TWI656879B - 用於治療或減緩自體免疫疾病及／或其併發症及／或腎炎的醫藥組成物以及其有效成分之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物，包括：一有效量之芸香科(Rutaceae)植物的萃取物為治療或減緩該自體免疫疾病及/或腎炎的有效成分，其中該自體免疫疾病係擇自於由紅斑性狼瘡(lupus erythematosus)、乾癬(psoriasis)、乾癬性關節炎(psoriatic arthritis)、僵直性脊髓炎(ankylosing spondylitis)、類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis)、幼年型自發性多關節炎(juvenile idiopathic arthritis)、克隆氏症(Crohn's disease)與潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)所組成之群組。

Description

用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/ 或腎炎的醫藥組成物以及其有效成分之用途
本發明係關於一種用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物以及其有效成分之用途。
自體免疫疾病，是一種人體內自己的免疫系統攻擊自己身體正常細胞的疾病。於自體免疫患者中，免疫系統會產生出對抗自己身體內正常細胞(甚至細胞內的各種正常組成部份)的抗體，造成不正常的過度發炎反應或是組織傷害，進而影響身體健康。
而自體免疫性疾病，如紅斑性狼瘡(lupus erythematosus)通常影響多重器官，包括腦、肺與腎臟。造成紅斑性狼瘡的確切病因不明，可能與遺傳、賀爾蒙、環境與感染有關。儘管紅斑性狼瘡的死亡率在1950年代之後已經逐漸降低，然而，患者仍受病症反覆發作之苦。
因此，目前仍亟需開發一種更有效之針對如紅斑性狼瘡等的自體免疫疾病治療藥物。
本發明提供一種用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物，包括：一有效量之芸香科(Rutaceae)植物的萃取物為治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的有效成分，其中該自體免疫疾病係擇自於由紅斑性狼瘡(lupus erythematosus)、乾癬(psoriasis)、乾癬性關節炎(psoriatic arthritis)、僵直性脊髓炎(ankylosing spondylitis)、類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis)、幼年型自發性多關節炎(juvenile idiopathic arthritis)、克隆氏症(Crohn's disease)與潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)所組成之群組。
本發明也提供一種芸香科植物的萃取物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中該自體免疫疾病係擇自於由紅斑性狼瘡、乾癬、乾癬性關節炎、僵直性脊髓炎、類風溼性關節炎、幼年型自發性多關節炎、克隆氏症與潰瘍性結腸炎所組成之群組。
本發明還提供另一種用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物，包括：一有效量之化合物，為治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的有效成分，其中該化合物擇自由下列所組成之群組的至少一個： (a)具有式(I)之化合物： (b)具有式(II)之化合物：；以及(c)具有式(III)之化合物： 其中R1為C1-C5烷基、、、或 、R2為H或C1-C3烷基、R3為H或C1-C3烷基、R4為H或C1-C3烷基，而R5為H或C1-C3烷基。
本發明另提供一種化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中該化合物係擇自由下列所組成之群組的至少一個：(a)具有式(I)之化合物： (b)具有式(II)之化合物：；以及(c)具有式(III)之化合物： 其中R1為C1-C5烷基、、、或 、R2為H或C1-C3烷基、R3為H或C1-C3烷基、R4為H或C1-C3烷基，而R5為H或C1-C3烷基。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能 更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
第1A圖顯示，黃皮(Clausena lansium)之乙醇萃取物HE-07對於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中之發炎因子TNF-α產生的影響。
第1B圖顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07對於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中之發炎因子IL-6產生的影響。
第2A圖顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07對於NZBWF1/J小鼠之尿液中的蛋白質含量的影響。
第2B圖顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07對於NZBWF1/J小鼠之血清中尿素氮含量的影響。
第2C圖顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07對於NZBWF1/J小鼠之血清中肌酸酐含量的影響。
第2D圖顯示，經載劑、黃皮之乙醇萃取物HE-07與環磷醯胺(cyclophosphamide,CTX)處理之NZBWF1/J小鼠之腎臟組織病理染色結果。
第2E圖顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07對於NZBWF1/J小鼠之腎臟發炎、腎小管病變與腎絲球炎的影響。
第2F圖顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07對於NZBWF1/J小鼠之存活率的影響。以Kaplan-Meier法及GraphPad Prism 6軟體進行存 活率分析，各組均與載劑組進行比較，結果顯示300mg/kg HE-07組與載劑組有顯著差異(p<0.05)，50mg/kg CTX組與載劑組亦有顯著差異(p<0.01)。
