JP2702811B2

JP2702811B2 - 改変型毛様体神経栄養因子

Info

Publication number: JP2702811B2
Application number: JP6510157A
Authority: JP
Inventors: パナヨテイトス，ニコス
Original assignee: リジエネロン・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレーテツド
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 1998-01-26
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: ATE151460T1; WO1994009134A2; US20030092129A1; ES2099981T3; HK1007767A1; EP0666912B1; DE69309702T2; AU667996B2; CA2132954A1; US6440702B1; IL107213A0; ZA937482B; GR3024039T3; AU5326094A; US5846935A; WO1994009134A3; JPH07506005A; DE69309702D1; CA2132954C; US20030220484A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本発明は、神経系又は他の疾患若しくは障害の治療に
有用な治療用CNTF関連ポリペプチドに関する。

毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor;
CNTF）は、ヒヨコ胚毛様体神経節ニューロンのin vitro
生存に必要とされるタンパク質である（Manthorpeら、1
980,J.Neurochem.34:69−75）。毛様体神経筋は、解剖
学的には眼窩空洞内の視神経の側直筋と硝の間に横たわ
って位置しており、毛様体筋と瞳孔括約筋の神経支配を
司る動眼神経から側交感神経繊維を受け取っている。

過去10年の間に、毛様体神経節ニューロンの生存を支
持する能力に加えて、多くの生物学的効果がCNTFに帰せ
られてきた。CNTFは、周産期のラットの視神経及び脳内
の両能性グリア祖先細胞の分化を誘導すると考えられて
いる（Hughesら、1988、Nature 335:70−73）。さらにC
NTFは、ヒヨコ胚背根神経節感覚ニューロンの生存を促
進することが確認されている（Skaper及びVaron,1986,B
rain Res.389:39−46）。さらにCNTFは、運動ニューロ
ン、海馬ニューロン及び前交感神経脊髄ニューロンの生
存及び分化を支持する［Sendtnerら,1990,Nature 345:4
40−441;Ipら,1991,J.Neurosci.11:3124−3134;Blottne
rら,1989,Neurosci.Lett.105:316−320］。

最近になって、Masiakowskiら、1991,J.Neurosci.57:
1003−1012及び1991年４月４日に公開された国際公開第
WO91/04316号（これらの内容の全体を本明細書に参考と
して組み入れるものとする）に記載されているように、
CNTFは、細菌性発現系でクローン化且つ合成された。

CNTF受容体（「CNTFRα」と称される）がクローン化
され、配列決定され且つ発現された［Davisら，（199
1）Science 253:59−63参照］。CNTF及び白血病阻害因
子（LIF）として知られているCNTF及び造血性因子は、I
L−６シグナル交換成分gp130並びに第２のβ成分（LIFR
βとして知られている）が関わる共有するシグナル伝
達経路を介して神経細胞上で作用する。従って、CNTF/C
NTF受容体複合体は、LIF反応性細胞、又はgp130及びLIF
R β成分を保有する他の細胞でシグナル変換を開始させ
ることが可能である［Ipら，（1992）Cell 69:1121−11
32］。

ヒトCNTFに加えて、対応するラット（Ｓckliら,198
9,Nature 342:920−923）及びウサギ（Linら,1989,J.Bi
ol.Chem.265:8942−8947）の遺伝子がクローン化され、
200個のアミノ酸からなるタンパク質をコードし、その
配列中の約80％はヒトの遺伝子と相同であることが判明
している。ヒト及びラットの組換えタンパク質が極めて
高いレベル（全タンパク質の70％に及ぶ）で発現され、
ほぼ均質になるまで精製された。

ヒト及びラットの組換えCNTFは、それらの構造的、機
能的類似性にも拘らず、いくつかの点で異なっている。
培養中のヒヨコ胚毛様体ニューロンの生存及び該ニュー
ロンからの神経突起の自然成長を支持するラットの組換
えCNTFの生物学的活性は、ヒトの組換えCNTFの４倍も優
れている［Masiakowskiら，（1991）,J.Neurochem.57:1
003−1012］。さらに、ラットCNTFはヒトCNTFよりヒトC
NTF受容体に対する親和性が高い。

同サイズのヒトCNTFとラットCNTFの物性における驚く
べき差異は、SDSゲル上でのそれらの異なる移動度にあ
る。この挙動の差異は、二つの分子の一方に変性状態に
おいても変わらない非一般的な構造特性が存在すること
を示している（Masiakowskiら,1991,同上）。

組換えタンパク質の機能性ドメインの構造組織を明ら
かにするために、遺伝子工学による突然変異誘発が多用
されている。欠失又は置換突然変異誘発を行うためのい
くつかの異なる方法が文献に記載されている。その中で
最も成功したのは、アラニンスキャニング突然変異誘発
［Cunnigham及びWells（1989）,Science 244:1081−108
5］及び相同スキャニング突然変異誘発［Cunnighamら，
（1989）,Science 243:1330−1336］であると思われ
る。これらの方法は、成長ホルモンの受容体結合ドメイ
ンの同定及びそれらの同族受容体への変化した結合特性
を有するハイブリッドタンパク質の生成に役立った。

