JP7129335B2 - 圃場栽培植物体におけるカドミウム蓄積の低減 - Google Patents
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Description
第一の態様では、少なくとも二つの重金属ATPアーゼ(HMA)の発現または活性を少なくとも部分的に低減させた突然変異体である植物体またはその一部について説明されており、該二つのHMAは、(i)配列番号1および配列番号2に対して少なくとも65%の配列同一性を有するポリペプチド、(ii)(i)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、もしくは(iii)HMAをコードする配列番号3および配列番号4に対して少なくとも65%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、該突然変異体である植物体またはその一部は、該突然変異体である植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、対照植物体に比べて少なくとも27%の低減を示している。
よってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;好適には、配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループP/Nドメインのアミノ酸位置402または464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、;および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループにおけるアミノ酸位置265に対応する少なくとも一つの突然変異;配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループの第二細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;好適には、配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループの第二細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号4に記載された非突然変異配列のAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;配列番号4に記載された非突然変異配列のP/Nドメインの第三細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループの第二細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;好適には、配列番号4に記載された非突然変異配列のP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;配列番号4に記載された非突然変異配列のAドメインループの第二細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループの第二細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;好適には、配列番号4に記載された非突然変異配列のAドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;ならびに、配列番号4に記載された非突然変異配列のP/Nドメインの第三細胞質ループの第二細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループのP/Nドメイン第二細胞質ループの第三細胞質ループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;好適には、配列番号4に記載された非突然変異配列のP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、のうちの一つ以上を含む。
好適には、突然変異体である植物体またはその一部は、以下の突然変異のうちの一つ以上を含む:配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびW265*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびL223Fであり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびD234Nであり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびG235Eであり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびW265**であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびL223Fであり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびD234Nであり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびG235Eであり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびL223Fであり;配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびD234Nであり、*は終止コドンを表し;または、配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびG235Eであり;配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびL223Fであり;配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびD234Nであり;配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびG235Eであり;配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;または、配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびL223Fであり;配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびD234Nであり;配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびG235Eであり;配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびL223Fであり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびD234Nであり、*は終止コドンを表し;配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびG235Eであり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびW265*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびL223F であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびD234Nであり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびG235Eであり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびW265**であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびL223Fであり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびD234Nであり、*は
終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびG235Eであり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびL223Fであり;配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびD234Nであり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびG235Eであり;配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびL223Fであり;配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびD234Nであり;配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびG235Eであり;配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびL223Fであり;配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびD234Nであり;配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびG235Eであり;配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびL223Fであり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびD234Nであり、*は終止コドンを表し;配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびG235Eであり、*は終止コドンである。
本開示に記載の植物体を生成することには、数多くの利点がある。
本明細書の範囲内で使用される技術的な用語および表現には一般に、植物体および分子生物学の関連分野でそれらに共通して適用される意味が与えられる。以下の用語の定義はどれも、本明細書の全内容に適用される。「含む、備える(comprising)」という語は、それ以外の要素または工程を除外するものではなく、また不定冠詞「a」もしくは「an」は、複数であることを除外するものではない。ある一つの工程が、請求の範囲に列挙された複数の特徴の機能を実現することもある。所定の数値または範囲の文脈での「約」、「本質的に」および「およそ」という用語は、所定の値または範囲の20%以内、10%以内、または5%、4%、3%、2%または1%以内である値または範囲を意味する。
好適には、HMA4ポリペプチド変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含みうる。
