TWI775408B - 用以治療與嗜中性白血球激活失調及趨化相關之疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本發明公開了3,3'-二羥基-2',6'-雙(對羥基芐基)-5-甲氧基二芐基(或布列 替尼)、其鹽、溶劑合物或酯於製備藥物上的新用途，此藥物適用於治療與嗜中性白血球激活失調及趨化相關之疾病和/或障礙，例如急性肺損傷(acute lung injury,ALI)。

Description

用以治療與嗜中性白血球激活失調及趨化相關之疾病的 方法

本發明是有關於一種天然聯苄的新用途，且特別是有關於3,3'-二羥基-2',6'-雙(對羥基芐基)-5-甲氧基二芐基(或稱布列替尼(bletinib))於治療與嗜中性白血球激活失調及趨化相關疾病和/或障礙(如，急性肺損傷)的用途。

嗜中性白血球是體循環中含量最豐富的顆粒性白血球，負責藉由去顆粒作用(degranulation)來消除病原體、使嗜中性白血球彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)釋出、呼吸道內超氧化物量暴增、及形成嗜中性白血球胞外殺菌網絡(neutrophil extracellular trap,NET)。因此，嗜中性白血球是後天性和先天性免疫系統的關鍵效應物。在發炎期間，嗜中性白血球趨化的關鍵步驟包括黏附和遷移，其受嗜中性白血球表面上的巨噬細胞-1抗原(Mac-1；又稱為αMβ2和CD11b-CD18)構型變化所調控。嗜中性白血球激活失調及趨化作用會經由釋出過量的蛋白水解酶、活性含氧物(reactive oxygen species,ROS)和嗜中性球胞外殺菌網絡而對宿主組織造成損害，從而導致各種疾病，包括自體免疫疾病(例如：系統性紅斑 狼瘡、類風濕性關節炎和銀屑病)、傳染病(如敗血症)、炎症性疾病(如急性呼吸窘迫症候群、慢性阻塞性肺病和哮喘)、動脈粥樣硬化和其他主要疾病(如癌症)。

傳統中醫數千年前就開始以白芨(Bletilla)塊莖來治療肺、胃腸和皮膚的發炎性和出血性疾病。布列替尼(3,3'-二羥基-2',6'-雙(對羥基芐基)-5-甲氧基二芐基)是一種天然聯芐，最早是從白芨鱗莖中萃取而得，具有抗菌、抗真菌、抗過敏和抗有絲分裂的活性。

在本申請案中，發明人意外發現布列替尼可以調節活化的人類嗜中性白血球的發炎狀況，因此，布列替尼可做為開發用於治療嗜中性白血球激活失調及趨化相關疾病和/或障礙(例如，急性肺損傷)之藥物的候選化合物。

本發明提供一種天然聯苄的新用途，此聯苄為從白芨中萃取的3,3'-二羥基-2',6'-雙(對羥基芐基)-5-甲氧基二芐基(或稱布列替尼)，意外發現其能抑制嗜中性白血球激活失調，因此布列替尼可以作為用於治療嗜中性白血球激活失調及趨化相關疾病和/或障礙(例如，急性肺損傷)之藥物的候選化合物。

因此，本發明第一方面涉及布列替尼，其之鹽、溶劑合物或酯在製備適用於治療急性肺損傷之藥物的用途。所述方法包括向患者施用一有效量的布列替尼、其鹽、溶劑合物或酯。

根據本發明的實施例，所述急性肺損傷可以是急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。

可通過本發明方法治療的急性呼係窘迫症候群示例，包括但不限於，輸血相關的肺損傷、呼吸機誘導的肺損傷、細菌誘導的肺損傷、病毒誘導的肺損傷等。

根據本發明的實施例，布列替尼係以0.1毫克到60克的量存在於藥物中。優選地，布列替尼係以2毫克到5克的量存在於藥物中。

根據本發明的實施例，適合以本方法進行治療的固體為哺乳類；優選地，是人類。

本發明的一個或多個實施例的細節，在以下所附描述中闡述。本發明的其他特徵和優點，將在詳細的描述和請求項中明顯可見。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

被包含在說明書且構成說明書一部分的附圖，繪示出本發明各方面的各種示例系統、方法和其他示例性實施例。經由下列關於圖示的詳細描圖式將能更好地理解本發明，其中：

圖1顯示布列替尼可抑制激活的人類嗜中性白血球中超氧陰離子的生成。先讓嗜中性白血球(6×10⁵cells/mL)與0.1% DMSO或0.3-10μM布列替尼培養5分鐘後，再暴露於各種能使之激活並產生超氧陰離子的刺激物下，包括(A)fMLF、(B)MMK-1、(C)NaF或(D)PMA，然後使用鐵細胞色素還原方法測量超氧陰離子含量。(E)使用LDH釋放來評估細胞毒性。(F)在無細胞的黃嘌呤 /黃嘌呤氧化酶系統中，評估布列替尼清除超氧化物的能力，其係以光譜儀在450nm波長下測量WST-1還原程度，以20U/mL超氧化物歧化酶作為陽性對照。所有數據都以箱形圖呈現，中位數(最小值-最大值；n=6)。所有數據與DMSO+fMLF組相比後，*p<0.05。

