CN104666585A - 地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用 - Google Patents
地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，可有效解决糖尿病患者的治疗用药问题，方法是，将地黄叶每次加地黄叶重量10-12倍的水提取2次，每次1-1.5h，合并两次提取液，减压浓缩至55℃相当于含生药0.5-2g/ml的浓缩液，浓缩液加入质量浓度为95%的乙醇使其醇浓度达到60-80%，4℃静置24h，取上清液，上清液减压浓缩至55℃相当于含生药1-4.5mg/ml的浓缩液，再用H103树脂柱分离纯化，然后用质量浓度10-20%的乙醇作洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，即得，本发明原料丰富，制备方法简单，易操作，稳定可靠，可通过工业化生产制得任意量的地黄叶提取物，可有效利用地黄叶提取物制备降血糖类的药物，实现地黄叶的综合开发和废物利用，开拓了制备降糖药物的新途径。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用。
背景技术
地黄叶为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的叶，首次载于《食疗本草》：“（地黄）叶可以羹”，后收入1988年版《北京市中药材标准》：“地黄叶苦、寒，归心、肝、肾经，清热，活血，益气养阴，补肾，用于少气乏力，面色无华，口干咽燥，气阴两虚证，外用于恶疮，手足癣”。地黄叶与块根是同株植物不同的营养器官，且现代研究表明地黄叶具有多种化学成分，又研究报道提取地黄叶总苷制备成为胶囊临床用于治疗肾炎，但至今未见关于地黄叶降血糖作用的研究报道。传统用药时，地黄仅地下块根经不同炮制而入药，地上部分基本全部舍弃，在资源日益紧张的今天，无疑是一种极大的浪费，有必要对地黄叶进行综合开发利用。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，可有效解决糖尿病患者的治疗用药问题。
本发明解决的技术方案是，地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，该地黄叶提取物是，将地黄叶每次加地黄叶重量10-12倍的水提取2次，每次1-1.5h，合并两次提取液，减压浓缩至55℃相当于含生药0.5-2g/ml的浓缩液，浓缩液加入质量浓度为95%的乙醇使其醇浓度达到60-80%，4℃静置24h，取上清液，上清液减压浓缩至55℃相当于含生药1-4.5mg/ml的浓缩液，再采用H103树脂柱分离纯化，上样量为2-7个柱体积，上样时间2-4h，然后用质量浓度10-20%的乙醇作洗脱剂对树脂柱进行洗脱，洗脱剂用量为2-15个柱体积，洗脱流速为0.4-0.5ml/min，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得干燥物，即地黄叶提取物，可用于制备降血糖类药物。
该地黄叶提取物作为唯一的活性部位用于制备降血糖类的药物，实现地黄叶提取物唯一活性部位在制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明原料丰富，制备方法简单，易操作，稳定可靠，采用本发明方法将地黄叶水提醇沉后，用H103树脂分离纯化，可以通过工业化生产制得任意量的地黄叶提取物，可有效利用地黄叶提取物制备降血糖类的药物，实现地黄叶的综合开发和废物利用，开拓了制备降糖药物的新途径，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1本发明对给药后糖尿病小鼠体重、摄食量、饮水量的影响图。
图2本发明对糖尿病小鼠体重的影响图。
图3本发明对糖尿病小鼠日均摄食量的影响图。
图4本发明对糖尿病小鼠日均饮水量的影响图。
图5本发明对糖尿病小鼠空腹血糖(mmol/L)的影响图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例实现。
实施例1
