JPWO2007010586A1

JPWO2007010586A1 - 造血幹細胞同定剤

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Publication number: JPWO2007010586A1
Application number: JP2007525455A
Authority: JP
Inventors: 秀明中島; 俊雄北村; ツァン，モニカ・リック−シン
Original assignee: Research and Diagnostics Systems Inc
Current assignee: Research and Diagnostics Systems Inc
Priority date: 2005-07-14
Filing date: 2005-07-14
Publication date: 2009-01-29
Also published as: WO2007010586A1

Abstract

造血幹細胞を直接的に同定することができる、造血幹細胞同定剤、造血幹細胞の同定方法、及び造血幹細胞高度濃縮画分の調製方法の提供。Ｒｏｂｏ−４タンパク質を抗原として生成され、該タンパク質に特異的に結合する抗体からなる造血幹細胞同定剤、Ｒｏｂｏ−４遺伝子からなる造血幹細胞同定剤、これを用いる造血幹細胞の同定方法及び造血幹細胞高度濃縮画分の調製方法。

Description

本発明は、造血幹細胞同定剤、造血幹細胞の同定方法、及び造血幹細胞高度濃縮画分の調製方法に関する。

幹細胞は、胚性幹細胞と体性幹細胞に分けられる。胚性幹細胞は、胚を構成する全ての種類の細胞に分化する能力を有し、無限に近い増殖能力を有する。一方、体性幹細胞は、ある一定の細胞系列への分化が運命付けられているが、その中で多分化能と自己増殖能を示す。

造血幹細胞とは、体性幹細胞の一つであり、すべての系列の血液細胞を作り出すことのできる多分化能と自分と同じ細胞を作り続けることができる自己複製能を有し、かつ、骨髄移植した場合には、数ヶ月以上の長期にわたり全ての血球系列を再構成することができる細胞をいう。

造血幹細胞の効率的な濃縮方法としては、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ）を用いた方法がある。ＦＡＣＳを利用する際の指標として、細胞表面マーカー、蛍光物質ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）及びＤＮＡに結合する色素であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を排出する性質を持つＳＰ（ｓｉｄｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）細胞などが知られている。

ＦＡＣＳでの細胞表面マーカーを用いた分画では、ｃ−Ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ−１陽性かつｌｉｎｅａｇｅｍａｒｋｅｒ陰性という細胞表面抗原の発現パターンを持つ分画（ＫＳＬ分画）、さらにＣＤ３４陰性を加えたＣＤ３４⁻−ＫＳＬ分画、ＫＳＬ−ＳＰ分画が造血幹細胞を高濃度に含んでいることが明らかにされており、これらの分画がしばしば造血幹細胞と同義に用いられている。しかし、これらの細胞表面マーカーは、造血幹細胞に特異的なものではなく、直接的に造血幹細胞を同定することはできなかった。

また、今日まで、造血幹細胞を特異的に識別するための細胞表面マーカーは、全く知られていなかった。

Ｒｏｂｏ−４は、Ｓｌｉｔ−２に対する細胞表面レセプターであり、胎児及び成体内皮細胞で発現される。心臓においては高度に発現されるが、脳における発現は極めて低い。また、Ｒｏｂｏ−４は、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）の移動を阻害する。

最近、Ｐｈｉｌｌｉｐｓらは、幹細胞の調節経路及びそのグローバルな遺伝的プログラムを明らかにするためにゲノムレベルでの遺伝子発現解析を報告している。それによると、Ｒｏｂｏ−４及びＳｌｉｔ−２は、Ｌｉｎ⁻ｃ−ｋｉｔ^＋Ｓｃａ−１^＋Ｒｈｏ^ｌｏｗマウス成体骨髄（ＢＭ）細胞（長期造血幹細胞：ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍＨＳＣｓ）及びＬｉｎ⁻ＡＡ４．１^＋ｃ−ｋｉｔ^＋Ｓｃａ−１^＋マウス胎児肝細胞（胎児肝ＨＳＣｓ）の両者において濃縮されていた。また、Ｓｌｉｔ−２は、神経幹細胞（ＮＳＣ）及び胚幹細胞（ＥＳＣ）の両者において濃縮されており、Ｒｏｂｏ−４は、ＥＳＣにおいて濃縮されていたが、Ｓｌｉｔ−２及びＲｏｂｏ−４は、ヒト胎児肝ＨＳＣｓにおいて濃縮されていなかった。（非特許文献１）

しかし、非特許文献１には、Ｒｏｂｏ−４が造血幹細胞において特異的に発現されていることは、何らの記載も示唆もない。

また、特開２００４−２４２５１３には、ＪＡＭ−１をマーカーとして用いる未分化造血細胞の同定・分離方法が記載されている（特許文献１）。しかし、この文献には、造血幹細胞に特異的なマーカーについては、何ら記載されていない。

したがって、造血幹細胞同定剤、造血幹細胞の同定方法、及び造血幹細胞高度濃縮画分の調製方法の開発が待たれていた。
特開２００４−２４２５１３ＰｈｉｌｌｉｐｓＲＬ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８８：１６３５−４０（２０００）

