CN115364274A - 一种血人参乙醇提取物水凝胶的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血人参乙醇提取物水凝胶剂的制备方法及应用。通过单因素考察和正交试验设计法筛选得到PVA/Lig/CS水凝胶最优处方，即PVA用量7.0 g、CS用量4.0 g、Lig用量0.5 g，最优制备工艺为冻融循环次数4次，每次冻结6 h。血人参乙醇提取物水凝胶剂ISs‑EthE‑Gel是利用混合水凝胶三维聚合物网络结构使结合的血人参乙醇提取物从水凝胶中持续释放，以防止巨噬细胞向炎症部位的过度迁移、聚集，通过改善创伤区的微环境促进创面快速愈合。

Description

一种血人参乙醇提取物水凝胶的制备及应用
技术领域
本发明涉及血人参提取技术领域，特别是一种血人参乙醇提取物水凝胶的制 备方法及应用。
背景技术
皮肤组织作为保护器官免受感染和环境变化的屏障，具有至关重要的作用， 但皮肤因各种物理、化学和微生物因子等因素引发的急、慢性创面常难以愈合， 甚至伴有大量腐肉、脓液和恶臭等，严重影响患者的生活质量。因此对创面愈合 进行干预以加速创面愈合是皮肤创面治疗的首要目标。
目前，皮肤创伤修复药物治疗因其便携性广受研究者关注。但大部分皮肤创 面用药，主要包括抗菌剂(抗生素、含银物质等)、干细胞疗法、生长因子等， 常存在生物安全性差、易产生耐药性，成本较高，稳定性较差等不足。天然药物 来源的中药因具有调控炎症细胞的增殖迁移、改善局部微循环、影响生长因子分 泌及成本较低等特点，在创面治疗方面具有一定优势。但由于有效组分复杂，中 药在应用方面上受到一定限制。近年来，随着研究的深入，基于一定创面敷料的 中药提取物在加速创面愈合及改善预后质量等方面的研究备受关注，并取得了有 效的进展。
血人参(Indigofera stachyodes，ISs)为豆科植物木蓝属茸毛木蓝 (Indigoferaatachyoides Lindl)的干燥根，是苗族民间常用药，于2003年 被《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载，应用历史悠久，其味甘、微苦， 性温，归肝、肾、大肠经，具有滋阴补虚、调经摄血、活血舒筋的功效，主治崩 漏，主要分布于云南、贵州、福建、广西等地，尤以贵州贵阳、安顺、黔西南、 黔东南等地分布广泛。
创面愈合是一个复杂的过程，在创面愈合治疗中创伤区微环境的重要性常被 忽视。水凝胶敷料因具备改善创面微环境等多种优势使其在皮肤创面治疗中逐渐 被关注，目前常用的聚乙烯醇/壳聚糖水凝胶具有良好的生物相容性、保湿性和 抗菌性能，但其较差的机械强度限制了其在伤口敷料中的广泛应用。苗药血人参 具有抗菌、抗氧化、抗炎的生理活性，同时能够显著抑制巨噬细胞向炎症部位迁 移和聚集。目前关于血人参应用于创面愈合的研究在国内外尚未见报道。而创面 愈合是一个复杂的过程，在创面愈合治疗中创伤区微环境的重要性常被忽视。本 发明是根据目的在于制备一种载有苗药血人参乙醇提取物的水凝胶作为创面敷 料，以期为皮肤创面愈合提供新型敷料，并为皮肤创面愈合药物的开发提供理论 基础。
发明内容
本发明是一种血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法及应用。目的在于制备一 种载有苗药血人参乙醇提取物的水凝胶作为创面敷料，该水凝胶是由木质素、聚 乙烯醇和壳聚糖组成，以木质素提高水凝胶的机械强度和伤口环境调节能力，以 壳聚糖增强创面的抗菌能力及以聚乙烯醇维持创面周围的润湿环境，并利用混合 水凝胶三维聚合物网络结构使结合的血人参乙醇提取物从水凝胶中持续释放以 防止巨噬细胞向炎症部位的过度迁移、聚集，以期通过改善创伤区的微环境以促 进创面快速愈合。以期为皮肤创面愈合提供新型敷料，并为皮肤创面愈合药物的 开发提供理论基础。
本发明的技术方案：
一种血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，所述血人参乙醇提取物水凝胶的 制备方法为：
(1)壳聚糖Chitosan溶液的制备：称取2.0～5.0g的CS溶于1～3％乙酸溶 液中，80～100℃恒温水浴搅拌至溶解，即得CS溶液；
(2)聚乙烯醇Polyvinyl alcohol溶液的制备：称取6.0～8.0g的PVA溶于 入超纯水中，在恒温水浴下搅拌至溶解，即得PVA溶液；
(3)木质素Lignin溶液的制备：称取0.5～1.5g的Lig溶于超纯水中，常 温磁力搅拌混匀，即得Lig溶液；
(4)血人参乙醇提取物浸膏粉ISs-EthE的制备：称取血人参药材适量，剪 断或切碎，加60％乙醇回流提取，过滤，滤渣加60％乙醇回流提取，过滤；合并 两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干燥至含水量<5％，即得血人 参乙醇提取物浸膏粉；
(5)血人参乙醇提取物水凝胶ISs-EthE-Gel的制备：称取血人参乙醇提取 物浸膏粉，精密称定，以60％乙醇溶液溶解，加入PVA溶液搅拌，混匀后加入Lig 溶液混合，继续搅拌均匀后加入CS溶液，得到的混合溶液离心3min脱气处理， 采用冻融法在-20℃下物理交联，即得含药水凝胶ISs-EthE-Gel。
前述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，步骤(1)中，所述壳聚糖 Chitosan溶液的制备为：称取4.0g的CS溶于2％乙酸溶液71g中，90℃恒温水 浴搅拌至溶解，即得CS溶液。
前述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，步骤(2)中，所述聚乙烯醇 Polyvinylalcohol溶液的制备为：称取7.0g的PVA溶于入32g超纯水中， 在90℃恒温水浴下搅拌至溶解，即得PVA溶液。
前述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，步骤(3)中，所述木质素溶液 的制备为：称取0.5g的Lig溶于9g超纯水中，常温磁力搅拌混匀，即得Lig 溶液。
前述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，步骤(4)中，所述血人参乙醇 提取物浸膏粉ISs-EthE的制备为：称取血人参药材适量，剪断或切碎，加5-7 倍量60％乙醇回流提取1-3h，过滤，滤渣加3-5倍量60％乙醇回流提取1-2h， 过滤，合并两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干燥至含水量<5％， 即得血人参乙醇提取物浸膏粉。
具体的说，前述的血人参乙醇提取物含量测定方法，所述步骤(4)中，所 述血人参乙醇提取物浸膏粉ISs-EthE的制备为：称取血人参药材适量，剪断或 切碎，加6倍量60％乙醇回流提取2h，过滤，滤渣加4倍量60％乙醇回流提取 1.5h，过滤，合并两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干燥至含 水量<5％，即得血人参乙醇提取物浸膏粉。
前述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，步骤(5)中，所述血人参乙醇 提取物水凝胶ISs-EthE-Gel的制备为：称取血人参乙醇提取物浸膏粉0.5g，精 密称定，以60％乙醇溶液7mL溶解，加入PVA溶液搅拌，混匀后加入Lig溶液混 合，继续搅拌均匀后加入CS溶液，得到的混合溶液离心3min脱气处理，采用冻 融法在-20℃下物理交联，冻融循环次数4次，每次冻结6h，即得含药水凝胶 ISs-EthE-Gel。
一种血人参乙醇提取物水凝胶的应用，所述血人参乙醇提取物水凝胶 ISs-EthE-Gel在促创面愈合技术中的应用。
前述的应用，所述血人参乙醇提取物水凝胶ISs-EthE-Gel是利用混合水凝 胶三维聚合物网络结构使结合的血人参乙醇提取物从水凝胶中持续释放以防止 巨噬细胞向炎症部位的过度迁移、聚集，以期通过改善创伤区的微环境以促进创 面快速愈合。
与现有技术相比，本发明有益效果是：
1、传统水凝胶的材料主要包括天然高分子材料和人工合成高分子材料，如 海藻酸钠，聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)，壳聚糖(Chitosan，CS)等。 PVA是具有良好生物相容性的中性聚合物，其成膜性好，保湿性强、可生物降解、 无致癌性等。CS是多糖类天然聚合物，具有大量的多孔结构及抗菌、止血活性。 PVA和CS构成复合水凝胶具有良好的生物相容性、保湿性和抗菌能力，但其较 差的机械强度限制了其在伤口敷料中的应用。木质素(Lignin，Lig)是由苯丙 类单元组成的无定形多聚芳香族，具有复杂多变的化学结构，将木质素用于构建 三维网状水凝胶时其含量可以显著影响水凝胶的力学性质。因此将PVA，LIg和 CS混合制备水凝胶通过PVA的保湿性能、CS的抗菌性以及Lig的机械性能，将 得到具有潜力的创面愈合新敷料。
2、创面愈合是一个复杂的过程，在创面治疗中创伤区微环境的重要性常被 忽视。常用的聚乙烯醇/壳聚糖水凝胶具有良好的生物相容性、保湿性和抗菌能 力，但其较差的机械强度限制了其在伤口敷料中的广泛应用。木质素能增加水凝 胶的力学性质。苗药血人参具有抗菌、抗氧化、抗炎的生理活性，同时能够显著 抑制巨噬细胞向炎症部位迁移和聚集。本发明水凝胶是由木质素、聚乙烯醇和壳 聚糖组成，旨在以木质素提高水凝胶的机械强度和伤口环境调节能力，以壳聚糖 增强创面的抗菌能力及以PVA维持创面周围的润湿环境，并利用混合水凝胶三维 聚合物网络结构使结合的血人参乙醇提取物从水凝胶中持续释放以防止巨噬细 胞向炎症部位的过度迁移、聚集，以期通过改善创伤区的微环境以促进创面快速 愈合。
