CN117310050A - 一种金银花抗氧化质量标志物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金银花抗氧化质量标志物的筛选方法，涉及中药活性成分提取与中药质量评价领域，该方法具体包括以下步骤：首先利用低共熔溶剂对金银花进行萃取；接着，考察提取物多重抗氧化性，构建抗氧化谱‑效关系，采用化学计量学方法筛选抗氧化标志物；最后，将筛选的质量标志物用于金银花真伪辨别与产地区分。本发明创造性的发现利用低共熔溶剂提取可以显著提高提取物的抗氧化性能，经谱‑效关系筛选出的抗氧化质量标志物具有优异的抗氧化性能。本发明的抗氧化标志物的提取、筛选方法绿色环保、效率高，所筛选的抗氧化标志物能用于金银花真伪鉴别与产地区分。
Description
技术领域
本发明涉及中药活性成分提取与中药质量评价领域，具体涉及一种金银花抗氧化质量标志物的筛选方法。
背景技术
金银花是忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花，性寒味甘，具有清热解毒和凉血化淤的功效，临床上主治外感风热、瘟病初起、疮疡病毒、红肿热痛和便脓血等症状。现代药理学研究表明，金银花具有优异的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌、降血糖、保肝护肝等作用，临床应用广泛。据统计，如双黄连注射液、小儿退烧颗粒、牛黄化毒片等含有金银花。此外，金银花也广泛用于食品饮料、医药保健、日用化妆等领域。目前，金银花在我国各地均有栽培，其道地产区为山东、河南、河北等地，但金银花质量受到产地、品种、采集时间、加工方法、包装方式等多种因素的影响。此外，金银花市场上还存在以假乱真和有效含量不达标等现象。因此，开展金银花质量评价研究不仅对其临床使用的安全性、有效性意义重大，对维持金银花市场稳定也至关重要。
现代药理学研究表明抗氧化是金银花发挥疗效的关键特性，因此开展金银花抗氧化成分筛选对金银花的质量评价至关重要。但目前，金银花抗氧化的物质成分不清，如何高效、全面提取金银花的抗氧化成分是金银花指标成分筛选的关键。目前，金银花中活性成分的提取主要以水、乙醇、甲醇作为溶液进行萃取，但是上述溶剂性能单一，无法完全萃取金银花中不同理化性质的抗氧化成分。尽管，开发了一些新型的溶剂对金银花活性成分进行提取，如公开号为CN 115684452 A的中国发明专利公开了一种提取金银花有效成分的方法、产品及应用，使用甘油水溶液提取的金银花活性成分；公开号为CN107157842A的中国发明专利公开了一种牙膏用金银花提取物的制备方法，使用了基于氯化胆碱的低共熔溶剂-盐双水相体系。但是，该方法没有针对金银花抗氧化物质，且有的使用的双水相体系，导致有些抗氧化成分残留在水相中。此外，目前并没有报道如何利用新型溶剂筛选金银花抗氧化成分的报道。因此，开发针对金银花抗氧化成分的提取方法，进而筛选金银花抗氧化质量标志物对金银花质量评价具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种金银花抗氧化质量标志物提取方法、筛选方法及其应用。
本发明的技术解决方案如下：
一种金银花抗氧化质量标志物的筛选方法，包括以下步骤：
S1：将金银花药材粉碎、干燥，过筛，得金银花粉末；将提取溶剂与金银花粉末混合后，萃取，过滤，得到不同批次的金银花抗氧化提取物；
所述提取溶剂为低共熔溶剂与水混合而得，低共熔溶剂为四甲基氯化铵-乙二醇低共熔溶剂；
所述四甲基氯化铵与乙二醇的摩尔比为1:2-4；
所述金银花粉末与提取溶剂按1：30-50质量体积比（g/mL）混合；
S2：利用高效液相色谱法对S1中不同批次的金银花抗氧化提取物进行分析，构建金银花指纹图谱；