第3A圖顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07對於馬兜鈴酸誘發腎炎之小鼠之體重變化的影響。
第3B圖顯示，經載劑、黃皮之乙醇萃取物HE-07與未經處理之小鼠於馬兜鈴酸投予後第12天的體重變化。相較於載劑處理組具顯著差異：*p<0.05。
第4A圖顯示，經載劑、黃皮之乙醇萃取物HE-07與未經處理之小鼠於馬兜鈴酸投予後第7天的血清中尿素氮(BUN)含量。相較於載劑處理組具顯著差異：*p<0.05；**p<0.01。
第4B圖顯示，經載劑、黃皮之乙醇萃取物HE-07與未經處理之小鼠於馬兜鈴酸投予後第12天的血清中尿素氮(BUN)含量。相較於載劑處理組具顯著差異：*p<0.05。
第5A圖顯示，經載劑、黃皮之乙醇萃取物HE-07與未經處理之小鼠於馬兜鈴酸投予後第7天的血清中肌酸酐(CRE)含量。相較於載劑處理組具顯著差異：**p<0.01。
第5B圖顯示，經載劑、黃皮之乙醇萃取物HE-07與未經處理之小鼠於馬兜鈴酸投予後第12天的血清中肌酸酐(CRE)含量。相較於載劑處理組具顯著差異：**p<0.01；***p<0.001。
第6圖顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X中之6個化合物的結構。
第7A圖顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X在脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中對於發炎因子TNF-α產生的影響。
第7B圖顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X在脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中對於發炎因子MCP-1產生的影響。
第8A圖顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X在紅斑性狼瘡動物模式中對於小鼠體重的影響。
第8B圖顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X在紅斑性狼瘡動物模式中對於小鼠存活率的影響。以Kaplan-Meier法及GraphPad Prism 6軟體進行存活率分析，各組均與載劑組進行比較，結果顯示300mg/kg HE-07-X組與50mg/kg CTX組均與載劑組有顯著差異(p<0.01)。
第9A圖顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X在紅斑性狼瘡動物模式中對於小鼠之腎臟發炎的影響。卡方檢定(Chi square Test)，*p<0.05(相較於載劑處理)。
第9B圖顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X在紅斑性狼瘡動物模式中對於小鼠之腎小管病變的影響。卡方檢定，*p<0.05(相較於載劑處理)。
第9C圖顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X在紅斑性狼瘡動物模式中對於小鼠之腎絲球炎的影響。卡方檢定，*p<0.05(相較於載劑處理)。
第10A與10B圖顯示，於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X中之化合物F4m、F5m、F3m 與F6m對於發炎因子TNF-α產生的影響。n=5，結果顯示為平均值±標準差：學生t檢驗(Student’s t-test)，**p<0.01；***p<0.001(相較於載劑處理)。
第11A與11B圖顯示，於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X中之化合物F4m、F5m、F3m與F6m對於發炎因子IL-6產生的影響。n=5，結果顯示為平均值±標準差：學生t檢驗，*p<0.05；**p<0.01(相較於載劑處理)。
第12A與12B圖顯示，於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X中之化合物F4m、F5m、F3m與F6m對於發炎因子MCP-1產生的影響。n=5，結果顯示為平均值±標準差：學生t檢驗，**p<0.01；***p<0.001(相較於載劑處理)。
第13圖顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X中之HE-07-Fr4(其中含有大於80%之化合物F4m)在紅斑性狼瘡動物模式中對於小鼠存活率的影響。以Kaplan-Meier法及GraphPad Prism 6軟體進行存活率分析，各組均與載劑組進行比較，結果顯示50mg/kg HE-07-Fr4組與載劑組有顯著差異(p<0.05)，50mg/kg CTX組與載劑組亦有顯著差異(p<0.01)。
本發明提供一種用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物，其可抑制IL-17產生及抑制發炎等，並具有治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的效果。上述自體免疫疾病的例子，可包括，但不限於紅斑性狼 瘡(lupus erythematosus)、乾癬(psoriasis)、乾癬性關節炎(psoriatic arthritis)、僵直性脊髓炎(ankylosing spondylitis)、類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis)、幼年型自發性多關節炎(juvenile idiopathic arthritis)、克隆氏症(Crohn's disease)與潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)等。
上述本發明之用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物，可包括，但不限於一有效量之芸香科植物的萃取物，其中芸香科植物的萃取物為自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的有效成分。在一實施例中，本發明之用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物，可更包括一藥學上可接受之載體或鹽類。