3、巨噬细胞在创面愈合过程扮演重要角色，经创面微环境的刺激可活化为 M1表型(促炎)或M2表型(抗炎)。当接触皮肤损伤信号时，单核巨噬细胞被 激活获得M1表型，同时释放促炎细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-1、IL-1β等)以 募集更多的巨噬细胞，促进巨噬细胞浸润参与炎症的发生过程。但失去控制的趋 化和迁移，将导致过多的炎性细胞及炎症因子聚集创面局部，产生持续、强烈的 炎症，甚者危及生命。因此抑制巨噬细胞向炎症部位的过度迁移、聚集是创面愈 合炎症期治疗的关键因素之一。同时在创面愈合进程中，M2型巨噬细胞通过释 放抗炎细胞因子(IL-4、IL-10等)抑制炎症和促进组织再生。且M2型巨噬细 胞过表达高水平的Arg-1酶是胶原蛋白合成、组织重塑、细胞增殖和纤维化所需 多胺的催化剂，在创面愈合后期起着重要作用。因此，设计促进M1型巨噬细胞 向M2表型巨噬细胞极化的敷料是创面愈合敷料开发的新途径。血人参乙醇提取 物(ISs-EthE)具有巨噬细胞向急性创伤部位募集的作用。因此，本研究水凝胶 是由Lig、PVA和CS制备的混合材料，旨在以木质素提高水凝胶的机械强度，以 壳聚糖增强创面的抗菌性能及以PVA维持创面周围的润湿环境，并利用混合水凝 胶三维聚合物网络结构使ISs-EthE从水凝胶中持续释放，防止巨噬细胞向炎症 部位的过度迁移、聚集，加快皮肤创面愈合，具体见图1。以期为皮肤创面愈合提供新型敷料，并为皮肤创面愈合药物的开发提供理论基础。
附图说明
图1：全文技术路线图；
图2：不同pH(5.0，6.0，7.0)ISs-EthE-Gel的累积释放率结果(儿茶素)；
图3：不同pH(5.0，6.0，7.0)ISs-EthE-Gel的累积释放率结果(表儿茶 素)；
图4：不同冻融循环次数水凝胶的溶胀率实验结果；
图5：不同冻融循环次数水凝胶的保湿率实验结果；
图6：不同冻融循环次数水凝胶的儿茶素累积释放率实验结果；
图7：不同冻融循环次数水凝胶的表儿茶素累积释放率实验结果；
图8：不同冻结时间水凝胶的溶胀率实验结果；
图9：不同冻结时间水凝胶的保湿率实验结果；
图10：不同冻结时间水凝胶的儿茶素累积释放率实验结果；
图11：不同冻结时间水凝胶的表儿茶素累积释放率实验结果；
图12：不同基质比水凝胶的溶胀率实验结果；
图13：不同基质比水凝胶的保湿率实验结果；
图14：不同基质比水凝胶的儿茶素累积释放率实验结果；
图15：不同基质比水凝胶的表儿茶素累积释放率实验结果；
图16：不同木质素含量水凝胶的溶胀率实验结果；
图17：不同木质素含量水凝胶的保湿率实验结果；
图18：不同木质素含量水凝胶的儿茶素累积释放率实验结果；
图19：不同木质素含量水凝胶的表儿茶素累积释放率实验结果；
图20：PVA水凝胶的FTIR；
图21：PVA/Lig水凝胶的FTIR；
图22：PVA/Lig/CS水凝胶的FTIR；
图23：ISs-EthE-Gel的FTIR(ISs-EthE-Gel)；
图24：PVA/Lig/CS水凝胶的宏观形态表征；
图25：ISs-EthE-Gel水凝胶的宏观形态表征；
图26：PVA/Lig/CS水凝胶的微观形态表征；
图27：ISs-EthE-Gel水凝胶的微观形态表征；
图28：水凝胶的溶胀率实验结果；
图29：水凝胶的保湿性实验结果；
图30：ISs-EthE-Gel中两种指标成分累积释放曲线；
图31：水凝胶的流变学结果；
图32：水凝胶的力学性能实验结果。；
图33：ISs-EthE-Gel的细胞生物相容性试验结果(n＝3)；
图34：不同时间点ISs-EthE-Gel的细胞划痕区域直观记录结果(划痕实验 直观记录图)；
图35：不同时间点ISs-EthE-Gel的细胞划痕区域面积定量结果(划痕实验 定量结果愈合率表示(n＝3)，与Blank组相比，**P<0.01，***P<0.001，与Blank 组8h相比，##P<0.01，###P<0.001)；
图36：ISs-EthE-Gel的对细胞炎症因子TNF-α的影响(n＝3)(*P<0.05， **P<0.01)；
图37：ISs-EthE-Gel的对细胞炎症因子IL-6的影响(n＝3)(*P<0.05， **P<0.01)；
图38：ISs-EthE及其有无CS水凝胶的抑菌(S.aureus和E.coli)结果图；
图39：ISs-EthE及其有无CS水凝胶的对S.aureus的抑菌结果；
图40：ISs-EthE及其有无CS水凝胶的对E.coli的抑菌结果；
图41：构建大鼠全层皮肤损伤模型并给予水凝胶治疗的示意图；
图42：给予药物处理伤口后各组第3d、7d和14d的伤口记录图
图43：14天内伤口面积变化示意图(a，Negative control；b，ISs-EthE； c，Gel；d，ISs-EthE-Gel；e，Positive Control)；
图44：给予药物处理伤口后各组第3d、7d和14d的创面愈合率(n＝5； 与Negativecontrol相比，*P<0.05，***P<0.001))；
图45：再生组织在第3d、7d和14d的H&E染色图像；
图46：3d和7d再生组织中CD86的免疫组化染色照片；
图47：3d和7d再生组织中CD163的免疫组化染色照片；
图48：第7d和第14d再生组织中CD86含量量统计(n＝3，与模型组相比， *P<0.05，**P<0.01)；
图49：3d和7d再生组织中CD163含量统计(n＝3，与模型组相比，*P<0.05， **P<0.01)；
图50：7d和14d再生组织中CD31免疫组化染色图片(新生毛细血管(↑))；
图51：7d和14d再生组织中Masson染色图片(胶原纤维(↑))；
图52：7d和14d再生组织中CD31含量(n＝3，与模型组相比，*P<0.05， **P<0.01)；
图53：7d和14d再生组织中胶原蛋白体积分数统计(n＝3，与模型组相比， *P<0.05，**P<0.01)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依 据。
实施例1：
1、血人参乙醇提取物水凝胶剂制作方法：
(1)壳聚糖(Chitosan，CS)溶液的制备：称取4.0g的CS溶于2％乙酸溶 液中，90℃恒温水浴搅拌至溶解，即得CS溶液；
(2)聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol)溶液的制备：称取7.0g的PVA溶于 入超纯水中，在恒温水浴下搅拌至溶解，即得PVA溶液；
(3)木质素(Lignin)溶液的制备：称取0.5的Lig溶于超纯水中，常温 磁力搅拌混匀，即得Lig溶液；
(4)血人参乙醇提取物浸膏粉(ISs-EthE)的制备：称取血人参药材适量， 剪断或切碎，加6倍量60％乙醇回流提取2h，过滤，滤渣加4倍量60％乙醇回 流提取1.5h，过滤，合并两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干 燥至含水量<5％，即得血人参乙醇提取物浸膏粉；
(5)血人参乙醇提取物水凝胶(ISs-EthE-Gel)的制备：称取血人参乙醇 提取物浸膏粉，精密称定，以60％乙醇溶液溶解，加入PVA溶液搅拌，混匀后加 入Lig溶液混合，继续搅拌均匀后加入CS溶液，得到的混合溶液离心3min脱气 处理，采用冻融法在-20℃下物理交联，即得含药水凝胶(ISs-EthE-Gel)。
2、制剂制备：将血人参乙醇提取物水凝胶剂ISs-EthE-Gel进行无菌灌装， 即得。
3、使用方法：直接外敷于创面。
4、功效：创面修复，包括疤痕体质等。
实施例2：
1、血人参乙醇提取物水凝胶剂制作方法：
(1)壳聚糖(Chitosan，CS)溶液的制备：称取2.0g的CS溶于1％乙酸溶 液中，80℃恒温水浴搅拌至溶解，即得CS溶液；
(2)聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol)溶液的制备：称取6.0g的PVA溶于 入超纯水中，在恒温水浴下搅拌至溶解，即得PVA溶液；
(3)木质素(Lignin)溶液的制备：称取0.5g的Lig溶于超纯水中，常温 磁力搅拌混匀，即得Lig溶液；
(4)血人参乙醇提取物浸膏粉(ISs-EthE)的制备：称取血人参药材适量， 剪断或切碎，加5倍量60％乙醇回流提取1h，过滤，滤渣加3倍量60％乙醇回 流提取1h，过滤，合并两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干燥 至含水量<5％，即得血人参乙醇提取物浸膏粉；
(5)血人参乙醇提取物水凝胶(ISs-EthE-Gel)的制备：称取血人参乙醇 提取物浸膏粉，精密称定，以60％乙醇溶液溶解，加入PVA溶液搅拌，混匀后加 入Lig溶液混合，继续搅拌均匀后加入CS溶液，得到的混合溶液离心3min脱 气处理，采用冻融法在-20℃下物理交联，即得含药水凝胶(ISs-EthE-Gel)。
2、制剂制备：将血人参乙醇提取物水凝胶剂ISs-EthE-Gel均匀涂布于背衬 材料上制成的贴膏剂，即得。
3、使用方法：直接贴于创面。
4、功效：创面修复，包括疤痕体质等。
实施例3：
1、血人参乙醇提取物水凝胶剂制作方法：
(1)壳聚糖(Chitosan，CS)溶液的制备：称取4.0g的CS溶于3％乙酸溶 液中，100℃恒温水浴搅拌至溶解，即得CS溶液；
(2)聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol)溶液的制备：称取8.0g的PVA溶于 入超纯水中，在恒温水浴下搅拌至溶解，即得PVA溶液；
