CN116491526A - 二月兰的杀螨用途、防治朱砂叶螨用途及其杀螨剂 - Google Patents
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Abstract
本发明二月兰的杀螨用途、防治朱砂叶螨用途及其杀螨剂，属于植物提取物的杀螨剂技术领域。本发明首先提供二月兰的杀螨用途，并在此基础上进一步提供二月兰防治朱砂叶螨的用途。基于上述新用途，本发明还提供一种杀螨剂，包括：杀螨活性成分；杀螨活性成分包括：含有反式亚油酸和反油酸乙酯的二月兰种子粗提液的萃取物。本发明的二月兰可有效杀螨，其种子粗提液的萃取物对对朱砂叶螨具有极强的杀螨活性。
Description
技术领域
本发明属于植物提取物的杀螨剂技术领域，涉及二月兰的杀螨用途、防治朱砂叶螨用途及其杀螨剂。
背景技术
二月兰（Orychoplragmus violaceus (L.) O.E.Schulz）是十字花科诸葛菜属植物，一年生或越年生草本植物，主要分布在亚洲中部及东部，在我国分布广泛。国内外对二月兰种子已有的研究报道表明，其含有多种化合物，二月兰作为一个历史悠久的民间用药，具有抑制肿瘤、抗菌消炎、保护肝脏等生理活性。
然而，二月兰的杀螨用途尚未被报道。
发明内容
为了开发二月兰的更多有益用途，本发明提供二月兰的杀螨用途及其杀螨剂。
本发明的技术方案如下：
二月兰的杀螨用途。
所述螨为朱砂叶螨；
优选地，所述二月兰指：二月兰种子粗提液的萃取物；
优选地，所述萃取物包括：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。
所述二月兰种子粗提液指：经乙醇热回流提取法对二月兰种子提取得到的粗提液。
二月兰防治朱砂叶螨的用途。
所述二月兰指：二月兰种子粗提液的萃取物；
优选地，所述萃取物包括：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。
所述二月兰种子粗提液指：经乙醇热回流提取法对二月兰种子提取得到的粗提液。
一种杀螨剂，包括：杀螨活性成分；其特征在于，杀螨活性成分包括：含有反式亚油酸和反油酸乙酯的二月兰种子粗提液的萃取物。
所述萃取物包括：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。
所述二月兰种子粗提液指：经乙醇热回流提取法对二月兰种子提取得到的粗提液。
所述的一种杀螨剂，还包括：辅料。
本发明的有益效果如下：
本发明首次提出二月兰的杀螨用途，尤其是二月兰防治朱砂叶螨的用途。并基于该新用途提供一种含有二月兰种子萃取物的杀螨剂。本发明对二月兰种子中的化学物质进行提取、分离和鉴定，测试二月兰种子提取物对朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)的触杀活性，探究活性物质组成成分。经实验发现，二月兰种子粗提液的萃取物中含有的反式亚油酸和反油酸乙酯是主要的杀螨活性成分，其中，反式亚油酸对朱砂叶螨具有极强的杀螨活性，矫正死亡率为93.33%；其次是反油酸乙酯，矫正死亡率为71.11%。
附图说明
图1为本发明实验例1的二月兰种子醇提物各相萃取物10mg/ml对朱砂叶螨的生物活性测定（n=30）。
图2为本发明实验例1的S1各组分1mg/ml浓度条件下对朱砂叶螨的杀螨活性（24h）。
图3为本发明实验例1的组分 S1-1的GC-MS离子流图。
图4为本发明实验例1的组分 S1-1主要化合物1mg/ml浓度条件下对朱砂叶螨的生物活性测定（24 h）。
具体实施方式
下面结合具体实施例和实验例对本发明的具体内容做进一步详细描述，但并不以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源
一、本发明实验例使用的二月兰种子可商购获得。
二、本发明实验例使用的朱砂叶螨为常见的农业害螨，可采集自任何发生朱砂叶螨灾害的农田或大棚。
三、本发明实验例使用的芸豆可商购获得。
第1组实施例、本发明二月兰的杀螨用途
本组实施例提供二月兰的杀螨用途。