S3：对S1中不同批次的金银花抗氧化提取物进行多维度抗氧化活性评价，获得多维度抗氧化活性；
S4：将S2中金银花指纹图谱中特征峰的峰面积与S3中的多维度抗氧化活性进行拟合，构建金银花抗氧化谱-效关系，采用化学计量学方法筛选抗氧化质量标志物。
进一步地，步骤S3中，所述多维度抗氧化活性评价为DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、OH自由基清除率和铁还原能力；
依据抗氧化活性评价的评价指标与提取物中总黄酮、总多酚以及总还原糖含量进行灰色关联度分析，根据分析结果构建多维度抗氧化性能计算公式=DPPH自由基清除率×25%+ABTS自由基清除率×25%+OH自由基清除率×25%+铁还原能力×25%；
按照多维度抗氧化性能计算公式计算得到多维度抗氧化活性。
进一步地，步骤S4中，金银花指纹图谱中特征峰的峰面积与多维度抗氧化活性进行拟合模型为：
Y=0.248016X1+0.0744882X2+0.144516X3-0.150627X4-0.136074X5+0.226756X6-0.0399248X7+0.0395959X8+0.233523X9；
其中，Y表示多维度抗氧化活性； X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9分别表示特征峰1、特征峰2、特征峰3、特征峰4、特征峰5、特征峰6、特征峰7、特征峰8、特征峰9的平均峰面积。
进一步地，步骤S4中，所述的化学计量学方法为采用SIMCA 14.1软件，进行偏最小二乘法判别分析；并以筛选变量重要性投影值大于1的成分作为抗氧化质量标志物。
进一步地，步骤S2中，高效液相色谱法的色谱条件为：采用Sepax C18柱250 mm x4.6 mm，5 um；柱温：31℃；流动相包括洗脱液A和洗脱液B，洗脱液A为0.1%磷酸水溶液，洗脱液B为乙腈；检测波长为330 nm。
本发明还公开了一种如上任一的筛选方法筛选出的抗氧化质量标志物为绿原酸、芦丁和异绿原酸A。
本发明还公开了一种金银花抗氧化质量标志物的应用，首先，按照上述的提取方法提取不同产地和真伪金银花抗氧化提取物；然后，利用高效液相色谱方法对金银花抗氧化提取物中的标志物进行含量分析；最后，利用不同产地和真伪金银花中抗氧化质量标志物的含量构建辨别模型，以区分金银花的真假和产地。
优选地，所述辨别模型为使用SPSS软件构建的聚类分析模型，分类距离为10及以下。
本发明的有益效果是：本发明创造性采用依据抗氧化效果得到的低共熔溶剂作为萃取溶剂，提取出的金银花提取物抗氧化性优异，保证大部分抗氧化成分的高效提取；采用高抗氧化活性的提取方法与指纹图谱联合首次构建了基于低共熔溶剂提取物的抗氧化的谱效关系，筛选出了具有优异抗氧化活性的抗氧化质量标志物：绿原酸、芦丁和异绿原酸A，且三类抗氧化标志物能有效区分金银花的真伪和产地。此外，本发明还发现以四甲基氯化铵-乙二醇（DES）作为溶剂，相比于传统的萃取溶剂，可以有效的破坏金银花的植物细胞壁。
附图说明
图1 为抗氧化定制低共熔溶剂的筛选过程；其中， A:氢键给体的筛选；B:氢键受体的筛选；C：摩尔比例的优化；Eg：乙二醇；Ac: 醋酸；MA：苹果酸；Pro:丙二醇；Glu：葡萄糖；Gly:甘油：Lac:乳酸；Ox:草酸；U：尿素；Bet:甜菜碱；TBAC:四丁基氯化铵；TEAC:四乙基氯化铵；TMAC:四甲基氯化铵。
图2为不同抗氧化物提取法获得的金银花提取物的DPPH自由基（A）、ABTS自由基（B）、OH自由基（C）清除率和铁还原能力（D）。
图3为金银花粉末萃取前后的扫描电镜图；A:萃取前；B：水萃取后；C：药典法萃取后；D：四甲基氯化铵-乙二醇低共熔溶剂萃取后。
图4为不同抗氧化物提取法提取的不同产地金银花提取物的抗氧化活性。
图5为水溶性维生素E（Trolox）与DPPH自由基清除率的标准曲线。