於上述本發明之醫藥組成物中，上述芸香科植物可包括黃皮屬(Clausena)植物、月橘屬(Murraya)植物或柑橘屬(Citrus)植物，但不限於此。又，上述黃皮屬植物的例子可包括，但不限於黃皮(Clausena lansium)、過山香(Clausena excavata Burm.f.)等。上述月橘屬植物的例子，可包括，但不限於山黃皮(Murraya euchrestifolia)、七里香(Murraya paniculata)等。上述柑橘屬植物的例子則可包括，但不限於柚(Citrus grandis)、桶柑(Citrus tankan)等。
於上述本發明之醫藥組成物中，上述芸香科植物的萃取物可以一醇類(例如，甲醇、乙醇或丙醇)、一酯類(例如，乙酸乙酯)、一烷類(例如，己烷)或一鹵烷(例如，氯甲烷、氯乙烷)萃取而得，但並不以此為限。在一實施例中，上述芸香科植物的萃取物可以乙醇萃取而得。
在一實施例中，上述本發明之醫藥組成物中，上述芸香科植物的萃取物為黃皮之乙醇萃取物。於此實施例中，黃皮之乙醇萃取物之指標成分可包括O-甲基獨活屬醇(O-methylheraclenol)、栓翅芹內酯(prangenin)、ζ-黃皮醯胺(ζ-clausenamide)、歐前胡素(imperatorin)、8-牛兒醇基補骨脂素(8-geranyloxypsoralen)與印度黃皮唑鹼(indizoline)，但不限於此。又，於此實施例中，於黃皮之乙醇萃取物中對於自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎有治療或減緩功效的活性成分，可包括，栓翅芹內酯、ζ-黃皮醯胺、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素、印度黃皮唑鹼或其任意之組合，但不限於此。
在上述芸香科植物的萃取物為黃皮之乙醇萃取物的實施例中，本發明之醫藥組成物可用於治療或減緩紅斑性狼瘡。而上述紅斑性狼瘡可為全身性紅斑性狼瘡。又於此實施例中，本發明之醫藥組成物可用於治療或減緩紅斑性狼瘡的併發症，例如狼瘡腎炎。再者，於此實施例中，本發明之醫藥組成物也可用於治療或減緩一般腎炎。
本發明也提供一種以化合物為主要有效成分之用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物。
上述本發明之用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物，可包括，但不限於，一有效量之化合物，其為治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的有效成分，其中上述化合物係可擇自下列化合物之至少一個：(a)具有式(I)之化合物： (b)具有式(II)之化合物：；與(c)具有式(III)之化合物： 其中R1為C1-C5烷基、、、或、R2為H或C1-C3烷基、R3為H或C1-C3烷基、R4為H或C1-C3烷基，而R5為H或C1-C3烷基。
又，上述自體免疫疾病的例子，可包括紅斑性狼瘡、 乾癬、乾癬性關節炎、僵直性脊髓炎、類風溼性關節炎、幼年型自發性多關節炎、克隆氏症與潰瘍性結腸炎等，但不限於此。
在一實施例中，上述本發明之用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物，可更包括一藥學上可接受之載體或鹽類。
而於上述本發明之用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物中，具有式(I)之化合物的例子，可包括栓翅芹內酯、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素等，但不限於此。具有式(II)之化合物的例子可包括，但不限於，ζ-黃皮醯胺等。具有式(III)之化合物的例子可包括，印度黃皮唑鹼等，但不限於此。
在一實施例中，於上述本發明之用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物中，具有式(I)之化合物可為栓翅芹內酯、歐前胡素或8-牛兒醇基補骨脂素，具有式(II)之化合物可為ζ-黃皮醯胺而具有式(III)之化合物可為印度黃皮唑鹼。
在另一實施例中，上述本發明之用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物中係以具有式(I)之化合物為有效成分。於此實施例中，本發明之醫藥組成物可用於治療或減緩紅斑性狼瘡。上述紅斑性狼瘡可為全身性紅斑性狼瘡。又於此實施例中，本發明之醫藥組成物可用於治療或減緩紅斑性狼瘡的併發症，例如狼瘡腎炎。另外，於此實施例中，本發明之醫藥組成物可用於治療或減緩一般腎炎。在一特定實施例中，上述具有式(I)之化合物為8-牛兒醇基補骨脂素。
於上述任何本發明用於治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的醫藥組成物中，前述藥學上可接受之載體可包括，但不限於溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將藥學組合物配置成劑型(dosage form)。
又，上述藥學上可接受之鹽類可包括，但不限於鹽類包括無機陽離子，例如，鹼金屬鹽類，如鈉、鉀或胺鹽，鹼土金族鹽類，如鎂、鈣鹽，含二價或四價陽離子之鹽類，如鋅、鋁或鋯鹽。此外，也可是為有機鹽類，如二環己胺鹽類、甲基-D-葡糖胺，胺基酸鹽類，如精胺酸、離胺酸、組織胺酸、麩胺酸醯胺。
本發明所製備之藥物給藥可以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮內(intradermal)靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)、動脈內(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)注射以及灌注技術。
口服成分的形式可包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。
再者，本發明還提供一種芸香科植物的萃取物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的 用途。
上述藥物可抑制IL-17產生及抑制發炎等，並具有治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的效果。而上述自體免疫疾病，可包括，紅斑性狼瘡、乾癬、乾癬性關節炎、僵直性脊髓炎、類風溼性關節炎、幼年型自發性多關節炎、克隆氏症與潰瘍性結腸炎等，但不限於此。
又，上述芸香科植物可包括黃皮屬植物、月橘屬植物或柑橘屬植物，但不限於此。上述黃皮屬植物的例子可包括，但不限於黃皮、過山香等。上述月橘屬植物的例子可包括，但不限於山黃皮、七里香等。此外，上述柑橘屬植物的例子可包括，但不限於柚、桶柑等。