発明の要旨本発明の目的は、運動ニューロン疾患及び筋肉変性疾
患を含むがそれらには限定されない疾患又は障害の治療
用の新規なCNTF関連神経栄養因子を提供することであ
る。

本発明の他の目的は、改良された治療特性を有する、
本明細書に特定的に記載されているもの以外のCNTF関連
因子を同定する方法を提供することである。

上記及びその他の目的は本発明により達成され、該方
法において、ヒトCNTFタンパク質のアミノ酸を置換する
と、該タンパク質の治療特性が向上する。一つの実施態
様において、電気泳動移動度の変化を、潜在的有用性を
有する改変CNTFタンパク質の初期スクリーニングに用い
る。

好ましい実施態様において、ヒトCNTFの63位のアミノ
酸グルタミンをアルギニン又は別のアミノ酸と置換する
ことにより、改変CNTF分子の生物学的活性が改善され
る。

図面の簡単な説明図1.種々のCNTFタンパク質の配列。A.ヒト（SEQ.ID.NO.
（配列番号）１）、ラット（SEQ.ID.NO.2）、ウサギ（S
EQ.ID.NO.3）、マウス（SEQ.ID.NO.4）及びニワトリ（S
EQ.ID.NO.5）（Leungら,1992,Neuron 8:1045−1053）の
配列。点（dots）は、ヒトの配列中に認められた残基を
示す。パネルB.ヒトCNTFアミノ酸残基（点）及びラット
CNTF（示されている残基）を示す改変CNTF分子（186［S
EQ.ID.NO.6］、187［SEQ.ID.NO.7］、188［SEQ.ID.NO.
8］、189［SEQ.ID.NO.9］、192［SEQ.ID.NO.10］、218
［SEQ.ID.NO.11］、219［SEQ.ID.NO.12］、222［SEQ.I
D.NO.13］、223［SEQ.ID.NO.14］及び228［SEQ.ID.NO.1
5］。各配列に対応する精製された組換えタンパク質の
名称が左側に示されている。

図2.還元SDS−15％ポリアクリルアミドゲル上のヒト、
ラット及びいくつかの改変CNTF分子の移動度。精製組換
えタンパク質を指示されているようにロードした。指示
MWマーカーをレーンＭ上にロードした。

図3.2種の改変CNTF分子の生物学的活性。A.ヒトCNTF
（黒のダイヤ形）、ラットCNTF（白の四角）及びRPN219
（黒の四角）。B.ヒトCNTF（黒のダイヤ形）、ラットCN
TF（白の四角）及びRPN228（黒の四角）。2ng/mlのラッ
トCNTFの存在下に生存するニューロンの数の百分率で表
わされた、タンパク質の指示濃度で生存する解離型E8ヒ
ヨコ毛様体ニューロンの用量応答。各実験点は３回の測
定の平均を表わす。

図4.（Ａ）SCGニューロン及び（Ｂ）MG87/huCNTFR線維
芽細胞に対する競合リガンド結合。３回の測定の平均か
ら得られた標準偏差が垂直バーで示されている。

発明の詳細な説明本発明はヒト又は動物の神経学的疾患又は障害の治療
法に関する。該方法は、部分的には、組換えラットCNTF
が組換えヒトCNTFより、より効率的にヒトCNTF受容体に
結合するという最初の発見、及びそれに続く、ヒトCNTF
をラットCNTFにより近似させるアミノ酸置換によって、
ヒトCNTF受容体に対する改変CNTFの結合が強化され、そ
の結果、生物学的活性が向上するという発見に基づいて
いる。

好ましい実施態様において、ヒトCNTFタンパク質中の
単一のアミノ酸を変えることにより、毛様体神経節ニュ
ーロンの生存及び自然成長を促すタンパク質の能力が著
しく向上する。

ヒト及びラットの組換えCNTFは、同数のアミノ酸（19
9）及び類似の分子量（Ｎ末端メチオニンの除去後、そ
れぞれMW22,798及び22,721）を有している。しかし、還
元SDS−PAGEゲル上では、組換えヒトCNTFがMW＝27,500
を有すタンパク質として移動するが、ラットCNTFは予想
移動度で移動する。その上、ヒトCNTFは、ヒヨコ毛様体
神経節（CG）ニューロンに対する生物学的活性がラット
CNTFの４分の１しかなく、且つヒトタンパク質は、細胞
表面上のヒト又はラット受容体への結合競争力がラット
CNTFに比べてかなり劣る。

