JPH07506005A

JPH07506005A - 改変型毛様体神経栄養因子

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Publication number: JPH07506005A
Application number: JP6510157A
Authority: JP
Inventors: パナヨテイトス，ニコス
Original assignee: リジエネロン・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレーテツド
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 1995-07-06
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: JP2702811B2; ATE151460T1; WO1994009134A2; US20030092129A1; ES2099981T3; HK1007767A1; EP0666912B1; DE69309702T2; AU667996B2; CA2132954A1; US6440702B1; IL107213A0; ZA937482B; GR3024039T3; AU5326094A; US5846935A; WO1994009134A3; DE69309702D1; CA2132954C; US20030220484A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、神経系又は他の疾患若しくは障害の治療に有用な治療用ＣＮＴＦ関連ポリペプチドに関する。

毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　；ＣＮＴＦ）は、ヒョコ胚毛様体神経節ニューロンのｉｎ　ｖｉｔ印生存に必要とされるタンパク質である（　Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、１９８０、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　３４　：　６９−７５）。毛様体神経節は、解剖学的には眼窩空洞内の視神経の側直筋と鞘の間に横たわって位置しており、毛様体筋と瞳孔括約筋の神経支配を司る動眼神経から副交感神経繊維を受け取っている。

過去１０年の間に、毛様体神経節ニューロンの生存を支持する能力に加えて、多くの生物学的効果がＣＮＴＦに帰せられてきた。ＣＮＴＦは、周産期のラットの視神経及び脳内の両能性グリア祖先細胞の分化を誘導すると考えられている（　Ｈｕｇｈｅｓら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ　３３５　：　７Ｏ−７３）　、さらにＣＮＴＦは、ヒョコ胚背根神経節感覚ニューロンの生存を促進することが確認されている（　５ｋａｐｅｒ及びＶａｒｏｎ、　１９８６゜−ロン、海馬ニューロン及び前交感神経を髄ニューロンの生存及び分化を支持する［５ｅｎｄｔｎｅｒら、　１９９０．　Ｎａｔｕｒｅ　３４５：　４４０−４４１　；　Ｉｐら、１９９１．　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１１　：　３１２４−３１３４ＨＢｌｏｔｔｎｅｒら、１９８９．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、１０５　：　３１６− ３２０］。

最近になって、Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　５７：　１００３−１０１２及び１９９１年４月４日に公開された国際公開第ｗ。

９１１０４３１６号（これらの内容の全体を本明細書に参考として組み入れるものとする）に記載されているように、ＣＮＴＦは、細菌性発現系でクローン化且つ合成された。

ＣＮＴＦ受容体（ｒＣＮＴＦＲα」と称される）がクローン化され、配列決定され且つ発現された［　Ｄａｖｉｓら、（１９９１）　５ｃｉｅｎｃｅ　２５３　：　５９−６３参照］。ＣＮＴＦ及び白血病阻害因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）として知られているＣＮＴＦ及び造血性因子は、ＩＬ−６シグナル変換成分ｇｐ１３０並びに第２のβ成分（ＬＩＦＲβとして知られている）が関わる共有するシグナル伝達経路を介して神経細胞上で作用する。

従って、ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦ受容体複合体は、ＬＩＦ反応性細胞、又はｇｐ１３０及びＬＩＦＲβ成分を保有する他の細胞でシグナル変換を開始させることが可能である［Ｉｐら、　（１９９２）　Ｃｅ１ｌ　６９　：　１１２１−１１３２コ　。

ヒトＣＮＴＦに加えて、対応するラット（ＳＯｃｋｌｉら、　１９８９、　Ｎａｔｕｒｅ　３４２　：　９２０−９２３）及びウサギ（Ｌｉｎら、　１９８９．　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５　：　８９４２−８９４７）の遺伝子がクローン化され、２００個のアミノ酸からなるタンパク質をコードし、その配列中の約８０％はヒトの遺伝子と相同であることが判明している。ヒト及びラットの組換えタンパク質が極めて高いレベル（全タンパク質の７０％に及ぶ）で発現され、はぼ均質になるまで精製された。

ヒト及びラットの組換えＣＮＴＦは、それらの構造的、機能的類似性にも拘らず、いくつかの点で異なっている。

培養中のヒョコ胚毛様体ニューロンの生存及び該ニューロンからの神経突起の自然成長を支持するラットの組換えＣＮＴＦの生物学的活性は、ヒトの組換えＣＮＴＦの４倍も優れている［Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、　（１９９１）、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　５７：　１００３−１０１２コ。さらに、ラットＣＮＴＦはヒトＣＮＴＦよりヒトＣＮＴＦ受容体に対する親和性が高１い。

同サイズのヒトＣＮＴＦとラットＣＮＴＦの物性における驚くべき差異は、ＳＤＳゲル上でのそれらの異なる移動度にある。この挙動の差異は、二つの分子の一方に変性状態においても変わらない非一般的な構造特性が存在することを示している（　Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、　１９９１．同上）。

組換えタンパク質の機能性ドメインの構造組織を明らかにするために、遺伝子工学による突然変異誘発が多用されている。欠失又は置換突然変異誘発を行うためのいくつかの異なる方法が文献に記載されている。その中で最も成功したのは、アラニンスキャニング突然変異誘発［Ｃｕｎｎｉｇｈａｍ及びＹｅｌｌｓ　（１９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：　１０８１−１０８５１及び相同スキャニング突然変異誘発［Ｃｕｎｎｉｇｈａｍら、　（１９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：　１３３０−１３３６１であると思われる。これらの方法は、成長ホルモンの受容体結合ドメインの同定及びそれらの同族受容体への変化した結合特性を有するハイブリッドタンパク質の生成に役立った。

発明の要旨本発明の目的は、運動ニューロン疾患及び筋肉変性疾患を含むがそれらには限定されない疾患又は障害の治療用の新規なＣＮＴＦ関連神経栄養因子を提供することである。

本発明の他の目的は、改良された治療特性を有する、本明細書に特定的に記載されているもの以外のＣＮＴＦ関連因子を同定する方法を提供することである。

上記及びその他の目的は本発明により達成され、該方法において、ヒトＣＮＴＦタンパク質のアミノ酸を置換すると、該タンパク質の治療特性が向上する。一つの実施態様において、電気泳動移動度の変化を、潜在的有用性を有する改変ＣＮＴＦタンパク質の初期スクリーニングに用いる。

好ましい実施態様において、ヒトＣＮＴＦの６３位のアミノ酸グルタミンをアルギニン又は別のアミノ酸と置換すれる。

図面の簡単な説明図１１種々のＣＮＴＦタンパク質の配列。Ａ、ヒト（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、（配列番号）１）、ラット（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、２）　、ウサギ（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、３）　、？つ７．（ＳＥＱ、１０．Ｎｏ、４）及びニワトリ（ｓＥＱ。

