CN111443144A - 一种钴60辐照对四消丸的质量影响研究方法 - Google Patents

Abstract

一种钴60辐照对四消丸的质量影响研究方法，具体方法：供试品的制备，对照品溶液的制备，色谱条件选择，测定方法，供试品1相似度试验，供试品2稳定性试验，供试品2重现性试验，灭菌前后指纹图谱的比较试验，灭菌前后样品共3批，每批3个样品，经HPLC进样分析测定，记录色谱图与未灭菌供试品中共有峰相比，钴60辐照灭菌和传统高温灭菌后，供试品样品中色谱峰均没有明显变化。本方法对钴60辐照对四消丸的质量影响进行研究，可得且钴60辐照灭菌薄层色谱与为未灭菌的四消丸的薄层色谱没有明显差异，对四消丸中化学成分的影响也较小。

Description

一种钴60辐照对四消丸的质量影响研究方法

技术领域

本发明涉及一种钴60辐照对四消丸的质量影响研究方法，具体指纹图谱检测建立方法技术领域。

背景技术

四消丸是由大黄、猪牙皂、牵牛子、牵牛子(炒)、香附、槟榔、五灵脂等七味药材组成。具有消水、消痰、消食、消气，导滞通便等功效，用于一切气食痰水，停积不化，胸腕饱闷，腹胀疼痛，大便秘结等症。

四消丸组方中共有多种中药药材，在药物制备过程中需要对药材进行灭菌处理，传统的灭菌处理方法为高温灭菌方法，高温灭菌在灭菌过程中产生了新的化学成分，虽然对四消丸中大黄素、大黄酚的含量影响也较小，但对四消丸中的化学成分有一定的影响。

钴60辐照灭菌具有穿透力强、不需升高温度和压力且操作简单的特点，因此被越来越多的应用于中药药材的灭菌过程中，本申请的目的即是讨论一种钴60辐照对四消丸的质量影响研究方法。

发明内容

本发明的目的在于提供种一种钴60辐照对四消丸的质量影响研究方法。

本发明一种钴60辐照对四消丸的质量影响研究方法，具体方法包含以下步骤：步骤一、供试品的制备，取四消丸粉末0.6750g，过四号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀、过滤，量取续滤液5mL，置烧瓶中蒸干，加8％盐酸溶液10mL，超声2min，加氯仿10mL，加热回流1h，放冷，置分液漏斗中，用氯仿润洗，分取氯仿层，将酸液用氯仿提取3次，合用氯仿液，减压蒸干，残渣加甲醇，转移置10mL容量瓶中，定容，即得为供试品1；将其中一部份供试品采用钴60辐照灭菌2-3小时为供试品2；

步骤二、对照品溶液的制备，精密称取大黄素20μg，大黄酚40μg，置5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成大黄素、大黄酚混合标准品溶液；

步骤三、色谱条件选择，选择5μm 4.6×150mm的ODS-3柱；流动相为色谱甲醇：0.1％磷酸溶液；检验波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样体积：20μL；

步骤四、测定方法，吸取参照物溶液和供试品1溶液、供试品2溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；

步骤五、供试品1相似度试验，将10批以上供试品1和对照品溶液的检测结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件，经数据匹配，生成对照指纹图谱，计算供试品1共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值，并比较供试品1图谱中各共有峰面积比值和指纹图谱各共有峰面积比值的差值，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对10批以上供试品1指纹图谱和对照指纹图谱经相似度评价，相似度不得低于0.90；

步骤六、供试品2稳定性试验，取一批钴60辐照灭菌的供试品2，在步骤三的色谱条件下，分别于0、6、12、24h下进样，记录指纹图谱，以大黄酸为参照物峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积比值，并计算RSD值，单峰面积大于总峰面积5％的共有峰其相对保留时间RSD＜1％，相对峰面积RSD＜3％，将数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，进行相似度评价，结果表明指纹图谱的相似度均大于0.98，表明样供试品2在24小时内稳定性良好；

步骤七、供试品2重现性试验，取6份一批钴60辐照灭菌的供试品2，在步骤三色谱条件下分别进样，以大黄酸为参照物峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，并计算RSD值，单峰面积大于总峰面积5％的共有峰相对保留时间RSD＜1％，相对峰面积的RSD＜3％，将数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，进行相似度评价，各供试品2指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重复性良好，符合指纹图谱研究技术的要求；

