JP4636413B2 - 神経誘導に含まれるポリペプチド及び核酸のファミリーであるｒｏｂｏ - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

この出願は、Corey S. Goodman, Thomas Kidd, Kevin J. Mitchell,及びGuy Tearによって１９９７年１０月２０日に出願され、遺伝子及びタンパク質の新規なファミリーであるＲｏｂｏという題名の米国仮出願番号６０／０６２９２１に基づく優先権を主張する。
本出願における研究は、部分的にＮＩＨ認可ＮＳ１８３６６によって支援されている。政府は、この出願に対して発光される特許に権利を有する場合がある。

（発明の分野）
本発明の分野は、神経細胞誘導に含まれるタンパク質である。

（発明の背景）
昆虫及び脊椎動物に見られるような両側的に対称な神経系は、特殊な正中構造を有し、それは２つの半分の鏡像の間の分配を確立する。神経系の２つの側面に結合する軸索は、正中線に向けて、それを越えて突出し、軸索交連を形成する。これらの交連性軸索は、少なくとも部分的には、正中線から発せられた長距離に達する化学攻撃剤に応答することにより、正中線に向けて突出する。重要な類の正中線化学攻撃剤はネトリン(netrins)であり（Serafini等, 1994; Kennedy等, 1994）、それらの構造、機能、及び正中線発現をシグナル化する誘導は線虫及びミバエから脊椎動物まで進化的に保存されている（Hedgecock等, 1990; Wadsworth等, 1996; Mitchell等, 1996; Harris等, 1996）。ネトリンの攻撃的作用は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのＤＣＣサブファミリーの成長円錐レセプターによって媒介されることがわかっている（Keino-Masu等, 1996; Chan等, 1996; Kolodziej等, 1996)。

また、正中線は重要な短距離の誘導シグナルも供給する。このことは、脊椎動物の脊髄又は昆虫の神経コードにおける異なる部類の軸索突起を考慮することにより最も良く例証される。幾つかの成長円錐は正中線から外向きに伸長するが、殆どは、それらの軌道の幾つかのセグメントの間で正中線に向けて又はそれに沿って伸長する。ある部類の成長円錐は、正中線に向けて又はその長軸に沿って伸長し、それを横切ることはない。しかしながら、殆どの成長円錐（ショウジョウバエＣＮＳの〜９０％）は正中線を横切る。横切った後、これらの成長円錐の大多数は、突起の長軸方向に戻り、正中線に沿って又はその近傍で成長する。興味深いことに、これらの軸索は、横切ることを続ける他の軸索の近傍で航行するにも関わらず、正中線を再度横切ることはない。

どのような正中線シグナル及び成長円錐レセプターが、成長円錐が正中線を横切るか否かを制御するのであろうか。一度横切った後、どのような機構がこれらの成長円錐が再度横切ることを防止するのであろうか。チキン（Stoeckli及びLamdmesser, 1995; Stoeckli等, 1997）及びバッタ（Myers及びBastiani, 1993）の胚における研究により、正中線が接触媒介忌避物質を含み、交連性成長円錐が正中線を横切るにはこの忌避を解消しなければならないという示唆が導かれた。例えば、正中線がそれを横切る成長円錐でさえ忌避できるというこの概念は、バッタ胚における第１の交連性成長円錐の時間経過画像によって支持される。正中線に接触すると、この成長円錐は急激に退縮することが多いが、最終的には忌避に打ち勝って正中線を横切る。

このような正中線誘導系の成分をコードする遺伝子を見つけるための一つの方法は、正中線を横切る軸索が多すぎるか又は少なすぎる変異体についてスクリーニングすることである。このような大規模変異体スクリーニングは、ショウジョウバエで既に行われ、２つの鍵となる変異体：交連無し（ｃｏｍｍ）及び迂回（ラウンドアバウト）（ｒｏｂｏ）の同定がなされている（Seeger等, 1993; Tear等, 1993による概説）。ｃｏｍｍ変異体胚において、交連性成長円錐は、最初は正中線方向に配向するが、次いでそれを横切らず、再度螺旋を巻いてそれ自身の側に伸長する。ｃｏｍｍは正中線細胞上に表現される新規な表面タンパク質をコードする。交連性成長円錐は、ＣＮＳ正中線に接触して横断し、ｃｏｍｍタンパク質は明らかに正中線細胞から交連性軸索に運ばれる（Tear等, 1996）。ｒｏｂｏ変異体胚においては、通常はそれらの一方の側にしか伸長しない多くの成長円錐がここでは正中線を横切って現れ、通常は一度しか正中線を横切らない軸索が複数回横切ることがわかっった（Seeger等, 1993; Kidd等, 1997）。ｃｏｍｍ及びｒｏｂｏの二重変異体は、ｒｏｂｏ様のフェノタイプを示す。

ここで我々は、動物種に渡るｒｏｂｏの特徴付けを開示する。ｒｏｂｏは、５Ｉｇドメイン、３フィブロネクチン（ＦＮ）ＩＩＩ型ドメイン、膜貫通ドメイン、及び長い細胞質ドメインを持つ新しいクラスの誘導レセプターをコードする。Ｒｏｂｏは、ミバエから哺乳動物までに高度に保持されたＩｇスーパーファミリーのタンパク質の新たなサブファミリーを決定する。タンパク質発現及び遺伝子導入レスキュー実験の結果は、Ｒｏｂｏが門番役制御の正中線横断として機能すること、及びＲｏｂｏが未知の正中線忌避物質に反応することを示している。

（発明の概要）
本発明は、Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２（集合的にＲｏｂｏ）ポリペプチド、関連する核酸、Ｒｏｂｏ特異的構造及び活性を有するそれらのポリペプチドドメイン、及びＲｏｂｏ機能のモジュレーターに関連する方法及び組成物を提供する。Ｒｏｂｏポリペプチドは、細胞、特に神経細胞の機能及びモルホロジーを調整することができる。これらのポリペプチドは、形質転換した宿主細胞から、主題のＲｏｂｏポリペプチドをコードする核酸から組み換え的に産生でき、あるいは哺乳類細胞から精製することもできる。本発明は、天然Ｒｏｂｏ遺伝子と特異的にハイブリッド形成できる単離されたＲｏｂｏハイブリッド形成プローブ及びプライマー、特異的抗体等のＲｏｂｏ特異的結合剤、及び主題組成物の診断（例えば、Ｒｏｂｏ転写物の遺伝子ハイブリッド形成スクリーニング）、治療（例えば、神経細胞成長を促進するＲｏｂｏ阻害剤）及びバイオ製薬工業（例えば、免疫原、Ｒｏｂｏ遺伝子及びポリペプチド単離のための試薬、リード製薬剤のための化学的スクリーニング用試薬など）における製造及び使用方法を提供する。

（本発明の詳細な説明）
ショウジョウバエ１、ショウジョウバエ２、線虫、ヒト１、ヒト２及びマウス１Ｒｏｂｏポリペプチドをコードする例示的天然ｃＤＮＡの核酸配列を、各々配列番号：１、３、５、７、９及び１１として示し、全概念的翻訳物を配列番号：２、４、６、８、１０及び１２として示す。本発明のＲｏｂｏポリペプチドは、配列番号：１、３、５、７、９及び１１の不完全翻訳物及び配列番号：２、４、６、８、１０及び１２の欠失変異体を含み、それらの翻訳物及び欠失変異体は、Ｒｏｂｏ特異的アミノ酸配列、結合特異性又は機能を有する。好ましい翻訳物／欠失変異体は、少なくとも６、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも３２、最も好ましくは少なくとも６４の翻訳物の残基ドメインを含む。特別な実施態様では、欠失変異体は１つ又はそれ以上のここに述べる構造的／機能的Ｒｏｂｏ免疫グロブリン、フィブロネクチン又は細胞質モチーフドメインを含む。例えば、１つ又はそれ以上のＲｏｂｏＩＧドメイン、特に２つ又はそれ以上のＲｏｂｏＩＧドメイン、特にＩＧ＃１及び＃２の融合物を含む開示したＲｏｂｏポリペプチドの可溶化形態は、Ｒｏｂｏ媒介シグナル化の競合的阻害剤を提供する。このような欠失変異体及び再結合欠失変異体融合物の例は、ヒトＲｏｂｏ１（配列番号：８）残基１−６７；６８−１６７；１６８−２５９；２６０−３５０；３５１−４５１；１−１６７；１−２５９；１−３５０；１−４５１；６８−２５９；１６８−２５９に結合した１−６７；２６０−４５０に結合した１−６７を含む。

他の欠失変異体は、特に以下に記載するような担体タンパク質に結合したときに、Ｒｏｂｏ特異的抗原及び／又は免疫原を提供する。一般的なＲｏｂｏ特異的ペプチドは、表１の整列させたＲｏｂｏポリペプチド配列における保存領域と比較して容易に明らかになる。

表１．Ｒｏｂｏファミリーのメンバーの配列アラインメント：
ショウジョウバエｒｏｂｏ１（Ｄ１、配列番号：２）及びヒトｒｏｂｏ１（Ｈ１、配列番号：８）にコードされる予想Ｒｏｂｏタンパク質の完全アミノ酸アラインメントを示す。線虫ｒｏｂｏの細胞外ドメイン（ＣＥ、配列番号：６；Ｓａｘ-３；Zallen等, 1997）、ショウジョウバエｒｏｂｏ２の細胞外ドメイン（Ｄ２、配列番号：４）、及びヒトｒｏｂｏ２の部分配列（Ｈ２、配列番号：１０）も整列させた。Ｄ２配列は、遺伝子発見プログラムＧｒａｉｌによって予測した。免疫グロブリンドメイン（Ｉｇ）、フィブロネクチンドメイン（ＦＮ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び保存された細胞質モチーフを示した。ラットｒｏｂｏ１の細胞外ドメインはＨ１と同一に近い。

