EA041833B1

EA041833B1 - Уменьшение накопления кадмия в выращенных в поле растениях табака

Info

Publication number: EA041833B1
Application number: EA201891707
Authority: EA
Inventors: Люсьен БОВЕ; Верена ЛИДШУЛЬТЕ
Original assignee: Филип Моррис Продактс С.А.
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2022-12-07

Description

Предпосылки изобретения

Много тяжелых металлов естественным образом присутствуют в почве и поглощаются растениями в разной степени. Некоторые тяжелые металлы, такие как марганец или цинк, являются незаменимыми для растений, поскольку они представляют собой кофакторы, необходимые для ферментативной активности. Другие тяжелые металлы не являются незаменимыми для растений, и в некоторых случаях уменьшение концентрации тяжелых металлов было бы выгодно. Кадмий (Cd) представляет собой один из металлов, для которых нет сведений о выгодных эффектах на развитие растения или человека. Он классифицируется как известный человеческий канцероген. Если Cd накапливается в растении в избытке, это может спровоцировать различные вредные эффекты, такие как уменьшение поверхности листа, уменьшение сухого веса, уменьшение содержания воды, уменьшение содержания хлорофилла и уменьшение содержания каротиноидов. Табак представляет собой вид растений, отличающийся способностью накапливать в четыре раза больший уровень Cd в побегах, чем в корнях. Желательно иметь возможность уменьшать накопление Cd в растениях, таких как табак. В частности, желательно иметь возможность уменьшать накопление Cd в растениях, таких как табак, когда они растут вне помещения, в открытом поле, в большом масштабе для коммерческого производства.

Степень накопления Cd в растениях может быть различной, в зависимости от нескольких параметров, которые объясняются сложностью генотипа+и условиями роста. Например, концентрации Cd в листьях выращенного в поле табака могут различаться в зависимости от таких факторов, как агроклимат, параметры почвы и сорта. В среднем концентрации Cd, измеренные в листьях выращенного в поле табака (включая стебли и жилки), могут быть в диапазоне от приблизительно 0,5 до 5 ч./млн (частей на миллион, или мкг/г сухого веса листьев табака). Более низкие и более высокие значения были обнаружены в диапазоне от 0 до 6,78 ч./млн (Lugon-Moulin et al., 2006).

Было сделано несколько различных попыток уменьшить накопление Cd в листьях табака. Один способ включал уменьшение накопления Cd в побегах с помощью изолирования Cd в вакуолях корня. Это было выполнено с помощью сверхэкспресирования кальциевых и марганцевых вакуольных транспортеров САХ2 и САХ4 А. thaliana в корнях табака (Korenkov et al., 2009).

Может быть желательным разработать генетически не модифицированный организм (не являющийся ГМО), подходя к уменьшению накопления Cd в листьях растения за счет применения инактивации гена. Из-за трудностей выращивания и извлечения прибыли с генетически модифицированных сельскохозяйственных культур в странах, включая европейские, может быть желательным работать с мутантами с наличием однонуклеотидных полиморфизмов, полученных с помощью обрабатывания этилметансульфонатом (EMS) или тому подобным, а не за счет использования методик генной инженерии. Мутанты не рассматриваются как GMO, даже когда мутации вызваны искусственно. В странах ЕС, например, отсутствуют специальные постановления для растений, полученных вследствие мутационной селекции.

В WO 2012/041913 описываются растения табака с уменьшенным содержанием тяжелого металла в листьях. Это достигается за счет использования растений табака, которые содержат по меньшей мере одну мутацию в гене НМА. Мутации приводят к замене, или делеции, или вставке по меньшей мере одной аминокислоты в полипептиде, который кодируется нуклеотидной последовательностью и уменьшает количество тяжелого металла, поглощенного листьями растения. Различные точечные мутации были идентифицированы в WO 2012/041913, как обобщено в табл. 1 в данном документе. Данная ссылка представляет данные о небольших проростках, выращенных в водной культуре. В данной системе, присутствовали очень большие концентрации Cd и Zn, которые не отображают состояния в системах открытых полей. Концентрации Cd, измеренные в листьях контрольных растений в таких системах, имеют значения в 30-300 раз более высокие по сравнению с концентрациями, обнаруженными в условиях грунта.

Hermand et al. (2014) описывают эффекты инактивации ортологов табака НМА2 и НМА4 Arabidopsis thaliana с применением мутации, полученной с помощью EMS-обработки. AtHMA2 и AtHMA4 кодируют АТФазы (НМА), которые транспортируют такие тяжелые металлы, как цинк (Zn) и Cd, от корней к побегам. Два ортолога генов AtHMA2 и AtHMA4 были идентифицированы в геноме N. tabacum и названы NtHMAa и NtHMAe соответственно. Экспрессия была изменена с целью определения возможности использования данного подхода получения линий табака с уменьшенными уровнями Cd в листьях. С целью изучения роли данных генов NtHMA в табаке линии табака, содержащие мутацию в каком либо из генов NtHMA, идентифицировали с помощью скрининга группы мутантов, подвергнутой мутагенезу с помощью EMS. Миссенс-мутации (P249S, Е387К и G515R) и нонсенс-мутации (W265* и R529*) были идентифицированы или в NtHMAa (P294S, Е387К и W265*), или в NtHMAe (G515R, R520*). Данные мутации приводили к изменению аминокислот или вводили преждевременные стоп-кодоны во вторую (P294S и W265*) и третью (Е387К, G515R и R520*) цитозольные петли белка НМА. Гомозиготные одиночные мутантные линии, разработанные Hermand et al. (2014), выращивали в искусственно стерильных условиях на агаровых пластинках, содержащих среду Мусариге-Скуга. Результаты, полученные с одиночными мутантами, как отмечено на фигурах 4а и b Hermand et al. (2014), обобщены в табл. 2 в данном документе. Было отмечено, что одиночные мутанты демонстрируют уменьшение накопления Cd и Zn в побегах. Было отмечено, что одиночные мутантные растения имеют параметры роста и развития, срав

- 1 041833 нимые с диким типом. Растения, содержащие нонсенс-мутацию в обоих генах NtHMA, демонстрировали сильную задержку роста и не производили семян. Примечательно, что данные, отмеченные на фиг. 4а и 4b, получены с применением небольших проростков, выращенных в стерильной культуре, в которой применялись искусственно завышенные концентрации Cd и Zn. Данные искусственно завышенные концентрации Cd и Zn не отображают естественные условия, которые присутствуют в открытых полевых условиях. Концентрации Cd, измеренные в побегах контрольных растений на фиг. 4а, составляют приблизительно 135 ч./млн. Данные концентрации имеют значения в приблизительно 30-300 раз более высокие по сравнению с концентрациями Cd, которые наблюдали в растениях, выращенных в полевых условиях. На основании результатов работы с применением мутантов, содержащих однонуклеотидные полиморфизмы, полученные с помощью обработки EMS, Hermand et al. (2014) сделали вывод, что функция NtHMAa/β должна сохраняться по меньшей мере частично для нормального роста и развития и что конструирование коммерчески доступных растений табака без наличия Cd в побегах не может быть достигнуто только посредством инактивации двух генов NtHMA. Обсуждается, что инактивация только одного из генов NtHMA может привести к получению коммерчески доступных растений, которые демонстрируют уменьшение концентрации Cd в побегах. Для дополнительного уменьшения способности растений накапливать Cd в листьях Hermand et al. (2014) рассмотрели объединение разных мутаций в генах NtHMA - такие как комбинация нонсенс-мутации в одном гене NtHMA с ликовой мутацией в другом гене NtHMA. Liedschulte et al. на 12-й конференции по Solanaceae (SOL2015), Бордо, Франция, с 25 по 29 октября 2015 г. описывает, что миссенс- или нонсенс-мутации или в НМА4.1, или в НМА4.2 (которые соответствуют NtHMAa и NtHMAe соответственно) не снижают содержания кадмия в листьях растений табака, выращенных в полевых условиях, в существенной мере. В данном исследовании описаны растения табака с RNAi HMA4, которые проявляют уменьшение содержания Cd в около 10 раз по сравнению с контролем, представляющим собой дикий тип. Однако фенотип был в значительной мере подвержен снижению роста, утолщению листьев и некротическим поражениям. Аналогичный фенотип был отмечен для мутантов табака с двойным нокаутом по НМА4 у Hermand et al., 2014. 19 гомозиготных линий с миссенс-мутацией по НМА4 и четыре гомозиготных линии с нонсенс-мутацией по НМА4 тестировали смежно с нуль-сегрегантами контрольными растениями в поле. Фенотипических различий в мутантных по НМА4 растениях не наблюдали. Статистически значимого (парный Т-критерий по соотношениям; р<0,05) уменьшения уровня Cd и Zn выше неоднозначного измерения (20%) не наблюдали ни в одной из тестовых мутантных линий, содержащих или гомозиготную миссенс-мутацию, или нонсенс-мутацию в одном из генов НМА4. Liedschulte et al. (2015) в своем исследовании сделали вывод, что полный нокаут по НМА4 приводит к сильному уменьшению уровня Cd и Zn и фенотипическим изменениям, включая карликовость и некротические поражения. Также был сделан вывод, что в отличии от Hermand et al. (2014), вредные мутации в NtHMA4.1 или NtHMA4.2 не уменьшают уровни Cd в существенной мере в растениях, выращенных в полевых условиях. Подход Hermand et al. (2014), согласно сделанному выводу, не является применимым в полевых условиях.

Существует постоянная потребность в данной области в разработке подходов, таких как подходы без ГМО, для уменьшения накопления Cd в растениях, таких как табак, когда они растут вне помещения, в открытом поле, в большом масштабе для коммерческого производства. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этой потребности.

Краткое описание изобретения

В WO 2012/041913 и у Hermand et al. (2014) описывают полученные с помощью EMS мутантные линии табака, которые демонстрируют уменьшение накопления Zn и Cd в побегах при исключительно стерильных искусственных условиях или при гидропонных условиях роста. В отличии от идей WO 2012/041913 и Hermand et al. (2014) настоящее изобретение связанно с уменьшением уровня Cd в растениях, когда они растут вне помещения в открытой среде (например, в поле) где уровни Cd являются в 30300 раз более низкими, чем уровни Cd, использованные в WO 2012/041913 и Hermand et al. (2014). Подразумевается, что растения, описанные в настоящем изобретении, используются для коммерческого производства, что требует от растений быть выращенными в полевых условиях на открытом воздухе в очень больших количествах, нежели быть выращенными в искусственных условиях. Выращивать растения в искусственных условиях было бы коммерчески невыгодно. Настоящее изобретение направлено на обеспечение мутантными растениями такими как мутантные растения, не являющиеся ГМО, в которых уровень накопления Cd уменьшается, если они выращены в открытых полевых условиях.

Условия, использованные Hermand et al. (2014), не отображают естественные условия в открытых полевых условиях, которые представляют интерес в настоящем изобретении. Результаты, отмеченные Hermand et al. (2014), ограничены в использовании для специалиста в данной области, заинтересованного в уменьшении уровня Cd в растениях, выращенных в открытых полевых условиях, поскольку уровни Cd в открытых полевых условиях и в искусственных условиях, использованных Hermand et al. (2014), не сопоставимы. Кроме того, Liedschulte et al. (2015) делают вывод, что вредные мутации в NtHMA4.1 или NtHMA4.2 не уменьшают уровни Cd в существенной мере в растениях, выращенных в полевых условиях выше уровня неоднозначного измерения (приблизительно 20%). Подход Hermand et al. (2014), согласно

- 2 041833 сделанному выводу, не является применимым в полевых условиях.

Авторы настоящего изобретения создали различных полученных с помощью EMS гомозиготных одиночных мутантов по НМА4, включая одиночную нонсенс-мутацию по W265*, отмеченную Hermand et al. (2014), и тестированную ими в открытых полевых условиях. Результаты данного эксперимента отмечены в табл. 3 в данном документе. Результаты демонстрируют, что ни один из тестированных одиночных мутантов, включая одиночную мутацию по W265* согласно Hermand et al. (2014), не показал снижения уровня Cd в открытых полевых условиях. Как можно видеть в табл. 3, четвертой колонке, % уменьшения уровня Cd по сравнению с контролем для каждого из тестируемых одиночных мутантов в открытых полевых условиях был равен 0%. Данные результаты согласуются с результатами, отмеченными Liedschulte et al. (2015).

На основании знаний, что ни один из одиночных мутантов, тестируемых и отмеченных в табл. 3 в данном документе, не показал какого-либо снижения уровня Cd в открытых полевых условиях, ожидания авторов настоящего изобретения заключались в том, что объединение двух или более из данных одиночных мутаций, которые неактивны в открытых полевых условиях, не будет иметь влияния или будет иметь незначительное влияние на уменьшение уровня Cd в открытых полевых условиях. Однако, и в противоположность данному ожиданию, авторы настоящего изобретения определили, что если различные одиночные мутации, как отмечено в табл. 3, объединить вместе в разных комбинациях с целью образовать двойных гомозиготных мутантов, то можно достигнуть высокого уровня уменьшения Cd в листе (например, 20% или больше) в открытых полевых условиях. В некоторых случаях уровень уменьшения Cd в листе, который был достигнут в открытых полевых условиях, составлял по меньшей мере приблизительно 27%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% или даже приблизительно 90% или больше, как обобщено в табл. 4, 5 и 6 в данном документе. Данный высокий уровень уменьшения Cd является весьма выгодным в уменьшении уровня Cd в растениях, выращенных в открытых полевых условиях. Неожиданно, растения с двойной мутацией с уменьшенным уровнем Cd в листе, как описано в данном документе, не испытывают вредного влияния фенотипа такого как уменьшение количеств роста/карликовости/биомассы. Выгодные результаты, отмеченные для двойных мутантов, описанные в данном документе, которые были обнаружены, не ожидались и не предсказывались авторами настоящего изобретения. Основываясь на этих данных, настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того факта, что растения могут проявлять уменьшение накопления Cd в листе при выращивании в открытых полевых условиях, при уменьшении, по меньшей мере частично, экспрессии или активности NtHMA4.1 и NtHMA4.2. Соответствующим образом, растения, не являющиеся ГМО, могут быть получены за счет использования мутагенеза и, соответствующим образом, не испытывать вредного влияния фенотипа. NtHMA4.1 и NtHMA4.2 соответствуют NtHMAa и NtHMAe, соответственно, как отмечено Hermand et al. (2014). Преимущественно разные комбинации мутантов могут быть использованы как набор инструментов для выведения различных разновидностей с уменьшенным уровнем кадмия и без дефектного фенотипа и/или урожая.

Аспекты и варианты осуществления изобретения

В первом аспекте, описаны мутантное растение или его часть, которые характеризуются по меньшей мере частично уменьшенной экспрессией или активностью по меньшей мере двух АТФаз тяжелых металлов (НМА), при этом указанные две НМА предусматривают, состоят из или состоят, по сути, из (i) полипептидов, которые характеризуются по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2; (ii) полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, изложенные в (i); или (iii) полинуклеотидов, которые характеризуются по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, кодирующими НМА; где мутантное растение или его часть проявляют уменьшение по меньшей мере 27% по сравнению с контрольным растением, накопления кадмия в листе, если мутантное растение выращено в поле в присутствии встречающегося в природе или не встречающегося в природе кадмия.

Соответствующим образом, экспрессия или активность одного из НМА, изложенных в (i), или (ii), или (iii), являются частично уменьшенными или утраченными, и экспрессия или активность одного из НМА, изложенных в (i), или (ii), или (iii), являются утраченными по сравнению с контрольным растением.

Соответствующим образом фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, соответствующим образом, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора.

Соответствующим образом мутантное растение или его часть содержат по меньшей мере одно генетическое изменение в регуляторном участке или в кодирующей последовательности каждой из полинуклеотидных последовательностей, изложенных в (ii) или (iii), соответствующим образом, при этом мутация представляет собой миссенс-мутацию или нонсенс-мутацию. Соответствующим образом мутантное растение или его часть содержат одну или более следующих мутаций: по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей

- 3 041833 мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 251 до 296 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 251, или 293, или 296 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 223 до 265 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, соответствующим образом, при этом растение содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 петли Адомена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 223, или 234, или 235, или 265 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 4 02 до 464 третьей петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4. Мутантное растение или его часть содержащие по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 402 или 464 третьей петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в аминокислотном положении 265 в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической

- 4 041833 петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 2 96 второй цитоплазматической петли А-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/N-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в третьей цитоплазматической петле P/N-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 во второй цитоплазматической петле петли А-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле третьей цитоплазматической петли P/N-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/N-домена во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в третьей цитоплазматической петле P/N-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 251 до 296 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 251, или 293, или 296 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 223 до 265 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, соответствующим образом, при этом растение содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствую

- 5 041833 щем аминокислотным положениям 223, или 234, или 235, или 265 петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/Nдомена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 402 до 464 третьей петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 402 или 464 третьей петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию, соответствующую аминокислотному положению 265 в петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 4 64 третьей цитоплазматической петли P/Nдомена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3, соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 второй цитоплазматической петли А-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/Nдомена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в третьей цитоплазматической петле P/N-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 во второй цитоплазматической петле петли А-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем

- 6 041833 аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли Адомена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле третьей цитоплазматической петли P/N-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/N-домена во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; соответствующим образом, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в третьей цитоплазматической петле P/N-домена немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3.

Соответствующим образом, мутантное растение или его часть содержат одну или более следующих мутаций: нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и Q561*, и при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 в SEQ ID NO: 1 и миссенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 немутированной последовательности изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и W265**, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем амино

- 7 041833 кислотному положению 235 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 1 и а нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и L223F; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; или миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и G235E; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и L223F; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и D234N; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и G235E; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; или миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и L223F; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и D234N; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и G235E; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 1 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и Q561*, и при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем амино

- 8 041833 кислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 в SEQ ID NO: 2 и миссенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и W265**, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 2 и нонсенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и W265*, при этом * указывает на стопкодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и L223F; миссенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 2 и миссенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и D234N, при этом * указывает на стопкодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и G235E; миссенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 2 и нонсенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и W265*, при этом * указывает на стопкодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и L223F; миссенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 2 и миссенсмутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и D234N; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и G235E; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем

- 9 041833 аминокислотному положению 265 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и L223F; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и D234N; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и G235E; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 2 и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 в SEQ ID NO: 2 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 в SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон.

В дополнительном аспекте раскрыт способ уменьшения уровня кадмия в листе выращенного в поле растения, предусматривающий стадии: (а) уменьшения экспрессии или активности двух АТФаз тяжелого металла (НМА), при этом указанные две НМА предусматривают, состоят из или состоят, по сути, из: (i) полипептидов, которые характеризуются по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2; (ii) полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, изложенные в (i); или (iii) полинуклеотидов, которые характеризуются по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, кодирующими НМА, соответствующим образом, при этом экспрессия или активность (НМА) уменьшены с помощью мутагенеза или редактирования генома; (b) растений, растущих в поле; (с) необязательно измерений содержания кадмия в растениях, полученных на стадии (b); и (d) идентификации растения, в котором содержание кадмия, находящегося в нем, уменьшено по сравнению с контрольным растением, в котором экспрессия или активность НМА не были уменьшены, соответствующим образом, при этом растение или его часть проявляют по меньшей мере 27% уменьшение по сравнению с контрольным растением в накоплении кадмия в листе, когда растение выращено в поле в присутствии встречающегося в природе или не встречающегося в природе кадмия; при этом соответствующим образом, фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, соответствующим образом, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора.

В дополнительном аспекте раскрыт способ идентификации одного или более генетических изменений в выращенных в поле растениях, который коррелирует с уменьшенными уровнями кадмия в листе по сравнению с выращенным в поле контрольным растением, которое не содержит одного или более генетических изменений, при этом указанный способ предусматривает стадии (а) идентификации растения с уменьшенными уровнями кадмия в листьях при выращивании в поле по сравнению с контрольным растением, которое выращено в поле, при этом необязательно фенотип растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, соответствующим образом, при этом растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора; (b) обеспечения образца нуклеиновой кислоты из растения, идентифицированного на стадии (a); и (с) идентификации в образце нуклеиновой кислоты из стадии (b) одного или более генетических изменений в полинуклеотидных последовательностях, кодирующих НМА, которые характеризуются по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с немутированными последовательностями, изложенными под SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, или в полинуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.

В дополнительном аспекте раскрыт растительный материал, полученный из мутантного растения или его части, как описано в данном документе, соответствующим образом, при этом растительный материал является подсушенным или высушенным растительным материалом, соответствующим образом, при этом фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, соответствующим образом, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с

- 10 041833 контрольным растением в такое же время сбора.

В дополнительном аспекте раскрыт способ получения растительного материала с уменьшенным накоплением кадмия в листе, когда растение выращено в поле, по сравнению с выращенным в поле контрольным растением, при этом указанный способ предусматривает стадии: (а) обеспечения мутантного растения или его части, как описано в данном документе; (b) выращивания растения в поле и (с) сбора растительного материала из растения, соответствующим образом, при этом фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, соответствующим образом, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора.

В дополнительном аспекте раскрыто мутантное растение или его часть или растительный материал, полученный или получаемый из них, который получен или получаемый можно получить с помощью способа по п.7, соответствующим образом, при этом фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, соответствующим образом, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора.

В дополнительном аспекте раскрыт растительный продукт, содержащий по меньшей мере часть мутантного растения или его часть или растительный материал, описанные в данном документе.

В дополнительном аспекте раскрыт табачный продукт, или курительное изделие, или потребительский продукт, содержащие мутантное растение или часть, или растительный материал, или растительный продукт, описанные в данном документе.

Соответствующим образом, по меньшей мере одно генетическое изменение введено с помощью (i) нецелевой обработки семенного материала мутагенным средством или (ii) подвергнуто воздействию системы редактирования генома, такой как сконструированная система на основе CRISPR/Cas, сконструированная эффекторная нуклеаза, подобная активаторам транскрипции, сконструированная нуклеаза с цинковыми пальцами или сконструированная мегануклеаза.

В дополнительном аспекте раскрыт выделенный полипептид, кодирующий полипептид АТФазы металла (НМА), характеризующийся по меньшей мере 60% идентичностью последовательности с немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1, и содержащий одну или более мутаций, описанных в данном документе.

В дополнительном аспекте раскрыт выделенный полипептид, кодирующий полипептид АТФазы металла (НМА), характеризующийся по меньшей мере 60% идентичностью последовательности с немутированной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 2, и содержащей одну или более мутаций, описанных в данном документе.

В дополнительном аспекте раскрыта комбинация из выделенных полипептидов, содержащая выделенные полипептиды, описанные в данном документе.

В дополнительном аспекте раскрыта выделенная полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид (полипептиды), описанный (описанные) в данном документе.

В дополнительном аспекте раскрыта конструкция, вектор или вектор экспрессии, содержащие выделенный полинуклеотид (полинуклеотиды), описанный (описанные) в данном документе.

В дополнительном аспекте раскрыта клетка мутантного растения из мутантного растения или его части или растительного материала, как описано в данном документе.

В дополнительном аспекте раскрыт подсушенный или высушенный растительный материал, содержащий клетку мутантного растения, как описано в данном документе.

Соответствующим образом, мутантное растение, описанное в данном документе, получено с помощью мутагенеза (например, мутагенез с помощью EMS) или редактирования генома (например, применение системы на основе CRISPR/Cas, сконструированной эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции, сконструированной нуклеазы с цинковыми пальцами или сконструированной мегануклеазы).

Некоторые преимущества

Получение растений согласно с настоящим изобретением обеспечивает ряд преимуществ.

Растения, описанные в данном документе, могут представлять собой растения, не являющиеся ГМО, которые преодолевают трудности выращивания и коммерческого использования генетически модифицированных сельскохозяйственных культур.

Растения, описанные в данном документе, могут быть выращены на почвах, содержащих различные концентрации Cd. Данные растения и производные от них семена могут обеспечить больше вариантов для культивирования в более широком спектре условий почвенной среды, которые могут увеличить количество пригодной для обработки почвы, доступной для практикующих специалистов. Это также может увеличить диапазон потенциально приемлемых фосфатных удобрений, которые могут содержать более высокие уровни Cd в качестве загрязняющего элемента. Таким образом, недорогие фосфатные удобрения могут стать приемлемыми для продукции растениеводства.

Курение продуктов, полученных с данных растений, и потребление продовольственных культур, к

- 11 041833 которым можно применить настоящее изобретение, может быть более полезным вариантом из-за боле низких уровней Cd. % уменьшения уровня Cd в мутантных растениях, и в частности в надземной части мутантных растений, включая мембрану листовой пластинки, может быть приблизительно по меньшей мере от 20, 27, 30, 33, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94 или 95% или больше, если сравнивать с аналогом дикого типа.

Фенотип мутантных растений, описанный в данном документе, может быть аналогичным или таким же как у аналогов дикого типа, в частности во время сбора, что означает, что количество биомассы, полученное для продукции, является коммерчески приемлемым. В частности, мутантные растения не испытывают пагубного влияния от уменьшения роста/карликовости, в частности во время сбора.

Комбинации мутаций, которые приводят к низкому возможному содержанию Cd в сочетании с коммерчески приемлемыми уровнями биомассы, могут быть выбраны согласно с видом растений и интересующим сортом табака.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Уровни экспрессии генов для НМА4.1 и НМА4.2 у TN90 и K326 в 8 тканях. Соотношение экспрессии генов между корнями и листьями является аналогичным для обоих НМА4.1 и НМА4.2. Растения, использованные в эксперименте, представляют собой зрелые растения, выращенные в поле. Столбцы и ошибки представляют собой средние и верхние доверительные интервалы трех параллелей растений.

Фиг. 2. Уровни экспрессии генов НМА4.1 и НМА4.2 в линиях с RNAi HMA4 TN90 и K326 и их соответствующих контролях WT. Все корни собирали у растений, выращенных на агаре, измельчали и экстрагировали. Столбцы и ошибки представляют собой среднее значение и стандартное отклонение (SD) 4 параллелей растений; *, **, и *** указывают на уровни значимости при Р<0,05, Р<0,01 и Р<0,001 соответственно по сравнению с контрольными растениями WT.

Фиг. 3. (а) Растения табака K326 и TN90 с RNAi НМА4 и их соответствующие фоновые растения WT, выращенные в течении пяти недель при режиме внесения удобрениями с низким содержанием N в теплице. Определены (b, с) уровни Cd/Zn в сухом весе, (d) высота, (е) вес листа, (f) толщина листа и (g) содержание воды (сравнение между свежим и сухим весом). Столбцы и ошибки представляют собой среднее значение ±SD для пяти растений; *, **, и *** указывают уровни значимости при Р<0,05, Р<0,01 и Р<0,001 соответственно по сравнению с необработанными контрольными растениями. Точечная пунктирная линия указывает на LOQ=0,05 ч./млн для измерения уровня Cd.

Фиг. 4. (а) Фенотип, (b) вес свежего листа и уровни (с) Cd в листе и (d) Zn в листе в сухом весе мутантных растений, содержащих уменьшенные значения функциональных аллелей НМА4 после пяти (левый) и одиннадцати (правый) недель роста в теплице. Генотип указан под панелями: А и а представляют собой мутантные аллели и аллели дикого типа для НМА4.1, В и b представляют собой мутантные аллели и аллели дикого типа для НМА4.2. Столбцы и ошибки представляют собой среднее значение ±SD для восьми растений; *, **, и *** указывают на уровни значимости при Р<0,05, Р<0,01 и Р<0,001 соответственно по сравнению с контрольными растениями WT. Точечные пунктирные линии указывают на LOQ=0,05 ч./млн для измерения уровня Cd.

Фиг. 5. Анализ уровня (a) Cd и (b) Zn в листе и (с) веса свежего листа в разных двойных мутантных растениях и их соответствующих нуль-сегрегантных по НМА4 контрольных растениях WT, выращенных в течении пяти и одиннадцати недель на почве в теплице. Черные столбцы указывают на нульсегрегантные контрольные растения, серые столбцы на соответсвтующих гомозиготных по НМА4 двойных мутантов; *, **, и *** указывают на уровни значимости при Р<0,05, Р<0,01 и Р<0,001 соответственно по сравнению с контрольными растениями WT. Точечные пунктирные линии указывают на LOQ=0,05 ч./млн для измерения уровня Cd.

Фиг. 6. Данные (а) уровня Cd в листе и (b) веса свежего листа мутантов по НМА4, выращенных в поле на участке, где присутствует умеренное содержание Cd. Указан генотип: А и а представляют собой мутантные аллели и аллели дикого типа для НМА4.1, В и b представляют собой мутантные аллели и аллели дикого типа для НМА4.2. Объединенные образцы листьев собирали при нижнем положении стебля на шести (для некоторых генотипов 3) повторяющихся опытных участках. Столбцы и ошибки представляют собой среднее значение и стандартное отклонение от 3-6 измерений дублируемых опытных участков; *, **, и *** указывают на уровни значимости при Р<0,05, Р<0,01 и Р<0,001 соответственно по сравнению с контрольными растениями WT. Точечные пунктирные линии указывают на LOQ=0,05 ч./млн для измерения уровня Cd.

Фиг. 7. Данные (а) уровня Cd в листе и (b) сухого веса листа для мутантов по НМА4, выращенных в поле на участке, где присутствует умеренное содержание Cd. Черные столбцы указывают на нульсегрегантные контрольные растения, серые столбцы на соответсвтующих гомозиготных по НМА4 двойных мутантов. Объединенные образцы листьев собирали при нижнем положении стебля на шести (для Q293*/W265* и Q293*/D234N четырех) повторяющихся опытных участках. Столбцы и ошибки представляют собой среднее значение и стандартное отклонение.

Фиг. 8. Данные (а, b) уровня Cd в листе и (с, d) веса подсушенного листа мутантов по НМА4, выра- 12 041833 щенных в поле на двух участках, где присутствует высокое содержание Cd; (а) и (с) соответствуют данным уровня Cd и веса подсушенного листа из поля 3 и b и d соответствуют Cd и данным веса подсушенного листа с поля 4. Черные столбцы указывают на нуль-сегрегантные контрольные растения, серые столбцы на соответсвтующих гомозиготных по НМА4 двойных мутантов. Объединенные образцы листьев собирали при нижнем положении стебля в пяти повторяющихся опытных участках. Столбцы и ошибки представляют собой среднее значение и стандартное отклонение.

