JP2008503211A - 3つの完全な転写単位を有するプラスミドおよびhivに対する免疫応答を誘発するための免疫原組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原に対する予防的免疫応答および治療的免疫応答を改善するためのプラスミド、免疫原組成物および方法に関連する。
プラスミドDNAに基づく免疫原組成物を使用する免疫化は、感染性疾患を防止または処置するための方法を開発するために、あるいは、進行中の疾患プロセスを処置することにおいて有用な強力なツールである。プラスミドDNA免疫化が動物モデルにおいて広範囲に試験されており、動物モデルでは、広範囲の様々な感染性媒介体および腫瘍抗原に対する細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を誘発することにおいて効果的であることが見出されている。非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3を参照のこと。
Donnelly JJら、Ann.Rev.Immunol.、1997年、第15巻、p.617〜48 Iwasaki Aら、J Immunol、1997年、第158巻、第10号、p.4591〜601 Wayne C.L.およびBennett M.、Crit.Rev.Immunol.、1998年、第18巻、p.449〜484 Conry R.M.ら、Gene Therapy、1996年、第3巻、第1号、p.67〜74 Chen TT.ら、Journal of Immunology、1994年、第153巻、第10号、p.4775〜87 Ayyavoo V.ら、AIDS、2000年、第14巻、第1号、p.1〜9 Amara R.R.ら、Vaccine、2002年、第20巻、第15号、p.1949〜55 Singh Gら、Vaccine、2002年、第20巻、p.1400〜1411 Sugimoto Y.ら、Hum.Gen.Ther.、1995年、第6巻、p.905〜915 Mizoguchi Hら、Mol.Ther.、2000年、第1巻、p.376〜382
1つの実施形態において、本発明は、(a)第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニットと、(b)第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットと、(c)第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニットとを含み、該第1のプロモーター、該第2のプロモーターおよび該第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1のポリアデニル化シグナル、該第2のポリアデニル化シグナルおよび該第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来するDNAプラスミドを提供する。本発明の別の実施形態において、第1、第2および第3のポリペプチドが真核生物細胞において発現される。
DNAに基づく免疫原組成物は、タンパク質抗原およびアジュバントの投与を含む従来の免疫原組成物の代替物を提供する。その代わり、DNAに基づく免疫原組成物では、1つまたは複数の抗原をコードするDNAを、その抗原が対象の組織の細胞によって発現される対象の組織に導入することが伴う。本明細書中で使用される場合、そのような免疫原組成物は「DNAに基づく免疫原組成物」または「核酸に基づく免疫原組成物」と呼ばれる。以前からの問題の1つは、多数の遺伝子が、保護免疫応答を生じさせるために要求されるとき、多数のプラスミドを、その多数の遺伝子を個々に発現させるために使用しなければならなかったことである。このことは製造および調節での負担を強いる。本発明の様々な実施形態は、この問題に対する解決策を、3つの独立したオープンリーディングフレームを同じ細胞において発現させることができるプラスミド設計により提供する。本発明の特定の実施形態では、遺伝子が、ポリタンパク質を作製するために融合され、このようにして、さらに多くのタンパク質を1つのプラスミドから発現させることができる。1つの実施形態において、6つのタンパク質が1つのプラスミドから発現させられる。
プラスミド、構築物およびベクターの各用語が本明細書全体を通して使用される。本明細書中で使用される用語「プラスミド」は、調節配列、オープンリーディングフレーム、クローニング部位、停止コドン、スペーサー領域、または、構造的領域もしくは機能的領域のために選択された他の配列をコードする様々な核酸分子が組み立てられ、遺伝子を脊椎動物宿主において発現させるためのベクターとして使用される環状かつスーパーコイル状のDNA分子を示す。さらに、本明細書中で使用される「プラスミド」は細菌株において複製することができる。本明細書中で使用される用語「構築物」は、遺伝子および調節エレメントの指定された構成を有する特定のベクターまたはプラスミドを示す。核酸配列は、「外因性」(これは、核酸配列が、ベクターが導入されようとしている細胞に対して外来であることを意味する)、「異種」(これは、核酸配列が、異なる遺伝子源に由来することを意味する)、または、「同族」(これは、宿主細胞の核酸内の位置においてその配列が通常的には見出されないことを除いて、配列が細胞内の配列に対して構造的に近縁であることを意味する)であることが可能である。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築し、または、本発明のプラスミドを改変するために十分な素養を有している。そのような技術は、例えば、Sambrook他、Molecular Cloning.A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1989)およびその引用参考文献(例えば、3.18頁〜3.26頁および16.17頁〜16.27頁での引用参考文献)、ならびに、Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers、New York、1995)に記載される(両者は参考として本明細書中に組み込まれる)。
脊椎動物の免疫原組成物を設計するための実際的な検討事項は、対象を免疫化するときに効果的な投与され得るDNAの量である。用量が検討されるとき、プラスミドの全体的なサイズを制限し、その一方で、プラスミド内での完全な転写ユニットの数を同時に最大にすることは、プラスミドDNA設計をもたらすための方針を提供する。プラスミドのサイズを最小限に抑え、かつ、発現される遺伝子の数を最大にすることの利点は、1マイクログラムの注入されたDNAあたり送達される免疫原タンパク質の量が高まることである。加えて、ベクターのサイズが増大するに従い、ベクターの不安定性の可能性が増大することが知られている。Herrera他、Biochem.Biophys.Res.Commun.、279:548〜551(2000)を参照のこと。従って、この目標を達成するために、個々の調節制御エレメント(例えば、プロモーターなど)のサイズを検討し、所与の発現レベルのために要求されるプロモーターの強さとバランスさせなければならない。同様に、オープンリーディングフレームのサイズがプラスミドの全体的なサイズの一因となる。本明細書中で使用される場合、転写ユニット間のDNA領域(これは、調節的な役割または選択された抗原をコードする役割を有しないDNAによって占められる)は、本明細書中では「スペーサー領域」として指される。スペーサー領域のサイズは、転写ユニット間の転写干渉のレベル、立体的障害のレベル、および、全体的なプラスミドサイズを決定することにおいて重要である。従って、各エレメントのサイズは、それがタンパク質コードであるか、または調節制御であるか、またはスペーサー領域であるとしても、慎重に検討しなければならず、また、最小の効果的な塩基対数に制限しなければならない。
本明細書中で使用される「ポリペプチド」は、本発明のプラスミドおよび免疫原組成物によってコードされる選択されたタンパク質抗原、糖タンパク質抗原、ペプチド抗原または他の改変されたタンパク質抗原を指す。本発明の実施形態では、選択された抗原に対して脊椎動物宿主における「ポリペプチド」に対する免疫応答を誘発するプラスミドおよび免疫原組成物が提供される。本明細書中で使用される用語「選択された抗原」はこのようなポリペプチドを指す。ポリペプチドを含む選択された抗原には、プラスミドDNAによって発現されるとき、病原性のウイルス、細菌、菌類、寄生虫、プリオンまたはそれらの組合せに由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る。あるいは、選択された抗原には、ガン細胞または腫瘍細胞に由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る。別の実施形態において、選択された抗原には、IgEの産生を妨害し、その結果、アレルゲンに対するアレルギー性応答を和らげるようにするために、アレルゲンに由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る。さらに別の実施形態において、選択された抗原には、望ましくない様式、量または存在位置で宿主によって産生される分子(自己分子)を表す分子またはその一部分に由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る(例えば、脊椎動物宿主におけるアミロイド沈着によって特徴づけられる疾患を防止または処置するようにするために、アミロイド前駆体タンパク質に由来する分子など)。本発明の1つの実施形態において、選択された抗原には、HIV−1に由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントが含まれ得る。
