CN114099509B - 一种酪氨酸激酶抑制剂在制造用以治疗因炎性体激活所致相关疾病的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开一种用以治疗因炎性体所致相关疾病及/或病症的方法。该方法包括向有此需要的个体施予有效量的4‑[4‑[5‑叔丁基‑2‑喹啉‑6‑基吡唑‑3‑基]‑氨甲酰基氨基]‑3‑氟苯氧基]‑N‑甲基吡啶‑2‑羧酰胺、其盐、溶剂合物或酯。

Description

一种酪氨酸激酶抑制剂在制造用以治疗因炎性体激活所致相 关疾病的药物中的用途
技术领域
本发明总体上是关于酪氨酸激酶抑制剂的新用途，特别是4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺于治疗因炎性体(inflammasome)激活所致相关疾病和/或病症的用途。
背景技术
炎性体是因应感染和源自宿主蛋白的分子而诱导发炎的先天免疫系统受体，因此已经与多种自体发炎和自体免疫疾病相关，包括神经退行性疾病(例如，多发性硬化症、阿兹海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森症(Parkinson disease)等)、代谢失调(例如动脉粥样硬化、第II型糖尿病、肥胖症等)及组织损伤等。因此，可抑制炎性体激活作用的药剂，应可作为因炎性体激活所致的相关疾病和/或病症的治疗药物。
发明内容
本发明提供酪氨酸激酶抑制剂4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(或称“瑞巴司替尼(rebastinib)”)的新用途，其被发现是可抑制炎性体激活的强力药剂，因此，瑞巴司替尼可作为一种候选药物，用来开发因炎性体激活所致相关疾病和/或病症的治疗药物。
据此，本发明的第一方面涉及一种治疗患有因炎性体激活所致相关疾病的个体的方法。该方法包括向该个体施予有效量的4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺、其盐、溶剂合物或酯。
根据本发明的实施方式，因炎性体激活所致的相关疾病为自体发炎疾病、癌症、传染性疾病、发炎疾病、代谢失调、神经退行性疾病、或组织损伤。
可通过本发明方法治疗的示例性自体发炎疾病包括但不限于：艾迪森氏症(Addison’s disease)、自体免疫甲状腺疾病、乳糜泻、多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、第I型糖尿病、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、全身性硬化症和白癜风(vitiligo)。
可通过本发明方法治疗的示例性癌症包括但不限于：B细胞淋巴瘤、乳癌、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、前列腺癌和皮肤癌。
可通过本发明方法治疗的示例性传染性疾病包括但不限于：细菌、真菌或病毒感染、败血症和败血性休克。在一些实施方式中，病毒感染是B型肝炎。
可通过本发明方法治疗的示例性发炎疾病包括但不限于：异位性皮肤炎(actopicdermatitis,AD)、哮喘、布劳综合征(Blau syndrome)、克罗恩病(Crohn’s disease)、隐热蛋白相关周期性综合征(Cryopyrin-associated periodic syndrome,CAPS)、慢性肺阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)、急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratory distress syndrome,ARDS)、急性肺损伤(acute lung injury,ALI)、痛风、巨细胞动脉炎、肝炎、发炎性肠道疾病、和肺纤维化。
可通过本发明方法治疗的示例性代谢失调包括但不限于：动脉粥样硬化、关节炎、肥胖和第II型糖尿病。
可通过本发明方法治疗的示例性神经退行性疾病包括但不限于：阿兹海默症、帕金森氏症等。
可通过本发明方法治疗的示例性组织损伤包括但不限于：急性肝衰竭、急性肺损伤(ALI)、ARDS等。可通过本发明方法治疗的示例性ALI/ARDS包括但不限于：输血相关肺损伤(transfusion-related lung injury)、呼吸机导致肺损伤(ventilator-induced klunginjury)、细菌引起肺损伤、病毒引起肺损伤等。在一些较佳实施方式中，该组织损伤的病症是急性肝衰竭。在另一些较佳实施方式中，该组织损伤的病症是ALI/ARDS。
根据本发明的实施方式，该4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺是以0.01至100mg/Kg的量施予该个体。较佳地，该4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺是以0.1至80mg/Kg的量施予该个体。