(3)木质素(Lignin)溶液的制备：称取1.5g的Lig溶于超纯水中，常温 磁力搅拌混匀，即得Lig溶液；
(4)血人参乙醇提取物浸膏粉(ISs-EthE)的制备：称取血人参药材适量， 剪断或切碎，加7倍量60％乙醇回流提取3h，过滤，滤渣加5倍量60％乙醇回 流提取2h，过滤，合并两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干燥 至含水量<5％，即得血人参乙醇提取物浸膏粉；
(5)血人参乙醇提取物水凝胶(ISs-EthE-Gel)的制备：称取血人参乙醇 提取物浸膏粉，精密称定，以60％乙醇溶液溶解，加入PVA溶液搅拌，混匀后加 入Lig溶液混合，继续搅拌均匀后加入CS溶液，得到的混合溶液离心3min脱 气处理，采用冻融法在-20℃下物理交联，即得含药水凝胶(ISs-EthE-Gel)。
2、制剂制备：将血人参乙醇提取物水凝胶剂ISs-EthE-Gel均匀涂布于背衬 材料上制成的贴膏剂，即得。
3、使用方法：直接贴于创面。
4、功效：创面修复，包括疤痕体质等。
实施例4：
1、水凝胶贴膏剂制作方法：
1、血人参乙醇提取物水凝胶剂制作方法：
(1)壳聚糖(Chitosan，CS)溶液的制备：称取3.0g的CS溶于2％乙酸溶 液中，90℃恒温水浴搅拌至溶解，即得CS溶液；
(2)聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol)溶液的制备：称取8.0g的PVA溶于 入超纯水中，在恒温水浴下搅拌至溶解，即得PVA溶液；
(3)木质素(Lignin)溶液的制备：称取0.5g的Lig溶于超纯水中，常温 磁力搅拌混匀，即得Lig溶液；
(4)血人参乙醇提取物浸膏粉(ISs-EthE)的制备：称取血人参药材适量， 剪断或切碎，加7倍量60％乙醇回流提取1h，过滤，滤渣加4倍量60％乙醇回 流提取1.5h，过滤，合并两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干 燥至含水量<5％，即得血人参乙醇提取物浸膏粉；
(5)血人参乙醇提取物水凝胶(ISs-EthE-Gel)的制备：称取血人参乙醇 提取物浸膏粉，精密称定，以60％乙醇溶液溶解，加入PVA溶液搅拌，混匀后加 入Lig溶液混合，继续搅拌均匀后加入CS溶液，得到的混合溶液离心3min脱 气处理，采用冻融法在-20℃下物理交联，即得含药水凝胶(ISs-EthE-Gel)。
2、制剂制备：将血人参乙醇提取物水凝胶剂(ISs-EthE-Gel)均匀涂布于 背衬材料上制成的贴膏剂，即得。
3、使用方法：直接贴于创面。
4、功效：创面修复，包括疤痕体质等。
本发明做了大量实验分析，具体如下：
一血人参乙醇提取物水凝胶的制备与表征
目前，水凝胶敷料在创面愈合治疗中应用较为广泛，主要原因可能是水凝胶 能防止微生物进入伤口，同时为伤口提供一个润湿环境，且其多孔性可以有效提 高水蒸气渗透性。本发明将开发PVA/Lig/Cs水凝胶，采用单因素考察法和正交 试验设计法依次对PVA/Lig/Cs水凝胶制备工艺和制备处方进行筛选优化，得到 最佳制备工艺和制备处方，对其进行形态学、保湿性能和力学性能考察，评价其 作为创面愈合候选新敷料的可行性。
1实验材料
1.1试药
名称 批号 生产厂家
壳聚糖 RH300965 罗恩试剂
木质素 RH238608 罗恩试剂
乙酸 RH197136 罗恩试剂
PVA-124 181207 西陇科学股份有限公司
儿茶素 170209 PureChem S<sub>TANDARD</sub>
表儿茶素 110878-201703 中国食品药品检定研究院
血人参药材 20210322 贵阳德昌祥药业有限公司
甲醇 10014118 国药集团化学试剂有限公司
乙醇 1000 国药集团化学试剂有限公司
PBS磷酸缓冲液 P1010 Solarbio
1.2仪器
名称 生产厂家
DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司
HJ-6A型数据恒温磁力搅拌器 常州国华电器有限公司
TDL-5A型大容量离心机 上海程捷仪器设备有限公司
DZF-6210型真空干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司
101-3AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司
FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司
Thermo Fisher Nicolet Is10-透射/ATR红外 Thermo Scientific
2PVA/Lig/CS水凝胶的制备
(1)壳聚糖(Chitosan，CS)溶液的制备：称取CS(4.0g)溶于1～3％乙 酸溶液中，80～100℃恒温水浴搅拌至溶解，即得CS溶液；
(2)聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)溶液的配制：称取PVA(7.0g) 溶于入超纯水(32g)中，恒温水浴(90℃)搅拌至溶解，即得。
(3)木质素(Lignin，Lig)溶液的制备：称取Lig(0.5g)溶于超纯水 (9g)中，常温磁力搅拌混匀，即得。
(4)PVA/Lig/CS水凝胶的制备
先将PVA溶液与Lig溶液混合，搅拌均匀后加入CS溶液，得到的混合溶液 进行离心(2000r·min-1，3min)脱气处理，采用冻融法(冷冻-解冻)在-20℃ 下物理交联，冻融循环次数4次，每次冻结6h，得空白水凝胶(Gel)。
(5)血人参乙醇提取物浸膏粉ISs-EthE的制备
称取血人参药材适量，剪断或切碎，加6倍量乙醇(60％)回流提取2h，过 滤，滤渣加4倍量乙醇(60％)回流提取1.5h，过滤。合并两次滤液，减压回 收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干燥至含水量<5％，即得血人参乙醇提取物 (ISs-EthE)浸膏粉，出膏率约为18％。
2.1ISs-EthE-Gel的制备
称取血人参乙醇提取物(ISs-EthE)浸膏粉(0.5g)，精密称定，以60％ 乙醇溶液(7mL)溶解，加入PVA溶液搅拌，按照“(4)PVA/Lig/CS水凝胶 的制备”制备含药水凝胶(ISs-EthE-Gel)。
2.2不同pH对ISs-EthE-Gel累积释放率的影响
ISs-EthE中的指标成分儿茶素和表儿茶素属于儿茶酚类化合物，其对pH较 敏感，在pH>6的环境中极易降解，且pH值越大其降解程度越高，因此本研究按 照“2.1”项下制备ISs-EthE-Gel，将制备好的ISs-EthE-Gel置于不同pH的PBS (pH＝5.0、6.0、7.0)中，评价不同pH对水凝胶药物释放性能的影响。
2.3PVA/Lig/CS水凝胶制备工艺及处方的单因素考察
为了考察冻融循环次数、冻结时间、不同基质比、木质素含量对复合水凝胶 的影响，本研究选取的冻融循环次数分别为2、4、6次，冻结时间分别为6h、 12h、24h，PVA、Lig和CS比例(w/w)分别为8:1.0:2，7:1.0:3，6:1.0:4； Lig含量分别为0.5g、1.0g和1.5g。除筛选因素改变外，将其他因素固定， 即冻融循环次数和冻结时间分别为4次和6h，PVA、Lig和CS(w/w)为7:1.0: 3，Lig含量为1.0g。按照“(4)PVA/Lig/CS水凝胶的制备”项下制备空白 水凝胶，评价各因素对水凝胶的溶胀率和保湿度的影响。按照“2.1”项下制备 含药水凝胶，评价各因素对水凝胶的药物释放性能的影响。
2.4PVA/Lig/CS水凝胶制备工艺及处方的正交试验设计
为了进一步优化水凝胶的制备工艺和处方，本实验选取PVA用量(A)、CS 用量(B)、Lig用量(C)和冻融循环次数(D)为PVA/Lig/CS水凝胶制备工艺 和处方的考查因素，以水凝胶的溶胀度和累积释放率为评价指标，按L9(34)因 素水平表(表1)进行正交试验。
表1.因素水平
Figure BDA0003747141850000131
3PVA/Lig/CS水凝胶的表征
3.1傅立叶红外光谱(FTIR)
将PVA水凝胶、PVA/Lig水凝胶、PVA/Lig/CS水凝胶和ISs-EthE-Gel冷冻 干燥，干燥后的水凝胶分别使用FTIR分析仪测量FTIR光谱，分辨率为4cm-1， 扫描次数为16次，光谱范围为4000～500cm-1。
3.2形态学表征
将PVA/Lig/CS水凝胶和ISs-EthE-Gel用相机记录其形态，同时进行冷冻干 燥，干燥后样品折断，暴露横截面，喷金干燥后用扫描电子显微镜观察其微观形 态。
3.3溶胀性能
将水凝胶试样真空干燥(48h)，称重(质量记为M0)，加入50mL超纯水 使其在常温下充分膨胀，在t时刻取出试样，滤纸擦干表面水分，称重(质量记 为Mt)。按公式2.1计算水凝胶的溶胀率(Swelling Ratio)，每组3个平行样 品，求平均值。
Figure BDA0003747141850000132
3.4保湿性能
将水凝胶试样真空干燥(48h)，称重(质量记为M0)，加超纯水(50mL) 使其在常温下膨胀，充分溶胀后称重(质量记为Me)。将充分溶胀后的水凝胶置 于恒温箱(37℃)中，在t时刻取出试样，称重(质量记为Mt)，计算保湿度 (Moisturizing)，每组3个平行样品，求平均值。
Figure BDA0003747141850000141
3.5释放性能