本発明のDNAプラスミドは、1つ、2つまたは3つの転写ユニットを含む。それぞれの転写ユニットが少なくとも1つのプロモーターを含む。従って、本発明の特定の実施形態において、選択された抗原をコードする核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために要求される、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるDNA配列を指す。表現「転写制御下」は、プロモーターが、遺伝子のRNAポリメラーゼによる開始および転写を制御するために核酸に関して正しい存在位置および配向にあることを意味する。
本発明のDNAプラスミドは3つの転写ユニットを含み、それぞれの転写ユニットが少なくとも1つのポリアデニル化シグナルを含む。本明細書中で定義される「ポリアデニル化シグナル」は、特定の転写ユニットの転写を終結させ、かつ、ポリペプチドをコードする核酸配列が適切に転写および翻訳されることを確実にする停止配列(または停止コドン)を指す。停止部位は合成または天然起源が可能である。停止部位の例には、ポリアデニル化シグナルおよび合成された二方向転写停止部位が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、ポリアデニル化シグナルにより、DNA配列の転写が停止する。
本発明において有用なDNAプラスミドおよび免疫原組成物はさらに、薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤または薬学的に受容可能なキャリアを含む。1つの実施形態において、前記薬学的に受容可能な希釈剤は、無菌水、無菌の等張性生理的食塩水、または生物学的緩衝液である。抗原性組成物はまた、そのような希釈剤またはキャリアと従来の様式で混合することができる。本明細書中で使用される表現「薬学的に受容可能なキャリア」は、ヒトまたは他の脊椎動物宿主に対する投与との適合性を有するありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性薬剤および吸収遅延剤などを包含することが意図される。適切なキャリアは当業者には明白であり、主として投与経路に依存する。
アジュバントは、免疫原または抗原と一緒に投与されたときに免疫応答を高める物質である。数多くのサイトカインまたはリンホカインが免疫調節活性を有することが示されており、従って、アジュバントとして使用することができ、それらには、インターロイキン1−α、インターロイキン1−β、インターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン5、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン8、インターロイキン10、インターロイキン12(例えば、米国特許第5,723,127号を参照のこと)、インターロイキン13、インターロイキン14、インターロイキン15、インターロイキン16、インターロイキン17およびインターロイキン18(およびその変異形態)、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(例えば、米国特許第5,078,996号およびATCCアクセション番号39900を参照のこと)、マクロファージコロニー刺激因子(MCSF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、ならびに、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β(TNF)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用なさらに他のアジュバントには、ケモカインが挙げられ、これには、限定されないが、MCP−1、MIP−1α、MIP−1βおよびRANTESが挙げられる。接着分子(例えば、セレクチン(例えば、L−セレクチン、P−セレクチンおよびE−セレクチン)など)もまたアジュバントとして有用である場合がある。さらに他の有用なアジュバントには、限定されないが、ムチン様分子(例えば、CD34、GlyCAM−1およびMadCAM−1)、インテグリンファミリーのメンバー(例えば、LFA−1、VLA−1、Mac−1およびp150.95など)、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー(例えば、PECAM、ICAM(例えば、ICAM−1、ICAM−2およびICAM−3)、CD2およびLFA−3など)、共刺激分子(例えば、CD40およびCD40Lなど)、増殖因子(血管成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、B7.1、B7.2、PDGF、BL−1および血管内皮細胞増殖因子が挙げられる)、受容体分子(Fas、TNF受容体、Flt、Apo−1、p55、WSL−1、DR3、TRAMP、Apo−3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL−R2、TRICK2およびDR6が挙げられる)が挙げられる。さらに別のアジュバント分子には、カスパーゼ(ICE)が挙げられる。国際特許出願公開WO98/17799および同WO99/43839もまた参照のこと(これらは参考として本明細書中に組み込まれる)。
ポリヌクレオチド分子から構成される免疫原組成物は望ましくは、ポリヌクレオチドトランスフェクション促進因子または「共薬剤」などの、場合により使用される賦形剤、例えば、細胞へのポリヌクレオチド移入を容易にする、局所麻酔剤、ペプチド、脂質(カチオン性脂質、リポソームまたは脂質粒子が含まれる)、ポリカチオン(例えば、ポリリシンなど)、枝分かれした三次元ポリカチオン(例えば、デンドリマーなど)、炭水化物、カチオン性の両親媒性物質、界面活性剤、ベンジルアンモニウム系界面活性剤または別の化合物などを含有する。そのような促進因子には、局所麻酔剤のブピバカインまたはテトラカインが挙げられる(米国特許第5,593,972号、同第5,817,637号、同第5,380,876号、同第5,981,505号および同第6,383,512号、ならびに、国際特許出願公開WO98/17790を参照のこと;これらは本明細書により参考として組み込まれる)。本発明において有用なそのような促進因子または共薬剤の他の非網羅的な例が、米国特許第5,703,055号、同第5,739,118号、同第5,837,533号;国際特許出願公開WO96/10038(1996年4月4日公開)および国際特許出願公開WO94/16737(1994年8月8日公開)に記載される(これらはそれぞれが参考として本明細書中に組み込まれる)。
他の賦形剤を本発明の免疫原組成物に含めることができ、そのような賦形剤には、保存剤、安定化成分および表面活性剤などが含まれる。
一般に、本発明の免疫原組成物の構成成分についての適切な「有効量」または投薬量の選択はまた、用いられる免疫原組成物中の選択された抗原の正体、ならびに、被験体の身体状態(特にとりわけ、免疫化被験体の全身の健康状態、年齢および体重が含まれる)に基づく。投与方法および投与経路、ならびに、免疫原組成物中のさらなる構成成分の存在もまた、DNAプラスミド組成物の投薬量および量に影響を及ぼし得る。有効用量のそのような選択および上方調節または下方調節はこの技術分野の技術の範囲内である。免疫応答(好ましくは、保護応答)を誘発するために、または、著しい有害な副作用を伴うことなく患者において外因性の作用を生じさせるために要求されるプラスミドの量は、これらの要因に依存して変化する。好適な用量が当業者によって容易に決定される。
さらに別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対する免疫応答が所望される上記の疾患または状態のいずれかを処置するための免疫原レジメン、予防的レジメンまたは治療的レジメンを即座に施すための医薬用キットを提供する。このようなキットは、高レベルの抗原特異的な免疫応答を哺乳動物被験体または脊椎動物被験体において誘発する方法で使用するために設計される。キットは、1セットの選択された抗原またはペプチドをコードする3つの転写ユニットを含むDNAプラスミドを含む少なくとも1つの免疫原組成物を含有する。免疫原組成物の多数回分の事前に包装された投薬量を多数回投与のためにキットにより提供することができる。
当業者は、多くのウイルスおよび細菌からの配列情報がこの技術分野では利用できることを理解する。より具体的には、配列情報を、ポリペプチドを本発明のプラスミドにおいて発現させる際に使用される遺伝子をクローン化するために使用することができる。HIVおよび他の病原体に由来する多くの配列に関する情報を、Los Alamos National Laboratory(ロスアラモス国立研究所)、および、United States National Library of Medicine(国立医学図書館)(8600 Rockville Pike、Bethesda、MD 20894)でのNational Center for Biotechnology Information(国立バイオテクノロジー情報センター)におけるHIV配列データベースから入手することができる。