さらに好適には、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置251~296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置251~296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置251または293または296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置251または293または296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、植物体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、植物体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置293に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置223~265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置293に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置223~265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置293に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドAドメインのNドメインのアミノ酸位置223、または234、または235、または265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置293に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドAドメインのNドメインのアミノ酸位置223、または234、または235、または265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループのアミノ酸位置402~464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループのアミノ酸位置402~464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループPドメインのアミノ酸位置402または464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループPドメインのアミノ酸位置402または464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインループにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号3によってコードされるP/Nドメインループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置265での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号4によってコードされるP/Nドメインループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置265での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む:(i)配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびQ561*であり、*は終止コドンを表し;(ii)配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびW265*であり、*は終止コドンを表し;(iii)配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;(iv)配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;(v)配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;(vi)配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびQ561*であり、*は終止コドンを表し;(vii)配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびL223Fであり、*は終止コドンを表し;(viii)配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびD234Nであり、*は終止コドンを表し;(ix)配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ293*およびG235Eであり、*は終止コドンを表し;または、(x)配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびW265*であり、*は終止コドンを表す。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループPドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループPドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループPドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループPドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループPドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループPドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループPドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置223に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置234に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号4によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む:(i)配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびW265**であり、*は終止コドンを表し;(ii)配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびL223Fであり、*は終止コドンを表し;(iii)配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびD234Nであり、*は終止コドンを表し;(iv)配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はQ464*およびG235Eであり、*は終止コドンを表し;(v)配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;(vi)配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびL223Fであり;(vii)配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびD234Nであり、*は終止コドンを表し;(viii)配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はE296KおよびG235Eであり;(ix)配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;(x)配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびL223Fであり;(xi)配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびD234Nであり;(xii)配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はT402IおよびG235Eであり;(xiii)配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびW265*であり、*は終止コドンを表し;(xiv)配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびL223Fであり;(xv)配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびD234Nであり;(xvi)配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はG251DおよびG235Eであり;(xvii)配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびQ561*であり、*は終止コドンを表し;(xviii)配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびL223Fであり、*は終止コドンを表し;(xix)配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびD234Nであり、*は終止コドンを表し;または(xx)配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はH438YおよびG235Eであり、*は終止コドンを表す。
特に有用なNicotiana tabacum品種には、バーレータイプ、ダークタイプ、熱風送管乾燥処理タイプ、およびオリエンタルタイプのたばこが含まれる。品種または栽培品種の非限定的な例は:BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、DF911、DT 538 LC Galpao tobacco、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、Hybrid 403LC、Hybrid 404LC、Hybrid 501 LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、Narrow Leaf Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC、’Periqe’ tobacco、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B13P、Xanthi(Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC number 2 Hybrid 49、Burley 21、KY8959、KY9、MD 609、PG01、PG04、PO1、PO2、PO3、RG11、RG 8、VA509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 2110、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havanaである。本明細書で具体的に識別されていない場合であっても、上記の低コンバーター亜種も意図されている。一実施形態では、タバコ(Nicotiana tabacum)のバーレータイプが使用される。
HMA4配列
NtHMA4.1(タンパク質配列:配列番号1、Genbank:CCQ77798.1;ヌクレオチド配列:配列番号3、Genbank:HF675181.1)、およびNtHMA4.2(タンパク質配列:配列番号2、Genbank:CCW03243.1;ヌクレオチド配列:配列番号4、Genbank:HF937054.1)
TN90(PI 543792、TC 586、USDA-GRINデータベース)、K326(PI 552505、TC 319、USDA-GRINデータベース)。AA37は、南米ダークたばこと米国バーレー種の生殖質との交雑種であると推定される。
HMA4RNAi構築物を構築するために、HMA4.1のエクソン7の配列(5’-TGAGAGCAAGTCAGGTCATCCGATGGCAGCCGCTCTGGTGGACTATGCACAATCAAATTCCGTTGAGCCAAAGCCTGATAGAGTTGAGCAGTTTCAAAATTTTCCTGGTGAAGGGATATTTGGAAGAATTGATGGAATGGAAATCTATGTCGGGAATAGGAAAATTTCTTCAAGAGCTGGATGTACCACAG-3’)をセンス方向およびアンチセンス方向で用い、隣接したイントロンの一部(5’-TAAATGGTTGAATCATTTCTTATGCTCATAGTAGAGATAAAACATCAGA GTTATAATTATAAGTATATGATTTCTCCAGTTAATTTTGCTGTTAGATTTTCTTTGACCTGTTTAGCACTAATGCGGTGGATGTTTGAAT-3’)をヘアピンループとして使用する。構築物を、Geneart(Invitrogen、Life Technologies、ドイツ、レーゲンスブルク)によって、Gatewayサイトを用いて設計し、合成する。続いて、それをGateway技術を用いて発現ベクターに移入し、対応する酵素(Invitrogen、Life technologies、米国カリフォルニア州カールズバッド)に移入する。アグロバクテリウムチュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を、発現ベクターと共に形質転換し、前述した方法(Horsch et al.,1985)を用いてたばこ葉ディスク形質転換用に使用する。T0一次形質転換体を土壌で栽培し、その根をHMA4発現に関して分析する。最良性能系統(HMA4の発現が最小)を特定し、T1世代植物体と野生型植物体とを寒天培地で栽培し、全根をHMA4発現に関して再度分析する。
