CN101339171B - 一种红花黄色素指纹图谱及其建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种红花黄色素指纹图谱及其建立方法。首先制备红花黄色素原料供试品溶液，其次制备参照物溶液，取羟基红花黄色素A对照品适量，制成参照物溶液，最后，进行测定，分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录50分钟色谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度洗脱液，检测波长为403nm。所述指纹图谱中共有峰4个，非共有峰总面积不超过总峰面积5％。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能够有效控制红花黄色素原料的质量和品质。
Description
技术领域
本发明涉及一种红花黄色素指纹图谱的建立方法，具体来说，是采用高效液相色谱法(HPLC)来建立红花黄色素原料指纹图谱，所述的红花黄色素原料系从红花中提取分离、纯化得到的红花总黄酮。
背景技术
红花属菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，具有活血化淤、通经之功效。红花是当今世界研究和应用的“热点”植物之一，对它的化学成分的研究，已有大量文献报导，从红花中提取分离和纯化得到的红花总黄酮成分红花黄色素，经药理研究证明是红花的主要药效部位。
目前，关于红花黄色素药物制剂较多，特别是注射用红花黄色素产品，质量控制显得尤为重要。要控制红花黄色素原料质量，最好采用它的物质群整体予以控制。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of Industry：Botanical Drug(Draft).2000 August)。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。
发明内容
截至目前，关于红花黄色素原料指纹图谱的建立方法却未见报道。为此，发明人对黄花黄色素原料指纹图谱的建立方法进行了研究，对红花黄色素10批原料进行了测定，建立起红花黄色素原料指纹图谱测定方法。
本发明的目的是通过对红花黄色素HPLC指纹图谱的研究，摸索出一种红花黄色素原料质量控制的方法，确立建立红花黄色素原料的标准指纹图谱的方法，借此可将红花黄色素原料指纹谱作为质量控制及真伪鉴别的指标之一。本发明还同时提供了红花黄色素原料的标准指纹图谱。
本发明通过下列步骤实施：
一种红花黄色素指纹图谱的测定方法，其中所述的红花黄色素系从红花中提取分离、纯化得到的红花总黄酮，其包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备，取羟基红花黄色素A对照品用合适溶剂溶解制成适量浓度的溶液作为参照物溶液；
(2)供试品溶液的制备，取红花黄色素供试品用合适溶剂溶解制成适量浓度的溶液作为供试品溶液；
(3)分别取参照物溶液与供试品溶液适量注入高效液相色谱仪测定，高效液相色谱的条件包括固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇与0.2％磷酸水溶液梯度洗脱液，检测波长为403nm；
本发明上述所述的方法，其中所述的步骤(3)中所述高效液相色谱的条件，优选为：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，柱温25℃，流动相以甲醇与0.2％磷酸水溶液进行梯度洗脱，梯度为按体积百分比流动相中甲醇含量为15％、0.2％磷酸水溶液含量为85％时进样，在50分钟内流动相中甲醇浓度从15％呈线性上升至54％、0.2％磷酸水溶液浓度从85％呈线性下降至46％，流速为1.0ml/min，检测波长为403nm，理论塔板数按红花黄色素峰计算应不低于5000。
上述所述的方法，其中，所述的红花黄色素指纹图谱中，共有特征指纹峰有4个，非共有特征指纹峰总面积不超过总峰面积的5％。
进一步地，上述所述的方法，其中所述的红花黄色素指纹图谱中，以羟基红花黄色素A的色谱峰的相对保留时间为1，共有特征指纹峰的相对保留时间(其中相对保留时间的差异限度为±10％)如下：
1号峰：相对保留时间0.74；
S号峰：相对保留时间1；
3号峰：相对保留时间1.21；
4号峰：相对保留时间1.50。
其中，上述所述的方法，其步骤(1)中参照物溶液的制备，可以是：精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加50％甲醇溶解制成羟基红花黄色素A浓度为0.1mg/ml的溶液，摇匀即得参照物溶液。
其中，上述所述的方法，其步骤(2)中供试品溶液的制备是：精密称取红花黄色素供试品适量，加50％甲醇溶解制成红花黄色素浓度为0.3mg/ml的溶液，摇匀，过微孔滤膜(0.45um)过滤即得供试品溶液。
本发明方法，所述的红花黄色素，系从红花中提取分离、纯化得到的红花总黄酮。可以通过现有技术已知方法从红花原药材中提取、分离、纯化得到红花总黄酮。例如CN1600817A、CN1935176A、CN101007828A等专利申请中公开的红花中提取、分离、纯化得到的红花总黄酮或者红花黄色素或者红花提取物产品等。前述专利申请公开内容引入本申请作为参考。
作为本发明优选实施方案之一，其中所述的红花黄色素原料是注射用红花黄色素，按干燥品计其总黄酮含量不低于80％，红花黄色素含量不低于70％；优选总黄酮含量为80％～95％，红花黄色素含量70％～85％。可以通过现有技术已知方法从红花药材中提取分离和纯化精制得到，例如可以通过如下方法制备得到：称取红花，加10-13倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。
将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的HZ801大孔吸附树脂柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。收集富含红花黄色素的洗脱液，洗脱液于80～90℃减压浓缩，得红花黄色素粗品浓缩液。
