晶片用藉由用10 mM乙酸鈉（pH 4.8)稀釋至5 pg/ml之抗 Robo Fab塗佈，接著以每分鐘5微升/分鐘之流動速率注射以達成約500反應單位（RU)之偶合抗體。接著，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反應之基團。為進行動力學量測，在25°C下以25 μΐ/min之流動速率將兩倍連續稀釋之人類或小鼠-ECD-His標籤可溶性抗原（約500 nM至約7·8 nM)注射於具有0.05% Tween® 20之PBS中。藉由自空白流動細胞減去 RU來校正結合反應。使用簡單一對一朗繆爾結合模型 (BIAevaluation軟體版本3.2)來計算締合速率（U及解離速率（kcff)。平衡解離常數（KD)計算為比率keff/kan。此實驗之 128838.doc •198- 200840822 結果顯示於下表3中。抗體YW71.22與人類及小鼠R〇bo4交叉反應。表3 抗Robo4 BIAcore™結合分析概述純系人類Robo4 ka kd KD YW71.22 2.90E+05 3.70E-03 1.30E-08 鼠科Robo4 ka kd KD YW71.22 4.50E+05 2.80E-03 6.20E-09

測試來源於YW71.22之親和力成熟抗R〇bo4抗體純系與在HUVEC細胞中内源表現之人類Robo4的結合及與在MS 1 細胞中内源表現之鼠科R〇bo4的結合。FACS分析揭示純系丫\¥71.22.81.16及丫，71.22.81.21與人類及鼠科11〇13〇4結合且此結合與YW71.22抗體相當（圖18)。實例7 ··親和力成熟Robo4抗體之結合分析使用親和力成熟¥171.22.81，16來產生全長1§(31及1^1)片段，兩者在根據EU編號之重鍵Fc區位置118上均具有cys 取代。Cys用於抗體與相關標記或藥物之位點特異性接合。藉由活體外結合量測且藉由放射性標記之細胞對全長 YW71.22.Sl.l6(Mab)、具有工程化Cys之全長 YW71.22.S1.16 (thioMab)及具有工程化Cys之YW71.22.S1·16之Fab片段 128838.doc -199- 200840822 (ThioFab)的結合來測定對人類及小鼠R〇bo4之結合親和在25°C 下藉由在ProteOn XPR36儀器（Bio-Rad Laboratories，

Inc·)上進行SPR量測來執行活體外結合實驗。如廠商所述，使用標準胺偶合程序將親和力成熟R〇bo4抗體（Mab、 ThioMab及ThioFab)以5 00-1000 RJJ之表面密度固定於活化 ProteOn GLC感應器晶片（Bio-Rad Laboratories，Inc.)上〇簡言之，以於20 mM乙酸鈉（pH 4·5)中10 pg/ml之濃度及3〇 μ 1 / m i η之流動速率注射抗體，歷時 5 min。藉由注射1 Μ乙醇胺來阻斷未反應之基團。為執行結合檢定，將樣品以30 μΐ/min之流動速率注射。為進行動力學量測，將連續稀釋之純化人類或小鼠R〇b〇4_His(約 25 nM至0.8 nM)注射於具有〇·〇1〇/0 Tween_2〇之pBS中且記錄締合及解離階段之感應圖。空白表面用於背景校正。無需再產生表面，此係因為pr〇te〇n蛋白相互作用陣列系統允許在同一表面上並行進行多達六個結合實驗。使用簡單一對一朗修爾結合模型（ProteOn Manager軟體V2.0，Bio-