在具体的实施例中，所述螨为朱砂叶螨；
优选地，所述二月兰指：二月兰种子粗提液的萃取物；
优选地，所述萃取物包括：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。
在一些实施例中，所述二月兰种子粗提液指：经乙醇热回流提取法对二月兰种子提取得到的粗提液。
本领域技术人员出于本发明的教导，可以选择二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子进行杀螨，或，对二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子进行提取或萃取得到的物质进行杀螨。
任何选择二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子进行杀螨的行为，或，任何对二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子进行提取或萃取得到的物质进行杀螨的行为，或，任何选择二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子制备获得的杀螨产品的行为或使用、销售、许诺销售、进口该杀螨产品的行为，或，任何采用二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子进行提取或萃取得到的物质制备得到的杀螨产品或使用、销售、许诺销售、进口该杀螨产品的行为，均落入本发明的保护范围。
所述螨不仅限于朱砂叶螨，也可以是朱砂叶螨以外的其他螨。
第2组实施例、二月兰防治朱砂叶螨的用途
本组实施例提供二月兰防治朱砂叶螨的用途。
在具体的实施例中，所述二月兰指：二月兰种子粗提液的萃取物；
优选地，所述萃取物包括：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。
在进一步的实施例中，所述二月兰种子粗提液指：经乙醇热回流提取法对二月兰种子提取得到的粗提液。
本领域技术人员出于本发明的教导，可以选择二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子防治朱砂叶螨或朱砂叶螨以外的害螨，或，对二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子进行提取或萃取得到的物质防治朱砂叶螨或朱砂叶螨以外的害螨。
任何选择二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子防治朱砂叶螨的行为，或，任何对二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子进行提取或萃取得到的物质防治朱砂叶螨的行为，或，任何选择二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子制备获得的防治朱砂叶螨产品的行为或使用、销售、许诺销售、进口该防治朱砂叶螨产品的行为，或，任何采用二月兰植株的任意组织、部位，包括但不限于：根、茎、叶、花、果实、种子进行提取或萃取得到的物质制备得到的防治朱砂叶螨产品或使用、销售、许诺销售、进口该防治朱砂叶螨产品的行为，均落入本发明的保护范围。
第3组实施例、本发明的杀螨剂
本组实施例提供一种杀螨剂，包括：杀螨活性成分；其特征在于，杀螨活性成分包括：含有反式亚油酸和反油酸乙酯的二月兰种子粗提液的萃取物。
在具体的实施例中，所述萃取物包括：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。
在更具体的实施例中，所述二月兰种子粗提液指：经乙醇热回流提取法对二月兰种子提取得到的粗提液。
在进一步的实施例中，所述的一种杀螨剂还包括：辅料。
所述辅料为药剂学上可接受的辅料，包括但不限于：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
实验例、二月兰的杀螨实验
1 材料来源