图6为金银花抗氧化物代表性色谱图。
图7为金银花指纹图谱。
图8 为基于抗氧化的低共熔溶剂萃取与抗氧化谱效关系的偏回归系数分析（A）和各共有峰的变量投影重要性分析（B）。
图9 为基于抗氧化质量指标物的金银花真伪鉴别与产地区分的聚类分析模型；LF：山银花；SD：山东；HN：河南；HB：河北。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：基于抗氧化性能的低共熔溶剂对金银花的提取
将金银花药材粉碎，干燥，过60目药典筛，得金银花粉末；接着，将四甲基氯化铵-乙二醇低共熔溶剂（摩尔比1：3）与水按1：2的体积比混合均匀得提取溶剂，将金银花粉末与提取溶剂按1：45的质量体积比（g/mL）混合后，在600 rpm，60℃条件下萃取30 min后，过滤，得金银花抗氧化提取物。
对比例1：传统提取方法对金银花进行提取
将金银花粉末分别与60vt%乙醇水溶液、60vt%的甲醇水溶液以及水按1：45的质量体积比（g/mL）混合后，在600 rpm，60℃条件下萃取30 min后，过滤，得金银花抗氧化提取物。
对比例2：2020版中国药典推荐的金银花活性成分提取方法
取0.5g金银花粉末与50 mL 75vt%甲醇水溶液混合后，在500W、40kHz条件下萃取30 min后，放冷，称定重量（质量减少的用75vt%的甲醇水溶液补足），过滤，得到金银花抗氧化提取物。
抗氧化性能评价：
（1）不同金银花提取物对DPPH自由基清除效果评价
将DPPH溶液溶解在乙醇中至终浓度为0.1 mM，测其吸光度；将不同抗氧化提取物用水稀释5倍；将800 μL DPPH溶液与50μL 抗氧化提取物溶液混合(以50vt%乙醇-水代替抗氧化提取物作为对照组)在黑暗中孵育30 min后，在517 nm处测量吸光度。金银花抗氧化提取物对DPPH自由基清除活性计算如下：
清除活性%=（Ac-As）/Ac；
式中，Ac、As分别为DPPH溶液与抗氧化提取物混合前、后在517 nm处的吸光度。
（2）不同金银花提取物对ABTS自由基清除效果评价
将ABTS水溶液（14 mM）与4.9 mM过硫酸钾（K2S2O8）水溶液在去离子水中在黑暗中反应12h-16h形成ABTS自由基＋工作母液。然后用去离子水稀释ABTS自由基＋工作母液，直到在734 nm处测得的吸光度值为0.7 ± 0.05。然后，将800 μL稀释的ABTS·+溶液与20 μL不同金银花抗氧化提取物（用水稀释5倍）混合。金银花抗氧化提取物的ABTS自由基＋清除活性如下测定：
清除活性%=[Ac-（As-A0）]/Ac；
式中，Ac为对照组（800 μL ABTS溶液与20 μL去离子水混合）在734 nm处的吸光度；
A0为空白组（800 μL去离子水）在734 nm处的吸光度；
As为实验组在734 nm处的吸光度。
（3）不同金银花抗氧化提取物对OH自由基清除效果评价
将FeSO4（1.8 mmol/L）、水杨酸（1.8 mmol/L）和100 μg/mL不同金银花抗氧化提取液（用水稀释5倍）混合（50vt%乙醇-水溶液作为空白样品），加入H2O2（100 mmol/L），30℃金属浴30 min，5000 rpm离心10 min后510 nm处测其吸光值。根据下式计算金银花抗氧化提取物的·OH清除活性：
清除活性%=[Ac-（As-A0）]/Ac；
式中，Ac为对照组在510 nm处的吸光度；A0为空白组（用去离子水代替H2O2）在510nm处的吸光度；As为实验组在510 nm处的吸光度。
（4）铁还原抗氧化能力