これらの例において議論されるプラスミドを表1および表2に示す。
三転写ユニットプラスミドDNAベクターの使用の実例として、3つの真核生物オープンリーディングフレームを同時発現することができるプラスミドベクターを作製した。三転写ユニットプラスミドDNAベクターを、HIV−1抗原をコードする下記の選択された遺伝子を実施例2に記載される三連転写ユニット発現カセットに挿入することによって作製した。すべてのクローニング技術を通常的な手順(Sambrook他、1989)に従って行った。
材料および方法;細胞およびトランスフェクション
実施例3で記載された6つのHIV遺伝子を発現するプラスミドを、コードされたタンパク質を発現する能力についてインビトロで評価した。すべてのインビトロ発現研究のために使用した細胞は、American Type Culture Collection(ATCC)から得られた293細胞およびRD細胞であった。HIVタンパク質をこれらの細胞において発現させるための手順は下記の通りであった:細胞をトランスフェクションの24時間前に直径35mmのウエルあたり2×105細胞の密度でプレートし、精製したプラスミドDNAによりトランスフェクションした。トランスフェクションのために、2μgのプラスミドをFugeneトランスフェクション試薬(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)と混合し、100μlの総体積で細胞に重層した。次いで、細胞を、10%のFBSを含む2mlのDMEM培地(BRL)により48時間インキュベーションした。最後に、細胞溶解物をさらなる分析のために集めた。
HIVタンパク質の特異的な検出を、ウェスタンブロットアッセイを使用して達成した。例えば、gagタンパク質、polタンパク質、エンベロープタンパク質およびvifタンパク質のそれぞれについてのウェスタンブロットアッセイを、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してタンパク質混合物を分離することによって行った。次いで、分離したタンパク質をPVDFメンブラン(Invitrogen、Carlsbad、CA)に転写した。事前に染色された分子量マーカー、ならびに、HIV−1の組換えp24(gag)タンパク質、組換えp66(pol)タンパク質、組換えgp160(env)タンパク質および組換えvifタンパク質(Invitrogen)をサイズ標準物およびポジティブコントロールとしてそれぞれ使用した。gag、pol、envおよびvifの発現の検出を免疫染色によって達成し、結合している分離されたタンパク質を有するPVDFメンブランをそれぞれのタンパク質に対して特異的な抗体とインキュベーションした。アルカリホスファターゼに結合体化された二次抗体(Invitrogen)を使用し、発色検出を、発色検出キット(Invitrogen)を使用することによって行った。
三連転写ユニットプラスミドからのHIV遺伝子の発現を評価し、単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミドのそれぞれからの同じ遺伝子の発現と比較した。単一転写ユニットプラスミドは、HCMVプロモーターおよびBGHポリAシグナルを発現調節エレメントとして含有する単一の真核生物転写ユニットを有していた。単一転写ユニットプラスミドには、表1に示されるように、101〜105、ならびに、110および111の番号が付けられている。例えば、プラスミド101はHIVのenv遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。同様に、プラスミド102はHIVのgag遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。加えて、プラスミド103はHIVのpol遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有し、プラスミド104はHIVのnef−tat−vif(ntv)融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。プラスミド101はまた、プラスミド104内のHCMVではなく、Lap1プロモーターによって駆動されることを除いて、HIVのnef−tat−vif(ntv)融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。最後に、プラスミド110はHIVのgag−pol−nef−tat−vif融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有し、プラスミド111はHIVのgag−pol融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。
表1.単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミド*
表2.三連転写ユニットプラスミド*
**IL−12はマウスまたはアカゲザルまたはヒトのいずれかに由来し得る。
半定量的なインビトロ発現分析に基づいて、データは、gag−pol、envおよびntvを含む、挿入されたHIV遺伝子のすべてが、3つの独立した転写ユニットを保持する三連プロモータープラスミドから著しいレベルで発現したことを示している。
次に、多数の遺伝子をコードする1つの三連転写ユニットプラスミドからの発現を、それぞれが1つの遺伝子を同じ遺伝子アレイから発現する多数のプラスミドからの発現と比較した。この場合、プラスミドあたりのDNAを1μgで一定に保った。それぞれの場合において、DNAの総量もまた、オープンリーディングフレームのインサートを有しないプラスミドDNAを補充することによって4μgで一定に保った。HIV gagの発現を、1μgのそれぞれのプラスミドで一過的にトランスフェクションされた培養細胞を使用して評価し、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。図6に示されるように、HIV gagの発現が、レーン2(2つのプラスミド)、レーン3(1つのプラスミド)、レーン4(1つのプラスミド)およびレーン5(4つのプラスミド)において容易に検出された。HIV gagの発現がレーン1(3つのプラスミド)では低かった。再度ではあるが、三転写ユニットプラスミド303はかなりの量のgagタンパク質を産生したが、2つ以上のプラスミドを含有する組合せよりも少なかった。
図6、図7および図8に示されるように、三転写ユニットプラスミド(303)を使用して、gag−polタンパク質、envタンパク質およびntvタンパク質をコードする3つのオープンリーディングフレームのすべてが、類似したレベルで同時に発現された。従って、このことから、このプラスミドの機能性が確認される。
gag、pol、envおよびnef−tat−vifのHIV遺伝子の発現を、2μgの濃度での三連転写ユニットプラスミドと、それぞれ1μgのDNAの2つのプラスミドの組合せとの間で比較した。総DNA濃度を、図9、図10、図11および図12に示されるように2μgで一定に保った。
多数の遺伝子をコードする1つの三連転写ユニットプラスミドからの発現を、同じ遺伝子アレイを発現する多数のプラスミドと比較した。この場合、プラスミドあたりのDNAが1μgで一定に保たれた。実施例5とは対照的に、DNAの総量は、DNAの総量を補うため、オープンリーディングフレームのインサートを有しないプラスミドDNAにより補充しなかった。データを示さないが、下記にまとめる。
高レベルの特定のタンパク質をrev非依存的様式で発現する、多数のHIV遺伝子をコードする三連転写ユニットプラスミドを設計し、構築した。これにより、単一のプラスミド構築物により、3つの転写物が独立的かつ効率的に発現したことが確認された。本実施例では、三連転写ユニットプラスミドからのHIV遺伝子の発現を、単一転写ユニット構築物または二連転写ユニット構築物のいずれかからの同じ遺伝子の発現と比較した。データは、一発現カセットまたは二連発現カセットによって発現された遺伝子発現と比較したとき、三連転写ユニットプラスミドからの遺伝子発現の方が低かったことを示している。しかしながら、上記実施例では、HCMVプロモーターに駆動される遺伝子発現がSCMVプロモーターよりも高く、HSV−lap1プロモーターがそれに続いたことが見出された。三連転写ユニット構築物におけるプロモーターの強さにおけるこの違いは、より低い免疫原性の抗原に対してより高い免疫原性の抗原を発現させるための遺伝子をプラスミドに配置するときには考慮しなければならない。
マウス研究を、gag、pol、env、nef、tatおよびvifを含む6つのHIV−1遺伝子からタンパク質を発現する三転写ユニットプラスミドベクターの免疫原機能性を明らかにし、かつ、比較するために行った。具体的には、様々な1個、2個または3個のプラスミドDNAに基づく免疫原組成物が、多重抗原特異的な細胞媒介性免疫応答をBalb/cマウスにおいて誘発する、相対的な能力を比較した。
これらの研究のために、4週齢〜6週齢のメスのBalb/cマウスを使用した。マウスを、研究室動物の管理および使用のための指針(National Research Council、National Academic Press、Washington,D.C.、1996)に従って飼育した。加えて、マウスの使用および管理のための手順はWyeth Researchの施設内動物管理使用委員会によって承認された。