根据本发明的实施方式，适合通过本发明方法治疗的个体是哺乳动物；较佳为人类。
本发明的一个或多个实施方式的细节将在以下所附的说明中详述。根据详细说明和申请专利范围，本发明的其他特征和优点将更形明白。
应当理解，前面的一般性说明和下面的详细说明都是通过实例为之，且旨在提供对所要求保护的发明的进一步解释。
附图说明
附图被纳入说明书中并构成其一部分，例示出本发明各个方面的各种示例性系统、方法和其他示例性实施方式。根据下面参照附图阅读的详细说明，将更好地理解本说明，附图中：
图1：瑞巴司替尼(Rebastinib)抑制在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活的d-THP-1细胞中尼日利亚菌素(nigericin)诱导的IL-1β分泌。将LPS激活的d-THP-1细胞培育在DMSO(0.1％，作为对照)、瑞巴司替尼(0.01-1μM)或格列本脲(glibenclamide)(50μM)中30分钟，然后以尼日利亚菌素(5μM)或溶剂处理30分钟。以ELISA试剂盒分析细胞上清液中IL-1β的浓度。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝6)。与对照相比，**p<0.01。
图2：瑞巴司替尼抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中尿酸一钠(monosodium urea,MSU)诱导的IL-1β分泌。将LPS激活的d-THP-1细胞培育在DMSO(0.1％，作为对照)、瑞巴司替尼(0.003-1μM)或格列本脲(50μM)中30分钟，然后以MSU(100μg/ml)或溶剂处理4小时。以ELISA试剂盒分析细胞上清液中IL-1β的浓度。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝6)。与对照相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图3：瑞巴司替尼抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中咪喹莫特(imiquimod,IMQ)诱导的IL-1β分泌。将LPS激活的d-THP-1细胞培育在DMSO(0.1％，作为对照)、瑞巴司替尼(0.003-1μM)或格列本脲(50μM)中30分钟，然后，以IMQ(100μM)或溶剂处理2小时。以ELISA试剂盒分析细胞上清液中IL-1β的浓度。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝6)。与对照相比，**p<0.01；***p<0.001。
图4：瑞巴司替尼抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的IL-18分泌。将LPS激活的d-THP-1细胞培育在DMSO(0.1％，作为对照)、瑞巴司替尼(0.01-1μM)或格列本脲(50μM)中30分钟，然后，以尼日利亚菌素(5μM)或溶剂处理30分钟。以ELISA试剂盒分析细胞上清液中IL-18的浓度。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝6)。与对照相比，*p<0.05。
图5：瑞巴司替尼不会改变LPS激活的d-THP-1细胞的细胞存活率。将LPS激活的d-THP-1细胞培育在DMSO(0.1％，作为对照)、瑞巴司替尼(0.01-1μM)、格列本脲(50μM)或Triton X-100(0.1％，为总乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放量)中1小时。以CytoTox 96非放射性细胞毒性检测法分析细胞上清液中LDH的浓度。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝6)。
图6：瑞巴司替尼抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的细胞焦亡(pyroptotic cell death)。将通过LPS激活的d-THP-1细胞培育在DMSO(0.1％)、瑞巴司替尼(1μM)或格列本脲(50μM)中30分钟，然后以尼日利亚菌素(5μM)或溶剂处理30分钟。以扫描电子显微镜来检视细胞焦亡的代表性图像(n＝4)。
图7：瑞巴司替尼抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的焦亡LDH释放。将LPS激活的d-THP-1细胞培育在DMSO(0.1％，作为对照)、瑞巴司替尼(0.01-1μM)、格列本脲(50μM)或Triton X-100中30分钟，然后以尼日利亚菌素(5μM)或溶剂处理30分钟。使用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测法分析细胞上清液中LDH的浓度。数据显示为平均值±S.E.M.(n＝6)。与对照相比，**p<0.01；***p<0.001。
