CN104447775B

CN104447775B - 一种新的生物碱类化合物、药物组合物和其医药用途

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Publication number: CN104447775B
Application number: CN201410811159.1A
Authority: CN
Inventors: 时培青
Original assignee: Individual
Current assignee: Shi Peiqing
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: CN104447775A

Abstract

提供百部中生物碱类化合物1或其药用盐，以其为有效成分和至少一种药学上可接受的载体组成的药物组合物，其制备方法，及其在制备治疗血瘀疾病的药物中的应用。化合物1具有显著的抗凝血和抗血栓活性，化学结构新颖，活性强，作为治疗血瘀疾病的药物有较多优势。

Description

一种新的生物碱类化合物、药物组合物和其医药用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及具有抗血瘀活性的生物碱类化合物，其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，及其在制备治疗血瘀疾病的药物中的应用。

背景技术

生物碱是一类来源于生物界(以植物为主)的含氮有机物，多数生物碱分子具有较复杂的环状结构，且氮原子在环状结构内，大多呈碱性，一般具有生物活性。生物碱广泛存在于植物、动物、微生物等生物有机体内。根据化学结构不同可分为异喹啉类、喹啉类、咪唑类、哌啶类、莨菪烷类、吲哚类等生物碱。大多数生物碱具有显著的生物活性，如抗HIV、治疗类风湿性关节炎、降低血压和抗寄生虫等。近年来，许多科学家以天然生物碱为先导化合物，对其结构进行修饰和改造，也合成了大量的生物碱类化合物，部分化合物也表现出显著的生理活性。

百部为多来源药材，《中华人民共和国药典》2010版规定百部来源为百部科植物直立百部Stemonasessilifolia(Miq.)Miq.、蔓生百部Stemonajaponica(Bl.)Miq.或对叶百部StemonatuberosaLour.的干燥块根。性微温，味甘、苦，归肺经；润肺下气止咳、杀虫灭虱，用于新久咳嗽、肺疹咳嗽、百日咳；外用于头虱、体虱、烧虫病、阴痒。文献报道，百部与百部属其它植物类似，主要含一类独特的吡咯类生物碱，称为百部碱类生物碱。百部生物碱的化学研究始于日本。1913年，Fumya.T从蔓生百部中分离得到一种生物碱Hodorine。1929～1934年，另一日本学者Suzuki.K报道了从蔓生百部的根中分离到百部次碱(Stemonidine)、百部碱(Stemonine)和异百部次碱(Isostemonidine)。此后，国内外对该科植物的化学和药理进行了很多研究，发现了很多具有药理活性的生物碱成分，尽管该类化合物的不稳定性和其在植物中含量的低微给化学研究带来了不少困难，但其新颖的结构和广泛的药理活性仍然激起了不少化学家的研究热情，随着现代波谱技术在百部生物碱结构鉴定中的广泛应用，我国学者系统的研究了六种国产百部科植物的生物碱组成，从中分离鉴定了大量新生物碱，包括一些新生物碱骨架。

目前已证实血瘀证的发生和发展与血小板聚集和凝血功能异常有密切关系，血瘀证可以表现为血小板聚集异常增强，凝血功能活化并形成血栓。抑制血小板聚集和抑制血栓形成对防治血栓性疾病具有重要作用。通过经典的体外抗凝血及抗血栓方法，以血浆复钙时间、凝血酶时间、体外血栓溶解率及全血凝块溶解率为指标，可以判断一个化合物的抗凝血效果。

发明人在对百部块根的化学成分研究中，分离鉴定了1个新的生物碱类化合物，为首次报道。药理试验结果表明，该生物碱化合物能显著延长家兔血浆复钙时间及凝血酶时间，且显著加快体外血栓及全血凝块的溶解，可以作为制备治疗血瘀疾病的药物的活性成分。

发明内容

本发明目的在于提供从百部根中分离得到的1个生物碱类化合物，其制备方法，在药物中特别是在制备治疗血瘀疾病的药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

下述结构式所示的生物碱类化合物1或其药用盐，

所述的药用盐，是指药学上可接受的盐，与有机酸如酒石酸或柠檬酸或甲酸或乙二酸，或是与无机酸如盐酸或硫酸或磷酸形成的盐。

一种用于预防或治疗血瘀疾病的药物组合物，其包含所述的化合物1或其药用盐和至少一种药学上可接受的载体。

所示的化合物1的制备方法，其制备方法包括：

(1)提取：将干燥百部根粉碎，用醇溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏，粗浸膏加水混悬均匀后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液浓缩后得到乙酸乙酯浸膏；

