CN105753931A - 筋骨痛消丸的质量控制方法 - Google Patents

筋骨痛消丸的质量控制方法 Download PDF

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CN105753931A
CN105753931A CN201610194514.4A CN201610194514A CN105753931A CN 105753931 A CN105753931 A CN 105753931A CN 201610194514 A CN201610194514 A CN 201610194514A CN 105753931 A CN105753931 A CN 105753931A
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muscle
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韩军涛
张宏都
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Abstract

本发明公开了筋骨痛消丸的质量控制方法，是一种通过控制筋骨痛消丸中活性成分进而控制成药质量的分析方法。本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有抗炎镇痛作用，可能是筋骨痛消丸发挥治疗作用的物质基础之一。该化合物可以从川牛膝中分离得到，且分离制备方法得率高，可以进行大规模制备。本发明提供的液相分析方法可以将筋骨痛消丸中的化合物(Ⅰ)与其他化合物分开，达到基线分离(分离度＞2.0)，化合物(Ⅰ)峰纯度检测合格。本发明提供的化合物(Ⅰ)在筋骨痛消丸的质量控制过程中可以作为化学对照品用于化合物(Ⅰ)的定性或定量分析。

Description

筋骨痛消丸的质量控制方法
技术领域
本发明属于药物技术领域，涉及药物制剂的质量分析，具体涉及筋骨痛消丸的质量控制方法。
背景技术
筋骨痛消丸是在著名中医骨伤科专家、洛阳平乐郭氏正骨第六代传人、白求恩奖章获得者郭维淮主任医师指导下，根据平乐郭氏正骨经验方研制而成的中药三类新药。该药在全国中医骨伤专科医疗中心—河南省洛阳正骨医院临床应用30余年。对骨质增生、慢性劳损引起的颈肩腰腿痛、跟痛症，急慢性软组织损伤以及骨折后肢体肿胀、疼痛、关节活动受限等症均有良好疗效。该药为国家中药保护品种、国家重点新产品、国家级火炬计划项目、国家中医药科技成果推广项目、河南省高新技术产业化重点项目。
筋骨痛消丸为棕褐色的浓缩丸，气微香，味微苦，主要成分为丹参、鸡血藤、香附、乌药、川牛膝、桂枝、威灵仙、秦艽、白芍、地黄、甘草。
体外实验证明筋骨痛消丸具有如下药理作用：1、镇痛作用：对小白鼠热板法所致的疼痛反应在用药后2、5、6h有显著镇痛作用；对小白鼠醋酸所致扭体反应镇痛率为50.5％；2、抗炎作用：本品对致炎剂—蛋清所致的大白鼠足跖肿胀有显著抑制作用；对小白鼠二甲苯所致耳肿胀、醋酸所致腹腔毛细血管通透性增加、琼脂所致肉芽肿均有显著抑制作用；3、抑制血小板聚集，缩短血小板最大聚集时间；对人体微循环障碍和血液流变学异常有显著改善作用。该药Ⅱ期临床研究由北京中医药大学东直门医院牵头，对457例(对照组102例)膝关节增生性关节炎进行了系统临床观察，对照实验研究采用单盲法，筋骨痛消丸总有效率达94.64％，显著优于对照药物(P＜0.01)。筋骨痛消丸对增生性关节炎平均起效时间11天，服药15天对主要症状膝关节疼痛。压痛、肿、胀、活动受限起效率均高于90％。
该药安全性良好，小白鼠最大耐受量相当于成人日用药量的150倍；长期毒性实验表明对大白鼠无明显毒性；临床观察355例对人体肝肾功能以及血常规等指标均无不良影响。该药安全可靠，可长期使用。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种从筋骨痛消丸中分离得到的新化合物；
本发明的第二目的在于提供上述新化合物的制备方法；
本发明的第三目的在于提供一种基于上述新化合物的液相分析方法，用于控制筋骨痛消丸的质量，提高筋骨痛消丸的质量控制水平；
本发明的第四目的在于提供上述新化合物在筋骨痛消丸质量控制中用作对照品的用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
所述的化合物(Ⅰ)的制备方法包括如下操作步骤：
步骤S1，将干燥的川牛膝粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用6～10％乙醇洗脱8～12个柱体积，再用65～75％乙醇洗脱12～16个柱体积，收集65～75％乙醇洗脱液，减压浓缩得65～75％乙醇洗脱浓缩物；
步骤S3，将步骤S2中65～75％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；