上記の観察から、これらの差異の原因となるCNTF分子
上の領域の同定に努力が向けられることになった。この
方法は、遺伝子工学法により、ヒトCNTF配列の一部を対
応ラットCNTF配列と交換したり、その逆を行ったりする
ことを含む。これを達成するには、２種のCNTF遺伝子に
共通であり且つそれらの対応発現ベクター内で非反復性
である制限部位を利用すると有利であった。そのような
部位は、必要に応じて２種の遺伝子のどちらか一方の同
一のタンパク質配列をコードする領域で遺伝子工学的に
処理された。この方法により、図１に示す改変型タンパ
ク質の各々についての発現ベクターを得た。個々のタン
パク質を60％以上の純度で単離した後、それらの特性を
ヒト及びラットのCNTFと比較した。

ヒトCNTF及びラットCNTFの電気泳動移動度は著しく異
なるので、各アミノ酸置換の効果は、先ずタンパク質の
移動度におけるそのような変化の効果を測定することに
より監視された。本明細書に記載されているように、電
気泳動移動度データは、ラットCNTFと同一の位置に移動
したヒト改変型CNTF分子の全てが単一のアミノ酸置換Gl
n63→Arg（Q63→Ｒ）を有していることを示した。

引き続き、ラットCNTF分子の電気泳動移動度に近い電
気泳動移動度を示した改変型ヒトCNTFタンパク質をその
生物学的活性及び受容体結合について調べた。

CNTFは、E8ヒヨコ胚の解離型毛様体ニューロンの生存
を支持する能力を特徴としている。この基準によると、
精製された組換えラットCNTFはラットの天然タンパク質
と同様な活性を有しているが、組換えヒトCNTFの４倍も
活性が高い［Masiakowskiら，（1991），同上］。同一
の検定法を上記のように作製した変性分子の生物学的活
性の定量に用いた。本明細書に記載のように、Q63→Ｒ
置換を有する改変型CNTF分子は全て、親であるヒトCNTF
タンパク質に比べて高い毛様体神経節ニューロン生存支
持能力を示した。こうした結果から、電気泳動移動度の
変化と生物学的特性の向上との間に強力な相関関係があ
ることが示された。

ヒトCNTFに加えられた改変の生物学的効果の測定に加
えて、分子のCNTF受容体への結合能力に対する各改変の
結果を測定することにより、分子の各々の潜在的生物学
的活性についても示唆を得ることが可能である。

一つの実施態様において、ラットの上位頚部神経節ニ
ューロン（SCG）への結合についてラットCNTFと競合す
る改変型ヒトCNTFタンパク質の能力を測定する。本明細
書に記載のように、ヒトCNTFは、これらの細胞から¹²⁵I
標識ラットCNTF結合を置換する能力が非標識ラットCNTF
の約90分の１しかない。しかし本明細書に記載されてい
る改変型ヒトCNTFタンパク質のいくつかは、ラットタン
パク質を置換する能力がヒトCNTFより高い。そのような
競合結合能力が増進した本明細書に記載の分子は全て電
気泳動移動度が変えられた、ラットCNTFと同じ様に移動
することを示す分子であった。

別の実施態様において、MG87線維芽細胞のような細胞
は遺伝子工学処理を受けてヒトCNTF受容体α成分を発現
するが、そのような細胞は改変型タンパク質のヒト受容
体への結合能力の検定に用いられる。ヒトCNTFは、ヒト
CNTF受容体に結合するための¹²⁵I標識ラットCNTFとの競
合において、ラットCNTFの約12分の１の能力しかない。
ヒトCNTFよりむしろラットCNTFに近似した電気泳動移動
度を有するもの全てを含む本明細書に記載の改変型ヒト
CNTF分子のいくつかは、ヒトCNTF受容体を発現する細胞
への¹²⁵IラットCNTFとの結合競合において、ヒトCNTFよ
り強力である。

別の実施態様において、網膜光受容体の変性を防止す
る特定の成長因子及び他の因子の能力を示すのに明白な
効用を有する動物モデルを、本発明の改変型CNTF分子の
治療特性の評価に用いることが可能である。実施例４に
記載のように、hCNTF（Gln63→Arg）は、網膜変性につ
いての光誘導損傷モデルの光受容体の変性を防止する能
力が組換えヒトCNTFの10倍も高い。

このように、本発明によりヒトCNTFタンパク質の特定
のアミノ酸を置換した結果、ヒトCNTF受容体に結合する
能力が高められ、従って、治療特性も向上したと期待さ
れる改変型ヒトCNTFタンパク質が得られる。

本発明の実施に有用な改変型CNTF分子は、クローニン
グ及び原核又は真核生物発現系における発現によって調
製可能である。組換え神経栄養遺伝子（neurotrophin g
ene）は、任意の多数の方法を用いて発現及び精製して
よい。この神経栄養因子をコードする遺伝子は、例え
ば、pCP110（但し、pCP110には限定されない）のような
細菌発現ベクターにサブクローン化し得る。