ＩＤ、Ｎｏ、５）　（Ｌｅｕｎｇら、１９９２．　Ｎｅｕｒｏｎ　８　：　１０４５−１０５３）の配列。点（ｄｏｔｓ）は、ヒトの配列中に認められた残基を示す。パネルＢ、ヒトＣＮＴＦアミノ酸残基（点）及びラットＣＮＴＦ　（示されている残基）を示す改変ＣＮＴＦ分子（１８６［ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、６］　、１８７　［ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、７］　、１８８　［ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ。

８］　、１８９　［ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、９１　．１９２　［ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１０］　、２１８　［ＳＥＱ、ＩＤ、ＮＯ。

１１］　、２１９　［ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１２１　．２２２［ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１３］　、２２３　［ＳＥＱ、ＩＤ。

Ｎｏ、１４］及び２２８　［ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１５１゜各配列に対応する精製された組換えタンパク質の名称が左側に示されている。

図２．還元５ＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル上のヒト、ラット及びいくつかの改変ＣＮＴＦ分子の移動度。精製組換えタンパク質を指示されているようにロードした。

指示ＭＷママ−−をレーンＭ上にロードした。

図３．２種の改変ＣＮＴＦ分子の生物学的活性。Ａ、ヒトＣＮＴＦ　（黒のダイヤ形）、ラットＣＮＴＦ　（白の四角）及びＲＰＮ２１９　（黒の四角）。Ｂ、ヒトＣＮＴＦ　（黒のダイヤ形）、ラッ１−ＣＮＴＦ（白の四角）及びＲＰＮ２２８（黒の四角）。２ｎｇ／ｍｌのラットＣＮＴＦの存在下に生存するニューロンの数の百分率で表わされた、タンパク質の指示濃度で生存する解離型Ｅ８ヒョコ毛様体ニューロンの用量応答。各実験点は３回の測定の平均を表わす。

図４　、（Ａ　）　Ｓ　ＣＧ　ニューロン及び（Ｂ）　ＭＧ　８７／ｈｕＣＮＴＦＲ線維芽細胞に対する競合リガンド結合。３回の測定の平均から得られた標準偏差が垂直バーで示されている。

発明の詳細な説明本発明はヒト又は動物の神経学的疾患又は障害の治療法に関する。該方法は、部分的には、組換えラットＣＮＴＦが組換えヒトＣＮＴＦより、より効率的にヒトＣＮＴＦ受容体に結合するという最初の発見、及びそれに続く、ヒトＣＮＴＦをラットＣＮＴＦにより近似させるアミノ酸置換によって、ヒトＣＮＴＦ受容体に対する改変ＣＮＴＦの結合が強化され、その結果、生物学的活性が向上するという発見に基づいている。

好ましい実施態様において、ヒトＣＮＴＦタンパク質中の単一のアミノ酸を変えることにより、毛様体神経節ニューロンの生存及び自然成長を促すタンパク質の能力が著しく向上する。

ヒト及びラットの組換えＣＮＴＦは、同数のアミノ酸（１９９）及び類似の分子量（Ｎ末端メチオニンの除去後、それぞれＭＷ２２，７９８及び２２，７２１）を有している。しかし、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では、組換えヒトＣＮＴＦがＭＷ＝２７，５００を有するタンパク質として移動するが、ラットＣＮＴＦは予想移動度で移動する。

その上、ヒトＣＮＴＦは、ヒヨコ毛様体神経節（ＣＧ）ニューロンに対する生物学的活性がラットＣＮＴＦの４分の１しかなく、且つヒトタンパク質は、細胞表面上のヒト又はラット受容体への結合競争力がラットＣＮＴＦに比べてかなり劣る。

上記の観察から、これらの差異の原因となるＣＮＴＦ分子上の領域の同定に努力が向けられることになった。この方法は、遺伝子工学法により、ヒトＣＮＴＦ配列の一部を対応ラットＣＮＴＦ配列と交換したり、その逆を行ったりすることを含む。これを達成するには、２種のＣＮＴＦ遺伝子に共通であり且つそれらの対応発現ベクター内で非反復性である制限部位を利用すると有利であった。そのような部位は、必要に応じて２種の遺伝子のどちらか一方の同一のタンパク質配列をコードする領域で遺伝子工学的に処理された。この方法により、図１に示す改変型タンパク質の各々についての発現ベクターを得た。個々のタンパク質を６０％以上の純度で単離した後、それらの特性をヒト及びラットのＣＮＴＦと比較した。

ヒトＣＮＴＦ及びラットＣＮＴＦの電気泳動移動度は著しく異なるので、各アミノ酸置換の効果は、先ずタンパク質の移動度におけるそのような変化の効果を測定することにより監視された。本明細書に記載されているように、電気泳動移動度データは、ラットＣＮＴＦと同一の位置に移動したヒト改変型ＣＮＴＦ分子の全てが単一のアミノ酸置換ＧＩｎ６３−Ａｒｇ　（Ｇ６３−”Ｒ）を有していることを示した。

引き続き、ラットＣＮＴＦ分子の電気泳動移動度に近い電気泳動移動度を示した改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質をその生物学的活性及び受容体結合について調べた。

ＣＮＴＦは、Ｅ８ヒョコ胚の解離型毛様体ニューロンの生存を支持する能力を特徴としている。この基準によると、精製された組換えラットＣＮＴＦはラットの天然タンパク質と同様な活性を有しているが、組換えヒトＣＮＴＦの４倍も活性が高い［Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、　（１９９１）、同上］。同一の検定法を上記のように作製した変性分子の生物学的活性の定量に用いた。本明細書に記載のように、Ｇ６３→Ｒ置換を有する改変型ＣＮＴＦ分子は全て、親であるヒトＣＮＴＦタンパク質に比べて高い毛様体神経節ニューロン生存支持能力を示した。

こうした結果から、電気泳動移動度の変化と生物学的特性の向上との間に強力な相関関係があることが示された。

ヒトＣＮＴＦに加えられた改変の生物学的効果の測定に加えて、分子のＣＮＴＦ受容体への結合能力に対する各改変の効果を測定することにより、分子の各々の潜在的生物学的活性についても示唆を得ることが可能である。

一つの実施態様において、ラットの上位頚部神経節ニューロン（ＳＣＧ）への結合についてラットＣＮＴＦと競合する改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質の能力を測定する。本明細書に記載のように、ヒトＣＮＴＦは、これらの細胞から１２Ｊ標識ラットＣＮＴＦ結合を置換する能力が非標識ラットＣＮＴＦの約９０分の１しかない。しかし本明細書に記載されている改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質のいくつかは、ラットタンパク質を置換する能力がヒトＣＮＴＦより高い。そのような競合結合能力が増進した本明細書に記載の分子は全て電気泳動移動度が変えられた、ラットＣＮＴＦと同じ様に移動することを示す分子であった。