>IG #1

>IG #2

>IG #3

>IG #4


>IG #5

>FN #1

>FN #2


>FN #3

<

> TM <

細胞質モチーフ #1

細胞質モチーフ #2

細胞質モチーフ #3

このようなＲｏｂｏ特異的免疫原性及び／又は抗原性ペプチドを表２に示す。

表２．Ｒｏｂｏ特異的ウサギポリクローナル抗体を生じさせる免疫原性Ｒｏｂｏポリペプチド：Ｒｏｂｏポリペプチド−ＫＬＨ複合体は以下のプロトコールで免疫化した。
Ｒｏｂｏポリペプチド配列 免疫原性
配列番号：２残基６８−７７ ＋＋＋
配列番号：２残基７９−９４ ＋＋＋
配列番号：２残基９５−１０３ ＋＋＋
配列番号：２残基１２２−１２９ ＋＋＋
配列番号：２残基１６５−１７６ ＋＋＋
配列番号：２残基１８１−１９１ ＋＋＋
配列番号：２残基１９３−２０４ ＋＋＋
配列番号：２残基２４４−２５１ ＋＋＋
配列番号：２残基２７４−２９０ ＋＋＋
配列番号：２残基３２２−３３１ ＋＋＋
配列番号：２残基３３９−３４７ ＋＋＋
配列番号：２残基４０７−４１７ ＋＋＋
配列番号：２残基４４１−４５１ ＋＋＋
配列番号：２残基４５３−４７４ ＋＋＋
配列番号：２残基５０２−５１６ ＋＋＋
配列番号：２残基５４１−５５３ ＋＋＋
配列番号：２残基６１７−６２９ ＋＋＋

さらに、種特異的抗原性及び／又は免疫原性ペプチドは、表１の多岐に渡る細胞質又は細胞基質領域として容易に明らかになる。そのようなヒト特異的ペプチドの例を表３に示す。

表３．Ｒｏｂｏ特異的ウサギポリクローナル抗体を生じさせる免疫原性Ｒｏｂｏポリペプチド：Ｒｏｂｏポリペプチド−ＫＬＨ複合体は以下のプロトコールで免疫化した（幾つかの抗体は、対応するマウス／ラットＲｏｂｏポリペプチドとの交差反応性を示す）。
Ｒｏｂｏポリペプチド配列 免疫原性
配列番号：８残基１−１２ ＋＋＋
配列番号：８残基１８−２８ ＋＋＋
配列番号：８残基３１−４０ ＋＋＋
配列番号：８残基４５−６５ ＋＋＋
配列番号：８残基１０６−１１６ ＋＋＋
配列番号：８残基１３７−１４５ ＋＋＋
配列番号：８残基１７４−１８４ ＋＋＋
配列番号：８残基２１４−２３０ ＋＋＋
配列番号：８残基２７４−２８６ ＋＋＋
配列番号：８残基３１４−３２４ ＋＋＋
配列番号：８残基３９９−４１２ ＋＋＋
配列番号：８残基４９６−５０７ ＋＋＋
配列番号：８残基５４８−５６５ ＋＋＋
配列番号：８残基５９９−６１１ ＋＋＋
配列番号：８残基６６０−６７１ ＋＋＋
配列番号：８残基７１７−７３０ ＋＋＋
配列番号：８残基７８０−７９１ ＋＋＋
配列番号：８残基８３５−８４７ ＋＋＋
配列番号：８残基８７７−８９１ ＋＋＋
配列番号：８残基９３０−９４２ ＋＋＋
配列番号：８残基９８１−９９８ ＋＋＋
配列番号：８残基１０４０−１０５１ ＋＋＋
配列番号：８残基１０８０−１０９０ ＋＋＋
配列番号：８残基１１５４−１１６８ ＋＋＋
配列番号：８残基１２１５−１２３１ ＋＋＋
配列番号：８残基１２７８−１３０２ ＋＋＋
配列番号：８残基１３７８−１４００ ＋＋＋
配列番号：８残基１４６０−１４６９ ＋＋＋
配列番号：８残基１４９７−１５１９ ＋＋＋
配列番号：８残基１６０６−１６２６ ＋＋＋
配列番号：８残基１６３９−１６５１ ＋＋＋
配列番号：１０残基５−１６ ＋＋＋
配列番号：１０残基３８−４７ ＋＋＋
配列番号：１０残基８３−９４ ＋＋＋
配列番号：１０残基１１２−１２５ ＋＋＋
配列番号：１０残基１６８−１８０ ＋＋＋
配列番号：１０残基１９５−２０９ ＋＋＋
配列番号：１０残基２２２−２３５ ＋＋＋
配列番号：１０残基２４１−２５４ ＋＋＋

特別な実施態様において、発現された配列タグＥＳＴ；ｙｕ２３ｄ１１、登録＃Ｈ７７７３４及びＥＳＴ；ｙｑ７６ｅ１２、登録＃Ｈ５２９３６、並びにそれらによって概念的にコードされるペプチドは、本発明の範囲内ではない（表４及び５）。特別な実施態様において、主題とするＲｏｂｏポリペプチドは、開示されたヒトＲｏｂｏＩポリペプチドの対応する領域、即ち、配列番号：８、残基１６８−２１７及び配列番号：８、残基１３１６−１４８５を除外する。

表４．Ｈ-Ｒｏｂｏ１と比較したＥＳＴ：ｙｕ２３ｄ１１配列。ｙｕ２３ｄ１１は配列決定したＤＮＡの断片を指す。断片は両側から配列決定し、次の２つの配列：Ｈ７７７３４及びＨ７７７３３を生ずる。ｙｕ２３ｄ１１はスプライシングしていないｃＤＮＡである。塩基５９−２１５のみがＨ-Ｒｏｂｏ１のコード配列（５０２−６５１）と合致する。残りの塩基はイントロン性である。Ｈ７７７３３の塩基はＨ-Ｒｏｂｏ１のコード配列と全く合致しない。
LRDDFRQNPSDVNVAVGEPAVMECQPPRGHPEPTISWKKDGSPLDDKDER H-Robo1
LRDDFRQKPSDVNVAVGEPAVMECQPPRGHPEPTISWKKDGSPLDDKDER EST H77734
配列にＴからＧへの変化という１つの誤りがあり、その結果アミノ酸ＮがＫに置き換えられた。配列を以下に示すが明確にするために逆にした。
TACTTCGGGATGACTTCAGACAAAAACCTTCGGATGTCATGGTTGCAGTA H-Robo1
TACTTCGGGATGACTTCAGACAAAACCCTTCGGATGTCATGGTTGCAGTA EST H77734
L R D D F R Q K P S D V M V A V
N

表５．Ｈ-Ｒｏｂｏ１と比較したＥＳＴ：ｙｑ７６ｅ１２配列。ｙｑ７６ｅ１２は配列決定したＤＮＡの断片を指す。断片は両側から配列決定し、次の２つの配列：Ｈ５２９３６及びＨ５２９３７を生ずる（後者は明確にするため逆にした）。配列は中間において重複することが見られる。間隙は断片シフトの誤りを示す。誤りは、一方の配列の任意の１つの位置においてのみであることを注記しておく。
GPLVSDMDTDAPEEEEDEADMEVAKMQTRRLLLRGLEQTPASSV H-Robo1
GPLVSDMDTDAPEEEEDEADMEVAKMQ. RRLLLRGLEQTPASSV EST H52936

GDLESSVTGSMINGWGSASEEDNISSGRSSVSSSDGSFFTDADF H-Robo1
GDLESSVTGSMINGWGSASEEDNISSGRSSVSSSDGSFFTDADF EST H52936

AQAVAAA AEYAGLKVARRQMQDAAGR RHFH AS QC PRPT H-Robo1
AQAVAAA AEYAGLKVARRQMQDAAGR RHFH AF QC PRPT EST H52936
?AAT A?YAGLKVARRQMQDAAGR RHFH AS QC PRPT EST H529367

SPVSTDSNMSAAVMQKTRPAKKLKHQPGHLRRETYTDDLPPPPV H-Robo1
SPVFTDSNM EST H52936
SPVSTDSNMSAAVMQKTRPAKKLKHQPGHLRRETYTDDLPPPPV EST H52937

PPPAIKSPTAQSKTQLEVRPVVVPKLPSMDARTDK H-Robo1
PPPAIKSPTAQSKTQLEVRPVVVPKLPSMDARTDK EST H52937

主題とするドメインは、Ｒｏｂｏ特異的細胞、特にニューロン変調又は阻害変調活性、Ｒｏｂｏ−リガンド結合阻害活性といったＲｏｂｏドメイン特異的活性又は機能を提供する。Ｒｏｂｏ特異的活性又は機能は、簡便なインビトロの、細胞ベースの、又はインビボのアッセイ：例えばインビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイにより、動物等（例えば遺伝子治療、遺伝子導入など）において決定することができる。結合アッセイは、Ｒｏｂｏポリペプチドと結合標的との分子相互作用が評価される任意のアッセイを含む。結合標的は、天然の細胞内結合標的、Ｒｏｂｏ調整タンパク質、又はＲｏｂｏ活性又はその位置を直接変調させる他の制御因子；あるいは、抗体などの特異的免疫タンパク質といった非天然結合標的、又は以下に記載するようなスクリーニングアッセイで同定されるもの等のＲｏｂｏ特異的試薬であってよい。Ｒｏｂｏ結合特異性は、結合平衡定数（通常は少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）により、主題のポリペプチドのＲｏｂｏ発現細胞における陰性変異体として機能する能力、異種宿主（例えば齧歯類又はウサギ）におけるＲｏｂｏ特異的抗体を生じさせる能力等によって検定される。

特許請求されるＲｏｂｏポリペプチドは、単離されたもの又は純粋なものであり：「単離された」ポリペプチドは、その天然状態において付随している物質であって与えられた試料において全ポリペプチドの好ましくは少なくとも約０．５％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成する物質の少なくとも幾つかを伴わず、与えられた試料において純粋なポリペプチドが全ポリペプチドの少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９９重量％を構成する。ここで用いられるポリペプチドは、一般的には少なくとも６残基、好ましくは少なくとも約１０残基、より好ましくは少なくとも約２５残基、最も好ましくは少なくとも約５０残基の長さのアミノ酸ポリマーである。Ｒｏｂｏポリペプチド及びポリペプチドドメインは、合成されても、組み換え技術により生産されても、又は哺乳動物、好ましくはヒト細胞から精製されてもよい。主題の組成物の生化学的合成、分子発現及び精製するための広範な分子及び生化学的方法が利用可能であり、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook,等, Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, 等, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY)又は当該分野で他に知られたものを参照されたい。

