CN109030675A - 一种巴戟天对照提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种巴戟天对照提取物，其来源于：对巴戟天药材粉末进行多次提取、浓缩、干燥，得到不同批次的巴戟天提取物，然后对不同批次的巴戟天提取物进行调配，得到巴戟天对照提取物。本发明的巴戟天对照提取物因是不同批次的提取物进行调配而成，保证了不同批次的巴戟天对照提取物的一致性；而且其性状稳定、均匀且便于使用。所述巴戟天对照提取物在应用上，是作为对照用于巴戟天及含巴戟天/巴戟天有效成分的药材或中药制剂的质量控制中，在此质量控制过程中，是将巴戟天对照提取物进行简单处理即可直接使用，操作简便，尤其在多成分含量测定时，对照提取物溶液的配制比对照品溶液的配制更加简便，不仅可以对药材或中药制剂进行定性鉴别，而且还可以用于半定量甚至定量分析。

Description

一种巴戟天对照提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药质量控制技术领域，特别是涉及一种巴戟天对照提取物的制备方法。

背景技术

现行中药质量控制模式基本上是沿着天然药物化学的发展，对中药某一种或几种有效成分为目标的分析方法和既有定性又可定量的质量标准的构思，参照国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制的模式，并借助文献报道建立相应的简单理化鉴别，再发展到以光谱、色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。每一味中药材都是多成分的综合体，这决定了其特有的整体性和模糊性，也表明以药材中一两个甚至几个成分作为药材质量的评价方法存在很大的局限性。1990版《中国药典》增加了对照药材的薄层色谱鉴别，使得中药及中成药的鉴别有了很大的进展。目前中药和国外的草药越来越重视多成分或多组分的检测，例如德国银杏叶提取物的质量控制。指纹图谱的分析方法，可以从整体上对药材进行质量控制，现在仍然有很大的研究价值。目前中国药典在控制药材质量方面有两种“对照品”，化学对照品和中药对照药材。其中化学对照品可用于药材的定性鉴别和定量分析，中药对照药材则用于显微鉴别和薄层鉴别。然而，化学对照品和中药对照药材在中药质量控制上都有其局限性。首先，中药中化学成分多样化，单一或者几个化合物并不能反映药材的全貌，而现有的标准往往有很多漏洞，以次充好的现象时有发生。中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致，而且只能用于定性鉴别，无法反映药材成分含量的高低。

中药对照提取物是用中药材制备的性状及成分稳定，可以用于定性或者定量分析的提取物，谢培山先生对中药对照提取物提出了四个基本要求(ASCS)，也是对照提取物应具备几个基本条件：Authenticity，药材来源可靠，具有代表性；Specificity，使用的检测方法专属性；Con-sistency，不同批次对照提取物应保持一致；Stability，性状稳定、均匀、便于使用。运用高效薄层色谱指纹图谱以及高效液相指纹图谱等方法，可以用于药材的定性鉴别，经过外标法标化的对照提取物，可以进一步用来半定量及定量分析检测。中药对照提取物将对中药质量控制有重要的意义。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种批次一致性好、性状稳定、均匀且便于使用的巴戟天对照提取物，本发明还提供了所述巴戟天对照提取物的制备方法和应用，即将所述巴戟天对照提取物用于巴戟天及含巴戟天/巴戟天有效成分的药材或中药制剂的质量控制中。

本发明第一方面提供了一种巴戟天对照提取物，其来源于：对不同批次的巴戟天药材粉末进行多次提取，得到不同批次的巴戟天提取物，然后对不同批次的巴戟天提取物进行调配，得到巴戟天对照提取物。

优选的，上述巴戟天对照提取物中耐斯糖的含量不得低于2.00％且不高于8.00％。

优选的，所述述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致。

更优选的，对所述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法和/或采用高效液相色谱法检测得到的色谱图中的耐斯糖与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致。

更优选的，对所述巴戟天对照提取物采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在蔗果3糖、蔗果5糖、蔗果6糖、蔗果7糖、蔗果8糖、蔗果9糖、蔗果10糖位置处的色谱峰分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致。

本发明第二方面提供了一种巴戟天对照提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、提取：取巴戟天药材粉末与水混合，提取后过滤，得到滤液1和滤渣1，将滤液1浓缩得到巴戟天粗提物；

步骤二、醇沉：取巴戟天粗提物，加入乙醇，沉淀，过滤，得到滤液2和滤渣2，并将滤液2干燥得到巴戟天精提物；

步骤三、制备巴戟天提取物：将所得巴戟天精提取，溶解于水，得到巴戟天精提物的水溶液，再加入辅料，干燥过筛得到巴戟天提取物；

步骤四、调配：将不同批次的巴戟天提取物进行调配，得到巴戟天对照提取物。

优选的，步骤一至步骤三中的提取，浓缩和干燥采用低温处理的方式进行。

更优选的，所述的低温为20℃～60℃。

优选的，所述步骤三与步骤四之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的巴戟天提取物的耐斯糖进行检测的步骤。