次いで、安定且つ生物学的に活性なタンパク質の形成
を可能にする任意の技術によって組換え因子を精製して
もよい。例えば、組換え因子を可溶性タンパク質又は封
入体として細胞から回収してもよく、その結果、タンパ
ク質又は封入体から因子を8M塩酸グアニジン及び透析に
よって定量的に抽出することが可能であるが、この方法
に限定されることはない。因子をさらに精製するには、
慣用のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー又はゲル
濾過を用いてもよい。

本発明により、CNTF/IL−6/LIF受容体ファミリーの受
容体を発現する細胞、又は、例えば、Davisら，（199
2）Cell 69:1121−1132に記載されているような適切な
シグナル交換成分を発現する任意の細胞を含む、CNTFに
反応する細胞のin vitro又はin vivoでの分化、増殖又
は生存の促進のために、本明細書に記載のように調製さ
れた改変型CNTF分子又はそのハイブリッド若しくは突然
変異体を用いることが可能である。あるいは、突然変異
体又はハイブリッドは細胞の分化又は生存に拮抗し得
る。

CNTF又はCNTF/CNTF受容体複合体に反応する任意の細
胞の障害の治療に本発明を用いてもよい。本発明の好ま
しい実施態様において、CNTF/IL−6/LIF受容体ファミリ
ーのメンバーを発現する細胞の障害は、これらの方法に
より治療可能である。そのような障害の例としては、下
記の細胞に関わるものを含むが、それらには限定されな
い：白血病細胞、造血幹細胞、（骨髄）巨核細胞及びそ
れらの祖先、DA1細胞、破骨細胞、造骨細胞、肝細胞、
脂肪細胞、腎上皮細胞、胚幹細胞、腎糸球体細胞、Ｔ細
胞、Ｂ細胞など。

従って本発明は、CNTF関連神経系又は分化疾患若しく
は障害又は神経損傷のある患者を有効量の改変型CNTF又
はそのハイブリッド若しくは突然変異体を用いて治療す
る方法を提供する。改変型CNTF分子は、CNTFについてMa
siakowskiらにより1991年４月４日公開の国際公開第WO9
1/04316号に、及びCNTF/CNTFR複合体についてDavisらに
より1991年12月12日公開の国際公開第WO091/19009号に
記載されている疾患若しくは障害の治療に使用してもよ
く、これらの文献の全文が本明細書に参考として組み入
れられる。

そのような疾患若しくは障害には、網膜変性のような
変形疾患、脊髄、コリン作用性ニューロン、海馬ニュー
ロンに関わる疾患若しくは障害、又は筋委縮性側索硬化
症若しくはベル（Bell）麻痺のような顔面神経障害のよ
うな運動ニューロンに関わる疾患又は障害が含まれる。
治療可能な他の疾患又は障害には、末梢神経障害、アル
ツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、
又は、例えば、除神経、慢性疲労（chronic disuse）、
代謝性ストレス及び栄養失調が原因となるか、又は筋ジ
ストロフィー症候群、先天性筋障害、筋肉の炎症性疾
患、中毒性障害、神経外傷、末梢神経障害、薬物若しく
は毒物誘導損傷又は運動神経細胞障害のような症状が原
因となる筋委縮症が含まれる。

本発明はさらに、外傷、手術、梗塞、感染及び悪性腫
瘍又は毒物にさらされることによって引き起こされ得る
神経系に対する損傷が原因となる疾患若しくは障害も考
慮に入れている。

さらに本発明は、単独の治療薬として又はCNTF受容体
との複合体として、適当な薬理学的担体中の本明細書に
記載の改変型CNTF分子又はそのハイブリッド若しくは突
然変異体からなる医薬組成物を提供する。

改変型CNTF、安定な改変型CNTF/CNTF受容体複合体又
はそのハイブリッド若しくは突然変異体を含んでいてよ
い有効成分は、注入（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉
内、皮下、神経内、神経周囲、髄腔内、心室内、硝子体
内、硝内など）を含むがそれらには限定されない任意の
適切な経路により上皮若しくは粘膜皮質のライニング
（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介して吸
収することにより、又は、細胞若しくは組織インプラン
トを含む持続放出性インプラントにより、in vivoでの
全身的的若しくは局所的投与に好適な医薬担体中に調剤
する必要がある。

有効成分は、投与形態に応じて、リポソーム、マイク
ロカプセル、ポリマー若しくはワックスベースの持続放
出性製剤内に取り込まれるか、又は食塩水のような液状
担体中に配合されるか、又は錠剤、丸剤若しくはカプセ
ル形態中に配合し得る。

製剤中に用いられる有効成分の濃度は、必要とされる
有効用量及び用いられる投与形態にしたがう。用量は、
所期の効果をあげる有効成分の循環プラズマ濃度を得る
に充分な量でなければならない。有効用量は、in vivo
又は動物のモデル試験系から得られる用量−応答曲線か
ら推定してよい。

