CN109207431B

CN109207431B - 一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法

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Publication number: CN109207431B
Application number: CN201811190716.7A
Authority: CN
Inventors: 贾荣; 郭继华; 王晓乐
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2038-10-12
Also published as: CN109207431A

Abstract

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，所述方法为：通过增加PCBP1蛋白在细胞内的表达水平，从而调控人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，达到抑制STAT3的α亚型mRNA的产生，进而使STAT3的α亚型表达水平下降。本发明所述方法通过提高细胞中PCBP1蛋白的表达水平，进而调控细胞内人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，减少STAT3的α亚型的表达，抑制STAT3α亚型mRNA的产生，进而使STAT3α蛋白表达水平下降，达到抑制肿瘤细胞生长和抗肿瘤的效果，本发明所述方法为开发抑制STAT3的药物提供了新的思路，为肿瘤治疗提供新的方法。

Description

一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法。

背景技术

STAT3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)属于信号转导与转录激活因子STAT家族，是重要的癌基因，在控制细胞的生长、分化、增殖、恶性转化和凋亡中有重要的作用。STAT3磷酸化后被激活，可以进入细胞核，并启动促进肿瘤发生发展的靶基因如Cyclin D1、survivin、Myc和Bcl-X_L的表达。细胞中STAT3蛋白的表达提高后一般也伴随着STAT3磷酸化和活化水平增高。STAT3在很多癌症中高表达，与患者的不良预后有密切关系。经过多年的大量研究，学者们探索制备各种抑制剂来抑制STAT3的表达和功能，但迄今为止临床上仍没有可以应用的抑制STAT3的药物来治疗癌症。

STAT3的表达与它的RNA

可变剪接有密切的关系。STAT3的基因包括24个外显子，其中第23个外显子的5端剪接位点是可变的，分别产生较长的α亚型(称为STAT3α)和较短的β亚型(称为STAT3β)mRNA(图1)。外显子23的序列在人和小鼠中高度保守，完全相同的碱基为98％，所对应的氨基酸则完全一致，也都有可变剪接。STAT3α编码全长的共770个氨基酸的STAT3蛋白。但STAT3β由于剪接后，阅读框架产生改变，使第715个后的氨基酸发生改变，并产生了一个终止密码子，最终产生的STAT3蛋白为722个氨基酸。STAT3蛋白主要有4个功能结构域：DNA结合区(DNA-binding domain,DBD)、SH2结构域、酪氨酸磷酸化位点结构域和羧基端转录激活结构域(transcriptional activation domain,TAD)。与STAT3全长蛋白(以下称为STAT3α蛋白)相比，STAT3β编码的较短的STAT3蛋白(以下称为STAT3β蛋白)缺乏羧基端的转录激活结构域。研究表明STAT3α蛋白是原癌基因，在肿瘤中高表达，促进肿瘤的发生和发展。而STAT3β蛋白则相反，在肿瘤中起了抑癌基因的作用(图1)。在肿瘤细胞中表达的主要是STAT3α，STAT3β蛋白则很不易检测到。Niu等发现在恶性黑色素瘤细胞中过表达STAT3β后，诱导了肿瘤细胞发生凋亡，抑制了肿瘤生长和引起了肿瘤退缩。Zammarch等进一步发现，在裸鼠上接种恶性黑色素瘤细胞形成肿瘤后，用反义寡核苷酸抑制STAT3α的剪接并促进STAT3β的表达，可以显著促进肿瘤的退缩。因此，采用适当的方法使STAT3前体mRNA外显子23剪接时增加STAT3β，同时减少STAT3α亚型的表达，以抑制促癌的STAT3α的表达，可能为肿瘤治疗提供新的方法。目前关于STAT3的外显子23的可变剪接的调控机制还不清楚。

PCBP1，也称为hnRNP E1，属于hnRNP家族，能与RNA的多聚胞嘧啶区域[poly(rC)]活性区域特异性结合，调控RNA可变剪接、稳定性和翻译等。PCBP1基因在进化中高度保守。很多研究都表明PCBP1在癌症组织中主要是低表达，如肺癌、甲状腺癌和宫颈癌等。

发明内容

本发明针对现有技术不足，目的在于提供一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，具体包括：通过增加PCBP1蛋白在细胞内的表达水平，从而调控人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，达到抑制STAT3的α亚型mRNA的产生，进而使STAT3的α亚型蛋白表达水平下降。

按上述方案，所述人癌基因STAT3外显子23中包含抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的序列，所述PCBP1蛋白能与该序列结合从而抑制人癌基因STAT3的α亚型表达。

