CN115372501A - 一种浙贝母或湖北贝母对照提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种浙贝母或湖北贝母对照提取物的制备方法，包括分别对多批浙贝母或湖北贝母药材粉末进行多次低温提取、低温浓缩、低温干燥得到不同批次的浙贝母或湖北贝母提取物，然后对不同批次的浙贝母或湖北贝母提取物进行调配，得到浙贝母或湖北贝母对照提取物。本发明的浙贝母或湖北贝母对照提取物的制备方法操作简便、成本低、重复性好且提取率高；用此制备方法制备浙贝母或湖北贝母对照提取物，保证了不同批次的浙贝母或湖北贝母对照提取物的一致性，而且其性状稳定、均匀且便于使用；采用本发明的浙贝母或湖北贝母对照提取物的制备方法最终得到的对照提取物薄层色谱指纹图谱、HPLC指纹图谱与对应原药材一致。

Description

一种浙贝母或湖北贝母对照提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中药质量控制技术领域，特别是涉及一种浙贝母或湖北贝母对照提取物及其制备方法和应用。
背景技术
现行中药质量控制模式基本上是沿着天然药物化学的发展，对中药某一种或几种有效成分为目标的分析方法和既有定性又可定量的质量标准的构思，参照国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制的模式，并借助文献报道建立相应的简单理化鉴别，再发展到以光谱、色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。
每一味中药材都是多成分的综合体，这决定了其特有的整体性和模糊性，也表明以药材中一两个甚至几个成分作为药材质量的评价方法存在很大的局限性。1990版《中国药典》增加了对照药材的薄层色谱鉴别，使得中药及中成药的鉴别有了很大的进展。目前中药和国外的草药越来越重视多成分或多组分的检测，例如德国银杏叶提取物的质量控制。指纹图谱的分析方法，可以从整体上对药材进行质量控制，现在仍然有很大的研究价值。
目前中国药典在控制药材质量方面有两种“对照品”，化学对照品和中药对照药材。其中化学对照品可用于药材的定性鉴别和定量分析，中药对照药材则用于显微鉴别和薄层鉴别。然而，化学对照品和中药对照药材在中药质量控制上都有其局限性。这种局限性表现在，一、中药中化学成分多样化，单一或者几个化合物并不能反映药材的全貌，而现有的标准往往有很多漏洞，以次充好的现象时有发生；二、中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致，而且只能用于定性鉴别，无法反映药材成分含量的高低。
中药对照提取物是用中药材制备的性状及成分稳定，可以用于定性或者定量分析的提取物，谢培山先生对中药对照提取物提出了四个基本要求(ASCS)，也是对照提取物应具备基本条件：Authenticity，药材来源可靠，具有代表性；Specificity，使用的检测方法专属性；Con-sistency，不同批次对照提取物应保持一致；Stability，性状稳定、均匀、便于使用。运用高效薄层色谱指纹图谱以及高效液相指纹图谱等方法，可以用于药材的定性鉴别，经过外标法标化的对照提取物，可以进一步用来半定量及定量分析检测。中药对照提取物将对中药质量控制有重要的意义。
发明内容
鉴于此，有必要提供一种浙贝母或湖北贝母对照提取物及其制备方法和应用。本发明提供了一种浙贝母或湖北贝母对照提取物的制备方法，该方法操作简便、成本低、重复性好且提取率高；本发明还提供了利用浙贝母或湖北贝母对照提取物的制备方制备的浙贝母或湖北贝母对照提取物，制备的浙贝母或湖北贝母对照提取物一致性好、性状稳定、均匀且便于使用，能够反映药材的全貌。
本发明一方面提供了一种浙贝母或湖北贝母对照提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
步骤一、乙醇提取，所述乙醇提取包括如下步骤：
a)取浙贝母或湖北贝母药材粉末与乙醇混合，闪提后过滤，得到滤液1和滤渣1；
b)将滤渣1重复步骤a)操作，得到滤液2和滤渣2，所得滤渣2再重复步骤a)操作，以此类推步骤b)共重复步骤a)进行N次操作，得到滤液N+1和滤渣N+1；
c)将滤液1～(N+1)合并得提取液1，将提取液1低温浓缩得到浙贝母或湖北贝母干膏；
步骤二、制备浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏：将步骤一得到的浙贝母或湖北贝母干膏，溶解于水，得到浙贝母或湖北贝母干膏的水溶液，将浙贝母干膏或湖北贝母的水溶液过大孔树脂柱，先用水冲洗、再用乙醇溶液冲至无色，合并乙醇溶液得到浙贝母或湖北贝母粗提取物溶液，将浙贝母或湖北贝母粗提取物溶液低温浓缩去除乙醇后得到浙贝母粗提取物干膏；
步骤三、制备浙贝母或湖北贝母提取物：将步骤二得到的浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏溶解于乙醇，得到浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏的乙醇溶液，再加入辅料，低温干燥过筛得到浙贝母或湖北贝母提取物；
步骤四、调配：将不同批次的浙贝母或湖北贝母提取物进行调配，得到浙贝母或湖北贝母对照提取物。
上述制备过程中的低温浓缩、低温干燥所采取的温度为20℃-60℃。
将不同批次的浙贝母或湖北贝母提取物进行调配，可以理解的是至少有十五批次的浙贝母或湖北贝母提取物进行调配或勾兑。
优选地，上述步骤一中8≥N≥0，且N为整数。
优选地，上述步骤一中的N为4。
优选地，上述步骤一中浙贝母或湖北贝母粉末与乙醇的重量体积比为1:5～1:50，所述的重量体积比的单位为g/mL。
更优选地，上述步骤一中的浙贝母粉末与乙醇的重量体积比为1：5。
优选地，上述步骤一中的乙醇的浓度为50％～95％。
更优选地，上述步骤一中的乙醇的浓度为95％。