优选的，所述步骤一中将滤渣1按照步骤一的提取方法经过N次提取，并将N次提取的滤液与滤液1合并即为提取液，并将提取液浓缩得到巴戟天粗提物；其中6≥N≥0，且N为整数。

更优选的，所述N为3。

优选的，所述步骤一中的巴戟天药材粉末与水的重量体积比为1:5～1:45。

更优选的，，所述步骤一中的巴戟天药材粉末重量与水的体积比为1：8。

优选的，所述步骤一中的提取方式为：超声提取。

更优选的，所述步骤一中的超声提取时间为1～120min。

更优选的，所述步骤一中的超声提取时间为60min。

优选的，所述步骤一中的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。

更优选的，所述步骤一中的过滤是用中速滤纸。

优选的，所述步骤二中巴戟天粗提物含醇量为：40％～80％。

更优选的，所述步骤二中巴戟天粗提物含醇量为：60％。

优选的，所述步骤三中巴戟天精提物与水的重量体积比：1：2～1:20。

优选的，所述步骤三中所用辅料是微粉硅胶和/或药用淀粉。

更优选的，所述辅料为微粉硅胶。

优选的，所述步骤三是在巴戟天精提物的水溶液中加入其重量的10％～50％的微粉硅胶。

更优选的，所述步骤三是在巴戟天精提物的水溶液中加入其重量的30％的微粉硅胶。

优选的，所述步骤三干燥后是过90～200目筛网过滤。

更优选的，所述步骤三干燥后是过110目筛网过滤。

优选的，所述步骤三与步骤四之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的巴戟天提取物的耐斯糖进行检测的步骤。

优选的，所述步骤四中调配的标准为：应使最终得到的对照提取物中耐斯糖不得低于2.00％且不高于8.00％。

优选的，对所述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致。

更优选的，对所述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法检测得到的色谱图中的耐斯糖分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致。

本发明第三方面提供了上述的巴戟天对照提取物在药材或中药制剂的鉴别中的应用。

优选的，所述的鉴别用于对巴戟天对照提取物在巴戟天或含巴戟天/巴戟天有效成分的药材或中药制剂的质量控制中。

优选的，所述应用采用的方法如下：将权利要求1所述的巴戟天对照提取物作为对照物，与药材或中药制剂一起经过薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，根据检测结果对比判断。

优选的，所述薄层色谱法和/或高效液相色谱法是对巴戟天对照提取物和药材或中药制剂中的耐斯糖进行检测。

优选的，所述的薄层色谱法检测条件为：

薄层板：TLC G60预制板(Merck)；

点样：2μl，条带状点样长8mm；

展开剂：乙酸乙酯:甲醇:水:冰乙酸＝8:3:1.8:3；

展开方式：于双槽展开缸一侧加展开剂，预平衡15分钟，展开上行8.5cm，40℃加热干燥2h；双槽展开缸一侧加展开剂，预平衡15分钟，再次上行展开8.5cm，50℃干燥15分钟后，放冷；

检视：浸以3％硫酸乙醇溶液，薄层板置薄层加热板上105℃加热8分钟，放冷10分钟，置于紫外灯(366nm)下检视荧光色谱图像。

优选的，所述的高效液相色谱法检测条件为：

色谱仪器：Agilent 1260series高效液相色谱仪，配有ELSD检测器(美国，AgilentTechnologies)

色谱柱：Merck公司-HILIC柱(150×2.1mm，5μm)；

流动相：A-水，B-乙腈；

梯度洗脱程序：0-10min：10％A→18％A，10-30min：18％A→35％A，30-40min：35％A→35％A；

0-10min：90％B→82％B，10-30min：82％B→65％B，30-40min：65％B→65％B；

流速0.4ml/min；进样量5μl；柱温30℃；蒸发器温度50℃；雾化器温度70℃，氮气流速1.4SLM；运行时间：50min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的巴戟天对照提取物因是不同批次的提取物进行调配而成，克服了因中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致的缺陷，从而保证了不同批次的巴戟天对照提取物的一致性；保证了制备全过程的低温控制，有效防止了有效成分的变化；其性状稳定、均匀且便于使用。所述巴戟天对照提取物在应用上，是将巴戟天对照提取物经过定量分析后，作为对照用于巴戟天及含巴戟天/巴戟天有效成分的药材或中药制剂的质量控制中，在此质量控制过程中，是将巴戟天对照提取物进行简单处理即可直接使用，操作简便，尤其在多成分含量测定时，对照提取物溶液的配制比对照品溶液的配制更加简便，不仅可以对药材或中药制剂进行定性鉴别，而且还可以用于半定量甚至定量分析。