图8：瑞巴司替尼抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的ASC斑点形成。将LPS激活的d-THP-1细胞培育在DMSO(0.1％，作为对照)、瑞巴司替尼(1μM)或格列本脲(50μM)中30分钟，然后，以尼日利亚菌素(5μM)或溶剂处理30分钟。细胞用4％聚甲醛(paraformaldehyde)固定后，再用抗ASC和Hoechst33342染色(n＝2)。以荧光显微镜(IX81,Olympus)来检视并获取荧光照片。
图9：瑞巴司替尼可减轻小鼠经LPS/D-半乳糖胺(D-GalN)诱导的急性肝损伤。将溶剂或瑞巴司替尼(5或10mg/kg)以静脉注射方式，施用到7-10周龄的小鼠(C57BL/6)体内约1小时，接着，再以腹膜注射方式将LPS(40μg/kg)/D-GalN(400mg/kg)施用至小鼠体内约5小时，来诱导产生急性肝损伤。(A)用数字相机(比例尺：1cm)拍摄肝脏形态的代表性总体图像。(B)整个肝脏的重量表示为平均值±S.E.M.(n＝2-4)。*p<0.05；与LPS/D-GalN处理相比。
图10：瑞巴司替尼减轻LPS/D-GalN诱导的小鼠的血清生化参数。用载体或瑞巴司替尼(5或10mg/kg)通过静脉注射来处理7-10周龄的小鼠(C57BL/6)，然后用LPS(40μg/kg)/D-GalN(400mg/kg)通过腹膜内注射再处理5小时，通过自动临床化学分析仪(Dri-ChemNX500i,Fujifilm)测定血清生化参数。(A)AST，(B)ALT，(C)BUN，(D)CRE，及(E)LDH释放是表示为平均值±S.E.M.(n＝2-4)。与LPS/D-GalN单独处理相比，*p<0.05；**p<0.01。
图11：瑞巴司替尼减轻LPS诱导的急性肺损伤。通过静脉注射以载体或瑞巴司替尼(10mg/kg)来处理7-8周龄的小鼠(C57BL/6)，1小时后，再利用气管内喷雾方式施予LPS(2mg/kg，溶在40μL的0.9％生理食盐水中)。5小时后，将小鼠牺牲并收集其肺组织，以苏木素和伊红(H&E)来染色。
具体实施方式
以下结合附图提供的详细说明旨在作为本发明的说明，而无意代表可以构造或利用本发明的唯一形式。
1.定义
术语“盐”是指药学上可接受的盐，在合理的医学判断范围内，其适合用来与人和低等动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应等，并且与合理的收益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自适合的无机与有机的酸和碱。药学上可接受的无毒酸加成盐的例子是氨基与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸或与有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸所形成的盐，或通过使用本领域已知的其他方法如离子交换所形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬胺酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、硫酸月桂酯盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、羟萘酸盐(pamoate)、果冻酸盐、过硫酸盐、3–苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自适当碱的盐包括碱金属、碱土金属、铵及N+(C1–4烷基)4 -盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。其他药学上可接受的盐在适当情况下包括无毒的铵、四级铵和使用抗衡离子(例如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根)形成的铵阳离子。
术语“溶剂合物”是指通常通过溶剂分解反应而与溶剂缔合的化合物形式。此物理缔合作用可包括氢键。常用溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、二乙醚等等。本文所述的化合物可例如以结晶形式制得，且可经溶剂合。适合的溶剂合物包括药学上可接受的溶剂合物，且进一步包括化学剂量溶剂合物与非化学剂量溶剂合物两者。在某些例子中，举例来说，当一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时，溶剂合物将能够单离。“溶剂合物”涵盖溶液相与可单离的溶剂合物两者。代表性溶剂合物包括水合物、乙醇合物及甲醇合物。