一种地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，该地黄叶提取物是，取地黄叶500g，洗去泥沙，切宽丝，置40℃以下通风干燥，置于提取设备（如提取罐）内，每次加地黄叶10倍重量的水回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液（即提取液），滤液置入旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE52-99）内，减压至-0.1MPa，55℃浓缩至为相当于含生药量1g/ml的浓缩液，加入质量浓度95%的乙醇使其醇浓度达到70%，4℃静置24h，取上清液，减压浓缩，上清液减压浓缩至55℃相当于含生药1mg/ml的浓缩液，再采用H103树脂分离纯化，上样体积为2个柱体积，上样时间为4h，然后用质量浓度10%的乙醇作洗脱剂对树脂柱进行洗脱，洗脱剂用量为8个柱体积，洗脱流速为0.5ml/min，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得干燥物，即地黄叶提取物。
实施例2：
一种地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，该地黄叶提取物是，取地黄叶500g，洗去泥沙，切宽丝，置40℃以下通风干燥，置于提取设备内，每次加地黄叶12倍重量的水回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，滤液置入旋转蒸发器内，减压至-0.1MPa，55℃浓缩至为相当于含生药量2g/ml的浓缩液，加入质量浓度95%的乙醇使其醇浓度达到80%，4℃静置24h沉淀，取上清液，减压浓缩，上清液减压浓缩至55℃相当于含生药2.5mg/ml的浓缩液，再采用H103树脂分离纯化，上样体积为6个柱体积，上样时间为2h，然后用质量浓度20%的乙醇作洗脱剂对树脂柱进行洗脱，洗脱剂用量为10个柱体积，洗脱流速为0.8ml/min，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得干燥物，即地黄叶提取物。
实施例3：
一种地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，该地黄叶提取物是，取地黄叶500g，洗去泥沙，切宽丝，置40℃以下通风干燥，置于提取设备内，每次加地黄叶11倍重量的水回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并滤液，滤液置入旋转蒸发器内，减压至-0.1MPa，55℃浓缩至为相当于含生药量0.5g/ml的浓缩液，加入质量浓度95%的乙醇使其醇浓度达到60%，4℃静置24h，取上清液，减压浓缩，上清液减压浓缩至55℃相当于含生药4.5mg/ml的浓缩液，再采用H103树脂分离纯化，上样体积为7个柱体积，上样时间为3h，然后用质量浓度15%的乙醇作洗脱剂对树脂柱进行洗脱，洗脱剂用量为15个柱体积，洗脱流速为0.4ml/min，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得干燥物，即地黄叶提取物。
实验研究
上述给出的实施例仅是用于说明本发明的具体实施方式，并不是用于本发明的保护范围，采用本发明方法可以通过工业化生产，制得任意量的地黄叶提取物该地黄叶提取物经反复试验，具有降糖之功效，有效用于制备降血糖类药物，实现地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，并经反复试验，均取得了相同或相近似的效果，有关试验资料如下：
1 实验材料
1.1 动物 KM雄性小鼠，SPF级，体重18-20g，由郑州大学医学院动物实验中心提供，动物许可证号SCXK（豫）2010-0002，合格证号41003100000829。
1.2 仪器 BMG型多功能酶标仪（江苏万科科教仪器有限公司）；BS 210S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；DZKW-4电子恒温不锈钢水浴锅（上海东星建材试验设备有限公司）；
1.3试剂 盐酸二甲双胍片(天津中新药业集团股份有限公司，批号：P3813021)；葡萄糖试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号：143231）；四氧嘧啶（Sigma，美国）；生理盐水（河南双鹤华利药业有限公司，批号:13103107B）