再者，上述芸香科植物的萃取物可以一醇類(例如，甲醇、乙醇或丙醇)、一酯類(例如，乙酸乙酯)、一烷類(例如，己烷)或一鹵烷(例如，氯甲烷、氯乙烷)萃取而得，但並不以此為限。在一實施例中，上述芸香科植物的萃取物可以乙醇萃取而得。
在一實施例中，上述芸香科植物的萃取物為黃皮之乙醇萃取物。於此實施例中，黃皮之乙醇萃取物之指標成分可包括O-甲基獨活屬醇、栓翅芹內酯、ζ-黃皮醯胺、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素與印度黃皮唑鹼，但不限於此。又，於此實施例中，於黃皮之乙醇萃取物中對於自體免疫疾病及/或腎炎有治療或減緩功效的活性成分可包括，但不限於栓翅芹內酯、ζ-黃皮醯胺、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素、印度黃皮唑鹼或其任意之組合，但不限於此。
在上述芸香科植物的萃取物為黃皮之乙醇萃取物的實施例中，在上述本發明芸香科植物的萃取物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途中，所述藥物可用於治療或減緩紅斑性狼瘡。上述紅斑性狼瘡可為全身性紅斑性狼瘡。又於此實施例中，所述藥物可用於治療或減緩紅斑性狼瘡的併發症，例如狼瘡腎炎。再者，於此實施例中，所述藥物可用於治療或減緩一般腎炎。
另外，本發明也提供一種化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途。上述化合物可擇自下列化合物之至少一個： (a)具有式(I)之化合物： (b)具有式(II)之化合物：；與(c)具有式(III)之化合物： 其中R1為C1-C5烷基、、、或 、R2為H或C1-C3烷基、R3為H或C1-C3烷基、R4為H或C1-C3烷基，而R5為H或C1-C3烷基。
上述化合物可為治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎的一有效成分。而上述自體免疫疾病的例子，則可包括紅斑性狼瘡、乾癬、乾癬性關節炎、僵直性脊髓炎、類風溼性關節炎、幼年型自發性多關節炎、克隆氏症與潰瘍性結腸炎等，但不限於此。
具有式(I)之化合物的例子，可包括栓翅芹內酯、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素等，但不限於此。具有式(II)之化合物的例子可包括，但不限於，ζ-黃皮醯胺等。又，具有式(III)之化合物的例子可包括，印度黃皮唑鹼等，但不限於此。
在一實施例中，於上述本發明之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途中，具有式(I)之化合物可為栓翅芹內酯、歐前胡素或8-牛兒醇基補骨脂，具有式(II)之化合物可為ζ-黃皮醯胺，而具有式(III)之化 合物可為印度黃皮唑鹼。
又在一實施例中，在本發明之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途中，上述化合物係以具有式(I)之化合物為有效成分。於此實施例中，所述藥物可用於治療或減緩紅斑性狼瘡。上述紅斑性狼瘡可為全身性紅斑性狼瘡。又於此實施例中，所述藥物可用於治療或減緩紅斑性狼瘡的併發症，例如狼瘡腎炎。另外，於此實施例中，所述藥物可用於治療或減緩一般腎炎。在一特定實施例中，上述具有式(I)之化合物為8-牛兒醇基補骨脂素。
實施例
A.材料與方法
1.方法1：藥材之乙醇萃取物的製備
將藥材清洗或烘乾後，進行粗粉碎。將500g藥材粉末加入5倍體積的95%乙醇，並以25℃震盪萃取一週。將所獲得之萃取液進行抽氣過濾，以取得濾液並將其定量體積。之後，將濾液取樣2mL以進行高效液相色譜分析(high performance liquid chromatography,HPLC)與薄層色層分析(thin layer chromatography,TLC)分析。
將其餘之濾液減壓濃縮至體積約30mL，之後分裝至冷凍乾燥瓶並進行冷凍乾燥，所獲得之冷凍乾產物即為試驗藥物(萃取率：約3.5%)。
2.方法2：以週邊血液白血球(peripheral blood leukocyte,PBL)細胞平台篩選抑制IL-17分泌的藥物
利用隱靜脈採血方式取得SD大鼠血液。將大鼠血液 加入含EDTA離心管中(最終濃度為2mg/ml)充份混勻，之後加入4倍體積量的ACK緩衝溶液以破解紅血球細胞。將上述離心管置於37℃水浴中5分鐘，加入4倍體積量的PBS緩衝溶液以3000rpm速度離心5分鐘，並除去上清液後。之後，重覆破解紅血球細胞的步驟二次，並加入適量體積的細胞培養液。
將細胞植入於96孔盤中(2x105個細胞/孔)，加入適當濃度的試驗藥物(10μl/孔)，並混合均勻。接著，將96孔盤放入37℃且含5%CO2之細胞培養箱中培養1小時。之後，於每孔加入刺激物丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)(最終濃度為30ng/ml)及離子黴素(ionomycin)(最終濃度為1μg/ml)。於均勻混合後，將96孔盤置入細胞培養箱中培養48小時。
於培養48小時後，將96孔盤以3000rpm離心5分鐘，使細胞沉澱並將上清液(細胞培養液)移至新的96孔盤(約155μl/孔)。
將保留於原96孔盤中之細胞添加alamar Blue(5μl/孔)，並放入37℃且含5%CO2細胞培養箱中4小時。之後，利用ELISA讀取儀以激發光560nm與發射光590nm檢測細胞存活率。
而將新的96孔盤中之細胞培養液稀釋2-4倍後，利用大鼠IL-17 ELISA套組(eBioscience,88-7170)檢測其IL-17含量。
細胞存活分析與IL-17含量分析皆以添加丙二醇甲醚醋酸酯及離子黴素組為100%，並以百分比顯示IL-17之分泌。
方法3：Th17細胞分化試驗(Th17 differentiation assay)
C57BL/6小鼠由國家動物中心購入後即飼養於工研 院動物站，並遵循工研院動物站使用實驗動物及實驗操作之規範(ITRI-IACUC-2012-025)。
將6-8週齡之C57BL/6小鼠的脾臟取出。之後利用Falcon® Cell Strainer(CORNING)將脾臟磨碎，並收集細胞懸浮液即為初級脾臟細胞。接著，利用IMag magnetic system(BD Pharmingen)依據其操作步驟自初級脾臟細胞分離出CD4+ T細胞。
接著將CD4+ T細胞加入24孔細胞培養盤中(5×105個細胞/孔)，其中24孔細胞培養盤需於前一天以anti-CD3(1μg/ml；eBioscience)作吸附處理。然後將anti-CD28(eBioscience)加入24孔細胞培養盤以使T細胞活化，同時加入IL-6(PEPROTECH)、TGF-β(PEPROTECH)、anti-IFN-γ(eBioscience)、anti-IL-4(eBioscience)、anti-IL-2(eBioscience)以進行Th17細胞之分化，並於最後加入待測樣品。之後，將24孔細胞培養盤置於37℃且含5% CO2之培養箱中培養3天。