术语“施予”、“施用”或“给药”在本文可互换使用，是指递送方式，包括但不限于静脉内、肌肉内、腹膜内、动脉内、颅内或皮下施用本发明的药剂(例如，化合物或组合物)。在一些实施方式中，将本发明的化合物或其盐、溶剂合物配制成用于口服给药的片剂。在其他实施方式中，在使用之前，例如静脉内注射之前，将本发明的化合物或其盐、溶剂合物配制成粉末以与合适的载体(例如，缓冲溶液)混合。
本文描述的化合物的“有效量”(单独或与另一种药剂组合服用)是指足以引起所需生物学反应，例如抑制炎性体激活或减轻本文所述目标疾病或与该疾病有关症状的量。如本领域普通技术人员将理解的，本文描述的化合物的有效量可根据诸如期望的生物学终点、化合物的药代动力学、所治疗的病症、给药模式、个体年龄和健康状况等因素而变化。在一些实例中，有效量可为治疗有效量，其是指足以在病症的治疗中提供治疗益处或使与该病症相关的一种或多种症状延迟发作或减到最小的治疗剂的量，单独或与其他疗法组合。术语“治疗有效量”可包括改善总体治疗、减少或避免该病症的症状、体征或原因和/或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。在其他实例中，有效量可以是预防有效量。化合物的预防有效量是指治疗剂单独或与其他药物组合使用的量，其在预防该病症方面提供预防益处。例如，化合物的“预防有效量”可为足以预防或延迟病症或与病症有关的一种或多种症状的发作或防止其复发的量。它也可以是改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，在特定实例中阐述的数值仍尽可能精确地报导。但是，任何数值都固有地包含某些误差，其必然是由各个测试测量中发现的标准偏差引起的。同样，如本文所用，术语“约”通常是指在给定值或范围的10％、5％、1％或0.5％之内。或者，术语“约”是指当由本领域普通技术人员考虑时在平均值的可接受标准误差内。除了在操作/工作实施例中，或者除非另有明确说明，否则所有数值范围、数量、值和百分比，例如本文所公开的材料数量、持续时间、温度、操作条件、数量比等的数值范围、数量、值和百分比，在任何情况下都应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本发明和所附申请专利范围中阐述的数值参数都是可以根据需要变化的近似值。至少，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数目并应用普通的舍入技术来解释。
除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“和”及“该”在本文中是用来包括复数对象。
2.本发明化合物的用途
本发明在于意外发现，酪氨酸激酶抑制剂4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺)(或称瑞巴司替尼)对炎性体的刺激剂具有抑制作用。因此，瑞巴司替尼可以作为候选化合物，来开发适合用于治疗因炎性体激活所致相关疾病和/或病症(例如自体发炎疾病、自体免疫疾病等)的药物。
据此，本发明的第一方面是提供一种治疗患有因炎性体激活所致相关疾病和/或病症的个体的方法。该方法包括向该个体施予有效量的4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺、其盐、溶剂合物或酯。
本发明的化合物可自商业来源中购得或是可通过相关领域中已知的任何方法制得。本发明化合物的生物活性分析显示，其是炎性体刺激剂的强力抑制剂，从而可抑制热解和/或ASC斑点的形成。此外，本发明化合物不具有细胞毒性，并且在患有急性肝损伤的个体中可显著地降低天冬氨酸氨基转胺酶(AST)、丙胺酸转胺酶(ALT)或肌酸酐(CRE)的水平。本发明还证实，本发明化合物可作为候选物，用来开发适合治疗因炎性体激活所致相关疾病和/或病症的药物。
根据本发明的实施方式，因炎性体激活所致相关疾病可为自体发炎疾病、癌症、传染性疾病、发炎疾病、代谢失调、神经退行性疾病、或组织损伤的病症。
可通过本发明方法治疗的性自体发炎疾病包括但不限于：艾迪森氏症、自体免疫甲状腺疾病、乳糜泻、多发性硬化症、牛皮癣、类风湿性关节炎、第I型糖尿病、SLE、全身性硬化症和白癜风。
可通过本发明方法治疗的示例性癌症包括但不限于：B细胞淋巴瘤、乳癌、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、胶质母细胞瘤、何杰金氏淋巴瘤、前列腺癌和皮肤癌。
可通过本发明方法治疗的示例性传染性疾病包括但不限于：细菌、真菌或病毒感染、败血症和败血性休克。在一些实施方式中，病毒感染是B型肝炎。
可通过本发明方法治疗的示例性发炎疾病包括但不限于：AD、哮喘、布劳综合征、克罗恩病、CAPS、COPD、ARDS、ALI、痛风、巨细胞动脉炎、肝炎、发炎性肠道疾病、和肺纤维化。
可通过本发明方法治疗的示例性代谢失调包括但不限于：动脉粥样硬化、关节炎、肥胖和第II型糖尿病。
可通过本发明方法治疗的示例性神经退行性疾病包括但不限于：阿兹海默症、帕金森氏症等。