別の実施態様において、Ｍ０８７線維芽細胞のような細胞は遺伝子工学処理を受けてヒトＣＮＴＦ受容体α成分を発現するが、そのような細胞は改変型タンパク質のヒト受容体への結合能力の検定に用いられる。ヒトＣＮＴＦは、ヒトＣＮＴＦ受容体に結合するための１２Ｊ標識ラツトＣＮＴＦとの競合において、ラットＣＮＴＦの約１２分の１の能力しかない。ヒトＣＮＴＦよりむしろラットＣＮＴＦに近似した電気泳動移動度を有するもの全てを含む本明細書に記載の改変型ヒトＣＮＴＦ分子のいくつかは、ヒトＣＮＴＦ受容体を発現する細胞への１２５ＩラツトＣＮＴＦとの結合競合において、ヒトＣＮＴＦより強力である。

別の実施態様において、網膜光受容体の変性を防止する特定の成長因子及び他の因子の能力を示すのに明白な効用を有する動物モデルを、本発明の改変型ＣＮＴＦ分子の治療特性の評価に用いることが可能である。実施例４に記載のように、ｈＣＮＴＦ　（Ｇ１ｎ６３−Ａｒｇ）は、網膜変性についての光誘導損傷モデルの光受容体の変性を防止する能力が組換えヒトＣＮＴＦの１０倍も高い。

このように、本発明によりヒトＣＮＴＦタンパク質の特定のアミノ酸を置換した結果、ヒトＣＮＴＦ受容体に結合する能力が高められ、従って、治療特性も向上したと期待される改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質が得られる。

本発明の実施に有用な改変型ＣＮＴＦ分子は、クローニング及び原核又は真核生物発現系における発現によって調製可能である。組換え神経栄養遺伝子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　ｇｅｎｅ）は、任意の多数の方法を用いて発現及び精製してよい。

この神経栄養因子をコードする遺伝子は、例えば、ｐＣＰｌｌｏ（但し、ｐｃＰｌｌｏには限定されない）のような細菌発現ベクターにサブクローン化し得る。

次いで、安定且つ生物学的に活性なタンパク質の形成を可能にする任意の技術によって組換え因子を精製してもよい。例えば、組換え因子を可溶性タンパク質又は封入体として細胞から回収してもよく、その結果、タンパク質又は封入体から因子を８Ｍ塩酸グアニジン及び透析によって定量的に抽出することが可能であるが、この方法に限定されることはない。因子をさらに精製するには、慣用のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー又はゲル濾過を用いてもよい。

本発明により、ＣＮＴＦ／Ｉ　Ｌ−６／Ｌ　Ｉ　Ｆ受容体ファミリーの受容体を発現する細胞、又は、例えば、Ｄａｖｉｓら。

（１９９２）　Ｃｅ１ｌ　６９　：　１１２１−１１３２に記載されているような適切なシグナル変換成分を発現する任意の細胞を含む、ＣＮＴＦに反応する細胞の功杉工印又はｉｎ　ｖｉｖｏでの分化、増殖又は生存の促進のために、本明細書に記載のように調製された改変型ＣＮＴＦ分子又はそのハイブリッド若しくは突然変異体を用いることが可能である。あるいは、突然変異体又はハイブリッドは細胞の分化又は生存に拮抗し得る。

ＣＮＴＦ又１１ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦ受容体複合体に反応する任意の細胞の障害の治療に本発明を用いてもよい。本発明の好ましい実施態様において、ＣＮＴＦ／Ｉ　Ｌ−６／ＬＩＦ受容体ファミリーのメンバーを発現する細胞の障害は、これらの方法により治療可能である。そのような障害の例としては、下記の細胞に関わるものを含むが、それらには限定されない：白血病細胞、造血幹細胞、（骨髄）巨核細胞及びそれらの祖先、ＤＡＩ細胞、破骨細胞、遺骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎上皮細胞、胚幹細胞、腎糸球体細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞など。

従って本発明は、ＣＮＴＦ関連神経系又は分化疾患若しくは障害又は神経損傷のある患者を有効量の改変型ＣＮＴＦ又はそのハイブリッド若しくは突然変異体を用いて治療する方法を提供する。改変型ＣＮＴＦ分子は、ＣＮＴＦについてＭａｓｉａｋｏｗｓｋｉらにより１９９１年４月４日公開の国際公開第１０９１１０４３１６号に、及びＣＮＴＦ／ＣＮＴＦＲ複合体についてＤａｖｉｓらにより１９９１年１２月１２日公開の国際公開第１００９１／１９００９号に記載されている疾患若しくは障害の治療に使用してもよく、これらの文献の全文が本明細書に参考として組み入れられる。

そのような疾患若しくは障害には、網膜変性のような変性疾患、を髄、コリン作用性ニューロン、海馬ニューロンに関わる疾患若しくは障害、又は筋委縮性側索硬化症若しくはベル（Ｂｅｌｌ）麻痺のような顔面神経障害のような運動ニューロンに関わる疾患又は障害が含まれる。治療可能な他の疾患又は障害には、末梢神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、又は、例えば、除神経、慢性疲労（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｄｉｓｕｓｅ）　希＊琳、代謝性ストレス及び栄養失調が原因となるか、又は筋ジストロフイー症候群、先天性筋障害、筋肉の炎症性疾患、中毒性障害、神経外傷、末梢神経障害、薬物若しくは毒物誘導損傷又は運動神経細胞障害のような症状が原因となる筋委縮症が含まれる。

本発明はさらに、外傷、手術、梗塞、感染及び悪性腫瘍又は毒物にさらされることによって引き起こされ得る神経系に対する損傷が原因となる疾患若しくは障害も考慮に入れている。

さらに本発明は、単独の治療薬として又はＣＮＴＦ受容体との複合体として、適当な薬理学的担体中の本明細書に記載の改変型ＣＮＴＦ分子又はそのハイブリッド若しくは突然変異体からなる医薬組成物を提供する。

改変型ＣＮＴＦ、安定な改変型ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦ受容体複合体又はそのハイブリッド若しくは突然変異体を含んでいてよい有効成分は、注入（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、神経内、神経周囲、髄腔内、心室内、硝子体内、鞘内など）を含むがそれらには限定されない任意の適切な経路により上皮若しくは粘膜皮質のライニング（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介して吸収することにより、又は、細胞若しくは組織インブラントを含む持続放出性インブラントにより、ｉｎ　ｖｉｖｏでの全身的若しくは局所的投与に好適な医薬担体中に調剤する必要がある。

有効成分は、投与形態に応じて、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマー若しくはワックスベースの持続放出性製剤内に取り込まれるか、又は食塩水のような液状担体中に配合されるか、又は錠剤、丸剤若しくはカプセル形態中に配合し得る。

製剤中に用いられる有効成分の濃度は、必要とされる有効用量及び用いられる投与形態にしたがう。用量は、所期の効果をあげる有効成分の循環プラズマ濃度を得るに充分な量でなければならない。有効用量は、ｉｎ　ｖｉｖｏ又は動物のモデル試験系から得られる用量一応答曲線から推定してよい。