突然変異体の母集団を、突然変異誘発物質であるエチルメタンスルホン酸(EMS)を用いてたばこAA37種子を処理することによって作製する。約9’800M2世代EMS処理植物体(1050M1世代変異体の分離子孫を表す)のDNAライブラリを、二つのHMA4遺伝子における突然変異についてスクリーニングする。5個のアンプリコンを配列決定し、それぞれHMA4.1およびHMA4.2において突然変異について分析する。以下のプライマー対を増幅に用いる:HMA4.1-エクソン1:順方向プライマー5’-GCATGTTCTTATAAGAGAAACTC-3’、逆方向プライマー5’-GTGAATTTATTTAACAAGCCACA-3’;HMA4.1-エクソン2:順方向プライマー5’-CCAAAATTGTTTCTGCTTCTCC-3’、逆方向プライマー5’-CGTCATATAAATTGGGACAAAAG-3’;HMA4.1-エクソン4/5:順方向プライマー5’-GTGTCTTTATTTTCTCACTGATA-3’、逆方向プライマー5’-TAGTGACGTGATTCATAAGACAA-3’;HMA4.1-エクソン6:順方向プライマー5’-ATCAGTCCTTTCACTTGACCC-3’、逆方向プライマー5’-AACCATTAGAGCCATTTCAGAA-3’;HMA4.1-エクソン7/8:順方向プライマー5’-GATACTGCAATACAAAAGCACAT-3’、逆方向プライマー5’-CACTTACTTGGTAATACGTTCT-3’;HMA4.2-エクソン1:順方向プライマー5’-TTGCTACTCTGGGTTGCTAC-3’、逆方向プライマー5’-TCAAGTTTAAAGTTTGCTTCTAC-3’;HMA4.2-エクソン2:順方向プライマー5’-TGTGCATACATAACGTAAATCG-3’、逆方向プライマー5’-ATCAAATACCACATAAGTAGGG-3’;HMA4.2-エクソン4/5:順方向プライマー5’-TTTAGTCACTTTGACATAAATGG-3’、逆方向プライマー5’-AAGACAGAGAACAAGTTCACAT-3’;HMA4.2-エクソン6:順方向プライマー5’-TCAGTCCTTTCGCTTGACCT-3’、逆方向プライマー5’-GAGAATGTGGTACTCGCAAG-3’;HMA4.2-エクソン7/8:順方向プライマー5’-ATACATTGAGGACACATAATCG-3’、逆方向プライマー5’-TATACCCCATTCTGACCCTTG-3’。増幅産物を、ABI XL3730(Applied Biosystems、Life Technologies、米国カリフォルニア州フォスターシティ)でサンガー法に従って配列決定する。同様に、HMA4.2-エクソン6を除いた増幅プライマーを用いて配列決定するが、そこではネステッド逆方向プライマー5’-TTATGAATATATGCTACAAATCAC-3’を用いて配列決定する。タンパク質機能に影響を及ぼす突然変異体系統を選択するために、ミスセンス突然変異だけではなく停止突然変異も選択する。
以下の溶液を肥料として用い、全ての溶液はYara Benelux B.V.(オランダ、ヴラールディンゲン)から購入している:「熱風送管乾燥型」:多量要素:666.5mg NO3-l-1、18mg NH4+l-1(総計165.39mg Nl-1)、88.78mg P2O5l-1、306.25mg K2Ol-1、49.99mg Mgl-1、185.61mg Cal-1、369.60mg SO42-l-1;微量要素:0.839mg Fel-1、0.549mg Mnl-1、0.262mg Znl-1、0.216mg Bl-1、0.048mg Cul-1、0.048mg Mol-1。「バーレー種」:多量要素:850.3mg NO3-l-1、18.5mg NH4+l-1(総計207.35mg Nl-1)、91.31mg P2O5l-1、383.65 mg K2Ol-1、49.99mg Mgl-1、185.61mg Cal-1、369.60mg SO42-l-1;微量要素:0.839mg Fel-1、0.549mg Mnl-1、0.327mg Znl-1、0.324mg Bl-1、0.048mg Cul-1、0.048 mg Mol-1。HMA4 RNAi系統を、「熱風送管乾燥型」または「バーレー種」の溶液のいずれかを用いて二つの並列実験で施肥する。溶液中の硝酸塩含有量は様々であるが、これがCdレベルまたはHMA4表現型に差次的影響を及ぼすことはない。(本研究で示すデータは「熱風送管乾燥型」溶液で施肥した植物体から得られるものである)。AA37系統を、「バーレー種」溶液で施肥する。Znの添加に関しては、Znの0.1gを、ZnSO4.H2O(Landor、スイス、ビルスフェルデン)の形態で100mlの水に希釈して適用する。全ての植物体を、10Lの鉢にて明:暗サイクルを16時間:8時間として栽培する。
圃場試験をスイス(ヴォー州)の圃場で行う。全ての植物体を浮遊トレイに植え付け(農業慣行に従って)、温室で栽培してから移植する。植物体を遺伝子型分類毎に分ける。植物を圃場で6回反復される実験単位に分類する。一年目に、それぞれの突然変異の組み合わせに関して、ホモ接合状態で両方の突然変異を保有する10個の植物体を、HMA4.1の突然変異に対してのみホモ接合である10個の植物体と、HMA4.2の突然変異に対してのみホモ接合である10個の植物体と、HMA4遺伝子の両方に対してヌル分離植物体である10個の植物体とに隣接して栽培する。二重ナンセンス突然変異体については、以下の二つの他の遺伝子型も(3個の複製物中に)含まれる:HMA4.1に対してホモ接合ナンセンス突然変異体であり、かつHMA4.2に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体である10個の植物体と、HMA4.2に対してホモ接合ナンセンス突然変異体であり、かつHMA4.1に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体である10個の植物体とであり、後者の群は、一つの機能的非突然変異対立遺伝子のみを含んでいる。二年目に、それぞれの突然変異の組み合わせに関して、ホモ接合状態で両方の突然変異を保有する20個の植物体を、HMA4遺伝子の両方に対してヌル分離植物体である20個の植物体に隣接して栽培する。圃場を標準的慣行に従ってバーレー種栽培に対して施肥する。
RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen、ドイツ、ヒルデン)を用いて、全RNAをたばこから抽出する。RNAをRQ1 RNase-free DNase(Promega、米国ウィスコンシン州マディソン)を用いて消化し、オリゴdT17プライマー、dTNP、RNasin Plus RNase InhibitorおよびM-MLV Reverse Transcriptase、RNase(H-)、Point Mutant(全てPromega製、米国ウィスコンシン州マディソン)を用いて逆転写する。qRT-PCRをMx3005Pシステム(Stratagene、Agilent、ドイツ、ヴァルトブロン)で実施する。SYBR 2ステップqRT Low Rox(Thermo Scientific、英国サリー)を使用して、HMA4.1順方向プライマー(5’-TCATGCAGAAATAAGAAGTGCCAG-3’)およびHMA4.1逆方向プライマー(5’-ATGGATGCTTAGAGAGTCCAGGA-3’)、またはHMA4.2順方向プライマー(5’-GTTATGCGGAAATAAGAAGTGCCTA-3’)およびHMA4.2逆方向プライマー(5’-CATGGATGCTTAGAGAGTCCAGAC-3’)を用いて増幅反応を行う。内部標準として、actin9遺伝子を、順方向プライマー(5’-CTATTCTCCGCTTTGGACTTGGCA-3’)および逆方向プライマー(5’-AGGACCTCAGGACAACGGAAACG-3’)と共に使用する。
葉の試料を、BioSprint 96 DNA Plant Kit(Qiagen、ドイツ、ヒルデン)と合わせたBioSprint 96(Qiagen、ドイツ、ヒルデン)を用いて抽出する。植物体の遺伝子型を求めるために、DNA試料をTaqMan反応に用いる。TaqManを、ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems、Life Technologies、米国カリフォルニア州フォスターシティ)と、TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems、Life Technologies、米国カリフォルニア州フォスターシティ)とを用いて行う。以下のTaqManプライマー(Microsynth、スイス、バルガッハ)とプローブ(Applied Biosystems、Life Technologies、英国ウォリントン)とを用いる:HMA4.1 Q293*:突然変異体プローブ5’-AGGATGGCATAGCT-3’、野生型(WT)プローブ5’-AGGATGGCACAGCT-3’、順方向プライマー5’ CTGGCACTACAAATCTAAATGGTAGTATAGTATTT-3’、逆方向プライマー5’-CTGGTGTATAATATTTAGCACACTTGTCG-3’;HMA4.1 E296K:突然変異体プローブ5’-CACAGCTTGTCAAAG-3’、WTプローブ5’-CACAGCTTGTCGAAG-3’、順方向プライマー5’-CTGGCACTACAAATCTAAATGGTAGTATAGTATTT-3’、逆方向プライマー5’-CTGGTGTATAATATTTAGCACACTTGTCG-3’;HMA4.1 T402I:突然変異体プローブ5’-TTTGACAAAACAGGGATTA-3’、WTプローブ5’-TTTGACAAAACAGGGACTA-3’、順方向プライマー5’-CCATGTGTTGCGCACTTTCA-3’、逆方向プライマー5’-AACTCGGTCACCATAAATTCTCCTT-3’;HMA4.1 G251D:突然変異体プローブ5’-AGAAAACACTGACAGACG-3’、WTプローブ5’-AAAACACTGACAGGCG-3’、順方向プライマー5’-AAGTCGTAAATGTTGATGAAGTCAAGG-3’、逆方向プライマー5’-CAGCCCAGACCGTTGAATCTC3’;HMA4.1 V351M:突然変異体プローブ5’-CTTTGGTCACATTGATGA-3’、WTプローブ5’-TTGGTCACATTGGTGAGT-3’、順方向プライマー5’-GGCTATATCAGCTTCTTTGGCAATT-3’、逆方向プライマー5’-AACACATGGCAACTGGTGTAGATAGA-3’;HMA4.1 G382R:突然変異体プローブ5’-TTCTGTTTAAAAGAGCAGAG-3’、WTプローブ5’-TCTGTTTAAAGGAGCAGAGTA-3’、順方向プライマー5’-CCATGTGTTGCGCACTTTCA-3’、逆方向プライマー5’-AACTCGGTCACCATAAATTCTCCTT-3’;HMA4.2 W265*:突然変異体プローブ5’-ATAGATTCAACGGTCTAGG-3’、WTプローブ5’-TTCAACGGTCTGGGC-3’、順方向プライマー5’-GGTGAAACTATACCTATTGATGGAGTTGTAA-3’、逆方向プライマー5’-CACTAAATAAATGAAGCATGAAGGAATACTAC-3’;HMA4.2 Q561*:突然変異体プローブ5’-CAACCATGTGTAGGAT-3’、WTプローブ5’-TGCCAACCATGTGCAG-3’、順方向プライマー5’-TTGGTGTAAAAGAAGCAATGAGAGAG-3’、逆方向プライマー5’-ATCATTTCAGCGTATTGCAGAATTT-3’。
収穫時に、成熟植物体の中央部より低い茎位置から収穫し、各圃場区画に対するプール試料にする(1個の植物体当たり1枚の葉)。個々の温室植物体から、中央部より低い茎位置の2枚の葉(全ての植物体に対して同じ葉位置)を収穫する。収穫された材料を、オーブンにて60℃で完全に乾くまで乾燥する。
突然変異耐性スコアを、UniProtの植物体配列データベース(2012年12月30日にダウンロード)に基づいてSIFTソフトウェア(Ng and Henikoff,2003)を用いて算出する。RNA-seqライブラリをIllumina TruSeq RNA Sample Prep Kitを用いて作製し、Illumina HiSeq-2500で配列決定する。塩基呼び出し(base calling)および試料の逆多重化を、Illumina HiSeq Control SoftwareおよびCASAVAパイプラインソフトウェアを用いて行う。読み取りデータを、Tophat2ソフトウェア(Kim et al.2013;version 2.0.11)を用いてこれまでに公表されたゲノム(Sierro et al.,2014)にマッピングする。差次的遺伝子発現をCuffdiff(Trapnell et al,2013、バージョン2.2.1)を用いて計算する。