圖2顯示布列替尼可減少由fMLF激活的嗜中性白血球中ROS的生成。(A)用0.1% DMSO或0.1-3μM布列替尼預處理帶有DHR123標記的人類嗜中性白血球，接著，再用0.1μM fMLF活化，並以流式細胞分析儀監測。嗜中性白血球中ROS水平和DHR123的平均螢光強度(mean fluorescence intensity,MFI)以箱形圖呈現，中位數(最小值-最大值；n=5)。(B)在有或沒有0.1μM fMLF的情況下，嗜中性白血球與0.1-3μM布列替尼或0.1% DMSO一起培養5分鐘，再使用酵素免疫分析儀(ELISA reader)即時監測化學發光的變化。化學發光的峰值以箱形圖呈現，中值(最小值-最大值；n=5；右圖)。所有數據與DMSO+fMLF組相比後，*p<0.05。

圖3顯示布列替尼可減弱激活後的嗜中性白血球中釋出之NE的量。用0.1-10μM布列替尼或0.1% DMSO處理嗜中性白血球5分鐘，再以NE受質與(A)fMLF、(B)MMK-1、(C)NaF或(D)LTB4共同誘導產生NE，然後用光譜儀評估所釋出的NE含量。數據以箱形圖呈現，中位數(最小值-最大值；n=6)。所有數據與DMSO+fMLF組相比後，*p<0.05。

圖4顯示布列替尼可減少PMA激活的嗜中性白血球中NET的生成。用0.1%DMSO或1-10μM布列替尼預處理人類嗜中性白血球10分鐘，然後在有或沒有10nM PMA的情況下培養。(A)使用Sytox green(一種核酸染色劑)來定量所生成的NET；(B)用抗-NE(紅色)或抗-MPO(綠色)的抗體染嗜中性白血球，然後以 共軛焦顯微鏡分析，至於DNA則是使用Hoechst 33342(藍色)檢測；(C)嗜中性白血球的掃描電子顯微鏡圖。所顯示者為代表性圖像。數據以箱形圖呈現，中位數(最小值-最大值；n=5)。所有數據與DMSO+fMLF組相比後，*p<0.05。

圖5A至5E顯示布列替尼可抑制fMLF激活的嗜中性白血球中的ERK和SFK被磷酸化的程度。預先用0.1% DMSO或10μM布列替尼來培養嗜中性白血球，然後再用0.1μM fMLF刺激。(A)SFK、(B)Akt(S473)、(C)ERK、(D)JNK和(E)p38之磷酸化和總量的免疫點墨及其相關定量數據以箱形圖來表示，中位數(最小-最大值；n=6)。所有數據與DMSO+fMLF組相比後，*p<0.05。

圖6A至6F顯示布列替尼可抑制SFKs的磷酸化。以免疫墨點法分別確定(A)Src、(B)Lyn、(C)Fgr和(D)Hck，以及下游蛋白(E)Btk和(F)Vav的磷酸化程度。

圖6G至6J顯示布列替尼會抑制多種酶的活性。以ADP-Glo激酶檢測試劑盒評估(G)Src、(H)Lyn、(I)Fgr或(J)Hck(1.5ng/mL)的酶活性，各酶係與DMSO、1-10μM布列替尼或0.1-3μM PP2單獨培養，然後再將125μM ATP(受質)添加到反應混合物中，60分鐘後再測定酶活性。數據以箱形圖呈現，中位數(最小值-最大值；n=6)。所有數據與DMSO+fMLF組相比後，*p<0.05。

圖7顯示布列替尼可抑制fMLF激活的人類嗜中性白血球的黏附和遷移。用0.1% DMSO或1-10μM布列替尼處理被Hoechst 33342標記的嗜中性白血球(10⁶cells/mL)5分鐘，然後在有或無0.1μM fMLF/1μg/mL CB下處理5分鐘。讓嗜中性白血球與bEnd.3細胞共同在37℃下培養30分鐘。於螢光顯微鏡檢下觀察並計數貼附在bEnd.3細胞上的嗜中性白血球細胞數目。(A)貼附的嗜中性白血球的量；(B)在趨化室頂部用DMSO或1-10μM布列替尼處理人類嗜中性白血球5分 鐘，然後在有或無0.1μM fMLF下再處理60分鐘，以細胞計數器測量遷移的嗜中性白血球數目。數據以箱形圖呈現，中位數(最小值-最大值；n=5)。所有數據與DMSO+fMLF組相比後，*p<0.05。

圖8顯示布列替尼可降低fMLF激活的嗜中性白血球中CD11b(整合素α_M)和CD18(整合素β₂)的表現。嗜中性白血球與0.1%DMSO或1-10μM布列替尼培養5分鐘，然後在有或無0.1μM fMLF/1μg/mL CB下處理5分鐘。以流式細胞儀檢測有FITC標記抗體其抗(A)CD11b和(B)CD18的平均螢光強度(MFI)。數據以箱須圖呈現，中位數(最小值-最大值；n=6)。所有數據與DMSO+fMLF組相比後，*p<0.05。

圖9顯示布列替尼可減輕小鼠中LPS誘導的ALI。通過腹膜內注射方式對BALB/c小鼠(每組n=6)注射載體(10%DMSO)或25mg/kg布列替尼，然後以氣管內噴灑方式噴灑LPS5小時。(A)肺外部的光學顯微鏡圖像，以及(B)H&E染色、Ly6G陽性、MPO陽性、NE陽性、IL-1β陽性、4-HNE陽性、緊連蛋白陽性和p-Vav陽性之肺切片的光學顯微鏡圖像。