本発明は、造血幹細胞同定剤、造血幹細胞の同定方法、及び造血幹細胞高度濃縮画分の調製方法を提供する。

本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、予想外にも、Ｒｏｂｏ−４が造血幹細胞の表面に特異的に発現されていることを見出し、本発明を完成させたものである。したがって、本発明は、下記に関する。

１．Ｒｏｂｏ−４タンパク質を抗原として生成され、該タンパク質に特異的に結合する抗体からなる造血幹細胞同定剤。
２．抗体が、モノクローナル抗体である、上記１に記載の造血幹細胞同定剤。
３．抗体が、受託番号がＡＴＣＣＰＴＡ−６８０９、ＡＴＣＣＰＴＡ−６８１０又はＡＴＣＣＰＴＡ−６８１１であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である、上記２に記載の造血幹細胞同定剤。
４．Ｒｏｂｏ−４遺伝子からなる造血幹細胞同定剤。
５．Ｒｏｂｏ−４遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする連続する１５個以上のヌクレオチドからなる造血幹細胞同定剤。
６．上記１〜５のいずれか１に記載の造血幹細胞同定剤を用いる造血幹細胞の同定方法。
７．上記１〜６のいずれか１に記載の造血幹細胞同定剤を用いる造血幹細胞高度濃縮画分の調製方法。

本発明は、造血幹細胞の分化における多能性のメカニズムの解明や、骨髄移植や遺伝子治療のための造血幹細胞の単離・精製のために有用である。

造血幹細胞におけるＲｏｂｏ−１〜Ｒｏｂｏ−４のｍＲＮＡの発現を示す。造血幹細胞・造血前駆細胞におけるＲｏｂｏ−４のｍＲＮＡの発現を示す。ＫＳＬ−ＳＰ及びＫＳＬ−ＭＰ分画におけるＲｏｂｏ−４のｍＲＮＡの発現を示す。

本発明のＲｏｂｏ−４は、細胞外ドメインに２つのインテグリン様のループ構造を有する、膜一回貫通型のタンパク質である。Ｒｏｂｏ−４のリガンドとしては、Ｓｌｉｔ−２が知られている。Ｒｏｂｏ４を発現している細胞は、Ｓｌｉｔ２と結合することによりＳｌｉｔ２の濃度勾配とは逆の方向に移動する。本発明でＲｏｂｏ−４とは、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子によってコードされ、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。たとえば、マウスのｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＮＭ０２８７８３であり、ヒトのｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＮＭ０１９０５５である。

本発明においては、本発明のＲｏｂｏ−４タンパク質の同定に際して、該タンパク質のポリペプチドを抗原として生成され、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いることができる。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を挙げることができる。また、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）法等により作製された一本鎖（Ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎ）抗体も利用が可能である。該抗体の作製は、本発明のポリペプチドを抗原として、従来公知の方法によって調製することができる。抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
抗ヒトＲｏｂｏ−４モノクローナル抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣＰＴＡ−６８０９（クローン２６５７２１．１１１）、ＡＴＣＣＰＴＡ−６８１０（クローン２６５７２２．１１１）又はＡＴＣＣＰＴＡ−６８１１（クローン２７４９１４．１１１）を用いて産生することができる。これらのハイブリドーマは、２０００年６月２１日付けで国際寄託機関である米国のＡＴＣＣに国際寄託されている。

本発明の抗体を用いて、被検細胞における造血幹細胞を同定するためには、公知の抗体を用いる免疫学的測定法を用いることができる。該免疫学的測定法としては、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等を挙げることができる。

本発明の造血幹細胞同定剤を用いて、被検細胞におけるＲｏｂｏ−４遺伝子及び／又はＲｏｂｏ−４タンパク質の発現を同定し、同定した造血幹細胞を濃縮し、造血幹細胞高度濃縮画分を調製することができる。

例えば、本発明の抗体を用いて蛍光抗体法を用いて造血幹細胞を、同定・濃縮するためには、造血幹細胞を標識し、標識された造血幹細胞をセルソーターにより分離し、採取することができる。

たとえば、本発明の抗体を蛍光標識し、これを造血幹細胞で発現されている抗原に結合させて、造血幹細胞を標識することができる（直接蛍光抗体法）。または、抗原を発現している造血幹細胞に、未標識の本発明の抗体を結合させた後に、標識した二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）を結合させて造血幹細胞を標識することもできる（間接蛍光抗体法）。該標識された造血幹細胞を蛍光活性化セルソーター等により、同定し、濃縮することができる。

また、未標識の本発明の抗体を造血幹細胞と接触させ、本発明の抗体を造血幹細胞で発現される抗原と結合させ、次いで、磁気ビーズを結合させた二次抗体と接触させて、該造血幹細胞を磁気によって標識することもできる。

また、本発明の抗体をビオチン標識し、これを造血幹細胞と接触させ、造血幹細胞で発現される抗原に結合させ、次いで、ストレプトアビジン標識磁気ビーズを結合させることもできる。該磁気ビーズで標識された造血幹細胞を、磁気分離カラム等を用いて濃縮することができる。