将水凝胶试样置于PBS溶液(20mL)中，恒温振荡(37℃)，分别在1、2、 3、4、5、7、12、24、36、48h取出释放介质(10mL)，同时补充同等体积的 空白释放介质，将取出的释放介质置于蒸发皿中干燥，待其完全蒸发后，加入 50％甲醇溶液溶解残留物质并定容至5mL，过滤(0.22μm，有机膜)，取10μL 进样分析，计算水凝胶试样的累积释放率(Cumulative releaserate)，每组 3个平行样品，求平均值。
Figure BDA0003747141850000142
其中，Ci为第i次取样，试样在释放体系中药物的浓度(μg·mL-1)；Ci-1为第i-1次取样，试样在释放体系中药物的浓度(μg·mL-1)；W0为试样中负载 的药物总量(μg)。
3.6流变学性能
将水凝胶置于平行板(直径为20.0mm)上，以1.0mm的固定间隙值进行频 率扫描分析。固定应变为1％，以0.01Hz～10Hz的频率范围，进行扫频测试， 实验过程中温度保持为25℃。
3.7力学性能
将水凝胶切成条状(4.5mmⅹ1.5mmⅹ10mm)，采用万能试验机以50.0 mm·min-1的拉伸速率进行拉伸测试，记录拉伸过程中水凝胶应变值和应力值。
4统计学分析
实验数据采用均值±标准差(SD)表示，并使用t-test和one-way ANOVA 进行数据统计学差异分析。当P<0.05时表明具有显著性差异，以*表示；当P<0.01 时表明具有极其显著性差异，以**表示；当P<0.001时表明具有十分显著性差异， 以***表示。实验数据均使用SPSS 21.0进行统计分析，并由GraphPad Prism 8 进行图像绘制。
5实验结果
5.1不同pH对ISs-EthE-Gel累积释放率的影响
ISs-EthE-Gel在不同pH(5.0，6.0，7.0)中累积释放率结果(图2和图3) 显示，儿茶素(图2)和表儿茶素(图3)的累积释放率与pH呈负相关，在pH＝5 的PBS溶液中累积释放率最大，药物释放率分别为92.3％和86.4％，在pH＝7的 PBS溶液中累积释放率最低，药物释放率分别为48.8％和9.8％，其中表儿茶素表 现出更强的pH敏感性，这可能与儿茶素和表儿茶素在pH>6时发生异构化导致其 降解，且表儿茶素的异构化率高于儿茶素有关。因此后续实验以pH＝5的释放介 质进行。
5.2PVA/Lig/CS水凝胶制备工艺及处方的单因素考察
5.2.1冻融循环次数
采用冻融法制备PVA水凝胶的机制被认为是在冷冻状态下，随着冻融循环增 加，水冻结、膨胀，推动PVA链与其他高分子材料链紧密接触，形成高分子无规 则状的高密度区，促进氢键和晶体的形成。不同冻融循环次数水凝胶溶胀率的实 验结果(图4)显示，不同冻融循环次数的复合水凝胶均在12h后到达溶胀平 衡状态，经过4次循环后，水凝胶的溶胀率达到最佳，溶胀率为374.8％。研究 表明水凝胶交联度越高，水分子的渗透率越低，当冻融循环增加至6次时水凝胶 溶胀率几乎不变，说明水凝胶冻融至4次时其交联程度可能已达到最大。因此， 第2次和第4次冻融循环之间溶胀率的增加可能与水凝胶稳定结构(氢键和晶体 等)的形成有关，且冻融4次水凝胶在0～200min时保湿率略高于冻融2次和冻 融6次水凝胶的保湿率(图5)。不同冻融循环次数对含药水凝胶累积释放率影 响的实验结果显示，冻融2次水凝胶中儿茶素(图6)和表儿茶素(图7)的累 积释放率最大，其次是交联6次和交联4次的水凝胶，该结果可能与冻融2次水 凝胶内部形成的氢键或晶体还未稳定有关。
5.2.2冻结时间
不同冻结时间水凝胶溶胀率的实验结果(图8)显示，不同冻结时间的水凝 胶均在12h后达到溶胀平衡状态，冻结6h水凝胶的溶胀率达到最佳，溶胀率 为401.4％，较冻结12h和24h水凝胶的平衡溶胀度(350.0％)高，说明冻结6 h后水凝胶形成的微晶和氢键数量可能达到最大，冻融时间增加至12h时水凝 胶形成的微晶和氢键可能逐渐趋于稳定，导致水凝胶水分渗透率也趋于稳定，因 此冻结12h和24h水凝胶的溶胀率几乎保持不变，且在0～200min内冻结12h 和24h水凝胶的保湿率略高于冻结6h水凝胶的保湿率(图9)。不同冻结时间水凝胶累积释放率的实验结果显示，冻结6h和24h水凝胶中儿茶素(图10) 和表儿茶素(图11)累积释放率较12h高，可达80％以上，这可能与冻结12h 后水凝胶中的高分子PVA、CS和Lig在交联过程中形成稳定紧密的微晶和氢键有 关。冻结24h水凝胶的累积释放率反而增大，猜想可能该时间点水凝胶中的微 晶和氢键已经形成有序排列的形状，促进药物更有序释放。
因冻结6h和24h可得到相同药物累积释放率的水凝胶，且冻结6h水凝 胶的溶胀率更佳，研究表明，水凝胶溶胀率是衡量其吸收伤口渗出液能力的关键 因素之一，因此本研究后续采用冻结6h进行水凝胶的制备。
5.2.3不同基质比
不同基质比水凝胶溶胀率的实验结果(图12)显示，PVA/Lig/CS(6:1.0:4) 水凝胶溶胀率最大，可达至284.0％，其次是PVA/Lig/CS(7:1.0:3)水凝胶 (265.6％)和PVA/Lig/CS(8:1.0:2)水凝胶(238.2％)。该结果表明水凝胶 处方中PVA和CS比值越小，水凝胶的溶胀度可能越大，其中CS对水凝胶的溶胀 度可能起主导作用。水凝胶保湿率的实验结果(图13)显示，凝胶处方中PVA 和CS比值越小，水凝胶的保湿性越小。不同基质比水凝胶累积释放率的实验结 果显示，PVA/Lig/CS(6:1.0:4)水凝胶中儿茶素(图14)和表儿茶素(图15)的累积释放率最大，分别为101.4％和85.4％。其次是PVA/Lig/CS(8:1.0:2) 水凝胶和PVA/Lig/CS(7:1.0:3)水凝胶，二者的儿茶素累计释放率分别是93.9％、 77.7％，表儿茶素的累积释放率分别为84.5％、64.8％。
5.2.4木质素含量
在木质素含量分别为0.5g、1.0g和1.5g的水凝胶处方中，PVA/Lig/CS (7:0.5:3)水凝胶的溶胀率(图16)和保湿率(图17)最高，该结果表明水 凝胶木质素在处方中的比例越小，水凝胶的溶胀率和保湿率可能越大。不同木质 素含量水凝胶的累积释放率实验结果(图18和图19)显示，PVA/Lig/CS(7:1.5: 3)水凝胶儿茶素(图18)和表儿茶素(图19)的累积释放率最大，其次是 PVA/Lig/CS(7:1.0:3)水凝胶和PVA/Lig/CS(7:0.5:3)水凝胶，该结果表 明，水凝胶中木质素含量越大水凝胶的药物释放率可能越大。
5.3PVA/Lig/CS水凝胶制备工艺及处方的正交试验设计
为了进一步筛选PVA/Lig/CS水凝胶的制备工艺和制备处方，本实验采用了 正交试验设计法对其制备工艺和制备处方进行优化。单因素考察实验结果显示， PVA用量、CS用量、Lig用量、冻融循环次数均对水凝胶的溶胀率、药物累积释 放率影响较大，对保湿度的影响相对较小，因此正交试验以水凝胶的累积释放率 和溶胀度进行评价指标，综合评分。对正交试验结果进行分析与比较，筛选 PVA/Lig/CS水凝胶的最佳制备工艺和制备处方。由表1.2直观分析中的R值知， A、B、C、D四个因素对PVA/Lig/CS水凝胶的最佳制备工艺和制备处方的影响大 小为C>B>D>A，最优水凝胶制备工艺和制备处方为A2B3C1D2。表1.3方差分析结果显示，因素C(木质素用量)对PVA/Lig/CS水凝胶制备工艺和制备处方的 综合评分具有显著性影响，其余三个因素对PVA/Lig/CS水凝胶制备工艺和制备 处方的综合评分无显著影响。综合分析确定PVA/Lig/CS水凝胶的制备工艺和制 备处方为A2B3C1D2，即PVA用量7.0g、CS用量4.0g、Lig用量0.5g和冻融 循环次数4次。
表1.2.L9(34)正交试验表及结果
Figure BDA0003747141850000171
Figure BDA0003747141850000181
表1.3.方差分析表
变异来源 平方和 df 均方 F p
A 34.957 2 17.479 0.024 0.976
B 272.688 2 136.344 7.801 0.114
C 1440.601 2 720.3 41.21 0.024*
D 184.492 2 92.246 5.278 0.159
残差 34.957 2 17.479
5.4PVA/Lig/CS水凝胶剂的表征
5.4.1FTIR
PVA水凝胶、PVA/Lig水凝胶、PVA/Lig/CS水凝胶及ISs-EthE-Gel的FTIR 图谱如图20-23所示。1600～1400cm-1是木质素典型的芳香族骨架振动，PVA/Lig 水凝胶、PVA/Lig/CS水凝胶及ISs-EthE-Gel在1419和1569cm-1处表现出特征 峰，且1569cm-1的峰强增加，表明木质素与PVA交联成功。3280cm-1的强吸 收峰是由于-OH拉伸振动，PVA存在大量亲水基团羟基，故PVA水凝胶、PVA/Lig 水凝胶、PVA/Lig/CS水凝胶及ISs-EthE-Gel在3280cm-1均出现强吸收。 ISs-EthE-Gel在3280cm-1峰强增加，猜想ISs-EthE可能以氢键的形式包载于 PVA/Lig/CS水凝胶中。
5.4.2形态表征
PVA/Lig/CS水凝胶及其载药水凝胶如图24和图25所示，该凝胶成型行好且 具有良好的弹性。在扫描电镜下，PVA/Lig/CS水凝胶呈三维多孔网状结构(图 26)，该结果可能归因于木质素具有由多种活性基团(羟基、羧基和磺酸基团等) 构成的特殊化学结构和空间构象，同时这些基团与PVA的羟基形成氢键，与CS 的氨基形成离子键。将PVA/Lig/CS水凝胶作为药物储库对ISs-EthE进行装载后， 形成的ISs-EthE-Gel仍保持一定数量的网状结构(图27)，该结构使水分子容 易渗透，是具有良好的溶胀性能的保障，为其作为伤口敷料对伤口组织液、细胞 代谢物等具有良好吸收效果提供理论依据。