步骤八、灭菌前后指纹图谱的比较试验，灭菌前后样品共3批，每批3个样品，经HPLC进样分析测定，记录色谱图与未灭菌供试品中共有峰相比，钴60辐照灭菌和传统高温灭菌后，供试品样品中色谱峰均没有明显变化；

根据3批未灭菌样品指纹图谱的共有峰标定结果标定14个共有峰，将9个灭菌前后供试品检测数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，与3批未灭菌样品生成的对照指纹图谱(R)进行共有峰数据匹配，将9个灭菌前后供试品图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，与3批未灭菌样品生成的对照指纹图谱(R)进行比较，计算相似度，与对照指纹图谱相比，供试品1之间的相似度在0.976-0.999之间，相似度良好，与自身批次未灭菌样品相比，供试品2的相似度在0.976-0.999之间，而传统高温灭菌样品相似度在0.943-0.996之间，相比之下，传统高温灭菌样品相似度相对较低；

以大黄素峰面积为l，计算灭菌前后样品共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值，并比较样品图谱中各共有峰面积比值和指纹图谱各共有峰面积比值的差值，由此可知钴60灭菌和传统高温灭菌均对四消丸中化学成分的影响较小。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本方法对钴60辐照对四消丸的质量影响进行研究，且从定性、定量及指纹图谱综合分析比较中发现：钴60辐照可以代替传统高温灭菌，为四消丸提供合理的灭菌方法，且钴60辐照灭菌具有穿透力强、不需升高温度和压力且操作简单的特点。且钴60辐照灭菌薄层色谱与为未灭菌的四消丸的薄层色谱没有明显差异，对四消丸中大黄素、大黄酚的含量影响小，对四消丸中化学成分的影响也较小。

附图说明

图1为实施例中供试品1的HPLC对照指纹图谱；

图2为实施例中对照品溶液的色谱图；

图3为实施例中灭菌前后样品分类图；

图4为实施例中灭菌前后样品图谱比较图；

图5为实施例中灭菌前后样品匹配色谱图；

图6为实施例中灭菌前后样品共有峰面积匹配结果图；

图7为实施例中相似度评价结果图；

图8为实施例中灭菌前后样品图谱共有峰面积的比值图；

图9为实施例中灭菌样品与指纹图谱各共有峰面积比值的差值图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：供试品的制备，取四消丸粉末0.6750g，过四号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀、过滤，量取续滤液5mL，置烧瓶中蒸干，加8％盐酸溶液10mL，超声2min，加氯仿10mL，加热回流1h，放冷，置分液漏斗中，用氯仿润洗，分取氯仿层，将酸液用氯仿提取3次，合用氯仿液，减压蒸干，残渣加甲醇，转移置10mL容量瓶中，定容，即得为供试品1；将其中一部份供试品采用钴60辐照灭菌2-3小时为供试品2；

对照品溶液的制备，精密称取大黄素20μg，大黄酚40μg，置5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成大黄素、大黄酚混合标准品溶液；

色谱条件选择，选择5μm 4.6×150mm的ODS-3柱；流动相为色谱甲醇：0.1％磷酸溶液；检验波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样体积：20μL；

测定方法，吸取参照物溶液和供试品1溶液、供试品2溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；

将10批供试品1溶液和对照品溶液的检测结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件，经数据匹配，生成对照指纹图谱(见图1)。由图1可知，共有峰中峰11：大黄酸；峰13：大黄酚；

共有指纹峰的标定，选择大黄酸为参照物，以其保留时间为1，计算指纹峰的相对保留时间。相对保留时间应相对固定。根据3批以上样品的检测结果，选择稳定性较好、吸收强、特征明显的色谱峰为共有峰。经匹配共标定14个共有指纹峰。供试品1的指纹图谱(图1)中应分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰(图2)。

共有峰面积的比值，以大黄酸峰面积为l，计算供试品共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值，并比较供试品图谱中各共有峰面积比值和指纹图谱各共有峰面积比值的差值。单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，其差值不得大于±20％；单峰面积占总峰面积大于或等于10％，而小于20％的共有峰，其差值不得大于±25％；单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积的比值不作要求，但必须标定相对保留时间。未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组峰的相对保留时间。

相似度评价，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对10批以上供试品指纹图谱和对照指纹图谱经相似度评价，相似度不得低于0.90。