また、造血幹細胞を同定するために、Ｒｏｂｏ−４遺伝子のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するプローブを用いることができる。該プローブを用いて造血幹細胞を同定するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、配列表に示したＤＮＡ配列から適宜の長さ、好ましくは、連続する１５以上、より好ましくは連続する２０以上のヌクレオチドからなるＤＮＡプローブを作成し、これらのプローブを蛍光標識し、これを試料とハイブリダイズさせることにより、造血幹細胞の同定を行うことができる。

該ＤＮＡプローブとしては、配列表に示した本発明の遺伝子の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなるプローブを用いることができる。

また、該プローブを、少なくとも１つ以上を固定化させたマイクロアレイ又はＤＮＡチップの形で用いることもできる。

なお、上記ＤＮＡプローブの作製に際して、本発明の塩基配列において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。

造血幹細胞におけるＲｏｂｏ−１〜Ｒｏｂｏ−４のｍＲＮＡの発現
マウス大腿骨より骨髄単核球を採取、ＭＡＣＳＬｉｎｅａｇｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎｋｉｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｌＢｉｏｔｅｃｈ）を用いてＬｉｎｅａｇｅｍａｒｋｅｒ陽性細胞（分化マーカー陽性細胞）を除去した後、抗ｃ−Ｋｉｔ抗体と抗Ｓｃａ−１抗体で染色した。ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてｃ−Ｋｉｔ^＋Ｓｃａ−１^＋Ｌｉｎｅａｇｅ（Ｌｉｎ）⁻細胞（ＫＳＬ）およびＬｉｎｅａｇｅ＋細胞をソーティングした。これらの細胞よりＲＮＡを抽出し、半定量ＲＴ−ＰＣＲ法によりＲｏｂｏ４ｍＲＮＡ量を定量した。
コントロールとしてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨを用いた。その結果、Ｒｏｂｏファミリーの中でもＲｏｂｏ−４のみが、ＫＳＬに特異的な発現が認められた。

造血幹細胞・造血前駆細胞におけるＲｏｂｏ−４ｍＲＮＡの発現
造血幹細胞を高濃度にふくむＫＳＬ細胞、造血前駆細胞である骨髄球系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、巨核球・赤芽球系前駆細胞（ＭＥＰ）、顆粒球／マクロファージ系前駆細胞（ＧＭＰ）、リンパ球系共通前駆細胞（ＣＬＰ）を既に報告されている方法によりＦＡＣＳソーティングした（ＫｏｎｄｏＭ，ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ９１：６６１−６７２，１９９７；ＡｋａｓｈｉＫ，ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．４０４：１９３−１９７，２０００）。これらの細胞よりＲＮＡを抽出、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によりＲｏｂｏ４ｍＲＮＡ量を測定した。コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。その結果、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、ＣＬＰなどの造血前駆細胞ではＲｏｂｏ−４の発現を認めず、ＫＳＬのみでＲｏｂｏ−４の特異的な発現が認められた。

ＫＳＬ−ＳＰ及びＫＳＬ−ＭＰ細胞におけるＲｏｂｏ−４ｍＲＮＡの発現。
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を排出する性質を持つ細胞群をｓｉｄｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）と呼ぶ。また、ＦＡＣＳ上ＳＰ以外の細胞群（ｎｏｎ−ＳＰ）を構成する主たる細胞集団をｍａｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＭＰ）と呼ぶ。ＫＳＬ細胞をさらにＳＰとＭＰに分画（ＫＳＬ−ＳＰ、ＫＳＬ−ＭＰ）すると、造血幹細胞はＫＳＬ−ＳＰ分画により濃縮されていることが知られている。マウス骨髄単核球より図１と同様の方法でＫＳＬ細胞を染色し、さらにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色、ＦＡＣＳによりＫＳＬ−ＳＰ細胞、ＫＳＬ−ＭＰ細胞、ＫＳＬ細胞、Ｌｉｎｅａｇｅ陽性細胞を分取した。これら細胞よりＲＮＡを抽出、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によりＲｏｂｏ−４ｍＲＮＡ量を定量した。コントロールとしてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨを用いた。Ｒｏｂｏ−４は造血幹細胞を最も高濃度に含むＫＳＬ−ＳＰ分画に最も強く発現し、次いでＫＳＬ−ＭＰに強い発現が見られた。

Claims

Ｒｏｂｏ−４タンパク質を抗原として生成され、該タンパク質に特異的に結合する抗体からなる造血幹細胞同定剤。
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の造血幹細胞同定剤。
抗体が、受託番号がＡＴＣＣＰＴＡ−６８０９、ＡＴＣＣＰＴＡ−６８１０又はＡＴＣＣＰＴＡ−６８１１であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である、請求項２に記載の造血幹細胞同定剤。
Ｒｏｂｏ−４遺伝子からなる造血幹細胞同定剤。
Ｒｏｂｏ−４遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする連続する１５個以上のヌクレオチドからなる造血幹細胞同定剤。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の造血幹細胞同定剤を用いる造血幹細胞の同定方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の造血幹細胞同定剤を用いる造血幹細胞高度濃縮画分の調製方法。