CN107616992B - 一种提高金银花活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高金银花活性成分的方法，更具体涉及地涉及一种通过光酶诱导技术提高金银花活性成分的方法。该方法包括下述顺序的步骤：(1)取金银花；(2)‑20℃冷冻；(3)320‑400nm的UV‑A、波长为280‑320nm的UV‑B、波长为200‑280nm的UV‑C交替照射。用该方法可显著提高金银花活性成分咖啡奎尼酸类和环烯醚萜苷类成分的含量，且大大缩短了紫外处理的时间，更加环保，同时小试实验证实，该方法适用于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高金银花活性成分的方法，更具体涉及地涉及一种通过光酶诱导技术提高金银花活性成分的方法。
背景技术
金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或带初开的花，自古以来就被誉为清热解毒良药，是临床常用药之一。金银花性甘寒、气芳，香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪，既能宣散风热，还善清解血毒，用于各，种热性病，如身热、喉痹、发疹、发斑、热毒血痢、咽喉肿痛、温病发热等症，均效，果显著。近年来研究发现，金银花中富含多种对人体健康有益的生物活性物质，诸如，挥发油类、黄酮类、有机酸类、萜类和多种微量元素等。
咖啡酰奎尼酸和环烯醚萜类化合物为忍冬科植物中最具代表性的活性成分，存在于已有研究报道的所有忍冬属植物中。咖啡酰奎尼酸(caffeoylquinic acid，CQA)类化合物是由奎尼酸和不同数目的咖啡酸缩合而成的酚酸类天然化合物。绿原酸是金银花的主要有效成分之一，一直以来都是作为金银花药材质量评价的重要指标。但最近研究表明，异绿原酸(包括3,4-di-O-caffeoylquinic acid，3,5-di-O-caffeoylquinic acid，4,5-di-O-caffeoylquinic acid等)抗病毒效果优于绿原酸，也是金银花重要的活性成分。咖啡酰奎尼酸类化合物具有抗病毒活性、抗氧化活性、抗肿瘤活性、神经保护活性、治疗消化系统及循环系统疾病等作用。
环烯醚萜(iridoid)为虹彩二醛(iridodial)通过分子内羟醛缩合形成的一类具有环烯醚结构特点的环状单萜衍生物，在金银花中分离得到了闭环环烯醚萜苷、裂环环烯醚萜苷和二聚环烯醚萜苷3类环烯醚萜类化合物。金银花中环烯醚萜类化合物具有广泛的生物活性，如抗病毒活性、抗氧化活性、抗肿瘤活性、抗炎作用、抗菌作用、保肝作用、保护神经系统、防治糖尿病和增强免疫作用等。
但是这些化合物含量普遍较低，若采用有效的技术手段，增加其含量，将会对金银花药材资源的利用起到积极的推动作用。光酶诱导技术主要是通过紫外光激活药用植物中与次生代谢产物相关的酶，改变其次生代谢产物含量构成，并优化光酶诱导的条件，提高目标次生代谢产物含量。
我们发现，利用光酶诱导技术可显著提高金银花中咖啡酰奎尼酸类(如异绿原酸A-C)和环烯醚萜苷类(如secoxyloganin、secologanin等)活性成分的含量，金银花抗氧化和抗病毒作用亦显著增强。论文《基于光酶诱导金银花活性次生代谢产物的快速发现》中公开了一种利用光酶诱导技术提高金银花活性次生代谢产物的方法，该方法采用分别用UV-A和UV-B照射金银花，发现UV-A和UV-B均可提高金银花部分活性此生代谢产物的含量。从该文献提供的数据可知，UV-A照射时间达到4小时时，金银花各活性次生代谢产物含量的变化量的平均值达到最大，不足4个小时时，基本趋势为金银花各活性次生代谢产物含量的变化量的平均值随照射时间的增长而增大；而UV-B照射时间达到6小时后，金银花各活性次生代谢产物含量的变化量的平均值才达到最大，不足6个小时时，基本趋势为金银花各活性次生代谢产物含量的变化量的平均值随照射时间的增长而增大。这样的照射时长，对于工业化生产来讲，实际的应用价值往往很低，因为第一工业化生产往往都是吨级生产量，紫外处理4或6小时，需要极高的成本和能耗，并且存在光污染不环保；第二由于紫外光穿透性不强，所述效果实际使用的处理时长远远大于其声称值，我们曾将该技术用于小试或中试实验，结果显示想要达到论文中所声称的效果，紫外实际处理的时间要远远长于4或6小时。