可通过本发明方法治疗的示例性组织损伤包括但不限于：急性肝衰竭、ALI和ARDS。在一些较佳实施方式中，该组织损伤的病症是急性肝衰竭。在其他较佳实施方式中，该组织损伤的病症是ALI/ARDS，其可以是输血相关急性肺损伤、呼吸机导致肺损伤、细菌引起肺损伤、或是病毒引起肺损伤等。
根据本发明的实施方式，本发明的化合物，也就是4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺，是以0.01至100mg/Kg的量施予个体，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99及100mg/Kg；较佳地，该4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺是以0.1至80mg/Kg的量施予个体，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80mg/Kg。在一个较佳实施方式中，该4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺是以0.8mg/Kg的量施予个体。在另一个较佳实施方式中，该4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺是以0.5mg/Kg的量施予个体。化合物的有效量可以一剂或多剂方式给药一天或数天(取决于给药方式)。
本发明化合物还可以与合适的载体或赋形剂一起配制成配方，用于合适的给药途径，例如口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或通过植入的贮库。术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
可根据本领域已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂(例如80)和悬浮剂配制无菌注射制剂(例如，无菌注射水性或油质悬浮液)。无菌注射制剂也可以是溶在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如溶在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受媒介物和溶剂选项中，可使用包括甘露醇、水、林格氏溶液和等张氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油通常也适合作为溶剂或悬浮介质(例如合成的甘油单酯或甘油二酯)。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，可用于制备注射剂，天然的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化形式，也可用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液也可包含长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似的分散剂。为了配制目的，也可以使用其他常用的表面活性剂，例如Tweens或Spans或其他类似的乳化剂或生物利用度增强剂，其通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型。
适合用于口服给药的制剂可为任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散液和溶液。就口服片剂而言，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服给予水性悬浮剂或乳剂时，可将本发明的化合物悬浮或溶解于与乳化剂或悬浮剂组合的油相中。如果需要，可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。可根据药物制剂领域中众所周知的技术来制备鼻用气雾剂或吸入制剂，并且可制备为盐水溶液，使用苄醇或其他合适的防腐剂，吸收促进剂以增强生物利用度，碳氟化合物和/或其他本领域已知的增溶剂或分散剂。本发明的化合物也可以栓剂的形式用于直肠给药。
可被包含在内含本发明化合物的制剂中的药学上可接受的载体或赋形剂包括，惰性稀释剂、增溶剂、分散和/或粒化剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、黏合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。药学组合物中还可以存在诸如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和加香剂的赋形剂。