於培養3天後，將24孔細胞培養盤以1100rpm離心5分鐘，使細胞沉澱並將上清液(細胞培養液)移至新的24孔盤(950μl/孔)。
將保留於原24孔盤中之細胞添加alamar Blue(AbD Serotec)(20μl/孔)，並於37℃且含5% CO2之培養箱中再培養6小時。於上述培養後，利用連續波長微孔盤分析儀測量細胞於波長570nm與600nm之吸光值，並依據產品建議之分析公式計算細胞存活率。
將上述細胞培養液進行5倍稀釋，接著利用市售套組Mouse IL-17A ELISA Ready-SET-Go！®(eBioscience)並根據產品 所建議之操作步驟分析其中之IL-17表現量。
4.方法4：以IFN-γ誘導單核球細胞產生CXCL9之試驗
自BCRC取得人類單核球細胞(THP-1)細胞。首先，將THP-1細胞(2×104/mL)種於96孔培養盤中。經於37℃且含5%CO2之培養箱中培養16小時後，加入重組人類IFN-γ(1mg/ml)與待測樣品於96孔培養盤中共同培養24小時。
於培養24小時後，將96孔培養盤以1100rpm離心3分鐘，使細胞沉澱並將上清液(細胞培養液)移至新的96孔培養盤(90μl/孔)。
將保留於原96孔盤中之細胞添加alamar Blue(AbDSerotec；Cat.No.BUF012B)，並於37℃且含5% CO2之培養箱中再培養4小時。於上述培養後，利用連續波長微孔盤分析儀測量細胞於波長570nm與600nm之吸光值，並透過下列公式計算細胞存活率： 細胞存活率=(11,726×實驗組OD570)-(80,586×實驗組OD600)/(11,726×對照組OD570)-(80,586×對照組OD600)×100%，其中，11,726與80,586分別為alamar Blue在OD570與OD600之莫耳吸光係數。
利用人類CXCL9/MIG DuoSet ELISA(R&D；Cat.No.DY392)並根據產品所建議之操作步驟分析細胞培養液之CXCL9表現量。
5.方法5：脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)誘發小鼠急性發炎模式
5.1 BALB/c小鼠
6-8週大之BALB/c公鼠係購自樂斯科生物科技股份有限公司(BioLASCO Taiwan Co.,Ltd)。之後進入工研院動物實驗站一般小鼠實驗區進行為期一週之檢疫工作，飼養條件符合國家實驗動物規範。進動物當天即將小鼠進行標示、分籠及秤重。於檢疫期間觀察小鼠之活動力與環境適應性。一週後，若小鼠體重正常增加，則將其移入飼養區等待實驗之進行。
飼養區之光照時間自動控制為12小時亮、12小時暗，溫度控制為23±2℃。動物可自由取得充分之食物及飲水。本品系實驗動物已有豐富的基礎參考資料與數據，可適用於發炎性功能評估試驗，實驗方法已獲得工研院IACUC委員會核准。
5.2小鼠之處理
於實驗前先將小鼠秤重並分組，使各組平均體重無明顯差異，並紀錄其臨床症狀。實驗前2-4小時將小鼠禁食，但仍正常供應飲水。在以脂多醣(lipopolysaccharides,LPS)刺激前/後特定時間，以口服、腹腔注射(IP)或靜脈注射(IV)方式給予小鼠試驗藥物，給藥後觀察並紀錄小鼠臨床症狀，對照組則控制為給予相同體積之溶劑。以腹腔注射(IP)方式給予小鼠1mg/kg之脂多醣(0.25ml/小鼠)刺激，觀察並紀錄小鼠之臨床症狀。
於以脂多醣刺激後1.5小時，將小鼠以過量CO2安樂死，之後以心臟採血方式取得小鼠全血。
小鼠全血以6000rpm於4℃離心10分鐘。之後收集血漿，以進行TNF-α、IL-6與MCP-1分泌量的測定。
5.3 TNF-α、IL-6與MCP-1分泌量的測定
血漿中之TNF-α、IL-6與MCP-1分泌量係依照Duoset® ELISA套組分析步驟進行分析，步驟簡述如下： 室溫下，於ELISA 96孔盤加入捕捉抗體(Capture Antibody)混合液(100μl/孔)，以覆蓋ELISA 96孔盤的表面。隔夜後，吸乾混合液並以清洗緩衝溶液(Wash Buffer)清洗ELISA 96孔盤(300μl/孔)，清洗三次，然後將阻礙緩衝溶液(Block buffer)加至ELISA 96孔盤(200μl/孔)以覆蓋剩餘空間，並在室溫下作用1小時。重複前述清洗步驟。
接著，將適當稀釋倍數之待測樣品及標準品加至ELISA 96孔盤(100μl/孔)，並在室溫下作用2小時。然後重複前述清洗步驟。
於清洗後，再將偵測抗體(Detection Antibody)混合液加至ELISA 96孔盤(100μl/孔)，並於室溫下作用2小時。重複前述清洗步驟。
再將鏈黴親和素-山葵過氧化氫酵素(Streptavidin-HRP)混合液加至ELISA 96孔盤(100μl/孔)，並於室溫下避光作用20分鐘。重複前述清洗步驟。
之後，將基質溶液(Substrate Solution)(TMB)(100μl/孔)加至ELISA 96孔盤，並於室溫下避光作用20分鐘。最後，將終止溶液(Stop Solution)(1N HCl)加至ELISA 96孔盤(50μl/孔)以終止顯色反應，並測定OD 450nm的吸光值。
5.4統計分析
本試驗數據以實驗結果之平均值(Mean)±標準差(Standard error,S.E.)來表示。採用t-test比較各組間是否具差異 性，若p值小於0.05則表示兩試驗組之間具有統計上顯著差異。
6.方法6：NZBWF1/J全身性紅斑性狼瘡(SLE)自體免疫動物模式
6.1 NZBWF1/J母鼠
NZBWF1/J母鼠係購自美國The Jackson Laboratory，動物檢疫後，代養至適當週齡(約16-25週大)。
實驗開始前，根據anti-dsDNA抗體數值將小鼠隨機分組，之後開始給予測試樣品。一週投藥5天，連續投藥10-18週後犧牲動物。投藥期間每週記錄體重變化，且每1-2週輕壓小鼠腹部使排尿，以試紙及蛋白質測定套組測定尿中白蛋白含量(mg/dl)。
實驗結束時，蒐集尿液並以心臟採血方式取得小鼠全血。之後取下小鼠腎臟秤重並記錄其外觀病變，並保存於10%中性福馬林中以備做病理切片觀察之用。病理評分標準係依文獻Shackelford et al.Toxicol.Pathol.30：93-96做判斷，以0-5分表示：0分代表無(not present)；1分代表極微(Minimal)(<1%)；2分代表輕微(Slight)(1-25%)；3分代表中度(Moderate)(26-50%)；4分代表中/重度(Moderate/Severe)(51-75%)；5分代表嚴重(Severe)(76-100%)。
