JP2001523458A - 神経細胞機能の調節方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞において発現した活性Ｒｏｂｏの量は、細胞と接触するＣｏｍｍポリペプチドの有効量を調節することにより変えられ、これによって、発現した活性Ｒｏｂｏの量は、細胞と接触するＣｏｍｍポリペプチドの有効量の調節により逆に調節される。特定の実施態様において、Ｃｏｍｍポリペプチドは、製薬的に許容可能な組成物として外因的に細胞に供給される。他の側面において、本発明はＲｏｂｏ-Ｃｏｍｍ相互作用を調節する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、一般的にＲｏｂｏ発現細胞、Ｃｏｍｍポリペプチド及び候補薬剤の混合物を作製し、細胞により発現したＲｏｂｏの量における薬剤の影響を測定することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願において行われた研究は、ＮＩＨ助成ＮＳ１８３６６により部分的に支
援されている。政府はこの出願に対して発行される特許に権利を有する場合があ
る。

【０００２】 (緒言)発明の分野 本発明の分野は神経細胞機能の調節方法である。

【０００３】背景 発達中の中枢神経系(ＣＮＳ)において、殆どの成長円錐は、その移動中に一又
は複数回、正中線に直面し、交差するか又は交差しないかの決定をする。この決
定は静的なものではなく、むしろ成長円錐の歴史に応じて変化する。例えば、シ
ョウジョウバエ(Drosophila)腹側の神経索において、介在ニューロンの約１０％
がそれ自身の側にのみ軸索を突出させ、ある場合には、正中線を横切らないでそ
の近傍に伸長する。介在ニューロンの他の９０％は最初に正中線を横切ってその
軸索を突出させ、ついで、方向を変えて他の側の長軸方向に突出しており、しば
しば、正中線の近傍まで伸長する。正中線を一度横切ったこれらの成長円錐は、
正中線に近接しているにもかかわらず、また多くの交連軸索がそれを横切るにも
かかわらず、決してそれを再び交差することはない。交差するか交差しないかの
決定はショウジョウバエに独特のものではなく、全ての両側性対称神経系の様々
な正中線構造に共通している。

【０００４】 どのような正中線シグナル及び成長円錐レセプターが、成長円錐が正中線を横
切るか否かを制御するのであろうか。一度横切った後、どのような機構によりこ
れらの成長円錐が再度横切ることが防止されるのであろうか。関連する問題は、
中間標的としての正中線の性質に関連する。そのように多くの成長円錐が正中線
をそのように誘因性構造であるとしていたとすると、なぜ成長円錐は迂回しない
で横切るのであろうか？なぜ成長円錐は正中線から離れるのであろうか？

【０００５】 このような系の成分をコードする遺伝子を見つけるための一つのアプローチ法
は、正中線を横切る軸索が多すぎるか又は少なすぎる軸索の変異体についてスク
リーニングすることである。このような大規模変異体スクリーニングは、ショウ
ジョウバエで既に行われ、２つの鍵となる変異体：交連無し(ｃｏｍｍ)及び迂回
(ラウンドアバウト)(ｒｏｂｏ)の同定がなされている(Seeger等, 1993; Tear等,
1993による概説)。ｃｏｍｍ変異体胚において、交連性成長円錐は、最初は正中
線方向に配向するが、ついでそれを横切らず、代わりに螺旋を巻いてそれ自身の
側に伸長する。他方、ｒｏｂｏ変異体胚は、あまりに多くの軸索が正中線を横切
る点で反対の表現型を示す；通常はそれら自身の側にしか伸長しない多くの成長
円錐がここでは正中線を横切るようで、通常は一度しか正中線を横切らない軸索
が複数回横切るようである(Seeger等,1993;本明細書)。ｃｏｍｍ及びｒｏｂｏの
二重変異体は、ｒｏｂｏ様表現型を示す。

【０００６】 ｃｏｍｍ及びｒｏｂｏは、如何にして正中線との交差性を制御しているのであ
ろうか。これらの遺伝子に関する最初の論文(Seegerら, 1993)もｃｏｍｍのクロ
ーニングに関するもの(Tearら, 1996)もこの問題を解決していない。ｃｏｍｍは
正中線細胞に表現される新規の表面タンパク質をコードする。実際、ｃｏｍｍに
ついての論文(Tearら, 1996)は、これからの研究が「Ｃｏｍｍの不可解な機能に
ある光を投じる助けとなる・・・・」であろうという希望で終わっている。

【０００７】 同時係属中の出願[Ｒｏｂｏ、ポリペプチドと核酸の新規ファミリー(A Novel
Family of Polypeptides and Nucleic Acids)、発明者：Corey S. Goodman, Tho
mas Kidd, Kevin J. Mitchell及びGuy Tear,本願と共に出願]には、ショウジョ ウバエを含む様々な種におけるｒｏｂｏのクローニング及びキャラクタリゼーシ
ョンが開示されている。ｒｏｂｏは、５の免疫グロブリン(Ig)ドメイン、３のフ
ィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、膜貫通ドメイン、及び長い細胞質ドメインを
持つ新しいクラスの誘導レセプターをコードする。Ｒｏｂｏは、ショウジョウバ
エから哺乳動物までに高度に保持されたＩｇスーパーファミリータンパク質の新
規なサブファミリーを定める。Ｒｏｂｏの外部ドメイン、特に最初の２つのＩｇ
ドメインは、ショウジョウバエからヒトまで高度に保存されているが、細胞質ド
メインは、より多岐にわたる。それにもかかわらず、細胞質ドメインは高度に保
持された３つの短いプロリンリッチのモチーフを含んでおり、このモチーフは、
ＳＨ３又はリンカーもしくはシグナル分子における他の結合ドメインに対する結
合部位を表す。

【０００８】 正中線を決して横切らない軸索においては、Ｒｏｂｏは最初からそれらの成長
円錐上に発現される；正中線を横切らない軸索の大部分に対しては、Ｒｏｂｏは
、正中線を横切った後にだけその成長円錐に高レベルで発現する。ショウジョウ
バエにおけるトランスジェニックレスキュー実験により、Ｒｏｂｏがレセプター
としての機能に一致して、細胞自律的に機能することができることが明らかにさ
れている。しかして、ショウジョウバエにおいて、Ｒｏｂｏは正中線交差性を制
御する門番役として機能するように思われる；Ｒｏｂｏが高レベルで発現する成
長円錐では、正中線を横切ることが妨げられる。哺乳動物におけるＲｏｂｏタン
パク質は軸索誘導の制御において同様な形で機能する。

【０００９】 ここでは、我々は、ＣｏｍｍがＲｏｂｏ発現をダウンレギュレートすることを
明らかにする異所性及び過剰発現の研究を開示しており、ＣｏｍｍがＲｏｂｏ媒
介正中線反発を抑制するように機能することを証明する。これらの結果から、正
中線におけるＣｏｍｍと成長円錐上のＲｏｂｏのレベルが密接に関連し合って動
的に調節され、ある成長円錐のみが正中線を横切ること、横切らない成長円錐は
正中線にとどまらないこと、そして一度横切った成長円錐は再度横切ることはな
いことが示されている。