本明細書に記載のように、本出願人は、電気泳動移動度を変化させることにより、生物学的活性又はリガンド結合能力が増進したタンパク質の信頼し得るスクリーニング法が得られることを確認した。従って、本明細書に記載の方法は、新規な治療用タンパク質のスクリーニングに一般的に応用することが可能である。かかる方法は、野生型のヒトタンパク質の電気泳動移動度を決定し、アミノ酸置換を該野生型ヒトタンパク質に導入し、該野生型タンパク質の電気泳動移動度と比較して、電気泳動移動度が変更された置換タンパク質を可能な候補として同定することを含む。

そのような置換タンパク質は、その生物学的活性及び／又は結合親和性を決定するためにさらに試験することが可能である。可能なアミノ酸置換は、例えば、ヒト以外の種の相同タンパク質に類似した塩基配列に基づいて行うことが可能である。

当業者には、ＣＮＴＦのアミノ酸塩基配列の他の変更によっても分子に対する特性が高められ得ることが認められるであろう。さらに当業者には、他の種、即ち、マウス、ウサギ及びニワトリからの相同ＣＮＴＦも、ヒトの疾患若しくは障害の治療における増進特性を有することが認められるであろう。このように、本発明は新規な神経栄養因子の同定法を含んでおり、該方法により、ヒト以外の種からの神経栄養因子を、ヒト受容体への結合能力並びにヒトの細胞系及び生体（ｉｎ　ｖｉｖｏ）系における生物学的活性に関して同定且つ検定する。新規な特性を有する動物種からの神経栄養因子を同定する場合には、本明細書に記載のような当業者には公知の方法を用いて、ヒトの因子と動物由来の因子を交換して、治療特性が増進した新規な神経栄養因子を作り出すことが可能である。

実施例実施例１．改変型ヒトＣＮＴＦ分子の電気泳動移動度材料及び方法Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ＲＦＪ２６は、ラクトースオペロンリプレッサーを過剰に産生ずる菌株である。

ヒトのＣＮＴＦ遺伝子を保有する発現ベクターｐＲＰＮ３３及びラットのＣＮＴＦ遺伝子を保有するｐＲＰＮｌｌｏはほぼ同一である（　Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、　１９９１．同上）。

プラスミドｐＲＰＮ２１９は、先ずｐＲＰＮ３３を制限酵素Ｎｈｅｌ及びＨｉｎｄ３を用いて分解し、４，０８１ｂｐの断片をゲル精製することにより構築された。次いで、ヒトＣＮＴＦ遺伝子部分をコードする第２のさらに小さい断片を、プライ７−ＲＡＴ−ｍ−ｄｎ　ｉＨ（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１６）：５’　ＡＣＧＧＴＡＡＧＣＴ　ＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣ３’　：及びＲＡＴ−Ｎｈ　ｅ　− Ｉ　−Ｍ　（Ｓ　ＥＱ。

ＩＤ、Ｎｏ、１７）：５’　ＴＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＧＡＡ　ＧＡＴＴＣＧＴＴＣＡ　ＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧ　ＣＴＣＴＴＡＣＧ　３’　を用いて、ラット遺伝子からＰＣＲ増幅することによって得られた１６７ｂｐのＮｈｅｌ −Ｈｉｎｄ３断片と置換した。

プラスミドｐＲＰＮ２２８をｐＲＰＮ２１９と同様な方法で構築したが、１６７ｂｐの置換断片は、ＤＮＡブライ７−Ｒａ　ｔ　−ｍ−ｄｎ　１）１−Ｌ−Ｒ（ＳＥＱ、Ｉ　Ｄ、　Ｎｏ。

１８）：　５’　ＡＡＧＧＴＡＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＧＡＧＴＣＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＧＴＧ３’及びＲａｔ−Ｎｈｅ−１（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１９）：５’　ＴＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＧＡＡＧ３’　を用いて増幅した。

プラスミドｐＲＰＮ１８６、ｐＲＰＮ１８７、ｐＲＰＮ１８８、ｐＲＰＮ１８９、ｐＲＰＮ１９２、ｐＲＰＮ２１８及びｐＲＰＮ２２２は、同様な手段又は図１に示されている単一の制限切断部位を用いたＤＡＮ断片の直接交換により生成させた。

全てのプラスミドの種を制限分析及びＤＮＡ塩基配列の決定によって確認した。

タンパク質の精製封入体のタンパク質合成の誘導、選択的抽出、溶解及び精製は、ラットＣＮＴＦとヒトＣＮＴＦについて記載されている（　Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、　１９９１．同上）ように行ったが、時折、代わりにゲル濾過を行ったり、それに加えてイオン交換クロマトグラフィーを行ったりした。あるいは、他のタンパク質について記載されている（　Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９８９、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、　２６４　：　１５０６６−１５０６９）ように、ストレプトマイシン及び硫酸アンモニウム分画、次いでカラムクロマトグラフィーにかけて、細胞の溶解物の上清からタンパク質を精製した。

酵素反応条件、ＤＮＡ電気泳動及びこれらの研究に使用される他の技術については既に詳細に記載されている［Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ、　Ｎ、　１９８７．　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄｓ　：＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　（Ｈａｒｄｙ。

Ｋ、Ｇ、　編）　１６３−１７６ページ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｕ、に、］。

椛！還元５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上のヒト、ラット及びいくつかのキメラＣＮＴＦ分子の移動度を図２に示す。

キメラ分子ＲＰＮ１８６、ＲＰＮ１８９、ＲＰＮ２１８及びＲＰＮ２２８は、ラットＣＮＴＦに類似した移動度を示すが、ＲＰＮ１８７、ＲＰＮ１８８、ＲＰＮ１９２及びＲＰＮ２２２は、ヒトＣＮＴＦに類似した移動度を示す。図１に並べられたこれらのタンパク質の配列に対してこれらの結果を相互参照してみると、６３位（Ｒ６３）にアルギニン残基を保有するタンパク質は全てラットＣＮＴＦの移動度を示すことがわかる。ＲＰＮ２２８の場合には、この単一のアミノ酸置換（Ｑ６３→Ｒ）は、ラットＣＮＴＦの通常の移動度をヒトＣＮＴＦに付与するに充分である。

図２は、異なる組換えタンパク質の純度の測定結果を示す。目視検査によれば、純度は、ＲＰＮＩ８９の６０％から、ＲＰＮ２２８の９０％を超える範囲内で変動する。

０．２Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５）（３７μＩ）中の組換えラットＣＮＴＦ　（２８μｇ）を、４ｍＣｉ　（２，０００Ｃｉ／ｍｍｏ　１　；　ＮＥＮ）の１２５Ｉ及び緩やかな窒素流下で乾燥した試薬（Ｂｏｌｔｏｎ及びＨｕｎｔｅｒ、　１９７３、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋　Ｊ、　１３３　：　５２９−５３９）を含むバイアルに移した。

