CN108265053B - 一种抑制外显子剪切抑制子功能的反义寡核苷酸的筛选方法 - Google Patents

一种抑制外显子剪切抑制子功能的反义寡核苷酸的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制外显子剪切抑制子功能的反义寡核苷酸的筛选方法。包括如下步骤：1）获得靶基因的外显子剪切抑制子和临近的基因序列。2）根据序列设计和合成一系列经硫代修饰的反义寡核苷酸。3）将反义寡核苷酸转染到细胞中，并在24小时后提取总蛋白。用western杂交法确定与靶基因外显子剪切抑制子结合效果最好的反义寡核苷酸。4）根据步骤3）获得的反义寡核苷酸的序列，合成2'‑O‑Methyl和硫代修饰的反义寡核苷酸，并转染细胞，用RT‑PCR的方法确定其可以高效地抑制外显子剪切抑制子功能。该方法适用于经济地筛选可以高效地抑制外显子剪切抑制子功能的反义寡核苷酸，具有良好的开发和应用前景。

Description

一种抑制外显子剪切抑制子功能的反义寡核苷酸的筛选方法
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域。具体涉及一种抑制外显子剪切抑制子功能的反义寡核苷酸的筛选方法。
背景技术
真核细胞的基因包含了外显子(exon)和内含子(intron)。当基因表达的时候，先由RNA聚合酶根据基因的DNA模板合成前体信使RNA(mRNA)。前体mRNA包括外显子和内含子。然后由剪切复合体(spliceosome)将内含子去除并将外显子连接，形成成熟的mRNA，可以指导蛋白质的合成。然而，前体mRNA的剪切并不是一成不变的，比如：有些外显子可能在剪切时被排除在成熟的mRNA中，称为外显子跳跃(exon skipping)，有些内含子被保留在成熟的mRNA中，称为内含子保留(intron retention)，可以看出，同一个基因转录后通过可变剪切可以产生多种mRNA，由于所包含的部分序列的改变，它们所编码的蛋白质也是不同的。这些前体mRNA的多种剪切方式被称为可变剪切(alternative splicing)。目前发现超过90％的人类基因的前体mRNA都有可变剪切的现象。有些基因的可变剪切方式众多，所产生的mRNA的种类成百上千，极大地丰富了基因组的编码能力。
目前的研究发现可变剪切与疾病的发生发展有密切的关系。比如癌症细胞的基因的可变剪切方式与正常细胞有很大的区别1。与癌症相关的基因发生可变剪切后往往会产生两种主要的结果；所编码的蛋白或促进或抑制癌症的发生发展。癌细胞中癌症相关基因的可变剪切主要是产生可以编码促进癌症发生发展的mRNA。因此通过调控可变剪切，抑制促进癌症发生发展的mRNA产生可以起到抑制癌症的作用。目前调控可变剪切的方法主要是通过反义寡核苷酸结合到外显子与内含子的结合点，抑制剪切复合体识别剪切位点，从而阻止外显子的剪切并被排除在成熟mRNA外2。
前体mRNA可变剪切的调控主要是通过可变剪切调控因子与前体mRNA外显子或内含子上的调控元件相互作用，比如外显子的剪切增强子(exonic splice enhancer，ESE)或抑制子(exonic splice suppressor或exonic splice silencer，ESS)。外显子剪切抑制子的功能主要是抑制外显子的剪切，使其不能包含在成熟mRNA中。有一些疾病与外显子剪切抑制子的作用有关。比如脊髓型肌萎缩症(SMA)病人往往有SMN2基因的第7个外显子上一个外显子抑制子的突变，导致第7个外显子的跳过丢失和所编码的蛋白功能的缺失。利用反义寡核苷酸结合在外显子抑制子上可以影响其功能，增加外显子7的剪切，增加SMN2蛋白的表达，从而起治疗作用3。