优选地，上述步骤一中的闪提时间为1～3min，功率为100W～3kW。
更优选地，上述步骤一中的闪提时间为2min，功率为2000W。
优选地，上述步骤一中的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。
更优选地，上述步骤一中的过滤是用中速滤纸过滤。
优选地，上述步骤二中浙贝母或湖北贝母干膏与水的重量体积比1:2-1:50，所述的重量体积比的单位为g/mL。
更优选地，上述步骤二中浙贝母或湖北贝母干膏与水的重量体积比1:5。
优选地，上述步骤二中浙贝母干膏或湖北贝母与D101大孔树脂的的重量比1:3-1:50。
更优选地，上述步骤二中浙贝母或湖北贝母干膏与D101大孔树脂的的重量比1:5。
优选地，上述步骤二中乙醇的浓度为50％～95％。
更优选地，上述步骤二中乙醇的浓度为95％。
优选地，上述步骤三中的浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏与乙醇的重量体积比为1:5～1:50。所述的重量体积比的单位为g/mL，所述酒精的浓度为95％。
优选地，上述步骤三中的浙贝母粗提取物干膏与乙醇的重量体积比为1:5。
优选地，上述辅料的重量为浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏重量的20％～60％。
优更选地，上述辅料的重量为浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏重量的40％。
优选地，上述辅料为微粉硅胶。
优选地，上述步骤三低温干燥后是过90～200目筛网过滤。
更优选地，上述步骤三低温干燥后是过110目筛网。
据优选地，上述步骤三和步骤四之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的浙贝母或湖北贝母提取物进行检测的调配前处理步骤。
本发明第二方面提供了一种浙贝母或湖北贝母对照提取物，所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物通过上面所述的制备方法获得。
优选地，上述的浙贝母或湖北贝母对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致。
优选地，上述的浙贝母或湖北贝母对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材在贝母素甲、贝母素乙的位置处的图谱一致。
优选地，上述的浙贝母或湖北贝母对照提取物含有的主要物质包含贝母素甲、贝母素乙。
本发明第三方面提供了上述的浙贝母或湖北贝母对照提取物在对应药材或对应中药制剂的鉴别，或在对应药材/含对应药材有效成分的药材或对应中药制剂的质量控制中的应用。
优选地，上述药材或中药制剂的鉴别，或在对应药材或对应中药制剂的鉴别，或在对应药材/含对应药材有效成分的药材或对应中药制剂的质量控制的方法为：将上面所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别。
优选地，上述薄层色谱法和/或高效液相色谱法是对浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂中的主要成分进行检测，所述的主要成分包含贝母素甲、贝母素乙。
优选地，上述浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂以薄层色谱法进行检测时，需要将浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂配置成溶液再进行检测，其中浙贝母或湖北贝母对照提取物溶液的配置方法为：将上面所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物加甲醇，配置成浓度为5mg/mL-30mg/mL的浙贝母或湖北贝母对照提取物甲醇溶液，过0.12—0.32μm滤膜即得浙贝母或湖北贝母对照提取物溶液，所述甲醇浓度为100％。
优选地，上述浙贝母或湖北贝母对照提取物甲醇溶液浓度为20mg/mL；所述滤膜为0.22μm。
进一步的，所述薄层色谱法中待检产品溶液配制方法为：取待检产品过四号筛后称取2～5g，加入2mL～10mL浓氨水，再加入20mL-100mL 95％乙醇，超声30～60min，功率为100W～3kW后用中速滤纸或者2000目筛网过滤，80℃-100℃水浴挥去乙醇，残渣加乙醇定容至2-20mL，过0.12-0.32μm滤膜即得待检产品溶液；优选称取待检产品2.5g，加入2mL浓氨水，再加入乙醇20mL，超声60min，功率为500w，中速滤纸过滤，100℃水浴挥去乙醇，残渣定容至2mL，过0.22μm滤膜，即得待检产品溶液。
优选地，上述薄层色谱法的检测条件为：
薄层板：HPTLC G60预制板；
点样：2μl，条带状点样长8mm；
薄层板的干燥：点样后的薄层板置于真空干燥箱干燥30min，保证薄层板的干燥；
展开剂：乙酸乙酯：甲醇：三乙胺：水＝17:1:1:0.5；
展开：8.5cm，控制湿度65％-75％；
检视：喷以10％硫酸乙醇溶液，置薄层加热版105℃加热5min，置于UV366nm下检视；
任选的，上述浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂以高效液相色谱法进行检测时，需要将浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂配置成溶液再进行检测，其中浙贝母或湖北贝母对照提取物溶液的配置方法为：将权利要求7所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物加甲醇，配置成浓度为
2.5mg/mL-15mg/mL的浙贝母或湖北贝母对照提取物甲醇溶液，过0.12—0.32μm滤膜即得浙贝母或湖北贝母对照提取物溶液，所述甲醇浓度为100％。