附图说明

图1是针对以化学对照品和巴戟天对照药材为参照物质对巴戟天原料药材进行薄层色谱法得到的薄层色谱图。其中标号S的色谱带对应为对照品耐斯糖，8对应为巴戟天对照提取物，1-7依次对应巴戟天原料药材1、巴戟天原料药材2、巴戟天原料药材3、巴戟天原料药材4、巴戟天原料药材5、巴戟天原料药材6和巴戟天原料药材7，8对应为巴戟天对照药材。

图2是针对以化学对照品和巴戟天对照药材为参照物质对巴戟天原料药材进行高效液相色谱法得到的HPLC指纹图谱叠加图，从上往下2-8分别对应巴戟天原料药材1、巴戟天原料药材2、巴戟天原料药材3、巴戟天原料药材4、巴戟天原料药材5、巴戟天原料药材6和巴戟天原料药材7，1对应为巴戟天对照药材，S1-S8对应化学对照品，R对应共有模式。

图3为巴戟天对照提取物制备流程图。

图4为巴戟天对照提取物与巴戟天提取原料药材共有模式叠加图，S1-S8对应化学对照品，ERS对应巴戟天对照提取物，R为巴戟天原料药材共有模式。

图5是针对以化学对照品、巴戟天对照药材和巴戟天对照提取物为参照物质对市售药材进行薄层色谱法得到的薄层色谱图。其中标号S的色谱带对应为对照品耐斯糖，10对应为巴戟天对照药材，11对应为巴戟天对照提取物，1-9依次对应巴戟天1、巴戟天2、巴戟天3、巴戟天4、巴戟天5、巴戟天6、巴戟天7、巴戟天8和巴戟天9。

图6是巴戟天药材及对照提取物高效薄层色谱图数码扫描图谱，1-9依次对应巴戟天1、巴戟天2、巴戟天3、巴戟天4、巴戟天5、巴戟天6、巴戟天7、巴戟天8和巴戟天9，10对应为巴戟天对照药材，11对应为巴戟天对照提取物。

图7是针对以化学对照品，巴戟天对照药材和巴戟天对照提取物为参照物质对市售药材进行高效液相色谱法得到的HPLC指纹图谱叠加图，从上往下3-11依次对应巴戟天1、巴戟天2、巴戟天3、巴戟天4、巴戟天5、巴戟天6、巴戟天7、巴戟天8和巴戟天9。1为巴戟天对照提取物，2对应为巴戟天对照药材，S对应化学对照品。

术语解释：

精密称定：指称取重量准确至所取重量的千分之一。

称定：称取重量准确至所取重量的百分之一。

多次：1-7次。

鉴别：巴戟天对照提取物作为对照品，对药材或中药制剂含有巴戟天有效成分进行定性定量分析

质量控制：巴戟天对照提取物作为对照品，对巴戟天及含巴戟天/巴戟天有效成分的药材或中药制剂定性和定量分析，通过分析可对待测样品是否是巴戟天，和/或是含巴戟天/巴戟天有效成分的药材或中药制剂进行判断，从而可实现对药材的质量进行把控。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中使用到的仪器和材料的来源如下：

拟用于制备对照提取物的药材：

巴戟天药材购于全国各大药材市场，经谢培山教授鉴定为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis Hort的干燥根。

Linomat 5薄层色谱半自动点样仪、ATS 4薄层色谱全自动点样仪、薄层色谱双槽展开缸、Chromatogram Immersion Device III色谱显色用浸渍槽和TLC visualizer薄层色谱摄像仪(瑞士，CAMAG)。

Agilent 1260series高效液相色谱仪，配有ELSD检测器(美国，AgilentTechnologies)。

甲醇、冰乙酸、磷酸、乙酸乙酯均为分析纯(广州化学试剂厂)。

乙腈为色谱纯(Merck KGaA)。

纯净水。

对照品：耐斯糖，标示纯度≥99％，(中国食品药品检定研究院；111891-201403)；

对照品：蔗果3糖(日本和光纯药工业株式会社，295-64111)、蔗果5糖(日本和光纯药工业株式会社，299-64131)；蔗果6糖、蔗果7糖、蔗果8糖、蔗果9糖、蔗果10糖为实验室自制；

巴戟天对照药材，(中国食品药品检定研究院；121163-201606)；

测试药材巴戟天：

巴戟天原料药材7批采购于全国各大药材市场，巴戟天原料药材1-7；

巴戟天药材9批采购于广州各大药店及药材市场，巴戟天1-9；

实施例1：巴戟天原料药材的筛选

本实施例提供了巴戟天对照提取物的原料药材的筛选方法。

用薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以化学对照品和巴戟天对照药材为参照物质对巴戟天原料药材进行分析以及筛选。

