DE69933699T2 - Verfahren zur produktion rekombinanter proteine in säugetierzellen durch co-expression mit fetuin - Google Patents

Verfahren zur produktion rekombinanter proteine in säugetierzellen durch co-expression mit fetuin Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der Genexpressionstechnologie und die Herstellung von Proteinen unter Verwendung von transformierten Wirtszellen und rekombinanten DNA-Vektoren.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung das Gebiet der effizienten Proteinherstellung in transformierten Säuger-Wirtszellen und Verfahren, Konstrukte und Wirtszellen um dies zu bewirken.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Effiziente Mittel zur Expression klonierter Gene als Proteinprodukt sind ein grundlegendes Werkzeug für die Identifizierung und Charakterisierung von klonierten Genen, für die Erzeugung von großen Mengen an Proteinen für eine Struktur-Funktionsanalyse und für die Herstellung von Proteinen zur Verwendung in medizinischen pharmazeutischen Präparaten.
  • Proteinexpressionssysteme sind in der Literatur beschrieben und finden sich beispielsweise in Nachschlagewerken wie Gene Expression Technology, Methods in Enzymology Bd. 185 (Hrsg. David Goeddel et al., Academic Press, Inc., London, 1991), Gene Structure and Expression, 2. Ausgabe, J.D. Hawkins (Cambridge University Press, London, 1991) und in dort zitierten Literaturstellen. Die Expression von einfachen Proteinen kann routinemäßig durchgeführt werden, unter Verwendung von geeigneten Escherichia coli-Expressionssystemen, diese Systeme sind jedoch typischerweise unzureichend für die Expression komplexer Säugerproteine. Säuger-Expressionssysteme sind zur Verwendung in Protein-Expressionssystemen entwickelt worden, diese Systeme erfordern jedoch komplexe Kulturmedien und die Haltung in Langzeit-Kultursystemen in großem Maßstab ist äußerst schwierig und teuer.
  • Die Anpassung von proteinproduzierenden Zelllinien an proteinarme oder serumfreie Medien war ein Verfahren zur Vereinfachung der abschließenden Reinigung des gewünschten Proteinprodukts, wie beispielsweise in US-Patent 4,757,005 beschrieben. Zahlreiche verbesserte Nährmedien und serumfreie Medien sind in den US-Patenten 5,143,842; 4,560,655; 5,024,947; 4,533,637; 4,767,704; 4,816,401; 5,631,159; 5,135,866 und in der Literatur beschrieben worden, wie beispielsweise in Hedlund und Miller „A Serum-Free Defined Medium Capable of supporting growth of four established human prostatic carcinoma cells lines" The Prostate 24:221-228 (1994). Verfahren für die Kultur von Säugerzellen sind ebenfalls beschrieben worden, wie beispielsweise in US-Patent 5,122,469 und in der Literatur. Kulturen in großem Maßstab und Proteinherstellungstechniken und Apparaturen sind ebenfalls beschrieben worden, wie in den US-Patenten 5,081,035 und 5,135,131 und in der Literatur.
  • Es ist somit im Fachbereich anerkannt, dass ein Bedarf für Säuger-Proteinexpressionssysteme und -verfahren besteht, und insbesondere für proteinfreie Säuger-Proteinexpressionssysteme, die für die Proteinproduktion in großem Maßstab geeignet sind. Dies gilt insbesondere angesichts der jüngsten Entdeckung und der Angst vor der Übertragung von Prionen und verwandten Erkrankungen aufgrund der Verwendung von Säugerproteinpräparaten, insbesondere Schaf- und Rinderproteinprodukten.
  • Die vorliegende Erfindung wendet sich diesem Anfordernis zu und beschreibt die unerwartete Entdeckung, dass Säuger-Wirtszellen für die effiziente Proteinexpression eines gewünschten Proteins angepasst werden können, indem die Wirtszelle für die Expression eines zusätzlichen Proteins transformiert oder co-transformiert wird, wobei das zusätzliche Protein entweder Alpha-2-HS-Glycoprotein oder ein Säuger-Fetuinprotein ist.
  • Der Einfachheit halber soll in der weiteren Beschreibung die Bezeichnung „Fetuin", wenn nicht anders angegeben, humanes Alpha-2-HS-Glycoprotein (AHSG) und sämtliche Säuger-Fetuinprotein-Äquivalente bedeuten, einschließlich und nicht begrenzt auf Rind, Maus, Schwein, Pferd und Ratte und deren Orthologe und Derivate.