步骤S4，将步骤S3中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为65～75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。
进一步地，步骤S1中用75％乙醇热回流提取。
进一步地，步骤S2中所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
进一步地，步骤S2中，先用8％乙醇洗脱10个柱体积。
更进一步地，步骤S2中，再用70％乙醇洗脱14个柱体积，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物。
进一步地，步骤S5中用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱。
上述化合物(Ⅰ)在筋骨痛消丸质量控制方法中用作化学对照品的用途。
所述筋骨痛消丸质量控制方法为高效液相色谱法，参数如下：
色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸水溶液；
梯度洗脱程序：0.01～15min，A25％～35％；15～25min，A35％～85％；25～32min，A85％；32～35min，A85％～25％；35～40min，A25％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：268nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
进一步地，所述的C18柱为AgilentZorbaxSBC18柱(4.6mm×250mm，5μm)。
本发明的优点：
1、本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有抗炎镇痛作用，可能是筋骨痛消丸发挥治疗作用的物质基础之一；
2、川牛膝是筋骨痛消丸中的一味药，化合物(Ⅰ)可以从川牛膝中分离得到，本发明提供的制备方法得率高，可以进行大规模制备；
3、本发明提供的液相分析方法可以将筋骨痛消丸中的化合物(Ⅰ)与其他化合物分开，达到基线分离(分离度＞2.0)，化合物(Ⅰ)峰纯度检测合格；
4、本发明制备的化合物(Ⅰ)纯度高，在筋骨痛消丸的质量控制过程中可以用于化合物(Ⅰ)的定性或定量。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
实施例1：化合物(Ⅰ)的制备和结构确证
分离制备方法：
步骤S1，将2kg干燥的川牛膝粉碎，用75％乙醇热回流提取(10L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用D101型大孔树脂富集，先用8％乙醇洗脱10个柱体积，再用70％乙醇洗脱14个柱体积，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；
步骤S3，将步骤S2中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1(8个柱体积)、25:1(6个柱体积)、15:1(5个柱体积)和5:1(7个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；
步骤S4，将步骤S3中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1(3个柱体积)、5:1(7个柱体积)和2:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(655mg，HPLC归一化纯度大于98％)。
结构确证：淡黄色粉末；HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z539.2965，结合核磁特征可得分子式为C32H42O7，不饱和度为12。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，600MHz)：H-1(5.98，d，J＝12.9Hz)，H-2(5.83，d，J＝12.9Hz)，H-4(4.57，qd，J＝6.9，4.4Hz)，H-5(2.54，d，J＝4.4Hz)，H-7(2.25，dd，J＝13.2，4.9Hz)，H-7(2.48，dd，J＝13.2，12.6Hz)，H-8(1.74，dd，J＝12.6，4.9Hz)，H-11(1.41，m)，H-11(2.21，dd，J＝11.0，6.8Hz)，H-12(1.70，m，2H)，H-15(1.31，dd，J＝14.2，4.3Hz)，H-15(2.35，dd，J＝14.2，7.9Hz)，H-16(5.34，td，J＝7.2，4.3Hz)，H-16b(2.06，s)，H-17(2.45，m)，H-18(1.15，s