巴戟天药材购于全国各大药材市场，经谢培山教授根据中国药典所述鉴定为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis Hort的干燥根。经鉴定7批药材符合标准可以备用。

1薄层色谱

1.1样品制备

化学对照品的溶液：取耐斯糖化学对照品适量，用50％甲醇配制成0.5mg/ml的溶液；

巴戟天原料药材溶液的制备：取巴戟天原料药材粉末，过二号筛(850±29μm，24目)，精密称定2g，置150ml具塞锥形瓶中，加入水溶液80ml，称定重量，水浴回流60分钟后，以中速滤纸过滤(孔径30～50μm)，残渣以5ml水洗涤2次，合并滤液和洗涤液，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度100ml，摇匀，取上清液过0.22μm的滤膜，即得巴戟天原料药材溶液。巴戟天原料药材买自全国各大药材市场，分别为巴戟天原料药材1、巴戟天原料药材2、巴戟天原料药材3、巴戟天原料药材4、巴戟天原料药材5、巴戟天原料药材6和巴戟天原料药材7。

巴戟天对照药材溶液的制备：采用实施例1中1.1巴戟天原料药材溶液制备方法制备。

1.2薄层色谱检测

将巴戟天对照药材溶液和巴戟天原料药材溶液采用薄层色谱检测法进行检测，

检测条件如下：

薄层板：TLC G60预制板(Merck)；

点样：2μl，条带状点样长8mm；

展开剂：乙酸乙酯:甲醇:水:冰乙酸＝8:3:1.8:3；

展开方式：于双槽展开缸(20cm×10cm)一侧加展开剂，预平衡15分钟，展开上行8.5cm，40℃加热干燥2h；双槽展开缸(20cm×10cm)一侧加展开剂，预平衡15分钟，再次上行展开8.5cm，50℃干燥15分钟后，放冷；

检视：浸以3％硫酸乙醇溶液，薄层板置薄层加热板上105℃加热8分钟，放冷10分钟，置于紫外灯(366nm)下检视荧光色谱图像。

检测结果：如图1所示，为紫外灯(366nm)下检视薄层色谱图(T：25℃，RH：70％)。标号S的色谱带为对照品耐斯糖，1-7依次对应巴戟天原料药材1、巴戟天原料药材2、巴戟天原料药材3、巴戟天原料药材4、巴戟天原料药材5、巴戟天原料药材6和巴戟天原料药材7；8对应为巴戟天对照药材；由图1可知，耐斯糖分离情况好，各批次巴戟天原料药材与巴戟天对照药材在同一位置都可以显示相同的斑点，各批次巴戟天原料药材与巴戟天对照药材间相似度高，初步将巴戟天原料药材1-7筛选为标准对照提取物的提取原料药材。

2高效液相色谱

2.1样品制备

化学对照品溶液的制备：分别取化学对照品耐斯糖、蔗果3糖、蔗果5糖、蔗果6糖、蔗果7糖、蔗果8糖、蔗果9糖、蔗果10糖适量，精密称定，加入50％甲醇配制成0.5mg/ml的溶液即得。

药材供试品溶液的制备：取各药材粉末，过二号筛(850±29μm，24目)，精密称定0.5g，置于圆底烧瓶中，加80mL水热回流提取1h，以中速滤纸过滤(孔径30～50μm)，残渣以5ml水洗涤2次，合并滤液和洗涤液，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度100ml，摇匀，溶液经0.22μm滤膜过滤，即得药材供试品溶液。巴戟天原料药材买自全国各大药材市场，分别为巴戟天原料药材1、巴戟天原料药材2、巴戟天原料药材3、巴戟天原料药材4、巴戟天原料药材5、巴戟天原料药材6和巴戟天原料药材7。

巴戟天对照药材溶液的制备：采用2.1中药材供试品溶液相同的方法制备。

2.2高效液相色谱检测

高效液相色谱法检测条件如下：

色谱仪器：Agilent 1260series高效液相色谱仪，配有ELSD检测器(美国，AgilentTechnologies)