红花黄色素粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，注射用水洗脱，流速为每分钟5ml，收集含红花黄色素部分。收集液经80～90℃减压浓缩后，得红花黄色素精品浓缩液，经冷冻干燥，得注射用红花黄色素原料(或注射用红花总黄酮原料)。
本发明的优点，主要有：
(1)以红花黄色素建立起来的HPLC指纹图谱，代表着红花药材药理活性部位，能有效地表征红花制剂的质量。红花的主要活性成分为红花黄色素，故用红花黄色素作为监控指标就更具有代表性。
(2)以红花黄色素整个指纹图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定红花黄色素原料整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价红花黄色素原料的质量提供了新的对照标准，将为提高红花黄色素及其成方制剂的质量及疗效做出贡献。
(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。而本发明样品处理大为简便，节约了检验的成本和时间。
附图说明
图1：红花黄色素原料指纹图谱(0～50分钟)
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。
实施例1：红花黄色素原料指纹图谱的建立方法
1、仪器与试剂
HP1100型高效液相色谱仪及HP Chemstation色谱工作站。
甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
羟基红花黄色素A对照品，由中国药品生物制品检定所提供，批号：111637-200502。
10批红花黄色素原料的批号分别为：取浙江永宁制业股份有限公司提供的样品10批，批号分别为：071101、070604、070813、071106、070602、080101、071002、071003、070901、070902，是红花黄色素冻干粉针的原料。
2、色谱条件
色谱柱：十八烷基键合硅胶(4.6×150mm)，柱温25℃；
流动相：A：甲醇，B：0.2％磷酸水溶液，梯度为：
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 15 | 85 |
| 0→50 | 15→54 | 85→46 |
检测波长为403nm，流速为1.0ml/min，理论板数按羟基红花黄色素A计算应不低于5000。
3、指纹图谱测定
(1)红花黄色素原料指纹图谱制备
参照物溶液的制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称重，置100ml量瓶中，加50％甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：精密称取红花黄色素原料约15mg，置于50ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)过滤即得；
测定：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，记录50分钟色谱。以羟基红花黄色素A色谱峰(S峰)的保留时间和峰面积为1，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积比值。
红花黄色素原料指纹图谱(0～50分钟)见图1。
(2)共有峰的确定
根据10批红花黄色素原料指纹图谱给出的相关参数，红花黄色素原料的色谱峰的50分钟内全部出现。比较各批药材的色谱峰，确定了4个共有特征指纹峰，其峰面积总和占总峰面积的95％以上，非共有峰总面积不超过5％。
以羟基红花黄色素A的色谱峰的相对保留时间为1，共有特征指纹峰的相对保留时间(相对保留时间的差异限度为±10％)如下：
1号峰：相对保留时间0.74；
S号峰：相对保留时间1.00；
3号峰：相对保留时间1.21；
4号峰：相对保留时间1.50。
所得到的红花黄色素原料指纹图谱中共有特征指纹峰的保留时间见表1。
表1十批红花黄色素原料测定结果(相对保留时间)
| tr | Rtr(1) | tr | Rtr(S) | tr | Rtr(3) | tr | Rtr(4) |
| 9.520 | 0.740 | 12.870 | 1.000 | 15.519 | 1.206 | 19.333 | 1.502 |
| 9.572 | 0.743 | 12.888 | 1.000 | 15.544 | 1.206 | 19.322 | 1.499 |
| 9.558 | 0.741 | 12.897 | 1.000 | 15.542 | 1.205 | 19.348 | 1.500 |
| 9.565 | 0.742 | 12.889 | 1.000 | 15.529 | 1.205 | 19.353 | 1.502 |
| 9.565 | 0.743 | 12.873 | 1.000 | 15.542 | 1.207 | 19.347 | 1.503 |
| 9.579 | 0.744 | 12.869 | 1.000 | 15.580 | 1.211 | 19.342 | 1.503 |
| 9.585 | 0.743 | 12.893 | 1.000 | 15.550 | 1.206 | 19.327 | 1.499 |
| 9.576 | 0.743 | 12.890 | 1.000 | 15.560 | 1.207 | 19.357 | 1.502 |
| 9.563 | 0.742 | 12.884 | 1.000 | 15.585 | 1.210 | 19.335 | 1.501 |
| 9.569 | 0.743 | 12.879 | 1.000 | 15.590 | 1.210 | 19.350 | 1.502 |
实施例2：指纹图谱的稳定性试验
按照指纹图谱稳定性测定方法操作，取同一批号供试品，考察12小时溶液稳定性。结果供试品常温12小时内稳定，符合指纹图谱的技术要求。结果见表2。
表2红花黄色素原料指纹图谱稳定性试验
| 时间 | tr | Rtr(1) | tr | Rtr(S) | tr | Rtr(3) | tr | Rtr(4) |