1.4 药材 地黄叶药材购自焦作温县宛西制药地黄种植基地，经河南中医学院董诚明教授鉴定为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的叶。桑叶（批号120501）购自郑州瑞龙制药股份有限公司，经河南中医学院董诚明教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶。
1.5 灌胃药液的制备
1.5.1 地黄叶提取物 地黄叶水提醇沉后，用H103树脂分离纯化所得的地黄叶提取物，加蒸馏水调节含药量为0.6g·mL-1，冷藏保存备用。
1.5.2 桑叶醇提 取桑叶，80℃水浴回流提取3次，每次1.5h，每次加20倍70%乙醇，纱布过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水调节含药量为0.6g·mL-1，冷藏保存备用。
1.5.3 地黄叶/桑叶1：1 每次灌胃前取1.5.1项下的地黄叶提取液及1.5.2项下的桑叶醇提液等量，混合均匀，备用。
1.5.4阳性药：取盐酸二甲双胍片，碾碎，用蒸馏水溶解，调浓度为20mg·mL-1，冷藏保存备用。
2方法
2.1糖尿病小鼠模型的建立
KM雄性小鼠适应性饲养7天，禁食不禁水16h后，以1mL/100g体重的剂量腹腔注射新鲜配制的四氧嘧啶生理盐水溶液(23mg/ml)，正常对照组注射等剂量的生理盐水。恢复饮食。腹腔注射之后24h内以5%葡萄糖饮水，以防止四氧嘧啶引起低血糖导致小鼠死亡，24h之后改为饮用自来水。72h后断尾取血，按葡萄糖试剂盒说明测空腹（取血前禁食不禁水16h）血糖值。血糖值大于11.1mmol/L的为成模标准。
2.2分组与给药
选择50只造模成功小鼠，以空腹血糖值为依据，按血糖平均原则分为5组，即模型对照组、地黄叶组、桑叶组、地黄叶桑叶1：1组和阳性对照组，每组10只。各组分别灌胃相应的药物，剂量均为1mL·100g-1，正常对照组、模型对照组大鼠灌胃等剂量的生理盐水，连续给药10天，每2天称体重1次，根据体重调整用药量。实验期间，每天早上定时灌胃1次，小鼠自由进水进食，每24h更换一次垫料。
2.3指标检测
2.3.1 观察小鼠的行为表现：精神状态，毛发，摄食，饮水，大、小便等。
2.3.2 记录体重、摄食量及饮水量 记录实验期间各组小鼠的体重、摄食量及饮水量的变化。
2.3.3 测给药前后血糖值 分别于给药前及给药10天后，小鼠禁食不禁水16h，剪尾取血，离心分离血清，用葡萄糖试剂盒测空腹血糖值。比较各组动物的空腹血糖值。
2.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计分析软件。数值变量采用均数±标准差（ ±s）进行统计描述，多组间比较采用One-way ANOVA方差分析，两两比较采用LSD法。P值小于或等于0.05被认为所检验数据间的差别有统计意义。
3．结果
3.1小鼠的行为表现
造模后小鼠精神萎靡、毛色杂乱、毛发易脱落、行动迟缓，饮食、饮水量增多，垫料潮湿，出现糖尿病患者的典型症状。相比于模型对照组，正常组小鼠皮毛光滑，行为未见异常，垫料干燥，地黄叶组和阳性对照组的小鼠有明显的改善，糖尿病症状均得到减轻，精神状态良好，体毛光洁，行动力正常。
3.2 对糖尿病小鼠体重、摄食量及饮水量的影响
造模结束，与正常对照组相比，模型对照组、地黄叶组、桑叶组、地黄叶桑叶1：1组和阳性对照组的小鼠平均体重极显著（P<0.01）减少，饮水量和饮食量均极显著（P<0.01）增加，符合糖尿病小鼠的典型症状；灌胃药物后，与模型组相比，各给药组的体重逐渐增加，饮水量和摄食量逐渐减少，说明各灌胃药物均能不同程度地改善糖尿病小鼠“多饮、多食、体重减轻”的症状，且地黄叶单用组的改善效果比桑叶单用改善效果好，二者合用不如分开单用效果佳。表1、图1显示各组对给药后糖尿病小鼠体重、摄食量、饮水量的影响；图2和图3、图4显示灌胃期间小鼠体重、饮水量和摄食量的连续变化。
表1 对给药后糖尿病小鼠体重、摄食量、饮水量的影响（
±s，n=10）
| 组别 | n | 体重/g | 饮水量/mL/只 | 摄食量/g/只 |
| 正常对照组 | 10 | 29.29±0.26 | 5.45±0.98 | 5.92±0. 8 |
| 模型对照组 | 10 | 21.41±1.392） | 15.56±2.142） | 17.28±1.952） |
| 阳性对照组 | 10 | 27.56±0.184）5） | 7.34±0.654）5） | 7.44±0.894） |