Фиг. 9. Схема белков НМА4 N. tabacum. Три функциональных домена выполняют реализацию каталитических функций: фосфорилирующий домен (Р), домен нуклеотидного связывания (N) и исполнительный домен (А), которые расположены во второй и третьей цитоплазматических петлях белка. Миссенс-мутации, которые, как оказалось, имеют влияние на функцию белка и уменьшают уровень Cd в сочетании с нонсенс-мутацией, выделены символами подчеркивания. Все остальные миссенс-мутации, проанализированные в данном исследовании, не имели влияния на уменьшение уровня Cd в сочетании с нонсенс-мутацией. Нонсенс-мутации выделены черным цветом. (Данная модель предназначена для иллюстративных целей и не отображает сворачивание домена.)

Определения

Техническим терминам и выражениям, используемым в пределах объема данного изобретения, следует придавать значение, которое обычно применяется к ним в данной области биологии растений и молекулярной биологии. Все нижеследующие определения терминов применяют ко всему содержанию данного изобретения. Слово содержащий не исключает другие элементы или стадии, а формы единственного числа не исключают множественное. Одна стадия может выполнять функции нескольких признаков, изложенных в формуле изобретения. Термины приблизительно, главным образом и примерно в контексте данного цифрового значения или диапазона относятся к значению или диапазону, которые находятся в пределах 20%, в пределах 10%, или в пределах 5, 4, 3, 2 или 1% от данного значения или диапазона.

Термин выделенный относится к любому объекту, который взят из его естественной среды, но этот термин не подразумевает какой-либо степени очистки.

Вектор экспрессии представляет собой средство доставки нуклеиновой кислоты, которое содержит комбинацию компонентов нуклеиновой кислоты для обеспечения экспрессии нуклеиновой кислоты. Подходящие векторы экспрессии включают в себя эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как кольцевые плазмиды из двухнитевой нуклеиновой кислоты; линеаризованные плазмиды из двухнитевой нуклеиновой кислоты и другие функционально эквивалентные векторы экспрессии любого происхождения. Вектор экспрессии содержит по меньшей мере промотор, расположенный выше по цепи и функционально связанный с нуклеиновой кислотой, конструкции нуклеиновых кислот или конъюгат нуклеиновых кислот, как определено ниже.

Термин конструкция относится к двухнитевому фрагменту рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащему один или несколько полинуклеотидов. Конструкция содержит матричную цепь, основания которой спарены с комплементарной смысловой или кодирующей цепью. Данная конструкция может быть встроена в вектор в двух возможных ориентациях, либо в той же (или смысловой) ориентации, либо в обратной (или антисмысловой) ориентации по отношению к ориентации промотора, расположенного в векторе, таком как вектор экспрессии.

Вектор относится к средству доставки нуклеиновой кислоты, которое содержит комбинацию компонентов нуклеиновой кислоты для обеспечения переноса нуклеиновой кислоты, конструкций нуклеиновых кислот и конъюгатов нуклеиновых кислот и тому подобного. Подходящие векторы включают в себя эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как кольцевые плазмиды из двухнитевой нуклеиновой кислоты; линеаризованные плазмиды из двухнитевой нуклеиновой кислоты и другие векторы любого происхождения.

Промотор относится к элементу/последовательности нуклеиновой кислоты, как правило расположенным выше по цепи и функционально связанным с фрагментом двухнитевой ДНК. Промоторы могут быть получены целиком из областей вблизи нативного представляющего интерес гена или могут состоять из разных элементов, полученных из различных нативных промоторов или сегментов синтетической ДНК.

Термины гомология, идентичность или сходство относятся к степени сходства последовательностей между двумя полипептидами или между двумя молекулами нуклеиновых кислот, сравниваемых путем выравнивания последовательностей. Степень гомологии между двумя отдельными сравниваемыми последовательностями нуклеиновых кислот является функцией количества идентичных или совпадающих нуклеотидов в сопоставимых положениях. Процент идентичности может быть определен путем визуального осмотра и математических расчетов. В качестве альтернативы процент идентичности двух последовательностей нуклеиновых кислот можно определить путем сравнения информации о последовательностях с применением компьютерной программы, такой как ClustalW, BLAST, FASTA или SmithWaterman. Процент идентичности двух последовательностей может принимать разные значения в зависимости от (i) способа, используемого для выравнивания последовательностей, например, ClustalW, BLAST, FASTA, способа Смита-Уотермана (используемых в разных программах), или структурного вы

- 13 041833 равнивания из 3D-сравнения; и (ii) параметров, используемых способом выравнивания, например, локального выравнивания по сравнению с глобальным, используемой матрицы замен пар (например, BLOSUM62, РАМ250, Gonnet и т.д.) и штрафа за пропуск, например, функциональной формы и констант. После проведения выравнивания существуют разные способы подсчета процента идентичности между двумя последовательностями. Например, можно разделить количество идентичностей на (i) длину самой короткой последовательности; (ii) длину выравнивания; (iii) среднюю длину последовательности; (iv) количество положений без пропуска; или (iv) количество эквивалентных положений за исключением выступающих концов. Более того, следует понимать, что процент идентичности также является строго зависимым от длины. Вследствие этого, чем более короткой является пара последовательностей, тем большую идентичность последовательностей, возникшую случайно, можно ожидать. Популярная программа для множественного выравнивания ClustalW (Nucleic Acids Research (1994) 22, 4673-4680; Nucleic Acids Research (1997), 24, 4876-4882) является подходящим способом получения множественных выравниваний полипептидов или полинуклеотидов.

Подходящие параметры для ClustalW могут являться следующими.

Для выравниваний полинуклеотидов: штраф за открытие пропуска=15,0, штраф за удлинение пропуска=6,66, матрица=идентичность.

Для выравниваний полипептидов:

штраф за открытие пропуска=10,0, штраф за удлинение пропуска=0,2, матрица=Gonnet.

Для выравниваний ДНК и белка: ENDGAP=-1 и GAPDIST=4. Специалистам в данной области техники известно, что может быть необходимо варьировать данные и другие параметры для оптимального выравнивания последовательностей. Соответствующим образом, затем проводят расчет процента идентичностей на основании такого выравнивания в виде (N/T), где N представляет собой количество положений, в которых в последовательностях присутствует идентичный остаток, и Т представляет собой общее количество сравниваемых положений, с включением пропусков, но за исключением выступающих концов.

Вариант означает в значительной степени аналогичную последовательность. Вариант может обладать аналогичной функцией или в значительной степени аналогичной функцией относительно последовательности дикого типа. Для вариантов, описанных в данном документе, аналогичная функция составляет по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80 или 90% от функции фермента дикого типа. Для вариантов, описанных в данном документе, по существу аналогичная функция составляет по меньшей мере приблизительно 90, 95, 96, 97, 98 или 99% от функции фермента дикого типа. Варианты могут иметь одну или более благоприятных мутаций, которые приводят к получению фермента, характеризующегося сниженным уровнем активности по сравнению с полипептидом дикого типа. Варианты могут иметь одну или более благоприятных мутаций, которые приводят к нокауту их активности (т.е. 100% ингибированию и, таким образом, нефункциональному полипептиду). Иллюстративные варианты, имеющие одну или более благоприятных мутаций, описаны в данном документе.

Термин растение относится к любому растению или части растения на любой стадии его жизненного цикла или развития, а также к его потомству. В одном варианте осуществления растение представляет собой растение табака, которое относится к растению, принадлежащему к роду Nicotiana. Предпочтительные виды растения табака описаны в данном документе. Соответствующим образом, растение представляет собой мутантное растение, в котором экспрессию одного или более генов или активность одного или более белков модулируют по сравнению с контрольным растением. Соответствующим образом, изменение, которое делает растение мутантным растением, приводит к модуляции экспрессии одного или более генов или модуляции активности одного или более полипептидов. В некоторых вариантах осуществления изменение представляет собой генетическое изменение или генетическую модификацию.

Части растения включают клетки растения, протопласты растений, тканевые культуры клеток растений, из которых можно регенерировать целое растение, каллюсы растений, корневища растений и клетки растений, которые являются интактными в растениях или частях растений, таких как зародыши, пыльца, пыльники, семяпочки, семена, листья, цветки, стебли, ветви, плод, корни, кончики корней и т.п. Потомство, варианты и мутанты регенерированных растений также включены в объем настоящего раскрытия при условии, что они содержат введенные полинуклеотиды, описанные в данном документе. Листья растений являются в особенности предпочтительными для применения в настоящем изобретении.

Клетка растения относится к структурной и физиологической единице растения. Клетка растения может находиться в виде протопласта без клеточной стенки, выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки, или может быть представлять часть более высокоорганизованной единицы, такой как без ограничения растительная ткань, орган растения или целое растение.

Термин растительный материал относится к любой твердой, жидкой или газообразной композиции, или их комбинации, получаемой из растения, включая биомассу, листья, стебли, корни, цветки или

- 14 041833 части цветка, плоды, пыльцу, яйцеклетки, зиготы, семена, черенки, секреты, экстракты, клеточные или тканевые культуры, или любые другие части или продукты растения. В одном варианте осуществления растительный материал содержит или состоит из биомассы, стеблей, семян или листьев. В другом варианте осуществления растительный материал содержит листья или состоит из них.

Термин разновидность относится к популяции из растений, которые обладают постоянными свойствами, отделяющими их от других растений того же вида. Имея один или несколько отличительных признаков, разновидность дополнительно характеризуется очень небольшой общей изменчивостью особей в пределах такой разновидности. Разновидность зачастую является предметом коммерческих продаж.

Термины линия или селекционная линия, используемые в данном документе, обозначают группу растений, которые используют при селекции растений. Линия отличается от разновидности, поскольку демонстрирует небольшую вариабельность между особями по одному или нескольким представляющим интерес признакам, хотя может присутствовать некоторая вариабельность между особями по другим признакам.

Термин не встречающийся в природе, используемый в данном документе, описывает объект (например, полинуклеотид, генетическую мутацию, полипептид, растение и клетку растения и растительный материал), который не образован природой или не существует в природе. Такие не встречающиеся в природе объекты или искусственные объекты можно создать, синтезировать, произвести, модифицировать, подвергнуть вмешательству или манипуляции способами, описанными в данном документе, или которые известны из уровня техники. Такие не встречающиеся в природе объекты или искусственные объекты можно создать, синтезировать, произвести, модифицировать, подвергнуть вмешательству или манипуляции человеком. Таким образом, в качестве примера не встречающееся в природе растение, не встречающуюся в природе клетку растения или не встречающийся в природе растительный материал можно создать с применением методик манипуляции с генами, например, с использованием антисмысловой РНК, интерферирующей РНК, мегануклеазы и т.п. В качестве дополнительного примера не встречающееся в природе растение, не встречающуюся в природе клетку растения или не встречающийся в природе растительный материал можно создать с применением интрогрессии или путем переноса одной или нескольких генетических мутаций (например, одного или нескольких полиморфизмов) от первого растения или клетки растения во второе растение или клетку растения (которые сами по себе могут быть встречающимися в природе), так что полученное растение, клетка растения или растительный материал или их потомство содержат генетическую структуру (например, геном, хромосому или ее сегмент), которая не образована естественным путем или которая не существует в природе. Полученное растение, клетка растения или растительный материал, таким образом, являются искусственными или не встречающимися в природе. Соответственно искусственные или не встречающиеся в природе растение или клетку растения можно создать путем модификации генетической последовательности в первом встречающемся в природе растении или клетке растения, даже если полученная генетическая последовательность встречается в природе во втором растении или клетке растения, генетический фон которых отличается от такового первого растения или клетки растения.

Термин модулирование может относиться к снижению, ингибированию, устранению, повышению или иному влиянию на экспрессию или активность полипептида. Этот термин может также относиться к снижению, ингибированию, устранению, повышению или иному влиянию на активность гена, кодирующего полипептид, который может включать в себя без ограничения модулирование транскрипционной активности.

Термины снижение или сниженный, используемые в данном документе, относятся к снижению от приблизительно 10% до приблизительно 99%, или снижению, составляющему по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 100% или более от количества или активности, такой как, без ограничения, полипептидная активность, транскрипционная активность и экспрессия белка.

Термины ингибировать или ингибированный или устранять или устраненный, используемые в данном документе, относятся к снижению от приблизительно 98% до приблизительно 100%, или снижению, составляющему по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, но в особенности 100% от количества или активности, такой как, без ограничения, полипептидная активность, транскрипционная активность и экспрессия.

Трансформация клетки может быть стабильной или временной. Термины временная трансформация или временно трансформированный или варианты указанных терминов относятся к введению одного или более экзогенных полинуклеотидов в клетку при отсутствии встраивания экзогенного полинуклеотида в геном клетки-хозяина. Напротив, термины стабильная трансформация или стабильно трансформированный относятся к введению и интеграции одного или более экзогенных полинуклеотидов в геном клетки. Термин стабильный трансформант относится к клетке, в которую стабильно интегрировали один или более экзогенных полинуклеотидов в геномную ДНК или ДНК органелл. Следует понимать, что организм или его клетка, трансформированные нуклеиновыми кислотами, конструкциями

- 15 041833 и/или векторами согласно настоящему изобретению, могут являться временно, а также стабильно трансформированными. В некоторых вариантах осуществления стабильная трансформация является предпочтительной.

Термин повышение или повышенный, используемые в данном документе, относятся к повышению от приблизительно 5% до приблизительно 99%, или повышению, составляющему по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 100% или более от количества или активности, такой как, без ограничения, полипептидная активность, транскрипционная активность и экспрессия белка.

Термин в значительной степени, используемый в данном документе и при использовании в контексте количества означает, что количество составляет по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 9%, по меньшей мере приблизительно 8%, по меньшей мере приблизительно 7%, по меньшей мере приблизительно 6%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 4%, по меньшей мере приблизительно 3%, по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 1% или по меньшей мере приблизительно 0,1% от количества, с которым его сравнивают.

Термин контроль в контексте контрольного растения или контрольной клетки растения и т.п. означает растение или клетку растения, в которых экспрессия или активность гена или белка, представляющих интерес, не были модулированы, и поэтому данный контроль может обеспечить сравнение или эталон относительно растения или клетки растения, в которых экспрессия или активность фермента были модифицированы. Таким образом, в контексте настоящего изобретения, контроль не будет содержать по меньшей мере одно генетическое изменение, которое снижает экспрессию или активность НМА4, описанного(описанных) в данном документе. Контрольное растение или клетка растения могут содержать пустой вектор. Контрольное растение или клетка растения могут соответствовать растению дикого типа или клетке растения дикого типа и т.п. Во всех таких случаях исследуемое растение и контрольное растение выращивают и собирают при одинаковых условиях с применением одинаковых протоколов для целей сравнения. Таким образом, в качестве примера исследуемое растение и контрольное растение могут быть выращены и собраны с почвы с приблизительно такими же уровнями содержания тяжелого (тяжелых) металла (металлов), такого как Cd, и, таким образом, можно выполнить сравнение между ними двумя. Это может привести к тому, что исследуемое растение и контрольное растение могут быть выращены в той же части поля, например, таким образом, их подвергают влиянию приблизительно таких же уровней Cd в почве. Изменения в уровнях, соотношениях, активности или распределении в отношении генов или полипептидов, описанных в данном документе, или изменения в фенотипе растения, в частности, сниженное накопление Cd и/или цинка, можно измерять способом, описанным в данном документе, сравнивая исследуемое растение с контрольным растением, соответствующим образом, при этом исследуемое растение и контрольное растение культивировали и/или собирали с применением одинаковых протоколов. Контрольное растение может обеспечивать эталонную точку для измерения изменений фенотипа исследуемого растения. Показатель изменений в фенотипе можно измерять в любой момент времени для растения, в том числе во время развития растения, старения или после обработки. Показатель изменений фенотипа можно измерять у растений, выращиваемых в любых условиях, в том числе у растений, выращиваемых в вегетационной камере, теплице или в поле. Изменения в фенотипе можно определить с помощью измерения содержания Cd и/или содержания цинка перед, и/или во время, и/или после отвердения или подсушивания с использованием способов, хорошо известных из уровня техники.

Термин поле, используемый в данном документе, предполагает его нормальное значение в области техники, а именно участок открытого грунта, в частности тот, который может быть засажен или засажен сельскохозяйственными культурами. Поле представляет собой часть окружающей природной среды, нежели искусственную среду - такую как лаборатория или теплица. Таким образом, в отличие от искусственной среды, которая обычно представляет собой строение или структуру, сделанные человеком, поле представляет собой часть открытой внешней среды.

Как описано в данном документе, экспрессия или активность НМА могут быть частично уменьшенными в мутантном растении. Используемый в данном документе термин частично уменьшен означает, что экспрессия или активность НМА в мутантном растении составляют от приблизительно 1% до 99% ниже, чем уровень экспрессии или активность НМА в контрольном растении. Соответствующим образом, экспрессия или активность НМА в мутантном растении составляют по меньшей мере от приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% ниже, чем уровень экспрессии или активности НМА в контрольном растении. В качестве примера ожидается, что нонсенс-мутация, которая отсекает большую часть белка НМА, не будет демонстрировать какой-либо ферментативной активности, тем самым приводя к полной потере активности (другими словами, нулевая активность). В качестве дополнительного примера для миссенс-мутации, ферментативная активность может быть такой же, как в контрольном растении, частично уменьшенной или не поддающейся выявлению (например, полностью утерянной или нулевой).

- 16 041833

Подробное описание

Выделенные варианты (мутанты) полипептида НМА4, описанные в данном документе, содержат полипептидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 и содержит по меньшей мере одну мутацию аминокислоты по сравнению с последовательностями дикого типа, изложенными в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 представляют собой немутированные последовательности. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответствуют аминокислотной последовательности АТФазы тяжелого металла Nicotiana tabacum (NtHMA4.1), № доступа в GenBank: CCQ77798, и аминокислотной последовательности АТФазы тяжелого металла Nicotiana tabacum (NtHMA4.2), № доступа в GenBank: CCW03243.1, соответственно. Соответствующим образом, выделенный полипептид содержит, состоит из или состоит по существу из последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 или 100% идентичностью последовательности с ним и содержит по меньшей мере одну мутацию аминокислоты. Определенные растения, такие как N. tabacum, содержат два гомолога НМА4, которые обозначаются в данном документе как НМА4.1 и НМА4.2.

В растении, клетке растения или растительном материале и им подобным функция или активность мутантного полипептида является модулируемой, уменьшенной, частично инактивированной, ингибированной, устраненной, приведенной к нокауту или утраченной. В одном варианте осуществления функция или активность мутантного полипептида может быть ингибированной, устраненной, приведенной к нокауту или утраченной, так что активность полипептида не поддается выявлению. В одном варианте осуществления функция или активность двух мутантных полипептидов (например, полипептидов, кодированных гомологами таких же генов) может быть ингибированной, устраненной, приведенной к нокауту или утраченной, так что активность полипептида не поддается выявлению.

В другом варианте осуществления функция или активность мутантного полипептида (например, одного гомолога гена) является утраченной, ингибированной или устраненной, так что активность полипептида не поддается выявлению, и функция или активность другого мутантного полипептида (например, второго гомолога гена) является уменьшенной или частично уменьшенной, так что активность полипептида НМА ниже по сравнению с контрольным полипептидом НМА, но все еще поддается выявлению. Иллюстративная комбинация мутаций данного типа представляет собой двойного гомозиготного мутанта G251D/Q561*, где мутация G251D частично уменьшает активность NtHMA4.1 (SEQ ID NO: 1), и мутация Q561* обеспечивает нокаут, ингибирует или устраняет активность NtHMA4.2 (SEQ ID NO: 2). Активность или SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2 является частично уменьшенной, и активность или SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2 является утраченной, ингибированной или устраненной при условии, что активность одного из полипептидов НМА4 является частично уменьшенной, и активность одного из НМА является утраченной. Активность или SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2 может быть частично уменьшенной, и активность или SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2 может быть утраченной, ингибированной или устраненной при условии, что активность одного из полипептидов НМА4 является частично уменьшенной, и активность одного из НМА является утраченной.

Соответствующим образом обеспечен полный нокаут по меньшей мере одного из НМА, и по меньшей мере один из НМА содержит нонсенс- или миссенс-мутацию, расположенные или в А-домене, в DKTGT-мотиве Р-домена, или в локусе HP N-домена.

В растении, клетке растения или растительном материале и им подобным активность NtHMA4.1 (SEQ ID NO: 1) и NtHMA4.2 (SEQ ID NO: 2) может быть утраченной, ингибированной или устраненной по сравнению с контрольным растением. Иллюстративная комбинация мутаций данного типа представляет собой двойной гомозиготный мутант Q293*/Q561*, где мутация Q293* обеспечивает нокаут, ингибирует или устраняет активность NtHMA4.1 (SEQ ID NO: 1) и мутация Q561* обеспечивает нокаут, ингибирует или устраняет активность NtHMA4.2 (SEQ ID NO: 2). Другие иллюстративные мутанты описаны в табл. 4 и 5. Предусмотрены комбинации или смеси вариантов (мутантов) полипептидов и полинуклеотидов НМА4.1 и НМА4.2, описанных в данном документе.

Для всех комбинаций такая же комбинация предусмотрена соответственно в другом гомологе. Например, предусмотрены комбинация НМА4.1 Е2 96K/ НМА4.2 Q561* и комбинация НМА4.1 Q561*/ НМА4.2 Е296К.

Соответствующим образом, варианты полипептида НМА4 приводят к тому, что растение, в котором они содержатся, характеризуется снижением количества Cd по меньшей мере на приблизительно 27, 33, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94 или 95% или более по сравнению с контролем.

Другие НМА с по меньшей мере 60% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, которые содержат по меньшей мере одну мутацию аминокислоты в положении (положениях), которые после выравнивания последовательностей соответствуют положениям, раскрытым в данном документе, и которые также предусмотрены для применения в настоящем изобретении. Примеры данных последовательностей включают последовательности НМА представителей семейства Solanaceae, таких как томат, картофель и баклажан.

Фрагменты вариантов полипептидов также предусмотрены, при условии, что они переносят одну

- 17 041833 или более мутаций аминокислоты. Фрагменты вариантов полипептидов могут варьировать от по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот, приблизительно 50 аминокислот, приблизительно 75 аминокислот, приблизительно 100 аминокислот приблизительно 150 аминокислот, приблизительно 200 аминокислот, приблизительно 250 аминокислот, приблизительно 300 аминокислот, приблизительно 400 аминокислот, приблизительно 500 аминокислот, приблизительно 600 аминокислот и до полноразмерного полипептида.

Варианты могут быть получены путем введения изменений любого типа (например, вставок, делеций или замены аминокислот, изменения структуры гликозилирования, изменения, которые влияют на повторное сворачивание или изомеризацию, трехмерную структуру или состояния самоассоциации), при условии, что мутантные полипептиды приводят к тому, что растение, в котором они экспрессируются, характеризуется по меньшей мере уменьшением накопления Cd, как описано в данном документе.

Варианты полипептидов включают в себя мутантов, полученных путем введения изменений любого типа (например, вставки, делеции или замены аминокислот, изменения структуры гликозилирования, изменения, которые влияют на повторное сворачивание или изомеризацию, трехмерную структуру или состояния самоассоциации), которые могут быть сконструированы преднамеренно или выделены естественным образом. Преднамеренные аминокислотные замены можно осуществлять, исходя из сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и амфипатической природы остатков при условии, что сохраняется вторичная активность связывания вещества. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, положительно заряженные аминокислоты включают в себя лизин и аргинин, и аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами с подобными значениями гидрофильности включают в себя лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Консервативные замены можно осуществлять, например, в соответствии с приведенной ниже таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке во второй колонке и, соответствующим образом, в одной и той же строке в третьей колонке можно заменять одна на другую.

АЛИФАТИЧЕСКИЕ	Неполярные	Gly Ala Pro Tie Leu Vai
Полярные - незаряженные	Cys Ser Thr Met Asn Gly
Полярные - заряженные	Asp Glu Lys Arg
АРОМАТИЧЕСКИЕ		His Phe Trp Tyr

Один предпочтительный тип мутаций представляет собой миссенс-мутацию, которая является точечной мутацией, в которой изменение одного нуклеотида обусловливает кодон, который кодирует другую аминокислоту. Миссенс-мутации могут быть особенно эффективными для частично инактивирования (например, уменьшения) полипептида НМА4, такого как НМА4.1 или НМА4.2.

Другой предпочтительный тип мутации представляет собой нонсенс-мутацию, которая является точечной мутацией, в которой изменение одного нуклеотида обусловливает преждевременный стоп-кодон или нонсенс-кодон в транскрибируемой мРНК и усеченный, неполный и нефункциональный полипептид НМА4, такой как НМА4.1 или НМА4.2. Нонсенс-мутации могут быть особенно эффективными для ингибирования или устранения, или приведения к нокауту активности полипептида НМА4, такого как НМА4.1 или НМА4.2.

Как описано в данном документе, экспрессия или активность одного из НМА4.1 или НМА4.2 по меньшей мере частично уменьшены, и экспрессия или активность другого НМА4.1 или НМА4.2 являются утраченными, устраненными или уменьшенными по сравнению с контрольным растением в некоторых вариантах осуществления. В одном варианте осуществления экспрессия или активность одного из НМА4.1 или НМА4.2 являются частично уменьшенными за счет использования точечной миссенсмутации, и экспрессия или активность другого НМА4.1 или НМА4.2 являются утраченными, устраненными или уменьшенными за счет использования точечной нонсенс-мутации.

Соответствующим образом мутации, описанные в данном документе, являются гетерозиготыми или гомозиготными мутациями. Соответствующим образом мутации, описанные в данном документе, являются гомозиготными мутациями.

Мутация (мутациии) может (могут) быть расположена (расположены), например, в регуляторном участке НМА4.1 или НМА4.2 или в кодирующей последовательности НМА4.1 или НМА4.2. В некоторых вариантах осуществления мутация (мутации) расположена (расположены) в кодирующей последовательности НМА4.1 или НМА4.2.

Полипептид НМА4 содержит различные домены, которые описаны в табл. 7.

Для комбинации мутантов, описанных в данном документе, такая же комбинация может быть включена в другой гомолог соответственно.

Экспрессия или активность по меньшей мере двух АТФаз тяжелого металла (НМА) являются частично уменьшенными, так что мутантное растение или его часть, содержащие НМА, проявляют по меньшей мере 27% уменьшение, по сравнению с контрольным растением, накопления кадмия в листе,

- 18 041833 когда мутантное растение выращено в поле в присутствии встречающегося в природе или не встречающегося в природе кадмия. Экспрессия или активность одного из НМА могут быть частично уменьшенными или утраченными, и экспрессия или активность другого НМА могут быть утраченными по сравнению с контрольным растением.

Соответствующим образом вариант полипептида НМА4 может содержать по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в А-домене полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Соответствующим образом вариант полипептида НМА4 может содержать по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в А-домене полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 251 до 296 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 251 до 296 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251, или 293, или 296 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Более соответствующим образом, вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251, или 293, или 296 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Соответствующим образом растение содержит меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Соответствующим образом растение содержит меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 223 до 265 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 223 до 265 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 223, или 234, или 235, или 265 N-домена А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 223, или 234, или 235, или 265 N-домена А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в P/N-домене полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в P/N-домене полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 402 до 464 петли P/N-домена полипептида НМА,

- 19 041833 кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 402 до 464 петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 402 или 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 402 или 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Соответствующим образом, вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в А-домене полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 петли P/N-домена, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в аминокислотном положении 265 в А-домене полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

Более соответствующим образом вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 петли P/N-домена, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в аминокислотном положении 265 в А-домене полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Соответствующим образом вариант содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: (i) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (ii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (iii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (iv) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (v) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (vi) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (vii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 немутированной последовательности изложенный в SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; (viii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; (ix) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон; или (х) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438

- 20 041833

SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон.

Соответствующим образом вариант содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: (i) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (ii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (iii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (iv) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (v) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (vi) нонсенсмутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и нонсенсмутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и Q561*, при этом * указывает на стопкодон; (vii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; (viii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; (ix) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон; или (х) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон.

Предусматривается, что любая из нонсенс-мутации может сочетаться с любой из миссенс-мутаций, описанных в данном документе.

Обобщенное представление данных, полученных с применением растений, содержащих вышеупомянутые варианты, когда они растут снаружи, в поле, изложено в табл. 4, 5 и 6. Растения, содержащие двойной мутант Q293*/Q561*, или Q293*/W265*, или Q464*/Q561*, или Q293*/G235E, или E296K/Q561*, или T402I/Q561*, проявляют около 80-96% уменьшения уровня Cd. Растения, содержащие двойной мутант G251D/Q561*, проявляют около 33-70% уменьшения уровня Cd. Растения, содержащие двойной мутант Q293VL223F или Q293*/D234N, проявляют около 27-37% уменьшения уровня Cd. На раннем этапе и при определенных условиях наблюдается задержка в развитии растения для двойных мутантов Q293*/Q561*, или Q293*/W265*, или Q464*/Q561*, или Q293*.G235E, или E296K/Q561*, или T402I/Q561*. Однако во время сбора не наблюдается четких различий в фенотипе между каждым из мутантов и контролем. G251D/Q561* демонстрирует нормальный рост и развитие. Хотя Q293*/Q561*, или Q293*/W265*, или Q464*/Q561*, или E296K/Q561*, или Q293*/G235E могут демонстрировать некротические поражения на своих листьях на раннем этапе, в зависимости от условий окружающей среды, присутствие некротических поражений не наблюдается при большинстве условий во время сбора в поле. Другие тестируемые комбинации мутаций (G382R/Q561*, V351M/Q561*, A188V/Q561*, Q293*/A369V, Q293*/A374V, T189I/Q561*, Q293*/S27L, q293*/A188V, G128E/Q561*) не приводят к значимому уменьшению уровня Cd или к большему уменьшению, чем 20%. Соответствующим образом в некоторых вариантах осуществления, двойной мутант не представляет собой G382R/Q561*, или V351M/Q561*, или A188V/Q561*, или Q293*/A369V, или Q293*/A374V, или T189I/Q561*, или Q293*/S27L, или Q293*/A188V, или G128E/Q561*.

Данные для некоторых из данных двойных мутантов, выращенных в теплице, показаны в табл. 8. Как можно видеть со сравнения таблицы 4 (полевое испытание) и табл. 8 (теплица), уровень уменьшения Cd для различных комбинаций мутаций обычно соответствуют друг другу.

- 21 041833

Дополнительных двойных мутантов протестировали в теплице. Результаты полученных данных представлены в табл. 9. С учетом общего соглашения по уровням уменьшения Cd для двойных мутантов, представленных в табл. 4 и 8, для данных по полю и данных по теплице можно предсказать, что данные по теплице, представленные в табл. 9, в общем будут также соответствовать результатам, которые будут получены с поля. Комбинации мутаций H438Y/W265* тестировали при тепличных условиях, только когда это приводило к уменьшению уровня Cd около 58%; изменений в фенотипе не наблюдали (табл. 9).