【００１０】 (発明の概要) 本発明は、細胞に発現した活性なＲｏｂｏの量を調節する方法及び組成物を提
供する。概略の方法は、活性Ｒｏｂｏペプチドの量を発現する細胞と接触するＣ
ｏｍｍポリペプチドの有効量を調節することを含み、それによって、細胞と接触
するＣｏｍｍポリペプチドの有効量の調節により、発現した活性Ｒｏｂｏの量が
逆に調節される。例えば、Ｃｏｍｍポリペプチドの有効量が増えれば、発現した
Ｒｏｂｏの量は減少される。Ｒｏｂｏポリペプチドは、好ましくはヒト、マウス
、線虫(C. elegans)又はショウジョウバエのＲｏｂｏＩ又はＩＩ配列又はＲｏｂ
ｏ特異的活性を有するそのポリペプチドドメインであり、Ｃｏｍｍポリペプチド
はＲｏｂｏ発現を特異的に調節し、(ａ)配列番号：１４又はＲｏｂｏ発現を特異
的に調節する欠失変異体を含んでなり、及び／又は(ｂ)配列番号：１３を含んで
なる核酸、又は好ましくはストリンジェントな条件下で配列番号：１３とハイブ
リダイズする核酸によりコードされるものである。特定の実施態様では、Ｃｏｍ
ｍポリペプチドは、生理学的に許容可能な組成物として外因的に細胞に供給され
る。他の側面では、本発明はＲｏｂｏ-Ｃｏｍｍ相互作用を調節する薬剤をスク リーニングする方法を提供する。これらの方法は、概して、Ｒｏｂｏ発現細胞、
Ｃｏｍｍポリペプチド及び候補薬剤の混合物を作製し、細胞により発現したＲｏ
ｂｏの量に対する薬剤の影響を測定することを含む。

【００１１】 (本発明の詳細な説明) 主題となる方法は、ある量の活性Ｒｏｂｏペプチドを発現する細胞と接触する
Ｃｏｍｍポリペプチドの有効量を調節し、これによって、細胞と接触するＣｏｍ
ｍポリペプチドの有効量の調節により、発現した活性Ｒｏｂｏの量を逆に調節す
ることが含まれる。Ｒｏｂｏ発現は、細胞-細胞相互作用、細胞移動性、モルホ ロジー等を含む広範な細胞機能を調節することが見出されている。従って、本発
明は、Ｃｏｍｍポリペプチドと細胞を接触させることにより、Ｒｏｂｏ発現を調
節する工程を含む、標的細胞機能を調節する方法を提供する。

【００１２】 標的Ｒｏｂｏポリペプチドは、一般に標的細胞に自然に発現される。ショウジ
ョウバエ１、ショウジョウバエ２、線虫、ヒト１、ヒト２及びマウス１のＲｏｂ
ｏポリペプチドをコードする例示的な天然ｃＤＮＡの核酸配列を、各々配列番号
：１、３、５、７、９及び１１として示し、全概念的翻訳物を配列番号：２、４
、６、８、１０及び１２として示す。標的Ｒｏｂｏポリペプチドは、配列番号：
２、４、６、８、１０及び１２の少なくとも１つの機能的ドメインを含み、その
ドメインは、Ｒｏｂｏ特異的アミノ酸配列、及び結合特異性又は機能を有する。
好ましいＲｏｂｏドメインは、少なくとも８、好ましくは少なくとも１６、より
好ましくは少なくとも３２、最も好ましくは少なくとも６４のこれら配列番号の
一つの連続残基を含む。特定の実施態様では、ドメインは一又は複数のここに述
べる構造的／機能的Ｒｏｂｏ免疫グロブリン、フィブロネクチン又は細胞質モチ
ーフドメインを含む。主題となるドメインは、特に担体タンパク質と結合する場
合、Ｒｏｂｏ特異性抗原及び／又は免疫原を提供する。例えば、Ｒｏｂｏ及びヒ
トＲｏｂｏ特異的ドメインに対応するペプチドは、スカシ貝抗原(ＫＬＨ)に共有
的に結合し、抱合体はフロイント完全アジュバントに乳化される。実験用ウサギ
を従来のプロトコールに従って免疫化して出血させる。Ｒｏｂｏ特異的抗体の存
在を、配列番号：２、４、６、８、１０又は１２の固定化Ｒｏｂｏポリペプチド
を用いた固相免疫吸着アッセイによって検定する。ジェネリックなＲｏｂｏ特異
的ペプチドは、表１の整列させたＲｏｂｏポリペプチド配列における保存領域と
比較して容易に明らかになる。

【００１３】 表１．Ｒｏｂｏファミリーのメンバーの配列アラインメント：ショウジョウバエ
ｒｏｂｏ１(Ｄ１、配列番号：２)及びヒトｒｏｂｏ１(Ｈ１、配列番号：８)によ
りコードされる予想Ｒｏｂｏタンパク質の完全アミノ酸アラインメントを示す。
線虫ｒｏｂｏの細胞外ドメイン(ＣＥ、配列番号：６；Ｓａｘ-３；Zallen等, 19
97)、ショウジョウバエｒｏｂｏ２の細胞外ドメイン(Ｄ２、配列番号：４)、及 びヒトｒｏｂｏ２の部分配列(Ｈ２、配列番号：１０)の部分的配列も整列させた
。Ｄ２配列は、遺伝子発見プログラムＧｒａｉｌによって予測した。免疫グロブ
リンドメイン(Ｉｇ)、フィブロネクチンドメイン(ＦＮ)、膜貫通ドメイン(ＴＭ)
、及び保存された細胞質モチーフの位置を示した。ラットｒｏｂｏ１の細胞外ド
メインはＨ１と同一に近い。

【００１４】 例示的なこのようなＲｏｂｏ特異的免疫原性及び／又は抗原性ペプチドを表２
に示す。

【００１５】 表２．Ｒｏｂｏ特異的ウサギポリクローナル抗体を生じさせる免疫原性Ｒｏｂｏ
ポリペプチド：Ｒｏｂｏポリペプチド-ＫＬＨ複合体は以下のプロトコールで免 疫化した。 Ｒｏｂｏポリペプチド、配列 免疫原性 配列番号：２、残基６８−７７ ＋＋＋ 配列番号：２、残基７９−９４ ＋＋＋ 配列番号：２、残基９５−１０３ ＋＋＋ 配列番号：２、残基１２２−１２９ ＋＋＋ 配列番号：２、残基１６５−１７６ ＋＋＋ 配列番号：２、残基１８１−１９１ ＋＋＋ 配列番号：２、残基１９３−２０４ ＋＋＋ 配列番号：２、残基２４４−２５１ ＋＋＋ 配列番号：２、残基２７４−２９０ ＋＋＋ 配列番号：２、残基３２２−３３１ ＋＋＋ 配列番号：２、残基３３９−３４７ ＋＋＋ 配列番号：２、残基４０７−４１７ ＋＋＋ 配列番号：２、残基４４１−４５１ ＋＋＋ 配列番号：２、残基４５３−４７４ ＋＋＋ 配列番号：２、残基５０２−５１６ ＋＋＋ 配列番号：２、残基５４１−５５３ ＋＋＋ 配列番号：２、残基６１７−６２９ ＋＋＋