| 地黄叶组 | 10 | 25.52±1.304） | 9.3±1.244） | 8.40±1.914） |
| 桑叶组 | 10 | 24.52±1.554） | 10.01±0.784） | 10.31±1.874） |
| 1:1组 | 10 | 22.39±1.516） | 10.56±1.744） | 12.31±2.004）6） |
注：与正常对照组比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型对照组比较：3）P＜0.05，4）P＜0.01；与地黄叶组比较：5）P＜0.05，6）P＜0.01
3.3 对给药前后糖尿病小鼠空腹血糖的影响
腹腔注射四氧嘧啶后，可以极显著（P<0.01）增加正常小鼠空腹血糖浓度，并且超过11.1mmol/L，各给药组之间无显著性差异（P＞0.05），且实验期间模型对照组小鼠血糖一直保持较高水平，未出现自行降低，表明糖尿病小鼠模型造模成功。各组灌胃相应药物后，糖尿病小鼠的血糖值有不同程度的下降。地黄叶组的降糖效果优于桑叶组，差异具有显著性差异（P＜0.05），地黄叶组与阳性组降糖效果类似，无显著性差异（P＞0.05）。地黄叶与桑叶合用的降糖效果不如分开单用好。表2、图5显示各组给药前后糖尿病小鼠空腹血糖值的变化。
表2 对糖尿病小鼠空腹血糖(mmol/L)的影响（
±s）
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | 给药前血糖/mmol·L-1 | 给药后血糖/mmol·L-1 |
| 正常组对照组 | 6 | 4.57±0.18 | 4.61±0.45 |
| 模型对照组 | 6 | 19.65±0.982） | 19.72±0.802） |
| 阳性对照组 | 0.2 | 20.20±0.882） | 12.57±0.734） |
| 地黄叶组 | 6 | 20.10±0.962） | 13.07±1.324） |
| 桑叶组 | 6 | 19.92±0.702） | 14.00±1.124）5） |
| 1︰1组 | 6 | 20.04±0.832） | 18.54±1.083）6） |
注：与正常对照组比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型对照组比较：3）P＜0.05，4）P＜0.01；与地黄叶组比较：5）P＜0.05，6）P＜0.01
4 临床实验
本发明提取物，经临床对高血糖患者和糖尿病患者58人，其中包括糖尿病患者20人，服用本发明地黄叶提取物，每天2次，每次1.5-3g，早晚各一次，30天后，经统计，108人中除糖尿病患者1人未见有明显效果外，其他107人的血糖均有不同程度的降低，糖尿病症状得到有效改善，有效率高达99%以上，而且未发现有不良反应，表明用药安全。
5结论
5.1糖尿病是一种因胰岛素分泌作用缺陷引起的临床综合症，多伴有并发症，特点是慢性高血糖和代谢紊乱，临床上表现为多饮、多食、多尿和体重减轻的“三多一少”等症状。糖尿病及其并发症的病因、发病机理目前尚未完全阐明，因此建立较理想的动物模型研究该病的发病机制和治疗具有重要意义。用不同的化学物质，所导致的糖尿病动物模型的致病机理不同。四氧嘧啶是胰岛细胞的化学损伤剂，其致糖尿病的机制是选择性地损坏正常小鼠的胰岛β细胞，使机体内胰岛素分泌不足，从而使血糖持续稳定升高而导致糖尿病，这是由于四氧嘧啶化学性质极不稳定，易与SH基(主要是半胱氨酸)发生反应，而胰岛的β细胞SH基含量较其他组织多，故四氧嘧啶只选择性地损害胰岛的β细胞。四氧嘧啶在使用剂量上报道相差较大，故本实验在传统的造模方法基础上进行了腹腔注射计量的考察，比较了250mg/kg，230mg/kg，200mg/kg三个计量，结果表明230mg/kg的腹腔注射计量较好，模型小鼠血糖较高，死亡率低。
5.2 《中药大辞典》中记载桑叶的药理作用为“以四氧嘧啶性糖尿病大鼠的空腹血糖、肾上腺素高血糖的测定作指标，桑叶有抗糖尿病作用”。桑叶中黄酮类成分具有降血糖、抗氧化、降血脂和抑制动脉粥样硬化等多种药理作用。本实验以总黄酮为指标优选的桑叶提取工艺，其醇提液中总黄酮含量在2.2%以上。由实验结果可知,灌胃后，地黄叶组的血糖值低于桑叶组，差异具有显著性（P＜0.05）从而进一步印证了地黄叶显著的降血糖作用。地黄叶与桑叶合用的降糖效果不如分开单用好，可能与二者都为苦、寒之性有关。
由上述资料充分证明地黄叶提取物具有明显的降血糖作用，且能改善糖尿病小鼠多饮、多食、多尿、体重减轻“三多一少”的典型症状，故可有效用于制备治疗糖尿病的药物，是中药地黄叶在用途上的创新。