分析値がLOQを下回る場合、LOQ値が計算およびグラフ表示用に考慮される。有意性の評価には、両側t検定を、分散の不均一性に対してサタースウェイトの修正を用いて行う。圃場実験については、比率に関する対応のあるt検定を突然変異体区画および対応する対照区画に対して行った。測定不確かさ(20%)未満での有意なCd/Zn低減を判定するために、未加工のp値を計算して、偶然に平均値(突然変異体)<0.8*平均値(対照)となる確率を求めた。
アラビドプシストランスポーターHMA2、HMA3、およびHMA4は近縁である。HMA2およびHMA4はZnおよびCdの根から苗条までの転流に関与する一方(Wong and Cobbett,2009)、HMA3は、Zn、Cd、Co、およびPbの根液胞貯蔵によるCd蓄積に関与している(Gravot et al.,2004;Morel et al.,2009)。アラビドプシスの配列に基づいて、たばこゲノムを、推定AtHMA2/3/4オルソログについてスクリーニングし、HMA4の二つのホモログであるHMA4.1およびHMA4.2(それぞれN.sylvestrisおよびN.tomentosiformisに由来)をN.tabacumにおいて見出す。
NtHMA4たばこ遺伝子がCdを低減させる標的となる可能性を評価するために、RNAi構築物を両方のNtHMA4ホモログに対して設計する。DNA断片を、構成的MMVプロモーターの制御下で二成分ベクターにクローニングし(Dey and Maiti,1999)、上述の二つの栽培品種であるTN90およびK326内に形質転換する。各々のたばこタイプに対して、RNAi系統を、HMA4ホメオログ両方の発現の低減に基づいて選択する(図2)。1系統当たり5個の植物体と、その各々の非形質転換対照とを、Znの補充の有り無し両方で土壌にて栽培する。
たばこ育種用に、栽培品種AA37のEMS母集団をHMA4における突然変異についてスクリーニングする。AA37は、南米ダークたばこと米国バーレー種の生殖質の交雑由来の栽培品種であり、それ故にK326よりもTN90に近いものである(Fricano et al.,2012)。比較可能な発現プロファイルによると、HMA4ホメオログの両方(図1および図2)が根から苗条までのZnおよびCdの転流に関与していることが示唆される。このため、触媒作用的に重要なドメインをコードするエクソンを、HMA4コピーの両方において点突然変異についてスクリーニングする。NtHMA4.1およびNtHMA4.2において特定されるアミノ酸の置換全てを、SIFTプログラムを用いて、タンパク質機能に及ぼしうる影響について分析する(Ng and Henikoff,2003)。小さいSIFTスコア(<0.05)は、アミノ酸残基が機能的レベルで許容されない可能性があることを意味する。NtHMA4.1およびNtHMA4.2において、それぞれ36個および33個の突然変異が特定され、ホメオログの各々には2個のナンセンス突然変異、およびSIFTスコア比が0.05未満の各ホメオログには15個のミスセンス突然変異が含まれている(表10)。SIFTスコアを、突然変異の選択を容易にするツールとして用いている。
温室データを確証するために、二つの圃場実験をカドミウムが中程度の条件下で行う。第一の実験では、同一の遺伝子型群(単一突然変異体、二重突然変異体、および対照植物体)を6箇所の複製区画で栽培する。各複製単位は、それぞれ二重突然変異体、HMA4WT対照、および二つの単純突然変異体の10個の植物体を含む。二重ナンセンス突然変異体については、一つの機能的非突然変異対立遺伝子を含む他の二つの遺伝子型(HMA4.1に対してホモ接合ナンセンス突然変異体/HMA4.2に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体、およびHMA4.1に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体/HMA4.2に対してホモ接合ナンセンス突然変異体)が含まれる。植物体をスイスの圃場で14週間栽培する。植物体表現型を調べ、中間部の茎位置で葉を収穫し、乾燥して、Cd/Zn分析を行う。p値を計算して、突然変異体のCdが対照に比べて偶然に20%超低減するのが観測される確率を求める。
二つの小圃場試験において、5組の有望な低Cd突然変異の組み合わせ(二重ナンセンス突然変異の組み合わせQ293*/Q561*、ならびに組み合わせQ293*/G235E、E296K/Q561*、T402I/Q561*、およびG251D/Q561*)と、それぞれの対照とを、Cd含有量が高いとわかっている二つの領域で栽培する。Cd/Znデータを表6に示し、Cdデータと表現型データのグラフを図8に示す。対照植物体は約3ppmのCdを蓄積する一方、突然変異の組み合わせQ293*/Q561*、Q293*/G235E、E296K/Q561*、およびT402I/Q561*に対しては、Cd含有量は、第一の領域(圃場3)および第二の領域(圃場4)において、それぞれ80%以上および90%以上減少している。組み合わせG251D/Q561*に関しては、Cd低減率は、両方の圃場箇所で約45%である。全ての系統に対して、平均値が20%未満となる確率は有意である(p<0.05、最大p値=0.0068)。葉重量に及ぼすいかなる影響も観察されていない(図8b)。
本明細書に記載のHMA4RNAi系統およびHMA4二重ナンセンス突然変異体において、葉のCdを10倍超低減でき、これは、たばこにおける根から苗条までのCdの移動がHMA4に本質的に依存することを示している。両方のHMA4遺伝子における突然変異が、低Cdのたばこ向けに繁殖することが必要になる。温室と圃場の両方の条件下で、HMA4二重ナンセンス突然変異体は90%のCd低減を示している。評価した全てのCd条件下で、HMA4遺伝子のうちのただ一つにおけるナンセンス突然変異は、たばこ植物体のCd含有量を低減させることができない。
HMA4ダブルノックアウトの表現型に及ぼす影響を最小化するために、第二の突然変異をHMA4遺伝子のうちの一つにおいて特定する。この目的は、様々な選択肢の中のかかる組み合わせを育種する場合に、それが植物体の表現型に影響を及ぼさずに、有意にCdを低減させるのに十分となることである。AA37のEMS突然変異体バックグラウンドでは、特に初期栽培段階では影響が見られるが、後期段階では生長およびバイオマスへのいかなる影響も観察することができない。しかしながら、関心対象品種のHMA4RNAi系統のデータ(図3)によると、特にバーレー品種において、生長への悪影響が生じる場合がある。
二重突然変異体E296K/Q561*およびQ293*/G235Eは、初期段階でダブルノックアウト突然変異体と同様の表現型(壊死性病変、生長の抑制)を示す一方、T402I/Q561* 突然変異体である植物体は良好な生長を示し、初期段階の葉には壊死部分が見られない。組み合わせG251D/Q561*は、30~70%のCd低減と、対照とは区別できない表現型とを提示している。さらなる二つの突然変異の組み合わせ(Q293*/L223FおよびQ293*/D234N)のみが少ないCd低減(一圃場試験でそれぞれ37%および27%)を示している。
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配列番号1
タバコ(Nicotiana tabacum)重金属ATPアーゼ(NtHMA4.1)GenBank登録番号 CCQ77798のアミノ酸配列。
1 MVESEKMNET KKLSKSYFDV LGICCTSEVV LVEKILKNLE GVKEVSVIVT TKTVIVIHDS
61 LLISPQQIVK ALNQARLEAS IRVKGEKNYQ KKWPSPFAIG SGILLGLSFL KYFFAPFQWL
121 ALAAVAVGIP PIIFRGVAAV RNLTLDINIL VLIAVAGSIV LHDYWEAGTI VFLFAIAEWL
181 ESRASHKATA AMSSLVNIVP PTAVLAESGE VVNVDEVKVN SILAVKAGET IPIDGVVVEG
241 ECDVDEKTLT GESFPVSKQR DSTVWAGTTN LNGYISVKTT ALAEDCAVAR MAQLVEDAQN
301 KKSKTQRYID KCAKYYTPAI VAISASLAIV PTALRVHNRN EWYRLALVTL VSACPCALVL
361 STPVAMCCAL SKAATSGLLF KGAEYLETLA KIKIMAFDKT GTITKGEFMV TEFKSLIDGF
421 SLNTLLYWVS SIESKSGHPM AAALVDYAQS NSVEPKPDRV EQFQNFPGEG IFGRIDGMEI
481 YVGNRKISSR AGCTTVPEIE GDSFKGKSVG YIFLGSSPAG IFSLSDVCRI GVKEAMRELK
541 QMGIKTAMLT GDCYAAANHV QDQLGGALDE FQAELLPEDK ATIIKGFQKE APTAMIGDGL
601 NDAPALATAD IGISMGISGS ALAKETGHVI LMTNDIGRIP KAARLARRVR RKIVENMIIS
661 VVTKAAIVAL AIAGYPLVWA AVLADTGTCL LVILNSMLLL RGGTRRHGKK CWRSSTPSHA
721 PHHKDKASCC KSENAPQLCC SDIESQKKCT SQSCSSEVCV PRCQPVSSGS KSCGNNQCPD
781 SIENSGFHSH RRPQCCSSKM AAKACQSAVS ESKSCGNNQC PDSVENSGFH SHPRPECCSS
841 KMAAKACQSA VSESKSCGNN QCPDSVENSG FHSHPRPQCC SSKMAAKAGQ SALSESKSCG
901 NNNCSDSIHK SNCHSLTNSL VCSSKMSAPQ CHSATSSNKS CGSTKCSDFS DKKCCQSDKI
961 PQTCSTKKSA PGCQSAVSGS KSCGNSKCSD SKDNSSHPSH PDHQTCMSKL CAPQSQSATS
1021 SSRTCGNTKC SDTNSKNSCY SQTNSESCSS KMSGPSCKTA NSGSRSCRNK KCQDSATENS
1081 FHSPLTNPLS GEKLSEQKSL DLVRKDKESS HDLRHGCSDE EHDHTNLDKA YDSCALQECC
1141 YSVQGNKTDV SETGIQETAH CDSTNQTCQT ASSGSMTCGN DKILDSLSIH GCHSHDNPLH
1201 EENNLEQKIL DVVGEGIKSP HAVGHGCSDK EHDHSHPEKA YDSCATDDCC FSVQVHGIDD
1261 VSKSEIQETA HCDSTKQSMV ISSSCKHEPK DQVNHCGLHS KTTPTDEELA KLVRRCCKYK
1321 PCHDVRSGCR KHAAECGPTV RSTINILRDN HHHYLDCSGR KVCSLLEKRH IGGCCDSFRK
1381 ECCAKKKHLG ASFGGGLSEI VIE
タバコ(Nicotiana tabacum)重金属ATPアーゼ(NtHMA4.2)GenBank登録番号 CCW03243.1のアミノ酸配列。
1 MVESEKMNDT KNLSKSYFDV LGICCTSEVV LVEKILKNLE GVKEVSVIVT TKTVIVIHDS
61 LLISQQQIVK ALNQARLEAS IRVKGEKNYQ KKWPSPFAIG SGILLGLSFL KYFFAPFQWL
121 ALAAVAVGIP PIIFRGVAAV RNLTLDINIL VLIAVTGSIV LHDYWEAGTI VFLFTIAEWL
181 ESRASHKATA AMSSLVNIVP PTAVLAESGE VVNVDEVKLN SILAVKAGET IPIDGVVMEG
241 ECDVDEKTLT GESFPVSKQI DSTVWAGTTN LNGYISVKTT ALAEDCAVAR MAQLVEDAQN
301 KKSKTQRYID KCAKYYTPAI VAISASLAIV PTALRVHNRN EWYRLALVTL VSACPCALVL
361 STPVAMCCAL SKAATSGLLF KGAEYLETLA KIKIMAFDKT GTITRGEFMV TEFKSLVDGL
421 GLNTLLYWVS SIESKSGHPM AAALVDYAQS NSVEPKPDRV EQFQNFPGEG IFGRIDGMEI