圖10顯示布列替尼可減少小鼠中LPS誘導生成的NET。通過腹膜內注射方式對BALB/c小鼠(每組n=6)注射載體(10% DMSO)或25mg/kg布列替尼，然後以氣管內噴灑方式噴灑LPS5小時。(A)MPO活性和(B)在LPS噴灑後5小時測量肺組織中的總蛋白濃度。(C)DAPI陽性、Ly6G陽性和citH3陽性肺切片的免疫熒光圖像。與載體+LPS組相比後，*p<0.05；與單獨的載體組相比後，#p<0.05。

圖11布列替尼降低了LPS誘導的小鼠的死亡率。以腹腔內注射方式對BALB/c小鼠(每組n=6)注射載體(10% DMSO)或25mg/kg布列替尼，接著再 於腹膜內注射LPS。監測小鼠存活率5天。數據以箱形圖呈現，中位數(最小值-最大值；n=6)。所有數據與載體+LPS組相比後，*p<0.05，與單獨的載體組相比後，#p<0.05。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、與C兩者、以及A、B與C三者。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際 數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

1.名詞解釋

「鹽」(salt)一詞在本文中是指藥學上可接受的鹽，在合理的醫學判斷範圍內，適於與人類和低等動物的組織接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應等，並且與合理的收益/風險比相稱。藥學上可接受的鹽是本領域眾所周知的。本發明化合物的藥學上可接受的鹽包括那些衍生自合適的無機和有機酸和鹼的鹽。藥學上可接受的無毒酸加成鹽的例子是氨基與無機酸(如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或與有機酸(如乙酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的鹽，或使用本領域已知的其他方法(例如離子交換)來形成鹽。其他藥學上可接受的鹽包括己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡糖硫酸鹽、葡糖庚酸鹽，己酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、十二烷基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸 鹽、2-萘磺酸鹽、菸酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽苯丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽等。從合適的鹼衍生的鹽包括鹼金屬、鹼土金屬、銨和N⁺(C_1-4烷基)^4-鹽。代表性的鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等。其他藥學上可接受的鹽，包括無毒銨、季銨和胺陽離子在適當時使用抗衡離子例如鹵素離子、氫氧根離子、羧酸根離子、硫酸根離子、磷酸根離子、硝酸根離子、低級烷基磺酸根離子和芳基磺酸根離子所形成的鹽。

「溶劑合物」(solvate)一詞在本文是指與溶劑締合(通常通過溶劑分解反應)的化合物形式。這種物理締合可以包括氫鍵。常規溶劑包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。本文所述的化合物可以被製備，例如以結晶形式製備，並且可以被溶劑化。合適的溶劑合物包括藥學上可接受的溶劑合物並且進一步包括化學計量溶劑合物和非化學計量溶劑合物。在某些情況下，溶劑化物將能夠分離，例如，當一種或多種溶劑分子併入結晶固體的晶格中時。「溶劑合物」包括溶液相和可分離的溶劑合物。代表性的溶劑合物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。

「給藥」、「施用」(administered,administering or administration)兩名詞在本文中可互換使用，意指遞送方式，其包括但不限於，靜脈內、肌肉內、腹膜內、動脈內、顱內或皮下施用藥劑(例如，本發明的化合物或組合物)。在一些實施方案中，將本發明的化合物或其鹽、其溶劑合物配製成用於口服給藥的錠 劑。在其他實施方式中，將本發明的化合物或其鹽、其溶劑合物配製成粉劑，在使用前與合適的載體(例如緩衝液)混合，例如靜脈注射。

本文所述化合物的「有效量」(effective amount)(單獨服用或與另一種藥劑組合)是指足以引發所需生物反應的量，例如抑制炎症的活化或減輕本文所述的目標疾病或與疾病相關的症狀。如本領域普通技術人員將理解的，本文所述化合物的有效量可根據諸如所需生物學終點、化合物的藥物動力學、所治療的病症、給藥方式和患者的年齡和健康狀況。在一些實例中，有效量可以是治療有效量，其是指單獨或與其他療法組合的治療劑量，足以在病症的治療中提供治療益處或延遲發作，或盡量減少與該病症相關的一種或多種症狀。治療有效量是指改善總體治療、減少或避免病症的症狀、病徵或原因，和/或增強另一種治療劑的治療功效的量。在其他實例中，有效量可以是預防有效量。化合物的預防有效量是指單獨或與其他藥劑組合的治療劑量，其提供預防病症的預防益處。例如，化合物的預防有效量可以是足以預防或延遲病症發作的量，或是預防或延遲與病症相關的一種或多種症狀發作的量，或是防止病症或一種或多種相關症狀復發的量。它也可以是改善總體預防或增強另一種預防劑的預防功效的量。

2.本發明化合物的用途

本發明意外地發現了從台灣白芨中提取的天然3,3'-二羥基-2',6'-雙(對羥基芐基)-5-甲氧基二芐基(或布列替尼)可治療激活的人類嗜中性白血球失調。因此，布列替尼可作為候選化合物，用來開發適於治療與嗜中性白血球激活失調及趨化相關的疾病或病症(例如，急性肺損傷(ALI)等)的藥物。

因此，本發明第一方面是提供布列替尼、其鹽、溶劑合物或酯在製備適用於治療ALI的藥物中的用途。

本發明化合物可購自商業來源，或通過本領域已知的任何方法分離而得，例如Lin等人先前描述的方法(J.Nat.Prod.2016,79,1911-1921)。本化合物的生物活性分析顯示它是一種強大的抑製劑，可抑制激活的人類嗜中性白血球中超氧陰離子的產生、活性氧(ROS)的產生和去顆粒作用。此外，在黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶無細胞系統中，布列替尼也沒有細胞毒性或清除超氧化物的活性。本發明證實，布列替尼可作為候選化合物，用於開發適於治療與嗜中性白血球激活失調及趨化相關的疾病(例如，ALI)的藥物。