Rad Laboratories， Inc·)計算締合速率（ka)及解離速率（k〇且平衡解離常數（kd)計算為比率kd/ka。結果概述於下表4 中〇 128838.doc -200- 200840822 表4 抗Rob〇4抗體親和力（K〇)概述抗體格式 (YW7L22.S1.16) 活體外(SPR) 放射性標記之細胞結合 hRobo4 mRobo4 HUVEC MSI thioMAb 1.2E-09 1.1E-09 1.2E-09 1.0E-09 MAb LIE-09 0.9E-09 ND ND thioFab 8.0E-09 1.5E-09 ND 3.2E-09 内源表現Robo4蛋白之HUVEC及MSI細胞用於放射性配位體細胞結合實驗中。為進行細胞結合實驗，使用Iod〇gen法峨化抗R〇bo4 thioMab及thioFab抗體。藉由凝膠過濾使用NAP-5管柱自游離125I-Na純化各放射性標記抗體；經純化之thioMab抗體具有6·96 pCi/pg之比活性且經純化之thioFab抗體具有 16·05 pCi~g之比活性。將含有固定濃度之碘化抗體及減少濃度之未經標記之抗體的50 μΐ競爭混合物置放於96孔盤中。將MSI及HUVEC細胞在生長培養基中在37°C下於5% C02中培養且接著使用非酶性細胞解離溶液（Sigma #C5914)將其自組織培養盤分離以用於隨後結合研究。將細胞用結合緩衝液（含有2°/。FBS、2 mM疊氮化鈉及50 mM HEPES之50:50 DMEM/F12培養基，pH 7·2)洗滌且將其以 0.2 mL結合緩衝液中約200,000個細胞置放於含有競爭混合物之96孔盤中。在各細胞培育中碘化Mab抗體之最終濃度為約150 pM(每0·25 ml約70,000 cpm)，且細胞培育中未經 128838.doc -201 - 200840822 標記之抗體的最終濃度始於400 nM且藉由連續稀釋2倍而達成10個濃度。在各細胞培育中碘化Fab抗體之最終濃度為約400 pM(每0.25 ml約1 50,000 cpm) ’且細胞培育中未經標記之抗體的最終濃度始於1·0 μΜ且藉由連續稀釋2倍而達成10個濃度。檢定競爭反應，一式三份。將競爭反應在室溫下培育2小時。接著將其轉移至微孔多屏濾盤 (Mi 11 ip ore Multiscreen filter pi ate)且用結合緩衝液洗滌 3 次以自結合之硪化抗體分離游離抗體。將過濾器在Wallac