  • Fetuin war das erste fötale Protein, das in fötalem Kälberserum charakterisiert wurde und es wurde herausgefunden, dass es homolog zu humanem Alpha-2-HS-Glycoprotein ist (Dziegielewska et al., 1993, „alpha-2-HS-glycoprotein is expressed at high concentration in human fetal plasma and cerebrospinal fluid", Fetal Diagn. Ther. 8:22-27). Das Alpha-2-HS- Glycoprotein wird vorrangig von Leber-Hepatozyten produziert und man nimmt an, dass es einer post-translationalen Modifikation unterliegt (Jahnen-Dechent et al., 1994, „Posttranslational processing of human alpha-2-HS-glycoprotein (human fetuin)" Eur. J. Biochem. 226:59-69). Es wurde gefunden, dass die Cystatin-artige Domäne von murinem Countertrypsin Trypsin hemmt (Yoshida et al., 1996, „Cystatin-like domain of mouse countertrypsin, a member of mammalian fetuin family, is responsible for the inhibition of trypsin", Biochemistry and Molecular Biology International 39(5):1023-1028). Es wurde gefunden, dass Fetuin/Alpha-2-HS-Glycoprotein während der Embryogenese exprimiert wird und die Knochenumgestaltung fördert und die Zellproliferation anregt und außerdem als Antagonist auf die antiproliferative Wirkung von transformierendem Wachstumsfaktor Beta1 (TGF-β1) wirkt (Demetriou et al., 1996, „Fetuin/alpha-2-HS-glycoprotein is a transforming growth factor-β Type II receptor mimic and cytokine antagonist", J. Bio. Chem. 271(22):12755-12761). Es wurde gefunden, dass Ratten-Phosphofetuin (phosphoryliertes Fetuin) die Hepatozyten-HGF-Aktivität moduliert (Ohnishi et al., 1997, „Effect of phosphorylated rat fetuin on the growth of hepatocytes in primary culture in the presence of human hepatocyte-growth factor". Eur. J. Biochem. 243:753-761).
  • Fetuin als Bestandteil von fötalem Kälberserum wurde als ein Bestandteil von Kulturgrundmedium identifiziert, wie beispielsweise in US-Patent 4,757,005 und 5,143,842. Erst die vorliegende Erfindung entdeckte jedoch, dass die Transformation von Wirtszellen für die Expression von Fetuin in Verbindung mit der Expression eines gewünschten Proteinprodukts die effiziente Expression des gewünschten Proteins und die vereinfachte Überleitung der transformierten Wirtszellen auf ein serumfreies oder proteinreduziertes Kultursystem ermöglicht, was eine Produktion von Proteinen in großem Maßstab ermöglicht.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die grundlegende Entdeckung, dass eine effiziente Expression eines gewünschten Proteins bewerkstelligt werden kann, indem eine Säuger-Wirtszelle verwendet wird, die auch Fetuinprotein exprimiert. Eine solche transformierte Wirtszelle, die Fetuin und ein gewünschtes Protein exprimiert, ist somit geeignet für die Anpassung an eine serumfreie oder proteinarme Proteinproduktion in einer Kultur in großem Maßstab. Das Fetuin der vorliegenden Erfindung umfasst humanes Alpha-2-HS-Glycoprotein (AHSG) und alle Säuger-Fetuinprotein-Äquivalente, einschließlich und nicht begrenzt auf Rind, Maus, Schwein, Pferd und Ratte, deren Orthologe und Derivate. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Fetuin entweder humanes oder bovines Fetuin, oder Orthologe und Derivate davon.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst die effiziente Expression eines gewünschten Proteins in sämtlichen Säugerzellkultursystemen, einschließlich und nicht begrenzt auf großmaßstäbliche, serumfreie, Hohlfaser-, Suspensionskultur, Adhäsionskultur-, Fermentationskultur- und kleinmaßstäbliche Proteinexpression. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf proteinarme oder serumfreie Expressionssysteme gerichtet.
  • Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten Säuger-Wirtszellen beinhalten und sind nicht begrenzt auf CHO-Zellen, HeLa-Zellen und andere Säugerzellen, die für die Expression von rekombinanten Proteinen angepasst sind. Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten Säuger-Wirtszellen können solche Zellen sein, die normalerweise Fetuin exprimieren und somit für eine solche Expression selektiert sind, für eine höhere Expression selektiert sind oder an eine solche Expression angepasst sind. Solche bereits vorhandenen Fetuin-exprimierenden Zellen werden modifiziert, um höhere Mengen an Fetuin zu exprimieren, als normalerweise produziert werden, mittels genetischer Manipulation des endogenen Genoms oder mittels Transfektion mit einem oder mehreren geeigneten Expressionsvektor(en). Die Säuger-Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können normalerweise nicht-exprimierend für Fetuin sein und werden gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung transformiert, um Fetuin zu transformieren. Die Transformation von geeigneten Wirtszellen für die Expression von Fetuin kann durch Transformation mit einem geeigneten Expressionsvektor, der ein exogenes Fetuingen enthält, erreicht werden.
  • Das gewünschte Proteinprodukt kann von den Fetuin-angepassten Wirtszellen exprimiert werden, mittels Standardexpressionsvektoren oder durch die Manipulation des Wirtszellgenoms, um ein gewünschtes Protein zu integrieren und zu exprimieren. Es ist außerdem möglich, einen Expressionsvektor zu konstruieren, der sowohl Fetuin als auch das gewünschte Protein exprimiert. In einem solchen Fall können das Fetuingen und das Gen für das gewünschte Protein unter Kontrolle entweder desselben oder unterschiedlicher Promotor/Enhancer-Systeme stehen. Es ist nicht außerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung, Fetuin-gewünschtes Protein Fusionsprodukte für die Expression zu erzeugen.
  • Ebenfalls offenbart ist ein verbesserter Säuger-Expressionsvektor für rekombinanten humanen glialen Wachstumsfaktor 2 (GGF 2) und die mit einem solchen Vektor transformierten GGF2-Zelllinien CHO (dhfr–/GGF2). Die vorliegende Erfindung umfasst CHO (dhfr–/α2HSGP/GGF2), die zu stabilen und erhöhten Sekretionsmengen an GGF2 in der Lage sind, und ein proteinfreies Produktionsverfahren für GGF2 durch kontinuierliche Perfusion der erfindungsgemäßen Zellen in einem Fermenter.