优选地，上述浙贝母或湖北贝母对照提取物甲醇溶液浓度为10mg/mL；所述滤膜为0.22μm。
进一步的，所述高效液相色谱法检测中，待检产品溶液的配制方法为：取待检产品过四号筛后精密称取1g-5g，置锥形瓶中，加入2mL-10mL浓氨水，再加入20mL-60mL甲醇，密塞，称定重量，混匀，置超声1～2h，功率为100W～3kW，放冷，再称定重量，加甲醇补足失重，中速滤纸或者2000目筛网过滤，精密取续滤液10-20mL，置蒸发皿中水浴80-100℃蒸干，残渣甲醇溶解，并转移至2-5mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，过0.12-0.32μm滤膜，取续滤液即得待检产品溶液。优选精密称取待检产品2g，加入4mL浓氨水，再加入40mL甲醇超声2h，功率为1000W，用中速滤纸滤过，取滤液10mL置蒸发皿中水浴100℃蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，即得待检产品溶液，所述甲醇浓度为100％。
优选地，上述的高效液相色谱法的检测条件：
色谱仪器：Agilent HPLC-1260高效液相色谱仪，配有美国Agilent 380-ELSD检测器；
色谱柱：Kromasil，4.6×250mm，5μm；
流动相：A-0.03％二乙胺水溶液，B-乙腈；
梯度洗脱程序：
Figure BDA0003767330080000061
检测器Agilent 380-ELSD的设置条件为：气体流速1.6SLM，蒸发器温度：90℃，雾化器温度80℃，Gain值2，Smoothing：5s，Data Rate:80Hz；流速1ml/min；进样量20μl；柱温25℃；运行时间：65min。
本发明具有以下有益效果：
本发明的浙贝母或湖北贝母对照提取物的制备方法采用了提取、制备浙贝母提取物和调配的步骤，操作简便、成本低、重复性好且提取率高。用此制备方法制备得到的浙贝母对照提取物因是不同批次的提取物进行调配而成，克服了因中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致的缺陷，从而保证了不同批次的浙贝母或湖北贝母对照提取物的一致性；保证了制备全过程的低温控制，有效防止了有效成分的变化；其性状稳定、均匀且便于使用；采用本发明的浙贝母或湖北贝母对照提取物的制备方法最终得到的对照提取物薄层色谱指纹图谱、HPLC指纹图谱与对应药材一致。
本发明还提供了药材或中药制剂的鉴别方法，或药材/含药材有效成分的药材或中药制剂的质量控制中的应用方法，可以对药材或中药制剂进行定性鉴别。
附图说明
图1是针对以浙贝母对照药材为参照物质对浙贝母原料药材进行薄层色谱法检测得到的高效薄层色谱图。1为对照品,由下至上分别为贝母素甲和贝母素乙，2对应为浙贝母对照药材，3-17依次对应浙贝母原料药材：浙贝母原料药材1、浙贝母原料药材2、浙贝母原料药材3、浙贝母原料药材4、浙贝母原料药材5，浙贝母原料药材6、浙贝母原料药材7、浙贝母原料药材8、浙贝母原料药材9、浙贝母原料药材10、浙贝母原料药材11、浙贝母原料药材12、浙贝母原料药材13、浙贝母原料药材14、浙贝母原料药材15。
图2是针对以湖北贝母对照药材为参照物质对湖北贝母原料进行薄层色谱法检测得到的高效薄层色谱图。1为对照品,由下至上分别为贝母素甲和贝母素乙，2对应为湖北贝母对照药材，3-17依次对应湖北贝母原料药材：湖北贝母原料药材1、湖北贝母原料药材2、湖北贝母原料药材3、湖北贝母原料药材4、湖北贝母原料药材5，湖北贝母原料药材6、湖北贝母原料药材7、湖北贝母原料药材8、湖北贝母原料药材9、湖北贝母原料药材10、湖北贝母原料药材11、湖北贝母原料药材12、湖北贝母原料药材13、湖北贝母原料药材14、湖北贝母原料药材15。
图3是针对以浙贝母对照药材为参照物质对浙贝母原料药材进行HPLC检测得到的HPLC叠加图。S1对应为浙贝母对照药材，S2-S16依次对应浙贝母原料药材：浙贝母原料药材1、浙贝母原料药材2、浙贝母原料药材3、浙贝母原料药材4、浙贝母原料药材5，浙贝母原料药材6、浙贝母原料药材7、浙贝母原料药材8、浙贝母原料药材9、浙贝母原料药材10、浙贝母原料药材11、浙贝母原料药材12、浙贝母原料药材13、浙贝母原料药材14、浙贝母原料药材15。
图4是针对以湖北贝母对照药材为参照物质对湖北贝母原料药材进行HPLC检测得到的HPLC叠加图。S1对应为湖北贝母对照药材，S2-S16依次对应湖北贝母原料药材：湖北贝母原料药材1、湖北贝母原料药材2、湖北贝母原料药材3、湖北贝母原料药材4、湖北贝母原料药材5，湖北贝母原料药材6、湖北贝母原料药材7、湖北贝母原料药材8、湖北贝母原料药材9、湖北贝母原料药材10、湖北贝母原料药材11、湖北贝母原料药材12、湖北贝母原料药材13、湖北贝母原料药材14、湖北贝母原料药材15。
图5是本发明浙贝母或湖北贝母对照提取物制备流程图。
图6为浙贝母对照提取物利用高效液相色谱法测定得到指纹图谱与浙贝母原料药材的共有模式图谱叠加图，ERS对应浙贝母对照提取物，R为浙贝母原料药材共有模式。
图7为湖北贝母对照提取物利用高效液相色谱法测定得到指纹图谱与湖北贝母原料药材的共有模式图谱叠加图，ERS对应湖北贝母对照提取物，R为湖北贝母原料药材共有模式。
图8是针对以浙贝母对照提取物和浙贝母对照药材为参照物质对市售浙贝母药材进行高效薄层色谱法检测得到的高效薄层色谱图。1为对照品由下至上分别对应为贝母素甲和贝母素乙，2对应为浙贝母对照药材，3对应为浙贝母对照提取物，4-14依次对应浙贝母药材1、浙贝母药材2、浙贝母药材3、浙贝母药材4、浙贝母药材5、浙贝母药材6、浙贝母药材7、浙贝母药材8、浙贝母药材9、浙贝母药材10和浙贝母药材11的药材。