【００１６】 さらに、種特異的抗原性及び／又は免疫原性ペプチドは、表１では多岐にわた
る細胞外又はサイトゾル領域として直ぐに明らかである。ヒトＲｏｂｏ特異的抗
体は、非ヒトＲｏｂｏポリペプチド(配列番号：２、４、６及び１２)と非交差反
応性であるものとして特徴付けられる。そのようなヒト特異的ペプチドの例を表
３に示す。

【００１７】 表３．ヒトＲｏｂｏ特異的ウサギポリクローナル抗体を生じさせる免疫原性Ｒｏ
ｂｏポリペプチド：以下に記載のプロトコールで免疫化したＲｏｂｏポリペプチ
ド-ＫＬＨ抱合体(幾つかの抗体は、対応するマウス／ラットＲｏｂｏポリペプチ
ドとの交差反応性を示す)。Ｒｏｂｏポリペプチド、配列 免疫原性 配列番号：８、残基１−１２ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１８−２８ ＋＋＋ 配列番号：８、残基３１−４０ ＋＋＋ 配列番号：８、残基４５−６５ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１０６−１１６ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１３７−１４５ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１７４−１８４ ＋＋＋ 配列番号：８、残基２１４−２３０ ＋＋＋ 配列番号：８、残基２７４−２８６ ＋＋＋ 配列番号：８、残基３１４−３２４ ＋＋＋ 配列番号：８、残基３９９−４１２ ＋＋＋ 配列番号：８、残基４９６−５０７ ＋＋＋ 配列番号：８、残基５４８−５６５ ＋＋＋ 配列番号：８、残基５９９−６１１ ＋＋＋ 配列番号：８、残基６６０−６７１ ＋＋＋ 配列番号：８、残基７１７−７３０ ＋＋＋ 配列番号：８、残基７８０−７９１ ＋＋＋ 配列番号：８、残基８３５−８４７ ＋＋＋ 配列番号：８、残基８７７−８９１ ＋＋＋ 配列番号：８、残基９３０−９４２ ＋＋＋ 配列番号：８、残基９８１−９９８ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１０４０−１０５１ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１０８０−１０９０ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１１５４−１１６８ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１２１５−１２３１ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１２７８−１３０２ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１３７８−１４００ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１４６０−１４６９ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１４９７−１５１９ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１６０６−１６２６ ＋＋＋ 配列番号：８、残基１６３９−１６５１ ＋＋＋ 配列番号：１０、残基５−１６ ＋＋＋ 配列番号：１０、残基３８−４７ ＋＋＋ 配列番号：１０、残基８３−９４ ＋＋＋ 配列番号：１０、残基１１２−１２５ ＋＋＋ 配列番号：１０、残基１６８−１８０ ＋＋＋ 配列番号：１０、残基１９５−２０９ ＋＋＋ 配列番号：１０、残基２２２−２３５ ＋＋＋ 配列番号：１０、残基２４１−２５４ ＋＋＋

【００１８】 主題とするドメインは、Ｒｏｂｏ特異的細胞、特にニューロン変調又は阻害変
調活性、Ｒｏｂｏ-リガンド結合又は阻害結合活性といったＲｏｂｏドメイン特 異的活性又は機能を提供する。Ｒｏｂｏ特異的活性又は機能は、簡便なインビト
ロの、細胞ベースの、又はインビボのアッセイ：例えばインビトロ結合アッセイ
、細胞培養アッセイにより、動物等(例えば遺伝子療法、遺伝子導入など)におい
て決定することができる。結合標的は、天然の細胞内結合標的、Ｒｏｂｏ制御タ
ンパク質又はＲｏｂｏ活性又はその局在化を直接変調させる他の制御因子；ある
いは、抗体などの特異的免疫タンパク質といった非天然結合標的、又は以下に記
載するようなスクリーニングアッセイで同定されるもの等のＲｏｂｏ特異的試薬
であってよい。Ｒｏｂｏ結合特異性は、結合平衡定数(通常は少なくとも約１０ ^７ Ｍ^−１、好ましくは少なくとも約１０^８Ｍ^−１、より好ましくは少なくとも約
１０^９Ｍ^−１)により、主題のポリペプチドのＲｏｂｏ発現細胞における陰性変 異体として機能する能力、異種宿主(例えば齧歯類又はウサギ)におけるＲｏｂｏ
特異的抗体を生じさせる能力等によって検定することができる。

【００１９】 同様に、Ｃｏｍｍポリペプチドは、便宜上、Ｒｏｂｏ発現を特異的に調節する
Ｃｏｍｍポリペプチドから選択される。例として、適切なＣｏｍｍポリペプチド
(ａ)は配列番号：１４又はＣｏｍｍ発現を特異的に調節するそれらの欠失変異体
を含有し、及び／又は(ｂ)配列番号：１３を含有する核酸、又は好ましくは緊縮
条件下で配列番号：１３とハイブリダイズさせた核酸によりコードされるもので
ある。適切な欠失変異体は、以下に記載するＲｏｂｏダウンレギュレーションア
ッセイで容易にスクリーニングされる。好ましいＣｏｍｍドメインは、少なくと
も８、好ましくは少なくとも１６、さらに好ましくは少なくとも３２、最も好ま
しくは少なくとも６４の配列番号：１４の連続残基を含み、特に、Ｒｏｂｏに対
し、上述した担体タンパク質と結合する場合、Ｃｏｍｍ特異的抗原性及び／又は
免疫原性のようなＣｏｍｍ特異的活性をもたらす。例示的なこのようなＣｏｍｍ
特異的免疫原性及び／又は抗原性ペプチドを表４に示す。

【００２０】 表４．Ｃｏｍｍ特異的ウサギポリクローナル抗体を生じさせる免疫原性Ｃｏｍｍ
ポリペプチド：Ｃｏｍｍポリペプチド-ＫＬＨ抱合体は上述したプロトコールで 免疫化。Ｃｏｍｍポリペプチド,配列 免疫原性 配列番号：１４、残基１−１１ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基６−１７ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基１８−３４ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基３５−４４ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基４５−６３ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基６４−７３ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基７４−８９１ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基９２−１０９ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基１１０−１２６ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基１２７−１３６ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基１３７−１５１ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基１５２−１７１ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基１７２−１８５ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基１８６−１９９ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基２００−２１５ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基２１６−２３５ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基２３６−２５０ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基２５１−２６０ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基２６１−２７５ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基２７６−２８８ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基２８９−３０７ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基３０８−３１７ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基３１８−３３１ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基３３２−３４４ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基３４５−３５６ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基３５７−３７０ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基４１−１５３ ＋＋＋ 配列番号：１４、残基１１７−３２９ ＋＋＋

