CN104341285A

CN104341285A - 一种植物源杀螨剂的制备与应用

Info

Publication number: CN104341285A
Application number: CN201310320566.8A
Authority: CN
Inventors: 胡延春; 廖飞; 何洁; 谭辉; 武雷; 罗彪; 罗丽娟
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明涉及一种高效、低毒、环保的植物杀虫提取物，其对家兔等动物的痒螨和疥螨均有良好的杀灭作用。紫茎泽兰甲醇提取物的杀螨活性成分为：9-羰基-10,11-去氢泽兰酮（euptox A）。Euptox A药液的制备步骤为：叶粉经甲醇超声提取；乙酸乙酯萃取；进行硅胶柱层析，大孔树脂柱洗脱，再反复硅胶柱层析得到euptox A；用吐温-80助溶剂溶解，制成含euptox A不同浓度的药液。在euptox A为2mg/mL时对兔痒螨和疥螨的都有较强杀螨效果，其LT₅₀分别为1.212、0.687h，在2h内对兔痒螨和疥螨LC₅₀分别为0.902mg/mL、1.068mg/mL。

Description

一种植物源杀螨剂的制备与应用

技术领域

本发明涉及一种高效、低毒、环保型杀螨的植物提取物，尤其是涉及一种用于杀灭动物螨虫的植物毒素的制备与应用。

背景技术

动物螨病是螨虫寄生动物体表而引起的一种动物慢性体外寄生虫病，其病原为疥螨、痒螨，主要发生于秋末、冬季和初春，通过患病动物与健康动物直接或间接接触传染，广泛传播于牛、羊、马、犬、免、鸡等动物。还可感染人类，在牧区、农牧区和规模化养殖场感染率和发病率均较高。动物发生该病主要表现为食欲降低或废绝、消瘦、被毛脱落等，影响动物的生产性能和经济价值，严重制约畜牧业健康发展和经济效益。目前，用于治疗动物螨病的药物主要为化学合成和抗生素类药物，如伊维菌素、阿维菌素、林丹乳油和螨净等，此类药物在有效防治动物螨病的同时，由于药物残留和草地污染，引起了公共卫生、食品安全和生态环境等问题。从天然产物中寻找、筛选防治动物螨病的药物已成为人们广泛关注的研究热点。

发明内容

本发明为了对外来入侵植物紫茎泽兰的开发利用提供新的思路，从紫茎泽兰叶片中分离纯化一种单体化合物Euptox A，其对家兔等动物的痒螨和疥螨均具有良好杀灭作用，且效果优于临床常用杀螨药物伊维菌素，有潜力作为一种高效、低毒、环保型的杀螨新药。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于杀螨的植物提取物，其特殊之处在于：所述植物提取物为紫茎泽兰甲醇提取物。

上述紫茎泽兰甲醇提取物为乙酸乙酯部位提取物。

上述紫茎泽兰提取物的杀螨活性成分为Euptox A。

Euptox A的制备：紫茎泽兰叶粉100 g，甲醇超声提取2-3次，每次60 min，合并滤液；滤液在40℃下减压蒸干得到浸膏；用20%的甲醇溶解浸膏，并用等量乙酸乙酯萃取2-3次，合并乙酸乙酯部分在40℃下减压蒸干得到浸膏；硅胶拌样，干法上样，进行硅胶柱层析，先用二氯甲烷洗脱除去低极性杂质，继续用二氯甲烷：乙酸乙酯（98：2,v/v）洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，浸膏溶于甲醇：水：三氯甲烷（85：10：5，v/v/v）溶剂中，上XAD-2大孔树脂柱洗脱，以除去色素等杂质，减压除去洗脱剂，残渣样品进行反复硅胶柱层析得到Euptox A纯品。

Euptox A的杀螨活性试验：用吐温-80等组溶剂溶解，制成含Euptox A为不同浓度的药液。将剂量0.5、1、2、3和4 mg/mL的Euptox A药液加入24孔板中，用滤纸吸取多余液体。用挑虫针将10只螨虫依次挑人各孔中，以吐温-80为空白对照，伊维菌素为阳性对照。每一浓度设5个重复。然后将24孔板放入测试环境(25℃，相对湿度75%)培养，每隔1h用显微镜观察一次，观察4 h，记录每个时段的死亡情况。当虫体肢节长时间不动或用针刺激无反应时判定为死亡。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、高效性：我们试验中发现3、4 mg/mL浓度的Euptox A 在4 h内体外可杀死全部供试疥螨，同样在4 h内4 mg/mL浓度的Euptox A可杀死全部供试痒螨。Euptox A的这种高效性，比现有伊维菌素等大环内酷类抗生素好，目前已有系统研究和临床普遍使用的其它中药及其相关制剂，很少有能达到这种效果的。