图9是针对以湖北贝母对照提取物和湖北贝母对照药材为参照物质对市售湖北贝母药材进行高效薄层色谱法检测得到的高效薄层色谱图。1为对照品由下至上分别对应为贝母素甲和贝母素乙，2对应为湖北母对照药材，3对应为湖北贝母对照提取物，4-12依次对应湖北贝母药材1、湖北贝母药材2、湖北贝母药材3、湖北贝母药材4、湖北贝母药材5、湖北贝母药材6、湖北贝母药材7、湖北贝母药材8、湖北贝母药材9。
图10是针对以浙贝母对照提取物和浙贝母对照药材为参照物质对市售浙贝母药材进行HPLC色谱法检测得到的HPLC指纹图谱叠加图。S1为浙贝母对照药材、S2为浙贝母对照提取物，S3-S13依次对应浙贝母市售药材1、浙贝母市售药材2、浙贝母市售药材3、浙贝母市售药材4、浙贝母市售药材5、浙贝母市售药材6、浙贝母市售药材7、浙贝母市售药材8、浙贝母市售药材9、浙贝母市售药材10和浙贝母市售药材11。
图11是针对以湖北贝母对照提取物和湖北贝母对照药材为参照物质对市售湖北贝母药材进行HPLC色谱法检测得到的HPLC指纹图谱叠加图。S1为湖北贝母对照药材、S2为湖北贝母对照提取物，S3-S11依次对应湖北贝母市售药材1、湖北贝母市售药材2、湖北贝母市售药材3、湖北贝母市售药材4、湖北贝母市售药材5、湖北贝母市售药材6、湖北贝母市售药材7、湖北贝母市售药材8、湖北贝母市售药材9。
具体实施方式
为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
仪器和材料：
拟用于制备对照提取物的药材:浙贝母、湖北贝母。
ATS 4薄层色谱全自动点样仪、薄层色谱双槽展开缸、和TLC visualizer薄层色谱摄像仪(瑞士，CAMAG)。
Agilent 1260series高效液相色谱仪，配有ELSD检测器(美国，Agilent 380-ELSD)。
乙腈色谱纯(Merck)
乙酸乙酯、甲醇、乙醇、三乙胺、硫酸、二乙胺均为分析纯(广州化学试剂厂)。
本发明涉及的展开剂和流动相的比例均是体积比。
浙贝母对照药材，(中国食品药品检定研究院；批号：120972-201906)；
湖北贝母对照药材，(中国食品药品检定研究院；批号：120962-201005)；
贝母素甲对照品，(中国食品药品检定研究院；批号：110750-201612，标示含量≥96.2％)；
贝母素乙对照品，(中国食品药品检定研究院；批号：110751-201712，标示含量≥97.7％)；
测试药材浙贝母和湖北贝母：
浙贝母原料药材15批采购于全国各大药材市场：浙贝母原料药材1、浙贝母原料药材2、浙贝母原料药材3、浙贝母原料药材4、浙贝母原料药材5，浙贝母原料药材6、浙贝母原料药材7、浙贝母原料药材8、浙贝母原料药材9、浙贝母原料药材10、浙贝母原料药材11、浙贝母原料药材12、浙贝母原料药材13、浙贝母原料药材14、浙贝母原料药材15。
湖北贝母原料药材15批采购于全国各大药材市场：湖北贝母原料药材1、湖北贝母原料药材2、湖北贝母原料药材3、湖北贝母原料药材4、湖北贝母原料药材5，湖北贝母原料药材6、湖北贝母原料药材7、湖北贝母原料药材8、湖北贝母原料药材9、湖北贝母原料药材10、湖北贝母原料药材11、湖北贝母原料药材12、湖北贝母原料药材13、湖北贝母原料药材14、湖北贝母原料药材15。
市售浙贝母药材11批采购于各大药店：浙贝母药材1、浙贝母药材2、浙贝母药材3、浙贝母药材4、浙贝母药材5、浙贝母药材6、浙贝母药材7、浙贝母药材8、浙贝母药材9、浙贝母药材10和浙贝母药材11。
市售湖北贝母药材9批采购于各大药店：湖北贝母药材1、湖北贝母药材2、湖北贝母药材3、湖北贝母药材4、湖北贝母药材5、湖北贝母药材6、湖北贝母药材7、湖北贝母药材8、湖北贝母药材9。
实施例1：浙贝母和湖北贝母原料药材的筛选
本实施例提供了本发明浙贝母和湖北贝母对照提取物的原料药材的筛选方法。
用高效薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以浙贝母对照药材和湖北贝母对照药材为参照物质对浙贝母和湖北贝母原料药材进行分析以及筛选。
浙贝母和湖北贝母药材购于全国各大药材市场，经鉴定为百合科植物浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)的干燥鳞茎和百合科植物湖北贝母(Fritillariahupehensis Hsiao et K.C.Hsia.)。经鉴定30批药材符合标准可以备用。
1薄层色谱
1.1样品制备
对照品溶液制备：分别称取贝母素甲和贝母素乙2.5mg，用甲醇配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜，即得对照品溶液。
对照药材和原料药材溶液：取浙贝母对照药材和原料药材粉末,过四号筛(250±9.9μm，65目，下同),各精密称定2.5g，加入2mL 25％-28％浓氨水，再加入95％乙醇20mL，超声60min，功率为500w，孔径为30-50μm的中速滤纸过滤，100℃水浴去除乙醇，残渣定容至2mL，过0.22μm滤膜，即得浙贝母对照药材溶液和浙贝母原料药材溶液；同法制备湖北贝母对照药材溶液及湖北贝母原料药材溶液。
1.2薄层色谱检测
检测条件如下：
薄层板：HPTLC G60预制板；
点样：对照品：2μl，原料药材/对照药材：5μl，条带状点样长8mm；
薄层板的干燥：点样后的薄层板置于真空干燥箱干燥30min，保证薄层板的干燥；
展开剂：乙酸乙酯：甲醇：三乙胺：水＝17:1:1:0.5；
展开：8.5cm，控制湿度65％-75％；
检视：喷以10％硫酸乙醇溶液，置薄层加热板105℃加热5min，置于UV366nm下检视；