Wizard 1470 γ 計數器（PerkinElmer Life and Analytical

Sciences Inc. Wellesley，MA)上計數。使用 NewLigand軟體 (Genentech)(其使用 Munson及 Robard，厂 1〇7· 220-39 (1980)之擬合演算法）評估結合資料以測定抗體之結合親和力及每一孔結合位點之濃度。每一細胞結合位點之數目藉由將總結合位點除以每一孔細胞數目來確定。實例8 :抗Robo4抗體抑制HUVEC管伸長在珠粒長出檢定中抗R〇bo4抗體（YW71.22)顯著抑制 HUVEC管伸長。如與對照抗體E25相比，管之總數及長度均減少（圖20)。舉例而言，長度為300 μπι或更長之管的數目減少60%。為進行珠粒長出檢定，在37°C及5% C〇2下將葡聚糖塗佈之Cytodex 3微載體珠粒（Amersham)用EGM-2中之 HUVEC(每一珠粒400個細胞）培育隔夜。為誘發凝結，將具有2.5 pg/ml血纖維蛋白原之PBS中0.5 ml細胞塗佈之珠粒（每毫升200個珠粒）添加至含有0.625單位凝血酶之24孔 128838.doc -202- 200840822 組織培養盤之一孔中且在室溫下培育5 min且接著在37°C下培育20 min。在37°C下使凝塊在EGM-2中平衡30 min。接著將培養基用含有皮膚纖維母細胞（Detroit 551，每毫升 20,000個細胞）之EGM-2替換。將抗體（50 pg/ml)添加至各孔，且每隔一天以培養基之變化來監測檢定，歷時8天。藉由倒置顯微鏡捕捉珠粒影像，且在各影像中珠粒周圍繪製100 μιη、200 μιη及300 μπι間隔之同心圓。對穿過各圓之管的數目進行計數，每一條件使用10-12個珠粒進行量化 (Nakatsu 等人，Microvascular Research 66·· 102-112 (2003)) 〇實例9 :抗Robo4抗體及抗Robo4抗體藥物接合物作為治療劑藉由使抗R〇bo4抗體與藥物-連接子部分MCC-DM1、 SPDB-DM4及mPEO-DMl接合來產生抗Robo4 ADC。在接合之前，根據WO 2004/010957中所述之方法，使用標準方法用1^£?來部分還原抗體。根據0〇1〇11丨1^等人，#^^· 2 1:778-784 (2003)及美國專利中請案第 2005/0238649號中所述之方法使用標準方法使部分還原之抗體與以上藥物-連接子部分接合。簡言之，將部分還原之抗體與藥物連接子部分組合以允許該等部分與半胱胺酸殘基（包括（但不限於）如本文所揭示之thioMAb之半胱胺酸工程化殘基）接合。使接合反應中止且純化ADC。各ADC 之藥物負載（每一抗體之藥物部分之平均數）係藉由HPLC來測定。使用（例如）包括spp-DMl、smce-DMl、MC-vc-PAB-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、MC-MMAE及 MC-MMAF之 128838.doc -203 - 200840822 藥物連接子部分來製備其他抗以〇1}〇4 ADC(例如參見WO 2004/010957 及WO 2006/034488)(其中每一者以全文引用的方式併入本文中）。實例10 :活體内腫瘤體積減小檢定叛露抗11〇1)〇4抗體：在人類非小細胞肺癌SK-MES-1之小鼠異種移植模型中裸露抗Robo4抗體YW71.22(未與細胞毒性劑或其他藥劑接合之抗體）未抑制腫瘤生長。為進行此研究，各HRLN雌性裸小鼠接受1 mm3腫瘤片段，皮下植入腰窩。藉由測徑規量測法每週監測腫瘤生長兩次。當腫瘤達到80-120 mm3之平均大小時，將小鼠分類以產生幾乎相同組平均腫瘤大小，且開始治療（第1天）。每週兩次腹膜内給與動物10 mg/kg抗Robo4抗體及/或5 mg/kg抗VEGF抗體或對照抗體，歷時5週。所有治療按體重以〇·2 mg/20 g調整。結果顯示於圖17中。此外，未觀測到具有MDA-MB-23 1乳癌異種移植之Fo5小鼠模型中腫瘤生長減小。包含Fc區之具有增強之ADCC活性的抗R〇bo4抗體可用以抑制腫瘤生長。ADCC增強之抗抗體可為裸露抗體或如本文所揭示之抗體藥物接合物。例如藉由增強 IgGl-FcyRIII相互作用來實現ADCC增強，此相互作用係視與抗體Fc區連接之碳水化合物部分而定。ADCC增強之非限制性例示性方法包括藉由在過度表現編碼N-乙醯基葡糖胺基轉移酶之GnTIII之宿主細胞（Narishimhan，J.价〇/. C/zem. 257:10235-10242 (1982)及 Umana 等人，iVaiwre 17:176-180 (1999));編碼 α-1，6-海藻糖基轉移酶 128838.doc -204- 200840822 之FUT8表現不足或缺乏表現之宿主細胞（Shinkawa等人， J. 5ζ·ο/· C/zem· 278:3466-3473 (2003));或 UDP-N-乙醯葡糖胺2-epinerase缺乏表現或表現不足之宿主細胞（諸如Lec3 CHO^ ^ )(Hong^ Stanley, J. Biol. Chem. 278:53045-53054 (2003))中表現抗Robo4來減少抗體之海藻糖基化。此外，藉由Fc區中之胺基酸變化來增強ADCC(例如參見WO 2000042072 及 WO 2004029207)。因此，本發明之抗 Robo4 抗體可用作細胞毒性劑，包括相對於展示野生型Fc ADCC 活性之抗Robo4抗體展示增強ADCC功能的抗Robo4抗體。抗Robo4抗體藥物接合物（抗Robo4 ADC):為測試毒素接合之抗R〇bo4 ADC在活體内減小腫瘤體積之能力的功效，採用以下方案。將SCID小鼠各在腰窩中經皮下接種人類癌細胞株之細胞。人類癌細胞株包括SK-MES-1人類非小肺癌細胞及 MDA-MB-23 1乳癌細胞作為非限制性實例。當腫瘤達到約 80-200 mm3之間的平均腫瘤體積時，將小鼠分組，且藉由靜脈注射毒素接合之抗體或未接合之抗體來治療。抗Robo4美登素藥物接合物減小實體腫瘤體積之用途在腰窩中以每20 g小鼠體重0.2 ml之體積用人類腫瘤細胞對SCID小鼠皮下注射。將細胞懸浮在HBSS中。當平均腫瘤大小達到約80-200 mm3時，將小鼠隨機分組且給予與美登素接合之抗R〇bo4 ADC或對照抗體之單次或多次靜脈内治療（經由尾靜脈）。 128838.doc -205- 200840822 在注射抗體後，監測各治療組中平均腫瘤體積，歷時約 3 0天。在腫瘤細胞經工程化以表現螢光素酶之情況下可藉由（例如）螢光偵測剩餘螢光素酶來偵測腫瘤。藉由與對照及未接合之抗體進行比較，測定毒素接合之抗CD22抗體之功效。使用其中與抗體接合之藥物為阿瑞他汀之抗R〇bo4 ADC 執行相同實驗。使用包含Fc區之具有增強ADCC活性的抗R〇bo4 ADC重複相同實驗。實例11 ··與可偵測之標記物接合之抗R〇b〇4抗艘