【００２１】 主題とするドメインは、Ｃｏｍｍ特異的細胞、特にニューロン変調又は阻害変
調活性、Ｃｏｍｍ-リガンド結合又は阻害結合活性といったＣｏｍｍドメイン特 異的活性又は機能を提供する。Ｃｏｍｍ特異的活性又は機能は、簡便なインビト
ロの、細胞ベースの、又はインビボのアッセイ：例えばインビトロ結合アッセイ
、細胞培養アッセイにより、動物等(例えば遺伝子治療、遺伝子導入など)におい
て決定することができる。結合標的は、天然の細胞内結合標的、Ｃｏｍｍ調整タ
ンパク質、又はＣｏｍｍ活性又はその位置を直接変調させる他の制御因子；ある
いは、抗体などの特異的免疫タンパク質といった非天然結合標的、又は以下に記
載するようなスクリーニングアッセイで同定されるもの等のＣｏｍｍ特異的試薬
であってよい。Ｃｏｍｍ結合特異性は、結合平衡定数(通常は少なくとも約１０ ^７ Ｍ^−１、好ましくは少なくとも約１０^８Ｍ^−１、より好ましくは少なくとも約
１０^９Ｍ^−１)により、主題のポリペプチドのＲｏｂｏ発現細胞における陰性変 異体として機能する能力、異種宿主(例えば齧歯類又はウサギ)におけるＲｏｂｏ
特異的抗体を生じさせる能力等によって検定される。

【００２２】 一実施態様において、Ｃｏｍｍポリペプチドは配列番号：１３を含んでなる核
酸、又は好ましくはストリンジェントな条件下で配列番号：１３の全長ストラン
ドとハイブリダイズさせた核酸によりコードされるものである。このような核酸
は、少なくとも３６、好ましくは少なくとも７２、さらに好ましくは少なくとも
１４４、最も好ましくは少なくとも２８８長さの塩基対である。特異的ハイブリ
ダイゼーションを実証するには、一般にストリンジェントな条件、例えば、５ｘ
ＳＳＰＥ(０．１８ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＮａＰＯ_４、ｐＨ７．７、０． ００１ＭのＥＤＴＡ)バッファー中に３０％ホルムアミドを含むバッファーで４ ２℃においてハイブリダイズさせ、４２℃において０．２ｘＳＳＰＥで洗浄した
とき(条件Ｉ)に結合させたままにすること；好ましくは、５ｘＳＳＰＥバッファ
ー中に５０％ホルムアミドを含むバッファーで４２℃においてハイブリダイズさ
せ、４２℃において０．２ｘＳＳＰＥで洗浄したとき(条件ＩＩ)に結合させたま
まにすることが必要とされる。配列番号：１３のストランドとハイブリダイズす
る例示的核酸を表５に示す。

【００２３】 表５．条件Ｉ及び／又はＩＩで、配列番号１３のストランドとハイブリダイズす
る核酸の例Ｃｏｍｍ核酸 ハイブリダイゼーション 配列番号：１３、ヌクレオチド１−４７ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド５８−９９ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド９５−１３８ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド１８１−２２０ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド２６１−２９９ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド２７４−３１５ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド３５１−３８９ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド４５０−５９３ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド５２４−５４６ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド５６１−６０８ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド６８９−７２７ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド７０８−７３７ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド７３８−８０１ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド８０５−８５４ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド８５５−９０７ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド９１０−９５３ ＋ 配列番号：１３、ヌクレオチド１００７−１０５９ ＋

【００２４】 多くのニューロン細胞、形質転換細胞、感染細胞(例えばウイルス)等を含む、
多様な細胞型が、開示された方法により調節を受けるＲｏｂｏポリペプチドを発
現する。Ｒｏｂｏ発現の確認は、抗体染色により容易になされる。従って、主題
となる方法のための適応には、軸索成長、腫瘍細胞浸潤又は遊走等を含む、多様
な細胞種及び機能が含まれる。標的細胞は、培地又はインサイツ、即ち天然宿主
内に存在していてもよい。インサイツ用途に対しては、組成物は、保定された血
液又は滑液などの生理学的液体に添加される。ＣＮＳ投与に対しては、血液脳関
門を横切る治療薬の移動を促進するために、手術又は注射による破壊、ＣＮＳ脈
管構造内皮細胞間の接着的接触を一時的に開く薬剤、及びそのような細胞を通る
転位置を容易にする組成物を含む様々な技術が利用可能である。また、Ｃｏｍｍ
ポリペプチドは、直接的な注射又は吸入、局所的、例えばエアロゾルを介した気
管内／経鼻投与、眼内、又はインプラント、例えば繊維、例えばコラーゲン内／
上、浸透ポンプ、適当に形質転換された細胞を含む移植片などに受け入れられる
。特定の投与方法は、繊維、例えばコラーゲン繊維、タンパク質ポリマーなどを
治療用ポリペプチドで被覆、包埋又は誘導体化することを含む。他の有用な方法
は、Otto等, (1989) J. Neuroscience Research, 22, 83-91及びOttoとUnsicker
(1990) J. Neuroscience, 10, 1912-1921に記載されている。一般に、投与され
る量は経験的に決定されるが、典型的には、レシピエントの体重１ｋｇ当たり約
１０から１０００μｇの範囲であり、濃度は、一般的に投与される用量１ｍｌ当
たり約５０から５００μｇの範囲である。安定化剤、殺菌剤などの他の添加剤を
含んでもよく、従来の量で含有せしめる。

【００２５】 一実施態様では、本発明は、滅菌塩水又は他の媒体、ゼラチン、油等の製薬的
に許容可能な賦形剤と組合せて主題となるＣｏｍｍポリペプチドを投与し、製薬
的に許容可能な組成物を作製することを提供するものである。組成物及び／又は
化合物は、単独で、又は任意の従来の担体、希釈液等と組合せて投与されてもよ
く、このような投与は単一又は複数回なされ得る。有用な担体には、固体、半固
体又は水及び無毒性の有機溶媒を含む液状媒体が含まれる。他の実施態様におい
て、本発明は、レシピエント宿主により主題化合物に代謝的に変換され得るプロ
ドラッグの形で主題化合物を提供することにある。ポリペプチドをベースとした
治療用の多様なプロドラッグ処方物が当該分野において知られている。組成物は
、錠剤、カプセル、トローチ、パウダー、スプレー、クリーム等を含む任意の簡
便な形態で提供される。組成物は、製薬的に許容可能な投与単位又は量で、多様
な容器に収容される。例えば、用量単位は、カプセル、ピル等を含む多様な容器
に含まれるであろう。組成物は、有利には、主題となる化合物とは異なる他の治
療用又は予防用薬剤と組合せられるか、及び／又は組合せて使用される。多くの
例では、主題となる組成物と共に投与することにより、このような薬剤の効果が
高められており、例えばGoodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Th
erapeutics、第9版、1996、McGraw-Hillを参照されたい。

【００２６】 他の側面では、本発明はＲｏｂｏ-Ｃｏｍｍ相互作用を調節する薬剤をスクリ ーニングする方法を提供する。一般的に、これらの方法は、Ｒｏｂｏ発現細胞、
Ｃｏｍｍポリペプチド及び候補薬剤の混合物を作製し、細胞により発現されるＲ
ｏｂｏの量に対する薬剤の影響を測定することを含む。該方法は、リード化合物
の化学ライブラリーの、自動化され、コスト効率が良く高スループットのスクリ
ーニングに受け入れられる。同定された試薬は、動物及びヒト試行のための製薬
工業における用途が見いだされる；例えば、医薬開発のために活性を最適化し毒
性を最小化するために、試薬を誘導体化してインビボ及びインビトロアッセイで
再スクリーニングすることができる。細胞及び動物ベースの神経誘導／反発アッ
セイは、以下の実験部分において詳細に説明する。