)，H-19(0.97，d，J＝4.2Hz)，H-19(2.02，d，J＝4.2Hz)，H-20(2.50，m)，H-21(0.88，d，J＝6.7Hz)，H-24a(5.92，s)，H-24a(6.03，s)，H-25(2.92，m)，H-26(1.05，d，J＝6.8Hz)，H-27(1.11，d，J＝6.8Hz)，H-28(1.60，d，J＝6.9Hz)，H-30(1.03，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，150MHz)：152.4(CH，1-C)，119.7(CH，2-C)，168.0(C，3-C)，79.1(CH，4-C)，48.8(CH，5-C)，208.6(C，6-C)，37.5(CH2，7-C)，40.5(CH，8-C)，30.3(C，9-C)，35.0(C，10-C)，28.5(CH2，11-C)，32.6(CH2，12-C)，45.8(C，13-C)，47.3(C，14-C)，47.5(CH2，15-C)，77.1(CH，16-C)，171.1(C，16a-C)，22.7(CH3，16b-C)，50.7(CH，17-C)，19.2(CH3，18-C)，36.3(CH2，19-C)，32.5(CH，20-C)，12.8(CH3，21-C)，203.9(C，22-C)，195.2(C，23-C)，154.3(C，24-C)，120.3(CH2，24a-C)，30.7(CH，25-C)，22.0(CH3，26-C)，21.6(CH3，27-C)，18.5(CH3，28-C)，20.6(CH3，30-C)。IR谱图中的1725cm-1与1694cm-1吸收带表明该化合物结构中存在羰基与共轭羰基；UV谱图中的最大吸收207nm与245nm说明结构中存在共轭双键。氢谱核磁数据表明该结构中不饱和度是由两个C-C双键结构，五个羰基结构以及五个环状骨架组成。碳谱核磁数据与DEPT谱数据表明该化合物结构中有32个共振碳信号，有七个甲基(δC22.7、19.2、12.8、22.0、21.6、18.5与20.6)，六个亚甲基(δC37.5、28.5、32.6、47.5、36.3与120.3)，九个次甲基(δC152.4、119.7、79.1、48.8、40.5、77.1、50.7、32.5与30.7)，十个季碳(δC168.0、208.6、30.5、35.0、45.8、47.3、154.3、171.1、203.9与195.2)，其中三个酮基(δC208.6、203.9与195.2)，两个酯羰基(δC168.0与171.1)，两个连氧次甲基碳(δC79.1与77.1)，四个烯碳(δC152.4与119.7；154.3与120.3)。核磁数据表明该化合物含有一个α,β-不饱和内酯结构[δH5.98(d，J＝12.9Hz，H-1)，5.83(d，J＝12.9Hz，H-2)；δC152.4(CH，C-1)，119.7(CH，C-2)，168.0(C，C-3)]，一个环丙烷结构[δH0.97(d，J＝4.2Hz，H-19)，2.02(d，J＝4.2Hz，H-19)；δC30.3(C，C-9)，35.0(C，C-10)，36.3(CH2，C-19)]，一个乙酰氧基[δH2.06(s，H-16b，3H)；δC171.1(C，C-16a)，22.7(CH3，C-16b)]。HMBC谱中，H-16(δH5.34)与C-16a(δC171.1)的相关性表明了乙酰氧基连在C-16(δC77.1)位上。通过NOESY谱数据解析H-4(δH4.57)、H3-28(δH1.60)与H-5(δH2.54)的关系可以说明28-甲基相对立体构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。化学结构式和碳原子编号如下：
实施例2：化合物(Ⅰ)的药理作用(抗炎镇痛)
1、材料与方法
1.1药物及试剂
化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。阿司匹林肠溶片(济南永宁制药股份有限公司)，吐温80(天津市广成化学试剂有限公司)；二甲苯(天津市博通化工有限公司)；依文思蓝(国药集团化学试剂有限公司)。
1.2动物
昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，清洁级，由泰山医学院实验动物中心提供。
1.3镇痛实验：小鼠扭体法
取小鼠30只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为化合物(Ⅰ)组(0.2g·kg-1)、阿司匹林组(0.2g·kg-1)及生理盐水对照组。每组10只，灌胃给药。给药容积20mL·kg-1。给药30min后，腹腔注射0.6％冰醋酸10mL·kg-1，观察记录15min内小鼠出现扭体反应鼠数和扭体次数，计算扭体次数均值及抑制扭体反应率。
抑制率＝(对照组扭体数-给药组扭体数)/对照组扭体数×100％