В некоторых вариантах осуществления двойные мутанты Q293*/Q561*, или Q293*/W265*, или E296K/Q561*, или T402I/Q561*, или Q464*/Q561*, или Q293*/G235E являются предпочтительными, поскольку они проявляют приблизительно 80% или более уменьшения уровня Cd в поле. В одном варианте осуществления данной предпочтительной комбинации мутантное растение или его часть содержат одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: (i) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (ii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (iii) миссенсмутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и нонсенсмутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и Q561*, при этом * указывает на стопкодон; (iv) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (v) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (vi) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон.

В одном варианте осуществления данной предпочтительной комбинации мутантное растение или его часть содержат одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: (i) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (ii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (iii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (iv) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (v) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (vi) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон.

В некоторых вариантах осуществления, двойные мутанты G251D/Q561*, или H438Y*/W265*, или Q293*/L223F, или Q293*/D234N являются предпочтительными (например, для введения в растения такие как табак, например, табак Берлей) поскольку они проявляют 27-70% уменьшения уровня Cd и с большей вероятностью не нарушают рост. В одном варианте осуществления данной предпочтительной комбинации мутантное растение или его часть содержат одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: (i) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (ii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y

- 22 041833 и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (iii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; (iv) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон.

В одном варианте осуществления данной предпочтительной комбинации мутантное растение или его часть содержат одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: (i) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (ii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (iii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; (iv) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q293* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон.

В некоторых вариантах осуществления, двойной мутант T402I/ Q561* является предпочтительным, поскольку он проявляет около 90% уменьшения уровня Cd и приемлемые морфологические характеристики даже на ранней стадии роста. Таким образом, согласно данному варианту осуществления мутантное растение или его часть содержат миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон.

Комбинации мутаций, описанные в данном документе, также предусмотрены. В частности, разные комбинации каждой из одиночных мутаций предусмотрены в двойных мутантах. Примеры таких комбинаций показаны в табл. 11 и 12, и они описаны ниже.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматическои петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

- 23 041833

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ

ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 третьей петли Р-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 третьей цитоплазматической петли P/N-домена по- 24 041833 липептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида

НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида

- 25 041833

НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления вариант содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого SEQ ID NO: 3.

Соответствующим образом, вариант содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: (i) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и W265**, при этом * указывает на стоп-кодон; (ii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; (iii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; (iv) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон; (v) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом,

- 26 041833 при этом мутации представляют собой Е296К и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (vi) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и L223F; (vii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; (viii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и G235E; (ix) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (х) миссенсмутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и миссенсмутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и L223F; (xi) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и D234N; (xii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и G235E; (xiii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (xiv) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и L223F; (xv) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и D234N; (xvi) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и G235E; (xvii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (xviii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; (xix) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; или (хх) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон.

Соответствующим образом вариант содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: (i) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и W265**, при этом * указывает на стоп-кодон; (ii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; (iii) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; (iv) нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Q464* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон; (v) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом,

- 27 041833 при этом мутации представляют собой Е296К и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (vi) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и L223F; (vii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; (viii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой Е296К и G235E; (ix) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (х) миссенсмутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и миссенсмутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и L223F; (xi) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и D234N; (xii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой T402I и G235E; (xiii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон; (xiv) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и L223F; (xv) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и D234N; (xvi) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой G251D и G235E; (xvii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон; (xviii) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон; (xix) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон; или (хх) миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутации в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, соответствующим образом, при этом мутации представляют собой H438Y и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон.

Полинуклеотид, описанный в данном документе, обычно содержит фосфодиэфирные связи, хотя в некоторых случаях включены полинуклеотидные аналоги, которые могут иметь альтернативные остовы, содержащие, например, фосфороамидатные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные или Ометилфосфороамидитные связи; и пептидные полинуклеотидные остовы и связи. Другие аналоги полинуклеотидов включают в себя полинуклеотиды с положительно заряженными остовами, неионными остовами и безрибозными остовами. Модификации рибозофосфатного остова можно делать по целому ряду причин, например, для повышения стабильности и периода полужизни таких молекул в физиологических средах или в качестве зондов на биочипе. Можно получать смеси природных полинуклеотидов и аналогов; в качестве альтернативы можно получать смеси разных полинуклеотидных аналогов и смеси встречающихся в природе полинуклеотидов и аналогов.

Выделенные варианты (мутанты) полинуклеотидов НМА4, описанные в данном документе, содержат полипептидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию нуклеотида по сравнению с последовательностью дикого типа, изложенной под SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 представляют собой немутированные последовательности. SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответствуют полинуклеотидной последовательности АТФазы тяжелого металла Nicotiana

- 28 041833 tabacum (NtHMA4.1), номер доступа в GenBank: HF675181.1, и АТФазе тяжелого металла Nicotiana tabacum (NtHMA4.2), номер доступа в GenBank: HF937054.1 соответственно. Соответствующим образом выделенный полипептид содержит, состоит или состоит по существу из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 или 100% идентичностью последовательности с ним, и по меньшей мере одну мутацию нуклеотида.

Соответствующим образом растение содержит по меньшей мере одну мутацию в каждой из SEQ ID NO: 3 и SEQ NO: 4 и/или фрагменте гена, которая нарушает трансляцию РНК-транскрипта, кодирующего НМА, изложенные в (ii), соответствующим образом, где мутация представляет собой миссенс-мутацию или нонсенс-мутацию.

Известно множество полинуклеотидных аналогов, включающих, например, фосфороамидатные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные или О-метилфосфороамидитные связи и пептидные полинуклеотидные остовы и связи. Другие аналоги полинуклеотидов включают в себя полинуклеотиды с положительно заряженными остовами, неионными остовами и безрибозными остовами. Полинуклеотиды, содержащие один или несколько карбоциклических сахаров, также включены.

Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации для полинуклеотидов, и руководство для разработки подходящих условий описаны в Sambrook et al., 1989. Используя данные о генетическом коде в комбинации с аминокислотными последовательностями, описанными в данном документе, можно получить наборы вырожденных олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды применимы в качестве праймеров, например, в полимеразных цепных реакциях (ПЦР), с помощью которых выделяют и амплифицируют фрагменты ДНК. В определенных вариантах осуществления вырожденные праймеры можно использовать в качестве зондов для генетических библиотек. Такие библиотеки будут включать в себя, без ограничения, библиотеки кДНК, геномные библиотеки и даже электронные библиотеки меток экспрессируемых последовательностей или ДНК библиотеки. Гомологичные последовательности, идентифицированные этим способом, будут затем использованы в качестве зондов для идентификации гомологов последовательностей, указанных в данном документе.

Кроме того, потенциальное применение имеют полинуклеотиды и олигонуклеотиды (например, праймеры или зонды), которые гибридизируются в условиях пониженной жесткости, как правило в условиях средней жесткости, и обычно в условиях высокой жесткости с полинуклеотидом (полинуклеотидами), описанным (описанными) в данном документе. Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации, и руководство для разработки подходящих условий могут с легкостью определить средние специалисты в данной области техники на основании, например, длины или состава оснований полинуклеотида. Один из путей достижения условий средней жесткости включает в себя применение раствора для предварительной отмывки, содержащего 5х стандартный цитрат натрия, 0,5% додецилсульфата натрия, 1,0 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (рН 8,0), гибридизационного буфера с приблизительно 50% формамида, бх стандартного цитрата натрия и температуры гибридизации при приблизительно 55°С (или других подобных гибридизационных растворов, таких как содержащий приблизительно 50% формамида при температуре гибридизации около 42°С) и условий отмывки при приблизительно 60°С с применением 0,5х стандартного цитрата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия. Как правило, условия высокой жесткости определяются как условия гибридизации, как описано выше, но с отмывкой при примерно 68 С, с применением 0,2х стандартного цитрата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия. SSPE (1х SSPE представляет собой 0,15 М хлорида натрия, 10 мМ фосфата натрия и 1,25 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 7,4) можно заменить стандартным цитратом натрия (1х стандартный цитрат натрия представляет собой 0,15 М хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия) в гибридизационных и отмывочных буферах; при этом отмывку выполняют в течение 15 мин после завершения гибридизации. Следует понимать, что температуру отмывания и концентрацию солей для отмывания можно скорректировать по мере необходимости для достижения желаемой степени жесткости с применением основных принципов, которые регулируют реакции гибридизации и стабильность двойной спирали, как это известно специалистам в данной области и дополнительно описано ниже (см., например, Sambrook, et al., 1989). При гибридизации полинуклеотида с целевым полинуклеотидом с неизвестной последовательностью предполагается, что длина гибрида будет такой как у гибридизирующегося полинуклеотида. Когда гибридизируют полинуклеотиды с известными последовательностями, длина гибрида может быть определена путем выравнивания последовательностей полинуклеотидов и идентификации участка или участков с оптимальной комплементарностью последовательности. Температура гибридизации для гибридов, которые предположительно составят менее чем 50 пар оснований в длину, должна быть на 5-10 С меньше, чем температура плавления гибрида, где температуру плавления определяют в соответствии со следующими уравнениями. Для гибридов, длина которых составляет менее 18 пар оснований, температура плавления (°С)=2 (количество оснований А+Т)+4 (количество оснований G+C). Для гибридов, длина которых составляет более 18 пар оснований, температура плавления (°С)=81,5+16,6 (log10 [Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), где N -количество оснований в гибриде и [Na+] - концентрация ионов натрия в гибридизационном буфере ([Na+] для 1х стандартного цитрата натрия = 0,165 М). Как правило, каждый такой гибридизирующийся полинуклеотид имеет длину, которая составляет по меньшей мере 25% (обычно, по

- 29 041833 меньшей мере 50, 60 или 70%, и наиболее часто по меньшей мере 80%) от длины полинуклеотида, с которым он гибридизируется, и характеризуется по меньшей мере 60% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) с полинуклеотидом, с которым он гибридизируется.

Выделенные полинуклеотиды также предусмотрены. Выделенный полинуклеотид не содержит последовательностей (оптимально, белок-кодирующих последовательностей), которые в естественных условиях фланкируют полинуклеотид (например, последовательностей, расположенных на 5'- и 3'-концах полинуклеотида) в геномной ДНК организма, из которого получен полинуклеотид. Например, в различных вариантах осуществления выделенный полинуклеотид может содержать менее приблизительно 5 т.о., 4 т.о., 3 т.о., 2 т.о., 1 т.о., 0,5 т.о. или 0,1 т.о. нуклеотидной последовательности, которая в естественных условиях фланкирует полинуклеотид в геномной ДНК клетки, из которой получен полинуклеотид.

Рекомбинантные конструкции могут быть использованы для трансформации растений или клеток растения. Рекомбинантная полинуклеотидная конструкция может содержать полинуклеотид, кодирующий один или более вариантов полипептидов, описанных в данном документе, функционально связанных с регуляторным участком, подходящим для экспрессии варианта полипептида. Таким образом, полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность, которая кодирует вариант полипептида. Растение или клетка растения могут содержать геном, который был изменен путем стабильной интеграции рекомбинантной ДНК. Рекомбинантная ДНК включает ДНК, полученную с помощью методик генной инженерии и сконструированную вне клетки, и включает ДНК, содержащую встречающуюся в природе ДНК, или кДНК, или синтетическую ДНК. Растение может включать в себя растение, регенерированное из первоначально трансформированной клетки растения, и растения-потомки от более поздних поколений или скрещиваний трансформированного растения. Соответствующим образом, модификация изменяет экспрессию или активность полинуклеотида НМА или полипептида НМА, описанных в данном документе, по сравнению с контрольным растением. В некоторых вариантах осуществления использован не относящийся к ГМО подход для уменьшения накопления Cd за счет использования инактивации гена. Таким образом, например, использованы мутанты с наличием одного или более нуклеотидных полиморфизмов, полученных за счет использования одного или более экзогенно добавляемых химических веществ - таких как мутагенные, тератогенные или канцерогенные органические соединения, например, этилметансульфонат (EMS), которые вызывают случайные мутации в используемом генетическом материале. ДНК-библиотеку обработанных растений можно подвергнуть скринингу для мутаций в двух генах НМА4.

Также предложены векторы, содержащие рекомбинантные полинуклеотидные конструкции, такие как описанные в данном документе. Подходящие основы для векторов включают в себя, например, те, которые обычно используют в данной области, такие как плазмиды, вирусы, искусственные хромосомы, искусственные хромосомы бактерий, искусственные хромосомы дрожжей или искусственные хромосомы бактериофагов. Подходящие векторы экспрессии включают в себя, без ограничения, плазмиды и вирусные векторы, полученные из, например, бактериофага, бакуловирусов и ретровирусов. Многочисленные векторы и системы экспрессии являются коммерчески доступными. Векторы могут включать в себя, например, точки начала репликации, участки связывания с ядерным матриксом или маркеры. Маркерный ген может придавать клетке растения селектируемый фенотип. Например, маркер может придавать биоцидную устойчивость, такую как устойчивость к антибиотику (например, к канамицину, G418, блеомицину или гигромицину) или к гербициду (например, к глифосату, хлорсульфурону или фосфинотрицину). Кроме того, вектор экспрессии может включать в себя последовательность метки, предназначенную для облегчения манипуляций или выявления (например, очистки или локализации) экспрессированного полипептида. Последовательности меток, такие как последовательности люциферазы, бетаглюкуронидазы, зеленого флуоресцентного белка, глутатион S-трансферазы, полигистидина, с-myc или гемагглютинина, как правило, экспрессируются в виде слияния с кодируемым полипептидом. Такие метки могут быть вставлены в любом месте в пределах варианта полипептида НМА, в том числе на карбоксильном или амино-конце.

Растение или клетку растения можно трансформировать путем интегрирования рекомбинантного полинуклеотида в ее геном, чтобы они стали стабильно трансформированными. Растение или клетка растения, описанные в данном документе, могут быть стабильно трансформированными. Стабильно трансформированные клетки, как правило, сохраняют введенный полинуклеотид при каждом клеточном делении. Растение или клетка растения также могут быть временно трансформироваными, так что рекомбинантный полинуклеотид не интегрируется в их геном. Временно трансформированные клетки, как правило, теряют весь введенный рекомбинантный полинуклеотид или некоторую его часть при каждом клеточном делении, так что введенный рекомбинантный полинуклеотид невозможно выявлять в дочерних клетках после достаточного числа клеточных делений. Также предусматривается применение редактирования генома.

В данной области техники существует целый ряд способов, доступных для трансформации клетки растения, каждый из которых охвачен данным документом, в том числе, биолистика, методики с применением генной пушки, Agrobacterium-опосредованная трансформация, опосредованная вирусным векто- 30 041833 ром трансформация и электропорация. Система Agrobacterium для интеграции чужеродной ДНК в хромосомы растений была тщательно изучена, модифицирована и использована для генной инженерии растений. Молекулы депротеинизированной рекомбинантной ДНК, содержащие последовательности ДНК, соответствующие исследуемому очищенному белку, функционально связанные в смысловой или антисмысловой ориентации с регуляторными последовательностями, соединяют с соответствующими последовательностями Т-ДНК с помощью общепринятых способов. Данные молекулы вводят в протопласты при помощи методики на основе полиэтиленгликоля или методики электропорации, каждая из которых является стандартной. В качестве альтернативы такие векторы, содержащие молекулы рекомбинантной ДНК, кодирующие исследуемый очищенный белок, вводят в живые клетки Agrobacterium, которые затем переносят ДНК в клетки растения. Трансформацию с помощью депротеинизированной ДНК без сопутствующих векторных последовательностей Т-ДНК можно выполнять с помощью слияния протопластов с ДНК-содержащими липосомами или с помощью электропорации. Депротеинизированную ДНК без сопутствующих векторных последовательностей Т-ДНК также можно использовать для трансформации клеток с помощью инертных высокоскоростных микрочастиц.

Выбор регуляторных участков, которые следует включить в рекомбинантную конструкцию, зависит от нескольких факторов, в том числе, без ограничения, от эффективности, селектируемости, индуцируемости, необходимого уровня экспрессии и предпочтительной экспрессии в определенных клетках или тканях. Обычным делом для специалиста в данной области техники является модулирование экспрессии кодирующей последовательности варианта НМА путем соответствующего выбора и размещения регуляторных участков по отношению к кодирующей последовательности. Аналогичным образом можно модулировать транскрипцию полинуклеотида. Некоторые подходящие регуляторные участки инициируют транскрипцию исключительно или преимущественно в определенных типах клеток. Способы идентификации и определения свойств регуляторных участков в геномной ДНК растений хорошо известны из уровня техники. Примеры промоторов включают в себя тканеспецифичные промоторы, распознаваемые тканеспецифичными факторами, присутствующими в разных типах тканей или клеток (например, специфичные для корня промоторы, специфичные для побега промоторы, специфичные для ксилемы промоторы), или присутствующими на различных стадиях развития, или присутствующими в ответ на различные условия окружающей среды. Примеры промоторов включают в себя конститутивные промоторы, которые могут активироваться в большинстве типов клеток без необходимости в специфических индукторах. Примеры промоторов для контроля над образованием полипептида RNAi включают в себя промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV/35S), SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos или промоторы убиквитина или фазеолина. Специалисты в данной области могут создавать множество вариантов рекомбинантных промоторов. В дополнение к растительным промоторам можно получить другие подходящие промоторы бактериального происхождения (например, промотор гена октопинсинтазы, промотор гена нопалинсинтазы и другие промоторы, полученные из Ti-плазмид), или их можно получить из вирусных промоторов (например, РНК-промоторы 35S и 19S вируса мозаики цветной капусты (CaMV), конститутивные промоторы вируса табачной мозаики, промоторы 19S и 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) или промотор 35S вируса мозаики норичника).

Следует понимать, что уменьшение или ингибирование экспрессии или активности НМА, описанных в настоящей заявке, можно достичь различными способами. Например, предусмотрено встраивание одной или нескольких мутаций в по меньшей мере один ген, кодирующий НМА, включая делеции, вставки, сайт-специфичные мутации, нуклеазы с цинковыми пальцами и т.п.

В одном аспекте предложено мутантное растение или его часть, характеризующиеся по меньшей мере частично уменьшенной экспрессией или активностью по меньшей мере двух АТФаз тяжелого металла (НМА), при этом две указанных НМА содержат, состоят из или состоят, по сути, из: (i) полипептидов, характеризующихся по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2; (ii) полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, изложенные в (i); или (iii) полинуклеотидов, которые характеризуются по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, которые кодируют НМА; при этом мутантное растение или его часть проявляют по меньшей мере 27% уменьшение, по сравнению с контрольным растением, накопления кадмия в листе, когда мутантное растение выращено в поле в присутствии встречающегося в природе или не встречающегося в природе кадмия.

Экспрессию или активность НМА можно модулировать за счет использования одной или более мутаций, которые приводят к уменьшению экспрессии или функции указанного гена или белка, кодируемого им. Помимо одной или более мутаций, описанных в данном документе, мутантное растение или клетка растения могут иметь одну или более дополнительных мутаций в одном или нескольких других генах или полипептидах. В некоторых вариантах осуществления мутанты могут иметь одну или более дополнительных мутаций в одном или более других генах или полипептидах.

В другом аспекте предусмотрен способ уменьшения уровня кадмия в листе выращенного в поле растения, который предусматривает стадии: (а) уменьшения экспрессии или активности двух АТФаз тяжелого металла (НМА), при этом указанные две НМА предусматривают, состоят из или состоят, по сути, из: (i) полипептидов, характеризующихся по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с

- 31 041833

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2; (ii) полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, изложенные в (i); или (iii) полинуклеотидов, которые характеризуются по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, кодирующими НМА; (b) выращивания растений в поле; (с) необязательно измерений содержания кадмия в растениях, полученных на стадии (b); и (d) идентификации растения, в котором содержание кадмия, имеющегося в нем, уменьшено по сравнению с контрольным растением, в котором экспрессия или активность НМА не были уменьшены, соответствующим образом, при этом растение или его часть проявляют по меньшей мере 27% уменьшение, по сравнению с контрольным растением, накопления кадмия в листе, когда растение выращено в поле в присутствии встречающегося в природе или не встречающегося в природе кадмия; соответствующим образом, при этом фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, соответствующим образом, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора. В некоторых вариантах осуществления экспрессия или активность двух НМА являются уменьшенными с помощью применения подхода с обеспечением мутагенеза, описанного в данном документе, или за счет использования мутантов, описанных в данном документе.

Время сбора растения будет, тем самым, очевидным специалисту в данной области техники. Другими словами, специалист в данной области будет знать, когда растение готово для сбора. В качестве примера специалист в данной области техники знает, когда собирать растение табака, поскольку листья растения табака начинают созревать. Для определенных разновидностей табака это значит, что листья начинают становиться желтыми, что подразумевалось и является желаемым для надлежащего высушивания. Также известны разновидности табака, который высыхает с изменением цвета от зеленого до коричневого или от зеленого до желтого и до коричневого. Растения могут быть собраны целиком или частично после того, как часть растения готова к сбору. Например, для растений табака время сбора может быть определено для каждого положения стебля. Листья в нижней части стебля табака сперва начнут менять цвет (например, на желтый) и могут быть собраны, и верхние листья затем также пожелтеют для дальнейшего сбора. Также предусмотрен способ идентификации одного или более генетических изменений в растениях, выращенных в поле, которые коррелируют с уменьшением уровней кадмия в листе по сравнению с выращенным в поле контрольным растением, которое не содержит одного или более генетических изменений, при этом указанный способ предусматривает стадии: (а) идентификации растения с уменьшенными уровнями кадмия в листьях при выращивании в поле по сравнению с контрольным растением, которое выращено в поле, при этом необязательно фенотип растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, соответствующим образом, при этом растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора; (b) обеспечения образца нуклеиновой кислоты из растения, идентифицированного на стадии (а); и (с) идентификации в образце нуклеиновой кислоты из стадии (b) одного или более генетических изменений в полинуклеотидных последовательностях, кодирующих НМА, которые характеризуются по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с немутированными последовательностями, изложенными под SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, или в полинуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления одна или более благоприятных мутаций идентифицированы за счет использования скрининга популяции мутантных растений. В некоторых вариантах осуществления одна или более благоприятных мутаций, которые определены за счет применения скринингового подхода, могут быть введены в разные растения или клетку растения, и введенная мутация может быть идентифицирована или выбрана с применением способов, известных специалисту в данной области техники, таких как анализ методом Саузерн-блоттинга, секвенирование ДНК, ПЦР-анализ или фенотипический анализ. Мутации, которые влияют на экспрессию генов или которые нарушают функцию кодируемого белка НМА, можно определять с применением способов, хорошо известных из уровня техники.

Любое представляющее интерес растение, в том числе клетку растения или растительный материал, можно модифицировать различными способами, с помощью которых, как известно, индуцируется мутагенез, в том числе сайт-направленный мутагенез, олигонуклеотид-направленный мутагенез, индуцированный химическими соединениями мутагенез, индуцированный ионизирующим излучением мутагенез, мутагенез с применением модифицированных оснований, мутагенез с применением содержащих пропуски ДНК-дуплексов, мутагенез с двухнитевыми разрывами, мутагенез с применением штаммов хозяев с нарушенной репарацией, мутагенез посредством синтеза полного гена, ДНК-шаффлинг и другие эквивалентные способы.

Варианты мутантного полипептида можно применять для создания мутантных растений или клеток растений, содержащих один или более вариантов мутантного полипептида. Активность НМА мутантного варианта полипептида может быть выше, ниже или приблизительно такой же, как у немутированного полипептида. Соответствующим образом, активность НМА вариантов мутантного полипептида является частично инактивированной (например, уменьшенной) или утраченной (например, ингибированной или устраненной), как описано в данном документе.

- 32 041833

Мутации в нуклеотидных последовательностях и полипептидах, описанных в данном документе, могут включать внесенные человеком мутации или синтетические мутации, или мутации, созданные при помощи генной инженерии. Мутации в нуклеотидных последовательностях и полипептидах, описанных в данном документе, могут быть мутациями, которые получены или которые можно получить с помощью способа, который включает в себя стадию манипуляции in vitro или in vivo. Мутации в нуклеотидных последовательностях и полипептидах, описанных в данном документе, могут быть мутациями, которые получены или которые можно получить с помощью способа, который включает в себя вмешательство человека. В качестве примера способ может включать в себя мутагенез с применением экзогенно добавляемых химических соединений, таких как мутагенные, тератогенные или канцерогенные органические соединения, например, этилметансульфонат (EMS), которые приводят к случайным мутациям в генетическом материале. В качестве дополнительного примера способ может включать в себя одну или более стадий генной инженерии - таких как одна или более стадий генной инженерии, которые описаны в данном документе, или их комбинации. В качестве дополнительного примера способ может включать в себя одну или более стадий скрещивания растений.

Активность одного или более полипептидов НМА в растении является сниженной или ингибированной согласно настоящему изобретению, если активность полипептида НМА является статистически меньшей, чем активность того же полипептида НМА или полипептидов в растении, которое не было модифицировано с целью ингибирования активности данного полипептида НМА, и которое культивировали и собирали с применением тех же протоколов. Активность полипептида НМА в растении считается устраненной, если данная активность не поддается выявлению с помощью аналитических способов, описанных в данном документе. Для того, чтобы анализировать активность транспорта Cd мутантного белка НМА, может быть использован анализ, основанный на дрожжах. В этом анализе полноразмерную последовательность можно клонировать в вектор экспрессии дрожжей и экспрессировать в Cd-чувствительном дрожжевом мутанте ycf1. Клетки в лог фазе разбавляют до разных OD₆₀₀ и помещают на среду, содержащую Cd. Выносливость штамма в отношении Cd отображает транспортную активность мутантного белка НМА. В качестве альтернативы активность может быть установлена при сочетании мутированной последовательности НМА со второй нонсенс-мутацией НМА, которая ликвидирует транспортную активность НМА. Ожидается, что нонсенс-мутация, которая отсекает большую часть белка, не будет демонстрировать никакой транспортной активности. Для миссенс-мутации ферментативная активность может быть либо частично уменьшена, или полностью утрачена. Если значения Cd в двойном мутанте, который сочетает в себе нонсенс и миссенс-мутации, являются аналогичными контрольным, можно сделать вывод, что миссенс-мутация не имеет значимого влияния на активность белка. Если значения Cd и/или фенотип находятся между двойной нонсенс-мутацией и контролем, можно предположить частичную активность миссенс-мутации. Если значения Cd и фенотип являются аналогичными двойному нонсенсмутанту НМА, можно сделать вывод, что миссенс-мутация ликвидирует транспортную активность.

Способы, с помощью которых случайным образом вводят случайную мутацию в последовательность гена, могут включать химический мутагенез, мутагенез с помощью EMS и радиационный мутагенез. Способы, которые позволяют вводить одну или более целевых мутаций в клетку, включают без ограничения технологию редактирования генома, в частности, мутагенез, опосредованный нуклеазой с цинковыми пальцами (рассмотрено в Petolino, 2015), целенаправленное введение индуцированных локальных повреждений в геномах (TILLING) (рассмотрено в Chen et al., 2014), мутагенез, опосредованный мегануклеазой (см., например, Arnould et al., 2011), TALEN (рассмотрено в Wright et al., 2014) и систему CRISPR/Cas (рассмотрено в Bortesi and Fischer, 2015). Способы редактирования генома/гена в растениях рассмотрено, например, в Puchta and Fauser (2013), Qiwei and Caixia, (2015) и Chen and Gao (2014).

Комбинации различных способов, описанных выше, также предусмотрены. Другими словами, активность или экспрессия одной НМА может быть модулирована с применением одной конкретной методики, а таковая второй НМА может быть модулирована с применением другой методики.

Некоторые не ограничивающие примеры мутаций представляют собой делеции, вставки, нонсенс- и миссенс-мутации по меньшей мере одного нуклеотида, однонуклеотидные полиморфизмы и простую повторяющуюся последовательность. После внесения мутации можно провести скрининг для идентификации мутаций, которые создают ранние стоп-кодоны или иным образом нефункциональные гены. Скрининг мутантов можно выполнить путем секвенирования, или путем применения одного или более зондов или праймеров, специфичных для данного гена или белка. Можно также создать в полинуклеотидах конкретные мутации, которые приводят в результате к модулированию экспрессии гена, модулированию стабильности мРНК или модулированию стабильности белка. Такие растения обозначены в данном документе как не встречающиеся в природе или мутантные растения. Мутантные или не встречающиеся в природе растения могут включать в себя по меньшей мере часть чужеродной, или синтетической, или созданной человеком нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), которая не присутствовала в растении до проведения с ним манипуляций. Чужеродной нуклеиновой кислотой может быть один нуклеотид, два или более нуклеотидов, два или более смежных нуклеотидов или два или более несмежных нуклеотидов, например, по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 или 1500 более смежных или несмежных нуклеотидов.

- 33 041833

В одном варианте осуществления семена растений подвергают мутагенезу и затем выращивают из них мутантные растения первого поколения, которые затем подвергают скринингу на наличие мутаций в их локусах. Может допускаться самоопыление растений первого поколения, и из семян растений первого поколения выращивают растения второго поколения, которые затем подвергают скринингу на наличие мутаций в их локусах. Хотя подвергнутый мутагенезу растительный материал (включая семена) можно подвергать скринингу на наличие мутаций, преимуществом скрининга растений второго поколения является то, что все соматические мутации соответствуют мутациям зародышевой линии. Специалисту в данной области будет понятно, что различный растительный материал, в том числе без ограничения семена, пыльцу, растительные ткани или клетки растения, можно подвергать мутагенезу для создания мутантных растений. Однако тип растительного материала, подвергнутого мутагенезу, может иметь значение, когда нуклеиновую кислоту растения подвергают скринингу на наличие мутаций. Например, если пыльцу подвергают мутагенезу до проведения опыления не подвергаемого мутагенезу растения, из семян, полученных в результате такого опыления, выращивают растения первого поколения. Каждая клетка растений первого поколения будет содержать мутации, созданные в пыльце; таким образом, эти растения первого поколения можно затем подвергать скринингу на наличие мутаций вместо того, чтобы дожидаться второго поколения.

Для создания мутаций можно применять мутагены, которые создают главным образом точечные мутации и короткие делеции, вставки, трансверсии и/или транзиции, включая химические мутагены и облучение. Мутагены включают без ограничения этилметансульфонат, метилметансульфонат, К-этил-Книтрозомочевину, триэтилмеламин, К-метил-К-нитрозомочевину, прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамид, диэтилсульфат, акриламидный мономер, мельфалан, азотистый иприт, винкристин, диметилнитрозамин, К-метил-К'-нитро-нитрозогуанидин, нитрозогуанидин, 2-аминопурин, 7,12-диметилбенз(а)антрацен, этиленоксид, гексаметилфосфорамид, бисульфан, диэпоксиалканы (диэпоксиоктан, диэпоксибутан и т.п.), 2-метокси-6-хлор-9-[3-(этил-2-хлорэтил)аминопропиламино]акридина дигидрохлорид и формальдегид.