可以本發明化合物治療的急性肺損傷實例，包括但不限於，急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，其可以是輸血相關的肺損傷、呼吸機誘導的肺損傷、細菌誘導的肺損傷、病毒誘導的肺損傷等。

根據本發明的實施例，本發明的化合物，即3,3'-二羥基-2',6'-雙(對羥基芐基)-5-甲氧基聯芐(或稱布列替尼)，是以0.01至100毫克/公斤的量施用於患者，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.03、0.04、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98和100毫克/公斤；優選地，3,3'-二羥基-2',6'-雙(對羥基芐基)-5-甲氧基二芐基(或布列替尼)是以0.1至80毫克/公斤的量施用於患者，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80毫克/公斤。在一較佳實施方案中，布列替尼係以2毫克/公斤的量投予患者。有效量的化合物可以一劑或多劑方式投予，持續一天或數天(取決於給藥方式)。

本發明化合物還可以與合適的載體或賦形劑一起配製成製劑，用於合適的給藥途徑，例如口服、注射(parenteral)、通過吸入噴霧、外用、直腸、鼻腔、口腔、陰道或植入式的儲囊。「注射」一詞包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內和顱內注射或輸注技術。優選地，所述布列替尼以約0.1毫克至約60克的量存在於製劑中；如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、390、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990毫克、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、51、52、53、54、55、56、57、58、59、和60克。更優選地，所述布列替尼以約2毫克至約5克的量存在於製劑中，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990毫克、1、2、3、4和5克。

無菌注射製劑(injectable formulation)，例如無菌注射的水性或油性懸浮液，可根據本領域已知的技術，以合適的分散劑或潤濕劑(例如TWEEN® 80)和懸浮劑配製。無菌注射製劑，也可以是在溶在稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液，而該稀釋劑或溶劑是無毒且可注射的，例如，在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的載體和溶劑包括甘露醇、水、林格氏液和等張氯化鈉溶液。此外，無菌的固定油通常用作溶劑或懸浮介質(例如，合成的甘油單酯或甘油二酯)。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用於製備注射劑，天然藥學上可接受的油，例如橄欖油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化形式的油，也可用於製備註射劑。這些油溶液或懸浮液還可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或類似的分散劑。其他常用的界面活性劑，例如Tweens或Spans或其他類似的乳化劑或生物利用度增強劑，它們通常用於製造藥學上可接受的固體、液體或其他也可用於配製目的之劑型。

適合口服給藥的製劑可以是任何口服可接受的劑型，包括但不限於膠囊、錠劑、乳液和水性懸浮液、分散液和溶液。在口服錠劑的情況下，常用的載體包括乳糖和玉米澱粉。通常還加入潤滑劑，例如硬脂酸鎂。對於以膠囊形式口服給藥，有用的稀釋劑包括乳糖和乾玉米澱粉。當口服給予水懸浮液或乳液時，本發明的化合物可以懸浮或溶解在與乳化劑或懸浮劑組合的油相中。如果需要，可以添加某些甜味劑、調味劑或著色劑。鼻氣霧劑或吸入製劑可根據藥物製劑領域眾所周知的技術製備，並可製備為鹽水溶液、苯甲醇溶液，或使用其他合適的防腐劑、吸收促進劑以提高生物利用度、碳氟化合物和/或其他本領域已知的增溶劑或分散劑。本發明的化合物也可以以栓劑的形式用於直腸給藥。

可包括在含有本發明的化合物製劑中的藥學上可接受的載體或賦形劑，包括惰性稀釋劑、增溶劑、分散劑和/或造粒劑、表面活性劑和/或乳化劑、崩散劑、黏合劑、防腐劑、緩沖劑、潤滑劑和/或油。賦形劑如可可脂和栓劑蠟、著色劑、包衣劑、甜味劑、調味劑和加香劑也可以存在於藥物組合物中。

存在於本發明製劑中的賦形劑必須是「藥學上可接受的」，即賦形劑與藥物組合物的活性成分相容(並且優選地，能夠穩定藥物組合物)並且對被給藥的患者無害。例如，增溶劑如環糊精，可與本發明的化合物形成特定的、更易溶的錯化物，可作為藥學上可接受的賦形劑，用於將本發明的化合物遞送到患者中。其他藥學上可接受的賦形劑的實例包括膠體二氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素、十二烷基硫酸鈉和D&C Yellow #10。

本文還公開了套組(例如，藥物包裝)，其包含了本文描述的化合物和容器(例如小瓶、安瓿、瓶子、注射器和/或分配器包裝或其他合適的容器)。在一些實施例中，套組可包括第二容器，其包含藥學上可接受的賦形劑，用於稀釋 或懸浮本發明製劑。在一些實施例中，將第一容器和第二容器中提供的本發明製劑或化合物組合，以形成一個單位劑型。

在某些實施例中，如本文所述的套組用於抑制嗜中性白血球的激活和趨化失調。在某些實施例中，如本文所述的套組用於有需要的患者中，治療如本文所述的任何目標疾病(例如，ALI)。因此，本文所述的任何套組，可包括包含在其中的化合物或藥物組合物的施用說明。本發明的套組還可包括監管機構(如FDA)所要求的資訊。在某些實施例中，提供套組和說明書用於治療本文所述的疾病。在某些實施例中，提供套組和說明書用於預防本文所述的疾病。本發明的套組可以包括一種或多種本文所述額外的藥劑，當作一個單獨的組合物。