5.4.3溶胀性能
溶胀性能是水凝胶的一项重要指标，PVA/Lig/CS水凝胶及其载药水凝胶的溶 胀度结果(图28)显示，PVA/Lig/CS水凝胶的平衡溶胀度为(436.82±9.623)％，ISs-EthE-Gel的平衡溶胀度为(168.32±2.53)％，ISs-EthE-Gel溶胀度下降的 原因可能是ISs-EthE以氢键形式包载于PVA/Lig/CS水凝胶中，使水凝胶的交联 度增加，导致水凝胶水渗透率下降。
5.4.4保湿性能
理想的创面敷料应具有优良的保湿性能，敷料提供的润湿环境为表皮细胞的 再生和趋化提供有利条件，保持细胞因子活性，促进创面快速愈合。PVA/Lig/CS 水凝胶及其载药水凝胶的保湿性结果(图29)显示，同一时间点PVA/Lig/CS水 凝胶的保湿率较ISs-EthE-Gel高，ISs-EthE-Gel在短时间内具有一定的保湿性 能。
5.4.5释放性能
药物释药性能是考察水凝胶作为缓控释制剂应用的一项重要指标。本研究采 用最优处方和工艺制备ISs-EthE-Gel，其累积释放率试验结果(图30)显示， ISs-EthE-Gel中ISs-EthE指标成分儿茶素和表儿茶素均在8h后达到恒速释放， 二者的累积释放率分别为90.9％、60.8％。采用Origin2019b软件对儿茶素和表 儿茶素的累积释放数据与零级方程、一级方程和Higuchi平方根方程进行拟合， 结果显示(表1.4)，ISs-EthE-Gel中ISs-EthE指标成分儿茶素和表儿茶素的 释放规律均复合一级动力学，该结果说明PVA/Lig/CS水凝胶作为ISs-EthE的药 物储库可以对其进行缓释。
表1.4.ISs-EthE-Gel中两种指标成分释放数据的拟合情况
Figure BDA0003747141850000191
5.4.6流变学性能
PVA/CS水凝胶、PVA/Lig/CS水凝胶、ISs-EthE-Gel的流变性能结果如图31， 其中储能模量(G′)表示水凝胶的弹性，损耗模量(G″)表示粘度，结果显示， 三种类型的水凝胶均呈现出弹性行为和粘性行为，因储能模量值较损耗模量值 高，判断三种类型水凝胶以弹性行为为主。同时，在PVA/CS水凝胶中添加Lig 后，水凝胶的储能模量和损耗模量均降低，该结果表明Lig在水凝胶中可能具有 增加水凝胶黏度(机械强度)的作用。当PVA/Lig/CS水凝胶携载ISs-EthE后， 载药水凝胶(ISs-EthE-Gel)的储能模量显著增加，产生该现象的原因可能是， 在载药水凝胶制备过程中，药物与PVA混合后加入Lig混匀时，由于ISs-EthE 的溶剂为60％乙醇，因此，该乙醇可能也充当一定润湿剂的作用，使PVA、Lig 和CS混合更加均匀，导致最终形成的凝胶弹性更好。见图31。
5.4.7力学性能
为了探究Lig在水凝胶中的作用，我们将PVA/CS水凝胶、PVA/Lig/CS水凝 胶和ISs-EthE-Gel进行拉伸试验，试验结果(图32)显示，PVA/CS水凝胶断裂 时的应变(断裂拉伸率)和抗拉强度分别为86.3％和8.0kPa，PVA/CS水凝胶 在变形过程中表现出明显的应变硬化现象，产生该现象的原因可能是在PVA/CS 结晶区内PVA/CS聚合物链表现出有限的延展性。当水凝胶中引入Lig后，Lig 可能增加了水凝胶三维空间结构，使其在拉伸过程中自行变形吸引拉力，导致 PVA/Lig/CS水凝胶断裂时的应变和抗拉强度分别308.3％和63.0kPa。当 PVA/Lig/CS水凝胶包载ISs-EthE后，ISs-EthE-Gel的断裂伸长率反而降低至229.1％，抗拉强度升至90.0kPa，可能是ISs-EthE以氢键形式包载于 PVA/Lig/CS水凝胶中，使水凝胶具有较高的晶体密度，增加了ISs-EthE-Gel网 络的刚性，降低了网络的柔韧性。
6结果与讨论
本章节以水凝胶的溶胀率、药物累积释放性能等作为评价指标，通过单因素 考察和正交试验设计法筛选得到PVA/Lig/CS水凝胶最优处方，即PVA用量7.0g、 CS用量4.0g、Lig用量0.5g，最优制备工艺为冻融循环次数4次，每次冻结 6h。FTIR试验结果证明采用冻融法制备的ISs-EthE-Gel可能主要以氢键的形 式包载ISs-EthE，且该水凝胶具有多孔网状结构，为水凝胶具备优良的溶胀性 能提供有利保障。同时水凝胶的保湿性为创面组织提供有利于愈合的润湿环境。 另外，ISs-EthE-Gel中ISs-EthE的释放规律复合一级动力学，具有缓释作用。 流变学和拉伸试验结果表明，ISs-EthE-Gel因Lig的加入使水凝胶的断裂拉伸 率和抗拉强度显著增加。
二、血人参乙醇提取物凝胶剂水凝胶的体外生物评价
理想的创面愈合水凝胶支架需要适当的保湿性能、力学性能，同时需要具备 良好的细胞生物相容性能。巨噬细胞是创面愈合炎症期的主要炎症细胞，当皮肤 创伤后，单核细胞分化为促炎性巨噬细胞向伤口趋化，释放炎症介质(TNF-α、 IL-6等)促进炎症反应，但炎症介质的过度产生会引起多种急慢性炎症疾病。 血人参作为苗族民间常用药，其ISs-EthE(50μg·mL-1)可显著抑制巨噬细胞 迁移以及显著抑制斑马鱼炎症模型中巨噬细胞向急性损伤部位迁移。因此，以 PVA/Lig/CS水凝胶作为药物缓释储库制备ISs-EthE-Gel，采用RAW264.7细胞对 ISs-EthE-Gel的细胞存活率进行评价，以细胞划痕试验探究ISs-EthE-Gel对巨 噬细胞迁移的影响，并以ELISA试剂盒检测经ISs-EthE-Gel预处理的巨噬细胞TNF-α和IL-6的释放情况，旨在通过抑制炎症期炎症细胞过度向伤口迁移提供 实验基础。
另外，伤口辅料作为有效隔离外部细菌感染的屏障，常缺乏有效的抗菌活性， 导致伤口感染和相关炎症，阻碍伤口愈合，因此具有优良抗菌性能也是评价伤口 敷料的一个重要指标。故本研究采用伤口常见细菌，金黄色葡萄球菌(S.aureus) 和大肠杆菌(E.coli)评价水凝胶的抑菌作用。
1实验材料
1.1试药
Figure BDA0003747141850000211
Figure BDA0003747141850000221
1.2仪器
Figure BDA0003747141850000222
2细胞培养
将细胞(RAW264.7)接种于75cm2的Corning培养瓶中，以DMEM培养基(含 10％胎牛血清)在细胞孵箱中培养(37℃、5％CO2)，待细胞长至70～80％汇合时， 用细胞刮刀轻轻刮下进行传代，待细胞细胞贴壁后进行下一步实验。
3细菌培养
LB培养基配制：按照表2.1配方配制LB培养基，并将其高压灭菌待用。
表2.1.LB培养基配方
Figure BDA0003747141850000223
细菌复苏和传代：将冻存的细菌(E.coli和S.aureus)混悬液0.5mL加入 液体LB培养基(30mL)中，过夜后取复苏的细菌液(1mL)加入液体LB培养 基(30mL)中进行传代，备用。
4水凝胶样品前处理
本章节水凝胶的生物相容性研究均以水凝胶的PBS浸提液进行，即将1.6g 水凝胶浸泡在10mL PBS中。在37℃下孵育24h，获得水凝胶浸提液，采用第 一章“3.1”项下试验条件进行儿茶素定量，用于相关试验研究。
5细胞相容性相容性试验
待细胞(RAW264.7)长至70％～80％汇合时，用细胞刮刀轻轻刮下，以1.5ⅹ104cells/孔密度接种于96孔板中，分为Blank组、DMSO组、ISs-EthE组、 PVA/Lig/Cs水凝胶组(Gel)和ISs-EthE-Gel组，每组3个复孔，培养(5％CO2， 37℃)过夜。各组分别加入无血清DMEM配制的PBS、DMSO、ISs-EthE(儿茶素 含量分别为25.0、50.0、100.0、200.0μg·mL-1)、Gel浸提液、ISs-EthE-Gel 浸提液(儿茶素含量分别为25.0、50.0、100.0、200.0μg·mL-1)，培养(5％CO2， 37℃)24h，吸去细胞上清液，每孔加入100μL无血清DMEM和10μL CCK-8 溶液，轻轻混匀后孵育(5％CO2，37℃)2h，使用酶标仪在450nm处的读取吸 光度。计算细胞存活率(Cell viability)。
Figure BDA0003747141850000231
6细胞划痕试验
实验前用记号笔在24孔板背后画横线。待细胞(RAW264.7)长至70％～80％ 汇合时，用细胞刮刀轻轻刮下，以1.0ⅹ105cells/孔密度接种于24孔板中，分 为Blank组、ISs-EthE组、PVA/Lig/Cs水凝胶组(Gel)和ISs-EthE-Gel组， 每组3个复孔，培养(5％CO2，37℃)过夜。吸出细胞上清，各组分别加入1mL 无血清DMEM配制的PBS，ISs-EthE(儿茶素50.0μg·mL-1)，Gel浸提液， ISs-EthE-Gel浸提液(儿茶素50.0μg·mL-1)，孵育2h。采用枪头(200μL)在各组细胞正上方垂直孔板预处理的黑线划痕，划线完成后，使用无菌PBS 清洗细胞2次，去除划下的细胞，给予LPS(100.0ng·mL-1)刺激，将细胞放 入胞培养箱中培养(5％CO2，37℃)。分别在不同时间点(8、12、24h)取出时 取出，显微镜拍照记录细胞愈合情况，以Image J分析各实验组的划痕面积，计 算伤口愈合率(公式3.2)，伤口愈合率(Healingrate)越小，说明RAW264.7 迁移率小。
Figure BDA0003747141850000241
A0指各组0h的划痕面积，Ai指各组第I h的划痕面积。
7对细胞炎症因子的影响