本発明は、特許請求するＲｏｂｏポリペプチドに特異的な天然細胞内結合標的等を含む結合試薬、それらの試薬の同定及び製造方法、及びそれらの診断、治療及び製薬開発における使用を提供する。例えば、特異的結合試薬は、種々の診断及び治療用途で、特に病理、創傷快復不全又は予後が不都合又は望ましくない軸索成長、配向又はその阻害を伴う場合に有用である。新規なＲｏｂｏ特異的結合試薬は、Ｒｏｂｏ特異的レセプター、例えば体細胞的に組み換えられたポリぺプチドレセプター様特異的抗体又はＴ細胞抗原レセプター（例えば、Harlow及びLane (1988) antibodies, A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory参照）、１-、２-及び３-ハイブリッドスクリーニング等のアッセイで同定される天然細胞内結合試薬、以下に記載するような化学的ライブラリのスクリーニングで同定される非天然細胞内結合試薬などを含む。特に興味深い試薬は、Ｒｏｂｏ機能を変調させる。

特別な実施態様では、主題ポリペプチドは、Ｒｏｂｏ又はヒトＲｏｂｏ特異的抗体を生じさせるのに用いられる。例えば、、上記のＲｏｂｏ及びヒトＲｏｂｏ特異的ペプチドは、キーホールリンペット抗原（ＫＬＨ）に共有結合し、複合体はフロイント完全アジュバントに乳化される。実験用ウサギを従来のプロトコールに従って免疫化して出血させる。Ｒｏｂｏ特異的抗体の存在を、固定化した配列番号：２、４、６、８、１０又は１２のＲｏｂｏポリペプチドを用いた固相免疫吸着剤アッセイによって検定する。ヒトＲｏｂｏ特異的抗体は、非ヒトＲｏｂｏポリペプチドとの非交差反応性で特徴付けられる（配列番号：２、４、６及び１２）。

従って、本発明は、例えば細胞をＲｏｂｏ阻害剤、例えば阻害的Ｒｏｂｏ欠失変異体、Ｒｏｂｏ特異的抗体など（上掲）と接触させることによりＲｏｂｏ活性を変調させる過程を含む、細胞機能を変調させる方法を提供する。標的細胞は、培地又はインシトゥ、即ち天然宿主内に存在していてよい。阻害剤は、（ｉ）組み換え核酸からの細胞内発現又は（ｉｉ）細胞の細胞外接触を含む任意の従来法により供給されうる。多くのインシトゥ用途では、組成物は、保定された血液又は滑液などの生理学的液体に添加される。ＣＮＳ投与については、血液脳関門を横切る治療薬の移動を促進するために、手術又は注射による破壊、ＣＮＳ脈管構造内皮細胞間の接着的接触を一時的に開く薬剤、及びそのような細胞を通る転位置を促進する組成物を含む様々な技術が利用可能である。また、Ｒｏｂｏポリペプチド阻害剤は、直接的な注射又は吸入、局所、例えばエアロゾルを介した気管内／経鼻投与、眼内、又はインプラント、例えば繊維、例えばコラーゲン内／上、浸透ポンプ、適当に形質転換された細胞を含む移植片などに従うことができる。特別な投与方法は、繊維、例えばコラーゲン繊維、タンパク質ポリマーなどを治療用タンパク質で被覆、包埋又は誘導体化することを含む。他の有用な方法は、Otto等, (1989) J. Neuroscience Research, 22, 83-91及びOtto及びUnsicker (1990) J. neuroscience, 10, 1912-1921に記載されている。一般に、投与される量は経験的に決定されるが、典型的には、患者の体重１ｋｇ当たり約１０から１０００μｇの範囲であり、濃度は、一般的に投与される用量１ｍｌ当たり約５０から５００μｇの範囲である。安定化剤、殺菌剤などの他の添加剤を含んでもよく、従来の量で含有せしめる。診断用途については、阻害剤又はＲｏｂｏ結合剤は、蛍光物質、放射活性、化学発光、又は他の容易に検出可能な分子で標識されることが多く、それらは結合試薬に直接結合するか結合試薬に特異的なプローブに結合するかのいずれかである。

開示したＲｏｂｏポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された発現系について最適化されたＲｏｂｏポリペプチドをコードする核酸の逆翻訳に用いられ（Holler等, (1993) Gene, 136 323-328; Martin等, (1995) Gene, 154, 150-166）あるいは天然Ｒｏｂｏコード核酸配列の単離で用いるための変性オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの生成に用いられる（"GCG" software, Genetics Computer Group, Inc., Madison W1）。Ｒｏｂｏをコードする核酸は、例えば、Ｒｏｂｏが変調した細胞機能などを伴う疾患のための候補薬剤の有効性などを研究するために、例えば、トランスジェニック動物を発現及びスクリーニングするために、Ｒｏｂｏ発現ベクターで用いられ、組み換え宿主細胞に導入される。

また本発明は、核酸ハイブリッド形成プローブ（表６、７）及び複製／増幅プライマー（表７、８）を提供し、それらは、配列番号：１、３、５、７、９又は１１を含むＲｏｂｏｃＤＮＡ特異的配列を有し、それに特異的なハイブリッド形成をもたらす（即ち、ＣＤＯｃＤＮＡの存在下で、各々配列番号：１、３、５、７、９又は１１に特異的にハイブリッド形成する）のに十分である。

表５．ヒト迂回１に対するハイブリッド形成プローブ
免疫グロブリンドメイン＃１

免疫グロブリンドメイン＃２

免疫グロブリンドメイン＃３

免疫グロブリンドメイン＃４

免疫グロブリンドメイン＃５

フィブロネクチンドメイン＃１

フィブロネクチンドメイン＃２

フィブロネクチンドメイン＃３

膜貫通ドメイン

細胞質モチーフ＃１

細胞質モチーフ＃２

細胞質モチーフ＃３

表６．ヒト迂回２に対するハイブリッド形成プローブ
免疫グロブリンドメイン＃４

免疫グロブリンドメイン＃５

フィブロネクチンドメイン＃１

表７．ヒト迂回１ドメインのＰＣＲのためのプライマー対
免疫グロブリンドメイン＃１
正：5' CCACCTCGCATTGTTGAACACCCTTCAGAC 3'
逆：5' ATGGCTACTTCCAGCGATGCATTGTGGCTC 3'
免疫グロブリンドメイン＃２
正：5' CTTCGGGATGACTTCAGACAAAACCCTTCG 3'
逆：5' TAAGACAGTCAGCTCGGCTACTTCACTCTC 3'
免疫グロブリンドメイン＃３
正：5' AGAGAGACCATCATTTGTGAAGAGACCCAG 3'
逆：5' AGGTTCTTGAACAGTCAGAGTAGCAGATGC 3'
免疫グロブリンドメイン＃４
正：5' CCACATTTTGTTGTGAAACCCCGTGACCAG 3'
逆：5' TGCAATCACATCTGTAACTTCCAAATATGC 3'
免疫グロブリンドメイン＃５
正：5' ATCGGCCTCCCCCAGTTATTCGACAAGGTC 3'
逆：5' CAAATTCTTGAACTTCAATGTAAGCACTCC 3'
フィブロネクチンドメイン＃１
正：5' GAGTTCCAGTTCAGCCTCCAAGACCTACTG 3'
逆：5' TCACTAATTCCATATGCATTAGCTGCCCTC 3'
フィブロネクチンドメイン＃２
正：5' CAAGCCAAATATCAGATCCAGTGAAAACAC 3'
逆：5' ATCTGCTCCTTGAAATTCATTAAAAAAAGG 3'
フィブロネクチンドメイン＃３
正：5' ATAGTGAAATCAAGTTTGCCAAAACCCTG 3'
逆：5' CTCTTTACCCCAGACCCAGCCCCAGTGCTG 3'
膜貫通ドメイン
正：5' GGACCAAGTCAGCCTCGCTCAGCAGATTTC 3'
逆：5' ACTAGTAAGTCCGTTTCTCTTCTTGCGGTG 3'
細胞質モチーフ＃１
正：5' CTGAAGGATGGGCGTTTTGTCAATCCATC 3'
逆：5' GTCCCAGTGGTTTCCAGTGCTTCTCGCCAG 3'
細胞質モチーフ＃２
正：5' GGCACAAGAAAGGGGCAAGAACACCCAAGG 3'
逆：5' ATAGCTTTCATCTACAGAAATGTTGTACTC 3'
細胞質モチーフ＃３
正：5' ACCAGACCAGCCAAGAAACTGAAACACCAG 3'
逆：5' GTACTTCCAGCTGTGTCTTGGATTGGGCAG 3'

表８．ヒト迂回２プライマー対
免疫グロブリンドメイン＃４
正：5' GTTGCTCAAGGTCGAACAGTGACATTTCCC 3'
逆：5' TGTCAAAACATCAGTAACCTCCAGTTGAGC 3'
免疫グロブリンドメイン＃５
正：5' GATAGACCTCCACCTATAATTCTACAAGGC 3'
逆：5' GACTCTGTCACATCCAGCACTGCACTCCAG 3'
フィブロネクチンドメイン＃１
正：5' CAATCAGTAAAAACTATGATTTAAGTG 3'
逆：5' TCGCTCTGACCATGAATAAGTAGATTG 3'

このようなプライマー又はプローブは、少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも３６、そして最も好ましくは少なくとも９６塩基の長さである。特異的ハイブリッド形成を示すことは、一般にストリンジェントな条件、例えば、５ｘＳＳＰＥ（０．１８ＭＮａＣｌ、０．０１ＭＮａＰＯ４、ｐＨ７．７、０．００１ＭＥＤＴＡ）バッファー中に３０％ホルムアミドを含むバッファーで４２℃においてハイブリッド形成し、４２℃において０．２ｘＳＳＰＥで洗浄したときに結合を保持すること；好ましくは、５ｘＳＳＰＥバッファー中に５０％ホルムアミドを含むバッファーで４２℃においてハイブリッド形成し、４２℃において０．２ｘＳＳＰＥで洗浄したときに結合を保持することが必要とされる。また、Ｒｏｂｏ核酸は、ＢＬＡＳＴＸ（Altschul等, (1990) Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol., 215, 403-410）などのアラインメントアルゴリズムを用いて識別することもできる。