適合以本文所述方法治療的「患者」可以是人類患者(如兒科患者，例如：嬰兒、兒童或青少年，或成人患者，例如：青年、中年、老年或老年)，或非人類動物，例如：狗、貓、牛、豬、馬、綿羊、山羊、囓齒動物(例如：小鼠、大鼠)和非人類靈長類動物(例如：食蟹猴、恒河猴)。非人類哺乳動物可以是轉基因動物或基因工程動物。在一些實例中，患者是患有本文所述的目標疾病(即ARDS)、懷疑患有該疾病或有患該疾病的風險的人類患者。在一些實施例中，患者是人或非人哺乳動物，懷疑患有繼發於嗜中性白血球激活和趨化失調的病症(例如：ARDS)。

還應理解，如本文所述的化合物或製劑可以在本文所述的任何方法中與一種或多種額外的藥劑(例如，治療和/或預防活性劑)組合使用。化合物或藥劑可以和額外的藥劑組合使用，給藥給有需要的患者，以提高活性(例如：活性(如：效力和/或功效)來治療、預防本文所述的疾病，和抑制患者嗜中性白血球的 活化。還應理解的是，所採用的療法可以實現對相同病症的期望效果，和/或它可以實現不同的效果。

現在將參考以下實施例更具體地描述本發明，提供這些實施例是為了示範而非限制。雖然它們通常是可以使用的，但是可以替代地使用本領域技術人員已知的其他程序、方法或技術。

實施例

材料和方法

製備布列替尼

根據先前林等人描述的方法(Lin et al.,J.Nat.Prod.2016 79,1911-1921)提取和純化布列替尼。簡言之，在60℃下用乙醇從海島苧麻(B.formosana)的根莖中提取布列替尼，並以管柱層析法加以純化。將布列替尼(純度>98%)溶解在二甲亞碸(DMSO)作為化合物母液。細胞實驗中使用的DMSO對照濃度為0.1%，不影響測量參數。

動物

動物照護和實驗計畫書係經台灣長庚大學動物照護和使用委員會批准。此外，動物研究是根據ARRIVE(動物研究：體內實驗報告/Animal Research：Reporting of In Vivo Experiments)指南進行。所有實驗程序均符合《實驗動物照護和使用指引》(The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(國家研究委員會更新實驗室照護和使用指南/National Research Council Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory，2011)。8週齡大之無特定病原體(Specified pathogen-free,SPF)BALB/c雄性小鼠(體重：20±1g)係購自BioLASCO(台灣)。五隻小鼠共用一個帶有標準墊料的通風籠子，並可自由飲用 水和食物。所有小鼠都被飼養在SPF動物設施中，光暗循環為12-12小時。小鼠在用於實驗前使其至少先適應環境1週。

LPS誘導的ALI和死亡率模型

總共24隻BALB/c雄性小鼠被隨機分成四組(6隻小鼠/組)並分別給予：載體、布列替尼、LPS、布列替尼+LPS。讓小鼠禁食、隔夜，然後從腹腔注射50μL布列替尼(25mg/kg)或50μL載體(10% DMSO)。以甲苯噻嗪(6mg/kg)和Zoletil 50(30毫克/公斤)對小鼠進行全身麻醉，通過氣管內噴灑50μL LPS(來自大腸桿菌O111：B4；2mg/kg)或50μL 0.9%鹽水(在載體組和布列替尼組中)，來誘導小鼠產生ALI。五小時後，將小鼠犧牲後，收集小鼠的肺組織並冷凍，測定其中髓過氧化酶(myeloperoxidase,MPO)活性；或是以10%的福馬林將組織固定後，用於組織切片和免疫螢光染色。

對於LPS誘導的死亡率模型，以腹膜內注射方式對小鼠注射單次50-μL劑量的LPS(來自大腸桿菌O111：B4；5mg/kg)或0.9%鹽水(單獨載體組)。監測小鼠5天，以確定存活率。

組織切片和免疫螢光染色

將小鼠肺組織用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌後，再以10%福爾馬林固定24小時。隨後將樣品脫水，用石蠟包埋，用切片機切成3μm厚的切片，並放置在載玻片上。以蘇木精和伊紅(H&E)以及相應的抗體對這些切片進行染色。然後，以光學顯微鏡擷取影像。

對於免疫螢光染色，將切片的組織分別與抗-H3(citH3；瓜氨酸R2+R8+R17，以1：800比例稀釋)和抗-Ly6G的抗體(以1：200的比例稀釋)混合後進行培育。有Alexa Fluor 488螢光標示的抗-citH3或有Alexa Fluor 568螢光 標示的抗-Ly6G的抗-IgG之二級抗體分別以1：1000和1：500比例稀釋後使用。以共軛焦顯微鏡(LSM 510 Meta，Zeiss)擷取免疫螢光圖像。

測定髓過氧化酶(MPO)活性

將小鼠肺組織懸浮在0.5%十六烷基三甲基溴化銨緩衝液(pH 6.0)中，然後進行超聲處理使其均質化。為了評估MPO活性，將MPO受質緩衝液(含PBS、0.0005%過氧化氫和0.2mg/mL O-二茴香胺鹽酸鹽)加入均質後的組織中，並以光譜儀檢測460nm處的吸光度，然後，參照人類MPO活性標準曲線計算MPO活性。