将三吡啶三嗪铁溶于40 mM盐酸中制得TPTZ溶液，然后将100 mL 0.3 M醋酸缓冲液，10 mL 20 mM氯化铁溶液和10 mL 10 mM混合得FRAP工作液；将20ul稀释5倍后的金银花提取液与1200 μL现配的FRAP工作液在37℃下避光反应5min后，在593nm处测定吸光度，以FeSO4.7H2O（0.6-4mM）为标准，结果以每毫克金银花Fe(Ⅱ)当量表示 (mM Fe(II)SE/g DW)。
依据抗氧化性能获得的低共熔溶剂结果如图1所示，从图1中可以看出，依据对金银花提取液多维度抗氧化活性的评价，发现低共熔溶剂的组成、比例对提取物的抗氧化性能具有较大的影响。以DPPH自由基清除率作为评价指标，对低共熔溶剂的氢键给体种类、氢键受体总类以及摩尔比进行了定向设计，发现四甲基氯化铵-乙二醇（1:3，mol/mol）的金银花提取物抗氧化性最优，表明该溶剂可以提取金银花中更多的抗氧化成分。
将实施例1、对比例1的提取方法获得的提取物进行比较，抗氧化性能结果见图2，从图中可以看出，采用DES（TMAC-Eg）得到的金银花抗氧化提取物对DPPH自由基（图2中的A）、ABTS自由基（图2 中的B）、OH自由基（图2 中的C）和铁还原能力（图2中的 D）均明显优于水、甲醇和乙醇的提取方法。液相色谱分析结果见表1，其结果显示，相比于对比例1和对比例2获得的提取物，采用四甲基氯化铵-乙二醇低共熔溶剂可以提取更多的绿原酸、芦丁、异绿原酸A、断马钱子酸、当药苷等活性成分。此外，扫描电镜结果（图3）显示，相比于传统的溶剂（水、甲醇），低共熔溶剂能破坏金银花粉末的细胞壁，从而提高了抗氧化物的提取效率。
表1不同提取方法对金银花活性成分的提取产率
实施例2：不同产地金银花抗氧化性能评价
对了探究方法的应用潜力，收集了山东、河南和河北三个产地的金银花，分别采用水、甲醇和DES以及中国药典法制备金银花抗氧化提取物，考察其抗氧化性能。具体方法如下：将金银花粉末分别与水、60vt%的甲醇水溶液以及60vt%的TMAC-EG （DES）水溶液按1：45的质量体积比（g/mL）混合后，在600 rpm，60℃条件下萃取30 min后，过滤，得不同产地的金银花抗氧化提取物。
中国药典法：取不同产地金银花粉末与50 mL 75vt%甲醇水溶液混合后，在500W、40kHz条件下萃取30 min后，放冷，称定重量（质量减少的用75vt%的甲醇水溶液补足），过滤，得不同产地的金银花抗氧化提取物。利用DPPH法评价抗氧化活性，抗氧化性能测试结果见图4；为了准确定量提取物的抗氧化性能，利用水溶维生素E（Trolox）做参照物构建抗氧化标准曲线（以DPPH自由基作为评价，参见图5）。从图4中的结果显示，本发明提供的方法对多种不同产地金银花中抗氧化成分均具有优异的提取效果，得到的提取物的抗氧化能力明显优于传统的水提法、甲醇提取法和中国药典法。因此，本发明的方法具有良好的适用性。
实施例3：抗氧化成分的筛选以及多维度抗氧化活性指标构建
为了探究金银花抗氧化成分的来源，分别利用福林酚法、NaNO2 -AlCl3方法以及二硝基水杨酸法对不同产地金银花的DES提取物中的总多酚（包括酚酸）、总黄酮以及总还原糖的含量进行分析，并将其含量与不同产地金银花提取物DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、OH自由基清除活性以及铁还原能力进行灰色关联度分析，结果见表2。
表2 各含量指标与金银花提取物抗氧化指标的灰色关联度分析结果
灰色关联度相关结果显示，金银花提取物中抗氧化成分主要与其总多酚和总黄酮含量有关（具有更高的相关度），多酚和黄酮可能是金银花主要的抗氧化成分。考虑到总多酚与总黄酮对四种抗氧化评价指标的相关度非常接近（0.870-0.901之间），表明金银花中的总多酚和总黄酮对四种抗氧化评价指标具有相同的贡献。但是，由于每种自由基种类不同（分为N自由基，O自由基和还原性Fe），各个活性成分对不同的基团响应不同。因此，根据灰色关联度分析结果（总多酚和总黄酮对四种抗氧化评价指标具有相同的贡献），构建多维度抗氧化性能计算公式=DPPH自由基清除率×25%+ABTS自由基清除率×25%+OH自由基清除率×25%+铁还原能力×25%。
