CN107714692A - 一种欧前胡素抗肠炎的医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药学领域,特别是涉及一种欧前胡素抗肠炎的医药用途。本发明的欧前胡素作为PXR受体激动剂,用于防治溃疡性结肠炎、慢性结肠炎、克隆氏病引起的炎症、腹泻等症。
Description
技术领域
本发明涉及医药学领域,特别是涉及一种欧前胡素的医药用途。本发明一 种治疗炎性肠病的欧前胡素作为PXR受体激动剂,用于防治溃疡性结肠炎、慢 性结肠炎、克隆氏病引起的炎症、腹泻等症。
背景技术
炎症肠病(IBD,肠炎)在西方国家相当常见,近十年在我国发病率也有 增高趋势,IBD是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病,包括溃疡性 结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。该病是诱发肠癌的高风险致病因素之一,已 逐渐发展为全球5大流行病种之一。据世界卫生组织估计大约15%肠炎患者最 终导致癌症发生与转移,严重威胁病人的健康安全。因此,控制肠炎的发生与 发展在预防炎症引起的肠癌起着重要的作用。然而,尽管20多年来在与控制 肠炎及肠炎引发肠癌的研究已取得许多的进步,但是到现在为止,肠炎的临床治疗效果仍旧不理想。
目前研究广泛认为NF-kB炎症通路调控炎症在该病的发展起着重要的作 用。因此,降低NF-kB调控的炎症通路有助于改善肠炎的发生以及发展。
孕烷X受体(PXR)参与调控了异源物和内源物代谢和处置的基因表达, 包括了I相代谢解毒酶(如CYP3A4、UGT1A1、GST)和II相转运体(MDR1、MRP2) 的基因表达,但是最近研究揭露了PXR作为调控肠炎的作用重要靶点。例如, PXR-/-基因敲除小鼠展现升高了NF-kB靶基因的化学因子和细胞因子(如 TNF-α、IL-8、MIP-3α、COX-2等)与严重肠炎,而小鼠外源性高表达PXR 可保护异源物DSS诱导的肠炎,表明了PXR调控通路与NF-kB炎症通路存在着关联。此外,PXR激动剂PCN或利福昔明通过与PXR/NF-kB的蛋白-蛋白相互作 用抑制NF-kB转录增加从而抑制了/或降低了肠炎的发生。在临床上,肠炎患 者的肠组织免疫组化显示降低了PXR及其靶基因的表达水平,并且PXR多态性 与患者的肠炎敏感性高度密切相关,是导致肠癌发生发展的重要致病因素之 一。因此,PXR可作为治疗肠炎的重要靶点,在肠炎的预防、治疗和相关药物 开发中起着十分重要的作用。通过找寻PXR激动剂,特异性活化肠PXR表达, 从而抑制NF-κB炎症信号通路及异源物侵入的细胞凋亡,有助于改善肠炎的 发生及肠炎炎症致癌症发生发展。
目前对该病急性期的药物治疗,主要是水杨酸类药物(如柳氮磺胺吡啶 SASP)、皮质类激素(如氢化可的松)和免疫抑制(如硫唑嘌呤AZA)等,但这 些药物用量较大,副作用较多,很多患者不能耐受。中医药治疗肠炎临床疗效 好,且副作用较少,易被患者接受。
白芷具有“解表散风,通窍,止痛,燥湿止带,消肿排脓”之功效。临床 广泛用于头痛、牙痛、鼻渊、肠风痔漏、赤白带下、痈疽疮疡、皮肤瘙痒等症 的治疗。欧前胡素是中药白芷的一个主要有效成分,具有抗炎,抗病毒、抗肿 瘤、抗增生等作用。然而,欧前胡素是否具有抗炎性肠病的功效尚未知。
发明内容
为了解决上述问题,本发明目的旨在提供一种欧前胡素抗肠炎的医药用 途。
具体地说,本发明提供了一种欧前胡素在制备防治肠炎的药物或食品中的 应用。
所述肠炎为溃疡性结肠炎、慢性结肠炎或克隆氏病引起的炎症、腹泻。
本发明的细节将在具体实施方式中得以详尽描述。
本发明的有益效果为:本发明具有性抗炎性肠病的新功效,具有疗效显著 且毒副作用较低的优点。
PXR激动剂是治疗大肠炎的新一代药物,如利法昔明,具有靶点明确,疗 效确切,毒副作用较低的优点。欧前胡素是白芷中的主要有效成分,具有抗炎 的作用。本发明提供的欧前胡素具有激活PXR的作用,是典型的PXR激动剂, 通过激活肠PXR,发挥显著的改善炎性肠病的作用。
本发明治疗炎性肠病的欧前胡素是中药白芷的主要有效成分,该化合物是 天然的,具备较高的安全性。
下面结合附图与具体实施方式,对本发明进一步说明。
附图说明
图1体现了欧前胡素具有增强人和小鼠PXR活性的功效;
图2体现了欧前胡素是PXR的激动剂;
图3体现了欧前胡素具有诱导PXR活性的作用;
图4体现了欧前胡素具有增强PXR活性的功效;
图5进一步体现了欧前胡素具有增强PXR活性的功效;
图6和图7体现了欧前胡素通过PXR/NF-кB炎症信号通路,发挥改善大 肠炎症的功效。
具体实施方式
实施例,参见图1至图7,本实施例提供了一种欧前胡素抗肠炎的医药用途, 具体地说,本发明提供了一种欧前胡素在制备防治肠炎的药物或食品中的 应用。
所述肠炎为溃疡性结肠炎、慢性结肠炎或克隆氏病引起的炎症、腹泻。