如下製備sDOTA標記之抗Robo4抗體。將DOTA-NHS-酯溶於二甲基乙醯胺（DMA，Fluka Chemika，Switzerland)中且製備為60-100 mg/mL之濃度。典型程序包含將MAb緩衝交換至具有2 mM EDTA之PBS(pH 7.2)中。以1分子MAb對4 個DOTA分子（1:4)之比率執行反應且反應在25°C下進行，同時在 Thermomixer盤（Eppendorf，Westbury，NY)上輕輕檟; 拌。當與作為非限制性實例之釔9GY、nlIn、177Lii及其類似物締合時，經DOTA標記之抗Robo4抗體可用作活體外或活體内可偵測標記物。藉由（例如）在43°C下用〇·25 Μ乙酸銨中inInCl3培育接合物45 min，將mAb接合物用luIn標記。添加EDTA至1 mM之最終濃度，且在37°C下培育混合物1 5分鐘。舉例而言，使用在43 °C下之1小時培育來執行 90Y之標記，此後添加DTPA至1 mM之最終濃度，且在37°C 下再培育混合物15 min。使用TosoHaas TSKgel G2000 SW 128838.doc -206- 200840822 管柱及生理鹽水之移動相，藉由尺寸排除HPLC純化放射性金屬標記mAb接合物。實例12 : Robo4及抗R〇bo4抗體之其他特徵

Robo4不阻斷内皮細胞（EC)遷移。使用HUVEC遷移檢定且在VEGF存在或不存在下使R〇b〇4-Fc及Robo4-His與血管 EC接觸。圖8顯示檢定之結果。單獨Robo4-Fc或R〇b〇4-His 並不誘發EC遷移且VEGF誘發之EC遷移未由Robo4增強。

Robo4不與Slit2結合。藉由Bi〇coreTM分析，與Slit2接觸之Robo4-Fc未顯示結合，而在同一檢定中Robol與Slit 2顯示結合（圖9)。將Slit2-His(組胺酸標籤之全長Slit2)以高密度固定於CM5 Biacore™晶片上。注射5 μΐ各分析物之等分試樣（R〇bo4-Fc或Robol-Fc融合蛋白）且使其與緩衝液 (HEPES/EDTA/NaCl，ρΗ7·5)中固定之配位體相互作用。