主題の核酸は、合成／非天然配列及び／又は単離されたもの、即ち、その天然状態に付随する、好ましくは与えられた分画に存在する全核酸の少なくとも０．５％、好ましくは少なくとも５重量％を構成する物質の少なくとも幾つかを伴わず、通常は組み換え体であり、非天然配列又は天然染色体に結合しているもの以外のヌクレオチドに結合した天然配列を含むことを意味する。配列番号：１、３、５、７、９又は１１又はその断片を含む主題の組み換え核酸は、そのような配列又は断片を末端に含み、天然染色体に結合しているもの以外の配列に直ぐに隣接（即ち連続）しているか、又は１０ｋｂ未満、好ましくは２ｋｂ未満、より好ましくは５００ｂｐ未満の天然隣接領域に隣接しており、それは、末端又は天然染色体に結合しているもの以外の配列に直ぐに隣接している。核酸は通常ＲＮＡ又はＤＮＡであるが、変調された安定性などを提供するために、他の塩基又はヌクレオチド類似物を含む核酸を使用するのが有利なことが多い。

特別な実施態様では、発現された配列タグＥＳＴ；ｙｕ２３ｄ１１、登録＃Ｈ７７７３４及びＥＳＴ；ｙｑ７６ｅ１２、登録＃Ｈ５２９３６、及びそれらの欠失変異体は本発明の範囲内ではない。他の実施態様では、主題のＲｏｂｏ核酸は、開示された天然ヒトＲｏｂｏＩ核酸の対応する領域、即ち配列番号：７、ヌクレオチド５００−６５１及び配列番号：７、ヌクレオチド３９４５−４４５５を除外する。

表１０．Ｈ５２９３６及び対応するヒトＲｏｂｏＩの間の相違点の例
（１）位置８６においてＡではなくＴがある。従って、新たなコドンはＡＧＡ（Ｒ）ではなくＴＧＡ（停止）と読める。
（２）位置２８６−７にＧが無く、フレームシフトを起こしている。
（３）位置３３４に外部のＧがあり、フレームシフトを起こしている。
（４）位置３４４に外部のＴがあり、フレームシフトを起こしている。
（５）位置３５７に外部のＮがあり、フレームシフトを起こしている。
（６）３６２にＣではなくＴがる。新たなコドンはＴＣＴ（Ｓ）ではなくＴＴＴ（Ｆ）と読める。
（７）位置３６４に外部のＴがあり、フレームシフトを起こしている。
（８）位置３７０に外部のＮがあり、フレームシフトを起こしてアミノ酸が変わっている（コドンＴＴＮは不明）
（９）位置３９４及び３９５においてＣではなく２つのＴがあり、フレームシフト及びアミノ酸変化を起こしている。

表１１．Ｈ５２９３７（逆配列）と対応するヒトＲｏｂｏＩ配列の間の相違点の例
（１）最初の３０塩基に複数の誤りがある。
（２）位置６３において、ＧがＡに置換している。Ｑに対するＣＡＧではなく新たなコドンＣＧＧはＲをコードする。
（３）ヒトグリコホリンＢ遺伝子（３５３−４４２）の一部結合することによりＥＳＴが終端している。

主題の核酸には広範な用途が見いだされ、翻訳可能な転写物、ハイブリッド形成プローブ、ＰＣＲプライマー、診断的核酸などとしての使用；Ｒｏｂｏ遺伝子及び遺伝子転写物の存在の検出において及びさらなるＲｏｂｏ相同体及び構造類似物をコードする核酸の検出及び増幅における使用を含む。診断において、Ｒｏｂｏハイブリッド形成プローブは、臨床及び実験室試料中の野生型及び変異型Ｒｏｂｏ対立遺伝子の同定における使用が見いだされた。変異体対立遺伝子は、高スループット臨床診断のための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブの生成に用いられる。治療においては、治療的Ｒｏｂｏ核酸は活性Ｒｏｂｏの細胞発現又は細胞内濃度又は利用可能性を変調させるのに用いられる。

本発明は、Ｒｏｂｏ変調可能な細胞機能のレベルにおいて活性な試薬のための薬剤、化合物又はリード化合物を同定する有効な方法を提供する。一般的に、これらのスクリーニング法は、Ｒｏｂｏの天然Ｒｏｂｏ結合標的との相互作用を変調させる化合物についてのアッセイを含む。結合試薬のために、標識されたインビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、免疫アッセイ、細胞ベースのアッセイ等を含む広範なアッセイ法が与えられている。これらの方法は、自動化され、リード化合物の化学ライブラリーのコスト効率が良く高スループットのスクリーニングとしやすい。同定された試薬は、動物及びヒト試行のための製薬工業における用途が見いだされ；例えば、医薬開発のために活性を最適化し毒性を最小化するために、試薬を誘導体化してインビボ及びインビトロアッセイで再スクリーニングしてもよい。

細胞及び動物ベースの神経誘導／反発アッセイは、以下の実験部分において詳細に説明する。インビトロ結合アッセイは、他のペプチド又はポリペプチド、例えば検出又は固着用のタグ等との融合生成物の一部であってもよいＲｏｂｏポリペプチドを含む成分の混合物を用いる。アッセイ用混合物は、天然細胞内Ｒｏｂｏ結合標的を含む。天然全長結合標的が用いられるが、その一部（例えばペプチド）が、アッセイにおいて便利に測定できる主題のＲｏｂｏポリペプチドに結合する親和性及び結合力を提供する限り、その一部を用いるのが好ましいことも多い。また、アッセイ用混合物は、候補となる薬理学的試薬も含んでいる。候補試薬は多数の化学的分類を含むが、典型的には有機化合物；好ましくは小有機化合物であり、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範な供給源から得られる。また、種々の他の試薬も混合物に含まれる。これらは、塩、バッファー、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などの試薬を含む。

得られた混合物は、候補製薬試薬の存在は別として、Ｒｏｂｏポリペプチドが細胞結合標的、参照結合親和性を持つ部分又は類似物に特異的に結合する条件下でインキュベートする。混合物成分は、不可欠な結合を与える任意の順序で添加され、インキュベーションは、最適な結合を促進する任意の温度で実施してよい。インキュベーション時間は、同様に最適結合のために選択されるが、迅速で高スループットのスクリーニングを円滑にするために最も短くされる。

インキュベーションの後、Ｒｏｂｏポリペプチドと１つ又はそれ以上の結合標的の間の試薬でバイアスされた結合を、任意の便宜的な方法で検出する。Ｒｏｂｏ又は結合標的ポリペプチドの少なくとも一方が標識を含んでいる場合、標識は、放射活性、蛍光、光学又は電子密度等としての直接的な検出、あるいはエピトープタグ等としての間接的な検出を提供する。標識及び他のアッセイ成分の性質に応じて、例えば、光学又は電子密度、放射線放出、非放射性エネルギー移動等を通して標識を検出するのに種々の方法が用いられ、あるいは抗体複合体で間接的に検出される。

Ｒｏｂｏポリペプチドの試薬の不存在での標的への結合親和性の、試薬の存在下における結合親和性に比較した相違は、試薬がＲｏｂｏポリペプチドのＲｏｂｏ結合標的への結合を変調させることを示している。例えば、以下にも述べる細胞ベースアッセイにおいても、試薬有無における軸索成長又は配向のＲｏｂｏ依存性変調の相違は、試薬がＲｏｂｏ機能を変調させることを示している。ここで用いる相違とは、統計的に有意な、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％の違いである。

以下の実験部分及び実施例は例示のために与えられ、何ら限定するものではない。
（実験）
迂回（ラウンドアバウト）遺伝子のクローニング。ｒｏｂｏ１対立遺伝子は組み換えマッピングにより第２の染色体の右腕上のｐｌｅｘｕｓ-ｂｒｏｗｎ間隙にマッピングされ；組み換え体の数が５８Ｆ／５９Ａにおけるｐｌｅｘｕｓに極めて近いマッピング位置を示唆した。１つの欠失［Ｄｆ(２Ｒ)Ｐ、５８Ｅ３／Ｆ１から６０Ｄ１４／Ｅ２を欠く］はｒｏｂｏ変異体に相補的でなく、他の２つの欠失［Ｄｆ(２Ｒ)５９ＡＢ及びＤｆ(２Ｒ)５９ＡＤ、各々５９Ａ１／３から５９Ｂ１／２及び５９Ａ１／３から５９D1／４を欠く］はｒｏｂｏに相補的であり、重複［Ｄｐ(２；Ｙ)ｂｗ＋Ｙ、５８Ｆ１／５９Ａ２から６０え３／Ｆ１を重複］がｒｏｂｏ変異体を救済する。このマッピングは５８Ｆ／５９Ａ領域にｒｏｂｏを位置させる。