检测结果如图1-图2所示，图1为浙贝母原料药材高效薄层色谱图，1为对照品由下至上分别为贝母素甲和贝母素乙，2对应为浙贝母对照药材，3-17依次对应浙贝母原料药材：浙贝母原料药材1、浙贝母原料药材2、浙贝母原料药材3、浙贝母原料药材4、浙贝母原料药材5，浙贝母原料药材6、浙贝母原料药材7、浙贝母原料药材8、浙贝母原料药材9、浙贝母原料药材10、浙贝母原料药材11、浙贝母原料药材12、浙贝母原料药材13、浙贝母原料药材14、浙贝母原料药材15。图2为湖北贝母原料药材高效薄层色谱图，1为对照品由下至上分别为贝母素甲和贝母素乙，2对应为湖北贝母对照药材，3-17依次对应湖北贝母原料药材：湖北贝母原料药材1、湖北贝母原料药材2、湖北贝母原料药材3、湖北贝母原料药材4、湖北贝母原料药材5，湖北贝母原料药材6、湖北贝母原料药材7、湖北贝母原料药材8、湖北贝母原料药材9、湖北贝母原料药材10、湖北贝母原料药材11、湖北贝母原料药材12、湖北贝母原料药材13、湖北贝母原料药材14、湖北贝母原料药材15。
由图1可见，各批次浙贝母原料药材和浙贝母对照药材在同一位置都可以显示相同的斑点，各批次浙贝母原料药材与浙贝母对照药材间相似度高，15批浙贝母原料药材可初步筛选为作为浙贝母对照提取物的原料。
由图2可见，各批次湖北贝母原料药材和湖北贝母对照药材在同一位置都可以显示相同的斑点，各批次湖北贝母原料药材与湖北贝母对照药材间相似度高，15批湖北贝母原料药材可初步筛选为作为湖北贝母对照提取物的原料。
2高效液相色谱
2.1样品制备
对照品溶液：称取贝母素甲和贝母素乙2mg，用甲醇配制成浓度为0.2mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜，即得对照品溶液。
对照药材和原料药材溶液：精密称浙贝母对照药材和原料药材粉末各2g，加入4mL浓氨水(质量百分比为25％-28％)，再加入40mL甲醇，密塞，称定重量，摇匀，超声2h(功率为1000W)，放至室温，再称定重量，加甲醇补足失重，用中速定性滤纸(通用电气生物科技(杭州)有限公司，型号：99-103-125)滤过，精密取滤液10mL置蒸发皿中水浴100℃蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，即得浙贝母对照药材和浙贝母原料药材溶液；同法制备湖北贝母对照药材溶液及湖北贝母原料药材溶液。
2.2高效液相色谱检测
高效液相色谱法检测条件如下：
色谱仪器：Agilent HPLC-1260高效液相色谱仪，配有ELSD检测器(美国，Agilent380-ELSD)
色谱柱：Kromasil(4.6×250mm，5μm)；
流动相：A-0.03％二乙胺水溶液，B-乙腈；
梯度洗脱程序：
Figure BDA0003767330080000121
Figure BDA0003767330080000131
检测器Agilent 380-ELSD(气体流速1.6SLM，蒸发器温度：90℃，雾化器温度80℃，Gain值2，Smmoothing：5s，Data Rate:80Hz)；流速1ml/min；柱温25℃；运行时间：65min。
高效液相色谱法检测方法：分别精密吸取对照品溶液、浙贝母对照药材溶液、浙贝母原料药材溶液、湖北贝母对照药材溶液和湖北贝母原料药材溶液各20μl，注入液相色谱仪。
高效液相色谱法检测结果：
测定，记录色谱图。
检测结果如图3-图4所示，图3为浙贝母原料药材HPLC叠加图，S1对应为浙贝母对照药材，S2-S16依次对应浙贝母原料药材：浙贝母原料药材1、浙贝母原料药材2、浙贝母原料药材3、浙贝母原料药材4、浙贝母原料药材5，浙贝母原料药材6、浙贝母原料药材7、浙贝母原料药材8、浙贝母原料药材9、浙贝母原料药材10、浙贝母原料药材11、浙贝母原料药材12、浙贝母原料药材13、浙贝母原料药材14、浙贝母原料药材15。图4为湖北贝母原料药材HPLC叠加图，S1对应为湖北贝母对照药材，S2-S16依次对应湖北贝母原料药材：湖北贝母原料药材1、湖北贝母原料药材2、湖北贝母原料药材3、湖北贝母原料药材4、湖北贝母原料药材5，湖北贝母原料药材6、湖北贝母原料药材7、湖北贝母原料药材8、湖北贝母原料药材9、湖北贝母原料药材10、湖北贝母原料药材11、湖北贝母原料药材12、湖北贝母原料药材13、湖北贝母原料药材14、湖北贝母原料药材15。
由图3可以看出，各批次浙贝母原料药材和浙贝母对照药材在相同的保留时间有相对应的色谱峰，各批次浙贝母原料药材与浙贝母对照药材间相似度较高，结合高效薄层色谱检测结果，15批浙贝母原料药材可筛选为作为浙贝母对照提取物的原料。
由图4可以看出，各批次湖北贝母原料药材和湖北贝母对照药材在相同的保留时间有相对应的色谱峰，各批次湖北贝母原料药材与湖北贝母对照药材间相似度较高，结合高效薄层色谱检测结果，15批湖北贝母原料药材可筛选为作为湖北贝母对照提取物的原料。
实施例2：浙贝母和湖北贝母对照提取物的制备
本实施例提供了本发明浙贝母和湖北贝母对照提取物的制备方法，其方法流程图如图5所示。
一：提取
选取浙贝母药材，制成粉末，药材粉末过四号筛，然后加入其质量5倍体积的的95％乙醇(即固液比为1：5(w/V，g/ml))，闪提(功率2000w，常温)提取2min后中速定性滤纸(通用电气生物科技(杭州)有限公司，型号：99-103-125)过滤，收集滤渣1和滤液1，滤渣1按相同方法再次提取四次，并将再次提取的四次收集的滤液与滤液1合并即为提取液，将提取液低温(小于45℃)浓缩溶剂即得浙贝母药材干膏。同法制备得到湖北贝母药材干膏。
二：制备粗提取物干膏
用浙贝母干膏质量5倍体积(w/V，g/ml)的水将浙贝母药材干膏溶解，得到药材干膏的水溶液，过D101大孔树脂柱，干膏与大孔树脂的重量比为1:5。上柱后先用水冲洗至无色，水溶液舍弃；再用95％乙醇溶液冲至无色，合并乙醇溶液得到浙贝母粗提取物溶液，将粗提取物溶液低温(小于45℃)去除乙醇后得到浙贝母粗提取物干膏。同法制备得到湖北贝母粗提取物干膏。
三：制备提取物
用浙贝母粗提取物干膏质量5倍体积(w/V，g/ml)的95％乙醇将浙贝母粗提取物干膏溶解，得到浙贝母粗提取物干膏的95％乙醇溶液，再加入浙贝母粗提取物干膏重量40％的微粉硅胶，混匀，用旋转蒸发仪低温(小于45℃)浓缩至干，粉碎过110目筛，得到浙贝母提取物。同法制备得到湖北贝母提取物。
多批次的浙贝母或湖北贝母药材粉末按照步骤一至步骤三的操作方法制得不同批次的浙贝母或湖北贝母提取物。
四：调配