Claims (5)
1.一种地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，其特征在于，该地黄叶提取物是，将地黄叶每次加地黄叶重量10-12倍的水提取2次，每次1-1.5h，合并两次提取液，减压浓缩至55℃相当于含生药0.5-2g/ml的浓缩液，浓缩液加入质量浓度为95%的乙醇使其醇浓度达到60-80%，4℃静置24h，取上清液，上清液减压浓缩至55℃相当于含生药1-4.5mg/ml的浓缩液，再采用H103树脂柱分离纯化，上样量为2-7个柱体积，上样时间2-4h，，然后用质量浓度10-20%的乙醇作洗脱剂对树脂柱进行洗脱，洗脱剂用量为2-15个柱体积，洗脱流速为0.4-0.5ml/min，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得干燥物，即地黄叶提取物。
2.根据权利要求1所述的地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，其特征在于，该地黄叶提取物是，取地黄叶500g，洗去泥沙，切宽丝，置40℃以下通风干燥，置于提取设备内，每次加地黄叶10倍重量的水回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，滤液置入旋转蒸发器内，减压至-0.1MPa，55℃浓缩至为相当于含生药量1g/ml的浓缩液，加入质量浓度95%的乙醇使其醇浓度达到70%，4℃静置24h，取上清液，减压浓缩，上清液减压浓缩至55℃相当于含生药1mg/ml的浓缩液，再采用H103树脂分离纯化，上样体积为2个柱体积，上样时间为4h，然后用质量浓度10%的乙醇作洗脱剂对树脂柱进行洗脱，洗脱剂用量为8个柱体积，洗脱流速为0.5ml/min，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得干燥物，即地黄叶提取物。
3.根据权利要求1所述的地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，其特征在于，该地黄叶提取物是，取地黄叶500g，洗去泥沙，切宽丝，置40℃以下通风干燥，置于提取设备内，每次加地黄叶12倍重量的水回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，滤液置入旋转蒸发器内，减压至-0.1MPa，55℃浓缩至为相当于含生药量2g/ml的浓缩液，加入质量浓度95%的乙醇使其醇浓度达到80%，4℃静置24h沉淀，取上清液，减压浓缩，上清液减压浓缩至55℃相当于含生药2.5mg/ml的浓缩液，再采用H103树脂分离纯化，上样体积为6个柱体积，上样时间为2h，然后用质量浓度20%的乙醇作洗脱剂对树脂柱进行洗脱，洗脱剂用量为10个柱体积，洗脱流速为0.8ml/min，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得干燥物，即地黄叶提取物。
4.根据权利要求1所述的地黄叶提取物在制备降血糖类药物中的应用，其特征在于，该地黄叶提取物是，取地黄叶500g，洗去泥沙，切宽丝，置40℃以下通风干燥，置于提取设备内，每次加地黄叶11倍重量的水回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并滤液，滤液置入旋转蒸发器内，减压至-0.1MPa，55℃浓缩至为相当于含生药量0.5g/ml的浓缩液，加入质量浓度95%的乙醇使其醇浓度达到60%，4℃静置24h，取上清液，减压浓缩，上清液减压浓缩至55℃相当于含生药4.5mg/ml的浓缩液，再采用H103树脂分离纯化，上样体积为7个柱体积，上样时间为3h，然后用质量浓度15%的乙醇作洗脱剂对树脂柱进行洗脱，洗脱剂用量为15个柱体积，洗脱流速为0.4ml/min，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得干燥物，即地黄叶提取物。
5.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的地黄叶提取物作为唯一活性部位在制备降糖药物中的应用。
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