Также предусматриваются спонтанные мутации в локусе, которые могут не быть непосредственно вызванными мутагеном, при условии, что они приводят к требуемому фенотипу. Подходящие мутагенные средства могут также включать в себя, например, ионизирующее излучение, такое как рентгеновское излучение, гамма-излучение, излучение быстрых нейтронов и ультрафиолетовое излучение. Любой способ получения нуклеиновой кислоты растения, известный специалистам в данной области, можно использовать для получения нуклеиновой кислоты растения для скрининга в отношении мутаций.

Нуклеиновую кислоту, полученную из отдельных растений, клеток растения или растительного материала, можно необязательно объединить, чтобы ускорить скрининг в отношении мутаций в популяции растений, происходящих из подвергнутых мутагенезу растительных тканей, клеток или материала. Можно подвергать скринингу одно или более следующих поколений растений, клеток растения или растительного материала. Размер необязательно объединенной группы зависит от чувствительности используемого способа скрининга.

После необязательного объединения образцов нуклеиновых кислот, их можно подвергнуть методикам полинуклеотид-специфичной амплификации, таким как полимеразная цепная реакция. Любой один или более праймеров или зондов, специфичных в отношении гена или последовательностей, непосредственно примыкающих к гену, можно использовать для амплификации последовательностей в пределах необязательно объединенного образца нуклеиновых кислот. Примеры олигонуклеотидных праймеров описаны в данном документе.

Соответствующим образом, один или более праймеров или зондов конструируют для амплификации участков локуса, в которых с наибольшей вероятностью возникают полезные мутации. Наиболее соответствующим образом, праймер конструируют для выявления мутаций в участках полинуклеотида. Кроме того, для праймера (праймеров) и зонда (зондов) желательно избегать известных сайтов полиморфизмов для облегчения скрининга на точечные мутации. Для облегчения выявления продуктов амплификации один или несколько праймеров или зондов можно метить с применением любого общепринятого способа введения метки. Праймер (праймеры) или зонд (зонды) можно сконструировать на основе последовательностей, описанных в данном документе, с применением способов, которые хорошо известны из уровня техники.

Для облегчения обнаружения продуктов амплификации праймер (праймеры) или зонд (зонды) можно пометить с применением любого общепринятого способа внесения метки. Их можно сконструировать на основе последовательностей, описанных в данном документе, с применением способов, которые хорошо известны в данной области. Полиморфизмы можно идентифицировать с помощью средств, известных из уровня техники, и некоторых из описанных в литературе.

В дополнительном аспекте предложен способ получения мутантного растения. Способ включает обеспечение по меньшей мере одной клетки растения, содержащей ген, кодирующий функциональный полипептид НМА, описанный в данном документе (или любую их комбинацию, описанную в данном документе). Далее эту по меньшей мере одну клетку растения обрабатывают в условиях, эффективных для модулирования активности полипептида (полипептидов) НМА, описанного (описанных) в данном

- 34 041833 документе. По меньшей мере одну мутантную клетку растения затем размножают в мутантное растение, где мутантное растение имеет модулированный уровень полипептида (полипептидов) НМА по сравнению с уровнем у контрольного растения. В одном варианте осуществления данного способа получения мутантного растения стадия обработки включает воздействие по меньшей мере на одну клетку химическим мутагенным средством, описываемым выше, и в условиях, эффективных для получения по меньшей мере одной мутантной клетки растения. В другом варианте осуществления данного способа стадия обработки включает воздействие по меньшей мере на одну клетку источником ионизирующего излучения в условиях, эффективных для получения по меньшей мере одной мутантной клетки растения. Термин мутантное растение включает мутантные растения, в которых генотип модифицирован по сравнению с контрольным растением.

В некоторых вариантах осуществления мутантное растение, клетка мутантного растения или мутантный растительный материал могут содержать одну или более мутаций, которые встречаются в природе в другом растении, клетке растения или растительном материале и обеспечивают необходимый признак. Данную мутацию можно ввести (например, путем интрогрессии) в другое растение, клетку растения или растительный материал (например, растение, клетку растения или растительный материал с генетическим фоном, отличающимся от такового растения, из которого происходит мутация) для создания мутации, которая не встречается в природе в данном растении, и для обеспечения у указанного растения данного признака. Таким образом, в качестве примера, мутацию, которая встречается в природе в первом растении, можно ввести во второе растение, такое как второе растение с генетическим фоном, отличающимся от такового первого растения. Специалист в данной области, таким образом, может осуществлять поиск и идентифицировать растение, несущее в естественных условиях в своем геноме один или несколько мутантных аллелей генов, описанных в данном документе, которые обеспечивают необходимый признак. Мутантный (мутантные) аллель (аллели), который (которые) встречается (встречаются) в природе, можно перенести во второе растение различными способами, включая селекцию, возвратное скрещивание и интрогрессию, с получением линий, разновидностей или гибридов, которые имеют одну или несколько мутаций в генах, описанных в данном документе. Растения, демонстрирующие необходимый признак, можно отобрать из пула мутантных растений. Соответствующим образом, отбор осуществляют с использованием данных о нуклеотидных последовательностях, описанных в данном документе. Следовательно, можно осуществлять скрининг в отношении генетического признака по сравнению с контролем. Такой скрининговый подход может включать применение общепринятых методик амплификации и/или гибридизации нуклеиновых кислот, как обсуждается в данном документе.

В другом аспекте предложен способ получения мутантного растения, которое характеризуется сниженными уровнями Cd по сравнению с контрольным растением, предусматривающий стадии: (а) обеспечения образца из первого растения; (b) определения того, содержит ли указанный образец одновременные мутации в каждом из полипептидов НМА4, описанных в данном документе, которые приводят к уменьшению уровней Cd в растениях, выращенных в поле; и (с) переноса обеих мутаций во второе растение. Мутацию (мутации) можно перенести во второе растение с помощью различных способов, которые известны из уровня техники, например с помощью генной инженерии, манипуляции с генами, интрогрессии, селекции растений, возвратного скрещивания и т.п. В одном варианте осуществления второе растение имеет генетический фон, отличный от такового первого растения.

В другом аспекте предложен способ получения мутантного растения, которое характеризуется сниженными уровнями Cd по сравнению с контрольным растением, предусматривающий стадии: (а) обеспечения образца из первого растения; (b) определения того, содержит ли указанный образец двойные мутации в полипептидах НМА4, описанных в данном документе, которые приводят к уменьшению уровней Cd в растениях, выращенных в поле; и (с) интрогрессии обеих мутаций из первого растения во второе растение. В одном варианте осуществления стадия интрогрессии включает в себя селекцию растений, необязательно включающую возвратное скрещивание и т. п. В одном варианте осуществления второе растение имеет генетический фон, отличный от такового первого растения. В одном варианте осуществления первое растение не представляет собой сорт или элитный сорт. В одном варианте осуществления второе растение представляет собой сорт или элитный сорт.

Дополнительный аспект относится к мутантному растению (включая мутантное растение сорта или элитного сорта), которое получено или которое можно получить с помощью способов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления мутантное растение может содержать одну или более мутаций, локализованных только в конкретном участке растения - таком как последовательности одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе. Согласно данному варианту осуществления остальная часть геномной последовательности мутантного растения будет такой же или практически такой же, как у растения перед осуществлением мутагенеза.

Настоящее изобретение является, вероятно, воспроизводимым в других растениях и применимым для селекции с линиями вариантов.

Растения, представляющие интерес, включают без ограничения однодольные и двудольные растения и системы клеток растений, в том числе виды из одного из следующих семейств: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Bras- 35 041833 sicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae,

Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae или Vitaceae.

Подходящие виды могут включать представителей рода Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis и Zea.

Подходящие виды могут включать Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (бородач Жерара), Pennisetum purpureum (слоновая трава), Phalaris arundinacea (двукисточник тростниковидный), Cynodon dactylon (свинорой пальчатый), Festuca arundinacea (овсяница тростниковая), Spartina pectinata (спартина гребешковая), Medicago sativa (люцерна), Arundo donax (арундо тростниковый), Secale cereale (рожь), Salix spp. (ива), Eucalyptus spp. (эвкалипт), Triticosecale (тритикале, пшеница, скрещенная с рожью), бамбук, Helianthus annuus (подсолнечник), Carthamus tinctorius (сафлор красильный), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина), Elaeis guineensis (масличная пальма), Linum usitatissimum (лен), Brassica juncea, Beta vulgaris (сахарная свекла), Manihot esculenta (маниок), Lycopersicon esculentum (томат), Lactuca sativa (латук), Musyclise alca (банан), Solanum tuberosum (картофель), Brassica oleracea (брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста), Camellia sinensis (чай), Fragaria ananassa (земляника), Theobroma cacao (какао), Coffea cliseca (кофе), Vitis vinifera (виноград), Ananas comosus (ананас), Capsicum annum (острый и сладкий перец), Allium сера (лук), Cucumis melo (дыня), Cucumis sativus (огурец), Cucurbita maxima (тыква гигантская), Cucurbita moschata (тыква мускатная), Spinacea oleracea (шпинат), Citrullus lanatus (арбуз), Abelmoschus esculentus (бамия), Solanum melongena (баклажан), Rosa spp. (роза), Dianthus caryophyllus (гвоздика), Petunia spp. (петуния), Poinsettia pulcherrima (пуансеттия), Lupinus albus (люпин), Uniola paniculata (овес), полевица (Agrostis spp.), Populus tremuloides (тополь осинообразный), Pinus spp. (сосна), Abies spp. (пихта), Acer spp. (клен), Hordeum vulgare (ячмень), Poa pratensis (мятлик), Lolium spp. (плевел) и Phleum pratense (тимофеевка), Panicum virgatum (просо), Sorghu yclise (сорго, суданская трава), Miscanthus giganteus (мискантус), Saccharum sp. (сахарный тростник), Populus balsamifera (тополь), Zea mays (кукуруза), Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Gossypium hirsutum (хлопок), Oryza sativa (рис), Helianthus annuus (подсолнечник), Medicago sativa (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла) или Pennisetum glaucum (просо жемчужное).

Различные варианты осуществления направлены на мутантные растения или клетки растения, модифицированные для модулирования уровней экспрессии гена, в результате чего получают растение или клетку растения - таких как растение табака или клетку растения табака - в которых уровень экспрессии полипептида НМА модулирован в тканях, представляющих интерес, по сравнению с контролем. Раскрытые композиции и способы можно применять для любого вида из рода Nicotiana, в том числе N. rustica и N. tabacum (например, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 и Petico). Другие виды включают N. acaulls, N. acuminata, N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. Clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetlana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. Ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides и N. x sanderae.

Применение сортов табака и элитных сортов табака также предусмотрено в данном документе. Мутантное растение, таким образом, может являться разновидностью табака или элитным сортом табака, который содержит один или более трансгенов или одну или более генетических мутаций или их комбинацию.

Генетическая (генетические) мутация (мутации) (например, один или несколько полиморфизмов) может (могут) представлять собой мутации, которые не существуют в природе в отдельной разновидности табака или сорте табака (например, элитном сорте табака), или может (могут) представлять собой генетическую (генетические) мутацию (мутации), которая (которые) существует в природе при условии, что мутация не существует в природе в отдельной разновидности табака или сорте табака (например, в

- 36 041833 элитном сорте табака).

Особенно применимые разновидности Nicotiana tabacum включают табак типа Берлей, табак темного типа, табак трубоогневой сушки и табак восточного типа. Неограничивающими примерами разновидностей или сортов являются: BD 64, СС 101, СС 200, СС 27, СС 301, СС 400, СС 500, СС 600, СС 700, СС 800, СС 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC табак Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, гибрид 403LC, гибрид 404LC, гибрид 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, табак Перик, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC номер 2 гибрид 49, Берлей 21, KY8959, KY9, MD 609, PG01, PG04, PO1, PO2, РО3, RG11, RG 8, VA509, AS44, Бенкет A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Также предусмотрены подразновидности вышеуказанного с низким уровнем превращения, даже если они специально не указаны в данном документе. В одном варианте осуществления используют тип Берлей Nicotiana tabacum.

Варианты осуществления также направлены на композиции и способы получения мутантных растений, которые были модифицированы для модулирования экспрессии или активности НМА полинуклеотида (полинуклеотидов), описанного (описанных) в данном документе (или любой их комбинации, как описано в данном документе). Преимущественно полученные мутантные растения по общему внешнему виду могут быть подобными или практически такими же, как контрольные растения. Различные фенотипические свойства, такие как степень зрелости, количество листьев на растении, высота стебля, угол отхождения листьев, размер листьев (ширина и длина), длина междоузлия и соотношение листовая пластина-главная жилка, можно оценивать путем полевых наблюдений.

Один аспект относится к семенам мутантного растения. Соответствующим образом, семя представляет собой семя табака. Дополнительный аспект относится к пыльце или семяпочке мутантного растения, которое описано в данном документе. Кроме того, предложено мутантное растение, описанное в данном документе, которое дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, придающую мужскую стерильность.

Также предложена тканевая культура регенерируемых клеток мутантного растения или его части, как описано в данном документе, при этом из культуры регенерируют растения, способные экспрессировать все морфологические и физиологические свойства родителя. Регенерируемые клетки включают без ограничения клетки из листьев, пыльцы, зародышей, семядолей, гипокотилей, корней, кончиков корней, пыльников, цветков и их части, семяпочек, побегов, стеблей, черешков, сердцевины и семенных коробочек или каллюса или протопластов, полученных из них.

Еще один дополнительный аспект относится к подсушенному или высушенному растительному материалу, такому как подсушенный или высушенный лист или подсушенный или высушенный табак, который получен или можно получить из мутантного растения или клетки, при этом экспрессия одного или более полинуклеотидов НМА, описанных в данном документе, или активность белка, кодируемого ними, является сниженной, что приводит к снижению уровней Cd в указанном растении.

Варианты осуществления также направлены на композиции и способы получения мутантных растений или клеток растения, которые были модифицированы для модулирования экспрессии или активности одного или нескольких полинуклеотидов НМА или полипептидов НМА, описанных в данном документе, что может приводить к получению растений, или компонентов растения (например, листьев, таких как подсушенные или высушенные листья), или клеток растений со сниженными уровнями Cd, как описано в данном документе.

Соответствующим образом внешний вид растений, описанных в данном документе, является практически таким же, как у контрольного растения. Соответствующим образом биомасса и размер листа являются практически неизменными по сравнению с контрольным растением. В одном варианте осуществления масса листьев у мутантного растения является практически такой же, как у контрольного растения. В одном варианте осуществления количество листьев у мутантного растения является практически таким же, как у контрольного растения. В одном варианте осуществления масса листьев и количество листьев у мутантного растения являются практически такими же, как у контрольного растения. В од

- 37 041833 ном варианте осуществления высота стебля у мутантных растении является практически такой же, как у контрольных растений через, например, один, два или три или более месяцев после пересадки в поле или через 10, 20, 30 или 36 или более дней после обрезания верхушек. Например, высота стебля у мутантных растений не меньше, чем высота стебля у контрольных растений. В другом варианте осуществления содержание хлорофилла у мутантных растений является практически таким же, как у контрольных растений. В другом варианте осуществления высота стебля у мутантных растений является практически такой же, как у контрольных растений, и содержание хлорофилла у мутантных растений является практически таким же, как у контрольных растений. В других вариантах осуществления размер, или форма, или количество, или окраска листьев у мутантных растений являются практически такими же, как у контрольных растений.

Снижение уровня экспрессии по сравнению с контролем может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100%, или снижение может составлять по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100%, которое включает в себя снижение транскрипционной активности или уровня экспрессии полинуклеотида или уровня экспрессии полипептида или их комбинации.

Снижение активности по сравнению с контролем может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100%, или снижение может составлять по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98 или 100%.

Полинуклеотиды и рекомбинантные конструкции, описанные в данном документе, можно использовать для модулирования экспрессии NtHMA4, описанного в данном документе, в представляющем интерес виде растений, соответствующим образом, в табаке. Полинуклеотиды и рекомбинантные конструкции, описанные в данном документе, можно применять для экспрессии мутантных полипептидов NtHMA4, описанных в данном документе, в представляющем интерес виде растений, соответствующим образом в табаке.

В некоторых вариантах осуществления фенотип листа и показатель роста мутантного растения или его части такие же как у контрольного растения. Пример двойной мутации, который обеспечивает данные свойства, представляет собой G251D/Q561*.

В некоторых вариантах осуществления, фенотип листа мутантного растения или его части является таким же, как у контрольного растения, и мутантное растение или его часть проявляют задержку роста на ранней стадии по сравнению с контрольным растением. Задержка роста на ранней стадии не считается проблемой, поскольку во время сбора не наблюдают разницы в биомассе по сравнению с контрольными растениями. Примером двойной мутации, которая обеспечивает данные свойства, является T402I/Q561*.

В некоторых вариантах осуществления, фенотип листа мутантного растения или его части является таким же, как у контрольного растения, за исключением присутствия некротических поражений на ранней стадии, и мутантное растение или его часть проявляет задержку роста по сравнению с контрольным растением на ранней стадии. Присутствие некротических поражений не является проблемой, поскольку в большей части условий во время сбора в поле некротических поражений не наблюдают. Примером двойной мутации, которая обеспечивает данные свойства, являются Q293*/Q561*, или Q293*/W265*, или E296K/Q561*, или Q464*/Q561*, или Q293*/G235E. Соответствующим образом количество выращенных мутантных растений или их части, как описано в данном документе, не является уменьшенным по сравнению с контрольным растением.

Соответствующим образом мутантные растения или их часть, как описано в данном документе, не проявляют карликовый фенотип по сравнению с контрольным растением. Соответствующим образом, мутантные растения или их часть, как описано в данном документе, не проявляют карликовый фенотип во время сбора по сравнению с контрольным растением во время сбора.

Соответствующим образом мутантные растения или их часть, как описано в данном документе, не демонстрируют уменьшения биомассы (вес листа) по сравнению с контролем. Соответствующим образом мутантные растения или их часть, как описано в данном документе, не демонстрируют уменьшения биомассы (вес листа) во время сбора по сравнению с контролем.

В некоторых вариантах осуществления мутантные растения могут быть обеспечены цинком во время роста.

Различные варианты осуществления направлены на способы снижения уровня экспрессии одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе, путем интеграции множества копий полинуклеотида в геном растения, причем указанные способы включают: трансформацию клетки растенияхозяина вектором экспрессии, который содержит промотор, функционально связанный с одним или более полинуклеотидами, описанными в данном документе. Полипептид, кодируемый рекомбинантным полинуклеотидом, может быть нативным полипептидом или может быть гетерологичным по отношению к клетке.

- 38 041833

Растение, несущее мутантный аллель одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе (или любой комбинации полинуклеотидов, как описано в данном документе), можно применять в программе селекции растений для создания применимых линий, разновидностей и гибридов. В частности, мутантный аллель интрогрессируют в коммерчески важные разновидности, описанные выше. Таким образом, предложены способы селекции растений, которые предусматривают скрещивание мутантного растения, как описано в данном документе, с растением, характеризующимся иными генетическими особенностями. Способ может дополнительно предусматривать скрещивание растения-потомка с другим растением и необязательно повторное скрещивание до тех пор, пока не будет получен потомок с необходимыми генетическими признаками или генетическим фоном. Одной целью, для которой служат такие способы селекции, является введение необходимого генетического признака в другие разновидности, селекционные линии, гибриды или сорта, особенно те, которые представляют коммерческий интерес. Другой целью является облегчение пакетирования генетических модификаций различных генов в отдельной разновидности, линиях, гибридах или сортах растений. Предусмотрены внутривидовые, а также межвидовые скрещивания. Растения-потомки, которые возникают в результате таких скрещиваний, также называемые селекционными линиями, являются примерами не встречающихся в природе растений согласно настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления предложен способ получения не встречающегося в природе растения или мутантного растения, предусматривающий: (а) скрещивание мутантного растения со вторым растением с получением семени-потомка табака; (b) выращивание семени-потомка в условиях роста растений с получением не встречающегося в природе растения. Способ может дополнительно предусматривать: (с) скрещивание предыдущего поколения не встречающегося в природе растения с самим собою или с другим растением с получением семени-потомка; (d) выращивание семени-потомка из стадии (с) в условиях роста растений с получением дополнительных не встречающихся в природе растений; и (е) повторение стадий скрещивания и выращивания (с) и (d) много раз с получением следующих поколений не встречающихся в природе растений. Способ может необязательно включать перед стадией (а) стадию обеспечения родительского растения, которое характеризуется отличительными генетическими особенностями и которое не идентично мутантному растению. В некоторых вариантах осуществления в зависимости от программы селекции стадии скрещивания и выращивания повторяют от 0 до 2 раз, от 0 до 3 раз, от 0 до 4 раз, 0 до 5 раз, от 0 до 6 раз, от 0 до 7 раз, от 0 до 8 раз, от 0 до 9 раз или от 0 до 10 раз для получения поколений не встречающихся в природе растений. Возвратное скрещивание является примером такого способа, при этом потомка скрещивают с одним из его родителей или с другим растением, генетически подобным его родителю, чтобы получить растение-потомка в следующем поколении, которое характеризуется генетическими особенностями, более близкими к одному из родителей. Методики селекции растений, в частности, селекции растений, хорошо известны и могут быть использованы в способах согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены не встречающиеся в природе растения, полученные с помощью данных способов. Определенные варианты осуществления исключают стадию селекции растения.

В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в данном документе, линии, полученные в результате селекции и скрининга вариантных генов, оценивают в поле с использованием стандартных полевых процедур. В эксперимент включают контрольные генотипы, в том числе исходного не подвергнутого мутагенезу родителя, и места посадки растений располагают в поле согласно рандомизированному полноблочному плану или согласно другому соответствующему планированию поля. Для табака используют стандартные агротехнические приемы, например, табак собирают, взвешивают и отбирают образцы для химического и другого общепринятого тестирования до и во время подсушивания или высушивания. Статистические анализы данных выполняют для подтверждения сходства выбранных линий с родительской линией. Цитогенетические анализы выбранных растений необязательно выполняют для подтверждения взаимосвязей набора хромосом и конъюгации хромосом.

ДНК-фингерпринтинг, однонуклеотидный полиморфизм, микросателлитные маркеры или подобные технологии можно использовать в программе селекции с отбором с помощью маркера (MAS) для переноса или разведения мутантных аллелей гена в других растениях, как описано в данном документе. Например, селекционер может создать сегрегирующие популяции за счет гибридизации генотипа, содержащего мутантный аллель, с генотипом, необходимым с точки зрения агрономии. Растения в поколении F2 или поколении возвратного скрещивания можно подвергнуть скринингу с использованием маркера, полученного из геномной последовательности или ее фрагмента, с использованием одной из методик, перечисленных в данном документе. Растения, идентифицированные как обладающие мутантным аллелем, можно подвергнуть возвратному скрещиванию или самоопылению для получения второй популяции, подлежащей скринингу. В зависимости от предполагаемого характера наследования или используемой технологии MAS может быть необходимым самоопыление отобранных растений перед каждым циклом возвратного скрещивания для облегчения обнаружения необходимых отдельных растений. Возвратное скрещивание или другую процедуру селекции можно повторять до тех пор, пока не восстановится необходимый фенотип рекуррентного родителя.

В программе селекции успешные скрещивания дают растения F1, которые являются фертильными.

- 39 041833

Отобранные растения F1 можно скрещивать с одним из родителей, и растения первого поколения возвратного скрещивания самоопыляют с получением популяции, которую снова подвергают скринингу в отношении экспрессии вариантного гена (например, нулевой версии гена). Процесс возвратного скрещивания, самоопыления и скрининга повторяют, например, по меньшей мере 4 раза до тех пор, пока при последнем скрининге не получат растение, которое является фертильным и в достаточной степени схожим с рекуррентным родителем. Это растение, при необходимости, самоопыляют и затем потомство снова подвергают скринингу, чтобы подтвердить, что растение демонстрирует экспрессию вариантного гена. В некоторых вариантах осуществления популяцию растений в поколении F2 подвергают скринингу в отношении экспрессии вариантного гена, например, растение, которое не экспрессирует полипептид из-за отсутствия гена, идентифицируют согласно стандартным способам, например, с помощью методики ПЦР с использованием праймеров, созданных на основе информации о нуклеотидной последовательности полинуклеотида (полинуклеотидов), описанного (описанных) в данном документе (или любой их комбинации, как описано в данном документе).

Гибридные разновидности можно получить путем предотвращения самоопыления женских родительских растений (то есть родительских форм) первой разновидности, позволяя пыльце с мужских родительских растений второй разновидности оплодотворить женские родительские растения и обеспечивая образование гибридных семян F1 на женских растениях. Самоопыление женских растений можно предотвратить путем кастрации цветков на ранней стадии развития цветка. В качестве альтернативы образование пыльцы на женских родительских растениях можно предотвратить с применением какой-либо формы мужской стерильности. Например, мужскую стерильность можно получить с помощью цитоплазматической мужской стерильности (CMS) или трансгенной мужской стерильности, где трансген подавляет микроспорогенез и/или образование пыльцы, или вызывает самонесовместимость. Женские родительские растения, характеризующиеся CMS, являются особенно применимыми. В вариантах осуществления, в которых женские родительские растения характеризуются CMS, пыльцу собирают с мужских фертильных растений и наносят вручную на рыльца женских родительских растений с CMS, и собирают полученные семена F1.

Разновидности и линии, описанные в данном документе, можно использовать для образования простых гибридов F1. В таких вариантах осуществления растения родительских разновидностей можно выращивать в виде практически однородно соединенных популяций для облегчения естественного перекрестного опыления мужскими родительскими растениями женских родительских растений. Семя F1, образованное на женских родительских растениях, селективно собирают с помощью обычных средств. Можно также выращивать две разновидности родительского растения в общей массе и собирать смесь гибридных семян F1, образовавшихся на женском родителе, и семян, образовавшихся на мужском родителе в результате самоопыления. В качестве альтернативы можно осуществить трехлинейное скрещивание, где простой гибрид F1 используют в качестве женского родителя и скрещивают с другим мужским родителем. В качестве другой альтернативы, можно создать гибриды двойного скрещивания, где потомство F1 двух разных простых гибридов скрещивают само с собой.

Популяцию мутантных растений можно подвергнуть скринингу или отбору в отношении тех представителей популяции, которые имеют необходимый признак или фенотип. Например, популяцию из потомков линии с одной трансформацией можно подвергнуть скринингу в отношении тех растений, которые имеют необходимый уровень экспрессии или активности полипептида (полипептидов), кодируемого (кодируемых) с ее помощью. Для идентификации уровней экспрессии или активности можно применять физические и биохимические способы. Они включают анализ по Саузерну или ПЦРамплификацию для обнаружения полинуклеотида; нозерн-блоттинг, анализ с защитой от РНКазы S1, анализ методом удлинения праймера или ПЦР-амплификацию в режиме реального времени для обнаружения РНК-транскриптов; ферментные анализы для обнаружения ферментативной или рибозимной активности полипептидов и полинуклеотидов; и гель-электрофорез белков, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и иммуноферментные анализы для обнаружения полипептидов. Другие методики, такие как гибридизация in situ, ферментативное окрашивание и иммуноокрашивание, и ферментативный анализ также можно использовать для обнаружения присутствия, или экспрессии, или активности полипептидов или полинуклеотидов.

В данном документе описаны мутантные растения, содержащие один или более рекомбинантных полинуклеотидов, одну или более полинуклеотидных конструкций, одну или более двухнитевых РНК, один или более конъюгатов или один или более векторов/векторов экспрессии.

Без ограничения мутантные растения, описанные в данном документе, можно модифицировать для других целей либо до того, либо после того, как экспрессия или активность были модулированы согласно настоящему изобретению. Соответствующим образом, мутантные растения остаются такими же растениями, не относящимися к GMO несмотря на данные дополнительные модификации. Одна или более следующих генетических модификаций могут присутствовать в мутантных растениях. В одном варианте осуществления один или несколько генов, которые вовлечены в превращение промежуточных продуктов азотного обмена, модифицируют с получением растений (например, листьев), у которых в подсушенном состоянии присутствуют более низкие уровни по меньшей мере одного специфичного для табака нитро

- 40 041833 замина, чем у контрольных растений. Неограничивающие примеры генов, которые можно модифицировать, включают, как описано в данном документе, гены, кодирующие аспарагинсинтетазу, такие как CYP82E4, CYP82E5 и CYP82E10, которые принимают участие в превращении никотина в норникотин и описаны в публикациях WO 2006091194, WO 2008070274, WO 2009064771 и PCT/US 2011/021088, и как описано в данном документе. В другом варианте осуществления один или более генов, которые вовлечены в поглощение тяжелых металлов или транспорт тяжелых металлов, модифицируют с получением растений или частей растений (таких как листья), характеризующихся более низким содержанием тяжелых металлов, чем у контрольных растений или их частей без модификации (модификаций). Неограничивающие примеры включают гены семейства белков, ассоциированных с множественной лекарственной устойчивостью, семейства посредников диффузии катионов (CDF), семейства Zrt-, Irt-подобных белков (ZIP), семейства катионообменников (САХ), семейства транспортеров меди (СОРТ), семейства АТФаз тяжелых металлов Р-типа (например, НМА, как описано в WO 2009074325), семейства гомологов белков макрофагов, ассоциированных с естественной устойчивостью (NRAMP), и семейства транспортеров с АТФ-связывающей кассетой (ABC) (например, MRP, описанных в WO 2012/028309, которые участвуют в транспорте тяжелых металлов, таких как Cd). Термин тяжелый металл, используемый в данном документе, включает в себя переходные металлы. Примеры других модификаций включают выносливость в отношении гербицидов, например, глифосат является действующим веществом многих гербицидов широкого спектра действия. Устойчивые к глифосату трансгенные растения были разработаны путем переноса гена aroA (глифосат EPSP-синтетаза из Salmonella typhimurium и E.coli). Устойчивые к сульфонилмочевине растения были получены путем трансформации мутантного гена ALS (ацетолактатсинтетаза) из Arabidopsis. Белок ОВ фотосистемы II из мутантного Amaranthus hybridus был перенесен в растения с получением атразин-устойчивых трансгенных растений; а бромоксинил-устойчивые трансгенные растения были получены путем встраивания гена bxn от бактерии Klebsiella pneumoniae. Другие примеры модификаций приводят к получению растений, которые устойчивы к насекомым. Токсин Bacillus thuringiensis (Bt) может обеспечить эффективный путь задержки появления Bt-устойчивых вредителей, как недавно показано на брокколи, где пирамидальные гены cry1Ac и cry1C Bt обеспечивали контроль капустной моли, устойчивой к любому одному белку, и существенно задерживали развитие устойчивых насекомых. Другая иллюстративная модификация приводит к получению растений, которые устойчивы к заболеваниям, вызываемым патогенами (например, вирусами, бактериями, грибами). Были разработаны растения, экспрессирующие ген Ха21 (устойчивость к бактериальному некрозу), с растениями, экспрессирующими одновременно ген слияния Bt и ген хитиназы (устойчивость к желтой огневке-травянке и выносливость в отношении ризоктониоза). Другая иллюстративная модификация приводит к измененной репродуктивной способности, такой как мужская стерильность. Другая иллюстративная модификация приводит к получению растений, которые выносливы в отношении абиотического стресса (например, засухи, изменения температуры, засоленности), и выносливые трансгенные растения были получены путем переноса фермента глицеролфосфат-ацилтрансферазы из Arabidopsis; генов, кодирующих маннитдегидрогеназу и сорбитдегидрогеназу, которые вовлечены в синтез маннита и сорбита, улучшающих устойчивость к засухе. Другие иллюстративные модификации могут приводить в результате к получению растений с улучшенным накоплением белков и масел, растений с повышенной эффективностью фотосинтеза, растений с длительным сроком хранения, растений с повышенным содержанием углеводов и растений, устойчивых к грибам; растений, кодирующих фермент, участвующий в биосинтезе алкалоидов. Также предусмотрены трансгенные растения, в которых экспрессия S-аденозил-L-метионина (SAM) и/или цистатионин-гамма-синтазы (CGS) была модулирована.