人類嗜中性白血球之單離

本研究是經長庚紀念醫院機構審查委員會(IRB No.201601111A3)根據赫爾辛基宣言批准後始進行的。獲得受試個體書面知情同意書後，從過去2週內未服用任何藥物的20-30歲健康個體中抽取血液樣本。然後，以標準程序(包括Ficoll-Hypaque梯度離心、葡聚醣沉降和紅細胞低張溶解)，分離出嗜中性白血球。然後將分離出來的嗜中性白血球胞懸浮在不含Ca²⁺的HBSS(pH 7.4)中，並儲存在4℃直至使用。

測量細胞外超氧陰離子量

通過鐵細胞色素c的減少，來評估激活的嗜中性白血球所產生的細胞外超氧陰離子量。讓嗜中性白血球(6×10⁵cells/mL)與Ca²⁺(1mM)和鐵細胞色素c(0.5mg/mL)在37℃下培養後，再與0.1% DMSO或0.3-10μM布列替尼培養5分鐘。用細胞鬆弛素B(cytochalasin B,CB，1或2μg/mL)對細胞進行預處理3分鐘，然後用fMLF、MMK-1或氟化鈉(NaF)刺激，或直接用佛波醇-12-肉荳蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)使細胞激活。使用光譜 儀(U-3010，Hitachi，Tokyo，Japan)連續檢測550nm處吸光度的變化，並使用先前描述的方法(Hwang等人，2003 Mol.Pharmacol.64(6),1419-1427)計算超氧陰離子量。

測量細胞內超氧陰離子量

在37℃下使用2μM二氫羅丹明123(DHR123)標記人類嗜中性白血球(2.5×10⁶cells/mL)10分鐘，然後與DMSO或布列替尼共同培養5分鐘，接著用0.1μM fMLF/0.5μg/mL CB刺激15分鐘。以流式細胞儀檢測螢光強度，藉以評估人類嗜中性白血球的細胞內超氧陰離子量。

測量總ROS量

在96孔盤中，將人類嗜中性白血球(2×10⁶cells/mL)與6U mL^-1辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)和37.5μM魯米諾在37℃下預培養5分鐘。將細胞與DMSO或布列替尼培養5分鐘，接著用0.1μM fMLF進行刺激。隨後在96孔盤化學發光計(Tecan Infinite F200 Pro；Männedorf，瑞士)上即時檢測和分析化學發光。

測量NE的釋放量

在用1mM CaCl₂和100μM NE受質(甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-p-硝基苯胺，Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide)處理後，將人類嗜中性白血球(6×10⁵cells/mL)與DMSO或布列替尼在37℃下培養5分鐘。用fMLF/0.5μg mL-1 CB、白三烯B4(leukotriene B4,LTB4)/2μg mL^-1 CB、NaF/2μg mL^-1 CB或MMK-1/0.5μg mL^-1 CB刺激細胞10分鐘，然後以光譜儀測量405nm處吸光度的變化，來測量釋放的NE量。

測量嗜中性白血球胞外網狀結構(neutrophil extracellular trap,NET)的生成量

定量細胞外DNA的量

將重懸於含2.5μM Sytox green的HBSS中的人類嗜中性白血球(10⁶cells/mL)與DMSO或布列替尼一起培養10分鐘，並使用10nM PMA或10μg/mL LPS刺激3小時。用Tecan Infinite 200分析儀測量波長介於485-535nm間的螢光強度。

擷取NET照片

嗜中性白血球(3×10⁵cells/mL)用DMSO或布列替尼培養10分鐘，然後用10nM PMA活化2小時。用4%多聚甲醛將嗜中性白血球固定後，用5%山羊血清阻隔劑處理1小時，然後用5μg/mL抗-MPO抗體(Abcam)和5μg/mL抗-NE抗體(Merck Millipore)處理1小時。然後將這些細胞用有Alexa 488或568標記的山羊抗兔二級抗體再處理1小時。此後，用PBS洗滌細胞並用1ng/mL Hoechst 33342和ProLong Gold抗褪色試劑(Invitrogen，CA，USA)處理。分別以免疫螢光顯微鏡和掃描電子顯微鏡來觀察激活的嗜中性白血球中生成的NET。

評估嗜中性白血球之黏附度

用Hoechst 33342標記人類中性粒細胞(10⁶cells/mL)，然後再與DMSO或布列替尼一起培養5分鐘。離心後，將細胞重新懸浮並用0.1μM fMLF/1μg/mL CB活化10分鐘，然後在37℃下與與bEnd.3細胞共同培養30分鐘。用HBSS洗滌後，用4%多聚甲醛將細胞固定，並在電動倒立式顯微鏡(Olympus，日本)上檢視和定量黏附在bEnd.3細胞上的嗜中性白血球數目。

評估嗜中性白血球之遷移性

以具有3-μm過濾器(Millipore)的微趨化室來評估嗜中性白血球的趨化遷移。將用布列替尼或DMSO處理5分鐘的嗜中性白血球(5×10⁶cells/mL)置於微趨化室的頂部腔室中，並在底部腔室內加入0.1μM fMLF。在5% CO₂下培養1小時後，以MoxiZ自動細胞計數器(ORFLO)計算從頂部遷移到底部腔室的嗜中性白血球數量。

評估表面CD18和CD11b之表現

先讓嗜中性白血球(5×10⁵cells/mL)與布列替尼或DMSO一起培養5分鐘，然後與0.1μM fMLF/1μg/mL CB一起培養5分鐘，藉以激活嗜中性白血球。在4℃下以200g離心8分鐘後，將細胞重新懸浮在5%有FITC偶聯的抗-CD18或抗-CD11b抗體的牛血清白蛋白中，並在黑暗中冰15分鐘。然後用流式細胞儀來分析螢光強度。