我々は、この領域にマッピングされたＰ１クローンから染色体歩行を始め、遠位側からはクローンＤＳ０２２０４を用いて、基部側からなクローンＤＳ０５６０９を用いて開始した。我々は、〜１５０ｋｂの歩行を完了するのにコスミドクローン（Tamkun等, 1992）を用いた。次いで我々は、組み換え体において多重標識した染色体とｒｏｂｏ変異体染色体との間にＲＦＬＰを探した。コスミド１０６−５からの６．８ｋｂＥｃｏＲＩ断片は、単一のｒｏｂｏ変異体組み換え系統に存在するマッピング染色体のＨｉｎｄＩＩ ＲＦＬＰを同定した。この断片は、ｒｏｂｏの局在化についての基部限界を決定した。次いで、この領域におけるさらなる欠失を試験した（Kerrebrock等, 1995）。これらの欠失の中で、Ｄｆ(２Ｒ)Ｘ５８−５及びＤｆ(２Ｒ)Ｘ５８−１２はｒｏｂｏを除去するが、Ｄｆ(２Ｒ)Ｘ５８−１はしない。Ｄｆ(２Ｒ)Ｘ５８−１２はＤｆ(２Ｒ)５９ＡＢに相補的でないがＤｆ(２Ｒ)５９ＡＤに相補的であり、Ｄｆ(２Ｒ)５９ＡＢが更に基部に伸長することを示唆し、この基部終点はｒｏｂｏの局在化についての遠位限界を与える。歩行からのプローブは、これらの欠失の切断点の同定に用いた（図１Ａ）。Ｄｆ(２Ｒ)Ｘ５８−１は、コスミドＧＪ１２内の９．６ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片において切断されるが、Ｄｆ(２Ｒ)５９ＡＢは、コスミド１０６−１４３５内のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片で切断される。これは、ｒｏｂｏの位置をこれらの制限断片に結合した７５ｋｂまで縮小させる。コスミドＧＪ１２、１０６−１２及び１０６−１４３５での０−１６ｈｒポリ−Ａ＋胚性ノーザンブロットのハイブリッド形成は、少なくとも５つの転写物を顕現させた。逆ノーザンブロットマッピングは、これらの転写物を含む領域を同定した（図１Ａ）。これらの領域は、ｃＤＮＡを単離するプローブとして使用した。７つの異なるｃＤＮＡを単離し、インシトゥハイブリッド形成によって分析した。これらの転写物の５つの発現パターンにより、それらが適当な段階で胚性ＣＮＳにおいて発現しないため、ｒｏｂｏをコードするときに、それらを一時的にディスカウントさせた。残りの２つのｃＤＮＡの中で、１２−１は、その大きさ及び発現からｒｏｂｏの最も有望な候補であることがわかった。１２−１転写物及び転写物の領域５’を含む１６ｋｂＸｂａＩ断片は、ｒｏｂｏ変異体を救済することができる。

迂回（ラウンドアバウト）は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーをコードする。我々は、１２−１転写単位に相当する重複ｃＤＮＡクローンを回収及び配列させた。１３９５アミノ酸をコードする単一の長い読み枠（ＯＲＦ）を同定した（表１のＤ１）。ＯＲＦの概念的翻訳により、Ｒｏｂｏタンパク質がＩｇスーパーファミリーのメンバーであり；Ｒｏｂｏの外部ドメインが３つのフィブロネクチン(Ｆｎ)ＩＩＩ型リピートに続く５つの免疫グロブリン(Ｉｇ)−様リピートを含むことを明らかにした。予測されるＯＲＦは、膜貫通ドメイン及び大きな４５７アミノ酸（ａ．ａ．）の細胞質ドメインも含む。Ｒｏｂｏ配列のハイドロパシー分析は、単一の２５ａ．ａ．の膜貫通ドメイン（Kyte及びDoolittle, 1982）に加えてＧ５１とＱ５２の間に予測される切断部位を持つシグナル配列（Nielsen等, 1997）を示した。

我々は、幾つかの基準に基づいてＲｏｂｏをコードする１２−１転写物を同定した。第１に、胚性Ｒｏｂｏフェノタイプは、このｃＤＮＡを含む１６ｋｂＸｂａＩゲノム断片によって救済され；他の転写物はこの１６ｋｂＸｂａＩ断片には含まれない。第２に、我々は、対立遺伝子ｒｏｂｏ６に付随するＣｆｏＩＲＦＬＰを同定した。この多型性は、ＯＲＦのヌクレオチド３３２がＧからＡに変化し、その結果Ｇｌｙ１１１がＡｓｐに変化したことによる。Ｇｌｙ１１１は、第１のＩｇドメインにあり（図２）、同定された全てのＲｏｂｏ相同体に保持される。この変化は対立遺伝子Ｒｏｂｏ６に特異的であり、親の染色体又は同じ親遺伝子型から生成された他の７つの対立遺伝子のいずれにも見られない。第３に、Ｒｏｂｏタンパク質を認識する抗体の生成（後述）が、対立遺伝子ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２、ｒｏｂｏ３、ｒｏｂｏ４及びｒｏｂｏ５はＲｏｂｏタンパク質を生成しないことを明らかにする（表１２）。

表１２．ｒｏｂｏ変異体対立遺伝子
対立遺伝子 異名 分類
ｒｏｂｏ１ ＧＡ２８５ タンパク質無し
ｒｏｂｏ２ ＧＡ１１１２ タンパク質無し
ｒｏｂｏ３ Ｚ１４ タンパク質無し
ｒｏｂｏ４ Ｚ５７０ タンパク質無し
ｒｏｂｏ５ Ｚ１７７２ タンパク質無し
ｒｏｂｏ６ Ｚ１７５７ タンパク質陽性；Ｇｌｙ１１１からＡｓｐ
ｒｏｂｏ７ Ｚ２１３０ 低下したタンパク質レベル
ｒｏｂｏ８ Ｚ３１２７ タンパク質陽性

全ての対立遺伝子は、ＦａｓＩＩＩ無し染色体のＥＭＳ突然変異誘発によって生成されら。これらの各対立遺伝子は、これらの対立遺伝子がｒｏｂｏ位置［Ｄｆ(２Ｒ)Ｘ５８−５］に対する染色体欠失に渡って配置されたとき観察された変異体フェノタイプが同型接合的対立遺伝子から区別できないので、ｒｏｂｏに対する完全、又は完全に近い、機能喪失のフェノタイプを表すことがわかる。

最後に、ｒｏｂｏのトランスジェニック神経発現はｒｏｂｏ変異体のフェノタイプを横切る正中線を救済する（以下参照）。
ｃＤＮＡ及びゲノムプローブを用いた発生的ノーザンブロットは、ｒｏｂｏが〜７５００ｂｐの単一の転写物にコードされることを示唆している。我々は、ゲノムＤＮＡを配列させ、配列内に１７のイントロンを同定したが、そのうち１４は５０−７５のみの長さであり、加えて３つのイントロンは８４３ｂｐ、２３６ｂｐ、及び１１０ｂｐである（図１Ｂ）。転写の正確な出発点は決定されていない。

進化的に保持されたＲｏｂｏ様タンパク質のファミリー。５つのＩｇ及び３つのＦｎドメイン、膜貫通ドメイン、及び長い（４５２ａ．ａ．）細胞質領域の存在は、Ｒｏｂｏがレセプター及びシグナル化分子でありうることを示している。ネトリンレセプターＤＣＣ／Ｆｒａｚｚｌｅｄ／ＵＮＣ−４０は、６Ｉｇ及び４Ｆｎドメイン及び同様に長い細胞質領域を持つ関連するドメイン構造を有する（Keino-Masu等, 1996; Chan等, 1996; Kolodziej等, 1996）。現在知られている「５＋３」機構を持つ唯一のタンパク質はＣＤＯ（Kang等, 1997）である。しかし、ＣＤＯはＲｏｂｏと遠く関連しているのみである（対応するＩｇ及びＦＮドメインの間で１５−３３％ａ．ａ．同一性）。

我々は、脊椎動物においてアミノ酸同一性がＣＤＯを越えＲｏｂｏ相同性を示す他の「５＋３」タンパク質を同定した。ヒト発現した配列タグ（ＥＳＴ；ｙｕ２３ｄ１、登録＃Ｈ７７７３４）はｒｏｂｏの第２のＩｇドメインと高い相同性を示し、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene）をプローブするのに用いられた。回収されたクローンは、５つのＩｇ及び３つのＦｎドメインを持つヒト遺伝子に相当する（図２）。例示的な機能性Ｒｏｂｏドメインを表１３−１７に示す（対応するコード核酸は配列表の対応する核酸配列から見分けられる）。

表１３．アミノ酸配列位置によるヒトＲｏｂｏ１の例示的ドメイン
シグナル配列： ６−２１
第１の免疫グロブリンドメイン： ６８−１６７
第２の免疫グロブリンドメイン： １６８−２５８
第３の免疫グロブリンドメイン： ２５９−３５０
第４の免疫グロブリンドメイン： ３５１−４５０
第５の免疫グロブリンドメイン： ４５１−５４６
第１のフィブロネクチンドメイン： ５４７−６４４
第２のフィブロネクチンドメイン： ６４５−７６１
第３のフィブロネクチンドメイン： ７６２−８６２
膜貫通ドメイン： ８９６−９１７
細胞質モチーフ＃１： １０７０−１０７９
細胞質モチーフ＃２： １１８１−１１９５
細胞質モチーフ＃３： １４８１−１４８８

表１４．アミノ酸配列位置によるヒトＲｏｂｏＩＩの例示的ドメイン
第４の免疫グロブリンドメイン： １−９１
第５の免疫グロブリンドメイン： ９２−１８５
第１のフィブロネクチンドメイン： １８６−２８２

表１５．アミノ酸配列位置によるショウジョウバエＲｏｂｏ１の例示的ドメイン
シグナル配列： ３０−４６
第１の免疫グロブリンドメイン： ５６−１５２
第２の免疫グロブリンドメイン： １５３−２５１
第３の免疫グロブリンドメイン： ２５２−３４４
第４の免疫グロブリンドメイン： ３４５−４４０
第５の免疫グロブリンドメイン： ４４１−５３５
第１のフィブロネクチンドメイン： ５３６−６３５
第２のフィブロネクチンドメイン： ６３６−７５３
第３のフィブロネクチンドメイン： ７５４−８５４
膜貫通ドメイン： ９１５−９３８
細胞質モチーフ＃１： １０３７−１０４６
細胞質モチーフ＃２： １０９８−１１１９
細胞質モチーフ＃３： １２６２−１２６９

表１６．アミノ酸配列位置によるショウジョウバエＲｏｂｏＩＩの例示的ドメイン
免疫グロブリンドメイン＃１： ４−９９
免疫グロブリンドメイン＃２： １００−１９２
免疫グロブリンドメイン＃３： １９３−２９６
免疫グロブリンドメイン＃４： ２９７−３９６
免疫グロブリンドメイン＃５： ３９７−４９４
フィブロネクチンドメイン＃１： ４９５−５９５
フィブロネクチンドメイン＃２： ５９６−７７０
フィブロネクチンドメイン＃３： ７７１−８７７
膜貫通ドメイン： ９０６−９２９
保持された細胞質モチーフ＃１： １０７５−１０８４

