KR101216278B1 - 3개의 완전한 전사 단위를 보유하는 플라스미드 및ｈｉｖ에 대하여 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성조성물 - Google Patents

3개의 완전한 전사 단위를 보유하는 플라스미드 및ｈｉｖ에 대하여 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 제1 프로모터 및 제1 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전사 단위; (b) 제2 프로모터 및 제2 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위; 및 (c) 제3 프로모터 및 제3 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제3 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 전사 단위를 포함하는 DNA 플라스미드를 제공하는데, 여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 프로모터는 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이고; 상기 제1, 제2 및 제3 폴리아데닐화 시그널은 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이다. 본 발명은 또한 2개, 3개 또는 4개의 플라스미드의 조합을 포함하는, HIV에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 추가로 제공하는데, 여기서 각각의 플라스미드는 특정의 항원들 예를 들어, 단일 항원 또는 2개 또는 3개의 항원들의 융합체를 발현한다.

Description

3개의 완전한 전사 단위를 보유하는 플라스미드 및 ＨＩＶ에 대하여 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물{PLASMID HAVING THREE COMPLETE TRANSCRIPTIONAL UNITS AND IMMUNOGENIC COMPOSITIONS FOR INDUCING AN IMMUNE RESPONSE TO HIV}
본 발명은 항원에 대한 예방적 및 치료적 면역 반응을 개선시키는 플라스미드, 면역원성 조성물 및 이 면역 반응의 개선 방법에 관한 것이다.
플라스미드 DNA계 면역원성 조성물을 사용하는 면역화는 감염성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 연구 방법의 개발, 또는 진행중인 질병을 치료하는데 유용하게 사용되는 강력한 도구이다. 플라스미드 DNA 면역화에 관한 실험은, 다양한 감염성 제제 및 종양 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 둘 다를 유도하는데 효과적인 것으로 알려진 동물 모델에서 철저하게 수행되어 왔다. 예를 들어, 문헌[ Donnelly JJ외 다수, Ann. Rev. Immunol.; 15: 617-48 (1997); Iwasaki A외 다수, J Immunol 158 (10): 4591-601(1997); Wayne, C.L. and Bennett M., Crit Rev. Immunol., 18: 449-484 (1998)]을 참조하시오.
플라스미드 DNA 면역화의 중요한 이점은, 유전자가 유효한 플라스미드 DNA 발현 벡터 내에 클로닝, 변형 및 배치되어, 관련 전사 후 변형, 발현 수준, 적당한 세포내 물질 교환 및 항원 제공을 가능하게 할 수 있다는 점이다. DNA 면역화에 유용한 플라스미드 DNA 벡터는 리포터 또는 치료 유전자를 운반하는데 사용되는 플라스미드 DNA 벡터와 유사하다. 플라스미드 DNA계 면역화는 외래 단백질을 생산하는 개체의 세포 기작을 이용하여 개체의 면역계를 자극하고, 그 결과 단백질 항원에 대한 면역 반응을 상승시킨다. 이러한 플라스미드 DNA 벡터는 일반적으로 진핵 생물 전사 조절 요소를 함유하는데, 이 요소로서는 광범위한 숙주 세포 내에서 유전자 발현 수준을 높이는 강력한 바이러스 프로모터/인핸서 요소와, mRNA 발현을 적당한 때에 종결시키도록 만드는 폴리아데닐화 서열이 있다. 반면에, 바이러스 조절 요소는 플라스미드 DNA 벡터에 사용하기에 유용한데, 이때 관련 유전자를 발현시키는 비 변형 바이러스 벡터를 사용하면 플라스미드 DNA를 사용할 경우에는 발생하지 않는 안전성과 기술에 관한 문제점을 높일 수 있다.
그러나, 현재의 플라스미드 DNA 디자인은 하나의 벡터 골격으로부터 유래된 다수의 유전자를 하나의 표적 세포에서 발현시키는 데 한계가 있다. 그러므로, 다수의 유전자를 운반 및 발현시키기 위해서는, 별도의 플라스미드 들과 표적 세포를 공동 형질 감염시킬 필요가 있다. 세포가 다수의 플라스미드와 함께 공동 형질 감염되어야 할 경우, 특히 플라스미드가 생체 내에서 사용될 경우, 모든 암호화 유전자를 최적의 상태로 발현시키기란 어려운 일이다. 이러한 한계를 극복하고, 2 이상의 유전자를 발현시키기 위한 시도에는 다음과 같은 것들을 사용하는 것을 포함한다: 바이러스 벡터, 대안적으로 스플라이싱된, 프로바이러스 DNA 유래의 다수의 전사물, 유전자 융합체, 바이러스 유래 IRES(내부 리보좀 도입 위치;Internal Ribosome Entry Site) 서열 함유 이중 시스트론 벡터 및 이중 발현 플라스미드. 문헌[Conry R.M.외 다수, Gene Therapy. 3(1):67-74, (1996); Chen TT.외 다수, Journal of Immunology. 153(10):4775-87, (1994); Ayyavoo V.외 다수, AIDS. 14(1): 1-9, (2000); Amara R.R.외 다수, Vaccine. 20(15): 1949-55, (2002); Singh G,외 다수,. Vaccine 20: 1400-1411 (2002)]을 참조하시오.
현존하는 플라스미드 디자인은 인간 면역원성 조성물 중에서 2 이상의 독립 개방 해독 틀을 발현시키는데 적합한 DNA 플라스미드를 제공함으로써 유발되는 문제점을 해결하지 못한다. 다수의 이중 시스트론 벡터의 경우, IRES의 제1 유전자 전사 상류만이 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터로부터 강력하게 발현된다. 문헌[Sugimoto Y.,외 다수, Hum. Gen. Then 6: 905-915 (1995); Mizoguchi H,외 다수, Mol. Ther. 1:376-382 (2000)]을 참조하시오. 한편, 이중 발현 카세트는 그보다 더 강력하게 발현된다. 예를 들어, B7-1 및 인간 태아 암 항원(CEA)에 대한 cDNA와 2개의 독립 카세트를 보유하는 하나의 플라스미드를 함께 운반하면, 플라스미드를 각각 따로 운반한 경우에 비하여 더 강력한 면역 반응을 일으킨다는 사실을 발견하였다. 예를 들어, 문헌[Conry R.M.외 다수, Gene Therapy. 3(1):67-74, (1996)]을 참조하시오. 그러나, 이 경우에는 상동성 HCMV 프로모터 및 소 성장 호르몬(BGH) 폴리-아데닐화 서열로 이루어진 2개의 별도 카세트들이 관여하였다. 플라스미드 내에 상동성 서열이 존재하면 반복 서열들 사이에서 재조합 현상이 일어날 가능성이 높아져 벡터가 불안정하게 되기 때문에, 플라스미드 내에 상동성 서열이 존재할 경우, 이 플라스미드는 DNA 면역원성 조성물에 사용하기에 적합하지 않 게 된다.
인간의 면역원성 조성물에 사용하기 위한 플라스미드 DNA 벡터를 디자인할 때 부딪힐 수 있는 다른 문제점은 플라스미드의 크기와 구조이다. 플라스미드에 전사 단위가 가하여지면, 전사 단위들 사이의 간섭 작용이 예를 들어, 입체 장애의 한 형태로서 나타날 수 있다. 세포의 RNA 전사 복합체는 다중 전사 단위 플라스미드 상 복수 개의 위치에 결합하여 DNA 코일을 풀고 유전자를 효과적으로 전사시킬 수 있어야 한다. 몇 가지 이유(예를 들어, 플라스미드의 불안정성, 플라스미드 조작의 어려움 및 가장 중요하게는 투여시 고려 사항)로 인하여, 단순히 플라스미드를 더 크게 만든다고 해서 반드시 상기 문제점에 대한 최선의 해결책이 된다고 말할 수는 없다. 개선된 플라스미드 DNA 다중 전사 단위 벡터를 디자인하기 위해서는 유전자의 배치, 개방 해독 틀의 간격 및 전사 방향, 발현 수준, 제조의 용이성, 개체를 면역화시키는데 필요한 벡터의 안전성 및 최종 투여량 등을 고려해야 한다.
그러므로, 다수의 단백질에 대한 광범위한 면역 반응이 필요할 경우, 복잡한 병원균 예를 들어, HIV로부터 여러 단백질들을 발현시키는데 사용되는 혁신적인 플라스미드 DNA, 비 바이러스 벡터 디자인이 필요하다. 뿐만 아니라, 단일 세포 내에서 다수의 HIV 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있는 다가의 DNA계 면역원성 조성물도 필요하다.
발명의 개요
하나의 구체예에서, 본 발명은 (a) 제1 프로모터 및 제1 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제1 폴리펩티드를 암호 화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전사 단위; (b) 제2 프로모터 및 제2 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위; 및 (c) 제3 프로모터 및 제3 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제3 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 전사 단위를 포함하는 DNA 플라스미드를 제공하는데; 여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 프로모터는 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이고; 상기 제1, 제2 및 제3 폴리아데닐화 시그널은 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드는 진핵 세포 내에서 발현된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주에서 선택된 항원에 대하여 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물을 제공하며, 이 면역원성 조성물은 (a)(i) 제1 프로모터 및 제1 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전사 단위; (ii) 제2 프로모터 및 제2 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위; (iii) 제3 프로모터 및 제3 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제3 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 전사 단위[여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 프로모터는 각각 상이한 전사 단위로부터 유래되고; 상기 제1, 제2 및 제3 폴리아데닐화 시그널은 각각 상이한 전사 단위로부터 유래됨]를 포함하는 DNA 플라스미드; 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 애쥬반트(adjuvant), 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 형질 감염 촉진제는 부피바카인이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드는 진핵 세포 내에서 발현된다.
본 발명의 임의의 구체예에서, 면역원성 조성물은 생체내 전기 천공법을 이용하여 포유 동물에 투여된다. 특정 구체예에서, 전기 천공법은 전기장 세기가 약 25～약 800 V/㎝인 전류로 근육에 전기 자극을 주는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주를 선택된 항원에 대해서 면역화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a)(i) 제1 프로모터 및 제1 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전사 단위; (ii) 제2 프로모터 및 제2 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위; (iii) 제3 프로모터 및 제3 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제3 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 전사 단위[여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 프로모터는 각각 상이한 전사 단위로부터 유래되고; 상기 제1, 제2 및 제3 폴리아데닐화 시그널은 각각 상이한 전사 단위로부터 유래됨]를 포함하는 DNA 플라스미드; 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 애쥬반트, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물을 척추 동물 숙주에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드는 진핵 세포 내에서 발현된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 선택된 항원은 박테리아, 바이러스, 알레르기원 및 종양으로 이루어진 군으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 선택된 항원은 인간 면역 결핍 바이러스, 유인원 면역 결핍 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 제1형 파라 인플루엔자 바이러스, 제2형 파라 인플루엔자 바이러스, 제3형 파라 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스, 인간 거세포 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 폴리오 바이러스, 로타 바이러스 및 코로나 바이러스(SARS)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 선택된 항원은 해모필러스 인플루엔자에에(Haemophilus influenzae) (병형 및 비 병형), 해모필러스 솜너스(Haemophilus somnus), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 네이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 피시타치(Chlamydia psittaci), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 알로이오코커스 오티디티스(Alloiococcus otiditis), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 타이 피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라에쉬스(Salmonella choleraesuis), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 쉬겔라(Shigella), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 코린박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 아비움-마이코박테리움 인트라셀룰라에 컴플렉스(Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 렙토스피라 인터로간스(Leptospira interrogans), 보렐리아 버그도페리(Borrelia burgdorferi), 파스퇴렐라 해모리티카(Pasteurella haemolytica), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 액티노바실러스 플루로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 마이코플라스마 갈리셉티큠(Mycoplasma gallisepticum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아로부터 유래된 박테리아 항원이다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 척추 동물 숙주는 포유 동물, 조류 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 척추 동물 숙주는 인간, 소, 양, 돼지, 말, 개 및 고양이 종들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 프로모터는 진핵 생물 세포 내에서 활성이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 프로모터는 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터(immediate early promoter), 유인원 거세 포 바이러스(SCMV) 프로모터, 쥐 거세포 바이러스(MCMV) 프로모터, 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 잠복기 관련 프로모터-1(latency-associated promoter-1)(LAP1), 유인원 바이러스 40 프로모터, 인간 연장 인자 1 알파 프로모터 및 인간 근육 세포 특이적 데스민 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 임의의 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 폴리아데닐화 시그널은 토끼 베타-글로빈 폴리(A) 시그널, 합성 폴리 A, HSV 티미딘 키나제 폴리 A, 인간 알파 글로빈 폴리 A, SV40 폴리 A, 인간 베타 글로빈 폴리 A, 폴리오마 바이러스 폴리 A 및 소 성장 호르몬 폴리 A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 제1 전사 단위는 HIV의 gag 유전자 및 pol 유전자의 융합체로부터 gag-pol 융합 단백질을 발현한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 HIV의 gag 유전자 및 pol 유전자의 융합체, 또는 gag-pol 유전자는 HIV의 HXB2 분리물로부터 유래된다.
본 발명의 임의의 구체예에서, 제2 전사 단위는 HIV의 외피 유전자로부터 외피 단백질을 발현한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 외피 유전자는 HIV의 1차 분리물인 6101로부터 유래된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 제3 전사 단위는 HIV의 nef 유전자, tat 유전자 및 vif 유전자의 융합체(ntv)로부터 nef, tat 및 vif 융합 단백질(NTV)을 발현한다. 본 발명의 특정 구체예에서, HIV의 nef 유전자, tat 유전자 및 vif 유전자의 융합체, 또는 ntv 유전자는 HIV의 NL4-3 분리물로부터 유래된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 3개 전사 단위 플라스미드 내 제1 전사 단위의 전사 방향은 제2 전사 단위의 전사 방향과 반대 방향이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제1 전사 단위의 전사 방향은 제3 전사 단위의 전사 방향과 반대 방향이다.
본 발명의 임의의 구체예에서, 본 발명은 3개 전사 단위 플라스미드를 제공하는데, 이 플라스미드는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 선별 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 하나의 구체예에서, 선별 마커는 가나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 선별 마커의 위치는 스페이서 영역 1, 스페이서 영역 2 및 스페이서 영역 3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 선별 마커의 위치는 스페이서 영역 2이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 3개 전사 단위 플라스미드를 제공하는데, 이 플라스미드는 박테리아 복제 기점을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 복제 기점의 위치는 스페이서 영역 1, 스페이서 영역 2 및 스페이서 영역 3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 선별 마커의 위치는 스페이서 영역 3이다. 특정 구체예에서, 복제 기점은 복제의 pUC 기원이다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명은 3개 전사 단위 플라스미드를 제공하는데, 여기서 상기 플라스미드는 전체적인 크기가 약 15 Kbp 미만이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 1은 약 400 염기쌍 미만이고, 스페이서 영역 2는 약 1100 염기쌍 미만이며, 스페이서 영역 3은 약 1100 염기쌍 미만이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주에서 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물을 제공하며, 이 면역원성 조성물은, (a) HIV gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제1 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (b) (i) 제1 프로모터 및 제1 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전사 단위; (ii) 제2 프로모터 및 제2 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위를 포함하는 제2 DNA 플라스미드[여기서, 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이고; 상기 제1 폴리아데닐화 시그널 및 제2 폴리아데닐화 시그널은 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이며; 상기 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 상기 제2 전사 단위의 전사 방향과 반대 방향이거나, 또는 상기 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 제2 전사 단위의 전사 방향과 동일한 방향이며, 상기 제1 전사 단위 및 제2 전사 단위는 1 Kbp 이상의 스페이서 영역에 의하여 분리되어 있음]; 및 (c) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 형질 감염 촉진제는 부피바카인이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 제1 플라스미드 상에 존재하는 프로모터는 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터이고, 제1 플라스미드 상에 존재하는 폴리아데닐화 시그널은 소 성장 호르몬 폴리 A 폴리아데닐화 시그널이며, 상기 제1 DNA 플라스미드는 HIV의 gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는데, 여기서, 상기 HIV의 gag 유전자 및 pol 유전자의 융합체 또는 gag-pol 유전자는 HIV의 HXB2 분리물로부터 유래된다. 임의의 구체예에서, 제2 플라스미드 상에 존재하는 제1 프로모터는 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터이고, 제2 플라스미드 상에 존재하는 제1 폴리아데닐화 시그널은 SV40 폴리 A 폴리아데닐화 시그널이며, 폴리펩티드는 HIV의 NL4-3 분리물로부터 유래된 nef 유전자, tat 유전자 및 vif 유전자의 융합체(ntv)로부터 발현된 nef, tat 및 vif 융합 단백질(NTV)이다. 특정 구체예에서, 제2 플라스미드 상에 존재하는 제2 프로모터는 유인원 거세포 바이러스(SCMV) 프로모터이고, 제2 플라스미드 상에 존재하는 제2 폴리아데닐화 시그널은 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 시그널이며, 암호화된 외피 폴리펩티드는 HIV의 1차 분리물인 6101로부터 유래된다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주를 선택된 항원에 대해서 면역화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) HIV gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제1 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (b) (i) 제1 프로모터 및 제1 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전사 단위; (ii) 제2 프로모터 및 제2 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위를 포함하는 제2 DNA 플라스미드[여기서, 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이고; 상기 제1 폴리아데닐화 시그널 및 제2 폴리아데닐화 시그널은 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이며; 상기 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 상기 제2 전사 단위의 전사 방향과 반대 방향이거나, 또는 상기 제1 전사 단위의 전사 방향은 상기 제2 전사 단위의 전사 방향과 동일한 방향이며, 상기 제1 전사 단위 및 제2 전사 단위는 1 Kbp 이상의 스페이서 영역에 의하여 분리되어 있음]; 및 (c) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물을 상기 척추 동물 숙주에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 형질 감염 촉진제는 부피바카인이다. 특정 구체예에서, 제1 플라스미드 상에 존재하는 프로모터는 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터이고, 제1 플라스미드 상에 존재하는 폴리아데닐화 시그널은 소 성장 호르몬 폴리 A 폴리아데닐화 시그널이며, 상기 제1 DNA 플라스미드는 HIV의 gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는데, 여기서, 상기 HIV의 gag 유전자 및 pol 유전자의 융합체, 또는 gag-pol 유전자는 HIV의 HXB2 분리물로부터 유래된다. 임의의 구체예에서, 제2 플라스미드 상에 존재하는 제1 프로모터는 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터이고, 제2 플라스미드 상에 존재하는 제1 폴리아데닐화 시그널은 SV40 폴리 A 폴리아데닐화 시그널이며, 폴리펩티드는 HIV의 NL4-3 분리물로부터 유래된 nef 유전자, tat 유전자 및 vif 유전자의 융합체(ntv)로부터 발현된 nef, tat 및 vif 융합 단백질(NTV)이다. 특정 구체예에서, 제2 플라스미드 상에 존재하는 제2 프로모터는 유인원 거세포 바이러스(SCMV) 프로모터이고, 제2 플라스미드 상에 존재하는 제2 폴리아데닐화 시그널은 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 시그널이며, 암호화된 외피 폴리펩티드는 HIV의 1차 분리물인 6101로부터 유래된다. 하나의 구체예에서, 면역원성 조성물은 생체내 전기 천공법을 이용하여 포유 동물에 투여된다. 특정 구체예에서, 전기 천공법은 전기장 세기가 약 25～약 800 V/㎝인 전류로 근육에 전기 자극을 주는 것을 포함한다. 하나의 구체예에서, 형질 감염 촉진제는 부피바카인이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주에서 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 대하여 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물을 제공하며, 이 면역원성 조성물은, (a) HIV gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제1 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (b) HIV pol 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제2 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (c)(i) 제1 프로모터 및 제1 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전사 단위; (ii) 제2 프로모터 및 제2 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위를 포함하는 제3 DNA 플라스미드[여기서, 상기 제1 및 제2 프로모터는 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이고; 상기 제1 및 제2 폴리아데닐화 시그널은 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이며; 상기 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 상기 제2 전사 단위의 전사 방향과 반대 방향이거나, 또는 상기 제1 전사 단위의 전사 방향은 상기 제2 전사 단위의 전사 방향과 동일한 방향이며, 상기 제1 및 제2 전사 단위는 1 Kbp 이상의 스페이서 영역에 의하여 분리되어 있음]; 및 (d) 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 DNA 플라스미드[여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; 및 (e) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주를 선택된 항원에 대해서 면역화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은, (a) HIV gag 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제1 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (b) HIV pol 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제2 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (c) 제1 프로모터 및 제1 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전사 단위; (ii) 제2 프로모터 및 제2 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되 어 있는 HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위를 포함하는 제3 DNA 플라스미드[여기서, 상기 제1 및 제2 프로모터는 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이고; 상기 제1 및 제2 폴리아데닐화 시그널은 각각 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이며; 상기 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 상기 제2 전사 단위의 전사 방향과 반대 방향이거나, 또는 상기 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 상기 제2 전사 단위의 전사 방향과 동일한 방향이며, 상기 제1 및 제2 전사 단위는 1 Kbp 이상의 스페이서 영역에 의하여 분리되어 있음]; 및 (d) 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 DNA 플라스미드[여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; 및 (e) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물을 상기 척추 동물 숙주에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 전기 천공법은 전기장 세기가 약 25～약 800 V/㎝인 전류로 근육에 전기 자극을 주는 것을 포함한다. 하나의 구체예에서, 형질 감염 축진제는 부피바카인이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주에서 HIV에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물을 제공하는데, 이 면역원성 조성물은 (a) HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제1 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (b) HIV gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함 하는 제2 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (c) HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제3 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (d) 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 DNA 플라스미드[여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; 및 (e) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구체예에서, 형질 감염 촉진제는 부피바카인이다. 다른 구체예에서, 부피바카인을 함유하는 면역원성 조성물은 전기 천공법으로 투여된다. 특정 구체예에서, HIV 외피, gag-pol, nef-tat-vif 및 애쥬반트 폴리펩티드는 진핵 세포 내에서 발현된다. 하나의 구체예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 플라스미드는 진핵 세포 내에서 활성인 프로모터를 함유한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주를 선택된 항원에 대하여 면역화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제1 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (b) HIV gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제2 DNA 플라스미드[여 기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (c) HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제3 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (d) 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 DNA 플라스미드[여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; 및 (e) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물을 척추 동물 숙주에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 형질 감염 촉진제는 부피바카인이다. 다른 구체예에서, 부피바카인을 함유하는 면역원성 조성물은 전기 천공법으로 투여된다. 특정 구체예에서, HIV 외피, gag-pol, nef-tat-vif 및 애쥬반트 폴리펩티드는 진핵 세포 내에서 발현된다. 하나의 구체예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 플라스미드는 진핵 세포 내에서 활성인 프로모터를 함유한다.
본 발명의 임의의 구체예에서, 제1, 제, 제3 및 제4 플라스미드는, 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터, 유인원 거세포 바이러스(SCMV) 프로모터, 쥐 거세포 바이러스(MCMV) 프로모터, 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 잠복기 관련 프로모터-1(LAP1), 유인원 바이러스 40 프로모터, 인간 연장 인자 1 알파 프로모터 및 인간 근육 세포 특이적 데스민 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 함유한다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 플라스미드는 토끼 베타-글로빈 폴리(A) 시그널, 합성 폴리 A, HSV 티미딘 키나제 폴리 A, 인간 알파 글로빈 폴리 A, SV40 폴리 A, 인간 베타 글로빈 폴리 A, 폴리오마 바이러스 폴리 A 및 소 성장 호르몬 폴리 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리아데닐화 시그널을 함유한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주에서 HIV에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물을 제공하며, 이 면역원성 조성물은 전술한 바와 같은 4개의 플라스미드를 포함하고, 이들 플라스미드는 각각 가나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 선별 가능 마커를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 플라스미드는 각각 박테리아의 복제 기점을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 복제 기점은 pUC 복제 기점이다.
본 발명은 또한 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 상기 제4 DNA 플라스미드는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 2개의 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위와 제1 전사 단위를 포함한다. 하나의 구체예에서, 제1 전사 단위는 프로모터와 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 IL-12 p35 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 제2 전사 단위는 프로모터와 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 IL-12 p40 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주에서 HIV에 대한 면역 반응을 유 도하는 면역원성 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 면역원성 조성물은, (a) HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제1 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (b) HIV gag 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제2 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (c) HIV pol 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제3 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (d) HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제4 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (e) 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제5 DNA 플라스미드[여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; 및 (f) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 형질 감염 촉진제는 부피카인이다. 다른 구체예에서, 부피카인을 함유하는 면역원성 조성물은 전기 천공법으로 투여된다. 하나의 구체예에서, HIV 외피, gag, pol, nef-tat-vif 및 애쥬반트 폴리펩티드는 진핵 세포 내에서 발현된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주를 선택 항원에 대하여 면역화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제1 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (b) HIV gag 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제2 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (c) HIV pol 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제3 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (d) HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제4 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; (e) 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제5 DNA 플라스미드[여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; 및 (f) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물을 상기 척추 동물 숙주에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 형질 감염 촉진제는 부피바카인이다. 다른 구체예에서, 부피바카인을 함유하는 면역원성 조성물은 전기 천공법으로 투여된다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 플라스미드는 진핵 세포 내에서 활성인 프로모터를 함유한다. 임의의 구체예에서, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 플라스미드는 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터, 유인원 거세포 바이러스(SCMV) 프로모터, 쥐 거세포 바이러스(MCMV) 프로모터 및 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 잠복기 관련 프로모터-1(LAP1), 유인원 바이러스 40 프로모터, 인간 연장 인자 1 알파 프로모터 및 인간 근육 세포 특이적 데스민 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 함유한다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 플라스미드는 토끼 베타-글로빈 폴리(A) 시그널, 합성 폴리 A, HSV 티미딘 키나제 폴리 A, 인간 알파 글로빈 폴리 A, SV40 폴리 A, 인간 베타 글로빈 폴리 A, 폴리오마 바이러스 폴리 A 및 소 성장 호르몬 폴리 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리아데닐화 시그널을 함유한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주에서 HIV에 대하여 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 상기 면역원성 조성물은 전술한 바와 같은 5개의 플라스미드를 포함하고, 이들 플라스미드는 각각 가나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 선별 가능 마커를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 플라스미드는 각각 박테리아의 복제 기점을 추가로 포함하며, 복제 기점은 pUC 복제 기점이다.
본 발명은 또한 면역원성 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 제5 DNA 플라스미드는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 2개의 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위와 제1 전사 단위를 포함한다. 하나의 구체예에서, 제1 전사 단위는 프로모터와 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 IL-12 p35 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 제2 전사 단위는 프로모터와 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 IL-12 p40 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 측면 및 구체예에 관하여는 이하 상세한 설명에 개시되어 있다.
도 1은 3개의 별도 개방 해독 틀로부터 유래된 6개의 HIV 유전자 또는 유전자 구조물을 진핵 세포 내에서 발현하도록 구성한 예시적 삼중 전사 단위 DNA 플라스미드를 순환 형식으로 나타낸 모식도이다. 도 1은 동일한 플라스미드를 선형으로 나타내되, 보다 상세하게 묘사한 모식도이다. 다음과 같은 축약어가 사용되었다: SCMV: 유인원 거세포 바이러스 프로모터, HCMV: 인간 거세포 바이러스 프로모터, BGH 폴리A: 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널, kan: 가나마이신 내성 마커 유전자, HSV lap1: 허피스 심플렉스 바이러스 잠복기 관련 프로모터 1, SV40 폴리 A: 유인원 바이러스 40 폴리아데닐화 시그널, SV40sd/sa: 유인원 바이러스 40 스플라이싱 공여 요소 및 수용 요소, gag-pol: HIV gag-pol 융합체, ntv: HIV nef-tat-vif 융합체, env: HIV 외피.
도 2는 293 세포 내에서의 HIV gag 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포 를 표시된 플라스미드 DNA 발현 벡터 2㎍으로 형질 감염시켰다. 형질 감염후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다:
형질 감염된 플라스미드
102: HCMV-gag
201: HCMV-pol, SCMV-gag
203: HCMV-gag/pol/nef/tat/vif, SCMV-env
302: SCMV-gag/pol, HCMV-, Lap1-nef/tat/vif
204: HCMV-gag/pol, SCMV-env
303: SCMV-gag/pol, HCMV-env, Lap1-nef/tat/vif
001: 삽입부 부재 대조구 플라스미드.