表3总多酚、总黄酮、总还原糖与金银花提取物的综合抗氧化性能的灰色关联度分析结果
为了验证多维度抗氧化性能的准确度，经不同产地金银花中总多酚（包括酚酸）、总黄酮以及总还原糖的含量与多维度抗氧化性能进行了灰色关联度分析。结果见表3，结果显示，采用多维度抗氧化性能对总多酚和总黄酮的相关度得到了明显增加（从0.870-0.901提高至0.964-0.952）；表明采用多维度抗氧化性能作为评价指标，筛选出的抗氧化指标成分更为精准。
实施例4：基于抗氧化的低共熔溶剂与谱效关系的抗氧化质量标志物的筛选方法
由于金银花中的多酚和黄酮均可以采用HPLC-DAD进行分析，因此采用了HPLC指纹图谱技术对金银花的抗氧化质量标志物进行筛选。液相色谱条件为：LC-20A高效液相色谱系统(岛津，日本)，Sepax C18柱(250 mm x 4.6 mm, 5 um)，柱温：31℃；流动相为0.1%（g/ml）磷酸水溶液(洗脱液A)和乙腈(洗脱液B)，梯度洗脱，梯度程序设置如下: 0~8min 14-19% B，8-14min 19% B,14-34min 19-31% B,34-35min 31-90% B,35-40min 90% B,40-45min 90-14% B。检测波长为330 nm。具体操作如下：
分别取15批金银花药材粉末，将四甲基氯化铵-乙二醇低共熔溶剂（1：3）与水按1：2的体积比混合均匀得提取溶剂，将金银花粉末与提取溶剂按1：45的质量体积比（g/mL）混合后，在600 rpm，60℃条件下萃取30 min后，过滤，得不同产地的金银花抗氧化提取物；采用HPLC对金银花提取物进行分析，将所得的液相色谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），经多点校正和自动匹配，分别叠加得到金银花抗氧化物特征指纹图谱，并筛选出共有峰（图6和图7）。接着，以9个共有峰的峰面积为自变量，不同批次的金银花提取物的多维度抗氧化活性作为因变量，导入SIMCA 14.1进行偏最小二乘法判别分析拟合。分别通过偏回归系数和各共有峰的变量投影重要性（VIP）进行分析，发现特征峰1、2、3、6、8、9与金银花的抗氧化活性程正相关（图8中的A），且1、6、9峰的 VIP 值大于 1（图8中的B），说明该类物质对金银花的抗氧化清除活性具有显著贡献，为金银花的抗氧化质量标志物。结构鉴定结果显示特征峰1、6、9分别为绿原酸、芦丁和异绿原酸A。
其中，金银花指纹图谱中特征峰的峰面积与多维度抗氧化活性进行拟合模型为：
Y=0.248016X1+0.0744882X2+0.144516X3-0.150627X4-0.136074X5+0.226756X6-0.0399248X7+0.0395959X8+0.233523X9；
其中，Y表示多维度抗氧化活性； X表示特征峰的平均峰面积，X的下标序号代表特征峰的顺序编号。
实施例5：基于抗氧化的低共熔溶剂与谱效关系的抗氧化质量标志物的应用
分别收集不同批次金银花主要来源的样品（河南4批、山东4批、河北3批）和山银花，粉碎，过筛得到金银花粉末；接着，将定制的四甲基氯化铵-乙二醇低共熔溶剂（摩尔比1：3）与水按1：2的体积比混合均匀得提取溶剂，将金银花粉末与提取溶剂按1：45的质量体积比（g/mL）混合后，在600 rpm，60℃条件下萃取30 min后，过滤，得金银花抗氧化提取物；采用HPLC对金银花提取物中绿原酸、芦丁和异绿原酸A含量进行分析；以3种抗氧化质量标志物的含量作为变量，得到原始数据矩阵，接着采用SPSS 26.0进行聚类分析，得到分类结果，参考图9，考察本发明的方法能否用于金银花产地区分与真伪鉴别。