嗜中性白血球裂解物的免疫墨點分析

嗜中性白血球與布列替尼或DMSO在37℃培養5分鐘，再用0.1μM fMLF激活30秒。通過電泳(12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)將蛋白質與嗜中性白血球裂解物分離，然後轉移到硝酸纖維素膜上。用免疫墨點法來鑑定目標蛋白，使用專一性抗-p38、抗-p-p38、抗-Akt、抗-p-Akt S473、抗-ERK、抗-p-ERK、抗-JNK、抗-p-JNK、抗-Src、抗-p-SFKs Y416、抗-p-Src Y416、抗-Lyn、抗-p-Lyn(Y396)、抗-Fgr、抗-p-Fgr(Y412)、抗-Hck、抗-p-Hck(Y410)、抗-Btk、抗-p-BtkY223、抗-Vav或是抗-p-Vav(Y174)的抗體，以及與HRP偶聯的二級抗-兔抗體(Cell Signaling Technology)。使用UVP BioSpectrum成像系統(Analytik Jena，美國)來檢測和量化訊號強度。

評估SFKs酶活性

以ADP-Glo激酶測定套組(Promega,Fitchburg,USA)並根據製造商提供的操作說明來評估SFK的激酶活性。簡言之，將SFK(Src、Lyn、Fgr或Hck)、它們的受質--125μM ATP和1-10μM布列替尼或0.1-3μM PP2添加到反應緩衝液中1小時來啟動激酶反應。ADP-Glo試劑用於終止激酶反應並去除殘留的ATP；接下來，加入將ADP轉化為ATP的激酶檢測試劑並培養30分鐘。螢光素/螢光素酶發光在Infinite 200Pro(Tecan,Switzerland)上測定。

統計數據和分析

所有數據均以箱刑圖(中位數、最小值-最大值)的形式呈現。所有實驗均採用單因子變異數分析和Dunnett多重比較檢驗。使用對數秩(Mantel-Cox)檢定分析小鼠的存活率。所有統計計算均使用GraphPad Prism軟體(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)進行。p值<0.05的差異在統計學上被認為是顯著的。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實驗例1 布列替尼的體外特性

1.1 布列替尼改善了激活的嗜中性白血球中超氧陰離子和ROS的生成

在本實施例中，通過監測受化學誘質激活的人類嗜中性白血球中所生成的超氧陰離子多寡，來探究布列替尼對發炎反應的調節作用。化學誘質包括甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸(formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine,fMLF)、NaF(一種G蛋白激活劑)、MMK-1(一種選擇性第II型甲酰肽受體(formyl peptide receptor 2,FPR2)激動劑)、和佛波醇12-肉荳蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)。結果如圖1所示。

依據圖1結果可發現，布列替尼可改善由fMLF激活的人類嗜中性白血球產生的超氧陰離子，且此一改善情況與布列替尼的劑量成正相關(IC₅₀=0.62±0.15μM；圖1，(A))。類似地，布列替尼會減弱由其他化學誘質(包括MMK-1、氟化鈉(NaF)和PMA)激活的嗜中性白血球的超氧陰離子的釋放程度(圖1、(B)、(C)和(D))。此外，在無細胞黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶系統中，布列替尼也未表現出任何細胞毒性(圖1，(F))或ROS清除活性(圖1，(G))。

此外，透過流式細胞儀和化學發光測定來確定布列替尼是否會影響激活的嗜中性白血球中的ROS生成。依據流式細胞儀分析和魯米諾放大化學發光測定的定量結果顯示，布列替尼顯著地抑制fMLF激活的嗜中性白血球中細胞內ROS的產生，且抑制程度與布列替尼的劑量呈現正相關(圖2、(A)和(B))。

1.2 布列替尼抑制活化的人類嗜中性白血球去顆粒作用

在本實施例中，通過測量激活的嗜中性白血球中嗜中性白血球彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)的釋放，來研究布列替尼對去顆粒作用的影響，因為去顆粒作用是嗜中性白血球在發炎期間的一項重要功能。

結果顯示，布列替尼可抑制fMLF激活的人類嗜中性白血球中NE的釋放(IC50=0.53±0.07μM)，但不會抑制靜止的嗜中性白血球中的NE釋放 (圖3,(A))。此外，布列替尼可下調分別用MMK-1、NaF和LTB4激活的嗜中性白血球的NE釋放，且此下調作用與布列替尼的濃度彼此成正相關(圖3、(B)、(C)和(D))。

1.3 布列替尼減弱嗜中性白血球胞外網狀結構(NET)的形成

NET主要由顆粒蛋白、蛋白酶和包覆有組織蛋白的染色質細絲組成，在發炎性疾病和自身免疫性疾病中至關重要。為了研究布列替尼對NET形成的影響，嗜中性白血球在用PMA(10nM)和LPS(10μg/mL)活化後，再用Sytox綠試劑盒(Sytox green)加以染色。

螢光光譜測定結果顯示，布列替尼可顯著減少由PMA誘導的NET形成量(圖4，(A))。此外，免疫螢光染色顯示，在NET中可發現，有以Hoechst 33342和抗-MPO抗體、抗-NE抗體共同染色的嗜中性白血球(圖4，(B))。免疫螢光染色和掃描電子顯微鏡圖像顯示，布列替尼可有效地抑制NET的形成(圖4、(B)和(C))。