도 3은 293 세포 내에서의 HIV pol 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포를 표시된 플라스미드 DNA 발현 벡터 2㎍으로 형질 감염시켰다. 형질 감염후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다:
형질 감염된 플라스미드
103: HCMV-pol
201: HCMV-pol, SCMV-gag
302: SCMV-gag/pol, HCMV-, Lap1-nef/tat/vif
203: HCMV-gag/pol/nef/tat/vif, SCMV-env
204: HCMV-gag/pol, SCMV-env
303: SCMV-gag/pol, HCMV-env, Lap1-nef/tat/vif
001 : 삽입부 부재 대조구 플라스미드
도 4는 293 세포 내에서 HIV nef/tat/vif(ntv)의 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포를 표시된 플라스미드 DNA 발현 벡터 2㎍으로 형질 감염시켰다. 형질 감염후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다:
형질 감염된 플라스미드
104: HCMV-ntv
105: Lap1-ntv
202: HCMV-ntv, SCMV-env
203: HCMV-gag/pol/nef/tat/vif, SCMV-env
302: SCMV-gag/pol, HCMV-, Lap1-nef/tat/vif
303: SCMV-gag/pol, HCMV-env, Lap1-nef/tat/vif
001 : 삽입부 부재 대조구 플라스미드
도 5는 293 세포 내에서의 HIV env 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포를 표시된 플라스미드 DNA 발현 벡터 2㎍으로 형질 감염시켰다. 형질 감염후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다:
형질 감염된 플라스미드
101: HCMV-env
202: HCMV-ntv, SCMV-env
203: HCMV-gag/pol/nef/tat/vif, SCMV-env
204: HCMV-gag/pol, SCMV-env
303: SCMV-gag/pol, HCMV-env, Lap1-nef/tat/vif
001 : 삽입부 부재 대조구 플라스미드
도 6은 293 세포 내에서 HIV gag의 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포를 표시된 플라스미드 DNA들을 조합하여 1㎍으로 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다:
래인 형질 감염된 플라스미드의 조합
1 301 (gag/pol) + 101 (env) + 104(ntv)
2 201 (gag, pol) + 202 (env, ntv)
3 203 (gag/pol/ntv, env)
4 303 (gag/pol, env, ntv)
5 101 (env) + 102(gag) + 103(pol) + 104(ntv)
도 7은 293 세포 내에서의 HIV gag 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포를 표시된 플라스미드 DNA들을 조합하여 1㎍으로 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다:
래인 형질 감염된 플라스미드의 조합
1 152 (gag/pol) + 101 (env) + 104(ntv)
2 201 (gag, pol) + 202(env, ntv)
3 203(gag/pol/ntv, env)
4 303(gag/pol, env, env)
5 101 (env) + 102(gag) + 103(pol) + 104(ntv)
6 001 (대조구)
도 8은 293 세포 내에서의 HIV ntv 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포를 표시된 플라스미드 DNA들을 조합하여 1㎍으로 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다
래인 형질 감염된 플라스미드의 조합
1 152 (gag/pol) + 101 (env) + 104(ntv)
2 201 (gag, pol) + 202(env, ntv)
3 203(gag/pol/ntv, env)
4 303(gag/pol, env, env)
5 101 (env) + 102(gag) + 103(pol) + 104(ntv)
6 001 (대조구)
도 9는 293 세포 내에서의 HIV pol 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포에 표시된 플라스미드 DNA를 표시된 농도로 조합하여 1㎍으로 형질 감염시켰다. 형 질 감염 후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다
래인 형질 감염된 플라스미드의 조합 형질감염된
플라스미드 농도(㎍)
1 001 (대조구) 2
2 201 (gag, pol) + 202(ntv, env) 1+1
3 204(gag/pol, env) + 104(ntv) 1+1
4 203(gag/pol/ntv, env) 2
5 302(gag/pol, ntv) + 101 (env) 1+1
6 303(gag/pol, env, ntv) 2
도 10은 293 세포 내에서의 HIV gag 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포에 표시된 플라스미드 DNA 를 표시된 농도로 조합하여 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다
래인 형질 감염된 플라스미드의 조합 형질감염된
플라스미드 농도(㎍)
1 001 (대조구) 2
2 201 (gag, pol) + 202(ntv, env) 1+1
3 204(gag/pol, env) + 104(ntv) 1+1
4 203(gag/pol/ntv, env) 2
5 302(gag/pol, ntv) + 101 (env) 1+1
6 303(gag/pol, env, ntv) 2
도 11은 293 세포 내에서의 HIV env 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포에 표시된 플라스미드 DNA를 표시된 농도로 조합하여 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다
래인 형질 감염된 플라스미드의 조합 형질감염된
플라스미드 농도(㎍)
1 001 (대조구) 2
2 201 (gag, pol) + 202(ntv, env) 1+1
3 204(gag/pol, env) + 104(ntv) 1+1
4 203(gag/pol/ntv, env) 2
5 302(gag/pol, ntv) + 101 (env) 1+1
6 303(gag/pol, env, ntv) 2
도 12는 293 세포 내에서의 HIV ntv 발현 결과를 나타내는 것이다. 293 세포에 표시된 플라스미드 DNA를 표시된 농도로 조합하여 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 48시간 경과시 웨스턴 블럿을 이용하여 세포 결합 HIV 단백질을 눈으로 관찰하였다. 특정 플라스미드에 대한 프로모터 및 개방 해독 틀은 다음과 같다
래인 형질 감염된 플라스미드의 조합 형질감염된
플라스미드 농도(㎍)
1 001 (대조구) 2
2 201 (gag, pol) + 202(ntv, env) 1+1
3 204(gag/pol, env) + 104(ntv) 1+1
4 203(gag/pol/ntv, env) 2
5 302(gag/pol, ntv) + 101 (env) 1+1
6 303(gag/pol, env, ntv) 2
DNA계 면역원성 조성물은 단백질 항원과 애쥬반트가 함께 투여되는 기존의 면역원성 조성물에 대한 대안이 된다. 대신, DNA계 면역원성 조성물에 있어서 DNA는 개체의 조직에 도입되는데, 이 DNA는 항원(들)을 암호화하고, 이 항원은 개체 조직의 세포에 의해 발현된다. 이와 같이 본원에 사용된 면역원성 조성물은, "DNA계 면역원성 조성물" 또는 "핵산계 면역원성 조성물"이라고도 칭하여 진다. 그러나, 복수 개의 유전자가 보호 면역 반응을 나타내는데 필요할 경우, 이 유전자들을 별도로 발현시키기 위해서는 복수 개의 플라스미드를 사용하여야 한다는 문제점이 있다. 이러한 점은 제조 및 조절 면에 있어서 장해물이 된다. 본 발명의 구체예는 동일한 세포 내에서 3개의 개방 해독 틀을 독립적으로 발현시킬 수 있는 플라스미드를 디자인함으로써 이러한 문제점에 대한 해결책을 제공한다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 유전자는 융합되어 다기능단백질(polyprotein)을 생성하고, 이러한 방식으로 단일 플라스미드로부터 다수의 단백질들이 발현될 수 있게 된다. 하나의 구체예에 의하면, 단일 플라스미드로부터 6개의 단백질이 발현된다.
다수의 요인들이 항원 유전자의 발현 및/또는 DNA계 면역원성 조성물의 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 요인들의 예로서는 플라스미드 벡터의 구성, 플라스미드 벡터의 크기, 항원 유전자를 발현시키는데 사용되는 프로모터의 선택, 플라스미드 상 전사 단위의 수와 크기, RNA 전사체의 안정성, 플라스미드 내 전사 단위의 배향, 플라스미드 내에서의 면역화 재현 가능성 및 삽입된 유전자의 안정성을 포함한다. 본 발명의 구체예는 상기와 같은 다수의 주요 매개 변수들을 최적화하는 플라스미드 디자인을 제공한다.
복수 개의 전사 단위를 보유하는 플라스미드 DNA 벡터의 디자인 및 최적화는 중요한 요소이다. 면역화된 개체에 투여된 항원의 실제 투여량을 개선시키기 위해서는 플라스미드의 크기는 최소화되어야 하는 반면에, 단백질 생산물과 생산된 단백질의 양은 최대화되어야 한다. 이러한 사항들을 조화시키기 위해서는 유전자의 배치, 전사 단위 간의 간격; 개방 해독 틀의 전사 방향; 발현 수준; 프로모터 크기, 배향 및 세기; 인핸서 크기, 배치, 배향 및 세기; 개방 해독 틀의 크기 및 구성; 조작의 용이성; 플라스미드의 안정성; 안전성; 및 개체를 면역화시키는데 필요한 벡터의 최종 투여량 등을 고려해야 한다.
면역화 시 DNA 플라스미드를 사용하는데 있어서 중요한 고려 사항은 플라스미드의 제조이다. 잠재적인 안전성에 관한 문제로 인하여, 제조 과정 및 최종 생산물은 철저한 정밀 검사와 품질 관리를 수행할 필요가 있다. 그 결과 공정 수행에 있어서 비용이 많이 들게 된다. 결과적으로, 복수 개의 플라스미드가 필요한 임의의 DNA 면역화는 그에 비례하여 비용이 더 많이 들게 되며 그 효율은 더 낮아지게 될 것이다. 따라서, 본 발명의 임의의 구체예에 있어서, 제조 비용을 낮출 필요가 있을 경우, 용도에 따라서 실제로 임의의 질병 진행에 대한 면역 반응을 유도하기에 적당한 단일 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
몇몇 경우에 있어서, 제조 비용이 증가함에도 불구하고, 각각 단일 전사 단위 또는 2개의 전사 단위를 함유하는 플라스미드들을 조합하여 사용하면, 더욱 유용한 면역원성 조성물을 얻을 수 있다. 그러한 경우, 최적의 수만큼의 플라스미드(효과적인 면역 반응을 유도하는데 필요한 유전자 모두를 암호화하는 플라스미드)를 포함하는 면역원성 조성물을 디자인하는 것이 중요하다. 각각 단일 전사 단위를 함유하는 복수 개의 플라스미드들을 사용하는 대신에, 필요한 유전자 모두를 발현하도록 3개의 전사 단위를 함유하는 플라스미드를 사용함에 있어서는 특정 항원의 면역원성과 균형을 맞추어야 한다. 단일 전사 단위 플라스미드들을 조합하여 사용하는 경우의 한 가지 이점은 개개의 유전자가 동일한 강력 프로모터에 의해 유도될 수 있다는 점이다. 예를 들어, HCMV 프로모터는 플라스미드 당 하나씩 사용되는 것이 아니라, 3개 전사 단위 플라스미드의 경우에서와 마찬가지로 각 플라스미드에 사용될 수 있다. 이와는 반대로, 3개 전사 단위 플라스미드를 사용할 경우 HCMV 프로모터는 내부 상동성 재조합 가능성과 플라스미드 불안정성을 차단하도록 한 번만 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 항원 발현 플라스미드를 포함하는 조성물에 있어서, 하나의 플라스미드는 단일 전사 단위를 보유하고 또 다른 플라스미드는 2개의 전사 단위를 보유한다. 이러한 조성물에 있어서, HCMV 프로모터는 단일 전사 단위를 보유하는 플라스미드 내에서 단일 항원 또는 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있으며, 또한 2개의 전사 단위를 보유하는 플라스미드 내에서 단백질 또는 융합 단백질 중 어느 하나를 발현시키는 데 사용될 수도 있다.
병원균이 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)인 경우, 면역원성 조성물은 4개의 단일 전사 단위 플라스미드를 포함하는데, 이 플라스미드는 각각 HIV 외피 폴리펩티드, HIV gag-pol 융합 폴리펩티드, HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드, 그리고 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 원하는 경우, HIV gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단일 전사 단위 플라스미드 대신에, 각각 HIV gag 폴리펩티드 및 HIV pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 2개의 단일 전사 단위 플라스미드가 사용될 수 있다[그러므로, 이러한 측면에서 5개의 플라스미드가 사용됨].
일반적으로, 프로모터의 기원에 따라서 이 프로모터는 조직 특이성과 mRNA 합성 개시 효율이 상이하다[Xiang외 다수, Virology, 209:564-579 (1994); Chapman외 다수, Nucl. Acids. Res., 19:3979-3986 (1991)]. 현재, 대부분의 DNA계 면역원성 조성물은 포유 동물계에서 거세포 바이러스(CMV)로부터 유래된 바이러스 프로모터에 의존적이다. 상기 CMV는 그 기원이 인간 또는 유인원일 수 있다. 이 조성물은 다수의 포유 동물 종에 있어서 근육 및 피부 면역화에 우수한 효능을 나타낸다. DNA 면역화에 의하여 유도되는 면역 반응에 영향을 미치는 것으로 알려진 다른 인자는 DNA 전달 방법으로서; 비경구 경로는 유전자 운반 속도가 느리고 유전자 발현 변이율이 상당히 높다. 문헌[Montgomery외 다수, DNA Cell Bio., 12:777-783 (1993)]을 참조하시오. 유전자 총을 사용하는 플라스미드의 고속 접종법은 마우스의 면역 반응을 강화시키는데, 아마도 DNA 형질 감염의 효율이 보다 높고 수지상 세포에 의해 항원이 보다 효율적으로 제공되기 때문일 것이다. 문헌[Fynan외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci, 90:11478-11482 (1993B); Eisenbraun외 다수, DNA Cell Biol., 12: 791-797 (1993)]을 참조하시오. 본 발명의 벡터 함유 핵산계 면역원성 조성물은 또한 당 업계에 공지된 기타 방법 예를 들어, 형질 감염, 전기 천공법, 미세 주입법, 형질 도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전법, 리포펙션(lipofection)(리소좀 융합) 또는 DNA 벡터 운반법에 의해 원하는 숙주에 도입될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Wu외 다수, J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut외 다수, 캐나다 특허 출원 제 2,012,311 호(1990년 3월 15일 출원)]을 참조하시오.
그러므로, 본 발명은 척추 동물 예를 들어, 포유 동물, 조류 및 어류의 유전적 면역화용인 플라스미드, 면역원성 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 플라스미드 면역원성 조성물 및 방법은 특히 포유 동물 개체 예를 들어, 인간, 소, 양, 돼지, 말, 개 및 고양이 종에 유용할 수 있다. 플라스미드, 면역원성 조성물 및 방법에 관하여는 이하 상세히 기술되어 있으며, 당 업자에게 공지된 사항이 개시되어 있는 참고 문헌에 인용된 인용 문헌을 참고로 하고 있다.
A. DNA 플라스미드, 벡터, 구성물, 면역원성 조성물
플라스미드, 구성물 및 벡터라는 용어는 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되고 있다. 본원에 사용된 "플라스미드"란 용어는, 조절 서열, 개방 해독 틀, 클로닝 위치, 종결 코돈, 스페이서 영역 또는 구조적 또는 기능적 영역에 대해 선택된 기타 서열을 암호화하는 다양한 핵산 분자가 집합하여 척추 동물 숙주에서 유전자를 발현하는 벡터로서 사용되는 환형의 수퍼코일(supercoil) DNA 분자를 의미한다. 뿐만 아니라, 본원에 사용된 "플라스미드"란, 박테리아 균종 내에서 복제할 수 있는 것이다. 본원에 사용된 "구성물"이란 용어는 유전자 및 조절 요소가 특이적으로 배열되어 있는 특정 벡터 또는 플라스미드를 의미한다. 핵산 서열은 "외인성" 즉, 벡터가 도입되는 세포에 외래일 수 있으며, "이종성" 즉, 서열들이 상이한 유전적 근원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 "상동성" 즉, 서열들이 세포 내에서는 상호 구조적으로 관련되어 있으나 숙주 세포 핵산 내 임의의 위치에서는 보통 발견되지 않ㅇ을 수 있다. 당업자는 벡터를 구성하거나 본 발명의 플라스미드를 표준적인 재조합 기술[예를 들어, 문헌(Sambrook외 다수, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989) 및 여기에 인용되어 있는 참고 문헌 예를 들어, pp 3.18-3.26 및 pp 16.17-16.27 및 Ausubel외 다수, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience Publishers, New York (1995); 상기 문헌 모두 본원에 참고용으로 인용되어 있음) 참조]을 통해서 변형시키는데 익숙할 것이다.
"벡터"란 용어는 항원(들)을 암호화하는 특정 핵산 분자가 발현될 수 있는 세포에 그 핵산 분자를 도입하도록 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 의미하는 것으로 사용된다. 상기 벡터로서는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)를 포함한다. "발현 벡터"란 용어는 전사될 수 있는 유전자 생산물의 최소한의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 일부의 경우에 있어서, RNA 분자는 이후 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 예를 들어, 발현 간섭 RNA(eiRNA), 단 간섭 RNA(siRNA), 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산과 같은 경우에 있어서, 상기 서열들은 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열" 즉, 특정 숙주 유기체 내에서 암호화 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 전사 및 가능한 번역에 필요한 핵산 서열을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 지배하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 갖는 핵산 서열을 함유할 수 있는데, 그에 관하여는 이하에 기술되어 있다.
"핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 복수 개의 뉴클레오티드[즉, 당(예를 들어, 리보즈 또는 데옥시리보즈), 인산기 및 교환 가능한 유기 염기 즉, 치환 피리미딘계 염기(예를 들어, 시토신(C), 티민(T) 또는 우라실(U)) 또는 치환 퓨린계 염기(예를 들어, 아데닌(A) 또는 구아닌(G))에 결합되어 있는 분자]라는 의미와 호환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 상기 용어는 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드 모두를 의미한다. 상기 용어는 또한 폴리뉴클레오시드(즉, 폴리뉴클레오티드에서 인산기가 없는 것)와 임의의 기타 유기 염기 함유 중합체도 포함한다. 핵산 분자는 현존하는 핵산 공급원(예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA)으로부터 얻어질 수 있으나, 합성(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성법)에 의해서도 얻어질 수 있다.
본원에 사용된 "각각 상이한 전사 단위로부터 유래된"이란 어구는 유사한 기능을 가진 각각의 조절 제어 요소 예를 들어, 프로모터가 모두 상이한 기원의 것이며, 재조합을 통하여 유전적 불안정성이 플라스미드 내에서 나타날 수 있는 정도로 서로 동성이 아닌 경우를 의미한다. 문헌[Herrera외 다수, Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:548-551 (2000)]을 참조하시오.
본 발명의 면역원성 조성물은 면역 반응을 일으키는 3개 이상의 선택된 항원을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 3중 전사 단위 DNA 플라스미드를 포함한다. 상기 플라스미드에 있어서, 선택된 항원은 포유 동물 또는 척추 동물 세포 내에서 이 항원이 발현을 유도하는 조절 서열의 제어하에 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 또한 선택된 항원을 암호화하는 플라스미드를 조합하여 포함한다. 이러한 조합은 부가의 선택 항원을 암호화하는 2개, 3개 또는 4개의 플라스미드로 이루어질 수 있다. 이와 같이 조합하여 존재하는 임의의 특정 플라스미드 상에는 1개, 2개 또는 3개의 전사 단위가 있을 수 있다. 뿐만 아니라, 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 부가의 플라스미드도 본 발명의 면역원성 조성물 중에 포함될 수 있다.
본 발명에 유용한 비 바이러스성 플라스미드 벡터는 선택된 면역원 및 항원을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리 및 정제된 DNA 서열을 함유한다. 표적 항원을 암호화하는 DNA 분자는 외인성 또는 이종성 핵산 서열을 암호화하도록 디자인 된 바이러스 또는 비 바이러스 공급원 예를 들어, 박테리아 종 또는 종양 항원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 플라스미드 또는 벡터는 바이러스 또는 파지로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 다양한 비 바이러스성 벡터는 당 업계에 공지되어 있으며, 그 예로서는 플라스미드, 박테리아 벡터, 박테리오파지 벡터, "나출형" DNA, 양이온 지질 또는 중합체로 농축된 DNA, 그리고 기타 형질 감염 촉진제 예를 들어, 국소 마취제인 부피바카인(이하 기술함)과 함께 제형화된 DNA를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 플라스미드 성분은 현존하는 벡터로부터 얻을 수 있다. 박테리아 벡터의 예로서는 바실레 칼메테 구에린(bacille Calmette Guerin)(BCG), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 이.콜라이(E.coli) 및 리스테리아(Listeria)로부터 유래된 서열들(이에 한정되는 것은 아님)을 포함한다. 플라스미드 성분을 얻는데 적당한 플라스미드 벡터로서는 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pK37, pKC101, pAC105, pVA51, pKH47, pUB110, pMB9, pBR325, Col E1, pSC101, pBR313, pML21, RSF2124, pCR1, RP4, pBAD18 및 pBR328를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
기타 성분들도 유도성 발현 벡터로부터 얻을 수 있다. 적당한 유도성 에스케리챠 콜라이 발현 벡터의 예로서는 pTrc(Amann외 다수, Gene, 69:301-315 (1988)), 아라비노즈 발현 벡터(예를 들어, pBAD18, Guzman외 다수, J. Bacteriol., 177:4121-4130 (1995)) 및 pETIId(Studier외 다수, Methods in Enzymology, 185:60-89 (1990))을 포함한다. pTrc 벡터로부터 표적 유전자를 발현시키는 것은 혼성 trp-lac 융합 프로모터로부터 유래된 숙주 RNA 중합효소 전사에 의존한다. pETIId로부터 표적 유전자를 발현시키는 것은 공동 발현된 바이러스 RNA 중합효소 T7 gnI에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터에 의한 전사에 의존한다. 이러한 바이러스 중합효소는 lacUV5 프로모터의 전사 제어하에 있는 T7 gn1 유전자를 보유하는 기존 프로파지로부터 유래된 숙주 균종 BL21(DE3) 또는 HMS I74(DE3)에 의해 공급된다. pBAD 시스템은 araC 유전자에 의해 조절되는 유도성 아라비노즈 프로모터에 의존한다. 프로모터는 아라비노즈의 존재 여부에 따라서 유도된다.
조절 성분은 외래 공급 성분 예를 들어, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex) 유도성 마우스 유방암 바이러스(MMTV) 프로모터, 테트라사이클린 유도성 시스템(Gossen외 다수, Science 268:1766-1769 (1995)) 및 레파마이신 유도성 시스템(Magari외 다수, J clin Invest, 100:2865-2872 (1997))에 의해 조절되는 유도성 프로모터에서 얻을 수 있다.
진핵 생물 내 전사 제어 시그널은 프로모터 및 인핸서 요소로 이루어져 있다. 본원에 사용된 "프로모터" 및 "인핸서"는 전사에 관여하는 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 DNA 서열을 의미한다. 문헌[Maniatis, T.,외 다수, Science 236:1237 (1987)]을 참조하시오. 전술한 바와 같이, 5'-비번역 영역은 프로모터 및 인핸서와 합하여져 선택된 항원의 발현을 증가시킬 수 있다. 원하는 포유 동물 또는 척추 동물 개체 내에서 항원을 발현시키는 프로모터, 인핸서 및 기타 조절 서열은 항원을 발현시키는데 유용하다고 알려진 다양한 프로모터 목록으로부터 유사하게 선택될 수 있다. 이와 같이 다양한 프로모터는 이하에 개시되어 있다. 이하 기술된 바와 같이 면역원성 DNA 플라스미드 조성물의 구체예에 있어서, 유용한 프로모터로서는 인간 거세포 바이러스(HCMV) 프로모터/인핸서[예를 들어, 미국 특허 제 5,158,062 호 및 동 제 5,385,839 호; 본원에 참고용으로 인용됨], 인간 허피스 바이러스 잠복기 관련 프로모터 1 및 2(HSVLap1 및 HSVLap2: 종종 "잠복-활성 프로모터 1 및 2"라고도 칭함), 그리고 유인원 거세포 바이러스(SCMV) 프로모터 인핸서가 있다. 문헌[Goins W.F.외 다수, J. Virology 68:2239-2252 (1994); Soares, K. J.외 다수, Virology 70:5384-5394; Goins W.F.외 다수, J. Virology 73:519-532 (1999)]을 참조하시오. 쥐 거세포 바이러스(MCMV) 프로모터도 사용하기 적당하다.
기타 유용한 전사 제어 요소로서는 전사후 조절 요소 예를 들어, 구성 운반 인핸서(CTE) 또는 CTE-유사 요소 예를 들어, RNA 이동 요소(RTE)를 포함하는데, 이것들은 스플라이싱되지 않았거나 또는 부분적으로 스플라이싱된 RNA를 세포질로 운반하는 것을 보조한다. 문헌[미국 특허 제 5,585,263 호, Hammarskjold외 다수 및 Zolotukhin외 다수, J. Virol.68:944-7952 (1994)]을 참조하시오. CTE 또는 RTE가 발현을 향상시키는 것으로 파악되고, 또한 다수의 유전자가 번역 후 제어 요소의 존재를 필요로 하기 때문에, 상기 CTE 또는 RTE가 요망된다. 상이한 경로를 이용하여 작용하는 CTE 또는 CTE-유사 요소로서는 여러 가지 종류의 것이 존재한다. 문헌[Tabernero외 다수, J. Virol. 71 :95-101 (1997)]을 참조하시오. 또한, CTE를 대체할 수 있는 전사후 제어 요소의 새로운 유형에 관하여 개시되어 있는 국제 출원 WO 99/61596을 참조하시오.
유전자 발현은 또한 mRNA 축적을 지지하고, mRNA 안정성을 증가시키는 수준에서 작용을 하거나, 또는 번역 수준을 보다 상승시키는 모든 기작에 리보좀을 개입시키는 것을 촉진함으로써 작용을 하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포유함으로써 강화된다. 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 임의의 5' 비번역 영역 및 인트론은 프로모터 및 인핸서와 결합되어 유전자 발현 수준을 더욱 상승시킬 수 있는 복합 프로모터 또는 키메라 프로모터를 생산할 수 있다.
유전자 발현을 증가시키는 데 유용한 5' 비번역 영역의 예로서는, 프로모터의 하류에 삽입되어, 프로모터의 특이성을 변형시키지 않고 번역을 증가시킴으로써 유전자 또는 트랜스 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 아데노바이러스 3 분체(tripartite) 리더 서열(Adtp)을 포함한다. 문헌[W. Sheay외 다수, Biotechniques 15(5):856-62 (1993)]을 참조하시오. 침팬지 및 마우스 연장 인자 1 알파(EF-1α) mRNA의 5' UTR은 RNA 전사 및/또는 RNA 안정성을 증가시킴으로써 유전자 발현을 강화하는 것으로 공지된 인트론을 함유한다. 문헌[S.Y. Kim외 다수, J Biotechnol. 14;93(2): 183-7 (1993)]을 참조하시오. 진핵 생물 개시 인자 4g(eIF4g)를 암호화하는 mRNA의 5'-UTR은 추정 내부 리보좀 도입 위치(IRES)가 존재하는 것을 특징으로 하고, 이것은 강력한 프로모터 활성을 나타낸다. 문헌[B. Han B. & J.T. Zhang Mol Cell Biol 22(21): 7372-84 (2002)]을 참조하시오. 더욱이, 인간 열 충격 단백질 70(Hsp70) mRNA의 5'UTR은 정상 세포 배양 조건하에서 mRNA 번역 효율을 몇 배 증가시키는 요소를 포함한다. 문헌[S. Vivinus외 다수,. Eur J Biochem. 268(7): 1908-17 (2001)]을 참조하시오. NF-카파B 억제 인자의 5'UTR은 잠재적 IRES로서 작용을 할 뿐만 아니라, 단일 시스트론 mRNA 내부에서 번역 인핸서로서의 기능을 한다. 문헌[A. Oumard외 다수, Mol Cell Biol. 20(8):2755-9 (2000)]을 참조하시오. CAP과 개시 코돈 사이에 결합 및 부가될 경우, SV40 5'UTR과, 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV)의 제1형 장형 말단 반복부(SUR) 유래 R 영역은 mRNA 안정화를 통하여 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 문헌[Y. Takebe외 다수, Mol Cell Biol. 8(1):466-472) (1988)]을 참조하시오.
본 발명의 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자, DNA 플라스미드 또는 벡터내 포유용 조절 서열로서는 프로모터 서열, 인핸서 서열, 5' 비번역 영역 서열, 인트론, CTE, RTE, 폴리아데닐화 서열, 스플라이싱 공여 서열 및 스플라이싱 수용 서열, 번역될 유전자의 처음과 마지막 부위에 각각 위치하는 전사 개시 및 종결 위치, 전사된 영역 내 번역을 위한 리보좀 결합 위치, 에피토프 태그, 핵 국소화 서열, 내부 리보좀 도입 위치(IRES) 요소, 골드버그-호그네스 "TATA" 요소, 제한 효소 절단 위치, 선별 마커 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 인핸서 서열은 예를 들어, SV40 DNA의 72 bp 직렬 반복부 또는 레트로바이러스의 장형 말단 반복부 즉, LTR 등을 포함하며, 이는 전사 효율을 증가시키는데 사용된다. 문헌[Wasylyk,외 다수, Nucleic Acid Res. 12:5589-5608 (1984)]을 참조하시오.
DNA 플라스미드에 유용한 기타 성분들 예를 들어, 복제 기점, 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리A, 유인원 바이러스 40(SV40) 폴리A), 약물 내성 마커(예를 들어, 가나마이신 내성 마커) 등은 또한 널리 공지된 서열 예를 들어, 실시예에 기술된 서열들과 이하에 구체적으로 기술한 서열로부터 선택될 수도 있다.
개별 프로모터 및 기타 공통된 플라스미드 요소를 선택하는 것은 통상적인 것으로서, 이러한 서열들 대다수는 본 발명에 유용한 플라스미드를 디자인하는데 유용하다. 예를 들어, 문헌[Sambrook외 다수, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989) 및 여기에 인용된 참고 문헌 예를 들어, pp 3.18-3.26 및 pp 16.17-16.27 및 Ausubel외 다수, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)]을 참조하시오. 본 발명에 유용한 플라스미드의 모든 성분들은 당업자에 의하여 당 업계에 공지된 재료와 제약 산업에 사용될 수 있는 것들로부터 용이하게 선택될 수 있다.
항원 또는 폴리펩티드를 발현하는 적당한 유전자의 예는 이하에 기술된 바와 같이 확인된다. 본원의 플라스미드 및 면역원성 조성물의 하나의 구체예에 있어서, 선택된 항원으로서는 HIV-1 항원 예를 들어, gag, pol, env, nef, vpr, vpu, vif 및 tat 유전자에 의하여 발현되는 항원들을 포함한다. 하나의 구체예에서, DNA 플라스미드의 암호화 및 비 암호화 서열 그리고 기타 성분들은 예를 들어, 항원 제법에 관하여 이하에 기술된 바에 따라서, 목적 숙주에 적당한 코돈을 선택하고 임의의 억제 서열을 제거함으로써 최적화된다.
본 발명의 구체예에 따라서, 조성물은 3개 이상의 선택 항원을 발현하는 하나의 플라스미드를 함유한다. 대안적으로, 플라스미드 조성물은 또한 동일한 선택 항원 또는 목적 폴리펩티드의 3개 이상의 복사체를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 하나의 DNA 플라스미드를 포함한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 조성물은 복수 개의 개방 해독 틀로부터 복수 개의 선택 항원을 발현하는 하나의 플라스미드를 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 플라스미드 조성물은 복수 개의 선택 항원 예를 들어, 상이한 계통 분기로부터 얻은 복수 개의 env 유전자를 암호화하는 유사한 개방 해독 틀의 복수 개의 복사체를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 하나의 DNA 플라스미드를 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 각각 단일의 항원을 발현하는 플라스미드들을 조합하여 사용하면 더욱 유효한 면역원성 조성물을 얻을 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 본 발명은 각각 HIV 면역원 또는 보조제를 암호화하는 4개의 플라스미드를 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다. 이와 같이 하나의 특이 면역원성 조성물은 다음과 같은 4개의 플라스미드를 조합하여 포함한다: (a) HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 단일 전사 단위를 보유하는 제1 DNA 플라스미드; (b) HIV gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 단일 전사 단위를 보유하는 제 2 DNA 플라스미드; (c) HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 단일 전사 단위를 보유하는 제3 DNA 플라스미드; (d) 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 제4 DNA 플라스미드; 및 (e) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상. 특정 구체예에서, HIV 유전자 각각을 발현시키는 프로모터는 HCMV 프로모터이고, HIV 유전자 각각에 대한 폴리 A 서열은 소 성장 호르몬 폴리 A이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 각각 단일 항원을 발현하는 플라스미드들을 조합하여 사용하는 것이 바람직한데, 이는 개별 폴리펩티드를 암호화하는 더욱 많은 개별 유전자와 융합 폴리펩티드를 암호화하는 보다 적은 융합 유전자를 함유하는, 더욱 많은 플라스미드를 사용하는 경우에 유리할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 본 발명은 각각 HIV 면역원 또는 보조제를 암호화하는 5개의 플라스미드를 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 구체예에서, 면역원성 조성물은 (a) HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 단일 전사 단위를 보유하는 제1 DNA 플라스미드; (b) HIV gag 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 단일 전사 단위를 보유하는 제 2 DNA 플라스미드; (c) HIV pol 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 단일 전사 단위를 보유하는 제3 DNA 플라스미드; (d) HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 단일 전사 단위를 보유하는 제4 DNA 플라스미드; (e) 애쥬반트 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 제5 DNA 플라스미드를 포함한다. 특정 구체예에서, HIV 유전자 각각을 발현시키는 프로모터는 HCMV 프로모터이고, HIV 유전자 각각에 대한 폴리 A 서열은 소 성장 호르몬 폴리 A이다.
추가의 구체예에서, DNA 플라스미드 및 면역원성 조성물은 개별 DNA 플라스미드 성분으로서 또는 항원-함유 DNA 플라스미드의 일부로서, 바람직한 사이토카인, 림포카인 또는 기타 유전자 애쥬반트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수도 있다. 핵산 서열이 사용될 수 있는 적당한 애쥬반트는 이하에 제공되어 있다. 본 발명에 예시된 구체예에 있어서, 본 발명의 DNA 플라스미드 조성물과 함께 투여되는 바람직한 사이토카인은 인터루킨-12이다.
DNA 플라스미드 조성물은 예를 들어, 이하 기술된 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체 중의 형태로 투여될 수 있다. 본 조성물은 임의의 선택된 투여 경로에 의하여 투여될 수 있지만, 바람직한 투여 방법의 하나의 구체예로서는 이하에 기술된 바와 같이, 형질 감염 촉진제인 부피바카인과 플라스미드 분자를 포함하는 조성물을 근육 내 동시 투여하는 방법이 있다.