  • Somit umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines gewünschten Proteins aus einer Säuger-Wirtszelle, wobei das Verfahren umfasst: Transformieren einer Säuger-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, Transformieren der selben Säuger-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein exprimierbares Gen enthält, welches für das gewünschte Protein kodiert, wobei die Säuger-Wirtszelle Säuger-Fetuin und das gewünschte Protein exprimiert, Expandieren der transformierten Wirtszellen in Kultur und Isolieren des gewünschten Proteins aus der Kultur. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren, bei dem der Vektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, oder der Expressionsvektor, der ein exprimierbares Gen enthält, welches für ein gewünschtes Protein kodiert, auch ein Gen enthält, das für einen selektierbaren Marker kodiert. Es ist außerdem vorgesehen, dass der Expressionsvektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, auch ein exprimierbares Gen enthält, welches für ein gewünschtes Protein kodiert. Die vorliegende Erfindung umfasst einen Expressionsvektor, umfassend: Einen Promotor, eine kodierende Sequenz für Fetuin, wobei die kodierende Sequenz mit dem Promotor funktionsfähig verknüpft ist, eine Intron-Sequenz, wobei sich die Intron-Sequenz stromabwärts des Promotors und stromaufwärts der für Fetuin kodierenden Sequenz befindet, wobei die Intron-Sequenz zwei identische Donorstellen und eine Akzeptorstelle umfasst, und eine kodierende Sequenz für ein heterologes Protein, wobei die kodierende Sequenz mit einem Promotor funktionsfähig verknüpft ist.
  • Es ist vorgesehen, dass die Reihenfolge der Transformation einer Zielwirtszelle bei der Verwendung von zwei Expressionsvektoren derart sein kann, dass die Säuger-Wirtszelle zuerst mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält. Es ist somit in den Verfahren der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass eine Zielwirtszelle zuerst mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der ein exprimierbares Gen enthält, welches für ein gewünschtes Protein kodiert.
  • So umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Säuger-Wirtszelle für die Produktion eines gewünschten Proteins von einem rekombinanten DNA-Expressionsvektor in der Säuger-Wirtszelle, wobei das Verfahren umfasst: Transformieren einer Säuger-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, und Transformieren der selben Säuger-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein exprimierbares Gen enthält, welches für ein gewünschtes Protein kodiert. Ebenfalls vorgesehen ist ein solches Verfahren, in dem der Vektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, oder der Expressionsvektor, der ein exprimierbares Gen enthält, welches für ein gewünschtes Protein kodiert, auch ein Gen enthält, das für einen selektierbaren Marker kodiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Wirtszelle vorgesehen, bei dem der Expressionsvektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, auch ein exprimierbares Gen enthält, welches für ein gewünschtes Protein kodiert, und bei dem der Expressionsvektor ein Gen enthält, welches für einen selektierbaren Marker kodiert. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von transformierten Wirtszellen betrifft ein Verfahren, bei dem die Säuger-Wirtszelle zuerst mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, oder ein Verfahren, bei dem die Säuger-Wirtszelle zuerst mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der ein exprimierbares Gen enthält, welches für ein gewünschtes Protein kodiert.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind Wirtszellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind. Insbesondere umfasst die Erfindung eine Säuger-Wirtszelle für die Expression eines gewünschten Proteins in Zellkultur, worin die Wirtszelle mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, und worin die Wirtszelle weiter mit einem zweiten Expressionsvektor transformiert ist, der ein exprimierbares Gen enthält, das für ein gewünschtes Protein kodiert. Ebenfalls vorgesehen und von der vorliegenden Erfindung umfasst ist eine Säuger-Wirtszelle für die Expression eines gewünschten Proteins in Zellkultur, worin die Wirtszelle mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen und ein exprimierbares Gen enthält, das für ein gewünschtes Protein kodiert.
  • Um eine effiziente Transformation von Wirtszellen zu begünstigen, ist es vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren die Verwendung eines Expressionsvektors beinhalten können, der außerdem ein Gen enthält, welches für einen selektierbaren Marker kodiert.
  • In einem bestimmten Aspekt umfasst die Erfindung die oben beschriebenen Verfahren und Wirtszellen, wobei der Expressionsvektor, der ein Fetuingen enthält, der Expressionsvektor pSV-AHSG ist. Eine bestimmte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Verfahren und Wirtszellen wie oben beschrieben, wobei der Expressionsvektor, der ein Gen, das für ein gewünschtes Protein kodiert, enthält, pCMGGF2 ist und wobei das gewünschte Protein humaner glialer Wachstumfaktor 2 (GGF2) ist.
  • In einer bestimmten Erfindungsform verwendet die Erfindung die Fetuin-adaptierte Wirtszelle CHO-αHSGP und Abkömmlinge oder Derivate davon.
  • Somit verwendet die Erfindung in einem bestimmten Aspekt insbesondere den Expressionsvektor pSV-AHSG und den Expressionsvektor pCMGGF2.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen und Konstrukte sind mit Bezug auf die folgenden Figuren besser verständlich, in denen:
  • 1 ein Diagramm ist, welches einen Expressionsvektor für humanes Alpha-2-HS-Glycoprotein veranschaulicht (Expressions-SEQ ID Nr.: 5, kodiert für ein Humanfetuinorthologes Protein SEQ ID Nr.: 6), pSV-AHSG.