【００２７】 以下の実験部分及び実施例は例示のために与えられ、本発明を何ら限定するも
のではない。 (実験) 迂回(ラウンドアバウト)は、同側的軸索が正中線を横切るのを防止するために
必要である。ｒｏｂｏ変異体では、ＭＡｂＢＰ１０２と共に観察される場合、長
軸方向に結合した軸索の数の減少と一致して、交連における胚性ＣＮＳ軸索の数
の増加に至る。２つの交連は正常なものよりも密で、互いにあふれた場合は部分
的に融合し；東軸方向はよりまばらで正中線方向に、互いにより近くなるように
引き寄せられている。我々は、段階１３で成長円錐のサブセット(ａＣＣ、ｐＣ Ｃ、ｖＭＰ２、ＭＰ１、ｄＭＰ２を含む)を染色し、段階１４-１７から、ｐＣＣ
経路(ｐＣＣ成長円錐により開かれる)、ＭＰ１経路(ＭＰ１成長円錐により開か れる)及び第３の側方経路(Linら, 1994；HidalgoとBrand, 1997)を含む(中央か ら外側へ)３つの主たる縦軸方向の軸索束を染色する、１Ｄ４ ＭＡｂ(抗Ｆａｓ ＩＩ)を使用し、より詳細にＲｏｂｏ変異体表現型を分析した。過去のＭＡｂ １
Ｄ４を用いた分析(Seegerら, 1993)により、ｐＣＣ成長円錐は、通常、正中線近
傍でその自己側を前方に突出させてｐＣＣ経路を開き、ｒｏｂｏ変異体胚では正
中線を横切って突出し、正中線でその反対側にある相同体と共に繊維束を形成す
ることが示された。切り開く軸索経路--通常は正中線近傍でその自己側を長軸方
向に突出させるｐＣＣ経路--は、ｒｏｂｏ変異体胚では正中線を横切って前方又
は後方に突出する。ｐＣＣ経路は、他方の側から同じ経路と接続し、正中線を横
切って前後に旋回するとき環状パターンをしており、よって遺伝子が命名された
表現型を定める。

【００２８】 ｒｏｂｏ変異体胚で観察されるファジーな交連表現型は、正中線又はＣＮＳの
どこかでの細胞運命の変化によるものとは思われない。全ての正中線細胞が存在
し、それらの運命は、様々な異なるマーカーでアッセイしたとき正常であると思
われる(Seegerら, 1993)。全ての交連性及び長軸方向の軸索経路は、それらの正
常の位置に存在しているが、長軸方向の経路は軸索繊維束が正中線の周囲を旋回
するときに、正中線のより近くに引き寄せられ、交連が融合し、あまりに多くの
軸索が正中線と交差してファジーになる。これに対して、正中線細胞の全て又は
一部が死亡しているか適切に分化していない変異体では、長軸方向の経路は正中
線上で崩壊するか、最初から、正常なものよりも互いにさらに近接している(Kla
mbtら, 1991；Mayer及びNusslein-Volhard, 1988)。よって、ｒｏｂｏ変異体胚 で観察された欠陥は細胞運命の変化によるものではなく、むしろ軸索誘導におけ
る欠陥の結果によるものである。

【００２９】 我々は、野生型の胚と対比させて、ｒｏｂｏ変異体におけるｐＣＣ成長円錐の
挙動についてより詳細に調べた。野生型胚において、ｖＭＰ２細胞体は、正中線
の縁部に埋込まれている。ｐＣＣ成長円錐は、ｖＭＰ２細胞体の真横の点まで前
方に伸長している。ついで、ｐＣＣ成長円錐はｖＭＰ２の成長円錐の側方伸長部
と接触し、ｐＣＣが前方で少し側方がかった方向に伸長する場合は、ｖＭＰ２成
長円錐はｐＣＣの軸索周囲に巻き付き、丁度その後方に伸長する(Lieら, 1994)
。ｖＭＰ２とｐＣＣのこの密接な接着は、ｖＭＰ２及びｐＣＣを含む、ニューロ
ンのサブセットの成長円錐、及び軸索、細胞体における軸索生長の始まりから発
現される同種親和性細胞付着分子(ＣＡＭ)(Grenninglohら, 1990, 1991)、Ｆａ ｓｃｉｃｌｉｎＩＩ(ＦａｓＩＩ)により媒介される。ＦａｓＩＩ変異体胚におい
ては、ｖＭＰ２とｐＣＣは、もはや密接には結合しておらず、それらの軸索は繊
維束を形成できない(Linら, 1994)。

【００３０】 ｖＭＰ２とｐＣＣニューロンがＦａｓＩＩを発現し、それらの成長円錐及び軸
索がＦａｓＩＩ媒介性的に互いに誘引しているならば、何故ｐＣＣ成長円錐は、
最初、短い距離しか離れていないｖＭＰ２細胞体に向けてより中央に伸長するの
であろうか？答えは、ｖＭＰ２細胞体が他の正中線細胞に部分的に埋込まれてお
り、よってｖＭＰ２細胞体が推定正中線忌避物により部分的に包囲されているた
めであるようである。ｒｏｂｏ変異体胚において、ｐＣＣの最初の軌跡はｖＭＰ
２細胞体に直接配向し、そこでｖＭＰ２に付着する；ついで、ｐＣＣ成長円錐は
正中線を横切って、正中線でその反対側にあるその相同体と繊維束を形成する。

【００３１】 迂回は、交連性軸索が正中線を再度横切るのを防止するために必要である。正
中線の前後に横切る(抗ＦａｓＩＩ ＭＡｂで可視化)ｐＣＣ経路によりとられる 環状経路により、幾つかの軸索が自由に正中線を再度横切っているとの示唆が得
られる。ＦａｓＩＩは、初期の胚の比較的小さな軸索のサブセット上で発現して
おり、よって我々はｒｏｂｏ変異体におけるｐＣＣ成長円錐の正中線の異常な交
差性を観察するためにそれを使用することができるが、より時間の経過した胚に
おいて得られる発現パターンは非常に複雑であり、軸索が正中線を横切っている
ことを正確に決定することは困難である。

【００３２】 ｒｏｂｏ変異体において、軸索が正中線を自由に横切り、また再度横切ってい
ることを確認するために、我々は、ＦａｓＩＩよりも限定されたＣＮＳ軸索のサ
ブセットで発現したＣＡＭ、コネクチン(Noseら, 1992)の発現を調べた。またコ
ネクチンは、分節神経の運動軸索に発現される。我々は、Ｃ１.４２７ ＭＡｂを
使用し、コネクチン発現を追跡した(Meadowsら, 1994)。コネクチンは、前側交 連の丁度前側で、また長軸方向の路の丁度内側の正中線近傍に細胞体があるＳＰ
１ニューロンに発現される。ＳＰ１の成長円錐は、通常は正中線を横切って突出
し、その反対側の相同体の軸索と繊維束を形成する。ついで、成長円錐がその反
対側の相同体の細胞体に付着し、細胞周囲に成長し、向きを変えてｐＣＣ経路の
中央サブ小束の前方に突出するようである。