481 YVGNRKISSR AGCTTVPEIE GDSFQGKSVG YIFLGSSPAG IFGLSDVCRI GVKEAMRELK
541 QMGIKTAMLT GDCYAAANHV QDQLGGAMDE FQAELLPEDK ATIIKGFQKE APTAMIGDGL
601 NDAPALATAD IGISMGISGS ALAKETGHVI LMTNDIGRIP KAARLARRVR RKIVENMIIS
661 VVTKAAIVAL AIAGYPLVWA AVLADTGTCL LVILNSMLLL RVGTHRHGKK CCRSATPSHA
721 PNHKDKASCC KSENAPQLCC SDIESQKKCT SQSCSSEVCV PRCQPVSSGS KSCGNNQCPD
781 SVENSGFHSH PRPQCCSSKM ASKACQSAVS ESKSCGNNQC PDSVENSGFH SHPRPQCCSS
841 KMASKACQSA VSESKSCGNN QCPDSVENSG FHSHPRPQCC SLKMASKACQ SAVSESKSCG
901 NNQCPDSVEN SGFHSHPRPQ CCSSKMAAKA CQSAVSESKS CGNNNCSESI YKSSCHSLTS
961 SLVCSSKMSA PQCHSATSSS KSCGSTKCSN FSDKKCCQYD KIPQTCSTKK SAPGCQSAVS
1021 GSKSCGDSKC SDSKDNSSHP SHPDHQICTS KLCAPQSQSA TSSSRTCGNM KCSDTNSKNS
1081 CYSHTNSESC SSKMSGPACK TANSGSRLCG NKKCLDSANE NSFHSLTNPL CEEKLLEKES
1141 LDLARKDRES NHDLSHGCSD EEHDHLNLDK AHDSCALQEC CYSVQGNKTD VSETGIQEAA
1201 HCDSINQTCQ TAISGSMTCG NNKSLDSLSI HGCHSHDSPL HKESNLEQKS LDVAGEGIKS
1261 PHAVGQGCSD KEHNHSHPEK AYDSCATDDC CFSVQVHGID DVSRSEIQET AHCDSTKQST
1321 VIPSSCEHEP KDQVNHCGSH SKSIPTDEEL AKLVRRCCKY KPCHDVRSGC RKHAAECGPT
1381 VRSTINILRD NHHHHLDCSG RKVCSLLEKR HIGGCCDSFR KECCAKNNHL GASFGGGLSE
1441 IVIE
タバコ(Nicotiana tabacum)重金属ATPアーゼ(NtHMA4.1)GenBank登録番号 HF675181.1のポリヌクレオチド配列。
1 agagaaggag aaaaatggtg gaaagtgaaa aaatgaatga aacaaagaag ttgagcaaga
61 gctattttga tgttttggga atttgctgta cttcagaagt tgttctagtt gaaaaaattc
121 tcaagaatct tgaaggggtt aaagaggttt cagtaattgt cacaacaaag actgtcattg
181 ttattcatga ttctcttctc atttctccgc aacaaattgt taaagcattg aatcaagcaa
241 gattagaagc aagcataaga gtgaaaggag agaaaaacta ccaaaagaaa tggccaagtc
301 catttgcaat tggcagtgga atattgcttg gactctcatt tttgaagtac ttttttgcac
361 ctttccaatg gttagcactt gcagctgttg cagttgggat tcctccaatt atttttagag
421 gtgtggctgc cgtgcgaaac ctcactcttg acatcaacat tcttgtttta atagcagtgg
481 ctggatcaat tgttttacac gattattggg aagctggtac tattgtcttc ttattcgcca
541 ttgcagaatg gctagagtca agggcaagtc acaaggctac cgctgctatg tcatcactgg
601 tcaatatagt ccctccaaca gcagttttag ctgaaagcgg agaagtcgta aatgttgatg
661 aagtcaaggt gaatagcatt cttgctgtga aagctggtga aactatacct attgatggag
721 ttgtagtgga aggggaatgt gacgtggacg agaaaacact gacaggcgag tcgtttccag
781 tttctaagca aagagattca acggtctggg ctggcactac aaatctaaat ggctatatca
841 gtgttaagac tacggctttg gctgaagatt gtgcggtggc taggatggca cagcttgtcg
901 aagatgctca gaacaagaaa tcaaaaaccc aaagatacat cgacaagtgt gctaaatatt
961 atacaccagc aattgtggct atatcagctt ctttggcaat tgttcctact gcattaagag
1021 ttcacaatcg aaatgaatgg tatcgcttgg ctttggtcac attggtgagt gcatgtccgt
1081 gtgcacttgt tctatctaca ccagttgcca tgtgttgcgc actttcaaaa gcagcaacgt
1141 ccggtcttct gtttaaagga gcagagtacc ttgagactct agctaaaatc aaaatcatgg
1201 cttttgacaa aacagggact ataactaaag gagaatttat ggtgaccgag ttcaagtctc
1261 tgattgatgg ttttagtctc aatacactgc tttactgggt ttcaagcatt gagagcaagt
1321 caggtcatcc gatggcagcc gctctggtgg actatgcaca atcaaattcc gttgagccaa
1381 agcctgatag agttgagcag tttcaaaatt ttcctggtga agggatattt ggaagaattg
1441 atggaatgga aatctatgtc gggaatagga aaatttcttc aagagctgga tgtaccacag
1501 taccagaaat agagggtgat agtttcaaag gaaagtctgt tggatacata tttttgggat
1561 catctccagc tggaattttc agtctttccg atgtttgtcg aattggtgta aaagaagcaa
1621 tgagagaact gaagcagatg ggtatcaaaa ccgcgatgct tactggtgat tgttatgcag
1681 ctgccaacca tgtgcaggat cagttaggtg gagctttgga tgaatttcaa gcagaactcc
1741 taccagagga caaggcaaca atcatcaagg gttttcagaa ggaagctcca acagcgatga
1801 taggcgacgg ccttaatgat gctcctgcat tagcaacagc tgacattggc atctcaatgg
1861 gcatctctgg gtcagctctc gctaaagaaa caggccatgt tatactaatg acaaatgaca
1921 tcggaagaat accgaaagct gcacgtcttg ctagaagagt tcgaaggaag attgttgaga
1981 atatgattat atcagtcgtt acaaaggctg ccatagttgc attggcaata gcaggttatc
2041 cattggtttg ggctgctgtc ctcgcagata ctgggacatg cttgctagtg attttgaaca
2101 gcatgctact tctacgagga ggcacacgca gacatgggaa aaaatgttgg agatcttcta
2161 ctccttcgca tgctccccac cacaaagaca aagcttcatg ttgcaagtcg gaaaatgctc
2221 cccagctgtg ttgctctgat attgagtcac aaaagaaatg tacaagtcaa tcatgctcgt
2281 ccgaggtgtg tgttccaaga tgtcaacctg tctcctcagg atcaaagtca tgtggaaata
2341 atcagtgccc agactccatt gaaaatagtg gttttcattc tcatcgccgt cctcaatgct
2401 gctcgtcgaa gatggctgct aaagcatgcc aatctgcagt ttcagaatca aagtcatgcg
2461 gaaataatca gtgcccagac tccgttgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgtcctg
2521 aatgctgctc gtcgaagatg gctgctaaag cgtgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt
2581 catgtggaaa taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc
2641 gtcctcaatg ctgttcatcg aagatggctg ctaaagcagg ccaatctgca ctttcagaat
2701 caaagtcatg tggaaataac aattgctcag actccattca caagagtaat tgtcattctt
2761 taactaactc tctagtatgt tcttccaaga tgtctgctcc acaatgtcat tctgctactt
2821 caagcaacaa atcatgtgga agtaccaagt gctccgactt cagtgacaaa aaatgttgtc
2881 aatccgacaa aattcctcaa acgtgctcta ccaagaagtc tgctccagga tgtcaatctg
2941 cagtttctgg gtctaaatca tgtggaaata gcaagtgttc agactcaaaa gacaatagta
3001 gccatccttc acatcccgat catcaaacat gcatgtctaa gttgtgtgct ccacaaagcc
3061 aatctgcaac ttcaagctcc aggacatgtg gaaatacaaa gtgctcggac accaatagca
3121 agaattcttg ttattcacaa accaactctg aatcatgctc ttcaaagatg tctggtccat
3181 catgcaaaac tgctaattca ggttcaaggt catgcagaaa taagaagtgc caggactctg
3241 caaccgagaa cagttttcat tcaccactta ctaatccact cagtggggaa aagctttcgg
3301 agcagaaaag cttggattta gtccgaaaag ataaggaatc aagtcatgat cttcgtcatg
3361 gctgctctga cgaggaacat gatcatacaa atttagacaa ggcatatgac agttgtgcct
3421 tacaagaatg ttgttattcg gttcaaggca ataaaactga tgtatcagaa actggaatcc
3481 aggaaactgc tcattgtgac agcaccaatc aaacatgcca aactgcaagt tcaggatcga
3541 tgacatgcgg aaatgataag atcctggact ctctaagcat ccatggttgt cattcgcatg
3601 ataatccact ccacgaggag aacaacttgg agcagaaaat cttggatgtt gttggagaag
3661 gtataaaatc acctcatgct gtcggtcatg gctgttcgga caaggaacac gatcactcac