本明細書に記載のように、本出願人は、電気泳動移動
度を変化させることにより、生物学的活性又はリガンド
結合能力が増進したタンパク質の信頼し得るスクリーニ
ング法が得られることを確認した。従って、本明細書に
記載の方法は、新規な治療用タンパク質のスクリーニン
グに一般的に応用することが可能である。かかる方法
は、野生型のヒトタンパク質の電気泳動移動度を決定
し、アミノ酸置換を該野生型ヒトタンパク質に導入し、
外野生型タンパク質の電気泳動移動度と比較して、電気
泳動移動度が変更された置換タンパク質を可能な候補と
して同定することを含む。そのような置換タンパク質
は、その生物学的活性及び／又は結合親和性を決定する
ためにさらに試験することが可能である。可能なアミノ
酸置換は、例えば、ヒト以外の種の相同タンパク質に類
似した塩基配列に基づいて行うことが可能である。

当業者には、CNTFのアミノ酸塩基配列の他の変更によ
っても分子に対する特性が高められ得ることが認められ
るであろう。さらに当業者には、他の種、即ち、マウ
ス、ウサギ及びニワトリからの相同CNTFも、ヒトの疾患
若しくは障害の治療における増進特性を有することが認
められるであろう。このように、本発明は新規な神経栄
養因子の同定法を含んでおり、該方法により、ヒト以外
の種からの神経栄養因子を、ヒト受容体への結合能力並
びにヒトの細胞系及び生体（in vivo）系における生物
学的活性に関して同定且つ検定する。新規な特性を有す
る動物種からの神経栄養因子を同定する場合には、本明
細書に記載のような当業者には公知の方法を用いて、ヒ
トの因子と動物由来の因子を交換して、治療特性が増進
した新規な神経栄養因子を作り出すことが可能である。

実施例実施例1.改変型ヒトCNTF分子の電気泳動移動度材料及び方法改変型CNTF分子の調製細菌株及びプラスミド E.coli Ｋ−12 RFJ26は、ラクトースオペロンリプ
レッサーを過剰に産生する菌株である。

ヒトのCNTF遺伝子を保有する発現ベクターpRPN33及び
ラットのCNTF遺伝子を保有するpRPN110はほぼ同一であ
る（Msiakcwskiら,1991,同上）。

プラスミドpRPN186、pRPN187、pRPN188、pRPN189、pR
PN192、pRPN218及びpRPN222は、同様な手段又は図１に
示されている単一の制限切断部位を用いたDAN断片の直
接交換により生成させた。

全てのプラスミドの種を制限分析及びDNA塩基配列の
決定によって確認した。

タンパク質の精製封入体のタンパク質合成の誘導、選択的抽出、溶解及
び精製は、ラットCNTFとヒトCNTFについて記載されてい
る（Masiakowskiら,1991,同上）ように行ったが、時
折、代わりにゲル濾過を行ったり、それに加えてイオン
交換クロマトグラフィーを行ったりした。あるいは、他
のタンパク質について記載されている（Panayotatosら,
1989,J.Biol.Chem.264:15066−15069）ように、ストレ
プトマイシン及び硫酸アンモニウム分画、次いでカラム
クロマトグラフィーにかけて、細胞の溶解物の上清から
タンパク質を精製した。

酵素反応条件、DNA電気泳動及びこれらの研究に使用
される他の技術については既に詳細に記載されている
［Panayotatos,N.1987,Engineering an Efficient Expr
ession System in Plasmids:A Practical Approach（Ha
rdy,K.G.編）１ 63−176ページ,IRL Press,Oxford,U.
K.］。

結果還元SDS−ポリアクリルアミドゲル上のヒト、ラット
及びいくつかのキメラCNTF分子の移動度を図２に示す。
キメラ分子RPN186、RPN189、RPN218及びRPN228は、ラッ
トCNTFに類似した移動度を示すが、RPN187、RPN188、RP
N192及びRPN222は、ヒトCNTFに類似した移動度を示す。
図１に並べられたこれらのタンパク質の配列に対してこ
れらの結果を相互参照してみると、63位（R63）にアル
ギニン残基を保有するタンパク質は全てラットCNTFの移
動度を示すことがわかる。RPN228の場合には、この単一
のアミノ酸置換（Q63→Ｒ）は、ラットCNTFの通常の移
動度をヒトCNTFに付与するに充分である。