稳定性试验，对Q201712039批钴60辐照灭菌的供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0、6、12、24h下进样，记录指纹图谱，以大黄酸为参照物峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积比值，并计算RSD值。结果表明，单峰面积大于总峰面积5％的共有峰其相对保留时间RSD＜1％，相对峰面积RSD＜3％。将数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，进行相似度评价。结果表明指纹图谱的相似度均大于0.98，表明样品在24小时内稳定性良好，符合指纹图谱研究技术的要求。

重现性试验，对6份Q201712039批钴60辐照灭菌的供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样。以大黄酸为参照物峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，并计算RSD值。结果表明，单峰面积大于总峰面积5％的共有峰相对保留时间RSD＜1％，相对峰面积的RSD＜3％。将数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，进行相似度评价。结果表明，各供试品指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重复性良好，符合指纹图谱研究技术的要求。

灭菌前后指纹图谱的比较研究，灭菌前后样品共3批，每批3个样品，见图3。

按照供试品溶液的制备方法制备灭菌前后供试品溶液，经HPLC进样分析测定，记录色谱图(见图4)。由图4可见，S1.未灭菌S2.钴60-γ射线灭菌S3.传统高温灭菌，与未灭菌供试品中共有峰相比，钴60辐照灭菌和传统高温灭菌后，供试品样品中色谱峰均没有明显变化。

根据3批未灭菌样品指纹图谱的共有峰标定结果标定14个共有峰，将9个灭菌前后供试品检测数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，与3批未灭菌样品生成的对照指纹图谱(R)进行共有峰数据匹配，匹配后色谱图见图5，匹配后共有峰面积见图6。

相似度评价，将9个灭菌前后供试品图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，与3批未灭菌样品生成的对照指纹图谱(R)进行比较，计算相似度，结果见图7。结果显示，与对照指纹图谱相比，供试品之间的相似度在0.976-0.999之间，相似度良好。与自身批次未灭菌样品相比，钴60辐照灭菌样品相似度在0.976-0.999之间，而传统高温灭菌样品相似度在0.943-0.996之间。相比之下，传统高温灭菌样品相似度相对较低，但仍符合指纹图谱研究技术的要求。

共有峰面积的比值，以大黄素峰面积为l，计算灭菌前后样品共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值(见图8)，并比较样品图谱中各共有峰面积比值和指纹图谱各共有峰面积比值的差值(结果见表9)。结果显示，单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰为峰13(48.42％)，单峰面积占总峰面积大于等于10％而小于20％的共有峰为峰7(10.95％)和峰11(11.22％)，大于等于5％而小于10％的的共有峰为峰4(9.68％)和峰14(7.41％)。以上共有峰面积比值与指纹图谱共有峰面积比值的差值比较结果见表13。由表9可知，峰13(单峰面积占总峰面积大于20％，其差值分别为-0.86、1.59、7.53、2.67、-9.43、-7.05、1.56、4.26、-0.97)、峰7(单峰面积占总峰面积大于10％，而小于20％的共有峰，其差值分别为-9.66、-10.98、-2.59、11.39、-8.90、2.14、8.97、1.97、5.57)、峰11(单峰面积占总峰面积大于10％，而小于20％的共有峰，其差值分别为0)、峰4(单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，其差值分别为-16.03、-25.32、-1.73、7.36、-6.69、7.48、12.95、5.27、14.13)和峰14(单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，其差值分别为3.41、0.73、19.57、-6.06、-4.23、-8.75、-2.94、3.47、-4.44)，其共有峰面积比值的差值均符合指纹图谱的要求，即：单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，其差值不得大于±20％；单峰面积占总峰面积大于或等于10％，而小于20％的共有峰，其差值不得大于±25％；单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积的比值不作要求。因此，钴60灭菌和传统高温灭菌均对四消丸中化学成分的影响较小。

相似度评价结果表明：钴60辐照灭菌对中成药的化学成分没有显著影响，而传统高温灭菌对中成药的化学成分有一定的影响，但仍符合指纹图谱研究技术的要求。共有峰面积比值结果表明：钴60辐照灭菌和传统高温灭菌对四消丸中化学成分的影响均较小。因此从指纹图谱方面考虑，钴60辐照灭菌略优于传统高温处理，可代替传统的高温灭菌。