Один или более таких признаков можно интрогрессировать в мутантные растения, принадлежащие к другому сорту, или можно непосредственно трансформировать в него. Интрогрессия признака или признаков в мутантные растения может быть достигнута любым способом селекции растений, известным из уровня техники, например, селекцией на основе родословной, возвратным скрещиванием, селекцией двойных гаплоидов и т.п. (см. публикации Wernsman, E.A, and Rufty, R.C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 в: Cultivar Development. Crop Species W.H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp.). Методики на основе молекулярной биологии, описанные выше, в частности, RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) и микросателлитные маркеры, можно использовать при таких возвратных скрещиваниях для идентификации потомства с самой высокой степенью генетической идентичности с рекуррентным родителем. Данный подход позволяет ускорить получение разновидностей, которые характеризуются генетической идентичностью по меньшей мере 90%, соответствующим образом, по меньшей мере 95%, более соответствующим образом, по меньшей мере 99% с рекуррентным родителем, еще более соответствующим образом, генетически идентичных с рекуррентным родителем, и которые дополнительно содержат признак или признаки, интрогрессированные от донорского родителя. Такое определение генетической идентичности может основываться на молекулярных маркерах, известных из уровня техники.

Последнее поколение, полученное путем возвратного скрещивания, можно подвергать самоопылению с получением потомков чистой линии в отношении переносимой (переносимых) нуклеиновой (нуклеиновых) кислоты (кислот). Полученные растения обычно характеризуются по существу всеми морфо

- 41 041833 логическими и физиологическими свойствами мутантных растений в дополнение к перенесенному (перенесенным) признаку (признакам) (например, одному или нескольким признакам, определяемым одним геном). Точный протокол возвратного скрещивания будет зависеть от изменяемого признака для определения соответствующего протокола испытаний. Хотя способы возвратного скрещивания упрощаются, если переносимый признак представляет собой доминантный аллель, рецессивный аллель также можно переносить. В данном случае может быть необходимо применять исследование потомства для определения успешности переноса необходимого признака.

Различные варианты осуществления обеспечивают уменьшение содержания Cd в мутантных растениях, а также в биомассе, в которой уровень экспрессии полинуклеотидов NtHMA4 является уменьшенным.

Части таких растений, в частности растений табака, и более конкретно листовую пластинку и среднюю жилку растений табака, можно включать в различные потребительские продукты или использовать в их изготовлении, включая без ограничения материалы, образующие аэрозоль, устройства, образующие аэрозоль, курительные изделия, изделия для курения, бездымные продукты и табачные продукты. Примеры материалов, образующих аэрозоль, включают без ограничения табачные композиции, виды табака, табачный экстракт, резаный табак, резаный наполнитель, подсушенный или высушенный табак, взорванный табак, гомогенизированный табак, восстановленный табак и трубочный табак. Курительные изделия и изделия для курения представляют собой, как правило, устройства, образующие аэрозоль. Примеры курительных изделий и изделий для курения включают без ограничения сигареты, сигариллы и сигары. Примеры бездымных продуктов включают жевательный табак и нюхательный табак. В определенных устройствах, образующих аэрозоль, вместо сгорания (или сжигания) табачную композицию или другой материал, образующий аэрозоль, нагревают, например, с помощью одного или более электрических нагревательных элементов с получением аэрозоля. Как правило, в таких нагреваемых курительных изделиях аэрозоль генерируется в результате передачи тепла от источника тепла на физически отделенный субстрат или материал, образующий аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже по потоку относительно источника тепла. Во время курения летучие соединения высвобождаются из субстрата, образующего аэрозоль, путем передачи тепла от источника тепла и захватываются воздухом, втягиваемым через курительное изделие. Когда происходит охлаждение высвобождаемых соединений, они конденсируются с образованием аэрозоля, вдыхаемого пользователем. Такие устройства содержат, например, образующие аэрозоль устройства с электрическим нагревом, в которых аэрозоль образуется в результате передачи тепла от одного или более электронагревательных элементов образующего аэрозоль устройства на образующий аэрозоль субстрат нагреваемого курительного изделия.

В другом типе нагреваемого устройства, образующего аэрозоль, аэрозоль получают путем передачи тепла от горючего топливного элемента или источника тепла к физически отделенному материалу, образующему аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже по потоку относительно источника тепла. Бездымные табачные продукты и различные табаксодержащие материалы, образующие аэрозоль, могут содержать табак в любом виде, в том числе в виде высушенных частиц, обрезков, гранул, порошков или суспензии, нанесенных на другие ингредиенты, смешанных с другими ингредиентами, окруженных другими ингредиентами или иным образом объединенных с другими ингредиентами в любом формате, таком как хлопья, пленки, таблетки, пены или шарики. Используемый в данном документе термин дым используют для описания типа аэрозоля, который получен с помощью курительных изделий, таких как сигареты, или при сжигании материала, образующего аэрозоль.

В одном варианте осуществления также предложен подсушенный растительный материал из мутантных растений табака, описанных в данном документе. Способы обработки зеленых листьев табака известны средним специалистам в данной области техники и включают без ограничения воздушную обработку, огневую обработку, паровую обработку и обработку на солнце. Способ обработки зеленых листьев табака зависит от типа собранного табака. Например, Берлей и определенные темные разновидности обычно обрабатывают воздушной обработкой, а трубочный табак, жевательный табак и нюхательный табак обычно обрабатывают огневой обработкой.

Бездымные табачные продукты, включающие растения табака, как описано в данном документе, можно изготавливать в любом формате, предпочтительном для комфорта в ротовой полости потребителя. Бездымные табачные продукты содержат табак в любой форме, включая высушенные частицы, обрезки, гранулы, порошки или пульпу, нанесенный на другие ингредиенты, смешанные с ними, окруженные ими или иным образом объединенные с ними в любом формате, таком как хлопья, пленки, таблетки, пеноматериалы или шарики. Бездымные табачные продукты могут быть окружены материалом, который может съедобным или несъедобным. Жидкое содержание бездымных табачных продуктов может быть заключено в форму, такую как шарики, для предотвращения взаимодействия с водорастворимой оберткой. Обертка может иметь форму кисета для частичного или полного закрытия табаксодержащих композиций или для выполнения функции клея для удержания вместе нескольких таблеток, шариков или хлопьев табака. Обертка также может заключать формируемую табачную композицию, которая соответствует форме рта потребителя. Обертка, которая разрушается в ротовой полости, может заключать бездымный табак, например, высушенный нюхательный табак или растворимый табак, и может быть получена на оборудовании продолжительного горячего формования или горизонтального формова

- 42 041833 ния/заполнения/упаковывания или другом предпочтительно упаковочном оборудовании с применением съедобных пленок (которые могут включать или не включать табак). Иллюстративные материалы для создания обертки включают пленочные композиции, содержащие НРМС, CMC, пектин, альгинаты, пуллулан и другие коммерчески реализуемые пищевые пленкообразующие полимеры. Обертки, которые не разрушаются в ротовой полости, могут состоять из тканого или нетканого материала, мелованной или немелованной бумаги или перфорированных или других пористых пластмассовых пленок. Обертки могут содержать в своем составе ароматизирующие и/или красящие средства. Бездымные продукты могут быть скомпонованы вместе с помощью обертки с применением любого способа, известного специалистам в области серийной упаковки, включая такие способы, как упаковка в блистеры или в стики, при которой небольшая упаковка может быть получена с помощью машины вертикального формования/заполнения/упаковывания.

В другом варианте осуществления также предложен высушенный растительный материал из мутантных растений, описанных в данном документе. Способы сушки листьев известны средним специалистам в данной области техники и включают, без ограничения, воздушную сушку и сушку на солнце. Точный способ сушки листьев зависит от типа собранного растения. Соответствующим образом растительный материал высушивают после сбора. Таким образом, в данном документе предусмотрено применение высушенного материала и послеуборочного высушенного материала. Процесс сушки может активировать один или более генов, связанных со старением. Экспрессию активности генов и белков, описанных в данном документе, можно контролировать в ходе подсушивания или сушки.

В другом варианте осуществления описаны табачные продукты, в том числе табаксодержащие материалы, образующие аэрозоль, содержащие растительный материал, такой как листья, предпочтительно подсушенные или высушенные листья, из мутантных растений табака, описанных в данном документе. Табачные продукты, описанные в данном документе, могут представлять собой смешанный табачный продукт, который может дополнительно содержать немодифицированный табак.

Количество Cd в растениях, выращенных в поле, части растения, растительном материале, растительном продукте или табачном продукте, описанных в данном документе, может быть уменьшено по меньшей мере на 33, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94 или 95% или более, по сравнению с аналогом дикого типа. Так как НМА4 принимает участие в транслокации Cd от корня к побегу, уменьшение или устранение активности или экспрессии НМА4 может привести к уменьшению накопления Cd в листьях и увеличить накопление Cd в корнях.

В некоторых вариантах осуществления, может быть желательным вырастить растения, описанные в данном документе, в присутствии удобрений. В одном варианте осуществления удобрение может содержать или состоять из Zn, который добавляют в поле либо до, либо во время роста растений. Данное введение добавки может помочь пополнить или восстановить содержание Zn в растении и при этом иметь уменьшенные уровни Cd. Данное введение добавки может помочь восстановить фенотип растения и при этом иметь уменьшенные уровни Cd. Добавление Zn может увеличить высоту стебля и/или вес листа.

Семена растений, описанных в данном документе, можно кондиционировать и упаковать в упаковочный материал с помощью средств, известных из уровня техники, с получением промышленного изделия. Упаковочный материал, такой как бумага или ткань, хорошо известен из уровня техники. Упаковка с семенами может иметь этикетку, например, бирку или этикетку, прикрепленную к упаковочному материалу, этикетку, напечатанную на упаковке, которая описывает происхождение содержащихся в ней семян.

Композиции, способы и наборы для генотипирования растений для идентификации, отбора или селекции могут включать в себя средства для обнаружения присутствия полинуклеотида (или любой их комбинации, как описано в данном документе) в образце полинуклеотида. Соответственно, описана композиция, содержащая один или более праймеров для специфической амплификации по меньшей мере части одного или более полинуклеотидов и, необязательно, один или более зондов и, необязательно, один или более реагентов для проведения амплификации или обнаружения.

В одном варианте осуществления также предложен подсушенный или высушенный растительный материал из мутантных растений, описанных в данном документе. Например, способы подсушивания или сушки листьев табака известны специалистам в данной области техники и включают без ограничения воздушную обработку, огневую обработку, паровую обработку и обработку на солнце. Способ подсушивания зеленых листьев табака зависит от типа собранного табака, как описано в данном документе.

В другом варианте осуществления описаны табачные продукты, в том числе табачные продукты, содержащие растительный материал такой как листья, предпочтительно, подсушенный растительный материал - такой как подсушенные или высушенные листья - из мутантных растений, описанных в данном документе, или которые получены согласно способам, описанным в данном документе. Табачные продукты, описанные в данном документе, могут дополнительно содержать немодифицированныи табак.

В другом варианте осуществления описаны табачные продукты, содержащие растительный материал, соответствующим образом, листья, такие как подсушенные или высушенные листья из мутантных растений, описанных в данном документе. Например, растительный материал можно добавить внутрь или снаружи табачного продукта, вследствие чего при сгорании высвобождается необходимый аромат. Табачный продукт в соответствии с этим вариантом осуществления может даже представлять собой не- 43 041833 модифицированный табак или модифицированный табак. Табачный продукт в соответствии с данным вариантом осуществления может быть получен из мутантного растения, которое имеет мутации в одном или более генах, отличающихся от генов, раскрытых в данном документе.

Настоящее изобретение дополнительно описано в примерах ниже, которые представлены для более подробного описания настоящего изобретения. Эти примеры, в которых изложен предпочтительный режим, предполагаемый в настоящее время для осуществления настоящего изобретения, предназначены для иллюстрации, а не для ограничения настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Материалы и способы.

Последовательности HMA4.

NtHMA4.1 (последовательность белка: SEQ ID NO: 1, Genbank: CCQ77798.1; нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 3, Genbank: HF675181.1) и NtHMA4.2 (последовательность белка: SEQ ID NO: 2, Genbank: CCW03243.1; нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 4, Genbank: HF937054.1).

Растительный материал.

TN90 (PI 543792, ТС 586, USDA -база данных GRIN), K326 (PI 552505, ТС 319, USDA-база данных GRIN). АА37 предположительно представляет собой гибрид южноамериканского темного табака и идиоплазмы американского Берлея.

Получение растений с RNAi HMA4.

Для создания конструкции для RNAi НМА4 последовательность экзона 7 НМА4.1 (5'TGAGAGCAAGTCAGGTCATCCGATGGCAGCCGCTCTGGTGGACTATGCACAATCAAATTCCGTT

GAGCCAAAGCCTGATAGAGTTGAGCAGTTTCAAAATTTTCCTGGTGAAGGGATATTTGGAAGAA

TTGATGGAATGGAAATCTATGTCGGGAATAGGAAAATTTCTTCAAGAGCTGGATGTACCACAG3') используют в смысловом и антисмысловом направлении и часть смежного интрона (5'ТАААТ GG ТТ GAAT CAT Т Т С Т ТAT GC Т CATAGТAGAGATAAAACATCAGA

GTTATAATTATAAGTATATGATTTCTCCAGTTAATTTTGCTGTTAGATTTTCTTTGACCTGTTT

AGCACTAATGCGGTGGATGTTTGAAT-3') используют в качестве петли шпильки. Конструкция разработана с помощью сайтов Gateway и синтезирована Geneart (Invitrogen, Life technologies, Регенсбург, Германия). Затем ее переносят на вектор экспрессии с применением технологии Gateway и соответствующих ферментов (Invitrogen, Life technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Agrobacterium tumefaciens трансформируют с помощью вектора экспрессии и используют для трансформации листовых дисков табака с применением описанных ранее способов (Horsch et al., 1985). Первичные трансформанты Т0 выращивают в почве и анализируют их корни в отношении экспрессии НМА4. Определяют линии с наилучшими показателями (характеризуются наиболее низкой экспрессией НМА4) и поколение Т1 и растения дикого типа выращивают на агаровой среде, и общую совокупность корней снова анализируют в отношении экспрессии НМА4.

Полученные с помощью EMS мутантные линии и TILLING Мутантную популяцию создают с помощью обрабатывания семян табака АА37 мутагенным средством этилметансульфонатом (EMS). Библиотеку ДНК приблизительно 9800 EMS-обработанных растений поколения М2 (представляют собой сегрегирующее потомство 1050 вариантов поколения M1) подвергают скринингу на наличие мутаций в двух НМА4 генах. Пять ампликонов секвенируют и анализируют на наличие мутаций в НМА4.1 и в НМА4.2 соответственно.

- 44 041833

Следующую пару праймеров используют для амплификации НМА4.1 - экзон 1.

прямой праймер 5'-GCATGTTCTTATAAGAGAAACTC-3', обратный праймер 5'GTGAATTTATTTAACAAGCCACA-3'; НМА4.1 - экзон2 : прямой праймер 5'CCAAAATTGTTTCTGCTTCTCC-3', обратный праймер5'CGTCATATAAATTGGGACAAAAG-3'; НМА4.1 - экзон4/5: прямой праймер 5'GTGTCTTTATTTTCTCACTGATA-3', обратный праймер5'TAGTGACGTGATTCATAAGACAA-3'; НМА4.1 - экзонб: прямой праймер 5'ATCAGTCCTTTCACTTGACCC-3', обратный праймер5'AACCATTAGAGCCATTTCAGAA-3'; ΗΜΆ4.1 - экзон7/8: прямой праймер 5'GATACTGCAATACAAAAGCACAT-3', обратный праймер5'CACTTACTTGGTAATACGTTCT-3'; НМА4.2 - экзон 1: прямой праймер 5'TTGCTACTCTGGGTTGCTAC-3', обратный праймер5'TCAAGTTTAAAGTTTGCTTCTAC-3'; НМА4.2 - экзон 2: прямой праймер 5'TGTGCATACATAACGTAAATCG-3', обратный праймер5'ATCAAATACCACATAAGTAGGG-3'; НМА4.2 - экзон 4/5: прямой праймер 5'TTTAGTCACTTTGACATAAATGG-3', обратный праймер5'AAGACAGAGAACAAGTTCACAT-3'; НМА4.2 - экзон 6: прямой праймер 5'TCAGTCCTTTCGCTTGACCT-3', обратный праймер5'GAGAATGTGGTACTCGCAAG-3'; НМА4.2 - экзон 7/8: прямой праймер 5'ATACATTGAGGACACATAATCG-3', обратный праймер5'TATACCCCATTCTGACCCTTG-3'.

Продукты амплификации секвенируют согласно способу Sanger на ABI XL3730 (Applied Biosystems, Life Technologies, Фостер-Сити, Калифорния, США). Праймеры амплификации аналогично используют для секвенирования, за исключением НМА4.2 - экзон 6, где вложенный обратный праймер 5-TTATGAATATATGCTACAAATCAC-3' используют для секвенирования. Для того, чтобы получить мутантную линию с влиянием на функцию белка, выбирают как стоп-мутации, так и миссенс-мутации. Тепличные условия для выращивания растений

Для удобрения используют следующие растворы, при этом все растворы приобретены у Yara Benelux B.V. (Влардинген, Нидерланды): Трубоогневая сушка: макроэлементы: 666,5 мг NO3-1-1, 18 мг NH4+ 1-1 (всего 165,39 мг N l-1), 88,78 мг Р2О5 l-1, 306,25 мг K2O l-1, 49,99 мг l-1, 185,61 мг Са l-1, 369,60 мг SO42- l-1; микроэлементы: 0,839 мг Fe l-1, 0,549 мг Mn l-1, 0,262 мг Zn l-1, 0,216 мг В l-1, 0,048 мг Cu l-1, 0,048 мг Мо l-1. Берлей: макроэлементы: 850,3 мг NO3- l-1, 18,5 мг NH4+ l-1 (всего 207,35 мг N l-1), 91,31 мг Р2О5 l-1, 383,65 мг K2O l-1, 49,99 мг l-1, 185,61 мг Са l-1, 369,60 мг SO42- l-1; микроэлементы: 0,839 мг Fe l-1, 0,549 мг Mn l-1, 0,327 мг Zn l-1, 0,324 мг В l-1, 0,048 мг Cu l-1, 0,048 мг Мо l-1. Линии RNAi НМА4 удобряют в двух параллельных экспериментах либо раствором Трубоогневая сушка, либо раствором Берлей. Содержание различных нитратов в растворах не имеет дифференциального эффекта на уровни Cd или фенотип НМА4. (Данные, представленные в данном исследовании, получены от растений, которые удобряют раствором Трубоогневая сушка). Линии АА37 удобряют раствором Берлей. Для прибавления Zn применяют 0,1 г Zn в форме ZnSO4.H2O (Landor, Бирсфельден, Швейцария), разбавленного в 100 мл Н2О. Все растения выращивают в 10-л горшках, в цикле 16 ч света: 8 ч темноты.

Полевые испытания.

Полевые испытания проводят в поле в Швейцарии (кантон Во). Все растения высевают в подвесные ящики (согласно сельскохозяйственной практике) и выращивают в теплице перед пересадкой. Растения группируют по генотипическим классам. Растения группируют в экспериментальные единицы, которые дублируют в поле шесть раз. В первый год для каждой комбинации мутаций выращивают 10 растений, которые несут обе мутации в гомозиготном состоянии, вместе с 10 растениями, гомозиготными только в отношении мутации в НМА4.1, 10 растениями, гомозиготными только в отношении мутации в НМА4.2, и 10 растениями, которые представляют собой нуль-сегрегантные растения в отношении обоих генов НМА4. Для двойных нонсенс-мутантов предусмотрены также два других генотипа (в трех повторностях): 10 растений, которые представляют собой гомозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.1 и гетерозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.2, и 10 растений, которые представляют собой гомозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.2 и гетерозиготные нонсенс-мутанты в отношении

- 45 041833

НМА4.1, причем эти последние группы содержат только один функциональный немутантный аллель. На второй год для каждой комбинации мутаций выращивают 20 растений, которые несут обе мутации в гомозиготном состоянии, вместе с 20 растениями, которые представляют собой нуль-сегрегантные растения в отношении обоих генов НМА4. Поле удобряют согласно стандартным приемам для выращивания

Берлея.

Два полевых испытания осуществляют в один год на двух полях в двух участках выращивания табака, содержащих высокий уровень кадмия. Для каждой комбинации мутаций выращивают 20 растений, которые переносят обе мутации в гомозиготном состоянии, смежно с 20 растениями, которые представляют собой нуль-сегрегантные растения в отношении обоих генов НМА4.

Анализ экспрессии с применением qPCR.

Общую РНК выделяют из табака с применением набора для выделения РНК из растений RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия). РНК расщепляют с применением ДНКазы без РНКаз RQ1 (Promega, Медисон, Висконсин, США) и обратно транскрибируют с применением олигопраймера dT17, dTNP, ингибитора РНКазы RNasin Plus и обратной транскриптазы M-MLV, РНКазы (Н-), Point Mutant (все от Promega, Медисон, Висконсин, США). qRT-PCR осуществляют с помощью системы Мх3005Р (Stratagene, Agilent, Вальдброн, Германия). Реакции амплификации осуществляют с помощью прямого праймера

НМА4.1 (5'-TCATGCAGAAATAAGAAGTGCCAG-3') и обратного праймера

НМА4.1 (5'-ATGGATGCTTAGAGAGTCCAGGA-3') или с помощью прямого праймера

НМА4.2 (5'-GTTATGCGGAAATAAGAAGTGCCTA-3') и обратного праймера

НМА4.2 (5'-CATGGATGCTTAGAGAGTCCAGAC-3') с применением SYBR 2-стадийной QRT Low Rox (Thermo Scientific, Суррей, Великобритания). В качестве внутреннего стандарта используют ген actin9 с прямым праймером (5'-CTATTCTCCGCTTTGGACTTGGCA-3') и обратным праймером (5'-AGGACCTCAGGACAACGGAAACG-3').

Выделение ДНК и генотипирование растения.

Образцы листа экстрагируют с применением BioSprint 96 (Qiagen, Хильден, Германия) совместно с набором для выделения ДНК из растений BioSprint 96 DNA plant kit (Qiagen, Хильден, Германия). Образцы ДНК используют в реакции TaqMan для того, что бы определить генотип растения. Taqman осуществляют с применением секвенатора ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, Фостер-сити, Калифорния, США) и мастер-микса TaqMan Fast Advanced (Applied Biosystems, Фостер-сити, Калифорния, США). Применяют следующие праймеры Taqman (Microsynth, Бальгах, Швейцария) и зонды (Applied Biosystems, Life Technologies, Воррингтон, Великобритания):

HMA4.1 Q293*:

зонд для мутантного гена 5'-AGGATGGCATAGCT-3', зонд для дикого типа (WT) 5'-AGGATGGCACAGCT-3', прямой праймер 5'

CTGGCACTACAAATCTAAATGGTAGTATAGTATTT-3', обратный праймер 5'CTGGTGTATAATATTTAGCACACTTGTCG-3'; НМА4.1 Е296К: зонд для мутантного гена 5'-CACAGCTTGTCAAAG-3', зонд для WT 5'- 46 041833

CACAGCTTGTCGAAG-3', прямой праймер 5'CTGGCACTACAAATCTAAATGGTAGTATAGTATTT-3', обратный праймер 5'CTGGTGTATAATATTTAGCACACTTGTCG-3'; НМА4.1 T402I: зонд для мутантного гена 5'-TTTGACAAAACAGGGATTA-3', зонд для WT 5'TTTGACAAAACAGGGACTA-3', прямой праймер 5'-CCATGTGTTGCGCACTTTCA-3', обратный праймер 5'-AACTCGGTCACCATAAATTCTCCTT-3'; НМА4.1 G251D: зонд для мутантного гена 5'-AGAAAACACTGACAGACG-3', зонд для WT 5'AAAACACTGACAGGCG-3', прямой праймер 5'AAGTCGTAAATGTTGATGAAGTCAAGG-3', обратный праймер 5'CAGCCCAGACCGTTGAATCTC3'; НМА4.1 V351M: зонд для мутантного гена 5'-CTTTGGTCACATTGATGA-3', зонд для WT 5'-TTGGTCACATTGGTGAGT-3', прямой праймер 5'-GGCTATATCAGCTTCTTTGGCAATT-3', обратный праймер 5'-AACACATGGCAACTGGTGTAGATAGA-3'; НМА4.1 G382R: зонд для мутантного гена 5'-TTCTGTTTAAAAGAGCAGAG-3', зонд для WT 5'TCTGTTTAAAGGAGCAGAGTA-3', прямой праймер 5'-CCATGTGTTGCGCACTTTCA3', обратный праймер 5'-AACTCGGTCACCATAAATTCTCCTT-3'; НМА4.2 W265*: зонд для мутантного гена 5'-ATAGATTCAACGGTCTAGG-3', зонд для WT 5'-TTCAACGGTCTGGGC-3', прямой праймер 5'GGTGAAACTATACCTATTGATGGAGTTGTAA-3', обратный праймер 5'CACTAAATAAATGAAGCATGAAGGAATACTAC-3'; НМА4.2 Q561*: зонд для мутантного гена 5'-CAACCATGTGTAGGAT-3', зонд для WT 5'TGCCAACCATGTGCAG-3', прямой праймер 5'-TTGGTGTAAAAGAAGCAATGAGAGAGS', обратный праймер 5'-ATCATTTCAGCGTATTGCAGAATTT-3'.

Анализ элементарного состава.

Во время сбора осуществляют сбор с положений стебля зрелых растений, соответствующих его средней и нижней части, с получением объединенных образцов для каждого полевого опытного участка (1 лист на растение). Осуществляют сбор листьев с двух положений стебля, соответствующих его средней и нижней части, с отдельных тепличных растений (такое же положение листа для всех растений). Собранный материал высушивают в печи при 60°С до полного высушивания.

Анализ образцов осуществляют с помощью ALS (Прага, Чешская Республика). Образцы гомогенизируют и минерализируют с помощью кислот и пероксида водорода перед анализом. Zn и Cd измеряют с помощью масс спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) согласно CZ_SOP_D06_02_002 (US EPA 200.8, CSN EN ISO 17294-2).

Биоинформатический анализ.

Показатели переносимости мутации получают с применением программного обеспечения SIFT (Ng and Henikoff, 2003), основанного на базе данных последовательностей растений с UniProt (загружена 30 декабря 2012 года). Библиотеки секвенированных РНК образуют с применением набора для приготовления образцов РНК Illumina TruSeq и секвенируют с помощью Illumina HiSeq-2500. Распознавание азотистых оснований и демультиплексинг образцов осуществляют с применением программного обеспечения Illumina HiSeq Control и программного обеспечения конвейерного действия CASAVA. Риды картируют согласно ранее опубликованному геному (Sierro et al., 2014) с применением программного обеспечения Tophat2 (Kim et al. 2013; версия 2.0.11). Дифференциальную экспрессию гена рассчитывают с применением Cuffdiff (Trapnell et al, 2013, версия 2.2.1).

Статистическая обработка.

Когда аналитическое значение ниже LOQ, значение LOQ учитывают в расчетах и графическом представлении. Для измерения значимости применяют 2-сторонние t-критерии с использованием коррекции Satterthwaite для неоднородности дисперсии. Для полевого эксперимента применяли парные t- 47 041833 критерии для соотношений данных мутантных опытных участков и соответствующих им контрольных опытных участков. Исходные р-значения рассчитывали для определения вероятности того, что среднее значение (мутанта) случайным образом <0,8* среднее значение (контроль), с целью определения значимого снижения уровня Cd/Zn ниже неоднозначно измеренного (20%).

Пример 2. Идентификация ортологов транспортеров НМА2/3/4 A. thaliana и анализ экспрессии NtHMA4.

Транспортеры НМА2, НМА3 и НМА4 Arabidopsis являются близко родственными. Поскольку НМА2 и НМА4 вовлечены в перемещение Zn и Cd от корня к побегу (Wong и Cobbett, 2009), НМА3 принимает участие в накоплении Cd с помощью вакуоль запасающего корня, в которых также хранятся Zn, Cd, Со и Pb (Gravot et al., 2004; Morel et al., 2009). Основываясь на последовательностях Arabidopsis, геном табака подвергают скринингу на наличие предполагаемых ортологов AtHMA2/3/4 и двух гомологов НМА4, НМА4.1 и НМА4.2, унаследованных от N. sylvestris и N. tomentosiformis соответственно и которые были обнаружены в N. tabacum.

Паттерны экспрессии НМА4.1 и НМА4.2 исследуют в двух основных сортах табака, TN90 и K326. Типы табака трубоогневой сушки (K326) требуют удобрения, менее богатого на азот по сравнению с типом табака Берлей (TN90) (Lewis et al., 2012). Данные различия в приемах удобрения также частично объясняют, почему содержание Cd оказывается более высоким в типе табака Берлей по сравнению с табаком трубоогневой сушки (Lugon-Moulin et al., 2006). Паттерны экспрессии NtHMA4.1 и NtHMA4.2 анализируют в разных тканях растений табака TN90 и K326, выращенных в поле. В данных двух сортах растений оба гена, как обнаружено, в частности экспрессируются в тканях корня и цветка, но также в незначительной степени во всех остальных тканях (фиг. 1). Данный паттерн находится в соответствии с данными по экспрессии GUS, отмеченными Hussain et al. (2004) для Arabidopsis и отмеченными Hermand et al. (2014) для табака.