【００３３】 野生型胚と同様、ｒｏｂｏ変異体胚において、ＳＰ１の成長円錐は正中線を横
切って伸長し、軸索、そしてその反対側にある相同体の細胞体に付着し、向きを
変えて前方に突出する。しかしながら、それが次のセグメント中に前方に突出す
る場合、典型的にはそれは正中線方向に移動し、正中線の他方の側においてその
反対側の相同体の軸索に明らかに誘引して付着する。典型的に、２つのＳＰ１軸
索は次の前方セグメントの後交連の周囲で共に結合する。場合によっては、それ
らは正中線の左側、場合によっては右側で共に伸長し、正中線を自由に横切り、
また再度横切り、隣接するセグメントの両側から派生するＳＰ１軸索と繊維束を
形成する。これらの結果には、正中線の交差から軸索が同側に突出するのをさら
に防止すること、Ｒｏｂｏが正中線との再交差から反対側に軸索が突出するのを
防止するように機能することが示されている。

【００３４】 迂回は用量過敏性方法における正中線の交差性をコントロールする。軸索の非
常に小さなサブセットを標識する他の軸索用マーカーはアプテラス(apterous)プ
ロモータ(ａｐＣと称される；Lundgrenら, 1995)の制御下で発現するＴａｕ-β-
ガラクトシダーゼレポーター遺伝子である。野生型胚においてａｐＣ-ｔａｕ-ｌ
ａｃＺ導入遺伝子は、ここでＡｐニューロンと呼ばれる腹部のヘミセグメント当
りに３つの介在ニューロンを標識する。Ａｐニューロンは側方細胞体を有し、そ
れらの成長円錐は、最初は正中線方向に突出している。正中線に近づくと、つい
でこれらの成長円錐は向きを変え、正中線の縁部に沿って、それら自身側に前方
に突出し、隣接するセグメントからそれらの相同体と共に、また互いに繊維束を
形成し；野生型胚においては、それらは腹部セグメントにおいて正中線を決して
横切らない。

【００３５】 Ｒｏｂｏ変異体胚において、Ａｐ軸索は全セグメントに正中線を横切り、それ
らの反対側の相同体と結合し、多くの場合ひとつの別個の長軸方向の小束で前方
に突出している。Ａｐ小束は、通常は、単一束と同様、正中線を横切る、また複
数回再度横切る、もしくは時折、一方又は他方が突出し、独立して正中線を横切
る異なる軸索束に分離するといった、２つの性質を示す。

【００３６】 我々は、ｒｏｂｏヘテロ接合性胚において、部分的に浸透するＡｐ軸索表現型
を見出した。野生型において、各セグメントの６Ａｐ軸索のいずれも正中線を横
切らなかったが；ｒｏｂｏホモ接合性変異体においては、６Ａｐ軸索の全てが正
中線を横切った。ｒｏｂｏヘテロ接合変異体胚において、Ａｐ軸索の一つが、約
３０％のセグメントで正中線を横切っているいるのが観察され、全Ａｐ軸索の５
％の浸透度がわかった(表１)。ｒｏｂｏの５０％と交差するこの部分的な浸透は
、これらの軸索におけるｒｏｂｏ遺伝子生成物に要求される用量を示す。さらに
、ひとたび多くの軸索経路が既に開かれてたならＡｐ軸索が軸索生成により中程
まで伸長するので、これらの結果には、ｒｏｂｏがパイオニア軸索の最初の突出
を確立させるためではなく、軸索形成の間中必要とされることが示されている。

【００３７】 Ｃｏｍｍの過小発現(underexpression)によりＲｏｂｏタンパク質のレベル増 加に至る。交連無し(ｃｏｍｍ)変異体は、ｒｏｂｏに対し相補的な表現型を示し
、ほとんどの軸索は正中線を横切らない(Seegerら, 1993)。ＭＡｂ ＢＰ１０２ で可視化させた場合、軸索交連は目立っては存在していない。ある種のハイポモ
ルフィックｃｏｍｍ対立遺伝子(例えば、ｃｏｍｍ^７；Tearら, 1996)において、
交連は全く存在しないが、むしろ部分的又は高度に異常な軸索交連は少しのセグ
メント(特に胸部)に存在する。我々は、１３Ｃ９抗-ＲｏｂｏＭＡｂを使用し、 これらｃｏｍｍハイポモルフック対立遺伝子におけるＲｏｂｏタンパク質の発現
性を試験した(Kiddら, 1997)。通常、Ｒｏｂｏは交連軸索においては非常に低レ
ベルで、長軸方向の軸索においては高レベルで発現する。ｃｏｍｍ変異体胚にお
いて、長軸方向の束におけるＲｏｂｏ発現は通常よりも高率のようである。興味
深いことに、ｃｏｍｍハイポモルフック対立遺伝子において、偶発的にまばらな
交連が、通常交連で見られるよりも高く、長軸方向の束で典型的に見られるもの
により近いレベルでＲｏｂｏ発現する。この結果は、Ｃｏｍｍタンパク質が交連
軸索におけるＲｏｂｏ発現を抑制するように機能する可能性があることが第１の
ヒントとなった。先の研究では、ｃｏｍｍは正中線グリアで発現し、明らかに交
連性軸索に移動する新規の膜貫通タンパク質をコードすることが示されている(T
earら, 1996)。これらの結果において、我々は全ニューロンにおいてｃｏｍｍが
発現するとＲｏｂｏレベルが減少し、ｒｏｂｏ表現型に至るのかと考えた。

【００３８】 Ｃｏｍｍの過剰発現はｒｏｂｏ様表現型を生み出す。ｃｏｍｍの発現が増加す
るとｒｏｂｏ様表現型に至るという仮説を調べるために、我々は、ＵＡＳ-ＧＡ Ｌ４系(Brand及びPerrimon, 1993)を使用し、ｃｏｍｍ発現のパターンを変化さ せた。我々は、ＵＡＳ-ｃｏｍｍトランスジェニック系を生成させ、ｓｃａ-ＧＡ
Ｌ４系を使用し、パン-神経的に発現させた。ドライバー及びエフェクターの導 入遺伝子の両方のコピーを担持するハエが生存しているため、我々は、親として
それらを使用しそれらの子孫を調べた。連続範囲のｒｏｂｏ様表現型が、ＭＡｂ
ｓ ＢＰ１０２及び１Ｄ４で観察された。表現型の範囲は、双方の導入遺伝子の 二つのコピーを担持する胚における重症度が各々の一つのコピーのみを担持する
胚と比較して増加するので、ｃｏｍｍ機能獲得表現型が用量感受性であることが
明らかになった。

【００３９】 外面的には、ｒｏｂｏ表現型は、ファジーな交連における結果の両方が、正中
線グリアの細胞死又は不適切な遊走に起因する変異体により模倣され得る(Klamb
tら, 1991)。しかしながら、このような表現型は軸索生成の中程まで見えず、初
期の軸索の挙動を調べることにより容易に検出される。加えて、我々は、正中線
グリアにより特異的に発現されるタンパク質、８Ｈ１１に対して産生されたＭＡ
ｂにより胚を染色し、正中線グリアがまだ存在していることを確認した。