表１７．アミノ酸配列位置による線虫Ｒｏｂｏ１の例示的ドメイン
第１の免疫グロブリンドメイン： ３０−１２９
第２の免疫グロブリンドメイン： １３０−２２３
第３の免疫グロブリンドメイン： ２２４−３１５
第４の免疫グロブリンドメイン： ３１６−４５３
第５の免疫グロブリンドメイン： ４５４−５４３
第１のフィブロネクチンドメイン： ５４４−６４３
第２のフィブロネクチンドメイン： ６４４−７６６
第３のフィブロネクチンドメイン： ７６７−８６５
膜貫通ドメイン： ９００−９２２
細胞質モチーフ＃１： １０３６−１０４５
細胞質モチーフ＃２： １１５３−１１６３
細胞質モチーフ＃３： １０６５−１０７４

相同性は最初の２つのＩｇドメインにおいて特に高く（Ｄ−Ｒｏｂｏ１とＣＤＯの間の同じ２つのＩｇドメインについての２６％及び３０％に比較して、各々５８％及び４８％ａ．ａ．の同一性）、それとともに、細胞外領域全体にわたる同一性と３つの保持された細胞質モチーフの存在により、我々は、これをヒト迂回１遺伝子（Ｈ−ｒｏｂｏ１）として設計した。データベース検索により、データベースＤＵＴＴ１においてＨ−ｒｏｂｏ１に対応する核酸配列はシグナル配列において相違していることが明らかとなり、選択的なスプライシング、９ｂｐの挿入及び７つの単一塩基対変化を示唆している。５つのＥＳＴ（実験方法参照）は、Ｈ−ｒｏｂｏ１の細胞質ドメインと高い配列類似性を示す。これらのＥＳＴの一つをプローブとして用いて単離したｃＤＮＡの配列により、第２のヒト迂回遺伝子を確認した（Ｈ−ｒｏｂｏ２）。

Ｈ−ｒｏｂｏ１及びＤ−ｒｏｂｏ１の間で保持された配列に基づく変性したＰＣＲプライマーを、ラット胚Ｅ１３脳ｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ断片の単離に用いた。断片は、Ｅ１３脊髄ｃＤＮＡライブラリーのプローブに用い、その結果、全長ラットｒｏｂｏ遺伝子（Ｒ−ｒｏｂｏ１）を単離した。予測されるタンパク質は、Ｈ−ｒｏｂｏ１と全長に渡って高い配列同一性（＞９５％）を示す。異なるＲ−ｒｏｂｏ１ｃＤＮＡクローンの５’配列は、この遺伝子がＨ−ｒｏｂｏ１／ＤＵＴＴＩと類似の形式で選択的にスプライシングされることを示す。我々は、Ｈ−ｒｏｂｏ２に高い相同性を持つＲ−ｒｏｂｏ２についてのｃＤＮＡクローンの単離に同様の方法を用いた。

マウスＥＳＴｖｉ９２ｅ０２は、Ｈ−ｒｏｂｏ１の細胞質部分に高い相同性を有する。線虫Ｓａｘ−３遺伝子もｒｏｂｏ相同体である（表１；Zallen等, 1997）。第２のショウジョウバエｒｏｂｏ遺伝子（Ｄ−ｒｏｂｏ２）も、公的なデータベースにおけるゲノム配列の分析から予測される。これらのデータを合わせると、Ｒｏｂｏが、少なくとも線虫の１つ、ショウジョウバエの２つ、ラットの２つ、及びヒトの２つのメンバーを持つＩｇスーパーファミリータンパク質の新たなサブファミリーのメンバーであることが見いだされることを示している。

Ｒｏｂｏファミリータンパク質のアラインメントにより、第１及び第２のＩｇドメインが、細胞外ドメインで最も高度に保持された部分であることが明らかとなる。細胞質ドメインは、３つの高度に保持されたモチーフの存在を除いては、高度に多岐にわたる（表１８）。

表１８．保持された細胞質モチーフ：３つの保持された細胞質モチーフのアミノ酸アラインメントは以下に示す構成である；線虫ｒｏｂｏ、モチーフ＃２及び＃３は、よりよいアラインメントを得るために切り換えた。
保持された細胞質モチーフ＃１
PDNPTPYATTMIIGTSS 1050 ショウジョウバエ迂回−Ｉ
SGQPTPYATTQLIQSNL 1083 ヒト迂回−Ｉ
NASPAPYATSSILSPHQ 1088 ショウジョウバエ迂回−ＩＩ
HDDPSPYATTTLVLSNQ 1049 線虫迂回
PTPYATT.HH..... 共通（ここでｈはＩ、Ｌ又はＶ）
保持された細胞質モチーフ＃２
INWSE.FLPPPPEHPPPSSTYG.Y 1119 ショウジョウバエ迂回−Ｉ
MNWAD.LLPPPPAHPPPHSNSEEY 1202 ヒト迂回−Ｉ
STWANVPLPPPPVQPLPGTELEHY 31 ヒト迂回−ＩＩ
KTLMD.FIPPPPSNPPPP.GGHVY 1168 線虫迂回−Ｉ
nW...hhPPP. PPP.s....Y 共通（ここでｈは疎水性）
保持された細胞質モチーフ＃３
PSPMQPPPPVPVPVPEGW.Y 1273 ショウジョウバエ迂回−Ｉ
YTDDLPPPPVPPPAIKSP 1493 ヒト迂回−Ｉ
YADDLPPPPVPPPAIKSP 90 マウス迂回−Ｉ
RAPAMPTNPVPPEPPARY 1077 線虫迂回
....PPPPVPPP.... 共通

第１のモチーフについての共通（配列）は、ＰｔＰＹＡＴＴｘｈｈであり、ｘは任意のアミノ酸でありｈはＩ、Ｌ、又はＶである。モチーフの中心にチロシンが存在することは、リン酸化の部位を示している。他の２つのモチーフは、１又は２のアミノ酸で離間した一連のプロリンから構成され、ＳＨ３ドメインの結合部位を暗示している。特に、モチーフ＃２のＬＰＰＰ配列は、ショウジョウバエ可能化タンパク質又はその哺乳動物相同体Ｍｅｎａ（Niebuhr等, 1997）に対する良好な結合部位を提供する。これら３つの保持された全ての部位は、Ｒｏｂｏ媒介シグナル伝達において機能するリンカー／アダプタータンパク質のドメイン（例えばＳＨ３ドメイン）についての結合部位として機能することができる。

Ｒｏｂｏはショウジョウバエ胚における長軸方向の軸索で領域的に発現される。軸索横断挙動の調整においてｒｏｂｏが果たしうる役割を決定するために、我々は、胚性ＣＮＳにおけるｒｏｂｏ発現パターンを試験した。ショウジョウバエにおけるｒｏｂｏｍＲＮＡのインシトゥハイブリッド形成パターンは、ＣＮＳにおける向上かつ拡散した発現を有することを示した。我々は、Ｒｏｂｏ発現を可視化するために、タンパク質の細胞外部分（アミノ酸４０４−７２５）の一部に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ１３Ｃ９）を生じさせた。Ｒｏｂｏは、胚帯伸展の間に側方縞において弱く発現された胚で最初に見いだされる。胚帯退縮の開始時にＲｏｂｏ発現は神経外胚葉で観察される。段階１２の末期までに、成長円錐体が最初に伸長するにつれ、Ｒｏｂｏは、ｐＣＣ、ａＣＣ、ＭＰ１、ｄＭＰ２及びｖＭＰ２を含む同側的に突出する成長円錐体上で見られる。明らかに、交連的成長円錐体が正中線に向けて及びそれを横切って伸長するとき、Ｒｏｂｏ発現は殆ど又は全く観察されない。しかしながら、これらの成長円錐体が長軸方向への突出に戻ると、それらのＲｏｂｏ発現レベルが劇的に上昇する。Ｒｏｂｏは、全ての長軸方向突出成長円錐体及び軸索に高レベルで発現される。それに対して、Ｒｏｂｏは、交連軸索上では検出不能に近いレベルでしか発現されない。このことは、長軸方向の路における〜９０％の軸索も交連の一つにおいて交差する軸索セグメントを有するので明らかである。即ち、Ｒｏｂｏ発現は領域的に制限されている。また、Ｒｏｂｏ発現は、表皮に渡って低レベルで、筋肉結合部位において高レベルで見られる。段階１６−１７の胚において、交連にかすかなＲｏｂｏ染色が見られるが、長軸方向路で観察されるものより極めて低いレベルである。

Ｒｏｂｏの免疫電子顕微鏡。我々は、高分解能でＲｏｂｏ局在化を試験するために免疫電子顕微鏡を用いた。段階１３の胚において、Ｒｏｂｏは、長軸方向の成長円錐体及び糸状仮足において長軸方向軸索自身より高いレベルで発現される。この局在化は、Ｒｏｂｏが誘導レセプターとして機能するモデルと一致する。免疫電子顕微鏡の向上した感度は、交連性軸索の表面におけるＲｏｂｏタンパク質の極めて低いレベルの存在を明らかにしている。さらに、交連性軸索内部にＲｏｂｏ陽性小胞を見ることができ、おそらくＲｏｂｏの成長円錐体への輸送を表している。最後に、連続的なセクションの使用による単一の軸索の経路を再構築することにより、我々は、個々の軸索が交連から長軸方向の路に戻った後にＲｏｂｏ発現が大きくアップレギュレートされたることを確認した。非横断及び横断後の軸索でのＲｏｂｏの発現及びその成長円錐体及びその糸状仮足での高いレベルは、Ｒｏｂｏが反発的な正中線キューのための軸索誘導レセプターとして機能するというモデルを提供する。

Ｒｏｂｏのトランスジェニック発現。我々は、Ｒｏｂｏが確かに正中線忌避物質に対する成長円錐体レセプターであるならば、軸索成長の初期段階の間のＲｏｂｏタンパク質のパン−神経発現が、ｃｏｍｍ機能喪失に類似しｒｏｂｏ機能喪失とは反対のｒｏｂｏ機能増進フェノタイプを導くであろうという仮説を立てた。この仮説を試験するために、我々は、ｐＵＡＳＴベクター中のＵＡＳプロモーターの下流側に完全なＯＲＦを含むがその非翻訳領域（ＵＴＲ）は含まないｒｏｂｏｃＤＮＡをクローニングし、ＧＡＬ４系（Brand及びPerrimon, 1993）で使用するためのトランスジェニックハエを生成させた。全てのニューロンにおけるｒｏｂｏの発現は、ＵＡＳ-ｒｏｂｏハエをｅｌａｖ-ＧＡＬ４又はｓｃａｂｒｏｕｓ-ＧＡＬ４系に交配させることにより達成した。