反応物を０℃で４５分間、次いで室温で１５分間インキュベートし、０．２Ｍのグリシン溶液（３０ｍｌ）を加えて反応を停止した。１５分後、０．０８％のゼラチンを含む０．２ｍｌのＰＢＳをさらに加え、混合物を５ｕｐｅ　ｒｄｅｘ− ７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通して、二量体及び他の多量体誘導体から標識単量体ＣＮＴＦを分離した。薄層クロマトグラフィーにかけて測定すると、取り込み量は概して２０％であり、比活性は一般に約１．０００Ｃｉ／ｍｍｏｌであった。単量体”’Ｉ−ＣＮＴＦを４℃で貯蔵し、調製後１週間までに使用した。構造及び配座の完全性試験として、＋ｚｓｌ　ＣＮＴＦ（約１０．０００ｃｐｍ）を５μｇの非標識ＣＮＴＦと混合し、ネイティブなゲル電気泳動により分析した。クーマシー染色又はオートラジオグラフ法により、一つの大きなバンドが見られた。さらに＋２５１−ＣＮＴＦは、培養中のＥ８ヒョコ毛様体ニューロンの生存を支持する活性が天然ＣＮＴＦに類似し得るものであることを示した。

組織培養技術新生ラットの上位頚部神経節（ＳＣＧ）をトリプシン（０，１％）で処理、機械的に解離し、ポリ−オルニチン（３０μｇ／ｍ＋）基体上に置いた。成長培地は、１０％熱不活性化牛脂児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＨａｍの栄養混合物Ｆ１２、神経成長因子（ＮＧＦ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）から構成した。培養を、湿らせた９５％空気１５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で維持した。

非ニューロン性神経節細胞を培養の１日目及び３日目にａｒａＣ（１０μＭ）で処理して取り出した。培養物を２週間の期間中に３回／週フィードし、定期的に結合検定に使用した。

ＭＧ８７／ＣＮＴＦＲは、ヒトＣＮＴＦα受容体遺伝子に感染させた線維芽細胞系である（Ｓｑｕｉｎｔｏら、　１９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ　５　：　７５７− ７６６　；　Ｄａｖｉｓら、１９９１．　５ｃｉｅｎｃｅ　２５３　：　５９− ６３）細胞の単層上で直接結合を行った。培養ウェル内の細胞を、燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ　；　ｐＨ７，４）　、０．１ｍＭのバシトラシン、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍ１のロイペプチン及び１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡからなる検定緩衝液で一度洗浄した。”’Ｉ−ＣＮＴＦを用い、室温で２時間インキュベートした後、細胞を素早く検定緩衝液で２度洗浄し、１％ＳＤＳを含むＰＢＳで溶解、Ｐａｃｋａｒｄ　Ｇａｍｍａ　Ｃｏｕｎｔｅｒで計測した。ｉ、ｏｏｏ倍過剰の非標識ＣＮＴＦの存在下に非特異結合を測定した。ＭＧ８７／ＣＮＴＦＲに対する特異結合は８０〜９０％であった。

ＧＲＡＰＨＰＡＤプログラム（ＩＳＩ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルバニア州）を用いてデータを分析した。

結果ラットＳＣＧニューロンへの結合に関する＋２Ｊ−ラットＣＮＴＦに対する精製組換えヒトＣＮＴＦ、ラットＣＮＴＦ及びＲＰＮ２１９の競合曲線を図４ａに示す。ラットＣＮＴＦもヒトＣＮＴＦもＳＣＧニューロンに結合するために＋２Ｊ −ラットＣＮＴＦと競合するが、ヒトＣＮＴＦ（ＩＣ５０＝２５ｎＭ）は、１２５Ｉ−ラットＣＮＴＦ結合を置換させる能力が、非標識ラットＣＮＴＦ　（ＩＣ５０＝０．２８ｎＭ）の９０分の１しかない。それに反してＲＰＮ２１９は、ラットＣＮＴＦと殆ど同様な能力を有しており、明らかにヒトＣＮＴＦ　（ＩＣ５０−０，３ｎＭ）より強力である。

ヒトＣＮＴＦ受容体の発現を誘導するプラスミドに感染させたマウスの線維芽細胞を用いた競合試験から同様な結果が得られた（図４ｂ）。ヒトＣＮＴＦ、ラットＣＮＴＦ及びＲＰＮ２２８はいずれも、ＭＧ８７／ＣＮＴＦ細胞に結合するために１２５■−ラットＣＮＴＦと競合する。ヒトＣＮＴＦ　（ＩＣ５０＝３０ｎＭ）はラットＣＮＴＦ　（ＩＣ５０＝２．８ｎＭ）の１２分の１の強さしかないが、ＲＰＮ２２８は明らかにヒトタンパク質（ＩＣ５０＝５．６ｎＭ）より強力である。

図１に示されている他の改変型ＣＮＴＦタンパク質を用いた結合競合試験も、Ｒ６３を有するタンパク質はラットＣＮＴＦの生物学的活性を有するが、Ｑ６３を有するタンパク質はヒトＣＮＴＦの結合特性を有することを示した（データは示さず）。これらの結果は、単一のアミノ酸置換（Ｑ６３→Ｒ）が、ラットＣＮＴＦに特徴的な受容体結り特性をヒトＣＮＴＦに付与するに充分であることを示している。

記載されている（　ｌｌａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、　１９９１．同上）ように、ヒヨコ毛様体神経節（ＣＧ）の解離培養上で組換えＣＮＴＦを検定したが、生存細胞はＭＴＴで染色された（　Ｍｏｓｍａｎｎ、　Ｔ、　１９８３　；　Ｊ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　６５　：　５５−６３）。

結果図３は、精製組換えヒトＣＮＴＦ、ラットＣＮＴＦ並びに改変型ＣＮＴＦタンパク質ＲＰＮ２１９及びＲＰＮ２２８について、解離されたＥ８ヒョコ胚毛様体神経節ニューロン集積培養の用量一応答曲線を示す。この検定によれば、キメラタンパク質の生物学的活性は、精製組換えラットＣＮＴＦの生物学的活性と見分けがつかず、組換えヒトＣＮＴＦより明らかに高い生物学的活性を有している。さらに図３の用量一応答曲線を比較すると、ＲＰＮ２１９、ＲＰＮ２２８又はラットＣＮＴＦで得られた生存ニューロンの最大レベルは、ヒトＣＮＴＦで得られたものより高いことが示される。これらの結果は、ラットＣＮＴＦと同様にＲＰＮ２１９及びＲＰＮ２２８が、より大きなニューロン群に対してヒトＣＮＴＦより活性が高いことを示唆している。