HIVのenv gp160、gag p55、polまたはnef−tat−vif融合タンパク質をコードする様々なプラスミドDNA発現ベクターを実験用免疫原組成物として使用し、空の発現ベクターバックボーンをコントロールの免疫原組成物ベクターとして使用した。研究設計については下記の表3を参照のこと。様々な発現ベクターによるHIV遺伝子の発現を、ヒト横紋筋肉腫(RD)細胞の一過的トランスフェクションの後、ウェスタンブロットによって確認した。実施例4〜実施例7を参照のこと。
表3.マウス研究設計−2回の免疫化
ELISPOT(またはElisaSpot、これは酵素結合免疫スポットアッセイの省略形である)は最初、抗体を分泌するB細胞を検出するための方法として開発された。この方法は現在、特定の抗原に対するT細胞の反応(通常、百万個あたりの活性化細胞の数として表される)を明らかにするために適合化されている。本実施例では、インターフェロン−γ(IFN−γ)の産生を単一の細胞の活性化についての読み取りとして使用した。
表4.2回の免疫化の後でのマウス免疫応答
すべての場合において、nef−tat−vif特異的な応答は比較的低かった。nef−tat−vifがlap1プロモーターの制御下にある群1マウスでは最も低かった。しかしながら、上記の実施例4〜実施例7では、HCMVプロモーターに駆動される遺伝子発現がSCMVプロモーターの場合よりも大きく、SCMVプロモーターに駆動される遺伝子発現がHSV−lap1プロモーターの場合よりも大きいことが見出されていた。三連プロモーター構築物において利用されているプロモーターの強さのこの違いが、この構築物が免疫原組成物において使用されたときに観測された、誘発された免疫応答がより低いことの原因であると考えられる。
表5.マウス研究設計−3回の免疫化
表6.マウスの細胞性免疫応答−3回の免疫化
#ntv、nef−tat−vif融合タンパク質
免疫原組成物による3回の免疫化後のELISPOT結果は、三転写ユニットプラスミドに基づく免疫原組成物による3回の免疫化の後におけるHIV細胞性免疫応答が3回目の免疫化の後で100%増大したことを示した。しかしながら、応答のバランスは、関与したプロモーターの強さ、および、抗原の相対的な免疫原性に依存して、依然として変化し得る。明らかではあるが、製造上の利点が必要であるいくつかの状況では、三連転写ユニットプラスミドは、3つ以上の遺伝子を免疫原組成物により投与するための良好なビヒクルである。
実施例8の表3および表4において、3つのpDNA免疫原組成物、特に、群2d、群3aおよび群3cで使用された免疫原組成物は、6個すべてのHIVタンパク質に対する強力(>600SFC/106細胞)、かつ、バランスの取れたHIV特異的なELISPOT応答を誘発することができるようであった。これらを非ヒト霊長類でのさらなる試験のために選択した。
この研究のために、合計で30頭のMamu−A*01陰性の、自家繁殖させたオスのインド産アカゲザル(Macaca mulatta)を使用した。マカクをNew Iberia Research Center(New Iberia、LA)に収容し、研究室動物の管理および使用に関する指針(National Research Council、National Academic Press、Washington,D.C.、1996)に従って飼育した。加えて、マカクの使用および管理に関する手順はWyeth Researchの施設内動物管理使用委員会によって承認された。
免疫化用の発現プラスミドをPuresyn,Inc(Malvern、PA)によって作製した。プラスミドを大腸菌により増殖させ、アルカリ溶解によって細胞から単離し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。その後、プラスミドを個々に、DNA:ブピバカイン複合体の形成を可能にするために0.25%のブピバカインを含有する等張性クエン酸塩緩衝液(29.3mMのクエン酸ナトリウム、0.67mMのクエン酸、150mMのNaCl、0.34mMのEDTA、pH=6.4〜6.7)により2.5mg/mLの濃度で処方した。最終的なプラスミド調製物は、90%を越えるスーパーコイル状プラスミドDNAからなることが示され、残留エンドトキシンは30EU/mgDNA未満であることが示された(データは示していない)。
表7.マカク研究設計
表8.多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的な全体的なHIV特異的IFN−γELISPOT応答
驚くべき結果は、エレクトロポレーションにより、全体的な細胞性免疫応答が10週で450%より高く増大し、16週で990%より高く増大したことであった。3cEを3cと比較のこと。表8に示される結果は、2つ以上の転写ユニットを有する少なくとも1つのプラスミドを含有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物が、エレクトロポレーションと組み合わされたとき、単一の転写ユニットを有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物と比較して、最大の全体的な細胞性免疫応答を10週間後または16週間後に生じさせていたことを示していた。群3cおよび群3aを比較のこと。
表9.多プラスミドDNAワクチン接種の後での第10週における個々のHIV抗原特異的なIFN−γELISPOT応答
表10.多プラスミドDNAワクチン接種の後での第16週における個々のHIV抗原特異的なIFN−γELISpot応答
表11は、30週(最後の免疫化の22週間後)での、HIVのenvタンパク質、gagタンパク質、polタンパク質、および、nef−tat−vifタンパク質の融合タンパク質に対するIFN−γELISPOT応答を示す。このマカク研究において、再度ではあるが、エレクトロポレーションの使用を除いた場合、群3aは、env、polおよびnef−tat−vifに対する最大のHIV抗原特異的なELISPOT応答を発達させた。表11を参照のこと。群3cの動物はgagに対する最大のELISPOT応答を発達させた。表11において3aを2dおよび3cと比較のこと。最大のELISPOT応答がエレクトロポレーションの使用により達成された。表11において群3cEを参照のこと。
表11.多プラスミドDNAワクチン接種の後での第30週における個々のHIV抗原特異的なIFN−γELISpot応答
個々のHIVタンパク質に対する経時的な細胞性免疫応答
IFN−γELISPOT応答を、表7に記載されるプラスミドによる免疫化の後、env、gag、pol、nef、tatおよびvifの個々のHIVタンパク質に対して、第2週、第4週、第6週、第8週、第10週および第16週で測定した。結果を表12〜表17に示す。
表12:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIV env特異的なIFN−γELISpot応答
表13:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIV gag特異的なIFN−γELISpot応答
表14:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIV pol特異的なIFN−γELISpot応答
表15:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIV nef特異的なIFN−γELISpot応答
表16:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIV tat特異的なIFN−γELISpot応答
表17:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIV vif特異的なIFN−γELISpot応答
表12〜表17は、個々のタンパク質に対する免疫応答を経時的に示しており、抗原発現プラスミドの数を免疫原組成物中で3から4へ増やすことにより、投与されたDNAのこの所定の濃度では、これらHIVタンパク質のすべてに対する免疫応答の低下がもたらされたことを示している。表12〜表17を参照のこと。
HIV特異的CTLおよびヘルパー細胞の相対的な量を、全体的なHIV特異的IFN−γELISpot応答を、CD4+細胞またはCD8+細胞の未分画の末梢血リンパ球(PBL)をまず枯渇化させ、その後第10週および第16週で測定することによって推定した。
CD4+細胞またはCD8+細胞を、抗ヒトCD4特異的マウスモノクローナル抗体または抗ヒトCD8特異的マウスモノクローナル抗体で被覆された磁性ポリスチレンビーズを製造者の説明書(Dynal Biotech、Oslo、ノルウェー)に従って使用して未分画PBLから枯渇させた。簡単に記載すると、新しく単離されたアカゲザルPBLを洗浄し、2%のFBSを含有する氷冷した1×PBSにより2×106細胞/mLの最終濃度に再懸濁した。抗ヒトCD4特異的マウスモノクローナル抗体または抗CD8特異的マウスモノクローナル抗体のいずれかで被覆されたDynalミクロビーズを、2%のFCSを含有する1×PBSにより3回洗浄し、その後、未分画PBLに5:1のビーズ対細胞の比率で加え、回転/傾斜装置において4℃で1時間インキュベーションした。インキュベーション後、ビーズ/細胞懸濁物を磁性カラムに入れ、CD4+細胞枯渇化PBLまたはCD8+細胞枯渇化PBLのいずれかを含有する貫流したもの(flow through)を集めた。細胞を、5%のFBSが補充された完全培養培地により1回洗浄し、5%のFBSを補充した完全培養培地により元の体積に再懸濁した。等体積の未分画のビーズ枯渇化PBLをELISpotアッセイでそのまま使用した。