(2)分离：上述乙酸乙酯浸膏用柱色谱分离纯化得到纯的化合物1。

所述制备方法，提取步骤所用的百部为直立百部、蔓生百部或对叶百部。

所述制备方法，分离步骤详细包括：(1)乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，与硅胶混合拌样，挥干溶剂后得拌样均匀的硅胶，装柱。用正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱(10:1,6:1,3:1,1:1,V/V)，收集正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱部分，减压回收溶剂；(2)取正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱物进一步用正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱(3:1,2:1,1:1，V/V)，收集正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱部分，减压回收溶剂；(3)取步骤(2)正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水(80:20)等度洗脱，收集4-5柱体积洗脱部位，浓缩；(4)取步骤(3)浓缩物用制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水(体积比80:20)洗脱部位得到纯的化合物1。

所述的化合物1或其药用盐在制备治疗血瘀疾病的药物中的应用。

本发明的化合物1可直接作为药物使用，其余辅料为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的药用载体或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、超填料以及药物制品辅剂。将所述的有效提取物或有效部位以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和口腔喷雾两种形式给药。

口服可用其固体或液体制剂，如粉剂、片剂、糖衣片剂、胶囊、酊剂、糖浆、滴丸剂等。

口腔喷雾可用其固体或液体制剂。

本发明药物可用于治疗血瘀疾病。

具体实施方式

实施例1：化合物1的制备

将干燥直立百部根(10kg)粉碎，用70％醇溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏，粗浸膏加水混悬均匀后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液浓缩后得到乙酸乙酯浸膏(625g)。乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，与硅胶混合拌样，挥干溶剂后得拌样均匀的硅胶，装柱。用正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱(10:1,6:1,3:1,1:1,V/V)，收集正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱部分，减压回收溶剂；取正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱物进一步用正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱(3:1,2:1,1:1，V/V)，收集正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱部分，减压回收溶剂；取正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水(80:20)等度洗脱，收集4-5柱体积洗脱部位，浓缩；取上述浓缩物用制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水(体积比80:20)得到纯的化合物1(12mg)；

将干燥蔓生百部根(8kg)粉碎，用70％醇溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏，粗浸膏加水混悬均匀后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液浓缩后得到乙酸乙酯浸膏(585g)。乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，与硅胶混合拌样，挥干溶剂后得拌样均匀的硅胶，装柱。用正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱(10:1,6:1,3:1,1:1,V/V)，收集正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱部分，减压回收溶剂；取正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱物进一步用正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱(3:1,2:1,1:1，V/V)，收集正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱部分，减压回收溶剂；取正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水(80:20)等度洗脱，收集4-5柱体积洗脱部位，浓缩；取上述浓缩物用制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水(体积比80:20)得到纯的化合物1(15mg)；

将干燥对叶百部根(10kg)粉碎，用70％醇溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏，粗浸膏加水混悬均匀后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液浓缩后得到乙酸乙酯浸膏(670g)。乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，与硅胶混合拌样，挥干溶剂后得拌样均匀的硅胶，装柱。用正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱 (10:1,6:1,3:1,1:1,V/V)，收集正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱部分，减压回收溶剂；取正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱物进一步用正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱(3:1,2:1,1:1，V/V)，收集正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱部分，减压回收溶剂；取正己烷-乙酸乙酯(1:1)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水(80:20)等度洗脱，收集4-5柱体积洗脱部位，浓缩；取上述浓缩物用制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水(体积比80:20)得到纯的化合物1(9mg)。化合物1结构鉴定：

淡红色粉末；HR-ESIMS显示[M+H]+为m/z 370.1916，结合核磁可得分子式为C₂₂H₂₇NO₄；¹HNMR(CDCl₃,δppm,600MHz)和¹³CNMR(CDCl₃,δppm,150MHz)数据见表1。结合DEPT、HSQC、HMBC、NOESY谱可确定其平面结构和相对构型。绝对构型通过ECD确证。

表1核磁共振信号归属数据

实施例2：药理学试验方法及活性数据

1、材料与试剂：新西兰大耳白兔，雄性，体质量1.6～2.5kg。化合物1为自制，HPLC纯度大于98％。凝血酶和纤维蛋白原(临用前配制)为上海生物制品研究所产品。