按上述方案，从细胞中用PCR方法获得PCBP1基因的编码序列，将编码序列克隆到载体中形成重组质粒并转染细胞，增加PCBP1蛋白在细胞中的表达水平。

按上述方案，从细胞中用PCR方法获得PCBP1基因的编码序列，然后与T7短肽的编码序列连接组成能编码T7短肽和PCBP1融合蛋白的基因片段，将基因片段克隆到载体中形成重组质粒并转染细胞，增加PCBP1蛋白在细胞中的表达水平。

按上述方案，所述载体为慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体或其它真核表达载体。

本发明的有益效果如下：本发明所述方法通过提高细胞中PCBP1蛋白的表达水平，进而调控细胞内人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，减少STAT3的α亚型(STAT3α)的表达，抑制STAT3α亚型mRNA的产生，进而使STAT3α蛋白表达水平下降，达到抑制肿瘤细胞生长和抗肿瘤的效果，本发明所述方法为开发抑制STAT3的药物提供了新的思路，为肿瘤治疗提供新的方法。

附图说明

图1为STAT3前体mRNA的可变剪接；方框表示外显子，方框间的实线表示内含子。内含子上方的虚线表示RNA剪接的方向，STOP表示终止密码子。

图2(A)为STAT3 mini基因表达质粒模式图；将人STAT3的外显子22、内含子22和外显子23的基因组序列克隆到pEGFP-N1质粒中CMV启动子后，并对外显子23的5端的序列进行了系列突变。(B)用STAT3特异性引物和载体质粒上的特异性引物，以RT-PCR检测外显子23的可变剪接，GAPDH是上样量的对照，右侧是RNA剪接和PCR产物的模式图，外显子上或下的短横表示PCR使用的上下游引物。

图3为RNA剪接调控因子PCBP1促进STAT3β亚型的表达，其中(A)是将图所标的RNA剪接调控因子表达质粒(pEGFP-N1是对照)转染293细胞，24小时后提取总RNA，以STAT3α或STAT3β特异性引物检测STAT3的外显子23的可变剪接，右侧是RNA剪接和PCR产物的模式图，外显子上或下的短横表示PCR使用的上下游引物；(B)Western杂交检测PCBP1的过表达，T7-PCBP1是质粒编码的与T7标签短肽融合的PCBP1蛋白，PCBP1抗体来自Origene公司。

图4为PCBP1与STAT3外显子4的序列可以结合；其中(A)为合成生物素标记的RNA寡核苷酸，mt4是STAT3外显子23上经突变序列，wt4是未突变的序列，PCBP1+是根据文献确定的能与PCBP1结合的RNA序列，作为阳性对照；(B)为RNA pulldown实验检测PCBP1与靶RNA序列的结合，用westerner杂交的方法检测PCBP1与RNA的结合，“细胞裂解物”是western杂交的阳性对照，检测“Pulldown实验后的细胞裂解物”是为了证明所加入的细胞总蛋白中的PCBP1结合到RNA上后留在琼脂糖珠上，总蛋白中剩余的PCBP1的量减少了。

图5为过表达PCBP1降低了STAT3α/STAT3β的比例，并抑制SCC-9的生长，其中(A)将表达PCBP1蛋白的慢病毒转染SCC-9细胞，提取总RNA和总蛋白，以RT-PCR检测外显子23的可变剪接，GADPH是上样量对照；(B)Western杂交验证PCBP1的过表达以及STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达水平，T7-PCBP1是质粒编码的与T7标签短肽融合的PCBP1蛋白，GAPDH是上样量的对照；(C)将过表达PCBP1蛋白或对照SCC-9细胞接种培养板，分别在第2和第4天进行细胞计数；(D)是(C)中第4天计数结果的柱状图，并显示两组间比较有统计学差异(P<0.05)；

说明：我们用的抗STAT3的抗体是BD公司的，可以同时识别STAT3α和STAT3β蛋白，但STAT3β蛋白的表达量通常都很低，western杂交不易检测到STAT3β蛋白，PCR扩增时也需要较多的循环数才能检测到，图中所示的STAT3蛋白主要是较长的STAT3α。

图6为过表达PCBP1降低了STAT3α/STAT3β的比例，并抑制了CAL 27的生长，其中(A)将表达PCBP1蛋白的慢病毒转染CAL 27细胞，提取总RNA和总蛋白，以RT-CPR检测外显子23的可变剪接，GADPH是上样量对照；(B)为Western验证PCBP1的过表达以及STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达水平，T7-PCBP1是质粒编码的与T7标签短肽融合的PCBP1蛋白，GAPDH是上样量的对照；(C)将过表达PCBP1蛋白或对照CAL 27细胞接种培养板，分别在第2和第4天进行细胞计数；(D)是(C)中第4天计数结果的柱状图，并显示两组间比较有统计学差异(P<0.05)。