3721 atccagaaaa ggcatatgac agttgtgcaa cagatgattg ttgtttttca gttcaagtcc
3781 atggcattga cgacgtatca aaaagtgaaa ttcaagaaac tgctcattgt gacagcacaa
3841 agcagagcat ggtcatctcc agcagctgca aacatgaacc aaaagatcag gtaaatcact
3901 gtggacttca ctctaaaact actccaactg atgaagaact agccaagctg gttagaagat
3961 gctgcaaata caaaccatgc cacgacgtcc gttctggctg caggaagcat gctgcagaat
4021 gtggtccaac cgttcgatca accatcaata tcttacggga caaccatcat cattacctag
4081 actgcagtgg tcgtaaggtt tgttcgctgt tggagaagag acacatcggt ggatgctgtg
4141 acagcttcag aaaagaatgt tgtgccaaga aaaaacacct tggagcaagt tttggaggag
4201 gtttatcaga aattgtcata gagtagatgc aatccgaagt gtacat
タバコ(Nicotiana tabacum)重金属ATPアーゼ(NtHMA4.2)GenBank登録番号 HF937054.1のポリヌクレオチド配列。
1 atagaaagaa gagaatggtg gaaagtgaga aaatgaatga cacaaagaat ctgagcaaga
61 gctattttga tgttttggga atttgctgta cttcagaagt tgttcttgtt gaaaaaattc
121 tcaagaatct tgaaggggtt aaagaggttt cagtaattgt cacaacaaag actgtcattg
181 ttattcatga ttctctcctc atttctcagc aacaaattgt taaagcattg aatcaagcaa
241 gattagaagc aagtataaga gtgaaaggag agaaaaacta ccaaaagaaa tggccaagtc
301 catttgcaat tggcagtgga atattgcttg gactctcatt tttgaagtac ttttttgcac
361 ctttccaatg gttagcactt gcagctgttg cagttgggat tcctccaatt atttttaggg
421 gtgtggctgc cgtgcgaaac ctcactcttg acatcaacat tcttgtttta atagcagtga
481 cgggatcaat tgttttacac gattattggg aagctggtac tattgtcttc ttattcacca
541 ttgcagaatg gctagagtca agggcaagtc acaaggctac tgctgctatg tcatcactgg
601 tcaatatagt ccctccaaca gcagttttag ctgaaagtgg agaagtcgta aatgttgatg
661 aagtcaagtt gaatagcatt cttgctgtta aagctggtga aactatacct attgatggag
721 ttgtaatgga aggggaatgt gacgtggacg agaaaacact gacaggcgag tcgtttccag
781 tttctaagca aatagattca acggtctggg ctggcactac aaatctaaat ggctatatca
841 gtgttaagac tacggctttg gctgaagatt gtgcggtggc taggatggcg cagcttgtcg
901 aagatgctca gaacaagaaa tcaaaaaccc aaagatacat tgacaagtgt gctaaatatt
961 atacaccagc aattgtggct atatcagctt ctttggcaat agttcctact gcattaagag
1021 ttcacaatcg aaatgagtgg tatcgcttgg ctttggtcac gttggtgagt gcatgtccgt
1081 gtgcacttgt gctatctaca ccagttgcca tgtgttgtgc actttctaaa gcagcaacgt
1141 ccggtcttct gtttaaagga gcagagtacc ttgagactct tgctaaaatc aaaatcatgg
1201 cttttgacaa aacagggact ataactagag gagaatttat ggtgaccgag ttcaagtctc
1261 tggttgatgg tcttggtctc aatacactgc tttactgggt ttcaagtatt gagagcaagt
1321 caggtcatcc gatggcagcc gctctggttg actatgcaca atcaaattcc gttgagccaa
1381 agcctgatag agttgagcag tttcaaaatt ttcctggtga agggatattt ggaagaattg
1441 atggaatgga aatctatgtc gggaatagga aaatttcttc aagagctgga tgtactacag
1501 taccagaaat agagggtgat agtttccaag gaaagtctgt tggatacata tttttgggat
1561 catctcccgc tggaattttc ggtctttccg atgtttgtcg aattggtgta aaagaagcaa
1621 tgagagagct gaagcagatg ggtatcaaaa ccgcgatgct tactggtgat tgttatgcag
1681 ctgccaacca tgtgcaggat cagttaggtg gagctatgga tgaatttcaa gcggaactct
1741 taccagagga caaggcaaca atcatcaagg gttttcagaa ggaagctcca acagcgatga
1801 taggcgacgg ccttaatgat gctcctgcat tagcaacagc tgacattggc atctcaatgg
1861 gcatctctgg gtcagctctc gcgaaagaaa caggccatgt tatactaatg acaaatgaca
1921 tcggaagaat accaaaagct gcacgtcttg ctagaagagt tcgaaggaag attgttgaga
1981 atatgattat atcagtcgtt acaaaggccg ccatagttgc attggcaata gcaggttatc
2041 cattggtttg ggctgctgtc ctcgcggata ctgggacatg cttgctagtg atcttgaaca
2101 gcatgctact tctacgagta ggcacacaca gacatgggaa aaaatgttgt agatctgcta
2161 ctccttcgca tgctcccaac cacaaagaca aagcttcttg ttgcaagtcg gaaaatgctc
2221 cgcagctgtg ttgctctgat attgagtcac aaaagaaatg tacgagtcaa tcatgctcgt
2281 ccgaggtgtg tgttccaaga tgtcaacctg tctcctcggg atcaaagtca tgtggaaata
2341 atcagtgccc agactccgtt gaaaatagtg gttttcattc tcatccccgt cctcaatgct
2401 gctcgtcgaa gatggcttct aaagcatgcc aatctgcagt ttcagaatca aagtcatgtg
2461 gaaataatca gtgcccagac tccgttgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgccctc
2521 aatgctgctc gtctaagatg gcttctaaag catgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt
2581 catgtggaaa taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc
2641 gtcctcaatg ctgctcgttg aagatggctt ctaaagcatg ccaatctgca gtttcagaat
2701 caaagtcatg tggaaataat cagtgcccag actccgttga aaatagtggt tttcattctc
2761 atccccgtcc tcaatgctgc tcgtcgaaga tggctgctaa agcatgccaa tctgcagttt
2821 cagaatcaaa gtcatgtgga aataacaatt gctcggagtc catttacaag agtagttgtc
2881 attctttaac aagttctcta gtatgttctt ccaagatgtc tgctccacaa tgtcattctg
2941 ccacttcaag ctccaaatca tgtggaagta ccaagtgctc caacttcagt gacaaaaaat
3001 gttgccaata tgacaaaatt cctcaaacgt gctctaccaa gaagtctgct ccaggatgtc
3061 aatctgcagt ttctgggtct aaatcatgtg gagatagcaa gtgttcagac tcgaaagaca
3121 atagtagcca tccttcacat cccgatcatc aaatatgcac gtctaagttg tgtgctccac
3181 aaagccaatc tgcaacttca agctccagga catgtggaaa tatgaagtgc tcggacacca
3241 atagcaagaa ttcttgttat tcacatacca actctgaatc atgctcttca aagatgtctg
3301 gtccagcatg caaaactgct aattcaggtt caaggttatg cggaaataag aagtgcctag
3361 actctgcaaa cgagaacagt tttcattcac ttactaatcc actctgtgag gaaaagcttt
3421 tggagaagga aagcttggat ttagcccgaa aagataggga atcaaatcat gatcttagtc
3481 atggttgctc tgacgaggaa catgatcatc taaatttaga caaggcacat gacagttgtg
3541 ccttacaaga atgttgttat tctgttcaag gcaataaaac tgatgtatca gaaactggaa
3601 tccaggaagc tgctcattgt gacagcatca atcaaacatg ccaaactgca atttcaggat
3661 caatgacatg cggaaataat aagagtctgg actctctaag catccatggt tgtcattcac
3721 atgatagtcc actccacaag gagagcaact tggagcagaa aagcttggat gttgctggag
3781 aaggtataaa atcacctcat gctgtcggtc aaggctgttc ggacaaggag cacaatcact
3841 cgcatccaga aaaggcgtat gacagttgtg caacagacga ttgttgtttt tcagttcaag
3901 tccatggcat tgacgacgta tcaagaagtg aaattcaaga aactgctcat tgtgacagca
3961 caaaacagag cacggtcatc cccagcagct gcgaacatga accaaaagat caggtaaatc
4021 actgtggatc tcactctaaa agtattccaa ctgatgaaga actagccaag ctggttagaa
4081 gatgctgcaa atacaaacca tgccacgatg tccgctctgg ctgcaggaag catgctgcag
4141 aatgtggtcc aaccgttcga tcaaccatca atatcttacg ggacaaccat catcatcatc