色谱柱：Merck公司-HILIC柱(150×2.1mm，5μm)；

流动相：A-水，B-乙腈；

梯度洗脱程序：0-10min：10％A→18％A，10-30min：18％A→35％A，30-40min：35％A→35％A；

0-10min：90％B→82％B，10-30min：82％B→65％B，30-40min：65％B→65％B；

流速0.4ml/min；进样量5μl；柱温30℃；蒸发器温度50℃；雾化器温度70℃，氮气流速1.4SLM；运行时间：50min。

高效液相色谱法(HPLC)检测方法：分别精密吸取化学对照品溶液、巴戟天对照药材溶液和药材供试品溶液各5μl，注入高压液相色谱仪，进行测定。

高效液相色谱法检测结果：

检测结果为HPLC指纹图谱叠加图，如图2所示：从上往下，R对应共有模式；1对应为巴戟天对照药材；2-8分别对应巴戟天原料药材1、巴戟天原料药材2、巴戟天原料药材3、巴戟天原料药材4、巴戟天原料药材5、巴戟天原料药材6和巴戟天原料药材7。S1-S8对应化学对照品：蔗果3糖、耐斯糖、蔗果5糖、蔗果6糖、蔗果7糖、蔗果8糖、蔗果9糖、蔗果10糖。

由图2可以看出，巴戟天原料药材1-巴戟天原料药材7的指纹图谱具有高度的一致性，使用ChemPattern 2017Pro版软件(北京科迈恩科技有限公司)建立巴戟天药材的指纹图谱共有模式，并对所有样品进行相似度分析。

根据既定的巴戟天药材指纹图谱共有模式，采用夹角余弦算法根据各样品组分及其峰面积对7批巴戟天药材进行相似度评价，结果如表1所示。

表1

样品	相似度
		巴戟天原料药材1	0.99
巴戟天原料药材2	0.99
		巴戟天原料药材3	1.00
巴戟天原料药材4	1.00
		巴戟天原料药材5	0.99
巴戟天原料药材6	1.00
		巴戟天原料药材7	0.98
巴戟天对照药材	0.97
		共有模式	1

根据以上相似度分析结果可知：7批巴戟天原料药材和巴戟天对照药材的相似度≥0.97，相似度很高，由此这7批巴戟天原料药材可选用为巴戟天标准对照提取物提取的原料药材。

实施例2：巴戟天标准对照提取物的制备

本实施例提供了巴戟天标准对照提取物的制备方法，其方法流程图如图3所示。

一：提取

分别选取实施例1鉴定的7种巴戟天原料药材500g制成粉末，将粉末过二号筛(850±29μm，24目)，然后加入原料药材质量8倍体积的的纯化水(即固液比为1：8(w/V)，质量的计量单位为g，体积的计量单位为ml)，超声(功率500w，常温)提取60min后中速定性滤纸过滤，收集滤渣1和滤液1，滤渣1按相同方法再次提取三次。

二：醇沉

将再次提取三次收集的滤液与滤液1合并即为提取液，将提取液低温浓缩(50℃)即得巴戟天粗提物；巴戟天粗提物加入乙醇至乙醇含量为60％，沉淀过夜，过滤，得到滤液2和滤渣2，将滤液2低温干燥(50℃)，得到巴戟天精提物200g；

三：制备巴戟天提取物

用100ml纯净水将巴戟天精提物溶解完全后，再加巴戟天精提物的30％(质量百分比)的微粉硅胶(山河药辅，批号170115)，用旋转蒸发仪60℃回收溶剂至干，粉碎过110目筛，得到巴戟天提取物。

将制备得到的7批巴戟天提取物，通过对照品利用高效液相色谱法测定，检测结果如表2所示：

表2

三：调配

将步骤二的7个批次的巴戟天提取物按1:1比例混合勾兑得到巴戟天对照提取物，最终产品对应原药材比例大约为1：33(g/g)。利用高效液相色谱法测定巴戟天对照提取物的成分，检测过程中采用耐斯糖对照品，耐斯糖的含量的测定结果如表3所示。

表3

调配标准为：应使最终的巴戟天对照提取物中耐斯糖的含量不得低于2.00％且不高于8.00％(含量以wt％计)。此调配标准中的各成分的含量的范围也是经过多次反复实验综合保持稳定性、一致性以及后面的应用等得出的最佳数据。

四：检测

将步骤三调配成的巴戟天对照提取物通过对照品利用高效液相色谱法测定得到指纹图谱，与制备原料药材各有模式图谱进行相似度检测，如图4，ERS对应巴戟天对照提取物，S1-S8分别对应化学对照品：蔗果3糖、耐斯糖、蔗果5糖、蔗果6糖、蔗果7糖、蔗果8糖、蔗果9糖、蔗果10糖，R为巴戟天原料药材共有模式，得到相似度为0.99，由此可见巴戟天对照提取物和巴戟天药材指纹图谱共有模式的相似度很高，这说明本发明的巴戟天对照提取物能代表巴戟天药材。