针对外显子抑制子设计有效的反义寡核苷酸是比较困难的。由于RNA有高度复杂、不易准确预测和较难检测的二级结构，使得反义寡核苷酸仅能在不多的位置可以高效地结合外显子抑制子。仅根据序列设计与靶序列互补的反义寡核苷酸经常效果较差。必须要根据靶序列和其上下游的邻近序列设计较多的不同序列的待选反义寡核苷酸，进行筛选实验。普通的反义寡核苷酸与mRNA结合后会诱导RNase H活性，导致mRNA的降解，不能调控mRNA的可变剪切。因此普通的反义寡核苷酸必须要经过修饰，避免RNase H活性。这样的修饰往往非常昂贵，其中较为廉价的2'-O-Methyl修饰也高达80元/碱基/2OD。由于每个反义寡核苷酸的长度一般为15-20个碱基，再加上稳定反义寡核苷酸的硫代修饰费用(5元/碱基/2OD)，每个2'-O-Methyl修饰的反义寡核苷酸的价格至少是1200到1700元。因此大量筛选时，合成反义寡核苷酸的成本非常高。
发明内容
本发明的目的是提供一种经济的方法筛选可以高效抑制可变外显子上外显子剪切抑制子的功能的反义寡核苷酸。仅用廉价的硫代修饰的反义寡核苷酸，就可以筛选出可能有效的反义寡核苷酸，调控基因的前体mRNA的可变剪切，从而调控基因的表达，具有良好的开发和应用前景。
在本发明的第一方面，提供一种抑制外显子剪切抑制子功能的反义寡核苷酸的筛选方法，依次包括如下步骤：
1)获得靶基因的外显子剪切抑制子和临近的基因序列；
2)根据序列设计和合成一系列经硫代修饰的反义寡核苷酸；
3)将反义寡核苷酸转染到HEK 293细胞中，并在24小时后提取总蛋白；用Western杂交法检测该基因的蛋白表达水平，确定与靶基因外显子剪切抑制子结合效果最好的反义寡核苷酸；
4)根据步骤3)筛选到的效果好的反义寡核苷酸的序列，合成每个碱基被2'-O-Methyl和硫代修饰的反义寡核苷酸，并转染HEK 293细胞；用RT-PCR的方法检测靶基因的外显子的可变剪切，确定效果最好的反义寡核苷酸能够高效地抑制外显子剪切抑制子的功能，促进外显子保留在mRNA中。
本发明针对目前在设计反义寡核苷酸过程中遇到的合成成本高的缺点，在寻找高效的抑制外显子剪切抑制子功能的反义寡核苷酸过程中，单独用廉价的硫代修饰的方法修饰反义寡核苷酸替代昂贵的2'-O-Methyl修饰或其它修饰方法。经硫代修饰的反义寡核苷酸在细胞的中的稳定性好，但与靶mRNA结合后还存在RNase H效应，会导致靶mRNA的降解，通常不单独用于调控靶mRNA可变剪切。由于反义寡核苷酸必须结合到靶mRNA上才能发挥作用，筛选的目的主要是找出能与靶mRNA有效结合的反义寡核苷酸。硫代修饰的反义寡核苷酸如能导致靶mRNA降解，则正说明了该序列的反义寡核苷酸能有效地结合到靶mRNA上。因此仅用廉价的硫代修饰的反义寡核苷酸，就可以筛选出可能有效的反义寡核苷酸。
附图说明
图1表达包含SRSF3外显子4的前体mRNA的示意图
方框表示外显子，外显子间的横线表示内含子，虚线表示RNA剪切的方向。CMV：巨细胞病毒启动子；STOP：终止密码子；EGFP：绿色荧光蛋白基因；ESS：外显子剪切抑制子。Degraded by NMD:由non-sense-mediated degradation(NMD)机制介导的mRNA降解。
图2筛选能与靶基因(SRSF3外显子4)外显子抑制子结合的反义寡核苷酸
A.外显子4的外显子剪切抑制子(ESS)的序列是由斜体标记，下方的线条表示相应的反义寡核苷酸；
B.将表达包含SRSF3外显子4的前体mRNA的系统与上述反义寡核苷酸分别转染HEK293细胞，24小时后提取细胞总蛋白，用westerner杂交检测SRSF3-GFP融合蛋白的表达，SR12为非特异性的反义寡核苷酸(NS)。
图3反义寡核苷酸SR-3可以促进SRSF3外显子4的可变剪切
L:包含外显子4的mRNA，S：不包含外显子4的mRNA。GAPDH是上样量的对照。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