【００４０】 ｃｏｍｍが異所的に発現している胚において、ＦａｓＩＩ陽性軸索、例えばｐ
ＣＣは、それらがｒｏｂｏ変異体で挙動するのと同様に機能することが見出され
た。Ｃｏｍｍが過剰発現する場合、ｐＣＣ成長円錐はｖＭＰ２細胞体方向に伸長
し、ついで、ｒｏｂｏ変異体でなされるのと同様に正中線を横切る。ｃｏｍｍ機
能獲得において、ｐＣＣ小束は正中線を自由に横切り、同様の環状対を形成する
か、ｒｏｂｏ機能喪失においてなされるのと同様に旋回する。

【００４１】 Ｃｏｍｍの過剰発現により、Ｒｏｂｏタンパク質のレベル低減に至る。ｃｏｍ
ｍの過剰発現により、真正Ｒｏｂｏ様軸索誘導の表現型が生じることを立証され
たので、次に我々は、抗Ｒｏｂｏ ＭＡｂ１３Ｃ９を使用し、これらの胚におけ るＲｏｂｏ発現を調べた。ｓｃａ-ＧＡＬ４ドライバーが、軸索生長(〜段階９) が始まる前に神経上皮における発現を推進し始め、段階１３によりスイッチが切
られる；ｓｃａ-ＧＡＬ４は表皮では発現しない。野生型胚において、Ｒｏｂｏ タンパク質の発現パターンは神経上皮、さらにいくつかの側方表皮片で始まるが
、正中線領域からははっきりとは不在である。ｃｏｍｍ機能獲得胚において、神
経上皮におけるＲｏｂｏ発現はかなり低減するか、発現しないが、一方神経系外
の表皮発現は維持されている。およそ第１の成長円錐が伸長しているときに、こ
の同様のパターンを観察することができる。野生型胚において、段階１２と１３
の間、正中線でＲｏｂｏは見出されないが、Ｒｏｂｏ発現は、同側的に突出して
いる成長円錐、例えばｐＣＣにおいては高レベルで、神経上皮中ではかなりのレ
ベルで存在している。これに対して、ｃｏｍｍ機能獲得胚においては、ｐＣＣ成
長円錐はＲｏｂｏタンパク質が欠乏しており、神経上皮で発現するＲｏｂｏのレ
ベルはかなり減少する。

【００４２】 ｓｃａ-ＧＡＬ４ドライバーの発現が終わるのと一致して、Ｒｏｂｏレベルの 劇的な減少が段階１４まで観察される。ｓｃａ-ＧＡＬ４；ＵＡＳ-ｒｏｂｏ胚に
おいて、Ｒｏｂｏタンパク質は段階１４後にＣＮＳ中に蓄積され始め、段階１６
までにかなりのレベルに達する(しかし、なお野生型以下)。興味あることに、こ
れらのトランスジェニック胚において、我々は、以後の段階の交連でいくつかの
Ｒｏｂｏ陽性軸索を観察しているが、Ｒｏｂｏ発現は長軸方向の束でより高く残
存している。我々は、交連におけるＲｏｂｏ陽性軸索を、間違ったパイオニア軸
索に導くより後の軸索と解釈している；先駆物質との繊維束形成により、これら
のＲｏｂｏ陽性軸索は、Ｒｏｂｏの控えめなレベルにかかわらず、正中線を横切
ることができる。

【００４３】 またｅｌａｖ-ＧＡＬ４系は、分裂終了ニューロンのみならず、パン神経的に 発現し；段階１２の間にＵＡＳ導入遺伝子の発現の推進が始まり、胚形成の残り
の間中、発現が保持される。ｅｌａｖ-ＧＡＬ４によるＣｏｍｍの異所性発現で は、ｒｏｂｏ表現型の深刻でないバージョンに至る。我々はこれを、Ｃｏｍｍ発
現が全体的に弱いレベルであるか、又はＣｏｍｍの増加がパイオニアが既に当初
の経路で確立された後に始まるためであると解釈している。さらに、ｓｃａ-Ｇ ＡＬ４が正常なｃｏｍｍ発現のソースである正中線グリアにおける発現を推進す
る一方、ｅｌａｖ-ＧＡＬ４は正中線グリアにおいて発現を推進しないため、ｅ ｌａｖ導入遺伝子のあまり深刻ではない表現型が、正中線のｃｏｍｍ発現の不足
によるものである可能性が存在する。

【００４４】 この問題を検討するために、我々は、交連の形成期間中に、全てが正中線で発
現し、ｓｉｍ-ＧＡＬ４、ｓｌｉｔ-ＧＡＬ４、Ｆ６３-ＧＡＬ４及びｐ５２Ａ-Ｇ
ＡＬ４を含む複数のＧＡＬ４系を使用し、正中線で特異的にＣｏｍｍレベルを増
加させる試みを行った。ＵＡＳ-ｃｏｍｍがこれら４つの系のどれででも発現し たとき、非常に弱いＢＰ１０２表現型のみが観察された。但し、これら挿入物の
多くがホモ接合性致死遺伝子であるため、我々はこれらの系で用量をｓｃａ-Ｇ ＡＬ４系での場合に匹敵するレベルに増加させることができなかった。これらの
機能増進表現型のいずれも、ｓｃａ-ＧＡＬ４系で観察されたもの程には強くな かった。また、我々は、異なるＧＡＬ４系を使用する、機能獲得表現型の強さに
おけるこれらの差異は、タイミング、発現レベル、又はＣＮＳ内における発現位
置の差異を反映しないことを除外することはできなかった。

【００４５】 我々は、ｃｏｍｍの正常な機能が交連性軸索に存在するＲｏｂｏ発現を低レベ
ルにダウンレギュレートし、よって、それらは正中線を横切ることができると結
論付けた。ＣＮＳにおけるＣｏｍｍのレベルが増加すると、より厳密なｒｏｂｏ
様表現型に至り、用量感受性を示す。また、用量に対するこの感受性は、ｒｏｂ
ｏヘテロ接合体におけるＡＰ軸索の挙動に現れ、よってＲｏｂｏの減少又はＣｏ
ｍｍの増加により平行な用量感受性を示す。

【００４６】 これらの結果には、Ｒｏｂｏ発現の制御は、転写から翻訳、翻訳後まで、複雑
かつ高度に調節されることが示されている。我々は、Ｃｏｍｍ発現とＲｏｂｏ発
現の間には、逆比例的関係があることを示している。野生型胚において、Ｃｏｍ
ｍは正中線で発現し、Ｒｏｂｏ発現は正中線を横切る交連性軸索において非常に
低い。ｃｏｍｍハイポモルフック変異体胚において、正中線を横切る数少ない軸
索は高レベルのＲｏｂｏタンパク質を発現する。ｃｏｍｍ機能獲得胚において( ｃｏｍｍの過剰及び異所性発現を推進するトランスジェニック構造体を使用)、 Ｒｏｂｏの全レベルは、Ｃｏｍｍ発現の増加とＲｏｂｏ発現の減少が一致する箇
所で劇的に減少する。さらに、一過性ｃｏｍｍ発現を推進するある種のＧＡＬ４
系を使用して、Ｃｏｍｍが一度、時間の経過した胚で消失すると、Ｒｏｂｏタン
パク質発現がその正常なレベルまで増加し始めることを観察した。よって、Ｃｏ
ｍｍは、非常にタイトな形でＲｏｂｏ発現をダウンレギュレートする。