实施例3巴戟天对照提取物的性状分析

1.表观状态：实施例2得到的巴戟天对照提取物为浅灰紫色粉末。

2.水分测定：按照2015版中国药典附录IX G(减压干燥法)进行。检测结果为巴戟天对照提取物含水量为0.50％。

3.一致性测试：按照实施例2的方法制备3批次巴戟天对照提取物，经测定各批次间的针对耐斯糖的薄层色谱检测结果差异很小，耐斯糖的荧光斑点有明显的显示，且分布非常一致；经高效液相色谱检测其耐斯糖含量在调配标准范围之内。因此利用本发明的巴戟天对照提取物的制备方法制备得到的巴戟天对照提取物一致性非常好。

4.稳定性测试：

取3个不同批次的按照实施例2中的方法制备的巴戟天对照提取物的供试品，按照国家药典委员会制订的“国家药品标准物质研制技术要求”的相关规定，考察指标包括性状和溶解性。

供试品开口放置在适宜的洁净容器中，60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测。

结果显示，高温试验前后供试品性状无明显变化，高温试验前后薄层色谱图也无明显变化，溶出率测定结果用SPSS进行独立样本t-检验，计算结果P＞0.05，说明无显著性差异。

对比例1

与实施例3的区别在于：(可适当提供对比例)

实施例4巴戟天对照提取物的应用

本实施例提供了对实施例2制备得到的巴戟天对照提取物的应用。

用薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以化学对照品、巴戟天对照药材和巴戟天对照提取物为参照物质对供试药品材进行分析，供试品药材购于广州。

1薄层色谱

1.1样品制备

化学对照品溶液的制备：取耐斯糖化学对照品适量，用50％甲醇配制成0.5mg/ml的溶液；

巴戟天对照提取物溶液的制备：精密称取实施例2制备得到的巴戟天对照提取物30mg，加入纯净水1ml，超声(500w)处理15分钟，摇匀，加纯净水定容至2ml容量瓶，过0.22μm滤膜即得巴戟天对照提取物溶液。

巴戟天药材供试品：依次为巴戟天1、巴戟天2、巴戟天3、巴戟天4、巴戟天5、巴戟天6、巴戟天7、巴戟天8和巴戟天9。

巴戟天药材供试品溶液制备：分别取供试品巴戟天药材粉末过二号筛，精密称定2g，置150ml具塞锥形瓶中，加入水溶液80ml，水浴回流60分钟后，过滤，残渣以少量水洗涤，合并滤液和洗涤液，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度100ml，摇匀，取上清液过0.22μm的滤膜，即得药材供试品溶液。

巴戟天对照药材溶液的制备：采用实施例4中1.1药材供试品溶液相同的方法制备。

1.2薄层色谱检测

将实施例4中1.1制备的巴戟天药材供试品溶液和巴戟天对照药材溶液进行薄层色谱检测，检测条件如下：

薄层板：TLC G60预制板(Merck)；

点样：2μl，条带状点样长8mm；

展开剂：乙酸乙酯:甲醇:水:冰乙酸＝8:3:1.8:3；

展开方式：于双槽展开缸一侧加展开剂，预平衡15分钟，展开上行8.5cm，40℃加热干燥2h；双槽展开缸一侧加展开剂，预平衡15分钟，再次上行展开8.5cm，50℃干燥15分钟后，放冷；

检视：浸以3％硫酸乙醇溶液，薄层板置薄层加热板上105℃加热8分钟，放冷10分钟，置于紫外灯(366nm)下检视荧光色谱图像。

检测结果：如图5所示，为紫外灯(366nm)下检视薄层色谱图(T：25℃，RH：70％)。标号S的色谱带为对照品耐斯糖，1-9依次对应巴戟天1、巴戟天2、巴戟天3、巴戟天4、巴戟天5、巴戟天6、巴戟天7、巴戟天8和巴戟天9。10对应为巴戟天对照药材，11对应为巴戟天对照提取物。

结果分析：由图5可知，耐斯糖分离情况较好，巴戟天对照提取物和巴戟天对照药材、巴戟天药材(巴戟天1-巴戟天9)在同一位置都可以显示相同的斑点，从图谱看出巴戟天对照提取物与巴戟天对照药材、巴戟天药材(巴戟天1-巴戟天9)有高度的一致性。

图6，巴戟天药材及对照提取物高效薄层色谱图数码扫描图谱。

2高效液相色谱

2.1样品制备

化学对照品溶液：取化学对照品耐斯糖适量，精密称定，加入50％甲醇配制成0.5mg/ml的溶液即得。

巴戟天对照提取物(ERS)溶液：精密称取巴戟天对照提取物30mg，置于2ml容量瓶中，加水1.5ml，超声(功率500w，常温)处理10分钟。放冷至室温，加水至刻度2ml，摇匀，溶液经0.22μm滤膜过滤，取滤液，即得巴戟天对照提取物溶液；