发明人在2010年发现人的可变剪切调控因子SRSF3(又称为SRp20)是一个原癌基因。进一步发明人在2015年发现人的SRSF3基因有一个可变外显子4。在该可变外显子4的3’端有一个外显子剪切抑制子。由于该外显子带有终止密码子，包含这个外显子的mRNA不能编码全长有功能的SRSF3蛋白。在癌症中有高表达的PTPB1和PTBP2蛋白与外显子剪切抑制子相互作用，促进了可变外显子4的跳过丢失，进而增加了全长有功能的SRSF3蛋白的表达，有利于癌症的发生和发展3。在本发明中开展研究尝试用比较经济的方法寻找可以高效地抑制可变外显子4上外显子剪切抑制子的功能，促进了可变外显子4的剪切，进而减少了全长有功能的SRSF3蛋白的表达，可能起抑制癌症的作用。
【实施例1】筛选能高效抑制SRSF3外显子4的外显子剪切抑制子功能的反义寡核苷酸
1.根据我们已发表的研究结果4，我们确定SRSF3外显子4的外显子剪切抑制子及其上下游的邻近序列CCTCACCTCACCATTTCTAGCTTGTTGAAACCCA(划线的是外显子剪切抑制子序列)。
2.根据这个序列我们设计了一系列反义寡核苷酸：
SR-2 GGTTTCAACAAGCTAGAAAT
SR-3 GTTTCAACAAGCTAGAAATG
SR-4 TTTCAACAAGCTAGAAATGG
SR-5 TTCAACAAGCTAGAAATGGT
SR-6 TCAACAAGCTAGAAATGGT
SR-7 CAACAAGCTAGAAATGGTG
SR-8 AACAAGCTAGAAATGGTGA
SR-9 ACAAGCTAGAAATGGTGAG
SR-10 CAAGCTAGAAATGGTGAGG
SR-11 AAGCTAGAAATGGTGAGGT
同时设计了一个非特异性的反义寡核苷酸(NS)作为对照，其序列是：ACTCTATCTGCACGCTGACT。
在生工生物工程(上海)股份有限公司合成了这些反义寡核苷酸，各个反义寡核苷酸的每个碱基都做了硫代修饰。
3.发明人以前制备了研究包含SRSF3外显子4的前体mRNA的一个表达系统4(图1)。该系统包含SRSF3外显子3、内含子3、外显子4、内含子4和外显子5。该系统可以模拟细胞中SRSF3前体mRNA的剪切。在外显子3的5’端加了起始密码子ATG。如果外显子3和5直接连接，可以和下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白(SRSF3-GFP)。如果外显子4被包含在mRNA中，由于出现了提前终止密码子，不能表达与绿色荧光蛋白融合蛋白。
利用脂质体转染剂Lipofecatmin 3000(Thermofisher公司)，将该系统与上述反义寡核苷酸分别转染HEK 293细胞，24小时后提取细胞总蛋白，然后将蛋白质样本在10％的SDS-PAGE胶(Thermofisher公司)中分离，用Western转印仪(Biorad公司)在60V电压下经2个小时转移到硝酸纤维素膜(Pall公司)上。将膜用5％脱脂牛奶封闭膜1个小时，与小鼠抗绿色荧光蛋白抗体(Santa Cruz公司，1:1000稀释)孵育2小时，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(Sigma公司，1:10000)孵育1小时，用发光底物(Thermofisher)和X线胶片检测特异性绿色荧光蛋白融合蛋白的表达水平。如图2，可见反义寡核苷酸SR-3具有最强的降解SRSF3-GFP融合蛋白的能力，说明其可能与SRSF3前体mRNA的外显子4有较强的结合能力。
4.我们根据结合效果好的反义寡核苷酸的序列，合成2'-O-Methyl和硫代修饰的反义寡核苷酸(生工生物工程(上海)股份有限公司)，利用脂质体转染剂Lipofecatmin3000转染CAL 27口腔癌细胞，24小时后提取总RNA。然后进行RT-PCR反应，包括：
1)逆转录