将步骤三的15个批次的浙贝母提取物按1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1比例混合勾兑得到浙贝母对照提取物，最终产品对应浙贝母原药材比例大约为1：46(g/g)。
将步骤三的15个批次的湖北贝母提取物1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1比例混合勾兑得到湖北贝母对照提取物，最终产品对应原药材比例大约为1：61(g/g)。
调配标准为：应使最终得到的对照提取物得到的图谱与其对应的原料药材图谱一致，此调配标准中的各成分的含量的范围也是经过多次反复实验综合保持稳定性、一致性以及后面的应用等得出的最佳数据。
五：检测
将步骤四调配成的浙贝母对照提取物利用高效液相色谱法测定得到指纹图谱与浙贝母原料药材的共有模式图谱如图6，ERS对应浙贝母对照提取物，R为浙贝母原料药材共有模式。浙贝母对照提取物和浙贝母原料药材指纹图谱共有模式有很高的相似度，这说明本发明的浙贝母对照提取物能代表浙贝母药材。湖北贝母对照提取物利用高效液相色谱法测定得到指纹图谱，与湖北贝母原料药材共有模式图谱如图7，ERS对应湖北贝母对照提取物，R为湖北贝母原料药材共有模式。湖北贝母对照提取物和湖北贝母原料药材指纹图谱有很高的相似度，这说明本发明的湖北贝母对照提取物能代表湖北贝母药材。
实施例3浙贝母和湖北贝母对照提取物的性状分析
浙贝母对照提取物的性状分析
1.表观状态：实施例2得到的浙贝母对照提取物为浅黄色粉末。
2.水分测定按照2015版中国药典四部0832水分测定法项下第一法(1、容量滴定法P104)测定。检测结果为浙贝母片对照提取物含水量为1.63％。
3.一致性测试：按照实施例2的方法制备10批次浙贝母对照提取物，经测定各批薄层色谱检测图谱差异很小。因此利用本发明的浙贝母对照提取物的制备方法制备得到的浙贝母对照提取物一致性非常好。
湖北贝母对照提取物的性状分析
1.表观状态：实施例2得到的湖北贝母对照提取物为浅黄色粉末。
2.水分测定按照2015版中国药典四部0832水分测定法项下第一法(1、容量滴定法P104)测定。检测结果为浙贝母片对照提取物含水量为1.89％。
3.一致性测试：按照实施例2的方法制备10批次湖北贝母对照提取物，经测定各批薄层色谱检测图谱差异很小。因此利用本发明的湖北母对照提取物的制备方法制备得到的湖北贝母对照提取物一致性非常好。
实施例4本发明实施例2制备得到的浙贝母和湖北贝母对照提取物的应用
用薄层色谱法以及高效液相色谱法以浙贝母对照提取物和浙贝母对照药材为参照物质对市售浙贝母药材进行分析，以湖北贝母对照提取物和湖北贝母对照药材为参照物质对市售湖北贝母药材进行分析。
1薄层色谱
1.1样品制备
对照品溶液制备：分别称取贝母素甲和贝母素乙2.5mg，用甲醇配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜，即得对照品溶液。
对照提取物溶液：精密称取实施例2制备得到的浙贝母对照提取物20mg，置2mL容量瓶中，加入100％甲醇1.5ml，超声(500w)处理30分钟，放冷，用甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜即得浙贝母对照提取物溶液。同法制成湖北贝母对照提取物溶液。
对照药材和供试品药材溶液：称取浙贝母对照药材和供试品药材粉末(过四号筛)各2.5g，加入2mL浓氨水，再加入70％乙醇20mL，超声60min，功率为500w，中速滤纸过滤，100℃水浴去除乙醇，残渣定容至2mL，过0.22μm滤膜，即得浙贝母对照药材及供试品药材溶液；同法制备湖北贝母对照药材溶液和供试品药材溶液。
1.2薄层色谱检测
检测条件如下：
薄层板：HPTLC G60预制板；
点样：对照品：2μl，供试品药材/对照药材：5μl，条带状点样长8mm；
薄层板的干燥：点样后的薄层板置于真空干燥箱干燥30min，保证薄层板的干燥；
展开剂：乙酸乙酯：甲醇：三乙胺：水＝17:1:1:0.5；
展开：8.5cm，控制湿度65％-75％；
检视：喷以10％硫酸乙醇溶液，置薄层加热版105℃加热5min，置于UV366nm下检视；
检测结果如图8-图9所示，图8为市售浙贝母药材高效薄层色谱图：1为对照品由下至上分别对应为贝母素甲和贝母素乙，2对应为浙贝母对照药材，3对应为浙贝母对照提取物，4-14依次对应浙贝母药材1、浙贝母药材2、浙贝母药材3、浙贝母药材4、浙贝母药材5、浙贝母药材6、浙贝母药材7、浙贝母药材8、浙贝母药材9、浙贝母药材10和浙贝母药材11的药材。图9为市售湖北贝母药材高效薄层色谱图：1为对照品由下至上分别对应为贝母素甲和贝母素乙，2对应为湖北母对照药材，3对应为湖北贝母对照提取物，4-12依次对应湖北贝母药材1、湖北贝母药材2、湖北贝母药材3、湖北贝母药材4、湖北贝母药材5、湖北贝母药材6、湖北贝母药材7、湖北贝母药材8、湖北贝母药材9。
结果分析：由图8可知，浙贝母对照提取、浙贝母对照药材和市售浙贝母药材(浙贝母药材1-浙贝母药材11)在同一位置显示相同颜色的斑点，说明浙贝母对照药材可以替代浙对照药材用于浙贝母药材的薄层鉴别。
由图9可知，湖北贝母对照提取、湖北贝母对照药材和市售湖北贝母药材(湖北贝母药材1-湖北贝母药材9)在同一位置显示相同颜色的斑点，说明湖北贝母对照药材可以替代湖北贝母对照药材用于湖北贝母药材的薄层鉴别。
2高效液相色谱
2.1样品制备
对照品溶液：称取贝母素甲和贝母素乙2mg，用甲醇配制成浓度为0.2mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜，即得对照品溶液。
对照提取物溶液：精密称取浙贝母对照提取物20mg，用甲醇配制成浓度为10mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜，即得浙贝母对照提取物溶液。取湖北贝母对照提取物同法制成湖北贝母对照提取物溶液。