並行実験で図１に示されている他の改変型ＣＮＴＦタンパク質の生物学的活性を調べた。いずれの場合にも、（Ｑ６３→Ｒ）ｆｆｉ換を保有する改変型ＣＮＴＦタンパク質はラットＣＮＴＦの生物学的活性を示したが、Ｑ６３を有するタンパク質はヒトＣＮＴＦの活性を示した（データは示さず）全体としてこれらの結果は、単一のアミノ酸置換（Ｑ６３→Ｒ）が、ヒトＣＮＴＦにラットＣＮＴＦの生物学的活性を付与するに充分であることを示している。

Ｒ３４４又はＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ株のＡｌｂｉｎｏラットを２〜５力月齢で用いた。ラットを、一定の光を照射する前に９日以上周期的光環境（２５ｆｔ−ｃ未満のケージ内照明を１２時間点灯：１２時間消灯）に維持した。ラットをケージの床上５Ｑｃｍに吊り下げられた白色反射器を備えたＧｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社製の４０ワツト「白色」蛍光電球２個により与えられた照明レベル１１５−２００ｆ　ｔ−ｃ　（殆どのラットは１２５−１７０ｆｔ−ｃを受けた）の一定の光で１乃至２週間照射した。照射している間、ラットをステンレス鋼のワイヤーバーカバーの付いた透明なポリカーボネイトケージ内に維持した。

一定の光を照射する２日前に、ケタミンーキシラジン混合物で麻酔したラットに、燐酸緩衝塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中に０゜１〜５００　ｎ　ｇ／μｌの濃度で溶解した１μｌのラットＣＮＴＦ、ヒトＣＮＴＦ又は改変型ＣＮＴＦ　［ｈＣＮＴＦ（Ｑ６３→Ｒ）］を硝子体内に注入した。注入は、眼の鋸状縁と赤道の間のほぼ中間にある強膜、脈絡膜及び網膜を通して３２ゲージの針を刺して行った。いずれの場合にも、眼の上半球内に注入した。

一定の光を照射した直後に、過量の二酸化炭素を投与し、その直後に混合アルデヒドを血管潅流させてラットを殺した。１μｍの厚さに切断するために、眼をエポキシ樹脂中に包埋して、眼の垂直経線に沿って全網膜の切片を作成した。０〜４＋病理学者レスキュースケール（４＋が最大レスキュー且つほぼ標準的な網膜完全性である）により光受容体レスキュ一度を評価して、光誘導網膜変性度を定量した。各切片の光受容体レスキュ一度を、同一ラットの対照眼との比較に基づいて４個体から評定した。この方法は、ＯＮＬ厚さのみならず、光受容体の内部及び外部セグメントに対するより微妙な変性変化、並びに眼内部の変性分布勾配を考慮するという利点を有している。用量一応答曲線を作成するために各時点につき３個の眼を調べた。

結果レスキュ一度を、ヒトＣＮＴＦ、ラットＣＮＴＦ及びｈＣＮＴＦ　（Ｑ６３→Ｒ）について測定した。該データから、ラットＣＮＴＦもｈＣＮＴＦ　（Ｑ６３→ Ｒ）も、光損傷モデルにおける光受容体レスキュ一度が組換えヒトＣＮＴＦの１０倍も高いことが示された。

本発明を好ましい特定の実施態様と組み合わせて上記に説明したが、該説明及び実施例は本発明の範囲を示しはしても限定しないように意図されており、本発明の範囲は添付の請求の範囲によって規定されるものとする。

配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：　Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ、　Ｎ１ｋｏｓ（ｉｉ）発明の名称：改変型毛様体神経栄養因子（１ｉｉ）塩基配列数＝１９（ｉｖ）連絡先。

（Ａ）宛名：　Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ。

（Ｂ）町名：　７７７０１ｄ　Ｓａｗ　Ｍｉｌｌ　Ｒｉｖｅｒ　Ｒｏａｄ（Ｃ）市：　ＴａｒｒｙｔｏｗｎＣＤ）州：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（Ｅ）国：Ｕ、Ｓ、Ａ。

（Ｆ）郵便番号：　１０５９１（Ｖ）コンピューター読み出し可能形態：（Ａ）メディアタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ｐｃコンパチブル（Ｃ）　操作システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０バージョン＃１．２５（ｖｉ）最近の出願データ：（Ａ）出願番号：　ＵＳＯ７／９５９．２８４（Ｂ）出願日：１９９２年１０月９日（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）弁理士／エージェント情報：（Ａ）氏名：　Ｋｅｍｐｌｅｒ　Ｐｈ、Ｄ、、　Ｇａ１ｌ　Ｍ。

（Ｂ）登録番号：　３２．１４３（ｉｘ）通信情報（Ａ）電話：　９１４−３４７−７０００（Ｂ）ファックス：　９１４−３４７ −２１１３（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　（配列番号）：１の情報。