  • 2 ist ein Diagramm, welches einen verbesserten GGF2-Expressionsvektor pCMGGF2 veranschaulicht.
  • 3 ist ein Diagramm, welches die effiziente proteinfreie Produktion von GGF2 veranschaulicht, unter Verwendung eines kontinuierlich perfundierten Fermenters und mit dem Vektor pCMGGF2-transformierten CHO-Wirtszellen.
  • 4A zeigt eine lineare Karte des CMV-Promotors, eine 5'-Intron-Sequenz (MIS) und HpaI-Klonierungsstelle. Die parallele Karte zeigt die Lokalisierung des 177 bp Introns innerhalb der MIS-Sequenz.
  • 4B zeigt die Nukleotidsequenz von MIS (SEQ ID Nr.: 11). Gekennzeichnet sind die von EBV abgeleitete Nukleotidsequenz (eckige Klammern) und ihre beiden Donorstellen (Klammer-auf-Symbol) und eine Akzeptorstelle (Klammer-zu-Symbol). Die wiederholten Sequenzen (2 x 71 bp) sind unterstrichen (dünn und dick).
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfasst die unerwartete Entdeckung, dass Säuger-Wirtszellen für eine effiziente Proteinexpression eines ersten gewünschten Proteins angepasst werden können, durch Transformation der Wirtszelle für die Produktion eines ersten Proteins, worin das erste Protein entweder Alpha-2-HS-Glycoprotein oder Säuger-Fetuin ist. Die erfindungsgemäßen Verfahren, Konstrukte und Wirtszellen sind geeignet für die Produktion eines gewünschten Proteins in Standard-Kultursystemen in kleinem Maßstab sowie für Produktionssysteme in großem Maßstab, einschließlich und nicht begrenzt auf Fermentationssysteme, Hohlfaserkultursysteme, Bechersysteme und Suspensionskultursysteme.
  • Protokolle und Verfahren für die Manipulation von Nukleinsäuren, PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren, Konstruktion von Expressionsvektoren, Transformation von Wirtszellen und die Kultur von transformierten Zellen für die Produktion von Proteinen sind im Fachbereich bekannt und in einer Vielfalt von Laborhandbüchern oder Texten zu finden, siehe allgemein Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1992 Short Protocols in Molecular Biology, 2. Ausgabe, John Wiley & Son; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology Bd. 185 (Hrsg. David Goeddel et al., Academic Press, Inc., London, 1991); Gene Structure and Expression, 2. Ausgabe, J. D. Hawkins (Cambridge University Press, London, 1991); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990, Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2. Ausg. (R. I. Freshney, 1987, Liss, Inc. New York, NY); Methods in Molecular Biology (Bd. 7), Gene Transfer and Expression Protocols (Hrsg. E. J. Murray, 1991, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.); Ramsay, M., Yeast Artificial Cloning, 1994, Molec. Biotech. 1: 181-201; und Smith, et al. 1990. Amplification of large artificial chromosomes Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8242- 8246.
  • Die Erfindung und viele ihrer Aspekte sind durch die Veranschaulichung in den folgenden Beispielen besser verständlich.
  • Beispiel 1: Fetuinexpression und Wirtszellen
  • Unter Verwendung eines für die Transfektion von Säugerzellen geeigneten Expressionsvektors wurde eine Nukleinsäuresequenz der SEQ ID Nr: 5, die für ein humanes Fetuingen-Orthologon kodiert, funktionsfähig insertiert und der vollständige Vektor wurde in CHO-Wirtszellen transformiert. Ein Beispiel für einen erfindungsgemäßen Fetuin-Expressionsvektor ist pSV-AHSG (1). Ein geeigneter Ausgangs-Expressionsvektor ist ein Vektor, der dazu geeignet wäre, die Insertion eines gewünschten Fetuingens aufzunehmen, so dass es funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor/Enhancer-System verknüpft ist. AHSG wurde mittels Reverse Transkriptase-PCR-Techniken (RT-PCR) kloniert, unter Verwendung von humaner Leber-mRNA (Clonetech, Palo Alto, CA). Die Sequenzen für die PCR-Primer waren: 1) 5'-CCT CCA ACC ACC TGC ACG CC (SEQ ID Nr.: 7) und 2) 5'-GTG GCT ATG TTT TCT GTG CC (SEQ ID Nr.: 8).
  • Um eine effiziente Selektion und Aufrechterhaltung einer stabilen Transformation zu ermöglichen, kann der bevorzugte geeignete Expressionsvektor ein oder mehrere Gene für selektierbare Marker enthalten, beispielsweise ein Antibiotikaresistenz-Gen oder ein ansonsten erforderliches metabolisches Protein, bei Kombination mit einer geeigneten defizienten Wirtszelle. Ein geeigneter Expressionsvektor kann eine Nukleinsäure enthalten, die für ein beliebiges geeignetes Säuger-Fetuin kodiert, beispielsweise Rinder-Fetuin, murines Fetuin, Schweine-Fetuin, Pferde-Fetuin oder Ratten-Fetuin. Die für Säuger-Fetuin kodierenden Nukleinsäuresequenzen sind im Fachbereich bekannt und aus der GenBank-Datenbank erhältlich, einschließlich Human (#36317), Ratte BSP (#89822), Ratte pp63 (#92482), Ratten-Fetuin (#94301), Rinder-Fetuin (#101386), Ovis Widder-Fetuin (#104788) und S. Scrofa-Fetuin (#101386). Bevorzugte Fetuin-Gene sind Human (#36317) (SEQ ID Nr. 3) und Rinder-Fetuin (#101386) (SEQ ID Nr. 1), deren Homologe und Orthologe, wie beispielsweise die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 5.