表18:未分画のCD4+細胞またはCD8+細胞を枯渇させたPBLにおける第10週および第16週での全体的なHIV特異的IFN−γELISpot応答
表18に示される結果は、特定の誘発された免疫応答に関与するHIV特異的CTL細胞対ヘルパー細胞の相対的な百分率の推定を示す。2、3の一般的な観察をデータから引き出すことができる。第1に、群2d、群3aおよび群3cは、HIVに対する同様な強度の細胞性免疫応答を誘発している。群3aはより高レベルの免疫応答を誘発するようであり、しかし、アッセイにおける変動量もまた、その群に関してはより大きい。エレクトロポレーションを免疫化と組み合わせて使用した場合、群3cにおけるプラスミドに対する免疫応答の強度が約5倍〜約10倍高まった。表18を参照し、3cEおよび3cを比較のこと。より多くの細胞が、エレクトロポレーションを免疫化とともに使用したことの結果として免疫応答に関係していたこともまた注目に値する。
プラスミドDNAを含有する免疫原組成物(IC)は、現在使用中の免疫原組成物技術の他のタイプを上回る利点をいくつか提供する。例えば、DNAに基づくICは、タンパク質に基づく従来のサブユニットICとは対照的に、コードされた抗原が主要組織適合性複合体(MHC)クラスI抗原プロセシング経路によって効率的にプロセシングおよび提示されることを可能にする。クラスI抗原プロセシング経路は、CD8+T細胞により媒介される免疫応答の誘発のために非常に重要である。しかしながら、タンパク質に基づく従来のサブユニットICは、典型的には、抗原特異的な抗体応答を誘発するその能力に関して、DNAに基づくICよりも効率がよい。
表19:多プラスミドDNA免疫化の後での経時的なHIV−1 6106のenv gp120特異的なELISA抗体力価
表20:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的かつ全体的なHIV−1特異的ELISA抗体力価
研究で使用されたマカクにおける末梢血白血球数(WBC)を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均WBC(×1000/ml)±標準誤差として報告した。表21を参照のこと。
表21:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総WBC数(×1000)
研究で使用された動物における末梢血赤血球数(RBC)を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均RBC(×106/ml)±標準誤差として報告した。表22を参照のこと。
表22:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総RBC数(×106)
表23:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総ヘモグロビンレベル
この研究で使用された動物において測定される末梢血血小板レベルを完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均血小板レベル(×1000)±標準誤差として報告した。表24を参照のこと。
表24:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総血小板数(×1000)
表25:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおけるパーセントヘマトクリット
表26:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総リンパ球数
表27:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総CD3+Tリンパ球数
表29:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総CD3+CD8+Tリンパ球数
表30:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用での多プラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総CD20+リンパ球数
表7に記載されるプラスミドおよび免疫原組成物による多プラスミド免疫化はまた、この研究で使用された動物において、血小板数(表24)、パーセントヘマトクリット(表25)、総リンパ球数(表26)、総CD3+Tリンパ球数(表27)、総CD3+CD4+Thリンパ球数(表28)、総CD3+CD8+Tリンパ球数(表29)および総CD20+Tリンパ球数(表30)に対する有害な影響を何ら生じさせなかった。再度ではあるが、これらの分析において、総リンパ球数(表26)、総CD3+Tリンパ球数(表27)、総CD3+CD4+Thリンパ球数(表28)、総CD3+CD8+Tリンパ球数(表29)に対するポジティブな効果が、群3cEを免疫化するためにブピバカイン処方免疫原組成物と組み合わせてエレクトロポレーションを使用したときに検出された。この群において、これらのカテゴリーのそれぞれにおけるリンパ球の数が研究期間中の様々な時点で著しく上昇していた。
表31:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用での多プラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクの体重(kg)
最後に、この分析は、表7に記載されるプラスミドおよび免疫原組成物による多プラスミド免疫化がまた、この研究で使用された動物の体重(表31)に対する有害な影響を何ら生じさせなかったことを示している。
前記実施例は、全体的な免疫応答を最大限にしなければならない状況では、プラスミドあたり1つの抗原を発現する単一の転写ユニットを有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物を使用することが好都合であり得ることを示唆している。本実施例では、マウス免疫化研究を、4つのプラスミドに基づく免疫原組成物の免疫原機能性と3つのプラスミドに基づく免疫原組成物のそれとを比較するために行った。より具体的には、gag遺伝子、pol遺伝子、env遺伝子、および、nef−tat−vif遺伝子の融合体のみを含む6個のHIV−1遺伝子の発現を誘導する4つの個々のプラスミドに基づく免疫原組成物の免疫原機能性を、env遺伝子、gag−pol遺伝子の融合体、および、nef−tat−vif遺伝子の第2の融合体を含む6個のHIV−1遺伝子の発現を行わせる3つの個々のプラスミドに基づく免疫原組成物と比較した。免疫原機能性を、多重抗原特異的な細胞媒介性免疫応答をBalb/cマウスにおいて誘発する様々な3つおよび4つのプラスミドDNAに基づく免疫原組成物の相対的な能力として評価した。HIV遺伝子および配列を実施例1に記載した。群3aおよび群3cからの3つのプラスミド免疫原組成物は実施例8および実施例9に記載されるものと同じであった。表1および表32を参照のこと。
HIVのenv gp160、gag p55、pol(もしくはgag−pol融合体)またはnef−tat−vif融合タンパク質をコードするプラスミドDNA発現ベクターを実験用免疫原組成物として使用し、空の発現ベクターバックボーンをコントロールの免疫原組成物ベクターとして使用した。研究設計については下記の表32を参照のこと。様々な発現ベクターによるHIV遺伝子の発現を、ヒト横紋筋肉腫(RD)細胞の一過的トランスフェクションの後、ウェスタンブロットによって確認した。実施例4〜実施例7を参照のこと。
これらの研究のために、4週齢〜6週齢のメスのBalb/cマウスを使用した。マウスを研究室動物の管理および使用に関する指針(National Research Council、National Academic Press、Washington,D.C.、1996)に従って飼育した。加えて、マウスの使用および管理についての手順はWyeth Reseachの施設内動物管理使用委員会によって承認された。
表32.マウス研究設計−2回の免疫化
表33.2回の免疫化の後におけるマウス免疫応答
本明細書中で引用されるすべての文書は参考として援用される。方法および構成要素における様々な改変および小さな変更が当業者には明らかであると考えられる。
Claims (88)
- DNAプラスミドであって、以下:
(a)第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット;
(b)第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニット;
(c)第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニット;
を含み、
該第1のプロモーター、該第2のプロモーターおよび該第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1のポリアデニル化シグナル、該第2のポリアデニル化シグナルおよび該第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であり、かつ、該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向である、