（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：２００アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ｉｉ）分子の型、タンパク質（Ｘｌ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：ＣＹ＠　Ｓａｒ　＾ｘｑ　：ｅｒ　ＸＩ・　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　入１龜Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＸＬｅ　Ａｒｇ　Ｓｉｒ　Ａｌｐ　Ｌｅｕ　τｈｒＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　！Ｉｉｍ　Ｇｉｎ　Ｏｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｎ　Ｌｙ−Ａｓｎ　Ｚｌ＊＾ａｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　入１＆　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　）ｌｅｔ　Ｐｒｏ　ＶＪＬＩ　ＡＩＪＩ　ｓａｒ　Ｔｈｒ　入ｓｐ　にｉｎ　■■ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の情報：（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝２００アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー二不明（ｉｉ）分子の型：タンパク質（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：ｖａＩ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｌ’ｌ　ＧＬｕ　ｔ４ｕ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　ＴｒｐＴｈｒＶａｔ　ｈＸｑ　５ＬＩｋ！？　Ｘｌ・器１＄入ｓｐ　Ｌｅ■ １６５　１７０　１７％人ｒｇ　ＶａＬ　ＸＬ・Ｓａｒ　Ｓａｒ　！Ｉｔｓ　Ｇｉｎ　Ｍｔ　Ｇｌｙ　Ｘｉ・　Ｓａｒ　入１ａ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　３１１ｇＭａｔ　Ａｉｍ　Ｐｈａ　Ｍａｔ　Ｏｌｕ　Ｉ！１ｓ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｌａｕτｈｒ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌａｕｉ　Ｓ　１０　１ｓ（’／１１　Ｓ虹Ａｒｇ　Ｔｈｅ　Ｘｌ龜τｒｐ　ｔａｕ　入１ａ入ｒｇ　Ｌｙ＠　Ｈｌｓ　Ａ１９　Ｂａｒ　Ａ１１＄Ｉ　ＩＪｕ　テｈｒ２６　、　２５　３０＾工ａ　Ｌａｕ　ＴＭ　ＧＬｕ　５＠ｒ　Ｔｙｒ　ｖａｔ　Ｌｙｓ　ＢＬｍ　Ｇ１ｎ０ＩＹ　Ｌａｕ　Ｍｎ　ＬＹＩＩ　入ｓｇｌ　！ｉｓコ５　４０　４５ λ１ｎ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　ｓｉｒ　ｖａｌ　λＩＩＰ　ＳＬＹ　ＶａＬ　１ｌｒｏ　Ｍａｔ　轟ＩＪＩ　ｓｅｔ　Ｔｈｅ　Ａｍｐ　Ｇｌｓ　嘯窒■ ５０　５５　ＧＧｓｉｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕλ１ｍ　（：１ｕ　Ａｒｇし＋ｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ＾＠ｎ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　？ｙｒ６５　７０　〕Ｓ　ａＯＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｈｌｓ　Ｘｉｓ　）４＠ｔ　Ｌａｕ　Ａｌａ　ＪＬｒｇ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｏｌｕ　入−ｐ　Ｇｉｎ　ＧｌｎＶａ■ ａｓ　９０　９５Ｌｅｕ　Ｌａｕ　（：ｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　ＸＬ・　Ｐｒｏ　Ｐｔり　Ｌｙｌ　人１ｐ　Ａｌｍ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｅ　Ｐｒｏ　ＶａP Ｉｃｅ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ａｍｐ　Ｏｌｙ　Ｌｓｕ　Ｐｈ＠　Ｇｌｕ　ＬＹｍ　ＬＹｍ　ｆ、ｓｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　ｔａｕ　Ｌｙｅ　Ｖ揩P Ｌａｕ　Ｇｉｎ　にｌｕ　Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｈｌｓ　テｒｐ　Ｔｈｅ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　ｊａｒ　Ｘ１ｍ　！！ｉ−＾−ｐ！ａｕ　＾ｒ９１６５　１７０　１）ＳＶａＬ　Ｘｉｓ　Ｂａｒ　Ｃｙ＠Ｉｎｋｓ　ＧＬｒｓτ−ＧＬｙ　ＸＬａ　ｌ’ ｒＯｊｕａ　ＩＩＬｓ　ｃｘｙ　ｓｉｒ　ｌ１１ｍ　ＴｙｔＬ！１０　１８５　１９０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の情報：（ｉ）配列の特′６ｉｌ：Ｍ（、ｔ　入１ａ　Ｐｈｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ａｌｎ　Ｓａｔ　Ｐｒｏ　Ｌ−ａｕ　丁ｈｒ　ｔａｕ　ＩＩＬｓ　Ａｒｇ　ＪＬｒｇ　＾ｓｐkｗａＳ　１０　１５ｃｙｓ　ｓｓｒ　入ｒｇ　Ｓａｔ　ＸＬａ　Ｔｒｐ　！＋ｕ　入１ａ＾ｘｑ　Ｌｙｓ　ＸＬａ　入ｘｇ　Ｓｉｒ　入１１ｐ　Ｌ＋＊ｕ　！ｈ■ 人１ａ　Ｌａｕ　Ｍａｔ　Ｏｌｕ　Ｓａｔ　Ｔｙｒ　Ｖ龜Ｉ　ＬＹｍ　Ｈ五−Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　＾ｍＨＬｙｓ　Ｊｋｎｎ　！ｌ＠３５　４０　ＡｓＳｅｒ　Ｌｓｕ　Ａ−ｐ　ｓＩ＆ｒ　Ｖａｌ　Ａｍｐ　Ｉｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｂａｒ　Ｔｈｒ　Ａｍｐ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｂａｒ　Ｇｌ■ ｓｏ　ｓｓ　ａ。

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（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝２００アミノ酸（Ｂ）配列の型・アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー：不明（ｉｉ）分子の型−タンノぐり質（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０の情報：（Ｂ）配列の型；アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー：不明Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｐｈａ　Ｔｈｘ　ＣＬｕ　Ｈｌｓ　Ｓ＠ｒ　！’ｒｏ　Ｌａｕ　ＴｈＸ　Ｐｒｏ　ＢＬｍ　Ａｒｇ　入ｒｇ　Ａｓｐ　Ｌａ■ １　５　１０　１ｓＣｙｓ　Ｓａｔ　八ｒｇ　ｓｅｘ　Ｘｉｓ　Ｔｒｐ　Ｌ８％＆　入１龜　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＨＬｍ　入ｔｑ　Ｓｓｒ　Ａｓｐ　ＬｅすＴｂｘｋｒｑ　ＴｈＸ　Ｐｈａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｅ　Ｗｕ　Ｌｅｕ　Ｏｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ＶａＬａｓ　、、　９５５１１ｍ　Ｐｈｓ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　テｈｒ　Ｇｌｕ　ＯＬｙ　λ静ｐ　Ｐｈ− ｆｕｎ　０１１１　Ａｌａ　ＸＬａ　ｆｉｌｓ　ＴｈＸ　Ｌ■■ ｚｏｏ　ｚｏｓ　ｕ。

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２、ＲＰＮ１８６　（配列番号６）　、ＲＰＮ１８９　（配列番号９）　、ＲＰＮ２１８　（配列番号１１）、ＲＰＮ２１９（配列番号１２）、ＲＰＮ２２８　（配列番号１５）から選択される請求項１に記載の改変型ヒト毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）。

３、請求項１に記載の改変型ヒトＣＮＴＦをコードする、単離且つ精製されたＤＮＡ分子。

４、請求項２に記載の改変型ヒトＣＮＴＦをコードする、単離且つ精製されたＤＮＡ分子。

５、組換えＤＮＡ分子中の発現調節配列に作動的に結合された請求項３に記載のＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子。

６、組換えＤＮＡ分子中の発現調節配列に作動的に結合された請求項４に記載のＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子。

７、請求項５又は６に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主。

８、細菌、酵母及び他の菌類、動物細胞並びに植物細胞から選択される請求項７に記載の単細胞宿主。

９、ＤＮＡ分子が宿主により発現されるように請求項５又は６に記載のＤＮＡ分子を含む組換え宿主を増殖させ、発現された毛様体神経栄養因子タンパク質を単離することを含む改変型ＣＮＴＦ分子を製造する方法。

１０、前記宿主が真核細胞である請求項９に記載の方法。

１１、前記宿主が原核細胞である請求項９に記載の方法。

１２、医薬上適する担体と共に請求項１又は２に記載の改変型ヒトｃＮＴＦを含む医薬組成物。

１３、神経系の疾患又は障害を治療すべ（ヒト又は動物の身体を治療する方法に使用するための請求項１又は２に記載の改変型ヒトＣＮＴＦ０１４、前記疾患又は障害が変性疾患である請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。

１５、前記疾患又は障害がを髄に関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。

１６、前記疾患又は障害が運動ニューロンに関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ０１７、前記疾患又は障害が、ベル麻痺のような顔面神経の運動ニューロンに関わる請求項１６に記載の改変型ＣＮＴ１８、前記変性疾患が筋委縮性側索硬化症である請求項１４に記載の改変型ＣＮＴＦ。