存在于本发明制剂中的赋形剂必须是“药学上可接受的”，意谓该赋形剂与药学组合物的活性成分兼容(并且较佳地能够稳定该药学组合物)并且对被施予该药学组合物的个体无害。例如，可与本发明化合物形成特异性更易溶解的络合物的增溶剂，如环糊精，可用来作为药学上可接受的赋形剂，用来将本发明化合物递送至个体内。其他药学上可接受的赋形剂实例包括胶体二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠和D&C黄色10号。
本文还公开了包含本文所述化合物和容器(例如小瓶、安瓿、瓶、注射器和/或分配器包装或其他合适的容器)的试剂盒(例如，药物包装)。在一些实施方式中，该试剂盒可包含第二容器，其包含用于稀释或悬浮本发明制剂的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，将提供于第一容器和第二容器中的本发明制剂或化合物组合以形成一个单位剂型。
在某些实施方式中，本文所述的试剂盒是用于抑制细胞中炎性体的激活。在某些实施方式中，本文所述的试剂盒是用于在有此需要的个体中治疗如本文所述的任何标靶疾病(例如，发炎疾病)。因此，本文所述的任何试剂盒可包含用于施用其中所包含的化合物或药学组合物的说明书。本发明的试剂盒还可包含法规机构如FDA所要求的信息。在某些实施方式中，该试剂盒和说明书提供来治疗本文所述的疾病。在某些实施方式中，该试剂盒和说明书提供来预防本文所述的疾病。本发明的试剂盒可包含一种或多种本文所述的另外药剂作为分开的组合物。
拟通过本文所述方法治疗的“个体”可为人类个体(例如儿科个体，诸如婴儿、儿童或青少年，或成年个体，诸如年轻人、中年人或老年人)，或非人类动物，如狗、猫、牛、猪、马、绵羊、山羊、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)和非人类灵长类动物(例如食蟹猴、恒河猴)。非人类哺乳动物可为转基因动物或基因工程动物。在一些实例中，该个体是患有如本文所述的靶标疾病(即，自体发炎疾病、癌症、传染性疾病、发炎疾病、代谢失调、神经退行性疾病或继发于所列疾病的病症)、怀疑患有该疾病或处于该疾病风险中的人类患者。在一些实施方式中，该个体是患有、怀疑患有继发于炎性体激活的病症(例如急性肝衰竭)的人类或非人类哺乳动物。
本文还描述了抑制细胞内炎性体激活的方法。这种方法包括使诸如本文所述的化合物以可有效抑制炎性体激活的量与细胞接触。该化合物的量可足以抑制至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)的炎性体形成刺激物的活性。在一些实施方式中，该方法可以在体外进行。在其他实施方式中，它们可通过将化合物施予需要本文所述治疗的个体而在体内进行。
应理解，如本文所述，化合物或制剂可与一种或多种其他药剂(例如，治疗和/或预防活性剂)组合用于本文所述的任何方法中。化合物或制剂可与改善其活性(例如活性(例如效力和/或功效))的其他药剂组合施予，在有需要的个体中治疗本文所述的疾病、在有需要的个体中预防本文所述的疾病、抑制个体或细胞中炎性体激活的刺激物的活性，还应理解，所采用的疗法对于相同的病症可以达到期望的效果，和/或其可以达到不同的效果。
现在将参考以下实施方式更具体地描述本发明，这些实施方式是出于说明而非限制目的所提供。尽管它们通常是可能使用的那些，但是可以替代地使用本领域普通技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实施例
材料与方法
细胞培养
人类单核细胞株THP-1是购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)并保持在37℃、5％CO2的培养箱中的RPMI-1640培养基中，该培养基中添加有10％胎牛血清(FBS)、1％抗生素-抗真菌溶液、0.1％β-巯基乙醇(β-ME)和酚红指示剂。培养基每2-3天更换。
从THP-1细胞诱导产生巨噬细胞样细胞(macrophage-like cells)
为了诱导分化，将THP-1细胞(细胞密度为约5x105/mL)培育在含有100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)的无血清培养基中约4小时。然后，将内含PMA的培养基替换为新鲜的RPMI-1640培养基，再继续培养2天，以使THP-1细胞分化成巨噬细胞样细胞，以下称为“d-THP-1细胞”。
诱导产生炎性体和释出IL-1β与IL-18
先用100ng/mL的脂多醣(LPS)处理d-THP1细胞3小时，然后更换成不含LPS的新鲜培养继续培育30分钟，再加入测试药物处理30分钟，最后分别在培养基中添加各种刺激物(即，尼日利亚菌素、尿酸一钠(MSU)和咪喹莫特(IMQ))以诱导炎性体的形成，及释出IL-1β和IL-18。
测定IL-1β和IL-18浓度
根据制造商提供的测定方法，以ELISA检测试剂盒(R&D系统)独立测定IL-1β和IL-18的浓度。IL-1β和IL-18的浓度是以Multiskan GO多板读数器分别测量在450nm和540nm下的吸亮度来决定。
细胞毒性检测