B. 플라스미드 내 요소의 물리적 배열
척추 동물 면역원성 조상물을 디자인하는 데 있어서 실질적으로 고려할 사항은 개체를 면역화시킬 때 효과적으로 투여될 수 있는 DNA의 양이다. 투여량을 고려할 때, 플라스미드의 전체 크기를 제한함과 동시에 플라스미드 내 완전한 전사 단위의 수를 최대화하면, 플라스미드 DNA 디자인을 생성하는 방안을 제공한다. 플라스미드 크기를 최소화하고 발현되는 유전자의 수를 최대화하였을 때의 이점은 주입된 DNA 1㎍ 당 운반되는 면역원성 단백질의 양이 증가하게 된다는 점이다. 또한, 벡터 크기가 증가하면, 벡터의 불안정성도 증가한다. 문헌[Herrera외 다수,, Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:548-551 (2000)]을 참조하시오. 따라서, 이러한 목표를 달성하기 위해서는, 개별 조절 제어 요소 예를 들어, 프로모터의 크기를 고려하여 이것과 소정의 발현 수준에 필요한 프로모터의 세기의 균형을 맞추어야 한다. 이와 유사하게, 개방 해독 틀의 크기는 전체적인 플라스미드의 크기에 기여한다. 본원에 사용된 전사 단위 사이의 DNA 영역[즉, 조절 또는 선택 항원 암호화 기능을 갖지 않는 DNA에 의해 점유된 영역]을 "스페이서 영역(spacer region)"이라고 칭한다. 스페이서 영역의 크기는 전사 단위 사이의 전사 방해 수준, 입체 장애 수준 및 전체 플라스미드 크기를 결정하는데 있어서 중요하다. 그러므로, 각 요소의 크기는, 그 요소가 단백질을 암호화하는 조절 제어 또는 스페이서 영역일 경우, 신중하게 고려해야 할 것이며 염기 쌍의 최소 유효 수량에 한정되어야 한다.
본 발명의 구체예는 전체 길이가 약 18 킬로 염기쌍(kb) 이하인 삼중 전사 단위 DNA 플라스미드를 제공한다. 대안적인 구체예에서, 본 발명은 전체 길이가 약 17 kb 이하인 삼중 전사 단위 DNA 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 다른 구체예는 전체 길이가 약 16 킬로 염기쌍(kb) 이하인 삼중 전사 단위 DNA 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 임의의 구체예는 전체 길이가 약 15 kb 이하인 삼중 전사 단위 DNA 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 다른 구체예는 전체 길이가 약 14 kb 이하인 삼중 전사 단위 DNA 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 특정 구체예는 전체 길이가 약 13 kb 이하인 삼중 전사 단위 DNA 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 특정 구체예는 전체 길이가 약 12 kb 이하인 삼중 전사 단위 DNA 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 다른 구체예는 전체 길이가 약 11 kb 이하인 삼중 전사 단위 DNA 플라스미드를 제공한다.
본원에 사용된 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위에서 20% 이내에 속하는 경우를 의미한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 3개의 전사 단위간 전사 방향의 배향은 DNA 플라스미드 디자인에 있어서 또 다른 고려 사항이다. 분자 생물학 업계의 숙련자는 환형 DNA 플라스미드에는 전사 방향이 2가지 뿐이라는 것을 파악하고 있을 것이다. 그러므로, 3개의 전사 단위를 보유하는 플라스미드 내에서 2개 이상의 전사 단위는 동일한 방향으로 진행할 것이다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 제2 전사 단위의 발현 방향과는 반대 방향이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 제2 전사 단위의 발현 방향과 반대 방향이고, 제3 전사 단위의 전사 방향은 제2 전사 단위와 동일한 방향이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 제2 전사 단위의 발현 방향과 반대 방향이고, 제3 전사 단위의 전사 방향은 제1 전사 단위와 동일한 방향이다.
당업자는 전사 단위의 번호 메김에 있어서, "제1", "제2" 및 "제3"은 오로지 편의를 위해 사용한 것임을 파악할 수 있을 것이다. 3개의 전사 단위는 플라스미드 둘레를 따라서 임의의 순서로 정렬될 수 있다.
2개의 전사 단위를 보유하는 플라스미드에 있어서, 2개의 전사 단위에 대한 전사 방향에 관하여는 임의의 제약이 따른다. 2개의 전사 단위에 대한 전사 방향이 반대 방향이라면, 상기 2개의 전사 단위는 스페이서 영역(200 bp)에 의해, 대안적으로는 300 bp의 스페이서 영역, 또는 대안적으로는 400 bp의 스페이서 영역에 의해 서로 구분되어 있을 수 있다.
2개의 전사 단위를 보유하는 플라스미드에서, 만일 2개의 전사 단위에 대한 전사 방향이 동일한 방향이라면, 2개의 전사 단위는 약 500 bp 이상의 스페이서 영역에 의해 서로 구분되어 있어야 한다. 다른 구체예에서, 2개의 전사 단위는 약 600 bp 이상의 스페이서 영역에 의해 서로 구분되어 있어야 한다. 또 다른 구체예에서, 2개의 전사 단위는 약 700 bp 이상의 스페이서 영역에 의해 서로 구분되어 있어야 한다. 임의의 구체예에 있어서, 2개의 전사 단위는 약 800 bp 이상의 스페이서 영역에 의해 서로 구분되어 있어야 한다. 다른 구체예에 있어서, 2개의 전사 단위는 약 900 bp 이상의 스페이서 영역에 의해 서로 구분되어 있어야 한다. 또 다른 구체예에 있어서, 2개의 전사 단위는 약 1000 bp 이상의 스페이서 영역에 의해 서로 구분되어 있어야 한다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 제2 전사 단위의 발현 방향과 동일한 방향이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 제2 전사 단위의 발현 방향과 동일하고, 제3 전사 단위의 전사 방향은 제2 전사 단위와 동일한 방향이다. 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 제2 전사 단위의 발현 방향과 동일하고, 제3 전사 단위의 전사 방향은 제1 전사 단위와 반대 방향이다.
스페이서 영역의 크기는 전사 단위들 사이의 전사 방해를 완화시키고, 입체 장애를 감소시키며, 전체적인 플라스미드의 크기를 조절하도록 조작할 수 있는 하나의 변수이다. 도 1에 나타낸 구체예에 있어서, SCMV 및 HCMV 프로모터 사이에 위치하는 전사 단위 1 및 2를 스페이서 영역이 구분하고 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 전사 단위 1 및 2를 구분하는 스페이서 영역을 "스페이서 영역 1"이라 칭한다. 도 1에 나타낸 다른 구체예에 있어서, SV 40 폴리 A 및 HSV Lap1 프로모터 사이에 위치하는 전사 단위 2 및 3을 스페이서 영역이 구분하고 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 전사 단위 2 및 3을 구분하는 스페이서 영역을 "스페이서 영역 2"라 칭한다. 도 1에 나타낸 구체예에 있어서, BGH 폴리 A 및 토끼 베타글로빈 폴리 A 사이에 위치하는 전사 단위 3 및 1을 세 번째 스페이서 영역이 구분하고 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 전사 단위 3 및 1을 구분하는 스페이서 영역을 "스페이서 영역 3"이라 칭한다.
본 발명의 다른 특징은 진핵 생물 플라스미드의 스페이서 영역을 사용하여 전체적인 플라스미드 크기를 최소화시켜 플라스미드 및/또는 애쥬반트의 기능을 수행할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 도 1에 나타낸 구체예에 있어서, 스페이서 영역 3은 박테리아 복제 기점을 포함한다. 또한, 도 1에 나타낸 구체예에 있어서, 스페이서 영역 2는 박테리아 내 성장을 위한 가나마이신 유전자를 포함한다. 다른 구체예에서, 스페이서 영역은 면역 반응을 자극하는 CpG 섬 서열(island sequence)을 포함한다. 다른 구체예에서, 스페이서 영역은 항원의 발현을 강화시키는 CTE 및/또는 RTE 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 스페이서 영역은 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역은 발현을 강화하는데 유용한 것으로 공지되어 있는 비번역 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 5 kb 미만, 또는 약 4 kb 미만이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 3 kb 미만, 또는 약 2 kb 미만이다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 1 kb 미만이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 800 ～ 약 1000 염기쌍(bp)이다. 본 발명의 대안적인 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 600 ～ 약 800 bp이다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 400 ～ 약 600 bp이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 300 ～ 약 400 bp이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 400 bp 미만이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 200 ～ 약 300 bp이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 100 ～ 약 200 bp이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 1의 크기는 약 10 ～ 약 100 bp이다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 5 kb 미만 또는 약 4 kb 미만이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 3 kb 미만 또는 약 2 kb 미만이다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 1 kb 미만이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 1100 bp 미만이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 800～약 1000 염기쌍(bp)이다. 본 발명의 대안적 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 600～약 800 bp이다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 400～약 600 bp이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 300～약 400 bp이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 200～약 300 bp이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 100～약 200 bp이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 2의 크기는 약 10～약 100 bp이다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 5 kb 미만 또는 약 4 kb 미만이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 3 kb 미만 또는 약 2 kb 미만이다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 1 kb 미만이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 1100 bp 미만이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 800 ～ 약 1000 bp이다. 본 발명의 대안적 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 600 ～ 약 800 bp이다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 400 ～ 약 600 bp이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 300 ～ 약 400 bp이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 200 ～ 약 300 bp이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 100 ～ 약 200 bp이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 스페이서 영역 3의 크기는 약 10 ～ 약 100 bp이다.
C. 본 발명의 면역원성 조성물에 의해 발현된 항원
본원에 사용된 "폴리펩티드"란 용어는 본 발명의 플라스미드 및 면역원성 조성물에 의해 암호화되는 선택된 단백질, 당단백질, 펩티드 또는 기타 변형된 단백질 항원을 의미한다. 본 발명의 구체예는 플라스미드 및 면역원성 조성물을 제공하며, 이것들은 척추 동물 숙주에서 선택된 항원에 대해 "폴리펩티드"의 면역 반응을 유도한다. 본원에 사용된, "선택된 항원"이란 용어는, 상기 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드를 포함하는 선택된 항원이 플라스미드 DNA에 의해 발현될 때, 이 항원은 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 기생체, 프리온 또는 이것들의 조합체로부터 유래된 단백질, 다기능 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 이것들의 단편 또는 융합체를 포함할 수 있다. 또는 상기 선택된 항원은 암 세포 또는 종양 세포로부터 유래된 단백질, 다기능 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 이것들의 단편 또는 융합체를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 선택된 항원은, 알레르기원에 대한 알레르기 반응을 완화시키기 위하여 IgE의 생산을 차단하도록, 알레르기원으로부터 유래된 단백질, 다기능 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 이것들의 단편 또는 융합체를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 선택된 항원은, 척추 동물 숙주 내에서 아밀로이드가 축적되는 것을 특징으로 하는 질병을 예방 또는 치료하기 위하여 바람직하지 않은 방식, 양 또는 위치에서 숙주(자가 분자)에 의해 생산되는 것들 예를 들어, 아밀로이드 전구체 단백질로부터 유래되는 것들인 단백질, 다기능 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 이들 분자 또는 일부분으로부터 유래된 단편 또는 융합체를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 선택된 항원은 HIV-1으로부터 유래된 단백질, 다기능 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예는 또한 (1) 척추 동물 숙주에서 면역 반응을 유도하는 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생체로부터 유래되거나, 또는 (2) 포유 동물 개체 내에서 치료적 또는 예방적 항암 효과를 유도하는 암 세포 또는 종양 세포로부터 유래된 암 항원 또는 종양-관련 항원으로부터 유래되거나, 또는 (3) 알레르기원에 대한 알레르기 반응을 완화시키기 위하여 IgE의 생산을 차단하도록 알레르기원으로부터 유래되거나, 또는 (4) 바람직하지 않은 효과를 감소시키기 위하여 바람직하지 않은 방식, 양 또는 위치에서 숙주(자가 분자)에 의해 생산되는 것들인 분자 또는 그의 일부로부터 유래된, 선택 항원을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이기도 하다.
다른 구체예에서, 바람직한 면역원성 조성물은, 선택 항원을 암호화하여 다음과 같은 바이러스성 질병 중 어느 하나를 예방 또는 치료하기 위한 면역 반응을 유도하는 본 발명의 삼중 전사 단위 플라스미드를 이용할 수 있다: 인간 면역 결핍 바이러스, 유인원 면역 결핍 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 제1형 ～ 제3형 파라 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스, 인간 거세포 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 폴리오 바이러스, 로타 바이러스, 캘리시바이러스, 홍역 바이러스, 수두 바이러스, 루벨라 바이러스, 아데노바이러스, 래비스 바이러스, 개 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 인간 폐렴 바이러스, 조류 폐렴 바이러스(칠면조 비기관지염 바이러스), 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 코로나 바이러스, 파르보 바이러스, 감염성 비기관지염 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 조류 감염성 F 낭병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 마렉병 바이러스, 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스, 말 동맥염 바이러스 및 다양한 뇌염 바이러스 및 코로나 바이러스 예를 들어, SARS 바이러스.
특정 구체예에서, 본 발명의 삼중 전사 단위 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물은 급성 질병을 일으키는 병원균 예를 들어 중증 급성 호흡기 바이러스(SARS), 인간 허피스 바이러스 8(HHV-8), 한탄 바이러스, 비브리오 콜레라 0139, 헬리코박터 파이로리 및 보렐리아 부조르페리로부터 유래된 선택 항원을 암호화하는 성분을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물은 예를 들어, 해모필러스 인플루엔자에(병형 및 비 병형), 해모필러스 솜너스, 모락셀라 카타랄리스, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 스트렙토코커스 피오제네스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 패칼리스, 헬리코박터 파이로리, 네이세리아 메닝지티디스, 네이세리아 고노로에아에, 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 뉴모니아에, 클라미디아 피시타치, 보르데텔라 페르투시스, 알로이오코커스 오티디티스, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 콜레라에쉬스, 에스케리챠 콜라이, 쉬겔라, 비브리오 콜레라에, 코린박테리움 디프테리아에, 마이코박테리움 투베르큘로시스, 마이코박테리아 아비움-마이코박테리아 인트라셀룰라에 컴플렉스, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 클로스트리듐 테타니, 렙토스피라 인터로간스, 보렐리아 버그도페리, 파스퇴렐라 해모리티카, 파스퇴렐라 멀토시다, 액티노바실러스 플루로뉴모니아에 및 마이코플라스마 갈리셉티큠으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의해서 유발되는 박테리아에 의한 질병을 예방 및/또는 치료하는 성분들을 포함한다.
본 발명의 구체예는 또한 예를 들어, 아스퍼질리스(Aspergillis), 블라스토마이세스(Blastomyces), 칸디다(Candida), 코시디오데스(Coccidiodes), 크립토코커스(Cryptococcus) 및 히스토플라스마(Histoplasma)로부터 유래된 선택 항원을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 임의의 구체예에서, 곰팡이로부터 유래된 선택 항원을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물은 곰팡에 의한 질병의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 또한 예를 들어, 레이쉬마니아 메이저(Leishmania major), 아스카리스(Ascaris), 트리큐리스(Trichuris), 지아디아(Giardia), 쉬스토소마(Schistosoma), 크립토스포리듐(Cryptosporidium), 트리코모나스(Trichomonas), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii) 및 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii)로부터 유래된 선택 항원을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 기생체의 선택 항원을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물은 기생체에 의한 질병의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 척추 동물 숙주에서 치료적 또는 예방적 항암 효과를 유도하는 면역원성 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 선택 항원 예를 들어, 암 항원 또는 종양-관련 항원 예를 들어, 전립선 특이 항원, 태아성 암 항원, MUC-1, Her2, CA-125 및 MAGE-3을 암호화하는 플라스미드를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 동일한 항원 또는 항원의 변이체는 복수 개의 전사 단위에 위치하여 특정 표적 항원의 전사 및 최종 투여량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 구체예는 또한 척추 동물 숙주에서 알레르기원에 대한 반응을 완화시키는 데 사용되는 알레르기원인 선택 항원을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 이 조성물은 알레르기원 또는 이의 단편을 함유하는 성분을 포함한다. 이러한 알레르기원의 예는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 5,830,877 호 및 국제 특허 공보 WO 99/51259에 개시되어 있다. 이러한 알레르기원으로서는 꽃가루, 곤충 독, 동물 비듬, 곰팡이 포자 및 약물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 면역원성 조성물은 알레르기 반응의 원인으로 알려진 IgE 항체의 생산을 차단시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 구체예는 또한 척추 동물 숙주 내에서 자가 분자에 대한 반응을 조절하는 선택 항원을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 상기 선택된 항원은 자가 분자 또는 이의 단편을 함유하는 항원을 포함한다. 이러한 자가 분자의 예로서는 당뇨병과 관련된 인슐린의 β-사슬, 식도 역류성 질환에 관여하는 G17 분자 및 질병 예를 들어, 다발성 경화증, 루푸스병 및 류마티스성 관절염에서 자가 번역 반응을 하향 조절하는 항원을 포함한다. 내부에 존재하는 β-아밀로이드 펩티드(Aβ 펩티드라고도 칭함), β 및 γ 분비 효소에 의하여 APP가 가공되어 생산되는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 39～43번 아미노산 단편도 포함된다. Aβ1-42 펩티드는 다음과 같은 서열을 보유한다: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (서열 1).
본 발명의 DNA 플라스미드를 디자인하기 위하여 선택 항원을 암호화하는 서열을 선별 및 사용하는 데 있어서, 선택 항원 암호화 유전자 서열의 코돈 사용 방식과 이 서열이 삽입된 DNA 플라스미드에서의 코돈 사용 방식을 변형함으로써, 항원의 발현량을 증가시키고/증가시키거나 여기에 존재하는 억제 서열을 제거하는 것 또한 바람직하다. 억제 서열은 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 5,965,726 호; 동 제 5,972,596 호; 동 제 6,174,666 호; 동 제 6,291,664 호; 및 동 제 6,414,132 호; 및 국제 특허 공보 WO 01/46408에 개시된 기술을 사용하여 제거될 수 있다. 간단하게 요약하면, 이 기술은 선택된 유전자 내에 존재하는 특정 억제/불안정 서열을 바람직하게는 복수 회의 점 돌연 변이에 의해 돌연 변이시키는 단계를 포함한다.
이하에 예시된 하나의 특정 구체예로서, 본 발명의 DNA 플라스미드 및 면역원성 조성물은 바람직하게는 HIV-1 유전자 예를 들어, gag, pol, env, nef, tat 및 vif에 대하여 최적화된 하나 이상의 서열을 사용한다.
본 발명의 삼중 전사 단위 플라스미드는 또한 숙주 세포를 형질 감염, 형질 전환 또는 감염시켜 시험관내에서 3개 이상의 폴리펩티드를 발현시키는데 사용하기에 적당하다.
D. 전사 단위에 유용한 프로모터
본 발명의 DNA 플라스미드는 1개, 2개 또는 3개의 전사 단위를 포함한다. 각 전사 단위는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 그러므로, 본 발명의 임의의 구체예에서, 선택 항원을 암호화하는 핵산은 프로모터의 전사 제어하에 있게 되는 것이다. "프로모터"란, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의하여 인식되며, 유전자의 특이적 전사를 개시할 필요가 있는 DNA 서열을 의미한다. "전사 제어하에 있다"는 어구는, 프로모터가 핵산과 관련하여 올바른 위치 및 배향으로 존재하여 RNA 중합 효소 개시 작용 및 유전자의 전사를 제어함을 의미한다.
본원에 사용된 프로모터란 용어는 RNA 중합 효소의 개시 위치 주변에 모여있는 전사 제어 모듈 군을 의미한다. 몇몇 바이러스 프로모터 예를 들어, HSV 티미딘 키나제(tk) 및 SV40 초기 전사 단위에 의한 프로모터를 분석함으로써 프로모터가 어떻게 조직화되어 있는지에 관하여 보다 깊이 알 수 있다. 최근 들어 이에 관한 연구가 늘어나면서, 프로모터는 개별의 기능적 모듈로 이루어져 있으며, 이들 모듈은 각각 약 7～20 bp의 DNA로 이루어져 있고, 전사 활성 인자 또는 억제 단백질에 대한 하나 이상의 인지 위치를 함유한다는 사실을 알게 되었다.
각 프로모터 내 하나 이상의 모듈은 RNA 합성의 개시 위치를 배정한다. 이에 관하여 가장 널리 공지된 예로서는 TATA 박스가 있으나, TATA 박스가 존재하지 않는 몇몇 프로모터 예를 들어, 포유 동물 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터에 있어서, 개시 위치 자체에 내재하는 별도의 요소가 개시 장소를 고정시키는 데 도움을 준다.
임의의 전사 단위 내에서 사용되는 적당한 프로모터는 진핵 세포 내에서 활성인 모든 프로모터를 포함한다. 적당한 진핵 세포 프로모터의 예로서는 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터(임의로는 HCMV 인핸서 포함)[예를 들어, Boshart외 다수, Cell, 47:521-530 (1985) 참조], 유인원 거세포 바이러스(SCMV) 프로모터, 쥐 거세포 바이러스(MCMV) 프로모터, 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) LAP1 프로모터, 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터, 인간 연장 인자 1 알파 프로모터, 레트로바이러스 장형 말단 반복부(LTR), 데스민 프로모터에 특이적인 근육 세포 또는 항원 제공 세포 내에서 활성인 임의의 기타 프로모터를 포함한다.
또한, 적당한 진핵 생물 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 등으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 활성에 있어서 비 특이적이고 선택 항원을 암호화하는 DNA 플라스미드에 사용되는 구성적 프로모터의 예로서는, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터(임의로는 RSV 인핸서 포함), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터(Invitrogen)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 외부에서 공급되는 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터로서는 아라비노즈 프로모터, 아연-유도성 양 메틸로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방암 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 에코디손 곤충 프로모터(No외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라사이클린-억제성 시스템(Gossen외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라사이클린-유도성 시스템(Gossen외 다수, Science, 268:1766-1769, (1995) 및 Harvey외 다수, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518, (1998)), RU486-유도성 시스템(Wang외 다수, Nat. Biotech., 15:239-243, (1997) 및 Wang외 다수, Gene Ther., 4:432-441, (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari외 다수, J. Clin. Invest, 100: 2865-2872, (1997))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 DNA 플라스미드에 유용할 수 있는 유도성 프로모터의 다른 유형으로서는, 특정 생리 상태 예를 들어, 온도 또는 급성 단계에 의해서 조절되거나 또는 복제하는 세포 중에서만 조절되는 프로모터가 있다. 유용한 조직-특이적 프로모터로서는 골격 β-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제를 암호화하는 유전자로부터 유래된 프로모터, 그리고 천연 생성되는 프로모터보다 활성이 더 높은 합성 근육 프로모터를 포함한다[Li외 다수, Nat. Biotech.,17:241-245, (1999)). 조직-특이적인 프로모터로서 공지된 것의 예로서는 간(알부민, Miyatake외 다수 J. Virol., 71:5124-32 (1997); B형 간염 바이러스 중심 프로모터(Sandig외 다수, Gene Ther., 3: 1002-9, (1996)); 알파-태아 단백질(AFP)(Arbuthnot외 다수, Hum. Gene Ther., 7:1503-14(1996)), 뼈(오스테오칼신, Stein외 다수, Mol. Biol. Rep., 24:185-96, (1997)); 뼈(시알로프로테인, Chen외 다수, J. Bone Miner. Res., 77:654-64, (1996)), 림프구(CD2, Hansal외 다수, J. Immunol.,161:1063-8, (1988)); 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 α 사슬), 뉴런(뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, Andersen외 다수 Cell. Mol. Neurobiol, 73:503-15, (1993)); 신경 세사 경쇄 유전자(Piccioli외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5, (1991)); 뉴런-특이적 ngf 유전자(Piccioli외 다수., Neuron, 15:373-84, (1995)) 등에 대한 프로모터가 있다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 공지의 프로모터에 관한 추가의 목록에 관하여는 국제 특허 공보 WO 00/55335를 참조하시오.
E. 전사 단위 내 유용한 폴리아데닐화 시그널
본 발명의 DNA 플라스미드는 3개의 전사 단위를 포함하며, 각 전사 단위는 하나 이상의 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. 본원에 정의된 "폴리아데닐화 시그널"이란, 특정 전사 단위의 전사를 종결시키고, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 적절하게 전사 및 번역되는 것을 보장하는 종결 서열(또는 종결 위치)를 의미한다. 종결 위치는 합성의 것이거나 또는 천연 기원의 것일 수 있다. 종결 위치의 예로서는 폴리아데닐화 시그널 및 합성 2 방향성 전사 종결 위치를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 통상적으로, 폴리아데닐화 시그널은 DNA 서열의 전사를 지연시킨다.
전사 단위중 임의의 것에 사용되는 적당한 폴리아데닐화 시그널로서는 진핵 세포 내에서 활성인 모든 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. 진핵 생물 폴리아데닐화 시그널의 예로서는 토끼 베타-글로빈 폴리(A) 시그널, 즉, 문헌에서 강력하다고 특성 특성 규명된 시그널을 포함한다[Gil 및 Proudfoot, Cell 49: 399-406 (1987); Gil and Proudfoot, Nature 312: 473-474 (1984)]. 이의 중요한 특성들 중 하나는 UG- 및 U-풍부 도메인 둘 다를 함유하는 하류 요소의 구조이다. 기타 폴리 A 시그널로서는 합성 폴리 A, HSV 티미딘 키나제 폴리 A[Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)]; 인간 알파 글로빈 폴리 A SV40 폴리 A[Schek, N, Cooke, C., and J. C. Alwine, Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)]; 인간 베타 글로빈 폴리 A[Gil, A. 및 N. J. Proudfoot, Cell 49:399-406 (1987)]; 폴리오마 바이러스 폴리 A[Batt, D. B 및 G. G. Carmichael Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995)]; 소 성장 호르몬 폴리 A[Gimmi, E. R., Reff, M. E. 및 I. C. Deckman, Nucleic Acid Res.(1989)]를 포함한다. 기타 다수의 폴리아데닐화 시그널이 당 업계에 공지되어 있으며, 이들 또한 본 발명의 구체예에 유용하다.
SV40의 초기 및 후기 폴리아데닐화 시그널 둘 다는 본 발명의 다양한 구체예에 유용하다. 문헌[Schek,외 다수, Mol. Cell Biol. 12:5386- 5393 (1992)]을 참조하시오. 이들 서열은 SV40 게놈의 2533번 뉴클레오티드에 존재하는 BamnHI 위치와 2770번 뉴클레오티드에 존재하는 BcII 위치 사이의 237 염기쌍 단편 내에서 암호화된다(Carswell and Alwine, Mol. Cell. Biol. 9:4248; 1989). Carswell 및 Alwine은 2개의 SV40 폴리아데닐화 시그널 중, 후기 시그널이 더 효율적인 것으로 결론을 내렸는데, 이는 아마도 효율적인 절단 및 폴리아데닐화를 촉진시키는 하류 및 상류 서열 요소 둘 다를 포함하고 있기 때문일 것이다.
부가의 폴리아데닐화 위치는 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 확인 및 구성될 수 있다. 최소한의 폴리아데닐화 위치는 AAUAAA 및 제2 인지 서열(일반적으로 G/U 풍부 서열로서, 하류 약 30 뉴클레오티드 위치에서 발견됨)로 이루어져 있다. 본원에 사용된 서열은 RNA 보다는 DNA로 제시되며, 이는 발현 벡터에 통합되는데 적당한 DNA의 제조를 촉진한다. DNA로 제시될 때, 폴리아데닐화 위치는 예를 들어, G/T 풍부 영역 하류를 보유하는 AATAAA로 이루어져 있다. 양 서열은 효율적인 폴리아데닐화 위치를 형성하도록 제공되어야 한다. 이들 위치의 용도는 RNA에 대한 특이적 RNA 결합 단백질을 보강하기 위한 것이다. 상기 AAUAAA는 절단 폴리아데닐화 특이성 인자[CPSF; Murthy K. G., and Manley J. L. (1995), Genes Dev 9:2672-2683]와 결합하고, 제2 위치(즉, G/U 서열)는 절단 자극 인자[CstF; Takagaki Y. and Manley J. L. (1997) Mol Cell Biol 17:3907-3914]와 결합한다. 상기 CstF는 몇몇 단백질로 이루어져 있으나, RNA 결합에 관여하는 단백질은 단백질의 리보뉴클레오단백질 도메인 군의 일원인 CstF-64이다[Takagaki외 다수 (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1403-1407].
F. 본 발명의 면역원성 조성물에 유용한 담체, 희석제, 촉진제, 애쥬반트 및 제제
본 발명에 유용한 DNA 플라스미드 및 면역원성 조성물은 추기로 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 희석제로서는 멸균수, 멸균 등장 염수 또는 생물학적 완충액이 있다. 항원성 조성물은 또한 이러한 희석제 또는 담체와 통상의 방식으로 혼합될 수도 있다. 본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡착 지연 제제 등과 같이, 인간이나 기타 척추 동물 숙주에 투여될 수 있는 것들을 포함한다. 적당한 담체는 당 업자에게 명백하며, 대부분 투여 경로에 따라서 달라질 것이다.
본 발명의 면역원성 조성물 중에 존재할 수 있는 부가의 부형제로서는 애쥬반트, 촉진제, 보존제, 표면 활성제 및 화학 안정화제, 현탁제 및 분산제가 있다. 통상적으로, 안정화제, 애쥬반트 및 보존제는 최적화되어 인간 또는 수의학적 개체에서 효능을 나타내는데 가장 좋은 제형이 된다.
1. 애쥬반트
애쥬반트는 면역원 또는 항원과 함께 투여될 때 면역 반응을 강화하는 물질이다. 다수의 사이토카인 또는 림포카인 예를 들어, 인터루킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(예를 들어, 미국 특허 제 5,723,127 호 참조), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이 형), 인터페론-α, β 및 γ, 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자(예를 들어, 미국 특허 제 5,078,996 호 및 ATCC 기탁 번호 39900), 대식 세포 콜로니 자극 인자(MCSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF) 및 종양 괴사 인자 α 및 β(TNF)가 면역 조절 활성을 갖는 것으로 알려져 있으므로, 이는 애쥬반트로서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 또 다른 애쥬반트로서는 케모킨 예를 들어, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 포함한다. 부착 분자 예를 들어, 셀렉틴 예를 들어, L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴도 또한 애쥬반트로서 유용할 수 있다. 기타 유용한 애쥬반트로서는 뮤신-유사 분자 예를 들어, CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1, 인테그린 군의 일원 예를 들어, LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95, 면역 글로불린 상과의 일원 예를 들어, PECAM, ICAMs, 예를 들어, ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3, CD2 및 LFA-3, 보조 자극 분자 예를 들어, CD40 및 CD40L, 성장 인자 예를 들어, 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 상피 성장 인자, B7.1, B7.2, PDGF, BL-1 및 혈관 내피 성장 인자, 수용체 분자 예를 들어, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또 다른 애쥬반트 분자로서는 카스파제(ICE)를 포함한다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 국제 특허 공보 WO 98/17799 및 WO 99/43839를 참조하시오.
하나의 구체예에서, 바람직한 애쥬반트로서는 플라스미드로부터 발현되는 IL-12 단백질이 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 5,457,038 호; 동 제 5,648,467 호; 동 제 5,723,127 호 및 동 제 6,168,923 호를 참조하시오. 하나의 구체예에서, 사이토카인은 단백질로서 투여될 수 있다. 임의의 구체예에서, IL-12는 본 발명의 DNA 플라스미드의 3개의 전사 단위 중 하나 또는 두개로부터 발현된다. 대안적으로, IL-12는 독립적으로 별도의 플라스미드로부터 발현된다. 다른 구체예에서, IL-15를 암호화 및 발현하는 플라스미드는 IL-12를 암호화 및 발현하는 플라스미드 대신에 투여된다.