1.hPXR反式转录活化研究
将HCT116结肠癌细胞按3×106个/ml种于10cm培养皿中,贴壁后,使 用Lipofectamine 2000试剂同时共转染Flag-pCDNA3.1、Flag-pCDNA3.1-hPXR、 Flag-pCDNA3.1-mPXR、pGL-CYP3A4-luc和TK-Renilla-luc 48h后,收割细胞, 依次加入50μl细胞液(1×104个细胞)、内含高、中、低浓度的欧前胡素(6.25、 12.5和25μM)的50μl培养液、利福平(10μM)以及有或没有酮康唑(5 μM)种于96孔板中,诱导48h后,采用双荧光素酶报告基因检测系统,按 照说明书操作,测定双荧光素酶的活性,研究欧前胡素对hPXR反式转录活化 的影响。
图1中,A为human PXR;B为mice PXR,实验结果如图1所示,瞬时 共转染各种质粒后,高、中、低浓度欧前胡素(6.25、12.5和25μM)治疗48h 后显著诱导CYP3A4-luc荧光素酶的活性(图1)。该化合物可显著诱导 PXR-CYP3A4通路,表明欧前胡素具有增强人和小鼠PXR活性的功效。
2.哺乳动物细胞双杂交系统分析
为了进一步验证欧前胡素对PXR的转录激活作用,进行了哺乳动物细胞 双杂交系统实验研究对欧前胡素在招募辅激活剂hPXR配体结合域的影响。将 HCT116细胞按2×104个/ml种于96孔板中,过夜贴壁后,使用Lipofectamine 2000试剂同时转染pVP16空载体(40ng)、pVP16-hSXR-LBD(40ng)或者 pVP16-hSXR-ΔAF2LBD(40ng)、pM-hSRC1-RID(10ng)、pGL4.74[hRluc/TK] (1ng)和pFR-luc报告质粒(100ng)24h后,加入高、中、低浓度欧前胡素(6.25、12.5和25μM)以及利福平(10μM)诱导48h后,采用双荧光素酶 报告基因检测系统,按照说明书操作,测定双荧光素酶的活性。
实验结果如图2所示,欧前胡素可以招募SRC1到PXR的LBD区域,形 成RXR:PXR二聚体,从而转录活化下游靶蛋白,如CYP3A4,表明了欧前 胡素是PXR的激动剂。
3.欧前胡素诱导LS174T细胞内CYP3A4和MDR1的mRNA及蛋白表达 水平
将LS174T细胞按2×106个/ml种于6孔板中,过夜贴壁后,加入高、中、 低浓度欧前胡素(6.25、12.5和25μM)以及利福平(10μM)治疗48h后, 收割细胞,采用Real-time PCR和Western blotting技术分别测定细胞内CYP3A4 和MDR1的mRNA及蛋白表达水平。
实验结果如图3所示,图3中,A为CYP3A4mRNA表达水平;B为MDR1 mRNA表达水平;C为hPXR mRNA表达水平;D为CYP3A4和MDR1蛋白 表达水平;欧前胡素诱导LS174T细胞的PXR调控的靶基因CYP3A4(图3A) 和MDR1(图3B)的mRNA及蛋白表达水平(图3D),进一步表明了欧前胡 素具有诱导PXR活性的作用。
4.欧前胡素增强LS174T细胞的CYP3A4的活性
将LS174T细胞按2×104个/ml种于96孔板中,贴壁后,加入高、中、 低浓度欧前胡素(6.25、12.5和25μM)、利福平(10μM)以及有或没有酮 康唑(5μM)的培养液,诱导48h后,吸去培养基,加入100μl的咪达唑仑 (10μM),继续孵育4h,然后加入冰冷2倍体积的乙腈(含20μg/ml的D4- 咪达唑仑马来酸盐作为内标)终止反应,涡旋10min,于4000×g离心5min, 转移150μl上清液到新的96孔板中,密封,注射10μl到LC-MS/MS系统, 测定1’-羟基咪达唑仑和咪达唑仑的含量,用1’-羟基咪达唑仑的生成量来评 价欧前胡素对CYP3A4活性的诱导作用。
实验结果如图4所示,高、中、低浓度欧前胡素显著促进1’-羟基咪达唑 仑含量的生成,表明了欧前胡素能增强CYP3A4活性的作用。该化合物可显著 诱导CYP3A4的活性,表明欧前胡素具有增强PXR活性的功效。
5.敲减hPXR后,欧前胡素失去对PXR调节靶基因CYP3A4和MDR1蛋 白表达水平诱导作用
将LS174T细胞按2×106个/ml种于6孔板中,贴壁后,使用Lipofectamine 2000 试剂同时共转染siPXR和siControl48h后,加入1ml含高、中、低浓度欧前胡素 (6.25、12.5和25μM)、利福平(10μM)培养基,治疗48h后,采用Western blotting 技术测定细胞内CYP3A4和MDR1的蛋白表达水平,研究敲减hPXR后欧前胡素对 细胞内CYP3A4和MDR1蛋白表达的影响。