取1μgRNA样本进行DNA酶处理，加1μL 10×DNase buffer(Thermofisher公司)和1μL DNaseI(1U/μL)(Thermofisher公司)，加无RNA酶水补足体积至10μL。混均后，室温静置10min。然后加入1μL 25mM EDTA溶液，65℃10分钟，中止DNA酶的作用。取出9μL处理好的RNA样本，加1μL Random Primers(Promega公司)和无RNA酶水4μL，70℃孵育5min后，立即取出置冰上。再加入1.25μL dNTPs(Thermofisher公司)、0.125μL RNase inhibitor(Promega公司)、5μL 5×MMLV buffer(Promega公司)、1μL MMLV逆转录酶(Promega公司)和无RNA酶水3.625μL。混匀后置37℃60min，完成逆转录，得到cDNA。
2)RT-PCR
取1μL cDNA，加12.5μL 2×Premix Taq DNA聚合酶混合物(Takara公司)、1μL正向引物(10μM)、1μl反向引物(10μM)和9.5μl无RNA酶水。检测包含SRSF3第四个外显子的引物序列是：5’CTCCCTCTTGGGGTCGTCGC 3’和5’CATGTGAAACGACACCAGCCAAGC 3’。检测跳过SRSF3第四个外显子的引物序列是：5’CCATAGAGAATTACACCTTTGTGTCACTG 3’和5’AGTCCTCCACCTCGTCGCAGATCTC 3’。检测内对照GAPDH的引物序列是：5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 3’和5’GAAGATGGTGATGGGATTTC 3’。反应参数是：94℃ 2min，经35个循环(94℃ 20秒，57℃ 30秒，72℃ 1分钟)后72℃ 7分钟。反应完成后在2％的琼脂糖凝胶中电泳观察反应产物。结果表明结合效果最好的反义寡核苷酸SR-3也可以高效地抑制能够抑制外显子剪切抑制子功能，促进外显子4保留在mRNA中(图3)。
参考文献
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4.Guo,J.,Jia,J.and Jia,R.,Sci Rep,2015,5,14548.
Figure IDA0001682694730000011
Figure IDA0001682694730000021
Figure IDA0001682694730000031
Figure IDA0001682694730000041

Claims (1)

1.一种抑制可变剪切调控因子SRSF3外显子4的外显子剪切抑制子的反义寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
1）获得靶基因的外显子剪切抑制子和临近的基因序列；
2）根据序列设计和合成一系列经硫代修饰的反义寡核苷酸；
3）将反义寡核苷酸转染到HEK 293细胞中，并在24小时后提取总蛋白；用Western杂交法检测该基因的蛋白表达水平，确定与靶基因外显子剪切抑制子结合效果最好的反义寡核苷酸；
4）根据步骤3）筛选到的反义寡核苷酸的序列，合成每个碱基被2'-O-Methyl和硫代修饰的反义寡核苷酸，并转染细胞；用RT-PCR的方法检测靶基因的外显子的可变剪切，确定效果，即该反义寡核苷酸能够高效地抑制外显子剪切抑制子的功能，促进外显子保留在mRNA中；
上述筛选方法获得的反义寡核苷酸序列为：
SR-2 GGTTTCAACAAGCTAGAAAT
SR-4 TTTCAACAAGCTAGAAATGG
SR-6 TCAACAAGCTAGAAATGGT
SR-8 AACAAGCTAGAAATGGTGA
SR-9 ACAAGCTAGAAATGGTGAG。
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