DNAプラスミド。 - 前記第1、第2および第3のポリペプチドが真核生物細胞において発現される、請求項1に記載のプラスミド。
- 前記第1、第2および第3のプロモーターが真核生物細胞において活性である、請求項1に記載のプラスミド。
- 前記第1、第2および第3のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス(SCMV)プロモーター、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)潜伏期関連プロモーター−1(LAP1)、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、請求項1に記載のプラスミド。
- 前記第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ(A)シグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、請求項1に記載のプラスミド。
- 前記第1のプロモーターがサルサイトメガロウイルス(SCMV)プロモーターである、請求項4に記載のプラスミド。
- 前記第1のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン(BGH)のポリアデニル化シグナルである、請求項5に記載のプラスミド。
- 前記第2のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーターである、請求項4に記載のプラスミド。
- 前記第2のポリアデニル化シグナルがシミアンウイルス40(SV40)のポリアデニル化シグナルである、請求項5に記載のプラスミド。
- 前記第3のプロモーターが単純ヘルペスウイルス(HSV)潜伏期関連プロモーター−1である、請求項4に記載のプラスミド。
- 前記第3のポリアデニル化シグナルがウサギβ−グロビンのポリアデニル化シグナルである、請求項5に記載のプラスミド。
- 前記第1の転写ユニットがHIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の融合体からgag−pol融合タンパク質を発現する、請求項1に記載のプラスミド。
- HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の前記融合体、または、gag−pol遺伝子がHIVの単離体HXB2に由来する、請求項12に記載のプラスミド。
- 前記第2の転写ユニットがHIVのエンベロープ遺伝子からエンベロープタンパク質を発現する、請求項1に記載のプラスミド。
- 前記エンベロープ遺伝子がHIVの初代単離体6101に由来する、請求項14に記載のプラスミド。
- 前記第3の転写ユニットが、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体(ntv)から、nef、tatおよびvifの融合タンパク質(NTV)を発現する、請求項1に記載のプラスミド。
- HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の前記融合体、または、ntv遺伝子がHIVの単離体NL4−3に由来する、請求項16に記載のプラスミド。
- プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1に記載のプラスミド。
- 前記選択マーカーが、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子からなる群より選択される、請求項18に記載のプラスミド。
- 前記選択マーカーの存在位置が、スペーサー領域1、スペーサー領域2およびスペーサー領域3からなる群より選択される、請求項19に記載のプラスミド。
- 前記選択マーカーの存在位置がスペーサー領域2である、請求項20に記載のプラスミド。
- 細菌の複製起点をさらに含む、請求項1に記載のプラスミド。
- 前記複製起点の存在位置が、スペーサー領域1、スペーサー領域2およびスペーサー領域3からなる群より選択される、請求項22に記載のプラスミド。
- 前記選択マーカーの存在位置がスペーサー領域3である、請求項23に記載のプラスミド。
- 前記複製起点がpUCの複製起点である、請求項22に記載のプラスミド。
- 前記プラスミドの全体的なサイズが約15キロ塩基対未満である、請求項1に記載のプラスミド。
- スペーサー領域1が約400塩基対未満である、請求項1に記載のプラスミド。
- スペーサー領域2が約1100塩基対未満である、請求項1に記載のプラスミド。
- スペーサー領域3が約1100塩基対未満である、請求項1に記載のプラスミド。
- 選択された抗原に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物は、以下:
(a)DNAプラスミドであって、以下:
(i)第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、
(ii)第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニット、
(iii)第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニット、
を含み、
ここで、該第1、第2および第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であり、かつ、該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向である、DNAプラスミド;および
(b)薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む、免疫原組成物。 - 前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、請求項30に記載の免疫原組成物。
- 前記第1、第2および第3のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス(SCMV)プロモーター、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)潜伏期関連プロモーター−1(LAP1)、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、請求項30に記載の免疫原組成物。
- 前記第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ(A)シグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、請求項30に記載の免疫原組成物。
- 前記第1のポリペプチドが、HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の融合体から発現されたgag−pol融合タンパク質である、請求項30に記載の免疫原組成物。
- 前記第2のポリペプチドが、HIVのエンベロープ遺伝子から発現されたエンベロープタンパク質である、請求項30に記載の免疫原組成物。
- 前記第3のポリペプチドが、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体(ntv)から発現された、nef、tatおよびvifの融合タンパク質(NTV)である、請求項30に記載の免疫原組成物。
- 選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、
(a)DNAプラスミドであって、以下:
(i)第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、
(ii)第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニット、
(iii)第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニット、
を含み、
ここで、該第1、第2および第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であり、かつ、該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向である、DNAプラスミド;および
(b)薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む、免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。 - 前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、請求項37に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーションが、約25V/cm〜約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、請求項38に記載の方法。
- 前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、請求項37に記載の方法。