待细胞(RAW264.7)长至70％～80％汇合时，用细胞刮刀轻轻刮下，以1.0ⅹ105cells/孔密度接种于24孔板中，分为Blank组、ISs-EthE组、PVA/Lig/Cs 水凝胶组(Gel)和ISs-EthE-Gel组，每组3个复孔，培养(5％CO2，37℃)过 夜。吸出细胞上清液，各组分别加入1.5mL无血清DMEM配制的PBS，ISs-EthE (儿茶素50.0μg·mL-1)，Gel浸提液，ISs-EthE-Gel浸提液(儿茶素50.0μ g·mL-1)，孵育2h。吸出细胞上清，用PBS清洗细胞2次，给予LPS(100.0ng·mL-1) 刺激18h，吸出细胞上清，按照ELISA试剂盒检测其中TNF-α和IL-6的含量。
8抑菌试验
采用E.coli和S.aureus通过CFU试验评价水凝胶的抑菌活性。用无菌PBS 将细菌浓度调整为1.0×108CFU·mL-1，将PVA/Lig水凝胶浸提液、PVA/CS水凝 胶浸提液、PVA/Lig/CS水凝胶浸提液(Gel)、ISs-EthE(儿茶素50.0μg·mL-1)、 ISs-EthE-Gel浸提液(儿茶素50.0μg·mL-1)和卡那霉素(kanamycin，50.0μ g·mL-1)分别与上述细菌悬液孵育(37℃)8h，各混悬液逐步稀释至10-5浓度， 后将其(30μL)接种于LB培养皿中。在37℃下孵育过夜后，拍照记录菌落 数并计数。每组重复3次试验。计算(公式3.3)抑制率(Inhibition)。
Figure BDA0003747141850000242
9统计学分析
实验数据采用均值±标准差(SD)表示，并采用t-test和one-way ANOVA 进行数据统计学差异分析。当P值小于0.05说明具有显著性差异，以*表示；当 P值小于0.01说明具有极其显著性差异，以**表示；当P值小于0.001说明具 有十分显著性差异，以***表示。实验数据统计分析均使用SPSS 21.0进行，并 由GraphPad Prism 8进行图像绘制。
10实验结果
10.1细胞相容性试验
ISs-EthE及其水凝胶细胞相容性结果(表2.2和图33)显示，ISs-EthE的 细胞存活率与ISs-EthE浓度呈负相关，ISs-EthE(儿茶素100.0μg·mL-1)和 ISs-EthE(儿茶素200.0μg·mL-1)的细胞存活率分别为73.8％和50.0％，且与 ISs-EthE相对应浓度的DMSO对细胞存活率无明显影响，该结果表明较高浓度的 ISs-EthE可能对RAW264.7细胞具有抑制作用。将PVA/Lig/Cs水凝胶携载 ISs-EthE后，在低浓度时，ISs-EthE-Gel(儿茶素25.0～100.0μg·mL-1)的细 胞存活率与浓度呈正相关，存活率均高于76.0％，ISs-EthE-Gel(儿茶素200.0 μg·mL-1)的细胞存活降低至73.5％，该结果与PVA/Lig/Cs水凝胶实验结果一 致，说明低水平的PVA/Lig/Cs水凝胶对细胞(RAW264.7)可能具有良好的增值 作用，高水平的PVA/Lig/Cs水凝胶对RAW264.7细胞可能具有轻微毒性。
表2.2.ISs-EthE-Gel的细胞生物相容性试验结果(n＝3)
Figure BDA0003747141850000251
10.2细胞划痕试验
为了探究ISs-EthE及ISs-EthE-Gel对细胞(RAW264.7)迁移的影响，本研 究采用划痕试验进行验证。各组不同时间点划痕区域直观记录结果(图34)显 示，各时间点ISs-EthE组和ISs-EthE-Gel组划痕区域的细胞明显较Blank组划 痕区域细胞少。划痕区域面积定量结果(表2.3和图35)显示，在8h、12h 和24h时，Blank组的细胞划痕愈合率分别为35.48％、44.89％、60.33％，各时 间点间相比具有显著性差异。Gel组在8h、12h和24h的细胞划痕愈合率分 别为28.27％、40.82％、43.87％，与Blank组对应时间点相比无统计学意义，同 时与Gel组8h划痕愈合率(28.27％)相比，Gel组24h的划痕愈合率43.87％ 具有统计学意义(P<0.05)，该结果表明Gel可能不具备抑制细胞(RAW264.7) 迁移的作用。ISs-EthE组在8h、12h和24h的细胞划痕愈合率分别为11.75％、 16.76％、23.15％，与Blank组对应时间点相比具有统计学意义(P<0.01)。与 Blank组相比，ISs-EthE-Gel组在8h、12h和24h时的愈合率显著减小，分 别为6.43％、8.67％、16.37％，且各时间点的愈合率无统计学差异。以上结果表 明ISs-EthE可以抑制RAW264.7细胞迁移，且随时间点增加抑制效果越明显。将PVA/Lig/Cs水凝胶对ISs-EthE进行包载后，ISs-EthE-Gel对RAW264.7细胞的 抑制迁移现象更显著。巨噬细胞是创面愈合炎症期的主要炎症细胞，因此， ISs-EthE-Gel可能对创面愈合炎症期治疗具有重要作用。
表2.3.不同时间点ISs-EthE-Gel的细胞划痕愈合率(n＝3)
Time(h) Blank ISs-EthE Gel ISs-EthE-Gel
8h 35.48±2.13 11.75±1.48<sup>**</sup> 28.27±11.93 6.43±2.27<sup>***</sup>
12h 44.89±2.41<sup>##</sup> 16.76±0.68<sup>**</sup>^ 40.82±5.58 8.67±9.91<sup>***</sup>
24h 60.33±0.53<sup>###</sup> 23.15±15.92<sup>**</sup> 43.87±5.80<sup>&amp;</sup> 16.37±5.39<sup>***</sup>
注：同一时间点与Blank组相比，**P<0.01，***P<0.001；与Blank组8h相 比，##P<0.01，###P<0.001。与ISs-EthE组8h相比，^P<0.05；与Gel组8h相 比，&P<0.05。
10.3对细胞炎症因子的影响
巨噬细胞在局部宿主防御和炎症反应中发挥重要作用，这些炎症反应由促炎 细胞因子(如IL-1、NO、IL-6和TNF-α等)协调控制。上一节我们证实了 ISs-EthE-Gel具有抑制巨噬细胞迁移的作用，本节将继续探究ISs-EthE-Gel对 LPS诱导巨噬细胞产生TNF-α、IL-6的影响。试验结果如表2.4和所示，与BlanK 组相比，ISs-EthE、Gel和ISs-EthE-Gel能显著降低LPS诱导巨噬细胞TNF-α 的产生(图36)。与BlanK组相比，ISs-EthE和ISs-EthE-Gel对LPS诱导巨噬 细胞IL-6的产生表现出抑制作用(图37)，但该作用无统计学意义。该结果表明ISs-EthE、Gel和ISs-EthE-Gel可能具有抑制炎症反应发生的作用。
表2.4.ISs-EthE-Gel的对细胞炎症因子的影响结果结果(n＝3)
Blank ISs-EthE Gel ISs-EthE-Gel
TNF-α 15.94±7.23 3.19±1.44<sup>**</sup> 6.91±4.31<sup>*</sup> 6.65±3.27<sup>*</sup>
IL-6 1.43±0.86 1.29±0.81 1.60±1.76 0.97±0.05
注：与Blank组相比，*P<0.05，**P<0.01。
10.4抑菌试验
抑菌结果(图38)显示，与PVA/Lig水凝胶相比，PVA/CS水凝胶、PVA/Lig/CS 水凝胶对S.aureus的抑制率显著增加(图39)，具有统计学意义(P<0.05)， 该结果说明在水凝胶中增加CS可以增加水凝胶的抗菌效果。同时与PVA/Lig水 凝胶相比，ISs-EthE(50.0μg·mL-1)和ISs-EthE-Gel对S.aureus的抑制率 显著增加(图39)，该结果表明ISs-EthE和ISs-EthE-Gel具有良好的抑菌效 果。另外，PVA/Lig水凝胶、ISs-EthE对E.coli的抑菌率分别为55.5％、99.4％ (图40)；PVA/CS、PVA/Lig/CS、ISs-EthE-Gel、Kanamycin(50.0μg·mL-1) 对E.coli的抑菌率均大于99.0％(图40)。以上结果表明ISs-EthE和 ISs-EthE-Gel对E.coli和S.aureus有良好的抑菌效果，为ISs-EthE作为创面 愈合药物及ISs-EthE-Gel作为创面愈合新辅料提供新可能。
表2.5.ISs-EthE及其有无CS水凝胶的抑菌结果(n＝3)
种类 PVA/Lig ISs-EthE PVA/CS Gel ISs-EthE-Gel Kanamycin
S.aueurs -51.9±30.3 59.6±4.4 100.0±0.0<sup>*</sup> 100.0±0.0<sup>*</sup> 100.0±0.0<sup>*</sup> 100.0±0.0<sup>*</sup>
E.coli 55.5±29.8 99.4±0.4 100.0±0.0 100.0±0.0 100.0±0.0 99.8±0.3
注：与PVA/Lig组相比，*P<0.05
11结论与讨论