对照药材和药材供试品溶液：密称对照药材和药材粉末2g，加入4mL浓氨水，再加入40mL甲醇，密塞，称定重量，摇匀，置超声2h，功率为1000W，放冷，再称定重量，加甲醇补足失重，用中速滤纸滤过，精密取滤液10mL置蒸发皿中水浴100℃蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜，即得对照药材和药材溶液。
2.2高效液相色谱检测
高效液相色谱法检测条件如下：
色谱仪器：Agilent HPLC-1260高效液相色谱仪，配有ELSD检测器(美国，Agilent380-ELSD)
色谱柱：Kromasil(4.6×250mm，5μm)；
流动相：A-0.03％二乙胺水溶液，B-乙腈；
梯度洗脱程序：0-15min：95％A→65％A，15→25min：65％A→60％A，25→30min：60％A→30％A，30→45min:30％A→23％A，45→55min:23％A-17％A，55→60min:17％A-5％A，60→65min:5％A。
检测器Agilent 380-ELSD(气体流速1.6SLM，蒸发器温度：90℃，雾化器温度80℃，Gain值2，Smmoothing：5s，Data Rate:80Hz)；流速1ml/min；柱温25℃；运行时间：65min。
高效液相色谱法检测方法：取对照品溶液、对照药材溶液、对照提取物溶液和药材溶液各20μl，注入液相色谱仪。
高效液相色谱法检测结果：
测定，记录色谱图。
检测结果如图10-图11所示，图10为市售浙贝母药材HPLC指纹图谱叠加图，S1为浙贝母对照药材、S2为浙贝母对照提取物，S3-S13依次对应浙贝母市售药材1、浙贝母市售药材2、浙贝母市售药材3、浙贝母市售药材4、浙贝母市售药材5、浙贝母市售药材6、浙贝母市售药材7、浙贝母市售药材8、浙贝母市售药材9、浙贝母市售药材10和浙贝母市售药材11。图11为市售湖北贝母药材HPLC指纹图谱叠加图，S1为湖北贝母对照药材、S2为湖北贝母对照提取物，S3-S11依次对应湖北贝母市售药材1、湖北贝母市售药材2、湖北贝母市售药材3、湖北贝母市售药材4、湖北贝母市售药材5、湖北贝母市售药材6、湖北贝母市售药材7、湖北贝母市售药材8、湖北贝母市售药材9。
由图10可知，浙贝母对照提取、浙贝母对照药材和浙贝母市售药材(浙贝母市售药材1-浙贝母市售药材11)在相同的保留时间有相对应的色谱峰，说明浙贝母对照药材可以替代浙对照药材用于浙贝母药材的HPLC指纹图谱鉴别。
由图11可知，湖北贝母对照提取、湖北贝母对照药材和湖北贝母市售药材(湖北贝母市售药材1-湖北贝母市售药材9在相同的保留时间有相对应的色谱峰，说明湖北贝母对照药材可以替代湖北贝母对照药材用于湖北贝母药材的HPLC指纹图谱鉴别。
根据TLC及HPLC指纹图谱的结果可知，对所述浙贝母对照提取物和湖北贝母对照提取物采用薄层色谱法和HPLC色谱法检测得到的色谱图与其对应的原料药材一致，因此本发明的浙贝母对照提取物和湖北贝母对照药材可应用于药材或中药制剂的定性鉴别。

Claims (10)

1.一种浙贝母或湖北贝母对照提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤一、乙醇提取，所述乙醇提取包括如下步骤：
a)取浙贝母或湖北贝母药材粉末与乙醇混合，闪提后过滤，得到滤液1和滤渣1；
b)将滤渣1重复步骤a)操作，得到滤液2和滤渣2，所得滤渣2再重复步骤a)操作，以此类推步骤b)共重复步骤a)N次操作，得到滤液N+1和滤渣N+1；
c)将滤液1～N+1合并得提取液1，将提取液1低温浓缩得到浙贝母或湖北贝母干膏；
步骤二、制备浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏：将步骤一得到的浙贝母或湖北贝母干膏，溶解于水，得到浙贝母或湖北贝母干膏的水溶液，将浙贝母或湖北贝母干膏的水溶液过大孔树脂柱，先用水冲洗、再用乙醇溶液冲至无色，合并乙醇溶液得到浙贝母或湖北贝母粗提取物溶液，将浙贝母或湖北贝母提取物溶液低温浓缩去除乙醇后得到浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏；
步骤三、制备浙贝母或湖北贝母提取物：将步骤二得到的浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏溶解于乙醇，得到浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏的乙醇溶液，再加入辅料，低温干燥过筛得到浙贝母或湖北贝母提取物；
步骤四、调配：将不同批次的浙贝母或湖北贝母提取物进行调配，得到浙贝母或湖北贝母对照提取物；
任选地，所述的大孔树脂柱为D101大孔树脂柱。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中8≥N≥0，且N为整数；
任选的，所述N为4。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中浙贝母或湖北贝母粉末与乙醇的重量体积比为1:5～1:50，所述的重量体积比的单位为g/mL；
任选的，所述步骤一中的浙贝母粉末或湖北贝母与乙醇的重量体积比为1：5；
任选的，所述步骤一中的乙醇的浓度为50％～95％；
优选的，所述步骤一中的乙醇的浓度为95％；
任选的，所述步骤一中的闪提时间为1～3min，功率为100W～3kW；
任选的，所述步骤一中的闪提时间为2min，功率为2000W；
任选的，所述步骤一中的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤；
任选的，所述步骤一中的过滤是用中速滤纸过滤。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中浙贝母或湖北贝母干膏与水的重量体积比1:2-1:50，所述的重量体积比的单位为g/mL；