二月兰种子，天津市农业科学院提供。将种子清洗后置于通风处进行阴干处理，密封后保存于冷藏柜里备用。
供试螨
为保证使用发育一致的成螨，采用培养皿培养：水洗后自然晾干的带柄芸豆叶（叶柄用脱脂棉包裹，滴加自来水保湿），叶面向下放置于培养皿(φ9 cm )内。将采集的健康成螨的朱砂叶螨接到叶片上，盖上培养皿盖，在温度(25±1)℃、湿度60%-65%、光周期 16h:8h(L:D)的实验室培养。24 h 后移出成螨，使用由卵发育的成螨用于生物测定。
2 试验方法
2.1 二月兰种子粗提物制备及溶剂萃取
使用乙醇热回流提取法对二月兰种子进行提取。称取5000.00g二月兰种子粉末置于锥形瓶中，以液料比1:6加入70%乙醇进行热回流提取，每次2h，重复三次。使用真空泵对提取液抽滤，收集提取液清液。将滤液以旋转蒸发仪转速 50转/分钟，水浴锅温度45℃条件下浓缩，蒸至冷凝管处无乙醇滴落时取出，合并三次浓缩后的滤液得到二月兰种子浸膏。用适量去离子水悬浮二月兰种子浸膏，配置成500ml二月兰种子粗提液，采取系统萃取法，悬液依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，待溶液分层后收集萃取液，重复 5次，合并萃取液。将使用有机溶剂萃取的溶液用旋转蒸发仪依次浓缩至干，水相使用冷冻干燥仪获得干物质。得到二月兰种种子乙醇提取物石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相物质，称重后密闭保存。
2.2 二月兰种子浸膏萃取物对朱砂叶螨雌成螨的室内触杀活性测定
取各萃取物置于锥形瓶中，加入 1%吐温-80 水溶液，将萃取物溶解配制制成1、2.5、5、10、25、50、100 mg/ml的供试药液，备用。以 1%吐温-80水溶液为空白对照。采用玻片浸渍法进行活性测定：将尺寸为2×0.5 cm的双面胶粘于载玻片（10×2cm）的一端，从新鲜的芸豆叶片上使用0号毛笔笔尖挑起健康好动、体型一致的雌成螨，在显微镜下将朱砂叶螨腹部朝上粘贴在双面胶上，确保螨足和螨虫的口器没有粘着在双面胶上，螨足可以自由活动。剔除不符合黏着要求的雌成螨，保证每个载玻片上最后有30头健康、腹部朝上的朱砂叶螨。将载玻片黏着有螨的一端浸入供试药液，确保所有朱砂叶螨完全与药液接触，5s 后取出。用吸水纸吸干朱砂叶螨四周和载玻片上多余的药液，放入温度(26±1)℃。
相对湿度(40±10)%，光照18h:6h(L:D)的人工气候箱中培养。每个处理重复3次。分别在24、48h后观察螨虫存活数量，用毛笔笔尖触动螨体，螨足不动者视为死亡。记录每组朱砂叶螨死亡数，计算死亡率、校正死亡率。如果空白对照组朱砂叶螨死亡率超过10%，则证明此次试验结果无效，需要重复整组试验。此次研究中所有空白对照的死亡率都未超过3%。
死亡率、校正死亡率的计算公式如下：
死亡率=（朱砂叶螨死亡数/供试螨总数）×100%
校正死亡率=（处理组死亡率-空白对组死亡率）/（100-空白对组死亡率）
2.3石油醚萃取物硅胶柱层析
使用100 cm×8cm玻璃层析柱，将450g活化后的硅胶粉作为固定相，采用湿法装柱，样品干法上样进行硅胶柱搭建。上样后使用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱条件依次为石油醚-乙酸乙酯(100:1 (1.0L)，20:1 (1.0L)，10:1(1.0L)，5:1(1.0L)，5:2 (1.0L)，1:1 (1.0L)，流速为1mL/min，以10ml一管为单位收集各段流分。洗脱的过程中通过薄层色谱层析法进行跟踪分析，将洗脱出的组分点样在薄层硅胶板上，以石油醚-乙酸乙酯=20:1 浓度展开，根据薄层层析硅胶板紫外分析仪下和三种显色方法下显色结果合并相同流分，将各流分减压浓缩至干，获得各组分。
根据朱砂叶螨触杀活性试验结果，对活性较高的组分，以对应的石油醚-乙酸乙酯浓度进行等度洗脱，通过薄层层析硅胶板检测，合并相同流分，减压浓缩至干，再次进行生物活性测定，确定二月兰种子醇提物石油醚萃取物杀螨活性物质所在组分。
2.3 数据统计分析