図２は、異なる組換えタンパク質の純度の測定結果を
示す。目視検査によれば、純度は、RPN189の60％から、
RPN228の90％を超える範囲内で変動する。

実施例2.改変型CNTF分子の結合活性の測定材料及び方法¹²⁵ I−CNTFの調製 0.2Mのホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）（37μｌ）
中の組換えラットCNTF（28μｇ）を、4mCi（2,000Ci/mm
ol;NEN）の¹²⁵I及び緩やかな窒素流下で乾燥した試薬
（Bolton及びHunter,1973,Biochem J.133:529−539）を
含むバイアルに移した。反応物を０℃で45分間、次いで
室温で15分間インキュベートし、0.2Mのグリシン溶液
（30ml）を加えて反応を停止した。15分後、0.08％のゼ
ラチンを含む0.2mlのPBSをさらに加え、混合物をSuperd
ex−75カラム（Pharmacia）に通して、二量体及び他の
多量体誘導体から標識単量体CNTFを分離した。薄層クロ
マトグラフィーにかけて測定すると、取り込み量は概し
て20％であり、比活性は一般に約1,000Ci/mmolであっ
た。単量体¹²⁵I−CNTFを４℃で貯蔵し、調製後１週間ま
でに使用した。構造及び配座の完全性試験として、¹²⁵I
−CNTF（約10,000cpm）を５μｇの非標識CNTFと混合
し、ネイティブなゲル電気泳動により分析した。クーマ
シー染色又はオートラジオグラフ法により、一つの大き
なバンドが見られた。さらに¹²⁵I−CNTFは、培養中のE8
ヒヨコ毛様体ニューロンの生存を支持する活性が天然CN
TFに類似し得るものであることを示した。

組織培養技術新生ラットの上位頚部神経節（SCG）をトリプシン
（0.1％）で処理、機械的に解離し、ポリ−オルニチン
（30μg/ml）基体上に於いた。成長培地は、10％熱不活
性化牛胎児血清（Hyclone）を含むHamの栄養混合物F1
2、神経成長因子（NGF）（100ng/ml）、ペニシリン（50
U/ml）及びストレプトマイシン（50μg/ml）から構成し
た。培養を、湿らせた95％空気/5％CO₂雰囲気下に37℃
で維持した。非ニューロン性神経節細胞を培養の１日目
及び３日目にaraC（10μＭ）で処理して取り出した。培
養物を２週間の期間中に３回／週フィードし、定期的に
結合検定に使用した。

MG87/CNTFRは、ヒトCNTFα受容体遺伝子に感染させた
線維芽細胞系である（Squintoら,1990,Neuron 5:757−7
66;Davisら,1991,Science 253:59−63）。

結合検定細胞の単層上で直接結合を行った。培養ウエル内の細
胞を、燐酸緩衝塩水（PBS;pH7.4）、0.1mMのバシトラシ
ン、1mMのP MSF、１μg/mlのロイペプチン及び1mg/mlの
BSAからなる検定緩衝液で一度洗浄した。¹²⁵I−CNTFを
用い、室温で２時間インキュベートした後、細胞を素早
く検定緩衝液で２度洗浄し、１％SDSを含むPBSで溶解、
Packard Gamma Counterで計測した。1,000倍過剰の非
標識CNTFの存在下に非特異結合を測定した。MG87/CNTFR
に対する特異結合は80〜90％であった。GRAPHPADプログ
ラム（ISI,Philadelphia,ペンシルバニア州）を用いて
データを分析した。

結果ラットSCGニューロンへの結合に関する¹²⁵I−ラットC
NTFに対する精製組換えヒトCNTF、ラットCNTF及びRPN21
9の競合曲線を図4aに示す。ラットCNTFもヒトCNTFもSCG
ニューロンに結合するために¹²⁵I−ラットCNTFと競合す
るが、ヒトCNTF（IC50＝25nM）は、¹²⁵I−ラットCNTF結
合を置換させる能力が、非標識ラットCNTF（IC50＝0.28
nM）の90分の１しかない。それに反してRPN219は、ラッ
トCNTFと殆ど同様な能力を有しており、明らかにヒトCN
TF（IC50＝0.3nM）より強力である。

ヒトCNTF受容体の発現を誘導するプラスミドに感染さ
せたマウスの線維芽細胞を用いた競合試験から同様な結
果が得られた（図4b）。ヒトCNTF、ラットCNTF及びRPN2
28はいずれも、MG87/CNTF細胞に結合するために¹²⁵I−
ラットCNTFと競合する。ヒトCNTF（IC50＝30nM）はラッ
トCNTF（IC50＝2.8nM）の12分の１の強さしかないが、R
PN228は明らかにヒトタンパク質（IC50＝5.6nM）より強
力である。

図１に示されている他の改変型CNTFタンパク質を用い
た結合競合試験も、R63を有するタンパク質はラットCNT
Fの生物学的活性を有するが、Q63を有するタンパク質は
ヒトCNTFの結合特性を有することを示した（データは示
さず）。これらの結果は、単一のアミノ酸置換（Q63→
Ｒ）が、ラットCNTFに特徴的な受容体結合特性をヒトCN
TFに付与するに充分であることを示している。