6.2測定尿中蛋白質含量
每1-2週輕壓小鼠腹部(膀胱)使其排尿，並將尿液收集於1.5ml離心管中，以尿液試紙測定尿液中的蛋白質含量(mg/dl)。以試紙沾染尿液，靜置1分鐘，依據試紙呈色結果判定蛋白質含量。其中以“-”代表尿蛋白含量為0mg/dl；以“+/-”代表尿蛋白含量為10mg/dl；以“+”代表尿蛋白含量為30mg/dl；以“++” 代表尿蛋白含量為100mg/dl；以“+++”代表尿蛋白含量為300mg/dl；以“++++”代表尿蛋白含量為1000mg/dl。若呈色介於兩個區間之間，則取兩區間之平均值為尿蛋白數值。
6.3測定血清中尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)及肌酸酐(creatinine,CRE)的含量
以尾巴採血方式自小鼠取得約0.1ml血液。將血液於室溫下靜置1-2小時後，以6,000rpm於室溫離心10分鐘。之後取上層血清測定血清中尿素氮(BUN)及肌酸酐(CRE)的含量。
血清中尿素氮(BUN)及肌酸酐(CRE)的含量以FUJI CHEM 4000i乾式血清生化儀進行測定，步驟簡述如下： 實驗前先將尿素氮(BUN)及肌酸酐(CRE)試片及待測血清置於室溫下回溫。之後，依儀器指示在試片中央加入10μl之血清原液(如數值超出測定範圍則將血清以滅菌水進行適當稀釋後測定)，並進行測定。待測定完成則可得到血清中尿素氮(BUN)及肌酸酐(CRE)的含量(mg/dl)。
7.方法7：馬兜鈴酸(aristolochic acid,AA)誘發之腎炎模式建立
將雌性BALB/c小鼠(LASCO,Taiwan)以口服方式投予試驗藥物(250mg/kg及750mg/kg)。3天後，再以腹腔注射每日投予5mg/kg的馬兜鈴酸至BALB/c小鼠。馬兜鈴酸投予過程中，仍持續投予小鼠試驗藥物(250mg/kg及750mg/kg)並記錄其體重變化。連續注射馬兜鈴酸12天之後犧牲小鼠，並採集血清以進行後續血清生化值(尿素氮(BUN)及肌酸酐(CRE))分析。血清生化值以富士乾式生化分析儀(4000i,FUJI)進行分析。
8.方法8：以EL4細胞平台篩選抑制IL-17分泌藥物
將EL4細胞植入於96孔盤(1x105細胞/孔)，加入適當濃度之試驗藥物(10μl/孔)，並混合均勻。
接著，將96孔盤放入37℃且含5%CO2之細胞培養箱中培養1小時。之後，於每孔加入刺激物丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)(最終濃度為10ng/ml)及離子黴素(ionomycin)(最終濃度為5ng/ml)。於均勻混合後，將96孔盤置入細胞培養箱中培養18小時。
於培養18小時後，將96孔盤以1200rpm離心5分鐘，使細胞沉澱並將上清液(細胞培養液)移至新的96孔盤(155μl/孔)。
將保留於原96孔盤中之細胞添加5mg/ml之MTT(5μl/孔)，並放入37℃且含5%CO2之細胞培養箱中1小時。之後將DMSO添加至細胞(150μl/孔)，以將結晶紫溶出。將96孔盤中之液體混合均勻之後，測定各孔於570nm之吸光值，以測定細胞存活率。
而將新的96孔盤中之細胞培養液稀釋2-4倍後，利小鼠IL-17 ELISA套組(R&D,DY421E)檢測其IL-17含量。
細胞存活分析與IL-17含量分析皆以添加丙二醇甲醚醋酸酯及離子黴素組為100%，並以百分比顯示IL-17之分泌。
B.結果
(A)黃皮之乙醇萃取物的作用
以上述方法1獲得黃皮之乙醇萃取物，將其命名為HE-07。
1.黃皮之乙醇萃取物HE-07對於週邊血液白血球(peripheral blood leukocyte,PBL)細胞與Th17細胞的影響
分別以上述方法2與方法3來確認黃皮之乙醇萃取物(HE-07)對於大鼠週邊血液白血球與CD4+ T細胞所分化成之Th17細胞之存活率與IL-17分泌的影響。結果分別如表1與表2所示。
表1與表2顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07可有效抑制兩種不同細胞之IL-17分泌。
目前已知IL-17在自體免疫疾病，如乾癬、乾癬性關節炎、僵直性脊髓炎等之中扮演了關鍵性角色，且IL-17的單株抗體已於臨床實驗證實對於上述自體免疫疾病具有顯著的治療效 果，此外動物實驗與臨床資料顯示，IL-17與紅斑性狼瘡相關。因此，具備抑制IL-17分泌之功效的黃皮之乙醇萃取物應可應用於上述自體免疫疾病的治療。
2.黃皮之乙醇萃取物HE-07對於以IFN-γ誘導單核球細胞所產生CXCL9的影響
CXCL9為紅斑性狼瘡相關趨化因子。以上述方法4與來確認黃皮之乙醇萃取物HE-07對於以IFN-γ誘導單核球細胞所產生CXCL9的影響。結果如表3所示。
結果顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07能夠有效抑制以IFN-γ所誘導之單核球細胞的CXCL9分泌。
3.黃皮之乙醇萃取物HE-07對於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中之發炎因子TNF-α與IL-6產生的影響
TNF-α與IL-6為目前公認與發炎相關之因子。以上述方法5與來確認黃皮之乙醇萃取物HE-07對於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中之發炎因子TNF-α與IL-6產生的影響。結果分別如第1A圖與第1B圖所示。
依據第1A圖與第1B圖可知，於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中，黃皮之乙醇萃取物HE-07可顯著抑制之發炎因子 TNF-α與IL-6的產生。
由於黃皮之乙醇萃取物對於TNF-α或IL-6有顯著的抑制效果，而已知TNF-α或IL-6涉及自體免疫疾病，因此應可將黃皮之乙醇萃取物應用於類風濕性關節炎、幼年型自發性多關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎等自體免疫疾病的治療或減緩。
4.黃皮之乙醇萃取物(HE-07)對於NZBWF1/J小鼠的作用
NZBWF1/J小鼠為常用之全身性紅斑性狼瘡自體免疫動物模式。以上述方法6來確認黃皮之乙醇萃取物(HE-07)對於NZBWF1/J小鼠之作用。結果如第2A至2F圖及表4所示。
第2A圖顯示，黃皮之乙醇萃取物HE-07可有效減少NZBWF1/J小鼠之尿液中的蛋白質含量。又，由第2B圖與第2C圖 可知，黃皮之乙醇萃取物HE-07可有效降低NZBWF1/J小鼠之血清中尿素氮與肌酸酐含量。
而依據第2D圖與第2E圖可知，於NZBWF1/J小鼠中，黃皮之乙醇萃取物HE-07可顯著減少腎臟發炎細胞浸潤，並顯著降低腎小管病變與腎絲球炎。
再者，第2F圖及表4顯示，黃皮之乙醇萃取物(HE-07)可顯著提高NZBWF1/J小鼠的存活率。