图7为PCBP1可以抑制口腔癌细胞CAL 27在体内中成瘤，STAT3α蛋白可以对抗PCBP1的抑制作用，其中(A)用western杂交检测以下细胞中T7-PCBP1蛋白和STAT3α-GFP蛋白过表达：能稳定表达PCBP1蛋白(PCBP1+GFP)CAL 27细胞、能稳定表达STAT3α-GFP融合蛋白(Vector+STAT3α)CAL 27细胞，同时稳定表达PCBP1蛋白和STAT3α-GFP融合蛋白(PCBP1+STAT3α)CAL 27细胞，或转染了对照载体(Vector+GFP)的CAL 27细胞；B～D将四种细胞分别接种四组裸鼠的实验：B是分离的肿瘤照片；C是分离的肿瘤的重量；D肿瘤的生长曲线，*：p<0.05。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1 STAT3外显子23包含抑制STAT3α亚型表达的剪接调控元件

为了解STAT3的外显子23的可变剪接的调控机制，我们克隆了人STAT3的部分基因组序列，包含外显子22、内含子22和外显子23。将该序列克隆到表达质粒pEGFP-N1中CMV启动子下游，构建了可以模拟STAT3外显子23可变剪接的mini基因。在该mini基因中，我们对外显子23的5’端的序列进行了系列突变，并将突变的质粒转染293细胞，检测外显子23的剪接变化。结果我们发现5’端的两个剪接位点间的大部分序列突变后，STAT3β亚型的表达显著减少，STAT3α亚型的表达显著增加，说明在这些序列中存在抑制STAT3α亚型表达的剪接调控元件(图2)。图2中mt1～mt9表示突变的mini基因。

具体包括：

1)PCR和克隆

取100ng人口腔癌细胞CAL 27的基因组DNA，加25μL 2×Phanta Max Buffer(诺唯赞公司)、1μL dNTP Mix(10μM，诺唯赞公司)、1μL Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(诺唯赞公司)和上下游引物(10μM)各1μL，加无RNA酶水补足体积至50μL。引物序列是5’CGCTGCCCCATACCTGAAGAC 3’和5’GGTTCAGCACCTTCACCATTATTTC 3’。反应参数是：95℃2min，经35个循环(95℃20秒，58℃30秒，72℃1分钟)后72℃7分钟。反应完成后在2％的琼脂糖凝胶中电泳观察反应产物，结果得到了415bp的人STAT3的部分基因组序列，包含外显子22、内含子22和外显子23，回收415bp的产物。

以回收PCR产物为模板，按上述PCR方法，以引物5’GAATTCACCATGGCTGCCCCATACCTGAAGAC 3’(SEQ ID NO：1)和5’GGATCCGGTTCAGCACCTTCACCATTATTTC 3’(SEQ ID NO：2)在PCR产物两端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，回收432bp PCR产物。

取100ng 432bp的PCR产物，加2μL 2×Premix Taq^TMDNA Polymerase(TaKaRa公司)，加无RNA酶水补足体积至4μL，72℃7分钟给PCR产物加A尾，然后加1μL salt solution(ThermoFisher公司)和1μL pCR2.1-TOPO TA(ThermoFisher公司)克隆载体，室温连接5分钟。

取2μL连接产物与50μL ECOS大肠杆菌感受态细胞(Yeastern Biotech公司)混合5分钟，再将混合物涂布在含25μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜。第二天，挑取单个细菌克隆送上海生工公司测序，确定携带432bp正确序列的细菌克隆。

取正确细菌克隆到含25μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜，用质粒小量提取试剂盒(Axygen公司)提取质粒。取1μg提取的质粒，加1μL 10×酶切缓冲液(ThermoFisher公司)、0.5μL BamHI酶(ThermoFisher公司)和0.5μL EcoRI酶(ThermoFisher公司)，加无RNA酶水补足体积至20μL，37℃孵育2小时，用2％的琼脂糖凝胶电泳回收430bp的含STAT3的外显子22、内含子22和外显子23的片段。用同样的方法酶切处理pEGFP-N1(TaKaRa公司)，用1％的琼脂糖凝胶电泳回收4.7kb的载体片段。取6μL回收的430bp片段和2μL回收的pEGFP-N1载体片段，加1μL T4连接酶buffer(ThermoFisher公司)和1μL T4连接酶(ThermoFisher公司)，16度连接过夜。取2μL连接产物，同样转化ECOS大肠杆菌感受态细胞(Yeastern Biotech公司)，再将混合物涂布在含25μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜。第二天，挑取单个细菌克隆送上海生工公司测序，确定携带430bp正确序列的细菌克隆，得到能够在细胞中表达和模拟STAT3外显子23可变剪接的mini基因表达质粒。