実施例3.改変型CNTF分子の生物学的活性の測定材料及び方法記載されている（Masiakwskiら,1991,同上）ように、
ヒヨコ毛様体神経節（CG）の解離培養上で組換えCNTFを
検定したが、生存細胞はMTTで染色された（Mosmann,T.1
983;J.Immunol.Methods 65:55−63）。

結果図３は、精製組換えヒトCNTF、ラットCNTF並びに改変
型CNTFタンパク質RPN219及びRPN228について、解離され
たE8ヒヨコ胚毛様体神経節ニューロン集積培養の用量−
応答曲線を示す。この検定によれば、キメラタンパク質
の生物学的活性は、精製組換えラットCNTFの生物学的活
性と見分けがつかず、組換えヒトCNTFより明らかに高い
生物学的活性を有している。さらに図３の用量−応答曲
線を比較すると、RPN219、RPN228又はラットCNTFで得ら
れた生存ニューロンの最大レベルは、ヒトCNTFで得られ
たものより高いことが示される。これらの結果は、ラッ
トCNTFと同様にRPN219及びRPN228が、より大きなニュー
ロン群に対してヒトCNTFより活性が高いことを示唆して
いる。並行実験で図１に示されている他の改変型CNTFタ
ンパク質の生物学的活性を調べた。いずれの場合にも、
（Q63→Ｒ）置換を保有する改変型CNTFタンパク質はラ
ットCNTFの生物学的活性を示したが、Q63を有するタン
パク質はヒトCNTFの活性を示した（データは示さず）。

全体としてこれらの結果は、単一のアミノ酸置換（Q6
3→Ｒ）が、ヒトCNTFにラットCNTFの生物学的活性を付
与するに充分であることを示している。

実施例4.光誘導光受容体損傷を防止するための改変型CN
TFの使用 F344又はSprague−Dawley株のAlbinoラットを２〜５
カ月齢で用いた。ラットを、一定の光を照射する前に９
日以上周期的光環境（25ft−ｃ未満のケージ内照明を12
時間点灯:12時間消灯）に維持した。ラットをケージの
床上60cmに吊り下げられた白色反射器を備えたGeneral
Electric社製の40ワット「白色」蛍光電球２個により
与えられた照明レベル115−200ft−ｃ（殆どのラットは
125−170ft−ｃを受けた）の一定の光で１乃至２週間照
射した。照射している間、ラットをステンレス鋼のワイ
ヤーバーカバーの付いた透明なポリカーボネイトケージ
内に維持した。

一定の光を照射する２日前に、ケタミン−キシラジン
混合物で麻酔したラットに、燐酸緩衝塩水（PBS）中に
0.1〜500ng/μｌの濃度で溶解した１μｌのラットCNT
F、ヒトCNTF又は改変型CNTF［hCNTF（Q63→Ｒ）］を硝
子体内に注入した。注入は、眼の鋸状縁と赤道の間のほ
ぼ中間にある強膜、脈絡膜及び網膜を通して32ゲージの
針を刺して行った。いずれの場合にも、眼の上半球内に
注入した。

一定の光を照射した直後に、過量の二酸化炭素を投与
し、その直後に混合アルデヒドを血管灌流させてラット
を殺した。１μｍの厚さに切断するために、眼をエポキ
シ樹脂中に包埋して、眼の垂直経線に沿って全網膜の切
片を作成した。０〜４＋病理学者レスキュースケール
（４＋が最大レスキュー且つほぼ標準的な網膜完全性で
ある）により光受容体レスキュー度を評価して、光誘導
網膜変性度を定量した。各切片の光受容体レスキュー度
を、同一ラットの対照眼との比較に基づいて４個体から
評定した。この方法は、ONL厚さのみならず、光受容体
の内部及び外部セグメントに対するより微妙な変性変
化、並びに眼内部の変性分布勾配を考慮するという利点
を有している。用量−応答曲線を作成するために各時点
につき３個の眼を調べた。

結果レスキュー度を、ヒトCNTF、ラットCNTF及びhCNTF（Q
63→Ｒ）について測定した。該データから、ラットCNTF
もhCNTF（Q63→Ｒ）も、光損傷モデルにおける光受容体
レスキュー度が組換えヒトCNTFの10倍も高いことが示さ
れた。