由於黃皮之乙醇萃取物有效改善紅斑性狼瘡動物模式NZBWF1/J小鼠之腎炎並提高其存活率，因此應可將其應用於治療紅斑性狼瘡與狼瘡腎炎。
5.黃皮之乙醇萃取物HE-07對於以馬兜鈴酸誘發腎炎之小鼠的作用
以上述方法7來確認黃皮之乙醇萃取物HE-07對於馬兜鈴酸誘發腎炎之小鼠之體重、血清中之尿素氮(BUN)含量以及血清中之肌酸酐(CRE)含量的影響。結果分別如第3A與3B圖、第4A與4B圖以及第5A與5B圖所示。
第3A與3B圖顯示，於馬兜鈴酸誘發小鼠腎炎12天後，黃皮之乙醇萃取物HE-07具有減緩小鼠體重下降的效果。
而由第4A與4B圖可清楚得知，於馬兜鈴酸誘發小鼠腎炎後，黃皮之乙醇萃取物HE-07顯著降低了小鼠血清中之尿素氮(BUN)含量。
又，第5A與5B圖則顯示，於馬兜鈴酸誘發小鼠腎炎後，黃皮之乙醇萃取物HE-07顯著降低了小鼠血清中之肌酸酐(CRE)含量。
依據上述結果可知，黃皮之乙醇萃取物可有效改善馬兜鈴酸所誘發之腎炎，應可將其應用於腎炎相關治療。
(B)黃皮之乙醇萃取物的活性片段與其作用
1.黃皮之乙醇萃取物HE-07之活性片段的確認
將黃皮之乙醇萃取物HE-07經由高效液相色譜分析與薄層色層分析分析，獲得各個黃皮之乙醇萃取物HE-07之片段，並進行活性測試，以確認出其活性片段，並將其命名為HE-07-X。
之後經由核磁共振光譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR spectroscopy)分析，確認於HE-07-X中之6個化合物，分別編碼為F8m、F7m、F6m、F5m、F4m與F3m。
F8m、F7m、F6m、F5m、F4m與F3m之結構如第6圖所示，其中F8m為O-甲基獨活屬醇(O-methylheraclenol)、F7m為栓翅芹內酯(prangenin)、F6m為ζ-黃皮醯胺(ζ-clausenamide)、F5m為歐前胡素(imperatorin)、F4m為8-牛兒醇基補骨脂素(8-geranyloxypsoralen)，與F3m為印度黃皮唑鹼(indizoline)。
又，上述6個化合物於活性片段HE-07-X中之含量，則如表5所示。
依據表5可知，化合物F8m、F7m、F6m、F5m、F4m 與F3m共佔活性片段HE-07-X的56.11wt%
2.活性片段HE-07-X對於週邊血液白血球與EL4細胞之IL-17分泌的影響
分別以上述方法2與方法8來確認活性片段HE-07-X對於大鼠週邊血液白血球與EL4細胞之IL-17分泌的影響。結果如表6所示。
依據表6可知，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X可抑制週邊血液白血球與EL4細胞分泌IL-17。
由於黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X可抑制IL-17分泌，而IL-17的單株抗體已於臨床實驗中被證實對於自體免疫疾病具有顯著的治療效果，且動物實驗與臨床資料顯示IL-17與紅斑性狼瘡相關。因此應可將其應用於自體免疫疾病，如乾癬、乾癬性關節炎、僵直性脊髓炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等的治療。
3.活性片段HE-07-X對於以IFN-γ誘導單核球細胞所產生CXCL9的影響
以上述方法4與來確認活性片段HE-07-X對於以IFN-γ誘導單核球細胞所產生CXCL9的影響。結果如表7所示。
依據表7可知，黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X可抑制TH-1細胞分泌CXCL9。
4.活性片段HE-07-X對於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中之發炎因子TNF-α與MCP-1產生的影響
TNF-α與MCP-1為目前公認與發炎相關之因子。以上述方法5與來確認活性片段HE-07-X在脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中對於發炎因子TNF-α與MCP-1產生的影響。結果分別如第7A圖與第7B圖所示。
依據第7A圖與第7B圖可知，於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中，活性片段HE-07-X可顯著抑制發炎因子TNF-α與MCP-1的產生並具有劑量效應。
由於黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X對於TNF-α或MCP-1有顯著的抑制效果，而已知TNF-α及MCP-1涉及自體免疫疾病，因此應可將其應用於類風濕性關節炎、幼年型自發性多關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等自體免疫疾病的治療或減緩。
5.活性片段HE-07-X對於NZBWF1/J小鼠的作用
以上述方法6來確認活性片段HE-07-X對於 NZBWF1/J小鼠之作用。結果如第8A與8B圖與表8，以及第9A至9C圖所示。
第8A圖顯示，在紅斑性狼瘡動物模式中，投予300mg/kg之活性片段HE-07-X可使小鼠體重穩定地增加。
又，根據第8B圖與表8可以清楚得知，在紅斑性狼瘡動物模式中，投予300mg/kg之活性片段HE-07-X可以大幅提高小鼠之存活率。
而依據第9A至9C圖可知，在紅斑性狼瘡動物模式中，投予300mg/kg之活性片段HE-07-X可顯著減緩小鼠腎臟發炎，並顯著降低腎小管病變與減緩腎絲球炎。
由於黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X可有效 改善紅斑性狼瘡動物模式NZBWF1/J小鼠之腎炎並提高其存活率，因此應可將其應用於治療紅斑性狼瘡與狼瘡腎炎。
(C)黃皮之乙醇萃取物的活性成分與其作用
將前述存在於黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X之6個化合物中佔較高重量比例之5個化合物，F7m、F6m、F5m、F4m與F3m進一步確認其個別之功效。
1.黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X中之化合物對於週邊血液白血球與EL4細胞之IL-17分泌的影響
分別以上述方法2與方法8來確認活性片段HE-07-X中之化合物對於週邊血液白血球與EL4細胞之IL-17分泌的影響。結果如表9所示。
依據表9可知，在從黃皮分離出之上述6個化合物中，F3m(印度黃皮唑鹼(indizoline))、F4m(8-牛兒醇基補骨脂素(8-geranyloxypsoralen))、F5m(歐前胡素(imperatorin))、F6m (ζ-黃皮醯胺(ζ-clausenamide))與F7m(栓翅芹內酯(prangenin))具有抑制IL-17分泌之活性。