1.4镇痛实验：小鼠甩尾法实验
取昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重18～22g，实验前12h禁食不禁水。把小鼠装入小鼠固定筒内，尾部暴露于外，测痛时，使小鼠尾尖部1/3处与聚光灯灯孔重合，待动物安静后进行测量，以鼠尾受热刺激出现甩尾作为疼痛反应指标。记录小鼠从开始光照射到甩尾反应的潜伏期(TFLs)作为痛阈。分组及给药同1.3。给药30min后，测定其甩尾时间。计算痛阈均值及痛阈提高率。痛阈提高率＝(给药后痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100％
1.5抗炎实验：对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
分别称取18～22g健康小白鼠30只，分为3组，每组10只，雌雄各半。每只小鼠按20mL·kg-1灌胃给药，剂量设置同1.3。连续给药7d。第7天给药0.5h后，各组小鼠于右耳正反面涂上二甲苯50μL致炎，1h后将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下两耳，用8mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，立即称重并记录其质量，计算肿胀度和肿胀率。
肿胀度＝右耳质量-左耳质量；肿胀率＝[(右耳质量-左耳质量)/左耳质量]×100％
1.6抗炎实验：对冰醋酸致小鼠血管通透性改变的影响
分组给药同1.3。第7天给药0.5h后，尾静脉注射1％的依文思蓝生理盐水溶液10mL·kg-1，立即腹腔注射0.6％醋酸生理盐水溶液10mL·kg-1，30min后脱颈椎处死小鼠，轻揉小鼠腹部1min后，打开腹腔，收集腹腔液，待收集完毕用4mL生理盐水分数次冲洗腹腔，用注射器吸出洗涤液，合并后加入生理盐水至5mL，以1000r·min-1离心5min，取上清液用721型分光光度计于680nm处测吸光度(A)，计算渗出抑制率。
渗出抑制率＝(对照组A-给药组A)/阴性对照组A×100％
1.7统计方法
采用SPSS19.0软件，数据以x±s表示，比较用t检验，P＜0.05为有统计意义。
2、实验结果
2.1镇痛作用
与对照组比，化合物(Ⅰ)组小鼠扭体反应次数和扭体反应鼠数均显著降低(P<0.01)，对醋酸致小鼠扭体反应次数的抑制效果优于阳性药阿司匹林。结果见表1。
与对照组比，化合物(Ⅰ)组小鼠光热辐射致疼痛反应的痛阈显著提高(P<0.01)，痛阈提高率与阳性药阿司匹林基本一致。结果见表2。
表1对冰醋酸致小鼠扭体次数的影响(x±s，n＝10)
组别 剂量/g·kg-1 扭体数/只 扭体数/次 抑制率/％
对照组 - 10 35.5±15.2 0
阿司匹林组 0.2 5 12.8±11.9 63.9
化合物(Ⅰ)组 0.2 6 11.5±3.8 67.6
表2对热刺激致小鼠痛阈改变的影响(x±s，n＝10)
组别 剂量/g·kg-1 药后痛阈/s 痛阈提高率/％
对照组 - 9.86±4.03 0
阿司匹林组 0.2 16.15±3.83 63.8
化合物(Ⅰ)组 0.2 16.02±2.56 62.5
2.2抗炎作用
二甲苯致炎后，化合物(Ⅰ)组小鼠耳廓肿胀率显著低于对照组(P＜0.01)，见表3。冰醋酸致炎后，化合物(Ⅰ)组小鼠腹腔液依文思蓝A显著低于对照组(P＜0.01)，见表4。
表3对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(x±s，n＝10)
组别 剂量/g·kg-1 肿胀度/mg 肿胀率/％
对照组 - 4.48±0.71 134.88±12.35
阿司匹林组 0.2 0.77±0.35 21.10±5.13
化合物(Ⅰ)组 0.2 0.90±0.68 24.66±10.54
表4对冰醋酸致小鼠血管通透性改变的影响(x±s，n＝10)
组别 剂量/g·kg-1 A 渗出抑制率/％
对照组 - 0.557±0.049 -
阿司匹林组 0.2 0.166±0.029 77.20
化合物(Ⅰ)组 0.2 0.333±0.024 40.25
以上结果表明，化合物(Ⅰ)具有显著的抗炎镇痛作用，可能是筋骨痛消丸发挥治疗作用的物质基础之一。
实施例3：筋骨痛消丸的质量控制方法
1、仪器：Agilent1260高效液相色谱仪
2、试剂：化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％，制备方法见实施例1；筋骨痛消丸为河南省洛正制药厂产品。
3、色谱条件：
色谱柱：AgilentZorbaxSBC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸水溶液；