本発明を好ましい特定の実施態様と組み合わせて上記
に説明したが、該説明及び実施例は本発明の範囲を示し
はしても限定しないように意図されており、本発明の範
囲は添付の請求の範囲によって規定されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｂ０１Ｄ 57/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 1/21 5/00 Ｂ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡ 15/09 ＺＮＡＡＡＢＣ１２Ｐ 21/02 ＡＡＭＧ０１Ｎ 27/447 ＡＡＲ 33/68 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３０１Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】改変Gln63→Argを有するヒト毛様体神経栄
養因子（CNTF）。
【請求項２】RPN186（配列番号６）、RPN189（配列番号
９）、RPN218（配列番号11）、RPN219（配列番号12）、
RPN228（配列番号15）から選択される請求項１に記載の
改変型ヒト毛様体神経栄養因子（CNTF）。
【請求項３】請求項１に記載の改変型ヒトCNTFをコード
する、単離且つ精製されたDNA分子。
【請求項４】請求項２に記載の改変型ヒトCNTFをコード
する、単離且つ精製されたDNA分子。
【請求項５】組換えDNA分子中の表現調節配列に作動的
に結合された請求項３に記載のDNA分子を含む組換えDNA
分子。
【請求項６】組換えDNA分子中の発現調節配列に作動的
に結合された請求項４に記載のDNA分子を含む組換えDNA
分子。
【請求項７】請求項５又は６に記載の組換えDNA分子で
形質転換された単細胞宿主。
【請求項８】細菌、酵母及び他の菌類、動物細胞並びに
植物細胞から選択される請求項７に記載の単細胞宿主。
【請求項９】DNA分子が宿主により発現されるように請
求項５又は６に記載のDNA分子を含む組換え宿主を増殖
させ、発現された毛様体神経栄養因子タンパク質を単離
することを含む改変型CNTF分子を製造する方法。
【請求項１０】前記宿主が真核細胞である請求項９に記
載の方法。
【請求項１１】前記宿主が原核細胞である請求項９に記
載の方法。
【請求項１２】医薬上適する担体と共に請求項１又は２
に記載の改変型ヒトCNTFを含む神経系の疾患又は障害を
治療するための医療組成物。
【請求項１３】神経系の疾患又は障害を治療すべくヒト
又は動物の身体を治療する方法に使用するための請求項
１又は２に記載の改変型ヒトCNTF。
【請求項１４】前記疾患又は障害が変性疾患である請求
項13に記載の改変型CNTF。
【請求項１５】前記疾患又は障害が脊髄に関わる請求項
13に記載の改変型CNTF。
【請求項１６】前記疾患又は障害が運動ニューロンに関
わる請求項13に記載に改変型CNTF。
【請求項１７】前記疾患又は障害が、ベル麻痺のような
顔面神経の運動ニューロンに関わる請求項16に記載の改
変型CNTF。
【請求項１８】前記変性疾患が筋委縮性側索硬化症であ
る請求項14に記載の改変型CNTF。
【請求項１９】前記変性疾患が、末梢神経障害、アルツ
ハイマー病、パーキンソン病又はハンチントン舞踏病か
らなる群から選択される請求項14に記載の改変型CNTF。
【請求項２０】神経系の疾患又は障害が神経系に対する
損傷を含む請求項13に記載の改変型CNTF。
【請求項２１】前記損傷が、外傷、手術、梗塞、感染又
は悪性腫瘍によって引き起こされる請求項20に記載の改
変型CNTF。
【請求項２２】前記損傷が毒物にさらされることによっ
て引き起こされる請求項20に記載の改変型CNTF。
【請求項２３】神経系の疾患又は障害がコリン作用性ニ
ューロンに関わる請求項13に記載の改変型CNTF。
【請求項２４】前記疾患又は障害が筋委縮症に関わる請
求項13に記載の改変型CNTF。
【請求項２５】萎縮症が、除神経、慢性疲労、代謝性ス
トレス及び栄養失調から引き起こされる請求項24に記載
の改変型CNTF。
【請求項２６】萎縮症が、筋ジストロフィー症候群、先
天性筋障害、筋肉の炎症性疾患又は中毒性障害から引き
起こされる請求項24に記載の改変型CNTF。
【請求項２７】萎縮症が、神経外傷、末梢神経障害、薬
物若しくは毒物誘導損傷又は運動神経細胞障害から引き
起こされる請求項24に記載の改変型CNTF。
【請求項２８】前記疾患又は障害が海馬細胞に関わる請
求項13に記載の改変型CNTF。
【請求項２９】生物学的活性及び／又はヒトCNTF受容体
に対する結合親和性が増進した改変型ヒトCNTFタンパク
質のスクリーニング法であって、野生型ヒトCNTFタンパク質のSDS−PAGE電気泳動移動度
を決定し；前記野生型ヒトCNTFタンパク質にアミノ酸置換を導入
し；置換されたタンパク質の電気泳動移動度を野生型CNTFタ
ンパク質の電気泳動移動度と比較し；電気泳動移動度が変更された置換タンパク質を、野生型
タンパク質の電気泳動移動度と比較して同定し；同定されたタンパク質の生物学的活性及び／又はヒトCN
TF受容体に対する結合親和性を測定することを含む前記
方法。
【請求項３０】野生型ヒトCNTFタンパク質中で置換され
たアミノ酸配列が、異なる動物種の相同タンパク質のア
ミノ酸配列に相当する請求項29に記載の方法。
【請求項３１】野生型ヒトCNTFタンパク質に導入された
アミノ酸置換がGln63→Arg63に相当する請求項29又は30
に記載の方法。