면역 반응을 강화하는 데 사용되는 적당한 애쥬반트로서는, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 4,912,094 호에 개시되어 있는 MPLM(3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; Corixa, Hamilton, MT)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP) 또는 이들의 유도체나 유사체[Corixa, Hamilton, MT][본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 6,113,918 호에 개시됨]도 또한 애쥬반트로서 사용하기에 적당하다. 이러한 AGP의 일례로서는, 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노이옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-b-D-글루코피라노시드 [529(구 RC529)라고 알려져 있음]가 있다. 상기 529 애쥬반트는 수성 형태이거나 또는 안정한 유액의 형태로서 제형화된다.
또 다른 애쥬반트로서는 광유 및 물의 유액, 알루미늄 염(알룸) 예를 들어, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 등, 앰피젠, 애브리딘, L121/수쿠알렌, D-락티드-폴리락티드/글리코시드, 플루론산 폴리올, 뮤라밀 디펩티드, 사멸된 보르데텔라(Bordetella), 사포닌 예를 들어, 스티뮬론TM QS-21(Antigenics, Framingham, MA.)(본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 5,057,540 호에 개시됨) 및 이로부터 얻어진 입자 예를 들어, ISCOMS(면역 자극 복합체), 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 박테리아 리포다당류, 합성 폴리뉴클레오티드 예를 들어, CpG 모티브 함유 올리고뉴클레오티드(본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 6,207,646 호), 백일해 독소(PT) 또는 이.콜라이 열-불안정 독소(LT), 구체적으로 LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129 (예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 국제 특허 공보 WO 93/13302 및 WO 92/19265 참조)를 포함한다.
뿐만 아니라, 콜레라 독소 및 이의 돌연 변이체 예를 들어, 국제 특허 공보 WO 00/18434[29번 아미노산 위치에 존재하는 글루탐산이 다른 아미노산(아스파르트산 제외) 바람직하게는 히스티딘에 의해 치환된 독소]에 개시된 것도 애쥬반트로서 유용하다. 유사한 CT 독소 또는 돌연 변이체에 관하여는 국제 특허 출원 공보 WO 02/098368[16번 아미노산 위치에 존재하는 이소루신만이 다른 아미노산에 의해 치환되거나, 68번 위치의 아미노산에 존재하는 세린이 다른 아미노산으로 치환될 때 함께 또는 단독으로 치환되거나; 72번 아미노산 위치에 존재하는 발린이 다른 아미노산으로 치환됨]에 개시되어 있다. 기타 CT 독소에 관하여는 국제 특허 출원 공보 WO 02/098369[25번 아미노산 위치에 존재하는 아르기닌이 다른 아미노산으로 치환되고/되거나; 49번 아미노산 위치에 임의의 아미노산이 삽입되고/되거나; 2개의 아미노산이 35번 및 36번 위치의 아미노산에 삽입됨]에 개시되어 있다.
몇몇 구체예에서, 애쥬반트를 암호화하는 플라스미드 DNA는 면역원성 조성물 중에 투여될 수 있다. 이러한 경우, DNA가 본 발명의 면역원성 조성물 중에 포함될 플라스미드에 삽입되어 있는 애쥬반트로서는 인터루킨-1(IL-1), IL-5, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNF-α, TNF-β 및 BL-1(국제 특허 출원 공보 WO 98/17799에 개시됨); B7.2(국제 특허 출원 공보 WO 00/51432에 개시됨); IL-8, RANTES, G-CSF, IL-4, 돌연 변이 IL-18, IL-7, TNF-R(국제 특허 출원 공보 WO 99/43839에 개시됨); 및 돌연 변이 CD80(국제 특허 출원 공보 WO 00/66162에 개시됨)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 사용된 "IL-12 단백질"이란 용어는, 2개의 서브유닛이 단일 암호화 서열에 의해 암호화되어 2개의 서브 유닛을 결합시키는 링커 서열을 보유하는 단일의 단백질로서 발현되는 단일 사슬 IL-12 단백질을 포함하는 하나 또는 두 개의 인간 IL-12 서브유닛을 의미한다.
특정 구체예에서, 사이토카인은 포유 동물 내에서 발현을 유도하는 조절 서열의 제어하에서 사이토카인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 조성물로서 투여된다. 또 다른 구체예에서, 사이토카인 발현 플라스미드는 면역원성 조성물 중에 존재하는 선택 항원을 암호화하는 DNA 플라스미드와 함께 투여된다. 또 다른 구체예에서, 사이토카인은 면역원성 조성물을 처음 투여하고 그 양을 증가시켜 다시 투여된다. 또 다른 구체예에서, 사이토카인은 증량 단계에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 사이토카인은 조성물의 처음 투여시 및 증량 투여시에 투여된다.
본 발명의 임의의 구체예에서, CpG DNA는 플라스미드에 애쥬반트로서 포함될 수 있다. 본원에 사용된 CpG DNA란, 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드 핵산 분자를 함유하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 메틸화되지 않은 시토신-구아닌 디뉴클레오티드 서열(즉, "CpG DNA") 또는 5' 시토신 → 3' 구아노신을 함유하는 DNA를 포함하고, 이들은 포스페이트 결합으로 연결되어 있으며, 면역계를 활성화하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 6,406,705 호(Davis외 다수) 및 미국 특허 제 6,207,646 호(Kreig외 다수)를 참조하시오. 척추 동물 DNA가 아닌 박테리아 DNA로부터 유래된 CpG DNA는 시험관내에서 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)에 직접적인 면역 자극 효과를 갖는다. 이러한 림프구 활성화는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드로 인한 것인데, 이 CpG 디뉴클레오티드는 박테리아 DNA에서 예상 빈도만큼 존재하지만(1/16), 척추 동물 DNA에서는 그 이하로 존재하며(CpG 억제, 1/50～1/60) 메틸화된다. CpG DNA에 따른 급속 면역 활성화는 미생물 분자에 특이적인 구조적 패턴을 인지하는 원래의 면역 방어 기작의 한 부분으로서 진화될 수 있었다. 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 6,406,705 호(Davis외 다수) 및 미국 특허 제 6,207,646 호(Krieg외 다수)를 참조하시오.
임의의 구체예에서, 개체에는 애쥬반트를 조합하여 투여하는데, 애쥬반트의 조합 형태는, 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG DNA 디뉴클레오티드를 함유하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 핵산 애쥬반트 예를 들어, IL-12를 포함한다.
2. 촉진제 또는 보조제
폴리뉴클레오티드 분자로 이루어진 면역원성 조성물은 바람직하게는 임의의 부형제 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 형질 감염 촉진제 또는 "보조제" 예를 들어, 국소 마취제, 펩티드, 양이온성 지질을 포함하는 지질, 리포좀 또는 지질 입자, 다 양이온 예를 들어, 폴리리신, 분지형의 3차원 다 양이온 예를 들어, 덴드리머, 탄수화물, 양이온 양친매성 물질, 세제, 벤질암모늄 계면활성제 또는 세포로의 폴리뉴클레오티드 운반을 촉진하는 기타 화합물을 함유한다. 이와 같은 촉진제로서는 국소 마취제인 부피바카인 또는 테트라카인[본원에 참고용으로 인용되어 있는, 미국 특허 제 5,593,972 호; 동 제 5,817,637 호; 동 제 5,380,876 호; 동 제 5,981,505 호 및 동 제 6,383,512 호 및 국제 특허 공보 WO 98/17799]을 포함한다. 본 발명에 유용한 촉진제 또는 보조제에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제 5,703,055 호; 동 제 5,739,118 호; 동 제 5,837,533 호; 국제 특허 공보 WO 96/10038(1996년 4월 4일); 및 국제 특허 공보 WO 94/16737(1994년 8월 8일)에 개시되어 있다.
가장 바람직하게, 형질 감염 촉진제는 핵산 분자와 하나 이상의 복합체를 형성하는 양만큼 존재한다. 형질 감염 촉진제가 본 발명의 핵산 분자와 플라스미드와 혼합될 때, 상기 형질 감염제는 DNA를 팩킹시키고 상동성인 다양한 작은 복합체 또는 입자를 형성한다. 그러므로, 본 발명의 면역원성 조성물에 관한 하나의 구체예에서, 복합체는 형질 감염 촉진제와 하나 이상의 본 발명의 플라스미드를 혼합함으로써 형성된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 유형의 플라스미드로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물의 다른 구체예에서, 형질 감염 촉진제는 각 플라스미드와 별도로 예비 혼합될 수 있다. 이후 별도의 혼합물을 단일 조성물로 배합하여, 모든 플라스미드가 단일의 알약의 투여형으로 투여될 경우에 바람직한 비율의 플라스미드가 단일의 면역원성 조성물 내에 존재하도록 만든다. 대안적으로, 형질 감염 촉진제 및 각 플라스미드는 별도로 혼합 및 투여되어 바람직한 비율을 형성할 수 있다.
이하, 면역원성 조성물의 구체예를 한정하는 데 "복합체" 또는 "하나 이상의 복합체" 또는 "복합체들"이라는 용어가 사용될 경우, 이 용어는 하나 이상의 복합체를 포함하는 용어라는 것을 이해할 수 있다. 각 복합체는 플라스미드를 함유한다. 바람직하게, 이 복합체의 지름은 약 50～약 150 ㎚이다. 촉진제가 국소 마취제 바람직하게는 부피바카인인 경우, 그 양은 폴리뉴클레오티드 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1～약 1.0 중량%인 것이 바람직하다. 또한 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[국제 특허 공보 WO 99/21591]에는, 보조제로서 벤질암모늄 계면활성제를 바람직하게는 약 0.001～0.03 중량%의 양으로 투여하는 것에 관하여 개시되어 있다. 본 발명에 따르면, 국소 마취제의 양은 상기 핵산 분자가 약 0.01～2.5 % w/v(국소 마취제) : 약 1～10 ㎍/㎖(핵산)의 비율로 존재한다. 다른 함량 범위는 약 0.05～1.25 % w/v(국소 마취제) : 약 100 ㎍/㎖ ～ 1 ㎎/㎖(핵산)이다.
3. 면역원성 조성물에 대한 기타 첨가제
기타 부형제 예를 들어, 보존제, 안정화 성분, 표면 활성제 등이 본 발명의 면역원성 조성물에 포함될 수 있다.
적당한 보존제의 예로서는 클로로부탄올, 소르브산염 칼륨, 소르브산, 이산화황, 몰식자산 프로필, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다.
사용될 수 있는 적당한 안정화 성분으로서는 예를 들어, 카사미노산, 수크로즈, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 이인산 모노칼륨, 락토즈, 락트알부민 가수분해물 및 분유를 포함한다.
적당한 표면 활성화 물질로서는 프룬트 불완전 애쥬반트, 퀴논 유사체, 헥사데실아민, 옥타데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 리소레시틴, 브롬화디메틸-디옥타데실암모늄, 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루론산 폴리올; 폴리아민 예를 들어, 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC, 카보폴; 펩티드 예를 들어, 뮤라밀 펩티드 및 디펩티드, 디메틸글리신, 터프친; 오일 유액; 및 무기 젤 예를 들어, 인산화알루미늄 등과, 면역 자극 복합체(ISCOMS)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 플라스미드는 또한 면역원성 조성물로서 사용되는 리포좀 내에 통합될 수도 있다. 상기 면역원성 조성물은 또한 면역원성 조성물의 선택적 투여 방식에 적당한 기타 첨가물을 함유할 수도 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 또한 동결된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있는데, 이 폴리뉴클레오티드는 분말, 액체 또는 현탁액 투여형 제조용인 기타 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 사용될 수 있는 것이다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19th edition (1995), 예를 들어, 제 95 장 Aerosols; 및 국제 특허 공보 제 WO 99/45966; 본원에 참고용으로 인용되어 있음]을 참조하시오.
이와 같은 면역원성 조성물은 임의의 통상적인 투여 경로를 통하여 투여되기에 적당한 부가제를 함유할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 예를 들어, 액체, 분말, 에어로졸, 정제, 캡슐, 장용외피 정제 또는 캡슐 또는 좌제의 형태로서 인간 개체 투여용으로 제조된다. 그러므로, 면역원성 조성물은 또한 현탁액, 용액, 유질 또는 수성 비히클 중의 유액, 페이스트 및 이식 가능한 지연 방출형 또는 생분해성 제형을 포함할 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 면역원성 조성물은 비경구 투여용 제형으로서 제조되며, 활성 성분은 적당한 비히클(예를 들어, 멸균 무 발열원성 물)로 재구성된 후 이 재구성된 조성물을 비 경구 투여하는데 사용되는 건조형(즉, 분말 또는 과립)으로서 제공된다. 기타 유용한 비 경구 투여형 제형은 활성 성분을 미세 결정형, 리포좀 제제형, 또는 생분해성 중합체 시스템의 성분으로서 포함한다. 지연 방출형 또는 이식용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 중합체 또는 소수성 물질 예를 들어, 유액, 이온 교환 수지, 불량 가용성 중합체 또는 불량 가용성 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 통상의, 생리적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및 부형제 예를 들어, 상기 유형의 약학적 제제에 유용한 용매, 완충액, 애쥬반트, 촉진제 또는 기타 성분들의 선택에 의하여 한정되지 않는다. 이와 같이 전술한 성분을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 조성물 제제의 적당한 pH 등장성, 안정성 및 기타 종래의 특성에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다.
F. 면역원성 조성물의 투여량 및 투여 경로, 그리고 전기 천공법
일반적으로, 본 발명의 면역원성 조성물(들) 성분의 적당한 "유효량" 또는 투여량은 사용된 면역원성 조성물 중에 존재하는 선택 항원의 정체와, 개체의 물리적 상태, 구체적으로 면역화된 개체의 전체적인 건강 상태, 연령 및 체중을 바탕으로 하여 정하여 질 것이다. 투여 방법 및 경로와 면역원성 조성물 중에 존재하는 부가 성분은 또한 DNA 플라스미드 조성물의 투여형과 양에 영향을 미칠 수 있다. 유효 투여량의 선택 및 이것의 상향 또는 하향 조절은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 면역 반응, 바람직하게는 보호 반응을 유도하거나, 또는 거의 부작용을 일으키지 않고 환자 체내에서 외인성 효과를 나타내는데 필요한 플라스미드의 양은 상기 인자들에 따라서 다르다. 적당한 투여량은 당업자에 의하여 용이하게 결정된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 다양한 경로 예를 들어, 비내, 경구, 질내, 직장내, 비경구, 피내, 경피(예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 국제 특허 공보 WO 98/20734 참조), 근육내, 복강내, 피하, 정맥 내 및 동맥 내 경로에 의하여 인간에게 또는 인간을 제외한 척추 동물에게 투여된다. 적당한 경로는 사용된 면역원성 조성물의 특성과, 환자의 연령, 체중, 성별 및 전체적인 건강 상태에 대한 평가 결과와 면역원성 조성물 중에 존재하는 항원, 그리고 참여 전문의에 의한 상기와 같은 소인의 평가 결과에 따라서 선택된다.
면역원성 조성물의 투여 순서와 각 투여 단계 사이의 기간은, 방법을 적용하는 숙주의 물리적 특성과 정확한 반응을 기준으로 하여 참여 전문의 또는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 최적화는 당업자에게 널리 공지되어 있을 것이다.
다른 구체예에서는, 폴리뉴클레오티드 약 0.1㎍ ～ 약 100㎎을 도입시키는 단계를 포함하여, 단일의 세포 내 즉, 생체 내에서 별도 유전자 생산물의 1개, 2개 또는 3개의 개방 해독 틀을 공동 발현시키는 방법이 제공된다.
면역원성 조성물을 투여할 경우, 전기 천공법을 이용하면 플라스미드 흡수율을 증가시킬 수 있다. 전기 천공법을 수행하기 위하여, 폴리뉴클레오티드가 주입된 위치 근처에 전극을 약 1～4 ㎜ 간격으로 배치해 둔다. 전극의 정확한 위치와 디자인은 전류가 폴리뉴클레오티드 주입 부위에의 방향에 수직인 근 섬유를 통과할 수 있는 한 다양할 수 있다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[미국 특허 제 5,273,525 호(G. A. Hofmann); 미국 특허 제 5,869,326 호(G. A. Hofmann); 미국 특허 제 5,993,434 호(S. B. Dev,외 다수); 미국 특허 제 6,014,584 호(G. A. Hofmann,외 다수); 미국 특허 제 6,068,650 호(G. A. Hofmann,외 다수); 미국 특허 제 6,096,020 호(G.A. Hofmann); 미국 특허 제 6,233,482 호(G.A. Hofmann,외 다수); 미국 특허 제 6,241,701 호(G.A. Hofmann); 미국 특허 제 6,418,341 호(G.A. Hofmann외 다수); 미국 특허 제 6,451,002 호(S.B. Dev,외 다수); 미국 특허 제 6,516,223 호(G.A. Hofmann); 미국 특허 제 6,763,264 호(G.A. Hofmann); 미국 특허 제 6,110,161 호(I. Mathiesen,외 다수]을 참조하시오.
일단 전극이 배치되면, 근육은 전기 천공되거나 또는 전기적으로 자극을 받는다. 이러한 자극은 소정의 진폭과 지속 기간을 갖는 펄스로서 전달된다. 형질 감염의 효율을 최적화시키기 위해서, 펄스 지속 기간, 전압, 용량, 전기장 세기, 진동수, 파형과 같은 매개 변수들에 변화를 줄 수 있으며, 이러한 변화에 따른 형질 감염 효율을 비교할 수 있다. 전기 펄스는 전기 천공에 의해 인가된 펄스화 전기장이다. 펄스는 한 방향, 두 방향, 지수형 또는 제곱형의 파장 형태를 가질 수 있다. 전압은 약 0～1000 볼트이고; 펄스의 지속 기간은 5 마이크로세컨드 ～ 5 밀리세컨드이며; 펄스의 횟수는 1회 ～ 30,000회이고; 펄스의 주파수는 0.5 ～ 1000 Hz이다. 전기장 세기의 유용한 범위는 약 25 ～ 약 800 V/㎝이다. 본 발명의 실시에 사용되는 전기 펄스는 전기 천공을 일으키는 데 충분한 전압과 지속 기간을 갖는 펄스를 포함한다. 문헌[Hofmann, G. A. Cells in electric fields. In E. Neumann, A. E. Sowers, & C. A. Jordan (Eds.), Electroporation and electrofusion in cell biology (pp. 389-407). Plenum Publishing Corporation (1989)]을 참조하시오.
G. 키트 성분
또 다른 구체예에서, 본 발명은 선택 항원에 대한 면역 반응이 바람직한 상기 질병 또는 병상 중 임의의 것을 치료하기 위하여 면역원성의, 예방적 또는 치료적 투약 계획에서 용이하게 투여하기 위한 약학적 키트를 제공한다. 이 키트는 포유 동물 또는 척추 동물 개체 내에서 항원-특이적 면역 반응을 높은 수준으로 유도하는 방법에 사용되도록 고안된다. 상기 키트는 선택 항원 또는 펩티드 세트를 암호화하는 3개의 전사 단위를 포함하는 DNA 플라스미드를 포함하는 하나 이상의 면역원성 조성물을 함유한다. 면역원성 조성물의 다수의 팩키징된 투여형은 복수 회 투여용 키트 내에 제공될 수 있다.
DNA 플라스미드를 포함하는 전술한 면역원성 조성물이 사이토카인 또는 기타 애쥬반트 예를 들어, IL-12를 발현하지 않는 경우, 상기 키트는 또한 복수 회 투여용인 별개의 사이토카인/애쥬반트 조성물이나, 사이토카인/애쥬반트 조성물의 다수의 팩키징된 투여형을 포함할 수도 있다. 이러한 사이토카인 조성물은 일반적으로 포유 동물 또는 척추 동물 세포 내에서 발현을 유도하는 조절 서열의 제어하에 있는 선택 사이토카인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 조성물이다. 기타 애쥬반트는 용액, 액체 또는 고체의 형태로 팩키징된 바이알 내에 제공될 수도 있다.
상기 키트는 또한 처음 투약 방법/증량 투약 방법에 있어서 면역원성 조성물을 사용하는 설명서를 포함하기도 한다. 이 키트는 또한 임의의 검정법을 수행하는 설명서, 다양한 담체, 부형제, 희석제, 애쥬반트 등과, 이 조성물을 투여하는 장치 예를 들어, 시린지, 스프레이 장치 등을 포함할 수도 있다. 기타 성분들로서는 1회용 장갑, 오염 방지 기구, 도포용 스틱 또는 용기 등을 포함할 수 있다.
본 발명을 보다 명확히 이해하기 위하여, 이하 실시예를 제시하였다. 다음의 실시예들은 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 이하 실시예에 인용된 모든 문헌, 공보 및 특허는 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
실시예 1. HIV 유전자의 선택 및 변형
당업자는 다수의 바이러스 및 박테리아에 관한 서열 정보를 당 업계에서 얻을 수 있다는 사실을 이해할 것이다. 더욱 구체적으로, 서열 정보는 본 발명의 플라스미드 내에서 폴리펩티드를 발현하는데 사용되는 유전자를 클로닝하는 데 사용될 수 있다. HIV 및 기타 병원균으로부터 얻어진 다수의 서열 정보는 로스 알라모스 국립 도서관 및 미합중국 국립 의학 도서관의 국립 생명공학 정보 센터(8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894)에 있는 HIV 서열 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 다음과 같은 HIV 유전자를 선택하여 대부분의 HIV 게놈을 발현하는 단일의 대표적 DNA 플라스미드에 포함시켰다: HXB2 분리체 유래 gag 유전자 및 HXB2 분리체 유래 pol 유전자. 완전 HXB2 서열은 GenBank 컴퓨터 데이터베이스에 기탁 번호 K03455로 예치되어 있다. nef, tat 및 vif 유전자는 NL4-3 분리체로부터 유래된 것이었다. 완전 NL4-3 서열은 GenBank 컴퓨터 데이터베 이스에 기탁 번호 M19921로 예치되어 있다. HIV 외피 유전자는 Davis Montefiore 박사로부터 구한 1차 분리체 6101로부터 유래된 것이었다. 완전 HIV 외피 서열은 GenBank 컴퓨터 데이터베이스에 기탁 번호 AY612855 및 bankit625244로 예치되어 있다.
대부분의 HIV 게놈을 단일의 발현 플라스미드 내에 포함시킬 수 있도록 만들기 위해서, 전장 gag-pol 유전자와 거의 전장인 nef-tat-vif 유전자를 사용하여 융합 유전자를 제조하였다. 뿐만 아니라, gag 및 pol 유전자 사이에 존재하는 프로테아제 절단 위치를 제거하였다. 본 발명의 구체예에 사용된 모든 HIV 유전자는 단백질 발현 수준을 높이도록 최적화된 RNA(변형 서열)였다. 미국 특허 제 5,965,726 호; 동 제 5,972,596 호; 동 제 6,174,666 호; 동 제 6,291,664 호; 및 동 제 6,414,132 호를 참조하시오.
대안적으로, HIV 유전자는 미국 특허 출원 제 60/576,819 호(2004년 6월 4일 출원)에 제공된 방법에 따라서 최적화될 수 있다. 본 방법에 따르면, 유전자의 발현은 임의의 야생형 코돈을 "대용(surrogate)" 코돈으로 치환시킴으로써 강화된다. 강화된 폴리뉴클레오티드 서열은 적당한 대용 코돈을 선택함으로써 정해진다. 대용 코돈은 천연 생성되는(야생형) 유전자의 A 및 T(또는 RNA의 경우에는 A 및 U) 함량을 변경하도록 선택된다. 대용 코돈은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 글루탐산, 글리신, 이소루신, 루신, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린을 암호화하는 코돈이다. 그러므로, 변형된 핵산 서열은 서열 전체에 걸쳐 이러한 각각의 아미노산에 대한 대용 코돈을 보유한다. 나머지 11개의 아미노산에 대하여는 변형되지 않으므로, 상 응하는 천연 생성 코돈은 제 위치에 존재하게 된다.
상기 HIV 유전자를 변형시켜 유전자의 안전성을 개선하고, 이 유전자의 발현을 최적화시키는 데 표준적인 기술이 사용되었다. 문헌[Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY. (1989)]을 참조하시오. 예를 들어, 다음과 같은 유전자 변형은 그 결과로 생성되는 벡터에 포함된 HIV 유전자의 안전성을 증가시키고(즉, 바이러스 효소의 불활성화를 통함), 이 유전자의 허용 폭을 최대화시키는데 사용되었다:
1) 각각의 유전자로부터 gag 종결자와 pol 개시자를 제거함으로써 HIV-1 gag-pol의 융합 다기능 단백질을 단일의 개방 해독 틀 내에서 제조하였으며, 돌연 변이를 야생형 해독 틀 이동 영역에 도입하여 2개의 별도 단백질이 형성되는 것을 방지하였다. 융합 구성물의 이러한 예에 있어서, 야생형 gag-pol 내에서의 해독 틀 이동 "불안정(slippery)" 서열인 TTTTTT(서열 2)는 cTTcTg(서열 3)로 변경되었다. gag-pol 융합 유전자의 구성에 관한 정보에 관하여는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Megede, J. Z.외 다수 J. Virology 77:6197-6207 (2003)]을 참조하시오. 야생형 gag-pol 융합 단백질은 gag 및 pol 유전자를 구분하며 아무런 기능을 갖지 않는 56개의 아미노산 개방 해독 틀 폴리펩티드를 함유한다. 이러한 구성물의 전체 크기를 최소화시키기 위하여, 마지막 4개의 잔기가 (Lys-Gly-Arg-Pro)(서열 4)인 gag 다기능 단백질을 변형시켜, 그 뒤에 10개의 환원 아미노산으로 이루어진 유전자 내 영역(Asp-Arg-Gln-Gly-Thr-Val-Ser-Phe-Asn-Phe)(서열 5)이 따르도록 만들었다. pol 다기능 단백질의 처음 4개의 잔기는 잔류한다(Pro-Gln-lle-Thr)(서열 6). gag-pol 유전자의 야생형 암호화 영역은 변형되지 않아서 삼중 전사 단위 플라스미드 내에서의 발현을 촉진시켰다.
2) 3개의 활성 아미노산 위치를 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 HIV-1 프로테아제의 모든 단백 분해 활성은 불활성화되었다(25～27번 위치의 Asp-Thr-Gly). 문헌[Loeb외 다수 Nature, 340:397 (1989); Wu외 다수 J Virol, 70: 3378 (1996)]을 참조하시오.
3) 다음과 같은 4개의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 역전사 효소(RT)를 불활성화시켰다; Tyr 183, Met 184, Asp 185, Asp 186. 문헌[Larder외 다수, Nature, 327: 716-717 (1987); Larder외 다수 PNAS, 86: 4803-4807 (1989)]을 참조하시오.
4) 단일의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 RNAse 활성을 없앴다: glu 478. 문헌[Davies외 다수, Science, 252:88-95 (1991); Schatz외 다수 1989, FEBS lett.257:311-314 (1989)]을 참조하시오.
5) 다음과 같은 3개의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 인테그라제 기능을 없앴다: Asp 626, Asp 678 및 Glu 714. 문헌[Wiskerchen외 다수 J. Virol, 69: 376-386 (1995); Leavitt외 다수 J. Biol. Chem., 268: 2113-2119 (1993)]을 참조하시오.
6) 다음과 같은 암호화 영역을 단일의 다기능 단백질을 암호화하는 틀 내[4 ～206번 nef 아미노산 잔기 ; 2～80번 tat 아미노산 잔기; 2～192번 vif 아미노산 잔기]에 융합시킴으로써 HIV-1 nef, tat 및 vif 유전자에 대한 단일의 개방 해독 틀을 형성시켰다. 이 다기능 단백질을 nef-tat-vif 또는 ntv라 칭한다.
7) 안전성에 대한 경계책으로서, nef의 미리스틸화(myristylation) 시그널(1～3번 잔기, MGG)를 제거하고, tat로부터 유래된 2개의 시스테인(C30 & C34)을 결실시킴으로써 nef 및 tat 단백질을 불활성화시켰다.
실시예 2. 단일, 이중 및 삼중 전사 단위 플라스미드의 구성
본 실시예에서 논의되는 플라스미드는 표 1 및 표 2에 제시하였다.
환형의 이중 사슬 DNA 플라스미드내의 다양한 성분들을 사용하여 삼중 전사 단위 발현 카세트를 구성하였다. 도 1을 참조하시오. 제1 성분은 진핵 세포 내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위한 제1 전사 단위로서, 유인원 거세포 바이러스(SCMV) 프로모터, 클로닝 위치 및 소 성장 호르몬(BGH) 폴리 A 시그널로 이루어져 있다. 제2 성분은 진핵 세포 내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위한 제2 전사 단위로서, 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터, 클로닝 위치 및 SV40 폴리아데닐화(폴리 A) 시그널로 이루어져 있다. 제1 및 제2 전사 단위는 스페이서 영역 1에 의해 분리되어 있다. 제3 성분은 진핵 세포 내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위한 제3 전사 단위로서, 허피스 심플렉스 바이러스 Lap1 프로모터, SV40 스플라이싱 공여체/수용체, 클로닝 위치, 그리고 토끼 베타 글로빈 폴리-A 시그널로 이루어져 있다. 문헌[Goins W.F.외 다수, J. Virology 68:2239-2252 (1994); Soares, K. J.외 다수, Virology 70:5384-5394; Goins W.F.외 다수, J. Virology 73:519-532 (1999)]을 참조하시오. 제2 전사 단위 및 제3 전사 단위는 스페이서 영역 2에 의해 분리되어 있다. 스페이서 영역 2는 또한 키메라 박테리아 가나마이신 내성(kmr) 유전자, 제 1a 형 아데닐일 4'-뉴클레오티딜 전이 효소와 함께 포함되어 있다. 문헌[Shaw KJ,외 다수,. Microbiol. Reviews 57: 138-163 (1993) and Sadale, Y,외 다수, J. Bacteriol. 141: 1178-1182 (1980)]을 참조하시오. 이 유전자는 플라스미드를 함유하는 박테리아를 선별할 수 있도록 함과 동시에, 제한된 수의 아미노글리코시드에 대한 내성을 부여하도록 고안되었다. 제3 및 제1 전사 단위는 스페이서 영역 3에 의하여 분리되어 있다. 스페이서 영역 3은 박테리아 내에서 플라스미드의 증식에 필요한 pUC 박테리아 복제 기점을 포함한다.
실시예 3. 6개의 HIV 유전자를 포함하는 삼중 전사 단위 플라스미드
3개의 전사 단위 플라스미드 DNA 벡터의 용도에 대한 입증 수단으로서, 3개의 진핵 생물 개방 해독 틀을 동시 발현시킬 수 있는 플라스미드 벡터를 제조하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, HIV-1 항원을 암호화하는 선택 유전자를 삼중 전사 단위 발현 카세트에 삽입시킴으로써 3개 전사 단위 플라스미드 DNA 벡터를 제조하였다. 종래의 방법에 따른 모든 클로닝 기술을 사용하였다[Sambrook외 다수 1989].
첫 번째로, HIV-1 gag-pol 융합 유전자를 제1 전사 단위의 SCMV 및 BGH 폴리 A 위치 사이에 존재하는 Pmel-Xhol 클로닝 위치에 삽입시켰다. 상기 gag 유전자는 HXB2 분리체로부터 유래된 것이었고, 이와 유사하게 상기 pol 유전자 또한 HXB2 분 리체로부터 유래된 것이었다. 완전 HXB2 서열은 GeneBank 컴퓨터 데이터베이스에 기탁 번호 K03455로 예치되어 있다. 당 업자는 기타 계통 분기 또는 기타 바이러스 또는 박테리아 유전자로부터 유래된 다른 HIV-1 gag 및 pol 유전자도 유사한 방식으로 삽입될 수 있다는 사실을 이해할 것이다. HIV 및 기타 병원균에 대한 서열 정보는 로스 알라모스 국립 연구소 및 미합중국 국립 의학 도서관의 국립 생명 공학 정보 센터(8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894)에 있는 HIV 서열 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
그 다음으로, HIV-1의 1차 분리체(6101)로부터 유래된 전장 외피 유전자(gp160)를 제2 진핵 생물 전사 단위의 HCMV 및 SV40 폴리-A 위치 사이에 존재하는 MIuI 클로닝 위치에 삽입하였다. 상기 6101 외피 서열은 GeneBank 컴퓨터 데이터베이스에 기탁 번호 AY612855 및 bankit625244로 예치되어 있다.