细胞毒性是通过测量乳酸脱氢酶(LDH)来测定，乳酸脱氢酶是仅在细胞死亡时才释放的胞质酶。简言之，收集来自有或无经过测试化合物处理或是Triton X-100(0.1％，为总LDH释放量)处理的d-THP-1细胞的上清液。将LDH基质添加到含有细胞上清液的试管中，将混合物在黑暗中反应30分钟，然后测量在490nm的吸亮度。细胞毒性由释放的LDH百分比/细胞中LDH总量来测定。
荧光图像
将d-THP-1细胞(如上所述经LPS、测试化合物和刺激物处理或未经处理)用4％聚甲醛固定，以PBS清洗3次后，用Triton X-100(0.1％)处理10分钟，再次以PBS清洗3次后，以5％BSA处理1小时，然后以PBS清洗3次后再加入一级抗体(抗-ASC)。让经过一级抗体(抗-ASC抗体)标记的细胞在4℃下培育过夜，然后用二级抗体标记(该标记是在室温下进行1小时)，再次以PBS清洗3次，加入Hoechst 33342后，使用荧光显微镜(IX81 Olympus,具有Lumen 200荧光照明系统)拍照。
使用场发射扫描电子显微镜观察细胞焦亡
将d-THP-1细胞(如上所述经LPS、测试化合物和刺激物处理或未经处理)，以4％聚甲醛和2.5％戊二醛(glutaraldehyde)依次分别固定10分钟，用PBS洗涤，然后与四氧化锇(OsO4)反应30分钟；将细胞用蒸馏水彻底洗涤干净后，与鞣酸(tannic acid)一同培育30分钟。通过乙醇的梯度溶液使细胞脱水，其中该乙醇的浓度从30％逐渐增加到50％、70％、80％、90％和100％。重复100％乙醇脱水步骤3次。然后使用临界点干燥器(Critical PointDryer(CPD))(LEICAME CPD 300)在超临界条件下用CO2与乙醇的混合物将样品干燥。随后将干燥的样品固定在氧化铝平台上，并用金离子进行溅射(离子溅射器，JEOL JFC-1100E，在1-2mA下操作60秒)，然后在场发射扫描电子显微镜(FESEM)下进行观察。
动物
将C57BL/6小鼠(7至10周大，每只体重约20-25克)以标准实验室饮食饲养在微型隔离器单元中。将动物圈养在湿度和温度受控的条件下，将明/暗周期设置为12小时间隔，并保持在规定且无机会病原体条件下。所有动物研究均根据长庚大学动物照护及使用委员会(中国台湾台北)批准的实验方案进行。
急性肝衰竭的动物模型
将小鼠随机分为4组。通过每只小鼠的尾静脉注射测试化合物(5或10mg/Kg)或对照溶剂(80％盐水、10％乙醇、10％Tween-20)。让小鼠休息1小时，然后通过腹腔注射LPS(40μg/ml)/D-GalN(400mg/kg)以引起急性肝衰竭。5小时后牺牲动物，分别收集血液样品和组织样品。分析血液样品中各自的LDH、AST、ALT、BUN和CRE的水平。肝组织10％福尔马林(formalin)固定、切片，再以苏木素和伊红(H&E)染色。
急性肺损伤(ALI)的动物模型
通过气管内喷雾方式对7-8周龄的小鼠(C57BL/6)施以LPS(2mg/kg)来诱发产生ALI。小鼠经过一夜禁食后，利用静脉注射方式，将瑞巴司替尼(10mg/kg)或等量的溶剂(载体)注入体内。1小时后，再利用气管内喷雾方式施予LPS(2mg/kg，溶在40μL的0.9％生理食盐水中)或是0.9％生理食盐水。5小时后，将小鼠牺牲并收集其肺组织，以10％福尔马林(formalin)固定、切片，再以苏木素和伊红(H&E)染色。
实施例1本发明化合物抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的IL-1β分泌
在本实施例中，探讨了本发明化合物(即瑞巴司替尼)对从LPS激活的巨噬细胞样细胞(即d-THP-1细胞)释放IL-1β的作用。为此，将d-THP-1细胞先用LPS(100ng/ml)激活，然后用各种浓度(即0.01、0.03、0.1、0.3或1μM)的本发明化合物或格列本脲(50μM，阳性对照)处理，最后用刺激物(即，尼日利亚菌素(5μM)、MSU(100μg/mL)或IMQ(100μM))刺激，结果如图1至图3所示。
如图所示，尼日利亚菌素导致显著量的IL-1β从LPS激活的d-THP-1细胞中释出，而该释出可为本发明化合物所降低(图1)。类似地，MSU和IMQ也会导致IL-1β被大量释放，其可分别被本发明化合物所抑制(图2及图3)。
实施例2本发明化合物抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的IL-18分泌
在本实施例中，探讨了本发明化合物(即瑞巴司替尼)对从LPS激活的巨噬细胞样细胞(即d-THP-1细胞)释出IL-18的效果。为此，将d-THP-1细胞先用LPS(100ng/ml)激活，然后用各种浓度(即0.01、0.03、0.1、0.3或1μM)的本发明化合物或格列本脲(50μM，阳性对照)处理，最后用尼日利亚菌素(5μM)刺激，结果如图4所示。
如图所示，尼日利亚菌素导致显著量的IL-18从LPS激活的d-THP-1细胞中释出，而该释出明显可为本发明化合物所降低(图4)。
实施例3本发明化合物的细胞毒性研究
在本实施例中，通过测量LDH来研究本发明化合物的细胞毒性作用。结果示于图5。