从图9中可以看出，当分类距离为15时，将金银花和山银花药材分为3类，其中河南产地和河北产地聚成一类，山东产地的金银花以及山银花各单独聚成一类，表明该分类距离可以将金银花与山银花完全分开。当分类距离为10的时候可以分成四类，来自山东，河南，河北产地的金银花各为一类，山银花为一类，金银花与山银花区分明显，表明该分类距离可以将金银花真伪和产地进行区分。因此，本发明发现的金银花抗氧化质量标志物可以用于金银花的真伪鉴别与产地区分。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，还可以做出其他各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种金银花抗氧化质量标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将金银花药材粉碎、干燥，过筛，得金银花粉末；将提取溶剂与金银花粉末混合后，萃取，过滤，得到不同批次的金银花抗氧化提取物；
所述提取溶剂为低共熔溶剂与水混合而得，低共熔溶剂为摩尔比1:2-4的四甲基氯化铵-乙二醇低共熔溶剂；
所述金银花粉末与提取溶剂按1：30-50质量体积比混合；
S2：利用高效液相色谱法对S1中不同批次的金银花抗氧化提取物进行分析，构建金银花指纹图谱；
S3：对S1中不同批次的金银花抗氧化提取物进行多维度抗氧化活性评价，获得多维度抗氧化活性；
S4：将S2中金银花指纹图谱中特征峰的峰面积与S3中的多维度抗氧化活性进行拟合，构建金银花抗氧化谱-效关系，采用化学计量学方法筛选抗氧化质量标志物。
2.根据权利要求1所述的一种金银花抗氧化质量标志物的筛选方法，其特征在于，步骤S3中，所述多维度抗氧化活性评价的评价指标为DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、OH自由基清除率和铁还原能力；
依据抗氧化活性评价的评价指标与提取物中总黄酮、总多酚以及总还原糖含量进行灰色关联度分析，根据分析结果构建多维度抗氧化性能计算公式=DPPH自由基清除率×25%+ABTS自由基清除率×25%+OH自由基清除率×25%+铁还原能力×25%；
按照多维度抗氧化性能计算公式计算得到多维度抗氧化活性。
3.根据权利要求1所述的一种金银花抗氧化质量标志物的筛选方法，其特征在于，步骤S4中，金银花指纹图谱中特征峰的峰面积与多维度抗氧化活性进行拟合模型为：
Y=0.248016X1+0.0744882X2+0.144516X3-0.150627X4-0.136074X5+0.226756X6-0.0399248X7+0.0395959X8+0.233523X9；
其中，Y表示多维度抗氧化活性； X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9分别表示特征峰1、特征峰2、特征峰3、特征峰4、特征峰5、特征峰6、特征峰7、特征峰8、特征峰9的平均峰面积。
4. 根据权利要求1所述的一种金银花抗氧化质量标志物的筛选方法，其特征在于，步骤S4中，所述的化学计量学方法为采用SIMCA 14.1软件，进行偏最小二乘法判别分析；并以筛选变量重要性投影值大于1的成分作为抗氧化质量标志物。
5. 根据权利要求1所述的一种金银花抗氧化质量标志物的筛选方法，其特征在于，步骤S2中，高效液相色谱法的色谱条件为：采用Sepax C18柱250 mm x 4.6 mm，5μm；柱温：31℃；流动相包括洗脱液A和洗脱液B，洗脱液A为0.1%磷酸水溶液，洗脱液B为乙腈；检测波长为330 nm。
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