2)突变

对mini基因中的外显子23的5’端的序列用重叠PCR(Overlapping PCR)进行了系列突变。突变引物对是:

5’CCATTTCCTACAGAACGTCGTCCTGGAATACCATTGACCTG 3’(SEQ ID NO：3)和

5’CAGGTCAATGGTATTCCAGGACGACGTTCTGTAGGAAATGG 3’(SEQ ID NO：4)；

5’CAGAACGACCTGCAGCATTTCGAATCACCTGCCGATGTCCC 3’(SEQ ID NO：5)

和5’GGGACATCGGCAGGTGATTCGAAATGCTGCAGGTCGTTCTG 3’(SEQ ID NO：6)；

5’TGCAGCAATACCATTGAGCAGGCCAAGTCCCCCCGCACTTT 3’(SEQ ID NO：7)

和5’AAAGTGCGGGGGGACTTGGCCTGCTCAATGGTATTGCTGCA 3’(SEQ ID NO：8)；

5’CCATTGACCTGCCGATGACGCGCGGCACTTTAGATTCAT 3’(SEQ ID NO：9)和

5’ATGAATCTAAAGTGCCGCGCGTCATCGGCAGGTCAATGG 3’(SEQ ID NO：10)；

5’GCCGATGTCCCCCCCCTGATTAGATTCATTGATG 3’(SEQ ID NO：11)和

5’CATCAATGAATCTAATCAGGGGGGGGACATCGGC 3’(SEQ ID NO：12)；

5’GCACTTTAGATTCATTCAAGGACTATGGAAATAATGGTGA 3’(SEQ ID NO：13)和

5’TCACCATTATTTCCATAGTCCTTGAATGAATCTAAAGTGC 3’(SEQ ID NO：14)；

5’TTCATTGATGCAGTTTCGTATTCAAGGTGAAGGTGCTGAA 3’(SEQ ID NO：15)和

5’TTCAGCACCTTCACCTTGAATACGAAACTGCATCAATGAA 3’(SEQ ID NO：16)；

5’CAGTTTGGAAATAATGCTCATGCTCCTGAACCGGATCCAC 3’(SEQ ID NO：17)和

5’GTGGATCCGGTTCAGGAGCATGAGCATTATTTCCAAACTG 3’(SEQ ID NO：18)；

5’ATAATGGTGAAGGTGCAGTAGCGGATCCACCGGTCGC 3’(SEQ ID NO：19)和

5’GCGACCGGTGGATCCGCTACTGCACCTTCACCATTAT 3’(SEQ ID NO：20)。

用这些引物对分别和mini基因中的上游引物5’

GAATTCACCATGGCTGCCCCATACCTGAAGAC 3’(SEQ ID NO：21)和下游引物5’GGATCCGGTTCAGCACCTTCACCATTATTTC 3’(SEQ ID NO：22)采用前述的方法和条件进行PCR，回收PCR产物，将产物经琼脂糖电泳回收纯化，取纯化产物各2μL，加25μL2×Phanta MaxBuffer(诺唯赞公司)、1μL dNTP Mix(10μM，诺唯赞公司)、1μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺唯赞公司)加无RNA酶水补足体积至48μL，进行重叠PCR第一步，反应参数是：95℃2min，经10个循环(95℃20秒，45℃30秒，72℃1分钟)后72℃7分钟，再加入上下游引物(10μM)各1μL，进行重叠PCR第二步，反应参数是：95℃2min，经35个循环(95℃20秒，58℃30秒，72℃1分钟)后72℃7分钟，将产物经琼脂糖电泳回收纯化，按前述克隆方法用突变PCR产物替代原来的mini基因。

3)转染

利用脂质体转染剂Lipofecatmin 3000(Thermofisher公司)，我们将1μg未突变和突变的mini基因表达质粒转染293细胞，1天后提取细胞总RNA，然后进行RT-PCR反应，具体包括：