Пример 3. Эффект подавления NtHMA4 на накопление Cd в листе и фенотип.

С целью оценки потенциала генов NtHMA4 табака в качестве мишеней для уменьшения уровня Cd разработаны конструкции для RNAi против обоих гомологов NtHMA4. Фрагменты ДНК клонируют в бинарные векторы под контролем конститутивного промотора MMV (Dey and Maiti, 1999) и трансформируют в два вышеупомянутых сорта растений TN90 и K326. Для каждого типа табака выбирают линию с RNAi, основываясь на уменьшении экспрессии обоих гомологов НМА4 (фиг. 2). Пять растений из каждой линии и соответствующие им не трансформированные контрольные растения выращивают на почве, с введением добавки в виде Zn и без нее.

Иллюстративные растения каждой линии изображены на фиг. 3а. Соответствующее им содержание Cd и Zn показаны на фиг. 3b и c. Обе линии TN90 и K326 с RNAi НМА4 имеют очень низкий уровень Cd (около LOQ=0,05 ч./млн) по сравнению с контрольными растениями (>0,55 ч./млн Cd) в обоих сортах. Кроме того, наблюдают уменьшение уровня Cd в более чем 10 раз и уменьшение уровня Zn в около 4 раз. Что касается биомассы растения (высота стебля и вес листа), линия K326 с RNAi НМА4 демонстрирует хорошие показатели, и они не являются существенно меньше, имея даже чуть более тяжелые листья чем у контрольного растения (фиг. 3d, е). Форма листа незначительно отличается, трансгенные листья более округлые и имеют утолщенные жилки (фиг. 3а). В отличии от этого, линии TN90 с RNAi НМА4 демонстрируют задержку роста и некротические участки на листьях (фиг. 3а, d). Листья являются более толстыми по сравнению с контролем TN90 WT (фиг. 3f). Основываясь на измерениях свежего и сухого веса, данные растения проявляют увеличение содержания воды (фиг. 3g). Эксперимент повторяют с применением удобрений с высоким уровнем нитратов, тем не менее, снабжение азотом не оказывает влияния на уровни Cd и фенотип (данные не продемонстрированы). В заключение, данные результаты демонстрируют, что подавление обоих гомологов НМА4 в обоих сортах табака уменьшает уровень Cd в листе в более чем 10 раз и уровень Zn в около 4 раз. Тем не менее, несмотря на аналогичное уменьшение уровней Cd/Zn в обоих разновидностях, фенотипические эффекты очень отличались между K326 и TN90, при этом K326 показал себя лучше.

Интересно отметить, что обработка растений с RNAi HMA4 с помощью Zn пополняет содержание Zn в растении почти до контрольных уровней и восстанавливает нормальный (Берлей) фенотип растения в TN90, с поддержанием при этом уменьшенных уровней Cd (фиг. 3а-с, заштрихованные полосы). Прибавление Zn увеличивает высоту стебля и вес листа в линии TN90 с RNAi и уменьшает содержание воды и толщину листа в обоих растениях TN90 и K326 с RNAi HMA4 (фиг. 3d-g, заштрихованные полосы). Это демонстрирует, что Zn может дополнять RNAi НМА4 и восстанавливать фенотип WT, поддерживая более чем 90% уменьшение содержания Cd.

Пример 4. Уменьшение уровня Cd в поле требует комбинации мутаций NtHMA4.

Для селекции табака популяцию обработанных EMS сортов растений АА37 подвергают скринингу на наличие мутаций в НМА4. АА37 представляет собой сорт растений, полученный путем скрещивания южноамериканского темного табака с идиоплазмой американского Берлея, таким образом, данный сорт более тесно связан с TN90, чем с K326 (Fricano et al., 2012). Сопоставление профилей экспрессии позволяют предположить, что оба гомолога НМА4 (фиг. 1 и 2) вовлечены в перемещение Zn и Cd от корня к побегу. Таким образом, экзоны, кодирующие каталитически важные домены, подвергают скринингу на

- 48 041833 наличие точечных мутаций в обеих копиях НМА4. Все аминокислотные замены, идентифицированные в NtHMA4.1 и NtHMA4.2, анализируют на наличие возможного влияния на функцию белка с применением программы SIFT (Ng and Henikoff, 2003). Небольшой показатель SIFT (<0,05) подразумевает, что аминокислотный остаток, вероятно, недопустим на функциональном уровне. В NtHMA4.1 и в NtHMA4.2 идентифицированы 36 и 33 мутаций соответственно, включая 2 нонсенс-мутации в каждом из гомологов и 15 миссенс-мутаций в каждом гомологе со значением показателя SIFT ниже 0,05 (табл. 10). Показатель SIFT используется в качестве инструмента для облегчения выбора мутаций.

Мутации в обеих изоформах НМА4 сочетают с помощью скрещивания. Такое скрещивание включает по меньшей мере одну нонсенс-мутацию и вторую мутацию, которая является либо нонсенсмутацией, либо миссенс-мутацией, прогнозируемой с применением SIFT. Перед каждым из тепличных и полевых тестов в подвесных ящиках сегрегирующих потомков выращивают, генотипируют с применением Taqman и группируют в отдельные классы перед пересадкой в почву.

В тепличном эксперименте тестируют шесть комбинаций мутаций. Для каждой из них восемь растений, которые переносят две гомозиготные мутации, выращивают вместе с восемью растениями, которые гомозиготны в отношении только одной мутации в НМА4.1, восемью растениями, которые гомозиготны в отношении мутации в НМА4.2, и восемью нуль-сегрегантными растениями в отношении обоих генов НМА4. Для двойных нонсенс-мутантов также включены два других генотипа: восемь растений, которые представляют собой гомозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.1 и гетерозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.2, и восемь растений, которые представляют собой гомозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.2 и гетерозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.1, причем данные последние группы содержат только один функциональный немутантный аллель. После пяти и одиннадцати недель выращивания в почве (а), листья с нижних позиций стебля собирают для определения свежего веса (b) и анализа в отношении уровней Cd, Zn (фиг. 4с, d).

В отличие от простых нонсенс-мутантов и нонсенс-мутантов с одним функциональным аллелем НМА4 только двойные нонсенс-мутанты НМА4.1 Q293*/HMA4.2 Q561* демонстрируют аналогичное уменьшение уровня Cd, как нарушение, наблюдаемое для растений с RNAi HMA4. После пяти недель выращивания в почве гомозиготные двойные нонсенс-мутанты демонстрируют уменьшение уровня Cd от 0,6 ч./млн. в контрольных растениях до уровней около предела количественного определения (LOQ=0,05 ч./млн.), когда содержание Zn уменьшается только на треть (фиг. 4с, d). Результаты анализа в отношении уровня Cd после одиннадцати недель демонстрируют, что тепличные растения с последующим ростом характеризовались небольшим уровнем Cd в увеличивающем количестве биомассы. Средние контрольные значения составляют около 0,3 ч./млн Cd, в то время как две проанализированные линии двойных мутантов демонстрируют уровни Cd ниже предела количественного определения (фиг. 4с). Интересно отметить, что одиночные нонсенс-мутанты и мутантные растения, несущие только один функциональный аллель НМА4, демонстрируют промежуточный уровень содержания Zn и при этом проявляют контрольные уровни Cd. Данные уровни Zn кажутся достаточными для нормального роста, учитывая, что в данных растениях не наблюдается разница в росте по сравнению с контролем. С другой стороны гомозиготные двойные нонсенс-мутанты демонстрируют 50% уменьшение в весе листа после пяти недель роста. Тем не менее, после одиннадцати недель мутантные растения достигают такого же размера, как и контрольные (фиг. 4а, b), присутствует только незначительная задержка цветения.

Иные комбинации мутантов исследуют после пяти недель роста, две другие комбинации (E296K/Q561* и T402I/Q561*) демонстрируют уменьшение уровня Cd, аналогичное двойному нонсенсмутанту, при этом характеризуются только одной третью содержания Zn в контроле (фиг. 5а, b). Две данные линии демонстрируют аналогичную задержку роста: на ранней стадии T402I/Q561* демонстрирует около 25% уменьшение веса листа, и E296K/Q561* демонстрирует 50% уменьшение веса листа (фиг. 5с). Спустя еще шесть недель роста больше не наблюдают существенно значимых различий в размере листа и высоте между контрольными растениями и двойными мутантами. Тем не менее, в линиях двойных мутантов присутствует незначительная задержка образования цветка. Две другие комбинации мутаций (G382R/Q561* и G251D/Q561*) не демонстрируют значимого уменьшения уровня Cd. Все данные по Cd и Zn подытожены в табл. 8. Для контрольных групп значения всех индивидуальных контрольных растений сгруппированы вместе в табл. 8.

В совокупности данные эксперименты демонстрируют, что оба гена НМА4 должны по меньшей мере частично подвергаться влиянию, чтобы значимо уменьшить уровни Cd.

Пример 5. Валидация уменьшения уровня Cd в двух полевых испытаниях при умеренных условиях содержания Cd.

Два полевых эксперимента проводят при умеренных условиях содержания кадмия с целью подтвердить тепличные данные. В первом эксперименте выращивают одинаковые генотипические группы (одиночные мутанты, двойные мутанты и контрольные растения) в шести дублируемых опытных участках. Каждая дублируемая единица содержит 10 растений двойных мутантов, контроль НМА4 WT и два простых мутанта соответственно. Для двойных нонсенс-мутантов включены также два других генотипа, которые содержат один функциональный немутантный аллель (гомозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.1/ гетерозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.2 и гетерозиготные нонсенс- 49 041833 мутанты в отношении НМА4.1/ гомозиготные нонсенс-мутанты в отношении НМА4.2). Растения выращивают в течении 14 недель в поле в Швейцарии. Исследуют фенотип растений и собирают листья со середины стебля, высушивают и подвергают анализу на уровень Cd/Zn. Р-значения рассчитывают для определения вероятности того, что наблюдаемое уменьшение уровня Cd в мутанте случайным образом составляет более чем 20% по сравнению с контролем.

В целом полевые и тепличные данные являются взаимосоответствующими. В то время как одиночные мутанты не демонстрируют какого-либо уменьшения уровня Cd по сравнению с контрольными растениями (табл. 2), такие же линии двойных мутантов, которые характеризовались низким уровнем Cd в теплице (T402I/Q561*; E296K/Q561*; Q293*/Q561*), так же как и дополнительный двойной нонсенсмутант (Q293*/W265*), демонстрируют аналогичное более чем десятикратное уменьшение уровня содержания Cd в полевых условиях с вероятностью р<0,05 (наибольшее р значение=0,0054) того, что среднее значение двойного мутанта является уменьшенным по меньшей мере на 20% (табл. 4). Кроме данных четырех линий линия G251D/Q561* демонстрирует 30% уменьшения уровня Cd, тем не менее, в данной линии содержание Cd не является значимо уменьшенным на более чем на 20% (р значение=0,1029). Несмотря на то, что содержание Zn уменьшено примерно на 70% в теплице, линии с низким уровнем Cd (T402I/Q561*; E296K/Q561*; Q293*/Q561*; Q293*/W265*), выращенные в поле, демонстрируют максимально только около 50% уменьшения уровня Zn (табл. 4). В первом полевом испытании вес листа является уменьшенным в линии E296K/Q561*, в свою очередь в трех других линиях с низким содержанием Cd (T402I/Q561*; Q293*/Q561*; Q293*/W265*) вес листа значимо не изменен (фиг. 6b). Морфология растения и листа не подвержена влиянию мутаций. Тем не менее, для линий E296K/Q561*, Q293*/Q561* и Q293*/W265* наблюдают некротические пятна на нижних листьях, в частности на ранней стадии роста. Двойные мутанты T402I/Q561* и G251D/Q561* демонстрируют наилучшие фенотипы и не проявляют некротических поражений в любой момент времени. Две данные линии почти не отличаются от соответствующих им контролей.

Во втором полевом испытании такую же комбинацию мутаций выращивают в поле вместе с дополнительными комбинациями (18 в целом). На этот раз одна экспериментальная единица содержит 20 гомозиготных двойных мутантных по НМА4 растений и 20 контрольных растений с НМА4 WT. Одиночных мутантов не подвергают анализу снова. Данные по уровню Cd/Zn продемонстрированы в табл. 5; графики данных по уровню Cd и данные по фенотипу изображены на фиг. 7. Те же линии, которые демонстрируют уменьшение уровня Cd в первом полевом испытании, снова демонстрируют сопоставимое уменьшение уровня Cd; за исключением линии G251D/Q561*, которая на этот раз даже демонстрирует 70% уменьшения уровня Cd. Кроме данных линий подвергнуты анализу дополнительно другие двойные нонсенс-мутации (Q464*/Q561*), которые демонстрируют, как ожидалось, очень сильное уменьшение уровня Cd на 94%. Аналогично новая комбинация мутация Q293*/G235E демонстрирует 94% уменьшения уровня Cd. Комбинации мутаций Q293*/L223F и Q293*/D234N характеризуются промежуточным уменьшением уровня Cd (37% и 27% соответственно). Линии Q293*/Q561*, Q293*/W265*, Q464*/Q561*, Q293*.G235E, E296K/Q561*, T402I/Q561*, G251D/Q561* и Q293*/L223F демонстрируют значимое уменьшение более чем на 20% уровня Cd (р<0,05; наибольшее р-значение=0,0007). Линия Q293*/D234N демонстрирует 27% уменьшения уровня Cd, но при этом уменьшение составляет не более чем 20% с р<0,05. Все остальные проанализированные двойные мутанты демонстрируют только менее чем 20% уменьшения уровня Cd и, таким образом, не представляют интереса для дальнейшего развития. Комбинации мутаций Q293*/Q561* и Q293*/W265*, Q464*/Q561*, Q293*/G235E и E296K/Q561* демонстрируют некротические пятна на листьях и уменьшенный показатель роста на ранней стадии. Тем не менее, во время сбора не наблюдают явной разницы между данными двойными мутантами и соответствующими им контролями. Сухой вес листа большей части мутантных линий в поле является аналогичным соответствующему ему весу контрольных растений (фиг. 7b). В некоторых случаях сухой вес листа незначительно отличается от контрольных образцов, тем не менее, без корреляции с уменьшением уровня Cd.

Пример 6. Валидация уменьшения уровня Cd в двух полевых испытаниях при условиях высокого содержания Cd.

В двух небольших полевых испытаниях растения с пятью комбинациями мутаций, перспективных в плане низкого уровня Cd (комбинация двойных нонсенс-мутаций Q293*/Q561*, так же как комбинации Q293*.G235E, E296K/Q561*, T402I/Q561* и G251D/Q561*), также как и соответствующие им контрольные растения, выращивают на двух участках с известным высоким содержанием Cd. Данные по уровню Cd/Zn продемонстрированы в табл. 6; графики данных по уровню Cd и данные по фентотипу показаны на фиг. 8. Контрольные растения накапливают около 3 ч./млн Cd, в свою очередь содержание Cd является уменьшенным на >80% и на >90% для комбинаций мутаций Q293*/Q561*, Q293*/G235E, E296K/Q561* и T402I/Q561* в первом (поле 3) и втором участках (поле 4) соответственно. Для комбинаций G251D/Q561* уменьшение уровня Cd достигает около 45% в обоих местоположениях в поле. Для всех линий вероятность того, что среднее значение ниже 20%, является значимой (р<0,05; наибольшее рзначение=0,0068). Не наблюдают влияния на вес листа (фиг. 8b).

В совокупности полевые данные демонстрируют, что при сельскохозяйственных полевых условиях даже в разных участках комбинации мутаций НМА4 имеют потенциал к уменьшению содержания Cd в

- 50 041833

5- 10 раз. Как представляется, развитие растения и урожай не подвергаются влиянию на поздней стадии роста сорта АА37.

Пример 7. NtHMA4 представляет собой ключевой фермент для перемещения Cd от корня к побегу.

В линиях с RNAi НМА4, а также в двойных нонсенс-мутантах по НМА4, описанных в данном документе, уровень Cd в листе может быть уменьшен в более чем 10 раз, тем самым указывая на то, что перенос Cd от корня к побегу в табаке, по сути, зависит от НМА4. Мутации в обоих генах НМА4 необходимы для разведения табака с низким уровнем Cd. Как при тепличных, так и при полевых условиях двойные нонсенс-мутанты НМА4 характеризуются 90% уменьшением уровня Cd. При всех условиях уровня Cd, которые были протестированы, нонсенс-мутация только в одном из генов НМА4 не способна уменьшать содержание Cd в растениях табака.

Интересно отметить, что при чрезвычайно высоких не встречающихся в природе параметрах Cd отмечалось 50% уменьшение уровня Cd в растениях, которые несут только одну нонсенс-мутацию в одном из генов NtHMA4 (Hermand, 2014). Это соответствует результатам наблюдений за Arabidopsis, где в агаровой среде с высоким уровнем Cd нокаут AtHMA4 уменьшает содержание Cd в побеге более чем на 50%, в свою очередь, одновременный нокаут обоих данных генов-транспортеров приводит к еще большему уменьшению (Wong и Cobbett, 2009). Исследование на NtHMA4.1 и NtHMA4.2 демонстрирует, что результаты, полученные с искусственных систем, нуждаются в подтверждении в полевых и почвенных условиях для оценки влияния мутации на разведение растения.

Как и для многих сельскохозяйственных культур, существуют различные сорта табака. Они характеризуются значительными различиями, например в требованиях к удобрению и накоплении аминокислот и сахаров (Lewis et al., 2012). В трех проанализированных сортах растений, TN90, K326 и АА37, разрушение НМА4 демонстрирует сопоставимый эффект, т.е. во всех данных сортах растений достигнуто уменьшение уровня Cd более чем на 90%. Тем не менее, несмотря на сопоставимый эффект, наблюдаемый в отношении уменьшения уровня Cd и Zn, производительность растений очень разная. В то время как K326 лишь незначительно подвержен нехватке НМА4, и характеризуется округлой формой листа и увеличением жилок листа, с постоянной биомассой и размером растения, TN90 демонстрирует сильную задержку роста и некротические поражения, в свою очередь, АА37, не являясь типичным растением типа Берлей, как TN90, демонстрирует только незначительные эффекты. Это подчеркивает метаболические различия между сортами табака относительно гомеостаза Zn. Снабжение Zn почвы обеспечивает возможность восстановить фенотип, и это указывает на то, что другие транспортеры могут восполнить НМА4 и опосредовать поглощение Zn, хотя и на низком уровне.

Пример 8. Низкий уровень Cd в сочетании с не подверженным влиянию фенотипом требует корректировки обоих гомологов NtHMA4.

Для того, что бы минимизировать эффекты двойного нокаута НМА4 на фенотип, вторую мутацию идентифицируют в одном из генов НМА4. Цель состоит в том, что во время разведения данной комбинации в виде различных сортов достаточно значимо уменьшить уровень Cd, но без влияния на фенотип растения. В то время как в мутантном фоне АА37 EMS эффект является заметным, в частности на ранней стадии роста, на поздней стадии явного влияния на рост и биомассу не наблюдают. Тем не менее, согласно данным по линиям с RNAi НМА4 (фиг. 3) и согласно разновидности, представляющей интерес, в частности с разновидностями типа Берлей, может проявляться негативное влияние на рост.

Далее по тексту описаны комбинации мутаций, которые считаются особенно полезными для дополнительного разведения растения. Кроме двойных нокаут-мутантов по НМА4 (Q293*/Q561*, Q293*/W265*, Q464*/Q561*) были идентифицированы дополнительные комбинации с сопоставимым уменьшением уровня Cd (80-90%).

В то время как двойные мутанты E296K/Q561* и Q293*/G235E демонстрируют фенотип, аналогичный двойным нокаут-мутантам на ранней стадии (некротические поражения, уменьшение роста), мутантные растения T402I/Q561* демонстрируют лучшие показатели роста и не проявляют некротических участков на листьях на ранней стадии. Комбинация G251D/Q561* обеспечивает от 30 до 70% уменьшения уровня Cd, и фенотип не отличается от контроля. Еще две комбинации мутаций (Q293*/L223F и Q293*/D234N) демонстрируют только низкие показатели уменьшения уровня Cd (37 и 27% соответственно в одном полевом испытании).

Второй тепличный эксперимент выполняли с дополнительными комбинациями мутаций, в которых комбинация H438Y/W265* демонстрирует 58% уменьшения уровня Cd и не влияет на фенотип (табл. 9).

Описанные выше комбинации мутаций предлагают возможность дозировать содержание Cd и Zn и найти оптимальную комбинацию мутаций для каждого сорта. Для такого сорта растений как Берлей, на котором сильнее сказывается нехватка НМА4, как продемонстрировано на трансгенных линиях (фиг. 3), может быть необходимо применить промежуточный состав (например, G251D/Q561*, H438Y/W265*, Q293*/L223F или Q293*/D234N).

Далее по тексту исследовали локализацию мутаций (фиг. 9). АТФаза тяжелого металла содержит три домена, которые являются важными для каталитической функции: фосфорилирующий домен (Р), домен нуклеотидного связывания (N) и исполнительный домен (А). Р-домен состоит из N- и Стерминальных краев третьей цитоплазматической петли. Средняя часть петли представляет собой N- 51 041833 домен. DKTGT-мотив обнаружен в Р-домене. Остаток аспартата в этом мотиве, за прогнозами, фосфорилируется в активном ферменте во время катализа. В А-домене каталитически активная TGE(S) петля выступает из структуры, взаимодействуя с сайтом фосфорилирования в АТФ-связующем домене (Banci et al., 2009).

Пять функциональных мутаций, которые имеют влияние на уровень поглощения Cd, обнаружены в А (исполнительный домен)-домене транспортера (L223F, D234N, G235E, G251D, Е296К), и G251* локализован в TGES-мотиве. С данных по другим транспортерам НМА известно, что мутации, которые происходят в А-домене, либо нарушают устойчивость укладки домена, либо влияют на взаимодействие с другими доменами фермента (Banci et al., 2009). Мутация T402I обнаружена в DKTGT-мотиве, а Р (фосфорилирущий)-домен в третьей цитоплазматической петле белка. Мутация H438Y обнаружена в HPмотиве N (нуклеотидное связывание)-домена в третьей цитоплазматической петле белка, который может воздействовать путем нарушения координационной связи с участием нуклеотида.

В заключение, две мутации являются необходимыми для ингибирования транслокации Cd, одна из них приведена к полному нокауту, и вторая представляет собой нонсенс- или миссенс-мутацию, которая вероятно расположена либо в А-домене, в DKTGT-мотиве Р-домена, либо в локусе HP N-домена во второй копии НМА4.

В совокупности данная работа подчеркивает потребность в идентификации предпочтительной системы для измерения эффекта мутаций НМА4 и их комбинаций на содержание Cd и на фенотип. Данная работа демонстрирует важное значение корректировки системы перемещения НМА4 от корня к побегу для того, чтобы получить табак с низким уровнем Cd без изменений фенотипа для всех сортов растений, вызывающих интерес.

Перечень источников.

Arnould, S., Delenda, С., Grizot, S., Desseaux, C., Paques,

F., Silva, G.H., and Smith, J. (2011). The I-Crel meganuclease and its engineered derivatives: applications from cell modification to gene therapy. Protein Eng Des Sei. 24 (1-2): 2731.

Banci, L., Bertini, I., Cantini, F., Migliardi, M., Natile,

G., Nushi, F., и Rosato, A. (2009) . Solution structures of the actuator domain of ATP7A and ATP7B, the Menkes and Wilson disease proteins. Biochemistry 48(33): 7849-7855.

Bortesi, L., и Fischer, R. (2015). The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnol Adv. 33 (1) : 4152 .

Chen, K, and Gao, C. (2014) . Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements. Plant Cell Rep. 33 (4) :575-583.

Chen, L., Hao, L., Parry, M.A., Phillips, A.L., и Hu, Y.G.

(2014). Progress in TILLING as a tool for functional genomics and improvement of crops. J Integr Plant Biol. 56 (5): 425-443.

Dey, N., and Maiti, I.B. (1999). Structure and promoter/leader deletion analysis of mirabilis mosaic virus (MMV) full-length transcript promoter in transgenic plants.

Plant Mol Biol. 40 (5): 771-82.

Fricano, A., Bakaher, N., Del Corvo, M., Piffanelli, P.,

Donini, P., Stella, A., Ivanov, N.V., and Pozzi, C. (2012) .

Molecular diversity, population structure, and linkage disequilibrium in a worldwide collection of tobacco (Nicotiana tabacum L.) germplasm. BMC Genet. 13:18. doi: 10.1186/1471-215613-18 .

Gravot, A., Lieutaud, A., Verret, F., Auroy, P., Vavasseur,

A., and Richaud, P. (2004). AtHMA3, a plant PIB-ATPase,

- 52 041833 functions as a Cd/Pb transporter in yeast. FEBS Lett. 561 (13) :22-28 .

Hermand, V., Julio, E., Dorlhac de Borne, F., Punshon, T., Ricachenevsky, F.K., Bellec, A., Gosti, F., and Berthomieu, P. (2014) Inactivation of two newly identified tobacco heavy metal ATPases leads to reduced Zn and Cd accumulation in shoots and reduced pollen germination. Metallomics, 6 (8), 1427-1440.

Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N.L., Wallroth, M., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Fraley, R. T. (1985). A Simple and General Method for Transferring Genes into Plants. Science, 227, 1229-1231.

Hussain, D., Haydon, M.J., Wang, Y., Wong, E., Sherson, S.M., Young, J, Camakaris J, Harper JF, Cobbett CS. (2004) Ptype ATPase heavy metal transporters with roles in essential zinc homeostasis in Arabidopsis. Plant Cell, 16 (5), 1327-1339.

Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., and Salzberg, S.L. (2013). TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology 14:R36.

Korenkov, V., King, B., Hirschi, K., and Wagner, G.J. (2009) . Root-selective expression of AtCAX4 and AtCAX2 results in reduced lamina cadmium in field-grown Nicotiana tabacum L. Plant Biotechnol J 7 (3) :219-226.

Lewis, R.S., Parker, R.G., Danehower, D.A., Andres, K., Jack, A.M., Whitley, D.S., and Bush, L.P. (2012) Impact of alleles at the Yellow Burley (Yb) loci and nitrogen fertilization rate on nitrogen utilization efficiency and tobacco-specific nitrosamine (TSNA) formation in air-cured tobacco. J Agric Food Chem. 60, 6454-6461.

Liedschulte, V., Laparra, H., Battey, J., Goepfert, S., and Bovet, L. Missense or nonsense mutations in either HMA4.1 or HMA4.2 do not significantly reduce cadmium content in the leaves of tobacco plants grown under field conditions. Стендовый доклад представлен на: The 12th Solanaceae conference; 25-29 октября 2015 г.; Бордо, Франция.

Lugon-Moulin, N., Martin, F., Krauss, M.R., Ramey, P.B.,

- 53 041833 and Rossi L. (2006) Cd concentration in tobacco (Nicotiana tabacum L.) from different countries and its relationship with other elements. Chemosphere 63, 1074-1086.

Morel, M., Crouzet, J., Gravot, A., Auroy, P., Leonhardt,

N., Vavasseur, A., and Richaud, P. (2009). AtHMA3, a PIB-ATPase allowing Cd/Zn/Co/Pb vacuolar storage in Arabidopsis. Plant

Physiol., 149 (2), 894-904.

Ng, P.C., and Henikoff, S. (2003). SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 31 (13) :3812-4 .

Petolino, J.F. (2015). Genome editing in plants via designed zinc finger nucleases. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 51 (1): 1-8.

Puchta, H., and Fauser, F. (2013) . Gene targeting in plants: 25 years later. Int J Dev Biol. 57 (6-8): 629-37.

Qiwei, S., and Caixia, G. (2015). Research progress of genome editing and derivative technologies in plants. Yi Chuan. 37 (10): 953-973.

Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989).

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. 2012. NIH Image to Imaged: 25 years of image analysis. Nature Methods 9, 671-675, 2012.

Sierro, N., Battey, J.N.D., Ouadi, S., Bakaher, N., Bovet,

L., Willig, A., Goepfert, S., Peitsch, M.C., and Ivanov, N.V.

(2014) The tobacco genome seguence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications 5, Article number: 3833 .

Trapnell, C., Hendrickson, D., Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, J.L., and Pachter, L. (2013). Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seg. Nature Biotechnology 31: 46-53.

Wong, C.K., and Cobbett C.S. (2009) HMA P-type ATPases are the major mechanism for root-to-shoot Cd translocation in Arabidopsis thaliana. New Phytol., 181 (1), 71-78.

Wright, D.A., Li, T., Yang, B., and Spalding, M.H. (2014)

TALEN-mediated genome editing: prospects and perspectives.

Biochem J. 462 (1): 15-24.

Любая публикация, цитируемая или описанная в данном документе, предоставляет соответствующую информацию, раскрытую до даты подачи настоящего изобретения. Заявления, сделанные в данном документе, не должны быть истолкованы как признание того, что авторы настоящего изобретения не имеют оснований для его противопоставления таким раскрытиям как более раннего. Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в данный документ с помощью ссылки. Различные модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сути настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. В действительности различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в клеточной, молекулярной биологии и биологии рас- 54 041833 тений или в смежных областях, предназначены находиться в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

Последовательности.

SEQ ID NO:1

Аминокислотная последовательность АТФазы тяжелого металла Nicotiana tabacum (NtHMA4.1), номер доступа в GenBank: CCQ77798.