Robo4在活體外與涉及血管引導之細胞表面受體UNC5B 相互作用。已顯示與受體之不同等-5(uncoordinated-5， UNC5)家族成員（UNC5 A、B、C及D)結合之軸突生長誘向因子（netrin)導致神經軸突阻抑（Klagsbrun，M.及Eichmann， A·，Cytokine & Growth Factor Reviews 16(4-5):535-548 (2005))。軸突生長誘向因子-UNC5B相互作用牽涉於血管生成中（Klagsbrun，M·及 Eichmann，A·，上文（2005)及 Lu，X. 等人，Nature 432:179-186 (2004))。藉由 SPR結合量測法測定Robo4與UNC5B之活體外相互作用，其中UNC5B-Fc 融合蛋白（UNC5B之胞外域與Fc區融合）固定於晶片上且使不同濃度之可溶性Robo4-Fc或Rob〇4-His與其相互作用。 128838.doc -207- 200840822 娜量測如實例7中所述來執行且相互作用結果顯示於圖Μ 中。如藉由ISH檢定使用！^〇1>〇4特異性RNA探針所示，在胎小鼠内皮中表現（圖n)。R〇b〇4亦在結腸腫瘤（人類 HM-7結腸腫瘤異種移植，圖12A及12B)及乳房腫瘤（人類 MDA-MB-175乳癌腫瘤異種移植，圖nc及12d)之小鼠腫瘤模型中表現。如相對於正常組織（圖13β及nD)之圖BA 及13C(在惡性黑素瘤中表現增加）中所證明，相對於正常鲁人類組織，Robo4在人類腫瘤組織中顯示增加之表現。 R〇b〇4表現亦見於人類小細胞肺癌（圖14A_D)、人類結腸癌 (圖14G-H)、人類前列腺腫瘤及小鼠血管肉瘤中。汉吡〇4在結腸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌（RCC)、移行細胞癌 (TCC，普通形式之膀胱癌）、乳癌、神經膠質瘤及肉瘤中之腫瘤内皮細胞中表現。藉由表現Robo4之小鼠微血管内皮MSI細胞經2小時之時 _ 間將抗R〇bo4抗體YW7 1.22内在化。在〇°C下使YW71.22抗體與小鼠微脈管系統内皮MS 1細胞上之R〇b〇4結合30分鐘，在37°C下培育0-2小時。每隔一段時間，將細胞固定且將其破膜（permeabilize)或未將其破膜。細胞表面上或藉由細胞内在化之抗R〇bo4抗體與螢光標記（Alexa標記）之抗人類IgG二次抗體相互作用。結果顯示於圖15A及15B中。藉由相同方案使丫\^71.22.81.16抗11〇13〇4抗體内在化，其中例外為在37°C下將抗Robo4在MSI細胞上培育0-4小時。如上將細胞破膜且著色。結果顯示於圖15C中。 128838.doc -208- 200840822 在使用人類臍血管肉皮細胞（HUVEC)細胞遷移檢定之活體外檢定中，抗R〇b〇4抗體未阻斷内皮細胞遷移。HUVEC 内源表現人類Rob〇4。此檢定如下執行。將HUVEC用 VEGF預先培育2小時。在抗R〇bo4抗體YW71.22、抗VEGF 抗體或Robo4-Fc或Rob〇4-His存在下使細胞遷移持續16小時。在此等條件下，抗R〇b〇4及可溶性R〇b〇4胞外域融合蛋白（Robo4-Fc及Rob〇4-His)兩者均不阻斷EC遷移（圖16)。抗Robo4抗體與活體内維管結構相關。經由尾靜脈注射 5 0微克之抗Rob〇4抗體71 ·22(圖19 A)或對照抗體（抗HER2，圖19B)且使其循環10分鐘。注射100微克FITC-.茄 (Lycopersicum esculentum)且使其循環5分鐘。將小鼠用 PBS中1% PFA灌注，將組織收集至30%蔗糖中且冰凍於 OCT中。用Cy3羊抗人IgG來偵測抗體。圖19A顯示維管結構中FITC·番蘇著色位置與抗R〇bo4 Cy3著色重叠，此與遷移至周圍組織中之對照抗體不同。雖然為達成清晰瞭解之目的，本發明已藉助於圖解及實例相當詳細地描述，但不應認為該等描述及實例限制本發明之範疇。本文所引用之所有專利、專利申請案、科學文獻及Genbank寄存編號之揭示内容以全文引用的方式明確併入以達成所有目的，如同各專利、專利申請案、科學文獻及Genbank寄存編號以引用的方式明確且個別併入一般。【圖式簡單說明】圖1A及1B繪示本發明之多種抗R〇b〇4純系之輕鏈及重鏈 128838.doc -209- 200840822 可變區的胺基酸序列排列（分別為圖1A及1B)。輕鏈及重鏈之高變區（HVR)以盒形互補判定區（CDR)指示。在圖1A 中，輕鏈HVR-L1、L2及L3分別為 Kabat位置24-34、50-56 及89-102。在圖1B中，重鏈HVR-H1、H2及H3分別為 Kabat位置26-35、49-65及93-102。藉由如實例中揭示之噬菌體呈現來製備純系且將其定序。圖2A及2B繪示自具有個別隨機化HVR之文庫選擇之親和力成熟抗體的輕鏈及重鏈可變區之胺基酸序列（分別為圖2A及2B)。圖2A及2B中HVR與圖1A及1B中所繪示之位置相同。圖3A、3B、4A及4B繪示用於實施本發明之例示性受體人類一致構架序列，其中序列標識符如下：可變輕鏈（VL) —致構架區減去Kabat HVR(圖3A及3B) 人類 VLk 亞群 I 一致構架 1-4(SEQ ID NO:9、10、99、 100) 人類 VLk亞群 Γ 一致構架 1-4(SEQ ID NO:9、101、99、 100) 人類 VLk 亞群 II 一致構架 1_4(SEQ ID NO:102、103、 104 、 100) 人類 VLk 亞群 II 一致構架 1-4(SEQ ID NO:105、106、 107 、 100) 人類 VLk 亞群 IV— 致構架 1-4(SEQ ID NO:108、109、 110 、 100) 構架序列内Kabat HVR LI、L2及L3之位置繪示為實體 128838.doc -210- 200840822 盒（shaded box) 〇可變重鏈（VH) —致構架區減去Kabat HVR(圖4A及4B) 人類VH亞群I 一致構架i_4減去Kabat HVR(亞群IA，SEQ ID ΝΟ:111、112、113、16)及（亞群 IB，SEQ ID NO:114、 115 、 113 、 16) 人類VH亞群I 一致構架卜々減去擴展HVR(亞群IC，SEQ ID NO:114、115、116、16)及（亞群 ID，SEQ ID N0:114、 115 、 117 、 16) 人類VH亞群II 一致構架i _4減去Kabat HVR(亞群IIA， SEQ ID NO:118、119、120、16)、（亞群 IIB，SEQ ID NO:121、122、120、16)