2、低毒环保：Euptox A来源于外来入侵植物，家畜对该植物有绝食性，相对还是较安全，且多数天然植物成分在自然环境中可自行降解，不致于在动物产品中长期残留或通过食物链富集。Euptox A作为从这些植物中得到的活性天然成分，同样具有低毒、安全和环保的特点。

3、变废为宝：紫茎泽兰已成为我国外来入侵物种之首，但目前对紫茎泽兰还没有有效的防治措施，且紫茎泽兰生物储量巨大，所需成本昂贵。本发明从紫茎泽兰叶片中分离得到一种具有高效杀螨活性的成分Euptox A，为紫茎泽兰的开发利用提供新的思路和基础，可达到变废为宝的目的。

Euptox A在各种动物的多种螨病的治疗方面展现出广阔的开发利用前景。

具体实施方式

1材料与方法

1.1试验药品及材料

1.1.1供试药材

紫茎泽兰，2012年7月采集于四川省凉山州，叶子阴干，粉碎备用。

1.1.2供试螨虫

采自自然感染的家兔耳廓内。病兔耳廓内多长满血痂，靠近耳道内侧湿润，呈团块状，外部相对稍干燥，呈卷纸状，患兔瘙痒不安，用小镊子剥取耳道和脚趾内痴皮，置玻璃平皿内，平皿边缘涂少量螨虫驱避剂—硫软膏，加热37℃左右，用挑虫针挑取活力强的螨虫供试验用。根据螨虫形态，鉴定为兔痒螨（Psoroptes cuniculi）、疥螨（Sarcoptes scabiei）。

1.1.3主要仪器与试剂

旋转蒸发仪；循环水式真空泵；真空干燥箱；倒置显微镜；高效液相色谱仪；甲醇；乙酸乙酯；二氯甲烷；三氯甲烷；柱层析硅胶；薄层板；吐温-80；Euptox A（标准品）。

1.1.4 9-羰基-10，11-去氢泽兰酮药液的制备

紫茎泽兰叶粉100 g甲醇超声提取2-3次，每次60 min，合并滤液；滤液在40℃下减压蒸干得到浸膏；用20%的甲醇溶解浸膏，并用等量乙酸乙酯萃取2-3次，合并乙酸乙酯部分在40℃下减压蒸干得到浸膏；硅胶拌样，干法上样，进行硅胶柱层析，先用二氯甲烷洗脱除去低极性杂质，继续用二氯甲烷：乙酸乙酯（98：2,v/v）洗脱, 不同组分用展开剂（石油醚：丙酮为12:1）展开，在286 nm紫外光下显亮蓝色荧光，收集与标准品一致R_f的洗脱液,减压蒸干，浸膏溶于甲醇：水：三氯甲烷（85：10：5，v/v/v）溶剂中，上XAD-2大孔树脂柱洗脱，以除去色素等杂质，减压除去洗脱剂，残渣样品进行反复硅胶柱层析得到Euptox A纯品；得到的纯品用高效液相色谱法进一步鉴定和定量；用吐温-80等组溶剂溶解，制成含Euptox A为不同浓度的药液。

1.1.5 体外杀螨试验

将剂量0.5、1、2、3和4 mg/mL的Euptox A药液加入24孔板中，用滤纸吸取多余液体。用挑虫针将10只螨虫依次挑人各孔中，以吐温-80为空白对照，伊维菌素为阳性对照。每一浓度设5个重复。然后将24孔板放入测试环境( 25℃，相对湿度75%)培养，每隔1h用显微镜观察一次，观察4h，记录每个时段的死亡情况。当虫体肢节长时间不动或用针刺激无反应时判定为死亡。

1.1.6 数据分析

采用互补重对数模型(简称CLL模型)分析拟合时间一剂量效应关系，求出模型参数及半数致死时间(LT₅₀)和半数致死浓度（LC₅₀），所有数据表示为平均值±SD，用SPSS20.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 毒素提取