1 MVESEKMNET	KKLSKSYFDV	LGICCTSEW	LVEKILKNLE	GVKEVSVIVT
TKTVIVIHDS 61 LLISPQQIVK	ALNQARLEAS	IRVKGEKNYQ	KKWPSPFAIG	SGILLGLSFL
KYFFAPFQWL 121 ALAAVAVGIP	PIIFRGVAAV	RNLTLDINIL	VLIAVAGSIV	LHDYWEAGTI
VFLFAIAEWL 181 ESRASHKATA	AMSSLVNIVP	PTAVLAESGE	VVNVDEVKVN	SILAVKAGET
IPIDGVWEG 241 ECDVDEKTLT	GESFPVSKQR	DSTVWAGTTN	LNGYISVKTT	ALAEDCAVAR
MAQLVEDAQN 301 KKSKTQRYID	KCAKYYTPAI	VAISASLAIV	PTALRVHNRN	EWYRLALVTL
VSACPCALVL 361 STPVAMCCAL	SKAATSGLLF	KGAEYLETLA	KIKIMAFDKT	GTITKGEFMV
TEFKSLIDGF 421 SLNTLLYWVS	SIESKSGHPM	AAALVDYAQS	NSVEPKPDRV	EQFQNFPGEG
IFGRIDGMEI 481 YVGNRKISSR	AGCTTVPEIE	GDSFKGKSVG	YIFLGSSPAG	IFSLSDVCRI
GVKEAMRELK 541 QMGIKTAMLT	GDCYAAANHV	QDQLGGALDE	FQAELLPEDK	ATIIKGFQKE
APTAMIGDGL 601 NDAPALATAD	IGISMGISGS	ALAKETGHVI	LMTNDIGRIP	KAARLARRVR
RKIVENMIIS 6 61 VVTKAAIVAL	AIAGYPLVWA	AVLADTGTCL	LVILNSMLLL	RGGTRRHGKK
CWRSSTPSHA 721 PHHKDKASCC	KSENAPQLCC	SDIESQKKCT	SQSCSSEVCV	PRCQPVSSGS
KSCGNNQCPD 781 SIENSGFHSH	RRPQCCSSKM	AAKACQSAVS	ESKSCGNNQC	PDSVENSGFH
SHPRPECCSS 841 KMAAKACQSA	VSESKSCGNN	QCPDSVENSG	FHSHPRPQCC	SSKMAAKAGQ
SALSESKSCG 901 NNNCSDSIHK	SNCHSLTNSL	VCSSKMSAPQ	CHSATSSNKS	CGSTKCSDFS

DKKCCQSDKI

- 55 041833

961 PQTCSTKKSA	PGCQSAVSGS	KSCGNSKCSD	SKDNSSHPSH	PDHQTCMSKL
CAPQSQSATS 1021 SSRTCGNTKC	SDTNSKNSCY	SQTNSESCSS	KMSGPSCKTA	NSGSRSCRNK
KCQDSATENS 1081 FHSPLTNPLS	GEKLSEQKSL	DLVRKDKESS	HDLRHGCSDE	EHDHTNLDKA
YDSCALQECC 1141 YSVQGNKTDV	SETGIQETAH	CDSTNQTCQT	ASSGSMTCGN	DKILDSLSIH
GCHSHDNPLH 1201 EENNLEQKIL	DWGEGIKSP	HAVGHGCSDK	EHDHSHPEKA	YDSCATDDCC
FSVQVHGIDD 1261 VSKSEIQETA	HCDSTKQSMV	ISSSCKHEPK	DQVNHCGLHS	KTTPTDEELA
KLVRRCCKYK 1321 PCHDVRSGCR	KHAAECGPTV	RSTINILRDN	HHHYLDCSGR	KVCSLLEKRH

IGGCCDSFRK

1381 ECCAKKKHLG ASFGGGLSEI VIE

SEQ ID NO:2

Аминокислотная последовательность АТФазы тяжелого металла

Nicotiana tabacum (NtHMA4	. 2) , номер	доступа в	GenBank:
CCW03243.1. 1 MVESEKMNDT	KNLSKSYFDV	LGICCTSEW	LVEKILKNLE	GVKEVSVIVT
TKTVIVIHDS 61 LLISQQQIVK	ALNQARLEAS	IRVKGEKNYQ	KKWPSPFAIG	SGILLGLSFL
KYFFAPFQWL 121 ALAAVAVGIP	PIIFRGVAAV	RNLTLDINIL	VLIAVTGSIV	LHDYWEAGTI
VFLFTIAEWL 181 ESRASHKATA	AMSSLVNIVP	PTAVLAESGE	WNVDEVKLN	SILAVKAGET
IPIDGWMEG 241 ECDVDEKTLT	GESFPVSKQI	DSTVWAGTTN	LNGYISVKTT	ALAEDCAVAR
MAQLVEDAQN 301 KKSKTQRYID	KCAKYYTPAI	VAISASLAIV	PTALRVHNRN	EWYRLALVTL
VSACPCALVL 361 STPVAMCCAL	SKAATSGLLF	KGAEYLETLA	KIKIMAFDKT	GTITRGEFMV
TEFKSLVDGL 421 GLNTLLYWVS	SIESKSGHPM	AAALVDYAQS	NSVEPKPDRV	EQFQNFPGEG
IFGRIDGMEI 481 YVGNRKISSR	AGCTTVPEIE	GDSFQGKSVG	YIFLGSSPAG	IFGLSDVCRI

- 56 041833

GVKEAMRELK

541 QMGIKTAMLT	GDCYAAANHV	QDQLGGAMDE	FQAELLPEDK	ATIIKGFQKE
APTAMIGDGL 601 NDAPALATAD	IGISMGISGS	ALAKETGHVI	LMTNDIGRIP	KAARLARRVR
RKIVENMIIS 6 61 WTKAAIVAL	AIAGYPLVWA	AVLADTGTCL	LVILNSMLLL	RVGTHRHGKK
CCRSATPSHA 721 PNHKDKASCC	KSENAPQLCC	SDIESQKKCT	SQSCSSEVCV	PRCQPVSSGS
KSCGNNQCPD 781 SVENSGFHSH	PRPQCCSSKM	ASKACQSAVS	ESKSCGNNQC	PDSVENSGFH
SHPRPQCCSS 841 KMASKACQSA	VSESKSCGNN	QCPDSVENSG	FHSHPRPQCC	SLKMASKACQ
SAVSESKSCG 901 NNQCPDSVEN	SGFHSHPRPQ	CCSSKMAAKA	CQSAVSESKS	CGNNNCSESI
YKSSCHSLTS 961 SLVCSSKMSA	PQCHSATSSS	KSCGSTKCSN	FSDKKCCQYD	KIPQTCSTKK
SAPGCQSAVS 1021 GSKSCGDSKC	SDSKDNSSHP	SHPDHQICTS	KLCAPQSQSA	TSSSRTCGNM
KCSDTNSKNS 1081 CYSHTNSESC	SSKMSGPACK	TANSGSRLCG	NKKCLDSANE	NSFHSLTNPL
CEEKLLEKES 1141 LDLARKDRES	NHDLSHGCSD	EEHDHLNLDK	AHDSCALQEC	CYSVQGNKTD
VSETGIQEAA 1201 HCDSINQTCQ	TAISGSMTCG	NNKSLDSLSI	HGCHSHDSPL	HKESNLEQKS
LDVAGEGIKS 1261 PHAVGQGCSD	KEHNHSHPEK	AYDSCATDDC	CFSVQVHGID	DVSRSEIQET
AHCDSTKQST 1321 VIPSSCEHEP	KDQVNHCGSH	SKSIPTDEEL	AKLVRRCCKY	KPCHDVRSGC
RKHAAECGPT 1381 VRSTINILRD	NHHHHLDCSG	RKVCSLLEKR	HIGGCCDSFR	KECCAKNNHL

GASFGGGLSE

1441 IVIE

SEQ ID NO:3

Полинуклеотидная последовательность

АТФазы тяжелого металла

Nicotiana tabacum (NtHMA4.1) номер доступа в GenBank:

HF675181.1.

- 57 041833

1 agagaaggag	aaaaatggtg	gaaagtgaaa	aaatgaatga	aacaaagaag
ttgagcaaga 61 gctattttga	tgttttggga	atttgctgta	cttcagaagt	tgttctagtt
gaaaaaattc 121 tcaagaatct	tgaaggggtt	aaagaggttt	cagtaattgt	cacaacaaag
actgtcattg 181 ttattcatga	ttctcttctc	atttctccgc	aacaaattgt	taaagcattg
aatcaagcaa 241 gattagaagc	aagcataaga	gtgaaaggag	agaaaaacta	ccaaaagaaa
tggccaagtc 301 catttgcaat	tggcagtgga	atattgcttg	gactctcatt	tttgaagtac
ttttttgcac 361 ctttccaatg	gttagcactt	gcagctgttg	cagttgggat	tcctccaatt
atttttagag 421 gtgtggctgc	cgtgcgaaac	ctcactcttg	acatcaacat	tcttgtttta
atagcagtgg 481 ctggatcaat	tgttttacac	gattattggg	aagctggtac	tattgtcttc
ttattcgcca 541 ttgcagaatg	gctagagtca	agggcaagtc	acaaggctac	cgctgctatg
tcatcactgg 601 tcaatatagt	ccctccaaca	gcagttttag	ctgaaagcgg	agaagtcgta
aatgttgatg 661 aagtcaaggt	gaatagcatt	cttgctgtga	aagctggtga	aactatacct
attgatggag 721 ttgtagtgga	aggggaatgt	gacgtggacg	agaaaacact	gacaggcgag
tcgtttccag 781 tttctaagca	aagagattca	acggtctggg	ctggcactac	aaatctaaat
ggctatatca 841 gtgttaagac	tacggctttg	gctgaagatt	gtgcggtggc	taggatggca
cagcttgtcg 901 aagatgctca	gaacaagaaa	tcaaaaaccc	aaagatacat	cgacaagtgt
gctaaatatt 961 atacaccagc	aattgtggct	atatcagctt	ctttggcaat	tgttcctact
gcattaagag 1021 ttcacaatcg	aaatgaatgg	tatcgcttgg	ctttggtcac	attggtgagt

gcatgtccgt

- 58 041833

1081 gtgcacttgt	tctatctaca	ccagttgcca	tgtgttgcgc	actttcaaaa
gcagcaacgt 1141 ccggtcttct	gtttaaagga	gcagagtacc	ttgagactct	agctaaaatc
aaaatcatgg 1201 cttttgacaa	aacagggact	ataactaaag	gagaatttat	ggtgaccgag
ttcaagtctc 1261 tgattgatgg	ttttagtctc	aatacactgc	tttactgggt	ttcaagcatt
gagagcaagt 1321 caggtcatcc	gatggcagcc	gctctggtgg	actatgcaca	atcaaattcc
gttgagccaa 1381 agcctgatag	agttgagcag	tttcaaaatt	ttcctggtga	agggatattt
ggaagaattg 1441 atggaatgga	aatctatgtc	gggaatagga	aaatttcttc	aagagctgga
tgtaccacag 1501 taccagaaat	agagggtgat	agtttcaaag	gaaagtctgt	tggatacata
tttttgggat 1561 catctccagc	tggaattttc	agtctttccg	atgtttgtcg	aattggtgta
aaagaagcaa 1621 tgagagaact	gaagcagatg	ggtatcaaaa	ccgcgatgct	tactggtgat
tgttatgcag 1681 ctgccaacca	tgtgcaggat	cagttaggtg	gagctttgga	tgaatttcaa
gcagaactcc 1741 taccagagga	caaggcaaca	atcatcaagg	gttttcagaa	ggaagctcca
acagcgatga 1801 taggcgacgg	ccttaatgat	gctcctgcat	tagcaacagc	tgacattggc
atctcaatgg 1861 gcatctctgg	gtcagctctc	gctaaagaaa	caggccatgt	tatactaatg
acaaatgaca 1921 tcggaagaat	accgaaagct	gcacgtcttg	ctagaagagt	tcgaaggaag
attgttgaga 1981 atatgattat	atcagtcgtt	acaaaggctg	ccatagttgc	attggcaata
gcaggttatc 2041 cattggtttg	ggctgctgtc	ctcgcagata	ctgggacatg	cttgctagtg
attttgaaca 2101 gcatgctact	tctacgagga	ggcacacgca	gacatgggaa	aaaatgttgg

agatcttcta

- 59 041833

2161 ctccttcgca	tgctccccac	cacaaagaca	aagcttcatg	ttgcaagtcg
gaaaatgctc 2221 cccagctgtg	ttgctctgat	attgagtcac	aaaagaaatg	tacaagtcaa
tcatgctcgt 2281 ccgaggtgtg	tgttccaaga	tgtcaacctg	tctcctcagg	atcaaagtca
tgtggaaata 2341 atcagtgccc	agactccatt	gaaaatagtg	gttttcattc	tcatcgccgt
cctcaatgct 2401 gctcgtcgaa	gatggctgct	aaagcatgcc	aatctgcagt	ttcagaatca
aagtcatgcg 2461 gaaataatca	gtgcccagac	tccgttgaaa	atagtggttt	tcattctcat
ccccgtcctg 2521 aatgctgctc	gtcgaagatg	gctgctaaag	cgtgccaatc	tgcagtttca
gaatcaaagt 2581 catgtggaaa	taatcagtgc	ccagactccg	ttgaaaatag	tggttttcat
tctcatcccc 2641 gtcctcaatg	ctgttcatcg	aagatggctg	ctaaagcagg	ccaatctgca
ctttcagaat 2701 caaagtcatg	tggaaataac	aattgctcag	actccattca	caagagtaat
tgtcattctt 2761 taactaactc	tctagtatgt	tcttccaaga	tgtctgctcc	acaatgtcat
tctgctactt 2821 caagcaacaa	atcatgtgga	agtaccaagt	gctccgactt	cagtgacaaa
aaatgttgtc 2881 aatccgacaa	aattcctcaa	acgtgctcta	ccaagaagtc	tgctccagga
tgtcaatctg 2941 cagtttctgg	gtctaaatca	tgtggaaata	gcaagtgttc	agactcaaaa
gacaatagta 3001 gccatccttc	acatcccgat	catcaaacat	gcatgtctaa	gttgtgtgct
ccacaaagcc 3061 aatctgcaac	ttcaagctcc	aggacatgtg	gaaatacaaa	gtgctcggac
accaatagca 3121 agaattcttg	ttattcacaa	accaactctg	aatcatgctc	ttcaaagatg
tctggtccat 3181 catgcaaaac	tgctaattca	ggttcaaggt	catgcagaaa	taagaagtgc

caggactctg

- 60 041833

3241 caaccgagaa	cagttttcat	tcaccactta	ctaatccact	cagtggggaa
aagctttcgg 3301 agcagaaaag	cttggattta	gtccgaaaag	ataaggaatc	aagtcatgat
cttcgtcatg 3361 gctgctctga	cgaggaacat	gatcatacaa	atttagacaa	ggcatatgac
agttgtgcct 3421 tacaagaatg	ttgttattcg	gttcaaggca	ataaaactga	tgtatcagaa
actggaatcc 3481 aggaaactgc	tcattgtgac	agcaccaatc	aaacatgcca	aactgcaagt
tcaggatcga 3541 tgacatgcgg	aaatgataag	atcctggact	ctctaagcat	ccatggttgt
cattcgcatg 3601 ataatccact	ccacgaggag	aacaacttgg	agcagaaaat	cttggatgtt
gttggagaag 3661 gtataaaatc	acctcatgct	gtcggtcatg	gctgttcgga	caaggaacac
gatcactcac 3721 atccagaaaa	ggcatatgac	agttgtgcaa	cagatgattg	ttgtttttca
gttcaagtcc 3781 atggcattga	cgacgtatca	aaaagtgaaa	ttcaagaaac	tgctcattgt
gacagcacaa 3841 agcagagcat	ggtcatctcc	agcagctgca	aacatgaacc	aaaagatcag
gtaaatcact 3901 gtggacttca	ctctaaaact	actccaactg	atgaagaact	agccaagctg
gttagaagat 3961 gctgcaaata	caaaccatgc	cacgacgtcc	gttctggctg	caggaagcat
gctgcagaat 4021 gtggtccaac	cgttcgatca	accatcaata	tcttacggga	caaccatcat
cattacctag 4081 actgcagtgg	tcgtaaggtt	tgttcgctgt	tggagaagag	acacatcggt
ggatgctgtg 4141 acagcttcag	aaaagaatgt	tgtgccaaga	aaaaacacct	tggagcaagt
tttggaggag 4201 gtttatcaga aattgtcata gagtagatgc aatccgaagt gtacat
SEQ ID NO:4

Полинуклеотидная последовательность АТФазы тяжелого металла

Nicotiana tabacum (NtHMA4.2')_r номер доступа в GenBank:

- 61 041833

HF937054.1

1 atagaaagaa	gagaatggtg	gaaagtgaga	aaatgaatga	cacaaagaat
ctgagcaaga 61 gctattttga	tgttttggga	atttgctgta	cttcagaagt	tgttcttgtt
gaaaaaattc 121 tcaagaatct	tgaaggggtt	aaagaggttt	cagtaattgt	cacaacaaag
actgtcattg 181 ttattcatga	ttctctcctc	atttctcagc	aacaaattgt	taaagcattg
aatcaagcaa 241 gattagaagc	aagtataaga	gtgaaaggag	agaaaaacta	ccaaaagaaa
tggccaagtc 301 catttgcaat	tggcagtgga	atattgcttg	gactctcatt	tttgaagtac
ttttttgcac 361 ctttccaatg	gttagcactt	gcagctgttg	cagttgggat	tcctccaatt
atttttaggg 421 gtgtggctgc	cgtgcgaaac	ctcactcttg	acatcaacat	tcttgtttta
atagcagtga 481 cgggatcaat	tgttttacac	gattattggg	aagctggtac	tattgtcttc
ttattcacca 541 ttgcagaatg	gctagagtca	agggcaagtc	acaaggctac	tgctgctatg
tcatcactgg 601 tcaatatagt	ccctccaaca	gcagttttag	ctgaaagtgg	agaagtcgta
aatgttgatg 661 aagtcaagtt	gaatagcatt	cttgctgtta	aagctggtga	aactatacct
attgatggag 721 ttgtaatgga	aggggaatgt	gacgtggacg	agaaaacact	gacaggcgag
tcgtttccag 781 tttctaagca	aatagattca	acggtctggg	ctggcactac	aaatctaaat
ggctatatca 841 gtgttaagac	tacggctttg	gctgaagatt	gtgcggtggc	taggatggcg
cagcttgtcg 901 aagatgctca	gaacaagaaa	tcaaaaaccc	aaagatacat	tgacaagtgt
gctaaatatt 961 atacaccagc	aattgtggct	atatcagctt	ctttggcaat	agttcctact
gcattaagag 1021 ttcacaatcg	aaatgagtgg	tatcgcttgg	ctttggtcac	gttggtgagt

- 62 041833 gcatgtccgt

1081 gtgcacttgt	gctatctaca	ccagttgcca	tgtgttgtgc	actttctaaa
gcagcaacgt 1141 ccggtcttct	gtttaaagga	gcagagtacc	ttgagactct	tgctaaaatc
aaaatcatgg 1201 cttttgacaa	aacagggact	ataactagag	gagaatttat	ggtgaccgag
ttcaagtctc 1261 tggttgatgg	tcttggtctc	aatacactgc	tttactgggt	ttcaagtatt
gagagcaagt 1321 caggtcatcc	gatggcagcc	gctctggttg	actatgcaca	atcaaattcc
gttgagccaa 1381 agcctgatag	agttgagcag	tttcaaaatt	ttcctggtga	agggatattt
ggaagaattg 1441 atggaatgga	aatctatgtc	gggaatagga	aaatttcttc	aagagctgga
tgtactacag 1501 taccagaaat	agagggtgat	agtttccaag	gaaagtctgt	tggatacata
tttttgggat 1561 catctcccgc	tggaattttc	ggtctttccg	atgtttgtcg	aattggtgta
aaagaagcaa 1621 tgagagagct	gaagcagatg	ggtatcaaaa	ccgcgatgct	tactggtgat
tgttatgcag 1681 ctgccaacca	tgtgcaggat	cagttaggtg	gagctatgga	tgaatttcaa
gcggaactct 1741 taccagagga	caaggcaaca	atcatcaagg	gttttcagaa	ggaagctcca
acagcgatga 1801 taggcgacgg	ccttaatgat	gctcctgcat	tagcaacagc	tgacattggc
atctcaatgg 1861 gcatctctgg	gtcagctctc	gcgaaagaaa	caggccatgt	tatactaatg
acaaatgaca 1921 tcggaagaat	accaaaagct	gcacgtcttg	ctagaagagt	tcgaaggaag
attgttgaga 1981 atatgattat	atcagtcgtt	acaaaggccg	ccatagttgc	attggcaata
gcaggttatc 2041 cattggtttg	ggctgctgtc	ctcgcggata	ctgggacatg	cttgctagtg
atcttgaaca 2101 gcatgctact	tctacgagta	ggcacacaca	gacatgggaa	aaaatgttgt

- 63 041833

agatctgcta
2161 ctccttcgca	tgctcccaac	cacaaagaca	aagcttcttg	ttgcaagtcg
gaaaatgctc
2221 cgcagctgtg	ttgctctgat	attgagtcac	aaaagaaatg	tacgagtcaa
tcatgctcgt
2281 ccgaggtgtg	tgttccaaga	tgtcaacctg	tctcctcggg	atcaaagtca
tgtggaaata
2341 atcagtgccc	agactccgtt	gaaaatagtg	gttttcattc	tcatccccgt
cctcaatgct
2401 gctcgtcgaa	gatggcttct	aaagcatgcc	aatctgcagt	ttcagaatca
aagtcatgtg
2461 gaaataatca	gtgcccagac	tccgttgaaa	atagtggttt	tcattctcat
ccccgccctc
2521 aatgctgctc	gtctaagatg	gcttctaaag	catgccaatc	tgcagtttca
gaatcaaagt
2581 catgtggaaa	taatcagtgc	ccagactccg	ttgaaaatag	tggttttcat
tctcatcccc
2641 gtcctcaatg	ctgctcgttg	aagatggctt	ctaaagcatg	ccaatctgca
gtttcagaat
2701 caaagtcatg	tggaaataat	cagtgcccag	actccgttga	aaatagtggt
tttcattctc
2761 atccccgtcc	tcaatgctgc	tcgtcgaaga	tggctgctaa	agcatgccaa
tctgcagttt
2821 cagaatcaaa	gtcatgtgga	aataacaatt	gctcggagtc	catttacaag
agtagttgtc
2881 attctttaac	aagttctcta	gtatgttctt	ccaagatgtc	tgctccacaa
tgtcattctg
2941 ccacttcaag	ctccaaatca	tgtggaagta	ccaagtgctc	caacttcagt
gacaaaaaat
3001 gttgccaata	tgacaaaatt	cctcaaacgt	gctctaccaa	gaagtctgct
ccaggatgtc
3061 aatctgcagt	ttctgggtct	aaatcatgtg	gagatagcaa	gtgttcagac
tcgaaagaca
3121 atagtagcca	tccttcacat	cccgatcatc	aaatatgcac	gtctaagttg
tgtgctccac
3181 aaagccaatc	tgcaacttca	agctccagga	catgtggaaa	tatgaagtgc

- 64 041833 tcggacacca

3241 atagcaagaa	ttcttgttat	tcacatacca	actctgaatc	atgctcttca
aagatgtctg 3301 gtccagcatg	caaaactgct	aattcaggtt	caaggttatg	cggaaataag
aagtgcctag 3361 actctgcaaa	cgagaacagt	tttcattcac	ttactaatcc	actctgtgag
gaaaagcttt 3421 tggagaagga	aagcttggat	ttagcccgaa	aagataggga	atcaaatcat
gatcttagtc 3481 atggttgctc	tgacgaggaa	catgatcatc	taaatttaga	caaggcacat
gacagttgtg 3541 ccttacaaga	atgttgttat	tctgttcaag	gcaataaaac	tgatgtatca
gaaactggaa 3601 tccaggaagc	tgctcattgt	gacagcatca	atcaaacatg	ccaaactgca
atttcaggat 3661 caatgacatg	cggaaataat	aagagtctgg	actctctaag	catccatggt
tgtcattcac 3721 atgatagtcc	actccacaag	gagagcaact	tggagcagaa	aagcttggat
gttgctggag 3781 aaggtataaa	atcacctcat	gctgtcggtc	aaggctgttc	ggacaaggag
cacaatcact 3841 cgcatccaga	aaaggcgtat	gacagttgtg	caacagacga	ttgttgtttt
tcagttcaag 3901 tccatggcat	tgacgacgta	tcaagaagtg	aaattcaaga	aactgctcat
tgtgacagca 3961 caaaacagag	cacggtcatc	cccagcagct	gcgaacatga	accaaaagat
caggtaaatc 4021 actgtggatc	tcactctaaa	agtattccaa	ctgatgaaga	actagccaag
ctggttagaa 4081 gatgctgcaa	atacaaacca	tgccacgatg	tccgctctgg	ctgcaggaag
catgctgcag 4141 aatgtggtcc	aaccgttcga	tcaaccatca	atatcttacg	ggacaaccat
catcatcatc 4201 tagactgcag	tggtcgtaag	gtttgttcgc	tgttggagaa	gagacacatt
ggtggatgct 4261 gtgacagctt	cagaaaagaa	tgttgtgcca	agaacaatca	ccttggagca
agttttggag 4321 gaggtttatc	agaaattgtc	atagagtaga	tgcaatctga	agtgtacata

tgttgt

- 65 041833

Таблица 1

Мутация	Наименован ие мутации (WO'913)	Уровень Cd в листе (ч./млн.)	% уменьшения уровня Cd по сравнению с контролем	Уровень Zn в листе (ч./млн.)	% уменьшения уровня Zn по сравнению с контролем
Контроль	ЕЗ-277дикий тип	92,3 ± 26, 5 (среднее значение ± SD, п=4)	-	92
R529*, гомозиготн ая	ЕЗ-277 мутант (HMA-DT R342*)	7,2 (среднее значение, п=2)	92%	62,3	32%
Контроль	BB16NN (контроль)	-560	-
Е387К, гомозиготн ая	276В5 (Нта-В Е200К)	-160	-71%
Е387К, гомозиготн ая	276В8 (Нта-В Е200К)	-250	-55%
Е387К, гомозиготн ая	276В18 (Нта-В Е200К)	-250	-55%
Контроль	277S (дикий ТИП )	525,0	-
R529*, гетерозиго тная	277Htz (HMA-DT R342*)	232,6	56%
Контроль	425S (дикий ТИП )	207,0	-
W2 65*, гомозиготн ая	425М (Нта- AS W78*)	36, 1	83%
Контроль	90S (дикий	77,2	-
L294F, гомозиготн ая	тип) 9 ОМ (НМА- AS L107F)	25,7	67%

Обобщенное представление данных по уровням Cd и Zn в одиночных мутантах по НМА описано в WO 2012/041913А1. Наименование мутантов в WO'913 отличается от наименования мутанта в данном документе, и мутанты описаны в Hermand et al., 2014. Это происходит из-за неполной последовательности, которую применяли в WO'913. В первой колонке используется соответствующий стандарт наименования.

- 66 041833

Таблица 2

Мутация	Уровень Cd в побегах (ч./млн. )	% уменьшения уровня Cd по сравнению с контролем	Уровень Zn (ч . /млн. )	% уменьшения уровня Zn по сравнению с контролем
Контроль	-135	-	2300	-
P294S, миссенс	-50	63%	2900	0%
Е387К, миссенс	-70	48%	1700	26%
W2 65*, нонсенс	-50	63%	1100	52%
G515R, миссенс	-70	48%	2000	13%
R259*, нонсенс	-60	56%	1500	35%

Обобщенное представление данных отмечено на фиг. 4а и с в Hermand et al. (2014) Metallomics. 6(8): 1427-1440.

Таблица 3. Полевое испытание 1 (участок с умеренным содержанием Cd). Полевые данные по одиночным мутантам

Мутац ИЯ	Контроль: уровень Cd в листе (ч . /млн. )	Мутант: уровень Cd в листе (ч./млн. )	% уменьшения уровня Cd в мутантах по сравнению с контролем	рЗначе ние	Контроль: уровень Zn в листе (ч . /млн. )	Мутант уровен ь Zn в листе (ч./мл н.)	% уменьше НИЯ уровня Zn в мутанта х по сравнен ию с контрол ем	рЗначение
ΗΜΆ4 . 1 W265*	0,91 ± 0,1	0,92 ± 0,13	0%	0,973 1	19,2 ± 7,4	23,8 ± 6, 3	0%	0,9906
ΗΜΆ4 . 1 Q561*	0,87 ± 0,11	1 ± 0,09	0%	1,000 0	18,6 ± 6,9	16, 6 ± 4,7	11%	0,9983
ΗΜΆ4 . 2 Q293*	0,85 ± 0,13	0,89 ± 0,12	0%	0,999 7	18,9 ± 4,6	17,7 ± 3,7	6%	0,9115
ΗΜΆ4 . 2 Е296К	0,89 ± 0,07	0,92 ± 0,1	0%	0,994 6	24,5 ± 15,8	13,4 ± 3,6	45%	0,1779
ΗΜΆ4 . 2 T402I	0,87 ± 0,09	0,93 ± 0,15	0%	0,998 4	21,9 ±5,8	14,4 ± 1,6	34%	0,0557
ΗΜΆ4 . 2 G251D	0,88 + 0,15	0,93 + 0,07	0%	0, 998 4	16 ± 3,9	15,1 + 2,8	6%	0,9700
ΗΜΆ4 . 2 G382R	0,93 ± 0,06	0,93 ± 0,09	0%	0,999 5	14,8 ± 2,6	17,3 ± 5,7	0%	0,9840
ΗΜΆ4 . 2 V351M	0,83 ± 0,11	0,95 ± 0,12	0%	0,995 7	17,8 ± 5,4	14,2 ± 2	20%	0,6459

Значения уровней Cd/Zn (среднее значение ± стандартное отклонение) в объединенных образцах из опытных участков с гомозиготными одиночными мутантами и соответствующими им нульсегрегантными контрольными растениями, выращенными в ходе полевого эксперимента большого масштаба. % уменьшения уровня Cd/Zn рассчитывают по сравнению с контрольными значениями, рзначение (парный t-критерий) рассчитывают для определения вероятности того, что среднее значение (мутантная линия) случайным образом <0,8* среднее значение (контрольная линия). Для линий со значимым уменьшением уровня Cd/Zn>20% (р<0,05) р-значения выделены жирным шрифтом. В полевом испытании для семи комбинаций мутаций выращивали соответствующих им одиночных мутантов, двойных мутантов и контрольные растения на шести дублируемых опытных участках (5 для Q293*/Q561*, 4 для E296/Q561* и 3 для Q293*/W265*). Каждая дублируемая единица содержит 10 растений двойных

- 67 041833 мутантов, контроль НМА4 WT и два простых мутанта соответственно. Так как мутации Q293* и Q561* проявляются в нескольких комбинациях, данные для этих одиночных мутаций основываются на значениях 8 и 33 опытных участков соответственно. Одиночные мутантные растения не демонстрируют уменьшения биомассы (вес листа) по сравнению с контролем, что можно увидеть на фиг. 6.