人類VH亞群II一致構架i-4減去擴展HVR(亞群IIC，SEQ ID NO:121、122、123、16)、（亞群 IID，SEQ ID NO:121、122、124、16) 人類VH亞群III一致構架i-4減去Kabat hvR(亞群IIIA， SEQ ID NO:125、126、127、16)、（亞群 IIIB，SEQ ID NO:128、129、127、16) 人類VH亞群III 一致構架減去擴展HVR(亞群IIIC， SEQ ID NO:128、129、130、16)、（亞群 IIID，SEQ ID NO:128、129、131、16) 人類VH受體1構架1-4減去Kabat HVR(亞群受體ia， SEQ ID NO: 132、126、133、16)及（亞群受體 IB，SEQ ID ΝΟ··128、129、133、16)

人類VH受體1構架1-4減去擴展HVR(亞群受體1C，SEQ 128838.doc -211- 200840822 ID NO:128、129、134、16) 人類VH受體2構架1-4減去Kabat HVR(亞群受體2A， SEQ ID NO:132、126、135、16)及（亞群受體 2B，SEQ ID NO:128、129、135、16) 人類VH受體2構架1-4減去擴展HVR(亞群受體2C，SEQ ID NO:128、129、136、16)及（亞群受體 2D，SEQ ID NO:128、129、137、16) 〇