驚くべきことに、ｒｏｂｏｍＲＮＡのパン−神経発現は、ＭＡｂ ＢＰ１０２でアッセイしたような強い軸索骨格フェノタイプを生成しなかった。抗ＦａｓＩＩ（ＭＡｂ １Ｄ４）での染色により、僅かな束状化欠失が明らかとなったが、軸索骨格全体は正常であった。我々が何故強いｒｏｂｏ異所性発現フェノタイプの観察に失敗したかについての洞察は、これらの胚を抗ＲｏｂｏＭＡｂで染色することによって与えられた。興味深いことに、Ｒｏｂｏタンパク質は、野生型より高いレベルで発現されたが、野生型のような制限、即ち、軸索の長軸方向部分での高いレベルの発現及び交連における低レベルが残されていた。この結果は、おそらく翻訳後に、Ｒｏｂｏ発現に強い調節が存在し、その長軸方向軸索セグメントへの局在化を確実にすることを示している。このような機構は、タンパク質翻訳、輸送、挿入、内部移行及び／又は安定性の調節によって制御しうる。

我々はこれらのトランスジェニックハエをｒｏｂｏ変異体の救済に用いた。ｒｏｂｏ３及びｒｏｂｏ５同型接合体におけるｅｌａｖ-ＧＡＬ４系によるｒｏｂｏの発現は、、ｐＣＣ及び他の同定されたニューロンを含むＦａｓＩＩ陽性軸索の正中線交差を救済した。

Ｒｏｂｏは細胞自律的形式で機能することが明らかとなる。Ｒｏｂｏが細胞自律的形式で機能できるかを試験するために、我々は、ｆｔｚｎｇ-ＧＡＬ４系（Lin等, 1994）を持つＵＡＳ−ｒｏｂｏ導入遺伝子を用いた。ｆｔｚｎｇ-ＧＡＬ４系は、ｐＣＣ、ｖＭＰ２、ｄＭＰ２、及びＭＰ１等のｒｏｂｏ変異体によって影響される多くの最初期ニューロンを含むＣＮＳニューロンのサブセットで発現する。ｆｔｚｎｇ-ＧＡＬ４系によるｒｏｂｏの発現は、ｒｏｂｏ変異体の頭が正中線に向かい横切るｒｏｂｏ変異体：ｐＣＣにおいてこれらの同定されたニューロンを救済するのに十分であり、それらの救済された胚は、もはや同側的に突出して正中線を横切らない。同じ胚を抗ｒｏｂｏＭＡｂ １３Ｃ９で染色した場合、我々は、全てのＲｏｂｏ陽性軸索が正中線を横切らないことを観察した。ｆｔｚｎｇ-ＧＡＬ４系は、軸索の多くのｐＣＣ経路（Lin等, 1994）、正中線長軸方向束での発現を誘導する。ｒｏｂｏ変異体において、この軸索束は正中線に自由に交差及び環化し、その対側性経路と結合する。ｆｔｚｎｇ-ＧＡＬ４系誘導ＵＡＳ−ｒｏｂｏによって救済された場合、偶発的に僅かな軸索が正中線を横切ることはあるものの、この経路はもはや正中線のそれ自身の側に大きく維持される。これらの発現は、Ｒｏｂｏが細胞自律的形式で機能できるという概念を支持する。

ラット脊髄における哺乳動物ｒｏｂｏ１の発現。幾つかの脊椎動物Ｒｏｂｏ相同体の単離は、Ｒｏｂｏが、ショウジョウバエにおけるのと同様に、脊椎動物神経系において正中線横断の調整に類似の役割を果たすことを示唆する。脊椎動物の脊髄において、腹側正中線はフロアプレートと呼ばれる細胞の独特な群を含む（概説のために、Colamarino及びTessier-Lavigne, 1995）。ショウジョウバエ神経系におけるように、脊椎動物脊髄は、横断及び非横断軸索の両方を含む。脊髄交連性ニューロンは、脊髄の背側で生まれ；交連性軸索はフロアプレートに向けてかつ横切って突出した後、頭側へ長軸方向に戻る。それに対して、２つの他の類のニューロンである背側連合ニューロン及び腹側運動ニューロンは、フロアプレートを横切らない（Altman及びBayer, 1984）。

Ｒｏｂｏがこれらの脊髄ニューロンの突出の機構において役割を果たす可能性を取り扱うために、我々は、インシトゥハイブリッド形成におけるＲＮＡによるラットｒｏｂｏ１の発現を試験した。最初の３つのＩｇドメインに渡るラットｒｏｂｏ１リボプローブを、Ｅ１３ラット脊髄の横行断面にハイブリッド形成させた。Ｅ１３において、多くの交連性軸索が既にフロアプレートを横切って伸長しているならば（Altman及びBayer, 1984）、ラットｒｏｂｏ１は、背側脊髄において、交連性ニューロンの細胞体に相当するパターンで高レベルに発現される。また、ラットｒｏｂｏ１は、発達中の運動カラムの領域において、腹側細胞の亜集団で低レベルで発現される。興味深いことに、発現パターンは、やはり交連及び運動ニューロンで発現され、ネトリン１に対するレセプターをコードする他のＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＤＣＣをコードするｍＲＮＡと類似し、部分的に重複している（Keino-Mase等, 1996）。しかしながら、ラットｒｏｂｏ１は、脊髄又は背根神経節のフロアプレート又はルーフプレートのいずれでも発現されない。これは、ルーフプレートで強く発現されるラットｃｄｏと反する（KB, MT-L及びR. Krauss）。末梢においては、ラットｒｏｂｏ１は、筋節及び発達中の肢においてもｃ−ｍｅｔを暗示するパターンで発現されることがわかり（Ebens等, 1996）、ラットｒｏｂｏ１も筋前駆細胞の泳動により発現されうる事を示している。従って、そのショウジョウバエ相同体と同様に、ラットｒｏｂｏＩ ＲＮＡは、軸索の交差及び非交差集団の両方によって発現され、それがＤ−Ｒｏｂｏ１の機能的等価物をコードすることを示している。

遺伝子ストック。８つ全てのＲｏｂｏ対立遺伝子を、Seeger等, 1993に記載されているように、ファシクリンＩＩＩについて欠失した染色体上で単離した。次いで、ＦａｓＩＩＩを含む複製物の使用及びｒｏｂｏ染色体の組み換えは、ｒｏｂｏフェノタイプの発現がＦａｓＩＩＩの不在に無関係であることを示した。欠失体は、インディアナ州ブルーミントンのショウジョウバエストックセンターから得た。

ｒｏｂｏ遺伝子のクローニング及び分子分析。ｒｏｂｏへの分子歩行の出発点は、Berkeley及びCreteショウジョウバエゲノムプロジェクトから得た。染色体歩行は、Ｔａｍｋｕｎライブラリー（Tamkun等, 1992）からのコスミドを単離するための標準的技術を用いて実施した。ｃＤＮＡは、Ｚｉｎｎ９-１２時間ショウジョウバエ胚ｇｔ１１ライブラリ（Zinn等, 1988)から、及びヒト胎児脳ライブラリ（Stratagene）から単離した。ポリ−Ａ＋ＲＮＡのノーザンブロット及び逆ノーザンブロットを、感受性チャーチ条件を用いてハイブリッド形成させた。

ｃＤＮＡ及びゲノムサブクローンの配列は、製造者のプロトコールに従ってAutoRread Kit又はAutoCycle Kit（Pharmacia）で配列（ＵＳＢ）を用いたジデオキシヌクレオチド鎖停止法により、又は３３Ｐサイクル配列により実施した。反応は、Pharmacia LKB又はABI自動化レーザー蛍光ＤＮＡ配列器で各々分析した。ｃＤＮＡは両方の鎖で完全に配列させた。配列コンティグは、Lasergene、Intelligenetics及びAssemblyLIGNソフトウェア（Kodak Eastman）を用いて編集した。データベース検索は、BLASTを用いて実施した（Altscuel等, 1990）。

全長Ｄ−ｒｏｂｏ１ｃＤＮＡは、２つの部分的ｃＤＮＡを内部ＨｐａＩ部位で結合させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．ＳＫ＋のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングすることにより生成させた。全長Ｈ−ｒｏｂｏ１ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡからのＸｂａＩ-ＳａｌＩ断片とＳａｌＩ部位でカルボキシル末端２２２アミノ酸をコードするＰＣＲ産物とを結合させることにより合成した。ＰＣＲ産物は、停止コドンに導入されたＥｃｏＲＩ部位を有する。ライゲーション生成物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．ＳＫ＋にクローニングし、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化させた。

ラットｒｏｂｏ１ｃＤＮＡをクローニングするために、Ｄ−ｒｏｂｏ１及びＨ−ｒｏｂｏ１の５’末端の間に保持された配列に対して設計された変性オリゴヌクレオチドプライマーを、Ｅ１３ラット脳ｃＤＮＡからの５００ｂｐ断片をＰＣＲで増幅するために使用した。この断片は、Ｅ１３脊髄ライブラリーを高ストリンジェント性でスクリーニングするのに用いられ、最後の７００ヌクレオチド以外の全部を含む４．２ｋｂのｃＤＮＡクローンの単離をもたらした。引き続きライブラリーをこのｃＤＮＡからの非重複プローブでスクリーニングすることにより、４つの部分的な及び７つの全長クローンの単離がもたらされた。ラットｒｏｂｏ２ｃＤＮＡをクローニングするために、我々は、同じライブラリーをＨ−ｒｏｂｏ２ｃＤＮＡの断片でスクリーニングした。