  • Geeignete Säuger-Wirtszellen werden anschließend mit einem Fetuin-Expressionsvektor transformiert und für eine stabile Transfektion selektiert. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Ausgangszellen CHO-Zellen, und nach Transfektion haben sie den Phänotyp (dhfr–/α2HSGP).
  • Geeignete Wirtszelllinien, in denen eine konstitutive Expression von Fetuin erfolgt, ermöglichen eine gesteigerte Proteinexpression von einem Expressionsvektor. Eine konstitutive Expression von Fetuin kann erfolgen durch aufeinander folgende Transfektion von Wirtszellen mit einem Expressionsvektor, der ein Fetuingen enthält; Screening und Selektion von transformierten Zellen, die Fetuin-Protein exprimieren; anschließend Transfektion der selektierten Zellen (oder von Abkömmlinge davon) mit einem Expressionsvektor, der ein Gen oder Gene des gewünschten zu exprimierenden Proteins oder der Proteine enthält.
  • Ein bevorzugtes Verfahren beinhaltet die Co-Transfektion von Wirtszellen mit separaten Expressionsvektoren, wobei ein Vektor für ein Fetuingen kodiert und der andere Vektor oder Vektoren für ein oder mehrere gewünschte Proteine kodieren. Ein durchschnittlicher Fachmann weiß jedoch, wie kombinierte Expressionsvektoren konstruiert werden können, worin ein Fetuingen von dem selben Vektor exprimiert wird, der für ein oder mehrere gewünschte Proteine kodiert und diese exprimiert. Eine weitere Permutation der Erfindung beinhaltet die Co-Transfektion eines solchen kombinierten Fetuin-/Protein-Expressionsvektors mit einem oder mehreren zusätzlichen Expressionsvektoren, die für das gewünschte Protein/die gewünschten Proteine kodieren.
  • Wie ein Fachmann erkennen wird, können verschiedene Permutationen der vorliegenden Erfindung erzeugt und ohne übermäßigen Aufwand verwendet werden.
  • Wenn die transformierten Wirtszellen festgestellt wurden, ist es möglich, solche transformierten Wirtszellen weiter zu screenen und zu selektieren, im Hinblick auf zusätzliche phänotypische Eigenschaften, wie beispielsweise die Proteinexpressionsmenge, Wachstumsrate und Wachstumsbedingungen wie Temperatur, Anforderungen an das Medium und Eignung für das Wachstum in proteinarmen oder serumfreien Medien.
  • Insbesondere können CHO-Zellen mit Plasmid psV-AHSG transformiert werden, was zu der Fetuin-adaptierten Wirtszelle CHO-α2HSGP (CHO-Phänotyp dhfr–/α2HSGP) führt.
  • Beispiel 2: Rekombinanter humaner glialer Wachstumsfaktor (GGF2)
  • Obwohl die Ätiologie von Multiple Sklerose (MS) unbekannt bleibt, beruhten Behandlungsstrategien für diese Entmarkungserkrankung auf der Modulierung der immunologischen Ereignisse, welche die Bildung von MS-Läsionen begleiten (Waubant EL, Oksenberg JR und Goodkin DE. 1997. Pathophysiology of multiple sclerosis lesions. Science & Medicine 4: 32-41). Beta-Interferon ist einer der Immunmodulatoren, der erfolgreich eingesetzt wurde, um rezividierende Formen von MS zu behandeln. Andere Faktoren, wie beispielsweise mitogene Wachstumsfaktoren für Oligodendrozyten sind als eine der jüngsten Behandlungsstrategien für MS bezeichnet worden. Man vermutete, dass das therapeutische Potenzial dieser neurotrophischen Faktoren die Remyelinisation fördert. Rekombinanter humaner glialer Wachstumsfaktor (GGF2) ist einer dieser Faktoren mit nachgewiesenen stimulatorischen Wirkungen auf Schwann-Zellen und Oligodendrozyten (Mahanthappa NK, Anton ES und Matthew WD. 1996. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. J. Neuroscience 16: 4672-46839). Ein Verfahren für die Herstellung von GGF2 zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Entmarkung im peripheren oder zentralen Nervensystem wurde in US-Patent 5,530,109 beschrieben.
  • Unter Verwendung des Expressionsvektors und der Produktionszelllinien, die in US-Patent 5,530,109 beschrieben wurden, wurde ihre Produktivität untersucht. Zu unserer Überraschung weisen diese Zelllinien eine eher geringe spezifische Produktivität auf (0,5-1 pg/c/d) und sind instabil. Anschließend versuchten wir erfolglos, unter Verwendung dieses Vektors hoch produktive Zelllinien zu gewinnen. Die Transfektionseffizienz war so gering, dass die Selektion in Methotrexat aus 14 Millionen Zellen nur eine Transformante ergab.