1)逆转录

取1μgRNA样本进行DNA酶处理，加1μL 10×DNase buffer(Thermofisher公司)和1μL DNaseI(1U/μL)(Thermofisher公司)，加无RNA酶水补足体积至10μL。混均后，室温放置10min。然后加入1μL EDTA溶液(25mM)，65℃加热10分钟，中止DNA酶的作用。取出9μL去除DNA的RNA样本，加1μL Random Primers(Promega公司)和无RNA酶水4μL，70℃孵育5min后，立即取出置冰上。再加入1.25μL dNTPs(Thermofisher公司)、0.125μL RNase inhibitor(Promega公司)、5μL 5×MMLV buffer(Promega公司)、1μL MMLV逆转录酶(Promega公司)和无RNA酶水3.625μL。混匀后置37℃60min，完成逆转录，得到cDNA。

2)RT-PCR

取1μL cDNA，加12.5μL 2×Premix Taq DNA聚合酶混合物(Takara公司)、1μL正向引物(10μM)、1μl反向引物(10μM)和9.5μl无RNA酶水。检测包含STAT3第23个外显子可变剪接的引物序列是：5’CGCTGCCCCATACCTGAAGAC 3’(SEQ ID NO：23)and 5′GCTCCTCGCCCTTGCTCACCA 3’(SEQ ID NO：24)。检测内对照GAPDH的引物序列是：5’GAAGGTGAA GGTCGGAGTC 3’(SEQ ID NO：25)和5’GAAGATGGTGATGGGATTTC 3’(SEQ ID NO：26)。反应参数是：94℃2min，经35个循环(94℃20秒，57℃30秒，72℃1分钟)后72℃7分钟。反应完成后在2％的琼脂糖凝胶中电泳观察反应产物，分析序列突变对STAT3α和STAT3β亚型表达量比例的影响(图2)。

从图2可以看出5’端的两个剪接位点间的序列(即图2A所示的wt中的ACCTGCAGCAATACCATTGACCTGCCGATGTCCCCCCG)中存在抑制STAT3α亚型表达的剪接调控元件。

实施例2 RNA可变剪接调控因子PCBP1显著降低了STAT3α和STAT3β的RNA表达水平的比例，显示其对STAT3α表达具有抑制作用

前体mRNA可变剪接主要是由RNA可变剪接调控因子调控。因此我们尝试在细胞中过表达了各种RNA可变剪接调控因子来筛选调控STAT3的外显子23可变剪接的因子。目前我们主要发现PCBP1过表达后显著降低了STAT3α和STAT3β的RNA表达水平的比例(图3)。

具体包括：

转染和RT-PCR

将hnRNP K、PTBP1、hnRNP A1、SRp75、hnRNP L、SC35、PCBP1、PCBP3这些RNA可变剪接调控因子的表达质粒转染293细胞，24小时后提取总RNA，用RT-PCR方法，以引物5’ATCGGCAGGTCAATGGTATTGC 3′(SEQ ID NO：27)和5’AAGGAGGAGGCATTCGGAAAGTA 3′(SEQ IDNO：28)检测STAT3α；引物5’CCAAACTGCATCAATGAATGGTGT 3′(SEQ ID NO：29)检测STAT3β，分析过表达这些RNA可变剪接调控因子对STAT3α和STAT3β亚型表达量比例的影响(图3)。

其中PCBP1表达质粒的制备方法是：人工合成能编码T7短肽片段的DNA序列：

ATGGCTTCTAGGATGGCATCGATGACAGGTGGTCAGCAAATGGGTAGCAGAATGGCAAGCATGACTGGTGGCCAACAGATGGGTTCTAGT(SEQ ID NO：30)。

用引物5’TGACCACGTAACGAGCCCAACTC3’(SEQ ID NO：31)和5’GAGAACAGCAGAAAGGGGTTATTGAG 3’(SEQ ID NO：32)通过RT-PCR方法从人细胞中获得PCBP1的基因序列，纯化获得的PCR产物，并以此产物为模板，再用引物5’GCCAACAGATGGGTTCTAGTGATGCCGGTGTGACTGAAAG3’(SEQ ID NO：33)和5’GCGGCCGCCTAGCTGCACCCCATGCC 3’(SEQ IDNO：34)进行PCR，使得产物所携带的PCBP1的编码序列添加部分T7短肽序列和NotI酶切位点。然后通过重叠PCR(Overlapping PCR)将前述的T7短肽DNA片段与PCBP1基因融合，形成可以表达T7-PCBP1融合蛋白的基因序列，并以EcoRI和NotI位点克隆到慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen中，该重组质粒可以表达T7短肽与PCBP1基因融合的蛋白片段，并可以被用来制备表达PCBP1的慢病毒。