本章首先采用CCK-8试剂盒检测了ISs-EthE及其水凝胶的细胞生物相容性， 实验结果表明，ISs-EthE(儿茶素20.0～200.0μg·mL-1)的细胞(RAW264.7) 存活率与ISs-EthE浓度呈负相关，同时低水平的PVA/Lig/Cs水凝胶可能具有 良好的细胞(RAW264.7)增值作用，高水平的PVA/Lig/Cs水凝胶可能具有轻微 的细胞(RAW264.7)毒性。划痕实验结果表明，ISs-EthE可以抑制炎症细胞 (RAW264.7)的迁移，抑制作用随时间增加而增强。将PVA/Lig/Cs水凝胶对 ISs-EthE进行包载后，ISs-EthE-Gel对炎症细胞(RAW264.7)的抑制迁移现象 更显著。另外，ISs-EthE-Gel能有效抑制LPS诱导巨噬细胞TNF-α的产生。抑 菌试验表明，ISs-EthE和ISs-EthE-Gel对E.coli和S.aureus有良好的抑菌效 果。本章结果为ISs-EthE作为创面愈合药物在创面愈合炎症期抑制炎症细胞向 伤口过度迁移进而促创面愈合，及ISs-EthE-Gel作为创面愈合新敷料用于体内创 面愈合治疗奠定基础。
三、血人参乙醇提取物凝胶的体内药效评价
上一章节已证实ISs-EthE-Gel可以有效抑制巨噬细胞迁移及抑制LPS诱导 巨噬细胞TNF-α的产生，因此其可能具备改善创面愈合炎症期的炎症反应以促 创面愈合的潜力。故本章节将采用全层皮肤损伤模型探究ISs-EthE及 ISs-EthE-Gel对大鼠皮肤损伤创面的愈合效果。通过对创面再生组织进行HE染 色评价创面组织炎症细胞的浸润情况，对再生组织进行免疫组化(CD86、CD163) 评价创面组织巨噬细胞向伤口募集及其极化的情况，对再生组织进行CD31免疫 组化考察创面组织血管生成情况，对再生组织进行Masson三色染色考察创面组 织胶原纤维的表达情况，以期为ISs-EthE及ISs-EthE-Gel调控创面愈合过程、 改善愈后质量提供依据。
1实验材料
1.1试药
Figure BDA0003747141850000281
1.2仪器
Figure BDA0003747141850000282
Figure BDA0003747141850000291
1.3实验动物
雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180～220g)，购自长沙天勤生物技术有 限公司。
2构建全层皮肤损伤模型
采用正常雄性SD大鼠(180～220g)构建全层皮肤损伤模型。将SD大鼠(96 只)随机分为6组，每组16只：即模型组(Negative control)，阳性对照组 (Positive Control)，血人参乙醇提取物组(ISs-EthE)，空白凝胶组(Gel)， 血人参乙醇提取物凝胶组(ISs-EthE-Gel)。其中ISs-EthE给药量为0.315g/kg (生药量)，ISs-EthE浓度0.26g·mL-1。造模前将大鼠麻醉并对其背部脱毛， 脱毛后用95％医用酒精消毒，随后在每只大鼠的背部创建1.5cmⅹ1.5cm的全 层皮肤伤口。造膜后第1天开始给药，隔1天给药1次，共6次。其中模型组给 予300μL PBS，阳性对照组给予重组牛碱性成纤维细胞生长因子，其余各组分 别给予相应药物。同时拍照记录创面愈合情况。
3体内创面愈合率的研究
采用Image-J软件分析3d、7d和14d时各组动物创面的伤口面积，并以 第1天伤口面积作为伤口初始面积，计算创面愈合率(Wound healing rating)。
Figure BDA0003747141850000301
其中A0表示伤口初始面积，Ai表示第i天的伤口面积。
4皮肤组织取样与切片
分别在术后3d、7d和14d随机选取3只动物进行安乐死，取出和造模面 积大小的再生皮肤，置于4％多聚甲醛溶液中固定48h，固定组织按照设定序列 (75％酒精1h，85％酒精1h，95％酒精Ⅰ50min，95％酒精Ⅱ50min，100％酒精Ⅰ 50min，100％酒精Ⅱ50min，100％酒精：二甲苯一比一混合20min，二甲苯Ⅰ 25min，二甲苯Ⅱ25min，石蜡Ⅰ1h，石蜡Ⅱ2h，石蜡Ⅲ3h)经全自动脱水机 脱水，切片。
5HE染色
将石蜡切片依次采用二甲苯和不同浓度(100％、95％、85％、75％)的乙醇进 行切片脱蜡至水，苏木精染色(10～20min)，自来水冲洗(1～3min)，盐酸酒 精分化(5～10s)，自来水冲洗(1～3min)，放入50℃的温水中或弱碱性水溶 液返蓝，直到出现蓝色为止，自来水冲洗(1～3min)，放入85％的酒精中浸泡 (3～5min)，伊红染色(3～5min)，水洗(3～5s)，梯度酒精脱水，二甲苯 透化，中性树胶封片，用于镜检，采用数字切片扫描仪对切片进行图像采集。
6免疫组化分析
将石蜡切片依次采用二甲苯和不同浓度(100％、95％、85％、75％)的乙醇进 行切片脱蜡至水。将切片浸入柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，微波炉高火加热(10 min)两次，中间停火8min，冷却后，PBS洗3次，5min/次。将切片放入3％ 双氧水，室温静置(10min)，PBS洗3次。滴加山羊血清封闭液，室温静置(20 min)后，滴加一抗，4℃过夜。次日PBS洗3次。滴加二抗，37℃静置(30min) 后，PBS洗3次，将新鲜配制的DAB显色液滴加到组织上，室温显色，显微镜下 控制显色时间，阳性为棕黄色，蒸馏水洗涤切片终止显色。以苏木素复染(3min)，自来水洗，清水返蓝后流水冲洗。最后将切片依次置于不同浓度(75％、85％、95％、 及100％)乙醇、二甲苯中分别浸泡10min，中性树胶封片。使用显微摄像系统 对切片进行图像采集，并使用Halo数据分析系统计算每张图像阳性面积占比。
7统计学分析
实验数据采用均值±标准差(SD)表示，并采用t-test和one-way ANOVA 进行数据统计学差异分析。当P值小于0.05说明具有显著性差异，以*表示；当 P值小于0.01说明具有极其显著性差异，以**表示；当P值小于0.001说明具 有十分显著性差异，以***表示。实验数据统计分析均使用SPSS 21.0进行，并 由GraphPad Prism 8进行图像绘制。
8实验结果
8.1体内创面愈合率研究
本实验构建全层皮肤损伤模型，将其用于ISs-EthE-Gel促创面愈合的评价 (图41)。如图42所示，伤口经治疗14d后，各实验组的伤口均得到一定程 度的改善，且除ISs-EthE-Gel和阳性药组，其他组在伤口表面仍存在明显结痂。 结合不同时间点伤口面积记录直观图(图43)可知，与比模型组相，第3d和 第7d时ISs-EthE-Gel和阳性药组伤口面积明显减小，以第3d尤为显著，且 两者的创面愈合率分别是模型组的8.0倍和3.5倍(表3.1和图44)。该结果 表明ISs-EthE-Gel具有良好的促创面愈合的作用，产生该作用可能与前面证实 ISs-EthE-Gel具有良好的生物相容性、抗菌性、抑制炎症细胞向创口过度聚集 有关及抑制TNF-α生成有关。
表3.1.第3d、7d和14d的各实验组的创面愈合率(n＝5)
Time(d) NegativeControl ISs-EthE Gel ISs-EthE-Gel PositiveControl
3 7.27±3.94 9.90±4.65 16.65±16.12 31.43±10.16<sup>***</sup> 25.52±9.85<sup>*</sup>
7 38.77±24.28 40.44±17.07 40.47±11.98 62.16±12.29 49.30±8.37
14 73.65±9.90 73.95±19.96 72.36±6.24 75.55±19.17 85.23±7.33
注：与Negative control相比，*P<0.05，***P<0.001
8.2再生组织HE染色
经药物干预后，对第3d、7d和14d的创面再生组织进行HE染色分析， 实验结果如图45所示，经治疗14d后，与模型组相比，ISs-EthE-Gel和阳性 药物组的皮肤组织修复程度相对最好，主要表现在炎性细胞浸润减少，毛血细管 形成增加，纤维组织形成明显等。ISs-EthE的皮肤组织修复程度较ISs-EthE-Gel 和阳性药物组差，Gel的皮肤组织修复程度相对次之。同时随着治疗时间增加， 各组的皮肤创面组织修复效果越明显。该结果表明，Gel相比，ISs-EthE及 ISs-EthE-Gel具有良好的创面修复作用。
8.3再生组织CD86和CD163的表达情况
上一章节我们已证实ISs-EthE-Gel能显著抑制巨噬细胞的迁移，对创面愈 合炎症期治疗具有巨大潜力。因此，本节我们选择表面生物标志物CD86和CD163 分别标记M1和M2巨噬细胞，观察ISs-EthE-Gel对创面愈合期间巨噬细胞极化 的影响。如图46和图47所示，与模型组相比，各试验组CD86的表达在第3d 和第7d时明显减少，其中第3d时模型组CD86的表达量分是ISs-EthE组、Gel 和ISs-EthE-Gel的2.4倍、1.6倍和2.2倍，第7d时模型组CD86的表达量分 是ISs-EthE组、Gel和ISs-EthE-Gel的4倍、2倍和1.5倍(表3.2和图48)。与模型组相比，各试验组第3d时CD163的表达无统计学意义，在第7d时， ISs-EthE-Gel组CD163的表达量是模型组2.1倍(表3.3和图49)。该结果表 明，在创面愈合前期，ISs-EthE、Gel和ISs-EthE-Gel均具有抑制M1型巨噬细 胞向创面过度募集的作用。同时将Gel作为ISs-EthE缓释药物储库制备的 ISs-EthE-Gel可能还具有促进促炎性巨噬细胞(M1型)向抗炎性巨噬细胞(M2 型)极化的作用。
表3.2.第3d、7d各实验组再生组织CD86的表达量(n＝3)
Figure BDA0003747141850000321
注：与Negative control相比，*P<0.05，**P<0.01
表3.3.第3d、7d各实验组再生组织CD163的表达量(n＝3)
Figure BDA0003747141850000322
注：与Negative control相比，*P<0.05
8.4再生组织CD31的表达情况