  • Um stabile Zelllinien mit einer hohen Produktivität für GGF2 zu gewinnen, wurde ein verbesserter Vektor konstruiert. Die Gewinnung von Produktionszelllinien wurde in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters durchgeführt, in CHO (dhfr–)- und CHO (dhfr–/α2HSGP)-Zellen unter Verwendung der verbesserten Vektoren. Die Selektion von hoch produktiven Zellen wurde in verschiedenen Konzentrationen von Methotrexat durchgeführt. Proteinfreie Klone wurden durch allmähliche Entwöhnung der Zellen von Serumproteinen gewonnen. Die spezifische Produktivität dieser Klone liegt im Bereich von 20-30 pg/c/d. Proteinfreie Bedingungen können definiert werden als Abwesenheit von im Wesentlichen allen humanen und tierischen Serum- und Plasma-Proteinen im Kulturmedium, wobei diese Proteine in Spuren vorhanden sein können, allerdings noch ergänzt mit humanem Insulin. Es ist bevorzugt, dass es sich bei dem ergänzenden Insulin um rekombinantes humanes Insulin handelt.
  • Beispiel 3. Konstruktion von GGF2-Expressionsvektoren
  • Für eine effiziente Transkription wurde die EBV BMLF-1 Zwischensequenz (MIS, eine 5'-Intron-Sequenz; 5'-IS) unmittelbar stromaufwärts der GGF2 cDNA und stromabwärts des Promotors insertiert. Spezifische Verfahren und Beispiele für die Erzeugung von Vektoren wie pSM97 sind in US-Patent 5,854,021 beschrieben (vor kurzem erteilte Anmeldung Nr 08/807,415, eingereicht am 28. Februar 1997).
  • Die MIS-Sequenz wurde durch Polymerasekettenreaktions (PCR)-Amplifikation des Epstein-Barr-Virus (EBV)-Leserahmen mit der Bezeichnung BMLF1 erzeugt. Diese MIS-Sequenz umfasst die DNA-Sequenz von 84.105 bis 84.262 des B95-8-Epstein-Barr-Virus, einschließlich einer Intron-Sequenz von 84.122 bis 84.227 von B95-8 EBV (Farrell, Advances in Viral Oncology, Bd. 8, Hrsg. G. Klein, Raven Press, Ltd., New York, 1989; Genbank-Access #X00784).
  • Zwei PCR-Primer, 1) 5'-GGATCGATAACTAGCAGCATTTCCT-3' (SEQ ID Nr.: 9) und 2) 5'-GGGTTAACTTCCAGAATGTGGCTCT-3' (SEQ ID Nr. 10) weisen verlängerte Restriktionsenzym-Schnittstellen für ClaI (ATCGAT) und HpaI (GTTAAC) an den 5'- bzw. 3'-Enden auf, für die Amplifikation und anschließende gerichtete Klonierung des MIS-Fragments. Selbstverständlich können andere geeignete Restriktionsschnittstellen entworfen werden.
  • Unter Verwendung von Expressionsvektor pCIS-F8 mit einer stabilisierenden Sequenz (CIS bezeichnet) stromabwärts eines Promotors und stromaufwärts der für Faktor VIII kodierenden DNA ( EP 0260148 , veröffentlicht 17. Sep. 1987) als Ausgangskonstrukt wurde das oben beschriebene, mit HpaI und ClaI verdaute PCR MIS-Fragment in die ClaI/HpaI-Schnittstelle von pCIS-F8 insertiert (nach Entfernung der Faktor VIII-Gensequenz). Das resultierende Plasmid, welches MIS enthielt, wurde als pSM95 bezeichnet. Diese MIS-Sequenz (5'-IS) unterscheidet sich von der ursprünglichen EBV-Sequenz dadurch, dass sie einen unerwarteten Repeat einer 71 bp Sequenz, welche eine Donorstelle enthält, aufweist. Diese neue MIS-Sequenz (5'-IS, 229 bp) weist zwei Donorstellen und eine Akzeptorstelle auf (siehe 4).
  • Die Intron-Sequenz CIS wurde von pSM95 durch SacII/ClaI-Verdau entfernt. Das verbleibende Rückgrat wurde mittels Klenow an den Enden geglättet und religiert. Dieses resultierende Plasmid, pSM97, besteht aus einem CMV-Promotor/Enhancer (CMVe/p), MIS, einer einzigen HpaI-Schnittstelle für die Klonierung, einem Poly-A-Signal und einem SV40 Frühen Promotor-dhfr in einem Plasmidrückgrat, das Ori- und Ampr-Gen enthält. Der Verdau des Plasmids pCGIG-HBS5 (US-Patent 5,530,109) mit EcoRI setzte die rekombinante humane GGF2-cDNA frei, an den Vektor pSM97 an der einzigen HpaI-Schnittstelle die Blunt-End ligiert war. Das resultierende Konstrukt wird als pCMGGF2 bezeichnet (2).
  • Beispiel 4. Gewinnung von GGF2-Zellklonen
  • Transfektionen.