梯度洗脱程序：0.01～15min，A25％～35％；15～25min，A35％～85％；25～32min，A85％；32～35min，A85％～25％；35～40min，A25％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：268nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
4、供试品溶液的制备
取筋骨痛消丸样品适量研成细粉，精确称取细粉1.20g置于25ml离心管中，加10ml二氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶剂，超声提取30min，离心取上清，残渣重复提取两次，合并3次上清液，水浴回收溶剂至干，残留物用甲醇溶解并定容至25ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液为供试液。
5、对照品溶液的制备
精密称取化合物(Ⅰ)20mg至20ml容量瓶中，甲醇超声溶解，冷却至室温后定容。精密移取2ml至20容量瓶中，甲醇稀释定容，配制成浓度约为0.1mg/ml的对照品溶液。
6、分析方法验证
使用DAD检测器，分别进样分析供试品溶液和对照品溶液，结果：供试品溶液液相色谱图中在对照品溶液液相色谱图出峰位置出峰；对照品溶液中化合物(Ⅰ)色谱峰的光谱图与供试品溶液中对应色谱峰的光谱图一致；供试品溶液中化合物(Ⅰ)色谱峰与相邻色谱峰的分离度大于2.0，且峰纯度高于阈值。
7、样品含量测定
分别取3个批号的筋骨痛消丸样品，按上述方法处理制备供试液，测定样品中化合物(Ⅰ)含量，3批样品中的含量分别为0.0388％、0.0384％、0.0387％。
本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有抗炎镇痛作用，可能是筋骨痛消丸发挥治疗作用的物质基础之一，可以从川牛膝中分离得到，在筋骨痛消丸的质量控制过程中可以作为化学对照品用于化合物(Ⅰ)的定性或定量分析。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
步骤S1，将干燥的川牛膝粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用6～10％乙醇洗脱8～12个柱体积，再用65～75％乙醇洗脱12～16个柱体积，收集65～75％乙醇洗脱液，减压浓缩得65～75％乙醇洗脱浓缩物；
步骤S3，将步骤S2中65～75％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；
步骤S4，将步骤S3中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为65～75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中用75％乙醇热回流提取。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，先用8％乙醇洗脱10个柱体积。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，再用70％乙醇洗脱14个柱体积，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S5中用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱。
8.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在筋骨痛消丸质量控制方法中用作化学对照品的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，所述筋骨痛消丸质量控制方法为高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法的参数如下：
色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸水溶液；
梯度洗脱程序：0.01～15min，A25％～35％；15～25min，A35％～85％；25～32min，A85％；32～35min，A85％～25％；35～40min，A25％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：268nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
10.权利要求9所述的C18柱为AgilentZorbaxSBC18柱(4.6mm×250mm，5μm)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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