任选的，所述步骤二中浙贝母或湖北贝母干膏与水的重量体积比1:5；
任选的，所述步骤二中浙贝母或湖北贝母干膏与D101大孔树脂的的重量比1:3-1:50；
任选的，所述步骤二中浙贝母干膏或湖北贝母与D101大孔树脂的的重量比1:5；
任选的，所述步骤二中乙醇的浓度为50％～95％；
任选的，所述步骤二中乙醇的浓度为95％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏与乙醇的重量体积比为1:5～1:50，所述的重量体积比的单位为g/mL，所述乙醇的浓度为95％；
任选的，所述步骤三中的浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏与乙醇的重量体积比为1:5；
任选的，所述辅料的重量为浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏重量的20％～60％；
任选的，所述辅料的重量为浙贝母或湖北贝母粗提取物干膏重量的40％；
任选的，所述辅料为微粉硅胶；
任选的，所述步骤三低温干燥后是过90～200目筛网过滤；
任选的，所述步骤三低温干燥后是过110目筛网。
6.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三和步骤四之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的浙贝母或湖北贝母提取物进行检测的调配前处理步骤。
7.一种浙贝母或湖北贝母对照提取物，其特征在于，所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物通过权利1-6任一项所述的制备方法获得；
任选的，所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致；
任选的，所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材在贝母素甲、贝母素乙的位置处的图谱一致；
任选的，所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物含有的主要物质包含贝母素甲、贝母素乙。
8.权利要求7所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物在对应药材或对应中药制剂的鉴别，或在对应药材/含对应药材有效成分的药材或对应中药制剂的质量控制中的应用。
9.权利要求8的应用，其特征在于，所述对应药材或对应中药制剂的鉴别，或在对应药材/含对应药材有效成分的药材或对应中药制剂的质量控制的方法为：将权利要求7的浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别；
任选的，所述薄层色谱法和/或高效液相色谱法是对浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂中的主要成分进行检测，所述的主要成分包含贝母素甲、贝母素乙。
任选的，将权利要求7的浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂以薄层色谱法进行检测时，需要将浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂配置成溶液再进行检测，其中浙贝母或湖北贝母对照提取物溶液的配置方法为：将权利要求7所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物加甲醇，配置成浓度为5mg/mL-30mg/mL的浙贝母对照提取物甲醇溶液，过0.12—0.32μm滤膜即得浙贝母或湖北贝母对照提取物溶液；
任选的，所述浙贝母或湖北贝母对照提取物甲醇溶液浓度为20mg/mL；所述滤膜为0.22μm；
任选的，所述薄层色谱法的检测条件为：
薄层板：HPTLC G60预制板；
点样：2μl，条带状点样长8mm；
薄层板的干燥：点样后的薄层板置于真空干燥箱干燥30min，保证薄层板的干燥；
展开剂：乙酸乙酯：甲醇：三乙胺：水＝17:1:1:0.5；
展开：8.5cm，控制湿度65％-75％；
检视：喷以10％硫酸乙醇溶液，置薄层加热板105℃加热5min，置于UV366nm 下检视。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述将权利要求7的浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂以高效液相色谱法进行检测时，需要将浙贝母或湖北贝母对照提取物、药材或中药制剂配置成溶液再进行检测，其中浙贝母或湖北贝母对照提取物溶液的配置方法为：将权利要求7所述的浙贝母或湖北贝母对照提取物加甲醇，配置成浓度为2.5mg/mL-15mg/mL的浙贝母对照提取物甲醇溶液，过0.12—0.32μm滤膜即得浙贝母或湖北贝母对照提取物溶液；
任选的，所述浙贝母或湖北贝母对照提取物甲醇溶液浓度为10mg/mL；所述滤膜为0.22μm；
任选的，所述的高效液相色谱法的检测条件：
色谱仪器：Agilent HPLC-1260高效液相色谱仪，配有美国Agilent 380-ELSD检测器；
色谱柱：Kromasil，4.6×250mm，5μm；
流动相：A-0.03％二乙胺水溶液，B-乙腈；
梯度洗脱程序：
Figure FDA0003767330070000041
检测器Agilent 380-ELSD的设置条件为：气体流速1.6SLM，蒸发器温度：90℃，雾化器温度80℃，Gain值2，Smoothing：5s，Data Rate:80Hz；流速1ml/min；进样量20μl；柱温25℃；运行时间：65min。
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