마지막으로, tat의 2～80번 잔기와 vif의 2～192번 잔기에 융합되어 있는 nef의 4～206번 잔기를 포함하는, HIV nef-tat-vif(NTV) 융합 단백질을 암호화하는 유전자 구성물을 HSVLap1 프로모터 및 토끼 베타-글로빈 폴리-A 시그널 사이에 존재하는 KpnI-EcoRV 클로닝 위치에 삽입하였다. nef, tat 및 vif 유전자는 HIV-1의 NL4-3 분리체로부터 유래된 것이었다. 완전 HIV-1 NL4-3 서열은 GeneBank 컴퓨터 데이터베이스에 기탁 번호 M19921로 예치되어 있다.
그러므로, 구성할 때, gag-pol 개방 해독 틀을 제1 전사 단위 중 SCMV 프로모터의 제어 하에 있는 BGH 폴리-A 위치에 배치하였으며; 외피 개방 해독 틀은 제2 진핵 생물 전사 단위 중 HCMV 프로모터의 제어하에 있는 SV40 폴리-A 시그널에 배 치하였고; nef-tat-vif 융합 개방 해독 틀은 제3 진핵 생물 전사 단위 중 HSV Lap1/SV40 인트론 및 토끼 베타-글로빈 폴리-A 시그널의 제어 하에 배치하였다.
실시예 4. 단일, 이중, 삼중 전사 단위 플라스미드로부터 유래된 HIV 유전자의 발현
재료 및 방법: 세포 및 형질 감염
실시예 3에 기술된 6개의 HIV 유전자를 발현하는 플라스미드가 암호화 단백질을 발현시키는 능력에 대하여 시험관내에서 평가하였다. 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)로부터 얻어진 293 세포 및 RD 세포를 시험관내 발현 연구에 사용하였다. 이들 세포 내에서 HIV 단백질을 발현시키는 방법은 다음과 같았다: 세포를 형질 감염시키기 24시간 전에 웰 지름 35 ㎜당 2 × 105 세포의 밀도로 이 세포를 도말한 후, 정제된 플라스미드 DNA로 형질 감염시켰다. 형질 감염시키기 위하여 플라스미드 2㎍을 Fugene 형질 감염 시약(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)과 혼합하여, 총 부피 100 ㎕가 되도록 세포에 부어 층을 형성시켰다. 그 다음, 세포를 DMEM 배지(BRL) 2 ㎖ 및 10% FBS와 함께 48 시간 동안 항온 처리하였다. 마지막으로, 세포 용균물을 추가 분석에 대비하여 수집하였다.
발현된 단백질의 검출
웨스턴 블럿 검정법을 이용하여 HIV 단백질을 특이적으로 검출하였다. 예를 들어, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법을 이용하여 단백질 혼합물을 분리시켜 gag, pol, 외피 및 vif 단백질 각각에 대한 웨스턴 블럿 검정법을 수행하였다. 그 다음, 분리된 단백질을 PVDF 막(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 옮겼다. 미리 염색해 놓은 분자량 마커 및 재조합 HIV-1 p24(gag), p66(pol), gp160(env) 및 vif 단백질(Invitrogen)을 각각 크기 기준 및 양성 대조구로 사용하였다. 면역 염색법에 의해 gag, pol, env 및 vif 발현 여부를 확인하였다. 분리된 단백질이 결합되어 있는 PVDF 막을 각각의 단백질에 특이적인 항체들과 항온 처리하였다. 알칼리성 포스파타제에 컨쥬게이트화된 2차 항체(Invitrogen)와 발색 검출 키트(Invitrogen)를 사용하여 색상을 확인하였다.
단일, 이중, 삼중 전사 단위 플라스미드로부터 유래된 HIV 유전자의 발현
삼중 전사 단위 플라스미드로부터 유래된 HIV 유전자 발현량을 측정하여 이를 단일 전사 단위 플라스미드와 이중 전사 단위 플라스미드 각각으로부터 유래된 동일한 유전자의 발현량과 비교하였다. 단일의 전사 단위 플라스미드는 발현 조절 요소로서 HCMV 프로모터와 BGH 폴리-A 시그널을 함유하는 단일의 진핵 생물 전사 단위를 보유하였다. 단일의 전사 단위 플라스미드를 표 1에 나타낸 바와 같이 101번에서부터 105번까지, 그리고 110번에서부터 111번까지 번호를 메겼다. 예를 들어, 101번 플라스미드는 단일 전사 단위 중에 개방 해독 틀로서 HIV env 유전자를 함유하였다. 이와 유사하게, 102번 플라스미드는 단일 전사 단위 중에 개방 해독 틀로서 HIV gag 유전자를 함유하였다. 또한, 103번 플라스미드는 단일 전사 단위 중에 개방 해독 틀로서 HIV pol 유전자를 함유하였으며, 104번 플라스미드는 단일 전사 단위 중에 개방 해독 틀로서 HIV nef-tat-vif(ntv) 유전자 융합체를 함유하였다. 101번 플라스미드는 또한 단일 전사 단위 중에 개방 해독 틀로서 HIV nef-tat- vif(ntv) 융합 유전자를 함유하였는데, 단, 이 플라스미드는 104번 플라스미드와 같이 HCMV보다는 Lap1 프로모터에 의해 유전자 발현이 유도되었다. 마지막으로, 110번 플라스미드는 단일 전사 단위 중에 개방 해독 틀로서 HIV gag-pol-nef-tat-vif 유전자 융합체를 함유하였으며, 111번 플라스미드는 단일 전사 단위 중에 개방 해독 틀로서 HIV gag-pol 유전자 융합체를 함유하였다.
이중 전사 단위 플라스미드는 2개의 완전한 진핵 생물 전사 단위를 보유하였다. 이중 전사 단위 플라스미드는 표 1에 나타낸 바와 같이 201번에서부터 204번 그리고 212번으로 번호를 메겼다. 이중 전사 단위 플라스미드의 발현 조절 요소는 제1 전사 단위 중에 SV40 폴리 A와 커플링되어 있는 HCMV 프로모터와, 제2 전사 단위 중에 BGH 폴리 A 시그널과 커플링되어 있는 SCMV 프로모터로 이루어져 있었다.이 구체예에서, 201번 플라스미드는 제1 전사 단위에는 HIV gag 유전자를, 그리고 제2 전사 단위에는 HIV gag 유전자를 함유하였다. 202번 플라스미드는 제1 전사 단위에는 HIV nef-tat-vif 유전자 융합체를, 그리고 제2 전사 단위에는 HIV env 유전자를 함유하였다. 203번 플라스미드는 제1 전사 단위에는 HIV gag-pol-nef-tat-vif 유전자 융합체를, 그리고 제2 전사 단위에는 HIV env 유전자를 함유하였다. 204번 플라스미드는 제1 전사 단위에는 HIV gag-pol 유전자 융합체를, 그리고 제2 전사 단위에는 HIV env 유전자를 함유하였다.
몇몇 구체예에서, 애쥬반트는 이것을 플라스미드에서 발현시킴으로써 제공된다. 그러한 경우, 플라스미드는 적당한 수의 전사 단위를 함유하여야 한다. 명확히 밝혀두기 위하여, 그리고 항원 플라스미드와 구별하기 위해서, 제1, 제2 및 제3이 라는 용어를 사용하여 1개, 2개 또는 3개의 전사 단위를 보유하는 애쥬반트 플라스미드를 나타내었다. 예를 들어, IL-12는 2개의 폴리펩티드로 이루어져 있는 애쥬반트이다. 적당한 플라스미드는 212번 플라스미드인데, 이 플라스미드는 HCMV 최조기 프로모터와 SV40 폴리아데닐화 시그널의 제어 하에 제1 전사 단위 내에서 발현되는 IL-12 p35 서브유닛을 함유하였고, IL-12 p40 서브유닛은 제2 전사 단위 내에서 유인원 CMV 프로모터(SCMV)와 BGH 폴리아데닐화 시그널의 제어하에 발현되는 것이다.
삼중 전사 단위 플라스미드는 3개의 완전 진핵 생물 전사 단위를 보유하였으며, 이것에 301번, 302번 및 303번과 같이 번호를 메겼다. 표 2를 참조하시오. 상기 3개의 플라스미드 간의 차이점은 삽입된 HIV 개방 해독 틀의 수였다. 삼중 전사 단위 플라스미드에 대한 발현 조절 요소는 제1 전사 단위 중에 BGH 폴리 A 시그널과 커플링되어 있는 SCMV 프로모터와, 제2 전사 단위 중에 SV40 폴리 A와 커플링되어 있는 HCMV 프로모터, 그리고 제3 전사 단위 중에 토끼 베타글로빈 폴리-A 시그널과 커플링되어 있는 HSV Lap1 프로모터로 이루어져 있었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 301번 플라스미드는 삼중 전사 단위 플라스미드이지만, 개방 해독 틀이 삽입되어 있는 전사 단위는 1개만을 보유하였다. 구체적으로 301번 플라스미드는 제1 전사 단위 내에 gag-pol 융합 유전자 개방 해독 틀을 함유하였다. 302번 플라스미드는 개방 해독 틀이 삽입되어 있는 2개의 전사 단위를 보유하는 삼중 전사 단위 플라스미드를 포함하는 것으로서, 제1 전사 단위 내에는 gag-pol을, 그리고 제3 전사 단위 내에는 HIV nef-tat-vif 융합 유전자 개방 해독 틀을 포함하였다(제2 전사 단위 내에는 유전자가 삽입되지 않음). 마지막으로, 303번 플라스미드는 개방 해독 틀이 삽입되어 있는 3개의 전사 단위를 보유하는 삼중 전사 단위 플라스미드로서, 제1 전사 단위 내에는 gag-pol 유전자 융합체 개방 해독 틀을, 제2 전사 단위 내에는 env 유전자 개방 해독 틀을, 그리고 제3 전사 단위 내에는 nef-tat-vif 융합 유전자 개방 해독 틀을 포함하였다.
단일 및 이중 전사 단위 플라스미드*
플라스미드
번호		 HIV 구성물 유형
001 삽입부 부재 대조구 벡터 대조구/전사 단위 부재
101 HCMV-env-BGH 폴리 A 단일형
102 HCMV-gag-BGH 폴리 A 단일형
103 HCMV-pol-BGH 폴리 A 단일형
104 HCMV-ntv-BGH 폴리 A 단일형
105 Lap1-ntv-토끼 베타 글로빈 폴리 A 단일형
110 HCMV-gag-pol-ntv-BGH 폴리 A 단일형/융합체
111 HCMV-gag-pol-BGH 폴리 A 단일형/융합체
201 HCMV-pol-SV40 폴리 A,
SCMV-gag-BGH 폴리 A		 이중형
202 HCMV-ntv-SV40 폴리 A,
SCMV-env-BGH 폴리 A		 이중형
203 HCMV-gag-pol-ntv-SV40 폴리 A,
SCMV-env-BGH 폴리 A		 이중형
204 HCMV-gag-pol-SV40 폴리 A,
SCMV-env-BGH 폴리 A		 이중형
212 **HCMV-mIL-12 p35-SV40 폴리 A,
SCMV-mIL-12 p40-BGH 폴리 A		 애쥬반트
* 축약어의 의미는 다음과 같다:
SCMV = 유인원 거세포 바이러스 프로모터
HCMV = 인간 거세포 바이러스 프로모터
HSVLap1 = 허피스 심플렉스 바이러스 잠복기 관련 프로모터 1
gag-pol = HIV gag-pol 융합체
ntv = HIV nef-tat-vif 융합체
env = HIV 외피
mIL-12 = 쥐 인터루킨-12
삼중 전사 단위 플라스미드*
플라스미드 번호 HIV 구성물 ORF 수
301 SCMV-gag-pol-BGH 폴리 A,
HCMV-[무]-Lap1-[무]		 1
302 SCMV-gag-pol-BGH 폴리 A,
HCMV-[무],
Lap1:ntv-토끼 베타 글로빈 폴리 A		 2
303 SCMV-gag-pol-BGH 폴리 A,
HCMV-env-SV40 폴리 A,
Lap1:ntv-토끼 베타 글로빈 폴리 A		 3
* 축약어의 의미는 다음과 같다:
SCMV = 유인원 거세포 바이러스 프로모터
HCMV = 인간 거세포 바이러스 프로모터
HSVLap1 = 허피스 심플렉스 바이러스 잠복기 관련 프로모터 1
gag-pol = HIV gag-pol 융합체
ntv = HIV nef-tat-vif 융합체
env = HIV 외피
HCMV-[무] 및 Lap1-[무]는 전사 단위가 개방 해독 틀을 포함하지 않는 경우를
의미함(301번 플라스미드 참조).
**IL-12는 쥐 또는 짧은 꼬리 원숭이(rhesus macaque) 또는 인간의 것임.
전술한 바와 같이, 삼중 전사 단위 플라스미드의 발현 결과를 비교하는데 사용하기 위하여 복수 개의 단일 및 이중 전사 단위 플라스미드를 구성하였다. 표 1 및 표 2를 참조하시오. 단일, 이중 및 삼중 전사 단위 플라스미드를 293 및/또는 RD 세포에 일시적으로 형질 감염시킨 다음, 적당한 항체를 사용하는 웨스턴 블럿으로 세포 용해물을 분석함으로써, 상기 gag, pol, env, nef-tat-vif, gag-pol 및 gag-pol-nef-tat-vif 함유 구성물의 발현 패턴을 평가하였다.
다양한 구성물로부터 유래된 세포 용해물 중에서 gag를 시험관내 발현시키고, 그 결과를 웨스턴 블럿을 통하여 확인하였다. 도 2 및 표 1을 참조하시오. 마우스 항 gag 모노클로날 및 인간 폴리클로날 혈청을 사용하여 각각 gag 및 pol 단백질을 검출하였다. 분자량 마커 및 HIV p24를 표준으로서 처음 2개의 래인에서 전개시켰다. gag를 발현하는 단일 전사 단위 플라스미드 102번을 처음 시료의 래인에서 전개시켰다. 2개의 전사 단위와 개방 해독 틀이 삽입된 2개의 전사 단위를 보유하는 플라스미드는 201번, 203번 및 204번 플라스미드로서, 모두 상당량의 gag, 또는 gag-함유 다기능 단백질 예를 들어, gag-pol-nef-tat-vif 또는 gag-pol을 생산하였다. gag-pol 융합 구성물에 있어서, gag 및 pol 사이에 존재하는 틀 이동 서열을 돌연 변이시켜 동일한 해독 틀로부터 gag 및 pol을 발현시켰다. 2개의 전사 단위 플라스미드인 201번, 203번 및 204번 플라스미드는 단일 전사 단위 플라스미드인 102번 플라스미드보다 gag를 조금 생산하였다. gag-pol 융합체를 암호화하는 이중 또는 삼중 전사 단위 플라스미드는 동량의 gag-pol 다기능 단백질(예상 크기 약 180 kDa인 위치로 이동)을 발현하였다. 형질 감염된 세포의 세포 용해물 중에서 거대한 gag-pol-ntv 다기능 단백질을 암호화하는 203번 플라스미드로부터 gag가 발현되었음이 확인되었으며, 이 단백질은 예상 크기 약 220kDa인 위치로 이동하였다. 그러나, 이와 같이 거대한 융합체(203번 플라스미드)의 발현량은 gag-pol을 암호화하는 302번 및 303번 플라스미드의 발현량보다 적었다. 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 또한 gag-pol 다기능 단백질의 형태로 상당량의 gag를 생산하였으나, 단일 전사 단위 플라스미드의 경우보다는 소량 생산하였으며, 이중 전사 단위 플라스미드에서 생산되는 수준과 거의 동량 생산하였다. 3개 전사 단위 플라스미드인 302번 플라스미드는 2개의 개방 해독 틀이 삽입되어 있는 것으로서, 그 중 단일 전사 단위는 개방 해독 틀을 보유하지 않는 것으로서 2개 전사 단위 플라스미드와 거의 동일한 수준으로 gag를 생산하였다. 도 2를 참조하시오.
다양한 구성물로부터 유래된 세포 용해물 중에서 pol의 시험관내 발현 프로필을 관찰하고 그 결과를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과, gag의 경우에서 관찰되는 패턴과 유사한 패턴을 나타냈다. 도 3 및 표 1을 참조하시오, 이 경우, pol 단백질을 인간 폴리클로날 혈청으로 검출하였다. 분자량 마커와 HIV 역전사 효소를 표준으로서 처음 2개의 래인에서 전개시켰다. pol을 발현하는 단일 전사 단위 플라스미드인 103번 플라스미드를 처음 시료 래인에서 전개시켰다. 그 다음, 2개의 전사 단위와 개방 해독 틀이 삽입된 2개의 전사 단위를 보유하는 플라스미드는 201번, 203번 및 204번 플라스미드로서, 모두 상당량의 pol, 또는 pol-함유 폴리펩티드 예를 들어, gag-pol-nef-tat-vif 또는 gag-pol을 생산하였다. gag의 경우와는 대조적으로, 2개 전사 단위 플라스미드인 201번, 203번 및 204번 플라스미드는 단일 전사 단위 플라스미드인 103번 플라스미드와 거의 동일한 수준의 pol을 생산하였다. 상기 pol 및 gag-pol 융합체는 pol 다기능 단백질을 발현하였는데, 이 다기능 단백질은 pol의 경우 예상 크기가 약 110 kDa인 위치로 이동하였으며, gag-pol의 경우에는 약 180 kDa, 그리고 gag-pol-nef-tat-vif의 경우에는 약 250 kDa인 위치로 이동하였다. 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 또한 gag-pol 다기능 단백질의 형태로 pol을 생산하였으나, 단일 및 이중 전사 단위 플라스미드보다는 소량으로 pol을 생산하였다. 다시 말해서, 3개 전사 단위 플라스미드인 302번 플라스미드는 2개의 개방 해독 틀이 삽입된 것으로서, 이들 중 하나의 전사 단위는 gag-pol 다기능 단백질의 형태로서, 2개 전사 단위 플라스미드인 201번 및 203번 플라스미드와 거의 동일한 수준으로 pol을 발현하였다. 도 3을 참조하시오. 본 실시예에서, 204번 플라스미드는 다른 2개 전사 단위 플라스미드인 201번 및 203번 플라스미드보다 pol을 많이 발현하였다. 도 3을 참조하시오.
nef-tat-vif 또는 NTV로 알려져 있는 HIV 조절 단백질의 융합체 세포 용해물 중에서의 시험관내 발현에 관하여 유사한 분석법을 수행하였다. 도 4 및 표 1을 참조하시오. 마우스 항 vif 모노클로날 항체를 사용하여 NTV 단백질을 확인하였다. 처음 2개의 래인에, 기준으로서 각각 분자량 마커 및 재조합 HIV vif p23을 전개시켰다. HCMV 또는 Lap1 프로모터로부터 각각 NTV를 발현하는 2개 단일 전사 단위 플라스미드인 104 번 및 105번 플라스미드를 처음 2개의 시료 래인에서 전개시켰다. 도 4를 참조하시오. nef-tat-vif의 발현 수준은 양 플라스미드에 의한 발현 수준과 거의 동일하였다. 그 다음, 개방 해독 틀이 삽입되어 있는 2개의 완전한 전사 단위를 보유하는 2개의 플라스미드(202번 및 203번 플라스미드)는 상당량의 nef-tat-vif 다기능 단백질을 생산하였다. nef-tatvif 단백질의 발현 수준은 203번 플라스미드보다는 낮았는데, 그 이유는 아마도 발현된 다기능 단백질이 꽤 크기 때문일 것이다(gag-pol-nef-tat-vif: 약 220 kDa). 3개 전사 단위 플라스미드인 302번 플라스미드는 2개의 개방 해독 틀이 삽입되어 있었는데, 그 중 단일 전사 단위는 개방 해독 틀을 보유하지 않는 것으로서, 단일 전사 단위 플라스미드와 거의 동일한 수준으로 nef-tat-vif를 생산하였다. 도 4를 참조하시오. 3개의 개방 해독 틀이 삽입되어 있는 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 또한 상당량의 nef-tat-vif 다기능 단백질을 생산하였다. 특히, 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 단일 전사 단위 플라스미드인 104번 및 105번 플라스미드보다 소량의 nef-tat-vif를 생산하였으며, 이중 전사 단위 플라스미드(202번 및 203번 플라스미드)로부터 거의 동일한 수준 또는 그보다 높은 수준으로 nef-tat-vif 다기능 단백질을 생산하였다. 도 4를 참조하시오.
다양한 단일, 이중 및 삼중 전사 단위 플라스미드가 세포 용해물 중에서 HIV-외피 유전자를 발현시키는 능력을 평가하였다. 도 5 및 표 1을 참조하시오. 마우스 항-env 모노클로날 항체를 사용하여 외피 단백질을 검출하였다. 분자량 마커 및 재조합 HIV gp120을 기준으로서 처음 2개의 시료 래인에서 전개시켰다. 처음 시료 래인은 단일 전사 단위 플라스미드인 101번 플라스미드(HCMV 프로모터로부터 env 발현함)로부터 발현된 단백질을 함유한다. 도 5를 참조하시오. 상당량의 외피 당단백질을 발현시켰다. 그 다음, 2개의 개방 해독 틀이 삽입되어 있는 2개의 완전한 전사 단위를 보유하는 3개 플라스미드(202번, 203번 및 204번 플라스미드)는 상당량의 외피 당단백질을 생산하였다. 각각의 경우에, 외피 유전자는 SCMV 프로모터에 의해 제어되었다. 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 또한 상당량의 env 당단백질을 생산하였으나, 발현 수준은 단일 및 이중 전사 단위 플라스미드(101번, 202번, 203번 및 104번 플라스미드)와 비교하였을 때, 2～3배 감소하였다. 도 5를 참조하시오.
결론
반 정량적 시험관내 발현 분석법을 기초로 하였을 때, 얻어진 데이터를 통하여, 모든 삽입 HIV 유전자 예를 들어, gag-pol, env 및 ntv는 3개의 독립 전사 단위를 보유하는 삼중 프로모터 플라스미드로부터 상당한 수준으로 발현됨을 알 수 있다.
실시예 5: 복수 개의 플라스미드 또는 플라스미드 당 DNA 농도가 일정한 단일 플라스미드를 통한 발현
다음은, 복수 개의 유전자를 암호화하는 단일의 삼중 전사 단위 플라스미드로부터의 발현량을 복수 개의 플라스미드(각각 유전자의 동일 어레이로부터 단일 유전자를 발현함)로부터의 발현량과 비교하였으며, 이때 플라스미드 당 DNA는 1㎍으로 일정하게 유지시켰다. 각각의 경우에 있어서, 개방 해독 틀이 삽입되지 않은 플라스미드 DNA를 보충하여 DNA의 총량 또한 4㎍으로 일정하게 유지시켰다. HIV gag 발현량은 각각 1㎍의 플라스미드로 일시 형질 감염시킨 배양 세포를 사용하여 평가하였으며, 세포 용해물을 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 래인 2(2개 플라스미드), 래인 3(1개 플라스미드), 래인 4(1개 플라스미드) 및 래인 5(4개 플라스미드)에서 HIV gag가 발현되었음을 용이하게 관찰할 수 있었다. HIV gag 발현량은 래인 1(3개 플라스미드)에서는 적었다. 상기 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 또한 상당량의 gag 단백질을 생산하였는데, 이는 보다 많은 플라스미드를 조합하여 함유하는 경우보다는 적은 양이었다.
단일 또는 복수 개의 플라스미드로부터의 HIV env 발현량을 평가하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 또한, 각 플라스미드 1㎍씩을 배양 세포에 일시적으로 형질 감염시키고 세포 용해물을 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 그 결과, 래인 1(3개 플라스미드), 래인 2(2개 플라스미드), 래인 3(1개 플라스미드), 래인 4(1개 플라스미드) 및 래인 5(4개 플라스미드)에서 HIV env가 발현되었음을 용이하게 파악할 수 있었다. 각각의 경우에 있어서, 개방 해독 틀이 삽입되지 않은 플라스미드 DNA로 보충하여 DNA의 총량을 4㎍으로 일정하게 유지시킴으로써, DNA의 총량을 4㎍으로 만들었다. 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 또한 상당량의 env 당단백질을 생산하였다. 도 7을 참조하시오. 이 경우, 단일의 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 래인 5에서 생산된 env 당단백질(4개 플라스미드 사용) 만큼의 env 당단백질을 생산하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 단일 또는 복수 개의 플라스미드로부터의 HIV nef-tat-vif 발현량은 각각 배양 세포에 일시적으로 형질 감염된 플라스미드를 1㎍씩 사용하여 평가하였으며, 세포 용해물은 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 도 8을 참조하시오. 그 결과, 래인 1(3개 플라스미드), 래인 2(2개 플라스미드), 래인 3(1개 플라스미드), 래인 4(1개의 3개 전사 단위 플라스미드) 및 래인 5(4개 플라스미드)에서 HIV nef-tat-vif가 발현되었음을 알 수 있었다. 도 8을 참조하시오. DNA의 총량은 4㎍으로 일정하게 유지시켰다. 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는, 비록 2개 플라스미드를 조합하여 함유하는 경우보다는 적지만, 상당량의 nef-tat-vif 단백질을 생산하였다.
결론
도 6, 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 3개 전사 단위 플라스미드(303)를 사용하면, gag-pol, env 및 ntv 단백질을 암호화하는 3개의 개방 해독 틀 모두가 유사한 수준으로 자발적으로 발현하므로, 이 플라스미드의 기능을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 2개의 플라스미드 또는 단일 플라스미드를 사용하여 복수 개의 유전자를 일정한 총 DNA 농도로 발현시키는 경우
HIV 유전자 gag, pol, env 및 nef-tat-vif의 발현량을 2㎍ 농도의 삼중 전사 단위 플라스미드를 사용하는 경우와 2개의 플라스미드를 조합하여 사용하는 경우(각 플라스미드는 1㎍ DNA 함유)와 비교하였다. 총 DNA 농도는 도 9, 도 10, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이 2㎍으로 일정하게 유지시켰다.
도 9는 pol 단백질 발현 양상이 2개의 플라스미드를 조합하여 사용하는 경우 또는 삼중 전사 단위 플라스미드를 사용하는 경우와 유사하다는 것을 나타내는 것이다. 래인 2는 201번 플라스미드와 202번 플라스미드를 조합 사용한 경우 발현되는 pol 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 것으로서, 2개의 이중 전사 단위 플라스미드는 HIV 유전자인 gag, pol, nef-tat-vif 및 env의 전체 어레이를 발현하도록 구성된 것이다. 그 다음, 이중 전사 단위 플라스미드와 단일 전사 단위 플라스미드를 조합 사용한 경우의 pol 단백질 발현 결과, gag, pol, env 및 nef-tat-vif가 다양한 형태로 발현되었으며, 그 발현 결과는 pol 단백질을 웨스턴 블럿시켜 평가되었다. 도 9의 래인 3(204번 및 104번 플라스미드) 및 래인 5(302번 및 101번 플라스미드)를 참조하시오. 각각의 경우, pol이 발현되는 것을 확인할 수 있다. 래인 4는 203번 플라스미드로부터 발현된 pol 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 것으로서, 여기서 상기 203번 플라스미드는 HIV 유전자인 gag-pol-nef-tat-vif 및 env의 전체 어레이를 발현하는 이중 전자 단위 플라스미드이다. 도 9를 참조하시오. 래인 6은 303번 플라스미드로부터 발현된 pol 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 포함하는 것으로서, 여기서 상기 303번 플라스미드는 실시예 2 및 3에 기술된 바와 같이, HIV 유전자인 gag-pol-env 및 nef-tat-vif의 전체 어레이를 발현하는 삼중 전사 단위 플라스미드의 일례이다. 도 9를 참조하시오.
도 10 및 도 11은 삼중 전사 단위 플라스미드로부터 발현된 단백질과 2개 플라스미드를 조합 사용하여 발현된 gag 및 외피 단백질을 비교한 결과를 나타내는 것이다. 래인 2는 201번 플라스미드와 202번 플라스미드를 조합 사용하였을 때 발현되는 gag 및 env 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 것으로서, 여기서 상기 플라스미드들은 2개의 이중 전사 단위 플라스미드가 HIV 유전자인 gag, pol, nef-tat-vif 및 env의 전체 어레이를 발현하도록 구성되었다. 그 다음, 이중 전사 단위 플라스미드와 단일 전사 단위 플라스미드를 조합 사용하였을 때 발현되는 gag 및 env 단백질의 발현 결과를 웨스턴 블럿을 사용하여 평가하였다. 도 10 및 11을 참조하시오[래인 3 = 204번 플라스미드 및 104번 플라스미드; 래인 5 = 302번 플라스미드 및 101번 플라스미드]. 302번 플라스미드는 2개의 개방 해독 틀만이 삽입되어 있기 때문에, 2개의 전사 단위 플라스미드로서의 기능을 하는 3개 전사 단위 플라스미드이다. 표 2를 참조하시오, 각각의 경우 gag 및 env가 발현됨을 확인할 수 있었다. 도 10을 참조하시오. 래인 4는 203번 플라스미드로부터 발현된 gag 및 env 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 예시한 것으로서, 여기서 상기 203번 플라스미드는 HIV 유전자인 gag-pol-nef-tat-vif 및 env의 전체 어레이를 발현하는 이중 전사 단위 플라스미드이다. 도 10 및 도 11을 참조하시오. 래인 6은 실시예 2 및 실시예 3에 기술된 바와 같은 삼중 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드로부터 발현된 gag 및 env 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 포함한다. 도 10 및 도 11을 참조하시오. 삼중 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드로부터 발현된 gag 및 env 단백질을 플라스미드들을 조합 사용한 경우와 비교하였다.
도 12는 웨스턴 블럿 검출법을 이용하여 삼중 전사 단위 플라스미드로부터 발현된 단백질과 다양한 플라스미드를 조합하여 사용할 경우 발현된 nef-tat-vif 다기능 단백질을 비교한 결과를 나타내는 것이다. 래인 2는 201번 및 202번 플라스미드를 조합하여 사용할 경우 발현되는 nef-tat-vif 다기능 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 것으로서, 여기서 상기 201번 및 202번 플라스미드는 HIV 유전자인 gag, pol, nef-tat-vif 및 env를 발현하도록 디자인된 2개의 이중 전사 단위 플라스미드이다. 래인 3 및 래인 5는 웨스턴 블럿을 이용하여 확인된 nef-tat-vif 다기능 단백질의 발현 결과를 나타내는 것으로서, 이 다기능 단백질은 이중 전사 단위 플라스미드와 단일 전사 단위 플라스미드를 상이하게 2가지 형태로 조합하였을 때에 생산된다. 도 12를 참조하시오[래인 3 = 204번 플라스미드 및 104번 플라스미드; 래인 5 = 302번 플라스미드 및 101번 플라스미드]. 전술한 바와 같이, 302번 플라스미드는 3개 전사 단위 플라스미드로서 개방 해독 틀이 오로지 2개 삽입되어 있기 때문에, 2개 전사 단위 플라스미드의 역할을 한다. 표 2를 참조하시오. 이 경우, 래인 5에 나타낸 302번 플라스미드로부터 발현된 상기 nef-tat-vif 단백질은 201번 및 202번(래인 2) 또는 204번 및 104번(래인 3) 플라스미드들을 조합 사용하였을 때 발현된 단백질의 경우보다 더욱 낮은 수준으로 생산된다. 도 12를 참조하시오. 래인 4는 203번 플라스미드로부터 발현된 nef-tat-vif 다기능 단백질을 나타내는 것으로서, 여기서 상기 203번 플라스미드는 HIV 단백질인 gag-pol-nef-tat-vif 및 env 단백질의 전체 어레이를 발현하는 이중 전사 단위 플라스미드이다. 도 12를 참조하시오. 래인 6은 삼중 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드로부터 발현된 nef-tat-vif 다기능 단백질을 나타내는 것이다. 도 12를 참조하시오. nef-tat-vif를 포함하는 303번 플라스미드로부터의 발현량은 302번 플라스미드로부터의 발현량보다 더욱 많았다. 특히 주목할 점은, 하나의 프로모터로부터 거대한 gag-pol-nef-tat-vif 다기능 단백질을 발현하고 다른 프로모터로부터는 env 단백질을 발현하는 2개 전사 단위 플라스미드(203)로부터의 발현 수준은 3개의 독립적인 전사 단위들로부터 유래된 동일한 유전자를 암호화하는 303번 플라스미드에서의 발현 수준보다 실질적으로 더욱 낮았다.