巴戟天药材供试品溶液：取各药材粉末(过二号筛)，精密称定0.5g，置于圆底烧瓶中，加80mL水热回流提取1h，过滤，残渣以5ml水洗涤2次，合并滤液和洗涤液，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度100ml，摇匀，溶液经0.22μm滤膜过滤，即得药材供试品溶液。药店药材均买自广州，分别为：巴戟天1、巴戟天2、巴戟天3、巴戟天4、巴戟天5、巴戟天6、巴戟天7、巴戟天8和巴戟天9。

巴戟天对照药材溶液制备：采用与实施例4中2.1药材供试品溶液制备相同的方法制备。

2.2高效液相色谱检测

高效液相色谱法检测条件如下：

色谱仪器：Agilent 1260series高效液相色谱仪，配有ELSD检测器(美国，AgilentTechnologies)

色谱柱：Merck公司-HILIC柱(150×2.1mm，5μm)；

流动相：A-水，B-乙腈；

梯度洗脱程序：0-10min：10％A→18％A，10-30min：18％A→35％A，30-40min：35％A→35％A；

0-10min：90％B→82％B，10-30min：82％B→65％B，30-40min：65％B→65％B；

流速0.4ml/min；进样量5μl；柱温30℃；蒸发器温度50℃；雾化器温度70℃，氮气流速1.4SLM；运行时间：50min。

高效液相色谱法检测方法：分别精密吸取化学对照品溶液、巴戟天对照药材溶液，巴戟天对照提取物溶液和巴戟天药材供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪。

高效液相色谱法检测结果：

结果见图7所示的HPLC指纹图谱叠加图，从上往下1对应为巴戟天对照提取物，2对应为巴戟天对照药材，3-11依次对应巴戟天1、巴戟天2、巴戟天3、巴戟天4、巴戟天5、巴戟天6、巴戟天7、巴戟天8和巴戟天9。S1-S8对应化学对照品：蔗果3糖、耐斯糖、蔗果5糖、蔗果6糖、蔗果7糖、蔗果8糖、蔗果9糖、蔗果10糖。

由图7可以看出，巴戟天1-巴戟天9供试品药材的指纹图谱相差较大。根据巴戟天对照提取物指纹图谱，采用夹角余弦算法根据各样品组分及其峰面积对9批巴戟天药材指纹图谱进行相似度评价，结果如表4所示。

表4

样品	相似度
		巴戟天1	0.64
巴戟天2	0.89
		巴戟天3	0.11
巴戟天4	0.54
		巴戟天5	0.26
巴戟天6	0.35
		巴戟天7	0.50
巴戟天8	0.43
		巴戟天9	0.98
巴戟天对照药材	0.97
		巴戟天对照提取物	1.00

根据以上相似度分析结果，供试品药材巴戟天9、巴戟天对照药材和巴戟天对照提取物的相似度分别为0.98和0.97，相似度很高，其余商品药材和巴戟天对照提取物相似度很低，这是由于其余巴戟天商品药材为炮制品，巴戟天在炮制过程中寡糖由于分解造成含量分布与巴戟天原药材有较大差异。该结果表明本发明的巴戟天对照提取物中的蔗果3糖、耐斯糖、蔗果5糖、蔗果6糖、蔗果7糖、蔗果8糖、蔗果9糖、蔗果10糖与巴戟天原药材的一致性良好，与巴戟天炮制品有显著差异，应用于药材或巴戟天制品或中药制剂的半定量鉴别分析。

根据巴戟天原料药材的薄层色谱(TLC)及HPLC指纹图谱的结果可知，对所述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图与其对应的原料药材一致，更确切的说，对所述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图中的耐斯糖位置处的荧光斑点和采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在耐斯糖位置处的色谱峰分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致，因此本发明的巴戟天对照提取物可应用于药材或中药制剂的定性鉴别，例如对药材或中药制剂的耐斯糖成分进行定性分析。

根据巴戟天商店药材的HPLC测定结果以及统计分析，巴戟天炮制品在高效液相色谱指纹图谱中与巴戟天原料药材在含量分布上有明显区别，故巴戟天对照提取物能有效的用于鉴别巴戟天炮制品。

Claims (10)

1.一种巴戟天对照提取物，其特征在于，其来源于：对不同批次的巴戟天药材粉末进行多次提取，得到不同批次的巴戟天提取物，然后对不同批次的巴戟天提取物进行调配，得到巴戟天对照提取物；

任选的，所述巴戟天对照提取物中耐斯糖的含量不低于2.00％且不高于8.00％；

任选的，对所述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致；

任选的，对所述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法和/或采用高效液相色谱法检测得到的色谱图中的耐斯糖与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致；