通过TLC和HPLC共同鉴定所提取物质为Euptox A，TLC检测在286 nm紫外光下显亮蓝色荧光，R_f值为0.62与标准品一致，HPLC下检测出峰时间相同与标准品一致，计算其纯度为96%以上。

2.2 体外杀螨试验

结果显示，Euptox A 5个不同浓度对痒螨和疥螨均有较好的杀灭作用，杀灭效果与毒素浓度大小成正相关，其中4mg/mL浓度在试验4h内杀死全部痒螨，在3、4 mg/mL浓度时4h内杀死全部疥螨，结果详见表1和表 2。

表 1 不同浓度的Euptox A 体外对痒螨的杀灭活性。

注:同列数右肩标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05 ）。

表2 不同浓度的Euptox A 体外对疥螨的杀灭活性。

注:同列数右肩标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

2.3 毒素的半数致死时间

根据2.2结果表明，Euptox A具有较强的体外杀螨作用，并对其半数致死时间测定。在浓度0.5、1、2、3和4 mg/mL 5种浓度对痒螨的半数致死时间分别为3.852、1.825、1.212、0.693、0.461 h，对疥螨的半数致死时间分别为5.311、2.124、0.687、0.526、0.326 h。半数致死时间与浓度都成负相关，在2、3、4 mg/mL时毒素对疥螨的杀灭效果比痒螨要强，详细结果见表3。Euptox A对痒螨和疥螨在不同时间段的半数致死浓度也有差异，详细结果见表4。

表3 不同浓度Euptox A杀痒螨和疥螨半数致死时间。

表4不同浓度Euptox A杀痒螨和疥螨半数致死浓度。

3 讨论

痒螨具有坚韧的角质表皮，对不利因素的抵抗力超过疥蜗和其他肉食性螨类，离开宿主以后的耐受力显得更强，在畜舍内可存活2个月，在牧场上可存活35天，而疥螨在畜舍内、墙壁上和各种器具上的存活时间不超过3周。本试验发现，2、3和4 mg/mL浓度的Euptox A 对痒螨和疥螨都有较好的杀灭效果，其中3和4 mg/mL浓度的Euptox A可在240 min时杀死全部供试疥螨，且4 mg/mL浓度的Euptox A可在240 min时杀死全部供试痒螨。说明Euptox A对动物寄生性螨虫有显著杀灭作用。此外，对人畜安全，不致在动物产品中长期残留或通过食物链富集，对土壤和水体无污染。Euptox A来源于紫茎泽兰叶片当中，且紫茎泽兰资源分布广泛。Euptox A的提取工艺较为简单，也容易合成得到。因此，Euptox A有望成为一种高效、低毒、环保的新型杀螨剂，具有广阔的开发利用前景。为紫茎泽兰的防控难题提供新的思路和理论基础。

Claims

1.杀螨活性成分：本发明植物提取物为紫茎泽兰甲醇提取物、紫茎泽兰乙酸乙酯部位提取物，紫茎泽兰甲醇提取物的杀螨活性成分为9-羰基-10,11-去氢泽兰酮。

2.药液的制备步骤为：紫茎泽兰叶粉100 g，甲醇超声提取2-3次，每次60 min，合并滤液；滤液在40℃下减压蒸干得到浸膏；用20%的甲醇溶解浸膏，并用等量乙酸乙酯萃取2-3次，合并乙酸乙酯部分在40℃下减压蒸干得到浸膏；硅胶拌样，干法上样，进行硅胶柱层析，先用二氯甲烷洗脱除去低极性杂质，继续用二氯甲烷：乙酸乙酯（98：2,v/v）洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，浸膏溶于甲醇：水：三氯甲烷（85：10：5，v/v/v）溶剂中，上XAD-2大孔树脂柱洗脱，以除去色素等杂质，减压除去洗脱剂，残渣样品进行反复硅胶柱层析得到Euptox A纯品；用吐温-80等组溶剂溶解，制成含Euptox A不同浓度的药。

3.体外杀螨效果：在Euptox A为2mg/mL时对兔痒螨和疥螨的都有较强杀螨效果，其LT₅₀分别为1.212、0.687 h，在2 h内对兔痒螨和疥螨LC₅₀分别为0.902 mg/mL、1.068 mg/mL。