通过对三个批号的未灭菌、传统高温灭菌及钴60辐照灭菌三种处理方式下的四消丸，进行薄层鉴别、HPLC法测定四消丸中大黄素、大黄酚的含量及指纹图谱分析，发现：与未灭菌的四消丸相比，钴60辐照灭菌薄层色谱没有明显差异，对四消丸中大黄素、大黄酚的含量影响也较小，且对四消丸中化学成分的影响均较小；但传统高温灭菌在灭菌过程中产生了新的化学成分，虽然对四消丸中大黄素、大黄酚的含量影响也较小，但相似度评价显示传统高温灭菌对四消丸中的化学成分有一定的影响。因此从定性、定量及指纹图谱综合分析比较发现：钴60辐照可以代替传统高温灭菌，为四消丸提供合理的灭菌方法，且钴60辐照灭菌具有穿透力强、不需升高温度和压力且操作简单的特点。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.一种钴60辐照对四消丸的质量影响研究方法，其特征在于：具体方法包含以下步骤：步骤一、供试品的制备，取四消丸粉末0.6750g，过四号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀、滤过,量取续滤液5mL，置烧瓶中蒸干，加8％盐酸溶液10mL，超声2min，加氯仿10mL，加热回流1h，放冷，置分液漏斗中,用氯仿润洗，分取氯仿层，将酸液用氯仿提取3次，合用氯仿液，减压蒸干，残渣加甲醇，转移置10mL容量瓶中，定容，即得为供试品1；将其中一部份供试品采用钴60辐照灭菌2-3小时为供试品2；

步骤二、对照品溶液的制备，精密称取大黄素20μg，大黄酚40μg，置5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成大黄素、大黄酚混合标准品溶液；

步骤三、色谱条件选择，选择5μm 4.6×150mm的ODS-3柱；流动相为色谱甲醇：0.1％磷酸溶液；检验波长：254nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样体积：20μL；

步骤四、测定方法，吸取参照物溶液和供试品1溶液、供试品2溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；

步骤五、供试品1相似度试验，将10批以上供试品1和对照品溶液的检测结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件，经数据匹配，生成对照指纹图谱，计算供试品1共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值，并比较供试品1图谱中各共有峰面积比值和指纹图谱各共有峰面积比值的差值，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对10批以上供试品1指纹图谱和对照指纹图谱经相似度评价，相似度不得低于0.90；

步骤六、供试品2稳定性试验，取一批钴60辐照灭菌的供试品2，在步骤三的色谱条件下，分别于0、6、12、24h下进样，记录指纹图谱，以大黄酸为参照物峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积比值，并计算RSD值，单峰面积大于总峰面积5％的共有峰其相对保留时间RSD＜1％，相对峰面积RSD＜3％，将数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，进行相似度评价，结果表明指纹图谱的相似度均大于0.98，表明样供试品2在24小时内稳定性良好；

步骤七、供试品2重现性试验，取6份一批钴60辐照灭菌的供试品2，在步骤三色谱条件下分别进样，以大黄酸为参照物峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，并计算RSD值，单峰面积大于总峰面积5％的共有峰相对保留时间RSD＜1％，相对峰面积的RSD＜3％，将数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，进行相似度评价，各供试品2指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重复性良好，符合指纹图谱研究技术的要求；

步骤八、灭菌前后指纹图谱的比较试验，灭菌前后样品共3批，每批3个样品，经HPLC进样分析测定，记录色谱图与未灭菌供试品中共有峰相比，钴60辐照灭菌和传统高温灭菌后，供试品样品中色谱峰均没有明显变化；

根据3批未灭菌样品指纹图谱的共有峰标定结果标定14个共有峰，将9个灭菌前后供试品检测数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，与3批未灭菌样品生成的对照指纹图谱(R)进行共有峰数据匹配，将9个灭菌前后供试品图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，与3批未灭菌样品生成的对照指纹图谱(R)进行比较，计算相似度，与对照指纹图谱相比，供试品1之间的相似度在0.976-0.999之间，相似度良好，与自身批次未灭菌样品相比，供试品2的相似度在0.976-0.999之间，而传统高温灭菌样品相似度在0.943-0.996之间，相比之下，传统高温灭菌样品相似度相对较低；

以大黄素峰面积为l，计算灭菌前后样品共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值，并比较样品图谱中各共有峰面积比值和指纹图谱各共有峰面积比值的差值，由此可知钴60灭菌和传统高温灭菌均对四消丸中化学成分的影响较小。

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