所有数据通过 3 次独立重复试验，结果以“平均值±标准误”(means±SE)表示。朱砂叶螨触杀试验的试验数据根据Abbott公式计算校正死亡率，用Tukey Test进行方差分析，利用spss18软件Probit分析并计算毒力回归方程，半数致死浓度(LC50)及95%置信区间。利用dps软件进行Duncan显著性分析。
3 结果分析
3.1各萃取物对朱砂叶螨雌成螨的室内触杀活性作用
为确定二月兰种子各相萃取物的杀螨活性，试验首先通过玻片浸渍法测定二月兰种子醇提物石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相物质在浓度为 10 mg/ml时对朱砂叶螨雌成螨的触杀活性作用（24h 和 48h）。图 1可知二月兰种子醇提物四种萃取物都具有对朱砂叶螨的触杀活性，其中二月兰种子醇提物石油醚萃取物触杀活性显著高于正丁醇萃取物和水相物质，略高于乙酸乙酯萃取物。处理 24 h 后，正丁醇萃取物和水相物质的生物活性较低，校正死亡率分别为 48.14%和22.22%，石油醚萃取相和乙酸乙酯萃取相的杀螨活性较强，24h校正死亡率分别为97.78%和85.92%。随着处理时间的增长，各萃取物对朱砂叶螨的触杀试验的矫正死亡率维持原有水平或者有所提升，水相物质的校正死亡率提升较大，提升了14.08%，其他三相萃取物的上升幅度都不超过 5%。综合以上试验结果，二月兰种子醇提物各相萃取物都具有杀螨活性，且随着处理后时间的增加，朱砂叶螨的矫正死亡率也逐步上升。其中二月兰种子醇提物石油醚萃取物的杀螨活性最为显著，二月兰种子醇提物正丁醇萃取物和水相物质的杀螨效果相对较弱。
为进一步研究确定二月兰种子醇提物各相萃取物对朱砂叶螨触杀活性能力，根据萃取物在10mg/ml对朱砂叶螨雌成螨的触杀活性将二月兰种子醇提物各相萃取相配制成5个质量浓度梯度的供试药液，采用玻片浸渍法，测定各萃取物对朱砂叶螨雌成螨的毒力，计算各萃取物的半致死浓度，结果见表1和表2。
由表1可知，石油醚萃取物对朱砂叶螨的触杀活性较为显著，在浓度为5mg/ml时24h的矫正死亡率为93.67%。由表2可知，二月兰种子醇提物各相萃取物对朱砂叶螨的半致死浓度分别为0.963mg/m1（石油醚萃取物）、5.341mg/ml（乙酸乙酯萃取物）、10.746mg/ml（正丁醇萃取物）和15.817mg/ml（水相物质）。石油醚萃取物的半致死浓度显著低于其他三项。综合二月兰种子醇提物各相萃取相对朱砂叶螨的触杀试验结果可知，二月兰种子醇提物石油醚萃取物杀螨活性最为显著。因此，之后的试验重点聚焦在石油醚萃取物的纯化以及成分组成探究上。
表1. 萃取后各相对朱砂叶螨雌成螨触杀活性(n=30)
表2. 萃取后各相对朱砂叶螨雌成螨毒力(n=30)
3.2二月兰种子提取物杀螨活性成分追踪
二月兰种子醇提物石油醚萃取物用硅胶柱色谱经过石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱共收集到36个流分。使用相同规格的薄层层析硅胶板，在相同的流动相条件下，根据薄层层析硅胶板紫外分析仪下和三种显色方法下显色结果合并相同流分，并减压浓缩至干，共获得6 个组分。各个组分加入 1%吐温-水溶液，配置成 1mg/ml 的带药溶液，用玻片法进行各组分对朱砂叶螨的触杀活性测定。各组分占比和对朱砂叶螨触杀试验结果如表 3 所示。
表3. 石油醚萃取物各组分占比及1mg/ml浓度对朱砂叶螨的触杀活性(n=30)
试验结果发现，组分S1 在二月兰种子醇提物石油醚萃取物中占比最少，仅占2.98%，但在 24h 对朱砂叶螨矫正死亡率为 100.00%，说明组分中含有杀螨活性极强的化学物质。其次是组分 S2 和组分S3，24h 的矫正死亡率为 78.89%和 58.89%，同样具有较高的杀螨活性。其他组分的杀螨活性相对较弱，各组分的矫正死亡率均低于 50%。可以初步判定二月兰种子醇提物石油醚萃取物的主要活性物质位于存在于组分 S1 之中。根据S1杀螨活性设定五个浓度梯度，进行朱砂叶螨触杀实验，分析得出S1的毒力回归方程及相关系数（表4）。
表4. 组分S1对朱砂叶螨雌成螨毒力