  • CHO (dhfr–)- und CHO (dhfr–/α2HSGP)-Zellen wurden mit Plasmid-DNA transfiziert, unter Verwendung des kationischen Lipid-DMRIE-C-Reagens (Life Technologies # 10459-014). Dreifache Wells einer 6-Well-Platte wurden für jede Plasmid-DNA, die in CHO (dhfr–) oder CHO (dhfr–/α2HSGP) transferiert wurde, verwendet. In jedem Well einer 6-Well-Platte wurden 10 μl an DMRIE-C-Reagens mit 2-5 μg an pCMGGF2-DNA in 0,5 ml serumfreiem DMEM-F12-Medium vermischt. Die Platte wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, um die Bildung der Lipid-DNA-Komplexe zu ermöglichen. Subkonfluente Zellen aus einem T-75 cm2-Kolben wurden trypsinisiert mit 0,5 ml 1XTrypsin-EDTA verdünnt in PBS (GibcoBRL # 15400-054), gestoppt mit 5 ml Wachstumsmedium, einmal mit PBS gewaschen, und resuspendiert in serumfreiem DMEM-F12-Medium auf 107 Zellen/ml. Anschließend wurden zu jedem Well 2x106 logarithmisch wachsende Zellen in 0,2 ml serumfreiem Medium zugegeben und anschließend wurde die Platte für 4-5 Stunden bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubiert. Zu jedem Well wurden 2 ml Wachstumsmedium mit 5 % definiertem FBS hinzugefügt. Die Zellen wurden 48 bis 72 Stunden nach Transfektion mittels ELISA auf transiente Expression untersucht.
  • Arzneistoffselektion und Genamplifikation
  • Zwei bis drei Tage nach der Transfektion wurden Zellen aus den dreifachen Wells pro Transfektion trypsinisiert, zusammengefasst und einmal mit serumfreiem Medium gewaschen. Die lebensfähigen Zelldichten wurden durch das Trypan Blue-Ausschlussverfahren bestimmt, anschließend in 96-Well-Platten in 5 % dialysiertem FBS, 50 nM Methothrexatselektionsmedium geimpft. Nach dem Screening nach GGF2-sekretierenden Populationen mittels ELISA wurden direkte Selektions- und Amplifikationsschritte in zunehmenden Konzentrationen an Methotrexat durchgeführt (100 nM, 200 nM, 400 nM, 1 μM) in Intervallen von 4-6 Wochen in einem 6-Well-Format mit 3 ml Selektionsmedium pro Well.
  • Grenzverdünnungsklonierung (LDC)
  • Einzelne Zellklone (SCC) wurden durch LDC erhalten, mit einer Zelle in 200 μl Medium pro Well eines 96-Well-Formats in arzeistofffreiem Selektionsmedium, welches 1 dialysiertes FBS enthielt. Die Kulturen wurden einmal pro Woche gefüttert. Nach zwei Wochen wurden die Platten durch Phasenmikroskopie hinsichtlich des Einzelzellwachstums bewertet und anschließend erfolgte ELISA-Screening.
  • Andere geeignete Verfahren und Konstrukte für die Selektion von transfizierten Zelllinien zur heterologen Proteinexpression sind in der Literatur und beispielsweise in US-Patent 5,612,213 beschrieben.
  • GGF2-ELISA
  • Ein Sandwich-Immunassay für den Nachweis von rhGGF2 in Gewebekulturüberständen wurde unter Verwendung von herkömmlichen Vorgehensweisen durchgeführt (siehe allgemein Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1992 Short Protocols in Molecular Biology, 2. Ausgabe, John Wiley & Son; Rose et al., 1986 Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3. Ausgabe, American Society of Microbiologists for suitable immunoassay protocols and methods). Bei Zugabe von Substrat kann die Menge an Antikörper Antigen-Peroxidase-konjugiertem Antikörperkomplex mittels Spektrophotometrie gemessen werden. Die Proben können mit einer Standardkurve der Absorption gegen die rhGGF2-Konzentration verglichen werden.
  • Beispiel 5. Anpassung an proteinfrei und Bewertung der Zellklone
  • Die selektierten GGF2-Klone wurden durch schrittweise zweifache Verdünnung in einem Schüttelkolben von 1 % FBS entwöhnt. Klon F10-B3, der stärkste Produzent mit einer spezifischen Produktivität von 20 pg/c/d, wurde in einem 1,5-Liter-Fermenter unter Verwendung des Produktionsgrundmediums an den proteinfreien Zustand angepasst. Das proteinfreie Produktionsgrundmedium ist ein angereichertes DMEM-F12-Medium, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 100 μM CaCl2, 250 μM L-Histidin, 50 μM FeSO4/EDTA, 2 g/L NaHCO3, 10 μg/ml rekombinantem humanem Insulin und 0,1 % Pluronic F68 (Tabelle 1). Das Medium behält einen pH-Bereich von 7,0-7,3 und einen Osmolaritätsbereich von 280-300 bei.
  • Tabelle 1 Transfektionseffizienz von GGF2-Expressionsvektoren
    Figure 00150001
  • Beispiel 6. Herstellung von GGF2
  • Ein kontinuierliches proteinfreies Herstellungsverfahren für GGF2 wurde entwickelt, indem ein 1,5-Liter-Fermenter mit Klon F10-B3-Zellen beimpft wurde, unter Verwendung des oben beschriebenen Produktionsgrundmediums. Die Zelldichte in dem Fermenter wurde bei ~ 2 x 106 Zellen/ml gehalten und mit einer Rate von 0,5 Liter/Tag perfundiert. Wie in 3 gezeigt, produzierten die Zellen während des 34-tägigen Produktionszeitraums andauernd hohe Mengen an GGF2. Es wurde ein Titer von 240 mg/Liter/Tag beobachtet. Dieses kontinuierliche Perfusionsverfahren kann leicht an große Fermenter angepasst werden (200- bis 500-Liter), die mit Zellretentionsvorrichtungen wie beispielsweise Settlern ausgestattet sind. Beispielsweise kann bei Verwendung eines 10-Liter-Fermenters in einem Zeitraum von 60 Tagen > 40 g an GGF2 hergestellt werden, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Konstrukte.