4201 tagactgcag tggtcgtaag gtttgttcgc tgttggagaa gagacacatt ggtggatgct
4261 gtgacagctt cagaaaagaa tgttgtgcca agaacaatca ccttggagca agttttggag
4321 gaggtttatc agaaattgtc atagagtaga tgcaatctga agtgtacata tgttgt
圃場試験1(Cdが中程度の領域):単一突然変異体の圃場データ
大規模圃場実験で栽培したホモ接合単一突然変異体およびそれらのヌル分離対照の区画からのプール試料のCd/Zn値(平均±標準偏差)。Cd/Zn低減%を対照値と比較して算出する。p値(対応のあるt検定)を計算して、偶然に平均値(突然変異体系統)<0.8*平均値(対照系統)となる確率を求める。有意な20%超のCd/Zn低減が見られる系統(p<0.05)に関して、p値は太字で強調されている。圃場試験では、7組の突然変異組み合わせに関して、それぞれの単一突然変異体、二重突然変異体、および対照の植物体を6箇所の複製区画で栽培した(Q293*/Q561*については5箇所、E296/Q561*については4箇所、Q293*/W265*については3箇所)。各複製単位は、それぞれ二重突然変異体、HMA4 WT対照、および二つの単純突然変異体の10個の植物体を含む。突然変異Q293*およびQ561*はいくつかの組み合わせに生じるため、これらの単一突然変異のデータは、それぞれ8区画および33区画の値に基づいている。単一突然変異体である植物体は、対照と比較してバイオマス(葉重量)の低減を示していないが、これは図6に示されている。
圃場試験1(Cdが中程度の領域):二重突然変異体の圃場データ
大規模圃場実験で栽培したホモ接合二重突然変異体およびそれらのヌル分離対照の区画からのプール試料のCd/Zn値(平均±標準偏差)。Cd/Zn低減%を対照値と比較して算出する。p値(対応のあるt検定)を計算して偶然に平均値(突然変異体系統)<0.8*平均値(対照系統)となる確率を求める。有意な20%超のCd/Zn低減が見られる系統(p<0.05)に関して、p値は太字で強調されている。圃場試験では、7組の突然変異の組み合わせのうちの分離種子ロットを植え付け、それらの遺伝子型について分析する。各々の突然変異の組み合わせについて、四つの遺伝子型群を6箇所の複製区間で栽培する(Q293*/Q561*に対しては5箇所、E296/Q561*に対しては4箇所、Q293*/W265*に対しては3箇所)。各複製単位は、それぞれ二重突然変異体、HMA4WT対照、および二つの単純突然変異体の10個の植物体を含む。表現型のデータ(葉の生重量)を図6に示す。
HMA4.1およびHMA4.2における特定および検証された突然変異の一覧表。アミノ酸変化を示し、対応するSIFTスコアを示している。興味深い突然変異(置換されたアミノ酸のSIFTスコアが元のSIFTスコアの0.05未満となるナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異)を太字で強調している。
Claims (33)
- 少なくとも二つの重金属ATPアーゼ(HMA)の発現または活性を少なくとも部分的に低減させた突然変異体である植物体またはその一部であって、前記二つのHMAが、
(i) 配列番号1および配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド、
(ii) (i)に記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または (iii) HMAをコードする配列番号3および配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド
を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、
前記突然変異体である植物体またはその一部が、前記突然変異体である植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、対照植物体に比べて少なくとも27%の低減を示す、前記突然変異体である植物体またはその一部。 - (i)または(ii)または(iii)に記載されたHMAのうちの一つの発現または活性が部分的に低下するかまたは失われ、且つ(i)または(ii)または(iii)に記載されたHMAのうちの一つの発現または活性が対照植物体に比べて失われる、請求項1に記載の突然変異体である植物体またはその一部。
- 収穫時の前記突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じである、請求項1または請求項2に記載の突然変異体である植物体またはその一部。
- 前記突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマスの減少を示さない、請求項3に記載の突然変異体である植物体またはその一部。
- 前記バイオマスが、葉重量である、請求項4に記載の突然変異体である植物体またはその一部。
- (ii)または(iii)に記載されたポリヌクレオチド配列の各々の制御領域において、またはコード配列において、少なくとも一つの遺伝子改変を含む、請求項1~5のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部。
- 前記遺伝子改変が、ミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異である、請求項6に記載の突然変異体である植物体またはその一部。
- 以下の突然変異の群:
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメイン内のアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメイン内のアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメイン内のアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメイン内のアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメイン内のアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメイン内のアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;ならびに
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメイン内のアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメイン内のアミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、
のうちの一つ以上を含む、請求項1~7のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部。 - 以下の突然変異の群:
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置251~296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置293に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置223~265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループのP/Nドメインのアミノ酸位置402~464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置251~296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置293に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置223~265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループのP/Nドメインのアミノ酸位置402~464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;ならびに
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、
のうちの一つ以上を含む、請求項8に記載の突然変異体である植物体またはその一部。 - 以下の突然変異の群:
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置251または293または296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置293に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置223または234または235または265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループのP/Nドメインのアミノ酸位置402または464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインにおけるアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置251または293または296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置293に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置223または234または235または265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三ループのP/Nドメインのアミノ酸位置402または464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置561に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのP/Nドメインのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドのAドメインのアミノ酸位置265に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置464に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置296に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置402に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置251に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異;ならびに
配列番号4に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第三細胞質ループのP/Nドメインのアミノ酸位置438に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号3に記載された非突然変異配列によってコードされるHMAポリペプチドの第二細胞質ループのAドメインのアミノ酸位置265、223、234、または235に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、
のうちの一つ以上を含む、請求項8又は9に記載の突然変異体である植物体またはその一部。 - 以下の突然変異の群であって:
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異;
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異;ならびに
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、
の群のうちの一つ以上を含む、請求項1~10のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部。 - 以下の突然変異の群であって:
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびL223Fであり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびD234Nであり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびG235Eであり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ464*及びQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ464*およびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ464*およびL223Fであり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ464*およびD234Nであり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ464*およびG235Eであり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびL223Fである;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびD234Nである;
配列番号1のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびG235Eである;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびL223Fである;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびD234Nである;
配列番号1のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびG235Eである;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびL223Fである;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびD234Nである;
配列番号1のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびG235Eである;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびL223Fである;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびD234Nである;
配列番号1のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号2のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびG235Eである;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびL223Fであり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびD234Nであり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置293に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ293*およびG235Eであり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ464*およびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ464*およびL223Fであり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ464*およびD234Nであり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置464に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はQ464*およびG235Eであり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびL223Fである;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびD234Nである;
配列番号2のアミノ酸位置296に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はE296KおよびG235Eである;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびL223Fである;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびD234Nである;
配列番号2のアミノ酸位置402に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はT402IおよびG235Eである;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置265に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびW265*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびL223Fである;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびD234Nである;
配列番号2のアミノ酸位置251に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はG251DおよびG235Eである;
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置561に対応する位置でのナンセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびQ561*であり、*は終止コドンを表す;
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置223に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびL223Fである;
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置234に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびD234Nである;ならびに
配列番号2のアミノ酸位置438に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号1のアミノ酸位置235に対応する位置でのミスセンス突然変異、ここで、前記突然変異はH438YおよびG235Eである、
の群のうちの一つ以上を含む、請求項11に記載の突然変異体である植物体またはその一部。 - 圃場栽培植物体の葉におけるカドミウムレベルの低減方法であって、前記方法が、
(a) 植物体における二つの重金属ATPアーゼ(HMA)の発現または活性を低減させる工程、ここで前記二つのHMAが、
(i) 配列番号1および配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド、
(ii) (i)に記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または (iii) HMAをコードする配列番号3および配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド
を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる;
(b) 前記植物体を圃場で栽培する工程;
(c) 任意に含まれていてもよい工程として、工程(b)で得られた前記植物体におけるカドミウム含有量を測定する工程;及び
(d) 前記植物体におけるカドミウム含有量が、前記HMAの発現または活性が減少していない対照植物体に比べて減少している植物体を特定する工程
を含む、前記方法。 - 工程(a)において、前記HMAの発現または活性が突然変異誘発またはゲノム編集により低下する、請求項13に記載の方法。
- 工程(d)において、前記植物体またはその一部が、前記植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、前記対照植物体に比べて少なくとも27%の低減を示す、請求項13に記載の方法。
- 工程(d)において、収穫時の前記突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じである、請求項13に記載の方法。
- 工程(d)において、前記突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマスの減少を示さない、請求項13に記載の方法。
- 前記バイオマスが、葉重量である、請求項17に記載の方法。
- 圃場栽培植物体における一つ以上の遺伝子改変を特定する方法であって、前記一つ以上の遺伝子改変が、前記一つ以上の遺伝子改変を含まない圃場栽培対照植物体と比べた場合の葉中のカドミウムレベルの低減と関連し、
(a) 圃場で栽培された場合に、前記圃場で栽培された対照植物体に比べて前記葉中のカドミウムレベルを低減させた植物体を特定する工程;
(b) 工程(a)で特定された植物体に由来する核酸試料を用意する工程;及び
(c) 工程(b)由来の核酸試料において、それぞれ配列番号1および配列番号2に記載された非突然変異配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、重金属ATPアーゼ(HMA)をコードする2つのポリヌクレオチド配列の各々における、またはそれぞれ配列番号3および配列番号4に対して少なくとも95%の配列同一性を有する2つのポリヌクレオチド配列の各々における一つ以上の遺伝子改変を特定する工程
を含む、前記方法。 - 工程(a)において、収穫時の前記植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じである、請求項19に記載の方法。
- 工程(a)において、前記植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマスの減少を示さない、請求項19に記載の方法。
- 前記バイオマスが、葉重量である、請求項21に記載の方法。
- 請求項1~12のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部に由来する植物材料。
- 乾燥処理された植物材料または乾燥済みの植物材料である、請求項23に記載の植物材料。
- 収穫時の前記突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じである、請求項23に記載の植物材料。
- 前記突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマスの減少を示さない、請求項23に記載の植物材料。
- 前記バイオマスが、葉重量である、請求項26に記載の植物材料。
- 圃場で栽培した場合に、圃場栽培対照植物体と比べて葉中のカドミウムの蓄積を低減させた植物材料を生成する方法であって、
(a) 請求項1~12のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部を用意する工程;
(b) 前記植物体を前記圃場で栽培する工程;及び
(c) 前記植物体から植物材料を収穫する工程
を含む、前記方法。 - 工程(c)において、収穫時の前記突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じである、請求項28に記載の方法。
- 工程(c)において、前記突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマスの減少を示さない、請求項28に記載の方法。
- 前記バイオマスが、葉重量である、請求項30に記載の方法。
- 請求項1~12のいずれかに記載の突然変異体である植物体もしくはその一部、または請求項23~27のいずれかに記載の植物材料を含む、植物産物。
- 請求項1~12のいずれかに記載の突然変異体である植物体もしくはその一部、または請求項23~27のいずれかに記載の植物材料、または請求項32に記載の植物産物を含む、たばこ製品もしくは喫煙物品、または消耗製品。
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