任选的，对所述巴戟天对照提取物采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在蔗果3糖、蔗果5糖、蔗果6糖、蔗果7糖、蔗果8糖、蔗果9糖、蔗果10糖位置处的色谱峰分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致。

2.一种权利要求1所述的巴戟天对照提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、提取：取巴戟天药材粉末与水混合，提取后过滤，得到滤液1和滤渣1，将滤液1浓缩得到巴戟天粗提物；

步骤二、醇沉：取巴戟天粗提物，加入乙醇，沉淀，过滤，得到滤液2和滤渣2，并将滤液2干燥得到巴戟天精提物；

步骤三、制备巴戟天提取物：将所得巴戟天精提物，溶解于水，得到巴戟天精提物的水溶液，再加入辅料，干燥过筛得到巴戟天提取物；

步骤四、调配：将不同批次的巴戟天提取物进行调配，得到巴戟天对照提取物；

任选的，步骤一至步骤三中的提取、浓缩和干燥采用低温处理的方式进行；

任选的，所述的低温为20℃～60℃；

任选的，所述步骤三与步骤四之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的巴戟天提取物的耐斯糖进行检测的步骤。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤一中将滤渣1 按照步骤一的提取方法经过N次提取，并将N次提取的滤液与滤液1合并即为提取液，并将提取液浓缩得到巴戟天粗提物；其中提取的次数为N次，其中6≥N≥0，且N为整数；

任选的，所述N为3。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的巴戟天药材粉末与水的重量体积比为1:5～1:45；

任选的，所述步骤一中的巴戟天药材粉末重量与水的体积比为1：8；

任选的，所述步骤一中的提取方式为：超声提取；

任选的，所述步骤一中的超声提取时间为1～120min；

任选的，所述步骤一中的超声提取时间为60min；

任选的，所述步骤一中的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。

任选的，所述步骤一中的过滤是用中速滤纸。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中巴戟天粗提物含醇量为：40％～80％；

任选的，所述步骤二中巴戟天粗提物含醇量为：60％。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中巴戟天精提物与水的重量体积比：1：2～1:20；

任选的，所述步骤三中所用辅料是微粉硅胶和/或药用淀粉。

任选的，所述辅料为微粉硅胶；

任选的，所述步骤三是在巴戟天精提物的水溶液中加入其重量的10％～50％的微粉硅胶；

任选的，所述步骤三是在巴戟天精提物的水溶液中加入其重量的30％的微粉硅胶；

任选的，所述步骤三干燥后是过90～200目筛网过滤；

任选的，所述步骤三干燥后是过110目筛网过滤。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四中调配使最终得到的对照提取物中耐斯糖不得低于2.00％且不高于8.00％。

任选的，对所述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致；

任选的，对所述巴戟天对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法检测得到的色谱图中的耐斯糖分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致。

8.权利要求1所述的巴戟天对照提取物在药材或中药制剂的鉴别中的应用。

9.根据权利要求8的所述的应用，其特征为，所述的鉴别用于巴戟天对照提取物在巴戟天或含巴戟天/巴戟天有效成分的药材或中药制剂的质量控制中。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的应用采用的方法如下：将权利要求1所述的的巴戟天对照提取物作为对照物，与药材或中药制剂一起经过薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，根据检测结果对比判断。

任选的，所述薄层色谱法和/或高效液相色谱法是对巴戟天对照提取物和药材或中药制剂中的耐斯糖进行检测；

任选的，所述的薄层色谱法检测条件为：

薄层板：TLC G60预制板(Merck)；

点样：2μl，条带状点样长8mm；

展开剂：乙酸乙酯:甲醇:水:冰乙酸＝8:3:1.8:3；

展开方式：于双槽展开缸一侧加展开剂，预平衡15分钟，展开上行8.5cm，40℃加热干燥2h；双槽展开缸一侧加展开剂，预平衡15分钟，再次上行展开8.5cm，50℃干燥15分钟后，放冷；

检视：浸以3％硫酸乙醇溶液，薄层板置薄层加热板上105℃加热8分钟，放冷10分钟，置于紫外灯(366nm)下检视荧光色谱图像；

任选的，所述的高效液相色谱法检测条件为：

色谱仪器：Agilent 1260 series高效液相色谱仪，配有ELSD检测器(美国，AgilentTechnologies)

色谱柱：Merck公司柱(150×2.1mm，5μm)；

流动相：A-水，B-乙腈；

梯度洗脱程序：0-10min：10％A→18％A，10-30min：18％A→35％A，30-40min：35％A→35％A；

0-10min：90％B→82％B，10-30min：82％B→65％B，30-40min：65％B→65％B；

流速0.4ml/min；进样量5μl；柱温30℃；蒸发器温度50℃；雾化器温度70℃，氮气流速1.4SLM；运行时间：50min。