요약하면, 삼중 전사 단위 플라스미드를 사용하면, 3개의 개방 해독 틀은 거의 동일한 수준으로 동시에 발현될 수 있고, 전체적인 발현 수준은 상기 유전자를 암호화하는 단일 및 이중 프로모터 구성물의 경우와 거의 비슷하였다. 시험관내 유전자 발현 데이터는, 복수 개의 HIV 유전자가 삼중 전사 단위 플라스미드로부터 발현되는 경우 프로모터가 거의 방해 받지 않고 기능을 할 수 있게 된다는 사실을 제시하고 있다. 그러므로, 개별 전사 단위를 벡터 내에 적당하게 배치한다.
실시예 7: 복수 개의 플라스미드 또는 단일 플라스미드를 사용하여 총 DNA 농도를 일정하게 유지시키지 않고 복수 개의 유전자를 발현시키는 경우
복수 개의 유전자를 암호화하는 단일의 삼중 전사 단위 플라스미드로부터의 발현량을 복수 개의 플라스미드(유전자의 동일한 어레이 발현)로부터의 발현량과 비교하였으며, 이 때 플라스미드 당 DNA 양은 1㎍으로 일정하게 유지시켰다. 실시예 5와는 대조적으로, DNA의 총량은, DNA 총량을 보충시키는 개방 해독 틀이 삽입되지 않은 플라스미드 DNA로 보충하지 않았다. 데이터를 직접 나타내지는 않았지만, 이하에 요약하였다.
본 실시예에서, HIV gag, pol, env 및 ntv 발현량은 배양 293 세포(각각 1㎍씩의 플라스미드로 일시 형질 감염됨)를 사용하여 평가하였으며, 세포 용해물은 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 3개의 플라스미드(101번, 104번, 301번), 2개의 플라스미드(201번 및 202번), 하나의 플라스미드(203번), 하나의 플라스미드(303번) 및 4개의 플라스미드(101번, 102번, 103번, 104번)를 조합 사용하여 형질 감염시켜, HIV gag 발현량을 확인하였다. 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 더욱 많은 플라스미드를 조합하여 사용한 경우에 비하여 gag 단백질을 더욱 다량으로 생산하였다. 특히, 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는, 6개의 HIV 유전자 모두를 보유하는 2개 전사 단위 플라스미드인 203번 플라스미드보다 더욱 많은 gag 다기능 단백질을 생산하였으며, 6개의 HIV 유전자 모두를 보유하는 2개 전사 단위 플라스미드인 201번 및 202번 플라스미드를 조합하여 사용한 경우보다는 조금 적게 생산하였다. 3개의 플라스미드(101번, 104번, 301번)를 조합하여 사용한 경우의 gag 발현은 미약하였는데, 여기서 상기 gag는 SCMV 프로모터에 의해 유도된 gag-pol 융합체로서 발현되었다.
단일 또는 복수 개의 플라스미드의 HIV env 발현량에 관하여도 평가하였다. 그 결과, HIV env 발현은 3개의 플라스미드(301번, 101번 및 104번), 2개의 플라스미드(201번 및 202번), 하나의 플라스미드(203번), 하나의 플라스미드(303번) 및 4개의 플라스미드(101번, 102번, 103번 및 104번)를 조합 사용하였을 때 용이하게 확인할 수 있었다. DNA의 총량은 사용된 플라스미드의 수에 따라 달랐는데, 이때 플라스미드당 1㎍의 DNA가 형질 감염되었다. 이 경우, 3개 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 기타 임의의 플라스미드 또는 플라스미드를 조합 사용하는 경우보다 많은 env 당단백질을 생산하였다.
단일 또는 복수 개의 플라스미드로부터의 HIV nef-tat-vif 발현량은 각각 1㎍씩의 플라스미드(배양 세포에 일시적으로 형질 감염됨)를 사용하여 평가하였으며, 이때 세포 용해물은 웨스턴 블럿으로 분석하였다. HIV의 nef-tat-vif 발현은 3개의 플라스미드(301번, 101번 및 104번), 2개의 플라스미드(201번 및 202번), 하나의 플라스미드(203번), 하나의 플라스미드(303번) 및 4개의 플라스미드(101번, 102번, 103번 및 104번)를 조합 사용하였을 때 확인되었다. 3개의 전사 단위 플라스미드인 303번 플라스미드는 상당량의 nef-tat-vif 단백질을 생산하였다.
결론
rev-독립 방식으로 특이 단백질을 높은 수준으로 발현하는 복수 개의 HIV 유전자를 암호화하는 삼중 전사 단위 플라스미드를 고안 및 구성한 결과, 단일 플라스미드 구성물이 3개의 전사물을 독립적이고 효과적으로 발현하였음을 확인할 수 있었다. 이 실시예에 있어서, 삼중 전사 단위 플라스미드로부터의 HIV 유전자 발현량을 단일 또는 이중 전사 단위 구성물로부터 유래된 동일한 유전자의 발현량과 비교하였다. 얻어진 데이터를 통하여, 삼중 전사 단위 플라스미드로부터의 유전자 발현량 이 단일 또는 이중 발현 카세트에 의해 발현되는 경우에 비하여 보다 소량임을 알 수 있다. 그러나, 전술한 실시예에 있어서, HCMV 프로모터-유도성 유전자 발현량은 SCMV 프로모터에 의한 경우보다 다량이었으며, HSV-lap1 프로모터에 의한 경우가 그 다음이었음을 알 수 있었다. 삼중 전사 단위 구성물 중에 존재하는 프로모터의 세기에 있어서의 차이는 플라스미드 내에서 더욱 높은 수준 또는 낮은 수준의 면역원성을 갖는 항원을 발현하도록 유전자를 배치할 때 고려해야 할 사항이다.
실시예 8. 1개, 2개 또는 3개의 완전한 전사 단위를 함유하는 플라스미드 벡터를 사용한 쥐 면역화 연구
6개의 HIV-1 유전자 예를 들어, gag, pol, env, nef, tat 및 vif로부터 단백질을 발현하는 3개 전사 단위 플라스미드 벡터의 면역원성 작용을 확립 및 비교하기 위하여 쥐를 사용한 연구를 실시하였다. 특히, 다양한 단일, 이중 및 삼중 플라스미드 DNA계 면역원성 조성물이 Balb/c 마우스 내에서 다수 항원 특이 세포 매개성 면역 반응을 나타내는 상대적 능력을 비교하였다.
표 3에 대략적으로 나타낸 바와 같이 총 100 ㎍의 DNA를 근육내 투여하여 Balb/c 마우스를 면역화시켰다. 모든 경우에 있어서, 면역원성 조성물은 0.25% 부피바카인과 함께 제형화되었으며, 이를 100 ㎕의 부피만큼 대퇴 사두근에 주사하였다. 2차 면역화 이후 10일 경과시에, 동물을 죽인 후 면역 검정용 혈청 및 비장을 분리하였다. 면역화된 마우스의 혈청을 항 gag 및 항 env 특이 항체 역가에 대해 분석하였다. 비장을 사용하여 항원-특이적 IFN-감마 분비 세포를 측정하였다(이하 기술된 바와 같이 ELISPOT 검정법 이용).
동물
이 연구를 위하여, 4～6주령 암컷 Balb/c 마우스를 사용하였다. 실험 동물의 보호 및 취급에 관한 가이드(National Research Council, National Academic Press, Washington, DC, 1996)에 따라서 마우스를 다루었다. 뿐만 아니라, 마우스를 취급 및 보호하는 방법도 와이어스 리서치 기관 동물 보호 및 취급 위원회(Wyeth Research's Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 방법에 따랐다.
면역원성 조성물 및 면역화
HIV env gp160, gag p55, pol, 또는 nef-tat-vif 융합 단백질을 암호화하는 다양한 플라스미드 DNA 발현 벡터를 실험용 면역원성 조성물로서 사용하고, 외래 유전자를 삽입하지 않은(empty) 발현 벡터 골격을 대조구 면역원성 조성물 벡터로서 사용하였다. 연구 디자인을 위하여 이하 표 3을 참조하시오. 다양한 발현 벡터에 의한 HIV 유전자 발현 여부는 인간 횡문근육종(RD) 세포를 일시적으로 형질 감염시킨 이후에 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 실시예 4 ～ 실시예 7을 참조하시오.
이 연구에 사용된 애쥬반트는 또한 DNA 플라스미드를 통하여 전달되었다. 본 실시예에서, 모든 동물에 IL-12를 발현하는 212번 플라스미드 25㎍을 공동 주입하였다. 본 애쥬반트 플라스미드는 2개 전사 단위 발현 플라스미드(표 1의 212번 플라스미드)로서, 쥐의 IL-12 p35 및 p40 유전자를 발현하는 플라스미드이다. 표 1을 참조하시오. IL-12 p35 서브유닛을 HCMV 최조기 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 시그널의 제어하에 발현시켰으며, IL-12 p40 서브유닛을 유인원 CMV 프로모터(SCMV) 및 BGH 폴리아데닐화 시그널의 제어하에 발현시켰다. 항 마우스 IL-12 p70 포획 ELISA(Endogen, Woburn, MA)(데이터는 표시하지 않음)를 이용하여 세포 상청액을 스크리닝함으로써, RD 세포를 일시적으로 형질 감염시키면 쥐 IL-12가 생산되는 것이 확인되었다.
마우스 연구 디자인 - 2회의 면역화
그룹
번호		 플라스미드
번호		 플라스미드 설명 총 DNA
(㎍)		 마우스
번호		 면역화
스케쥴
(주)
1 303 HCMV-env; SCMV-gag/pol; lap-ntv 100 9 0～3
1a 203 HCMV-gag/pol; SCMV-env 100 9 0～3
2b 101+110 HCMV-env
HCMV-gag-pol-ntv		 50
50		 9 0～3
2c 104+204 HCMV-ntv
HCMV-gag-pol, SCMV-env		 50
50		 9 0～3
2d 111+202 HCMV-gag-pol
HCMV-ntv, SCMV-env		 50
50		 9 0～3
2e 201+202 HCMV-pol, SCMV-gag
HCMV-ntv, SCMV-env		 50
50		 9 0～3
3a 111
101
104		 HCMV-gag/pol
HCMV-env
HCMV-ntv		 33
33
33		 9 0～3
3b 101
104
201		 HCMV-env
HCMV-ntv
HCMV-pol, SCMV-gag		 33
33
33		 9 0～3
3c 102
103
202		 HCMV-gag
HCMV-pol
HCMV-ntv, SCMV-env		 33
33
33		 9 0～3
4 001 대조구 벡터 100 6 0～3
면역화용 발현 벡터는 퓨어신, 인코포레이션(Malvern, PA)에 의해 생산되었다. 플라스미드는 이.콜라이 내에서 증식되어, 알칼리 분해에 의해 세포로부터 분리되고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었으며, 이 플라스미드는 촉진제로서 부피바카인 0.25%를 함유하는 등장 시트르산염 완충액(29.3 mM 시트르산 나트륨, 0.67 mM 시트르산, 15O mM NaCl, 0.34 mM EDTA, pH = 6.4 ～ 6.7) 중에 2.5 ㎎/㎖의 농도로 각각 제형화하여, DNA:부피바카인 복합체를 형성하였다. 모든 그룹에 대해서, 애쥬반트 플라스미드를 면역원성 조성물의 일부로서 항원 발현 플라스미드와 혼합 사용하였다. 최종 플라스미드 제제는 90% 초과의 수퍼코일링된 플라스미드 DNA로 이루어진 것으로 파악되었으며, 나머지 내독소는 30 EU/㎎ DNA 미만인 것으로 파악되었다(데이터는 나타내지 않음). 면역화 직전에, 적당한 플라스미드 발현 벡터 제형들을 혼합하여 면역원성 조성물을 제조하였다. 결과로 생성된 면역원성 조성물을 18게이지 바늘이 장착된 0.3 ㎖ 들이 시린지를 사용하여 양쪽 대퇴 사두근에 근육내 주사하여 투여하였다.
쥐 IFN-γ ELISPOT 검정법
원래 ELISPOT(또는 ElisaSpot; Enzyme Linked Immuno Spot 검정법의 약어)은 항체-분비 B 세포를 검출하는 방법으로서 개발되었다. 현재 이 방법은 특이 항원에 대한 T 세포의 반응[보통, 세포 백만개당 활성화된 세포의 수로서 표시됨]을 측정하는 데 응용되기도 한다. 본 실시예에서는, 인터페론-감마(IFN-감마) 생산량을 단일 세포의 활성화에 대한 해석 수단으로 사용하였다.
본 분석법에서, ELISPOT은 특이 HIV 항원을 발현하는 면역원성 조성물에 의해 유도되는 세포 독성 T 세포 활성을 측정하는 데 사용되었다. IFN-γ ELISPOT 반응을 측정하기 위하여, 마우스 IFN-γ ELISPOT 키트(모델 번호 551083, BD Biosciences, San Diego CA)를 사용하였다. 각 웰당 막으로된 기저부를 갖는 96 웰 미세 역가 평판 내에서 ELISPOT 검정법을 수행하였다. 특히, 96 웰 편평 기저부 ELISPOT 평판(ImmunoSpot, Cellular Technology Limited, Cleveland Ohio)을 정제된 항 마우스 γ-인터페론(mIFN-γ) 모노클로날 항체(상품 번호 51-2525KC, BD- Biosciences, San Diego CA)와 함께 밤새도록 코팅한 다음(농도 = 10 mcg/㎖), 이 평판을 멸균 1 × 포스페이트 완충 염수(1 × PBS)로 3회 세척하고, 다시 R10 완전 배양 배지[10% 열 불활성화(HI) 소 태아 혈청(FBS) 및 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린, 100 mcg/㎖ 황산 스트렙토마이신, 1 mM 피루브산나트륨, 1 mM HEPES, 100 mcM 비 필수 아미노산 함유 RPMI-1640]로 2 시간 동안 블로킹시켰다. 처음에 2개의 멸균 현미경 슬라이드의 동결 말단부 사이에서 비장을 분쇄하여 마우스 비장을 가공하였다. 결과로 생성된 균질물을 완전 R05 배양 배지[5% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린, 100 mcg/㎖ 황산 스트렙토마이신, 1 mM 피루브산 나트륨, 1 mM HEPES, 100 mcM 비 필수 아미노산으로 보강된 RPMI 1640 배지] 10 ㎖중에 재현탁시키고, 그 후에 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심 분리법으로 비장 림프구를 분리하여, 이를 2 mcg/mL Con-A (Sigma), 펩티드 풀(11개의 아미노산에 의해 중첩된 15머; 각각의 최종 펩티드 농도 = 2.5 mcM) 스패닝(spanning) HIV gag p55, HIV-1 6101 env gp160, pol, nef, tat, vif를 함유하는 완전 R10 배양 배지, 또는 외래 함유물이 없는(보강물이 없는) 배지에 재현탁시켰다. 접종시킨 세포 수는 웰 당 4 × 105 비장 림프구(4 × 106 비장 림프구/㎖)였으며, 이를 2개의 웰에서 분석하였다. 비장 림프구를 37℃에서 22～24 시간 동안 항온 처리한 다음, 이를 처음에 탈이온수로 3회 세척한 다음 얼음 상에서 10～20분 동안 항온 처리함으로써 ELISPOT 평판에서 분리해냈다. 그 다음, 평판을 0.1% Tween-20을 함유하는 1 × PBS로 6회 세척하였다. 그 다음에, 평판을 R10으로 희석된 항 마우스 IFN-γ 바이오틴화 검출 항체[5.0 mcg/㎖, 상품 번호 51-1818KZ, BD-Biosciences, San Diego CA]로 처리한 다음, 4℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 이후 ELISPOT 평판을 0.1% Tween-20을 함유하는 1 × PBS로 10회 세척하고, R10으로 1:100 희석된 스트렙타비딘-호오스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트(Catalog No. 51-9000209, BD-Biosciences, San Diego CA)를 웰 당 100 mcL씩 처리하여, 실온에서 1시간 더 항온 처리하였다. 이 평판을 0.1% Tween-20을 함유하는 1 × PBS로 6회 헹군 다음, 또 1 × PBS로 3회 세척하여 미결합 스트렙타비딘-호오스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트를 제거하였다. 그 다음, AEC 기질 용액(Catalog No. 551951, BD- Biosciences, San Diego CA) 중에 AEC 색원체 20 mcL/㎖를 희석시켜 퍼옥시다제 기질을 제조하였다. 3～5 분동안 기질 용액을 100 mcL/웰로 첨가하여 발색을 개시하였다. 마지막으로, 상기 평판을 물로 헹구고 공기 건조시켰다. ELISPOT 분석기 또는 ELISPOT 평판중 단일 웰의 사진을 촬영하는 이미지 형성 장치를 사용하여 결과를 측정하고, 그 후 점의 갯 수를 세었다. 이 경우, 결과로 생성된 점들은 Immunospot 판독기(CTL Inc., Cleveland, OH)를 사용하여 계수하였다. 이 때 반응(- 배지 백그라운드)이 배지 반응보다 3배 이상이고, 인터페론 감마를 분비하는 점 형성 세포가 106개의 비장 림프구 당 50개 이상인 경우(#SFC/106 비장 림프구), 펩티드-특이적 IFN-γ ELISPOT 반응은 양성인 것으로 간주하였다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 표 3에 나타낸 플라스미드로 이루어진 면역원성 조성물을 사용하여 2회 면역화시킨 다음에, 복수 회 플라스미드 DNA 면역화된 마우스에서의 각 HIV-1 항원 및 총 HIV 특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응을 측정하였다.
2회 면역화 이후의 쥐 면역 반응
그룹 ID gag-특이적
반응* 		pol-특이적
반응		 env-특이적
반응		 ntv#-특이적
반응		 총 HIV-특이적
반응
대조구 2 0 3 0 5
1a 46 43 238 4 331
2e 29 138 181 12 360
2c 102 118 203 44 467
1 20 39 468 2 529
3b 16 109 404 20 548
2d 188 185 251 8 632
2b 43 65 548 6 662
3a 139 105 802 18 1064
3c 174 378 616 11 1179
* 항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 106개의 비장 림프구 당 인터페론 감마를 분비하는 점 형성 세포수(#SCF/106 비장 림프구)로서 나타내었다.
# ntv, nef-tat-vif 융합 단백질.
모든 경우에 있어서, 상기 nef-tat-vif 특이적 반응은 비교적 약했다. nef-tat-vif가 lap1 프로모터의 제어하에 있는 그룹 1의 마우스에서 가장 약했다. 그러나, 상기 실시예 4～7에서, HCMV 프로모터 유도성 유전자 발현량은 SCMV 프로모터에 의한 경우보다 많았으며, SCMV-프로모터 유도성 유전자 발현량은 HSV-lap1 프로모터의 경우보다 많았다. 삼중 프로모터 구성물에서 사용되는 프로모터들의 세기의 차이는 이 구성물이 면역원성 조성물에 사용될 때 관찰되는 약 유도성 면역 반응에 영향을 미칠 수 있다.
융합 단백질의 사용에 있어서, 3a 및 3c에서의 HIV pol에 대한 ELISPOT 반응을 비교한 결과, 단일 폴리펩티드가 사용되었을 때보다 융합 폴리펩티드가 사용되었을 때에 면역원성이 약간 더 감소 되었음을 알 수 있다.
다른 고려 사항은 관찰되는 단백질의 상대적 면역원성이다. 예를 들어, 3b와 3c[HCMV 프로모터 유도성 유전자 발현으로 인하여 단일 전사 단위를 함유하는 단일 플라스미드 상에서 env, gag, pol 및 nef-tat-vif 유전자가 각각 발현되는 경우]를 관찰한 결과, 면역원성의 세기의 순서는 대략 env > pol > gag > nef-tat-vif임을 알 수 있다. 전술한 바와 같이, 프로모터 세기 및 상대적 면역원성은 둘 다 면역원성 조성물에 사용하기 위한 각각의 플라스미드와 플라스미드 조합의 패턴을 디자인할 때 고려되어야 할 사항이다.
그 다음, 1개, 2개 및 3개의 플라스미드 면역원성 조성물을 사용하여 3회 면역화시켰을 때, 면역 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 다음의 연구를 수행하였다. 표 5를 참조하시오. 6개의 마우스로 이루어진 그룹을 전술한 바와 같이 면역화시키되, 단, 3주의 간격으로 2회 면역화시키지 않고 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 표 5를 참조하시오, 그룹 1, 2e 및 3a는 표 3과 동일한 면역원성 조성물을 이용하였다. 또한, 3회 면역화시키는 연구에 있어서, 신규의 플라스미드인 301번 플라스미드를 구성하여 gag/pol 융합 단백질의 SCMV 프로모터-유도성 유전자 발현과 gag/pol 융합 단백질의 HCMV 프로모터 유도성 유전자 발현을 직접 비교하였다. 표 5 및 6의 그룹 3a 및 4b를 비교하시오. 이 플라스미드로써 또한 삼중 전사 단위 플라스미드로부터 발현되는 gag-pol 융합체의 면역원성 효능과 유사한 프로모터에 의하여 유도되는 3개의 단일 전사 단위 플라스미드로부터 발현되는 gag-pol 융합체 및 env 유전자를 비교하였다. 표 5 및 6의 그룹 1 및 4b를 비교하였다. 최종 증량 투여 이후 17일 경과시에 비장 조직을 수집하여 이를 각각의 HIV 단백질에 대한 항원 특이적 ELISPOT 반응에 대해 분석하였다.
쥐 연구 디자인 - 3회 면역화
1그룹
번호		 플라스미드
번호		 플라스미드 설명 총 DNA 양
(㎍)		 마우스
번호		 면역화
스케쥴
(주)
1 303 HCMV-env; SCMV-gag/pol; lap-ntv 100 9 0 - 3 - 6
2e 201 + 202 HCMV-pol, SCMV-gag,
HCMV-ntv, SCMV-env		 50
50		 9 0 - 3 - 6
3a 111
101
104		 HCMV-gag/pol
HCMV-env
HCMV-ntv		 33
33
33		 9 0 - 3 - 6
4b 101
104
301		 HCMV-env
HCMV-ntv
SCMV-gag/pol,
HCMV-[무], Lap1-[무]		 33
33
33		 9 0 - 3 - 6
대조구 001 대조구 벡터 100 6 0 - 3 - 6
1.그룹 1, 2e 및 3a는 3회 면역화시켰다는 점을 제외하고는 표 3의 면역원성 조성물과
동일한 조성물을 이용함.
3개 전사 단위 플라스미드로부터의 총 유도성 세포 면역 반응은 단일 및 이중 전사 단위 플라스미드를 함유하는 면역원성 조성물에 의하여 유도된 세포 면역 반응의 경우와 거의 동일하거나 또는 더욱 셌다. 표 6을 참조하시오.
쥐 세포 면역 반응 - 3회 면역화
그룹 ID gag-특이 반응* pol-특이 반응 env-특이 반응 ntv#-특이 반응 총 HIV-특이
반응
1 34 58 986 1 1077
2e 32 363 431 69 895
3a 174 162 713 82 1131
4b 47 35 722 79 883
대조구 0 0 3 2 5
*항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응을 #SFC/106 비장 림프구로서 나타냄.
#ntv, nef-tat-vif 융합 단백질.
면역원성 조성물의 3회 면역화 이후 ELISPOT 수행 결과, 3개 전사 단위 플라스미드계 면역원성 조성물을 사용하여 3회 면역화시켰을 경우의 HIV 세포 면역 반응은 세번째 면역화 시킨 이후에 100% 까지 증가하였다. 그러나, 반응의 영향력은 관련된 프로모터의 세기와 항원의 상대적 면역원성에 따라서 다양할 수 있다. 명확히 말해서, 제조가 용이해야 할 몇몇 경우에 있어서, 삼중 전사 단위 플라스미드는 3개 이상의 유전자를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 데 있어서 훌륭한 비히클이 될 것이다.
지금까지 시험한 면역원성 조성물 중의 모든 플라스미드는, 3회 면역화 이후에 항원을 정확히 발현하고, 세포 면역 반응을 면역원성으로 만들고 활성화시키는 것으로 파악된다. 그러나, 삼중 프로모터 구성물 중 HSV Lap1 프로모터의 제어 하에 두었을 경우에는 nef, tat 및 vif 특이적 반응은 살펴볼 수 없었다.
일부 계획 하에서는, 항원의 종류에 따라서 세포 면역 반응을 광범위하고 영향력 있게 유도하는 면역원성 조성물이 바람직할 것이다. 이 경우, 표 3 및 표 4에 나타낸 2개 및 3개의 pDNA 면역원성 조성물 디자인(2d, 3a 및 3c)은 효능을 나타낼 수 있고(> 600 SFC/106 세포), 영향력 있는 HIV-특이적 ELISPOT 반응을 나타낼 수 있는 것으로 보이며, 인간을 제외한 유인원 중에서 동물을 선택하여 추가의 시험을 하였다. 실시예 9를 참조하시오.
실시예 9. 1개 또는 2개의 완전한 전사 단위를 함유하는 플라스미드 벡터를 이용한 짧은 꼬리 원숭이 면역화 연구
실시예 8의 표 3 및 표 4에 있어서, 3개의 pDNA 면역원성 조성물, 구체적으로 그룹 2d, 3a 및 3c에 사용된 면역원성 조성물은 모든 6개의 HIV 단백질에 대하여 효능을 나타낼 수 있고(> 600 SFC/106 세포), 영향력 있는 HIV-특이적 ELISPOT 반응을 나타낼 수 있는 것으로 보이며, 인간을 제외한 유인원 중에서 동물을 선택하여 추가의 시험을 하였다.
실험 디자인
본 연구를 위하여, Mamu-A*01 음성이고 인공 번식된(captive-bred) 인도산 수컷 리서스 짧은 꼬리 원숭이(마카카 물라타; Macaca mulatta)를 총 30 마리 준비하였다. 짧은 꼬리 원숭이를 뉴 이베리아 리서치 센터(New Iberia Research Center)(New Iberia, LA)에서 사육하고, 실험 동물의 보호 및 취급에 관한 가이드(National Research Council, National Academic Press, Washington, DC, 1996)에 따라서 수용하였다. 뿐만 아니라, 짧은 꼬리 원숭이를 취급 및 보호하는 방법도 와이어스 리서치 기관 동물 보호 및 취급 위원회에 의하여 승인된 방법에 따랐다.
면역화 :
Puresyn, Inc.(Malvern, PA)에 의하여 면역화를 위한 발현 플라스미드를 생산하였다. 플라스미드를 이.콜라이[알칼리 분해에 의해 세포로부터 분리되어 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제됨]에서 증식시켰다. 이후 플라스미드를 각각 0.25% 부피바카인을 함유하는 등장성 시트르산 완충액[29.3 mM 시트르산 나트륨, 0.67 mM 시트르산, 150 mM NaCl, 0.34 mM EDTA, pH = 6.4 ～ 6.7] 중에서 2.5 ㎎/㎖의 농도로 제조하여 DNA:부피바카인 복합체를 형성하였다. 최종 플라스미드 제제는 슈퍼코일링된 플라스미드 DNA를 90% 초과하여 함유하였고, 나머지 내독소는 30 EU/㎎ DNA 미만인 것으로 파악되었다(데이터는 나타내지 않음)
리서스 짧은 꼬리 원숭이 연구에 사용되는 애쥬반트는 면역원성 조성물의 일부로서 전달된 DNA 플라스미드였다. 이 애쥬반트 플라스미드는 짧은 꼬리 원숭이 IL-12 p35 및 p40 유전자를 암호화하는 2개 전사 단위 발현 플라스미드(표 1의 212번 플라스미드)이다. 표 7을 참조하시오. IL-12 p35 서브유닛은 HCMV 최조기 프로모터와 SV40 폴리아데닐화 시그널의 제어 하에 발현되었으며, IL-12 p40 서브 유닛은 유인원 CMV 프로모터(SCMV)와 BGH 폴리아데닐화 시그널의 제어 하에 발현되었다. 플라스미드-발현 짧은 꼬리 IL-12의 생물 활성은 일시적으로 형질 감염된 RD 세포로부터 얻어진 상청액을, 이 상청액이 휴면중인 짧은 꼬리 원숭이의 말초 혈액 림프구(PBL; 데이터는 나타내지 않음) 중에서 IFN-γ 분비를 유도시키는 능력에 대하여 분석함으로써 확인되었다.
짧은 꼬리 원숭이 연구 디자인
그룹
번호		 플라스미드
번호		 1플라스미드 설명 총 DNA 양
(㎍)		 동물 번호
2d 111 +
202
212		 HCMV-gag-pol
HCMV-ntv, SCMV-env
HCMV-IL-12 p35, SCMV-IL-12 p40		 4.25
4.25
1.5		 6
3a 111
101
104
212		 HCMV-gag/pol
HCMV-env
HCMV-ntv
HCMV-IL-12 p35, SCMV-IL-12 p40		 2.8
2.8
2.8
1.5		 6
3c 102
103
202
212		 HCMV-gag
HCMV-pol
HCMV-ntv, SCMV-env
HCMV-IL-12 p35, SCMV-IL-12 p40		 2.8
2.8
2.8
1.5		 6
3cE2 102
103
202
212		 HCMV-gag
HCMV-pol
HCMV-ntv, SCMV-env
HCMV-IL-12 p35, SCMV-IL-12 p40		 0.56
0.56
0.56
0.30		 6
4a3 102
101
103
104
212		 HCMV-gag
HCMV-env
HCMV-pol
HCMV-ntv
HCMV-IL-12 p35, SCMV-IL-12 p40		 2.1
2.1
2.1
2.1
1.5		 6
4-
대조구		 001
212		 대조구 벡터
HCMV-IL-12 p35, SCMV-IL-12 p40		 8.5
1.5		 6
1. 모든 그룹들에 애쥬반트로서 리서스 짧은 꼬리 원숭이의 IL-12(rIL-12)를 암호화하는 212번 플라스미드(HCMV-IL-12 p35, SCMV-IL-12 p40) 1.5 ㎎을 투여함.
2. 두 번째 그룹 3c는 투여 프로토콜에 전기 천공법을 추가할 경우 포함됨.
3. 추가 그룹(4a)은 짧은 꼬리 원숭이 연구 후반 부에 합류시켜, 지정된 4 벡터 백신
디자인의 면역원성을 측정함.