从图3(A)可以看出增加PCBP1的表达可以显著减少STAT3α和STAT3β亚型表达量比例；图3(B)说明了PCBP1的过表达。

实施例3 PCBP1可以与STAT3外显子23中抑制STAT3β表达的序列结合

PCBP1也称为hnRNP E1，能与RNA的多聚胞嘧啶区域[poly(rC)]活性区域特异性结合，调控RNA可变剪接、稳定性和翻译等。根据以往研究提示的PCBP1可能结合在RNA上的序列，结合我们突变实验中已经发现的STAT3外显子23中抑制STAT3β表达的序列，我们发现第4个突变(mt4)对应的未突变序列(wt4)是UCCCCCCG。该序列很可能与PCBP1结合。我们进行了RNA pulldown实验(图4)，发现PCBP1确实可以与该序列结合，突变序列mt4不能结合，说明了PCBP1可以结合未突变序列(wt4)，并很可能通过与该序列结合促进STAT3β的表达。

很多研究都表明PCBP1在癌症组织中主要是低表达，而且过表达PCBP1可以抑制多种肿瘤的生长和侵袭(Zhang et al.2015,Wang et al.2010)。而我们发现PCBP1促进有抑癌作用的STAT3β的表达正好也符合PCBP1对肿瘤的抑制作用。

具体操作包括：

(1)在生工公司合成生物素标记的RNA寡核苷酸。序列见图4A。mt4是STAT3外显子23上经突变序列，wt4是未突变的序列。根据文献确定的能与PCBP1结合的RNA序列PCBP1+作为阳性对照。

(2)制备293细胞总蛋白提取物。将293细胞接种到直径10cm培养皿中，待细胞生长到90％汇合，加入RIPA缓冲液(Thermofisher公司)裂解细胞，冰上放置5分钟，收集缓冲液并离心取上清作为293细胞总蛋白提取物。

(3)RNA pulldown和western杂交实验。取2μL生物素标记的RNA寡核苷酸与带亲和素的琼脂糖珠(Thermofisher公司)共孵育，得到RNA-琼脂糖珠复合体。将该复合体与293细胞总蛋白提取物共孵育过夜。然后将未结合的蛋白洗掉，加2×SDS缓冲液将能与靶RNA结合的蛋白从琼脂糖珠上洗脱下来，95度变性处理2分钟。然后将样本加到10％PAGE胶(Thermofisher公司)进行蛋白质垂直电泳，电泳结束后将蛋白用转印装置(BioRad公司)转到硝酸纤维素膜(Pall公司)上，用5％的脱脂牛奶封闭1小时，加小鼠抗PCBP1抗体(Origene公司，1:200稀释)在4度过夜。第二天洗膜后加过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG二抗(Sigma公司，1:10000稀释)孵育1小时，用SuperSignal West Pico PLUS(Thermofisher公司)发光液处理，胶片曝光显影，结果见图4，发现PCBP1可以与该序列结合，不与突变的序列结合。

实施例4 PCBP1可以抑制STAT3α亚型的表达，从而抑制口腔癌细胞的生长

目前PCBP1在口腔癌中的表达和作用还不清楚。所以我们想了解PCPB1在口腔癌细胞中是否确实可以增强STAT3β的表达和抑制STAT3α的表达。我们在口腔癌细胞系SCC-9和CAL 27中转染表达PCBP1蛋白的慢病毒，RT-PCR检测发现，与对照病毒转染的细胞相比，过表达PCBP1使STAT3α和STAT3β表达量的比例显著下降了，特别是STAT3α的量明显下降(图5)。Western检测也发现过表达PCBP1后STAT3的表达量和磷酸化STAT3也明显下降。另外，过表达PCBP1显著抑制了SCC-9细胞的生长。在另一个口腔癌细胞系CAL 27中我们也发现了类似的结果(图6)。这些结果说明，PCBP1可以调控STAT3的外显子23的可变剪接，主要是抑制促癌的STAT3α表达水平，从而抑制了口腔癌细胞的生长。

具体操作包括：

(1)构建过表达PCBP1蛋白的细胞和细胞生长

利用脂质体转染剂Lipofecatmin 3000(Thermofisher公司)，按4：3：1的比例在293T细胞中共转染PCBP1表达质粒(或对照pLVX-IRES-ZsGreen质粒)、包装质粒psAPX2和pMD2.G；3天后收集293T细胞产生的包含慢病毒上清，加入到SCC-9或CAL 27细胞24小时后更换培养基，继续培养，获得能稳定表达PCBP1蛋白或含对照载体的SCC-9或CAL 27细胞。我们将稳定表达PCBP1蛋白或对照SCC-9或CAL 27细胞接种培养板，2天后用0.25％的胰酶-EDTA(Thermofisher公司)消化细胞，并计数。4天后再计数。结果发现，过表达PCPB1可以显著地抑制SCC-9(图5C-D)和CAL 27细胞的生长(图6C-D)。