【００４７】 ほんの少量のＣｏｍｍが正中線で正常に発現される。また正中線では、Ｒｏｂ
ｏレセプターに対するリガンドである推定忌避物が高レベルで発現される。高レ
ベルのＲｏｂｏを発現する成長円錐、例えば一度正中線と交差している交連成長
円錐、又は最初から同側的に突出している成長円錐は、通常低レベルの正中線Ｃ
ｏｍｍによる有意なダウンレギュレーションに比較的免疫性があり、よって正中
線との交差が防止される。異常に高レベルのＣｏｍｍのみ(過剰発現したトラン ス遺伝子を使用)は、これらの成長円錐が正中線を横切ることができるレベルま で、十分にこのＲｏｂｏ発現をダウンレギュレートする。これに対し、通常より
低レベルのＲｏｂｏが発現する成長円錐(すなわち、Ｃｏｍｍの存在下で正中線 を横切る交連性成長円錐)はＣｏｍｍに対して高度に感受性で、Ｃｏｍｍが通常 の低レベルであると、Ｒｏｂｏのレベルをさらに低減することができ、よってそ
れらを正中線と交差させることができる。Ｃｏｍｍが不在であると、成長円錐全
てが自由に横切るｒｏｂｏ；ｃｏｍｍ二重変異体において、Ｒｏｂｏのレベルが
低いため、これらの成長円錐は正中線を横切ることができない。

【００４８】 遺伝子ストック。全てのｒｏｂｏ対立遺伝子を、Seeger等, 1993に記載されて
いるように、ファシクリンＩＩＩについて欠失した染色体上で単離した。ｒｏｂ
ｏ表現型の発現がＦａｓＩＩＩの不在に無関係である。

【００４９】 タンパク質免疫細胞化学。免疫細胞化学はPatel(1994)に記載されているよう にして実施した。抗ｒｏｂｏ染色に対しては、ＭＡｂ １３Ｃ９は０．１％Ｔｗ ｅｅｎ-２０を含むＰＢＳ中に１：１０で希釈し、メタノールへの暴露を最小に するように胚を固定してクラッキングした。トリトンの存在及びメタノール中で
の胚のストックは、共にＭＡｂ１３Ｃ９の活性を破壊することが見いだされた。
ＭＡｂ Ｃ１．４２７を用いた抗コネクチン染色については、胚を３．７％ホル ムアルデヒド／ＰＥＭバッファー(１００ｍＭのＰＩＰＥＳ、２ｍＭのＥＧＴＡ 、１ｍＭのＭｇＳＯ_４)に固定し；Ｃ１．４２７を０．１％のＴｒｉｔｏｎを含 むＰＢＳ中に１：１０希釈した。ａｐｔｅｒｏｕｓ-ｔａｕ-ｌａｃＺ胚は、手で
失活させ、ポリ-リジン被覆スライド上で切開し、続いて３．７％ホルムアルデ ヒドで２０分間固定し；ウサギ抗βガラクトシダーゼ(Ｃａｐｐｅｌ１)を１：１
００００で使用し、ビオチニル化抗ウサギ二次物を１：１０００で使用し、Vect
astain Elite ABCキット(ベクター研究所)で高めた。

【００５０】 ショウジョウバエの形質転換、ｒｏｂｏレスキュー及び過剰発現。ｃｏｍｍの
ｃＤＮＡを、ｐＵＡＳＴのＸｈｏＩ及びＸｂａ部位に、１．７ｋｂのＸｈｏＩ- ＸｂａＩフラグメントとして挿入した(Brand及びPerrimon, 1993)。形質転換体 は、標準的方法により生成及びマッピングした。

【００５１】 参考文献 Brand, A. H.,及びPerrimon, N. (1993) Development 118, 401-415. Hidalgo, A.,及びBrand, A. H.,(1997) Development 124, 3253-3262. Kidd, T., Brose, K., Mitchell, K., Fetter, R., Tessier-Lavigne, M., Good
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る。Cell, 審査中。 Klambt, C., Jacobs, J.R.,及びGoodman, C.S.(1991) Cell 64, 801-815. Lundgren, S.E.,ら(1995) Development 121, 1769-1773. Mayer, U.及びNusslein-Volhard, C.(1988) Genes Dev. 2, 1496-1511. Meadows, L.A.,ら(1994) J. Cell Sci. 107, 321-328. Nose, A., Mahajan, V.B.,及びGoodman, C.S.(1992) Cell 70, 553-567. Patel, N.H. (1994) 「細胞生物学における方法、第44巻、ショウジョウバエメ ラノガスター：細胞生物学における実際的用途」(L.S.B. Goldstein及びE. Fyrb
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究所用マニュアル(Cold Spring Harbor, New York；Cold Spring Harbor Labora
tory). Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D.,及びGoodman C.S. (1993) Neuron 10
, 409-426. Tear, G.,ら(1996) Neuron 16, 501-514.

【００５２】 この明細書中で引用した全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物及び特許
出願が特別にかつ独立して参考として取り入れられることが明示されているよう
に、ここに出典を明示して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にするために
、例示及び実施例によって幾分詳細に記述したが、当業者には、本発明の教示に
照らして、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それ
らにある種の変更及び修正がなし得ることが容易に明らかになるであろう。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 キッド，トーマス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720， バークレー，ライフ サイエンシス アデ ィション ＃519，ユニバーシティ オブ カリフォルニア，バークレー (72)発明者 ティアー，ガイ イギリス国 ロンドン エスダブル７ ２ エーゼット，エクシビション ロード，デ パートメント オブ バイオケミストリ ー，インペリアル カレッジ (72)発明者 ラッセル，クレア イギリス国 ロンドン エスダブル７ ２ エーゼット，エクシビション ロード，デ パートメント オブ バイオケミストリ ー，インペリアル カレッジ (72)発明者 ミッシェル，ケヴィン，ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720， バークレー，ライフ サイエンシス アデ ィション ＃519，ユニバーシティ オブ カリフォルニア，バークレー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 EA04 GA11 HA01 4H045 AA10 BA10 CA45 DA01 DA21 EA21 FA74

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞において発現した活性Ｒｏｂｏの量を調節する方法にお いて、細胞と接触するＣｏｍｍポリペプチドの有効量を調節し、それによって、
   発現した活性Ｒｏｂｏの量を、細胞と接触するＣｏｍｍポリペプチドの有効量の
   調節により逆に特異的に調節する工程を含んでなる方法。
2. 【請求項２】 Ｃｏｍｍポリペプチドの有効量を増加させ、発現したＲｏｂ
   ｏの量を減少させる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 Ｃｏｍｍポリペプチドを、製薬的に許容可能な組成物として
   外因的に細胞に供給する請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 細胞、Ｃｏｍｍポリペプチド及び候補薬剤の混合物を作製し
   、発現したＲｏｂｏの量に対する薬剤の効果を測定する工程をさらに含む請求項
   １に記載の方法。