0주, 4주 및 8주 경과시에 짧은 꼬리 원숭이를 모두 면역화시켰다. 면역화 직전에, 적당한 플라스미드 발현 벡터 제형을 혼합하여 면역원성 조성물을 제조하고, 이를 양쪽 삼각근과 양쪽 대퇴 사두근(주입 부피 = 1 ㎖, 위치당 DNA 2.5 ㎎)에 18게이지 바늘이 장착된 3㎖들이 시린지로 근육 내 주사(그룹 2d, 3a, 3c 및 대조구)하여 투여하였다.
표준 1㎖들이 시린지(21 게이지 바늘 장착; Braun) 여러 개(8.0 ㎜ 간격으로 배치함)를 이용하여 양쪽 삼각근과 양쪽 대퇴 사두근에 근육 내 주사하여, 그룹 3cE의 짧은 꼬리 원숭이를 pDNA로 면역화시킨 후, 곧 바로 전기 자극을 주었다(즉, 전기 천공). DNA 총량 2 ㎎을 주입할 때마다 위치당 플라스미드 DNA를 0.5 ㎎씩 주입할 경우, 주입 부피는 0.2 ㎖로 하였다. 그러므로, 전기 천공 그룹(3cE)에는 다른 그룹에 투여된 총 DNA 양의 5분의 1 만큼만 투여하였다.
본 실시예에서, 전기 천공 조건은 다음과 같았다: 25OmA 및 약 100 V/cm에서 20 ms씩 한 방향 펄스 6회 인가). 각 펄스 사이에 250 ms의 간격을 둠.
전기 천공법을 수행하지 않았을 경우, 표 8에 나타낸 결과를 통하여, 단일 전사 단위를 보유하는 플라스미드들의 조합(그룹 3a)을 주성분으로 한 면역원성 조성물은, 하나 이상의 전사 단위를 보유하는 하나 이상의 플라스미드를 함유하는 플라스미드들의 조합을 주성분으로 한 면역원성 조성물의 경우에 비하여 10주 또는 16주 경과 후에 전체적인 세포 면역 반응이 가장 셌음을 알 수 있었다. 3a와 2d 및 3c를 비교하시오.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 시간에 따른
전체 HIV-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
전체 HIV-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹 ID 기본 한도 2주 4주 6주 8주 10주 16주
2d 43.8
±10.5		 286.5
±234.9		 287.7
±104.5		 403.1
±89.9		 348.3
±108.8		 769.9
±340.4		 407.5
±82.2
3a 29.5
±12.8		 61.5
±23.2		 204.8
±26.4		 635.0
±230.5		 365.8
±47.1		 1652.5
±563.3		 1015.3
±584.8
3c 35.5
±9.0		 56.5
±12.3		 138.3
±32.5		 892.5
±277.5		 300.0
±95.9		 786.7
±213.1		 816.3
±330.6
3cE 41.5
±13.6		 1405.0
±422.0		 346.3
±72.7		 1287.9
±365.6		 3349.6
±1575.9		 3637.8
±863.7		 8140.8
±1819.0
4a 18.8
±8.2		 52.1
±13.3		 43.3
±16.6		 272.9
±60.0		 230.0
±40.5		 190.6
±38.9		 nd1
대조구 32.0
±12.5		 10.2
±2.7		 33.2
±12.0		 24.2
±9.3		 16.7
±4.0		 12.1
±4.1		 47.1
±13.7
* 전체 HIV-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106PBLs ± 표준 오차로서 나타냄.
nd1 = 전기 천공법을 수행하지 않음.
전기 천공법으로 인하여 전체적인 세포 면역 반응이 10주 경과시에는 450% 이상 세지고, 16주 경과시에는 990% 이상 세진다는 놀라운 결과가 얻어졌다. 3cE 및 3c를 비교하시오. 표 8에 나타낸 결과를 통하여 하나 이상의 전사 단위를 보유하는 하나 이상의 플라스미드를 함유하는 플라스미드들의 조합을 주성분으로 하는 면역원성 조성물 투여시 전기 천공법을 수행하면 10주 또는 16주 경과시 전체적인 세포 면역 반응이 단일 전사 단위를 보유하는 플라스미드들의 조합을 주성분으로 하는 면역원성 조성물에 비하여 더욱 세졌음을 알 수 있었다. 그룹 3c 및 그룹 3a를 비교하시오.
짧은 꼬리 원숭이 연구에 있어서, 전기 천공법을 수행하지 않으면, 10주 또는 16주 경과시 그룹 3a의 전체적인 HIV 항원-특이적 ELISPOT 반응이 가장 세졌음을 알 수 있었다(1,652 및 1015 SFC/108 세포). 이러한 반응은 그룹 2d(770 SFC/108 세포) 또는 그룹 3c(787 SFC/108 세포)와 그다지 차이를 나타내지 않았다. 표 8을 참조하시오. 그러나, 전기 천공법을 수행하면 ELISPOT 반응이 가장 세졌다. 표 8의 그룹 3cE를 참조하시오.
흥미로운 사실은, 전기 천공법이 수행되었을 때 증량 투여 면역화 이후의 최고 면역 반응은 전기 천공법을 수행하지 않은 그룹에 비하여 늦게 나타났다는 사실이다. 예를 들어, 그룹 3a 동물에 대한 전체 HIV 특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 4주차 면역화 또는 증량 투여 이후 약 6주차에서 최고였다. 표 8을 참조하시오. 이와는 대조적으로, 전기 천공법을 수행한 그룹에 있어서는 거의 10주차 되는 때에 가장 셌다. 표 8을 참조하시오.
세포 면역 반응은 6개의 HIV 단백질에 대한 IFN-감마 ELISPOT 반응과 같이 추가 분석되었다. 표 9는 HIV env, gag, pol 및 nef-tat-vif 단백질의 융합 단백질에 대한 IFN-감마 ELISPOT 반응 결과를 나타내는 것이다. 짧은 꼬리 원숭이 연구에 있어서, 전기 천공법을 수행하지 않으면 그룹 3a는 env 및 nef-tat-vif에 대하여 10주 경과시 HIV 항원-특이적 ELISPOT 반응이 가장 셌다. 표 9를 참조하시오. 그룹 3c의 동물은 gag에 대하여 ELISPOT 반응이 가장 셌으며, 그룹 2d는 pol 단백질에 대하여 ELISPOT 반응이 가장 셌다. 표 9의 3a와 2d 및 3c를 비교하시오. 전기 천공법을 수행하였을 경우 ELISPOT 반응이 가장 셌다. 표 9의 그룹 3cE를 참조하시오.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 10주 경과시
각각의 HIV-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹
ID		 Env Gag Pol ntv total
2d 360.4
±111.8		 107.9
±45.2		 204.0
±182.6		 97.6
±67.6		 769.9
±340.4
3a 1170.41
±427.0		 43.8
±17.5		 173.8
±97.7		 264.63
±113.8		 1652.5
±563.3
3c 412.1
±131.7		 246.32
±59.7		 106.7
±60.5		 21.7
±8.9		 786.7
±213.1
3cE 861.1
±292.5		 1147.9
±356.9		 1023.1
±384.0		 605.7
±159.3		 3637.8
±863.7
4a 132.9
±33.9		 29.4
±6.5		 9.1
±5.4		 19.2
±7.9		 190.6
±38.9
대조구 7.1
±3.4		 1.7
±0.8		 2.5
±1.1		 0.8
±0.5		 12.1
±4.1
* 각각의 HIV 항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106 PBLs±표준 오차로 나타냄.
1. 그룹 2d에 비하여 env-특이적 ELISPOT 반응이 통계적으로 셈(p < 0.05).
2. 그룹 3a에 비하여 gag-특이적 ELISPOT 반응이 통계적으로 셈(p < 0.05).
3. 그룹 3c에 비하여 ntv-특이적 ELISPOT 반응이 통계적으로 셈(p < 0.05).
표 10은 마지막으로 면역화시킨 이후 8주 경과시 즉, 16주차에 nef-tat-vif 단백질의 융합 단백질과 HIV env, gag, pol에 대한 IFN-감마 ELISPOT 반응 결과를 나타내는 것이다. 전기 천공법을 수행하지 않았을 경우, 그룹 3a에서는 env 및 nef-tat-vif에 대한 HIV 항원-특이적 ELISPOT 반응이 16주 경과시에 가장 셌고, 반면에 그룹 3c에서는 gag 및 pol에 대한 HIV 항원-특이적 ELISPOT 반응이 10주 경과시에 가장 셌다. 전기 천공법을 수행하였을 경우 ELISPOT 반응이 가장 셌다. 표 10의 그룹 3cE를 참조하시오.
표 9 및 표 10은 면역원성 조성물 중 항원 발현 플라스미드의 수를 3개에서 4개로 늘리면 HIV 단백질 모두에 대한 면역 반응이 감소하게 됨을 나타내는 것이다. 표 9 및 표 10을 참조하시오.
표 9 및 표 10은 또한 면역원성 조성물 중 2개의 항원 발현 플라스미드(둘 중 하나는 2개의 전사 단위를 보유함)를 포함하는 그룹 2d의 플라스미드가 HIV 단백질 모두에 대하여 가장 광범위하고 가장 영향력 있는 면역 반응을 유도한다는 사실을 나타낸다. 표 9 및 표 10을 참조하시오.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 16주 경과시
각각의 HIV 항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹
ID		 Env Gag Pol ntv total
2d 217.5
±33.3		 76.3
±25.8		 81.3
±32.2		 32.5
±14.3		 407.5
±82.2
3a 831.0
±457.8		 39.7
±35.6		 80.2
±68.7		 64.3
±25.6		 1015.3
±584.8
3c 437.5
±187.9		 250.0
±88.2		 96.3
±68.0		 32.5
±10.7		 816.3
±330.6
3cE 1984.7
±698.1		 1975.3
±567.2		 2305.6
±786.2		 1875.3
±624.4		 8140.8
±1819.0
4a nd1 nd nd nd nd
대조구 22.5
±7.2		 5.0
±2.3		 9.2
±3.6		 10.4
±4.4		 47.1
±13.7
* 각각의 HIV 항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106 PBLs±표준 오차로 나타냄.
1. nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
표 11은 마지막으로 면역화한 이후 22주 경과시 즉, 30주차에 nef-tat-vif 단백질의 융합 단백질과 HIV env, gag, pol에 대한 IFN-감마 ELISPOT 반응 결과를 나타내는 것이다. 짧은 꼬리 원숭이 연구에 있어서 전기 천공법을 수행하지 않았을 경우, 그룹 3a에서는 env, pol 및 nef-tat-vif에 대한 HIV 항원-특이적 ELISPOT 반응이 가장 셌다. 표 11을 참조하시오. 그룹 3c 동물들은 gag에 대한 ELISPOT 반응이 가장 셌다. 표 11의 3a와 2d 및 3c를 비교하시오. 전기 천공법을 수행하였을 때 ELISPOT 반응이 가장 셌다. 표 11의 그룹 3c를 참조하시오.
마우스 및 짧은 꼬리 원숭이 연구에 있어서, 항원-특이적 ELISPOT 반응은 일반적으로 HCMV 프로모터의 제어하에 있는 각각의 유전자가 투여된 그룹이 가장 셌다. 짧은 꼬리 원숭이 연구에 있어서, 전기 천공법을 수행하였는지 여부는, 면역원성 조성물이 1개 내지 2개의 완전한 전사 단위를 보유하는 플라스미드를 포함하고 있는지 여부 또는 융합 단백질이 사용되었는지 여부보다 면역 반응을 나타내는 데 있어서 보다 중요한 인자였다.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 30주 경과시
각각의 HIV 항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹
ID		 Env Gag Pol ntv total
2d 44.2
±11.6		 6.7
±3.1		 8.8
±6.3		 4.6
±3.6		 64.2
±16.0
3a 184.0
±105.4		 5.6
±3.7		 14.0
±6.9		 10.2
±4.7		 213.9
±119.1
3c 52.5
±11.7		 25.4
±6.6		 2.9
±2.0		 0.8
±0.8		 81.7
±19.6
3cE 831.3
±339.1		 768.9
±216.7		 907.4
±476.5		 886.4
±371.8		 3,393.9
±920.4
4a1 nd nd nd nd nd
대조구 9.6
±4.8		 0.0
±0.0		 1.6
±1.2		 0.0
±0.0		 11.3
±5.8
* 각각의 HIV 항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106 PBLs±표준 오차로 나타냄.
1. nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
각각의 HIV 단백질에 대한 경시적 세포 면역 반응
표 7에 기재된 플라스미드로 면역화시킨 후 2주, 4주, 6주, 8주, 10주 및 16주 경과시 각각의 HIV 단백질인 env, gag, pol, nef, tat 및 vif에 대한 IFN-감마 ELISPOT 반응을 측정하였다. 그 결과를 표 12～표 17에 제시하였다.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 시간에 따른 HIV env-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
HIV env-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹 ID 기본 한도 2주 4주 6주 8주 10주 16주
2d 17.7
±4.5		 204.0
±162.8		 182.3
±64.8		 295.1
±60.9		 209.6
±66.1		 360.4
±111.8		 217.5
±33.3
3a 5.3
±2.2		 43.8
±19.6		 165.3
±20.6		 577.9
±224.5		 308.8
±38.6		 1170.4
±427.0		 831.0
±457.8
3c 21.0
±8.4		 26.3
±7.1		 84.8
±20.2		 538.3
±174.2		 192.1
±71.1		 412.1
±131.7		 437.5
±187.9
3cE 23.2
±9.5		 598.3
±203.9		 144.2
±30.9		 382.9
±87.2		 1165.8
±647.7		 861.1
±292.5		 1984.7
±698.1
4a 14.6
±8.7		 24.2
±10.1		 22.1
±9.6		 254.2
±57.5		 169.2
±33.5		 132.9
±33.9		 nd1
대조구 13.7
±5.4		 3.0
±1.6		 17.2
±9.0		 17.1
±6.0		 9.2
±2.6		 7.1
±3.4		 22.5
±7.2
* HIV env-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106PBLs ± 표준 오차로서 나타냄.
nd1 = 전기 천공법을 수행하지 않음.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 시간에 따른
HIV gag-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
HIV gag-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹 ID 기본 한도 2주 4주 6주 8주 10주 16주
2d 6.8
±1.5		 23.5
±16.7		 36.0
±18.3		 28.1
±5.7		 59.6
±31.2		 107.9
±45.2		 76.3
±25.8
3a 2.2
±1.0		 9.0
±3.4		 21.5
±4.9		 17.5
±11.5		 10.0
±2.7		 43.8
±17.5		 39.7
±35.6
3c 4.5
±2.1		 19.0
±6.7		 51.7
±15.6		 229.6
±67.0		 86.7
±21.8		 246.3
±59.7		 250.0
±88.2
3cE 4.8
±2.9		 709.6
±244.1		 161.3
±38.3		 381.7
±78.5		 1169.6
±551.6		 1147.9
±356.9		 1975.3
±567.2
4a 2.1
±8.7		 12.4
±3.7		 5.4
±2.4		 10.0
±4.0		 27.5
±6.2		 29.4
±6.5		 nd1
대조구 3.2
±2.2		 1.0
±0.6		 7.7
±4.5		 1.7
±0.8		 2.1
±1.2		 1.7
±0.8		 5.0
±2.3
* HIV gag-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106PBLs ± 표준 오차로서 나타냄.
nd1 = 전기 천공법을 수행하지 않음.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 시간에 따른
HIV pol-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
HIV pol-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹 ID 기본 한도 2주 4주 6주 8주 10주 16주
2d 12.2
±4.3		 33.8
±31.3		 27.7
±7.6		 53.3
±32.3		 41.7
±25.1		 204.0
±182.6		 81.3
±32.2
3a 7.3
±4.1		 1.8
±0.9		 7.3
±2.9		 17.5
±7.9		 15.0
±4.5		 173.8
±97.7		 80.2
±68.7
3c 6.5
±3.4		 3.5
±2.1		 1.8
±1.3		 102.1
±42.3		 17.1
±6.8		 106.7
±60.5		 96.3
±68.0
3cE 3.7
±2.4		 54.6
±30.5		 22.1
±9.1		 316.3
±215.8		 497.9
±179.7		 1023.1
±384.0		 2305.6
±786.2
4a 1.7
±1.1		 9.3
±6.8		 2.5
±1.3		 5.4
±2.0		 13.8
±4.8		 9.1
±5.4		 nd1
대조구 10.7
±4.4		 3.2
±2.8		 4.7
±3.0		 2.1
±1.6		 4.2
±2.7		 2.5
±1.1		 9.2
±3.6
* HIV pol-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106PBLs ± 표준 오차로서 나타냄.
nd1 = 전기 천공법을 수행하지 않음.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 시간에 따른
HIV nef-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
HIV nef-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹 ID 기본 한도 2주 4주 6주 8주 10주 16주
2d 4.8
±3.2		 16.3
±16.3		 22.5
±16.7		 12.4
±6.0		 32.9
±14.4		 43.7
±27.6		 24.6
±12.3
3a 20.1
±9.8		 2.5
±2.0		 7.9
±3.6		 13.8
±5.2		 22.5
±9.8		 192.1
±76.7		 54.8
±25.4
3c 4.2
±4.2		 0.4
±0.4		 0.0
±0.0		 10.4
±7.5		 3.3
±2.5		 10.0
±8.1		 18.3
±9.6
3cE 5.1
±3.4		 11.9
±7.2		 11.7
±7.7		 67.1
±56.6		 281.7
±207.0		 403.2
±158.3		 1276.2
±516.3
4a 0.4
±0.4		 1.7
±1.4		 5.4
±3.1		 2.1
±2.1		 10.4
±5.0		 8.3
±4.4		 nd1
대조구 3.6
±2.8		 0.8
±0.8		 0.8
±0.8		 0.0
±0.0		 0.0
±0.0		 0.0
±0.0		 2.9
±1.5
* HIV nef-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106PBLs ± 표준 오차로서 나타냄.
nd1 = 전기 천공법을 수행하지 않음.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 시간에 따른
HIV tat-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
HIV tat-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹 ID 기본 한도 2주 4주 6주 8주 10주 16주
2d 7.1
±3.3		 0.8
±0.5		 7.1
±4.2		 8.5
±3.3		 2.9
±2.1		 4.6
±2.1		 3.8
±1.4
3a 10.0
±5.3		 3.8
±2.3		 2.9
±1.2		 4.2
±2.0		 8.8
±7.3		 14.6
±8.2		 1.7
±1.2
3c 6.2
±4.5		 6.3
±2.9		 0.4
±0.4		 8.3
±3.5		 0.4
±0.4		 1.3
±1.3		 2.9
±1.2
3cE 7.6
±5.2		 22.4
±13.8		 2.1
±1.0		 25.0
±17.8		 75.0
±42.4		 29.3
±19.9		 190.0
±88.4
4a 0.0
±0.0		 1.8
±1.5		 5.8
±2.9		 1.3
±1.3		 5.8
±3.7		 10.3
±6.1		 nd1
대조구 5.1
±4.5		 0.8
±0.5		 2.1
±1.6		 3.3
±1.5		 0.0
±0.0		 0.0
±0.0		 2.1
±1.2
* HIV tat-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106PBLs ± 표준 오차로서 나타냄.
nd1 = 전기 천공법을 수행하지 않음.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 수행 후 시간에 따른
HIV vif-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
HIV vif-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응*
그룹 ID 기본 한도 2주 4주 6주 8주 10주 16주
2d 9.4
±3.9		 7.9
±7.9		 3.3
±2.9		 5.8
±2.7		 1.7
±1.2		 8.7
±8.1		 4.2
±1.9
3a 12.9
±8.5		 0.4
±0.4		 0.4
±0.4		 4.2
±2.3		 0.8
±0.8		 12.1
±12.1		 7.8
±2.7
3c 6.4
±4.8		 0.8
±0.5		 0.0
±0.0		 3.8
±2.0		 0.4
±0.4		 2.5
±2.5		 11.3
±3.3
3cE 8.9
±5.9		 8.2
±5.1		 5.0
±2.6		 115.0
±51.6		 159.6
±64.8		 173.2
±103.6		 409.1
±129.9
4a 0.0
±0.0		 2.8
±1.8		 2.1
±0.8		 0.0
±0.0		 3.3
±1.1		 0.6
±0.2		 nd1
대조구 6.8
±2.2		 1.2
±0.8		 0.8
±0.8		 0.0
±0.0		 1.3
±1.3		 0.0
±0.0		 5.4
±3.1
* HIV vif-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106PBLs ± 표준 오차로서 나타냄.
nd1 = 전기 천공법을 수행하지 않음.
각각의 단백질에 대한 경시적 면역 반응 결과를 제시하는 표 12 ～ 표 17에 따르면, 면역원성 조성물 중 항원을 발현하는 플라스미드의 수가 3개에서 4개로 증가하면, 소정의 DNA 투여 농도에서 HIV 단백질 모두에 대한 면역 반응이 감소함을 알 수 있었다. 표 12 ～ 표 17을 참조하시오.
실시예 10: HIV 특이적 CTL 및 조력 세포의 비율 측정
처음에 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 미분획화된 말초 혈액 림프구(PBLs)를 방혈시킨 후 10주 및 16주 경과시의 전체적인 HIV-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응을 측정하여 HIV 특이적 CTL 및 조력 세포의 상대량을 측정하였다.
PBL 방혈 비드의 제조
제조자의 설명서[Dynal Biotech, Oslo, Norway]에 따라서, 항 인간 CD4- 또는 CD8-특이적 마우스 모노클로날 항체로 코팅된 자성 폴리스티렌 비드를 사용하여 미분획화된 PBL로부터 CD4+ 또는 CD8+ 세포를 방혈시켰다. 요약하면, 갖 분리해 낸 리서스 원숭이의 PBL을 세척하고 2% PBS 함유 얼음 냉각 1 × PBS중에 2 × 106 세포/㎖의 농도(최종 농도)로 재현탁하였다. 항 인간 CD4- 또는 CD8-특이적 마우스 모노클로날 항체로 코팅된 Dynal 미소 비드를 2% FCS 함유 1 × PBS로 3회 세척한 후, 이를 비드 : 세포 비율 5:1이 되도록 미분획화 PBL에 첨가한 다음, 이를 회전/사면화 기구에서 1 시간 동안 4℃로 항온 처리하였다. 항온 처리후, 상기 비드/세포 현탁액을 자성 컬럼에 넣고, 여기에 CD4+ 또는 CD8+ 세포 방혈 PBL을 함유하는 유체를 통과시켜 수집하였다. 세포를 5% FBS로 보강된 완전 배양 배지로 1회 세척하고, 이를 5% FBS로 보강된 완전 배양 배지로 재현탁시켜 원래 부피가 되도록 만들었다. 동 부피의 미분획화된 PBL 방혈 비드를 ELISPOT 검정법에 직접 사용하였다.
CD4+ 또는 CD8+ 세포 하위 세트 방혈 효율 및 ELISPOT 평판에 가하여진 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 정확한 수를 혈구 계측기로 정량하였다. 요약하면, PBL 방혈 비드를 2% FBS를 함유하는 1 × PBS로 1회 세척한 다음, 실온에서 다음과 같은 모노클로날 항체로 15분 동안 염색하였다: 항-리서스 짧은 꼬리 원숭이 CD3-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC, 클론 SP34; BD Pharmingen, San Jose, CA); 항-인간 CD4- 피코에리트린(PE, 클론 M-T477; BD Pharmingen, San Jose, CA); 항-인간 CD8-페리디닌 클로로필 단백질(PerCP; 클론 SK1 ; BD Pharmingen, San Jose, CA); 및 항-인간 CD20-알로피코시아닌(APC, 클론 L27; BD Pharmingen, San Jose, CA). 이후 2% FBS, 0.02% 아지드를 함유하는 1 × PBS로 세포를 1회 세척한 다음, 이를1% 파라포름알데히드를 함유하는 1 × PBS 중에 재현탁하였다. FACSCalibur 혈구 계측기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 FACS 분석을 수행한 다음, CellQuest Software로 분석하였다. CD4+ 또는 CD8+ 세포 방혈 비율은 일반적으로 > 95%였다(데이터는 나타내지 않음).
10주 및 16주 경과시 미분획화 및 CD4+ 또는 CD8+ 세포 방혈 PBL 중
전체 HIV-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응
10주 16주
그룹 ID 미분획화 CD4 방혈 CD8 방혈 미분획화 CD4 방혈 CD8 방혈
2d 1,501
±632		 1,494
±801		 364
±77		 902
±173		 758
±141		 431
±93
3a 2,524
±789		 1,239
±662		 997
±222		 1,821
±906		 1,059
±689		 539
±175
3c 1,484
±359		 908
±268		 536
±147		 1,532
±556		 856
±308		 607
±203
3cE 6,651
±1,326		 10,563
±3,388		 1,921
±274		 13,361
±2,770		 21,051
±7,067		 2,754
±543
4a 1,591
±281		 688
±119		 954
±248		 nd1 nd nd
대조구 6
±2		 31
±10		 34
±15		 187
±12		 107
±31		 118
±24
* 전체 HIV-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 평균 #SFC/106 미분획화 CD4+ 또는 CD8+
방혈 PBLs ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
표 18에 나타낸 결과는, 특정 유도성 면역 반응에 관여하는 HIV 특이적 CTL 세포 대 조력 세포의 상대적 비율의 측정 결과이다. 상기 데이터로부터 일반적인 관찰 결과를 약간이나마 유추할 수 있다. 처음 그룹 2d, 3a 및 3c는 HIV에 대한 세포 면역 반응 정도가 유사함을 유추할 수 있다. 그룹 3a는 면역 반응을 더 높은 수준으로 유도하지만, 검정시 변이량도 더 많았다. 면역화와 함께 전기 천공법을 수행하는 경우, 그룹 3c에 속하는 플라스미드에 대한 면역 반응의 정도는 약 5배 ～ 약 10 배 정도까지 세졌다. 표 18의 3cE 와 3c를 비교하시오. 면역화와 함께 전기 천공법을 수행함으로 인하여 면역 반응에 더 많은 세포들이 관여한다는 사실도 또한 주목할 만한 사실이다.
실시예 11 : 복수 회 플라스미드 면역화에 의하여 유도된 HIV 특이적 항체 역가
플라스미드 DNA를 함유하는 면역원성 조성물(IC)은 현재 사용되고 있는 다른 유형의 면역원성 조성물 기술에 비하여 몇 가지 이점을 제공한다. 예를 들어, DNA계 IC는 종래의 단백질계 서브유닛 IC와는 대조적으로, 암호화된 항원이 효율적으로 가공되어, 제1군 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 항원 가공 경로에 의해 제공되도록 만든다. 상기 제1군 항원 가공 경로는 CD8+ T 세포 매개 면역 반응의 유도에 중요하다. 그러나, 종래의 단백질계 서브유닛 IC는 통상적으로 항원-특이적 항체 반응을 유도하는 능력의 관점에서 볼 때, DNA계 IC보다 효능이 우수하다.
HIV 바이러스 용균물-특이적 항체 역가를 측정하기 위해서, ELISA 평판을 18시간 동안 4℃에서 세제 파쇄 HIV-1MN(20 ng/웰)[Advanced Biotechnologies, Columbia, MD]으로 코팅시켰다. 세제로 파쇄된 HIV-1MN를 카보네이트/비카보네이트 완충액(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6) 중에서 희석시켰다. HIV env-특이적 항체의 역가를 측정하기 위하여, ELISA 평판을 1 × PBS에 희석시킨 정제 HIV-1 6101 gp120[듀크 대학교의 래리 리아오 기증, 20 ng /웰]으로 코팅하였다. HIV 단백질로 18 시간 동안 항온 처리한 후, ELISA 평판을 0.1% Tween 20을 함유하는 1 × PBS로 5회 세척하고, 이를 0.1% Tween 20 및 3 % BSA를 함유하는 1 × PBS로 실온에서 2 시간 동안 블로킹시켰다. 면역화된 동물과 대조구 동물로부터 유래된 혈청 시료를 1 % BSA 및 0.1 % Tween-20을 함유하는 1 × PBS로 희석시킨 다음, 이를 ELISA 평판에 1:100의 희석률로 가한 후, 다시 3배 더 희석시켜 가하였다. 희석된 혈청 시료를 단백질 코팅된 평판에서 4℃로 밤새 항온 처리하였다. 바이오틴과 컨쥬게이트화된 1차 항체(유인원 IgG에 특이적임)를 실온에서 2 시간 동안 항온 처리하여, 항원-특이적 면역글로불린을 검출하였다. 이 항체를 0.1% Tween-20 및 1 % BSA(Accurate Scientific, Westbury, NY)로 보충된 1 × PBS로 1:30,000배 희석시켰다. 그 다음, 1차 항체를 씻어 버린 다음, 1 시간 동안 실온에서 스트렙타비딘-호오스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트화된 항-바이오틴 2차 항체[500 유닛/㎖ 스톡, 0.1 % Tween-20, 1 % BSA가 보강된 1 x PBS로 1:10,000 배 희석, Roche Immunochemical, Indianapolis, IN]로 항온 처리하였다. 마지막으로, TMB(3,3', 5,5'-테트라메틸 벤지딘, Sigma)를 웰 당 100 mcL씩 가하여 발색시켰다. 항원-특이적 항체의 역가는, O.D.450 값이 동일한 동물의 원래 혈청(즉, 0주 경과시 혈청) + 3개의 표준 편차 값보다 더욱 큰 최종 혈청 희석물의 역가로서 정의하였다.
복수 회의 플라스미드 DNA 면역화 과정에 있어서 처음 16주중 임의의 시점에서의 HIV 외피 역가를 측정하여 이를 표 19에 나타내었다. HIV1 6101 env gp120 ELISA 역가는, O.D.450 값이 동일한 동물의 원래 혈청(즉, 0주 경과시 혈청) + 3개의 표준 편차 값보다 더욱 큰 최종 혈청 희석시의 역가로서 계산하였다. 표 19의 데이터(및 이하 표 20의 데이터)는 평균 log10 역가 ± 평균의 표준 오차로서 제시하였다. 이 경우, HIV-1 env 역가가 2.00 이하이면, 종말점의 역가가 1:100 미만인 것으로서, 이는 검출 한계 이하의 값에 해당한다.
복수 회 플라스미드 DNA 면역화 이후의
경시적 HIV-1 6101 env gp120 특이적 ELISA 항체 역가
HIV-1 env ELISA 역가*
그룹1 ID 2주 4주 6주 8주 10주 16주
2d 2.00
±0.00		 2.00
±0.00		 2.08
±0.35		 2.43
±0.21		 2.73
±0.27		 2.59
±0.20
3a 2.00
±0.00		 2.00
±0.00		 2.16
±0.10		 2.64
±0.32		 2.95
±0.28		 2.56
±0.29
3c 2.00
±0.00		 2.00
±0.00		 2.16
±0.16		 2.48
±0.21		 2.80
±0.32		 2.95
±0.37
3cE 2.16
±0.16		 2.72
±0.16		 4.39
±0.49		 3.67
±0.44		 5.18
±0.20		 4.78
±0.23
4a nd1 nd nd nd nd nd
대조구 2.00
±0.00		 2.08
±0.08		 2.00
±0.00		 2.16
±0.10		 2.16
±0.16		 2.32
±0.16
*데이터는 평균 log10 역가 ± 평균의 표준 오차로서 나타냄.
HIV-1 env 역가가 2.00 이하이면, 종말점의 역가가 1:100 미만인 것으로서,
이는 검출 한계 이하의 값에 해당함.
1nd는 전기 천공법을 수행하지 않았음을 나타냄.