实验结果如图5所示,图5中,A为hPXR mRNA表达水平;B为CYP3A4mRNA 表达水平;C为MDR1mRNA表达水平;D为CYP3A4和MDR1蛋白表达水平;E 为CYP3A4酶活性。敲减hPXR后,高、中、低浓度欧前胡素失去对CYP3A4和 MDR1mRNA蛋白表达的诱导作用(图5)。该化合物在失去PXR功能后导致失去 诱导CYP3A4的表达及活性作用,从反面进一步证实了表明欧前胡素具有增强 PXR活性的功效。
6.欧前胡素改善DSS诱导的小鼠肠炎
将SPF级C57BL小鼠,雄性,随机分为7组:即对照组、欧前胡素组、DSS 组、DSS+欧前胡素高、中、低组(100,50和25mg/kg)以及DSS+PCN(mPXR 激动剂)组(n=10)。小鼠自由饮用水,预先用PCN(10mg/kg)和欧前胡素诱 导3天,对照组和DSS组给予0.05%CMC-Na。从第3天开始到第9天,DSS各组小 鼠自由饮用4%DSS(W/V)的生理盐水溶液,对照组和木欧前胡素组小鼠自由 饮用生理盐水。第9天结束实验,水合氯醛麻醉,腹主动脉采血,并处死小鼠,解剖,取结肠进行各项指标的检测。
(1)症状观察及病理组织切片观察
每天对各组小鼠进行称重并记录,观察小鼠粪便,记录大鼠发生腹泻、血便 的例数。
取肛门以上8cm肠段卷起,置10%中性甲醛中固定,常规脱水、透明后,石 腊包埋切片,4μm厚连续切片,分别作HE和免疫组化染色。HE染色,于光镜 下观察肠细胞变性、坏死,炎症细胞浸润等病理损伤情况。
(2)肠粘膜的炎症因子测定
腹主动脉采血放免法检测TNF-α、IL-6、IL-1β等。另取新鲜结肠组织,用预 冷的生理盐水冲洗除去血液,滤纸吸干称质量,加9倍生理盐水,在低温(冰 水)中用玻璃研磨器研磨制成100ml/L的组织匀浆,高速离心取上清液低温 (4℃)保存待测。MPO等按碧云天试剂盒说明书进行测定。
(3)mPXR、NF-kB(p65和p-p65)、IkBa(p-IkBa)、等炎症通路蛋白表达 水平检测
用RIPA裂解肠组织,采用BCA测定总蛋白的含量,以β-actin作为内参,加 入各蛋白I抗和II抗,孵育,测定mPXR、NF-kB、IkBa、TNF-a等的蛋白表达水 平。
实验结果见图6和图7。图6中,A为小鼠体重变化;B为小鼠便血情况;C为 大肠长度;D为欧前胡素抗DSS诱导大肠缩短的代表性图片;E为代表性病理图 片;F为病理级别。图7中,A为小鼠mPXR蛋白表达;B为NF-κB蛋白表达;C为 大肠TNF-α含量;D为大肠IL-1β含量;E为MPO含量。
图6所示,欧前胡素显著保护DSS-诱导的体重降低(图6A),减少DSS所致 的便血情况(图6B),逆转DSS所致的大肠缩短情况(图6C和图6D),并改善小 鼠大肠的病理变化(图6E和F)。结果表明欧前胡素显可具有改善小鼠大肠炎症 的的功效。图7所示,欧前胡素通过诱导大肠的mPXR的蛋白表达(图7A),进 而抑制NF-кB的蛋白表达水平(图7B),导致降低DSS-诱导的炎症因子的含量(图 7C、D和E)。结果表明欧前胡素通过PXR/NF-кB炎症信号通路,发挥改善大肠 炎症的功效。
综上所述,本发明治疗炎性肠病的欧前胡素药物具有显著改善大肠炎的功 效,其药理作用优于阳性药物PCN的疗效,且该化合物为常用中药白芷中的一 个天然的成分,安全性较高且毒副作用较低。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限 制。任何熟悉本领域的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围情况下,都可 利用上述揭示的技术手段和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和 修饰,或修改为等同变化的等效实施例。故凡是未脱离本发明技术方案的内容, 依据本发明之形状、构造及原理所作的等效变化,均应涵盖于本发明的保护范 围内。
Claims (2)
1.欧前胡素在制备防治肠炎的药物或食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述肠炎为溃疡性结肠炎、慢性结肠炎或克隆氏病引起的炎症、腹泻。
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CN108728417A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-11-02 | 湖南农业大学 | 用于筛选饲料抗生素替代品的方法及其产品 |
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WO2017025638A1 (en) * | 2015-08-12 | 2017-02-16 | Sigmoid Pharma Limited | Compositions |
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