而我们提供的方法，紫外处理金银花的时间大大缩短，且诱导后金银花各活性次生代谢产物含量的变化量更显著。且在大规模小试和中试实验中，我们提供的方法仍能在2小时以内达到理想的金银花各活性次生代谢产物含量的变化量。我们提供的方法更适用于工业化大规模生产，效率更高，且减少了光污染，更加环保。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高金银花活性成分的方法，该方法紫外处理时间更短，效率更高，更加环保，且用该方法可显著提高金银花活性成分咖啡奎尼酸类和环烯醚萜苷类成分的含量。
本发明提供了一种提高金银花活性成分的方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)取金银花；
(2)-20℃冷冻；
(3)紫外光照射。
进一步地，步骤(1)所述的金银花为离体新鲜金银花。
进一步地，步骤(2)所述的-20℃冷冻的冷冻时间为0.5-2h；
优选地，步骤(2)所述的-20℃冷冻的冷冻时间为1h。
进一步地，步骤(3)所述的紫外光照射的方法为采用UV-A、UV-B、UV-C进行交替照射。
优选地，步骤(3)所述的紫外光照射的方法为依次采用UV-C、UV-A和UV-B交替照射。即，先采用UV-C照射，再采用UV-A照射，随后再采用UV-B照射；一轮照射完成后，再按照UV-C到UV-A，再到UV-B的顺序进行后续轮的照射。
其中，每次采用UV-A照射的时间为0.2-0.7h，优选为0.3-0.6h，进一步优选为0.5h。
其中，每次采用UV-B照射的时间为0.2-0.7h，优选为0.3-0.6h，进一步优选为0.5h。
其中，每次采用UV-C照射的时间为0.1-0.6h，优选为0.2-0.5h，进一步优选为0.5h。
在一些优选的实施方案中，步骤(3)所述的紫外光照射的方法为依次采用UV-C时间0.5h、UV-A时间0.5h和UV-B时间0.5小时进行交替照射。
进一步地，步骤(3)所述的紫外照射所用的总时间为0.5-2h；
进一步地，步骤(3)所述的紫外光照射所用的温度为25-30℃；优选为26-29℃；进一步优选为28℃。
本发明的有益效果在于：
(1)传统研究认为金银花对UV-A和UV-B敏感，但本申请发明人在实践中发现，交替使用UV-A、UV-B、UV-C照射，尤其是在特定的照射顺序、时间和温度条件下，与单一UV-A或UV-B或UV-C照射相比，更好地提高了金银花中咖啡奎尼酸类和环烯醚萜苷类成分的含量，且金银花的抗氧化能力也更强。
(2)本发明在紫外照射前加入了冷冻一步，再加上交替照射，使得本发明提供的方法在极短的时间内即可达到并超过单一照射时金银花中咖啡奎尼酸类和环烯醚萜苷类成分含量的提高值。
(3)本发明提供的方法，效率更高，紫外照射时间更短，更加环保，且适合大规模工业化生产，小试(200kg实验)实验结果显示，两小时内仍能达到理想的咖啡奎尼酸类和环烯醚萜苷类成分含量的提高值。
附图说明
图1：254nm下金银花活性成分色谱图(蓝色曲线为金银花，黑色曲线为绿原酸标准品)。
具体实施方式
通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。
实施例及对比例
一种提高金银花活性成分的方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)取新鲜离体金银花1kg；
(2)-20℃冷柜冷冻，冷冻时间见表1；
(3)紫外照射条件分别见表1：其中A1代表UV-A照射1h，B1代表UV-B照射1h，C1代表UV-C照射1h，其余依此类推。
表1
| 组别 | 冷冻时间(h) | 紫外光强及照射时间 | 紫外照射总时长(h) | 诱导温度(℃) |
| 实施例1 | 0.5 | B0.3C0.3A0.3 | 0.9 | 28 |
| 实施例2 | 1 | B0.3C0.3A0.3 | 0.9 | 28 |
| 实施例3 | 1 | C0.4A0.4C0.4 | 1.2 | 28 |
| 实施例4 | 1 | C0.5A0.5B0.5 | 1.5 | 28 |
| 实施例5 | 2 | C0.5A0.5B0.5 | 1.5 | 28 |
| 实施例6 | 1 | C0.5A0.5B0.5 | 1.5 | 25 |
| 对比例1 | 0 | C0.5A0.5B0.5 | 1.5 | 28 |
| 对比例2 | 1 | A4 | 4 | 28 |
| 对比例3 | 1 | B6 | 6 | 28 |
| 对比例4 | 0 | A4 | 4 | 28 |
| 对比例5 | 0 | B6 | 6 | 28 |