S1 用石油醚:乙酸乙酯=20:1 的洗脱液进行等度洗脱，获得的各流分根据薄层层析硅胶板紫外分析仪下和三种显色方法下显色结果合并相同流分，经旋转蒸发仪蒸干溶剂，共获得 4 个流分，命名为 S1-1，S1-2，S1-3，S1-4。S1-1 在 1mg/ml 对朱砂叶螨的矫正死亡率为 98.89%，其他三个组分的矫正死亡率分别为60.00%、62.22%、28.89%（图2），虽然S1-1的矫正死亡率低于S1，但S1-1的杀螨活性显著高于其他组分，因此确定S1中的主要活性组分为S1-1。根据S1杀螨活性设定五个浓度梯度，进行朱砂叶螨触杀实验，分析得出S1的毒力回归方程及相关系数（表5）。
表5. 组分S1-1对朱砂叶螨雌成螨毒力
3.3 GC-MS检测二月兰种子杀螨成分组成结果
使用GC-MS对二月兰种子杀螨活性组分S1-1进行化学成分分析鉴定，结果如图3所示，分析图以时间为横坐标，纵坐标为总离子流，将所得数据与标准谱库检索质谱图中各色谱峰进行比对。从二月兰种子杀螨活性组分S1-1中共鉴定出5种主要化学成分，这些活性物质总锋面积占所有峰面积的93.68%。由表6 可知二月兰种子杀螨活性组分S1-1的化学组分主要为酯类化合物，其中峰面积占比最高的物质为反式亚油酸，占总峰面积的45.56%；其次是反油酸乙酯(21.32%)、棕榈酸乙酯(12.22%)、正十七烷酸乙酯(8.34%)、邻苯二甲酸二丁酯(6.24%)。
表6. 二月兰种子杀螨成分GC-MS化学成分分析
3.4 二月兰种子活性组分主要化合物杀螨活性
根据对二月兰种子杀螨活性组分S1-1进行主要化合物的分析与鉴定结果显示的5种主要成分，从市面上购买这5种主要化合物的标准品，配制药液对朱砂叶螨进行触杀试验，进行活性测定，试验结果见图4。
试验结果显示，相较于空白对照组，所有单体化合物都具有明显的杀螨活性。在1mg/ml 的浓度下，反式亚油酸具有极强的杀螨活性，矫正死亡率为93.33%；其次是反油酸乙酯，矫正死亡率为 71.11%。虽然购买的反式亚油酸标准品对朱砂叶螨的触杀活性比二月兰种子活性组分 S1-1略低，但反式亚油酸的杀螨活性要远高于组分中其他化合物，因此可以判定反式亚油酸是二月兰种子提取物中的主要活性化合物。
根据反式亚油酸杀螨活性，配置五个梯度浓度的药液对朱砂叶螨的进行触杀实验，所得数据进行统计及分析，结果如表7所示。
表7. 反式亚油酸对朱砂叶螨雌成螨毒力
。
Claims (10)
1.二月兰的杀螨用途。
2.根据权利要求1所述的二月兰的杀螨用途，其特征在于，所述螨为朱砂叶螨；
和/或，所述二月兰指：二月兰种子粗提液的萃取物；
和/或，所述萃取物包括：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。
3.根据权利要求2所述的二月兰的杀螨用途，其特征在于，所述二月兰种子粗提液指：经乙醇热回流提取法对二月兰种子提取得到的粗提液。
4.二月兰防治朱砂叶螨的用途。
5.根据权利要求4所述的二月兰防治朱砂叶螨的用途，其特征在于，所述二月兰指：二月兰种子粗提液的萃取物；
和/或，所述萃取物包括：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。
6.根据权利要求4或5所述的二月兰防治朱砂叶螨的用途，其特征在于，所述二月兰种子粗提液指：经乙醇热回流提取法对二月兰种子提取得到的粗提液。
7.一种杀螨剂，包括：杀螨活性成分；其特征在于，杀螨活性成分包括：含有反式亚油酸和反油酸乙酯的二月兰种子粗提液的萃取物。
8.根据权利要求7所述的一种杀螨剂，其特征在于，所述萃取物包括：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。
9.根据权利要求7所述的一种杀螨剂，其特征在于，所述二月兰种子粗提液指：经乙醇热回流提取法对二月兰种子提取得到的粗提液。
10.根据权利要求7-9任一所述的一种杀螨剂，其特征在于，还包括：辅料。
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