(2)RT-PCR检测STAT3外显子23的可变剪接

在转染SCC-9或CAL 27细胞48小时后提取总RNA，用RT-PCR方法，以引物5’ATCGGCAGGTCAATGGTATTGC 3′(SEQ ID NO：35)and5’AAGGAGGAGGCATTCGGAAAGTA 3′(SEQ IDNO：36)检测STAT3α；引物5’CCAAACTGCATCAATGAATGGTGT 3′(SEQ ID NO：37)检测STAT3β，分析过表达PCBP1对STAT3α和STAT3β亚型表达量比例的影响(图5A和图6A)，结果发现在两种细胞中，过表达PCBP1都显著减少STAT3α和STAT3β亚型表达量比例以及STAT3α的表达水平。

(3)Western杂交检测STAT3的表达。在转染SCC-9或CAL 27细胞48小时后提取总蛋白，用上述western杂交检测方法分析STAT3α和磷酸化STAT3蛋白的表达。结果发现，在两种细胞中，过表达PCBP1都显著降低了STAT3α和磷酸化STAT3蛋白的表达水平(图5B和图6B)。

实施例5 PCBP1可以抑制口腔癌细胞CAL 27在体内中成瘤，STAT3α蛋白可以对抗PCBP1的抑制作用

为了明确PCBP1对STAT3α的抑制作用是否会影响肿瘤的发生发展。我们在CAL 27细胞中单独或同时过表达PCBP1和STAT3α蛋白，并将细胞接种裸鼠，结果发现，与对照细胞相比过表达PCBP1的CAL 27细胞在体内的成瘤能力受到了明显抑制；而同时过表达PCBP1和STAT3α蛋白的癌细胞的成瘤能力显著高于只过表达PCBP1的癌细胞(图7)。这些结果说明，PCBP1在肿瘤细胞中过表达后确实可以抑制肿瘤的发生发展，而这种抑制作用与PCBP1对STAT3α亚型的表达抑制有明确的关系。

具体操作包括：

(1)构建过表达PCBP1蛋白和STAT3α蛋白的细胞。

将STAT3α与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因表达质粒(吉凯公司)中的STAT3α与GFP融合基因(STAT3α-GFP)通过NotI和SpeI位点克隆到pLVX-IRES-PURO载体上，构建出STAT3α的慢病毒表达质粒。另外，将GFP基因通过NotI和SpeI位点克隆到pLVX-IRES-PURO载体上，构建出表达GFP的对照慢病毒表达质粒。将利用脂质体转染剂Lipofecatmin 3000(Thermofisher公司)，按4：3：1的比例在293T细胞中共转染STAT3α慢病毒表达质粒(或对照GFP对照慢病毒表达质粒)、包装质粒psAPX2和pMD2.G；3天后收集293T细胞产生的包含慢病毒上清，同时也如前述制备过表达PCBP1的慢病毒和载体对照病毒(Vector)。将上述病毒按以下组合转染CAL 27细胞：STAT3α-GFP+PCBP1、STAT3α-GFP+Vector、GFP+PCBP1和GFP+Vector。24小时后更换培养基，继续培养，获得能稳定表达PCBP1蛋白或STAT3α-GFP融合蛋白，或同时表达PCBP1蛋白和STAT3α-GFP融合蛋白，或对照载体的CAL 27细胞。

(2)裸鼠成瘤实验

将20只裸鼠分为四组。上述四种细胞分别接种到四组裸鼠皮下(按50万个细胞/鼠)，12天后每3天测一次肿瘤的大小，第27天时分离肿瘤并称重。结果发现：与对照细胞相比过表达PCBP1的CAL 27细胞在体内的成瘤能力受到了明显抑制；而同时过表达PCBP1和STAT3α蛋白的癌细胞的成瘤能力显著高于只过表达PCBP1的癌细胞(图7)。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120>一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法