| 0h | 9.541 | 0.741 | 12.873 | 1.000 | 15.557 | 1.208 | 19.332 | 1.502 |
| 2h | 9.508 | 0.738 | 12.875 | 1.000 | 15.566 | 1.209 | 19.339 | 1.502 |
| 3.5h | 9.538 | 0.740 | 12.890 | 1.000 | 15.578 | 1.209 | 19.333 | 1.500 |
| 7h | 9.579 | 0.744 | 12.863 | 1.000 | 15.580 | 1.211 | 19.342 | 1.503 |
| 12h | 9.599 | 0.745 | 12.893 | 1.000 | 15.575 | 1.208 | 19.346 | 1.501 |
实施例3：指纹图谱的精密度试验
按照指纹图谱精密度规定方法操作，取同一批号红花黄色素原料为供试品，取1份，连续进样5次，测定精密度。结果仪器等整个检测系统的精密度良好，基本符合指纹图谱的技术要求。结果见表3。
表3红花黄色素原料指纹图谱精密度试验
| 次数 | tr | Rtr(1) | tr | Rtr(S) | tr | Rtr(3) | tr | Rtr(4) |
| 1 | 9.541 | 0.741 | 12.873 | 1.000 | 15.557 | 1.208 | 19.332 | 1.502 |
| 2 | 9.511 | 0.741 | 12.833 | 1.000 | 15.559 | 1.212 | 19.323 | 1.506 |
| 3 | 9.508 | 0.738 | 12.875 | 1.000 | 15.566 | 1.209 | 19.339 | 1.502 |
| 4 | 9.532 | 0.741 | 12.864 | 1.000 | 15.542 | 1.208 | 19.336 | 1.503 |
| 5 | 9.538 | 0.740 | 12.890 | 1.000 | 15.578 | 1.209 | 19.333 | 1.500 |
实施例4：指纹图谱的重现性试验
按照指纹图谱重现性规定方法操作，取同一批号的红花黄色素原料供试品，取6份，分别检测指纹图谱，结果符合指纹图谱的技术要求。结果见表4。
表4红花黄色素原料指纹图谱重现性试验
| 份 | tr | Rtr(1) | tr | Rtr(S) | tr | Rtr(3) | tr | Rtr(4) |
| 1 | 9.599 | 0.745 | 12.893 | 1.000 | 15.575 | 1.208 | 19.346 | 1.501 |
| 2 | 9.582 | 0.741 | 12.925 | 1.000 | 15.614 | 1.208 | 19.390 | 1.500 |
| 3 | 9.627 | 0.745 | 12.919 | 1.000 | 15.631 | 1.210 | 19.400 | 1.502 |
| 4 | 9.607 | 0.743 | 12.937 | 1.000 | 15.610 | 1.207 | 19.387 | 1.499 |
| 5 | 9.616 | 0.745 | 12.912 | 1.000 | 15.598 | 1.208 | 19.361 | 1.499 |
| 6 | 9.614 | 0.744 | 12.921 | 1.000 | 15.595 | 1.207 | 19.366 | 1.499 |
已经根据优选实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种红花黄色素指纹图谱的测定方法，其中所述的红花黄色素系从红花中提取分离、纯化得到的红花总黄酮，并且所述的红花黄色素按干燥品计，其总黄酮含量为80％～95％，羟基红花黄色素A含量为70％～85％，其包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备，精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加50％甲醇溶解制成羟基红花黄色素A浓度为0.1mg/ml的溶液，摇匀即得参照物溶液；
(2)供试品溶液的制备，精密称取红花黄色素供试品适量，加50％甲醇溶解制成红花黄色素浓度为0.3mg/ml的溶液，摇匀，过0.45um微孔滤膜过滤即得供试品溶液；
(3)分别取参照物溶液与供试品溶液适量注入高效液相色谱仪测定，高效液相色谱的条件包括固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，柱温25℃，流动相以甲醇与0.2％磷酸水溶液进行梯度洗脱，梯度按体积百分比进样时流动相中甲醇15％和0.2％磷酸水溶液85％，在50分钟内流动相中甲醇呈线性上升至54％和0.2％磷酸水溶液呈线性下降至46％，流速为1.0ml/min，检测波长为403nm，理论塔板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于5000。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的红花黄色素指纹图谱中，共有特征指纹峰有4个，非共有特征指纹峰总面积不超过总峰面积的5％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的红花黄色素指纹图谱中，以羟基红花黄色素A的色谱峰的相对保留时间为1，共有特征指纹峰的相对保留时间如下，其中相对保留时间的差异限度为±10％：
1号峰：相对保留时间0.74；
S号峰：相对保留时间1；
3号峰：相对保留时间1.21；
4号峰：相对保留时间1.50。
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| 张 娟等.红花黄色素HPLC 指纹图谱研究.《分析检测》.2008,第29卷(第1期),第257－259页. * |
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