CD31是一种在早期血管生成中表达的跨膜蛋白，本研究采用CD31免疫组化 染色法评价创面的血管生成情况。如图50所示，与模型组相比，ISs-EthE组和 ISs-EthE-Gel组的CD31表达明显，尤其是ISs-EthE-Gel组，其在第7d和第 14d时CD31表达分别是模型组的2.5和3.2倍(表3.4和图52)，说明ISs-EthE 组和ISs-EthE-Gel组的创面形成了更多成熟结构的毛细血管。该结果表明 ISs-EthE和ISs-EthE-Gel可能通过增加创面再生组织中的血管生成促进创面修 复。在伤口处理第14d时，Gel组CD31表达量也较模型组显著，该结果表明， PVA/Lig/Cs水凝胶具有一定的促创面愈合作用，该作用可能与其具有良好的保 湿性能、生物相容性和抗菌性能有关。
表3.4.第7d、14d各实验组再生组织CD31的表达量(n＝3)
Figure BDA0003747141850000331
注：与Negative control相比，*P<0.05，**P<0.01
8.5再生组织胶原纤维沉淀情况
伤口部位胶原蛋白的形成在伤口愈合重塑期修复受损皮肤组织和增强组织 的抗拉强度方面发挥着重要作用，本研究采用Masson三色染色法评价伤口愈合 过程中胶原纤维沉积的情况。如图51所示，在第7d和第14d，各组实验组均 出现了胶原纤维沉积(蓝色区域)。与模型组相比，ISs-EthE组、ISs-EthE-Gel 和阳性药组胶原纤维沉积的现象更密集和显著，以伤口处理后的第14d尤甚， 通过定量分析纤维组织表达面积百分比(表3.5和图53)知，ISs-EthE组、 ISs-EthE-Gel胶原纤维组织表达面积百分比是模型组的2.0倍，阳性药组胶原 纤维组织表达面积百分比是模型组的2.4倍(表3.5和图53)。该结果表明 ISs-EthE和ISs-EthE-Gel对改善创面愈后质量具有良好作用，该作用可能与前 述在创面愈合炎症期抑制促炎型巨噬细胞向创面过度聚集有关。
表3.5.第7d、14d各实验组再生皮肤纤维组织表达面积百分比(n＝3)
Figure BDA0003747141850000332
注：与Negative control相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
9结论与讨论
本章采用全层皮肤损伤模型评价了ISs-EthE-Gel水凝胶的促创面愈合效果， 实验结果表明，ISs-EthE-Gel具有良好的促创面愈合的作用，该作用可能通过 在创面愈合期炎症期减少炎症细胞浸润、抑制M1型巨噬细胞向创面炎症部位过 度募集、促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，在创面愈合增殖期增加创面 组织血管形成以及在创面愈合重塑期增加胶原纤维沉淀等实现。
四、总结
本发明以单因素考察和正交设计试验分析筛选得到最优的PVA/Lig/CS水凝 胶，即PVA、CS和Lig的比例为7:4:0.5(w/w)，最优制备工艺为冻融循环次 数4次，每次持续6h。将PVA/Lig/CS水凝胶携载ISs-EthE后，ISs-EthE-Gel 具有多孔网状结构及良好溶胀性能，有利于吸收伤口组织液和渗出物。且 ISs-EthE-Gel中ISs-EthE指标成分的释放规律复合一级动力学，具有药物缓释 作用。同时Lig能显著增强PVA/Lig/CS水凝胶的机械强度，为其作为水凝胶创 面敷料提供依据
良好的创面敷料不仅具有优良的溶胀、保湿等性能，还需具有良好的生物相 容性、抑菌性等。本研究表明，ISs-EthE(儿茶素20.0～200.0μg·mL-1)的细 胞(RAW264.7)存活率与ISs-EthE浓度呈负相关，高水平的PVA/Lig/Cs水凝 胶可能具有轻微的细胞(RAW264.7)毒性。另外，ISs-EthE可以抑制炎症细胞 (RAW264.7)的迁移，抑制作用可能与时间呈正相关。同时将PVA/Lig/Cs水凝 胶对ISs-EthE进行包载后，ISs-EthE-Gel对炎症细胞(RAW264.7)的抑制迁移 现象更显著。抑菌试验表明，ISs-EthE和ISs-EthE-Gel对E.coli和S.aureus 有良好的抑菌效果。本章结果为ISs-EthE作为创面愈合药物在创面愈合炎症期 抑制炎症细胞向伤口迁移以促创面愈合，及ISs-EthE-Gel作为创面愈合新敷料 用于体内创面愈合治疗奠定基础。
本发明采用全层皮肤损伤模型评价了ISs-EthE-Gel的促大鼠创面愈合效果， 实验结果表明，ISs-EthE-Gel具有良好的促创面愈合的作用，该作用可能通过 在创面愈合期前期减少炎症细胞浸润、抑制巨噬细胞向创面过度趋化、促进M1 型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，在创面愈合中后期促进血管生成、增加纤维 组织形成以改善创面愈合质量等实现。

Claims (9)

1.一种血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法为：
（1）壳聚糖Chitosan溶液的制备：称取2.0~5.0g的CS溶于1~3%乙酸溶液中，80~100℃恒温水浴搅拌至溶解，即得CS溶液；
（2）聚乙烯醇Polyvinyl alcohol溶液的制备：称取6.0~8.0g的PVA溶于入超纯水中，在恒温水浴下搅拌至溶解，即得PVA溶液；
（3）木质素Lignin溶液的制备：称取0.5~1.5g的Lig溶于超纯水中，常温磁力搅拌混匀，即得Lig溶液；
（4）血人参乙醇提取物浸膏粉ISs-EthE的制备：称取血人参药材适量，剪断或切碎，加60%乙醇回流提取，过滤，滤渣加60%乙醇回流提取，过滤；合并两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干燥至含水量<5%，即得血人参乙醇提取物浸膏粉；
（5）血人参乙醇提取物水凝胶ISs-EthE-Gel的制备：称取血人参乙醇提取物浸膏粉，精密称定，以60%乙醇溶液溶解，加入PVA溶液搅拌，混匀后加入Lig溶液混合，继续搅拌均匀后加入CS溶液，得到的混合溶液离心3 min脱气处理，采用冻融法在-20℃下物理交联，即得含药水凝胶ISs-EthE-Gel。
2.根据权利要求1所述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述壳聚糖Chitosan溶液的制备为：称取4.0 g的CS溶于2%乙酸溶液71g中，90℃恒温水浴搅拌至溶解，即得CS溶液。
3.根据权利要求1所述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述聚乙烯醇Polyvinyl alcohol溶液的制备为：称取7.0 g的PVA溶于入32 g超纯水中，在90℃恒温水浴下搅拌至溶解，即得PVA溶液。
4.根据权利要求1所述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述木质素溶液的制备为：称取0.5g的Lig 溶于9g超纯水中，常温磁力搅拌混匀，即得Lig溶液。
5.根据权利要求1所述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述血人参乙醇提取物浸膏粉ISs-EthE的制备为：称取血人参药材适量，剪断或切碎，加5-7倍量60%乙醇回流提取1-3h，过滤，滤渣加3-5倍量60%乙醇回流提取1-2h，过滤，合并两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干燥至含水量<5%，即得血人参乙醇提取物浸膏粉。
6.根据权利要求5所述的血人参乙醇提取物含量测定方法，其特征在于：所述步骤（4）中，所述血人参乙醇提取物浸膏粉ISs-EthE的制备为：称取血人参药材适量，剪断或切碎，加6倍量60%乙醇回流提取2h，过滤，滤渣加4倍量60%乙醇回流提取1.5h，过滤，合并两次滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，真空干燥至含水量<5%，即得血人参乙醇提取物浸膏粉。
7.根据权利要求1所述血人参乙醇提取物水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，所述血人参乙醇提取物水凝胶ISs-EthE-Gel的制备为：称取血人参乙醇提取物浸膏粉0.5g，精密称定，以60%乙醇溶液7mL溶解，加入PVA溶液搅拌，混匀后加入Lig溶液混合，继续搅拌均匀后加入CS溶液，得到的混合溶液离心3min脱气处理，采用冻融法在-20℃下物理交联，冻融循环次数4次，每次冻结6h，即得含药水凝胶ISs-EthE-Gel。
8.一种血人参乙醇提取物水凝胶的应用，其特征在于：所述血人参乙醇提取物水凝胶ISs-EthE-Gel在促创面愈合技术中的应用。
9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述血人参乙醇提取物水凝胶ISs-EthE-Gel是利用混合水凝胶三维聚合物网络结构使结合的血人参乙醇提取物从水凝胶中持续释放以防止巨噬细胞向炎症部位的过度迁移、聚集，以期通过改善创伤区的微环境以促进创面快速愈合。
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何梓瑶 等: "响应面法优化血人参水凝胶面膜基质", 《山东化工》, vol. 51, pages 28 - 31 *

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