発現された配列タグ及びゲノム配列。ＥＳＴ類ｙｕ２３ｄ１１（＃Ｈ７７７３４）、ｚｒ５４ｇ１２（＃ＡＡ２３６４１４）及びｙｑ７６ｅ１２（＃Ｈ５２９３６、＃Ｈ５２９３７）は、Ｈ−ＲｏｂｏＩの一部をコードする。ＥＳＴｙｑ７ｅ１２は、ヒトグリコホリンＢ遺伝子の一部に異常にスプライシングされる。５つのＥＳＴ類、ｙｎ５０ａ０７、ｙｇ０２ｂ０６、ｙｇ１７ｂ０６、ｙｎ１３ａ０４及びｙｍ１７ｇ１１は、Ｈ−ｒｏｂｏ２の一部をコードする。ショウジョウバエＰ１クローンＤＳ００３２９はＤ−ｒｏｂｏ２のゲノム配列をコードする。配列１８２５７１０及び１８２５７１１（ともに：＃Ｕ８８１８３：位置ＺＫ３７７）は、線虫ｒｏｂｏの予測される配列をコードする。ＥＳＴｖｉ６２ｅ０２（＃ＡＡ４９９１９３）は、マウスｒｏｂｏ１をコードする。

ｒｏｂｏ対立遺伝子における分子欠失の同定。ｒｏｂｏ転写単位に影響する制限断片長多型を同定するために、ｒｏｂｏ対立遺伝子及びそれらの親の染色体のサザンブロットを、ゲノムコスミドクローン１０６−１４３５からの断片又は部分的ｃＤＮＡクローンとハイブリッド形成させた。ＤＮＡは同型接合的変異胚から得た。次いで胚の半分から得たＤＮＡに対して３５サイクルのＰＣＲを実施した。使用したＣｆｏＩ多型に隣接する領域に特異的なプライマーは、ＲＯＢＯ６（5'-GCATTGGGTCATCTGTAGAG-3'）及びｒｏｂｏ２３（5'-AGCTATCTGGAGGGAGGCAT-3'）であった。ＰＣＲ産物は、Pharmacia H300スピンカラムで精製し、直接配列させた。

ショウジョウバエの形質転換、ｒｏｂｏレスキュー、及び過剰発現。コスミド１０６−１４３５からの１６ｋｂのＸｂａＩ断片をショウジョウバエ形質転換ベクターｐＣａＳｐｅＲ３にクローニングした。形質転換体は、標準的方法により生成及びマッピングした。４つの独立した系が、ＭＡｂ１Ｄ４染色で判定してｒｏｂｏ１，３，５対立遺伝子を救済することを示した。

プライマー（5'-GAGTGGTGAATTCAACAGCACCAAAACCACAAAATGCATCCC-3'）及び（5'-CGGGGAGTCTAGAACACTTCATCCTTAGGTG-3'）を用いたＤ−ｒｏｂｏＯＲＦのＰＣＲ増幅は、ショウジョウバエコンセンサス（Cavener, 1987）により密接に一致し、２１ｂｐの５’ＵＴＲのみを有して３’ＵＴＲ配列を持たない変更されたリボソーム結合部位を持つＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）、次いでｐＵＡＳＴ（Brand及びPerrimon, 1993）にクローニングした。形質転換系は、全てのニューロンでＧＡＬ４を発現するｅｌａｖ-ＧＡＬ４及びｓｃａ-ＧＡＬ４系、又はＣＮＳニューロンのサブセットにおいて発現するｆｔｚｎｇ-ＧＡＬ４（Lin等, 1994）と交配させた。胚は、ＭＡｂ類ＢＰ１０２、１Ｄ４及び１３Ｃ９での染色により検定した。ｒｏｂｏ変異バックグラウンドにおける異所性発現については、ストックｒｏｂｏ３及びｒｏｂｏ５（ともにタンパク質無し）を用いた。交配は、ストックｗ；ｒｏｂｏ／ＣｙＯ；ＵＡＳ-ｒｏｂｏ及びｗ；ｒｏｂｏ／ＣｙＯ；ｅｌａｖ-ＧＡＬ４を利用した。バランスのとれたストックを維持するのが困難であるため、ｒｏｂｏ／＋；ｆｔｚ-ｎｇＧＡＬ４／＋雄は必要に応じて生成させた。

融合タンパク質及び抗体の生成。６つのヒスチジンタグタンパク質を、Ｄ−ｒｏｂｏタンパク質のアミノ酸４０４−７２５をｐＱＥ３１ベクター（Qiagen）のＰｓｔＩ部位にクローニングすることにより構築した。融合タンパク質は変性条件下で精製し、次いでＰＢＳに対して透析した。マウスの免疫化及びＭＡｂ生成は、標準的なプロトコールに従った（Patel, 1994）。

ＲＮＡ局在化及びタンパク質免疫細胞化学。ジゴキシゲニン標識アンチセンスｒｏｂｏ転写物は、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおけるｒｏｂｏｃＤＮＡのサブクローンから生成させた。インシトゥ組織ハイブリッド形成は、Tear等, 1996に記載されているように実施した。免疫細胞化学はPatel等, 1994に記載されているように実施した。ＭＡｂ１Ｄ４は１：５希釈で、ＢＰ１０２は１：１０で用いた。抗ｒｏｂｏ染色については、ＭＡｂ１３Ｃ９は０．１％Ｔｗｅｅｎ-２０を含むＰＢＳ中に１：１０希釈し、メタノールへの暴露を最小にするように胚を固定してクラッキングした。ｔｒｉｔｏｎの存在及びメタノール中での胚のストックは、ともにＭａＢ１３Ｃ９の活性を破壊することが見いだされた。

ラット脊髄のインシトゥハイブリッド形成は実質的に、Fan及びTessier-Lavigne, 1994に記載されたように実施した。Ｅ１３胚を４％パラホルムアルデヒドに固定し、加工し、ＯＣＴに包埋し、１０ｍに切断した。最初の３つの免疫グロブリンドメインに渡る１．０ｋｂの３５ＳアンチセンスｒＲｏｂｏリボプローブをハイブリッド形成に用いた。さらなる非重複プローブも用いて同一の結果を得た。ＤＣＣ転写物は、Keino-Masu等, 1996に記載されているように検出した。ＲＡＧ−１に対する免疫組織化学は、４Ｄ７モノクローナル抗体（Dodd等, 1988）を用いて１０ｍの脊髄横断片で行った。

電子顕微鏡。Ｃａｎｔｏｎ Ｓ胚は、手で卵子を取り出し、背側を開いて腸を除去し、既に記載されている方法（Lin等, 1994）に従って、以下の修正を加えて免疫電子顕微鏡用に調製した。固定した胚をＭＡｂ１３Ｃ９（１：１）と１−２時間、ビオチン化ヤギ抗マウス二次抗体（１：２５０）と１．５時間、次いでストレプトアビディン複合ＨＲＰ（１：２００）と１．５時間続けてインキュベートした。ＨＲＰ−ＤＡＢ反応のためにグルコースオキシダーゼではなく過酸化水素（０．０１％）を用いた。

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この明細書中で引用した全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物及び特許出願が特別にかつ独立して参考として取り入れられることが明示されているように、ここに出典明示して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にするために、例示及び実施例によって幾分詳細に記述したが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それらにある種の変更及び修正がなし得ることが容易に明らかになるであろう。

迂回（ラウンドアバウト）ゲノム配置の構成を示す図である。（Ａ）コスミド染色体歩行は、第２の染色体の５８Ｆ／５９Ａ領域を通る。用いられたコスミド内の欠陥切断点の位置は上部の２つの点で示した。歩行からの同定された転写物はコスミドの下部に示した。１２−１転写物は、ｒｏｂｏ遺伝子に相当し；転写方向は遠位から近位に向けてである。１６ｋｂ ＸｂａＩゲノムレスキュー断片の位置を下部に示した。（Ｂ）ｒｏｂｏ転写物内のイントロンの位置及び大きさ。コード配列は線の太い部分で示した。転写物は（Ａ）におけるその配向を反映するように３’−５’で示した。 Ｒｏｂｏタンパク質の構造を示す図である。ショウジョウバエＲｏｂｏタンパク質の模式図である。ｒｏｂｏ６における免疫グロブリン（Ｉｇ）、フィブロネクチン（ＦＮ）及び膜貫通（ＴＭ）ドメイン並びにアミノ酸置換の位置を示した。ショウジョウバエＲｏｂｏ１及びヒトＲｏｂｏ１の間のパーセントアミノ酸同一性を各ドメインについて示した。

Claims (9)

1. 配列番号：２又は８に示されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたＲｏｂｏポリぺプチド。
2. 配列番号：８の残基１−１２、配列番号：８の残基１８−２８、配列番号：８の残基３１−４０又は配列番号：８の残基４５−６５を含んでなる断片、又は配列番号：８で示されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたヒトＲｏｂｏポリペプチド。
3. 配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる請求項１又は２に記載の単離されたＲｏｂｏポリペプチド。
4. 配列番号：８のアミノ酸１−８９５を含んでなる、可溶化形態のＲｏｂｏポリペプチド。
5. 配列番号：２の免疫原性断片を用いて製造される、単離されたＲｏｂｏ特異的抗体。
6. ヒトＲｏｂｏポリペプチドの特異的抗体である、請求項５に記載の抗体。
7. 配列番号：８の残基１−１２、配列番号：８の残基１８−２８、配列番号：８の残基３１−４０、配列番号：８の残基４５−６５、配列番号：８の残基７８０−７９１、配列番号：８の残基８３５−８４７、配列番号：８の残基８７７−８９１、配列番号：８の残基９３０−９４２、配列番号：８の残基９８１−９９８、配列番号：８の残基１０４０−１０５１、配列番号：８の残基１０８０−１０９０、配列番号：８の残基１１５４−１１６８、配列番号：８の残基１２１５−１２３１、配列番号：８の残基１２７８−１３０２、配列番号：８の残基１３７８−１４００、配列番号：８の残基１４６０−１４６９、配列番号：８の残基１４９７−１５１９、配列番号：８の残基１６０６−１６２６及び配列番号：８の残基１６３９−１６５１の免疫原性断片を用いて製造する、単離されたＲｏｂｏ特異的抗体。
8. 請求項１ないし４の何れかに記載のポリペプチドをコードするコード鎖を含んでなる組み換え核酸であって、前記ヌクレオチドストランドが２０００塩基対以下の天然隣接領域に隣接している組み換え核酸。
9. 請求項８に記載の核酸を含んでなる細胞。

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