由於F3m(印度黃皮唑鹼)、F4m(8-牛兒醇基補骨脂素)、F5m(歐前胡素)、F6m(ζ-黃皮醯胺)與F7m(栓翅芹內酯)可抑制IL-17分泌，而IL-17的單株抗體已於臨床實驗中被證實對於自體免疫疾病具有顯著的治療效果，因此應可將其應用於自體免疫疾病，如乾癬、乾癬性關節炎、僵直性脊髓炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等的治療。
4.黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X中之化合物對於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中之發炎因子TNF-α、IL-6與MCP-1產生的影響
以上述方法5與來確認活性片段HE-07-X中之化合物對於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中之發炎因子TNF-α、IL-6與MCP-1產生的影響。結果分別如第10A與10B圖、第11A與11B圖與第12A與12B圖所示。
第10A與10B圖顯示，於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中，F4m與F5m可顯著抑制發炎因子TNF-α的產生。第11A與11B圖顯示，於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中，F4m、F3m與F6m可顯著抑制發炎因子IL-6的產生。而第12A與12B圖顯示，於脂多醣誘發小鼠急性發炎模式中，F4m、F5m、F3m與F6m皆可顯著抑制發炎因子MCP-1的產生。
依據上述結果可知，在從黃皮分離出之上述6個化合物中，F3m(印度黃皮唑鹼(indizoline))、F4m(8-牛兒醇基補骨脂素(8-geranyloxypsoralen))、F5m(歐前胡素(imperatorin))與 F6m(ζ-黃皮醯胺(ζ-clausenamide))具有抗發炎之活性。
由於F3m(印度黃皮唑鹼)、F4m(8-牛兒醇基補骨脂素)、F5m(歐前胡素)與F6m(ζ-黃皮醯胺)對於TNF-α、IL-6與MCP-1有顯著的抑制效果，因此應可將其應用於類風濕性關節炎、幼年型自發性多關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等自體免疫疾病的治療或減緩。
5.黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X中之化合物對於NZBWF1/J小鼠的作用
以上述方法6來確認黃皮之乙醇萃取物的活性片段HE-07-X中之化合物對於NZBWF1/J小鼠之作用。結果如第13圖以及表10所示。
第13圖及表10顯示，在紅斑性狼瘡動物模式中，投予50mg/kg之活性片段HE-07-Fr4(含有大於80%之F4m(8-牛兒醇基補骨脂素))12週可顯著提高小鼠之存活率。
由於F4m(8-牛兒醇基補骨脂素)可有效改善紅斑性狼瘡動物模式NZBWF1/J小鼠之存活率，因此應可將其應用於治療紅斑性狼瘡。
(D)芸香科植物之乙醇萃取物的作用
將其他芸香科植物分別以上述方法1獲得乙醇萃取物。上述其他芸香科植物分別為，屬於黃皮屬之過山香，屬於月橘屬之七里香與山黃皮，以及屬於柑橘屬之柚與桶柑。
以上述方法8來確認其他芸香科植物之乙醇萃取物對於EL4細胞之IL-17分泌的影響。結果如表11所示。
依據表11可知，黃皮之近源屬種植物，屬於黃皮屬之過山香、屬於月橘屬之七里香與山黃皮，以及屬於柑橘屬之柚 與桶柑之乙醇萃取物皆可抑制EL4細胞分泌IL-17。
由於，屬於黃皮屬之過山香、屬於月橘屬之七里香與山黃皮，以及屬於柑橘屬之柚與桶柑之乙醇萃取物皆可抑制IL-17分泌，而IL-17的單株抗體已於臨床實驗中被證實對於自體免疫疾病具有顯著的治療效果，因此應可將其應用於自體免疫疾病，如乾癬、乾癬性關節炎、僵直性脊髓炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等的治療。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (9)

  1. 一種化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中該化合物係擇自由下列所組成之群組的至少一個：(a)具有式(I)之化合物：
    Figure TWI656879B_C0001
    (b)具有式(II)之化合物：
    Figure TWI656879B_C0002
    ；以及(c)具有式(III)之化合物：
    Figure TWI656879B_C0003
    其中R1為C1-C5烷基、、
    Figure TWI656879B_C0005
    、
    Figure TWI656879B_C0006
    或、R2為H或C1-C3烷基、R3為H或C1-C3烷基、R4為H或C1-C3烷基，而R5為H或C1-C3烷基。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中具有式(I)之化合物為栓翅芹內酯、歐前胡素或8-牛兒醇基補骨脂素。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中具有式(II)之化合物為ζ-黃皮醯胺。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中具有式(III)之化合物為印度黃皮唑鹼。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中該有效成分為具有式(I)之化合物。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中該自體免疫疾病為紅斑性狼瘡。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中該紅斑性狼瘡為全身性紅斑性狼瘡。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中該自體免疫疾病之併發症為狼瘡腎炎。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之化合物用於製造治療或減緩自體免疫疾病及/或其併發症及/或腎炎之藥物的用途，其中具有式(I)之化合物8-牛兒醇基補骨脂素。
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