2、样品的制备：取10.80mg化合物1加10％乙醇溶液稀释成不同质量浓度。

3、体外抗凝血作用：

(1)对家兔血浆复钙时间的影响。家兔耳缘静脉取血4.5mL，加至含有38g/L枸橼酸钠0.5mL的10mL离心管中，混匀，1000r/min离心10min，取上清液备用。另取96孔板1个，实验组每孔加入混合血浆0.1mL及不同质量浓度化合物1(0.216、0.108、0.054mg/mL)各0.1mL，对照组加入混合血浆0.1mL及10％乙醇溶液0.1mL，于37℃温育1min后分别向每孔加入2.775g/LCaCl₂溶液0.1mL，计时，直到检测到纤维蛋白丝时停止计时，重复10次，求平均值，即为血浆复钙时间。

(2)对凝血酶时间的影响。同上制备混合血浆，在96孔板加入混合血浆和不同质量浓度化合物1(0.216、0.108、0.054mg/mL)各0.1mL，37℃温育3min，再加入已预温的1×10⁴U/L凝血酶0.1mL，混匀，记录血浆凝固所需时间。以10％乙醇溶液为对照，每组重复10次，取平均值。

4、体外抗血栓作用：

(1)溶栓作用。家兔耳缘静脉采血置试管中，按体积比1:9加入质量浓度为38g/L枸橼酸钠溶液，然后依次加入纤维蛋白原溶液(质量分数为0.5％)、CaCl₂溶液(55.5g/L)和凝血酶溶液(1.0×10⁵U/L)，加入量为每毫升血中加入纤维蛋白原溶液20μL、CaC1₂溶液10μL和凝血酶溶液20μL。混匀，注入到内径为8mm的玻璃试管中，37℃水浴20min后取出血栓，切成5mm的小段，放入装有不同质量浓度化合物1(0.216、0.108、0.054mg/mL)和10％乙醇溶液各2mL的试管中，37℃温育，于0、4、12、24、48h分别测定剩余血栓段的质量，计算血栓溶解率，重复测定10次。

(2)对全血凝块的溶解作用。家兔心脏采血20mL置于表面皿中，2h后自然凝固后切成0.3cm³的小块，用生理盐水淋洗3遍待用。将不同质量浓度化合物1(0.216、0.108、0.054mg/mL)及10％乙醇溶液各2mL加入不同西林瓶中，每组5小瓶，再向各瓶中随机加入2个血块，37℃水浴保温，观察血块溶解情况，分别于0、12、24、48h分别测血块的质量，计算全血凝块溶解率。

5、结果：不同质量浓度的化合物1均能显著延长家兔血浆复钙时间和凝血酶时间(见表2)；与对照组比较，化合物1在不同时间点均显示出较强的溶解全血凝块的作用，且随着给药时间的延长，全血凝块溶解率增加(见表3)。

表2化合物1对家兔血浆复钙时间和凝血酶时间的影响

备注：与10％乙醇组比较，各给药组P＜0.01

表3化合物1对体外血栓与全血凝块的溶解作用

备注：与10％乙醇组比较，各给药组P＜0.01。

Claims

1.下述结构式所示的生物碱化合物1，

2.一种用于预防或治疗血瘀疾病的药物组合物，其包含权利要求1所述的化合物1和至少一种药学上可接受的载体。

3.权利要求1所示的化合物1的制备方法，包括：

(1)提取：将干燥百部根粉碎，用70％乙醇溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏，粗浸膏加水混悬均匀后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液浓缩后得乙酸乙酯浸膏；

(2)分离：上述乙酸乙酯浸膏用柱色谱分离纯化得到纯的化合物1，具体包括如下步骤：乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，与硅胶混合拌样，挥干溶剂后得拌样均匀的硅胶，装柱，依次用体积比10:1、6:1、3:1和1:1的正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷-乙酸乙酯体积比1:1洗脱部分，减压回收溶剂；对正己烷-乙酸乙酯体积比1:1洗脱部分进一步依次用体积比3:1、2:1和1:1的正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，收集正己烷-乙酸乙酯体积比1:1洗脱部分，减压回收溶剂，然后对该洗脱部分进行反相硅胶柱层析，用体积比为80:20的甲醇-水等度洗脱，收集4-5柱体积洗脱部分，浓缩得浓缩物，再取该浓缩物用制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水体积比80:20洗脱部分得到纯的化合物1。

4.根据权利要求3所述的制备方法，提取步骤所用百部为直立百部、蔓生百部或对叶百部。

5.权利要求1所述的化合物1在制备治疗血瘀疾病药物中的应用。