표 19에 나타낸 바와 같이, 그룹 3c의 동물들 즉, 하나 이상의 전사 단위를 보유하는 플라스미드를 하나 이상 함유하는 플라스미드의 조합을 주성분으로 하는 면역원성 조성물로 면역화된 동물들은 전기 천공법을 수행하지 않았을 경우의 역가가 16주 경과시에 가장 높았다. 그러나, 그룹 2d 및 3a에 대한 결과는 어느 정도 유사하였지만, 그룹 3a의 동물의 8주 및 10주차 역가가 가장 높았다. 표 19의 3a와 2d 및 3c를 비교하시오. 하나 이상의 전사 단위를 보유하는 플라스미드를 하나 이상 함유하는 플라스미드의 조합을 주성분으로 하는 면역원성 조성물을 사용하여 전기 천공-전기 자극을 수행하여 면역화시켰을 때 HIV 외피 단백질에 대한 역가가 가장 높았다. 표 19의 3c와 3cE를 비교하시오.
복수 회의 플라스미드 DNA 면역화 이후 2주, 4주, 6주, 8주, 10주 및 16주 경과시 전체 바이러스 용해물에 대한 전체 HIV 역가를 측정하여 표 20에 나타내었다. HIV-1MN 바이러스 용해물-특이적 ELISA 역가는, O.D.450 값이 동일한 짧은 꼬리 원숭이의 원래 혈청(즉, 면역화 이전의 혈청) + 3개의 표준 편차 값보다 더욱 큰 최종 혈청 희석물의 역가로서 계산하였다. 이하 표 20의 데이터는 평균 log10 역가 ± 평균의 표준 오차로서 제시하였다. 이 경우, 항체의 역가가 1.70 이하이면, 종말점의 역가는 1:50 미만인 것으로서, 이는 검출 한계 이하의 값에 해당한다. 표 20의 16주 경과시 결과는 표 19에 제시한 결과와 유사하였다.
복수 회 플라스미드 DNA 백신화 이후의
경시적 HIV-1 특이적 ELISA 항체의 전체 역가
전체 HIV-1 ELISA 역가*
그룹 ID 2주 4주 6주 8주 10주 16주
2d 1.70
±0.00		 1.70
±0.00		 1.75
±0.05		 1.75
±0.05		 2.04
±0.28		 1.70
±0.00
3a 1.75
±0.05		 1.75
±0.05		 1.70
±0.00		 1.70
±0.00		 1.70
±0.00		 1.70
±0.00
3c 2.06
±0.19		 2.11
±0.18		 1.75
±0.05		 1.88
±0.13		 1.85
±0.07		 1.90
±0.06
3cE 1.88
±0.13		 1.88
±0.13		 3.46
±0.53		 2.38
±0.34		 4.36
±0.16		 3.75
±0.29
4a nd1 nd nd nd nd nd
대조구 1.70
±0.00		 1.75
±0.05		 1.70
±0.00		 1.70
±0.00		 1.91
±0.21		 1.91
±0.21
*데이터는 평균 log10 역가 ± 평균의 표준 오차로서 제시.
항체 역가가 1.70 이하이면, 종말점의 역가는 1:50 미만인 것으로서,
이는 검출 한계 이하의 값에 해당함.
1nd는 전기 천공법을 수행하지 않았음을 나타냄.
실시예 12 : 짧은 꼬리 원숭이의 다양한 혈청학적 매개 변수 및 체중에 대한 복수회 플라스미드 면역화의 효과
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 짧은 꼬리 원숭이의 말초 혈액의 백혈구 계수(WBC)를 경시적으로 측정하여, 평균 WBC(×1000/㎖) ± 표준 오차로 나타내었다. 표 21을 참조하시오.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이 체내 전체 WBC 계수(×1000)
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 10.3
±1.1		 8.8
±1.4		 8.1
±1.0		 7.2
±0.7		 7.1
±1.0		 8.6
±0.7		 6.9
±0.9		 6.6
±0.4
3a 8.6
±1.4		 5.5
±0.8		 7.9
±1.3		 6.0
±0.9		 6.3
±1.0		 7.3
±1.1		 7.8
±1.1		 8.0
±1.6
3c 9.4
±1.4		 6.3
±0.6		 8.0
±0.8		 7.0
±0.8		 7.3
±0.9		 9.9
±0.9		 8.4
±1.4		 7.8
±1.2
3cE 11.0
±1.7		 12.1
±1.5		 8.2
±1.1		 18.4
±2.0		 11.0
±1.3		 13.1
±1.3		 9.3
±0.9		 7.9
±0.5
4a 11.6
±0.8		 10.3
±1.4		 8.9
±0.8		 8.0
±0.8		 8.2
±0.5		 7.9
±0.5		 8.3
±0.7		 nd1
대조구 7.6
±0.9		 5.6
±0.7		 7.1
±0.9		 5.7
±0.6		 5.9
±0.7		 7.6
±1.3		 5.6
±0.5		 6.6
±0.7
* 완전 혈구 계수 분석법에 의해 측정된 말초 혈액 백혈구 계수(WBC)는
평균 WBC(×1000/㎖) ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 동물의 말초 혈액의 적혈구 계수(RBC)를 경시적으로 측정하여, 평균 RBC(×106/㎖) ± 표준 오차로 나타내었다. 표 22를 참조하시오.
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 동물의 말초 혈액의 헤모글로빈 수치(g/dl)를 경시적으로 측정하여, 평균 헤모글로빈 수치 ± 표준 오차로 나타내었다. 표 23을 참조하시오.
표 7에 나타낸 플라스미드와 면역원성 조성물을 사용하여 복수 회 플라스미드 면역화시킬 경우, 본 연구에 사용된 동물의 체내 WBC, RBC 및 헤모글로빈 수치에 어떠한 악영향도 미치지 않았다. 표 21～표 23을 참조하시오. 그룹 3cE를 면역화시키는데 사용된 면역원성 조성물을 사용함과 동시에 전기 천공법이 행하여지면 한가지 명백한 긍정적 효과가 관찰되었다. 이 그룹에서, WBC의 수는 본 연구 수행 과정 전반에 걸쳐 상당히 증가하였다. 표 21을 참조하시오.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이 체내 전체 RBC 계수(×106)
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 5.60
±0.12		 5.64
±0.03		 5.62
±0.08		 5.69
±0.09		 5.70
±0.11		 5.67
±0.11		 5.74
±0.06		 5.91
±0.08
3a 5.61
±0.19		 5.36
±0.17		 5.39
±0.17		 5.40
±0.13		 5.39
±0.15		 5.53
±0.18		 5.32
±0.14		 5.70
±0.16
3c 5.39
±0.13		 5.32
±0.14		 5.43
±0.09		 5.46
±0.13		 5.38
±0.14		 5.45
±0.10		 5.52
±0.13		 5.69
±0.09
3cE 5.63
±0.15		 5.91
±0.09		 5.80
±0.07		 5.60
±0.21		 5.87
±0.10		 5.57
±0.13		 5.70
±0.07		 5.75
±0.11
4a 5.99
±0.11		 5.68
±0.09		 5.97
±0.08		 5.77
±0.11		 5.84
±0.07		 5.79
±0.12		 5.54
±0.10		 nd1
대조구 5.69
±0.18		 5.49
±0.13		 5.57
±0.09		 5.63
±0.09		 5.61
±0.08		 5.66
±0.09		 5.73
±0.12		 5.94
±0.13
* 완전 혈구 계수 분석법에 의해 측정된 말초 혈액 적혈구 계수(RBC)는
평균 RBC(×106/㎖) ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이 체내 헤모글로빈의 전체 수치
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 12.5
±0.3		 12.7
±0.2		 12.5
±0.2		 12.6
±0.2		 12.5
±0.1		 12.6
±0.2		 12.9
±0.2		 13.1
±0.2
3a 13.1
±0.3		 12.6
±0.3		 12.6
±0.3		 12.5
±0.3		 12.6
±0.3		 13.0
±0.3		 12.8
±0.4		 13.4
±0.2
3c 12.7
±0.3		 12.6
±0.2		 12.7
±0.2		 12.7
±0.2		 12.6
±0.4		 13.0
±0.3		 13.2
±0.3		 13.5
±0.3
3cE 12.8
±0.3		 13.4
±0.2		 13.0
±0.2		 13.1
±0.3		 13.4
±0.2		 12.9
±0.2		 13.0
±0.1		 13.3
±0.2
4a 13.5
±0.3		 13.1
±0.2		 13.5
±0.2		 13.1
±0.2		 13.2
±0.2		 13.1
±0.2		 12.5
±0.2		 nd1
대조구 13.3
±0.3		 12.8
±0.3		 13.0
±0.2		 12.9
±0.2		 13.0
±0.2		 13.2
±0.1		 13.6
±0.3		 13.9
±0.3
* 완전 혈구 계수 분석법에 의해 측정된 말초 혈액 헤모글로빈 수치(g/dL)는
평균 헤모글로빈 수치 ± 표준 오차로 나타냄.
1nd =전기 천공법을 수행하지 않음.
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 동물의 말초 혈액의 혈소판 수치를 경시적으로 측정하여, 평균 혈소판 수치(×1000) ± 표준 오차로 나타내었다. 표 24를 참조하시오.
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 동물의 헤마토크릿 수치 %를 경시적으로 측정하여, 평균 헤마토크릿 수치 % ± 표준 오차로 나타내었다. 표 25를 참조하시오.
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 동물의 말초 혈액의 총 림프구 수를 경시적으로 측정하여, 평균 총 림프구 수 ± 표준 오차로 나타내었다. 표 26을 참조하시오.
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 동물의 말초 혈액의 총 CD3+ T-림프구 수를 경시적으로 측정하여, 평균 총 CD3+ T-림프구 수 ± 표준 오차로 나타내었다. 표 27을 참조하시오.
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 동물의 말초 혈액의 총 CD3+ CD4+ Th-림프구 수를 경시적으로 측정하여, 평균 총 CD3+CD4+ Th-림프구 수 ± 표준 오차로 나타내었다. 표 28을 참조하시오.
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 동물의 말초 혈액의 총 CD3+ CD8+ T-림프구 수를 경시적으로 측정하여, 평균 총 CD3+CD8+ T-림프구 수 ± 표준 오차로 나타내었다. 표 29를 참조하시오.
완전 혈구 계수 분석법에 의해 본 연구에 사용된 동물의 말초 혈액의 총 CD20+ 림프구 수를 경시적으로 측정하여, 평균 총 CD20+ 림프구 수 ± 표준 오차로 나타내었다. 표 30을 참조하시오.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이의 총 혈소판 수(×1000)
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 404
±42		 433
±19		 399
±21		 411
±16		 392
±30		 420
±13		 448
±17		 394
±21
3a 419
±41		 418
±31		 399
±28		 441
±25		 402
±30		 411
±20		 450
±35		 380
±17
3c 454
±19		 404
±13		 418
±21		 405
±19		 391
±13		 423
±41		 381
±23		 381
±27
3cE 384
±29		 389
±30		 414
±31		 389
±33		 431
±33		 315
±33		 400
±24		 347
±24
4a 364
±21		 373
±9		 339
±16		 368
±15		 355
±16		 357
±16		 360
±19		 nd1
대조구 458
±39		 412
±33		 386
±47		 383
±14		 386
±43		 414
±35		 409
±27		 378
±34
* 완전 혈구 계수 분석법에 의해 측정된 말초 혈액 혈소판 수치는
평균 혈소판 수치(×1000) ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이 체내 헤마토크릿 %
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 38.3
±0.9		 38.5
±0.5		 37.8
±0.6		 38.6
±0.4		 38.4
±0.4		 38.6
±0.5		 38.9
±0.4		 40.2
±0.5
3a 39.9
±1.0		 37.7
±0.8		 38.4
±1.1		 38.3
±0.9		 38.0
±0.8		 39.7
±1.1		 38.3
±1.1		 40.7
±0.7
3c 38.9
±0.8		 37.8
±0.8		 38.7
±0.5		 38.8
±1.1		 38.4
±1.1		 39.3
±0.9		 39.7
±0.9		 40.6
±0.8
3cE 39.1
±0.9		 40.6
±0.5		 39.7
±0.6		 39.6
±0.9		 40.9
±0.5		 39.0
±0.6		 40.0
±0.3		 39.9
±0.5
4a 41.3
±0.8		 38.8
±0.6		 40.8
±0.5		 39.6
±0.4		 40.1
±0.6		 39.8
±0.6		 37.9
±0.5		 nd1
대조구 40.3
±1.0		 38.5
±0.6		 39.3
±0.4		 39.4
±0.4		 39.6
±0.5		 40.3
±0.5		 40.8
±0.7		 41.8
±0.7
* 완전 혈구 계수 분석법에 의해 측정된 헤모크릿 수치 %는
평균 헤모크릿 수치 % ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이 체내 총 림프구 수
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 3444
±554		 4399
±521		 3952
±578		 4038
±462		 3646
±677		 4631
±574		 3600
±581		 3018
±422
3a 2955
±613		 2901
±452		 2706±405 2910
±434		 2804
±459		 3631
±714		 3186
±775		 3814
±736
3c 3213
±448		 3097
±369		 3192
±407		 3343
±559		 3417
±699		 4268
±667		 3098±678 3925
±805
3cE 3157
±331		 3737
±718		 4441
±608		 2737
±383		 4835
±822		 5286
±987		 4927
±575		 4385
±612
4a 4850
±348		 3763
±381		 4268
±339		 3471
±149		 4544
±363		 3494
±248		 3408
±248		 nd1
대조구 2638
±230		 3685
±784		 3280
±349		 3037
±334		 3828
±456		 4392
±465		 3451
±358		 3470
±220
* 완전 혈구 계수 분석법에 의해 측정된 말초 혈액 중 총 림프구 수는
평균 림프구 총 수 ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이 체내 총 CD3+ T-림프구 수
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 1778
±356		 2469
±265		 2167
±306		 2299
±257		 2051
±356		 2917
±313		 2261
±318		 1852
±218
3a 1697
±291		 1796
±269		 1681±255 1910
±327		 1822
±322		 2536
±450		 2344
±619		 2772
±523
3c 1862
±215		 1815
±175		 1862
±187		 1949
±279		 2080
±341		 2679
±313		 2019±385 2458
±426
3cE 1716
±223		 1926
±421		 2718
±427		 1417
±241		 3139
±560		 3437
±680		 3229
±360		 2928
±457
4a 2848
±240		 2141
±263		 2481
±265		 1881
±95		 2851
±328		 2153
±212		 2141
±224		 nd1
대조구 1455
±85		 2188
±484		 1883
±218		 1749
±258		 2334
±382		 2789
±334		 2352
±341		 2291
±197
* 말초 혈액
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이 체내 총 CD3+CD4+ Th-림프구 수
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 1117
±226		 1463
±197		 1348
±219		 1371
±190		 1317
±225		 1770
±208		 1435
±225		 1457
±266
3a 934
±143		 1007
±158		 986
±156		 1084
±191		 1078
±198		 1425
±242		 1291
±322		 1535
±287
3c 1132
±167		 1108±130 1178
±129		 1195
±176		 1283
±209		 1598
±208		 1229±224 1480
±256
3cE 1034
±155		 1115
±194		 1622
±267		 827
±124		 1752
±271		 1917
±347		 1673
±165		 1628
±165
4a 1774
±220		 1362
±202		 1528
±202		 1171
±91		 1743
±247		 1363
±163		 1360
±174		 nd1
대조구 877
±79		 1292
±259		 1162
±117		 1109
±155		 1430
±239		 1659
±226		 1437
±178		 1353
±139
* 완전 혈구 계수 분석법에 의해 측정된 말초 혈액 중 총 CD3+CD4+ Th-림프구 수는
평균 CD3+CD4+ Th-림프구 총 수 ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이 체내 총 CD3+CD8+ T-림프구 수
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 627
±141		 1008
±105		 807
±96		 908
±87		 729
±147		 1137
±131		 811
±103		 678
±92
3a 729
±159		 778
±118		 691
±94		 823
±139		 729
±120		 1111
±224		 1041
±285		 1254
±251
3c 663
±61		 661
±69		 635
±61		 709
±102		 744
±122		 1023
±111		 712
±151		 884
±149
3cE 626
±78		 774
±229		 1067
±169		 542
±114		 1409
±334		 1431
±348		 1528
±206		 1270±294
4a 1005
±47		 721
±70		 901
±74		 628
±53		 994
±95		 699
±64		 718
±58		 nd1
대조구 540
±92		 876
±252		 695
±151		 625
±141		 870
±172		 1104
±184		 872
±215		 880
±131
* 완전 혈구 계수 분석법에 의해 측정된 말초 혈액 중 총 CD3+CD8+ T-림프구 수는
평균 CD3+CD8+ T-림프구 총 수 ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 면역화된 짧은 꼬리 원숭이 체내 총 CD20+ 림프구 수
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 1468
±309		 1287
±347		 1369
±403		 1131
±328		 1337
±391		 1300
±331		 993
±301		 918
±275
3a 1071
±296		 857
±204		 859
±218		 767
±175		 782
±195		 799
±229		 575
±115		 746
±189
3c 1143
±269		 994
±205		 1155
±264		 1089
±283		 1083
±340		 1322
±380		 902
±295		 1175
±356
3cE 1081
±140		 968
±139		 1221
±156		 923
±125		 1147
±201		 1080
±173		 1006
±138		 966
±118
4a 1332
±186		 1127
±162		 1247
±113		 1255
±148		 1051
±104		 938
±100		 987
±91		 nd1
대조구 984
±161		 1134
±296		 1171
±169		 1027
±183		 1206
±221		 1223
±204		 912
±144		 945
±164
* 완전 혈구 계수 분석법에 의해 측정된 말초 혈액 중 총 CD20+ 림프구 수는
평균 CD20+ 림프구 총 수 ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
표 7에 나타낸 바와 같이, 플라스미드와 면역원성 조성물로 복수 회 플라스미드 면역화시켰을 경우에도, 본 연구에 사용된 동물의 체내 혈소판 수(표 24), 헤모크릿 %(표 25), 총 림프구 수(표 26), 총 CD3+ T-림프구 수(표 27), 총 CD3+CD4+ Th-림프구 수(표 28), 총 CD3+CD8+ T-림프구 수(표 29) 및 총 CD20+ T-림프구 수(표 30)에 악영향을 미치지 않았다. 뿐만 아니라, 이러한 분석 결과, 그룹 3cE를 면역화시키는 데 부피바카인 제형화 면역원성 조성물을 사용함과 동시에 전기 천공법을 수행하였을 때, 총 림프구 수(표 26), 총 CD3+ T-림프구 수(표 27), 총 CD3+CD4+ Th-림프구 수(표 28), 총 CD3+CD8+ T-림프구 수(표 29)에 있어서 긍정적인 효과가 나타남을 알 수 있었다. 이 그룹에 있어서, 이들 카테고리에 속하는 각각의 경우 림프구 수는 연구 수행 과정 중 상당히 증가하였다.
본 연구에 사용된 동물의 체중을 1주일 간격으로 모니터하였다. 체중(㎏)은 평균 체중 ± 표준 오차로 나타내었다. 표 31을 참조하시오.
전기 천공법을 수행하였을 때와 수행하지 않았을 때
플라스미드 DNA 백신으로 복수 회 면역화된 짧은 꼬리 원숭의 체중(㎏)
주
그룹 ID -2 0 2 4 6 8 10 16
2d 3.74
±0.27		 3.63
±0.27		 3.84
±0.29		 3.93
±0.28		 3.98
±0.29		 4.16
±0.29		 4.00
±0.28		 4.05
±0.28
3a 3.63
±0.19		 3.56
±0.19		 3.74
±0.22		 3.75
±0.22		 3.83±0.25 3.98
±0.23		 3.85
±0.25		 3.96
±0.25
3c 3.70
±0.23		 3.65
±0.20		 3.87
±0.24		 3.97
±0.25		 4.16
±0.25		 4.26
±0.29		 4.14
±0.26		 4.28
±0.30
3cE 3.67
±0.23		 3.91
±0.23		 4.03
±0.28		 3.99
±0.26		 4.04
±0.28		 4.12
±0.25		 4.06
±0.27		 4.14
±0.30
4a 3.67
±0.19		 3.72
±0.21		 3.83
±0.22		 3.77
±0.19		 3.85
±0.18		 3.71
±0.18		 3.72
±0.14		 nd1
대조구 3.61
±0.23		 3.66
±0.20		 3.91
±0.18		 4.03
±0.19		 4.15
±0.18		 4.24
±0.19		 4.21
±0.20		 4.29
±0.21
* 체중(㎏)은 평균 체중 ± 표준 오차로 나타냄.
1nd = 전기 천공법을 수행하지 않음.
마지막으로, 본 분석 결과를 통하여, 표 7에 기술된 면역원성 조성물과 플라스미드로 복수 회 플라스미드 면역화시키면, 본 연구에 사용된 동물의 체중에 어떠한 악영향도 미치지 않음을 알 수 있었다(표 31).
실시예 13 : 단일 전사 단위를 보유하는 플라스미드를 4개 포함하는 면역원성 조성물을 이용한 쥐 면역화 연구
상기 실시예 들은 전체 면역 반응이 최대화되어야 할 경우, 플라스미드 당 단일 항원을 발현하는 단일 전사 단위를 보유하는 플라스미드들의 조합을 주성분으로 하는 면역원성 조성물을 사용하는 것이 유리할 수 있음을 시사한다. 본 실시예는 쥐의 면역화 연구에 관한 것으로서, 4개의 플라스미드를 주성분으로 하는 면역원성 조성물의 면역원 기능성과 3개의 플라스미드를 주성분으로 하는 면역원성 조성물의 면역원 기능성을 비교하기 위해 수행하였다. 더욱 구체적으로 말하면, 6개의 HIV-1 유전자 예를 들어, gag, pol, env 및 하나의 nef-tat-vif 유전자 융합체를 발현시키는 4개의 각 플라스미드를 주성분으로 하는 면역원성 조성물의 면역원 기능성과, 6개의 HIV-1 유전자 예를 들어, env, gag-pol 유전자의 제1 융합체와 nef-tat-vif 유전자의 제2 융합체를 발현시키는 3개의 각 플라스미드를 주성분으로 하는 면역원성 조성물의 면역원 기능성을 비교하였다. 면역원 기능성은 다양한 3개 및 4개의 플라스미드 DNA계 면역원성 조성물이 Balb/c 마우스 내에서 항원-특이적 세포 매개성 면역 반응을 복수 회 유도하는 능력으로 평가되었다. HIV 유전자 및 서열에 관하여는 실시예 1에 기술하였다. 그룹 3a 및 3c로부터 유래된 3개 플라스미드의 면역원성 조성물은 실시예 8 및 실시예 9에 기술된 바와 동일하였다. 표 1 및 표 32를 참조하시오.
면역원성 조성물 및 면역화
HIV env gp120, gag p55, pol(또는 gag-pol 융합체)을 암호화하는 플라스미드 DNA 발현 벡터, 또는 nef-tat-vif 융합 단백질을 실험용 면역원성 조성물로서 사용하였으며, 아무것도 삽입되지 않은 발현 벡터 골격을 대조구 면역원성 조성물 벡터로서 사용하였다. 연구 디자인을 위해서는 이하 표 32를 참조하시오. 다양한 발현 벡터에 의한 HIV 유전자 발현 여부는 인간 횡문근육종(RD) 세포를 일시적으로 형질 감염시킨 이후에 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 실시예 4 ～ 실시예 7을 참조하시오.
그룹 3a는 각각 단일 전사 단위 플라스미드를 포함하여 3개의 플라스미드를 가지지만, 항원 중 2개는 융합 단백질(gag-pol 및 nef-tat-vif)이다. 그룹 3c도 또한 3개의 플라스미드를 보유하지만, 이들 플라스미드 중 2개는 단일 전사 단위를 보유하고 제3 플라스미드는 2개의 완전한 전사 단위를 보유한다. 표 32를 참조하시오. 항원들 중 오직 하나만이 융합 단백질(nef-tat-vif)로서 발현된다. 그룹 4a는 각각 단일 전사 단위 플라스미드를 포함하여 4개의 프라스미드를 보유하지만, 항원들 중 오직 하나만이 융합 단백질(nef-tat-vif)로서 발현되었다.
본 연구에 사용되는 애쥬반트도 또한 DNA 플라스미드에 의해 전달되었다. 본 실시예에서, 모든 동물들에 쥐 IL-12 p35 및 p40 유전자를 암호화하고 쥐의 IL-12를 발현하는 212번 플라스미드 25 ㎍을 공동 주입하였다. 표 1을 참조하시오.
Balb/c 마우스에 표 32에 요약된 DNA를 총 100 ㎍ 근육 내 투여하여 면역화시켰다. 모든 경우에 있어서, 면역원성 조성물은 0.25% 부피바카인과 함께 제형화되어 대퇴 사두근에 100 ㎕의 부피만큼을 주사하였다. 2차 면역화 이후 10일 경과시, 동물을 죽여서 면역 검정용 혈청과 비장을 분리하였다. 비장은 이하에 기술된 바와 같이 ELISPOT 검정법을 이용하여 항원-특이적 IFN-감마 분비 세포를 측정하는데 사용하였다.
동물
본 연구를 위하여, 4～6주령 된 암컷 Balb/c 마우스를 사용하였다. 실험 동물의 보호 및 취급에 관한 가이드(National Research Council, National Academic Press, Washington, DC, 1996)에 따라서 마우스를 다루었다. 뿐만 아니라, 마우스를 취급 및 보호하는 방법도 와이어스 리서치 기관 동물 보호 및 위급 위원회에 의해 승인된 방법에 따랐다.
쥐 연구 디자인 - 2회 면역화
1그룹 번호 플라스미드
번호		 플라스미드
설명
 총 DNA 양
(㎍)		 마우스
번호		 면역화
스케쥴
(주)
3a 111
104
101		 HCMV-gag/pol
HCMV-ntv
HCMV-env		 33
33
33		 8 0 ～ 3
3c 102
103
202		 HCMV-gag
HCMV-pol
HCMV-ntv, SCMV-env		 33
33
33		 8 0 ～ 3
4a 101
102
103
104		 HCMV-env
HCMV-gag
HCMV-pol
HCMV-ntv		 25
25
25
25		 8 0 ～ 3
5 001 대조구 벡터 100 4 0 ～
1그룹 3a 및 3c는 표 3과 동일한 면역원성 조성물을 이용함.
상기 표 33에 나타낸 데이터를 통하여, 면역원성 조성물 중 항원 발현 플라스미드의 수를 3개에서 4개로 증가시키면 HIV 단백질에 대한 면역 반응은 별로 세지지 않음을 알 수 있었다. 표 33을 참조하시오.
2회 면역화 이후의 쥐 면역 반응
그룹 ID gag-특이적
반응* 		pol-특이적
반응		 env-특이적
반응		 ntv#-특이적
반응		 총 HIV-특이적
반응
대조구 3 0 9 1 13
3a 163 247 1564 116 2090
3b 436 1155 671 83 2345
4a 294 662 1150 123 2229
*항원-특이적 IFN-감마 ELISPOT 반응은 106개의 비장 림프구 당 인터페론 감마를 분비하는 점 형성 세포(#SCF/106 비장 림프구)로서 나타내었다.
# ntv, nef-tat-vif 융합 단백질.
본원에 인용된 모든 문헌은 참고용으로 인용되어 있는 것이다. 방법과 구성에 있어서 다양하되 최소한으로 가하여지는 변형에 관하여는 당 업자에게 명백할 것으로 생각된다.
SEQUENCE LISTING <110> Wyeth Sidhu, Maninder K. Egan, Michael Israel, Zimra Eldridge, John <120> PLASMID HAVING THREE COMPLETE TRANSCRIPTIONAL UNITS AND IMMUNOGENIC COMPOSITIONS FOR INDUCING AN IMMUNE RESPONSE TO HIV <130> AM101565 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 tttttt 6 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(1) <223> mutation to allow read through <220> <221> misc_difference <222> (4)..(4) <223> mutation to allow read through <220> <221> misc_difference <222> (6)..(6) <223> mutation to allow read through <400> 3 cttctg 6 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 4 Lys Gly Arg Pro 1 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Asp Arg Gln Gly Thr Val Ser Phe Asn Phe 1 5 10 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 6 Pro Gln Ile Thr 1

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  10. 척추 동물 숙주에서 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물로서,
    (a) HIV gag-pol 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 전사 단위를 포함하는 제1 DNA 플라스미드[여기서, 상기 단일 전사 단위는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있음];
    (b) (i) 제1 프로모터 및 제1 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전사 단위;
    (ii) 제2 프로모터 및 제2 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 HIV 외피 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전사 단위
    를 포함하는 제2 DNA 플라스미드
    [여기서, 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 각각 서로 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이고; 상기 제1 폴리아데닐화 시그널 및 제2 폴리아데닐화 시그널은 각각 서로 상이한 전사 단위로부터 유래된 것이며;
    상기 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 상기 제2 전사 단위의 전사 방향과 반대 방향이거나; 또는 상기 제1 전사 단위에 대한 전사 방향은 상기 제2 전사 단위의 전사 방향과 동일한 방향이며, 상기 제1 전사 단위와 제2 전사 단위는 1 Kbp 이상의 스페이서 영역에 의해 분리되어 있음]; 및
    (c) 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 형질 감염 촉진제 중 하나 이상
    을 포함하는 면역원성 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 형질 감염 촉진제가 부피바카인인 면역원성 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 상의 프로모터, 및 제2 플라스미드 상의 제1 프로모터 및 제2 프로모터가 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터, 유인원 거세포 바이러스(SCMV) 프로모터, 쥐 거세포 바이러스(MCMV) 프로모터, 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 잠복기 관련 프로모터-1(LAP1), 유인원 바이러스 40 프로모터, 인간 연장 인자 1 알파 프로모터 및 인간 근육 세포 특이적 데스민 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 상의 폴리아데닐화 시그널, 및 제2 플라스미드 상의 제1 폴리아데닐화 시그널 및 제2 폴리아데닐화 시그널이 토끼 베타-글로빈 폴리(A) 시그널, 합성 폴리 A, HSV 티미딘 키나제 폴리 A, 인간 알파 글로빈 폴리 A, SV40 폴리 A, 인간 베타 글로빈 폴리 A, 폴리오마 바이러스 폴리 A 및 소 성장 호르몬 폴리 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 상에 존재하는 프로모터가 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터인 면역원성 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 상에 존재하는 폴리아데닐화 시그널이 소 성장 호르몬 폴리 A 폴리아데닐화 시그널인 면역원성 조성물.
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  17. 제12항에 있어서, 상기 제2 플라스미드 상에 존재하는 제1 프로모터가 인간 거세포 바이러스(HCMV) 최조기 프로모터인 면역원성 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 상기 제2 플라스미드 상에 존재하는 제1 폴리아데닐화 시그널이 SV40 폴리 A 폴리아데닐화 시그널인 면역원성 조성물.
  19. 제10항에 있어서, 상기 HIV nef-tat-vif 융합 폴리펩티드가 HIV의 nef 유전자, tat 유전자 및 vif 유전자의 융합체(ntv)로부터 발현되는 nef, tat 및 vif 융합 단백질(NTV)인 면역원성 조성물.
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  21. 제12항에 있어서, 상기 제2 플라스미드 상에 존재하는 제2 프로모터가 유인원 거세포 바이러스(SCMV) 프로모터인 면역원성 조성물.
  22. 제13항에 있어서, 상기 제2 플라스미드 상에 존재하는 제2 폴리아데닐화 시그널이 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 시그널인 면역원성 조성물.
  23. 제10항에 있어서, 상기 HIV 외피 폴리펩티드가 HIV의 1차 분리체 6101로부터 유래되는 것인 면역원성 조성물.
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  40. 제10항 내지 제15항, 및 제17항 내지 제19항, 및 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의된 면역원성 조성물을 포함하는, HIV 감염을 치료하기 위한, 선택 항원에 대하여 척추 동물 숙주를 면역화시키기 위한 의약.
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