如数据所示，本发明化合物本身对所测试的d-THP-1细胞没有细胞毒性。
实施例4本发明化合物抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的细胞焦亡和焦亡性LDH释出
焦亡(pyroptosis)是程序性细胞死亡的一种形式。在此过程中，免疫细胞识别自身内部的外来危险信号，释放促发炎细胞因子，膨胀，爆裂，然后死亡。在本实施例中，探讨了本发明化合物对尼日利亚菌素诱导的细胞焦亡和LDH释放的影响，其中使用场发射扫描电子显微镜观察焦亡现象，并以酶测定法来测定LDH水平。
参考图6，其是在有或无本发明化合物存在下，用尼日利亚菌素刺激的LPS激活的d-THP-1细胞的照片。如所预期的，尼日利亚菌素诱导LPS激活的d-THP-1细胞产生肿胀和裂解，但若以本发明化合物以及格列本脲(阳性对照)预处理，均可显著地降低细胞焦亡现象。此外，还观察到本发明化合物会抑制LDH的释放(图7)。
实施例5本发明化合物抑制在LPS激活的d-THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的ASC斑点形成
炎性体激活的标志是形成ASC斑点，它是由炎性体衔接蛋白ASC(含CARD的细胞凋亡相关斑点样蛋白)形成的微米级结构，由一个热蛋白结构域(pyrin domain,PYD)和一个硫胱氨酸蛋白酶募集结构域(caspase recruitment domain(CARD))组成。在本实施例中，使用荧光显微镜观察本发明化合物对LPS激活的d-THP-1细胞中，尼日利亚菌素诱导的ASC斑点形成的作用，结果示于图8。
从图8中的照片可以清楚地看出，以尼日利亚菌素处理后，会形成明显的ASC斑点，但是，如果用本发明的化合物或格列本脲(阳性对照)预处理细胞，则会大幅减少ASC斑点的形成。本实施例的数据清楚地显示，本发明化合物可以抑制炎性体，使其不被激活。
实施例6本发明化合物减轻小鼠中LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤
在本实施例中使用急性肝损伤的动物模型，来研究本发明化合物对急性肝衰竭的影响。简言之，首先对以LPS/D-GalN(LPS：40μg/mL；D-GalN：400mg/mL)来处理动物，以造成急性肝损伤，然后，分别在本发明化合物处理之前和之后，采取血液和组织样品，然后对其进行生化和显微镜分析。结果示于图9和10中。
从图9可明显看出，LPS/D-GalN处理会造成肝损伤，因为受损的肝组织的总体图像呈深红色，这是组织出血的迹象(图9，A小图)。相比之下，从经本发明化合物处理的动物肝脏样品拍摄的图像则显示，出血和发炎程度明显减弱，这也反映在组织重量的减少上(图9，B小图)。此外，在本发明化合物处理后，肝组织损伤的各种指针，包括ALT、AST、CRE和LDH在内，其各自水平均显著降低。
实施例7本发明化合物减轻小鼠中LPSN诱导的急性肺损伤(ALI)
在本实施例中使用ALI的动物模型，来研究本发明化合物对ALI的影响。简言之，以气管内喷洒LPS(2mg/Kg)的方式来处理7-8周龄的动物，使造成ALI。小鼠在禁食一晚后，以静脉注射方式注射瑞巴司替尼(10mg/kg)或是等量的溶剂，1小时后，以气管内喷洒LPS(2mg/kg，溶在40μL的0.9％生理食盐水中)或0.9％生理食盐水的方式来使动物产生ALI。5小时后将小鼠牺牲，并取其肺组织。以10％福尔马林来固定组织，然后以H&E染色。结果示于图11中。
从图11的照片显示，以溶剂处理的肺脏组织，不会出现ALI；相反的，LPS处理过的肺脏组织，其细胞型态改变且出现浸润现象。至于在以LPS诱发产生ALI之前，若先经过瑞巴司替尼(10mg/kg)处理，则因LPS所致的肺组织型态改变程度或是浸润现象，都明显变好。此一结果显示瑞巴司替尼可改善或治愈ALI。
总的来说，本发明化合物可抑制炎性体的激活，因此可以作为候选物用来开发用于治疗因炎性体激活所致相关疾病和/或病症的药物，该疾病和/或病症包括继发于该因炎性体激活所致相关疾病和/或病症的病症，例如急性肝衰竭和ALI。
将理解的是，以上实施方式的说明仅通过示例的方式给出，本领域普通技术人员可以做出各种修改。上面的说明书、实施例和数据提供本发明示例性实施方式的结构和使用的完整说明。尽管以上已经以一定程度的特点或参照一个或多个单独的实施方式描述了本发明的各种实施方式，但是本领域普通技术人员可以在不脱离本发明范围的情况下对所公开的实施方式进行多种变化。

Claims (2)

1.4-[4-[5-叔丁基-2-喹啉-6-基吡唑-3-基]-氨甲酰基氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺的用途，其是用于制造用来治疗个体的急性肝衰竭的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其中该个体是哺乳动物。
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