１９、前記変性疾患が、末梢神経障害、アルツノ１イマー病、パーキンソン病又はハンチントン舞踏病からなる群から選択される請求項１４に記載の改変型ＣＮＴＦ。

２０、神経系の疾患又は障害が神経系に対する損傷を含む請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。

２１、前記損傷が、外傷、手術、梗塞、感染又は悪性腫瘍によって引き起こされる請求項２０に記載の改変型ＣＮＴ２２、前記損傷が毒物にさらされることによって引き起こされる請求項２０に記載の改変型ＣＮＴＦ。

２３、神経系の疾患又は障害がコリン作用性ニューロンに関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。

２４、前記疾患又は障害が筋委縮症に関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。

２５、萎縮症が、除神経、慢性疲労、代謝性ストレス及び栄養失調から引き起こされる請求項２４に記載の改変型ＣＴＦ０２６　萎縮症が、筋ジストロフイー症候群、先天性筋障害、筋肉の炎症性疾患又は中毒性障害から引き起こされる請求項２４に記載の改変型ＣＮＴＦ０２７、萎縮症が、神経外傷、末梢神経障害、薬物若しくは毒物誘導損傷又は運動神経細胞障害から引き起こされる請求項２４に記載の改変型ＣＮＴＦ０２８、前記疾患又は芒害が海馬細胞に関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮ’Ｔ　Ｆ　。

２９、生物学的活性及び／又は結合親和性が増進したヒトタンパク質のスクリーニング法であって、野生型ヒトＣＮＴＦタンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動移動度を決定し；前記野生型ヒトＣＮＴＦタンパク質にアミノ酸置換を導入し；置換されたタンパク質の電気泳動移動度を野生型ＣＮＴＦタンパク質の電気泳動移動度と比較し；電気泳動移動度が変更された置換タンパク質を、野生型タンパク質の電気泳動移動度と比較して同定し：同定されたタンパク質の生物学的活性及び／又は結合親和性を測定することを含む前記方法。

３０、野生型ヒトタンパク質中で置換されたアミノ酸配列が、異なる動物種の相同タンパク質のアミノ酸配列に相当する請ボ項２９に記載の方法。

３１、野生型ヒトＣＮＴＦタンパク質に導入されたアミノ酸置換がＧ１ｎ６３→ Ａｒｇ５３に相当する請求項２９又は３０に記載の方法。

フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１００　ＡＡＭＡＲＣＯ７Ｋ　１４／４７　８３１８−４ＨＣｌ　２　Ｎ　５／１０／／　Ｂ　ＯＩ　Ｄ　５７１０２　９３４４−４ＤＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｈ９２８２−４ＢＧＯＩＮ　２７／４４７８３１４−４Ｃ７３６３−２Ｊ（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　ＳＥ）、ＧＡ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＶＮＦＩＡ６１Ｋ　３７１０２　ＡＡＢ／／　ＧＯＩＮ　２７／２６　３０１　Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

１．改変Ｇｌｎ６３→Ａｒｇを有するヒト毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）。
２．ＲＰＮ１８６、ＲＰＮ１８９、ＲＰＮ２１８、ＲＰＮ２１９、ＲＰＮ２２８から選択される請求項１に記載の改変型ヒト毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）。
３．請求項１に記載の改変型ヒトＣＮＴＦをコードする、単離且つ精製されたＤＮＡ分子。
４．請求項２に記載の改変型ヒトＣＮＴＦをコードする、単離且つ精製されたＤＮＡ分子。
５．組換えＤＮＡ分子中の発現調節配列に作動的に結合された請求項３に記載のＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子。
６．組換えＤＮＡ分子中の発現調節配列に作動的に結合された請求項４に記載のＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子。
７．請求項５又は６に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主。
８．細菌、酵母及び他の菌類、動物細胞並びに植物細胞から選択される請求項７に記載の単細胞宿主。
９．ＤＮＡ分子が宿主により発現されるように請求項５又は６に記載のＤＮＡ分子を含む組換え宿主を増殖させ、発現された毛様体神経栄養因子タンパク質を単離することを含む改変型ＣＮＴＦ分子を製造する方法。
１０．前記宿主が真核細胞である請求項９に記載の方法。
１１．前記宿主が原核細胞である請求項９に記載の方法。
１２．医薬上適する担体と共に請求項１又は２に記載の改変型ヒトＣＮＴＦを含む医薬組成物。
１３．神経系の疾患又は障害を治療すべくヒト又は動物の身体を治療する方法に使用するための請求項１又は２に記載の改変型ヒトＣＮＴＦ。
１４．前記疾患又は障害が変性疾患である請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。
１５．前記疾患又は障害が脊髄に関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。
１６．前記疾患又は障害が運動ニューロンに関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。
１７．前記疾患又は障害が、ベル麻痺のような顔面神経の運動ニューロンに関わる請求項１６に記載の改変型ＣＮＴＦ。
１８．前記変性疾患が筋委縮性側索硬化症である請求項１４に記載の改変型ＣＮＴＦ。
１９．前記変性疾患が、末梢神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病又はハンテントン舞踏病からなる群から選択される請求項１４に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２０．神経系の疾患又は障害が神経系に対する損傷を含む請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２１．前記損傷が、外傷、手術、梗塞、感染又は悪性腫瘍によって引き起こされる請求項２０に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２２．前記損傷が毒物にさらされることによって引き起こされる請求項２０に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２３．神経系の疾患又は障害がコリン作用性ニューロンに関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２４．前記疾患又は障害が筋委縮症に関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２５．萎縮症が、除神経、慢性疲労、代謝性ストレス及び栄養失調から引き起こされる請求項２４に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２６．萎縮症が、筋ジストロフィー症候群、先天性筋障害、筋肉の炎症性疾患又は中毒性障害から引き起こされる請求項２４に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２７．萎縮症が、神経外傷、末梢神経障害、薬物若しくは毒物誘導損傷又は運動神経細胞障害から引き起こされる請求項２４に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２８．前記疾患又は障害が海馬細胞に関わる請求項１３に記載の改変型ＣＮＴＦ。
２９．生物学的活性及び／又は結合親和性が増進したヒトタンパク質のスクリーニング法であって、野生型ヒトタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動移動度を決定し；前記野生型ヒトタンパク質にアミノ酸置換を導入し；置換されたタンパク質の電気泳動移動度を野生型タンパク質の電気泳動移動度と比較し；電気泳動移動度が変更された置換タンパク質を、野生型タンパク質の電気泳動移動度と比較して同定し；同定されたタンパク質の生物学的活性及び／又は結合親和性を測定することを含む前記方法。
３０．野生型ヒトタンパク質中で置換されたアミノ酸配列が、異なる動物種の相同タンパク質のアミノ酸配列に相当する請求項２９に記載の方法。