  • Der in US-Patent 5,530,109 beschriebene Vektor pCDIG-HBS5 des Stands der Technik weist sehr geringe Transfektionseffizienzen auf. Von diesem Vektor erzeugte CHO (GGF2)-Klone weisen nicht nur eine geringe spezifische Produktivität (0,5-1,0 pg/c/d) unter serumfreien Bedingungen auf, sondern sie sind außerdem instabil. Überraschenderweise fördert das verbesserte erfindungsgemäße Plasmid pCMGGF2 eine stabile und hohe Expression von GGF2 und eine effiziente Selektion und Amplifikation des dhfr-Gens bei Methotrexatselektion und -Amplifikation. Die mit dem verbesserten Vektor gewonnenen Klone zeigen eine stabile GGF2-Expression und eine hohe spezifische Produktivität (20-30 pg/c/d) unter proteinfreien Bedingungen.
  • Die Produktivität von verschiedenen Zelllinien wurde weiter verglichen. Die nachstehende Tabelle 2 vergleicht die Produktivität von CHO- und CHO-α2HSGP-Zellen, welche GGF2 unter serumfreien Bedingungen exprimieren. Überraschenderweise war die spezifische Produktivität von serumfreien Klonen, die für die Fetuinexpression angepasst waren, 2-8-mal höher als bei regulären CHO-Zellen.
  • Tabelle 2 Erhöhte Produktion von GGF2 in CHO-Zellen – Konstitutive Expression von Fetuin
    Figure 00160001
  • Figure 00170001
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  • Figure 00270001

Claims (13)

  1. Verfahren zum Isolieren eines gewünschten Proteins aus einer Säuger-Wirtszelle, wobei das Verfahren umfasst: Transformieren einer Säuger-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, Transformieren derselben Säuger-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein exprimierbares Gen enthält, welches für das gewünschte Protein codiert, wobei die Säuger-Wirtszelle Säuger-Fetuin und das gewünschte Protein exprimiert, Expandieren der transformierten Wirtszellen in Kultur, und Isolieren des gewünschten Proteins aus der Kultur.
  2. Verfahren zur Herstellung einer transformierten Säuger-Wirtszelle zur Herstellung eines gewünschten Proteins mittels eines rekombinanten DNA-Expressionsvektors in der Säuger-Wirtszelle, wobei das Verfahren umfasst: Transformieren einer Säuger-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, und Transformieren derselben Säuger-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein exprimierbares Gen enthält, welches für ein gewünschtes Protein codiert.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Vektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, oder der Expressionsvektor, der ein exprimierbares Gen enthält, welches für ein gewünschtes Protein codiert, auch ein Gen enthält, das für einen selektierbaren Marker codiert.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Expressionsvektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, auch ein exprimierbares Gen enthält, das für ein gewünschtes Protein codiert.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Expressionsvektor ein Gen enthält, das für einen selektierbaren Marker codiert.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Säuger-Wirtszelle zuerst mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, oder worin die Säuger-Wirtszelle zuerst mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der ein exprimierbares Gen enthält, das für ein gewünschtes Protein codiert.
  7. Verfahren zur Herstellung einer Säuger-Wirtszelle zur Expression eines gewünschten Proteins in Zellkultur, umfassend: Transformieren der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen und ein exprimierbares Gen, das für ein gewünschtes Protein codiert, enthält.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Expressionsvektor zusätzlich ein Gen enthält, das für einen selektierbaren Marker codiert.
  9. Säuger-Wirtszelle für die Expression eines gewünschten Proteins in Zellkultur, worin die Wirtszelle mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen enthält, und worin die Wirtszelle weiterhin mit einem zweiten Expressionsvektor transformiert ist, der ein exprimierbares Gen enthält, das für ein gewünschtes Protein codiert.
  10. Säuger-Wirtszelle für die Expression eines gewünschten Proteins in Zellkultur, worin die Wirtszelle mit einem Expresionsvektor transformiert ist, der ein exprimierbares Säuger-Fetuin-Gen und ein exprimierbares Gen, das für ein gewünschtes Protein codiert, enthält.
  11. Expressionsvektor, umfassend: a) einen Promotor b) eine codierende Sequenz für Fetuin, wobei die codierende Sequenz mit dem Promotor funktionsfähig verknüpft ist, c) eine Intron-Sequenz, wobei sich die Intron-Sequenz stromabwärts des Promotors und stromaufwärts der für Fetuin codierenden Sequenz befindet, wobei die Intron-Sequenz zwei identische Donorstellen und eine Akzeptorstelle umfasst, und d) eine codierende Sequenz für ein heterologes Protein, wobei die codierende Sequenz mit einem Promotor funktionsfähig verknüpft ist.
  12. Expressionsvektor nach Anspruch 11, worin die für Fetuin codierende Sequenz entweder eine humane Sequenz, eine bovine Sequenz, oder eine homologe oder orthologe Sequenz davon ist.
  13. Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 11 transformiert ist.
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