Таблица 4. Полевое испытание 1 (участок с умеренным содержанием Cd). Полевые данные двойных мутантов

Комбинаци я мутаций (НМА4.1 /НМА4.2)	Контроль уровень Cd в листе (ч./млн. )	Мутант: уровень Cd в листе (ч . /млн. )	% уменьш ения уровня Cd в мутант ах по сравне НИЮ с контро л ем	рЗначен ие	Контроль уровень Zn в листе (ч./млн. )	Мутант уровен ь Zn в листе (ч./мл н.)	% уменьшения уровня Zn в мутантах по сравнению с контролем	рЗначен ие
Q293/Q56 1	0,82 ± 0,15	0,058 ± 0,008	93%	0	18,6 ± 3	12,9 ± 5,1	31%	0,1204
Q293/W26 5	0,91 ± 0,1	0,069 ± 0,012	92%	0,0013	19,2 ± 7,4	21,6 ± 20	0%	0,6331
E296K/Q56 1*	0,89 ± 0,07	0,093 ± 0,104	90%	0,0054	24,5 ± 15,8	12,1 ± 4,7	51%	0,0377
T402I/Q56 1*	0,87 ± 0,09	0,042 ± 0,003	95%	0	21,9 ± 5,8	10 ± 1,9	54%	0,0043
G251D/Q56 1*	0,88 ± 0,15	0,59 ± 0,13	33%	0,1029	16 ± 3,9	14 ± 2,6	13%	0,9056
G382R/Q56 1*	0,93 ± 0,06	0,83 ± 0,07	11%	0,9993	14,8 ± 2,6	15,6 ± 4,3	0%	0,9990
V351M/Q56 1*	0,83 ± 0,11	0,91 ± 0,06	0%	0,9994	17,8 ± 5,4	18,7 ± 5,1	0%	0,9794

Значения уровней Cd/Zn (среднее значение ± стандартное отклонение) в объединенных образцах из опытных участков с гомозиготными двойными мутантами и соответствующими им нуль-сегрегантными контрольными растениями, выращенными в ходе полевого эксперимента большого масштаба. % уменьшения уровня Cd/Zn рассчитывают по сравнению с контрольными значениями, р-значение (парный tкритерий) рассчитывают для определения вероятности того, что среднее значение (мутантная линия) случайным образом <0,8* среднее значение (контрольная линия). Для линий со значимым уменьшением уровня Cd/Zn>20% (р<0,05) р-значения выделены жирным шрифтом. В полевом испытании засевают и подвергают анализу в отношении генотипа сегрегирующие семена из партий семи комбинаций мутаций. Для каждой комбинации мутаций выращивают четыре генотипические группы в шести дублируемых опытных участках (5 для Q293*/Q561*, 4 для E296/Q561* и 3 для Q293*/W265*). Каждая дублируемая единица содержит 10 растений двойных мутантов, контроль НМА4 WT и два простых мутанта соответственно. Данные по фенотипу (вес свежего листа) показаны на фиг. 6.

- 68 041833

Таблица 5. Полевое испытание 2 (участок с умеренным содержанием Cd). Полевые данные двойных мутантов

Комбинация мутаций (НМА4.1/НМ А4.2)	Контрол уровень Cd в листе (ч./млн ·)	Мутант: уровень Cd в листе (ч./млн. )	% уменьшены я уровня Cd в мутантах по сравнению с контролем	рЗначен ие	Контроль уровень Zn в листе (ч./млн. )	Мутант уровен ь Zn в листе (ч./мл н.)	% уменьшены я уровня Zn в мутантах по сравнению с контролем	рЗначен ие
Q293*/Q561	0,61 ± 0,07	0,064 ± 0,021	89%	0	37,4 ± 5,5	13,7 ± 3,6	63%	0,0007
Q293*/W265	0,49 ± 0,12	0,058 ± 0,005	88%	0,0007	33,5 ± 7,4	13,2 ± 1,7	61%	0,0151
Q464*/Q561	0,66 ± 0,07	0,043 ± 0,003	94%	0	37,1 ± 7,5	9,4 ± 1,6	75%	0
Q293*/G235 E	0,64 ± 0,06	0,04 ± 0	94%	0	33,7 ± 5,9	8,5 ± 1,8	75%	0
E296K/Q561	0,61 ± 0,12	0,047 ± 0,018	92%	0	33,8 ± 6, 9	10,7 ± 2,4	68%	0,0002
T402I/Q561	0,71 ± 0,14	0,041 ± 0,002	94%	0	39,2 ± 5,3	9,3 ± 0,7	76%	0
G251D/Q561	0,74 ± 0,13	0,22 ± 0,06	70%	0	34,5 ± 6, 7	9,1 ± 1,1	74%	0,0002
Q293*/L223 F	0,61 ± 0,11	0,38 ± 0,09	37%	0,0002	36,5 ± 5,6	25,4 ± 3,1	31%	0,0118
Q293*/D234 N	0,47 ± 0,03	0,34 ± 0,05	27%	0,1494	30,5 ± 7,1	10,8 ± 0,8	65%	0,0072
A188V/Q561	0,58 ± 0,06	0,48 ± 0,1	17%	0,5872	36,7 ± 6, 5	34,9 ± 7,6	5%	0,9866
G382R/Q561	0,65 ± 0,12	0,56 ± 0,07	14%	0,8572	36, 8 ± 6, 4	35,2 ± 5,8	4%	0,9997
Q293*/A369 V	0,46 ± 0,04	0,4 ± 0,05	14%	0,9007	33,3 ± 4,3	32 ± 4,1	4%	0,9929
Q293*/A374 V	0,47 ± 0,07	0,43 ± 0,06	9%	0,9645	36,5 ± 7,9	31,9 ± 4,8	12%	0,958
V351M/Q561	0,66 ± 0,05	0,63 ± 0,06	6%	0,9823	34,1 ± 5,2	32,9 ± 4,7	4%	0,9999
T189I/Q561	0,69 ± 0,09	0,67 ± 0,11	3%	0,9829	40,8 ± 4,4	45,3 ± 7,2	0%	1
Q293*/S27L	0,58 ± 0,09	0,61 ± 0,06	0%	0,9996	32,8 ± 5,2	34,8 ± 7,7	0%	0,9977
Q293*/A188 V	0,48 ± 0,07	0,51 ± 0,08	0%	0,9999	30,6 ± 7,7	29,8 ± 3,4	3%	0,9761
G128E/Q561	0,71 ± 0,08	0,85 ± 0,15	0%	0,9997	36,4 ± 7,4	31,1 ± 5,2	15%	0,9737

Значения уровней Cd/Zn (среднее значение ± стандартное отклонение) в объединенных образцах из опытных участков с гомозиготными двойными мутантами и соответствующими им нуль-сегрегантными контрольными растениями, выращенными в ходе полевого эксперимента большого масштаба. % уменьшения уровня Cd/Zn рассчитывают по сравнению с контрольными значениями, р-значение (парный tкритерий) рассчитывают для определения вероятности того, что среднее значение (мутантная линия) случайным образом <0,8* среднее значение (контрольная линия). Для линий со значимым уменьшением уровня Cd/Zn>20% (р<0,05) р-значения выделены жирным шрифтом. В полевом испытании для 18 комбинаций мутаций выращивали двойных мутантов и соответствующие им контрольные растения в шести дублируемых опытных участках (4 для Q293*/W265* и для Q293*/D234N). Каждая дублируемая единица содержит 20 растений двойных мутантов и контроль НМА4 WT соответственно. Данные по фенотипу (сухой вес листа) показаны на фиг. 7.

- 69 041833

Таблица 6. Полевые данные полевых испытаний 3 и 4: участки с высоким содержанием Cd

Поле 3: участок 1 с высоким содержанием Cd

Комбинация мутаций (НМА4.1/НМ А4.2)	Контроль уровень Cd в листе (ч./млн. )	Мутант уровен ь Cd в листе (ч. /мл н.)	% уменьшения уровня Cd в мутантах по сравнению с контролем	рЗначен ие	Контроль уровень Zn в листе (ч./млн. >	Мутант уровен ь Zn в листе (ч. /мл н.)	% уменьшения уровня Zn в мутантах по сравнению с контролем	рЗначен ие
Q293*/Q561	3,05 ± 0,71	0,61 ± 0,24	80%	0,0003	94, 8 ± 15,5	22,9 ± 5,7	76%	0,0000
Q293*/G235 Е	3,49 ± 0,79	0,58 ± 0,26	84%	0,0003	114,3 ± 19,1	21,8 ± 5,1	81%	0,0000
E296K/Q561	3,09 ± 0,82	0,4 ± 0,19	87%	0,0001	112,7 ± 22,8	20,1 ± 4,5	82%	0,0000
T402I/Q561	2,38 ± 0,8	0,47 ± 0,16	80%	0,0009	81, 9 ± 9,7	20,8 ± 2,5	75%	0,0001
G251D/Q561	2,89 ± 0,75	1,56 ± 0,38	46%	0,0014	107 ± 18,6	25,3 ± 4,6	76%	0,0000

Поле 4: участок 2 с высоким содержанием Cd

Комбинация мутаций (НМА4.1/НМ А4.2)	Контроль уровень Cd в листе (ч./млн. )	Мутант уровен ь Cd в листе (ч./мл н.)	% уменьшения уровня Cd в мутантах по сравнению с	рЗначен ие	Контроль уровень Zn в листе (ч./млн. )	Мутант уровен ь Zn в листе (ч./мл н.)	% уменьшения уровня Zn в мутантах по сравнению с	рЗначен ие
			контролем				контролем
Q293*/Q561	2,65 ± 2,52	0,16 ± 0,08	94%	0,0068	32,1 ± 10,7	11,4 ± 1,1	65%	0,0303
Q293*/G235 Е	3,81 ± 2,88	0,18 ± 0,04	95%	0,0006	38 ± 8,2	12,3 ± 1,6	68%	0,0018
E296K/Q561	2,9 ± 2,5	0,13 ± 0,02	96%	0,0009	36,3 ± 8,6	14,5 ± 1,6	60%	0,0052
T402I/Q561	2,81 ± 1,98	0,27 ± 0,11	90%	0,0001	30,7 ± 9,2	16,4 ± 2,7	47%	0,0439
G251D/Q561	4, 01 ± 1,84	2,27 ± 0,97	43%	0,0056	38,8 ± 10,6	14,2 ± 1,8	63%	0,0107

Значения уровней Cd/Zn (среднее значение ± стандартное отклонение) объединенных образцов из опытных участков гомозиготных двойных мутантов и их нуль-сегрегантных контрольных растений, выращенных в ходе двух полевых экспериментов в участках с высоким содержанием кадмия. % уменьшения уровня Cd/Zn рассчитывают по сравнению с контрольными значениями. р-значение (парный tкритерий) рассчитывают для определения вероятности того, что среднее значение (мутантная линия) случайным образом <0,8* среднее значение (контрольная линия). Для линий со значимым уменьшением уровня Cd/Zn>20% (р<0,05) р-значения выделены жирным шрифтом. В полевом испытании для пяти комбинаций мутаций выращивали двойных мутантов и соответствующие им контрольные растения в пяти дублируемых опытных участках. Каждая дублируемая единица содержит 20 растений двойных мутантов и контроль НМА4 WT соответственно. Анализировали только опытные участки с приемлемым для мутанта и контроля показателем роста (5 опытных участков для большинства линий, за исключением: в поле 3: 4 опытных участка для T402I/Q561*; в поле 4:4 опытных участка для G251D/Q561* и 3 опытных участка для Q293*/Q561*). Данные по фенотипу (вес подсушенного листа) показаны на фиг. 8.

- 70 041833

Таблица 7

Аминокислотные остатки	Длина (аминокислот)	Описание
1-90	90	Цитоплазматическая N-концевая последовательность (НМА-домен)
91-112	22	Трансмембранный домен 1
113-115	3	Внеклеточная последовательность
116-135	20	Трансмембранный домен 2
136-142	7	Первая цитоплазматическая петля
143-163	21	Трансмембранный домен 3
164-164	1	Внеклеточная последовательность
165-183	21	Трансмембранный домен 4
186-311	126	Вторая цитоплазматическая петля (А-домен)
312-334	23	Трансмембранный домен 5
335-342	8	Внеклеточная последовательность
343-360	18	Трансмембранный домен 6
361-653	293	Третья цитоплазматическая петля (P-домен и N-домен)
654-673	20	Трансмембранный домен 7
674-677	4	Внеклеточная последовательность
678-697	20	Трансмембранный домен 8
698-1403 (НМА4.1)/ 1444 (НМА4.2)	706 (НМА4.1)/ 747(НМА4.2)	Цитоплазматическая С-концевая последовательность

Доменная структура НМА4 была установлена с выравниваний последовательностей с белками НМА2 и НМА4 Arabidopsis и соответствующей им доменной аннотацией с помощью UniProt (AtHMA2: Q9SZW4; AtHMA4: 064474).

Таблица 8. Тепличные данные выбранных двойных мутантов

Комбинация мутаций	Уровень Cd в листе (ч./млн.)	% уменьшения уровня Cd по сравнению с контролем	Уровень Zn в листе (ч./млн.)	% уменьшения уровня Zn по сравнению с контролем
Контроль	0,66 ± 0,24	-	32,5 ± 12,1	-
Q293/Q561	0,059 ± 0,015	91%	10,7 ± 3,43	67%
E296K/Q561*	0,051 ±	92%	8,18 ± 2,61	75%
	0, 003
T402I/Q561*	0,077 ± 0, 016	88%	7,99 ± 1,20	75%
G251D/Q561*	0,42 ± 0,12	37%	15,3 ± 13,2	53%
G382R/Q561*	0,55 ± 0,13	(17%)	22,5 ± 5,77	31%
V351M/Q561*	0,53 ± 0,15	(19%)	19,8 ± 4,60	39%

- 71 041833

Значения уровней Cd/Zn (среднее значение ± стандартное отклонение) восьми растений (шесть растений для Q293*/A374V), которые представляют собой гомозиготные двойные мутанты (мутации указаны как гомозиготные мутации в НМА4.1/ гомозиготные мутации в НМА4.2) и нуль-сегрегантные контрольные растения всех двойных мутантов мутанты (всего 54 растения). % уменьшения уровня Cd/Zn рассчитывают по сравнению с контрольными значениями. Для того, чтобы сделать таблицу менее сложной, все 54 контрольные растения анализируют вместе в вышеприведенной таблице и значения уровня Cd/Zn опытных участков двойных мутантов сравнивают со всеми контрольными растениями. (Рассчитывают t-критерии, и значения в скобках не указывают на значимое уменьшение при Р<0,05.) Растения в данном эксперименте выращивают на больших опытных участках в теплице. Указаны морфология растения и урожай, проанализированные после четырех и одиннадцати недель роста в горшках.

Таблица 9. Тепличные данные дополнительно выбранных двойных мутантов

Комбинация Мутаций	Уровень Cd в листе (ч. /млн.)	% уменьшения уровня Cd по сравнению с контролем	Уровень Zn в листе (ч./млн.)	% уменьшения уровня Zn по сравнению с контролем
Контроль	0,31 ± 0, 09	-	33, 9 ± 4,57	-
H438Y/W265*	0,13 ± 0,06	58%	12,2 ± 2,4	64%
L36F/Q561*	0,38 ± 0,16	0%	28,8 + 5, 34	15%

Значения уровней Cd/Zn в листе (среднее значение ± стандартное отклонение 9 параллелей растений для H438Y/W265* и 6 параллелей растений для L36F/Q561*) двух дополнительных комбинаций гомозиготных мутантов по НМА4 (мутации указаны как гомозиготные мутации в НМА4.1/ гомозиготные мутации в НМА4.2) и такого же числа нуль-сегрегантных контрольных растений для каждого двойного мутанта. % уменьшения уровня Cd/Zn рассчитывают по сравнению с контрольными значениями.

- 72 041833

Таблица 10
	ЭкЗон		а/к измене ние	Показ атель WT SIFT	Показ атель Mut. SIFT	Показа тель SIFT/ WT SIFT	ЭкЗон	а/к измене ние	Показ атель WT SIFT	Показ атель Mut. SIFT	ПокаЗат ель SIFT/ WT SIFT
НМА 4 .	1- экз.	1	S16R	1	0, 022	0,022	НМА4.2экз. 1	M7I	0,377	0,359	0,954
НМА 4 .	1- экз.	1	V30I	0,454	0, 074	0,164	НМА4.2экз. 1	D19N	1	0,008	0,008
НМА 4 .	1- экз.	1	L36F	1	0, 003	0,003	НМА4.2экз. 1	S27L	1	0,018	0,018
НМА4 .	1- экз.	1	Е44К	1	0,291	0,291	НМА4.2экз. 1	L31F	1	0,028	0,028
НМА 4 .	1- экз.	1	T50I	0,277	0, 066	0,238	НМА4.2экз. 1	L62F	1	0,033	0,033
НМА 4 .	1- экз.	2	Е78К	1	0, 167	0,167	НМА4.2экз. 2	G106E	0,513	0,238	0,465
НМА 4 .	1- экз.	2	A9 8V	1	0,540	0,540	НМА4.2экз. 2	L145F	1	0,165	0,165
НМА4 .	1- экз.	2	G128E	1	0, 029	0,029	НМА4.2экз. 4/5	A188V	1	0,003	0,003
НМА4 .	1- экз.	2	P130L	0,095	0,281	2,948	НМА4.2экз. 4/5	P200L	1	0,005	0,005
НМА 4 .	1- экз.	2	A13 8V	1	0, 184	0,184	НМА4.2экз. 4/5	S221N	0,545	0,096	0,176
ΗΜΆ4	. 14/5	ЭКЗ .		A188V	1	0, 004	0,004	НМА4.2экз. 4/5	L223F	1	0,019	0,019
ΗΜΆ4	. 14/5	экз.		T189I	1	0, 015	0,015	НМА4.2экз. 4/5	A22 4V	1	0,152	0,152
ΗΜΆ4	. 14/5	экз.		А191Т	1	0, 093	0,093	НМА4.2экз. 4/5	D234N	1	0	0
НМА4	. 14/5	экз.		V217I	1	0,280	0,280	НМА4.2экз. 4/5	G235E	1	0,001	0,001
ΗΜΆ4	. 14/5	экз.		G251D	1	0	0	НМА4.2экз. 4/5	G251D	1	0	0
ΗΜΆ4	. 14/5	экз.		А2 66Т	1	0, 005	0,005	НМА4.2экз. 4/5	W265*			Останов ка
ΗΜΆ4	. 1- 4/5	экз.		A2 87V	0,635	1	1,575	НМА4.2экз. 6	Р331Т	0, 120	0,038	0,318
НМА4	. 14/5	экз.		Q293*			Остано вка	НМА4.2экз. 6	P331S	0, 120	0,019	0,154
ΗΜΆ4	. 14/5	экз.		Е2 96К	1	0	0	НМА4.2экз. 6	Т349М	0,286	0,021	0,075
НМА4	. 14/5	экз <		C312Y	1	0,348	0,348	НМА4.2экз. 6	V364V	1	0,089	0,089
НМА 4 .	1- экз.	6	T349I	0,153	0, 101	0,658	НМА4.2экз. 6	A369V	1	0,001	0,001
НМА4 . НМА 4 .	1- экз. 1- экз.	6 6	V351M S376F	1 1	0, 003 0,017	0,003 0,017	НМА4.2tiiWI.z⁶экз. 6	A374V G419D	1 0,583	0,008 1	0,008 1,715
НМА 4 .	1- экз.	6	G382R	1	0,002	0,002	НМА4.2экз. 7/8	S452F	1	0,005	0,005
НМА 4 .	1- экз.	6	T402I	1	0	0	НМА4.2экз. 7/8	D476Y	1	0,001	0,001
НМА 4 .	1- экз.	6	Е407К	1	0,340	0,340	НМА4.2экз. 7/8	G506R	1	0,006	0,006
НМА4	. 1- 7/8	экз.		S434N	1	0,018	0,018	НМА4.2экз. 7/8	V509F	1	0,057	0,057
НМА4	. 1- 7/8	экз.		G437S	0,161	1	6,219	НМА4.2экз. 7/8	G510E	1	0,401	0,401
НМА4	. 1- 7/8	экз.		H438Y	1	0	0	НМА4.2экз. 7/8	P518S	0,459	0,187	0,407
НМА4	. 1- 7/8	экз.		А448Т	1	0,003	0,003	НМА4.2экз. 7/8	A519V	1	0,562	0,562
НМА4	. 1- 7/8	экз.		Q464*			Остано вка	НМА4.2экз. 7/8	G523S	1	0,759	0,759
НМА4	. 17/8	экз.		R474K	0,366	1	2,731	НМА4.2экз. 7/8	T546I	1	0,061	0,061
НМА4	. 1- 7/8	экз.		M47 8I	0,243	0,028	0,117	НМА4.2экз. 7/8	Q561*			Останов ка
НМА4	. 1- 7/8	экз.		T494I	0,651	0,145	0,222
НМА4	. 1- 7/8	экз.		V496I	1	0,181	0,181
НМА4	. 1- 7/8	экз.		H559Y	1	0,429	0,429

Список идентифицированных и подтвержденных мутаций в НМА4.1 и НМА4.2. Указаны аминокислотные изменения и соответствующие им показатели SIFT. Вызывающие интерес мутации выделены

Claims

жирным шрифтом (нонсенс-мутация или миссенс-мутация с показателем SIFT замененных а/к <0,05 исходного показателя SIFT).

Таблица 11. Примеры комбинаций мутаций, которые, как ожидается, снижают уровень содержания Cd в листе

Другие возможные комбинации Мутация в НМА4.1 Мутация в НМА4.2

Комбинация 1 Q4 64* W2 65*

Комбинация 2 Q4 64* L223F

Комбинация 3 Q4 64* D234N

Комбинация 4 Q4 64* G235E

Комбинация 5 Е296К W2 65*

Комбинация 6 Е296К L223F

Комбинация 7 Е296К D234N

Комбинация 8 Е296К G235E

Комбинация 9 T402I W2 65*

Комбинация 10 T402I L223F

Комбинация 11 T402I D234N

Комбинация 12 T402I G235E

Комбинация 13 G251D W2 65*

Комбинация 14 G251D L223F

Комбинация 15 G251D D234N

Комбинация 16 G251D G235E

Комбинация 17 H438Y Q561*

Комбинация 18 H438Y L223F

Комбинация 19 H438Y D234N

Комбинация 20 H438Y G235E

Таблица 12. Примеры комбинаций мутаций, которые, как ожидается, снижают уровень содержания Cd в листе

Другие возможные комбинации Мутация в НМА4.2 Мутация в НМА4.1

Комбинация 1 Q4 64* W2 65*

Комбинация 2 Q4 64* L223F

Комбинация 3 Q4 64* D234N

Комбинация 4 Q4 64* G235E

Комбинация 5 Е296К W2 65*

Комбинация 6 Е296К L223F

Комбинация 7 Е296К D234N

Комбинация 8 Е296К G235E

Комбинация 9 T402I W2 65*

Комбинация 10 T402I L223F

Комбинация 11 T402I D234N

Комбинация 12 T402I G235E

Комбинация 13 G251D W2 65*

Комбинация 14 G251D L223F

Комбинация 15 G251D D234N

Комбинация 16 G251D G235E

Комбинация 17 H438Y Q561*

Комбинация 18 H438Y L223F

Комбинация 19 H438Y D234N

Комбинация 20 H438Y G235E

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Мутантное растение или его часть с уменьшенной экспрессией или активностью по меньшей мере двух АТФаз тяжелого металла (НМА) по меньшей мере на 10 % по сравнению с контрольным растением, где указанные две НМА содержат:

(i) полипептиды по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2;

(ii) полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, изложенные в (i); или (iii) полинуклеотиды по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, кодирующие НМА;

где мутантное растение или его часть проявляет по меньшей мере 27% уменьшение, по сравнению с контрольным растением, накопления кадмия в листе, когда мутантное растение выращено в поле в присутствии кадмия.

- 74 041833
2. Мутантное растение или его часть по п.1, где экспрессия или активность одного из НМА, изложенных в (i), или (ii), или (iii), являются частично уменьшенными или утраченными, и экспрессия или активность одного из НМА, изложенных в (i), или (ii), или (iii), являются утраченными по сравнению с контрольным растением.
3. Мутантное растение или его часть по п.1 или 2, где фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора.
4. Мутантное растение или его часть по любому из предыдущих пунктов, содержащая по меньшей мере одно генетическое изменение в регуляторной области или в кодирующей последовательности каждой из полинуклеотидных последовательностей, изложенных в (ii) или (iii), при этом мутация представляет собой миссенс-мутацию или нонсенс-мутацию.
5. Мутантное растение или его часть по любому из предыдущих пунктов, содержащие одну или более из следующих групп мутаций:

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 251 до 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 251, или 293, или 296 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 223 до 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, при этом растение содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 223, или 234, или 235, или 265 второй цитоплазматической петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 402 до 464 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 402 или 464 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению в третьей цитоплазматической петле P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной после- 75 041833 довательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 третьей цитоплазматической петли P/N-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию, соответствующую аминокислотному положению 265 во второй цитоплазматической петле А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению Адомена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению во второй цитоплазматической петле петли А-домена полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению Адомена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению Адомена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида

- 76 041833

НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 251 до 296 Адомена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 251, или 293, или 296 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению Адомена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 223 до 265 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, при этом растение содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 223, или 234, или 235, или 265 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям от 402 до 464 P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 402 или 464 P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию, соответствующую аминокислотному положению 265 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3;

- 77 041833 по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению Адомена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3;

по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению Адомена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3; и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению P/Nдомена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3; по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 P/N-домена третьей цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, и по меньшей мере одну мутацию в положении, соответствующем аминокислотным положениям 265, 223, 234 или 235 А-домена второй цитоплазматической петли полипептида НМА, кодируемого немутированной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3.
6. Мутантное растение или его часть по любому из предыдущих пунктов, содержащие одну или более из следующих групп мутаций:

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q293* и Q561*, и при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q293* и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Е296К и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой T402I и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон;

- 78 041833 миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой H438Y и

W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q293* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q293* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q293* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой H438Y и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q464* и W265**, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q464* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q464* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q464* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Е296К и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Е296К и L223F;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Е296К и D234N;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Е296К и G235E;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой T402I и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой T402I и L223F;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой T402I и D234N;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой T402I и G235E;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой G251D и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой G251D и L223F;

- 79 041833 миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой G251D и D234N;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой G251D и G235E;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой H438Y и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой H438Y и L223F;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой H438Y и D234N;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 1, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой H438Y и G235E;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Q293* и Q561*, и при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Q293* и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Е296К и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой T402I и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой G251D и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Q293* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Q293* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 293 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Q293* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой H438Y и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Q464* и W265**, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2,

- 80 041833 и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Q464* и L223F, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Q464* и D234N, при этом * указывает на стоп-кодон;

нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Q464* и G235E, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Е296К и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Е296К и L223F;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Е296К и D234N;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 296 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой Е296К и G235E;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой T402I и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой T402I и L223F;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой T402I и D234N;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 402 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой T402I и G235E;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 265 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой G251D и W265*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой G251D и L223F;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой G251D и D234N;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 251 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой G251D и G235E;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой H438Y и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 223 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой H438Y и L223F;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 234 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой H438Y и D234N;

миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 438 SEQ ID NO: 2, и миссенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 235 SEQ ID NO: 1, при этом мутации представляют собой H438Y и G235E; и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 464 SEQ ID NO: 1, и нонсенс-мутацию в положении, соответствующем аминокислотному положению 561 немутированной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, при этом мутации представляют собой Q464* и Q561*, при этом * указывает на стоп-кодон.
7. Способ уменьшения уровня кадмия в листе выращенного в поле растения по меньшей мере на 27%, включающий стадии:

- 81 041833 (a) уменьшение экспрессии или активности двух АТФаз тяжелого металла (НМА) по меньшей мере на 10% по сравнению с контрольным растением, при этом указанные две НМА содержат:

(i) полипептиды по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 и SEQ

ID NO: 2;

(ii) полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, изложенные в (i); или (ii i) полинуклеотиды по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, кодирующие НМА, при этом уменьшение экспрессии или активности НМА осуществляют с помощью мутагенеза или редактирования генома;

(b) выращивание растения в поле; и (c) идентификация растения, в котором содержание кадмия, имеющегося в нем, уменьшено по сравнению с контрольным растением, в котором экспрессия или активность НМА не были уменьшены, при этом растение или его часть проявляют по меньшей мере 27% уменьшение, по сравнению с контрольным растением, накопления кадмия в листе, когда растение выращивают в поле в присутствии кадмия; при этом фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора.
8. Способ по п.7, в котором необязательно до стадии (с) осуществляют измерение содержания кадмия в растении, полученном на стадии (b).
9. Способ идентификации одного или более генетических изменений в выращенном в поле растении, которые коррелируют с уменьшенными уровнями кадмия в листе по меньшей мере на 27% по сравнению с выращенным в поле контрольным растением, которое не содержит одного или более генетических изменений, при этом указанный способ включает стадии:

(a) идентификация растения с уменьшенными по меньшей мере на 10% уровнями кадмия в листьях при выращивании в поле по сравнению с контрольным растением, выращенным в поле, при этом растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора;

(b) получение образца нуклеиновой кислоты из растения, идентифицированного на стадии (а); и (c) идентификация в образце нуклеиновой кислоты из стадии (b) одного или более генетических изменений в полинуклеотидных последовательностях, кодирующих НМА по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности с немутированными, представленными в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, или в полинуклеотидной последовательности по меньшей мере с 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
10. Способ по п.9, в котором необязательно на стадии (а) фенотип растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора.
11. Растительный материал, полученный из мутантного растения или его части по любому из пп.1-6 или из мутантного растения или его части, полученных с помощью способа по любому из пп.7-10, для изготовления табачных продуктов, при этом растительный материал является подсушенным или высушенным растительным материалом, при этом фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора.
12. Способ получения растительного материала с уменьшенным накоплением кадмия в листе при выращивании в поле по сравнению с выращенным в поле контрольным растением, при этом указанный способ включает стадии:

(a) обеспечение мутантного растения или его части по любому из пп.1-6;

(b) выращивание растения в поле; и (c) сбор растительного материала с растения, при этом фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора.
13. Мутантное растение или его часть, полученные с помощью способа по п.9, для изготовления табачных продуктов, при этом фенотип мутантного растения или его части во время сбора является таким же, как у контрольного растения в такое же время сбора, при этом мутантное растение или его часть не демонстрируют уменьшения биомассы (например, веса листа) во время сбора по сравнению с контрольным растением в такое же время сбора.
14. Растительный материал для изготовления табачных продуктов, полученный из мутантного растения или его части по п.13.
15. Растительный продукт для изготовления табачных продуктов, содержащий по меньшей мере часть мутантного растения или его части по любому из пп.1-6 или п.13 или растительный материал по п.11 или 14.

-