- 前記第1、第2および第3のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス(SCMV)プロモーター、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)潜伏期関連プロモーター−1(LAP1)、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ(A)シグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、請求項37に記載の方法。
- ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、
(a)HIVのgag−pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;
(b)第2のDNAプラスミドであって、以下:
(i)第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef−tat−vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、
(ii)第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットを含み、
ここで、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第2のDNAプラスミド;および
(c)薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む、免疫原組成物。 - 前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、請求項43に記載の免疫原組成物。
- 前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス(SCMV)プロモーター、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)潜伏期関連プロモーター−1(LAP1)、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群から選択される、請求項43に記載の免疫原組成物。
- 前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ(A)シグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、請求項43に記載の免疫原組成物。
- 前記第1のプラスミドにおける前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーターである、請求項45に記載の免疫原組成物。
- 前記第1のプラスミドにおける前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリAのポリアデニル化シグナルである、請求項46に記載の免疫原組成物。
- 前記第1のDNAプラスミドがHIVのgag−pol融合ポリペプチドをコードし、HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の前記融合体、または、gag−pol遺伝子がHIVの単離体HXB2に由来する、請求項43に記載の免疫原組成物。
- 前記第2のプラスミドにおける前記第1のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーターである、請求項45に記載の免疫原組成物。
- 前記第2のプラスミドにおける前記第1のポリアデニル化シグナルがSV40ポリAのポリアデニル化シグナルである、請求項46に記載の免疫原組成物。
- 前記HIV nef−tat−vif融合ポリペプチドが、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体(ntv)から発現される、nef、tatおよびvifの融合タンパク質(NTV)である、請求項43に記載の免疫原組成物。
- HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の前記融合体、または、ntv遺伝子がHIVの単離体NL4−3に由来する、請求項52に記載の免疫原組成物。
- 前記第2のプラスミドにおける前記第2のプロモーターがサルサイトメガロウイルス(SCMV)プロモーターである、請求項45に記載の免疫原組成物。
- 前記第2のプラスミドにおける前記第2のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン(BGH)のポリアデニル化シグナルである、請求項46に記載の免疫原組成物。
- 前記HIVエンベロープポリペプチドがHIVの初代単離体6101に由来する、請求項43に記載の免疫原組成物。
- 選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下:
(a)HIVのgag−pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;
(b)第2のDNAプラスミドであって、以下:
(i)第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef−tat−vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、
(ii)第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニット、を含み、
ここで、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第2のDNAプラスミド;および
(c)薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。 - 前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、請求項57に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーションが、約25V/cm〜約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、請求項58に記載の方法。
- 前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、請求項57に記載の方法。
- 前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス(SCMV)プロモーター、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)潜伏期関連プロモーター−1(LAP1)、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、請求項57に記載の方法。
- 前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ(A)シグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、請求項57に記載の方法。
- 前記第1のプラスミドにおける前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーターである、請求項61に記載の免疫原組成物。
- 前記第1のプラスミドにおける前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリAのポリアデニル化シグナルである、請求項62に記載の免疫原組成物。
- 前記第1のDNAプラスミドがHIVのgag−pol融合ポリペプチドをコードし、HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の前記融合体、または、gag−pol遺伝子がHIVの単離体HXB2に由来する、請求項57に記載の方法。
- 前記第2のプラスミドにおける前記第1のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーターである、請求項61に記載の方法。
- 前記第2のプラスミドにおける前記第1のポリアデニル化シグナルがSV40ポリAのポリアデニル化シグナルである、請求項62に記載の方法。
- 前記HIV nef−tat−vif融合ポリペプチドが、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体(ntv)から発現される、nef、tatおよびvifの融合タンパク質(NTV)である、請求項57に記載の方法。
- HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の前記融合体、または、ntv遺伝子がHIVの単離体NL4−3に由来する、請求項68に記載の方法。
- 前記第2のプラスミドにおける前記第2のプロモーターがサルサイトメガロウイルス(SCMV)プロモーターである、請求項61に記載の方法。
- 前記第2のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモン(BGH)のポリアデニル化シグナルである、請求項62に記載の方法。
- 前記HIVエンベロープポリペプチドがHIVの初代単離体6101に由来する、請求項57に記載の方法。
- ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物が、以下:
(a)HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;
(b)HIVのgag−pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;
(c)HIVのnef−tat−vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;
(d)アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;および
(e)薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む、免疫原組成物。 - 選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下:
(a)HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;
(b)HIVのgag−pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;
(c)HIVのnef−tat−vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;
(d)アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;および
(e)薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む、免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。 - 前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、請求項74に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーションが、約25V/cm〜約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、請求項75に記載の方法。
- HIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物が、以下:
(a)HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;
(b)HIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;
(c)HIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;
(d)HIVのnef−tat−vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;
(e)アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第5のDNAプラスミド;および
(f)薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む、免疫原組成物。 - 選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下:
(a)HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;
(b)HIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;
(c)HIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;
(d)HIVのnef−tat−vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;
(e)アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第5のDNAプラスミド;および
(f)薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む、免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。 - 前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、請求項78に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーションが、約25V/cm〜約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、請求項79に記載の方法。
- ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物が、以下:
(a)HIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;
(b)HIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;
(c)第3のDNAプラスミドであって、以下:
(i)第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef−tat−vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、
(ii)第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットを含み、
ここで、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第3のプラスミド;および
(d)アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;および
(e)薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む、免疫原組成物。 - 前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルス(SCMV)プロモーター、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)潜伏期関連プロモーター−1(LAP1)、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、請求項81に記載の組成物。
- 前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ−グロビンポリ(A)シグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、請求項81に記載の組成物。
- 選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下:
(a)HIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;
(b)HIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;
(c)第3のDNAプラスミドであって、以下:
(i)第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef−tat−vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、
(ii)第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットを含み、
ここで、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、
該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第3のプラスミド;および
(d)アジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;および
(e)薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つ
を含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。 - 前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、請求項84に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーションが、約25V/cm〜約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、請求項85に記載の方法。
- 前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、請求項86に記載の方法。
- 選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化するための医薬品の製造における、請求項37〜42、57〜62、65〜72、74〜76、78〜80または84〜87のいずれか1項に記載される免疫原組成物の使用。
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