<160> 37

<210> 1

<211> 32bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

gaattcacca tggctgcccc atacctgaag ac 32

<210> 2

<211>31bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

ggatccggtt cagcaccttc accattattt c 31

<210> 3

<211> 41bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

ccatttccta cagaacgtcg tcctggaata ccattgacct g 41

<210> 4

<211> 41bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

caggtcaatg gtattccagg acgacgttct gtaggaaatg g 41

<210> 5

<211> 41bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

cagaacgacc tgcagcattt cgaatcacct gccgatgtcc c 41

<210> 6

<211> 41bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

gggacatcgg caggtgattc gaaatgctgc aggtcgttct g 41

<210> 7

<211> 41bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

tgcagcaata ccattgagca ggccaagtcc ccccgcactt t 41

<210> 8

<211> 41bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

aaagtgcggg gggacttggc ctgctcaatg gtattgctgc a 41

<210> 9

<211> 39bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

ccattgacct gccgatgacg cgcggcactt tagattcat 39

<210> 10

<211> 39bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>10

atgaatctaa agtgccgcgc gtcatcggca ggtcaatgg 39

<210> 11

<211> 34bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>11

gccgatgtcc cccccctgat tagattcatt gatg 34

<210> 12

<211> 34bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>12

catcaatgaa tctaatcagg ggggggacat cggc 34

<210> 13

<211> 40bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>13

gcactttaga ttcattcaag gactatggaa ataatggtga 40

<210> 14

<211> 40bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>14

tcaccattat ttccatagtc cttgaatgaa tctaaagtgc 40

<210> 15

<211> 40bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>15

ttcattgatg cagtttcgta ttcaaggtga aggtgctgaa 40

<210> 16

<211> 40bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>16

ttcagcacct tcaccttgaa tacgaaactg catcaatgaa 40

<210> 17

<211> 40bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>17

cagtttggaa ataatgctca tgctcctgaa ccggatccac 40

<210> 18

<211> 40bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>18

gtggatccgg ttcaggagca tgagcattat ttccaaactg 40

<210> 19

<211> 37bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>19

ataatggtga aggtgcagta gcggatccac cggtcgc 37

<210> 20

<211> 37bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>20

gcgaccggtg gatccgctac tgcaccttca ccattat 37

<210> 21

<211> 32bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>21

gaattcacca tggctgcccc atacctgaag ac 32

<210> 22

<211> 31bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>22

ggatccggtt cagcaccttc accattattt c 31

<210> 23

<211> 21bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>23

cgctgcccca tacctgaaga c 21

<210> 24

<211> 21bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>24

gctcctcgcc cttgctcacc a 21

<210> 25

<211> 19bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>25

gaaggtgaag gtcggagtc 19

<210> 26

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>26

gaagatggtg atgggatttc 20

<210> 27

<211> 22bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>27

atcggcaggt caatggtatt gc 22

<210> 28

<211> 23bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>28

aaggaggag gcattcggaa agta 23

<210> 29

<211> 24bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>29

ccaaactgca tcaatgaatg gtgt 24

<210> 30

<211> 90bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>30

atggcttcta ggatggcatc gatgacaggt ggtcagcaaa tgggtagcag aatggcaagc 60

atgactggtg gccaacagat gggttctagt 90

<210> 31

<211> 23bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>31

tgaccacgta acgagcccaa ctc 23

<210> 32

<211> 26bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>32

gagaacagca gaaaggggtt attgag 26

<210> 33

<211> 40bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>33

gccaacagat gggttctagt gatgccggtg tgactgaaag 40

<210> 34

<211> 26bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>34

gcggccgcct agctgcaccc catgcc 26

<210> 35

<211> 22bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>35

atcggcaggt caatggtatt gc 22

<210> 36

<211> 23bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>36

aaggaggagg cattcggaaa gta 23

<210> 37

<211> 24bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400>37

ccaaactgca tcaatgaatg gtgt 24

Claims

1.一种非治疗目的抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，其特征在于：通过增加PCBP1蛋白在细胞内的表达水平，从而调控人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，达到抑制STAT3的α亚型mRNA的产生，进而使STAT3的α亚型蛋白表达水平下降。

2.根据权利要求1所述的非治疗目的抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，其特征在于，所述人癌基因STAT3外显子23中包含抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的序列，所述PCBP1蛋白能与该序列结合从而抑制人癌基因STAT3的α亚型表达。

3.根据权利要求1所述的非治疗目的抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，其特征在于，从细胞中用PCR方法获得PCBP1基因的编码序列，然后与T7短肽的编码序列连接组成能编码T7短肽和PCBP1融合蛋白的基因片段，将该基因片段克隆到载体中形成重组质粒，转染至细胞并表达，增加PCBP1蛋白在细胞中的表达水平。

4.根据权利要求1所述的非治疗目的抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，其特征在于，所述载体为慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、逆转录病毒表达载体或其它真核表达载体。