圖5 Α繪示Robo4多肽之全長胺基酸序列。潛在信號序列由虛下劃線指示。一部分胞外域由實下劃線指示。圖5B繪示用於（例如）本文所揭示之抗R〇bo4 Fab噬菌體呈現實驗中的His標籤之可溶性Robo4胞外域片段之序列（SEQ ID NO:171)。Robo4胞外域與組胺酸標籤連接，以便於回收或偵測。圖6人繪示抗11〇1>〇4抗體丫冒71.22重鏈之全長序列（8£(5 10 NO: 169)。粗體文字所示且加下劃線之丙胺酸為半胱胺酸經取代以產生thioMAb之位置。圖6B纟會示抗Robo4抗體 YW71.22輕鏈之全長序列（SEQ ID NO:170)。圖7繪示鼠科Robo4胞夕卜域之胺基酸序歹ij (SEQ ID NO: 172)，其包含潛在信號序列且具有在位置H232連接之組胺酸標籤RRA(H)5。虛下劃線指示在哺乳動物細胞中表現期間分裂之潛在信號序列。圖8為使用Robo4構築體進行HUVEC遷移檢定之結果的條形圖。圖9顯示指示Robo4不與Slit2結合之BiaCore檢定的結 128838.doc -212- 200840822 果。圖10顯示指示Robo4與UNC5B相互作用之BiaCore檢定的結果。圖11為顯示Robo4在胎小鼠内皮中表現之ISH檢定的圖片。圖12A及12B顯示Robo4在人類HM-7結腸癌小鼠異種移植腫瘤模型中之表現。圖12C及12D顯示Robo4在人類 MDA-MB-175乳癌腫瘤小鼠異種移植模型中之表現。 _ 圖13A-D顯示Robo4在人類惡性黑素瘤中之表現。圖14A-D顯示Robo4在小細胞肺癌中之表現。圖14E-H顯示Robo4在結腸癌中之表現。圖15八-15(：繪示藉由小鼠1^81細胞使抗11〇13〇4抗體71.22 内在化（圖15A及15B)，及藉由小鼠MSI細胞使親和力成熟抗 Robo4抗體 71.22.S1.16 内在化（圖 15C)。圖16為顯示内皮細胞遷移檢定之結果的條形圖。抗 Robo4抗體不阻斷VEGF誘發之EC遷移。 ^ 圖17為在給與對照抗體、抗VEGF抗體、抗Robo4抗體 (YW71.22)及抗Robo4抗體加上抗VEGF抗體之異種移植小鼠模型中中值腫瘤體積隨時間變化之圖。在此等實驗中裸露Robo4抗體不抑制腫瘤生長。圖18A及18B顯示指示親和力成熟之抗R〇b〇4純系 71.22.81.16及71.22.81.21與内在表現於111^£(：細胞上之 Robo4結合的FACS曲線圖之結果。圖18C及18D顯示指示相同親和力成熟之抗Robo4抗體純系與内在表現於鼠科 128838.doc -213- 200840822 MSI細胞上之鼠科Robo4結合的FACS曲線圖之結果。此等曲線圖亦顯示親本抗體7 1.22亦與人類及鼠科Robo4交叉反應。圖19A及19B顯示如實例12中所述抗Robo4抗體71·22在注射至小鼠之後與維管結構結合。圖20八及208繪示指示抗11〇1>〇4抗體71.22抑制1111¥£(：管伸長之珠粒長出檢定的結果。圖20A顯示如與不相干之對照抗體（抗豚草抗體，E25)相比在用71,22治療111；¥£(：後管之總數及長度均降低。抗VEGF抗體用作陽性對照抗體。圖20B顯示在100 μηι、200 μιη及300 μπι下取同心圓之代表性實例。 128838.doc -214-

Claims

200840822 十、申請專利範圍： 1. 一種抗R〇bo4抗體，其包含：至少一、二、三、四、五或六個選自由下列組成之群之高變區（HVR)序列： (i) 包含序列Α1·Α11之HVR-L1，其中A1-A11為 RASQDVSTAVA(SEQ ID ΝΟ:1)； (ii) 包含序列B1-B7之HVR-L2，其中B1-B7為 SASFLYS(SEQ ID NO:2)； φ (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3，其中C1-C9為 QQSYTTPPT(SEQ ID NO:3)； (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1，其中D1-D10為 GFTINGYYIH(SEQ ID NO:17)； (v) 包含序列E卜E18之HVR-H2，其中E1-E18為 GFIYPAGGDTDYADSVKG(SEQ ID NO: 18)； (vi) 包含序歹》J F卜F17之HVR-H3，其中F1-F17為 ARLIGNKFGWSSYGMDY(SEQ ID NO:19) ； A _ (vii) 至少一個變異HVR，其中該變異HVR包含 SEQ ID ΝΟ:1、2、3、17、18或19中所示序列之至少一個胺基酸殘基的插入、缺失或取代。 2. 如請求項1之抗體，其包含一個輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含一個選自由圖1A及2A中所示之SEQ ID NO: 72-97組成之群的胺基酸序列。 3. 如請求項1之抗體，其包含一個重鏈可變域，該重鏈可變域包含一個選自由圖1B及2B中所示之SEQ ID NO: 128838.doc 200840822 140-165組成之群的胺基酸序列。 4. 如請求項1之抗體，其包含一個輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含：包含 SEQ ID NChl 之 HVR-L1 ; 包含 SEQ ID NO:2 之 HVR-L2 ;及包含 SEQ ID NO:20 之 HVR-L3。 5. 如請求項1之抗體，其包含一個重鏈可變域，該重鏈可變域包含：