1.4 布列替尼抑制fMLF活化的嗜中性白血球中的ERK和Src家族激酶(SFK)磷酸化

眾所周知，SFKs和MAPK/ERK路徑在嗜中性白血球的去顆粒作用、呼吸爆、NET形成和遷移中扮演關鍵作用。因此，本實例探討布列替尼對嗜中性白血球中SFK、Akt、ERK、JNK和p38磷酸化的影響。

免疫墨點結果顯示，在fMLF激活的嗜中性白血球中，SFKs、Akt(S473)、ERK、JNK、p38、Src(Y416)、Lyn(Y396)、Fgr(Y412)、Hck(Y410)、Btk(Y223)和Vav(Y174)的磷酸化程度都增強了。然而，布列替尼可顯著地抑制ERK、SFKs、Src(Y416)、Lyn(Y396)、Fgr(Y412)、Hck(Y410)、Btk(Y223)和 Vav(Y174)的磷酸化，但卻不會抑制Akt、JNK、和p38之磷酸化(圖5、6A至6F)。

1.5 布列替尼抑制SFK活性

SFK是存在於嗜中性白血球中的非受體酪氨酸激酶的統稱，主要表現的蛋白為Src、Fgr、Hck和Lyn。SFKs負責形成體內發炎環境。無細胞ADP-Glo激酶測定證實，布列替尼和PP2(一種SFK的專一性抑製劑)均會抑制Src、Fgr、Hck和Lyn的激酶活性，且抑制程度與布列替尼或PP2的濃度間彼此為正相關(圖6G至6J)。

1.6 布列替尼可減少激活的人類嗜中性白血球的黏附和遷移

黏附和遷移都是發炎期間嗜中性白血球一系列驅化反應的關鍵步驟。在本實施例中，為了確認布列替尼是否會干擾黏附和遷移過程，首先用Hoechst 33342標記人類嗜中性白血球(10⁶cells/mL)，然後用布列替尼(1-10μM)進行預處理，再用fMLF刺激，然後將激活後的人類嗜中性白血球與bEnd.3細胞一同在37℃下培養30分鐘。使用螢光顯微鏡檢測並計數黏附在bEnd.3細胞上的嗜中性白血球。定量結果顯示，布列替尼可抑制fMLF激活的嗜中性白血球的黏附功能(圖7，(A))。此外，使用趨化室和細胞計數器來計算嗜中性白血球的遷移數量，發現布列替尼明顯會降低fMLF誘導的嗜中性白血球的遷移(圖7，(B))。此外，IL-8為一種可吸引嗜中性白血球的趨化因子，觀察發現IL-8所誘導的嗜中性白血球遷移，也會被布列替尼抑制(數據未顯示)。

1.7 布列替尼會降低激活的嗜中性白血球中Mac-1的表現

Mac-1是一種補體受體，由CD11b(整合素α_M)和CD18(整合素β₂)組成，在發炎期間會促進白血球驅化。因此，CD11b和CD18會表現在嗜中性 白血球上的表面，通過流式細胞儀分析，結果顯示布列替尼會顯著減弱fMLF激活的人類嗜中性白血球中CD11b和CD18的表現量(圖8)。此外，布列替尼也會抑制人類嗜中性白血球中IL-8誘導的CD11b表現量(數據未顯示)。

實驗例2 布列替尼會減輕脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠急性肺損傷(ALI)和死亡率

本實施例探討了布列替尼在體內的抗炎作用。為此，BALB/c小鼠，通過腹腔注射給藥方式給予布列替尼(25mg/kg)或DMSO，然後，氣管內噴灑LPS 5小時。肺的外部照片和HE染色的組織病理切片顯示，LPS會誘導組織產生出血和紅斑、肺泡間隔增厚、以及形成肺間質水腫(圖9)。此外，在LPS給藥後觀察到炎性MPO和Ly6G陽性細胞(嗜中性白血球的特異性標誌物)、蛋白酶釋放(NE)、細胞激素產生(IL-1β)、氧化壓力誘導的脂質過氧化(4-HNE)和血管穿透性(緊連蛋白)的浸潤。在布列替尼治療組中，肺結構的扭曲得到顯著抑制。此外，布列替尼也會減弱LPS活化的Vav磷酸化(p-Vav)(圖9)。

小鼠肺組織中的MPO活性和總蛋白水平代表肺水腫的嚴重程度，其在對照組中顯著增加，但在布列替尼治療組中則出現顯著性的改善(圖10，(A)和(B)))。此外，在布列替尼治療後，LPS誘導的NET形成(Ly6G⁺citH3⁺細胞積累)量也顯著地下降(圖10，(C))。

在LPS處理過的小鼠中，進一步觀察到布列替尼會提高小鼠存活率。對BALB/c小鼠注射LPS(5mg/Kg)，並監測它們的存活率5天。對照組中的所有小鼠均在2天內死亡，而每隻經布列替尼治療的小鼠(25mg/Kg)的存活時間則被顯著地延長(對數秩測試，p=0.0085；圖11)。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

Claims (6)

1. 一種布列替尼的用途，其適於用來製備一罹患急性肺損傷之患者的治療藥物。
2. 如請求項1所述之用途，其中該布列替尼於該治療藥物中的含量介於0.1毫克到60克間。
3. 如請求項1所述之用途，其中該急性肺損傷是急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。
4. 如請求項3所述之用途，其中該ARDS是輸血相關的肺損傷、呼吸機誘導的肺損傷、細菌誘導的肺損傷或病毒誘導的肺損傷。
5. 如請求項1所述之用途，其中該患者是一種哺乳類動物。
6. 如請求項5所述之用途，其中該患者是一人類。

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