实验例1
金银花总提物指纹图谱的构建
(1)新鲜离体的金银花花蕾经过烘干并粉碎后，过40目药筛。称取1.0g，精密称定，滤纸包好置于广口瓶中，加入甲醇200ml置于超声波发生器中超声提取60min(温度控制在30℃左右)，倒出上清液，复加甲醇100ml继续提取至无色，将两次得到的上清液合并，旋转蒸发仪蒸干(60℃)，残渣用甲醇定容到10ml容量瓶中。摇匀后取1.5mL，于室温10000转/分钟离心10分钟，上清液过0.45μm滤膜，HPLC分析，并通过改变流动相最终优化得到圆锥铁线莲总提物的指纹图谱，最优色谱条件如下：
仪器：Waters2695高效液相色谱仪(四元泵、998光电二极管矩阵列检测器、Empower色谱工作站)；
色谱柱：WatersSymmetryC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；前置AgilentC18预柱(美国安捷伦公司)；
流动相：4％醋酸水、乙腈梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测波长：254nm；进样量：30μl；分析时间：85min；线性洗脱梯度见表2(A为4％醋酸水，B为乙腈)：
表2
| 时间(min) | 0 | 50 | 60 | 70 | 80 | 81 | 85 |
| A(％) | 90 | 80 | 65 | 5 | 5 | 90 | 90 |
| B(％) | 10 | 20 | 35 | 95 | 95 | 10 | 10 |
得到的金银花的指纹图谱见图1：峰1为chlorofenic acid，峰2为secologanicacid，峰3为secoxyloganin，峰4为secologanin，峰5为isochlorogenic acid，峰6为isochlorogenic acid，峰7为isochlorogenic acid，峰8为(E)-aldosecologanin。其中，峰1、5、6、7为咖啡酰奎尼酸类化合物，峰2、3、4、8为环烯醚萜类化合物。
实验例2
不同诱导条件下指纹图谱的变化情况：
按表1所列条件诱导结束后，实施例和对比例均在适宜的条件(温度在25℃，湿度60％)下完全避光培养。培养24h结束后，将金银花于烘箱中烘干(60℃)，粉碎，过40目药筛。按上述实验例1所述金银花总提物指纹图谱建立的方法，建立实施例和对比例的指纹图谱，并进行比对分析，结果见表3和表4。
由结果可知，在冷冻1h，C0.5A0.5B0.5紫外照射及28℃诱导条件下，金银花活性成分咖啡酰奎尼酸类化合物及环烯醚萜类化合物的含量变化最大。
表3
表4
实验例3
工业化小试实验：
(1)取新鲜离体金银花200kg；
(2)将200kg的金银花放入-20℃冷柜冷冻1h；
(3)冷冻完成后，将金银花分层放入紫外辐射柜中，在28℃条件下，C0.5A0.5B0.5紫外交替照射；
(4)照射完后，取样，按照按上述实验例1所述金银花总提物指纹图谱建立的方法，建立指纹图谱，并进行比对分析，结果见表3和表4中的实验例3。
Claims (5)
1.一种提高金银花活性成分的方法，该方法包括下述顺序的步骤：
（1）取金银花；
（2）-20℃冷冻；
（3）紫外光照射；
步骤（2）所述的-20℃冷冻的冷冻时间为0.5-2 h；
步骤（3）所述的紫外光照射的方法为依次采用波长为200-280 nm的UV-C、波长为320-400 nm的UV-A和波长为280-320 nm的UV-B进行交替照射；
步骤（3）所述的紫外照射所用的总时间为0.5-2 h。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）所述的-20℃冷冻的冷冻时间为1 h。
3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）所述的紫外光照射的方法为UV-C照射0.1-0.6 h后，UV-A照射0.2-0.7 h，再UV-B照射0.2-0.7 h。
4.如权利要求3所述的方法，其中，步骤（3）所述的紫外光照射的方法为UV-C照射0.5 h后，UV-A照射0.5 h，再UV-B照射0.5 h。
5.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中，步骤（3）所述的紫外光照射所用的温度为25-30 ℃。
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