包含 SEQ ID NO:17 之 HVR-H1 ; 包含 SEQ ID NO:18 之 HVR-H2 ;及 &#SEQIDNO:19<HVR-H3。 6. 如請求項1之抗體，其包含： (i) 一個輕鏈可變域，其包含：包含 SEQ ID ΝΟ:1 之 HVR-L1，包含 SEQ ID NO:2 之 HVR-L2，及包含 QQSRSDHPT(SEQ ID NO:20)之 HVR-L3 ;及 (ii) 一個重鏈可變域，其包含：包含 SEQ ID NO:17 之 HVR-H1，包含 SEQ ID NO:18 之 HVR-H2，及包含 SEQ ID NO:19 之 HVR-H3。 7. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化抗體。 8. 如請求項1之抗體，其中該抗體係選自由Fab、Fab’及 (Fab’)2組成之群。 9. 如請求項1之抗體，其進一步包含細胞毒性劑。 128838.doc 200840822 I 〇·如請求項9之抗體，其中該細胞毒性劑係選自由以下組成之群：N2’-脫乙醯基-Ν-2ί(3-巯基-1-氧基（oxo)丙基）-美登素（maytansine)(DMl)、單甲基阿瑞他汀（auristatin) E(MMAE)、單甲基阿瑞他汀F(MMAF)及其組合。 II ·如請求項10之抗體，其進一步包含可偵測標記。 12.如請求項11之抗體，其中該可偵測標記係選自由以下組成之群：生物素、螢光染料、放射性核素、螯合劑 1，4,7，1〇_四氮雜環十二烷_队^"，：^"，-四乙酸（00丁八）、微泡、全氟化碳奈米顆粒乳液、金屬顆粒及其組合。 13·如請求項n之抗體，其中該可偵測標記共價連接於抗體之半胱胺酸殘基。 14. 如請求項13之抗體，其中該半胱胺酸殘基係在該重鏈以區根據EU編號之位置118上。 15. —種如請求項丨之抗體之用途，其係用於製造供調節血管生成之藥劑。 16. 如請求項15之用途，其中該藥劑進一步包含細胞毒性劑。 17. 如請求項15之用途，其中該血管生成受到抑制。 18. 如請求項15之用途，其中該血管生成係與一種選自由以下組成之群之病症有關：癌症、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生Ή瘤、慢性炎症、眼内新生二管性疾病、增生性視網膜病、糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生金管性青光眼、移植角膜么且織及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎、牛皮癖 128838.doc 200840822 及其組合。 19.如請求項15之用途，其中該血管生成係與癌症有關。 2〇·如請求項19之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群··鱗狀細胞癌、肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌之胃癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌（liver cancer)、膀胱癌、泌尿道癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌（hepatic carcinoma)、肛門癌、陰莖癌、專素瘤、多發性骨髓瘤及B細胞淋巴瘤、腦癌、頭頸癌、骨肉瘤（〇ste0gemc sarcoma)及血管肉瘤，及相關轉移，及其組合。 21·如明求項15之用途，其中該血管生成調節係在哺乳動 22·如清求項21之用途，其中該哺乳動物為人類。

、月求項1 5之用途’其中該藥劑係與_種選自由以下組成之群之樂劑組合··抗贅生性劑、化學治療劑、生長抑制劑、細胞毒性劑及其組合。 24·^請求項23之用途，其中該藥劑為抗VEGF抗體。 25·^4如請求項U之抗體之用途，其係用於製造供在哺乳動物活體内顯像之藥劑。 A如請求項25之用途，；中該哺乳動物為人類。 27·:請求項25之用途，其中該哺乳動物疑似患有一種選自由以下組成之群之疾病或病症：癌症1錢㈣^ 128838.doc 200840822

晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、憚柹火 m 『又r生火症、眼内新生企管性疾病、增生性視網膜病、糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織之免疫排斥反應、類風濕關即炎、牛皮癬及1 組合。 /、 128838.doc